JP2788270B2 - 培養培地のための脂質マイクロエマルジョン - Google Patents

培養培地のための脂質マイクロエマルジョン

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JP2788270B2 JP50672288A JP50672288A JP2788270B2 JP 2788270 B2 JP2788270 B2 JP 2788270B2 JP 50672288 A JP50672288 A JP 50672288A JP 50672288 A JP50672288 A JP 50672288A JP 2788270 B2 JP2788270 B2 JP 2788270B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発酵及び細胞培養の分野に関する。より詳
しくは、本発明は、脂質がマイクロエマルジョンの形で
供給されている細胞培養培地及び細胞培養培地に脂質を
分散する方法に関する。
脂質は、ほとんどの動物細胞培養のために明らかに必
須の必要条件である。Yamaneなど.,Proc.Japn Acad.,57
B（10）:385〜389,388ページ（1981）；及びIscove,“C
ulture of Lymphocytes and Hemopoietic Cell in Seru
m−Free Medium,"Barnesなど．（eds.），Method for S
erum−Free Culture of Neuronal and Lymphoid Cells,
169〜185（170ページで、次のことを述べている：“リ
ンパ球及び造血細胞に関する実験が推定される場合、脂
質は、新たに組織片培養された細胞のために一般的な必
須条件であることが判明される”）を参照のこと。〕培
地への脂質の直接の添加は、それらの低い溶解性のため
に実用的でない。従来、血清含有培地において、脂質
は、それが水溶性リポタンパク質として担持される血清
中における培地に供給され、そして血清を含まない培地
においては、脂質は、それが溶媒、たとえばクロロホル
ムを用いる方法により連結されるアルブミンにより担持
される〔Goodwinなど.,Kurstakなど．（eds.）,Inverte
brate Systems In Vitro,493〜508ページ（1980）;Isco
ve,id．〕。
従来の培養培地は一般的に、多量（約５〜20％）、血
清を添加することにより調製されて来たけれとも、血清
の使用は、多くの欠点、たとえば（１）培地の費用の半
分以上が通常、血清の値段により占められる費用；
（２）それぞれ異なっており、そしてマイコプラズマ又
はウィルスにより汚染されている血清の品質を調べる必
要がある時間；及び（３）血清が種々の未確認タンパク
質を含む下流の精製問題を有する。従来の血清を含まな
い培地におけるアルブミン、すなわち主要血漿タンパク
質の使用に関して考慮される〔Yamaneなど.,Proc.Japan
Acad.,57B（10）:385〜389（1981）（それは388ページ
で次のことを述べる：“言うまでもないがBSAは、個々
の市販の調製物のその細胞増殖促進作用においてしばし
ば、矛盾する血清タンパク質である”）を参照のこ
と。〕大規模にアルブミンを精製することは困難である
ので、市販のアルブミン調製物は他のタンパク質を含
み、そして結晶化された調製物でも、98％以上の純度を
越えない。“汚染タンパク質の他に、アルブミン調製物
は、他の疎水性物質、たとえば脂肪酸及びステロイドホ
ルモン、及びそれらの汚染する遷移金属イオンと共に精
製において使用される微量の塩及び緩衝液を含むと思わ
れる。"Iscove,前記.176ページ。従って、細胞培養培地
から、血清及びアルブミンの両者、並びに他のタンパク
質を脂質キャリヤーとして排除することは好都合であ
る。本発明は、そのような脂質キャリヤーの排除の選択
を付与する。
Iscove,前記.179〜181ページは、血清を含まない培地
に脂質を供給するために使用される従来技術の方法の例
を供給する。そのような方法において、脂質が、クロロ
ホルム中に溶解されることによって混合され；そのクロ
ロホルムは次に蒸発せしめられ、そして脂質がビーカー
の底上に乾燥せしめられる。次に、アルブミンを含む懸
濁培地が添加され、そしてその混合物は、殺菌したフィ
ルターの孔（0.45μｍ）を通過するのに十分に小さな小
胞−リポソームの形で脂質を分散するために音波処理さ
れる。そのような方法のIscoveの次の説明は、そのよう
な態様で培養培地に脂質を供給するいくつかの固有の問
題を指摘する： 音波処理期間の最後で、ダイズ脂質の数個の小さな凝
集体が分散液に漏れた。これらは無視される。その懸濁
液が1.2μｍの孔の大きさの膜を一度通され、この後、
それは、通常、殺菌された0.45μｍのフィルターを難な
く通過する。フィルターが急速に阻止する場合、それ
は、1.2μｍの膜を通してさらに１度、その懸濁液を通
すことが助けになる。フィルター上の灰色の残留物は、
音波処理機のプローブから細断された粒状金属である。
濾過は、音波処理のすぐ後で最っとも容易であり、そし
て遅れるべきでない。
得られた懸濁液は４℃で貯蔵される。それらは、貯蔵
の１日目又は２日目でいく分不透明になる。この変化は
たぶん、大きな平均の大きさへのリポソームのいくらか
の合体をもたらすが、しかし培養におけるそれらの有効
性に対しての効果はもたない。
殺菌されたフィルター上での分散及び保持の完結にお
ける量の変化のために、個々の脂質調製物は、その最適
濃度を決定するために滴定されるべきである。
すでに脂質により供給されている培地のフィルター殺
菌は、回避されるべきである。なぜならば、フィルター
上での不定量の脂質を保持する危険が存在するからであ
る。
本発明の細胞培養培地への脂質の導入は、細胞への脂
質の有効性を増強し、そして濾過で失われ、そして従っ
て細胞に利用できなくなる球状の脂質凝集体を回避す
る。本発明はさらに、脂質成分及び培地成分の残りを別
々にフィルター殺菌する必要がないことも提供する。
本発明は、生物利用形で必須脂質を供給するために細
胞培養培地に添加され得る安定した脂質のマイクロエマ
ルジョンに関する。本発明はさらに、脂質がそのような
脂質のマイクロエマルジョンの形で供給される細胞培養
培地にも関する。
本発明はさらに、１又は複数の乳化剤の使用により培
養培地に脂質を分散する方法も提供する。乳化剤は好ま
しくはリン脂質及び／又は非毒性ポリマー界面活性剤、
より好ましくはレシチン及び／又は非毒性で非イオン性
のポリマー界面活性剤、及びさらに一層好ましくはレシ
チン及び／又はプルロニックポリオール及び／又はポリ
ソルベート化合物である。
本発明はさらに、脂質、有機溶媒及び１又は複数の乳
化剤を含んで成る脂質溶液成分、及び１又は複数の乳化
剤及び水を含んで成る水性成分も提供する。それは、液
体マイクロエマルジョンの形成をもたらす脂質溶液成分
と水性成分との撹拌により添加される。
詳細な説明 マイクロエマルジョンの形での脂質の導入は、細胞へ
の培地中の脂質の利用可能性を高める。マイクロエマル
ジョンは、１つの液体が第２の液体の本体を通して小さ
な球状物（該小さな球状物はミセルとして本明細書に記
載される）に分配されている調製物として本明細書にお
いて定義される。本発明の液体マイクロエマルジョン
は、水性成分及び脂質液体成分を撹拌により混合するこ
とにより調製され、ここで前記水性成分は水に１又は複
数の乳化剤を含むものとして本明細書で定義され、そし
て前記液体溶液成分は有機溶媒に１又は複数の脂質及び
１又は複数の乳化剤を含んで成るものとして本明細書で
定義される。
上記のように、本発明の脂質マイクロエマルジョン
は、培養培地から脂質キャリヤー、たとえば血清、血清
アルブミン又は他のタンパク質を排除する手段を提供す
る。血清成分が本発明のマイクロエマルジョンの形で少
なくとも１種の脂質栄養物により一部交換されている従
来の培養培地に対応する培地もまた、本発明の範囲内に
ある。従って、従来の培地中の血清又は他のタンパク質
性物質、たとえばアルブミンは、本発明に従って減じら
れ、又は分配され得る。本発明の培養培地の使用は、培
地中に蓄積される生成物の単離及び精製を容易にする。
培養培地の多量の生成がまた、本発明に従って容易にさ
れる。
本発明のもう１つの利点は、本発明の好ましい乳化
剤、すなわちプルロニックポリオールが、哺乳類培養に
おいて物理的保護剤としてすでに使用されており、そし
て細胞に対して非毒性であり且つ細胞増殖に対して非阻
害性であることが下記に示されていることである。Kilb
urnなど.,Biotech.＆ Bioengin.,Volx:801−814（196
8）;Mizrahi,Develop.Biol.Standard,55:93−102（198
4）；及びMizrahi,J.Clin.Microbiol.,2（１）:11−13
（1975年７月）。
従って、プルロニックポリオール、すなわち本発明の
好ましい乳化剤は、撹拌され且つ／又はスパージされた
培養物のための物理的保護剤を提供することにおいてだ
けでなく、また、培養物に供給されるべき脂質のための
乳化システムを提供することにおいての二重の目的に作
用する。従って、本発明の培地は、いづれかの培養条件
下での細胞の増殖のために、但し特に、撹拌され且つ／
又はスパージされた条件下での細胞増殖のために及び一
般的に十分に空気供給される培養のために高められた栄
養環境を提供する。結果として、このような培地は、組
換え体、ウィルス及び／又は天然の生成物（ここで天然
の生成物の例は、生来のタンパク質又はモノクローナル
抗体である）の生成のために高められた栄養環境を付与
する。
用語“タンパク質”とは、用語“ペプトン”を排除す
るようにここでは定義される。本発明の培地は、好まし
くは、ひじょうに低い濃度、すなわち好ましくは約1000
μg/ml以下、より好ましくは約50μg/ml以下、さらによ
り好ましくは約５μg/ml以下のタンパク質を含む。ある
任意の成分、たとえば成長因子、たとえばインシュリ
ン、トランスフェリン又はカタラーゼが下記に示される
ように所望されることが決定される場合、それらは好ま
しくは低濃度で存在し、そして脂質キャリヤーとして機
能しない。
脂質は、水不溶性であり、そして非極性（又は脂肪）
溶媒、たとえば数ある中で、アルコール、エーテル、ク
ロロホルム又はベンゼンにより抽出可能であることによ
り特徴づけられる脂肪及び脂肪様物質の異種グループの
いづれかとしてここで定義される。脂質は、不飽和脂肪
酸、飽和脂肪酸、ステロイド、脂質可溶性ビタミン及び
リン脂質並びにそれらのエステルを含む。不飽和脂肪酸
の例として、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、ア
ラキドン酸及びエルカ酸及びそれらのグリセリド並びに
エステルを挙げることができる。好ましい脂肪酸はま
た、脂肪酸エステル、好ましくは多不飽和脂肪酸エステ
ル及びさらに一層好ましくは、魚の肝油、好ましくはタ
ラの肝油に見出されるような、多不飽和脂肪酸とメチル
エステルとの混合物を含む。飽和脂肪酸の例として、パ
ルミチン酸及びステアリン酸及びそれらのグリセリドを
挙げることができる。脂質可溶性ビタミンの例として、
ビタミンA,D及びＥを挙げることができる。ステロイ
ド、すなわち水素添加されたシクロペントフェナントレ
ン環システムを含む脂質の例として、プロゲステロン、
副腎皮質ホルモン、生殖腺ホルモン、心臓アグリコン、
胆汁酸及びステロイド（たとえばコレステロール）を挙
げることができる。好ましいステロイドは、ステロー
ル、好ましくはコレステロールである。
本発明の細胞培養培地に供給される脂質のタイプは、
培養されるべき細胞の選択に依存する。また、脂質は、
培養される特定の細胞系のために適切な濃度で供給さ
れ、ここで前記濃度は細胞に対して非毒性であり、そし
て細胞増殖を阻害しない。昆虫細胞は、哺乳類細胞より
も高い濃度の脂質に耐えることができると思われる。哺
乳類細胞培養のための典型的な脂質成分は、例１及び２
に示され、そして昆虫細胞のための典型的な脂質成分は
例３に示される。哺乳類細胞のための例１の脂質成分
は、例３の昆虫細胞のための脂質成分と同じであり、但
し、脂質及び乳化剤Tween 80の濃度に関して、昆虫の脂
質成分のための濃度よりも哺乳類の脂質成分のための濃
度が10倍低い。昆虫細胞のための脂質の好ましい範囲
は、次の通りである： 多不飽和脂肪酸メチルエステルの混合物、たとえば魚
の肝油、好ましくはタラの肝油は、好ましくは培地中に
おいて、約1mg/〜約50mg/、好ましくは約5mg/〜
約15mg/及び最っとも好ましくは約10mg/の濃度で存
在する。タラの肝油の前記濃度は、さらに脂質可溶性ビ
タミンＡの好ましい濃度を含む。ステロール、好ましく
はコレステロールは、約2mg/〜約7mg/、より好まし
くは約3mg/〜約5mg/及び最っとも好ましくは約4.5m
g/の濃度で存在する。脂質成分のα−トコフェロール
は、約0.5mg/〜約4mg/、より好ましくは約2mg/の
濃度で存在する。
下記例に使用される昆虫細胞培養のためのそのような
好まし血清を含まない、低タンパク質又は実質的にタン
パク質を含まない３種の培地の成分が、第１表に示され
る。第１表におけるプルロニックポリオール−脂質のマ
イクロエマルジョンが、例３に従って調製される。
昆虫細胞への脂質の利用可能性を高める他に、マイク
ロエマルジョンの形で供給される脂質の利点は、脂質画
分及び培地成分の残りを別々にフィルター殺菌しなくて
もよいことである。本発明の脂質マイクロエマルジョン
は、フィルター殺菌されないで培地に添加され得、そし
て次に全培地が、フィルター殺菌過程の間の脂質の損失
に関係なくフィルター殺菌され得る。大規模な生成のた
めには、そのような利点が有意である。しかしながら、
もちろん脂質溶液成分及び水性成分を別々にフィルター
殺菌し、そして脂質マイクロエマルジョンを無菌的に調
製することが可能である。
本発明の培地の脂質溶液成分は、脂質の混合物、たと
えば多不飽和脂肪酸、α−トコフェロールアセテート及
びコレステロールの混合物の適量及び適量の有機溶媒、
好ましくはC1〜C3のアルコール、より好ましくはエタノ
ール中における乳化剤を混合することによって調製され
る。有機溶媒の最終濃度が、細胞増殖に対して非毒性で
あり、且つ非阻害性であることが重要である。たとえ
ば、本発明の好ましい培地における有機溶媒としてのエ
タノールの好ましい濃度は、およそ1ml/であろう。次
に、脂質溶液成分は、任意にフィルター殺菌される。
（脂質溶液成分は、約−20℃〜約−80℃の範囲の温度で
窒素下に貯蔵され得る。） １又は複数の乳化剤、好ましくは保護剤／乳化剤を含
む水性成分は、同様に任意にフィルター殺菌される。好
ましくは、脂質溶液成分の体積よりも多い水性成分は、
ゆっくり且つ任意に減菌的に、脂質溶液成分に、渦巻に
撹拌しながら添加される。脂質溶液成分への水性成分の
撹拌による添加に基づいて、脂質マイクロエマルジョン
が形成される。（一般的に、脂質溶液成分に水性成分を
添加することが、反対にすることよりも好ましい。） 次に、任意にフィルター殺菌された脂質マイクロエマ
ルジョンが、培地に添加され得る。フィルター殺菌され
た成分から脂質マイクロエマルジョンを減菌的に形成す
る選択がとられない場合、その選択は、すべての添加が
完結した後、全培地のフィルター殺菌を残す。
本発明の脂質マイクロエマルジョンを調製するために
好ましい乳化剤は、非毒性のポリマー界面活性剤、胆汁
塩、たとえばデオキシコレート、及び／又はリン脂質で
ある。好ましくは、乳化剤は、非毒性のポリマー界面活
性剤及び／又はリン脂質である。その非毒性ポリマー界
面活性剤は、非イオン性であり、そしてそのリン脂質乳
化剤はレシチンであることがさらに好ましい。水性及び
脂質溶液成分の両者に１又は複数の乳化剤がさらに存在
することが好ましい。
McCutcheon's Emulsifiers ＆ Detergentsの出版物
（McCutcheon Division of MC Publishing Co.,175 Roc
k Road,Glenn Rock,NJ.U.S.A.により出版された）は、
本発明の乳化剤として使用するための非毒性で非イオン
性のポリマー界面活性剤候補体の例を示す。単純な試験
が、本発明の範囲内の適切な乳化剤の選択のために概要
されている。
乳化剤は、細胞に対して非毒性であり、そして細胞増
殖、生殖及びそれによる生成物の発現に対して非阻害性
である、培地中の最終濃度で存在する。乳化剤は、それ
らが希釈されている培地中におけるよりも水性及び脂質
溶液成分において、それぞれ100又は1000因子、より濃
縮される。たとえば、水性成分10ml中、10％プルロニッ
クF68及び脂質溶液成分1ml中、25mgのTween 80がいった
ん、撹拌により混合され、脂質マイクロエマルジョンが
形成され、次にこれが１の培地に添加され、そしてそ
れぞれ0.1％（プルロニックF68のために100倍希釈度）
及び25mg/（Tween 80のために1000倍希釈度）の濃度
に希釈される。
ひじょうに時折りではあるが、水性又は脂質溶液成分
の体積の溶解性限界は、特定の乳化剤の最大で非毒性の
有益な濃度が全体として培地のために達する前に達する
ことができる。そのような事が生じる場合、乳化剤は培
地に直接添加され、すなわち、そのような添加が、保護
剤／乳化剤の保護及び／又は乳化効果を高めることによ
り、細胞に有益であることが決定される場合、脂質マイ
クロエマルジョン外に添加され得る。従って、本発明の
培地におけるプルロニックポリオールのための好ましい
濃度（重量／体積）は、約0.01％〜約１％であり；しか
しながら、プルロニックF68の溶解性限界は水中におい
て約10％であり、そして従って、10mlの水性成分は、最
終培地における乳化剤濃度範囲の高い方の濃度を適合せ
しめるために十分でないであろう。従って、追加のプル
ロニックF68の添加が、そのような添加が前記保護剤／
乳化剤の保護／乳化効果を最適にする必要があると思わ
れる場合、培地に直接行なわれ得る。10mlの水性成分に
おけるプルロニックF68の濃度は、好ましくは約１〜約1
0％、より好ましくは約５％〜約10％、及びさらにより
好ましくは約10％であろう。
好ましくは、水性成分中の乳化剤は、保護剤である。
保護剤は、撹拌され、そして／又はスパージされた培養
物における損傷及び死から細胞を保護するために機能的
に作用する非毒性で水溶性の化合物として本明細書で定
義される。
保護剤候補体は、まず、細胞培養の当業者に既知であ
る方法、たとえば培養のために選択される細胞の懸濁液
又は単層にそれを添加することにより、それが培養され
るべき細胞に対して非毒性であることを確認し、そして
その培養物の増殖と対照とを比較することにより選択さ
れ得る。次にその非毒性保護剤候補体は、小規模でより
抜きの細胞の撹拌され且つ／又はスパージされた培養物
にその候補体を添加し、そして適切な期間の後、生存率
及び増殖速度を観察し、そして対照培養物における細胞
の生存率及び増殖速度と前記培養物の細胞の生存率及び
増殖速度とを比較することにより、保護能力について試
験され得る。
本発明の培地のための非毒性で非イオン性のポリマー
界面活性保護剤／乳化剤候補体の源は、Edition of McC
utcheon's Emulsifiers ＆ Detergents,前記に見出され
る。
さらに好ましくは、水性成分中の乳化剤（又は複数の
乳化剤は、酸化プロピレン及び酸化エチレンのブロック
コポリマー（ポリオキシプロピレン ポリオキシエチレ
ン縮合体）である。好ましくは、そのような保護剤／乳
化剤は、プルロニックポリオール類、たとえばプルロニ
ックF68,F77,F88及びF108、好ましくはF68及びF88、よ
り好ましくはF68である。プルロニックポリオールは、B
ASF Wyandotte Corp.（101 Cherry Hill road,P.O.Box1
81,Parsippany NJ07054,U.S.A.）から入手される。
好ましくは保護剤／乳化剤の濃度は、損傷から細胞を
保護するのに最っとも効果的であるが、しかし細胞の増
殖、生殖及びそれによる生成物の発現に対して非阻害性
である濃度である。プルロニックポリオール保護剤／乳
化剤は、好ましくは約0.01％〜約１％、より好ましくは
約0.05％〜約0.5％及び最っとも好ましくは約0.1％の濃
度（重量／体積）で本発明の培地に存在する。
しかしながら、水性成分中の乳化剤が、本発明を実施
するための保護剤である必要はない。細胞増殖、生殖及
びウィルス、組換え体又は天然の生成物、たとえば抗体
又は生来のタンパク質の発現に対して非阻害性である非
毒性乳化剤が使用され得る。しかしながら、好ましく
は、水性成分中の乳化剤が保護剤でない場合、他の保護
剤が、培養物が十分に空気添加されている場合に培地に
含まれる。そのような他の保護剤は、好ましくは細胞表
面安定化剤及び／又は増粘剤及び／又は気泡界面活性緩
和剤であろう。非毒性のポリマー界面活性剤以外の好ま
しい保護剤の例は、ヒドロキシエチルスターチ、メチル
セルロース、カルボキシメチルセルロース（ナトリウム
カルボキシメチルセルロース）、デキストラン硫酸、ポ
リビニルピロリドン、フィコール（ficoll）、アルギン
酸及びポリプロピレングリコールである。
脂質溶液成分中の好ましい乳化剤は、リン脂質及び非
毒性で非イオン性のポリマー界面活性剤である。好まし
いリン脂質乳化剤はレシチンであり、そして好ましい非
毒性で非イオン性のポリマー界面活性剤は、下記式： 〔式中、Ｒは16〜20個（16,20も含む）の炭素原子を有
する飽和又は不飽和脂肪酸であり;tは10〜20（10,20も
含む）の整数であり；そしてｕは10〜20（10,20も含
む）の整数である〕で表わされるポリソルベート化合物
である。
最っとも好ましくは、そのようなポリソルベート化合
物乳化剤は、ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノ
オレエート（ポリソルベート80として知られている）で
ある。そのような非毒性非イオン性ポリマー界面活性剤
は、ICI Americas Inc.（New Murphy Road ＆ Concord
Pike,Wilmington,DE 19897,USA）からTween 80として入
手できる。もう１つのポリソルベート80は、Durkee Ind
ustrial Foods Group/SCM Corp.（900 Union Commerce
Bldg.,Cleveland,Ohio 44115,USA）からDurfax80として
入手できる。そのような非イオン性非毒性ポリマー界面
活性剤／乳化剤、たとえばポリソルベート80は、好まし
くは、約0.5mg/ml〜約75mg/ml、より好ましくは約1mg/m
l〜約30mg/ml及びより好ましくは約2.5mg/ml〜約25mg/m
lの濃度で本発明の脂質溶液成分中に存在する。
脂質溶液成分に添加され得る任意の成分は、還元剤／
抗酸化剤、たとえばジチオトレイトール、β−メルカプ
トエタノール及びモノチオールグリセロール（ここでこ
のモノチオールグリセロールは好ましい還元剤／抗酸化
剤である）を包含する。そのような成分は、それらが水
性及び脂質溶液成分の両者に溶解し、そして好ましく
は、選択された細胞系のために適切な濃度で脂質溶液成
分に添加される場合、両親媒性であると思われる。
乳化剤、保護剤／乳化剤、乳化剤の組合せ、又は保護
剤／乳化剤及び乳化剤（又は複数の乳化剤）の組合せが
本発明の培地に供給されるべき脂質を乳化するのに有効
であるかどうかの試験は、次の通りに簡単に行なわれ得
る。第１に、候補体乳化剤又は乳化剤の組合せが、候補
体保護剤のために上記のような態様で、選択された細胞
に対して非毒性であるものとして確認されるべきであ
る。第２に、その候補体保護剤が決定された非毒性濃度
で試験される。適切な脂質が適切な有機媒体、好ましく
はアルコール（C1−C3）、より好ましくはエタノールに
溶解される。次に候補体乳化剤又は乳化剤の組合せの個
々の乳化剤が、脂質溶液と共に混合され又は別の水性溶
液中に組合され、そしてこれは、溶液、すなわち有機溶
液又は水溶液に、その候補体乳化剤がより容易に混合さ
れることに依存する。次に、水性成分が脂質溶液成分に
添加され、そして激しく撹拌される。透明〜わずかに透
明なマイクロエマルジョンが、脂質が都合良く乳化され
る場合に形成されるはずである。
候補体乳化剤の選択試験に関しては、少なくとも１種
の乳化剤が、脂質溶液成分に及び１種が水性成分に存在
すべきである。たった１種の候補体乳化剤が試験される
場合、それは既知の乳化剤により試験され得、たとえば
候補体乳化剤が水に容易に混合される場合、それは脂質
溶液成分における乳化剤としてのTween 80により候補体
水性成分において試験され；ところが、候補体乳化剤が
適切な脂質の溶液に容易に混合できる場合、それは、水
性成分におけるプルロニックF68により試験される。も
う１つの選択は、水性及び脂質溶液成分の両者における
単一の候補体乳化剤を試験することであり、すなわちこ
こで、同じ乳化剤が候補体水性成分及び候補体脂質溶液
成分の両者に適切な濃度で存在するであろう。
本発明の細胞培養培地に供給されるべき脂質を乳化す
るための１つの選択は、二成分乳化剤システムであり、
ここで、上記のように、保護剤は、乳化剤及び保護剤で
あり、そして脂質溶液成分に存在する乳化剤又は乳化剤
の組合せと一緒に作用することができる。本発明の培地
の二成分乳化剤システムの好ましい例は、保護剤／乳化
剤、好ましくはプルロニックポリオール、より好ましく
はプルロニックF68又はプルロニックF88及びさらにより
好ましくはプルロニックF68、及び非毒性非イオン性ポ
リマー界面活性剤、好ましくはポリソルベート化合物及
びより好ましくはポリソルベート80の組合せである。
本発明の脂質を乳化するためのもう１つの選択は、保
護剤が有意に乳化しないが、しかし１又は複数の追加の
乳化剤が、脂質溶液成分に添加され、そしてマイクロエ
マルジョンを形成するためにその中に存在する乳化剤と
一緒に作用する水性成分に存在するシステムである。
本発明の脂質マイクロエマルジョンが添加される培地
の選択は、培養される特定の細胞に依存する。すべての
細胞タイプのための培地が市販されている。
たとえば、次の市販の基礎培地を含む昆虫細胞培養の
ための広範囲の種類の市販の培地が存在する：たとえば
トリプトースブイヨンを含まないTC10〔Microbiologica
l Associatesから入手できる;Garclinerなど.,J.Inver
t.Pathol.，25:363（1975）を参照のこと〕、Grace's A
ntheraeaの培地〔Vaughnなど.,TCA Manual,３（１）（1
976）;Yunkerなど.,Science，155:1565〜1566（196
7）〕,Medium M20 of Mark's〔Vaughnなど.,TCA Manua
l，３（１）（1976）;Marks,Kruseなど．（eds），Tiss
ue Culture Methods and Applications,153〜156ページ
（1973）〕,Goodwin's IPL−52培地〔Goodwin,In Virt
o，11:369〜378（1975）〕,Goodwin's IPL培地〔Goodwi
nなど.,Kurstakなど．（eds.），Invetebrate Systems
In Vitro（1980）〕Goodwin's IPL−76ペプトン培地〔G
oodwinなど.,前記;Goodwinなど.,In Vitro，14:485〜49
4（1978）〕,Hink's TMH FH培地（修正された〕〔Hink,
Nature（London），226:466〜467（1970）〕,Medium S
−301 of Hansen〔Hansen,In Maramorosch（ed.），Inv
ertebrate Tissue Culture Research Applications,75
〜99ページ（1976）;Vaughnなど.,TCA Manual,3（１）
（1976）〕、及びIPL−41培地〔Weissなど.,In Vitro，
17（６）:495〜502（1981）〕（ここでIPL−41が好まし
い基礎培地である）。
IPL−41基礎培地は市販されており、そしてWeissな
ど.,In Vitro，17（６）:495〜502（1981年６月）及びW
eissなど.,CRC Press,前記,70〜72ページ（1986）に記
載されている。
Weissなど．（In Vitro）の496ページでの第１表及
びWeissなど．（CRC Press）の71〜72ページでの第３表
は、IPL−41のすべての成分を概略し、そしてそれらの
割合をmg/で供給し；前記表は引用により本明細書に
組込まれる。Weissなど．（In Vitro）の497ページ
で、完全培地IPL−41の調製が記載されており、ここで
トリプトースホスフェートブイヨン（TPB）及びウシ胎
児血清（FBS）が添加されている。本発明の培地を調製
することに使用されるIPL−41基礎培地は好ましくは、
トリプトースホスフェートブイヨン（TPB）又はウシ胎
児血清（FBS）を含まない。“基礎培地”とは、無機
塩、糖、アミノ酸、場合によってはまた、ビタミン、有
機酸及び／又は緩衝液の栄養混合物として本明細書で定
義される。補足物と共に基礎培地は、細胞の寿命、増殖
及び生殖を支持する必要がある栄養物を供給する。本発
明の培地を調製するための出発点として使用される基礎
培地の選択は、臨界ではないが、しかし選択された細胞
系のために適切であるべきであり、そして好ましくはほ
とんど又はまったく、血清、血清アルブミン又は他の脂
質キャリヤーを含まないであろう。基礎培地はまた、細
胞寿命、増殖、生殖及び組換え体又はウィルス生成物の
発現及び抗体の生成を支持するのに必要とされるアミノ
酸及びビタミンのような必要な栄養物を供給する適切な
ペプトン及び脂質成分が選択され得るような態様におい
て任意であると思われる。
哺乳類細胞のための市販の培地として、下記のものを
挙げることができる：ダルベッコの変性されたイーグル
培地（DME;Irvine Scientific,Santa Ana,California U
SAから入手できる）;RPMI 1640培地（これもまた、Irvi
ne Scientificから入手できる）;HL−Ｉ（Ventrex Lab
s,Portland,Maine USA）;HB 104（Hana Biologicals,Be
rkeley,California USA）；イーグル最少必須培地；及
びHam F−12培地;RITC 80−７〔Yamaneなど.,Exp.Cell.
Res.，134:470（1981）〕;RITC 56−１〔Yamaneなど.,I
n Kohnoなど．（eds.），International Symposium on
Clinical Potentials and Interferons in Viral Disea
se and Malignant Tumors,355〜364ページ（1981）〕。
植物細胞培養のための培地の例は、Murashigeなど.,P
hysiol.Pland，15:473（1962）;Gamborgなど.,Exp.Cel
l．Res.，50:151（1968）；及びGamborgなど.,In Vitr
o，12:473（1976）に記載される例を包含する。
動物細胞、藻類、細菌、菌類及び原生動物のための培
養培地の例は、Coteなど．（eds.），ATCC Media Handb
ook，第１版1984,（ATCC 1984）に見出され得る。
本発明の培地はまた、他の好ましくは水溶性成分、た
とえばグルコース摂取を高めるためのインシュリン、鉄
輸送のためのトランスフェリン、セレンとしての微量元
素、ペルオキシル化保護剤としてのカタラーゼ、脂質前
駆体としてのエタノールアミン、テストステロンとして
のステロイドホルモン、トリヨードチロニンとしての甲
状腺ホルモン、核酸前駆体、たとえばヒポキサンチン、
チミジン、デオキシアデノシン及びデオキシチジン並び
にビタミン、鉱物、アミノ酸及び他の栄養物、たとえば
Ｌ−グルタミン、ピルビン酸、α−クリセロースホスフ
ェート、グリセロール、葉酸及びイノシトール（これら
は、細胞培養のために従来の血清供給又は血清フリー培
地に含まれる）を含むこともできる。そのような成分の
いくつかはタンパク質であるけれども、それらは、脂質
を担持する目的のために供給されず、そして好ましくは
低濃度で存在する。
本発明の脂質マイクロエマルジョンが添加される培地
を調製するための方法は、臨界ではない。培地は、たと
えば、まず、すべての成分及び添加物を、それぞれ適切
な濃度で水に溶解し、そして次に、殺菌された培養培地
を得るために、圧力下で前記溶液を膜フィルター上で濾
過することにより調製され得る。
本発明の培地による細胞の培養方法もまた、臨界でな
い。細胞は、従来の培養培地のための条件とおよそ同じ
条件下で本発明の培地中で培養される。但し、可能な場
合いつでも、細胞は、十分に酸素添加条件下で、すなわ
ち撹拌され且つ／又はスパージされた培地中で増殖せし
められるべきである。
一般的に、本発明の培地に増殖する昆虫細胞は、選択
された特定の細胞系のために適切な温度範囲及び条件下
で培養される。たとえば、スポドプテラ フルギペルダ
（Spodoptera frugiperda）細胞、好ましくはSf9細胞
は、約25℃〜約32℃、好ましくは約27℃〜約28℃の温度
範囲で培養され、そしてここで培養培地のpHは好ましく
は、約６〜約７、より好ましくは約6.2〜約6.4の範囲で
維持される。
本発明の培地は、細胞の増殖のためにだけでなく、ま
た有用な生理学的活性物質、たとえばインターフェロ
ン、リンホカイン及び抗体の産生のためにも利用でき
る。本発明の例によれば、組換えCSF−１は、本発明の
脂質マイクロエマルジョンを含む培地で培養される宿主
の昆虫細胞により産生される。“コロニー刺激因子（CS
F−１）”は、CSF−１について当業界で理解される活性
の範囲を示すタンパク質に関し、すなわち、Metcalf,J.
cell Physiol.，76:89（1970）の標準のイン ビトロコ
ロニー刺激アッセイに適用される場合、それは初めにマ
クロファージコロニーの形成をもたらす。生来のCSF−
１はグリコシル化された二量体であり；二量体化は、活
性のために必要である。用語CSF−１は、二量体及び単
量体形の両者を言及する。
バキュロウィルスの発現ベクターシステム（BEVS）を
通して昆虫細胞に発現される他の異種タンパク質が、Su
mmersなど.,Banbury Report:Genetically Altered Viru
ses in the Environment，22:319〜329（1985）に概略
されている。しかしながら、この開示の利益を有する当
業者は、多くの他の組換えタンパク質が本発明に従っ
て、動物。植物及び／又は微生物細胞により生成され得
ることを認識するであろう。典型的な組換えタンパク質
は、変性されたプロウロキナーゼ又はウロキナーゼ、組
織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）、TPA−ウロキナ
ーゼハイブリッド、毒性タンパク質、たとえば完全なリ
シン毒素、リシンＡ鎖、リシンＡを含む生成物、並びに
インターフェロン（α，β及びγ及びそれらのハイブリ
ッド）、インターロイキン、腫瘍壊死因子、エリトロポ
エチン及び他の造血増殖因子、ヒト成長ホルモン、並び
にブタ、ウシ及び他の成長ホルモン、上皮増殖因子、イ
ンシュリン、Ｂ型肝炎ワクチン、スーパーオキシドジス
ムターゼ、第VIII因子、第VIII C因子、心房のナトリウ
ム排泄因子、ネコ白血病ウィルスワクチン、たとえばgp
70ポリペプチド、レシチン、たとえばリシンコムムニス
（Ricin communis）のアグルチニン（RCA）、ジフテリ
ア毒素、ゲロニン、プスードモナス アエルギノサ（Ps
eudomonas aeruginosa）からの外毒素、ファトラカ
アメリカナ（Phytolacca americana）からの毒性タン
パク質（PAP I,PAP II及びPAP−Ｓ）、バシラス トリ
ンギエンシス（Bacillus thuringiensis）からの殺虫
性タンパク質、多くの酵素、たとえばCAT、及び無数の
他のハイブリッドタンパク質を包含するが、制限コロニ
ー刺激因子〔たとえば、数ある中で長い及び短い形のCS
F−１又はＭ−CSF,G−CSF,GM−CSF及びインターロイキ
ン−３〕は包含しない。
さらに、上記のように、種々のモノクローナル抗体
は、本発明の培地で培養されたハイブリドーマにより産
生され得、そして種々のウィルス生成物は、そのように
して培養された昆虫細胞から産生され得る。
主に本発明の培地は、マイクロキャリヤー養培物を含
む懸濁培養のために使用される。しかしながら、本発明
の脂質マイクロエマルジョンは、脂質が有益な添加と思
われるいづれかの培地に添加され得る。一般的に、細胞
が、血清、アルブミン、他のタンパク質性脂質キャリヤ
ー又は他の非タンパク質性脂質キャリヤー、たとえばシ
クロデキストリン又はシクロデキストリンの混合物（Ya
maneなど.,前記；アメリカ特許第4,533,637号を参照の
こと）が使用される培地中で都合良く増殖される場合、
その細胞は、脂質が脂質マイクロエマルジョンとして供
給されている本発明の培地中で増殖され得る。
細胞に供給される脂質は、臨界でない。それらは、そ
れらが必須の又は増殖促進栄養物、物理的又は化学的保
護剤として、又は他の機能を有するものとして、たとえ
ば加溶媒分解剤、膜変性剤、表面張力緩和剤及び／又は
細胞表面安定化剤として考慮されても、本発明のマイク
ロエマルジョンとして供給され得る。
細胞は、動物、微生物又は植物起源のものである。動
物細胞の場合、それらは脊椎動物又は無脊椎動物からで
ある。好ましくは、その細胞は、組換え体、ウィルス及
び／又は天然の生成物を産生することができる細胞であ
る。典型的な脊椎動物細胞は、哺乳類細胞、たとえばリ
ンパ球、繊維芽細胞、上皮細胞、卵巣細胞、及びそれら
の形質転換された細胞、種々の悪性細胞及びそれらに由
来するハイブリドーマである。より特定には、哺乳類細
胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、エプスタ
イン−バールウィルス（EBV）−形質転換ヒトリンパ芽
球細胞系、たとえばUMCL及びC51804、ヒトバーキットリ
ンパ腫由来のナマルワ細胞、ネズミリンパ球細胞由来の
骨髄腫SPI細胞、ヒト繊維芽細胞、たとえばHEL及びIMR
−90、ヒト腫瘍に由来する上皮細胞、たとえばHeLa−
S3,Hep−２及びKB、ヒト一次培養細胞、ウサギYoshida
肉腫細胞、ハムスターの繊維芽細胞BHK−21、ネズミ繊
維芽細胞3T3、ネズミリンパ腫細胞YAC−１、ヒト／マウ
スハイブリドーマ、たとえば抗−LPS IgMを産生する安
定細胞系Ｄ−234−４−27−８（1984年８月10日、ATCC
寄託番号HB8598としてAmerican Type Culture Collecti
on,Rockville,Maryland USAに寄託されている）及びヒ
ト繊維芽細胞インターフェロンに対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを包含する。
典型的な無脊椎動物細胞は、昆虫細胞、好ましくは野
生型ウィルス又は組換えバキュロウィルスのいづれかに
よる感染に基づいてウィルス又は組換え生成物を産生す
ることができ、そして血清、アルブミン、他のタンパク
質及び／又は他の脂質キャリヤーを含む培地で増殖し、
生殖し、そして組換え体及び／又はウィルス生成物を発
現することが示されている細胞である。たとえば、およ
そ10％の血清を含むIPL−41基礎培地で増殖され得る昆
虫細胞は、脂質が本発明のマイクロエマルジョンとして
供給されている培地中で増殖され得る。そのような昆虫
細胞系は、ボムビックス モリ（Bumbyx mori）、リマ
ントリア ジスパー（Lymantria dispar）、トリコプ
ルシア ニ（Trichoplusia ni）及びスポドプテラ フ
ルギペルダ（Spodoptera frugiperda）を包含する。
〔一般的に、Granadosなど．（eds.），The Biology of
Baculoviruses（CRC Press 1986）;Vaughn,Adv.Cell.C
ult.,1:281（1981）;Vaughn,J.Invert.Pathol.,28:233
（1976）;Vaughn,In Maramorosch（ed.），Invert.Tiss
ue Culture:Research Applics.,295ページ（1976）；及
びVaughn,In Barigozzi（eds.）Proceedings of Intern
atl.Colloq.invert.Tissue Culture，（2nd,Tremezzo,1
967）,119ページ（1968）を参照のこと。〕 さらに、本発明の培地で増殖され得る昆虫細胞は、好
ましくは、バキュロウィルス発現ベクターシステム又は
他の野生型ウィルスに対して宿主であり得る昆虫網のい
づれかの目からであるが、好ましくは双翅目又は鱗翅目
からである。約300種の昆虫が、核多角体病ウィルス（N
PV）病を有することが報告されており、そしてこれらの
多くは（243）は、鱗翅目から単離された。〔Weissな
ど.,“Cell Culture Method for Large−Scale Propaga
tion of Baculoviruses,"In Granadosなど．（eds.），
The Biology of Baculoviruses:Vol.II Practical Appl
ication for Insect Control,63〜87ページ（64ページ
で）（1986）。〕次の昆虫に由来する昆虫細胞系が典型
的である：カルポカプサ ポモネラ（Carpocapsa pomo
nella）（好ましくな細胞系CP−128）；トリコルシア
ニ（Trichoplusia ni）（好ましくは細胞系TN−30
8）；オートグラファ カルホルニカ（Autographa cal
ifornica）；スポドプテラ フルギペルダ（Spodoptera
frugiperda）（好ましくは細胞系Sf9）；リマントリ
ア ジスパー（lymantria dispar）；マメストラ ブ
ラシカエ（Mamestra brassicae）；アエデス アルボ
ヒクタス（Aedes albopictus）；オルギア プスード
ツガタ（Orgyia pseudotsugata）；ネオジプリオン
セルチフェル（Neodiprion sertifer）；アエデス ア
エジプチ（Aedes aegypti）；アンテラエ エウカルプ
チ（Antheraea encalypti）；ゴノリモスケア オペル
クラエ（Gnorimoschema opercullela）；ガラリア メ
ロネラ（Galleria mellonella）；スポドプテラ リト
ラリス（Spodoptera littolaris）；ブラテラ ゲルマ
ニカ（Blatella germanica）；ドロソフィア メラノ
ガステル（Drosophilla melanogaster）；ヘルオチス
ゼア（Heliothis zea）；スポドプテラ イクシグア
（Spodoptera exigna）；ラシプルシア オウ（Rachip
lusia ou）；プロジア インテルプンクテラ（Plodia
interpunctella）；アムサエタ モオレイ（Amsaeta
moorei）；アグロチス ｃ−ニグラム（Agrotis ｃ
−nigrum）；アドキソファイエス オラナ（Adoxophyes
orana）；アグロチス セグタム（Agrotis segetu
m）；ボムビックス モリ（Bombyx mori）；ハイポノ
メウタ マリネラス（Hyponomeuta malinellus）；コ
リアス コーリテム（colias curytheme）；アンチカ
ルシアゲルメタリア（Anticarsia germmetalia）、ア
パンテレス メラノスセラス（Apanteles melanoscelu
s）；アルクチア カジャ（Arctia caja）及びポルテ
トリア ジスパー（Porthetria dispar）。好ましい昆
虫細胞系は、スポドプテラ フルギペルダからであり、
そして細胞系Sf9が特に好ましい。本発明の例に使用さ
れるSf9細胞系は、Max D.Summers（Texas A ＆ M Unive
rsity,College Station,TX77843 USA）から得られた。
他のS.フルギペルダ細胞系、たとえばIPL−Sf−21AE II
Iは、Vaughnなど.,In Vitrok，13:213〜217（1977）に
記載される。
本発明の培地に培養される好ましい昆虫細胞系は、多
くの昆虫病原ウィルス、たとえばパルボウィルス、ポッ
クスウィルス、バキュロウィルス及びラブドウィルスの
生殖のために適切であり、この中で、バキュロウィルス
のグループからの核多角体病ウィルス（NPV）及び顆粒
症ウィルス（GV）が好ましい。NPVウィルス、たとえば
オートグラファspp.,スホドプテラspp.,トリコプルシア
spp.,ラシプルシアspp.,ガラリアspp.及びリマントリア
spp.からのウィルスがさらに好ましい。Smithなど.,J.V
irol.，30:828〜838（1979）;Smithなど.,J.Virol.，3
3:311〜319（1980）；及びSmithなど.,Virol.，89:517
〜527（1978）により特徴づけられ、そして記載される
バキュロウィルス株オートグラファ カリホルニカNPV
（AcNPV）、ラシプルシア オウNPV、ガラリア メロネ
ラNPV及びAcNPVのいづれかプラーク精製株、たとえばE
2,R9,S1,M3がより好ましい。
Smithなどによるヨーロッパ特許出願第127,839号（19
84年12月12日に公告された）は、宿主の昆虫細胞に選択
された遺伝子を発現することができる組換えバキュロウ
ィルス発現ベクターの産生方法を記載する。前記ヨーロ
ッパ出願は、引用により本明細書に組込まれる。組換え
バキュロウィルス発現ベクターは、宿主の昆虫細胞中に
野生型バキュロウィルスDNAを同時トランスフェクトさ
れ、ここで組換えが生じる。次に、組換えバキュロウィ
ルスが、EP 127,839及びSummersなど.,“A Manual and
Method for Baculovirus Vectors and Insect Cell Cul
ture Procetdures,"Texas Agricultural Experiment Bu
lletin No.1555（Texas A ＆ M Univ.;1987年５月）に
記載される方法に従って検出され、そして単離される。
次にその得られた組換えバキュロウィルスを用いて、培
養された昆虫細胞を感染し、そして導入された選択遺伝
子からのタンパク質生成物が昆虫細胞により発現され、
そして培地中に分泌される。組換えAcNPV発現ベクター
（このゲノム中に適切な遺伝子が挿入されている）によ
り感染されたS.フルギペルダ細胞の培養を通して組換え
β−インターフェロン、インターロイキン−２及びクロ
ラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（CA
T）の生成がここに例示される。そのような組換えバキ
ュロウィルス発現システム及び組換えタンパク質の発現
におけるその使用に関する情報は、Summersなど.,前記
に見出される。
下記例に言及される組換えバキュロウィルス トラン
スファーベクターpAcM4及びpAcM6は、それぞれ寄託番号
67429及び67438として、1987年６月12日、American Typ
e Culture Collection（ATCC）〔12301,Parklawn Driv
e,Rockville,MD 20852（U.S.A.）〕に寄託されている。
前記ベクターもまた、寄託され、そしてそれぞれCMCC第
3002号及びCMCC第2996号としてCetus Master Culture C
ollection（CMCC）に保持されている。組換えバキュロ
ウィルスAcM4は、rCSF−１の150個のアミノ酸形をコー
ドするヌクレオチド配列を担持し、そして組換えバキュ
ロウィルスAcM6は、rCSF−１の522個のアミノ酸形をコ
ードするヌクレオチド配列を担持する。
組換えバキュロウィルスによる昆虫細胞の感染の時期
の効果は、増強された特異的生産性に対して臨界的であ
ることが示された。その組換えタンパク質の特異的生産
は、非酸性制限条件下での細胞増殖の指数増殖相の間、
一定であることが見出された。非指数増殖条件下での遅
い感染は、低い特異的生産性及び低い最終力価をもたら
した。好ましくは、指数増殖相は、組換えタンパク質生
成物の最高の合計生産性を達成するために最高の可能性
ある細胞密度に拡張される。制限増殖、たとえば細胞増
殖の定常期における条件下での宿主の昆虫細胞の感染
は、組換えタンパク質生成物の減じられた特異的生産性
をもたらす。
組換えタンパク質生成物の特異的生産性（Ｕ又はmg/
細胞）は比較的、培養物が指数増殖期に存在する限り、
感染の時期で細胞密度に無関係である。たとえば、スポ
ドプテラ フルギペルダ細胞が宿主の昆虫細胞であり、
そして本発明の培地が好ましい場合、上記の事が生じ
る。
約1.0×106〜約4.0×106個の細胞/ml、好ましくは約
2.5〜約3.5×106個の細胞/mlの細胞密度が、組換えバキ
ュロウィルスによる感染のために好ましい。
バキュロウィルス発現ベクターシステムを用いる場
合、組換えタンパク質生成物の収穫の時期は、ウィルス
及び細胞溶解による組換えタンパク質の汚染を避けるた
めに及びそれにより組換えタンパク質の下流の精製を単
純にするために臨界的である。生成物の安定性を考慮す
れば、有意な細胞溶解が生じる前、組換え生成物を収穫
することが好ましい。
さらに、本発明の培地に発現される個々の組換え体、
ウィルス又は生来の生成物は、発行が行なわれる間、安
定性及び分解について調べられるべきである。最適な収
穫時期の決定が、そのような考慮でわかるべきである。
次の例は、本発明の水性及び脂質溶液成分、脂質マイ
クロエマルジョン、培地及び方法をさらに例示する。こ
れらの例は、例示的であって、制限するものではない。
例１ 哺乳類細胞のための脂質マイクロエマルジョン調製 タラの肝油10mg、コレステロール4.5mg、α−トコフ
ェロールアセテート2.0mg及び25mgのTween 80を、エタ
ノール10ml中に添加し、それらを溶解し、そしてその溶
液をフィルター殺菌した。哺乳類培養培地および１の
ために十分な量の脂質マイクロエマルジョンを調製する
ために、水中、10％プルロニックF68（10ml）を、脂質
溶液成分1mlに、撹拌しながら、ゆっくり且つ無菌状態
で添加した。すでにフィルター殺菌された培養培地に添
加され得るマイクロエマルジョンを形成した。
例２ 哺乳類細胞のための脂質マイクロエマルジョン調製 モノチオールグリセロール10mg、リノール酸10mg、レ
シチン10mg、コレステロール5mg、α−トコフェロール
アセテート5mg及び20mgのTween 80を、エタノール10ml
中に添加し、そして溶解した。哺乳類培養培地およそ１
のために十分な量の脂質マイクロエマルジョンを調製
するために、水中、10％プルロニックF68（10ml）を、
脂質溶液成分1mlに撹拌しながら、ゆっくりと添加し
た。その工程の間、脂質の損失を伴わないでフィルター
殺菌され得る培養培地に添加され得る脂質マイクロエマ
ルジョンを形成した。
例３ 昆虫細胞のための脂質マイクロエマルジョン調製 タラの肝油100mg,250mgのTween 80、コレステロール4
5mg及びα−トコフェロールアセテート20mg、をエタノ
ール10mlに添加し、そしてそれらを溶解した。次に、そ
の脂質溶液成分をフィルター殺菌した。
昆虫培養培地約１のために十分な量の脂質マイクロ
エマルジョンを調製するために、10％プルロニックF68
（10ml）を、脂質溶液成分1mlに撹拌しながらゆっくり
且つ無菌条件下で添加した。すでにフィルター殺菌され
た昆虫細胞培養培地に添加され得るマイクロエマルジョ
ンを形成した。
例４ 脂質マイクロエマルジョンを含む血清フリー培地におけ
る昆虫細胞の増殖 Sf9細胞の培養物5mlを、多くの継代のためにISFM−３
及びISFM−４培地の両者を有する、27℃で100〜150rpm
（0.5インチの軌道半径を有する）で撹拌される250mlの
振盪フラスコ中で増殖せしめた。前記培地は、上記例３
に記載される脂質マイクロエマルジョンを含む。最初
に、ISFM−４培養物は、ISFM−３よりも長い遅滞期を有
するが、しかし第３継代までに、両培養物は同等に増殖
し、そして短い遅滞期を有した。ISFM−３及びISFM−４
培養物の両者は、従来の血清含有昆虫培養培地よりも長
い遅滞期を有する。両培地における８継代の平均増殖特
徴が、下記第２表に示される。これらの培地は、類似す
る培養条件下で10％血清を含む培地に見出されるものと
比較できる増殖速度（Td＝17〜24時間）、約５×106個
の細胞/mlの最大細胞密度及び細胞の生存率（99〜100
％）を付与する。
例５ 脂質マイクロエマルジョンを含む血清フリー培地におい
て増殖される昆虫細胞による組換えCSF−１の生成 上記例４に記載される方法による25〜30継代（75〜12
0世代）のために増殖されたSf9細胞を、バキュロウィル
ス発現ベクターシステムによるrCSF−１の産生について
試験した。トリプトースホスフェートブイヨン（2.6g/
）及び10％ウシ胎児血清を含むIPL−41完全培地にお
けるSf9培養物を、対照として使用した。例４で使用さ
れる培地、すなわち上記詳細な説明に記載されるような
BSAを含まないSFM2Mへの追加の培地がまた、この例に使
用される。
組換えバキュロウィルスAcM4を用いて、１の感染の多
重度で指数的に増殖する培養物を感染せしめた。第３表
に示されるように、血清を含む培養物及び本発明の脂質
マイクロエマルジョンを含む血清フリー培養物は、RIA
により評価される場合、類似するレベルのrCSF−１（約
106U/ml）を生成した。
例６ 昆虫細胞は、血清を含む培地から、脂質マイクロエマル
ジョンを含む血清フリー培地に容易に適合する 10％血清を含む培地、すなわちIPL−41完全培地に維
持されるSf9細胞は、第１及び第２継代の後、BSAを含ま
ないSFM2M,ISFM−３及びISFM−４に容易に適合した。続
く継代及び組換えバキュロウィルスAcM4及び第２組換え
バキュロウィルスAcM6による感染は、脂質マイクロエマ
ルジョンを含むそのような培地が、昆虫細胞の大規模増
殖のために及び組換えバキュロウィルス発現ベクターシ
ステムによる組換えタンパク質生成物の産生のために適
切な培地であることを確証した。
寄 託 前記にように、Ｅ．コリ/MM294における組換えバキュ
ロウィルストランスファーベクターpAcM4及びpAcM6は、
それぞれATCC番号67429及び67428として、1987年６月12
日、American Type Culture Collection（ATCC）,12001
Parklawn Drive,Rockville,MD20852（U.S.A.）に寄託
された。さらにハイブリドーマ細胞系Ｄ−234−427−８
は、寄託番号HB8598として1984年８月10日、ATCCに寄託
された。
前記寄託は、ATCCと本特許出願の被譲渡人、シータス
・コーポレーション（Cetus Corporation）の間の契約
に従ってなされた。ATCCとの契約はその寄託を記載し、
及び確認する本願に関する米国特許の発行或いは任意の
米国或いは外国特許出願の公告或いは公開の内最初に来
るものの時点において、該菌株及びその継代物の永久的
利用可能性を公衆に提供するものであり、又、その菌株
及びその継代物の利用可能性を35USC §122及びそれに
従う特許庁長官規則（特に886 OG 638に関して37 CFR
§1.14を含む）に従って米国特許庁長官により権限があ
るものと決定されたものに提供するものである。本願の
被譲渡人は、寄託中の菌株が適当な条件下に培養された
際に死亡或いは紛失或いは破壊されるならば、それを通
知を受けてから迅速に同一菌株の生きた培養物と取換え
ることに同意した。
ブダペスト条約の条件下の寄託は、寄託された微生物
の試料を提供する最も最近の請求がATCCにより受取られ
た後、少なくとも５年間の間及び如何なる場合において
も寄託日後少なくとも30日間生きた且つ非汚染状態で該
寄託培養物が維持されることを保障する。
寄託された菌株の利用性は、その特許法律に従って政
府の権力下で承諾される権利に違反して本発明を実施す
る許可として解釈されるべきでない。
又、本発明は寄託された実施態様は本発明の特別の面
を例示することのみを目的としたものであるので寄託さ
れた組換えトランスファーベクターによって制限される
ものと考えられてはならない。機能的に寄託されたもの
と同等の任意の組換えバキュロウィルストランスファー
ベクターは本発明の範囲内のものと考えられる。更に、
本発明において示され、及び説明されたものに加えて、
当業者に明らかな各種本発明の修正は前記説明から冒頭
に掲げた特許請求の範囲に入るものと考えられる。
フロントページの続き (56)参考文献 Ｅ．ＫＵＲＳＴＡＫ編「Ｉｎｖｅｒｔ ｅｂｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」（1980）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ／ＮＯＲＴＨ−ＨＯＬＬＡＮＤ ＢＩＯ ＭＥＤＩＣＡＬ ＰＲＥＳＳ 67−77頁 Ｐ．ＡＮＮ ＲＹＡＮ他著［ＥＸＰＥ ＲＩＭＥＮＴＡＬ ＣＥＬＬ ＲＥＳＥ ＡＲＣＨ］（1972）ＶＯＬ．172，ｎｏ. ２ 第318−328頁 ＷＩＬＬＩＡＭ Ｊ．ＢＥＴＴＧＥＲ ［ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ」Ｖｏｌ．78，Ｎｏ．９ 第 5588−5592頁 ＭＩＺＲＡＨＩ他著「ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯ ＢＩＯＬＯＧＹ」（1975）ＶＯＬ．２, ＮＯ．１、11−13頁 ＭＩＺＲＡＨＩ著「ＤＥＶＥＬＯＰ. ＢＩＯＬ．ＳＴＡＮＤＡＲＤ」（1982) Ｖｏｌ．55、93−102頁 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 5/00 - 5/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】脂質がマイクロエマルジョンの形態で供給
    される無血清細胞培養培地であって、該マイクロエマル
    ジョンが、水中に１又は複数の乳化剤を含む水性成分
    と、有機溶媒中に１又は複数の脂質及び１又は複数の乳
    化剤を含む、煮沸することなく予め生成された脂質溶液
    成分とを、撹拌しながら組み合わせることによって調製
    される、細胞培養培地。
  2. 【請求項２】前記乳化剤が、リン脂質、及び／又は、酸
    化プロピレンと酸化エチレンとのブロックコポリマー及
    び下記式： ［式中、Ｒは16〜20個（16、20も含む）の炭素原子を有
    する飽和又は不飽和脂肪酸であり:tは10〜30（10、30も
    含む）の整数であり；そしてｕは10〜20（10、20も含
    む）の整数である］で表されるポリソルベート化合物か
    ら成る群から選択される非毒性非イオン性ポリマー界面
    活性剤である、請求の範囲第１項記載の細胞培養培地。
  3. 【請求項３】前記乳化剤又は前記水性成分の１又は複数
    の乳化剤がまた、保護剤である、請求の範囲第２項記載
    の細胞培養培地。
  4. 【請求項４】前記水性成分中の乳化剤／保護剤が、酸化
    プロピレンと酸化エチレンとのブロックコポリマーから
    成る群から選択される非毒性非イオン性ポリマー界面活
    性剤である、請求の範囲第３項記載の細胞培養培地。
  5. 【請求項５】前記酸化プロピレンと酸化エチレンとのブ
    ロックコポリマーがプルロニックポリオールである、請
    求の範囲第４項記載の細胞培養培地。
  6. 【請求項６】前記プルロニックポリオールが、プルロニ
    ックF68、F77、F88及びF108から成る群から選択され
    る、請求の範囲第５項記載の細胞培養培地。
  7. 【請求項７】１又は複数のリン脂質及び／又は１又は複
    数のポリソルベート化合物が、前記脂質溶液成分内の乳
    化剤である、請求の範囲第２項記載の細胞培養培地。
  8. 【請求項８】前記脂質溶液成分の乳化剤がポリオキシエ
    チレン（20）ソルビタンモノオレエート及び／又はレシ
    チンである、請求の範囲第７項記載の細胞培養培地。
  9. 【請求項９】前記脂質溶液成分の乳化剤がポリオキシエ
    チレン（20）ソルビタンモノオレエートであり、該脂質
    溶液成分における該乳化剤の濃度が約0.5mg/ml〜約75mg
    /mlであり、そして前記水性成分中のプルロニックF68が
    約１％〜約10％の濃度（重量／体積）で存在する、請求
    の範囲第８項記載の細胞培養培地。
  10. 【請求項１０】無血清培養培地のための無血清脂質マイ
    クロエマルジョンであって、水中に１又は複数の乳化剤
    を含む水性成分と、有機溶媒中に１又は複数の脂質及び
    １又は複数の乳化剤を含む、煮沸することなく予め生成
    された脂質溶液成分とを、撹拌しながら組み合わせるこ
    とによって調製される、脂質マイクロエマルジョン。
  11. 【請求項１１】前記脂質が、不飽和脂肪酸、多不飽和脂
    肪酸メチルエステルの混合物、脂質可溶性ビタミン及び
    ステロールから成る群から選択され、前記有機溶媒がC1
    〜C3アルコールであり、そして前記乳化剤が、リン脂質
    及び非毒性非イオン性ポリマー界面活性剤から成る群か
    ら選択される、請求の範囲第10項記載の無血清脂質マイ
    クロエマルジョン。
  12. 【請求項１２】前記脂質が、リノール酸、リノレン酸、
    オレイン酸；魚の肝油；ビタミンＡ、Ｄ及びE;及びコレ
    ステロールから成る群から選択され； 前記有機溶媒がエタノールであり；そして 前記乳化剤が、レシチン及びポリソルベート化合物から
    成る群から選択される請求の範囲第11項記載の無血清脂
    質マイクロエマルジョン。
  13. 【請求項１３】還元剤／抗酸化剤をさらに含む、請求の
    範囲第12項記載の無血清脂質マイクロエマルジョン。
  14. 【請求項１４】前記還元剤／抗酸化剤がモノチオールグ
    リセロールである、請求の範囲第13項記載の無血清脂質
    マイクロエマルジョン。
  15. 【請求項１５】無血清細胞培養培地内に脂質を分散する
    方法であって： 有機溶媒中に１又は複数の脂質及び１又は複数の乳化剤
    を含む脂質溶液成分を、煮沸することなく予め生成する
    工程； 水中に１又は複数の乳化剤を含む水性成分と該脂質溶液
    成分とを撹拌により組み合せて、脂質マイクロエマルジ
    ョンを生成する工程；および 該培地に該脂質マイクロエマルジョンを添加する工程 を包含する、方法。
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