JP2871483B2 - 微生物によるインジゴ生成のためのｄｎａ形質転換ベクター - Google Patents
微生物によるインジゴ生成のためのｄｎａ形質転換ベクターInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般に、微生物による
染料の製造、特に、インドールが存在しない培地での微
生物の培養を利用した染料の製造ならびにその生成物に
関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】イン
ジゴまたはインジゴチンは、アジア、東インド、アフリ
カ、および南アメリカに生育する多くの植物において、
配糖体として存在し、長年にわたって青色染料として使
用されてきた。 インジゴは、主に、インジゴフェラ(I
ndigofera)属およびイサタス(Isatus)属の植物から得ら
れ、最も古いものとして知られる織物、すなわち、紀元
前2000年に埋葬されたミイラのリネン巻布を青色に染め
るために使用されている。 19世紀の中頃には、インジ
ゴは、欧州と東洋の交易の主要品目となった。 インジ
ゴ分子の構造の解明と合成に成功する以前は、天然のイ
ンジゴを使用するために、長時間の発酵工程を経て、染
料を、可溶性・無色のインジカンの形態で遊離させて、
織物に浸透させていた。 織物とインジカンをバットの
中に浸漬すれば、可溶性のインジカンは、容易にグルコ
ースとインドキシルに加水分解する。 そして、空気に
曝す等による弱い酸化によって、インドキシルはインジ
ゴに変化し、織物の繊維内で、色素が再生する。 【０００３】19世紀には、この有用な化合物の構造を解
明するために、多大な努力が払われた。 化学式 C16H
10N2O2 に対応するインジゴの化学構造は、アドルフ・
フォン・バイアー(Adolf von Baeyer)によって、その18
年にわたるこの染料の研究の後に、1883年に発表され
た。 今日もなお、苛性ソーダとナトリウムアミドの混
合物に、フェニルグリシネート・ナトリウムを融解し
て、インドキシルの合成を行う方法が、世界中で使用さ
れている。 産業的に成功した方法はいずれも、インド
キシルを空気酸化させてインジゴに転化するための最終
工程を有している。これまで、インジゴは主に、木綿あ
るいは毛織物を濃紺色の色合に染めるために使用されて
いた。 そして、この化合物については、太陽エネルギ
ーを集める方法に適用できる可能性が示唆されている
（英国特許 No. 1,554,192を参照のこと）。 【０００４】微生物による青色色素の生成に関する従来
の知見が、本発明の背景と関連がある。 ある研究者
が、1927年に、選択的培養法を用いて、インドールを分
解して青色の結晶を形成することができる土壌微生物シ
ュードモナス・インドロキシダン(Psudomonas indoloxi
dans) 菌を分離している。 この細菌の培養にて認めら
れた青色の粒子は、水、アルコール、エーテル、キシロ
ール、およびベンゾールには溶けないが、濃硫酸に溶け
て、青色溶液となり、この液を用いて絹を青色に染めて
いる。 この研究者は、インドキシルは、この微生物の
細胞内で形成されるものではなく、青色結晶の形成が、
増殖した細菌から放出される細胞外酵素の産生によるも
のであると結論している。 この微生物は、エネルギー
源としてインドールを用いることができず、加えて、炭
素源を補充しないと、インドールをインジゴチンに酸化
することもできなかったが、炭素が供給されれば、イン
ドールを酸化することが可能となる。 窒素に対する炭
素の比率が高くなれば、シュードモナス・インドロキシ
ダン菌の増殖と、インジゴチンの生成に適するようにな
るようである。 【０００５】さらに、この研究者が行った観察によれ
ば、インドールはこの微生物の成長を抑制するらしく、
インドールが消費されるとすぐに、微生物は急速に増殖
した。インドールの酸化は、この微生物の増殖の初期段
階にのみ起きることが観察された。 培養中にはインド
キシルは全く認められず、インジゴチンがさらに酸化さ
れてイサチンになることはないようであった。 この研
究者は、その他の２種類の土壌微生物、ミコバクテリウ
ム・グローベラルム(Mycobacterium globerulum)および
マイクロコッカス・ピルトネシス(Micrococcus piltone
sis)も、インドール細菌培養基上でのみ、少量のインジ
ゴチンを生成することを報告している〔Grey, P.H.,
「土壌細菌によるインドールからのインジゴチンの生
成」、Roy.Soc. Proc., B, 102: pp.263-280 (1927年)
を参照のこと〕。 【０００６】「青色色素」を生成するシゾフィラム・コ
ミューン(Schizophyllum commune)菌類の単一突然変異
体培養についても報告がある。 この培養では、グルコ
ース、(NH4)2HPO4、チアミン、KH2PO4、K2HPO4、および
MgSO4・7H2Oを含む化学的な性質が明らかな合成培地が
使用されている。 アンモニウムイオンが、その窒素源
であった。 赤と青の両方の色素が、菌糸浸出物から採
取された。 この浸出物から、クロロホルムを用いて抽
出した青色色素が何であるかは、溶解度試験、吸収分光
試験、および化学分析によって確認された。 これらの
試験の結果はすべて、青色の色素がインジゴであるとい
う結論で一致していた〔Miles, P. et al.,「シゾフィ
ラム・コミューンの突然変異体の培養から生成された色
素としてのインジゴの確認」、Archives of Biochemist
ry and Biophysics, 62: pp.1-5(1956年）を参照のこ
と〕。 【０００７】1962年に、微生物クロモバクテリウム・バ
イオラシム(Chromobacterium violaceum)による色素バ
イオラセインの生合成に関する研究が実施され、この微
生物が、L-トリプトファンを容易にバイオラセインに変
換したが、このアミノ酸を増殖には利用しなかった。
研究者らは、L-トリプトファン専用の新規の微生物定量
法を考案したが、この方法では、生成されたL-トリプト
ファンの量は、試料中のL-トリプトファンの量との間に
関数の関係があった。 具体的には、凍結乾燥した細胞
と共に、L-トリプトファンをインキュベートすると、イ
ンドールが一時的に形成され、48時間のインキュベーシ
ョンの後には、濃い青色色素が合成された。 着色物質
は、その色彩、吸収スペクトル、および薄層クロマトグ
ラフィーの移動度から、インジゴであることが判明し
た。 研究者らは、インドキシルが、この細菌内でのイ
ンジゴ合成経路の中間体であるとの結論に達し、さら
に、トリプトファナーゼ、すなわち、トリプトファン合
成酵素の働きにより、クロモバクテリウム・バイオラシ
ムは、L-トリプトファンをインドールに変化することを
知見するに至ったのである。 この微生物は、L-トリプ
トファンからだけではなく、インドールからもバイオラ
セインを合成した。 バイオラセイン合成経路での酵素
を、急速な凍結乾燥により不活性化すると、L-トリプト
ファンとインドールは、いずれもインジゴに変化した
〔Sebak, O. and Jaeger, H., 「クロモバクテリウム・
バイオラシム」におけるインドール代謝の分岐経路」、
Nature,196:pp.793-795 (1962年) を参照のこと〕。 【０００８】さらに最近の報告によると、研究者たち
は、インドールを炭素および窒素の唯一の供給源として
用いた培養法により、土壌からある微生物を分離した。
インドール、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、MgSO4 、水およ
び酵母エキスを含んだ培地で成長させると、急速にイン
ドールを分解するある好気性グラム陽性球菌は、培地中
に放出されない青色色素を生成した。 培地中のインド
ールは急速に消費されることがわかり、培養期間中に数
回、インドールが加えられた。 回収した細胞は、新鮮
な青色を呈しており、基質１モルにつき11〜13個の酸素
原子を消費してインドールを分解した。 この微生物の
培養に、インドールに代えてアントラニル酸、グルコー
スあるいはグリセリンを用いると、細胞はインドールの
分解能力を示さず、その活性が誘導的であることを示し
た。 インドールを用いて増殖させると、この微生物
は、インドールを、オキシインドール、アントラニル
酸、およびカテコールに分解した。 この微生物の無細
胞抽出液は、酵素のジオキシインドール、オキシゲナー
ゼを含み、この酵素は、ジオキシインドールのアントラ
ニル酸塩と二酸化炭素への変換の触媒作用を呈した。
このジオキシインドール・オキシゲナーゼは、微生物
を、インドールを用いて増殖する場合にのみ現れる誘導
酵素であることが確認された。 これら研究者が提唱し
たインドールの分解経路は、インドール−インドキシル
−ジオキシインドール−アントラニル酸−カテコールで
あった〔Fujioka, M. and Wada, H.,「細菌によるイン
ドールの酸化」、Biochemica et Biophysica Acta, 15
8: 70-78 (1968年) を参照のこと〕。 【０００９】これまで、上記した微生物のいずれもが、
インジゴの大規模な微生物による合成のために用いられ
たことはなかった。 これは、主に、インドールを基質
として供給したり、あるいは増殖培地の厳密な栄養バラ
ンスを保持するために要する、経済的要因によるものと
考えられる。 【００１０】動物の腸内に固有の腸内細菌（例えば、大
腸菌）は、トリプトファナーゼ構造遺伝子により生成さ
れる酵素である、トリプトファナーゼの活性により、イ
ンドールを蓄積することができる〔例えば、Post et a
l., P.N.A.S. USA, 76: 1697-1701 (1979) を参照のこ
と〕。 トリプトファナーゼは、トリプトファンの分解
において触媒作用を呈し、インドール、ピルビン酸塩、
およびアンモニアの化学量論的生成を生じる。 関連酵
素であるトリプトファン合成酵素も、インドール・グリ
セロール燐酸およびセリンから、トリプトファンを合成
する際の触媒となる。 大腸菌でのトリプトファナーゼ
の合成は、トリプトファンによって誘導可能である。
Escherichia coli K12 のトリプトファナーゼの構造遺
伝子tnaAは、クローンが作成されて、その配列が明らか
にされている。 Deeleyet al.,「Escherichia coli K1
2 のトリプトファナーゼの構造遺伝子のヌクレオチド配
列」, J. Bacteriology, 147; pp.787-796 (1981年) 、
およびDeeley et al.,「Escherichia coli K12 のトリ
プトファナーゼ・プロモーターでの転写の開始」, J.Ba
cteriology, 151; pp.942-951 (1982年) を参照のこ
と。 腸内細菌は、単純な培地でも成長できるが、イン
ドールをインジゴに変換する酵素的手段は有していな
い。 【００１１】本発明の背景に特に関連があるのは、本願
発明者による、「芳香族炭化水素の微生物による酸化の
方法と物質」なる名称の、1982年９月20日に出願された
米国特許出願No.419,953であり、当該出願を先行技術と
して、本明細書に組み込んだ。当該出願では、特に、ナ
フタレンをサリチル酸塩へ酸化分解する酵素を宿主微生
物にて発現するコードを決定するシュードモナス・ピュ
チダ(Pseudomonas putida)菌由来のＤＮＡ配列を含んだ
プラスミドpE317 について言及されている。具体的に
は、当該出願は、大腸菌等の微生物を形質転換して、通
常は、ナフタレン等の芳香族化合物の微生物による無機
化において過渡的に形成される有用な中間生成物を選択
的に生成かつ蓄積する能力を付与するために、pE317 お
よびその他のプラスミドを使用することを開示するもの
である。 【００１２】プラスミドpE317 がコードする酵素には、
ナフタレン・ジオキシゲナーゼが含まれる。 この酵素
は、ナフタレンのシス-1,2- ナフタレン・ジヒドロジオ
ールへの転換のための触媒作用を行う。 本発明者およ
び共同研究者は、シュードモナス(Pseudomonas sp.) NC
1B 9816菌から得た多成分酵素系におけるナフタレンの
酸化に関する徹底的な研究を以前に実施し〔Ensley et
al., J. Bacteriology, 149; pp. 948-954 (1982年) を
参照のこと〕、ナフタレンの酸化における最初の反応
が、三つのタンパク質成分から構成される酵素系に関係
するものであるとした。 【００１３】従って、インドールを合成し、蓄積するこ
とができる、ある種の微生物およびインジゴ合成の基質
としてインドールを用いる能力を有するその他の微生物
が存在することが明らかにもかかわらず、当該技術分野
においては、微生物を用いてインジゴを生成するための
効率の良い方法に関する、信頼のできる説明はなされて
いなかったのが実情である。 【００１４】 【課題を解決するための手段】本発明は、インドールが
存在しない培地で増殖する遺伝子工学的な形質転換を行
った微生物におけるインジゴ生成の、最初の手段を提供
するものである。 【００１５】本発明の態様の一つとして、本発明は、イ
ンドールを生成、蓄積する代謝能力を有する選択された
微生物にて、インジゴを微生物学的に生成するための方
法を提供する。 この方法は、一種以上の芳香族ジオキ
シゲナーゼ酵素を合成する能力を有するように、微生物
を、遺伝子操作して安定裏に形質転換を行うことを含
む。 本発明において使用できるジオキシゲナーゼ酵素
は、微生物による芳香族炭化水素のシスヒドロキシオー
ルへの酸化転換のための触媒となる。 形質転換された
微生物は、インドールの酸化転換のための触媒となる、
ジオキシゲナーゼ酵素の触媒作用を促進する条件下で増
殖される。 予測される酸化転換反応生成物は、シス−
インドール-2,3- ジヒドロジオールである。 次に、こ
の生成物は、インドキシルに転位されるものと考えら
れ、そして、インドキシルは空気の存在下で縮合してイ
ンジゴとなる。 そして、インジゴは、微生物あるいは
その増殖培地から分離される。 【００１６】現時点で最も好ましい態様の一つにおい
て、インドールを生成、蓄積する代謝能力をすでに有す
る微生物内でのインジゴの微生物学的製造は、大腸菌を
宿主細胞として用いることで実現できる。 遺伝子操作
による形質転換には、シュードモナス・ピュチダのナフ
タレン無機化プラスミドnah7から得た、シュードモナス
菌由来の芳香族ジオキシゲナーゼであるナフタレン・ジ
オキシゲナーゼの発現をコードするＤＮＡ配列を含んだ
ＤＮＡベクターによる形質転換が含まれる。 この目的
に適切なベクターが、米国特許出願 No. 419,953に記載
されたpE317 である。 【００１７】本発明の方法に、トリプトファナーゼ酵素
を合成する能力を持つように、安定的にかつ遺伝子的に
微生物を形質転換する工程、そして、トリプトファンを
ピルビン酸塩とインドールに分解するトリプトファナー
ゼ触媒分解を促進する条件下で、微生物を増殖する工程
を追加することができる。 トリプトファナーゼ酵素な
らびに芳香族ジオキシゲナーゼ酵素を合成する能力を発
生（あるいは、促進）するための宿主微生物の遺伝子操
作による形質転換は、両方のタイプの酵素をコードする
ＤＮＡ配列を含む、単一のＤＮＡベクターを用いて形質
転換を行うことにより実現できる場合がある。 【００１８】このように、本発明は、インドールを生
成、蓄積する代謝能力を有さない選択された微生物にお
いて、また、前記した能力を有する微生物において、イ
ンジゴを当該微生物によって製造する方法を提供する。
「複合的に形質転換された」微生物は、トリプトファ
ンからインドールへの転換のためのトリプトファナーゼ
酵素触媒作用と、細胞内でさらに「処理」されてインジ
ゴに転換する、インドールの酸化形態へのジオキシゲナ
ーゼ酵素触媒酸化転換を、共に促進する条件下で増殖さ
せることができる。 インジゴは、その後に、微生物お
よび／または培地から分離することができる。 【００１９】従って、本発明は、微生物による芳香族ジ
オキゲナーゼ酵素とトリプトファナーゼ酵素との合成の
ためのコードを定めるＤＮＡ配列を含む新規のＤＮＡ形
質転換ベクターをさらに提供する。 「インジゴ・オペ
ロン」は、単一ベクターに組み込んでも良く、そのオペ
ロンにおいては、トリプトファナーゼとジオキシゲナー
ゼの両方の酵素のコード領域は、単一のプロモーター／
レギュレーターによって制御される。 オペロンのプロ
モーター／レギュレーターは、微生物宿主において、両
酵素を同時に機能させることを可能にし、トリプトファ
ンからインドール、そして、インドールからシス−イン
ドール-2,3- ジヒドロジオール、そして最終的に、イン
ジゴへの連続的な触媒作用を引き起こす微生物の「シン
ク」を生成する。 プロモーター／レギュレーターは、
誘導物質あるいは培養温度の変化に敏感であることが好
ましい。 【００２０】本発明のさらに別の態様によると、一種以
上のジオキシゲナーゼ酵素を合成する（ゲノムあるいは
プラスミドを担体とするＤＮＡ配列の発現による）能力
を有する微生物は、インドールが存在しない培地で増殖
するとインジゴを生成する能力を有するように、遺伝子
的に変更される。 このような遺伝子的な変更は、トリ
プトファナーゼ酵素を合成する能力を付与するための、
安定した形質転換を伴う。 【００２１】本発明のその他の態様および利点は、以下
に例示的に示した実施例の開示から明らかである。 【００２２】 【実施例】本発明の好適な実施態様における方法および
物質は、特に、シュードモナス・ピュチダ菌由来のプラ
スミドを担体とするＤＮＡ配列に関係し、これら配列
は、所望のインドール生成宿主微生物、例えば、大腸菌
を形質転換するために用いることができる。 この実施
態様での方法とＤＮＡ形質転換ベクターにより形質転換
された細胞は、ＤＮＡ配列を最初のジオキシゲナーゼ酵
素（あるいは、酵素系）の合成の形態で発現し、この酵
素は、蓄積されたインドールを、シス−インドール-2,3
- ジヒドロジオールに変換することが可能である。 次
に、ジヒドロジオールは転位してインドキシルを形成
し、インドキシルも選択された宿主微生物内に蓄積す
る。 後者の生成物は、空気の存在下でインジゴに変換
される。 【００２３】本発明を実施する上で有用なジオキシゲナ
ーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列は、芳香族炭化水素の
シス−ジヒドロキシジオール型への微生物による酸化変
換のための触媒となる一つ以上の酵素を合成・蓄積する
能力を有する微生物に組換方法を適用して入手してもよ
い。 本発明に使用するＤＮＡ配列を特に供給する必要
があると考えられるものは、増殖培地に供給されたイン
ドールをインジゴに変換する能力を有することが経験的
に確認された微生物である。 このような微生物の一つ
が、遺伝子操作可能なナフタレン分解プラスミドnah7を
含むシュードモナス・ピュチダPpG7である。 この微生
物は、米国特許出願 No. 419,953に開示した芳香族炭化
水素の酸化のための選択的方法のために使用されたプラ
スミドpE317 の親株である。 シュードモナス・ピュチ
ダ(Pseudomonas putida) NC1B 9816も適切なＤＮＡ配列
をもたらすものと考えられ、これはnah7に似通った（そ
して、おそらく同一の）遺伝子操作可能なナフタレン分
解プラスミドを含んでいる。 これらの微生物はいずれ
も、それらの増殖培地の成分としてインドールが供給さ
れると、インジゴを生成することが、これまでに観察さ
れている。 【００２４】さらに本発明の実施において、ジオキシゲ
ナーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の有用な供給源にな
ると考えられるものは、ナフタレン以外の芳香族炭化水
素（例えば、トルエン、ベンゼン等）を酸化・無機化す
る能力を有する微生物であり、酵素をコードする遺伝子
の担体がプラスミドであるかゲノムであるかは関係な
い。 このような微生物の例として、 Yeh et al., Bio
chem. & Biophys. Res.Comm., 78: 401-410 (1977) に
記載のシュードモナス・ピュチダ「TOL 」、および Gib
son et al., Biochem., 9: 1626-1630 (1970) に記載の
シュードモナス・ピュチダ39/Dを挙げることができる。
これらの微生物はいずれも、トルエンの酸化による生
成物としてのシス−トルエン-2,3- ジヒドロジオールの
形成において触媒作用を呈するジオキシゲナーゼ酵素を
合成する能力を有する。 これらの微生物はいずれも、
それらの増殖培地の成分としてインドールが供給される
とインジゴを生成する能力が付与されることが、すでに
観察されている。 【００２５】ジオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ
配列が適当なベクターによって、自らトリプトファナー
ゼ酵素を有する微生物、例えば、大腸菌が形質転換され
ると、この微生物はトリプトファンからインジゴを生成
することができるようになる。 【００２６】以下の実施例では、(1) アンピシリンを含
んだ組成が明確な培地での増殖の際に、本発明のベクタ
ーを有する微生物によって生成された青色色素の同定、
(2)ＤＮＡベクターのＤＮＡコード領域により生成され
たナフタレン・ジオキシゲナーゼ酵素が、大腸菌の菌体
内で生成されたインドールと反応していることの確認、
および(3) 組換大腸菌によるインジゴ合成の速度の測定
について開示した。 【００２７】実施例１ プラスミドpE317 を以下のようにして、プラスミドnah7
から調製した〔米国特許出願 No. 419,953の実施例４を
参照〕。 プラスミドnah7〔Yen & Gunsalus,Proceedin
gs of the National Academy of Sciences, U.S.A., 7
9, pp. 874-878(1982)〕を、ハンセンとオルソンのアル
カリ性ナトリウムドデシル硫酸法〔Journal of Bacteri
ology, 135, pp. 227-238 (1978)〕によって、シュード
モナス・ピュチダPpG7(A.T.C.C. 17485)から単離し、そ
して、HindIII で完全消化した。 【００２８】HindIII 消化したnah7ＤＮＡ断片を、Hind
III 切断したプラスミドpBR322(A.T.C.C.37017)に連結
した。 得られたプラスミドを、Escherichia coli HB1
01に形質転換し、これを200mg/mlのアンピシリンを含む
Ｌ−寒天プレートにて24時間成長させた後、コロニーを
24〜48時間かけてナフタレン蒸気にさらし、そして、ナ
フトキノンの生成により認められるナフタレン代謝によ
る褐変を観察することによって、ナフタレン代謝能力に
ついてコロニーをスクリーニングした〔Shamsuzzamon a
nd Barnsley, Biochemistry and Biophysics Research
Communications, 60, pp.582-589 (1974) 〕。 【００２９】21000 塩基対の大きさのプラスミドを、褐
色コロニーから単離した。 HindIII切断した時に、4400
塩基対と 16500塩基対の大きさの断片が得られた。 165
00塩基対の断片は、ナフタレン分解酵素の合成をコード
する遺伝子を含むnah7の一部である。 16500塩基対の断
片は、EcoRI で切断されて５つの断片になった。 【００３０】プラスミドに、５つのEcoRI 切断片の少な
くともいずれかが挿入されるように、その５つの断片は
再連結され、そしてEscherichia coli HB101に形質転換
した。 【００３１】前述したようにして、コロニーをスクリー
ニングした。 二つのEcoRI 部位を有する 17300塩基対
の断片を、褐色コロニーから単離した。 この 17300塩
基対の断片を、EcoRI 切断し、精製し、EcoRI 切断した
pBR322 DNAに連結し、そして、大腸菌に形質転換した。
この組換体を、前述したようにしてスクリーニングし
た。 このようにして、pBR322からの4400塩基対と、ナ
フタレンからサリチル酸への代謝に必要な遺伝子を含む
挿入体である 10900塩基対から構成される、前出の 153
00塩基対のpE317 を得た。 【００３２】そして、大腸菌がpE317 によって形質転換
し、 200μg/mlのアンピシリンを含むルリアブロスにて
増殖すると、一晩のインキュベーションの後に、青色色
素が培養培地および細胞内に生成されているのが観察さ
れた。 【００３３】青色色素を以下の方法によって精製し、次
いで同定した。 pE317を保有する大腸菌 HB101を、18
時間にわたって、0.25％グルコース、25mg/Lのプロリン
とロイシン、そして、2.0mg/L アンピシリンを補充し
た、10g/L K2HPO4、3.5g/L Na(NH4)HPO4・4H2O、2.0g/L
クエン酸・H2O、0.2g/L MgSO4・7H2Oから構成される250
mlの無機培地を入れた２つの１Ｌフラスコ内にて増殖し
た。 フラスコを、250rpmで振とうし、かつ30℃に保っ
た。 【００３４】増殖の後に、細胞は、培地から遠心分離法
によって分離し、濃青色の細胞ペレットと透明な淡黄色
の上澄が得られた。 細胞ペレットは、25mlの沸騰クロ
ロホルムによって８回にわたって抽出した。 有機抽出
物はまとめて、アルゴンガスの流れの下で、10mlに減容
された。 そして、有機抽出物を、無水硫酸ナトリウム
によって乾燥し、クロロホルム中ですでに平衡化したシ
リカゲル60カラム(2.5×５cm) の頂面に置いた。 青色
色素を、クロロホルムによってカラム内で洗浄し、4.0m
l の留分を得た。 青色色素を含む留分は、クロロホル
ム：酢酸：メタノール〔40：２：1(容積／容積）〕の溶
媒系で展開した薄層クロマトグラフィー用シート（EM試
薬、シリカゲル60F 254)上のクロマトグラフィーによっ
て純度を検定した。 薄層クロマトグラフィーによる分
析の後に、単一紫外線吸収スポットを含む、これらの青
色の留分を一括して、真空条件下にてその溶媒を除去し
た。この方法の結果、26mgの濃青色の結晶が得られた。
結晶を少量のクロロホルムに溶解して、分析した。
そして、この青色色素は、合成インジゴ(Kodak社）のク
ロマトグラフィー特性、可視光線ならびに紫外線照射、
質量分析、および赤外線スペクトルと同一の結果を示し
た。 このデータは、組換大腸菌を上述した条件下で増
殖する際に、インジゴが生成されたことを示すものであ
る。 【００３５】実施例２ クローニングされたナフタレン・ジオキシゲナーゼ遺伝
子から合成された酵素が、大腸菌菌体内に生成されたイ
ンドールと反応しているとする指摘は、以下の観察と符
合する。 【００３６】(1) 何度か非選択培地〔すなわち、アンピ
シリンを含まない〕にて連続して培養した後に、組換微
生物は、インジゴを生成する能力を喪失する。 これら
の培養において、ナフタレンを酸化する能力の有無につ
いて分析すると、ナフタレンを酸化する活性も併せて失
われていることがわかる。 【００３７】形質転換されない大腸菌は、青色色素を生
成することができないので、これらの実験は、青色色素
の形成においてナフタレン・ジオキシゲナーゼ遺伝子が
不可欠であることを実証している。 【００３８】(2) 組換大腸菌を、10mMのトリプトファン
あるいは１mMのインドールを補充した培養培地で増殖す
ると、青色色素の形成は促進される。 【００３９】(3) 組換大腸菌が、１％グルコースを補充
した培地で増殖すると、青色色素の形成は観察されな
い。 高レベルのグルコースは、大腸菌内のトリプトフ
ァーゼ合成の異化抑制を招く〔Botsford, J.L. & R.D.
DeMoss, J. Bacteriol. 105:303-312 (1971)〕。 【００４０】(4) Nah7プラスミドに関するナフタレン・
ジオキシゲナーゼ遺伝子を有するシュードモナス・ピュ
チダPpG7を、培養培地にてインドールと共にインキュベ
ートすると、青色色素の形成が認められた。 この微生
物は、トリプトファナーゼ酵素系を有さず、通常の代謝
ではインドールを生成しない。 【００４１】実施例３ 組換大腸菌によるインジゴの合成割合が、以下の手順で
測定された。 形質転換した大腸菌と、形質転換してい
ない大腸菌を、実施例１で述べた無機培地を入れた２つ
のフラスコ内で増殖した。 形質転換していない大腸菌
の増殖のために用いた無機培地からは、アンピシリンを
除去した。 微生物の増殖は、500nm にて吸光度を測定
することで観察した。 インジゴの合成は、種々の時間
間隔で、各培養液から1.0mlの試料を採取することによ
って観察した。 培養液を、2.0mlの酢酸エチルを用い
て抽出し、エマルジョンを分別するために遠心分離を行
い、上層の一部（酢酸エチル）をキュベットに移した。
各有機抽出物の 600nmでの真吸光度を測定した。 イ
ンジゴは、酢酸エチル内において、 600nmで可視吸収極
大を示すことが経験的に認められた。 増殖中に容易に
測定できるインジゴの合成が、形質転換された大腸菌を
含む培養液では認められたが、形質転換されていない大
腸菌を含む培養液においては、インジゴの合成は認めら
れなかった。 【００４２】前記したそれぞれの例は、用いた大腸菌細
胞内の内在性トリプトファナーゼ酵素が、トリプトファ
ンをインドール（そして、おそらく、ピルビン酸とアン
モニア）に変換することを実証している。 ナフタレン
・ジオキシゲナーゼの微生物による合成をコードするＤ
ＮＡ配列を含むＤＮＡベクターを用いた大腸菌の形質転
換の結果、芳香族ジオキシゲナーゼが細胞内で生成され
る。 本発明の実施において、インドールからインジゴ
への変換の際に形成される中間体は、未だ何ら決定され
ていない。 しかしながら、ジオキシゲナーゼ酵素が触
媒作用をするインドールへの変換の最初の生成物は、シ
ス−インドール-2,3- ジヒドロジオールであると考えら
れる。 ジオールの転位反応は、インドキシルを生成
し、そして、空気存在下でのインドキシルの縮合によっ
てインジゴが生成される。 【００４３】このような手順を経て形成されるインジゴ
の量は、トリプトファナーゼ酵素をコードするＤＮＡ配
列を、安定裏に取り込むように、微生物をさらに形質転
換すれば、大幅に増加させることができる。 前出のDe
eley et alの文献を参照。 【００４４】大腸菌は、大腸菌自体のトリプトファナー
ゼ酵素コード領域を有しているが、その領域およびその
調整メカニズムは染色体にあり、１細胞当たり１つのコ
ピーをもたらすに過ぎない。 コピー数の多いＤＮＡプ
ラスミド・ベクターにおいては、トリプトファナーゼ酵
素コード領域の多くのコピーが分散することができ、ト
リプトファンからインドールへ、効率良く、高い変換率
にて変換することができる。 このトリプトファンの代
謝の増大は、大腸菌の内在性トリプトファン合成酵素調
整機構を活性化して、インドール・グリセロール燐酸塩
およびセリンを、トリプトファンに変換すると考えられ
る。 トリプトファナーゼ酵素およびジオキシゲナーゼ
酵素のＤＮＡベクターコード領域が、同じＤＮＡベクタ
ー上にあり、かつ同じプロモーターで制御されている場
合には、それらは同時に活性化される可能性がある。
このようなベクターを保有する大腸菌細胞が、最適レベ
ルにまで成長すると、プラスミドの両酵素をコードする
領域は同時に活性化されて、細胞内のトリプトファン
を、インドールとピルビン酸塩に、そして、インドール
をインドキシリンに、そして、最終的にインジゴに至る
まで、細胞内に生成されたトリプトファンがすべて消費
されるまで、変換を続ける。 そうして生成されたイン
ジゴは、しばしば培地において、そして、細胞中で結晶
となり、簡単な化学的および物理的な方法で取り出すこ
とができる。 【００４５】宿主微生物が、インドールを生成、蓄積す
る内在的な代謝能力を有していない場合、トリプトファ
ナーゼ酵素および芳香族ジオキシゲナーゼ酵素のための
コードを有するＤＮＡベクターによる微生物の形質転換
は、まず、微生物にトリプトファンをインドールに、そ
して、インドールをインジゴに変換する能力を付与する
ように機能する。 【００４６】望ましい態様によると、本発明の「インジ
ゴ・オペロン」ＤＮＡ形質転換ベクターは、プロモータ
ー／レギュレーターに同時的に制御されるトリプトファ
ナーゼ酵素およびジオキシゲナーゼ酵素のコード領域を
共に含む。 このようなインジゴ・オペロンの一つは、
pE317 のように、シュードモナス・ピュチダのナフタレ
ン無機化プラスミドnah7の小さな部分から構成され、そ
れは、ナフタレンジオキシゲナーゼ酵素の発現を調整す
る能力を備えたオペロンを有するＤＮＡ断片を含む。
ＤＮＡ形質転換ベクターには、ジオキシゲナーゼ遺伝子
と共に、前出のDeeley et alの文献に記載されているよ
うな、トリプトファナーゼ酵素コード領域が存在する。 【００４７】このようなインジゴ・オペロンの作成にお
いて潜在的に役立つ、温度感受性のプロモーター／レギ
ュレーターの一例が、cI857 の制御下にあるλPLファー
ジである。 この極めて効率の良いプロモーター(PL)
は、γリプレッサータンパク質cIによって調製でき、γ
リプレッサータンパク質cIは、大腸菌γ溶原菌内で自生
的に調製される生成物である。 突然変異体リプレッサ
ータンパク質cI857 は、32℃を下回る温度では、PLプロ
モーターを不活性化する。 32〜41℃の間の温度では、
cI857 は不活性化され、それによってPLプロモーターの
制御下で転写を開始する。 Shimataka, H. et al., Na
ture, 292: 128-131 (1981)、およびSussman, R. et a
l., Acad. Sci. Paris, 254: 1517-1519 (1962) を参照
のこと。 【００４８】細胞の成長および遺伝子の発現調製におい
て、温度に鋭敏なプロモーター／レギュレーターを用い
ることの利点は極めて明白であるが、トリプトファナー
ゼおよび／またはジオキシゲナーゼの活性の低下とい
う、潜在的な欠点に照らして考慮しなければならない。 【００４９】 【発明の効果】上記実施例および関連する説明は主に、
インジゴの生成に関係する方法で、インドールを「処
理」する遺伝子工学的手段を有さない、すなわち、適切
なジオキシゲナーゼ酵素を合成する能力を有さない微生
物による、インジゴの生成に関するものである。 当業
者からすれば、本発明が、適切なジオキシゲナーゼ酵素
を合成する能力をすでに保有している微生物の培養増殖
により、インジゴの生成を可能ならしめるものであるこ
とは明らかである。 このことは、前記した微生物を遺
伝子工学的に形質転換することで、トリプトファナーゼ
酵素の合成をコードするＤＮＡ配列を安定裏に取り込
み、それによって、細胞のトリプトファンを処理してジ
オキシゲナーゼ酵素の作用を受けるように、インドール
基質に変換することで実現される。 微生物の内在性の
トリプトファナーゼ合成能力を、トリプトファナーゼ遺
伝子の多数の「余分の」コピーを挿入することによって
増大させる場合と同様に、選択された宿主細胞の内在性
のジオキシゲナーゼ合成能力を、「インジゴ・オペロ
ン」を含むプラスミドの多数のコピーを挿入して増大さ
せることには、多くの利点がある。 【００５０】目下のところ、本発明におけるこの態様を
実施するために最も好適な宿主細胞として、先にジオキ
シゲナーゼ遺伝子の適切な供給源として述べた、シュー
ドモナス・ピュチダ、すなわち、PpG7、NCIB 9816、「T
OL」、および39/Dが挙げられる。 【００５１】本発明の望ましい実施態様を示して本発明
を説明してきたが、本発明に関する先の実施例での開示
を考慮すれば、当業者が変更や修正を想到することは可
能であろう。
染料の製造、特に、インドールが存在しない培地での微
生物の培養を利用した染料の製造ならびにその生成物に
関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】イン
ジゴまたはインジゴチンは、アジア、東インド、アフリ
カ、および南アメリカに生育する多くの植物において、
配糖体として存在し、長年にわたって青色染料として使
用されてきた。 インジゴは、主に、インジゴフェラ(I
ndigofera)属およびイサタス(Isatus)属の植物から得ら
れ、最も古いものとして知られる織物、すなわち、紀元
前2000年に埋葬されたミイラのリネン巻布を青色に染め
るために使用されている。 19世紀の中頃には、インジ
ゴは、欧州と東洋の交易の主要品目となった。 インジ
ゴ分子の構造の解明と合成に成功する以前は、天然のイ
ンジゴを使用するために、長時間の発酵工程を経て、染
料を、可溶性・無色のインジカンの形態で遊離させて、
織物に浸透させていた。 織物とインジカンをバットの
中に浸漬すれば、可溶性のインジカンは、容易にグルコ
ースとインドキシルに加水分解する。 そして、空気に
曝す等による弱い酸化によって、インドキシルはインジ
ゴに変化し、織物の繊維内で、色素が再生する。 【０００３】19世紀には、この有用な化合物の構造を解
明するために、多大な努力が払われた。 化学式 C16H
10N2O2 に対応するインジゴの化学構造は、アドルフ・
フォン・バイアー(Adolf von Baeyer)によって、その18
年にわたるこの染料の研究の後に、1883年に発表され
た。 今日もなお、苛性ソーダとナトリウムアミドの混
合物に、フェニルグリシネート・ナトリウムを融解し
て、インドキシルの合成を行う方法が、世界中で使用さ
れている。 産業的に成功した方法はいずれも、インド
キシルを空気酸化させてインジゴに転化するための最終
工程を有している。これまで、インジゴは主に、木綿あ
るいは毛織物を濃紺色の色合に染めるために使用されて
いた。 そして、この化合物については、太陽エネルギ
ーを集める方法に適用できる可能性が示唆されている
（英国特許 No. 1,554,192を参照のこと）。 【０００４】微生物による青色色素の生成に関する従来
の知見が、本発明の背景と関連がある。 ある研究者
が、1927年に、選択的培養法を用いて、インドールを分
解して青色の結晶を形成することができる土壌微生物シ
ュードモナス・インドロキシダン(Psudomonas indoloxi
dans) 菌を分離している。 この細菌の培養にて認めら
れた青色の粒子は、水、アルコール、エーテル、キシロ
ール、およびベンゾールには溶けないが、濃硫酸に溶け
て、青色溶液となり、この液を用いて絹を青色に染めて
いる。 この研究者は、インドキシルは、この微生物の
細胞内で形成されるものではなく、青色結晶の形成が、
増殖した細菌から放出される細胞外酵素の産生によるも
のであると結論している。 この微生物は、エネルギー
源としてインドールを用いることができず、加えて、炭
素源を補充しないと、インドールをインジゴチンに酸化
することもできなかったが、炭素が供給されれば、イン
ドールを酸化することが可能となる。 窒素に対する炭
素の比率が高くなれば、シュードモナス・インドロキシ
ダン菌の増殖と、インジゴチンの生成に適するようにな
るようである。 【０００５】さらに、この研究者が行った観察によれ
ば、インドールはこの微生物の成長を抑制するらしく、
インドールが消費されるとすぐに、微生物は急速に増殖
した。インドールの酸化は、この微生物の増殖の初期段
階にのみ起きることが観察された。 培養中にはインド
キシルは全く認められず、インジゴチンがさらに酸化さ
れてイサチンになることはないようであった。 この研
究者は、その他の２種類の土壌微生物、ミコバクテリウ
ム・グローベラルム(Mycobacterium globerulum)および
マイクロコッカス・ピルトネシス(Micrococcus piltone
sis)も、インドール細菌培養基上でのみ、少量のインジ
ゴチンを生成することを報告している〔Grey, P.H.,
「土壌細菌によるインドールからのインジゴチンの生
成」、Roy.Soc. Proc., B, 102: pp.263-280 (1927年)
を参照のこと〕。 【０００６】「青色色素」を生成するシゾフィラム・コ
ミューン(Schizophyllum commune)菌類の単一突然変異
体培養についても報告がある。 この培養では、グルコ
ース、(NH4)2HPO4、チアミン、KH2PO4、K2HPO4、および
MgSO4・7H2Oを含む化学的な性質が明らかな合成培地が
使用されている。 アンモニウムイオンが、その窒素源
であった。 赤と青の両方の色素が、菌糸浸出物から採
取された。 この浸出物から、クロロホルムを用いて抽
出した青色色素が何であるかは、溶解度試験、吸収分光
試験、および化学分析によって確認された。 これらの
試験の結果はすべて、青色の色素がインジゴであるとい
う結論で一致していた〔Miles, P. et al.,「シゾフィ
ラム・コミューンの突然変異体の培養から生成された色
素としてのインジゴの確認」、Archives of Biochemist
ry and Biophysics, 62: pp.1-5(1956年）を参照のこ
と〕。 【０００７】1962年に、微生物クロモバクテリウム・バ
イオラシム(Chromobacterium violaceum)による色素バ
イオラセインの生合成に関する研究が実施され、この微
生物が、L-トリプトファンを容易にバイオラセインに変
換したが、このアミノ酸を増殖には利用しなかった。
研究者らは、L-トリプトファン専用の新規の微生物定量
法を考案したが、この方法では、生成されたL-トリプト
ファンの量は、試料中のL-トリプトファンの量との間に
関数の関係があった。 具体的には、凍結乾燥した細胞
と共に、L-トリプトファンをインキュベートすると、イ
ンドールが一時的に形成され、48時間のインキュベーシ
ョンの後には、濃い青色色素が合成された。 着色物質
は、その色彩、吸収スペクトル、および薄層クロマトグ
ラフィーの移動度から、インジゴであることが判明し
た。 研究者らは、インドキシルが、この細菌内でのイ
ンジゴ合成経路の中間体であるとの結論に達し、さら
に、トリプトファナーゼ、すなわち、トリプトファン合
成酵素の働きにより、クロモバクテリウム・バイオラシ
ムは、L-トリプトファンをインドールに変化することを
知見するに至ったのである。 この微生物は、L-トリプ
トファンからだけではなく、インドールからもバイオラ
セインを合成した。 バイオラセイン合成経路での酵素
を、急速な凍結乾燥により不活性化すると、L-トリプト
ファンとインドールは、いずれもインジゴに変化した
〔Sebak, O. and Jaeger, H., 「クロモバクテリウム・
バイオラシム」におけるインドール代謝の分岐経路」、
Nature,196:pp.793-795 (1962年) を参照のこと〕。 【０００８】さらに最近の報告によると、研究者たち
は、インドールを炭素および窒素の唯一の供給源として
用いた培養法により、土壌からある微生物を分離した。
インドール、KH2PO4、K2HPO4、NaCl、MgSO4 、水およ
び酵母エキスを含んだ培地で成長させると、急速にイン
ドールを分解するある好気性グラム陽性球菌は、培地中
に放出されない青色色素を生成した。 培地中のインド
ールは急速に消費されることがわかり、培養期間中に数
回、インドールが加えられた。 回収した細胞は、新鮮
な青色を呈しており、基質１モルにつき11〜13個の酸素
原子を消費してインドールを分解した。 この微生物の
培養に、インドールに代えてアントラニル酸、グルコー
スあるいはグリセリンを用いると、細胞はインドールの
分解能力を示さず、その活性が誘導的であることを示し
た。 インドールを用いて増殖させると、この微生物
は、インドールを、オキシインドール、アントラニル
酸、およびカテコールに分解した。 この微生物の無細
胞抽出液は、酵素のジオキシインドール、オキシゲナー
ゼを含み、この酵素は、ジオキシインドールのアントラ
ニル酸塩と二酸化炭素への変換の触媒作用を呈した。
このジオキシインドール・オキシゲナーゼは、微生物
を、インドールを用いて増殖する場合にのみ現れる誘導
酵素であることが確認された。 これら研究者が提唱し
たインドールの分解経路は、インドール−インドキシル
−ジオキシインドール−アントラニル酸−カテコールで
あった〔Fujioka, M. and Wada, H.,「細菌によるイン
ドールの酸化」、Biochemica et Biophysica Acta, 15
8: 70-78 (1968年) を参照のこと〕。 【０００９】これまで、上記した微生物のいずれもが、
インジゴの大規模な微生物による合成のために用いられ
たことはなかった。 これは、主に、インドールを基質
として供給したり、あるいは増殖培地の厳密な栄養バラ
ンスを保持するために要する、経済的要因によるものと
考えられる。 【００１０】動物の腸内に固有の腸内細菌（例えば、大
腸菌）は、トリプトファナーゼ構造遺伝子により生成さ
れる酵素である、トリプトファナーゼの活性により、イ
ンドールを蓄積することができる〔例えば、Post et a
l., P.N.A.S. USA, 76: 1697-1701 (1979) を参照のこ
と〕。 トリプトファナーゼは、トリプトファンの分解
において触媒作用を呈し、インドール、ピルビン酸塩、
およびアンモニアの化学量論的生成を生じる。 関連酵
素であるトリプトファン合成酵素も、インドール・グリ
セロール燐酸およびセリンから、トリプトファンを合成
する際の触媒となる。 大腸菌でのトリプトファナーゼ
の合成は、トリプトファンによって誘導可能である。
Escherichia coli K12 のトリプトファナーゼの構造遺
伝子tnaAは、クローンが作成されて、その配列が明らか
にされている。 Deeleyet al.,「Escherichia coli K1
2 のトリプトファナーゼの構造遺伝子のヌクレオチド配
列」, J. Bacteriology, 147; pp.787-796 (1981年) 、
およびDeeley et al.,「Escherichia coli K12 のトリ
プトファナーゼ・プロモーターでの転写の開始」, J.Ba
cteriology, 151; pp.942-951 (1982年) を参照のこ
と。 腸内細菌は、単純な培地でも成長できるが、イン
ドールをインジゴに変換する酵素的手段は有していな
い。 【００１１】本発明の背景に特に関連があるのは、本願
発明者による、「芳香族炭化水素の微生物による酸化の
方法と物質」なる名称の、1982年９月20日に出願された
米国特許出願No.419,953であり、当該出願を先行技術と
して、本明細書に組み込んだ。当該出願では、特に、ナ
フタレンをサリチル酸塩へ酸化分解する酵素を宿主微生
物にて発現するコードを決定するシュードモナス・ピュ
チダ(Pseudomonas putida)菌由来のＤＮＡ配列を含んだ
プラスミドpE317 について言及されている。具体的に
は、当該出願は、大腸菌等の微生物を形質転換して、通
常は、ナフタレン等の芳香族化合物の微生物による無機
化において過渡的に形成される有用な中間生成物を選択
的に生成かつ蓄積する能力を付与するために、pE317 お
よびその他のプラスミドを使用することを開示するもの
である。 【００１２】プラスミドpE317 がコードする酵素には、
ナフタレン・ジオキシゲナーゼが含まれる。 この酵素
は、ナフタレンのシス-1,2- ナフタレン・ジヒドロジオ
ールへの転換のための触媒作用を行う。 本発明者およ
び共同研究者は、シュードモナス(Pseudomonas sp.) NC
1B 9816菌から得た多成分酵素系におけるナフタレンの
酸化に関する徹底的な研究を以前に実施し〔Ensley et
al., J. Bacteriology, 149; pp. 948-954 (1982年) を
参照のこと〕、ナフタレンの酸化における最初の反応
が、三つのタンパク質成分から構成される酵素系に関係
するものであるとした。 【００１３】従って、インドールを合成し、蓄積するこ
とができる、ある種の微生物およびインジゴ合成の基質
としてインドールを用いる能力を有するその他の微生物
が存在することが明らかにもかかわらず、当該技術分野
においては、微生物を用いてインジゴを生成するための
効率の良い方法に関する、信頼のできる説明はなされて
いなかったのが実情である。 【００１４】 【課題を解決するための手段】本発明は、インドールが
存在しない培地で増殖する遺伝子工学的な形質転換を行
った微生物におけるインジゴ生成の、最初の手段を提供
するものである。 【００１５】本発明の態様の一つとして、本発明は、イ
ンドールを生成、蓄積する代謝能力を有する選択された
微生物にて、インジゴを微生物学的に生成するための方
法を提供する。 この方法は、一種以上の芳香族ジオキ
シゲナーゼ酵素を合成する能力を有するように、微生物
を、遺伝子操作して安定裏に形質転換を行うことを含
む。 本発明において使用できるジオキシゲナーゼ酵素
は、微生物による芳香族炭化水素のシスヒドロキシオー
ルへの酸化転換のための触媒となる。 形質転換された
微生物は、インドールの酸化転換のための触媒となる、
ジオキシゲナーゼ酵素の触媒作用を促進する条件下で増
殖される。 予測される酸化転換反応生成物は、シス−
インドール-2,3- ジヒドロジオールである。 次に、こ
の生成物は、インドキシルに転位されるものと考えら
れ、そして、インドキシルは空気の存在下で縮合してイ
ンジゴとなる。 そして、インジゴは、微生物あるいは
その増殖培地から分離される。 【００１６】現時点で最も好ましい態様の一つにおい
て、インドールを生成、蓄積する代謝能力をすでに有す
る微生物内でのインジゴの微生物学的製造は、大腸菌を
宿主細胞として用いることで実現できる。 遺伝子操作
による形質転換には、シュードモナス・ピュチダのナフ
タレン無機化プラスミドnah7から得た、シュードモナス
菌由来の芳香族ジオキシゲナーゼであるナフタレン・ジ
オキシゲナーゼの発現をコードするＤＮＡ配列を含んだ
ＤＮＡベクターによる形質転換が含まれる。 この目的
に適切なベクターが、米国特許出願 No. 419,953に記載
されたpE317 である。 【００１７】本発明の方法に、トリプトファナーゼ酵素
を合成する能力を持つように、安定的にかつ遺伝子的に
微生物を形質転換する工程、そして、トリプトファンを
ピルビン酸塩とインドールに分解するトリプトファナー
ゼ触媒分解を促進する条件下で、微生物を増殖する工程
を追加することができる。 トリプトファナーゼ酵素な
らびに芳香族ジオキシゲナーゼ酵素を合成する能力を発
生（あるいは、促進）するための宿主微生物の遺伝子操
作による形質転換は、両方のタイプの酵素をコードする
ＤＮＡ配列を含む、単一のＤＮＡベクターを用いて形質
転換を行うことにより実現できる場合がある。 【００１８】このように、本発明は、インドールを生
成、蓄積する代謝能力を有さない選択された微生物にお
いて、また、前記した能力を有する微生物において、イ
ンジゴを当該微生物によって製造する方法を提供する。
「複合的に形質転換された」微生物は、トリプトファ
ンからインドールへの転換のためのトリプトファナーゼ
酵素触媒作用と、細胞内でさらに「処理」されてインジ
ゴに転換する、インドールの酸化形態へのジオキシゲナ
ーゼ酵素触媒酸化転換を、共に促進する条件下で増殖さ
せることができる。 インジゴは、その後に、微生物お
よび／または培地から分離することができる。 【００１９】従って、本発明は、微生物による芳香族ジ
オキゲナーゼ酵素とトリプトファナーゼ酵素との合成の
ためのコードを定めるＤＮＡ配列を含む新規のＤＮＡ形
質転換ベクターをさらに提供する。 「インジゴ・オペ
ロン」は、単一ベクターに組み込んでも良く、そのオペ
ロンにおいては、トリプトファナーゼとジオキシゲナー
ゼの両方の酵素のコード領域は、単一のプロモーター／
レギュレーターによって制御される。 オペロンのプロ
モーター／レギュレーターは、微生物宿主において、両
酵素を同時に機能させることを可能にし、トリプトファ
ンからインドール、そして、インドールからシス−イン
ドール-2,3- ジヒドロジオール、そして最終的に、イン
ジゴへの連続的な触媒作用を引き起こす微生物の「シン
ク」を生成する。 プロモーター／レギュレーターは、
誘導物質あるいは培養温度の変化に敏感であることが好
ましい。 【００２０】本発明のさらに別の態様によると、一種以
上のジオキシゲナーゼ酵素を合成する（ゲノムあるいは
プラスミドを担体とするＤＮＡ配列の発現による）能力
を有する微生物は、インドールが存在しない培地で増殖
するとインジゴを生成する能力を有するように、遺伝子
的に変更される。 このような遺伝子的な変更は、トリ
プトファナーゼ酵素を合成する能力を付与するための、
安定した形質転換を伴う。 【００２１】本発明のその他の態様および利点は、以下
に例示的に示した実施例の開示から明らかである。 【００２２】 【実施例】本発明の好適な実施態様における方法および
物質は、特に、シュードモナス・ピュチダ菌由来のプラ
スミドを担体とするＤＮＡ配列に関係し、これら配列
は、所望のインドール生成宿主微生物、例えば、大腸菌
を形質転換するために用いることができる。 この実施
態様での方法とＤＮＡ形質転換ベクターにより形質転換
された細胞は、ＤＮＡ配列を最初のジオキシゲナーゼ酵
素（あるいは、酵素系）の合成の形態で発現し、この酵
素は、蓄積されたインドールを、シス−インドール-2,3
- ジヒドロジオールに変換することが可能である。 次
に、ジヒドロジオールは転位してインドキシルを形成
し、インドキシルも選択された宿主微生物内に蓄積す
る。 後者の生成物は、空気の存在下でインジゴに変換
される。 【００２３】本発明を実施する上で有用なジオキシゲナ
ーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列は、芳香族炭化水素の
シス−ジヒドロキシジオール型への微生物による酸化変
換のための触媒となる一つ以上の酵素を合成・蓄積する
能力を有する微生物に組換方法を適用して入手してもよ
い。 本発明に使用するＤＮＡ配列を特に供給する必要
があると考えられるものは、増殖培地に供給されたイン
ドールをインジゴに変換する能力を有することが経験的
に確認された微生物である。 このような微生物の一つ
が、遺伝子操作可能なナフタレン分解プラスミドnah7を
含むシュードモナス・ピュチダPpG7である。 この微生
物は、米国特許出願 No. 419,953に開示した芳香族炭化
水素の酸化のための選択的方法のために使用されたプラ
スミドpE317 の親株である。 シュードモナス・ピュチ
ダ(Pseudomonas putida) NC1B 9816も適切なＤＮＡ配列
をもたらすものと考えられ、これはnah7に似通った（そ
して、おそらく同一の）遺伝子操作可能なナフタレン分
解プラスミドを含んでいる。 これらの微生物はいずれ
も、それらの増殖培地の成分としてインドールが供給さ
れると、インジゴを生成することが、これまでに観察さ
れている。 【００２４】さらに本発明の実施において、ジオキシゲ
ナーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の有用な供給源にな
ると考えられるものは、ナフタレン以外の芳香族炭化水
素（例えば、トルエン、ベンゼン等）を酸化・無機化す
る能力を有する微生物であり、酵素をコードする遺伝子
の担体がプラスミドであるかゲノムであるかは関係な
い。 このような微生物の例として、 Yeh et al., Bio
chem. & Biophys. Res.Comm., 78: 401-410 (1977) に
記載のシュードモナス・ピュチダ「TOL 」、および Gib
son et al., Biochem., 9: 1626-1630 (1970) に記載の
シュードモナス・ピュチダ39/Dを挙げることができる。
これらの微生物はいずれも、トルエンの酸化による生
成物としてのシス−トルエン-2,3- ジヒドロジオールの
形成において触媒作用を呈するジオキシゲナーゼ酵素を
合成する能力を有する。 これらの微生物はいずれも、
それらの増殖培地の成分としてインドールが供給される
とインジゴを生成する能力が付与されることが、すでに
観察されている。 【００２５】ジオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ
配列が適当なベクターによって、自らトリプトファナー
ゼ酵素を有する微生物、例えば、大腸菌が形質転換され
ると、この微生物はトリプトファンからインジゴを生成
することができるようになる。 【００２６】以下の実施例では、(1) アンピシリンを含
んだ組成が明確な培地での増殖の際に、本発明のベクタ
ーを有する微生物によって生成された青色色素の同定、
(2)ＤＮＡベクターのＤＮＡコード領域により生成され
たナフタレン・ジオキシゲナーゼ酵素が、大腸菌の菌体
内で生成されたインドールと反応していることの確認、
および(3) 組換大腸菌によるインジゴ合成の速度の測定
について開示した。 【００２７】実施例１ プラスミドpE317 を以下のようにして、プラスミドnah7
から調製した〔米国特許出願 No. 419,953の実施例４を
参照〕。 プラスミドnah7〔Yen & Gunsalus,Proceedin
gs of the National Academy of Sciences, U.S.A., 7
9, pp. 874-878(1982)〕を、ハンセンとオルソンのアル
カリ性ナトリウムドデシル硫酸法〔Journal of Bacteri
ology, 135, pp. 227-238 (1978)〕によって、シュード
モナス・ピュチダPpG7(A.T.C.C. 17485)から単離し、そ
して、HindIII で完全消化した。 【００２８】HindIII 消化したnah7ＤＮＡ断片を、Hind
III 切断したプラスミドpBR322(A.T.C.C.37017)に連結
した。 得られたプラスミドを、Escherichia coli HB1
01に形質転換し、これを200mg/mlのアンピシリンを含む
Ｌ−寒天プレートにて24時間成長させた後、コロニーを
24〜48時間かけてナフタレン蒸気にさらし、そして、ナ
フトキノンの生成により認められるナフタレン代謝によ
る褐変を観察することによって、ナフタレン代謝能力に
ついてコロニーをスクリーニングした〔Shamsuzzamon a
nd Barnsley, Biochemistry and Biophysics Research
Communications, 60, pp.582-589 (1974) 〕。 【００２９】21000 塩基対の大きさのプラスミドを、褐
色コロニーから単離した。 HindIII切断した時に、4400
塩基対と 16500塩基対の大きさの断片が得られた。 165
00塩基対の断片は、ナフタレン分解酵素の合成をコード
する遺伝子を含むnah7の一部である。 16500塩基対の断
片は、EcoRI で切断されて５つの断片になった。 【００３０】プラスミドに、５つのEcoRI 切断片の少な
くともいずれかが挿入されるように、その５つの断片は
再連結され、そしてEscherichia coli HB101に形質転換
した。 【００３１】前述したようにして、コロニーをスクリー
ニングした。 二つのEcoRI 部位を有する 17300塩基対
の断片を、褐色コロニーから単離した。 この 17300塩
基対の断片を、EcoRI 切断し、精製し、EcoRI 切断した
pBR322 DNAに連結し、そして、大腸菌に形質転換した。
この組換体を、前述したようにしてスクリーニングし
た。 このようにして、pBR322からの4400塩基対と、ナ
フタレンからサリチル酸への代謝に必要な遺伝子を含む
挿入体である 10900塩基対から構成される、前出の 153
00塩基対のpE317 を得た。 【００３２】そして、大腸菌がpE317 によって形質転換
し、 200μg/mlのアンピシリンを含むルリアブロスにて
増殖すると、一晩のインキュベーションの後に、青色色
素が培養培地および細胞内に生成されているのが観察さ
れた。 【００３３】青色色素を以下の方法によって精製し、次
いで同定した。 pE317を保有する大腸菌 HB101を、18
時間にわたって、0.25％グルコース、25mg/Lのプロリン
とロイシン、そして、2.0mg/L アンピシリンを補充し
た、10g/L K2HPO4、3.5g/L Na(NH4)HPO4・4H2O、2.0g/L
クエン酸・H2O、0.2g/L MgSO4・7H2Oから構成される250
mlの無機培地を入れた２つの１Ｌフラスコ内にて増殖し
た。 フラスコを、250rpmで振とうし、かつ30℃に保っ
た。 【００３４】増殖の後に、細胞は、培地から遠心分離法
によって分離し、濃青色の細胞ペレットと透明な淡黄色
の上澄が得られた。 細胞ペレットは、25mlの沸騰クロ
ロホルムによって８回にわたって抽出した。 有機抽出
物はまとめて、アルゴンガスの流れの下で、10mlに減容
された。 そして、有機抽出物を、無水硫酸ナトリウム
によって乾燥し、クロロホルム中ですでに平衡化したシ
リカゲル60カラム(2.5×５cm) の頂面に置いた。 青色
色素を、クロロホルムによってカラム内で洗浄し、4.0m
l の留分を得た。 青色色素を含む留分は、クロロホル
ム：酢酸：メタノール〔40：２：1(容積／容積）〕の溶
媒系で展開した薄層クロマトグラフィー用シート（EM試
薬、シリカゲル60F 254)上のクロマトグラフィーによっ
て純度を検定した。 薄層クロマトグラフィーによる分
析の後に、単一紫外線吸収スポットを含む、これらの青
色の留分を一括して、真空条件下にてその溶媒を除去し
た。この方法の結果、26mgの濃青色の結晶が得られた。
結晶を少量のクロロホルムに溶解して、分析した。
そして、この青色色素は、合成インジゴ(Kodak社）のク
ロマトグラフィー特性、可視光線ならびに紫外線照射、
質量分析、および赤外線スペクトルと同一の結果を示し
た。 このデータは、組換大腸菌を上述した条件下で増
殖する際に、インジゴが生成されたことを示すものであ
る。 【００３５】実施例２ クローニングされたナフタレン・ジオキシゲナーゼ遺伝
子から合成された酵素が、大腸菌菌体内に生成されたイ
ンドールと反応しているとする指摘は、以下の観察と符
合する。 【００３６】(1) 何度か非選択培地〔すなわち、アンピ
シリンを含まない〕にて連続して培養した後に、組換微
生物は、インジゴを生成する能力を喪失する。 これら
の培養において、ナフタレンを酸化する能力の有無につ
いて分析すると、ナフタレンを酸化する活性も併せて失
われていることがわかる。 【００３７】形質転換されない大腸菌は、青色色素を生
成することができないので、これらの実験は、青色色素
の形成においてナフタレン・ジオキシゲナーゼ遺伝子が
不可欠であることを実証している。 【００３８】(2) 組換大腸菌を、10mMのトリプトファン
あるいは１mMのインドールを補充した培養培地で増殖す
ると、青色色素の形成は促進される。 【００３９】(3) 組換大腸菌が、１％グルコースを補充
した培地で増殖すると、青色色素の形成は観察されな
い。 高レベルのグルコースは、大腸菌内のトリプトフ
ァーゼ合成の異化抑制を招く〔Botsford, J.L. & R.D.
DeMoss, J. Bacteriol. 105:303-312 (1971)〕。 【００４０】(4) Nah7プラスミドに関するナフタレン・
ジオキシゲナーゼ遺伝子を有するシュードモナス・ピュ
チダPpG7を、培養培地にてインドールと共にインキュベ
ートすると、青色色素の形成が認められた。 この微生
物は、トリプトファナーゼ酵素系を有さず、通常の代謝
ではインドールを生成しない。 【００４１】実施例３ 組換大腸菌によるインジゴの合成割合が、以下の手順で
測定された。 形質転換した大腸菌と、形質転換してい
ない大腸菌を、実施例１で述べた無機培地を入れた２つ
のフラスコ内で増殖した。 形質転換していない大腸菌
の増殖のために用いた無機培地からは、アンピシリンを
除去した。 微生物の増殖は、500nm にて吸光度を測定
することで観察した。 インジゴの合成は、種々の時間
間隔で、各培養液から1.0mlの試料を採取することによ
って観察した。 培養液を、2.0mlの酢酸エチルを用い
て抽出し、エマルジョンを分別するために遠心分離を行
い、上層の一部（酢酸エチル）をキュベットに移した。
各有機抽出物の 600nmでの真吸光度を測定した。 イ
ンジゴは、酢酸エチル内において、 600nmで可視吸収極
大を示すことが経験的に認められた。 増殖中に容易に
測定できるインジゴの合成が、形質転換された大腸菌を
含む培養液では認められたが、形質転換されていない大
腸菌を含む培養液においては、インジゴの合成は認めら
れなかった。 【００４２】前記したそれぞれの例は、用いた大腸菌細
胞内の内在性トリプトファナーゼ酵素が、トリプトファ
ンをインドール（そして、おそらく、ピルビン酸とアン
モニア）に変換することを実証している。 ナフタレン
・ジオキシゲナーゼの微生物による合成をコードするＤ
ＮＡ配列を含むＤＮＡベクターを用いた大腸菌の形質転
換の結果、芳香族ジオキシゲナーゼが細胞内で生成され
る。 本発明の実施において、インドールからインジゴ
への変換の際に形成される中間体は、未だ何ら決定され
ていない。 しかしながら、ジオキシゲナーゼ酵素が触
媒作用をするインドールへの変換の最初の生成物は、シ
ス−インドール-2,3- ジヒドロジオールであると考えら
れる。 ジオールの転位反応は、インドキシルを生成
し、そして、空気存在下でのインドキシルの縮合によっ
てインジゴが生成される。 【００４３】このような手順を経て形成されるインジゴ
の量は、トリプトファナーゼ酵素をコードするＤＮＡ配
列を、安定裏に取り込むように、微生物をさらに形質転
換すれば、大幅に増加させることができる。 前出のDe
eley et alの文献を参照。 【００４４】大腸菌は、大腸菌自体のトリプトファナー
ゼ酵素コード領域を有しているが、その領域およびその
調整メカニズムは染色体にあり、１細胞当たり１つのコ
ピーをもたらすに過ぎない。 コピー数の多いＤＮＡプ
ラスミド・ベクターにおいては、トリプトファナーゼ酵
素コード領域の多くのコピーが分散することができ、ト
リプトファンからインドールへ、効率良く、高い変換率
にて変換することができる。 このトリプトファンの代
謝の増大は、大腸菌の内在性トリプトファン合成酵素調
整機構を活性化して、インドール・グリセロール燐酸塩
およびセリンを、トリプトファンに変換すると考えられ
る。 トリプトファナーゼ酵素およびジオキシゲナーゼ
酵素のＤＮＡベクターコード領域が、同じＤＮＡベクタ
ー上にあり、かつ同じプロモーターで制御されている場
合には、それらは同時に活性化される可能性がある。
このようなベクターを保有する大腸菌細胞が、最適レベ
ルにまで成長すると、プラスミドの両酵素をコードする
領域は同時に活性化されて、細胞内のトリプトファン
を、インドールとピルビン酸塩に、そして、インドール
をインドキシリンに、そして、最終的にインジゴに至る
まで、細胞内に生成されたトリプトファンがすべて消費
されるまで、変換を続ける。 そうして生成されたイン
ジゴは、しばしば培地において、そして、細胞中で結晶
となり、簡単な化学的および物理的な方法で取り出すこ
とができる。 【００４５】宿主微生物が、インドールを生成、蓄積す
る内在的な代謝能力を有していない場合、トリプトファ
ナーゼ酵素および芳香族ジオキシゲナーゼ酵素のための
コードを有するＤＮＡベクターによる微生物の形質転換
は、まず、微生物にトリプトファンをインドールに、そ
して、インドールをインジゴに変換する能力を付与する
ように機能する。 【００４６】望ましい態様によると、本発明の「インジ
ゴ・オペロン」ＤＮＡ形質転換ベクターは、プロモータ
ー／レギュレーターに同時的に制御されるトリプトファ
ナーゼ酵素およびジオキシゲナーゼ酵素のコード領域を
共に含む。 このようなインジゴ・オペロンの一つは、
pE317 のように、シュードモナス・ピュチダのナフタレ
ン無機化プラスミドnah7の小さな部分から構成され、そ
れは、ナフタレンジオキシゲナーゼ酵素の発現を調整す
る能力を備えたオペロンを有するＤＮＡ断片を含む。
ＤＮＡ形質転換ベクターには、ジオキシゲナーゼ遺伝子
と共に、前出のDeeley et alの文献に記載されているよ
うな、トリプトファナーゼ酵素コード領域が存在する。 【００４７】このようなインジゴ・オペロンの作成にお
いて潜在的に役立つ、温度感受性のプロモーター／レギ
ュレーターの一例が、cI857 の制御下にあるλPLファー
ジである。 この極めて効率の良いプロモーター(PL)
は、γリプレッサータンパク質cIによって調製でき、γ
リプレッサータンパク質cIは、大腸菌γ溶原菌内で自生
的に調製される生成物である。 突然変異体リプレッサ
ータンパク質cI857 は、32℃を下回る温度では、PLプロ
モーターを不活性化する。 32〜41℃の間の温度では、
cI857 は不活性化され、それによってPLプロモーターの
制御下で転写を開始する。 Shimataka, H. et al., Na
ture, 292: 128-131 (1981)、およびSussman, R. et a
l., Acad. Sci. Paris, 254: 1517-1519 (1962) を参照
のこと。 【００４８】細胞の成長および遺伝子の発現調製におい
て、温度に鋭敏なプロモーター／レギュレーターを用い
ることの利点は極めて明白であるが、トリプトファナー
ゼおよび／またはジオキシゲナーゼの活性の低下とい
う、潜在的な欠点に照らして考慮しなければならない。 【００４９】 【発明の効果】上記実施例および関連する説明は主に、
インジゴの生成に関係する方法で、インドールを「処
理」する遺伝子工学的手段を有さない、すなわち、適切
なジオキシゲナーゼ酵素を合成する能力を有さない微生
物による、インジゴの生成に関するものである。 当業
者からすれば、本発明が、適切なジオキシゲナーゼ酵素
を合成する能力をすでに保有している微生物の培養増殖
により、インジゴの生成を可能ならしめるものであるこ
とは明らかである。 このことは、前記した微生物を遺
伝子工学的に形質転換することで、トリプトファナーゼ
酵素の合成をコードするＤＮＡ配列を安定裏に取り込
み、それによって、細胞のトリプトファンを処理してジ
オキシゲナーゼ酵素の作用を受けるように、インドール
基質に変換することで実現される。 微生物の内在性の
トリプトファナーゼ合成能力を、トリプトファナーゼ遺
伝子の多数の「余分の」コピーを挿入することによって
増大させる場合と同様に、選択された宿主細胞の内在性
のジオキシゲナーゼ合成能力を、「インジゴ・オペロ
ン」を含むプラスミドの多数のコピーを挿入して増大さ
せることには、多くの利点がある。 【００５０】目下のところ、本発明におけるこの態様を
実施するために最も好適な宿主細胞として、先にジオキ
シゲナーゼ遺伝子の適切な供給源として述べた、シュー
ドモナス・ピュチダ、すなわち、PpG7、NCIB 9816、「T
OL」、および39/Dが挙げられる。 【００５１】本発明の望ましい実施態様を示して本発明
を説明してきたが、本発明に関する先の実施例での開示
を考慮すれば、当業者が変更や修正を想到することは可
能であろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:40）
(Ｃ１２Ｐ 17/16
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 17/16
Ｃ１２Ｒ 1:40）
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．トリプトファナーゼ酵素を産生する宿主微生物にイ
ンジゴを生成する代謝能力を付与するＤＮＡ形質転換ベ
クターであって、該ベクターが、シュードモナス・ピュ
チダ（Pseudomonas putida）の遺伝子から取得したナフ
タレン・ジオキシゲナーゼのコード領域を含む、ことを
特徴とするＤＮＡ形質転換ベクター。 ２．前記宿主微生物が、大腸菌である請求項１に記載の
ＤＮＡ形質転換ベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6250573A JP2871483B2 (ja) | 1994-10-17 | 1994-10-17 | 微生物によるインジゴ生成のためのｄｎａ形質転換ベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6250573A JP2871483B2 (ja) | 1994-10-17 | 1994-10-17 | 微生物によるインジゴ生成のためのｄｎａ形質転換ベクター |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58503567A Division JP2560001B2 (ja) | 1982-10-27 | 1983-10-27 | 微生物によるインジゴの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0833487A JPH0833487A (ja) | 1996-02-06 |
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Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
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-
1994
- 1994-10-17 JP JP6250573A patent/JP2871483B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７９（３）（１９８２），ｐ．８７４−８７８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0833487A (ja) | 1996-02-06 |
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