JP2727216B2 - メタロチオネイン類似タンパク - Google Patents
メタロチオネイン類似タンパクInfo
- Publication number
- JP2727216B2 JP2727216B2 JP6359589A JP6359589A JP2727216B2 JP 2727216 B2 JP2727216 B2 JP 2727216B2 JP 6359589 A JP6359589 A JP 6359589A JP 6359589 A JP6359589 A JP 6359589A JP 2727216 B2 JP2727216 B2 JP 2727216B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- metallothionein
- minutes
- membrane
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、メタロチオネインと類似な性質を有する新
規なタンパク質に関し、更に詳細には豆科植物の種子、
根端から抽出処理により得ることのできるメタロチオネ
イン類似タンパクに関する。
規なタンパク質に関し、更に詳細には豆科植物の種子、
根端から抽出処理により得ることのできるメタロチオネ
イン類似タンパクに関する。
［従来の技術及びその課題］ 重金属イオンは生体内において毒性を示すことが知ら
れているが、この毒性は、一般に重金属イオンがキレー
ト形成することにより遊離の場合よりも低下するとされ
ている。
れているが、この毒性は、一般に重金属イオンがキレー
ト形成することにより遊離の場合よりも低下するとされ
ている。
動物の生体内では、重金属の存在によりメタロチオネ
インが誘導合成され、そのキレート作用により重金属無
毒化の役割を果たすといわれている。
インが誘導合成され、そのキレート作用により重金属無
毒化の役割を果たすといわれている。
メタロチオネインは、Cd、Zn、Cu、Co、Ag、Hgなど種
々の金属を強固に結合することのできるアポタンパク質
で、分子量約6,000の誘導性タンパク質である。
々の金属を強固に結合することのできるアポタンパク質
で、分子量約6,000の誘導性タンパク質である。
メタロチオネインは組成アミノ酸の13がシステインで
あり、かつ芳香族のアミノ酸を含まないという特徴を有
する。
あり、かつ芳香族のアミノ酸を含まないという特徴を有
する。
このメタロチオネインは、哺乳類、鳥類、甲殻類、魚
類、軟体動物、藻類、菌類など広範囲の真核生物から分
離されているが、こればかりでなく藍藻等の一部原核生
物からも見出されている。しかしながら、高等植物から
は全く見出されていない。
類、軟体動物、藻類、菌類など広範囲の真核生物から分
離されているが、こればかりでなく藍藻等の一部原核生
物からも見出されている。しかしながら、高等植物から
は全く見出されていない。
メタロチオネインの物性等については現在まで種々報
告されており、重金属と結合して安定で可溶性の化合物
を形成する能力を有し、またシステインの−SH基による
還元能力や反応性に富む等その特性に着目して、生体内
で有害重金属やフリーラジカル等有害物質の解毒剤、ま
た生体内への亜鉛等有用金属の供給源等としての応用が
期待されている。
告されており、重金属と結合して安定で可溶性の化合物
を形成する能力を有し、またシステインの−SH基による
還元能力や反応性に富む等その特性に着目して、生体内
で有害重金属やフリーラジカル等有害物質の解毒剤、ま
た生体内への亜鉛等有用金属の供給源等としての応用が
期待されている。
しかしながら、メタロチオネインの工業的な利用に
は、動物中に存在するメタロチオネインが極めて微量で
あり、かつその精製、分離が難しいという量的及び質的
の両面からの難点があり、その実現を困難なものとして
いる。
は、動物中に存在するメタロチオネインが極めて微量で
あり、かつその精製、分離が難しいという量的及び質的
の両面からの難点があり、その実現を困難なものとして
いる。
そこで、メタロチオネイン若しくはこれと同等な作用
を有するタンパク質を、工業的に利用できる規模で提供
されることが望まれていた。
を有するタンパク質を、工業的に利用できる規模で提供
されることが望まれていた。
［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行な
った結果、大量に栽培されている大豆等の豆科植物の種
子及び根端中には、メタロチオネインと免疫的に交叉
し、かつ、亜鉛に対する親和性、耐熱性等メタロチオネ
インと極めて類似するタンパク質が含まれていることを
見出した。
った結果、大量に栽培されている大豆等の豆科植物の種
子及び根端中には、メタロチオネインと免疫的に交叉
し、かつ、亜鉛に対する親和性、耐熱性等メタロチオネ
インと極めて類似するタンパク質が含まれていることを
見出した。
また、このタンパク質は抽出により容易に豆科植物中
から分離できることを見出した。
から分離できることを見出した。
すなわち本発明は、豆科植物の種子または根端より抽
出されるメタロチオネイン類似タンパクを提供するもの
である。
出されるメタロチオネイン類似タンパクを提供するもの
である。
本発明のメタロチオネイン類似タンパクを調製するた
めに用いられる豆科植物としては、特に限定はなく一般
の豆科植物を利用することができる。具体的には、大
豆、小豆、インゲン豆等を例示することができるが、量
的及び原原料の入手性等の点から大豆が特に好ましい。
また、より多くのメタロチオネイン類似タンパクを得る
ためには、Cu蓄積性の豆科植物を用いることが好まし
く、更に、本発明メタロチオネイン類似タンパクをより
効率良く誘導するためには、一定濃度のCu等重金属イオ
ンの存在下で栽培したものを用いることが好ましい。重
金属イオンは、経時的に順次加えていくことが好ましい
が、例えばCu蓄積性の大豆に銅イオンを添加する場合、
最終的にその濃度として400ppb程度とすればよい。
めに用いられる豆科植物としては、特に限定はなく一般
の豆科植物を利用することができる。具体的には、大
豆、小豆、インゲン豆等を例示することができるが、量
的及び原原料の入手性等の点から大豆が特に好ましい。
また、より多くのメタロチオネイン類似タンパクを得る
ためには、Cu蓄積性の豆科植物を用いることが好まし
く、更に、本発明メタロチオネイン類似タンパクをより
効率良く誘導するためには、一定濃度のCu等重金属イオ
ンの存在下で栽培したものを用いることが好ましい。重
金属イオンは、経時的に順次加えていくことが好ましい
が、例えばCu蓄積性の大豆に銅イオンを添加する場合、
最終的にその濃度として400ppb程度とすればよい。
原材料である豆科植物からメタロチオネイン類似タン
パクを得るには、まず、当該植物の種子または根端を細
断し、適当量の還元剤とCu2+等重金属イオンの存在下、
適当な緩衝液中でホモジュネートする。
パクを得るには、まず、当該植物の種子または根端を細
断し、適当量の還元剤とCu2+等重金属イオンの存在下、
適当な緩衝液中でホモジュネートする。
好ましい還元剤としては、２−メルカプトエタノール
等が挙げられ、また、Cu2+は、例えば硫酸銅として添加
すれば良い。これらの還元剤、重金属イオンの添加量は
それぞれ２−メルカプトエタノールは0.035％（w/v）及
びCu2+は100mg/程度である。また、緩衝液としては、
リン酸緩衝液、トリス−HCl（pH8.0）等を例示すること
ができる。
等が挙げられ、また、Cu2+は、例えば硫酸銅として添加
すれば良い。これらの還元剤、重金属イオンの添加量は
それぞれ２−メルカプトエタノールは0.035％（w/v）及
びCu2+は100mg/程度である。また、緩衝液としては、
リン酸緩衝液、トリス−HCl（pH8.0）等を例示すること
ができる。
次いで、ホモジュネートにより得られた均質物を濾過
し、濾液を遠心分離する。遠心分離は、10,000〜15,000
rpmで10〜20分程度行なうことが好ましい。
し、濾液を遠心分離する。遠心分離は、10,000〜15,000
rpmで10〜20分程度行なうことが好ましい。
メタロチオネイン類似タンパクは、遠心分離により得
られる上清に含まれているので、得られた上清をそのま
ま用いることもできるが、必要に応じて上清をタンパク
質分離の常法で処理し、精製されたメタロチオネイン類
似タンパクを得ることもできる。
られる上清に含まれているので、得られた上清をそのま
ま用いることもできるが、必要に応じて上清をタンパク
質分離の常法で処理し、精製されたメタロチオネイン類
似タンパクを得ることもできる。
かくして得られた本発明のメタロチオネイン類似タン
パクは以下のような性質を有する。
パクは以下のような性質を有する。
（１）免疫学的性質 RIA法を用いて、本発明タンパク質と、ラット肝に存
在するメタロチオネインポリクローナル抗体［MT−１
（大塚製薬（株）］との交叉反応性を検討した。
在するメタロチオネインポリクローナル抗体［MT−１
（大塚製薬（株）］との交叉反応性を検討した。
すなわち、予めフェリチン、α−フェトプロテイン、
グルタチオン、マウスのメタロチオネインの一部配列
（６〜10a・ａ配列）等との間で交叉反応性が認められ
ず、ラット肝メタロチオネイン以外の抗原に対して交叉
反応性がないことが確認されているMT−１を標準希釈液
に溶解して１次抗体とした。
グルタチオン、マウスのメタロチオネインの一部配列
（６〜10a・ａ配列）等との間で交叉反応性が認められ
ず、ラット肝メタロチオネイン以外の抗原に対して交叉
反応性がないことが確認されているMT−１を標準希釈液
に溶解して１次抗体とした。
この１次抗体と、標準のラットのメタロチオネインお
よび放射標識を施したメタロチオネインとをインキュベ
ートし、これに２次抗体液としてメタロチオネイン類似
タンパクを加え、生成した沈澱の放射活性を計測した。
この結果、本発明のメタロチオネイン類似タンパクはラ
ット肝メタロチオネインとの交叉反応性が明らかに認め
られた。
よび放射標識を施したメタロチオネインとをインキュベ
ートし、これに２次抗体液としてメタロチオネイン類似
タンパクを加え、生成した沈澱の放射活性を計測した。
この結果、本発明のメタロチオネイン類似タンパクはラ
ット肝メタロチオネインとの交叉反応性が明らかに認め
られた。
（２）SDS−PAGEによる分子量決定 ラエムリの方法［Laemmli,U.K.Nature（London）,22
7,680−685（1970）］に従ってSDS−PAGEを行なった。
常法により染色した後、本発明のメタロチオネイン類似
タンパクの分子量を求めたところ、約17,000であった。
7,680−685（1970）］に従ってSDS−PAGEを行なった。
常法により染色した後、本発明のメタロチオネイン類似
タンパクの分子量を求めたところ、約17,000であった。
（３）EIA法による染色及びウエスタンブロッティング
法による分子量測定 本発明のメタロチオネイン類似タンパクのSH基をカル
ボキシメチル化し、結合膜として２フッ化ポリビニルを
用い、電気泳動によりその分子量を測定したところ約1
7,000であった。
法による分子量測定 本発明のメタロチオネイン類似タンパクのSH基をカル
ボキシメチル化し、結合膜として２フッ化ポリビニルを
用い、電気泳動によりその分子量を測定したところ約1
7,000であった。
（４）亜鉛に対する親和性 亜鉛に対する親和性をZnブロティングの手法（Leslie
A.Schiff,Max L.Nibert,and Bernord N.Fields;Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 85.4195−4199,June（1988）Biochem
istry）により評価した。この結果、本発明のメタロチ
オネイン類似タンパクは、亜鉛に対し高い親和性を示し
た。
A.Schiff,Max L.Nibert,and Bernord N.Fields;Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 85.4195−4199,June（1988）Biochem
istry）により評価した。この結果、本発明のメタロチ
オネイン類似タンパクは、亜鉛に対し高い親和性を示し
た。
（５）耐熱性 本発明のメタロチオネイン類似タンパクを100℃で５
分間処理したときの活性の低下はなく、熱処理によって
夾雑タンパクの一部が沈殿するために全タンパクあたり
のメタロチオネイン量は40％増大した。
分間処理したときの活性の低下はなく、熱処理によって
夾雑タンパクの一部が沈殿するために全タンパクあたり
のメタロチオネイン量は40％増大した。
［発明の効果］ 本発明のタンパクは、メタロチオネインと同様に生体
内において有害重金属やフリーラジカル等の有害物質の
解毒剤あるいは生体内への亜鉛等の有用金属の供給源と
して有用である。そして、本発明タンパクは食品として
供されているダイズなどのマメ科植物から効率的に単離
することができる。
内において有害重金属やフリーラジカル等の有害物質の
解毒剤あるいは生体内への亜鉛等の有用金属の供給源と
して有用である。そして、本発明タンパクは食品として
供されているダイズなどのマメ科植物から効率的に単離
することができる。
［実施例］ 以下実施例を挙げ、本発明をより詳しく説明する。
実施例１ （１） タンパク質の抽出： 抽出材料としてイネ根、各種ダイズ根及びダイズトヨ
スズ種子を用い、メタロチオネイン類似タンパクの抽出
試験を行なった。
スズ種子を用い、メタロチオネイン類似タンパクの抽出
試験を行なった。
根からメタロチオネイン類似タンパクを抽出するため
に、まず、Cu蓄積性のイネ（品種：統一）及びCu蓄積性
のダイズ（品種：トヨスズ）を発芽させ、発芽３日後に
これらの幼植物を水耕栽培液（春日井氏液）に移した。
水耕栽培の初めの１週間は基本培養液組成の1/4濃度で
育て、２週間目からは200ppbのCu2+を加えた基本組成に
換え、２週間培養した。その後、イネはそのまま、ダイ
ズはCu濃度を400ppbとして更に１週間培養し、それらの
根を根部試料とした。
に、まず、Cu蓄積性のイネ（品種：統一）及びCu蓄積性
のダイズ（品種：トヨスズ）を発芽させ、発芽３日後に
これらの幼植物を水耕栽培液（春日井氏液）に移した。
水耕栽培の初めの１週間は基本培養液組成の1/4濃度で
育て、２週間目からは200ppbのCu2+を加えた基本組成に
換え、２週間培養した。その後、イネはそのまま、ダイ
ズはCu濃度を400ppbとして更に１週間培養し、それらの
根を根部試料とした。
上記で得た根部試料及びダイズ（トヨスズ）の種子試
料のそれぞれを生重量で2.0g量り取り、細断後、氷冷下
で4mlの20mMトリス−HCl緩衝液（pH8.8）、5mMβ−メル
カプトエタノール、100ppmのCu2+（CuSO4として）と混
合してホモジュナイズした。この均質物を濾過したの
ち、濾液を100,000gで１時間超遠心し、その上清として
タンパク抽出液4mlを得た。
料のそれぞれを生重量で2.0g量り取り、細断後、氷冷下
で4mlの20mMトリス−HCl緩衝液（pH8.8）、5mMβ−メル
カプトエタノール、100ppmのCu2+（CuSO4として）と混
合してホモジュナイズした。この均質物を濾過したの
ち、濾液を100,000gで１時間超遠心し、その上清として
タンパク抽出液4mlを得た。
（２）耐熱性試験： タンパク抽出液のうち、根部試料からのものは２等分
しその一方について耐熱性試験を行なった。すなわち、
一方のタンパク抽出液を100℃で５分間保持し、熱処理
しないタンパク抽出液との間でそのタンパク含量、メタ
ロチオネイン類似タンパク（以下、「TM様タンパク」と
いう）含量を比較した。
しその一方について耐熱性試験を行なった。すなわち、
一方のタンパク抽出液を100℃で５分間保持し、熱処理
しないタンパク抽出液との間でそのタンパク含量、メタ
ロチオネイン類似タンパク（以下、「TM様タンパク」と
いう）含量を比較した。
タンパク質含量はプロテインアッセイキット（バイオ
ラッド社製）を用い、MT様タンパク含量はポリクローナ
ル抗体であるMT−１を用いるRIA法により測定した。こ
の結果を第１表に示す。
ラッド社製）を用い、MT様タンパク含量はポリクローナ
ル抗体であるMT−１を用いるRIA法により測定した。こ
の結果を第１表に示す。
第１表から明らかなように、イネ根からはMT様タンパ
ク質が検出されなかったがダイズの根部試料及び種子か
らはMT様タンパク質が得られた。また、ダイズ根試料で
は、加熱後の全タンパク中のMT様タンパク質量割合は0.
038％であるのに対し非加熱試料中の割合は0.026％であ
り、MT様タンパク質は加熱に対して安定であることが示
された。なお、得られた試料はいずれも−80℃で凍結乾
燥した。
ク質が検出されなかったがダイズの根部試料及び種子か
らはMT様タンパク質が得られた。また、ダイズ根試料で
は、加熱後の全タンパク中のMT様タンパク質量割合は0.
038％であるのに対し非加熱試料中の割合は0.026％であ
り、MT様タンパク質は加熱に対して安定であることが示
された。なお、得られた試料はいずれも−80℃で凍結乾
燥した。
（３）SDS−PAGEによる分子量測定： 実施例１で得られたタンパク抽出液（ダイズ根からの
もの；非加熱）10μに、60mM DTE（2,3−ジハイドロ
キシ−1,4−ジチオールブタン）、40mM EDTA、４％SD
S、25％グリセロールを含む100mMトリス−HCl（pH8.8）
溶液を10μ加え、５分間煮沸した。12,000rpmで２分
間遠心し、これに1.0mMヨード酢酸を含む1.25mM NaOH溶
液を４μ加え、50℃で15分間インキュベートした。こ
れをふたたび12,000rpmの遠心に２分間付し、得られた
上清をカルボキシメチル化タンパク抽出液とした。
もの；非加熱）10μに、60mM DTE（2,3−ジハイドロ
キシ−1,4−ジチオールブタン）、40mM EDTA、４％SD
S、25％グリセロールを含む100mMトリス−HCl（pH8.8）
溶液を10μ加え、５分間煮沸した。12,000rpmで２分
間遠心し、これに1.0mMヨード酢酸を含む1.25mM NaOH溶
液を４μ加え、50℃で15分間インキュベートした。こ
れをふたたび12,000rpmの遠心に２分間付し、得られた
上清をカルボキシメチル化タンパク抽出液とした。
SDS−PAGEはラエムリの方法（Laemmli,U.K.Nature（L
ondon）,227,680−685（1970））に従い行なった。また
ゲルは、その組成が全アクリルアミド17.5％、ビスアク
リルアミド2.23％、分離ゲルサイズが縦13×横15cmのも
のを用いた。
ondon）,227,680−685（1970））に従い行なった。また
ゲルは、その組成が全アクリルアミド17.5％、ビスアク
リルアミド2.23％、分離ゲルサイズが縦13×横15cmのも
のを用いた。
なお、ゲル厚は0.5、１及び2mmのものを目的に応じて
使い分けた。
使い分けた。
ブロッティングは、次の様にして行なった。すなわ
ち、ブロッティング装置としてザルトリウス社、ザルト
ブロットII（セミドライ式）を、ブロッティング溶液と
して緩衝液Ａ（0.3Mトリス−HCl、20％メタノール（pH1
0.4））、緩衝液Ｂ（25mMトリス−HCl、20％メタノール
（pH9.5）および緩衝液Ｃ（25mMトリス−ほう酸、20％
メタノール（pH9.5））を、ブロッティングフィルター
としてはポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜（ミ
リポアーイモビロン）をゲルの大きさに切断し、メタノ
ールに数秒間浸した後、上記緩衝液Ｃに５分以上振盪し
て用いた。ブロッティングは、前処理として泳動後、ゲ
ルを緩衝液Ｃに浸し、15分間振盪せしめ、陰極電極上に
緩衝液Ｃに浸した濾紙２枚、緩衝液Ａに浸した濾紙２
枚、陽極電極を順に重ね2.5mA/cm2の電流密度で20分行
なった（ゲル厚2mmの時は40分）。
ち、ブロッティング装置としてザルトリウス社、ザルト
ブロットII（セミドライ式）を、ブロッティング溶液と
して緩衝液Ａ（0.3Mトリス−HCl、20％メタノール（pH1
0.4））、緩衝液Ｂ（25mMトリス−HCl、20％メタノール
（pH9.5）および緩衝液Ｃ（25mMトリス−ほう酸、20％
メタノール（pH9.5））を、ブロッティングフィルター
としてはポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜（ミ
リポアーイモビロン）をゲルの大きさに切断し、メタノ
ールに数秒間浸した後、上記緩衝液Ｃに５分以上振盪し
て用いた。ブロッティングは、前処理として泳動後、ゲ
ルを緩衝液Ｃに浸し、15分間振盪せしめ、陰極電極上に
緩衝液Ｃに浸した濾紙２枚、緩衝液Ａに浸した濾紙２
枚、陽極電極を順に重ね2.5mA/cm2の電流密度で20分行
なった（ゲル厚2mmの時は40分）。
ブロッティング後は、PVDF膜を、25mM塩化ナトリウム
を含む10mMほう酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）に浸し、
５分間振盪した後、蒸留水に浸し５分間振盪した。
を含む10mMほう酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）に浸し、
５分間振盪した後、蒸留水に浸し５分間振盪した。
タンパク質の検出は、PVDF膜を0.1％CBB−G250（Coom
assie Brilliant Blue G250）を含む蒸留水−メタノー
ル−酢酸（5:5:2（v/v））混液に５分間浸した後、50％
メタノール（vmv）に１分間浸してバックグランドを脱
色し、蒸留水で軽く洗った後風乾して行なった。またブ
ロッティング後のゲルは、2.5％CCB−G250を含む蒸留水
−エタノール−酢酸（650:250:80（V/V））混液に数時
間浸し、バックグランドを脱色し乾燥した。
assie Brilliant Blue G250）を含む蒸留水−メタノー
ル−酢酸（5:5:2（v/v））混液に５分間浸した後、50％
メタノール（vmv）に１分間浸してバックグランドを脱
色し、蒸留水で軽く洗った後風乾して行なった。またブ
ロッティング後のゲルは、2.5％CCB−G250を含む蒸留水
−エタノール−酢酸（650:250:80（V/V））混液に数時
間浸し、バックグランドを脱色し乾燥した。
（５）エンザイム イムノ アッセイ（EIA）： 上記（４）のブロッティングの終わったPVDF膜をTBS
（20mMトリス、500mM NaCl（pH7.5））に10分間浸し、
振盪する。ブロッキング液（TBSに３％ゼラチンを加え
たもの）に膜を浸し、５分間振盪する。これをもう一度
繰り返した後、TTBSに１％ゼラチンを加えた抗体希釈液
で3,000倍に希釈した一次抗体液（抗ラットMTウサギIgG
抗体の抗体希釈液）に膜を浸し一晩振盪した。TTBS液
（TBSに0.05％Tween−20を加えたもの）に膜を浸し、５
分間振盪した。この操作をもう一度繰返した後、GAR−H
RP二次抗体液（山羊抗ウサギIgG抗体，ホースラディシ
ュペルオキシダーゼコンジュゲートの抗体希釈液による
3,000倍希釈液）に膜を浸し、１時間以上振盪した。TTB
Sに膜を浸し、５分間振盪する操作を２回繰返した後、T
BS液に膜を浸し、５分間振盪する操作を１回繰返した。
基質液（60mgの基質を含む20ml氷冷メタノールと、30％
H2O2を60μ含む100ml TBSを使用直前に混合して調
製）に膜を浸し、45分間振盪した。蒸留水に膜を浸し、
軽く洗い、風乾した後写真をとり、イムノアッセイを行
なった。
（20mMトリス、500mM NaCl（pH7.5））に10分間浸し、
振盪する。ブロッキング液（TBSに３％ゼラチンを加え
たもの）に膜を浸し、５分間振盪する。これをもう一度
繰り返した後、TTBSに１％ゼラチンを加えた抗体希釈液
で3,000倍に希釈した一次抗体液（抗ラットMTウサギIgG
抗体の抗体希釈液）に膜を浸し一晩振盪した。TTBS液
（TBSに0.05％Tween−20を加えたもの）に膜を浸し、５
分間振盪した。この操作をもう一度繰返した後、GAR−H
RP二次抗体液（山羊抗ウサギIgG抗体，ホースラディシ
ュペルオキシダーゼコンジュゲートの抗体希釈液による
3,000倍希釈液）に膜を浸し、１時間以上振盪した。TTB
Sに膜を浸し、５分間振盪する操作を２回繰返した後、T
BS液に膜を浸し、５分間振盪する操作を１回繰返した。
基質液（60mgの基質を含む20ml氷冷メタノールと、30％
H2O2を60μ含む100ml TBSを使用直前に混合して調
製）に膜を浸し、45分間振盪した。蒸留水に膜を浸し、
軽く洗い、風乾した後写真をとり、イムノアッセイを行
なった。
（６）ドットプロットは、ダイズ（トヨスズツルコガ
ネ）根タンパク粗抽出液とラットメタロチオネイン溶液
とを前記に従い各々カルボキシメチル化し、１、0.1、
0.01μg/μにそれぞれ希釈し、これらをニトロセルロ
ース膜（ポアサイズは0.2μｍ）に各１μのせ、１時
間風乾の後EIA法によりMT様タンパクの存在を認めた。
一次抗体は1,000倍希釈液を用いた。
ネ）根タンパク粗抽出液とラットメタロチオネイン溶液
とを前記に従い各々カルボキシメチル化し、１、0.1、
0.01μg/μにそれぞれ希釈し、これらをニトロセルロ
ース膜（ポアサイズは0.2μｍ）に各１μのせ、１時
間風乾の後EIA法によりMT様タンパクの存在を認めた。
一次抗体は1,000倍希釈液を用いた。
タンパク質のバンドは、銀染色法により染色した。染
色試薬は、第一化学薬品社製銀染色試薬「第一」を用
い、De Morenoらの方法（De Moreno M.R.,Smith J.F.an
d Smith R.V.,Anal.Biochem.,151,466−470（1985））
に準じて、クマシーブリリアントブルーで染色した。
色試薬は、第一化学薬品社製銀染色試薬「第一」を用
い、De Morenoらの方法（De Moreno M.R.,Smith J.F.an
d Smith R.V.,Anal.Biochem.,151,466−470（1985））
に準じて、クマシーブリリアントブルーで染色した。
なお、標準タンパク質としては、分子量2510、6210、
8160、14,400及び16,950のものを用いた。その結果、分
子量16,950付近にバンドが検出されたことより、本発明
タンパクの分子量は約17,000と判断した。
8160、14,400及び16,950のものを用いた。その結果、分
子量16,950付近にバンドが検出されたことより、本発明
タンパクの分子量は約17,000と判断した。
（７）亜鉛親和性の判定 Zn2+ブロッティングはレスリ−シッフの方法（Leslie
A.Schiff,Max L.Nibert and Bernord N.Fields;Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,85,4195−4199,June（1988）Biochem
istry）に従い行なった。すなわち、ブロッティングの
終わったPVDF膜を還元液（10mMトリス−HCl、0.5％２−
ME Tween20（pH6.8））に浸し、１時間振盪した。膜を
緩衝液（10mMトリス−HCl（pH6.8））に浸し、１時間振
盪した。更に、膜上に65ZnCl2溶液（10mMトリス−HCl
（pH6.8）、１μCi/ml65ZnCl2、2.5mM MgCl2、2.5mM Ca
Cl2、0.1M KCl）を15mlのせ、10分間静置した。膜を洗
液（10mMトリス−HCl（pH6.8）、0.1mM KCl）に浸し、
１分間振盪した後、膜を２度洗った。当該膜を間接法に
よるオートラジオグラフィー（コダックXOmat AR又はP
R）に−70℃で10時間かけた。その結果、分子量17,000
に相当する部分に強いバンドが検出され、本発明タンパ
クが亜鉛に対し親和性を有することが判った。
A.Schiff,Max L.Nibert and Bernord N.Fields;Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,85,4195−4199,June（1988）Biochem
istry）に従い行なった。すなわち、ブロッティングの
終わったPVDF膜を還元液（10mMトリス−HCl、0.5％２−
ME Tween20（pH6.8））に浸し、１時間振盪した。膜を
緩衝液（10mMトリス−HCl（pH6.8））に浸し、１時間振
盪した。更に、膜上に65ZnCl2溶液（10mMトリス−HCl
（pH6.8）、１μCi/ml65ZnCl2、2.5mM MgCl2、2.5mM Ca
Cl2、0.1M KCl）を15mlのせ、10分間静置した。膜を洗
液（10mMトリス−HCl（pH6.8）、0.1mM KCl）に浸し、
１分間振盪した後、膜を２度洗った。当該膜を間接法に
よるオートラジオグラフィー（コダックXOmat AR又はP
R）に−70℃で10時間かけた。その結果、分子量17,000
に相当する部分に強いバンドが検出され、本発明タンパ
クが亜鉛に対し親和性を有することが判った。
Claims (1)
- 【請求項１】豆科植物の種子または根端より抽出され、
以下に示す性質を有するメタロチオネイン類似タンパ
ク。 ラットの肝に存在するメタロチオネインに特異性を
有するポリクロナール抗体と交叉反応性を有する。 SDS−PAGEにより測定した分子量は約17,000であ
る。 亜鉛に対して親和性を有する。 100℃５分間の加熱処理に対しても安定である。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6359589A JP2727216B2 (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | メタロチオネイン類似タンパク |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6359589A JP2727216B2 (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | メタロチオネイン類似タンパク |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02247200A JPH02247200A (ja) | 1990-10-02 |
| JP2727216B2 true JP2727216B2 (ja) | 1998-03-11 |
Family
ID=13233780
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6359589A Expired - Lifetime JP2727216B2 (ja) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | メタロチオネイン類似タンパク |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2727216B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW233264B (ja) | 1992-02-03 | 1994-11-01 | Otsuka Pharma Co Ltd | |
| JP5202443B2 (ja) * | 2009-06-01 | 2013-06-05 | 興和株式会社 | 有害金属測定試薬及び測定方法 |
| CN107056935A (zh) * | 2016-09-27 | 2017-08-18 | 济南米铎碳新能源科技有限公司 | 金属硫蛋白的制备方法 |
-
1989
- 1989-03-17 JP JP6359589A patent/JP2727216B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02247200A (ja) | 1990-10-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bowen | Detrital nonprotein amino acids are the key to rapid growth of Tilapia in Lake Valencia, Venezuela | |
| De Smet et al. | Stress responses and changes in protein metabolism in carp Cyprinus carpio during cadmium exposure | |
| Swain et al. | Histidine content of low-molecular-weight beef proteins influences nonheme iron bioavailability in Caco-2 cells | |
| Fulton | Proline control of the feeding reaction of Cordylophora | |
| Den et al. | Influence of Concanavalin A, wheat germ agglutinin, and soybean agglutinin on the fusion of myoblasts in vitro. | |
| Evtushenko et al. | Cadmium accumulation in organs of the scallop Mizuhopecten yessoensis—II. Subcellular distribution of metals and metal-binding proteins | |
| Chang et al. | Identification of galectin I and thioredoxin peroxidase II as two arsenic-binding proteins in Chinese hamster ovary cells | |
| JP2727216B2 (ja) | メタロチオネイン類似タンパク | |
| Serra et al. | Cadmium accumulation and Cd-binding proteins in the bivalve Scapharca inaequivalvis | |
| Wikfors et al. | Cadmium-binding polypeptides in microalgal strains with laboratory-induced cadmium tolerance | |
| Engel | The intracellular partitioning of trace metals in marine shellfish | |
| Fahimi et al. | Localization of the Heme–Binding Protein in the Cytoplasm and of A Heme–Binding Protein–Like Immunoreactive Protein in the Nucleus of Rat Liver Parenchymal Cells: Immunocytochemical Evidence of the Subcellular Distribution Corroborated by Radioimmunoassay and Immunoblotting | |
| Bodanszky et al. | Origin of D-amino-acids in microbial peptides: Rule of α-epimerization | |
| Mallavia et al. | Physiology of Rickettsiae VII. Amino Acid Incorporation by Coxiella burnetii and by Infected Hosts | |
| Slovin et al. | Glyphosine, a plant growth regulator, affects chloroplast membrane proteins | |
| Linder | Iron and copper metabolism in cancer, as exemplified by changes in ferritin and ceruloplasmin in rats with transplantable tumors | |
| Kang et al. | Medaka villin 1-like protein (VILL) is associated with the formation of microvilli induced by decreasing salinities in the absorptive ionocytes | |
| Kosterlitz et al. | Assay of the Biological Value of a Protein by its Effect on Liver Cytoplasm | |
| KR100455068B1 (ko) | 고콜레스테롤 식이에 의해 유발되는 질환의 치료 또는예방에 유용한 자화소성 세라믹 | |
| KOJIMA et al. | Studies on Poisonous Metals (VI) Effect of Food Components on Transport of Cadmium Across Rat Small Intestine in Vitro | |
| Pal et al. | Studies on the water soluble lens proteins of the lizard, Calotes versicolor. I. Fractionation and molecular weight determination | |
| Kumagai et al. | Subunit structure of amine oxidase from Aspergillus niger | |
| SU1245287A1 (ru) | Способ получени высокобелковых форм пшеницы | |
| El-Sakhawy et al. | Histological and Immunohistochemical studies of the effect of vitamin C on the parotid salivary glands of male albino rats after chromium exposure. | |
| Barton-Wright et al. | Microbiological Assay of Amino-Acids with Leuconostoc mesenteroides P. 60 |