JP2836952B2 - Crosslinked hyaluronic acid gel, its use and its production method - Google Patents
Crosslinked hyaluronic acid gel, its use and its production methodInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、リン含有試薬とくにリン(V)の酸の誘導
体との反応によって架橋が行われた架橋ヒアルロン酸誘
導体に関する。本発明はまた、このような生成物の製造
方法、ならびにそのゲル中に導入されたヒアルロン酸ま
たは医薬の投与のための徐放性デポ剤としてのその使用
に関する。The present invention relates to a crosslinked hyaluronic acid derivative which has been crosslinked by the reaction of a phosphorus-containing reagent with a phosphorus (V) acid derivative. The invention also relates to a process for the preparation of such a product, and to its use as a sustained release depot for the administration of hyaluronic acid or a medicament introduced into the gel.
ヒアルロン酸は高分子量の多糖であり、その特性は著
しく粘稠性であり、N−アセチルグルコサミンとグルク
ロン酸の二糖反復単位から構成されている。それは、ヒ
トおよび動物の生体内、たとえば関節液、硝子体液およ
び心膜液中に天然に存在する。すべての種においてヒア
ルロン酸の構造は同じであるが、その分子量は広範囲に
変動する。その生体吸収性と、毒性および免疫作用がな
いことから、ヒアルロン酸は、医学的関係で、たとえば
関節の可動性に影響を与える関節疾患の処置に、また眼
の手術に関連してあるいは術後の癒着を防止するための
外科的補助剤として有用であることが明らかにされてき
た。このような場合に、ヒアルロン酸は粘稠な水溶液の
形で使用されてきた。しかしながら、多くの場合、その
持続性は短く、また機械的な安定化は弱く、所望の治療
効果は達成されない。Hyaluronic acid is a high molecular weight polysaccharide whose properties are extremely viscous and are composed of disaccharide repeating units of N-acetylglucosamine and glucuronic acid. It occurs naturally in human and animal organisms, for example, in synovial fluid, vitreous humor and pericardial fluid. Although the structure of hyaluronic acid is the same in all species, its molecular weight varies widely. Due to its bioabsorbability, lack of toxicity and immunological effects, hyaluronic acid can be used in medical contexts, e.g. in the treatment of joint disorders affecting the mobility of joints, and in connection with or post-operative eye surgery. It has been shown to be useful as a surgical adjunct for preventing adhesions. In such cases, hyaluronic acid has been used in the form of a viscous aqueous solution. However, in many cases, their durability is short and their mechanical stabilization is weak, and the desired therapeutic effect is not achieved.
この点の改良は、ヒアルロン酸を化学的に架橋して不
溶性のゲルを形成させることによって実現されている。
このようなゲルの製造、および硝子体液の代替物として
また網膜剥離の処置におけるその使用は、たとえば米国
特許第4,716,154号に記載されている。第一に癒着防止
剤として使用される、分解性を調節可能なゲルが、PCT
出願WO86/00912号に記載されている。これらのヒアルロ
ン酸ゲルに共通した特徴は、架橋操作の過程でその物質
中に、生体にとって「異物」である非内因性構造が導入
されていることである。この事情が、架橋用のマトリッ
クスとしてヒアルロン酸のような内因性物質を使うとい
う基本的な考え方の効果を損ってしまっている。この新
物質は現実に、生体に対して「異物」である構造を含有
しているからである。結果として、内因性、非毒性、非
免疫原性のヒアルロン酸は、「異物」として認識され免
疫反応や炎症反応を生じる架橋物質への変貌を遂げてし
まっている。An improvement in this regard has been achieved by chemically cross-linking hyaluronic acid to form an insoluble gel.
The preparation of such gels and their use as an alternative to vitreous humor and in the treatment of retinal detachment is described, for example, in US Pat. No. 4,716,154. First of all, PCT is a gel whose degradability can be adjusted, which is used as an anti-adhesion agent.
It is described in application WO 86/00912. A common feature of these hyaluronic acid gels is that a non-endogenous structure which is a "foreign body" to a living body is introduced into the substance during the crosslinking operation. This has undermined the effectiveness of the basic idea of using endogenous substances such as hyaluronic acid as the matrix for crosslinking. This is because this new substance actually contains a structure that is a "foreign substance" to a living body. As a result, endogenous, non-toxic, non-immunogenic hyaluronic acid has been transformed into a cross-linked substance that is recognized as "foreign" and produces an immune or inflammatory response.
本発明者らは驚くべきことに、新規な、生体が分解で
きる架橋ヒアルロン酸ゲル誘導体を見出したのである。
この誘導体は、ヒアルロン酸をリン含有試薬、とくにリ
ン(V)酸誘導体と反応させることによって製造され、
内因性の架橋すなわちリン酸エステルを含んでいる。リ
ン酸エステルはin vivoに広く存在する。その例として
は、リン脂質、DNAおよびRNAを挙げることができる。The present inventors have surprisingly found a novel, biodegradable crosslinked hyaluronic acid gel derivative.
This derivative is produced by reacting hyaluronic acid with a phosphorus-containing reagent, especially a phospho (V) acid derivative,
Contains endogenous crosslinks or phosphate esters. Phosphate esters are widely present in vivo . Examples include phospholipids, DNA and RNA.
本発明のリン酸架橋ヒアルロン酸ゲルは、他の多くの
点で、たとえばその製造過程でもその性質でも、従来技
術における架橋ヒアルロン酸物質の製造過程および性質
に比べて優れている。架橋反応の時間はきわめて短く、
また反応性架橋試薬はすぐに加水分解されるので本発明
の物質は最低限の精製しか必要としない。このゲルは生
体によって分解され、この分解時間は広い限界内で変動
させることができる。従来の架橋ヒアルロン酸ゲルと異
なり、本発明のゲルは完全に乾燥したのちにも、完全な
再膨潤が可能である。The phosphoric acid crosslinked hyaluronic acid gel of the present invention is superior in many other respects, for example, in its manufacturing process and its properties, to the manufacturing processes and properties of crosslinked hyaluronic acid materials in the prior art. The time for the crosslinking reaction is very short,
Also, since the reactive cross-linking reagent is hydrolyzed immediately, the materials of the present invention require minimal purification. The gel is degraded by the living body, and the degradation time can be varied within wide limits. Unlike conventional crosslinked hyaluronic acid gels, the gels of the present invention are capable of complete reswelling even after being completely dried.
多糖のリン酸架橋は、主としてデンプンの処理に関し
て公知の方法である(たとえばKoch,H.ら:Strke,34:1
6,1982参照)。しかしながら、デンプンの誘導体化は、
不均一系における不溶性物質の処理である。ヒアルロン
酸のリン酸架橋も固体材料に対し、たとえばピリジン中
で不均一に行うこともできるが、再現性の高い、膨潤性
ゲル物質を得るためには、ヒアルロン酸を溶解された形
で架橋剤と処理する反応の選択が好ましい。この処理
は、ヒアルロン酸がたとえば新油性の陽イオンとの塩の
形成によって可溶化される有機溶媒中で実施することが
できる。しかしながら驚くべきことに、本発明者らは、
反応をヒアルロン酸塩の水溶液中で行うと、驚くべきこ
とに、濁りのない透明なゲルが得られることを見出した
のである。この反応を水溶液中で行うことは、取扱いお
よび精製の観点から好ましい。Phosphate cross-linking of polysaccharides is a known method primarily for starch processing (eg, Koch, H. et al .: Strke, 34: 1).
6,1982). However, derivatization of starch
Treatment of insoluble materials in a heterogeneous system. The phosphoric acid cross-linking of hyaluronic acid can also be carried out heterogeneously on solid materials, for example in pyridine, but in order to obtain a highly reproducible, swellable gel substance, the cross-linking agent must The choice of the reaction to be treated is preferred. This treatment can be carried out in an organic solvent in which the hyaluronic acid is solubilized, for example, by the formation of a salt with a lipophilic cation. Surprisingly, however, we have:
It has been surprisingly found that when the reaction is carried out in an aqueous solution of a hyaluronate, a clear gel without turbidity is obtained. Performing this reaction in an aqueous solution is preferable from the viewpoint of handling and purification.
使用される架橋試薬はリン(V)酸の誘導体とくにそ
のハライド、オキシハライドまたは無水物である。この
ような架橋試薬の例としては、五塩化リン、塩化ホスホ
リル(オキシ塩化リン)またはその相当する臭化物もし
くはヨウ化物、五酸化リンおよび三メタリン酸塩を挙げ
ることができる。The crosslinking reagent used is a derivative of phosphorus (V) acid, in particular its halide, oxyhalide or anhydride. Examples of such crosslinking reagents include phosphorus pentachloride, phosphoryl chloride (phosphorous oxychloride) or its corresponding bromide or iodide, phosphorus pentoxide and trimetaphosphate.
反応はアルカリ性メジウム中で行われる。リン酸誘導
体のカップリングおよび加水分解は、かなり大量の酸の
放出を招く。形成されたリン酸エステルもヒアルロン酸
マトリックスも、いずれも酸分解を受けやすい。したが
って、反応の全く開始時から十分な塩基を存在させてお
くことがきわめて重要である。粘稠なゲル化系に何かを
添加することは不可能だからである。しかしながら同時
に、ヒアルロン酸はアルカリ分解を受けやすいので、初
期溶液のpHは高すぎてはならない。これは、水溶液中で
の架橋の場合にはpHは9〜14でなければならないこと
(しかし、この範囲の高領域部分のpH値はアルカリ性ヒ
アルロン酸塩溶液を冷却時in situで調製する場合にの
み使用できる)、またその系は十分な緩衝能をもつべき
ことを意味する。使用できる塩基には水酸化ナトリウム
およびカリウムのような金属水酸化物がある。しかしな
がら、これらの水酸化物ではすでに低濃度で高いpH値を
生じ、同時に酸の中和に対する緩衝能は低い。この理由
から、他の緩衝能が優れている塩基、たとえばアルキル
アミンのような窒素塩基とくにトリエチルアミン、トリ
ブチルアミンおよびメチルモルホリンのような立体障害
のある塩基を使用すべきである。しかしまた、水溶液中
での架橋による好ましい製造には、塩基性リン酸金属塩
たとえばリン酸三ナトリウムまたはリン酸カリウムが用
いられる。これらのゲルの後処理操作では、生成する副
生成物は生物学的に耐性のあるリン酸塩のみであるか
ら、毒性を示す可能性があるアルカリの残留物を除去す
るための精製工程をさらに実施する必要がない。反応を
無水メジウム中で行う場合には、上述した塩基よりも弱
い塩基、たとえばピリジンを使用することも可能であ
る。The reaction is performed in an alkaline medium. Coupling and hydrolysis of the phosphoric acid derivative results in the release of a significant amount of acid. Both the phosphate ester formed and the hyaluronic acid matrix are susceptible to acid degradation. Therefore, it is very important that sufficient base is present from the very beginning of the reaction. This is because it is not possible to add anything to a viscous gelling system. At the same time, however, the pH of the initial solution must not be too high, as hyaluronic acid is susceptible to alkaline degradation. This means that in the case of crosslinking in aqueous solution, the pH must be between 9 and 14 (however, the pH value in the higher part of this range may be lower if the alkaline hyaluronate solution is prepared in situ upon cooling. Only means that the system should have sufficient buffer capacity. Bases that can be used include metal hydroxides such as sodium and potassium hydroxide. However, these hydroxides already produce high pH values at low concentrations and at the same time have low buffering capacity for acid neutralization. For this reason, other buffers with good buffering capacity should be used, for example nitrogen bases such as alkylamines, especially sterically hindered bases such as triethylamine, tributylamine and methylmorpholine. However, preference is also given to using basic metal phosphates such as trisodium phosphate or potassium phosphate for a preferred preparation by crosslinking in aqueous solution. In these gel post-treatment operations, the only by-product formed is the biologically resistant phosphate, so a further purification step to remove potentially toxic alkaline residues is required. No need to implement. If the reaction is carried out in anhydrous medium, it is also possible to use weaker bases than those mentioned above, for example pyridine.
架橋反応をヒアルロン酸の溶液中均一系で行う場合に
は、その濃度は広範囲に変動させることができる。実用
的に好都合な濃度範囲は、反応混合物中ヒアルロン酸2
〜15重量%である。1%程度の低濃度でもすでにゲルの
形成は起こるが、これらのゲルはきわめて液体に近い稠
性(liquescent consistency)を示し、技術的目的では
あまり価値がない。架橋操作に用いられるヒアルロン酸
の濃度には理論的な上限はない。しかしながら、すでに
中程度の濃度で、高分子量のヒアルロン酸は処理がきわ
めて困難な溶液を形成するという事情から、実用的な上
限が設けられる。すなわち、分子量がたとえば約106の
ヒアルロン酸の場合、濃度は約10%を超えてはならな
い。When the cross-linking reaction is performed in a homogeneous system in a solution of hyaluronic acid, the concentration can be varied over a wide range. A practically convenient concentration range is the concentration of hyaluronic acid 2 in the reaction mixture.
~ 15% by weight. Gel formation already occurs at concentrations as low as 1%, but these gels exhibit a very liquid-like consistency and are of little value for technical purposes. There is no theoretical upper limit on the concentration of hyaluronic acid used in the crosslinking operation. However, already at moderate concentrations, high molecular weight hyaluronic acid sets a practical upper limit due to the fact that it forms a solution that is extremely difficult to treat. That is, for a hyaluronic acid having a molecular weight of, for example, about 10 6 , the concentration should not exceed about 10%.
架橋に用いられるヒアルロン酸の分子量は約数千から
約数百万まで広範囲に変動させることができる。たとえ
ば、その濃度または架橋剤の量によって20,000〜5×10
6とすることができる。しかしながら、好ましい分子量
範囲は約10,000〜4×106である。The molecular weight of the hyaluronic acid used for crosslinking can vary widely from about thousands to about millions. For example, depending on the concentration or the amount of the crosslinking agent, 20,000 to 5 × 10
It can be 6 . However, the preferred molecular weight range is about 10,000-4 × 10 6 .
ヒアルロン酸またはヒアルロン酸塩たとえばナトリウ
ム塩のほかに、他のヒアルロン酸誘導体、たとえば部分
硫酸化ヒアルロン酸またはエステル化ヒアルロン酸(EP
265,116参照)も、本発明の方法に従って架橋できる。
これはもちろん、たとえば米国特許4,713,448号に記載
されているような、他のある種のわずかな化学修飾に付
されたヒアルロン酸にも適用できる。In addition to hyaluronic acid or hyaluronic acid salts such as sodium salts, other hyaluronic acid derivatives such as partially sulfated or esterified hyaluronic acid (EP
265, 116) can also be crosslinked according to the method of the invention.
This is, of course, also applicable to hyaluronic acid which has been subjected to certain other minor chemical modifications, for example as described in US Pat. No. 4,713,448.
架橋剤の量も、ヒアルロン酸の分子量および濃度に応
じて広範囲に変動させることができる。ヒアルロン酸の
水溶液と架橋剤として塩化ホスホリルを用いた好ましい
態様においては、後者の量はヒアルロン酸に基づいて10
〜500重量%と変動させることができる。The amount of crosslinker can also vary over a wide range depending on the molecular weight and concentration of hyaluronic acid. In a preferred embodiment using an aqueous solution of hyaluronic acid and phosphoryl chloride as the cross-linking agent, the latter amount is 10% based on hyaluronic acid.
Can vary from ~ 500% by weight.
架橋反応は室温またはそれより幾分高い温度で実施す
ることもできる。しかしながら、これらの温度では反応
は著しく速く、ゲルの形成は室温の場合、反応時間数分
で起こってしまう。したがって、反応を十分制御するた
めには、もっと低温、たとえば0〜10℃の範囲内の温度
が選ばれる。The cross-linking reaction can also be performed at room temperature or somewhat higher. However, at these temperatures the reaction is remarkably fast, and gel formation occurs in a few minutes at room temperature. Therefore, a lower temperature, for example, a temperature in the range of 0 to 10 ° C., is selected to sufficiently control the reaction.
しかしながら、ヒアルロン酸を水溶液中で架橋する場
合の好ましい反応系においては、架橋試薬の大部分は完
全に可溶化しているのではなく、これらの試薬と水相は
2相系を形成していることに留意すべきである。したが
って、架橋剤相とヒアルロン酸の水相との間の接触面積
を可能な限り大きくすることが重要である。架橋試薬は
きわめて容易に安定な懸濁液または乳化液を形成するの
で、架橋はヒアルロン酸の流動性によって結果が左右さ
れる。こと2相系の安定性はまた温度が低いほど上昇す
る。However, in a preferred reaction system in which hyaluronic acid is cross-linked in an aqueous solution, most of the cross-linking reagent is not completely solubilized, and these reagents and the aqueous phase form a two-phase system. It should be noted that It is therefore important that the contact area between the crosslinker phase and the aqueous phase of hyaluronic acid be as large as possible. Crosslinking depends very much on the flowability of hyaluronic acid, since the crosslinking reagents very easily form stable suspensions or emulsions. The stability of the two-phase system also increases with lower temperatures.
ゲル物質は、生理的に許容される緩衝液中で膨潤させ
微粉化したのち、そのまま注射が可能である。ゲルは、
たとえばオートクレーブにより、熱安定化することもで
きる。また、注射可能な粉砕ゲル製剤のほかに、たとえ
ばフィルム、チューブ等のように整型した材料の形の他
の製剤を生成させることもできる。The gel substance can be injected as it is after swelling and pulverization in a physiologically acceptable buffer. The gel is
For example, heat stabilization can be performed by an autoclave. In addition to injectable crushed gel preparations, other preparations in the form of shaped materials, such as films, tubes, etc., can be produced.
エポキシ架橋ヒアルロン酸塩ゲル(Laurent,T.C.ら:A
cta Chem.Scand.,18:274〜275,1964)の場合と異なり、
本発明のゲルは、たとえば凍結乾燥によって乾燥したの
ちにも、完全に再膨潤させることができる。これは製造
上の観点からきわめて有利である。乾燥した安定な中間
生成物を保存することにより、pH7以上の緩衝液中に膨
潤状態でゲルを保存した場合に起こる分解は回避される
からである。また、最終ゲル組成物の濃度や膨潤メジウ
ムを変えることも容易になる。Epoxy cross-linked hyaluronate gel (Laurent, TC et al .: A
cta Chem. Scand., 18 : 274-275,1964)
The gels of the invention can be completely re-swelled even after drying, for example by freeze-drying. This is very advantageous from a manufacturing point of view. This is because storing the dried and stable intermediate product avoids degradation that occurs when the gel is stored in a swollen state in a buffer solution having a pH of 7 or more. It also facilitates changing the concentration and swelling medium of the final gel composition.
乾燥ゲル中のリンの含量は100分の1%のオーダーか
ら1%程度まで変動させることができる。均一な水溶液
中で架橋したゲルでは、水溶液中で完全に膨潤したゲル
の固体含量は0.1〜10%である。一方、完全には溶解し
ていないヒアルロン酸を用い不均一系で架橋したゲルの
膨潤の程度ははるかに低い。通常、このようにして生成
されたフィルムの固体含量は30%である。The phosphorus content in the dried gel can vary from the order of 1/100% to as low as 1%. For gels cross-linked in a homogeneous aqueous solution, the solid content of the gel completely swollen in the aqueous solution is 0.1-10%. On the other hand, the degree of swelling of a gel crosslinked in a heterogeneous system using hyaluronic acid that is not completely dissolved is much lower. Usually, the solids content of the film thus produced is 30%.
本発明のゲルはpH5.75で最大の安定性を示すが、生理
的pH(7.3)においては分解される。しかしながら、同
じく分解可能で特許出願WO86/00912号に記載されている
カルボキシレート架橋ヒアルロン酸ゲルに比較して、リ
ン酸架橋ゲルははるかに高い安定性を有する。すなわ
ち、このリン酸架橋によって、従来の種類のゲルに比
べ、分解時間が著しく長く、また分解時間をもっと変動
させることができるヒアルロン酸塩ゲルを得ることが可
能になったのである。分解時間が約1日から2カ月まで
のゲルを製造することができる。特許出願EP272,300号
にも、カルボン酸エステルとエーテル架橋の組み合わせ
によってヒアルロン酸塩ゲルの分解時間を延長する方法
が記載されているが、これらのゲルは注射が可能な形態
に製造することはできない。The gels of the present invention show maximum stability at pH 5.75, but degrade at physiological pH (7.3). However, compared to the carboxylate cross-linked hyaluronic acid gel, which is also degradable and described in patent application WO 86/00912, the phosphoric acid cross-linked gel has much higher stability. In other words, the phosphoric acid crosslinking has made it possible to obtain a hyaluronate gel in which the decomposition time is significantly longer than that of the conventional type gel and the decomposition time can be further varied. Gels with degradation times of about 1 day to 2 months can be produced. Patent application EP 272,300 also describes a method of extending the degradation time of hyaluronate gels by a combination of a carboxylic acid ester and an ether bridge, but these gels cannot be manufactured in an injectable form. Can not.
本発明の一態様によれば、他の成分たとえば医薬も含
有するゲルを製造することができる。これは、所望の成
分を、架橋前または架橋後にゲルに加えることによって
達成され、たとえば徐放効果を得ることができる。According to one aspect of the present invention, a gel that also contains other components, such as a drug, can be produced. This is achieved by adding the desired components to the gel before or after crosslinking, for example, to achieve a sustained release effect.
本発明の他の態様においては、ゲルは、in vivoにお
ける可溶性ヒアルロン酸塩の徐放に使用される。ヒアル
ロン酸の局所たとえば関節内への投与の有効性について
は文献によりよく知られている。この場合のこれまでの
問題点のひとつに、ヒアルロン酸は粘度が高いにもかか
わらず、投与領域から拡散によって急速に消失してしま
うことがある。本発明のゲルの分解生成物は、前述のよ
うに、ヒアルロン酸と無害なリン酸塩であり、これらの
ゲルを植込むと、ヒアルロン酸の優れた徐放性デポ剤と
なる。In another aspect of the invention, the gel is used for sustained release of soluble hyaluronate in vivo . The effectiveness of topical administration of hyaluronic acid, eg, into a joint, is well known in the literature. One of the previous problems in this case is that despite its high viscosity, hyaluronic acid quickly disappears from the administration area by diffusion. As described above, the decomposition products of the gel of the present invention are hyaluronic acid and harmless phosphate, and when these gels are implanted, they become excellent sustained-release depots of hyaluronic acid.
本発明はしたがって、ヒアルロン酸またはその誘導体
の溶液を、リン含有試薬とくにリン(V)酸誘導体での
処理に付すことによるヒアルロン酸の架橋方法に関す
る。この場合の方法は第一に、ヒアルロン酸またはその
誘導体の水溶液を、アルカリ性条件下好ましくはpH9〜1
4において、リン(V)酸誘導体と反応させる方法であ
る。好ましいリン(V)酸誘導体としては、現時点で
は、ハライド、オキシハライドまたは無水物、たとえば
五塩化リン、塩化ホスホリル(オキシ塩化リン)または
その相当する臭化物もしくはヨウ化物、五酸化リン、お
よび三メタリン酸が考えられる。The present invention therefore relates to a method for cross-linking hyaluronic acid by subjecting a solution of hyaluronic acid or a derivative thereof to treatment with a phosphorus-containing reagent, in particular a phosphoric acid (V) acid derivative. In this case, first, an aqueous solution of hyaluronic acid or a derivative thereof is treated under alkaline conditions, preferably at pH 9-1.
4. The method according to 4, wherein the reaction is carried out with a phosphorus (V) acid derivative. Preferred phosphorus (V) acid derivatives currently include halides, oxyhalides or anhydrides, such as phosphorus pentachloride, phosphoryl chloride (phosphorous oxychloride) or its corresponding bromide or iodide, phosphorus pentoxide, and trimetaphosphoric acid Can be considered.
本発明はさらに、上述のようにして製造されるリン酸
エステル架橋を含むヒアルロン酸ゲル、および医薬投与
用製剤およびヒアルロン酸投与用の徐放性デポ剤として
の上述のゲルの使用を包含する。The present invention further includes hyaluronic acid gels containing phosphate ester crosslinks prepared as described above, and the use of the gels as pharmaceutical dosage forms and sustained release depots for hyaluronic acid administration.
本発明を例示する目的で以下に多くの実施例を示す
が、これらはいかなる意味においても本発明を限定する
ものではない。Many examples are set forth below to illustrate the invention, but they are not intended to limit the invention in any way.
とくに指定のない場合は、ゲルの製造には高分子量ヒ
アルロン酸ナトリウム(MW3×106)を使用した。Unless otherwise specified, high molecular weight sodium hyaluronate (MW 3 × 10 6 ) was used for gel production.
ゲルは、等張性のSrensen緩衝液pH5.75〔100ml Na
2HPO4(9.470g/)、900ml Na2PO4・H2O(9.208g/)
および5200mg NaCl/溶液〕中で膨潤させ、洗浄し、オ
ートクレーブ処理した。The gel was made with isotonic Srensen buffer pH 5.75 [100 ml Na
2 HPO 4 (9.470g /), 900ml Na 2 PO 4・ H 2 O (9.208g /)
And 5200 mg NaCl / solution], washed and autoclaved.
ゲルの分解時間は、リン酸緩衝食塩溶液pH7.3中37℃
でインキュベートして測定し、ゲルの完全な可溶化を
過によってチェックした。Gel degradation time was 37 ° C in phosphate buffered saline solution pH 7.3
The gel was solubilized and checked for complete solubilization.
実施例 1 ヒアルロン量ナトリウム500mgをガラスの遠沈管中に
秤量した。飽和リン酸三ナトリウム(Na3PO4)溶液8.3m
lを加えた。この多糖をリン酸塩溶液中、一夜冷蔵庫に
入れて膨潤させた。Example 1 500 mg of sodium hyaluronate was weighed into a glass centrifuge tube. 8.3m saturated sodium phosphate (Na 3 PO 4 ) solution
l was added. The polysaccharide was swelled in a phosphate solution in a refrigerator overnight.
サンプルをガラス棒で、ヒアルロン酸が完全に溶解す
るまで撹拌した。このようにして調製された6%ヒアル
ロン酸塩溶液のpHは約12.8である。The sample was stirred with a glass rod until the hyaluronic acid was completely dissolved. The pH of the 6% hyaluronate solution thus prepared is about 12.8.
この溶液を氷浴中約+1℃に冷却した。激しく撹拌し
ながら、167μの塩化ホスホリル(POCl3)を加えた。
数分間撹拌すると、溶液はゲル化した。サンプルを全部
で5分間撹拌し、ついで均一な透明ゲルが得られるまで
遠心分離した。The solution was cooled to about + 1 ° C in an ice bath. With vigorous stirring, 167μ phosphoryl chloride (POCl 3 ) was added.
Upon stirring for a few minutes, the solution gelled. The sample was stirred for a total of 5 minutes and then centrifuged until a uniform clear gel was obtained.
さらに10分間反応させたのち、中性のpHを有する得ら
れたゲルを薄いスライスに切断した。このスライスを1
のSrensen緩衝液に移した。振盪させながらゲルを
2日間洗浄し、この間緩衝液を3回取り換えた。膨潤し
たゲルの収量は35mlであった。After a further 10 minutes of reaction, the resulting gel with a neutral pH was cut into thin slices. This slice
In Srensen buffer. The gel was washed with shaking for 2 days, during which time the buffer was changed three times. The yield of swollen gel was 35 ml.
ゲルはメッシュの細かいスチール線の網を通過させて
粉砕し、シリンジに充填し、ついてオートクレーブ処理
を行った。軟く、わずかに粘着性のゲルは細い注射針を
通して容易に注射することができる。The gel was crushed by passing it through a fine mesh steel wire net, filled into a syringe, and then autoclaved. The soft, slightly sticky gel can be easily injected through a fine needle.
オートクレーブ処理しないゲルの分解時間は5週であ
ったが、ゲルクレーブ処理したゲルに3〜4週間以内に
分解した。透析し乾燥したゲルのリン含量は0.081%で
あった。膨潤したゲルの固体含量は1.4%であった。The degradation time of the gel without autoclaving was 5 weeks, but it degraded to gel-claved gel within 3-4 weeks. The dialyzed and dried gel had a phosphorus content of 0.081%. The solids content of the swollen gel was 1.4%.
実施例 2 ヒアルロン酸ナトリウム300mgを水15ml中に取り、冷
蔵庫に入れて一夜膨潤させた。撹拌してヒアルロン酸塩
を完全に溶解させると、2%の溶液が生成した。これに
固体リン酸ナトリウム(Na3PO4・12H2O)3.7gを加え
た。塩が溶解したのち、溶液を氷浴中で冷却し、ついで
400μのPOCl3を用い、実施例1と同様にして架橋を行
った。Example 2 300 mg of sodium hyaluronate was taken in 15 ml of water and placed in a refrigerator to swell overnight. Upon stirring, the hyaluronate was completely dissolved to form a 2% solution. To this, 3.7 g of solid sodium phosphate (Na 3 PO 4 .12H 2 O) was added. After the salts have dissolved, the solution is cooled in an ice bath and then
Crosslinking was carried out in the same manner as in Example 1 using 400 μl of POCl 3 .
生成したゲルを蒸留水に対して2日間透析し、ついで
生成物を粉砕し、凍結乾燥した。リン含量は0.10%であ
った。乾燥ゲルをSrensen緩衝液中で3日間膨潤さ
せ、ついでオートクレーブ処理した。このようにして得
られたゲルは、粘着性、均一で、完全に透明であり、か
なりの可動性を示した。オートクレーブ処理したゲルの
分解時間は4〜5日であった。The resulting gel was dialyzed against distilled water for 2 days, then the product was crushed and freeze-dried. The phosphorus content was 0.10%. The dried gel was swollen in Srensen buffer for 3 days and then autoclaved. The gel thus obtained was sticky, uniform, completely transparent and showed considerable mobility. The degradation time of the autoclaved gel was 4-5 days.
実施例 3 水10ml中ヒアルロン酸塩300mgと、塩基として2.5gのN
a3PO4・12H2Oを用いて3%の溶液を調製するほかは実施
例2と同様の実験を繰り返した。架橋剤としてはPOCl32
50μを使用した。Example 3 300 mg of hyaluronate in 10 ml of water and 2.5 g of N as base
The same experiment as in Example 2 was repeated except that a 3% solution was prepared using a 3 PO 4 .12H 2 O. POCl 3 2 as a crosslinking agent
50μ was used.
この場合は、膨潤ゲルの固体含量は3.6%であった。
オートクレーブ処理したゲルの分解時間は10日、乾燥ゲ
ルのリン含量は0.085%であった。In this case, the solids content of the swollen gel was 3.6%.
The decomposition time of the autoclaved gel was 10 days, and the phosphorus content of the dried gel was 0.085%.
実施例 4 ヒアルロン酸ナトリウム400mgを水3.3mlに溶解して、
きわめて粘稠な12%溶液を生成させた。サンプルを約+
10℃に冷却し、ついでトリエチルアミン(これは+18℃
以下で水溶性である)を撹拌しながら加えた。溶液のpH
は約13.5であった。サンプルをさらに+1℃まで冷却
し、POCl3183μで架橋した。リン含量0.12%の硬いゲ
ルが得られた。オートクレーブ処理した状態でゲルの分
解時間は4週であった。Example 4 400 mg of sodium hyaluronate was dissolved in 3.3 ml of water,
A very viscous 12% solution was formed. About +
Cool to 10 ° C, then triethylamine (this is + 18 ° C
(Which is water-soluble below) was added with stirring. Solution pH
Was about 13.5. The sample was further cooled to + 1 ° C and crosslinked with 183μ of POCl 3 . A hard gel with a phosphorus content of 0.12% was obtained. The gel decomposition time in the autoclaved state was 4 weeks.
実施例 5 6%のヒアルロン酸塩溶液5mlを4−メトキシモルホ
リン1mlと混合した。溶液のpHは約11.2であった。この
溶液を上述のようにしてPOCl3200μで架橋した。Example 5 5 ml of a 6% hyaluronate solution was mixed with 1 ml of 4-methoxymorpholine. The pH of the solution was about 11.2. This solution was crosslinked with 200 μl of POCl 3 as described above.
やや液化性のゲルが得られた。ゲルをpH5.0のSren
sen緩衝液で膨潤させたのちオートクレーブ処理した。
非オートクレーブ処理ゲルの分解時間は15〜19日であっ
たが、オートクレーブ処理後には分解時間は10日であっ
た。A slightly liquefied gel was obtained. Gel with pH 5.0 Sren
After swelling with sen buffer, the mixture was autoclaved.
The degradation time of the non-autoclaved gel was 15-19 days, but after autoclaving the degradation time was 10 days.
実施例 6 この実施例では、水溶液中、塩基として様々な濃度の
水酸化ナトリウムを用いて架橋の試験を行った。Example 6 In this example, a cross-linking test was performed using various concentrations of sodium hydroxide as a base in an aqueous solution.
冷10%ヒアルロン酸塩溶液2.75gに様々な量の水酸化
ナトリウム溶液を加え、ついで既定量の架橋剤、100μ
のPOCl3で架橋を行った。Various amounts of sodium hydroxide solution were added to 2.75 g of the cold 10% hyaluronate solution, and then a predetermined amount of the crosslinking agent, 100 μl
Crosslinking was carried out with POCl 3 .
a)5M NaOH100μ:POCl3の添加後、溶液は急速にきわ
めて酸性になった(pH約2)。きわめて少量の水不溶性
ゲルが得られたのみであった。a) After addition of 100 μM 5M NaOH: POCl 3 , the solution rapidly became very acidic (pH about 2). Only a very small amount of water-insoluble gel was obtained.
b)5M NaOH250μ;この場合も、急速にきわめて酸性
の反応溶液の生成が起こった。得られたゲルはきわめて
液体に近い稠性を示し、オートクレーブ処理によって分
解した。b) 250μ of 5M NaOH; again, the formation of a very acidic reaction solution occurred rapidly. The resulting gel had a very liquid consistency and was degraded by autoclaving.
c)5M NaOH500μ:架橋後、かなり高い稠性を示すゲ
ルが得られた。その完全に膨潤した状態でのヒアルロン
酸塩含量は0.6%であった。しかしながら、オートクレ
ーブ処理で、ゲルのかなりの分解を生じた。オートクレ
ーブ処理サンプルの分解時間は4日であった。c) 5 μM NaOH 500μ: After crosslinking, a gel was obtained which showed considerably higher consistency. The hyaluronate content in its fully swollen state was 0.6%. However, autoclaving resulted in significant degradation of the gel. The decomposition time of the autoclaved sample was 4 days.
d)5M NaOH1000μ:ヒアルロン酸塩はアルカリ液に
よって急速に分解され、低粘度の溶液を生成した。架橋
剤を添加してもゲルの形成は起こらなかった。d) 5 μM NaOH 1000μ: Hyaluronate was rapidly decomposed by the alkaline solution to produce a low viscosity solution. No gel formation occurred with the addition of the crosslinking agent.
これらの例は、架橋系には適当な緩衝制御が必要なこ
とを明瞭に示している。These examples clearly show that the crosslinking system requires proper buffer control.
実施例 7 ヒアルロン酸ナトリウム3000mgを飽和Na3PO4溶液3ml
に溶解して10%溶液を生成させ、ついでこれをPOCl325
μで架橋した。硬いゲルが得られ、その分解時間は14
日であった。Example 7 3000 mg of sodium hyaluronate was added to 3 ml of a saturated Na 3 PO 4 solution.
In POCl 3 25 to form a 10% solution.
Crosslinked with μ. A hard gel is obtained with a degradation time of 14
It was a day.
実施例 8 分子量100,000の酸分解ヒアルロン酸ナトリウム80mg
を飽和Na3PO4溶液1mlに溶解した。これにさらに0.2gの
固体Na3PO4・12H2Oを加えた。この溶液をPOCl375μで
架橋した。Example 8 80 mg of acid-decomposed sodium hyaluronate having a molecular weight of 100,000
Was dissolved in 1 ml of a saturated Na 3 PO 4 solution. To this was added an additional 0.2 g of solid Na 3 PO 4 .12H 2 O. This solution was crosslinked with 75μ of POCl 3 .
乳白色のもろいゲルが得られ、分解時間は2週であっ
た。A milky, friable gel was obtained with a degradation time of 2 weeks.
実施例 9 ヒアルロン酸ナトリウム300mgを飽和Na3PO4溶液5mlに
溶解した。この溶液を冷却し、五塩化リン(PCl5)200m
gを少量ずつ、激しく撹拌しながら加えた。五塩化リン
は塩化ホルホリルよりも急速にまた激しく反応した。わ
ずかに乳白色を帯びたゲルが得られ、分解時間は2週で
あった。Example 9 300 mg of sodium hyaluronate was dissolved in 5 ml of a saturated Na 3 PO 4 solution. The solution is cooled and phosphorus pentachloride (PCl 5 ) 200m
g was added in small portions with vigorous stirring. Phosphorus pentachloride reacted faster and more vigorously than phorphoryl chloride. A slightly milky gel was obtained with a degradation time of 2 weeks.
実施例 10 ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム200mgをジメ
チルホルムアミド2mlに溶解した。この溶解をトリエチ
ルアミン1mlと混合し、ついで溶液を冷却してPOCl3100
μを加えた。ゲルの生成はほぼ瞬間的に起こった。生
成したゲルは白色のフレークからなり、水中でほとんど
膨潤性を示さなかった。このゲルのヒアルロン酸塩含量
は30%であった。Example 10 200 mg of tetrabutylammonium hyaluronate was dissolved in 2 ml of dimethylformamide. The dissolution was mixed with 1 ml of triethylamine, then the solution was cooled and POCl 3 100
μ was added. Gel formation occurred almost instantaneously. The resulting gel consisted of white flakes and showed little swelling in water. The gel had a hyaluronate content of 30%.
実施例 11 ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム100mgをジメ
チルホルムアミド2mlに溶解した。トリエチルアミン200
μを加え、溶液を冷却して五酸化リン(P2O5)200mg
と混合する。ほとんどすぐに、白色のゲルの沈澱が生成
した。このゲルは実施例10で製造したゲルと同じ性質を
示した。Example 11 100 mg of tetrabutylammonium hyaluronate was dissolved in 2 ml of dimethylformamide. Triethylamine 200
Add μ, cool the solution and add phosphorus pentoxide (P 2 O 5 ) 200mg
Mix with. Almost immediately, a white gel precipitate formed. This gel exhibited the same properties as the gel prepared in Example 10.
実施例 12 ヒアルロン酸ナトリウム100mgを3×10mlの乾燥ピリ
ジンとともに蒸発させた。この物質を10mlのピリジンに
懸濁し、ついでこの懸濁液を冷却して、POCl3400μを
加えた。この溶液を15分間振盪した。このように処理し
たヒアルロン酸塩は水に不溶性で、不規則な膨潤を起こ
しやすく、硬い白色部分と透明なゲル部分の混合物を生
成する。最も硬い架橋白色ゲル部分は生理的pHでは分解
しないが、アルカリ処理に付すと溶解する。透析乾燥ゲ
ルの中のリン含量は0.77%であった。Example 12 100 mg of sodium hyaluronate was co-evaporated with 3 × 10 ml of dry pyridine. This material was suspended in 10 ml of pyridine, then the suspension was cooled and 400 μl of POCl 3 was added. This solution was shaken for 15 minutes. The hyaluronate thus treated is insoluble in water, is prone to irregular swelling, and produces a mixture of a hard white portion and a clear gel portion. The hardest crosslinked white gel part does not decompose at physiological pH, but dissolves when subjected to alkali treatment. The phosphorus content in the dialysis dried gel was 0.77%.
実施例 13 透析した、塩を含まないヒアルロン酸ナトリウムをペ
トリ皿中で乾燥して、透明な平らなフィルムを形成させ
た。このフィルムを水1部とトリエチルアミン9部の冷
却混合物で数秒間膨潤させた。膨潤したフィルムを、塩
化ホスホリル中に数秒間浸漬するかまたは塩化ホスホリ
ルの蒸気中に約1分間保持して、塩化ホスホリル処理を
行った。いずれの場合も、透明な、水不溶性の架橋フィ
ルムが得られ、その膨潤状態での固体含量は約30%であ
った。Example 13 Dialyzed, salt-free sodium hyaluronate was dried in a Petri dish to form a clear, flat film. The film was swollen for a few seconds with a cold mixture of 1 part water and 9 parts triethylamine. The swollen film was immersed in phosphoryl chloride for a few seconds or kept in the vapor of phosphoryl chloride for about 1 minute to perform phosphoryl chloride treatment. In each case, a clear, water-insoluble, crosslinked film was obtained with a solids content in the swollen state of about 30%.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C08B 37/08 A61K 9/00,31/725──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on front page (58) Field surveyed (Int. Cl. 6 , DB name) C08B 37/08 A61K 9/00, 31/725
Claims (7)
ン含有試薬と反応させて架橋することを特徴とする架橋
ヒアルロン酸またはその誘導体のゲル製造方法。1. A method for producing a gel of crosslinked hyaluronic acid or a derivative thereof, comprising reacting a solution of hyaluronic acid or a derivative thereof with a phosphorus-containing reagent to crosslink the solution.
1記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the reagent is a derivative of phosphorus (V) acid.
ライドまたは無水物である請求項2記載の方法。3. The method according to claim 2, wherein the phosphorus (V) acid derivative is a halide, oxyhalide or anhydride.
スホリまたは五酸化リンである請求項3記載の方法。4. The method according to claim 3, wherein the phosphorus (V) acid derivative is phosphorus pentachloride, phosphoric chloride or phosphorus pentoxide.
(V)酸誘導体と反応させることによって製造すること
を特徴とする架橋ヒアルロン酸またはその誘導体のゲ
ル。5. A gel of cross-linked hyaluronic acid or a derivative thereof produced by reacting hyaluronic acid or a derivative thereof with a phosphorus (V) acid derivative.
とする架橋ヒアルロン酸またはその誘導体のゲル。6. A gel of cross-linked hyaluronic acid or a derivative thereof, wherein the cross-link is a phosphate ester bridge.
からなる可溶性ヒアルロン酸または医薬の投与のための
徐放性デポ剤。7. A sustained-release depot for administration of soluble hyaluronic acid or a medicament comprising a gel of cross-linked hyaluronic acid or a derivative thereof.
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