JP2782347B2 - Concentration and purification method of neutral glycosphingolipid - Google Patents
Concentration and purification method of neutral glycosphingolipidInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、牛乳等に含まれている中性スフィンゴ糖脂
質を効率よく精製する方法に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for efficiently purifying neutral glycosphingolipids contained in milk and the like.
（従来の技術） 糖脂質は、グリコリピッドともいい、炭水化物と脂質
を主成分とするもので、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖
脂質などに分類される。(Prior art) Glycolipids, also called glycolipids, are mainly composed of carbohydrates and lipids, and are classified into glyceroglycolipids, glycosphingolipids and the like.
近年、この脂質に関する研究が、医学及び薬学の分野
を中心に、盛んに行われるようになり、その生理的機能
性が注目されるようになってきている。In recent years, research on this lipid has been actively conducted mainly in the fields of medicine and pharmacy, and its physiological functionality has been attracting attention.
このうち、スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴシンのア
ミノ基に脂肪酸が酸アミド結合した構造を持つセラミド
の一級アルコールに各種の糖類がグリコシド結合した糖
脂質の総称であり、中性スフィンゴ糖脂質と酸性スフィ
ンゴ糖脂質とから成っている。このスフィンゴ糖脂質
は、種々の動物組織に存在していることが知られてお
り、細胞や組織の発生・分化、神経機能、感染及び正常
細胞の悪性化などに関係していると言われている。Of these, glycosphingolipid is a generic name for glycolipids in which various sugars are glycoside-linked to primary alcohols of ceramide having a structure in which a fatty acid is acid-amide bonded to the amino group of sphingosine, and neutral glycosphingolipids and acidic glycosphingolipids. Consists of lipids. This glycosphingolipid is known to be present in various animal tissues, and is said to be involved in the development and differentiation of cells and tissues, nervous function, infection and malignant transformation of normal cells. I have.
また、永井らの脂質化学研究、第27巻、182〜185頁
（1985）、藤野らの日本畜産学会報、第40巻、第８号、
349〜354頁（1969）、及び森らの日本畜産学会報、第41
巻、第２号、75〜79頁（1970）など、牛乳中に含有され
るスフィンゴ糖脂質に関する研究が行われており、酸性
スフィンゴ糖脂質のガングリオシドや中性スフィンゴ糖
脂質のグリコシルセマミド、ラクトシルセラミドなど比
較的多く存在していることが明らかにされている。Also, Nagai et al., Lipid Chemistry Research, Vol. 27, pp. 182-185 (1985), Fujino et al., Bulletin of the Japanese Society of Animal Husbandry, Vol. 40, No. 8,
349-354 (1969), and Mori et al.
Vol. 2, No. 2, pp. 75-79 (1970), studies on glycosphingolipids contained in milk have been conducted, and gangliosides of acidic glycosphingolipids and glycosyl semamides of neutral glycosphingolipids, It has been shown that silceramide is present in relatively large amounts.
一方、一般的に行われている中性スフィンゴ糖脂質の
調製方法として、酢酸またはトリクロル酢酸などの酸で
蛋白質と複合体を形成している中性スフィンゴ糖脂質を
沈澱させ、その沈澱物に、クロロホルム−メタノール混
合液などのアルコールを含む有機溶媒を加えて、蛋白質
との複合体から中性スフィンゴ糖脂質を分離、抽出する
方法が行われている。しかし、このような方法では、比
較的高含有量の中性スフィンゴ糖脂質を含む組成物を得
ることはできず、従って、効率よく中性スフィンゴ糖脂
質を精製できないという問題がある。このような事情に
より、牛乳等に含まれる中性スフィンゴ糖脂質を工業的
規模で調製することは、事実上、困難であった。On the other hand, as a general method of preparing a neutral glycosphingolipid, a neutral glycosphingolipid which forms a complex with a protein with an acid such as acetic acid or trichloroacetic acid is precipitated, and the precipitate is A method of separating and extracting a neutral glycosphingolipid from a complex with a protein by adding an organic solvent containing an alcohol such as a mixed solution of chloroform and methanol has been performed. However, in such a method, a composition containing a relatively high content of neutral glycosphingolipid cannot be obtained, and therefore, there is a problem that the neutral glycosphingolipid cannot be efficiently purified. Under such circumstances, it has been practically difficult to prepare a neutral glycosphingolipid contained in milk or the like on an industrial scale.
（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、先に、牛乳ガングリオシドを含む乳質
物質に蛋白質加水分解酵素を作用させて蛋白質を分解
し、得られた蛋白質仮睡分解溶液を限外濾過法、ゲル濾
過法、或いは透析法などから選ばれる方法で処理するこ
とにより、牛乳ガングリオシドを濃縮調製する方法（特
開昭63−269992）を提案した。(Problems to be Solved by the Invention) The present inventors firstly used a protease to act on a milk substance containing milk ganglioside to degrade proteins, and ultrafiltrated the obtained protein napsis solution. A method for concentrating and preparing milk ganglioside by treating with a method selected from the group consisting of a method, a gel filtration method and a dialysis method has been proposed (JP-A-63-2699992).
その後、上述の牛乳ガングリオシドを濃縮調製する方
法により得られた組成物中には、酸性スフィンゴ糖脂質
のガングリオシドと共に、中性スフィンゴ糖脂質、特に
グリコシルセラミド及びラクトシルセラミドが、比較的
多く存在していることの知見を得て、この牛乳ガングリ
オシドを濃縮調製する方法を牛乳等に含ませる中性スフ
ィンゴ糖脂質の抽出、精製の際に、前処理法として応用
することにより、効率よく中性スフィンゴ糖脂質を精製
する方法を成すに至った。Thereafter, in the composition obtained by the above-mentioned method of concentrating and preparing milk ganglioside, along with the ganglioside of acidic glycosphingolipids, neutral glycosphingolipids, particularly glycosylceramide and lactosylceramide, are present in relatively large amounts. It has been found that the method for concentrating and preparing this milk ganglioside is applied as a pretreatment method during the extraction and purification of neutral glycosphingolipids contained in milk, etc. A method for purifying lipids has been achieved.
従って、本発明では、牛乳等に含まれる中性スフィン
ゴ糖脂質を効率よく精製する方法を提供することを課題
とする。Therefore, an object of the present invention is to provide a method for efficiently purifying neutral glycosphingolipids contained in milk and the like.
以下、本発明を説明する。 Hereinafter, the present invention will be described.
（課題を解決するための手段） 本発明に係る中性スフィンゴ糖脂質の精製法は、一般
的な中性スフィンゴ糖脂質の抽出、精製の操作に先立っ
て、中性スフィンゴ糖脂質を含む物質に蛋白質加水分解
酵素を作用させて蛋白質を加水分解し、得られた蛋白質
加水分解溶液を、例えば限外濾過法、ゲル濾過法、或い
は透析法などから選ばれる方法で処理して中性スフィン
ゴ糖脂質を濃縮し、必要に応じて、この溶液を通常行わ
れる方法で乾燥した粉末を用い、中性スフィンゴ糖脂質
を抽出、精製することを特徴とする。(Means for Solving the Problems) The method for purifying a neutral glycosphingolipid according to the present invention is a method for extracting and purifying a neutral glycosphingolipid prior to a general operation of extracting and purifying a neutral glycosphingolipid. A protein hydrolyzing enzyme is used to hydrolyze the protein, and the resulting protein hydrolyzed solution is treated by a method selected from, for example, ultrafiltration, gel filtration, or dialysis to obtain a neutral glycosphingolipid. Is concentrated, and if necessary, the neutral glycosphingolipid is extracted and purified using a powder obtained by drying the solution by a commonly used method.
本発明において、出発原料として用いる物質として
は、牛乳及び牛乳から得られるバターミルク、ホエー、
脱脂乳などの乳質物質、動物の脳や腎等が挙げられる。
これらの物質は、スフィンゴ糖脂質以外に蛋白質、乳
糖、脂質などを含有するため、これらを除く必要があ
る。In the present invention, the substance used as a starting material includes milk and buttermilk obtained from milk, whey,
Milk substances such as skim milk, animal brain and kidney, and the like.
Since these substances contain proteins, lactose, lipids, etc. in addition to glycosphingolipids, it is necessary to remove them.
まず、蛋白質加水分解酵素を用いて蛋白質をペプチ
ド、或いはアミノ酸まで加水分解する。この加水分解に
用いる蛋白質加水分解酵素としては、トリプシン、ペプ
シン、キモトリプシン、パパイン、タカジアスターゼ、
枯草菌プロテアーゼなどを例示し得る。蛋白質加水分解
の反応条件は、例えば、原料の乳質物質に含まれる蛋白
質濃度に対して0.1〜10重量％となるように蛋白質加水
分解酵素を添加し、pH2〜10、温度20〜60℃にて３〜100
時間反応させることが好ましい。このようにして、原料
の乳質物質に含まれる蛋白質を加水分解した溶液を90〜
100℃で数分間加熱し、蛋白質加水分解酵素を失活させ
る。First, a protein is hydrolyzed into peptides or amino acids using a protein hydrolase. The protein hydrolases used for this hydrolysis include trypsin, pepsin, chymotrypsin, papain, Takadiasidase,
Bacillus subtilis protease and the like. The reaction conditions for the protein hydrolysis are, for example, adding a protein hydrolase so as to be 0.1 to 10% by weight based on the protein concentration contained in the raw material milk substance, at pH 2 to 10, at a temperature of 20 to 60 ° C. 3-100
It is preferable to react for a time. In this way, the solution obtained by hydrolyzing the protein contained in the raw material milk
Heat at 100 ° C for several minutes to inactivate the protease.
次に、この蛋白質加水分解溶液を限外濾過法、ゲル濾
過法、或いは透析法などで処理して、溶液中のスフィン
ゴ糖脂質濃度を高める。Next, this protein hydrolysis solution is treated by ultrafiltration, gel filtration, dialysis, or the like to increase the concentration of glycosphingolipids in the solution.
限外濾過法は、大きい溶質分子を小さい溶質分子や溶
媒分子から篩い分ける分子レベルの濾過法で、通常は限
外濾過膜を装着した装置を用いる。限外濾過膜として
は、2,000〜500,000の分画分子量のものを用いるとよ
い。この限外濾過膜を装着した装置を用いて限外濾過を
行うことにより、蛋白質加水分解酵素によって加水分解
されたペプチド及びアミノ酸や乳糖その他の低分子物質
が溶出液として除かれ、濃縮槽でスフィンゴ糖脂質が濃
縮される。The ultrafiltration method is a molecular-level filtration method in which large solute molecules are sieved from small solute molecules and solvent molecules, and usually uses an apparatus equipped with an ultrafiltration membrane. As the ultrafiltration membrane, one having a molecular weight cut off of 2,000 to 500,000 may be used. By performing ultrafiltration using a device equipped with this ultrafiltration membrane, peptides, amino acids, lactose, and other low molecular substances hydrolyzed by protein hydrolase are removed as an eluate, and sphingo is concentrated in a concentration tank. The glycolipid is concentrated.
ゲル濾過法は、溶媒で膨潤させたゲル粒子を充填した
カラムを用い、溶出速度の違いで高分子の溶質と低分子
の溶質とを分離する方法で、セファデックス（登録商
標）、バイオゲル（登録商標）、アガロースゲルなどが
用いられている。この方法では、ボイド画分にスフィン
ゴ糖脂質が溶出される。The gel filtration method uses a column packed with gel particles swollen with a solvent and separates high-molecular solutes from low-molecular solutes at different elution rates. Sephadex (registered trademark), biogel (registered) Trademark), agarose gel and the like. In this method, glycosphingolipids are eluted in the void fraction.
このようにして得られたスフィンゴ糖脂質を含む溶液
を必要に応じて濃縮、乾燥し、得られた濃縮液又は乾燥
粉末を用いて、中性スフィンゴ糖脂質を抽出、精製す
る。The solution containing the glycosphingolipid thus obtained is concentrated and dried as necessary, and the neutralized glycosphingolipid is extracted and purified using the obtained concentrated liquid or dry powder.
中性スフィンゴ糖脂質の抽出及び精製は、例えば、次
のような手順で行うことができる。Extraction and purification of neutral glycosphingolipids can be performed, for example, by the following procedure.
（１） 溶媒としてクロロホルム−メタノール混合溶液
（2:1、v/v）を上記の濃縮液又は乾燥粉末に加え、室温
で30分間撹拌して中性スフィンゴ糖脂質を抽出し、この
抽出液を蒸発乾固する。(1) A chloroform-methanol mixed solution (2: 1, v / v) as a solvent is added to the above-mentioned concentrated solution or dry powder, and the mixture is stirred at room temperature for 30 minutes to extract neutral glycosphingolipids. Evaporate to dryness.
（２） 溶媒としてアセトンを上記の蒸発乾固した抽出
物に加え、室温で20分間撹拌して中性脂質を抽出し、ア
セトンと共に除去する。(2) Acetone as a solvent is added to the above evaporated and dried extract, and the mixture is stirred at room temperature for 20 minutes to extract neutral lipids, and is removed together with acetone.
（３） 上記のアセトンと共に中性脂質を除去した残渣
にクロロホルムに加えて溶解し、この溶液をシリカゲル
カラムに通液して中性スフィンゴ糖脂質をシリカゲルに
吸着させた後、シラカゲルカラムをクロロホルムで洗浄
する。(3) The residue obtained by removing the neutral lipids together with the acetone is added to and dissolved in chloroform, and the solution is passed through a silica gel column to adsorb the neutral glycosphingolipid to the silica gel, and then the silica gel column is washed with chloroform. I do.
（４） 溶出液としてクロロホルム−メタノール混合溶
液（9:1、v/v）を用い、上記の中性スフィンゴ糖脂質を
吸着させたシリカゲルからグルコシルセラミドを溶出す
る。(4) Glucosylceramide is eluted from the silica gel to which the above neutral glycosphingolipid is adsorbed using a chloroform-methanol mixed solution (9: 1, v / v) as an eluent.
（５） 中性スフィンゴ糖脂質を吸着させたシリカゲル
からグルコシルセラミドを溶出した後、溶出液としてク
ロロホルム−メタノール混合液（8:2、v/v）を用い、ラ
クトシルセラミドを溶出する。(5) After eluting glucosylceramide from the silica gel to which neutral glycosphingolipids are adsorbed, lactosylceramide is eluted using a chloroform-methanol mixture (8: 2, v / v) as an eluent.
以上のようにして溶出されたグルコシルセラミド及び
ラクトシルセラミドの溶出液を蒸発乾固することによ
り、それぞれ純度90％以上の白色粉末を得ることができ
る。By evaporating the eluate of glucosylceramide and lactosylceramide eluted as described above to dryness, a white powder having a purity of 90% or more can be obtained.
（発明の効果） 本発明は、中性スフィンゴ糖脂質の新規な濃縮調製
法、即ち、蛋白質分解酵素を用い蛋白質を分解し、限外
濾過法、ゲル濾過法あるいは透析法等により、濃縮調製
する方法を用いたので、中性スフィンゴ糖脂質を効率よ
く有利に濃縮調製し、高濃度の中性スフィンゴ糖脂質を
工業的規模で調製することができた。(Effects of the Invention) The present invention provides a novel method for concentrating and preparing a neutral glycosphingolipid, that is, decomposing a protein using a proteolytic enzyme, and concentrating and preparing the protein by ultrafiltration, gel filtration or dialysis. Since the method was used, neutral glycosphingolipids could be efficiently and advantageously concentrated and prepared, and a high concentration of neutral glycosphingolipids could be prepared on an industrial scale.
なお、中性スフィンゴ糖脂質は、一般に蛋白質と複合
体を形成しており、この結合を切るには、アルコールを
含む有機溶媒が必須とされている。In addition, neutral glycosphingolipids generally form a complex with a protein, and an organic solvent containing alcohol is indispensable to break this bond.
しかし本発明においては、これらアルコールなどを必
要とせずに濃縮調製することが可能となった。However, in the present invention, it has become possible to perform concentration preparation without the need for these alcohols and the like.
（実施例） 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。(Examples) Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples.
実施例１ バターミルク粉20kgを水180に溶解した溶液に0.5kg
の枯草菌プロテアーゼを添加し、pH7.6、温度40℃で15
時間反応させ、蛋白質を分解した後、90℃で10分間加熱
し、酵素を失活させた。Example 1 0.5 kg of a solution prepared by dissolving 20 kg of buttermilk powder in water 180
Bacillus subtilis protease, pH 7.6, temperature 40 ° C 15
After reacting for hours to decompose the protein, the mixture was heated at 90 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme.
次いで、この溶液を、GR−51P（DDS社製）の膜面積0.
36m2の濾過膜を装着した限外濾過装置（LAB−20型モジ
ュール、DDS社製）にて、温度40℃、流量15／分、平
均圧力0.6MPaで濾過し、中性スフィンゴ糖脂質を濃縮し
た。濃縮終了後、濃縮槽より濃縮液を回収し、凍結乾燥
を行って、粉末1,400gを得た。Next, this solution was coated with GR-51P (manufactured by DDS) having a membrane area of 0.
Ultrafiltration device equipped with filter membrane 36m 2 (LAB-20 type modules, manufactured by DDS Ltd.) at a temperature of 40 ° C., flow rate 15 / min, and filtered at an average pressure 0.6 MPa, concentrate the neutral glycosphingolipids did. After the concentration was completed, the concentrated liquid was recovered from the concentration tank and freeze-dried to obtain 1,400 g of powder.
このようにして得られた粉末は、中性スフィンゴ糖脂
質を7.6％含有していた。The powder thus obtained contained 7.6% of neutral glycosphingolipid.
実施例２ 牛乳50にトリプシンを150g添加し、pH7.6、温度40
℃で24時間蛋白質を分解した後、90℃で10分間加熱し、
酵素を失活させた。Example 2 Milk 50 was added with 150 g of trypsin, pH 7.6, temperature 40
After decomposing the protein at 24 ° C for 24 hours, heat at 90 ° C for 10 minutes,
The enzyme was deactivated.
次いで、この溶液をHW−55（TOYO SODA社製）を充填
したゲル濾過カラム（60×100cm）に流し、中性スフィ
ンゴ糖脂質が濃縮されているボイド画分を回収し、凍結
乾燥を行って粉末1,200gを得た。Next, this solution was passed through a gel filtration column (60 × 100 cm) packed with HW-55 (manufactured by TOYO SODA), and a void fraction in which neutral glycosphingolipids were concentrated was collected and lyophilized. 1,200 g of a powder was obtained.
このようにして得られた粉末は、中性スフィンゴ糖脂
質を1.8％含有していた。The powder thus obtained contained 1.8% of neutral glycosphingolipid.
実施例３ 実施例１により調製した高含有中性スフィンゴ糖脂質
粉末1kgにクロロホルム−メタノール混液（2:1、v/v）
を10加え、室温で30分間撹拌し、中性スフィンゴ糖脂
質を抽出した。Example 3 A chloroform-methanol mixture (2: 1, v / v) was added to 1 kg of the high-content neutral glycosphingolipid powder prepared in Example 1.
Was added and stirred at room temperature for 30 minutes to extract neutral glycosphingolipids.
次に、抽出液を濃縮乾固した後、アセトン２を加え
室温で20分間撹拌し、アセトンに中性スフィンゴ糖脂質
を溶出させた後、アセトンを除去した。Next, after the extract was concentrated to dryness, acetone 2 was added and the mixture was stirred at room temperature for 20 minutes to elute neutral glycosphingolipid in acetone, and then acetone was removed.
残渣をクロロホルムで溶解し、シリカゲルカラム（4.
0×60cm）に流し、中性スフィンゴ糖脂質を吸着させ、
次いでクロロホルム２で洗浄した後、クロロホルム−
メタノール混液（9:1、v/v）２でグルコシルセラミド
を溶出し、さらにクロロホルム−メタノール混液（8:
2、v/v）２でラクトシルセラミドを溶出させた。The residue was dissolved in chloroform, and the residue was dissolved in a silica gel column (4.
0 × 60cm) to adsorb neutral glycosphingolipids,
Then, after washing with chloroform 2, chloroform-
Glucosylceramide was eluted with a methanol mixture (9: 1, v / v) 2 and further a chloroform-methanol mixture (8: 1, v / v).
2, v / v) 2 to elute lactosylceramide.
各々の溶出液をエバポレータで蒸発乾固し、各々白色
粉末30gを得た。Each eluate was evaporated to dryness using an evaporator to obtain 30 g of a white powder.
このようにして得られた粉末の中性スフィンゴ糖脂質
の純度は薄層クロマトグラフィーで90％（オルシノール
法）であった。The purity of the powdery neutral glycosphingolipid thus obtained was 90% (orcinol method) by thin-layer chromatography.
実施例４ 新鮮な牛脳20kgに４倍量の水を加えて十分に均質化し
た溶液に30gのペプシンを添加し、pH7.6、温度40℃で８
時間反応させ、蛋白質を分解した後、90℃で10分間加熱
し、酵素を失活させた。Example 4 30 g of pepsin was added to a fully homogenized solution obtained by adding 4 volumes of water to 20 kg of fresh bovine brain at pH 7.6 and at a temperature of 40 ° C.
After reacting for hours to decompose the protein, the mixture was heated at 90 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme.
次いで、この溶液を、GR−51P（DDS社製）の膜面積0.
36m2の濾過膜を装着した限外濾過装置（LAB−20型モジ
ュール、DDS社製）にて、温度40℃、流量15／分、平
均圧力0.6MPaで濾過し、中性スフィンゴ糖脂質を濃縮し
た。濃縮終了後、濃縮槽より濃縮液を回収し、凍結乾燥
を行って、粉末2,300gを得た。Next, this solution was coated with GR-51P (manufactured by DDS) having a membrane area of 0.
Concentrates neutral glycosphingolipids by filtration with an ultrafiltration device (LAB-20 type module, manufactured by DDS) equipped with a 36 m 2 filtration membrane at a temperature of 40 ° C, a flow rate of 15 / min and an average pressure of 0.6 MPa. did. After the concentration was completed, the concentrated liquid was recovered from the concentration tank and freeze-dried to obtain 2,300 g of powder.
このようにして得られた粉末は、中性スフィンゴ糖脂
質を9.3％含有していた。The powder thus obtained contained 9.3% of neutral glycosphingolipid.
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07H 15/04 C11C 1/04 C12S 3/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)Continued on the front page (58) Fields surveyed (Int.Cl. 6 , DB name) C07H 15/04 C11C 1/04 C12S 3/02 CA (STN) REGISTRY (STN) WPIDS (STN)
Claims (6)
加水分解酵素を作用させて蛋白質を加水分解し、得られ
た蛋白質加水分解溶液を限外濾過法、ゲル濾過法及び透
析法から選ばれる方法で濃縮することを特徴とする中性
スフィンゴ糖脂質の濃縮法。1. A protein containing a neutral glycosphingolipid is reacted with a protein hydrolyzing enzyme to hydrolyze the protein, and the resulting protein hydrolyzate is selected from ultrafiltration, gel filtration and dialysis. A method for concentrating neutral glycosphingolipids, comprising concentrating by a method.
質である請求項１記載の濃縮法。2. The method according to claim 1, wherein the substance containing neutral glycosphingolipid is a milk substance.
濃縮液から中性スフィンゴ糖脂質を抽出、精製すること
を特徴とする中性スフィンゴ糖脂質の精製法。3. A method for purifying neutral glycosphingolipids, comprising extracting and purifying neutral glycosphingolipids from the concentrate prepared by the concentration method according to claim 1 or 2.
濃縮液を、更に乾燥した後、該乾燥粉末から中性スフィ
ンゴ糖脂質を抽出、精製することを特徴とする中性スフ
ィンゴ糖脂質の精製法。4. A neutral sphingosaccharide, characterized in that the concentrated solution prepared by the concentration method according to claim 1 or 2 is further dried, and then neutral glycosphingolipid is extracted and purified from the dried powder. A method for purifying lipids.
ドである請求項３又は４記載の精製法。5. The method according to claim 3, wherein the neutral glycosphingolipid is glucosylceramide.
ドである請求項３又は４記載の精製法。6. The method according to claim 3, wherein the neutral glycosphingolipid is lactosylceramide.
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| JP32195688A JP2782347B2 (en) | 1988-12-22 | 1988-12-22 | Concentration and purification method of neutral glycosphingolipid |
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