JP2671912B2 - Novel antibacterial protein, production method and use thereof - Google Patents

Novel antibacterial protein, production method and use thereof

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JP2671912B2
JP2671912B2 JP7088393A JP8839395A JP2671912B2 JP 2671912 B2 JP2671912 B2 JP 2671912B2 JP 7088393 A JP7088393 A JP 7088393A JP 8839395 A JP8839395 A JP 8839395A JP 2671912 B2 JP2671912 B2 JP 2671912B2
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稔 山川
眞則 山本
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農林水産省蚕糸・昆虫農業技術研究所長
敷島紡績株式会社
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Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、鞘翅目に属する昆虫の
幼虫体表傷害時にその幼虫の体液中に誘導される抗菌性
蛋白類およびその製造法ならびにその用途に関する。
BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an antibacterial protein that is induced in the body fluid of larvae of an insect belonging to the order Coleoptera, its production method and its use.

【0002】[0002]

【従来の技術】細菌や異種の血球を昆虫に接種したり、
単に体表に傷をつけるといった刺激を与えると体液中に
数々の抗菌性蛋白が誘導されることが知られている。こ
れらの物質は、抗体産生能をもたない動物の生体防御に
とって重要な関わりがあるものと考えられる。これらの
うちで、例えばゴミムシダマシ科の一種(Zophobas at
ratus)幼虫体液中に誘導される活性蛋白として、抗菌活
性をもつ蛋白(J.Boil.Chem.、266巻、245
20−24525頁(1991))などが固定されてい
る。その抗菌活性をもつ蛋白としては、コレオプテリシ
ン(Coleoptericin)と命名され、その理化学的性質も明
らかにされている蛋白、および同じくゴミムシダマシ科
の一種(Zophobas atratus)の幼虫体液から得られ、デ
ィフェンシングループに属し、その理化学的性質も明ら
かにされている蛋白等が知られている。これらは幅広い
抗菌スペクトルを有することから、生体防御物質と考え
られ、さらにこれらの抗菌性蛋白は、特にクラム陰性菌
の大腸菌およびグラム陽性菌のミクロコッカスに対して
強い抗菌力を有している。
BACKGROUND ART Inoculation of insects with bacteria and different types of blood cells,
It is known that various antibacterial proteins are induced in body fluids when a stimulus such as simply damaging the body surface is given. These substances are considered to have an important role in host defense of animals without antibody-producing ability. Among these, for example, a member of the family Tenebrionidae (Zophobas at
ratus) as an active protein induced in larval body fluid, a protein having antibacterial activity (J. Boil. Chem., 266, 245
20-24525 (1991)) and the like are fixed. The protein with its antibacterial activity is named Coleoptericin, a protein whose physicochemical properties have been clarified, and also obtained from the larval fluid of a member of the family Tenebrionidae (Zophobas atratus). And proteins whose physicochemical properties are also known. Since they have a broad antibacterial spectrum, they are considered to be bioprotective substances, and further, these antibacterial proteins have strong antibacterial activity against Escherichia coli, which is a clam-negative bacterium, and Micrococcus, which is a gram-positive bacterium.

【0003】一方、近年、高等哺乳動物でも、精液中や
血清中に、抗菌力が強くて幅広いスペクトルをもつ抗菌
性蛋白の存在が明らかとなり、一般の動物体液中の抗菌
性蛋白が重要視されている。
On the other hand, in recent years, the existence of antibacterial proteins having a high antibacterial activity and a broad spectrum has been revealed in semen and serum even in higher mammals, and antimicrobial proteins in general animal body fluids have been regarded as important. ing.

【0004】しかしながら、他の鞘翅目に属する昆虫の
抗菌性蛋白については、ほとんど精製・分離がなされて
おらず、物質の性状等の理化学的性状は明らかにされて
いない。
However, the antibacterial proteins of other insects belonging to the order Coleoptera have not been purified or separated, and physicochemical properties such as properties of substances have not been clarified.

【0005】[0005]

【発明が解決しようとする課題】かかる事情に鑑み、本
発明は、鞘翅目に属するタイワンカブトムシの抗菌性蛋
白について精製・分離方法を確立し、物質の性状、N末
端アミノ酸配列等の理化学性状を明らかにすることを目
的とする。したがって、この蛋白性物質が単一なまでに
精製・分離でき、そのアミノ酸配列が決定され、さらに
これら昆虫由来の蛋白がヒトなどの脊椎動物の生体防御
機構に働くとなれば、例えば医学・薬学的見地からも寄
与するところは大きい。
In view of the above circumstances, the present invention has established a method for purifying and separating an antibacterial protein of the beetle Beetle belonging to the order Coleoptera, and has established the physical and chemical properties of the substance, N-terminal amino acid sequence and the like. The purpose is to clarify. Therefore, if this proteinaceous substance can be purified / isolated into a single substance, its amino acid sequence is determined, and these insect-derived proteins act on the biological defense mechanism of humans and other vertebrates, for example, medical / pharmaceutical There is a great contribution from the point of view.

【0006】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、意外にも、鞘翅目に属する昆虫、とりわ
けタイワンカブトムシ幼虫の体表傷害時にその体液中に
抗菌性蛋白が誘導されることを見いだし、その精製・分
離に成功し、本発明を完成するに至った。
[Means for Solving the Problems] As a result of intensive studies, the present inventors have surprisingly found that an antibacterial protein is induced in the body fluid of insects belonging to the order Coleoptera, especially the larva of the swan, Beetle. It was found that they were carried out, the purification and separation of them were successful, and the present invention was completed.

【0007】すなわち、本発明は、 (1) 鞘翅目に属する昆虫の幼虫の体表傷害時にその
幼虫の体液中に誘導される、N末端アミノ酸配列がH2
N−Val−Pro−Val−Gly−Ser−Asp−Pro-Glu−
Pro−Lys−Leu−Met−Thr−Met−Asp−Leu−V
al−Pro−His−であり、下記の性質を有する抗菌性蛋
白、またはこれと免疫学的に共通抗原性を有する抗菌性
蛋白 (i)分子量約7,100〜7,300 (ii)熱安定性(5〜10分間、100℃) (2) 鞘翅目に属する昆虫がタイワンカブトムシ(Or
yctes rhinoceros)である、(1)記載の抗菌性蛋白 (3) 幼虫が三令幼虫である、(1)または(2)に
記載の抗菌性蛋白 (4) 幼虫の体液が体表傷害後0〜10日経過後のも
のである、(1)ないし(3)のいずれか1に記載の抗
菌性蛋白、および、
That is, the present invention is as follows: (1) The N-terminal amino acid sequence H 2 is induced in the body fluid of an insect larva belonging to the order Coleoptera upon body surface injury.
N-Val-Pro-Val-Gly-Ser-Asp-Pro-Glu-
Pro-Lys-Leu-Met-Thr-Met-Asp-Leu-V
al-Pro-His-, which is an antibacterial protein having the following properties, or an antibacterial protein having an immunologically common antigenicity therewith (i) molecular weight of about 7,100 to 7,300 (ii) thermostable Sex (5-10 minutes, 100 ℃) (2) Insects belonging to the order Coleoptera are
yctes rhinoceros), the antibacterial protein according to (1), (3) the larva is a third-instar larva, (1) or the antibacterial protein according to (2), (4) the body fluid of the larva is 0 after body surface injury. The antibacterial protein according to any one of (1) to (3), which is after 10 days, and

【0008】(5) 鞘翅目に属する昆虫の幼虫の体表
に傷害を与え、その後得られる体液より体液細胞および
脂肪体を除去したものから、N末端アミノ酸配列がH2
N−Val−Pro−Val−Gly−Ser−Asp−Pro−Glu
−Pro−Lys−Leu−Met−Thr−Met−Asp−Leu−
Val−Pro−His−であり、下記の性質を有する抗菌性
蛋白、またはこれと免疫学的に共通抗原性を有する抗菌
性蛋白を取得することを特徴とする、抗菌性蛋白の製造
法 (i)分子量約7,100〜7,300 (ii)熱安定性(5〜10分間、100℃) (6) 鞘翅目に属する昆虫がタイワンカブトムシ(Or
yctes rhinoceros)である、(5)記載の製造法 (7) 幼虫が三令幼虫である、(5)または(6)に
記載の製造法 (8) 幼虫の体液が体表傷害後0〜10日経過後のも
のである、(5)ないし(7)のいずれか1に記載の製
造法、ならびに、
(5) The body surface of the larva of an insect belonging to the order Coleoptera is damaged, and the body fluid obtained after removing body fluid cells and fat pads has an N-terminal amino acid sequence of H 2
N-Val-Pro-Val-Gly-Ser-Asp-Pro-Glu
-Pro-Lys-Leu-Met-Thr-Met-Asp-Leu-
A method for producing an antibacterial protein, which comprises obtaining an antibacterial protein that is Val-Pro-His- and has the following properties, or an antibacterial protein that has an immunological common antigenicity therewith (i ) Molecular weight about 7,100 to 7,300 (ii) Thermal stability (5 to 10 minutes, 100 ° C) (6) Insects belonging to the order Coleoptera are beetle beetles (Or
yctes rhinoceros) (5) The production method according to (5) The larva is a third-instar larva, the production method according to (5) or (6) (8) The body fluid of the larva is 0 to 10 after body surface injury. The production method according to any one of (5) to (7), which is after a lapse of days, and

【0009】(9) 鞘翅目に属する昆虫の幼虫の体表
傷害時にその幼虫の体液中に誘導される、N末端アミノ
酸配列がH2N−Val−Pro−Val−Gly−Ser−Asp
−Pro−Glu−Pro−Lys−Leu−Met−Thr−Met−
Asp−Leu−Val−Pro−His−であり、下記の性質を
有する抗菌性蛋白、またはこれと免疫学的に共通抗原性
を有する抗菌性蛋白を有効成分とする可食性抗菌剤 (i)分子量約7,100〜7,300 (ii)熱安定性(5〜10分間、100℃) (10) 鞘翅目に属する昆虫がタイワンカブトムシ
(Oryctes rhinoceros)である、(9)記載の可食性抗
菌剤 (11) 幼虫が三令幼虫である、(9)または(1
0)に記載の可食性抗菌剤 (12) 幼虫の体液が体表傷害後0〜10日経過後の
ものである、(9)ないし(11)のいずれか1に記載
の可食性抗菌剤を提供するものである。
(9) The N-terminal amino acid sequence of H 2 N-Val-Pro-Val-Gly-Ser-Asp, which is induced in the body fluid of the larva of an insect larva belonging to the order Coleoptera, is induced.
-Pro-Glu-Pro-Lys-Leu-Met-Thr-Met-
Asp-Leu-Val-Pro-His-, which is an edible antibacterial agent containing an antibacterial protein having the following properties or an antibacterial protein having an immunologically common antigenicity therewith as an active ingredient (i) Approximately 7,100 to 7,300 (ii) Thermal stability (5 to 10 minutes, 100 ° C) (10) Insects belonging to the order Coleoptera are the Taiwan beetle
(Oryctes rhinoceros), the edible antibacterial agent according to (9). (11) The larva is a third-instar larva, (9) or (1).
(12) The edible antibacterial agent according to any one of (9) to (11), wherein the body fluid of the larva is 0 to 10 days after the body surface injury. To do.

【0010】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて、「免疫学的に共通抗原性を有する抗菌性蛋白」
とは、1個またはそれ以上のアミノ酸を置換または削除
した抗菌性蛋白であって、共通の抗原性を有する抗菌性
蛋白をいう。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. In the present invention, "antibacterial protein having immunological common antigenicity"
The term “antibacterial protein” in which one or more amino acids are substituted or deleted and which has a common antigenicity.

【0011】本発明で対象とする昆虫は鞘翅目に属する
昆虫である。具体的には、コガネムシ、ゴミムシダマシ
などがある。これらのうちでは、コガネムシ科のコカブ
トムシ、特にタイワンカブトムシが好ましい。
The insects targeted by the present invention are insects belonging to the order Coleoptera. Specifically, there are scarab beetles, beetles, etc. Among these, the scarab beetles of the family Scarabaeidae, particularly the Chinese beetle, are preferred.

【0012】対象昆虫は、幼虫でなければならない。こ
こで「幼虫」とは、昆虫の完全変態の過程において、孵化
後、蛹化前のものをいう。本発明で適当なものは、三令
に同調してある幼虫、特に三令に同調してあるタイワン
カブトムシ幼虫である。
[0012] The target insect must be a larva. Here, the term “larva” refers to those after hatching and before pupation in the process of complete metamorphosis of insects. Suitable in the present invention are larvae that are synchronized with the third instar, in particular larvae of the beetle that are synchronized with the third instar.

【0013】抗菌性ペプチドを誘導すべく昆虫体液に傷
害を与える操作は、結果的に感染の危険を増大させる任
意の方法が可能である。「体表」といっても体表のみを意
味するものではなく、注射針の貫通のように体内にも傷
害を与える操作をも包含することは言うまでもない。傷
害を与えるべき体表は、昆虫の体のどこであってもよい
が、通常は頭部を除く部分である。
The procedure of damaging insect body fluids to induce antimicrobial peptides can be any method that results in an increased risk of infection. It is needless to say that the term "body surface" does not mean only the body surface, but also includes an operation such as penetration of an injection needle that causes damage to the body. The body surface to be injured may be anywhere in the body of the insect, but it is usually the part excluding the head.

【0014】傷害を与えて0〜10日後、望ましくは約
1日後、体液をしぼり出し、遠心分離により体液細胞を
除き、出発材料とする。
0 to 10 days after the injury is given, preferably about 1 day after, the body fluid is squeezed out and the body fluid cells are removed by centrifugation to obtain a starting material.

【0015】本発明抗菌性蛋白の分離・精製には、一般
の蛋白類の分画と精製に常用される様々な方法が適用で
きる。本発明において、特にタイワンカブトムシ幼虫を
用いる場合、上記で得られた遠心上清を逆相クロマトグ
ラフィーで分画し、各画分について後に述べる抗菌活性
の測定法に従って有意な活性を示す画分を分取し、さら
に逆相クロマトグラフィーを繰り返し単一のピークにま
で精製できる。
For the isolation and purification of the antibacterial protein of the present invention, various methods commonly used for fractionation and purification of general proteins can be applied. In the present invention, in particular, when using the larvae of the Taiwanese beetle, the centrifugal supernatant obtained above is fractionated by reverse phase chromatography, and a fraction showing significant activity according to the method for measuring antibacterial activity described below for each fraction is obtained. It can be separated and further purified by reverse phase chromatography to obtain a single peak.

【0016】該遠心画分から本発明の単一な物質まで精
製する場合、上記以外にも様々な方法が考えられ、例え
ばイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフ
ィー、電気泳動などを適宜用いて目的を達することが可
能である。
In the case of purifying from the centrifugal fraction to the single substance of the present invention, various methods other than those described above are conceivable. For example, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, electrophoresis, etc. are appropriately used to achieve the purpose. It is possible.

【0017】このようにして得られた抗菌性物質はトリ
プシン処理によって失活することから、蛋白性物質であ
ることが明らかである。この抗菌性蛋白は、凍結乾燥を
行なうと白色粉末として得られる。
Since the antibacterial substance thus obtained is inactivated by the trypsin treatment, it is clear that it is a protein substance. This antibacterial protein is obtained as a white powder when freeze-dried.

【0018】また、本発明の抗菌性蛋白は耐熱性が良好
であるので、粗標品を加熱することによって純化して比
活性を高めることができる。すなわち、粗標品を80〜
120℃、好ましくは100℃前後で10〜60分程度
の熱処理に付すと好都合である。
Further, since the antibacterial protein of the present invention has good heat resistance, it can be purified by heating a crude sample to enhance its specific activity. That is, 80 to
It is convenient to perform heat treatment at 120 ° C., preferably around 100 ° C. for about 10 to 60 minutes.

【0019】本発明による抗菌性蛋白の抗菌活性の測定
法は、例えば、グラム陽性菌の場合は、黄色ブドウ球菌
(Staphylococcus aureus)または溶血レンサ球菌(Str
eptococcus pyogenes)を用いて、その増殖阻止率を指
標として測定できる。
The method for measuring the antibacterial activity of the antibacterial protein according to the present invention is, for example, in the case of Gram-positive bacteria, Staphylococcus aureus
(Staphylococcus aureus) or hemolytic streptococcus (Str
eptococcus pyogenes), and its growth inhibition rate can be used as an index.

【0020】本発明による抗菌性蛋白は、その抗菌性を
生かして抗菌剤として有用である。すなわち、それ単独
で、あるいは適当な液体、固体または気体の担体ないし
希釈剤と組み合わせた形態で、あるいは他の薬剤と組み
合わせた形態で、外用あるいは内用の抗菌剤として使用
することができる。
The antibacterial protein according to the present invention is useful as an antibacterial agent by taking advantage of its antibacterial property. That is, it can be used as an external or internal antibacterial agent alone or in a form of being combined with an appropriate liquid, solid or gas carrier or diluent, or in a form of being combined with another drug.

【0021】したがって、本発明の抗菌性ペプチドは、
例えば、細菌性疾患に対する薬剤として使用することが
できる。その場合は、投与の剤型およびその投与量につ
いては、患者および疾患の種類、症状等を勘案して、本
発明による抗菌効果が認められる限り任意の選択が可能
である。
Therefore, the antibacterial peptide of the present invention is
For example, it can be used as a drug against bacterial diseases. In this case, the dosage form and the dosage of the administration can be arbitrarily selected in consideration of the type and symptoms of the patient and the disease, as long as the antibacterial effect according to the present invention is recognized.

【0022】本発明の抗菌性蛋白は蛋白質そのものであ
るので、少なくとも結果的に経口にて接種されるときに
は、その毒性はほとんどないと考えられる。したがっ
て、この抗菌性ペプチドは、ヒトおよび動物用の薬剤お
よび食品ないし飼料添加物として利用することができ
る。例えば、本発明による抗菌性蛋白は食品添加物とし
ての抗菌剤、換言すれば可食性抗菌剤として有用であ
る。
Since the antibacterial protein of the present invention is a protein itself, it is considered that its toxicity is almost negligible at least when it is orally inoculated. Therefore, this antibacterial peptide can be used as a drug for humans and animals and a food or feed additive. For example, the antibacterial protein according to the present invention is useful as an antibacterial agent as a food additive, in other words, an edible antibacterial agent.

【0023】[0023]

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、本発明はこの実施例に限定されるものではな
い。
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

【0024】1)材料および測定法 (1)出発材料 タイワンカブトムシ幼虫は、三令幼虫を用いた。体表に
傷害を与える操作は、幼虫を氷上に数分間置いて動きを
鈍くしてから皮下針を貫通させるという方法を用いた。
傷害を与えた幼虫を腐葉土の入った容器中、25℃にて
24〜48時間飼育した。その後、幼虫脚部を切断し、
腹部を押さえてしぼり出すことにより、氷上のチューブ
中に体液滴を採取した。通常1匹の幼虫から約1.5ml
の体液が得られた。得られた体液を39,000×g/5
0分間の遠心分離に付して血球成分を除き、澄明な上清
を−20℃で保存した。
1) Material and measuring method (1) Starting material As the larva of the Taiwan beetle, a third instar larva was used. For the operation of injuring the body surface, a method was used in which the larva was placed on ice for several minutes to slow down the movement, and then a hypodermic needle was penetrated.
The injured larvae were bred at 25 ° C. for 24 to 48 hours in a container containing mulch. After that, cut off the larval leg,
Body droplets were collected in a tube on ice by pressing down on the abdomen and squeezing out. Usually about 1.5 ml from one larva
Body fluid was obtained. The obtained body fluid is 39,000 × g / 5
The blood cells were removed by centrifugation for 0 minutes, and the clear supernatant was stored at -20 ° C.

【0025】(2)体液の分画 約10匹の幼虫から採取した体液(約15ml)を溶媒A
(20%アセトニトリル/0.05%トリフルオロ酢酸)
で平衡化しておいたSep−Pak C18カートリッジ(Wa
ters Associates社製)にアプライした。溶媒Aでカラ
ムを洗浄後、60%アセトニトリル/0.05%トリフ
ルオロ酢酸で抗菌活性を溶出させた。この活性画分につ
いて、アセトニトリルを除去するために、凍結乾燥を行
なった。この乾燥粉末を0.05%トリフルオロ酢酸に
溶解し、0.05%トリフルオロ酢酸で平衡化しておい
たProRPC HR5/10 C8カラム(Pharmacia社
製,5×100mm)にアプライした。0.05%トリフル
オロ酢酸でカラムを洗浄後、0%→50%アセトニトリ
ル/0.05%トリフルオロ酢酸(75分間)の条件でグ
ラジェント溶出を行なった。この段階で、抗菌活性はア
セトニトリル26〜31%画分に溶出された。この活性
画分について、アセトニトリルを除去するために、凍結
乾燥を行なった。さらに、この乾燥粉末を溶媒Aに溶解
し、溶媒Aで平衡化しておいたProRPC HR5/1
0 C8カラム(Pharmacia社製,5×100mm)にアプラ
イした。溶媒Aでカラムを洗浄後、20%→40%アセ
トニトリル/0.05%トリフルオロ酢酸(120分間)
という緩やかなグラジェント条件で溶出を行なった。こ
の段階で、抗菌活性はアセトニトリル22〜24%画分
(B画分)およびアセトニトリル24〜27%(C画分)の
二つの画分に分離された。これらの活性画分について、
アセトニトリルを除去するために、凍結乾燥を行なっ
た。本発明はC画分から抗菌性蛋白類(オリクチン)を精
製してなされたものである。
(2) Fractionation of body fluid Body fluid (about 15 ml) collected from about 10 larvae was used as solvent A.
(20% acetonitrile / 0.05% trifluoroacetic acid)
Sep-Pak C 18 cartridge (Wa
ters Associates). After washing the column with solvent A, the antibacterial activity was eluted with 60% acetonitrile / 0.05% trifluoroacetic acid. The active fraction was freeze-dried to remove acetonitrile. This dry powder was dissolved in 0.05% trifluoroacetic acid and applied to a ProRPC HR5 / 10 C 8 column (Pharmacia, 5 × 100 mm) equilibrated with 0.05% trifluoroacetic acid. After washing the column with 0.05% trifluoroacetic acid, gradient elution was carried out under the condition of 0% → 50% acetonitrile / 0.05% trifluoroacetic acid (75 minutes). At this stage, antibacterial activity was eluted in the 26-31% fraction of acetonitrile. The active fraction was freeze-dried to remove acetonitrile. Furthermore, this dry powder was dissolved in solvent A and equilibrated with solvent A to produce ProRPC HR5 / 1.
It was applied to a 0 C 8 column (Pharmacia, 5 × 100 mm). After washing the column with solvent A, 20% → 40% acetonitrile / 0.05% trifluoroacetic acid (120 minutes)
The elution was performed under mild gradient conditions. At this stage, the antibacterial activity is 22-24% of acetonitrile fraction
It was separated into two fractions (fraction B) and 24-27% acetonitrile (fraction C). For these active fractions,
Lyophilization was performed to remove the acetonitrile. The present invention was made by purifying antibacterial proteins (orectin) from the C fraction.

【0026】(3)抗菌活性の測定 黄色ブドウ球菌(Stapylococcus aureus)または溶血レ
ンサ球菌(Streptococcus pyogenes)を培養し、指数増
殖期の細胞を選択し、60mM NaCl含有の30mMリ
ン酸緩衝液(Na2HPO4/NaH2PO4,pH7.0)中に
懸濁させた(Beckman社製 DU−650分光計で
550,0.1(1.5×107細胞数/ml))。試料(50
μl)、ミューラー・ヒントン培地(40μl,Difco社製)
および細菌懸濁液(10μl)をマイクロチューブ中に混
合し、振盪しながら37℃、20時間インキュベートし
た。その後その混合物を急冷してA550を測定した。
(3) Measurement of antibacterial activity Staphylococcus aureus or Streptococcus pyogenes was cultured, cells in exponential growth phase were selected, and 30 mM phosphate buffer solution containing 60 mM NaCl (Na 2) was selected. It was suspended in HPO 4 / NaH 2 PO 4 , pH 7.0 (A 550,0.1 (1.5 × 10 7 cells / ml on a Beckman DU-650 spectrometer)). Sample (50
μl), Mueller Hinton medium (40 μl, manufactured by Difco)
And the bacterial suspension (10 μl) was mixed in a microtube and incubated at 37 ° C. for 20 hours with shaking. Thereafter, the mixture was quenched and A550 was measured.

【0027】(4)トリシン−SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動 スラブ式トリシン−SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動は、SchaggerおよびJagowの方法(Anal.Bioc
hem.、166巻、368−379頁(1987))に従っ
て行なった。蛋白試料をSDSゲル−ローディング緩衝
液(50mMTris−HCl(pH6.8),10%β−メルカ
プトエタノール,2% SDS(ドデシル硫酸ナトリウ
ム),0.1%プロモフェノール・ブルー,10%グリセ
ロール)に溶解し、100℃、5分間加熱処理後、トリ
シン−SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た。ゲルのアクリルアミド含量は16.2%であった。
電気泳動後、ゲルをフェアバンクスらの方法(Biochemi
stry、10巻、2606−2617頁(1971))によ
ってクマシブリリアントブルーR−250で染色した。
(4) Tricine-SDS-polyacrylamide gel electrophoresis Slab-type tricine-SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed by the method of Schagger and Jagow (Anal. Bioc.
hem. 166, 368-379 (1987)). Protein samples were dissolved in SDS gel-loading buffer (50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% β-mercaptoethanol, 2% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.1% promophenol blue, 10% glycerol). After heating at 100 ° C. for 5 minutes, it was subjected to tricine-SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The acrylamide content of the gel was 16.2%.
After electrophoresis, the gel was loaded with the method of Fairbanks et al. (Biochemi
stry, Vol. 10, 2606-2617 (1971)) and stained with Coomassie Brilliant Blue R-250.

【0028】2)オリクチンの精製 約10匹の幼虫から得られた約140μgのC画分は、
130mM NaCl含有の10mMリン酸緩衝液(Na2
PO4/NaH2PO4,pH6.0)に溶解し、熱沈澱性蛋
白を完全に除去するため、100℃で5分間加熱処理し
た。そして、その調製物を10分間/39,000×gの
遠心分離に付し、得られた上清を最終的に30%アセト
ニトリル/0.05%トリフルオロ酢酸が含まれるよう
に調製し、溶媒B(30%アセトニトリル/0.05%
トリフルオロ酢酸)で平衡化しておいた逆相カラム(2.
1×100mm,Pharmacia社製 μRPC C2/C1
8)にアプライした。この逆相カラムはファルマシア社
製SMARTシステムに連結させて用いた。溶媒Bでカ
ラムを洗浄後、30%→40%アセトニトリル/0.0
5%トリフルオロ酢酸(60分間)という緩やかなグラジ
ェント条件で溶出を行なった。200μlずつ分画し、
アセトニトリルを除去するために、凍結乾燥を行ない、
各々の画分について測定した。抗菌活性は、第1図に示
すように蛋白のピークに一致する単一なピークとして溶
出した。活性画分はトリシン−SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で単一蛋白バンド(分子量約7,10
0〜7,300)を与え、オリクチンと命名した。精製
されたオリクチンの電気泳動図を第2図に示す。図中、
矢印は指標蛋白(ミオグロビンI&II(14.1kD
a)、ミオグロビンI(8.2kDa)、ミオグロビンII
(6.2kDa)およびミオグロビンIII(2.5kDa))
の位置を示す。蛋白量はローリーの方法(J.Biol.C
hem.、193巻、265−275頁(1951))によ
り、スタンダードとして合成カイコ・セクロピンBを用
いて測定した。精製された本発明の生理活性蛋白オリク
チンをエドマン分解し、PTH−アミノ酸を分析したと
ころ、N末端のアミノ酸19個の配列(配列番号:1)
が決定された。
2) Purification of olivine About 140 μg of C fraction obtained from about 10 larvae
10 mM phosphate buffer containing 130 mM NaCl (Na 2 H
PO 4 / NaH 2 PO 4 , pH 6.0) and heat treatment at 100 ° C. for 5 minutes in order to completely remove the heat-precipitating protein. Then, the preparation was subjected to centrifugation for 10 minutes / 39,000 × g, and the resulting supernatant was finally prepared so as to contain 30% acetonitrile / 0.05% trifluoroacetic acid, and the solvent was added. B (30% acetonitrile / 0.05%
Reversed phase column (2.
1 x 100 mm, Pharmacia μRPC C2 / C1
8) was applied. This reversed-phase column was connected to a Pharmacia SMART system and used. After washing the column with solvent B, 30% → 40% acetonitrile / 0.0
Elution was performed under mild gradient conditions of 5% trifluoroacetic acid (60 minutes). Fraction 200 μl each,
Lyophilize to remove acetonitrile,
Each fraction was measured. The antibacterial activity was eluted as a single peak corresponding to the protein peak as shown in FIG. The active fraction was subjected to tricine-SDS-polyacrylamide gel electrophoresis to obtain a single protein band (molecular weight: about 7,10).
0-7300) was given and it was named oliching. The electropherogram of the purified olivine is shown in FIG. In the figure,
The arrow indicates the indicator protein (myoglobin I & II (14.1 kD
a), myoglobin I (8.2 kDa), myoglobin II
(6.2 kDa) and myoglobin III (2.5 kDa))
Indicates the position of. The amount of protein was determined by the method of Lowry (J. Biol. C.
hem. , 193, pp. 265-275 (1951)) using synthetic silkworm cecropin B as a standard. The purified bioactive protein of the present invention, olectin, was subjected to Edman degradation and analyzed for PTH-amino acid. As a result, a sequence of 19 amino acids at the N-terminal (SEQ ID NO: 1) was obtained.
Was decided.

【0029】3)オリクチン濃度と抗菌活性の測定 2)で精製され得られた抗菌性蛋白オリクチンを用いて
測定した。なお、1)−(3)の抗菌活性の測定において
被検液50μl中の蛋白量を0〜10μg/mlと変化させ
て測定した。その結果を第3図に示す。この結果より、
本発明の生理活性蛋白オリクチンの抗菌活性は、グラム
陽性菌および陰性菌の両方に対して強く認められた。
3) Measurement of olivine concentration and antibacterial activity It was measured using the antibacterial protein olivine obtained by purifying in 2). In the measurement of the antibacterial activity of 1)-(3), the amount of protein in 50 μl of the test liquid was changed to 0 to 10 μg / ml. FIG. 3 shows the results. From this result,
The antibacterial activity of the bioactive protein orectin of the present invention was strongly recognized against both Gram-positive bacteria and negative bacteria.

【0030】また、本発明の生理活性蛋白オリクチン
は、100℃で5〜10分間熱処理した後であっても、
もとの抗菌活性を保持していた。
Further, the physiologically active protein orectin of the present invention can be treated even after heat treatment at 100 ° C. for 5 to 10 minutes.
It retained its original antibacterial activity.

【0031】[0031]

【発明の効果】本発明による抗菌性ペプチドはそれ自体
抗菌性を有し、しかも毒性はほとんどない。したがっ
て、この性質を利用できる種々の用途が考えられるが、
特にこれらの物質を有効成分とする医薬品製剤としての
応用、あるいは食品添加物としての利用が期待できる。
とりわけ、タイワンカブトムシ幼虫より取得した抗菌性
ペプチドは、熱安定性であり、熱による加工工程を含む
用途には特に利用が期待できるものである。
INDUSTRIAL APPLICABILITY The antibacterial peptide according to the present invention has antibacterial properties by itself, and has almost no toxicity. Therefore, there are various possible applications that can utilize this property,
In particular, it can be expected to be applied as a pharmaceutical preparation containing these substances as active ingredients or used as a food additive.
In particular, the antibacterial peptide obtained from the larva of the Taiwanese beetle is thermostable and can be particularly expected to be used for applications including a processing step by heat.

【0032】[0032]

【配列表】[Sequence list]

配列番号:1 配列の長さ:19 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Val Pro Val Gly Ser Asp Pro Glu Pro Lys Leu Met Thr Met Asp Leu Val Pro 1 5 10 15 His SEQ ID NO: 1 Sequence length: 19 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence: Val Pro Val Gly Ser Asp Pro Glu Pro Lys Leu Met Thr Met Asp Leu Val Pro 1 5 10 15 His

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図1】 精製オリクチンの逆相SMART分析結果を
示す説明図である。
FIG. 1 is an explanatory diagram showing the results of reverse phase SMART analysis of purified olivine.

【図2】 オリクチンの電気泳動図を模写した図であ
る。
FIG. 2 is a copy of an electropherogram of olivine.

【図3】 本発明のオリクチンの抗菌作用を示す図であ
る。
FIG. 3 is a view showing the antibacterial action of olivine of the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07K 7/08 ZNA A61K 37/02 ADZ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical indication C07K 7/08 ZNA A61K 37/02 ADZ

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】 鞘翅目に属する昆虫の幼虫の体表傷害時
にその幼虫の体液中に誘導される、N末端アミノ酸配列
がH2N−Val−Pro−Val−Gly−Ser−Asp−Pro
−Glu−Pro−Lys−Leu−Met−Thr−Met−Asp−
Leu−Val−Pro−His−であり、下記の性質を有する
抗菌性蛋白。 (i)分子量約7,100〜7,300 (ii)熱安定性(5〜10分間、100℃)
1. A induced upon insect larvae body injuries belonging to Coleoptera the body fluid of the larvae, N-terminal amino acid sequence H 2 N-Val-Pro- Val-Gly-Ser-Asp-Pro
-Glu-Pro-Lys-Leu-Met-Thr-Met-Asp-
An antibacterial protein which is Leu-Val-Pro-His- and has the following properties. (i) Molecular weight of about 7,100 to 7,300 (ii) Thermal stability (5 to 10 minutes, 100 ° C)
【請求項2】 鞘翅目に属する昆虫がタイワンカブトム
シ(Oryctes rhinoceros)である、請求項1記載の抗菌
性蛋白。
2. The antibacterial protein according to claim 1, wherein the insect belonging to the order Coleoptera is the beetle Oryctes rhinoceros.
【請求項3】 幼虫が三令幼虫である、請求項1または
2に記載の抗菌性蛋白。
3. The antibacterial protein according to claim 1 or 2, wherein the larva is a third-instar larva.
【請求項4】 幼虫の体液が体表傷害後0〜10日経過
後のものである、請求項1ないし3のいずれか1に記載
の抗菌性蛋白。
4. The antibacterial protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the body fluid of the larva is from 0 to 10 days after the body surface injury.
【請求項5】 鞘翅目に属する昆虫の幼虫の体表に傷害
を与え、その後得られる体液より体液細胞および脂肪体
を除去したものから、N末端アミノ酸配列がH2N−Va
l−Pro−Val−Gly−Ser−Asp−Pro−Glu−Pro
−Lys−Leu−Met−Thr−Met−Asp−Leu−Val−
Pro−His−であり、下記の性質を有する抗菌性蛋白を
取得することを特徴とする、抗菌性蛋白の製造法。 (i)分子量約7,100〜7,300 (ii)熱安定性(5〜10分間、100℃)
5. The body surface of an insect larva belonging to the order Coleoptera is injured, and body fluids and fat pads are removed from the body fluid obtained thereafter, and the N-terminal amino acid sequence is H 2 N-Va.
l-Pro-Val-Gly-Ser-Asp-Pro-Glu-Pro
-Lys-Leu-Met-Thr-Met-Asp-Leu-Val-
A method for producing an antibacterial protein, characterized in that the antibacterial protein is Pro-His- and has the following properties. (i) Molecular weight of about 7,100 to 7,300 (ii) Thermal stability (5 to 10 minutes, 100 ° C)
【請求項6】 鞘翅目に属する昆虫がタイワンカブトム
シ(Oryctes rhinoceros)である、請求項5記載の製造
法。
6. The method according to claim 5, wherein the insect belonging to the order Coleoptera is the beetle Oryctes rhinoceros.
【請求項7】 幼虫が三令幼虫である、請求項5または
6に記載の製造法。
7. The production method according to claim 5, wherein the larva is a third-instar larva.
【請求項8】 幼虫の体液が体表傷害後0〜10日経過
後のものである、請求項5ないし7のいずれか1に記載
の製造法。
8. The method according to claim 5, wherein the body fluid of the larva is from 0 to 10 days after the body surface injury.
【請求項9】 鞘翅目に属する昆虫の幼虫の体表傷害時
にその幼虫の体液中に誘導される、N末端アミノ酸配列
がH2N−Val−Pro−Val−Gly−Ser−Asp−Pro
−Glu−Pro−Lys−Leu−Met−Thr−Met−Asp−
Leu−Val−Pro−His−であり、下記の性質を有する
抗菌性蛋白を有効成分とする可食性抗菌剤。 (i)分子量約7,100〜7,300 (ii)熱安定性(5〜10分間、100℃)
9. induced upon insect larvae body injuries belonging to Coleoptera the body fluid of the larvae, N-terminal amino acid sequence H 2 N-Val-Pro- Val-Gly-Ser-Asp-Pro
-Glu-Pro-Lys-Leu-Met-Thr-Met-Asp-
An edible antibacterial agent which is Leu-Val-Pro-His- and which contains an antibacterial protein having the following properties as an active ingredient. (i) Molecular weight of about 7,100 to 7,300 (ii) Thermal stability (5 to 10 minutes, 100 ° C)
【請求項10】 鞘翅目に属する昆虫がタイワンカブト
ムシ(Oryctes rhinoceros)である、請求項9記載の可
食性抗菌剤。
10. The edible antibacterial agent according to claim 9, wherein the insect belonging to the order Coleoptera is the beetle Oryctes rhinoceros.
【請求項11】 幼虫が三令幼虫である、請求項9また
は10に記載の可食性抗菌剤。
11. The edible antibacterial agent according to claim 9, wherein the larva is a third-instar larva.
【請求項12】 幼虫の体液が体表傷害後0〜10日経
過後のものである、請求項9ないし11のいずれか1に
記載の可食性抗菌剤。
12. The edible antibacterial agent according to claim 9, wherein the body fluid of the larva is 0 to 10 days after the body surface injury.
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