【発明の詳細な説明】
（イ）発明の目的
「産業上の利用分野」
本発明は、結晶性毒素遺伝子及び該結晶性毒素遺伝子
の導入された形質転換菌に関するものであり、鱗翅目害
虫に有効である生物農薬の製造に利用されるものであっ
て農薬、農薬関連工業で広く利用されるものである。
「従来の技術」
バシルス・ツリンギェンシスノ生活環中、胞子形成期
に形成される細胞内封入体は結晶性毒素と称され、多く
の鱗翅目害虫に対して毒性を示すことが知られており、
該結晶性毒素を有効成分とする生物農薬が、主にバシル
ス・スリンギェンシス・クリスタキ変種HD−１株（Baci
llus thuringiensis var kurstakiHD−１−Dipel）の胞
子形成期の醗酵液を用いて製造されている。
「発明が解決しようとする問題」
胞子形成期の醗酵液を用いて行われる結晶性毒素を有
効成分とする生物農薬の製造は、以下に記載した理由に
より、比較的高い製造コストを必要としている。
すなわち、結晶性毒素は芽胞形成期において、胞子の
形成と同調して出現することから、一醗酵槽の運転に時
間がかかるのに加え、その収量が低く、生産効率が優れ
ているとはいえないのである。
従って、この高い生物農薬の製造コストの低減は、当
業者にとって解決すべき大きな問題点となっている。
（ロ）発明の構成
「問題を解決するための手段」
本発明者等は上記問題点を解決するために、ホイット
レー（H.R.Whiteley）が特開昭58−500565で開示した遺
伝子操作による結晶性毒素の産生の追試を試み、バシル
ス・ツリンギェンシス中に存在する結晶性毒素をコード
化する結晶性毒素遺伝子を抽出したところ、バシルス・
ツリンギェンシス中には当該結晶性毒素遺伝子が３種も
しくはそれ以上存在することを見いだし、且つそれぞれ
の遺伝子を組み込んだ細胞種が産生する結晶性毒素は殺
虫力がそれぞれ異なることを見いだして本発明を完成し
た。
なお、本発明者等は結晶性毒素遺伝子の２種につい
て、その構造を確定しそれぞれcry−１−１（微工研菌
寄第8482号）、cry−１−２（微工研菌寄第8483号）と
名付けた。
すなわち、本発明は非コード領域を含む図−４（Ｂ）
で示される塩基配列もしくはそれと実質上相同な塩基配
列を有する結晶性毒素遺伝子、及び混在する結晶性毒素
遺伝子により分離された該結晶性毒素遺伝子を細菌種に
導入してなる形質転換菌に関するものである。なお、こ
こで塩基配列と実質上相同な塩基配列を有する遺伝子と
は、図−４（Ｂ）で示される塩基配列に欠失、置換、挿
入等の変異が生じたもので、図−４（Ｂ）で示される塩
基配列を有する遺伝子の産生物と同様な殺虫活性効果を
有する産生物を与える遺伝子である。
◎cry−１−２
本発明者等は、バシルス・ツリンギェンシス・クリス
タキ変種HD−１株中に存在する結晶性毒素遺伝子をクロ
ーニングすることとし、ホットレーがJ.Biol.Chem.Vol.
258,1960−1967,1983に開示した記載を参考に、得られ
た結晶性毒素遺伝子の制限酵素切断地図を作成したとこ
ろ、図、１（Ｂ）のごとくなり、それは、ホイットレー
が示したものと全体的には類似していたが、部分的には
異なるものであった。又、本発明者等が決定したcry−
１−２の塩基配列を図−４（Ｂ）に示した。この配列を
ホイットレーが開示したものと全体的には相同性が高か
ったが、異なる配列を有する部分が複数存在するもので
あった。従って、本発明者等がクローニングした結晶性
毒素遺伝子cry−１−２はホイットレーがクローニング
した結晶性毒素遺伝子は異なるものである。
◎cry−１−１
上記の結果から、バシルス・ツリンギェンシス・クリ
スタキ変種HD−１株中には、複数の結晶性毒素遺伝子が
存在することが明らかになったため、更に、クローニン
グを、cry−１−２の構造遺伝子の５末端側に位置する
制限酵素EcoR I切断約1.8KbのDNA断片（Ｅ−1.8）及び
構造遺伝子の中央から下流にかけて存在する制限酵素Hi
nd III切断約1.0KbのDNA断片（Ｈ−1.0）をプローブと
して用い、同株のファージライブラリーから結晶性毒素
遺伝子を選別し、両方のプローブに陽性であった組み換
えファージが21株およびDNAプローブＥ−1.8にのみ陽性
でＨ−1.0に陰性であるファージが13株得られ、この陽
性株21株のもつ遺伝子を解析し、これらは、同質の制限
酵素地図を有し図−１（Ａ）で示されるごとく調節遺伝
子領域と結晶性毒素の構造遺伝子を含む結晶性毒素遺伝
子cry−１−１であった。
結晶性毒素遺伝子cry−１−１は図−１の地図で示さ
れる様にcry−１−２の構造と、上流は比較的よく似て
いるが、下流は大きく異なるものであるうえ、異なる制
限酵素切断部位があり、cry−１−２とは異なる結晶性
毒素遺伝子である。cry−１−１の塩基配列を求め図−
４（Ａ）に示した。この塩基配列は、細菌ホイットレー
が前記文献で示した結晶性毒素遺伝子の塩基配列と１ベ
ース異なるだけで実質的に同一とみなされるものであ
る。
◎その他の結晶性毒素遺伝子
上記cry−１−１をクローニングした際に得られたDNA
プローブＥ−1.8にのみ陽性で、Ｈ−1.0に陰性であるフ
ァージ13株は、結晶性毒素遺伝子の調節遺伝子領域と構
造遺伝子の５末端的1Kbを含むものであり、これらは制
限酵素地図から４個のグループに別けることができ、う
ち２個のグループはcry−１−１とcry−１−２に属する
ものであるが、のこりの２個のグループはそれらに属せ
ずcry−１−１とcry−１−２の異なる結晶性毒素遺伝子
が存在することを示した。
さらに、制限酵素Hind IIIで完全切断したDNAを電気
泳動により展開し、フィルターに吸着させ、cry−１−
２を制限酵素Xba Iで切断して生成する約0.4KbのDNA断
片をプローブとして用い、サザンハイブリダイゼーショ
ンを用い、制限酵素Xba I切断DNA断片とハイブリダイズ
したために生じたバンドを３本、4.7Kb、5.4Kb、及び6.
6Kbに検出した。本結果は、図−５に示されるごとく制
限酵素Xba I切断断片を含む制限酵素Hind III切断断片
には３個の大きさの異なるものがあることを示してお
り、4.7KbのDNA断片はcry−１−１に属し、5.4Kbはcry
−１−２に属するものと判断され、6.6KbのDNA断片を有
する結晶性毒素遺伝子が他に存在することをここでも示
した。
◎結晶性毒素の産生
結晶性毒素遺伝子cry−１−１およびcry−１−２の大
腸菌ベクターにそれぞれクローニングし大腸菌中で結晶
性毒素を発現させることができた。
結晶性毒素の発現は、菌体の抽出物を電気泳動させる
ことにより確認できる。
「作用」
バシルス・ツリンギェンシス中には結晶性毒素をコー
ドする結晶性毒素遺伝子が３ないしそれ以上存在するこ
とを、本発明者党は見いだしたが、さらに驚くことに
は、それぞれの結晶性毒素遺伝子から得られる結晶性毒
素の殺虫力には大きな差異があり、従来得ていたバシル
ス・ツリンギェンシス・クリスタキ変種HD−１株からの
結晶性毒素はそれらの平均化されたものであったのであ
る。
従って、これらの事実を見いだしてなされた本発明、
すなわちバシルス・ツリンギェンシス中から殺虫力の異
なる結晶性毒素をコードする結晶性毒素遺伝子（cry−
１−２）を分離選別し、該遺伝子を用いて得られる形質
転換菌は、従来の結晶性毒素と異なる殺虫力の結晶性毒
素を提供出来るという優れた作用効果を奏するものであ
る。
〔実施例〕
本発明に於ける組み換え体プラスミド類の作成および
殺虫力の測定に際し、以下の詳細な方法が行なわれた。
ａ）バシルス・ツリンギェンシス・クリスタキ変種HD−
１株結晶性毒素遺伝子cry−１−２の選別のための遺伝
子ライブラリー作製
バシルス・ツリンギェンシス・クリスタキ変種HD−１
株を30℃でＬ−培地を用いてクレット単位240迄培養
し、リゾチーム浄化した後、SDS処理を行ない全DNAを抽
出、精製した。抽出したDNAを制限酵素Sau3A Iにて部分
浄化した。制限酵素反応は製造業者（宝酒造株式会社
製）の推奨に従った。種々の条件で消化したDNAをショ
糖密度勾配遠心分離にかけ、４〜6Kb分画を回収精製し
た。
次に、精製した４〜6Kb分画を、制限酵素BamH Iを用
いた消化により、既に開環済の大腸菌プラスミドpUC−
９に結合させた。プラスミドpUC−９は公知の方法であ
るアルカリ−SDS法により、pUC−９を含む大腸菌JM83か
ら単離された。結合はT4DNAリガーゼ（宝酒造株式会社
製）によって、製造業者の推奨に従った条件で、16時間
反応を行なった。
次に、前記組み換えプラスミドを大腸菌JM83株中に形
質転換した。形質転換は塩化カルシウム処理を行なった
大腸菌を用いて、ManndelらがJ.Mol.Biol.53,154（197
0）で述べた方法によって行なった。形質転換された大
腸菌JM83株は、アンピシリン50μg/mlと５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
20μg/mlを含む、Ｌ−寒天培地上に撒かれた。プラスミ
ドpUC−９はMessingらによってGene19,259（1982）に述
べられているように、アンピシリン耐性遺伝子を持ち、
大腸菌JM83中では組み換えが行なわれている場合は白
の、組み換えが行なわれていない場合は青のコロニーを
1acZ遺伝子の働きで形成させる形質を与える。従って、
前記回転培地上で形成された白色のコロニーを、遺伝子
が組み込まれたライブラリーとした。
ｂ）結晶性毒素遺伝子cry−１−２を持つ転換菌の選別
バシルス・ツリンギェンシス・クラスタキ変種HD−１
株の結晶性毒素遺伝子の１つの遺伝子構造が、ホワイト
リーらによって明らかにされた。
本発明者らは、その情報をもとに、結晶性毒素遺伝子
選別のためのDNAプローブ２種をトリエステル法にて合
成した。合成されたオリゴヌクレオチドはATGGATAACAAT
CCおよびCTCCTGTAGGGTTTという塩基配列の二種である。
各々３′末端を32P−γ−ATP（アマーシャム製）によっ
て標識され実験に供試された。
次に作成されたバシルス・ツリンギェンシス・クラス
タキ変種HD−１株の遺伝子ライブラリーより、前記DNA
プローブを用いて、結晶性毒素遺伝子を持つ転換菌がコ
ロニーハイブリダイゼーションによって選び出された。
コロニーハイブリダイゼーションは、講談社サイエンテ
ィフィク遺伝子操作マニュアルに記述された方法に従っ
て行ない、ニトロセルロースフィルターはSchleicher
＆ Schnell社製BA85が使用された。コロニーハイブリダ
イゼーションの結果、約600個のコロニーから２個の陽
性組換菌が得られた。
ｃ）バシルス・ツリンギェンシス・クルスタキ変種HD−
１結晶性毒素遺伝子cry−１−２の構造解析
コロニーハイブリダイゼーションにより得られた陽性
組換菌について、詳細な制限酵素切断地図を作製した。
制限切断地図作製に用いた制限酵素はEcoR I、Hind II
I、Acc I、Aha III、Hinc II、Pst I、Pvu II、Sal I、
Sma I、Xba I、（以上、宝酒造株式会社製）、Kpu I
（ニッポンジーン社製）、Ban III（トーヨーボー社
製）で掛々製造業者の推奨する方法にて使用した。
次に、作成した制限酵素切断地図、図−１（Ｂ）をも
とに結晶性毒素遺伝子を各種、断片化し、プラスミドpU
C−９およびpUC−13に再クローン化した。再クローン化
は主に以下の記載により行なわれた。
結晶性毒素遺伝子を各種制限酵素で、製造業者の推奨
する方法に従い切断し、アガロースゲルを用い、サザン
らの方法（J.Mol.Biol.98,508,1975）に従い目的のDNA
断片を回収した。次に目的の制限酵素で開環済のプラス
ミドpUC−９またはpUC−13にT4DNAリガーゼ（宝酒造株
式会社製）を用いて、製造業者の推奨方法に従い、結合
反応を行なった。結合し再び環状になったプラスミドを
先記の方法で、大腸菌JM83中に形質転換し、プレート上
で選別した。
次に、作成した組換プラスミドを使用して、結晶性毒
素遺伝子の一次構造の決定を行なった。一次構造の決定
はサンガーらの原理（Proc.Nat.Acad.Sci.USA74,1977）
を利用し、プラスミドを直接酵素反応に元いる方法で行
なわれた。プライマーはPLバイオケミカル社製の17量体
のプライマー右用および左用が使用された。酵素反応は
宝酒造株式会社製のタカラM13シークエンスキットを用
い、製造者の推奨に従った条件にて行なわれた。DNAの
標識には、アマーシャム社製32P−α−dCTPが使用され
た。標識の終了したDNA試料は0.2mm厚、40cm×20cmのポ
リアクリルアミドゲルを用いて電気泳動された。ポリア
クリルアミドゲルは６％および８％の濃度のものが使用
され、2000V定電流通電でそれぞれ電気泳動された。電
気泳動の終了したゲルは、ワットマン3MM濾紙に貼りつ
けられ、乾燥された後、富士写真工業株式会社社製Ｘ線
フィルムで14時間オートラジオグラフィーにかけられ
た。
ｄ）バシルス・ツリンギェンシス・クルスタキ変種HD−
１株中に存在する結晶性毒素遺伝子の性格づけ
発明者らが、クローン化し構造を明らかにした結晶精
読素の遺伝子はホワイトリーらの示す結晶性毒素遺伝子
とは異なるものであることが明らかとなった。本結果よ
り、バシルス・ツリンギェンシス・クルスタキ変種HD−
１株には少なくとも２つ以上の結晶性度素の遺伝子が存
在することが示唆された。以上の背景のもと、本発明者
らは、サザンプロット解析により、バシルス・ツリンギ
ェンシス・クルスタキ変種HD−１株中の結晶性毒素の性
格づけを行なった。
MYP培地にて30℃で240クレットまで培養したバシルス
・ツリンギェンシス・クルスタキ変種HD−１株からゴッ
トソンらの方法（Biochem.Biophys.Acta 299,516,197
3）に従い全DNAを抽出精製した。抽出したDNAは制限酵
素Hind III（宝酒造株式会社製）を用い、製造者の推奨
に従った条件下で完全に切断した。切断されたDNA断片
を0.8％アガロースゲル電気泳動にて展開後サザンらの
提示したDNA解析法サザンブロッティング（J.Mol.Biol.
98,503,1975）にかけられた。サザンブロッティングは
講談社サイエンティフィク「遺伝子操作マニュアル」の
方法に従い行なわれた。ハイブリダイゼーションのため
のDNAプローブは発明者らがクローン化した結晶性毒素
遺伝子cry−１−２を制限酵素Xba Iで切断し、生成する
約0.4KbのDNA断片をアマーシャム社製ニックトランスレ
ーションキットを用い、32P−α−dCTP（アマーシャム
社製）によって標識したものが用いられた。
ｅ）バシルス・ツリンギェンシス・クルスタキ変種HD−
１株結晶性毒素遺伝子cry−１−１の選別のための遺伝
子ライブラリーの作製
バシルス・ツリンギェンシス・クルスタキ変種HD−１
株には複数の結晶性毒素遺伝子が存在することが明白に
なったため、本発明者らは、前項と異った方法により、
再度遺伝子ライブラリーを作製し、クローン化を試み
た。
バシルス・ツリンギェンシス・クルスタキ変種HD−１
株より、先記の方法で抽出した全DNAを制限酵素EcoR I
（宝酒造株式会社製）にて部分切断した。切断したDNA
断片をショ糖密度勾配のもとで超遠心分離で分画し、11
〜21Kbのファージ頭部に組み込み可能な断片を分取し
た。一方、入ファージシャロン4Aを制限酵素EcoR I（宝
酒造株式会社製）で切断し、付着末端を持つ断片を調整
した。以上のように調整したバシルス・ツリンギェンシ
ス・クルスタキ変種HD−１のDNA断片とファージのDNA断
片はDNA結合酵素T4DNAリガーゼ（宝酒造株式会社製）に
よって結合させた。結合反応は製造業者の推奨する方法
に従って行なわれた。
次に結合させたDNA断片はスタンバーグらの方法（Gen
e 1,255,1977）によりインビトロパッケージングされ
た。この操作は宝酒造株式会社インビトロパッケージン
グキットを用い製造業者の推奨する方法に従い行なわれ
た。パッケージングの完了したファージはＴ−寒天培地
上に、大腸菌LE392を指示菌としてプレーティングさ
れ、37℃にて12時間培養した。出現したプラークをかき
取り、これをバシルス・ツリンギェンシス亜種HD−１株
遺伝子ファージライブラリーとした。
ｆ）バシルス・ツリンギェンシス・クルスタキ変種HD−
１株結晶性毒素遺伝子cry−１−１のファージライブラ
リーからの選別
前項に記載したバシルス・ツリンギェンシス・クルス
タキ変種HD−１株の遺伝子ライブラリーより結晶性毒素
遺伝子を持つファージの選抜をプラークハイブリダイゼ
ーション方にて行なった。組み換え体の選抜に用いられ
たDNAプローブは先項にてクローン化した結晶性毒素遺
伝子cry−１−２の構造遺伝子領域の５′末端より約270
塩基に位置するEcoR Iの制限酵素切断部位から、３′側
に向って約1700塩基下流に位置するEcoR I迄の領域（以
下Ｅ−1.7と省略）と、同じく構造遺伝子５′末端より
約1690塩基下流に位置するHind IIIの制限酵素切断部か
ら３′側に向って約1000塩基に位置するHind III迄の領
域（以下Ｈ−1.0と略称）の２つを用いた。制限酵素Eco
R IおよびHind III消化により調製したＥ−1.8およびＨ
−1.0はアマーシャム社製ニッケトランスレーションキ
ットを用い、32P−αdCTP（アマーシャム社製）によっ
て標識された。プラークハイブリダイゼーションは講談
社サイエンティフィク遺伝子操作マニュアルに述べられ
ている方法で行なわれた。
ｇ）バシルス・ツリンギェンシス・クルスタキ変種HD−
１結晶性毒素遺伝子cry−１−１の構造解析
構造解析は先項に記載したcry−１−２と同様の方法
で行なわれた。
ｈ）クローン化された結晶性毒素遺伝子cry−１−１お
よびcry−１−２の産生物の同定と殺虫力の測定
本発明者らによって差別化された２種類のパシルス・
ツリンギェンシス・クルスタキ変種HD−１株の結晶性毒
素遺伝子cry−１−１とcry−１−２はそれぞれ大腸菌ブ
ラスミドpUC9にクローン化され、その塩基配列が明らか
にされた結果、cry−１−１の遺伝子産性は1176アミノ
酸より構成されており、分子量は133020さらにcry−１
−２の遺伝子酸物は1155アミノ酸より成り、分子量が13
0623であった。本結果は、従来より示されてきた結晶性
毒素の分子量約130000とよく一致する。
次に、クローン化した結晶性毒素遺伝子を大腸菌JM83
株に導入し、発現せしめ、菌体の抽出液中の蛋白質を以
下に記載した方法にて解析した。
各遺伝子を持つ大腸菌JM83株をＬ−培地で培養し、培
養液150mlを遠心集菌し、水で菌体を洗浄した後、30mM
トリス塩酸緩衝液（pH8.0）−10mMエチレンジアミン四
酢酸−50mM塩化ナトリウム液10mlに懸濁し、15mg/mlに
なるようにリゾチーム（生化学工業社製）を加え、37℃
で１時間反応させた。次にDNase I（宝酒造株式会社
製）を30μ加えた後、−80℃と室温での凍結と触解を
４回繰り返し、細胞を破壊した。本試料を用いてSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカイコ幼虫に対
する殺虫力を試験した。
電気泳動は、15cm×15cmの大きさに作製された2mm厚
の５％ポリアクリルアミドゲルに20μの試料を乗せ、
100mA定電流にて５時間通電した。分子量マーカーとし
てオリエンタル酵母株式会社製MW−Marker（HPLC）を同
時に泳動した。泳動の終了したゲルは0.25％クマシーブ
リリアントブルーＲ−250にて染色され、10％酢酸−10
％メチルアルコール水溶液にて脱色された。
大腸菌中に移入されたcry−１−１およびcry−１−２
の遺伝子産物の殺虫力は次に記述される方法にて測定さ
れた。組換株より調製した試料およびバシルス・ツリン
ギェンシス・クルスタキ変種HD−１株の培養液より分離
した結晶性毒素の溶解液0.5mlは共同飼料社製の人工飼
料に混和後、9cmφのシャーレに広げられた。一枚のシ
ャーレにつき４令にまで飼育されたカイコ幼虫10頭を移
し、37℃で72時間静置した後、シャーレ中の死虫数を測
定した。カイコ幼虫はカイコ卵をカネボウシルクエレガ
ンス社より購入し、３令まで飼育したものを試験に供し
た。殺虫力の表記はハワード・ダルメージらの方法（J.
Jnvertebrate Pathology 18,240,1971）に従った。
試料中の結晶性毒素含量（mg）は前述のSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動像をデンシトメーターにかけ
下記の式より求めた。
上記方法で試験した結晶性毒素遺伝子cry−１−１、c
ry−１−２の翻訳された遺伝子産物さらに、バシルス・
ツリンゲンシス・クルスタキ変種HD−１株により製造し
た結晶性毒素の殺虫力の結果は表−１に示した。
この結果から明らかなように、殺虫力は３者で異なる
ものであった。すなわち、殺虫力はcry−１−１の産物
＞HD−１株の結晶毒素＞cry−１−２の産物であった。
以上の研究から、バシルス・ツリンゲンシス・クルス
タキ変種HD−１株より製造している生物農薬中には殺虫
力の異なる複数の結晶性毒素が存在していることは明白
であり、生物農薬の殺虫力は複数の結晶性毒素蛋白質の
持つ殺虫力の平均化されたものであることが明らかであ
る。事実、バシルス・ツリンギェンシス・クルスタキ変
種HD−１株の発酵液から得られた結晶性毒素の殺虫力
（337000IU/Mg）はcry−１−２の発現して産生される蛋
白質の活性（821240IU/mgと56520IU/mg）の中間に位置
する。
更に、cry−１−１及びcry−１−２のコナガに対する
殺虫活性を以下の様にして求めた。
cry−１−１を持つ大腸菌JM109及びcry−１−２を持
つ大腸菌JM83をそれぞれＬ−培地で培養し、培養液を遠
心により集菌した後、菌体を1mMエチレンジアミン四酢
酸（pH8.0）、2mMフェニルメチルスルフォニルフロライ
ド液に懸濁し、超音波破砕処理を行った。該懸濁液を30
0ppmのトリトンＸ−100溶液で適宜希釈し、異なる濃度
の希釈液を作成した。これらの希釈液に、6cm四方に切
断したキャベツ葉を浸漬し、ポリ容器にいれ、風乾し
た。各容器に２〜３令のコナガ幼虫を10頭ずつ入れ、28
℃で３新乾飼育した後成虫数を策定し毒素蛋白当りのLC
50値を求め毒素蛋白の殺虫活性を比較した結果を表−２
に示した。
（ハ）発明の効果
本発明によれば、高殺虫力の結晶性毒素を製造するこ
とが可能であり、その結果、生物農薬の製造に伴うコス
トを低減させ、既存製品に対する市場競争力を付与する
ものである。Detailed Description of the Invention (a) Purpose of the Invention "Field of Industrial Application" The present invention relates to a crystalline toxin gene and a transformant into which the crystalline toxin gene has been introduced. It is used for the production of effective biological pesticides and is widely used in pesticides and pesticide-related industries. "Prior art" Intracellular inclusions formed during sporulation during the Bacillus thuringiensisno life cycle are called crystalline toxins and are known to be toxic to many Lepidopteran pests. Cage,
Biological pesticides containing the crystalline toxin as an active ingredient are mainly Bacillus thuringiensis kristaki variety HD-1 strain (Baci
llus thuringiensis var kurstaki HD-1-Dipel) is produced by using the fermentation liquid of the sporulation stage. "Problems to be Solved by the Invention" The production of a biopesticide containing a crystalline toxin as an active ingredient, which is carried out using a fermentation solution in the sporulation period, requires a relatively high production cost for the reasons described below. . That is, since the crystalline toxin appears in synchronization with the formation of spores during the spore formation period, it takes time to operate the single fermenter, and the yield is low, so it can be said that the production efficiency is excellent. There is no. Therefore, this high reduction in the production cost of biopesticides is a major problem to be solved by those skilled in the art. (B) Structure of the Invention "Means for Solving the Problem" In order to solve the above problems, the present inventors have proposed a genetically engineered crystalline toxin disclosed by HR Whiteley in JP-A-58-500565. In an attempt to supplement production, a crystalline toxin gene encoding a crystalline toxin present in Bacillus thuringiensis was extracted.
The present invention was completed by discovering that three or more of the crystalline toxin genes are present in Thuringiensis, and that the crystalline toxins produced by the cell types incorporating the respective genes have different insecticidal activities. did. The inventors of the present invention have determined the structures of two crystalline toxin genes, cry-1-1 (Microtechnical Research Institute No. 8482) and cry-1-2 (Microtechnical Research Institute, Microtechnology Research Institute). No. 8483). That is, the present invention includes a non-coding region as shown in FIG.
A crystalline toxin gene having a nucleotide sequence represented by or a nucleotide sequence substantially homologous thereto, and a transformant obtained by introducing the crystalline toxin gene isolated by a mixed crystalline toxin gene into a bacterial species. is there. The gene having a base sequence substantially homologous to the base sequence is one in which a mutation such as deletion, substitution, or insertion has occurred in the base sequence shown in FIG. 4 (B). It is a gene that gives a product having an insecticidal activity effect similar to the product of the gene having the nucleotide sequence shown in B). ◎ cry-1-2 The present inventors decided to clone the crystalline toxin gene existing in Bacillus thuringiensis kristaki variety HD-1 strain, and Hotley et al. J. Biol. Chem. Vol.
A restriction enzyme digestion map of the obtained crystalline toxin gene was created with reference to the description disclosed in 258, 1960-1967, 1983, and it became as shown in Fig. 1 (B), which was shown by Whitley. They were similar overall but partially different. In addition, the cry-
The nucleotide sequence of 1-2 is shown in Fig. 4 (B). Although this sequence was highly homologous to the one disclosed by Whitley, there were a plurality of portions having different sequences. Therefore, the crystalline toxin gene cry-1-2 cloned by the present inventors is different from the crystalline toxin gene cloned by Whitley. ◎ cry-1-1 From the above results, it was revealed that multiple crystalline toxin genes exist in the Bacillus thuringiensis kristaki variety HD-1 strain. Restriction enzyme EcoR I cleaved about 1.8 Kb DNA fragment (E-1.8) located at the 5'end of the structural gene of No. 2 and restriction enzyme Hi existing from the center to the downstream of the structural gene
A crystalline toxin gene was selected from the phage library of the same strain using a DNA fragment (H-1.0) of about 1.0 Kb cleaved by nd III as a probe. We obtained 13 strains of phages that were positive only for E-1.8 and negative for H-1.0, and analyzed the genes of the 21 positive strains. These have the same restriction enzyme map and are shown in FIG. 1 (A). It was a crystalline toxin gene cry-1-1 containing the regulatory gene region and the structural gene of crystalline toxin as shown in. The crystalline toxin gene cry-1-1 is relatively similar to the structure of cry-1-2 on the upstream side as shown in the map of Fig. 1, but is greatly different on the downstream side and has different restrictions. It is a crystalline toxin gene that has an enzyme cleavage site and is different from cry-1-2. Figure out the nucleotide sequence of cry-1-1
4 (A). This base sequence is considered to be substantially the same as that of the bacterial toxin gene, which differs from the base sequence of the crystalline toxin gene shown in the above-mentioned document by the bacterial Whitley by one base. ◎ Other crystalline toxin genes DNA obtained when the above cry-1-1 was cloned
The phage 13 strain, which is positive only for probe E-1.8 and negative for H-1.0, contains the regulatory gene region of the crystalline toxin gene and the 5-terminal 1 Kb of the structural gene, and these are 4 from the restriction map. Can be divided into two groups, two of which belong to cry-1-1 and cry-1-2, but the two remaining groups do not belong to them and cry-1-1 It was shown that there are different crystalline toxin genes of cry-1-2. Furthermore, the DNA completely digested with the restriction enzyme Hind III was developed by electrophoresis, adsorbed on a filter, and cry-1-
Using a DNA fragment of about 0.4 Kb generated by cleaving 2 with restriction enzyme Xba I as a probe, Southern hybridization was used to generate 3 bands of 4.7 Kb resulting from hybridization with the DNA fragment cleaved with restriction enzyme Xba I. , 5.4 Kb, and 6.
Detected at 6 Kb. As shown in Fig. 5, this result shows that there are three restriction enzyme Hind III digested fragments including the restriction enzyme Xba I digested fragment, which have three different sizes, and the 4.7 Kb DNA fragment is cry. -1-1, 5.4 Kb is cry
It was also shown here that there is another crystalline toxin gene that was determined to belong to 1-2 and has a DNA fragment of 6.6 Kb. ◎ Production of crystalline toxin The crystalline toxin could be expressed in Escherichia coli by cloning into the E. coli vector of the crystalline toxin genes cry-1-1 and cry-1-2, respectively. The expression of the crystalline toxin can be confirmed by subjecting the cell extract to electrophoresis. "Action" The present inventor found that there are three or more crystalline toxin genes encoding crystalline toxins in Bacillus thuringiensis, but it is more surprising that each crystalline toxin gene is There is a large difference in the insecticidal activity of the crystalline toxins obtained from Bacillus thuringiensis kristaki variety HD-1 strain which was obtained in the past was an average of those. Therefore, the present invention made by finding these facts,
That is, a crystalline toxin gene (cry- encoding a crystalline toxin having different insecticidal activity) from Bacillus thuringiensis (cry-
A transformant obtained by separating and selecting 1-2) and using the gene has an excellent effect of providing a crystalline toxin having an insecticidal activity different from that of the conventional crystalline toxin. [Examples] The following detailed methods were carried out in preparing recombinant plasmids and measuring insecticidal activity in the present invention. a) Bacillus thuringiensis kristaki variety HD-
Preparation of gene library for selection of 1 strain crystalline toxin gene cry-1-2 Bacillus thuringiensis kristaki variety HD-1
The strain was cultivated up to 240 Klett units in L-medium at 30 ° C., purified by lysozyme, and then subjected to SDS treatment to extract and purify total DNA. The extracted DNA was partially purified with the restriction enzyme Sau3A I. The restriction enzyme reaction followed the recommendation of the manufacturer (Takara Shuzo Co., Ltd.). The DNA digested under various conditions was subjected to sucrose density gradient centrifugation, and 4-6 Kb fractions were collected and purified. Next, the purified 4 to 6 Kb fraction was digested with the restriction enzyme BamHI, and the Escherichia coli plasmid pUC-which had been already opened was digested.
Bound to 9. The plasmid pUC-9 was isolated from Escherichia coli JM83 containing pUC-9 by the known method of alkali-SDS. For the ligation, T4 DNA ligase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was used and the reaction was carried out for 16 hours under the conditions recommended by the manufacturer. Next, the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli JM83 strain. For transformation, Escherichia coli treated with calcium chloride was used, and Manndel et al., J. Mol. Biol. 53, 154 (197
It was performed by the method described in 0). The transformed Escherichia coli JM83 strain contained 50 μg / ml of ampicillin and 5-bromo-4.
-Chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Plated on L-agar containing 20 μg / ml. Plasmid pUC-9 carries the ampicillin resistance gene, as described in Gene 19,259 (1982) by Messing et al.
In Escherichia coli JM83, white colonies are shown when recombination has been carried out, and blue colonies are shown when no recombination has been carried out.
Gives the trait to be formed by the action of the 1acZ gene. Therefore,
White colonies formed on the rotating medium were used as a gene-incorporated library. b) Selection of transformants having the crystalline toxin gene cry-1-2 Bacillus thuringiensis clathki variety HD-1
The genetic structure of one of the crystalline toxin genes of the strain was elucidated by Whiteley et al. Based on this information, the present inventors synthesized two DNA probes for selecting crystalline toxin gene by the triester method. The synthesized oligonucleotide is ATGGATAACAAT
There are two types of nucleotide sequences, CC and CTCCTGTAGGGTTT.
Each 3'end was labeled with 32 P-γ-ATP (manufactured by Amersham) and used for the experiment. Next, from the gene library of Bacillus thuringiensis clathki var.
Using the probe, transformants carrying the crystalline toxin gene were selected by colony hybridization.
Colony hybridization was performed according to the method described in the Kodansha Scientific Gene Operation Manual. The nitrocellulose filter was Schleicher.
& BA85 made by Schnell was used. As a result of colony hybridization, two positive recombinant bacteria were obtained from about 600 colonies. c) Bacillus thuringiensis kleustaki variety HD-
1. Structural analysis of crystalline toxin gene cry-1-2 A detailed restriction enzyme cleavage map was prepared for the positive recombinant bacteria obtained by colony hybridization.
The restriction enzymes used for constructing the restriction map were EcoR I and Hind II
I, Acc I, Aha III, Hinc II, Pst I, Pvu II, Sal I,
Sma I, Xba I, (Made by Takara Shuzo Co., Ltd.), Kpu I
(Nippon Gene Co., Ltd.) and Ban III (Toyo Bo Inc.) were used according to the method recommended by the manufacturer. Next, various crystalline toxin genes were fragmented based on the prepared restriction enzyme digestion map, Fig. 1 (B), and plasmid pU
It was recloned into C-9 and pUC-13. Recloning was mainly performed as described below. The crystalline toxin gene is cleaved with various restriction enzymes according to the method recommended by the manufacturer, and the target DNA is obtained according to the method of Southern et al. (J. Mol. Biol. 98, 508, 1975) using agarose gel.
The fragments were recovered. Next, T4 DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) was used to ligate the plasmid pUC-9 or pUC-13 which had been opened with the target restriction enzyme, according to the method recommended by the manufacturer. The ligated and recircularized plasmid was transformed into E. coli JM83 and screened on plates as described above. Next, the recombinant plasmid thus prepared was used to determine the primary structure of the crystalline toxin gene. The primary structure is determined by Sanger et al. (Proc.Nat.Acad.Sci.USA74,1977)
Was carried out by a method in which the plasmid was directly subjected to an enzymatic reaction using P. As the primer, a 17-mer primer for PL Biochemical Co., Ltd. for right and left primers was used. The enzymatic reaction was performed using Takara M13 Sequence Kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. under the conditions recommended by the manufacturer. 32 P-α-dCTP manufactured by Amersham was used for labeling the DNA. The labeled DNA sample was electrophoresed on a 0.2 mm thick, 40 cm x 20 cm polyacrylamide gel. Polyacrylamide gels having a concentration of 6% and 8% were used and were electrophoresed at a constant current of 2000 V. The gel after the electrophoresis was attached to Whatman 3MM filter paper, dried, and then subjected to autoradiography with an X-ray film manufactured by Fuji Photo Industry Co., Ltd. for 14 hours. d) Bacillus thuringiensis krustaki variety HD-
Characterization of the crystalline toxin gene present in one strain It was revealed that the gene of the crystal-reading element that the inventors have cloned and clarified the structure is different from the crystalline toxin gene shown by Whiteley et al. became. From this result, Bacillus thuringiensis Krustaki variety HD-
It was suggested that one strain has at least two genes of crystallin elements. Based on the above background, the present inventors characterized the crystalline toxin in Bacillus thuringiensis krustaki strain HD-1 strain by Southern plot analysis. From the Bacillus thuringiensis krustaki variety HD-1 strain cultivated in MYP medium at 30 ° C. up to 240 klets, the method of Gottson et al. (Biochem.Biophys.Acta 299,516,197
According to 3), total DNA was extracted and purified. The extracted DNA was completely cleaved using the restriction enzyme Hind III (Takara Shuzo Co., Ltd.) under the conditions according to the manufacturer's recommendations. The cleaved DNA fragment was developed by 0.8% agarose gel electrophoresis and then Southern blotting (J. Mol. Biol.
98,503,1975). Southern blotting was performed according to the method of Kodansha Scientific "Genetic Operation Manual". As a DNA probe for hybridization, a crystalline toxin gene cry-1-2 cloned by the inventors was cleaved with a restriction enzyme XbaI, and a DNA fragment of about 0.4 Kb produced by Amersham Co. Nick Translation Kit was used. The one labeled with 32 P-α-dCTP (manufactured by Amersham) was used. e) Bacillus thuringiensis krusutaki variant HD-
Construction of gene library for selection of 1 strain of crystalline toxin gene cry-1-1 Bacillus thuringiensis krustaki variety HD-1
Since it became clear that multiple crystalline toxin genes are present in the strain, the present inventors have conducted a method different from the above-mentioned method.
A gene library was prepared again and cloning was tried. Bacillus thuringiensis krustaki variety HD-1
The total DNA extracted from the strain by the above-mentioned method was digested with the restriction enzyme EcoRI
(Takara Shuzo Co., Ltd.) partially cut. Cut DNA
Fractions were ultracentrifuged under a sucrose density gradient and
Fragments that could be integrated into the ~ 21 Kb phage head were sorted. On the other hand, the phage phage Sharon 4A was cleaved with a restriction enzyme EcoRI (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) to prepare a fragment having sticky ends. The Bacillus thuringiensis krustaki variety HD-1 DNA fragment and the phage DNA fragment prepared as described above were ligated with a DNA-binding enzyme T4 DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.). The coupling reaction was performed according to the method recommended by the manufacturer. Next, the ligated DNA fragment was analyzed by Stanberg et al. (Gen
e1,255,1977) and in vitro packaging. This operation was performed by using the Takara Shuzo Co., Ltd. in vitro packaging kit according to the method recommended by the manufacturer. The phages for which packaging was completed were plated on T-agar medium using Escherichia coli LE392 as an indicator strain and cultured at 37 ° C for 12 hours. The plaques that appeared were scraped off and used as Bacillus thuringiensis subspecies HD-1 strain gene phage library. f) Bacillus thuringiensis krustaki variety HD-
Selection of 1 strain of crystalline toxin gene cry-1-1 from phage library Plaque hybridization of selection of phages having crystalline toxin gene from the gene library of Bacillus thuringiensis kurstaki variant HD-1 strain described in the previous section. It was done by one. The DNA probe used for the selection of the recombinant was about 270 from the 5'end of the structural gene region of the crystalline toxin gene cry-1-2 cloned in the previous section.
The region from the restriction enzyme cleavage site of EcoR I located at the base to the EcoR I located at about 1700 bases downstream toward the 3'side (hereinafter abbreviated as E-1.7) and also about 1690 from the 5'end of the structural gene. Two regions (hereinafter, abbreviated as H-1.0) from the restriction enzyme cleavage site of Hind III located downstream of the base to Hind III located at about 1000 bases toward the 3'side were used. Restriction enzyme Eco
E-1.8 and H prepared by RI and Hind III digestion
-1.0 was labeled with 32 P-αdCTP (manufactured by Amersham) using a Nicker translation kit manufactured by Amersham. Plaque hybridization was performed by the method described in Kodansha Scientific Gene Operation Manual. g) Bacillus thuringiensis kleustaki variety HD-
1. Structural Analysis of Crystalline Toxin Gene cry-1-1 Structural analysis was performed by the same method as cry-1-2 described above. h) Identification of products of cloned crystalline toxin genes cry-1-1 and cry-1-2 and determination of insecticidal activity Two types of Pacillus
The crystalline toxin genes cry-1-1 and cry-1-2 of the Turingensis krustaki variety HD-1 strain were cloned into Escherichia coli plasmid pUC9, respectively, and their nucleotide sequences were revealed. The gene productivity is composed of 1176 amino acids, and the molecular weight is 133020 and cry-1.
-2 gene acid consists of 1155 amino acids and has a molecular weight of 13
It was 0623. This result is in good agreement with the molecular weight of the crystalline toxin of about 130,000, which has been shown so far. Next, the cloned crystalline toxin gene was cloned into E. coli JM83.
It was introduced into a strain, expressed, and the protein in the extract of the bacterial cells was analyzed by the method described below. Escherichia coli JM83 strain having each gene was cultured in L-medium, 150 ml of the culture solution was collected by centrifugation, and the cells were washed with water, then 30 mM.
Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) -10 mM ethylenediaminetetraacetic acid-50 mM Suspended in 10 ml of sodium chloride solution, added lysozyme (manufactured by Seikagaku Corporation) to 15 mg / ml, and 37 ° C.
For 1 hour. Next, after adding 30 μl of DNase I (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), the cells were disrupted by repeating freezing and touching at −80 ° C. and room temperature four times. SDS-
Polyacrylamide gel electrophoresis and insecticidal activity against silkworm larvae were tested. Electrophoresis was performed by placing a 20μ sample on a 2mm-thick 5% polyacrylamide gel made to a size of 15cm x 15cm.
It was energized at a constant current of 100 mA for 5 hours. As a molecular weight marker, MW-Marker (HPLC) manufactured by Oriental Yeast Co. was run at the same time. The gel after the electrophoresis was stained with 0.25% Coomassie Brilliant Blue R-250 and 10% acetic acid-10.
It was decolorized with a% methyl alcohol aqueous solution. Cry-1-1 and cry-1-2 transferred into E. coli
The insecticidal activity of this gene product was measured by the method described below. A sample prepared from the recombinant strain and 0.5 ml of the crystalline toxin solution separated from the culture solution of Bacillus thuringiensis kleustaki var. It was Ten silkworm larvae reared up to the fourth instar were transferred to one petri dish, allowed to stand at 37 ° C. for 72 hours, and the number of dead insects in the petri dish was measured. As the silkworm larvae, silkworm eggs were purchased from Kanebo Silk Elegance Co., Ltd. and bred up to the third instar were subjected to the test. Indication of insecticidal power is the method of Howard Dalmage et al. (J.
Jnvertebrate Pathology 18,240,1971). The crystalline toxin content (mg) in the sample was determined by applying the above SDS-polyacrylamide gel electrophoresis image to a densitometer and using the following formula. Crystalline toxin gene cry-1-1, c tested by the above method
The translated gene product of ry-1-2.
The results of the insecticidal activity of the crystalline toxins produced by the strain Turingensis kurstaki strain HD-1 are shown in Table 1. As is clear from this result, the insecticidal activity was different among the three. That is, the insecticidal activity was a product of cry-1-1> a crystal toxin of strain HD-1> a product of cry-1-2. From the above studies, it is clear that there are multiple crystalline toxins with different insecticidal activity in the biopesticide produced from Bacillus thuringiensis kleustaki var. HD-1 strain. Is clearly the averaged insecticidal activity of multiple crystalline toxin proteins. In fact, the insecticidal activity (337000IU / Mg) of the crystalline toxin obtained from the fermentation liquor of Bacillus thuringiensis kleustaki var. And 56520 IU / mg). Furthermore, the insecticidal activity of cry-1-1 and cry-1-2 against diamondback moth was determined as follows. Escherichia coli JM109 having cry-1-1 and E. coli JM83 having cry-1-2 were each cultivated in an L-medium, and the culture solution was collected by centrifugation, and then the cells were 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (pH 8.0). , 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride solution was suspended and subjected to ultrasonic crushing treatment. 30 the suspension
Diluted solutions with different concentrations were prepared by appropriately diluting with 0 ppm Triton X-100 solution. Cabbage leaves cut into 6 cm squares were dipped in these diluted solutions, placed in a plastic container and air-dried. Put 10 2-3 larvae of diamondback moth in each container,
Determine the number of adults after 3 new dry breeding at ℃, LC per toxin protein
The 50 values were calculated and the results of comparing the insecticidal activity of the toxin proteins are shown in Table-2.
It was shown to. (C) Effect of the Invention According to the present invention, it is possible to produce a crystalline toxin having a high insecticidal activity, and as a result, the cost associated with the production of biological pesticides is reduced, and market competitiveness with respect to existing products is imparted. To do.
【図面の簡単な説明】
第１図はバシルス・ツリンギェンシス・クルスタキ変種
HD−１よりクローニングした２つの結晶性毒素およびそ
の近傍の制限酵素地図を表わしており、矢印は結晶性毒
素遺伝子の位置と方向を示す。
図中の制限酵素作用部位はＢがBan III、ＥがEcoR I、H
cがHind II、HdがHind III、ＫがKpn I、PsがPst I、Pv
がPvu IIさらにＸがXba Iを表わす。
第２図は、バシルス・ツリンギェンシス・クルスタキ変
種より分離したDNAを制限酵素Hind IIIにて完全切断
後、アガロースゲル電気泳動を行ない、cry−１−２を
制限酵素Xba Iで完全消化して得られる約0.4KbのDNA断
片をプローブに用いサザンハイブリダイゼーションを行
なったものである。MMは入ファージのDNAを制限酵素Hin
d IIIにて完全消化したDNA断片の泳動位置を示わしてお
り分子量マーカーに相当する。
第３図は、大腸菌ベクターpUC9と結合させたcry−１−
１およびcry−１−２により形質転換させた大腸菌の培
養体の抽出物のSDS/5％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動像を表わす。染色はクマーシーブリリアントブルーに
より行なわれた。図中の番号は１がcry−１−１による
形質転換体、２がバシルス・ツリンギェンシスから分離
した結晶性毒素、３がcry−１−２による形質転換体お
よび４が宿主である大腸菌JM83を表わす。矢印のFendot
oxinは結晶性毒素の泳動位置を示す。
第４図は（Ａ）−１、（Ａ）−２、（Ａ）−３がcry−
１−１の（Ｂ）−１、（Ｂ）−２、（Ｂ）−３がcry−
１−２の塩基配列を夫々表わす。cry−１−１の塩基の
下線はcry−１−２との比較において相同を欠く塩基を
示す。また波線矢印Bt IおよびBt IIはバシルス・ツリ
ンギェンシス中での、また波線矢印Ecは大腸菌中での転
与開始点を表わす。
第５図はサザンハンブリダイゼーションで示された4.
7、5.4および6.6Kb DNA断片の意味を模式的に表わした
ものであり、矢印は結晶性毒素の構造遺伝子の位置を表
わす。制限酵素の略称は図−１と同じ。[Brief description of the drawings] Fig. 1 shows a variety of Bacillus thuringiensis krustaki.
FIG. 2 shows two crystalline toxins cloned from HD-1 and a restriction enzyme map in the vicinity thereof, and arrows indicate the position and direction of the crystalline toxin gene. The sites of restriction enzyme action in the figure are Ban III for B, EcoR I, H for E.
c is Hind II, Hd is Hind III, K is Kpn I, Ps is Pst I, Pv
Represents Pvu II, and X represents Xba I. Figure 2 is obtained by completely cleaving the DNA isolated from Bacillus thuringiensis krusutaki varieties with the restriction enzyme Hind III, followed by agarose gel electrophoresis, and the complete digestion of cry-1-2 with the restriction enzyme Xba I. Southern hybridization was carried out using a DNA fragment of about 0.4 Kb as a probe. MM is a restriction enzyme Hin for the DNA of the input phage.
The migration position of the DNA fragment completely digested with dIII is shown and corresponds to a molecular weight marker. FIG. 3 shows cry-1- linked to the E. coli vector pUC9.
1 shows SDS / 5% polyacrylamide gel electrophoresis images of extracts of E. coli cultures transformed with 1 and cry-1-2. Staining was performed with Coomassie Brilliant Blue. In the figure, 1 represents a transformant with cry-1-1, 2 is a crystalline toxin isolated from Bacillus thuringiensis, 3 is a transformant with cry-1-2, and 4 is E. coli JM83 as a host. . Arrow Fendot
Oxin indicates the migration position of crystalline toxin. In FIG. 4, (A) -1, (A) -2, and (A) -3 are cry-.
1-1 (B) -1, (B) -2, (B) -3 are cry-
The base sequences of 1-2 are shown respectively. The underline of the base of cry-1-1 shows the base lacking homology in comparison with cry-1-2. The wavy arrows Bt I and Bt II represent the transfer initiation point in Bacillus thuringiensis, and the wavy arrow Ec in E. coli. Figure 5 shows Southern hybridization4.
It is a schematic representation of the meaning of 7, 5.4 and 6.6 Kb DNA fragments, and the arrow indicates the position of the structural gene of the crystalline toxin. Abbreviations for restriction enzymes are the same as in Figure 1.
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｒ 1:07）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 大森 巌
名古屋市港区船見町１丁目１番地 東亞
合成化学工業株式会社研究所内
審査官 植野 浩志Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Internal reference number FI Technical indication C12R 1:07) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72) Inventor Iwao Omori 1-1 Funami-cho, Minato-ku, Nagoya-shi Toshi Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. Researcher Hiroshi Ueno