JP2869759B2 - Hepatitis C virus inspection method and primer set used therefor - Google Patents
Hepatitis C virus inspection method and primer set used thereforInfo
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの検
査方法に関する。さらに詳しくはＣ型肝炎ウイルスの５
種類のサブタイプの簡易な決定法およびそれに用いるプ
ライマーセットに関する。The present invention relates to a method for testing hepatitis C virus. More specifically, hepatitis C virus 5
The present invention relates to a simple method for determining subtypes and a primer set used for the method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルスには、現在少なくとも
５種類のサブタイプ (Pt, K1, K2a, K2b, Tr) が存在す
ると推定されている。日本におけるこれらのサブタイプ
の頻度はK1：73.4％、 K2a：16.5％、 K2b：6.９％、T
r：0.５％、Pt：0.５％である。これらのサブタイプ
は、地域的に分布が異なり、Ｃ型肝炎の血清疫学的研
究、遺伝進化学的研究に重要な因子であると考えられ
る。さらにＣ型慢性肝炎のインターフェロン療法におい
て、これらのサブタイプによりインターフェロンの治療
効果が異なると考えられており、治療のスケジュールを
発展させてゆく上で、あるいは治療後の予後を推定する
上で重要な地位を占めると考えられる。BACKGROUND OF THE INVENTION It is currently estimated that hepatitis C virus has at least five subtypes (Pt, K1, K2a, K2b, Tr). The frequency of these subtypes in Japan is K1: 73.4%, K2a: 16.5%, K2b: 6.9%, T
r: 0.5%, Pt: 0.5%. These subtypes differ in distribution regionally and are considered to be important factors for seroepidemiological and genetic evolution studies of hepatitis C. Furthermore, in interferon therapy for chronic hepatitis C, it is thought that the therapeutic effect of interferon differs depending on these subtypes, and is important in evolving the treatment schedule or estimating the prognosis after treatment. It is considered to occupy a position.
【０００３】現在Ｃ型肝炎ウイルスのサブタイプを決定
する方法には以下の３者がある。１) Ｃ型肝炎ウイルス
のＲＮＡの塩基配列を比較し決定する方法。２) 各サブ
タイプに特異なＤＮＡをラジオアイソトープあるいはジ
ゴキシゲニンなどを用いて標識し、スロット・ブロット
・ハイブリダイゼーション（slot blot hybridizatio
n）、サザン・ブロット・ハイブリダイゼーション（Sou
thern blot hybridization)などを用いて検出する方
法。３) ｃＤＮＡをＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに
より増幅した後に、各種制限酵素により切断し、生じた
ＤＮＡ断片の多形性を比較し決定する方法。At present, there are the following three methods for determining the subtype of hepatitis C virus. 1) A method for comparing and determining the nucleotide sequence of RNA of hepatitis C virus. 2) DNA specific to each subtype is labeled with radioisotope or digoxigenin, etc., and slot blot hybridizatio
n), Southern blot hybridization (Sou
Detection method using thern blot hybridization). 3) A method in which cDNA is amplified with a DNA-dependent DNA polymerase, and then cleaved with various restriction enzymes, and the resulting DNA fragments are compared and determined for polymorphism.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記
１) の方法は、極めて長時間を要し、多数の検体の決定
には不向きであり、２) の方法は、長時間を要する上、
サブタイプを大きくふたつに分類できるにすぎない。
３) の方法は、ｃＤＮＡを複数の制限酵素で切断した後
に高濃度のアクリルアミドゲルで電気泳動する必要があ
り、長時間と熟練を要し、しかも制限酵素切断後のＤＮ
Ａ断片のパターンも必ずしも一定でないという欠点を有
する。以上の記述からも明らかなように、Ｃ型肝炎ウイ
ルスのサブタイプについて、特に多数の検体を簡易に決
定する方法に関しては、いまだ不十分であるといわざる
を得ない。従って、このサブタイプを簡易に、かつ短時
間の容易な操作で決定する方法を発明する必要があるこ
とは明らかである。However, the above method 1) requires an extremely long time and is not suitable for determining a large number of specimens, and the method 2) requires a long time.
Subtypes can only be classified into two broad categories.
The method 3) requires cleaving the cDNA with a plurality of restriction enzymes, followed by electrophoresis on a high-concentration acrylamide gel, which requires a long time and skill, and also requires the DNase after restriction enzyme digestion.
There is a disadvantage that the pattern of the fragment A is not always constant. As is clear from the above description, it cannot be said that the subtype of hepatitis C virus is still insufficient, especially with respect to a method for easily determining a large number of samples. Therefore, it is apparent that there is a need to invent a method for determining this subtype simply and with a simple operation in a short time.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記状況
に鑑み鋭意検討した結果、本発明に到達したものであ
る。すなわち、本発明は、検体から得られた核酸からｃ
ＤＮＡを合成した後、Ｃ型肝炎ウイルスサブタイプに特
異な各ＤＮＡ群から少なくとも１種ずつ選ばれたオリゴ
ＤＮＡとアンチセンスプライマーからなるミックスプラ
イマーセット、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤ
ＮＡを増幅し、次いで電気泳動しＤＮＡ断片を検出する
ことを特徴とするＣ型肝炎ウイルスの検査方法、ならび
に該検査方法に用いるプライマーセットである。Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive studies in view of the above situation, and as a result, have reached the present invention. That is, the present invention provides a method for preparing c from nucleic acid obtained from a sample.
After synthesizing DNA, a mixed primer set consisting of an oligo DNA selected from at least one of each DNA group specific to the hepatitis C virus subtype and an antisense primer, and cD using a DNA polymerase
A test method for hepatitis C virus, which comprises amplifying NA and then electrophoresing to detect a DNA fragment, and a primer set used for the test method.
【０００６】本発明は、血清中のＣ型肝炎ウイルスサブ
タイプの簡易な決定法に関するものであり、さらに詳し
くは、少量の血清を蛋白変性剤にて処理後、除蛋白して
得られた核酸 (１) に対して、ＤＮＡヘキサマーの混合
物よりなるランダムヘキサマー及びＲＮＡ依存型のＤＮ
Ａポリメラーゼ、dNTP (N=A, T, C, G) 混合物を用いて
核酸 (１) のｃＤＮＡを合成し、ついで該ｃＤＮＡに対
し、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼを用いて、各サブ
タイプに特異な下記のＤＮＡ群１−５から少なくとも１
種ずつ選ばれたオリゴＤＮＡと下記ＤＮＡ群６のオリゴ
ＤＮＡを混合してミックスプライマーセットとし、これ
を用いてｃＤＮＡを増幅し、アガロースゲルで電気泳動
後、ＤＮＡ断片を臭化エチジウムで染色し、紫外線照射
下に検出し、そのサイズを比較することにより、一段階
の操作で該ｃＤＮＡがどのサブタイプに属するものかを
簡易に決定する方法に関する。 ＤＮＡ群１ (サブタイプK1特異的) オリゴＤＮＡ S29 (5'-ACTGAGAATGACATCCGTGT-3') オリゴＤＮＡ S127 (5'-TTGGCCCCCGAGGCCAGAC-3') オリゴＤＮＡ S7 (5'-GGCATAAGGTCGCTCACAGAGC-3') オリゴＤＮＡ S121 (5'-AGGCCACTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3') オリゴＤＮＡ S21 (5'-CTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3') オリゴＤＮＡ S53 (5'-GACTTGGCCCCCGAGGCCAGACA-3') オリゴＤＮＡ S57 (5'-ACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTC-3') ＤＮＡ群２ (サブタイプK2a特異的) オリゴＤＮＡ S45 (5'-CTGCCTGAGGAGGCTCACAT-3') オリゴＤＮＡ S39 (5'-CTACGTGGGAGGGCCTATGTT-3') オリゴＤＮＡ S9 (5'-GGGGAACACCATCACATGCTACG-3') オリゴＤＮＡ S117 (5'-GCGGCTTGCCAGGCTGCAGGGATAGTTGC-3') オリゴＤＮＡ S17 (5'-TGCCAGGCTGCAGGGATAGTTGC-3') オリゴＤＮＡ S27 (5'-TGCAGGGATAGTTGCACCCTC-3') オリゴＤＮＡ S61 (5'-TATGTTCAACAGCAAGGGCCAGA-3') オリゴＤＮＡ S63 (5'-TCAGGCCTGCTCCCTGCCCG-3') ＤＮＡ群３ (サブタイプK2b特異的) オリゴＤＮＡ S37 (5'-TTCCCTGCCTCAGGAGGCTA-3') オリゴＤＮＡ S13 (5'-GCCCATGACAAACAGCAAGGGACAAT-3') オリゴＤＮＡ S11 (5'-GCTGCAGGGATCGTGGACCCTATC-3') オリゴＤＮＡ S59 (5'-GGCTTGTCCCTGCCTGAAGAGGCCA-3') ＤＮＡ群４ (サブタイプTr特異的) オリゴＤＮＡ SS1 (5'-GACCTTGAACCAGAAGCTCGTA-3') オリゴＤＮＡ SS5 (5'-GTATAACAGCAAAGGACTCC-3') オリゴＤＮＡ SS7 (5'-CCGCGCTAGCGGCGTCTTGC-3') オリゴＤＮＡ SS3 (5'-GTCTGCGGAGATGATTTGGT-3') ＤＮＡ群５ (サブタイプPt特異的) オリゴＤＮＡ S5 (5'-AGCGACATCCGTACGGAGGAGG-3') オリゴＤＮＡ S43 (5'-AATCTACCAATGTTGTGACC-3') オリゴＤＮＡ S19 (5'-CCCAAGCCCGCGTGGCCATCAA-3') オリゴＤＮＡ S41 (5'-ACTTGCTACATCAAGGCCCG-3') オリゴＤＮＡ S111 (5'-CAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACG-3') オリゴＤＮＡ S51 (5'-CGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAG-3') オリゴＤＮＡ S65 (5'-TGATCTCGACCCCCAAGCCCGCGT-3') オリゴＤＮＡ S67 (5'-GGCCCTCTTACCAATTCAAG-3') ＤＮＡ群６ (全てのタイプ用アンチセンスプライマー) オリゴＤＮＡ PL14 (5'-CTGGTCATAGCCTCCGTGAA-3') 本発明においては、Ｃ型肝炎ウイルスのサブタイプを決
定しようとする対象検体は、少量の血清である。血清は
50−100μl である。The present invention relates to a simple method for determining the hepatitis C virus subtype in serum, and more particularly, to a nucleic acid obtained by treating a small amount of serum with a protein denaturing agent and then removing the protein. (1) a random hexamer comprising a mixture of DNA hexamers and an RNA-dependent DN
A cDNA of nucleic acid (1) is synthesized using a mixture of A polymerase and dNTP (N = A, T, C, G). Then, the cDNA is subjected to DNA-dependent DNA polymerase specific to each subtype. At least one of the following DNA groups 1-5:
The oligo DNA selected for each species and the oligo DNA of the following DNA group 6 were mixed to form a mixed primer set, the cDNA was amplified using the mixed primer set, electrophoresed on an agarose gel, and the DNA fragment was stained with ethidium bromide. The present invention relates to a method for easily determining to which subtype the cDNA belongs by a one-step operation by detecting under ultraviolet irradiation and comparing the sizes thereof. DNA group 1 (subtype K1 specific) oligo DNA S29 (5'-ACTGAGAATGACATCCGTGT-3 ') oligo DNA S127 (5'-TTGGCCCCCGAGGCCAGAC-3') oligo DNA S7 (5'-GGCATAAGGTCGCTCACAGAGC-3 ') oligo DNA S121 ( 5'-AGGCCACTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3 ') Oligo DNA S21 (5'-CTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3') Oligo DNA S53 (5'-GACTTGGCCCCCGAGGCCAGACA-3 ') Oligo DNA S57 (5'-ACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTC-3') DNA group 2 K2a-specific) Oligo DNA S45 (5'-CTGCCTGAGGAGGCTCACAT-3 ') Oligo DNA S39 (5'-CTACGTGGGAGGGCCTATGTT-3') Oligo DNA S9 (5'-GGGGAACACCATCACATGCTACG-3 ') Oligo DNA S117 (5'-GCGGCTTGCCAGGCTGCAGGGATAGGC) ') Oligo DNA S17 (5'-TGCCAGGCTGCAGGGATAGTTGC-3') Oligo DNA S27 (5'-TGCAGGGATAGTTGCACCCTC-3 ') Oligo DNA S61 (5'-TATGTTCAACAGCAAGGGCCAGA-3') Oligo DNA S63 (5'-TCAGGCCTGCTCCCTGCCCG-3 ') DNA group 3 (subtype K2b specific) oligo DNA S37 (5'-TTCCCTGCCTCAGGA GGCTA-3 ') Oligo DNA S13 (5'-GCCCATGACAAACAGCAAGGGACAAT-3') Oligo DNA S11 (5'-GCTGCAGGGATCGTGGACCCTATC-3 ') Oligo DNA S59 (5'-GGCTTGTCCCTGCCTGAAGAGGCCA-3') DNA group 4 (Subtype Tr specific ) Oligo DNA SS1 (5'-GACCTTGAACCAGAAGCTCGTA-3 ') Oligo DNA SS5 (5'-GTATAACAGCAAAGGACTCC-3') Oligo DNA SS7 (5'-CCGCGCTAGCGGCGTCTTGC-3 ') Oligo DNA SS3 (5'-GTCTGCGGAGATGATTTGGT-3') DNA Group 5 (specific for subtype Pt) Oligo DNA S5 (5'-AGCGACATCCGTACGGAGGAGG-3 ') Oligo DNA S43 (5'-AATCTACCAATGTTGTGACC-3') Oligo DNA S19 (5'-CCCAAGCCCGCGTGGCCATCAA-3 ') Oligo DNA S41 (5 '-ACTTGCTACATCAAGGCCCG-3') Oligo DNA S111 (5'-CAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACG-3 ') Oligo DNA S51 (5'-CGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAG-3') Oligo DNA S65 (5'-TGATCTCGACCCCCAAGCCCGCGT-3 ') Oligo DNA S67 (5'- GGCCCTCTTACCAATTCAAG-3 ') DNA group 6 (antisense primer for all types) Oligo D In A PL14 (5'-CTGGTCATAGCCTCCGTGAA-3 ') present invention, the target analyte to be determined the subtype of hepatitis C virus is a small amount of serum. Serum
50-100 μl.
【０００７】本発明では、まず少量の血清からウイルス
ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。ウイルスＲＮＡ
の調製とｃＤＮＡの合成は当業界一般公知の方法で実施
できる。本発明においては、次に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いてｃＤＮＡの増幅を行う。使用する
ＤＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼＩ、T4ＤＮＡポリメラーゼ、Taq ＤＮＡポリメラー
ゼ、Tth ＤＮＡポリメラーゼ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ
などを使用し得る。これらのＤＮＡポリメラーゼのう
ち、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるのが好ましい。
使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、東洋紡製の Tth
ＤＮＡポリメラーゼ、プロメガ社、ボクスイブラウン
社、宝酒造社、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー社な
どから各々販売されている TaqＤＮＡポリメラーゼ、ス
トラタジーン社から発売されている PfuＤＮＡポリメラ
ーゼを使用できる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた
ＤＮＡの増幅は、Saiki R.K.らの方法 (Science, 230,
1350-1354, 1985)が開発されたが、上記のポリメラーゼ
を用いて供給社の能書に従って実施できる。In the present invention, first, viral RNA is prepared from a small amount of serum, and cDNA is synthesized. Viral RNA
Preparation and cDNA synthesis can be performed by methods generally known in the art. In the present invention, next, DNA-dependent DNA
The cDNA is amplified using a polymerase. As the DNA polymerase to be used, Escherichia coli DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, Pfu DNA polymerase and the like can be used. Among these DNA polymerases, it is preferable to use a thermostable DNA polymerase.
The thermostable DNA polymerase used is Toyobo's Tth
DNA polymerase, Taq DNA polymerase sold by Promega, Boxy Brown, Takara Shuzo, Bethesda Research Laboratories, etc., and Pfu DNA polymerase sold by Stratagene can be used. Amplification of DNA using a thermostable DNA polymerase was performed according to the method of Saiki RK et al. (Science, 230,
1350-1354, 1985), but can be performed according to the supplier's specifications using the polymerase described above.
【０００８】本発明においてはＤＮＡを増幅する際にオ
リゴＤＮＡを混合したミックスプライマーセットを用い
る。オリゴＤＮＡは、各サブタイプの特徴的な塩基配列
を示す部位にアニールするように人工的に合成する。オ
リゴＤＮＡのミックスプライマーセットとしては、前述
のＤＮＡ群１−５から少なくとも１種及びＤＮＡ群６の
種類を選んで混合して使用する。プライマーの組み合わ
せの選択により検出状況が変化し、場合によっては検出
が不能となるため、この選定組み合わせは重要である。In the present invention, when amplifying DNA, a mixed primer set in which oligo DNAs are mixed is used. The oligo DNA is artificially synthesized so as to anneal to a site exhibiting a characteristic base sequence of each subtype. As a mix primer set of oligo DNA, at least one kind of the above DNA group 1-5 and the kind of the DNA group 6 are selected and mixed for use. This selection combination is important because the detection situation changes depending on the selection of the primer combination and, in some cases, detection becomes impossible.
【０００９】本発明においてオリゴＤＮＡのミックスプ
ライマーセットとして好ましい組み合わせは、 ミックスプライマーセット６：S121, S61, S59, SS7, S
111, PL14 ミックスプライマーセット７：S57, S117, S13, SS7, S
111, PL14 および ミックスプライマーセット12：S57, S117, S13, SS7, S
65, PL14 である。In the present invention, a preferred combination as a mix primer set for oligo DNA is mix primer set 6: S121, S61, S59, SS7, S
111, PL14 Mixed primer set 7: S57, S117, S13, SS7, S
111, PL14 and mixed primer set 12: S57, S117, S13, SS7, S
65, PL14.
【００１０】さらに、本発明において、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて増幅を行う際に、ジメチルスルホキ
シド (DMSO) を終濃度10％となるように加えることが、
反応の特異性、感度を向上させる上で特に重要である。
また、オリゴＤＮＡ同士の非特異的な結合を妨げるた
め、dNTP (N=A, T, C, G) とDMSOとオリゴＤＮＡを除い
た溶液をあらかじめ80度に加熱し、その後にdNTP (N=A,
T, C, G) とDMSOとオリゴＤＮＡを加えることが好まし
い。また、はじめの10回のＤＮＡポリメラーゼ反応は94
度で２本鎖の核酸を熱変性させて行い、これに引き続い
て30回のＤＮＡポリメラーゼ反応を、熱変性の温度を90
度と低くして行うことは、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ
を保護し、検出の感度を向上させる上で特に好ましい。Further, in the present invention, when performing amplification using a thermostable DNA polymerase, dimethyl sulfoxide (DMSO) is added to a final concentration of 10%.
It is particularly important for improving the specificity and sensitivity of the reaction.
Also, in order to prevent non-specific binding between oligo DNAs, a solution excluding dNTPs (N = A, T, C, G), DMSO and oligo DNAs was previously heated to 80 ° C, and then dNTPs (N = A,
It is preferable to add (T, C, G), DMSO and oligo DNA. The first 10 DNA polymerase reactions were 94
The double-stranded nucleic acid is thermally denatured at a temperature of 30 ° C., followed by 30 DNA polymerase reactions at a heat denaturation temperature of 90 ° C.
It is particularly preferable to perform the reaction at a low temperature in order to protect the heat-resistant DNA polymerase and improve the detection sensitivity.
【００１１】本発明においては、上記のようにして増幅
させたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、ついで臭化
エチジウム染色したものを紫外線照射して発色せしめ、
特定ＤＮＡバンドを検出する。ＤＮＡのアガロースゲル
電気泳動、臭化エチジウムによる染色、紫外線照射によ
る発色、特定ＤＮＡバンドの検出は当業界一般公知の方
法で実施できる。検出されたＤＮＡバンドのサイズを比
較することにより、該ＤＮＡがどのサブタイプに属する
か、簡単に決定することができる。本発明で好ましく用
いられるミックスプライマーセットを使用したときの各
サイズは以下の通りである。In the present invention, the DNA amplified as described above is subjected to agarose gel electrophoresis, and the ethidium bromide-stained DNA is irradiated with ultraviolet light to develop a color.
A specific DNA band is detected. Agarose gel electrophoresis of DNA, staining with ethidium bromide, coloring by ultraviolet irradiation, and detection of a specific DNA band can be carried out by methods generally known in the art. By comparing the sizes of the detected DNA bands, it is possible to easily determine to which subtype the DNA belongs. The respective sizes when the mixed primer set preferably used in the present invention is used are as follows.
【００１２】 [0012]
【００１３】[0013]
【実施例】以下、実施例を挙げてさらに具体的に述べる
が、本発明はこれらの実施例に限るものではない。 実施例１ 血清中の HCV抗体およびＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ陽性に
よりＣ型慢性肝炎と診断された５種類のサブタイプの患
者血清の各１00μl にグアニジンチオシアン酸塩水溶液
(５M グアニジンチオシアン酸塩／25mMクエン酸ナトリ
ウム／0.５％サルコシル／0.２M β−メルカプトエタノ
ール) 400μl を添加し、室温で１分間攪拌後、フェノ
ール／クロロホルム (４／１) 混合液 400μl で３回抽
出を行った。この水相に10分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム、１μg のグリコーゲン、2.５倍容のエタノールを添
加し、−80度15分間保持後、遠心して得られたペレット
を70％、ついで 100％エタノールで洗浄し、1 U/μl RN
asin (東洋紡社製) 溶液に溶解した。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. Example 1 An aqueous solution of guanidine thiocyanate was added to each 100 μl of the serum of patients of five subtypes diagnosed as chronic hepatitis C based on positivity of HCV antibody and hepatitis C virus RNA in serum.
(5 M guanidine thiocyanate / 25 mM sodium citrate / 0.5% sarkosyl / 0.2 M β-mercaptoethanol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 minute, and then mixed with 400 μl of a phenol / chloroform (4/1) mixed solution. Three extractions were performed. One-tenth volume of 3M sodium acetate, 1 µg of glycogen, and 2.5 volumes of ethanol were added to the aqueous phase, and the mixture was kept at -80 ° C for 15 minutes. After centrifugation, the pellet obtained was centrifuged at 70% and then at 100%. Wash with ethanol, 1 U / μl RN
It was dissolved in an asin (Toyobo) solution.
【００１４】このようにして得られた核酸溶液１μl に
対してベセスダ・リサーチ・ラボラトリー社製のMMLV逆
転写酵素と、その添付バッファーを用い、供給社のマニ
ュアルに従い総量20μl で42度30分間ｃＤＮＡの合成を
行った。このようにして得られたＤＮＡ溶液に対して、
プロメガ社製Taq ＤＮＡポリメラーゼと添付バッファー
(10 x Buffer)を用いて、ｃＤＮＡ溶液１μl 、10 x B
uffer 2.5 μl 、10mM dNTP ミクスチャー (dATP, dCT
P, dGTP, dTTP) の0.5μl、DMS0の2.５μl 、前述のミ
ックスプライマーセット６、蒸留水、Taq ＤＮＡポリメ
ラーゼ1.25ユニットを加え、総量25μl とし、さらに流
動パラフィン50μlを加え、94度で４分間熱変性を行
い、さらに94度１分、61度１分、72度１分、さらにこの
３段階の温度時間変化の操作を10回繰り返し、さらに、
90度30秒、59度１分、72度１分、さらにこの温度時間変
化の操作を30回繰り返し、最後に72度７分間ポリメラー
ゼ反応を行った。次に、３％アガロースゲル上で反応液
10μl を電気泳動し、臭化エチジウムで染色後、紫外線
を照射し、各タイプに期待された位置に出現したバンド
の有無によりサブタイプを決定した (図１) 。Using 1 μl of the nucleic acid solution thus obtained, MMLV reverse transcriptase manufactured by Bethesda Research Laboratories, Inc. and its accompanying buffer were used, and a total volume of 20 μl was used to prepare cDNA for 42 ° C. for 30 minutes according to the supplier's manual. Synthesis was performed. With respect to the DNA solution thus obtained,
Promega Taq DNA polymerase and attached buffer
(10 x Buffer), 1 μl of cDNA solution, 10 x B
2.5 μl buffer, 10 mM dNTP mixture (dATP, dCT
(P, dGTP, dTTP), 0.5 μl of DMS0, the above-mentioned mixed primer set 6, distilled water, and 1.25 units of Taq DNA polymerase to make a total volume of 25 μl. Add 50 μl of liquid paraffin, and add 4 minutes at 94 ° C. The heat denaturation was performed, and the operation of 94 ° C. 1 minute, 61 ° C. 1 minute, 72 ° C. 1 minute, and these three steps of temperature-time change was repeated 10 times.
This operation of changing the temperature over time was repeated 30 times at 90 ° C for 30 seconds, 59 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute, and finally a polymerase reaction was performed at 72 ° C for 7 minutes. Next, the reaction solution was run on a 3% agarose gel.
10 μl was electrophoresed, stained with ethidium bromide, irradiated with ultraviolet light, and the subtype was determined by the presence or absence of a band that appeared at the expected position for each type (FIG. 1).
【００１５】これらのＣ型肝炎ウイルスのサブタイプは
塩基配列を決定し、確認したが、いずれも塩基配列によ
り決定したものと一致していた。また、前述のミックス
プライマーセット７およびミックスプライマーセット12
でも同様に検出を行ったが、結果はミックスプライマー
セット６を用いたものと同じであった (図２および３)
。The nucleotide sequence of these hepatitis C virus subtypes was determined and confirmed, but all of them were consistent with those determined by the nucleotide sequence. In addition, the above-mentioned mix primer set 7 and mix primer set 12
The detection was performed in the same manner as above, but the results were the same as those using the mixed primer set 6 (FIGS. 2 and 3).
.
【００１６】[0016]
【発明の効果】本発明の方法は、一段階のＤＮＡポリメ
ラーゼ反応を行うのみで、塩基配列の決定、ハイブリダ
イゼーション、制限酵素による切断などの段階を不必要
とするため、多数の検体のサブタイプを決定する上で特
に有用である。The method of the present invention requires only one-step DNA polymerase reaction and does not require steps such as nucleotide sequence determination, hybridization, and cleavage with restriction enzymes. Is particularly useful in determining
【図１】ミックスプライマーセット６を用いた場合の電
気泳動のパターンを示す図である。FIG. 1 is a view showing an electrophoresis pattern when a mixed primer set 6 is used.
【図２】ミックスプライマーセット７を用いた場合の電
気泳動のパターンを示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an electrophoresis pattern when a mixed primer set 7 is used.
【図３】ミックスプライマーセット12を用いた場合の電
気泳動のパターンを示す図である。FIG. 3 is a view showing an electrophoresis pattern when a mixed primer set 12 is used.
Claims (10)
成した後、Ｃ型肝炎ウイルスサブタイプに特異な各ＤＮ
Ａ群から少なくとも１種ずつ選ばれたオリゴＤＮＡとア
ンチセンスプライマーからなるミックスプライマーセッ
ト、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを増幅
し、次いで電気泳動しＤＮＡ断片を検出することを特徴
とするＣ型肝炎ウイルスの検査方法。1. A method for synthesizing cDNA from a nucleic acid obtained from a specimen, and then preparing each DN specific to the hepatitis C virus subtype.
Hepatitis C characterized by amplifying cDNA using a mixed primer set consisting of oligo DNA and antisense primer selected from at least one group A and DNA polymerase, followed by electrophoresis to detect a DNA fragment How to test for viruses.
ＤＮＡ群が、下記のＤＮＡ群１からＤＮＡ群５である請
求項１記載のＣ型肝炎ウイルスの検査方法。 ＤＮＡ群１ オリゴＤＮＡ S29 (5'-ACTGAGAATGACATCCGTGT-3') オリゴＤＮＡ S127 (5'-TTGGCCCCCGAGGCCAGAC-3') オリゴＤＮＡ S7 (5'-GGCATAAGGTCGCTCACAGAGC-3') オリゴＤＮＡ S121 (5'-AGGCCACTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3') オリゴＤＮＡ S21 (5'-CTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3') オリゴＤＮＡ S53 (5'-GACTTGGCCCCCGAGGCCAGACA-3') オリゴＤＮＡ S57 (5'-ACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTC-3') ＤＮＡ群２ オリゴＤＮＡ S45 (5'-CTGCCTGAGGAGGCTCACAT-3') オリゴＤＮＡ S39 (5'-CTACGTGGGAGGGCCTATGTT-3') オリゴＤＮＡ S9 (5'-GGGGAACACCATCACATGCTACG-3') オリゴＤＮＡ S117 (5'-GCGGCTTGCCAGGCTGCAGGGATAGTTGC-3') オリゴＤＮＡ S17 (5'-TGCCAGGCTGCAGGGATAGTTGC-3') オリゴＤＮＡ S27 (5'-TGCAGGGATAGTTGCACCCTC-3') オリゴＤＮＡ S61 (5'-TATGTTCAACAGCAAGGGCCAGA-3') オリゴＤＮＡ S63 (5'-TCAGGCCTGCTCCCTGCCCG-3') ＤＮＡ群３ オリゴＤＮＡ S37 (5'-TTCCCTGCCTCAGGAGGCTA-3') オリゴＤＮＡ S13 (5'-GCCCATGACAAACAGCAAGGGACAAT-3') オリゴＤＮＡ S11 (5'-GCTGCAGGGATCGTGGACCCTATC-3') オリゴＤＮＡ S59 (5'-GGCTTGTCCCTGCCTGAAGAGGCCA-3') ＤＮＡ群４ オリゴＤＮＡ SS1 (5'-GACCTTGAACCAGAAGCTCGTA-3') オリゴＤＮＡ SS5 (5'-GTATAACAGCAAAGGACTCC-3') オリゴＤＮＡ SS7 (5'-CCGCGCTAGCGGCGTCTTGC-3') オリゴＤＮＡ SS3 (5'-GTCTGCGGAGATGATTTGGT-3') ＤＮＡ群５ オリゴＤＮＡ S5 (5'-AGCGACATCCGTACGGAGGAGG-3') オリゴＤＮＡ S43 (5'-AATCTACCAATGTTGTGACC-3') オリゴＤＮＡ S19 (5'-CCCAAGCCCGCGTGGCCATCAA-3') オリゴＤＮＡ S41 (5'-ACTTGCTACATCAAGGCCCG-3') オリゴＤＮＡ S111 (5'-CAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACG-3') オリゴＤＮＡ S51 (5'-CGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAG-3') オリゴＤＮＡ S65 (5'-TGATCTCGACCCCCAAGCCCGCGT-3') オリゴＤＮＡ S67 (5'-GGCCCTCTTACCAATTCAAG-3')2. The method for testing hepatitis C virus according to claim 1, wherein each DNA group specific to the hepatitis C virus subtype is the following DNA group 1 to DNA group 5. DNA group 1 Oligo DNA S29 (5'-ACTGAGAATGACATCCGTGT-3 ') Oligo DNA S127 (5'-TTGGCCCCCGAGGCCAGAC-3') Oligo DNA S7 (5'-GGCATAAGGTCGCTCACAGAGC-3 ') Oligo DNA S121 (5'-AGGCCACTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3' Oligo DNA S21 (5'-CTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3 ') Oligo DNA S53 (5'-GACTTGGCCCCCGAGGCCAGACA-3') Oligo DNA S57 (5'-ACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTC-3 ') DNA Group 2 Oligo DNA S45 (5'-CTGCCTGAGGAGGCTCAT-3 ') Oligo DNA S39 (5'-CTACGTGGGAGGGCCTATGTT-3') Oligo DNA S9 (5'-GGGGAACACCATCACATGCTACG-3 ') Oligo DNA S117 (5'-GCGGCTTGCCAGGCTGCAGGGATAGTTGC-3') Oligo DNA S17 (5'-TGCCAGGCTGCAGGGATAGTTGC-3 ') Oligo DNA S27 (5'-TGCAGGGATAGTTGCACCCTC-3 ') Oligo DNA S61 (5'-TATGTTCAACAGCAAGGGCCAGA-3') Oligo DNA S63 (5'-TCAGGCCTGCTCCCTGCCCG-3 ') DNA group 3 Oligo DNA S37 (5'-TTCCCTGCCTCAGGAGGCTA-3') ) Oligo DNA S13 (5'-GCCCATGACAAACAGCAAGGGACAAT-3 ') Oligo DNA S1 1 (5'-GCTGCAGGGATCGTGGACCCTATC-3 ') Oligo DNA S59 (5'-GGCTTGTCCCTGCCTGAAGAGGCCA-3') DNA group 4 Oligo DNA SS1 (5'-GACCTTGAACCAGAAGCTCGTA-3 ') Oligo DNA SS5 (5'-GTATAACAGCAAAGGACTCC-3') Oligo DNA SS7 (5'-CCGCGCTAGCGGCGTCTTGC-3 ') Oligo DNA SS3 (5'-GTCTGCGGAGATGATTTGGT-3') DNA group 5 Oligo DNA S5 (5'-AGCGACATCCGTACGGAGGAGG-3 ') Oligo DNA S43 (5'-AATCTACCAATGTTGTGACC-3') Oligo DNA S19 (5'-CCCAAGCCCGCGTGGCCATCAA-3 ') Oligo DNA S41 (5'-ACTTGCTACATCAAGGCCCG-3') Oligo DNA S111 (5'-CAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACG-3 ') Oligo DNA S51 (5'-CGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAG-3') S65 (5'-TGATCTCGACCCCCAAGCCCGCGT-3 ') Oligo DNA S67 (5'-GGCCCTCTTACCAATTCAAG-3')
群６である請求項１または２記載のＣ型肝炎ウイルスの
検査方法。 ＤＮＡ群６ オリゴＤＮＡ PL14 (5'-CTGGTCATAGCCTCCGTGAA-3')3. An antisense primer comprising the following DNA:
The method for testing hepatitis C virus according to claim 1 or 2, which is group 6. DNA group 6 oligo DNA PL14 (5'-CTGGTCATAGCCTCCGTGAA-3 ')
ＮＡ 121、オリゴＤＮＡ S61、オリゴＤＮＡ S59、オリ
ゴＤＮＡ SS7、オリゴＤＮＡ S111 およびオリゴＤＮＡ
PL14 からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣ
型肝炎ウイルスの検査方法。4. A mixed primer set comprising oligo D
NA 121, oligo DNA S61, oligo DNA S59, oligo DNA SS7, oligo DNA S111 and oligo DNA
The C according to any one of claims 1 to 3, comprising PL14.
How to test for hepatitis virus.
ＮＡ S57、オリゴＤＮＡS117、オリゴＤＮＡ S13、オリ
ゴＤＮＡ SS7、オリゴＤＮＡ S111 およびオリゴＤＮＡ
PL14 からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣ
型肝炎ウイルスの検査方法。5. The method according to claim 5, wherein the mixed primer set is oligo D
NA S57, oligo DNA S117, oligo DNA S13, oligo DNA SS7, oligo DNA S111 and oligo DNA
The C according to any one of claims 1 to 3, comprising PL14.
How to test for hepatitis virus.
ＮＡ S57、オリゴＤＮＡ S117 、オリゴＤＮＡ S13、オ
リゴＤＮＡ SS7、オリゴＤＮＡ S65およびオリゴＤＮＡ
PL14 からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣ
型肝炎ウイルスの検査方法。6. A mixed primer set comprising oligo D
NA S57, oligo DNA S117, oligo DNA S13, oligo DNA SS7, oligo DNA S65 and oligo DNA
The C according to any one of claims 1 to 3, comprising PL14.
How to test for hepatitis virus.
１種ずつ選ばれたオリゴＤＮＡと下記ＤＮＡ群６のオリ
ゴＤＮＡからなるプライマーセット。 ＤＮＡ群１ オリゴＤＮＡ S29 (5'-ACTGAGAATGACATCCGTGT-3') オリゴＤＮＡ S127 (5'-TTGGCCCCCGAGGCCAGAC-3') オリゴＤＮＡ S7 (5'-GGCATAAGGTCGCTCACAGAGC-3') オリゴＤＮＡ S121 (5'-AGGCCACTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3') オリゴＤＮＡ S21 (5'-CTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3') オリゴＤＮＡ S53 (5'-GACTTGGCCCCCGAGGCCAGACA-3') オリゴＤＮＡ S57 (5'-ACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTC-3') ＤＮＡ群２ オリゴＤＮＡ S45 (5'-CTGCCTGAGGAGGCTCACAT-3') オリゴＤＮＡ S39 (5'-CTACGTGGGAGGGCCTATGTT-3') オリゴＤＮＡ S9 (5'-GGGGAACACCATCACATGCTACG-3') オリゴＤＮＡ S117 (5'-GCGGCTTGCCAGGCTGCAGGGATAGTTGC-3') オリゴＤＮＡ S17 (5'-TGCCAGGCTGCAGGGATAGTTGC-3') オリゴＤＮＡ S27 (5'-TGCAGGGATAGTTGCACCCTC-3') オリゴＤＮＡ S61 (5'-TATGTTCAACAGCAAGGGCCAGA-3') オリゴＤＮＡ S63 (5'-TCAGGCCTGCTCCCTGCCCG-3') ＤＮＡ群３ オリゴＤＮＡ S37 (5'-TTCCCTGCCTCAGGAGGCTA-3') オリゴＤＮＡ S13 (5'-GCCCATGACAAACAGCAAGGGACAAT-3') オリゴＤＮＡ S11 (5'-GCTGCAGGGATCGTGGACCCTATC-3') オリゴＤＮＡ S59 (5'-GGCTTGTCCCTGCCTGAAGAGGCCA-3') ＤＮＡ群４ オリゴＤＮＡ SS1 (5'-GACCTTGAACCAGAAGCTCGTA-3') オリゴＤＮＡ SS5 (5'-GTATAACAGCAAAGGACTCC-3') オリゴＤＮＡ SS7 (5'-CCGCGCTAGCGGCGTCTTGC-3') オリゴＤＮＡ SS3 (5'-GTCTGCGGAGATGATTTGGT-3') ＤＮＡ群５ オリゴＤＮＡ S5 (5'-AGCGACATCCGTACGGAGGAGG-3') オリゴＤＮＡ S43 (5'-AATCTACCAATGTTGTGACC-3') オリゴＤＮＡ S19 (5'-CCCAAGCCCGCGTGGCCATCAA-3') オリゴＤＮＡ S41 (5'-ACTTGCTACATCAAGGCCCG-3') オリゴＤＮＡ S111 (5'-CAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACG-3') オリゴＤＮＡ S51 (5'-CGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAG-3') オリゴＤＮＡ S65 (5'-TGATCTCGACCCCCAAGCCCGCGT-3') オリゴＤＮＡ S67 (5'-GGCCCTCTTACCAATTCAAG-3') ＤＮＡ群６ オリゴＤＮＡ PL14 (5'-CTGGTCATAGCCTCCGTGAA-3')7. A primer set comprising at least one oligo DNA selected from each of the following DNA groups 1 to 5 and an oligo DNA of the following DNA group 6. DNA group 1 Oligo DNA S29 (5'-ACTGAGAATGACATCCGTGT-3 ') Oligo DNA S127 (5'-TTGGCCCCCGAGGCCAGAC-3') Oligo DNA S7 (5'-GGCATAAGGTCGCTCACAGAGC-3 ') Oligo DNA S121 (5'-AGGCCACTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3' Oligo DNA S21 (5'-CTGCGGCCTGTCGAGCTGCGAA-3 ') Oligo DNA S53 (5'-GACTTGGCCCCCGAGGCCAGACA-3') Oligo DNA S57 (5'-ACCCTCACATGTTACTTGAAGGCCTC-3 ') DNA Group 2 Oligo DNA S45 (5'-CTGCCTGAGGAGGCTCAT-3 ') Oligo DNA S39 (5'-CTACGTGGGAGGGCCTATGTT-3') Oligo DNA S9 (5'-GGGGAACACCATCACATGCTACG-3 ') Oligo DNA S117 (5'-GCGGCTTGCCAGGCTGCAGGGATAGTTGC-3') Oligo DNA S17 (5'-TGCCAGGCTGCAGGGATAGTTGC-3 ') Oligo DNA S27 (5'-TGCAGGGATAGTTGCACCCTC-3 ') Oligo DNA S61 (5'-TATGTTCAACAGCAAGGGCCAGA-3') Oligo DNA S63 (5'-TCAGGCCTGCTCCCTGCCCG-3 ') DNA group 3 Oligo DNA S37 (5'-TTCCCTGCCTCAGGAGGCTA-3') ) Oligo DNA S13 (5'-GCCCATGACAAACAGCAAGGGACAAT-3 ') Oligo DNA S1 1 (5'-GCTGCAGGGATCGTGGACCCTATC-3 ') Oligo DNA S59 (5'-GGCTTGTCCCTGCCTGAAGAGGCCA-3') DNA group 4 Oligo DNA SS1 (5'-GACCTTGAACCAGAAGCTCGTA-3 ') Oligo DNA SS5 (5'-GTATAACAGCAAAGGACTCC-3') Oligo DNA SS7 (5'-CCGCGCTAGCGGCGTCTTGC-3 ') Oligo DNA SS3 (5'-GTCTGCGGAGATGATTTGGT-3') DNA group 5 Oligo DNA S5 (5'-AGCGACATCCGTACGGAGGAGG-3 ') Oligo DNA S43 (5'-AATCTACCAATGTTGTGACC-3') Oligo DNA S19 (5'-CCCAAGCCCGCGTGGCCATCAA-3 ') Oligo DNA S41 (5'-ACTTGCTACATCAAGGCCCG-3') Oligo DNA S111 (5'-CAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACG-3 ') Oligo DNA S51 (5'-CGGGCAGCCTGTCGAGCCGCAG-3') S65 (5'-TGATCTCGACCCCCAAGCCCGCGT-3 ') Oligo DNA S67 (5'-GGCCCTCTTACCAATTCAAG-3') DNA group 6 Oligo DNA PL14 (5'-CTGGTCATAGCCTCCGTGAA-3 ')
オリゴＤＮＡ S59、オリゴＤＮＡ SS7、オリゴＤＮＡ S
111 およびオリゴＤＮＡ PL14 からなる請求項７記載の
プライマーセット。8. An oligo DNA 121, an oligo DNA S61,
Oligo DNA S59, Oligo DNA SS7, Oligo DNA S
The primer set according to claim 7, comprising 111 and oligo DNA PL14.
、オリゴＤＮＡ S13、オリゴＤＮＡ SS7、オリゴＤＮ
Ａ S111 およびオリゴＤＮＡ PL14 からなる請求項７記
載のプライマーセット。9. Oligo DNA S57, Oligo DNA S117
, Oligo DNA S13, oligo DNA SS7, oligo DN
The primer set according to claim 7, comprising A S111 and oligo DNA PL14.
、オリゴＤＮＡ S13、オリゴＤＮＡ SS7、オリゴＤＮ
Ａ S65およびオリゴＤＮＡ PL14 からなる請求項７記載
のプライマーセット。10. Oligo DNA S57, Oligo DNA S117
, Oligo DNA S13, oligo DNA SS7, oligo DN
The primer set according to claim 7, comprising A S65 and oligo DNA PL14.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16822692A JP2869759B2 (en) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | Hepatitis C virus inspection method and primer set used therefor |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16822692A JP2869759B2 (en) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | Hepatitis C virus inspection method and primer set used therefor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05337000A JPH05337000A (en) | 1993-12-21 |
| JP2869759B2 true JP2869759B2 (en) | 1999-03-10 |
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ID=15864121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16822692A Expired - Lifetime JP2869759B2 (en) | 1992-06-04 | 1992-06-04 | Hepatitis C virus inspection method and primer set used therefor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2869759B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9408573D0 (en) * | 1994-04-29 | 1994-06-22 | Gatsby Charitable Foundation | Identification, production and use of saponin gylcosyl hydrolases |
-
1992
- 1992-06-04 JP JP16822692A patent/JP2869759B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05337000A (en) | 1993-12-21 |
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