JP2662998B2 - Proline-containing peptide - Google Patents
Proline-containing peptideInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗凝固活性を有する新規なプロリン含有ペプ
チドに関する。The present invention relates to a novel proline-containing peptide having anticoagulant activity.
従来、抗凝固薬としてはアンチトロンビンIIIと複合
体を形成し凝固因子の作用を阻害するヘパリン、あるい
はビタミンK依存性凝固因子の産生を阻害するワーファ
リンが知られている。また近年、血液凝固の最終段階で
あるフィブリンの重合を抑制するペプチドとしてフィブ
リンα鎖、N末のペプチドであるグリシルプロリルアル
ギニルバリンおよびこの誘導体のグリシジルプロリルア
ルギニルプロリンが報告されている(バイオケミストリ
ー、19巻、1013頁、1980年)。Conventionally, as anticoagulants, heparin which forms a complex with antithrombin III and inhibits the action of coagulation factors, or warfarin which inhibits the production of vitamin K-dependent coagulation factors is known. Recently, fibrin α-chain, N-terminal peptide glycylprolylarginyl valine and its derivative glycidylprolylarginylproline have been reported as peptides that inhibit the polymerization of fibrin, which is the final stage of blood coagulation. (Biochemistry, 19, 1013, 1980).
しかしながら、その作用は必ずしも満足し得るもので
はなく、更に優れた抗凝固作用を有する薬剤の開発が望
まれていた。However, the effect is not always satisfactory, and development of a drug having an even better anticoagulant effect has been desired.
斯かる実情において、本発明者らはフィブリンの重合
を抑制することによって抗凝固作用を示すペプチド化合
物について鋭意検討した結果、本発明を完成した。Under such circumstances, the present inventors have conducted intensive studies on peptide compounds that exhibit an anticoagulant effect by suppressing the polymerization of fibrin, and as a result, completed the present invention.
すなわち、本発明は、次の一般式(I)、 〔式中、Zはプロリン残基またはプロリルプロリン残基
を示し、R1およびR2は各々独立に水素原子、直鎖状もし
くは分岐状の低級アルキル基、環状アルキル基、パラニ
トロフェニル基またはアミノ基を示すか、あるいはR1と
R2が一緒になってアルキレン基または基 (ここで、R3およびR4は各々独立に水素原子、低級アル
キル基、水酸基、カルボキシル基、低級アルキルオキシ
カルボニル基、カルバモイル基または低級アルキルアミ
ノカルボニル基を示し、mおよびnは同時に0になるこ
とのない0〜5の整数を示す)を示す〕 で表わされるプロリン含有ペプチドおよびその塩を提供
するものである。That is, the present invention provides the following general formula (I): [In the formula, Z represents a proline residue or a prolylproline residue, and R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, a linear or branched lower alkyl group, a cyclic alkyl group, a paranitrophenyl group or Represents an amino group, or R 1
R 2 together form an alkylene group or group (Where R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom, a lower alkyl group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a lower alkyloxycarbonyl group, a carbamoyl group or a lower alkylaminocarbonyl group, and m and n are simultaneously 0) Which is an integer from 0 to 5).] And a salt thereof.
式(I)において、低級アルキル基としては、例えば
メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブ
チル基、イソブチル基、第二級ブチル基、第三級ブチル
基、ペンチル基、ネオペンチル基等の直鎖状又は分枝状
のものを例示することができる。また、環状アルキル基
としてはシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペ
ンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シク
ロオクチル基を例示することができる。In the formula (I), examples of the lower alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a secondary butyl group, a tertiary butyl group, a pentyl group and a neopentyl group. Linear or branched ones can be exemplified. Examples of the cyclic alkyl group include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, and a cyclooctyl group.
式(I)の化合物は遊離体であっても、また塩であっ
てもよい。式(I)のR3および/またはR4がカルボキシ
ル基の場合、これらのカルボン酸の塩としては、例えば
リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金
属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類
金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、N−メ
チルグルカミン塩、トリス−(ヒドロキシルメチル)ア
ミノメタン塩等の無機塩類、有機塩類が挙げられる。ま
たアルギニン、リジン、オルニチン等のアミノ酸の塩基
性部分を酸付加塩とすることができ、その酸付加塩とし
ては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化
水素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩類、あるいは酢酸塩、
メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエン
スルホン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸
塩、乳酸塩等の有機酸塩類を挙げることができる。The compound of the formula (I) may be in a free form or a salt. When R 3 and / or R 4 in the formula (I) is a carboxyl group, the salts of these carboxylic acids include, for example, alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt, and alkali salts such as magnesium salt and calcium salt. Inorganic salts such as earth metal salts, ammonium salts, triethylamine salts, N-methylglucamine salts, and tris- (hydroxylmethyl) aminomethane salts, and organic salts. Arginine, lysine, or a basic portion of an amino acid such as ornithine can be an acid addition salt, as the acid addition salt, hydrochloride, sulfate, nitrate, hydrobromide, hydroiodide, Inorganic salts such as phosphates, or acetates,
Organic acid salts such as methanesulfonate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, citrate, maleate, fumarate and lactate can be mentioned.
またこれらの遊離体や酸付加塩、カルボン酸の塩は水
和物として存在することもある。These free products, acid addition salts, and salts of carboxylic acids may exist as hydrates.
更に本発明のプロリン含有ペプチド(I)には光学異
性体及びラセミ体の何れもが包含される。Further, the proline-containing peptide (I) of the present invention includes both optical isomers and racemates.
本発明のプロリン含有ペプチド(I)は、公知の手段
を用いる化学的合成法によって製造することができる。
このペプチド合成には液相法、固相法の何れをも採用で
きる。The proline-containing peptide (I) of the present invention can be produced by a chemical synthesis method using a known means.
For the peptide synthesis, either a liquid phase method or a solid phase method can be adopted.
ペプチド合成におけるペプチド鎖の延長方法には、ア
ミノ酸を逐次延長してゆくステップワイズエロンゲーシ
ョン法とアミノ酸数個からなるフラグメントをあらかじ
め合成しておき、次いでフラグメントの間でカップリン
グするフラグメントコンデンセーション法とがあるが、
本発明のプロリン含有ペプチドはいずれの方法によって
も製造することができる。The peptide chain extension method in peptide synthesis includes a stepwise elongation method in which amino acids are sequentially extended and a fragment condensation method in which a fragment consisting of several amino acids is synthesized in advance and then coupled between fragments. There is,
The proline-containing peptide of the present invention can be produced by any method.
縮合方法としては、アジド法、混合酸無水物法、ジシ
クロヘキシルカルボジイミド(DCC)法、活性エステル
法、カルボジイミダゾール法、酸化還元法、ジフェニル
リン酸アジド(DPPA)法、DCC+添加物(1−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール、N−ヒドロキシサクシンイミ
ド、N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカル
ボキシイミド等)法、ウッドワード試薬Kを用いる方法
等を挙げることができる。Examples of the condensation method include an azide method, a mixed acid anhydride method, a dicyclohexylcarbodiimide (DCC) method, an active ester method, a carbodiimidazole method, a redox method, a diphenylphosphate azide (DPPA) method, and a DCC + additive (1-hydroxy Benzotriazole, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide) method, a method using Woodward reagent K, and the like.
溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが
知られているものから適宜選択されうる。たとえば、ジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメ
チルホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラ
ン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロルエタンまたは
これらの混合物が挙げられる。The solvent can be appropriately selected from those known to be usable for the peptide condensation reaction. For example, dimethylformamide, dimethylsulfoxide, hexamethylphosphoramide, dioxane, tetrahydrofuran, ethyl acetate, chloroform, dichloroethane or a mixture thereof can be mentioned.
反応温度としては、特に制限がなく広い範囲内で適宜
選択できるが、一般には−30℃〜30℃程度の温度にて反
応を行うのが好ましい。The reaction temperature is not particularly limited and can be appropriately selected within a wide range, but it is generally preferable to carry out the reaction at a temperature of about -30 ° C to 30 ° C.
本発明のプロリン含有ペプチドの製造にあたり、反応
に関与しないアミノ酸あるいはペプチドのカルボキシル
基は、一般にはエステル化することにより、すなわち、
低級のアルキルエステル(メチルエステル、エチルエス
テル、第三級ブチルエステル等)、アラルキルエステル
(ベンジルエステル、p−メトキシベンジルエステル、
p−ニトロベンジルエステル等)として保護しておくの
が好ましい。反応に関与しないアミノ基の保護基として
は、ベンジルオキシカルボニル基、p−メトキシベンジ
ルオキシカルボニル基、ホルミル基、第三級ブチルオキ
シカルボニル基、トリフルオロアセチル基等のペプチド
合成化学の分野で通常使用されている保護基が使用され
る。In producing the proline-containing peptide of the present invention, a carboxyl group of an amino acid or a peptide that does not participate in the reaction is generally esterified, that is,
Lower alkyl esters (methyl ester, ethyl ester, tertiary butyl ester, etc.), aralkyl esters (benzyl ester, p-methoxybenzyl ester,
(p-nitrobenzyl ester, etc.). As a protecting group for an amino group not involved in the reaction, a benzyloxycarbonyl group, a p-methoxybenzyloxycarbonyl group, a formyl group, a tertiary butyloxycarbonyl group, a trifluoroacetyl group and the like are usually used in the field of peptide synthetic chemistry. The protecting groups used are used.
更に、側鎖に官能基を有するアミノ酸のうち、アルギ
ニンのグアニジノ基の保護基としては、例えば、ニトロ
基、トシル基、p−メトキシベンゼンスルホニル基、メ
シチレン−2−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニ
ル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチル
オキシカルボニル基等が使用される。Further, among the amino acids having a functional group in the side chain, as a protecting group for the guanidino group of arginine, for example, nitro group, tosyl group, p-methoxybenzenesulfonyl group, mesitylene-2-sulfonyl group, benzyloxycarbonyl group, An isobornyloxycarbonyl group, an adamantyloxycarbonyl group and the like are used.
保護基を有するアミノ酸、ペプチドフラグメント、さ
らに保護基を有するプロリン含有ペプチドの脱保護は、
通常、この分野で使用されている方法、すなわち、パラ
ジウム黒、パラジウム炭素、白金等を触媒とする接触還
元法、液安ナトリウム法、トリフルオロ酢酸法、臭化水
素法、塩化水素法、フッ化水素法、酢酸法、ギ酸法、メ
タンスルホン酸法、トリフルオロメタンスルホン酸法等
により行われる。尚、酸を用いる方法においては、アニ
ソール、チオアニソール等のカチオン捕捉剤の添加が有
効である。Deprotection of a protective group-containing amino acid, a peptide fragment, and a proline-containing peptide having a protective group,
Usually, methods used in this field include a catalytic reduction method using palladium black, palladium carbon, platinum or the like as a catalyst, a liquid sodium method, a trifluoroacetic acid method, a hydrogen bromide method, a hydrogen chloride method, and a fluoride method. It is performed by a hydrogen method, an acetic acid method, a formic acid method, a methanesulfonic acid method, a trifluoromethanesulfonic acid method, or the like. In the method using an acid, it is effective to add a cation scavenger such as anisole or thioanisole.
保護基を有するアミノ酸、ペプチドフラグメント、保
護基を有するプロリン含有ペプチド、さらに目的物のプ
ロリン含有ペプチドは、ペプチドを分離するのに通常、
採用されている手段、例えば、抽出、再沈殿、シリカゲ
ルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、向流分配、ゲルクロマトグラフィー等により容易に
単離精製される。Amino acids having a protecting group, peptide fragments, proline-containing peptides having a protecting group, and further a proline-containing peptide of interest are usually used to separate peptides.
It is easily isolated and purified by the means employed, for example, extraction, reprecipitation, silica gel chromatography, ion exchange chromatography, countercurrent distribution, gel chromatography and the like.
本発明の式(I)のプロリン含有ペプチドは従来の抗
凝固薬とは異なる新規な構造および作用機作を有し、選
れた抗凝固作用を有する。また近年知られるフィブリン
α鎖、N末のペプチド誘導体と比較しても高活性である
ことが特徴である。以下、本発明プロリン含有ペプチド
の抗凝固作用を具体的に示す。The proline-containing peptide of formula (I) of the present invention has a novel structure and action mechanism different from conventional anticoagulants, and has a selected anticoagulant effect. It is also characterized by high activity compared to recently known fibrin α-chain and N-terminal peptide derivatives. Hereinafter, the anticoagulant effect of the proline-containing peptide of the present invention will be specifically described.
すなわち、次の方法によって、フィブリノーゲントロ
ンビン時間を測定した。検体のトリス緩衝液100μ
に、トリス緩衝液中6mg/mlの濃度で溶解したウシフィブ
リノーゲン溶液100μを加え、37℃で2分間インキュ
ベーションした。これにトリス緩衝液中2〜3Uの濃度で
溶解したウシトロンビン溶液を加え、クロッテック(三
光純薬社製)を用いて凝固時間を測定した。トロンビン
量−凝固時間の標準曲線から検体の凝固時間をトロンビ
ン量に換算し阻害率(%)を算出した。検体濃度と阻害
率(%)より50%阻害濃度(IC50)を求め、これを凝固
作用の指標とした。グリシルプロリルアルビニルプロリ
ンのIC50を1とした際の相対強度を表1に示した。That is, fibrinogen thrombin time was measured by the following method. Sample Tris buffer 100μ
Was added to 100 μl of a bovine fibrinogen solution dissolved at a concentration of 6 mg / ml in Tris buffer, followed by incubation at 37 ° C. for 2 minutes. A bovine thrombin solution dissolved at a concentration of 2 to 3 U in Tris buffer was added thereto, and the coagulation time was measured using Crottech (manufactured by Sanko Junyaku). From the standard curve of thrombin amount-clotting time, the clotting time of the sample was converted to the amount of thrombin, and the inhibition rate (%) was calculated. A 50% inhibitory concentration (IC 50 ) was determined from the sample concentration and the inhibition rate (%), and this was used as an index of the coagulation action. The relative intensity at the time of the IC 50 of glycyl prolyl Al vinyl proline and 1 are shown in Table 1.
本発明化合物は強い抗凝固作用を有することからヒト
の医薬として使用することができる。 Since the compound of the present invention has a strong anticoagulant effect, it can be used as a human medicine.
本発明化合物をヒトの医薬として使用する場合、投与
量は投与法によって異なるが、静脈内投与の場合では、
成人一日当たり10mgから、250mg、好ましくは30mgから5
0mgの範囲である。この投与量を静脈注射又は点滴静脈
注射とするのがよい。また経口投与の場合では、成人一
日当たり60mgから1g、好ましくは300mgから600mgの範囲
である。この投与量を二回から四回に分けて経口投与す
る。また上に示した一日量は場合によっては上記の量を
超えてもよい。When the compound of the present invention is used as a human medicine, the dose varies depending on the administration method, but in the case of intravenous administration,
10 mg to 250 mg, preferably 30 mg to 5 mg / day for an adult
The range is 0 mg. This dose may be intravenous or intravenous drip. In the case of oral administration, the dose is 60 mg to 1 g, preferably 300 mg to 600 mg per day for an adult. This dose is orally administered in two to four divided doses. Also, the daily doses indicated above may optionally exceed the above-mentioned amounts.
本発明化合物は凝固系の異常によって引き起される疾
病に対して有効であり、凝固系の異常によって引き起こ
される疾病を治療し、予防し、または軽減することがで
きる。The compounds of the present invention are effective against diseases caused by abnormalities in the coagulation system, and can treat, prevent or reduce diseases caused by abnormalities in the coagulation system.
凝固系の異常によって引き起こされる疾病としては、
静脈血栓症、心筋梗塞症、肺塞栓症、脳塞栓症、四肢動
脈血栓塞栓症、手術中・術後の血栓塞栓症等の血栓塞栓
症、また汎発生血管内血液凝固症候群(DIC)等であ
る。Diseases caused by abnormalities in the coagulation system include:
For thromboembolism such as venous thrombosis, myocardial infarction, pulmonary embolism, cerebral embolism, limb thromboembolism, thromboembolism during and after surgery, and pandemic intravascular coagulation syndrome (DIC) is there.
本発明化合物を含む抗凝固剤は、投与法に応じて適当
な製剤を選択し、通常用いられている各種製剤の調製法
によって調製できる。経口製剤としては、例えば錠剤、
散剤、顆粒剤、カプセル剤や、溶液剤、シロップ剤、エ
リキシル剤、油性ないし水性の懸濁液等が挙げられる。
注射剤としては、製剤中に安定剤、防腐剤、溶解補助剤
を配合することもあり、これらの補助剤を含むこともあ
る溶液を容器に収納後、凍結乾燥等によって固形製剤と
して用時調製の製剤としても良い。また一投与量を容器
に収納しても良く、また多投与量を同一の容器に収納し
ても良い。The anticoagulant containing the compound of the present invention can be prepared by selecting an appropriate preparation according to the administration method, and preparing various commonly used preparations. As oral preparations, for example, tablets,
Examples include powders, granules, capsules, solutions, syrups, elixirs, oily or aqueous suspensions, and the like.
Injectables may contain stabilizers, preservatives, and solubilizing agents in the formulation, and may contain a solution that may contain these adjuvants in a container, and then be prepared as a solid formulation by freeze-drying etc. May be prepared as a preparation. One dose may be stored in a container, or multiple doses may be stored in the same container.
固形製剤としては活性化合物とともに製剤学上許容さ
れている添加物を含み、例えば充填剤類や増量剤類、結
合剤類、崩壊剤類、溶解促進剤類、湿潤剤類、潤滑剤類
等を必要に応じて選択して混合し、製剤化することがで
きる。Solid preparations include pharmaceutically acceptable additives together with the active compound, such as fillers, extenders, binders, disintegrants, dissolution enhancers, wetting agents, lubricants and the like. They can be selected and mixed as needed to form a formulation.
液体製剤としては溶液、懸濁液、乳液剤等を挙げるこ
とができるが添加剤として懸濁化剤、乳化剤等を含むこ
ともある。Liquid preparations include solutions, suspensions, emulsions and the like, but may also contain suspending agents, emulsifiers and the like as additives.
注射製剤の一例としては、実施例1の化合物50mg、マ
ンニトール25mg、塩化ナトリウム45mgを含む凍結乾燥製
剤バイアルを注射用無菌水5mlにて復元し、この後、生
理食塩水あるいは5%デキストロース注射剤等と混合す
ればよい。As an example of an injection preparation, a lyophilized preparation vial containing 50 mg of the compound of Example 1, 25 mg of mannitol, and 45 mg of sodium chloride was reconstituted with 5 ml of sterile water for injection, and then physiological saline or 5% dextrose injection. Can be mixed.
以下に実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
以下で使用している略号は、通常のアミノ酸化学に於
て使用される略号であるが、そのうちの何例かは下に示
した通りである。The abbreviations used below are the abbreviations used in ordinary amino acid chemistry, some of which are as shown below.
Z;ベンジルオキシカルボニル基 Z(OMe);p−メトキシベンジルオキシカルボニル基 Arg(NO2);NG−ニトロアルギニン Boc;第三級ブトキシカルボニル基 Arg(Mts);NG−メシチレンスルホニルアルギニン またローム・アンド・ハース社製の樹脂、アバーライ
トIRA−400(AMBERLITE IRF−400)、ワイエムシィ社製
の高速液体クロマトグラフィ用のクロマトカラムYMC−p
ack D−ODS等を精製に使用した。Z; benzyloxycarbonyl group Z (OMe); p-methoxybenzyloxycarbonyl group Arg (NO 2 ); NG- nitroarginine Boc; tertiary butoxycarbonyl group Arg (Mts); NG -mesitylenesulfonylarginine and ROHM・ Resin manufactured by And Haas Company, ABERLITE IRF-400 (AMBERLITE IRF-400), YMC-p chromatographic column for high performance liquid chromatography manufactured by YMC
ack D-ODS and the like were used for purification.
薄層クロマトグラフィでの各Rf値は、次の溶媒を使用
したときの値である。Each Rf value in the thin layer chromatography is a value when the following solvent is used.
Rf1;n−ブタノール:酢酸:水=4:1:5の下層を展開溶媒
とした時のRf値。Rf 1 ; Rf value when the lower layer of n-butanol: acetic acid: water = 4: 1: 5 is used as a developing solvent.
Rf2;n−ブタノール:ピリジン:酢酸:水=4:1:1:2を展
開溶媒とした時のRf値 Rf3;クロロホルム:メタノール:水=8:3:1の下層を展
開溶媒とした時のRf値。Rf 2 ; Rf value using n-butanol: pyridine: acetic acid: water = 4: 1: 1: 2 as a developing solvent Rf 3 ; chloroform: methanol: water = 8: 3: 1 as a developing solvent Rf value at the time.
Rf4;ベンゼン:酢酸エチル=1:1を展開溶媒とした時のR
f値。Rf 4 ; R when benzene: ethyl acetate = 1: 1 is used as a developing solvent
f value.
Rf5;クロロホルム:酢酸:メタノール=90:2:8を展開溶
媒とした時のRf値。Rf 5 ; Rf value when chloroform: acetic acid: methanol = 90: 2: 8 is used as a developing solvent.
実施例1 H−Gly−Pro−Arg−Pro−N(C2H5)2・2HClの合成: 1) H−Pro−N(C2H5)2・AcOH Z−Pro−OH5.00gを30mlのN,N−ジメチルホルムアミ
ド(DMF)に溶かし、氷−食塩で−10℃以下に冷却後、
トリエチルアミン2.8mlとイソブチルクロロホルメイト
2.6mlを加えた。約10分後、冷却したジエチルアミン4.1
mlを加え、一夜撹拌した。溶媒を留去し、残渣を酢酸エ
チルに溶かした後、10%炭酸ナトリウム水溶液、水、5
%クエン酸水溶液、水の順序で抽出洗浄し、酢酸エチル
層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残
渣をメタノール20mlに溶かし、酢酸1ml及び、パラジウ
ム黒を加えて、室温にて1時間接触還元を行なった。触
媒を除去した後、溶媒を留去し、残渣を乾燥した。The 1) H-Pro-N ( C 2 H 5) 2 · AcOH Z-Pro-OH5.00g: Example 1 H-Gly-Pro-Arg -Pro-N (C 2 H 5) Synthesis of 2 · 2HCl After dissolving in 30 ml of N, N-dimethylformamide (DMF) and cooling to below -10 ° C with ice-salt,
2.8 ml of triethylamine and isobutyl chloroformate
2.6 ml was added. After about 10 minutes, cooled diethylamine 4.1
ml was added and stirred overnight. The solvent was distilled off, and the residue was dissolved in ethyl acetate.
The mixture was extracted and washed in the order of a% citric acid aqueous solution and water, and the ethyl acetate layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off. The residue was dissolved in methanol (20 ml), acetic acid (1 ml) and palladium black were added, and the mixture was subjected to catalytic reduction at room temperature for 1 hour. After removing the catalyst, the solvent was distilled off and the residue was dried.
収量1.43g、油状物、〔α〕D:−57.3゜(c=1.3、メタ
ノール)、Rf3:0.58 2) Z(OMe)−Arg(NO2)−Pro−N(C2H2)2 Z(OMe)−Arg(NO2)−OH2.82gをDMF20mlに溶か
し、氷−食塩で−10℃以下に冷却後、トリエチルアミン
1.0ml、1−ハイドロキシベンズトリアゾール(HOBT)
1.00g及び1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DC
C)1.50gを加えた。約10分後、5mlのDMF中、氷冷下トリ
エチルアミン0.7mlで中和したAcOH・H−Pro−N(C
2H5)20.83gを加え、一夜撹拌した。残渣を酢酸エチル
に溶かし、10%炭酸ナトリウム水溶液、水、5%クエン
酸水溶液、水の順序で抽出洗浄した後、酢酸エチル層を
無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残渣を
シリカゲルカラム(φ1.6×45cm)、溶媒(クロロホル
ム、1%メタノール/クロロホルム)で精製した。1%
メタノール/クロロホルム溶出分画の溶媒を留去し、残
渣を乾燥した。Yield: 1.43 g, oil, [α] D : -57.3 ゜ (c = 1.3, methanol), Rf 3 : 0.58 2) Z (OMe) -Arg (NO 2 ) -Pro-N (C 2 H 2 ) 2 Dissolve 2.82 g of Z (OMe) -Arg (NO 2 ) -OH in 20 ml of DMF, cool to −10 ° C. or lower with ice-brine, and add triethylamine.
1.0ml, 1-hydroxybenztriazole (HOBT)
1.00 g and 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DC
C) 1.50 g was added. About 10 minutes later, AcOH.H-Pro-N (C) neutralized with 0.7 ml of triethylamine under ice-cooling in 5 ml of DMF
2 H 5) 2 0.83g was added and stirred overnight. The residue was dissolved in ethyl acetate, extracted and washed in the order of a 10% aqueous sodium carbonate solution, water, a 5% aqueous citric acid solution and water. The ethyl acetate layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off. The residue was purified using a silica gel column (φ1.6 × 45 cm) and a solvent (chloroform, 1% methanol / chloroform). 1%
The solvent of the fraction eluted with methanol / chloroform was distilled off, and the residue was dried.
収量2.20g、amorphous、〔α〕D:−46.6゜(c=1.0、
メタノール)、Rf3:0.73 元素分析:C24H37N7O5として 計算値 C 53.82、H 6.96、N 18.31 分析値 C 53.98、H 7.11、N 17.97 3) Boc−Gly−Pru−Arg(NO2)−Pro−N(C2H5)2 Z(OMe)−Arg(NO2)−Pro−N(C2H5)21.00gにア
ニソール2.0mlを加え、氷冷下トリフルオロ酢酸(TFA)
3.0mlを加え、室温1時間撹拌し、Z(OMe)基を除去し
た。次いで氷冷下エーテルを加え、沈殿させ、ろ取し
た。Boc−Gly−Pro−OH0.51gをDMF8mlに溶かし、氷−食
塩で−10℃以下に冷却後、トリエチルアミン0.26mlとイ
ソブチルクロロホルメイト0.25mlを加え、撹拌した。約
10分後、DMF10ml中トリエチルアミン0.26mlで中和した
H−Arg(NO2)−Pro−N(C2H5)2を加え、一夜撹拌
した。溶媒を留去し、残渣をn−ブタノールに溶かした
後、10%炭酸ナトリウム水溶液、水、5%クエン酸水溶
液、水の順序で抽出洗浄し、n−ブタノール層の溶媒を
留去した。残渣にエーテルを加え、結晶化した。Yield 2.20 g, amorphous, [α] D : -46.6 ゜ (c = 1.0,
Methanol), Rf 3 : 0.73 Elemental analysis: Calculated as C 24 H 37 N 7 O 5 C 53.82, H 6.96, N 18.31 Analytical values C 53.98, H 7.11, N 17.97 3) Boc-Gly-Pru-Arg (NO 2 ) -Pro-N (C 2 H 5 ) 2 Z (OMe) -Arg (NO 2 ) -Pro-N (C 2 H 5 ) 2 1.00 g was added to anisole 2.0 ml, and trifluoroacetic acid ( TFA)
3.0 ml was added and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour to remove the Z (OMe) group. Then, ether was added thereto under ice cooling to precipitate the precipitate, which was collected by filtration. 0.51 g of Boc-Gly-Pro-OH was dissolved in 8 ml of DMF, cooled to −10 ° C. or less with ice-salt, 0.26 ml of triethylamine and 0.25 ml of isobutylchloroformate were added, and the mixture was stirred. about
After 10 minutes, H-Arg (NO 2 ) -Pro-N (C 2 H 5 ) 2 neutralized with 0.26 ml of triethylamine in 10 ml of DMF was added and stirred overnight. The solvent was distilled off, the residue was dissolved in n-butanol, and then extracted and washed in the order of 10% aqueous sodium carbonate solution, water, 5% aqueous citric acid solution and water, and the solvent of the n-butanol layer was distilled off. Ether was added to the residue for crystallization.
収量0.96g,mp118〜122℃、〔α〕D:−89.7゜(c=1.
0、メタノール)、Rf2:0.77 元素分析:C27H47N9O8・1/2H2Oとして 計算値 C 51.09、H 7.62、N 19.86 分析値 C 51.04、H 7.60、N 19.72 4) H−Gly−Pro−Arg−Pro−N(C2H5)2・2HCl Boc−Gly−Pro−Arg(NO2)−Pro−N(C2H5)20.50g
をメタノール10mlに溶かし、パラジウムを加えて、室温
18時間接触還元を行い、ニトロ基を除去した。溶媒を留
去し、残渣に氷冷下6N塩化水素/ジオキサン2.0mlを加
え、室温1時間撹拌して、Boc基を除去した。氷冷下エ
ーテルを加え、沈澱させ、冷エーテルで数回傾瀉し、乾
燥した。残渣に水を加え、凍結乾燥した。Yield 0.96 g, mp 118-122 ° C, [α] D : -89.7 ゜ (c = 1.
0, methanol), Rf 2 : 0.77 Elemental analysis: C 27 H 47 N 9 O 8 · 1 / 2H 2 O Calculated C 51.09, H 7.62, N 19.86 Analytical values C 51.04, H 7.60, N 19.72 4) H -Gly-Pro-Arg-Pro- N (C 2 H 5) 2 · 2HCl Boc-Gly-Pro-Arg (NO 2) -Pro-N (C 2 H 5) 2 0.50g
Was dissolved in methanol (10 ml), palladium was added, and the mixture was cooled to room temperature.
The catalytic reduction was performed for 18 hours to remove the nitro group. The solvent was distilled off, and 2.0 ml of 6N hydrogen chloride / dioxane was added to the residue under ice cooling, followed by stirring at room temperature for 1 hour to remove the Boc group. Ether was added under ice cooling to precipitate, decanted several times with cold ether, and dried. Water was added to the residue and lyophilized.
収量0.44g、amorphous、〔α〕D:−119.3゜(c=1.0、
H2O) 20時間酸加水分解後のアミノ酸比:Gly1.00、Pro2.05、A
rg0.98、回収率(92%) 元素分析:C22H40N8O4・2HCl・2H2Oとして 計算値 C 44.82、H 7.86、N 19.01 分析値 C 44.92、H 7.98、N 18.53 実施例2及び3 実施例1と同様にして、 を合成した。これら及びこれら合成する際の中間体の物
性は次の通りである。Yield 0.44 g, amorphous, [α] D : -119.3 ゜ (c = 1.0,
H 2 O) Amino acid ratio after 20 hours acid hydrolysis: Gly1.00, Pro2.05, A
Rg0.98, recovery rate (92%) Elemental analysis: C 22 H 40 N 8 O 4 · 2HCl · 2H 2 O Calculated C 44.82, H 7.86, N 19.01 analytical values C 44.92, H 7.98, N 18.53 Example 2 and 3 In the same manner as in Example 1, Was synthesized. The physical properties of these and the intermediates for synthesizing them are as follows.
融点:97〜98℃ 〔α〕D:−21.5゜(c=1.0、メタノール) 元素分析:C18H24N2O3として 計算値 C 68.33 H 7.65 N 8.85 分析値 C 68.25 H 7.65 N 8.70 Rf4:0.27 〔α〕D:−48.2゜(c=1.0、メタノール) 元素分析:C25H37N7O7として 計算値 C 54.83 H 6.81 N 17.91 分析値 C 54.66 H 6.70 N 17.66 Rf3:0.77 〔α〕D:−90.1゜(c=1.0、メタノール) 元素分析:C31H45N9O8として 計算値 C 55.43 H 6.75 N 18.77 分析値 C 55.19 H 6.80 N 18.48 Rf3:0.72、Rf5;0.32 〔α〕D:−144.6゜(c=1.0、水) 元素分析:C23H42N8O5・2AcOH・3H2Oとして 計算値 C 47.36 H 8.24 N 16.36 分析値 C 47.71 H 8.44 N 16.69 Rf2:0.46 酸分解によるアミノ酸比:Gly、1.00;Pro、1.04;Arg、0.
96(回収率;77%) 融点:55〜58℃ 〔α〕D:−33.0゜(c=1.0、メタノール) Rf3;0.68 融点:91〜95℃ 〔α〕D:−22.4゜(c=1.0、メタノール) 元素分析:C33H50N6O6Sとして 計算値 C 58.65 H 7.94 N 13.24 分析値 C 58.38 H 7.83 N 12.90 Rf5:0.60 融点:108〜111℃ 〔α〕D:−72.1゜(c=1.0、メタノール) 元素分析:C41H59N8O8S・1/2H2Oとして 計算値 C 59.11 H 7.26 N 13.45 分析値 C 59.07 H 7.04 N 13.24 Rf5:0.58 〔α〕D:−104.3゜(c=1.0、水) 酸分解によるアミノ酸比:Gly、1.00;Pro、1.91;Arg、1.
07(回収率;80%) ・Z−Gly−Pro−OH P.Bruckner et al.,Helv.Chim.Acta.,58,1276(197
5)に従い合成。 Melting point: 97-98 ° C [α] D : −21.5 ゜ (c = 1.0, methanol) Elemental analysis: Calculated as C 18 H 24 N 2 O 3 C 68.33 H 7.65 N 8.85 Analytical value C 68.25 H 7.65 N 8.70 Rf 4 : 0.27 [Α] D : -48.2 ゜ (c = 1.0, methanol) Elemental analysis: Calculated as C 25 H 37 N 7 O 7 C 54.83 H 6.81 N 17.91 Analytical value C 54.66 H 6.70 N 17.66 Rf 3 : 0.77 [Α] D : -90.1 ゜ (c = 1.0, methanol) Elemental analysis: Calculated as C 31 H 45 N 9 O 8 C 55.43 H 6.75 N 18.77 Analytical value C 55.19 H 6.80 N 18.48 Rf 3 : 0.72, Rf 5 ; 0.32 [Α] D: -144.6 DEG (c = 1.0, water) Elemental analysis: C 23 H 42 N 8 O 5 · 2AcOH · 3H 2 O Calculated C 47.36 H 8.24 N 16.36 analytical values C 47.71 H 8.44 N 16.69 Rf 2 : 0.46 amino acid ratio by acid degradation: Gly, 1.00; Pro, 1.04; Arg, 0.
96 (recovery rate; 77%) Melting point: 55-58 ° C [α] D : -33.0 ゜ (c = 1.0, methanol) Rf 3 ; 0.68 Melting point: 91-95 ° C [α] D : −22.4 ゜ (c = 1.0, methanol) Elemental analysis: Calculated as C 33 H 50 N 6 O 6 S C 58.65 H 7.94 N 13.24 Analytical value C 58.38 H 7.83 N 12.90 Rf 5 : 0.60 Melting point: 108-111 ° C [α] D : −72.1 ゜ (c = 1.0, methanol) Elemental analysis: Calculated as C 41 H 59 N 8 O 8 S · 1 / 2H 2 O C 59.11 H 7.26 N 13.45 Analytical value C 59.07 H 7.04 N 13.24 Rf 5 : 0.58 [Α] D : -104.3 ゜ (c = 1.0, water) Amino acid ratio by acid decomposition: Gly, 1.00; Pro, 1.91; Arg, 1.
07 (recovery rate; 80%) ・ Z-Gly-Pro-OH P.Bruckner et al., Helv. Chim. Acta., 58, 1276 (197
Synthesized according to 5).
実施例4 ・2HClの合成: 1) Z−Pro−pNA p−ニトロアニリン1.10gを乾燥ピリジン6.0mlに溶か
し、氷−食塩で−10℃以下に冷却後、三塩化リン(0.35
ml)の乾燥ピリジン(5.0ml)溶液を滴下した。約15分
後、室温に戻しZ−Pro−OH2.00gを加え、60〜70℃に加
温した。約3時間後、室温に戻し、一夜撹拌した。溶媒
を留去し、残渣を酢酸エチルに溶かし、10%炭酸ナトリ
ウム水溶液、水、5%クエン酸水溶液、水の順序で抽出
洗浄し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、
溶媒を留去した。残渣に酢酸エチルを加え、結晶化し
た。Example 4 ・ Synthesis of 2HCl: 1) 1.10 g of Z-Pro-pNA p-nitroaniline was dissolved in 6.0 ml of dry pyridine, cooled to −10 ° C. or less with ice-saline, and then mixed with phosphorus trichloride (0.35 g).
ml) of dry pyridine (5.0 ml) was added dropwise. After about 15 minutes, the temperature was returned to room temperature, 2.00 g of Z-Pro-OH was added, and the mixture was heated to 60 to 70 ° C. After about 3 hours, the mixture was returned to room temperature and stirred overnight. The solvent was distilled off, the residue was dissolved in ethyl acetate, extracted and washed with 10% aqueous sodium carbonate, water, 5% aqueous citric acid and water in this order, and the ethyl acetate layer was dried over anhydrous sodium sulfate.
The solvent was distilled off. Ethyl acetate was added to the residue for crystallization.
収量1.76g、mp167〜169℃、[α]b:−107.5゜(c=1.
0、メタノール)、Rf5:0.53 元素分析:C19H19N3O5として 計算値 C 61.78、H 5.18、N 11.38 分析値 C 61.86、H 5.19、N 11.45 2) Boc−Arg(Mts)−Pro−pNA Z−Pro−pNA1.00gに氷冷下臭化水素酢酸溶液(30
%、HBr/AcoH)3.0mlを加え、室温1時間撹拌し、Z基
を除去した。Boc−Arg(Mts)−OH1.50gをDMF10mlに溶
かし、氷−食塩で−10℃以下に冷却後、トリエチルアミ
ン0.45mlとイソブチルクロロホルメイト0.42mlを加え
た。約10分後、DMF中氷冷下トリエチルアミン0.40mlで
中和したH−Pro−pNAを加え、一夜撹拌した。残渣をシ
リカゲルカラム(φ1.5×27cm)、溶媒(クロロホル
ム、1%メタノール/クロロホルム、2%メタノール/
クロロホルム)で精製した。2%メタノール/クロロホ
ルム溶出分画の溶媒を留去し、残渣にエーテルを加え、
結晶化した。Yield 1.76 g, mp 167-169 ° C., [α] b : -107.5 ° (c = 1.
0, methanol), Rf 5 : 0.53 Elemental analysis: C 19 H 19 N 3 O 5 Calculated value C 61.78, H 5.18, N 11.38 Analysis value C 61.86, H 5.19, N 11.45 2) Boc-Arg (Mts) − Pro-pNA Z-Pro-pNA 1.00 g was added to a hydrogen bromide acetic acid solution (30
%, HBr / AcoH) and stirred at room temperature for 1 hour to remove the Z group. 1.50 g of Boc-Arg (Mts) -OH was dissolved in 10 ml of DMF, cooled to −10 ° C. or lower with ice-salt, 0.45 ml of triethylamine and 0.42 ml of isobutylchloroformate were added. After about 10 minutes, H-Pro-pNA neutralized with 0.40 ml of triethylamine in DMF under ice cooling was added, and the mixture was stirred overnight. The residue was subjected to a silica gel column (φ1.5 × 27 cm), solvent (chloroform, 1% methanol / chloroform, 2% methanol /
(Chloroform). The solvent of the fraction eluted with 2% methanol / chloroform was distilled off, and ether was added to the residue.
Crystallized.
収量1.40g、mp134〜137℃、[α]D:−72.0゜(c=1.
0、メタノール)、Rf3:0.71 3) Z−Gly−Pro−Arg(Mts)−Pro−pNA Boc−Arg(Mts)−Pro−pNA1.00gに氷冷下アニソール
0.2mlとTFA3.0mlを加え、室温1時間撹拌し、Boc基を除
去した。Z−Gly−Pro−OH0.55gをDMF8mlに溶かし、氷
−食塩で−10℃以下に冷却後、トリエチルアミン0.25ml
とイソブチルクロロホルメイト0.24mlを加えた。約10分
後、DMF中氷冷下トリエチルアミン0.21mlで中和したH
−Arg(Mts)−Pro−pNAを加え、一夜撹拌した。溶媒を
留去し、残渣を酢酸エチルに溶かし、10%炭酸ナトリウ
ム水溶液、水、5%クエン酸水溶液、水の順序で抽出洗
浄し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶
媒を留去した。残渣に酢酸エチルとエーテルを加えて、
結晶化した。Yield 1.40 g, mp 134-137 ° C., [α] D : -72.0 ゜ (c = 1.
0, methanol), Rf 3: 0.71 3) under ice-cooling anisole Z-Gly-Pro-Arg ( Mts) -Pro-pNA Boc-Arg (Mts) -Pro-pNA1.00g
0.2 ml and 3.0 ml of TFA were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour to remove the Boc group. Dissolve 0.55 g of Z-Gly-Pro-OH in 8 ml of DMF, cool to −10 ° C. or less with ice-salt, and then add 0.25 ml of triethylamine.
And 0.24 ml of isobutyl chloroformate. About 10 minutes later, H was neutralized with 0.21 ml of triethylamine in ice-cooled DMF.
-Arg (Mts) -Pro-pNA was added and stirred overnight. The solvent is distilled off, the residue is dissolved in ethyl acetate, and the extract is washed with 10% aqueous sodium carbonate solution, water, 5% aqueous citric acid solution and water in this order, and the ethyl acetate layer is dried over anhydrous sodium sulfate. did. Ethyl acetate and ether were added to the residue,
Crystallized.
収量1.05g、mp131〜134℃、[α]D:−106.3゜(c=1.
0、メタノール)、Rf3:0.67 元素分析:C41H51O10N9S・1/2H2Oとして 計算値 C 56.54、H 6.02、N 14.47 分析値 C 56.36、H 6.06、N 14.22 4) H−Gly−Pro−Arg−Pro−pNA・2HCl Z−Gly−Pro−Arg(Mts)−Pro−pNA0.50gに氷冷下
チオアニソール0.68mlとTFA9.89mlを加え溶かし、トリ
フルオロメタンスルホン酸(TFNSA)1.03mlを加え撹拌
した。氷冷下1時間、続いて室温下1時間撹拌し、脱保
護を行った。計2時間撹拌後、水−食塩で−10℃以下に
冷却したエーテル250mlを加えて沈澱させ、冷エーテル
で数回傾瀉し、乾燥した。残渣を5%酢酸水溶液に溶か
し、エーテルで洗浄し、5%酢酸層をアンバーライトIR
A−400(AMBER LITE IRA−400)で室温下20分間処理を
行い、酢酸塩とした後、凍結乾燥した。CDSカラム(YMC
−pack D−CDS−5φ20×250mm)を用いたprep.HPLCに
より精製し、凍結乾燥した。塩酸塩とするために、等モ
ルの1N HClを加えて凍結乾燥した。Yield 1.05 g, mp 131 ° -134 ° C., [α] D : -106.3 ゜ (c = 1.
0, methanol), Rf 3 : 0.67 Elemental analysis: C 41 H 51 O 10 N 9 S 1/2 H 2 O Calculated value C 56.54, H 6.02, N 14.47 Analysis value C 56.36, H 6.06, N 14.22 4) H-Gly-Pro-Arg-Pro-pNA · 2HCl Z-Gly-Pro-Arg (Mts) -Pro-pNA 0.50 g was added with thioanisole 0.68 ml and TFA 9.89 ml under ice cooling and dissolved, and trifluoromethanesulfonic acid ( (TFNSA) 1.03 ml was added and stirred. The mixture was stirred for 1 hour under ice cooling and then for 1 hour at room temperature to perform deprotection. After stirring for a total of 2 hours, 250 ml of ether cooled to −10 ° C. or less with water-salt was added to precipitate, decanted several times with cold ether, and dried. The residue was dissolved in a 5% aqueous acetic acid solution, washed with ether, and the 5% acetic acid layer was removed from Amberlite IR.
The mixture was treated with A-400 (AMBER LITE IRA-400) at room temperature for 20 minutes to obtain acetate, and then freeze-dried. CDS column (YMC
-Pack D-CDS-5 φ20 × 250 mm), and purified by prep. To make the hydrochloride, an equimolar 1N HCl was added and lyophilized.
収量0.18g、amorphous、[α]D:−152.1゜(c=1.0、
水)、24時間酸加水分解後のアミノ酸比:Gly1.20、Pro
1.99、Arg1.00、回収率(85%) 実施例5 ・2HClの合成: Boc−Pro−OH5.00gをDMF30mlに溶かし、氷−食塩で−
10℃以下に冷却後、トリエチルアミン3.5ml、HOBt6.20g
及びDCC7.20gを加えた。約10分後、氷冷下で冷却したシ
クロヘキシルアミン2.6mlを加え、一夜撹拌した。ジシ
クロヘキシル尿素(DC−Urea)を除去した後、溶媒を留
去し、残渣を酢酸エチルに溶かし、10%炭酸ナトリウム
水溶液、水の順序で抽出洗浄し、酢酸エチル層を無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残渣に酢酸エ
チルを加え、結晶化した。Yield 0.18 g, amorphous, [α] D : -152.1 ゜ (c = 1.0,
Water), amino acid ratio after acid hydrolysis for 24 hours: Gly1.20, Pro
1.99, Arg1.00, recovery rate (85%) ・ Synthesis of 2HCl: Dissolve 5.00 g of Boc-Pro-OH in 30 ml of DMF, and ice-salt-
After cooling to 10 ° C or less, triethylamine 3.5 ml, HOBt 6.20 g
And 7.20 g of DCC were added. About 10 minutes later, 2.6 ml of cyclohexylamine cooled under ice cooling was added, and the mixture was stirred overnight. After dicyclohexylurea (DC-Urea) was removed, the solvent was distilled off, the residue was dissolved in ethyl acetate, extracted and washed with 10% aqueous sodium carbonate solution and water in this order, and the ethyl acetate layer was dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was distilled off. Ethyl acetate was added to the residue for crystallization.
収量5.42g、mp142〜144℃、[α]D:−48.1゜(c=1.
0、MeOH)、 Rf5:0.72 元素分析:C16H28O3N2として 計算値 C 64.83、H 9.52、N 9.45 分析値 C 65.02、H 9.80、N 9.45 0.95gに氷冷下アニソール0.1mlとTFA2.0mlを加え、室温
1.5時間撹拌し、Boc基を除去した。次いで氷冷下エーテ
ルを加え、沈殿させ、冷エーテルで数回傾瀉し、乾燥し
た。Boc−Arg(Mts)−OH2.00gをDMF10mlに溶かし、氷
−食塩で−10℃以下に冷却後、トリエチルアミン0.67ml
とHOBt1.20gとDCC1.40gを加えた。約10分後、DMF10ml
中、氷冷下トリエチルアミン0.6mlで中和した を加え、一夜撹拌した。Yield 5.42 g, mp 142-144 ° C., [α] D : -48.1 ゜ (c = 1.
0, MeOH), Rf 5 : 0.72 Elemental analysis: C 16 H 28 O 3 N 2 Calculated C 64.83, H 9.52, N 9.45 Analytical value C 65.02, H 9.80, N 9.45 Add 0.9 ml of anisole and 2.0 ml of TFA to 0.95 g under ice-cooling.
The mixture was stirred for 1.5 hours to remove the Boc group. Then, ether was added thereto under ice-cooling to cause precipitation, decanted with cold ether several times, and dried. Dissolve 2.00 g of Boc-Arg (Mts) -OH in 10 ml of DMF, cool to −10 ° C. or less with ice-salt, and then add 0.67 ml of triethylamine.
And 1.20 g of HOBt and 1.40 g of DCC were added. After about 10 minutes, DMF10ml
Neutralized with 0.6 ml of triethylamine under ice cooling in medium Was added and stirred overnight.
DC−Ureaを除去した後、残渣を酢酸エチルに溶かし、
10%炭酸ナトリウム、水、5%クエン酸水溶液、水の順
序で抽出洗浄し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで
乾燥し、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラム(φ
1.2×19cm)、溶媒(クロロホルム,1%メタノール/ク
ロロホルム)で精製した。1%メタノール/クロロホル
ム溶出分画の溶媒を留去し、残渣にエーテルを加え、結
晶化した。After removing DC-Urea, the residue was dissolved in ethyl acetate,
The extract was washed with 10% sodium carbonate, water, 5% citric acid aqueous solution and water in this order, the ethyl acetate layer was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off. The residue is purified on a silica gel column (φ
1.2 × 19 cm) and a solvent (chloroform, 1% methanol / chloroform). The solvent of the fraction eluted with 1% methanol / chloroform was distilled off, and ether was added to the residue for crystallization.
収量1.88g、mp115〜118℃、[α]D:−30.8゜(c=1.
0、メタノール)、 Rf5:0.51 元素分析:C31H50O6N6Sとして 計算値 C 58.65、H 7.94、N 13.24 分析値 C 58.93、H 8.18、N 12.91 1.00gに氷冷下アニソール0.1mlとTFA2.0mlを加え、室温
1.5時間撹拌し、Boc基を除去した。Z−Gly−Pro−OH1.
50gをDMF10mlに溶かし、氷−食塩で−10℃以下に冷却
後、トリエチルアミン0.7mlとHOBt0.50gとDCC0.50gを加
えた。約10分後、DMF中、氷冷下0.2mlで中和したH−Ar
g(Mts)− を加え、一夜撹拌した。DC−Ureaを除去した後、溶媒を
留去し、残渣を酢酸エチルに溶かし、10%炭酸ナトリウ
ム水溶液、水、5%クエン酸水溶液、水の順序で抽出洗
浄し、酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶
媒を留去した。残渣をシリカゲルカラム(φ2.1×23c
m)、溶媒(クロロホルム,1%メタノール/クロロホル
ム)で精製した。1%メタノール/クロロホルム溶出分
画の溶媒を留去し、残渣に石油エーテルを加え、結晶化
した。Yield 1.88 g, mp 115-118 ° C., [α] D : −30.8 ° (c = 1.
0, methanol), Rf 5 : 0.51 Elemental analysis: Calculated as C 31 H 50 O 6 N 6 S Calculated C 58.65, H 7.94, N 13.24 Analytical values C 58.93, H 8.18, N 12.91 0.1 ml of anisole and 2.0 ml of TFA were added to 1.00 g under ice cooling,
The mixture was stirred for 1.5 hours to remove the Boc group. Z-Gly-Pro-OH 1.
50 g was dissolved in 10 ml of DMF, cooled to −10 ° C. or less with ice-salt, and 0.7 ml of triethylamine, 0.50 g of HOBt, and 0.50 g of DCC were added. About 10 minutes later, H-Ar neutralized with 0.2 ml of ice in DMF under ice cooling.
g (Mts) − Was added and stirred overnight. After removing DC-Urea, the solvent was distilled off, the residue was dissolved in ethyl acetate, and the extract was washed with 10% aqueous sodium carbonate solution, water, 5% aqueous citric acid solution and water in that order, and the ethyl acetate layer was dried over anhydrous sodium sulfate And the solvent was distilled off. The residue is purified on a silica gel column (φ2.1 × 23c
m) and a solvent (chloroform, 1% methanol / chloroform). The solvent of the fraction eluted with 1% methanol / chloroform was distilled off, and petroleum ether was added to the residue for crystallization.
収量0.95g、mp122〜125℃、[α]D:−76.0゜(c=1.
0、メタノール)、Rf5:0.66 元素分析:C41H58O8N8Sとして 計算値 C 59.83、H 7.10、N 13.61 分析値 C 59.79、H 7.15、N 13.47 に氷冷下チオアニソール0.86mlとTFA12.43mlを加え溶か
し、TFMSA1.29mlを加え撹拌した。氷冷下1時間、続い
て室温1時間撹拌し、脱保護を行った。計2時間撹拌
後、氷−食塩で−10℃以下に冷却したエーテル250mlを
加えて沈澱させ、冷エーテルで数回傾瀉し、乾燥した。
残渣を5%酢酸に溶かし、エーテルで洗浄し、5%酢酸
層をアンバーライトIRA−400で室温20分間処理を行い、
酢酸塩とした後、凍結乾燥した。塩酸塩とするために、
等モルの1N HClを加えて凍結乾燥した。Yield 0.95 g, mp 122-125 ° C., [α] D : -76.0 ゜ (c = 1.
0, methanol), Rf 5 : 0.66 Elemental analysis: C 41 H 58 O 8 N 8 S Calculated value C 59.83, H 7.10, N 13.61 Analysis value C 59.79, H 7.15, N 13.47 Under ice-cooling, 0.86 ml of thioanisole and 12.43 ml of TFA were added and dissolved, and 1.29 ml of TFMSA was added and stirred. The mixture was stirred for 1 hour under ice cooling and then for 1 hour at room temperature to perform deprotection. After stirring for a total of 2 hours, 250 ml of ether cooled to −10 ° C. or lower with ice-salt was added to precipitate, decanted several times with cold ether, and dried.
The residue was dissolved in 5% acetic acid, washed with ether, and the 5% acetic acid layer was treated with Amberlite IRA-400 at room temperature for 20 minutes.
After being made into acetate, it was freeze-dried. To make it a hydrochloride,
Equimolar 1N HCl was added and lyophilized.
収量0.40g、amorphous、[α]D:−105.2゜(c=1.0、
H2O) 24時間酸加水分解後のアミノ酸比:Gly1.00、Pro2.11、A
rg1.03、回収率(87.7%) 元素分析:C24H42O4N8・2HCl・2H2Oとして 計算値 C 46.82、H 7.86、N 18.20 分析値 C 46.64、H 7.56、N 17.91 実施例6及び7 実施例5として同様にして を合成した。これらを合成する際の中間体の物性は次の
通りである。Yield 0.40 g, amorphous, [α] D : -105.2 ゜ (c = 1.0,
H 2 O) Amino acid ratio after 24 hours acid hydrolysis: Gly1.00, Pro2.11, A
Rg1.03, recovery rate (87.7%) Elementary analysis: C 24 H 42 O 4 N 8 · 2HCl · 2H 2 O Calculated C 46.82, H 7.86, N 18.20 analytical values C 46.64, H 7.56, N 17.91 Example 6 and 7 As Example 5 Was synthesized. The physical properties of the intermediates for synthesizing these are as follows.
融点:148〜150℃ [α]D;−45.3゜(c=1.0、メタノール) 元素分析:C17H30N2O3として 計算値 C 65.77、H 9.74、N 9.02 分析値 C 65.71、H 9.97、N 9.10 Rf5:0.75 融点:112〜116℃ [α]D:−30.6゜(c=1.0、メタノール) 元素分析:C32H53N6O6Sとして 計算値 C 59.14、H 8.22、N 12.93 分析値 C 59.27、H 8.37、N 12.63 Rf5:0.78 融点:118〜121℃ [α]D:−71.1(c=1.0、メタノール) 元素分析:C42H60N8O8S・H2Oとして 計算値 C 59.00 H 7.31 N 13.10 分析値 C 59.26 H 7.27 N 13.09 Rf5:0.50 ・2HCl [α]D:−117.3゜(c=1.0、水) 元素分析:C25H44N8O4・2HCl・5/4H2Oとして 計算値 C 48.74 H 7.93 N 18.18 分析値 C 49.10 H 7.94 N 17.82 酸分解によるアミノ酸比:Gly、1.00;Pro、2.08;Arg、0.
94(回収率;89%) 融点:135〜138℃ [α]D:−50.1゜(c=1.0、メタノール) 元素分析:C18H32N2O3として 計算値 C 66.63 H 9.94 N 8.63 分析値 C 66.50 H 10.17 N 8.72 Rf5:0.83 融点:101〜103℃ [α]D:−30.7゜(c=1.1、メタノール) 元素分析:C33H54N6O6Sとして 計算値 C 59.74 H 8.21 N 12.68 分析値 C 59.76 H 8.51 N 12.38 Rf5:0.80 融点:113〜116℃ [α]D;−73.0゜(c=1.0、メタノール) 元素分析:C43H62N8O8Sとして 計算値 C 60.68 H 7.34 N 13.17 分析値 C 60.41 H 7.26 N 12.90 Rf3:0.67 ・2HCl [α]D:−116.1゜(c=1.0、水) 元素分析:C26H46N8O4・2HCl・7/4H2Oとして 計算値 C 48.86 H 8.12 N 17.53 分析値 C 48.86 H 7.99 N 17.53 酸分解によるアミノ酸比:Gly、1.00;Pro、2.13;Arg、1.
06(回収率;83%) 実施例10 H−Gly−Pro−Arg−Pro−Pro−NH2・2AcOHの合成: アプライドバイオシステムズ社(Applied Biosystem
s)製430A型ペプチド自動合成機(MODEL430A PEPTIDE S
YNTHESIZER)を用いた固相法で合成した。樹脂はp−メ
トキシベンツヒドリルアミン樹脂(0.61mmol/g)を使用
し、各保護アミノ酸は、Boc−Gly−OH、Boc−Pro−OH、
Boc−Arg(Tos)−OHを使用した。合成手順はすべてア
プライドバイオシステムズ社のプログラムに従った。最
終脱保護は、アニソール1mlの存在下、フッ化水素酸(H
F)10mlで、氷冷下1時間処理を行った。HFを留去し、
残渣を5%AcOHに溶かし、エーテルで洗浄し、5%AcOH
層をアンバーライトIRA−400で室温20分間処理を行って
酢酸塩とした後、凍結乾燥した。残渣をカルボキシメチ
ルセルロースを用いたイオン交換クロマトグラフィー
(φ2.0×15cm)、溶媒(水、10mM酢酸アンモニウム、2
5mM酢酸アンモニウム、50mM酢酸アンモニウム)で精製
した。25mM酢酸アンモニウム溶出分画の溶媒を留去し、
水を加えて凍結乾燥した。 Melting point: 148-150 ° C [α] D ; -45.3 ° (c = 1.0, methanol) Elemental analysis: Calculated for C 17 H 30 N 2 O 3 C 65.77, H 9.74, N 9.02 Analytical values C 65.71, H 9.97 , N 9.10 Rf 5 : 0.75 Melting point: 112-116 ° C [α] D : −30.6 ゜ (c = 1.0, methanol) Elemental analysis: Calculated as C 32 H 53 N 6 O 6 S Calculated value C 59.14, H 8.22, N 12.93 Analytical value C 59.27, H 8.37, N 12.63 Rf 5 : 0.78 Melting point: 118-121 ° C [α] D : -71.1 (c = 1.0, methanol) Elemental analysis: Calculated as C 42 H 60 N 8 O 8 S · H 2 O C 59.00 H 7.31 N 13.10 Analytical value C 59.26 H 7.27 N 13.09 Rf 5 : 0.50 ・ 2HCl [α] D : -117.3 ゜ (c = 1.0, water) Elemental analysis: Calculated as C 25 H 44 N 8 O 4 2HCl / 5 / 4H 2 O C 48.74 H 7.93 N 18.18 Analytical value C 49.10 H 7.94 N 17.82 Amino acid ratio by acidolysis: Gly, 1.00; Pro, 2.08; Arg, 0.
94 (recovery rate; 89%) Melting point: 135-138 ° C [α] D : -50.1 ゜ (c = 1.0, methanol) Elemental analysis: Calculated as C 18 H 32 N 2 O 3 C 66.63 H 9.94 N 8.63 Analytical value C 66.50 H 10.17 N 8.72 Rf 5 : 0.83 Melting point: 101-103 ° C [α] D : −30.7 ゜ (c = 1.1, methanol) Elemental analysis: Calculated as C 33 H 54 N 6 O 6 S C 59.74 H 8.21 N 12.68 Analytical value C 59.76 H 8.51 N 12.38 Rf 5 : 0.80 Melting point: 113-116 ° C [α] D ; -73.0 ゜ (c = 1.0, methanol) Elemental analysis: Calculated for C 43 H 62 N 8 O 8 S C 60.68 H 7.34 N 13.17 Analytical value C 60.41 H 7.26 N 12.90 Rf 3 : 0.67 ・ 2HCl [α] D : -116.1 ゜ (c = 1.0, water) Elemental analysis: Calculated as C 26 H 46 N 8 O 4 2HCl 7 / 4H 2 O C 48.86 H 8.12 N 17.53 Analytical value C 48.86 H 7.99 N 17.53 Amino acid ratio by acid degradation: Gly, 1.00; Pro, 2.13; Arg, 1.
06 (recovery rate: 83%) Synthesis Example 10 H-Gly-Pro-Arg -Pro-Pro-NH 2 · 2AcOH: Applied Biosystems (Applied Biosystem
s) Model 430A peptide automatic synthesizer (MODEL430A PEPTIDE S
YNTHESIZER). The resin used was p-methoxybenzhydrylamine resin (0.61 mmol / g), and each protected amino acid was Boc-Gly-OH, Boc-Pro-OH,
Boc-Arg (Tos) -OH was used. All synthetic procedures followed the Applied Biosystems program. The final deprotection was performed using hydrofluoric acid (H
F) The mixture was treated with 10 ml under ice cooling for 1 hour. HF is distilled off,
The residue was dissolved in 5% AcOH, washed with ether, and washed with 5% AcOH.
The layer was treated with Amberlite IRA-400 at room temperature for 20 minutes to obtain acetate, and then lyophilized. The residue was subjected to ion exchange chromatography using carboxymethylcellulose (φ2.0 × 15 cm), solvent (water, 10 mM ammonium acetate, 2
(5 mM ammonium acetate, 50 mM ammonium acetate). The solvent of the fraction eluted with 25 mM ammonium acetate was distilled off,
Water was added and lyophilized.
収量0.14g、amorphous、[α]D:−152.3゜(c=1.0、
水) 元素分析:C23H39O5N9・2CH3COOH・5/2H2Oとして 計算値 C 47.22、H 7.63、N 18.36 分析値 C 47.50、H 7.35、N 18.37Yield 0.14 g, amorphous, [α] D : -152.3 ゜ (c = 1.0,
Water) Elemental analysis: C 23 H 39 O 5 N 9 · 2CH 3 COOH · 5 / 2H 2 O Calculated C 47.22, H 7.63, N 18.36 analytical values C 47.50, H 7.35, N 18.37
Claims (5)
を示し、R1およびR2は各々独立に水素原子、直鎖状もし
くは分岐状の低級アルキル基、環状アルキル基、パラニ
トロフェニル基またはアミノ基を示すか、あるいはR1と
R2が一緒になってアルキレン基または基 (ここで、R3およびR4は各々独立に水素原子、低級アル
キル基、水酸基、カルボキシル基、低級アルキルオキシ
カルボニル基、カルバモイル基または低級アルキルアミ
ノカルボニル基を示し、mおよびnは同時に0になるこ
とのない0〜5の整数を示す)を示す〕 で表わされるプロリン含有ペプチドおよびその塩。1. The compound of the general formula (I) [In the formula, Z represents a proline residue or a prolylproline residue, and R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, a linear or branched lower alkyl group, a cyclic alkyl group, a paranitrophenyl group or Represents an amino group, or R 1
R 2 together form an alkylene group or group (Where R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom, a lower alkyl group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a lower alkyloxycarbonyl group, a carbamoyl group or a lower alkylaminocarbonyl group, and m and n are simultaneously 0) A proline-containing peptide and a salt thereof.
ある請求項1記載のプロリン含有ペプチドおよびその
塩。2. The proline-containing peptide according to claim 1, which is H-Gly-Pro-Arg-Pro-N (C 2 H 5 ) 2 and a salt thereof.
塩。(3) The proline-containing peptide according to claim 1, which is or a salt thereof.
塩。(4) The proline-containing peptide according to claim 1, which is or a salt thereof.
請求項1記載のプロリン含有ペプチドおよびその塩。5. H-Gly-Pro-Arg- Pro-Pro-NH 2 a proline-containing peptides and salts thereof according to claim 1, wherein.
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JP63265809A JP2662998B2 (en) | 1988-10-21 | 1988-10-21 | Proline-containing peptide |
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JP63265809A JP2662998B2 (en) | 1988-10-21 | 1988-10-21 | Proline-containing peptide |
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US20210261610A1 (en) * | 2018-06-15 | 2021-08-26 | Yokogawa Electric Corporation | Method for producing amide |
Citations (1)
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---|---|---|---|---|
US4221706A (en) | 1979-06-14 | 1980-09-09 | Abbott Laboratories | Chromogenic substrates |
-
1988
- 1988-10-21 JP JP63265809A patent/JP2662998B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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US4221706A (en) | 1979-06-14 | 1980-09-09 | Abbott Laboratories | Chromogenic substrates |
Non-Patent Citations (1)
Title |
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第26回ペプチド化学討論会講演予稿集第21頁 |
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