JP2639677B2 - DNA having lipase genetic information - Google Patents
DNA having lipase genetic informationInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はリパーゼの遺伝情報を有するDNAに関し、更
に詳細には、319個のアミノ酸配列をコードする塩基配
列を含むリパーゼの遺伝情報を有するDNA、これを有す
るベクター、これを保持する形質転換体、当該アミノ酸
配列を有するリパーゼ活性を示すポリペプチドおよび該
ポリペプチドの製造法に関する。The present invention relates to a DNA having lipase genetic information, and more specifically, a DNA having lipase genetic information containing a nucleotide sequence encoding a 319 amino acid sequence. And a vector having the same, a transformant carrying the same, a polypeptide having the lipase activity having the amino acid sequence, and a method for producing the polypeptide.
リパーゼは、トリグリセリドやジグリセリドをグリセ
リンと脂肪酸とに加水分解する反応を触媒するかまたは
その可逆的反応を触媒する酵素であり、消化薬、臨床検
査試薬、各種脂肪酸の製造またはグリセリドの改質など
広範囲な分野で利用されている。そしてリパーゼの起源
としては、動物の膵液や胃液、植物の種子、酵母、細菌
等の微生物などが知られているが、供給安定性の面から
微生物由来のリパーゼが広く用いられている。Lipase is an enzyme that catalyzes the reaction of hydrolyzing triglyceride or diglyceride into glycerin and fatty acids or catalyzes the reversible reaction.It is widely used for digestive medicines, clinical test reagents, production of various fatty acids, or modification of glycerides. Is used in various fields. As the origin of lipase, pancreatic juice and gastric juice of animals, seeds of plants, microorganisms such as yeast and bacteria are known, and lipases derived from microorganisms are widely used from the viewpoint of supply stability.
ところで臨床検査試薬や脂肪酸の製造などの反応に利
用されるリパーゼに求められる性質としては、pH、熱や
界面活性剤等に対する安定性が高いことが挙げられる。
そして、このような性質を有するリパーゼを得ることを
目的として新しい微生物の探索(特公昭46−29787号な
ど)が行なわれている。By the way, properties required for lipases used in reactions such as clinical test reagents and fatty acid production include high stability against pH, heat, surfactants and the like.
In order to obtain a lipase having such properties, a search for a new microorganism (eg, Japanese Patent Publication No. 46-29787) has been conducted.
ところで、近年の遺伝子組み換え技術の進歩に伴ない
種々の生理活性ポリペプチドをコードするDNAが数多く
報告されており、またリパーゼに関する遺伝子工学とし
てはシユードモナス属およびバチルス属に属するリパー
ゼ生産菌よりのDNA、およびそれを用いるリパーゼの製
造法(特開昭62−228279号公報)、アスペルギルス属に
属するリパーゼ生産菌よりのDNAおよびそれを用いるリ
パーゼの製造法(特開昭62−272988号公報)が報告され
ている。By the way, a number of DNAs encoding various physiologically active polypeptides have been reported with the recent advances in genetic recombination techniques, and as lipase-related genetic engineering, DNA from lipase-producing bacteria belonging to the genus Pseudomonas and Bacillus, And a method for producing lipase using the same (JP-A-62-228279), a DNA from a lipase-producing bacterium belonging to the genus Aspergillus, and a method for producing lipase using the same (JP-A-62-272988). ing.
そこで本発明者らはかかる有用なリパーゼをコードす
るDNAを遺伝子工学の手法によつて得るべく鋭意研究し
た結果、クロモバクテリウム属に属するリパーゼ生産菌
より分離したDNAを用いて組み換えDNAを作成したとこ
ろ、従来のリパーゼ活性を有するポリペプチドとは、そ
のアミノ酸配列をコードする塩基配列、およびそのアミ
ノ酸配列を著しく異にした新規なDNAおよび安定性を示
すポリペプチドが得られることを見い出し、本発明を完
成した。Thus, the present inventors have conducted intensive studies to obtain DNAs encoding such useful lipases by genetic engineering techniques, and as a result, have prepared recombinant DNAs using DNAs isolated from lipase-producing bacteria belonging to the genus Chromobacterium. However, it has been found that a polypeptide having a conventional lipase activity can be obtained as a base sequence encoding the amino acid sequence thereof, a novel DNA having a significantly different amino acid sequence, and a polypeptide exhibiting stability. Was completed.
すなわち、本発明はN末端側より第3図にて表わされ
る1番目(Ala)から319番目(Val)までのアミノ酸配
列をコードする塩基配列を含むことを特徴とするリパー
ゼの遺伝情報を有するDNA、これを有するベクター、こ
れを保持する形質転換体、当該アミノ酸配列を有するリ
パーゼ活性を示すポリペプチドおよび該ポリペプチドの
製造法を提供するものである。That is, the present invention provides a DNA having lipase genetic information, comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence from the N-terminal side to the amino acid sequence from the 1st (Ala) to the 319th (Val) shown in FIG. A vector having the same, a transformant carrying the same, a polypeptide having the amino acid sequence and exhibiting lipase activity, and a method for producing the polypeptide.
本発明のDNAは、例えば遺伝子組換え技術を利用し次
の如くして製造される。すなわちリパーゼ生産能を有す
るリパーゼ遺伝子の供与体である微生物、例えばクロモ
バクテリウム属に属するリパーゼ生産菌よりDNAを分離
精製した後、超音波、制限酵素などを用いて切断したDN
A断片と切断してリニヤーした発現ベクターとを両DNAの
平滑または接着末端部においてDNAリガーゼなどにより
結合閉環させ、斯くして得られた組換えDNAベクターを
複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカ
ーとリパーゼの活性とを指標としてクリーニングして取
得した該組換えDNAベクターを保持する微生物を培養
し、該培養菌体から該組換えDNAベクターを分離精製
し、次いで該組換えベクターからリパーゼ遺伝情報を有
する本発明DNAを採取することにより製造される。The DNA of the present invention is produced, for example, using a gene recombination technique as follows. That is, after separating and purifying DNA from a microorganism that is a donor of a lipase gene having lipase-producing ability, for example, a lipase-producing bacterium belonging to the genus Chromobacterium, ultrasonically, DN cut with a restriction enzyme or the like.
The A fragment and the linearly cut expression vector are ligated and closed with DNA ligase or the like at the blunt or cohesive ends of both DNAs, and the resulting recombinant DNA vector is transferred to a replicable host microorganism, A microorganism holding the recombinant DNA vector obtained by cleaning using the marker of the vector and the activity of the lipase as an index is cultured, the recombinant DNA vector is separated and purified from the cultured cells, and then the recombinant vector is purified from the recombinant vector. It is produced by collecting the DNA of the present invention having lipase genetic information.
リパーゼ遺伝子の供与体である微生物としては、クロ
モバクテリウム・ビスコスム・バリエタス・パラリポテ
ィカム(Chromobacterium viscosum var.paralipolitic
um)が挙げられる。Microorganisms that are donors of the lipase gene include Chromobacterium viscosum varietas paralipolitic (Chromobacterium viscosum var.paralipolitic).
um).
また、遺伝子組換え技術によりリパーゼ産生能を付与
せしめた形質転換微生物を、リパーゼ遺伝子の供与体と
して利用してもよい。In addition, a transformed microorganism to which lipase-producing ability has been imparted by a gene recombination technique may be used as a lipase gene donor.
遺伝子の供与体である微生物から由来するDNAは次の
如くにして採取される。即ち、供与微生物である上述し
た細菌のいずれかを、例えば、液体培地で約1〜3日通
気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、
次いでこれを溶菌させることによつてリパーゼ遺伝子の
含有溶菌物を調製することができる。溶菌方法として
は、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁
溶解酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼ
などの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活
性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍
結融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法との組み合
せで行つてもよい。DNA derived from a microorganism as a gene donor is collected as follows. That is, any of the above-mentioned bacteria that are donor microorganisms, for example, aerated and stirred for about 1 to 3 days in a liquid medium, and the resulting culture is collected by centrifugation,
Then, the lysate is lysed to prepare a lysate containing the lipase gene. As a lysis method, for example, treatment with a cell wall lysing enzyme such as lysozyme or β-glucanase is performed, and other enzymes such as a protease or a surfactant such as sodium lauryl sulfate are used in combination, if necessary. May be performed in combination with the lysis method described above.
このようにして得られた溶菌物からDNAを分離、精製
するには、常法に従つて、例えばフエノール抽出による
除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処
理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合
わせることにより行なう。In order to separate and purify DNA from the lysate obtained in this manner, methods such as protein removal treatment by phenol extraction, protease treatment, ribonuclease treatment, alcohol precipitation, and centrifugation are appropriately combined according to a conventional method. It does by doing.
分離精製された微生物DNAを切断する方法は、例え
ば、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことがで
きるが、得られるDNA断片とベクターDNAとの結合を容易
ならしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド
配列に作用する、例えば、EcoR I,Hind III,BamH Iなど
のII型制限酵素が適している。The method of cutting the separated and purified microbial DNA can be performed, for example, by sonication, treatment with a restriction enzyme, and the like.However, in order to facilitate the binding of the obtained DNA fragment to the vector DNA, a restriction enzyme, particularly a specific enzyme, is used. Suitable are type II restriction enzymes which act on the nucleotide sequence, such as, for example, EcoRI, HindIII, BamHI.
また、使用するベクターは、宿主微生物の細胞中で自
律的に増殖しうるフアージまたはプラスミドDNAを人工
処理して遺伝子組換えベクター用として適したものに構
築されたものが好ましい。Further, the vector to be used is preferably one constructed by artificially treating a phage or a plasmid DNA capable of autonomous growth in the cells of a host microorganism, so as to be suitable for a gene recombinant vector.
フアージとしては、例えば、エシエリヒア・コリ(Es
cherichia coli)を宿主微生物とする場合には、λgt・
λC,λgt・λB等が使用できる。Examples of phages include Escherichia coli (Es
cherichia coli) is used as the host microorganism.
λC, λgt and λB can be used.
また、プラスミドとしては、例えば、エシエリヒア・
コリを宿主微生物とする場合にはpBR322,pBR325,pACYC1
84,pUC12,pUC13,pUC18,pUC19等が使用でき、バチルス・
ズブチルス(Bacillus subtilis)を宿主微生物とする
場合にはpUB110、pC194等が使用でき、またサツカロマ
イセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)を宿
主微生物とする場合には、YRp7、pYC1、YEp13、pJDB、Y
Ip1等が使用できる。さらに、エシエリヒア・コリおよ
びサツカロマイセス・セレビシア等の二種以上の宿主微
生物の細胞中で自律的に増殖可能なシヤトルベクターを
利用することもできる。このようなベクターを、先に述
べたリパーゼ遺伝子供与体である微生物DNAの切断に使
用した制限酵素と同じ制限酵素で切断して、ベクター断
片を得ることが好ましい。Examples of plasmids include, for example, Escherichia
When E. coli is used as the host microorganism, pBR322, pBR325, pACYC1
84, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, etc. can be used.
When subtilis (Bacillus subtilis) is used as the host microorganism, pUB110, pC194 and the like can be used. When Saccharomyces cerevisiae is used as the host microorganism, YRp7, pYC1, YEp13, pJDB, Y
Ip1 etc. can be used. In addition, shuttle vectors that can autonomously propagate in cells of two or more host microorganisms such as Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae can also be used. Such a vector is preferably cleaved with the same restriction enzymes used for cutting the above-described microorganism DNA as a lipase gene donor to obtain a vector fragment.
微生物DNA断片とベクター断片とを結合させる方法
は、公知のDNAリガーゼを用いる方法であればよく、例
えば、微生物DNA断片の接着末端とベクター断片の接着
末端とのアニーリングの後、適当なDNAリガーゼの作用
により微生物DNA断片とベクター断片との組換えDNAを作
成する。必要ならば、アニーリングの後、宿主微生物に
移入して、生体内のDNAリガーゼを利用し組換えDNAを作
成することもできる。The method of binding the microbial DNA fragment to the vector fragment may be a method using a known DNA ligase.For example, after annealing the cohesive end of the microbial DNA fragment and the cohesive end of the vector fragment, a suitable DNA ligase is used. By the action, a recombinant DNA of the microorganism DNA fragment and the vector fragment is prepared. If necessary, after annealing, the DNA can be transferred to a host microorganism, and recombinant DNA can be prepared using in-vivo DNA ligase.
宿主微生物としては、組換えDNAが安定かつ自律的に
増殖可能で、且つ外来性DNAの形質が発現のできるもの
であればよく、例えば、宿主微生物がエシエリヒア・コ
リの場合、エシエリヒア・コリDH1,エシエリヒア・コリ
HB101,エシエリヒア・コリW3110,エシエリヒア・コリC6
00等が使用でき、宿主微生物がバチルス・ズブチルスの
場合、バチルス・ズブチルス207−25〔ジーン(Gene)
第34巻、第1〜8頁、1985年〕、バチルス・ズブチルス
207−21〔ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー(Jou
rnal of Biochemistory)第95巻、第87〜93頁、1984
年〕、バチルス・ズブチルスBD170〔ネーチヤー(Natur
e)第293頁、第481〜483頁、1981年〕、バチルス・ズブ
チルスM株(ATCC6051)等が使用でき、宿主微生物がサ
ツカロマイセス・セレビシアの場合、サツカロマイセス
・セレビシアAH−22〔ジーン(Gene)第39巻、第117〜1
20頁、1985年〕、サツカロマイセス・セレビシアBWG1−
7A〔モレキユラー・アンド・セルラー・バイオロジー
(Molecular&CellularBiology)第6巻、第355〜367
頁、1986年〕等が使用できる。As the host microorganism, any recombinant DNA can be stably and autonomously proliferated, as long as it can express the trait of the exogenous DNA.For example, when the host microorganism is Escherichia coli, Escherichia coli DH1, Escherichia Koli
HB101, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C6
00 and the like, and when the host microorganism is Bacillus subtilis, Bacillus subtilis 207-25 [Gene
34, pages 1-8, 1985], Bacillus subtilis
207-21 [Journal of Biochemistry (Jou
rnal of Biochemistory) Vol. 95, pp. 87-93, 1984
Years], Bacillus subtilis BD170 [Natur
e) p. 293, p. 481-483, 1981], Bacillus subtilis M strain (ATCC6051), etc., and when the host microorganism is Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae AH-22 [Gene, Gene. Volume 39, Vol. 117-1
20, 1985), Satsukaromyces cerevisiae BWG1-
7A [Molecular & Cellular Biology, Volume 6, 355-367
1986] can be used.
宿主微生物に組換えDNAを移入する方法としては、例
えば、宿主微生物がエシエリヒア属に属する微生物の場
合には、カルシウムイオンの存在下で組換えDNAの移入
を行い、宿主微生物がバチルス属に属する微生物の場合
には、コンピテントセル法またはプロトプラスト法など
を採用することができ、さらにマイクロインジエクシヨ
ン法を用いてもよく、また宿主微生物がサツカロマイセ
ス属に属する微生物の場合には、プロトプラスト法、ま
たはリチウムアセテート法等を用いてもよい。As a method for transferring the recombinant DNA to the host microorganism, for example, when the host microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia, transfer the recombinant DNA in the presence of calcium ions, the host microorganism is a microorganism belonging to the genus Bacillus In the case of, the competent cell method or the protoplast method can be adopted, and the microinjection method may be further used.If the host microorganism is a microorganism belonging to the genus Saccharomyces, the protoplast method, or A lithium acetate method or the like may be used.
宿主微生物への目的組換えDNA移入の有無についての
選択は、目的組換えDNAを保持するベクターの薬剤耐性
マーカーとリパーゼとを同時に発現し得る微生物を検索
すればよく、例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培
地で生育し、かつリパーゼを生成する微生物を選択すれ
ばよい。Selection of the presence or absence of transfer of the target recombinant DNA to the host microorganism may be performed by searching for a microorganism capable of simultaneously expressing the drug resistance marker and the lipase of the vector holding the target recombinant DNA, for example, based on the drug resistance marker. A microorganism that grows on a selection medium and produces lipase may be selected.
このようにして一度選択されたリパーゼ遺伝子を保有
する組換えDNAは、形質転換微生物から取り出し、他の
宿主微生物に移入することも容易に実施できる。また、
リパーゼ遺伝子を保持する組換えDNAから制限酵素など
により切断してリパーゼ遺伝子であるDNAを切り出し、
これと同様な方法により切断して得られるベクター断片
とを結合させて、宿主微生物に移入することも容易に実
施できる。The thus-selected recombinant DNA having the lipase gene can be easily taken out from the transformed microorganism and transferred to another host microorganism. Also,
The lipase gene is cut out of the recombinant DNA holding the lipase gene by cutting with a restriction enzyme, etc.
The vector fragment obtained by cleavage by the same method as described above can be ligated and transferred to a host microorganism.
また本質的にリパーゼ活性を有する本発明のリパーゼ
遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異
遺伝子であるリパーゼムテインにおいては、まず該人工
変異遺伝子を上述の種々なる方法の使用により増幅さ
れ、最終的には、この変異遺伝子をベクターに挿入せし
めて組換えDNAを作成し、これを宿主微生物に移入させ
ることによつて、リパーゼムテインの製造が可能であ
る。In the case of lipase mutein, which is an artificially mutated gene prepared by a genetic engineering technique from the lipase gene of the present invention having essentially lipase activity, first, the artificially mutated gene is amplified by using the various methods described above, Specifically, the lipase mutein can be produced by inserting the mutant gene into a vector to prepare a recombinant DNA and transferring it to a host microorganism.
かくして得られる本発明DNAの塩基配列は、Science21
4,1205〜1210(1981年)に示されているジデオキシ法で
解読し、決定することができる。例えばリパーゼ遺伝子
供与体としてクロモバクテリウム属に属する菌を用い、
宿主微生物としてエシエリヒア・コリを用いて得られた
プラスミド中のリパーゼ遺伝子の塩基配列は第4図の通
りである。The nucleotide sequence of the DNA of the present invention thus obtained is Science 21
4,1205-1210 (1981) and can be determined by the dideoxy method. For example, using a bacterium belonging to the genus Chromobacterium as a lipase gene donor,
The nucleotide sequence of the lipase gene in the plasmid obtained using Escherichia coli as the host microorganism is as shown in FIG.
第4図において、N末端の1位Alaを示すコドンGCGの
上流たる5′末端側は、アミノ酸をコードするコドンで
あればいずれでもよく、さらにその5′末端側にアミノ
酸をコードするコドンを1個以上有してもよいが、好ま
しくはATGまたはシグナルペプチドに対応するポリデオ
キシリボ核酸を挙げることができる。またC末端Valを
示すGTGの下流たる3′末端側は翻訳終止コドンまたは
アミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよく、
さらにその3′末端側にアミノ酸をコードするコドンを
1個以上有してもよいが、その場合にはこの複数個のコ
ドンの3′末端にさらに翻訳終止コドンを有することが
好ましい。In FIG. 4, the 5 'terminal upstream of the codon GCG representing Ala at position 1 at the N-terminus may be any codon that encodes an amino acid. It may have more than one, but preferably a polydeoxyribonucleic acid corresponding to ATG or a signal peptide. Further, the 3 ′ terminal side downstream of GTG representing C-terminal Val may be any translation termination codon or a codon encoding an amino acid,
Further, one or more codons encoding amino acids may be provided on the 3'-terminal side. In this case, it is preferable that the plurality of codons further have a translation termination codon at the 3'-terminal.
また、本発明DNAを発現させることにより生産される
ポリペプチドのアミノ酸配列は、DNAの塩基配列から予
測決定できる。なお、該ペプチドのN−末端部を構成す
る部分アミノ酸配列は、以下の如くして決定できる。す
なわち、リパーゼ産生能を有するリパーゼ遺伝子供与微
生物を栄養培地で培養して菌体内にリパーゼを産生蓄積
せしめ、培養終了後、得られた培養物を過または遠心
分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を
機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊
し、また必要に応じてEDTAおよび/または適当な界面活
性剤等を添加すれば、リパーゼが可溶化され、水溶液と
して分離採取される。この様にして得られたリパーゼの
水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安分
画、ゲル過、吸着クロマトグラフイー、イオン交換ク
ロマトグラフイーにより処理して、高純度リパーゼが得
られ、高純度リパーゼを用いて液相プロテイン シーケ
ンサー(ベツクマン社製:BECKMAN System 890ME)によ
りリパーゼであるペプチドのN末端部を構成する部分ア
ミノ酸配列が決定される。また、少なくとも、該部分ア
ミノ酸配列は、遺伝子操作によつて得られたリパーゼの
N末端部分アミノ酸配列と一致するものであることを確
認した。第4図で示す塩基配列から、上記の如くして決
定されたアミノ酸配列は第3図の通りである。第3図の
アミノ酸配列において、N末端のAlaで示される上流の
アミノ酸残基としては1個または複数個のアミノ酸より
なり、好ましくは水素原子、Metまたはシグナルペプチ
ドが挙げられる。またC末端のValで示される下流のも
のとしてはそのまま、または酸アミドであつてもよく、
また1個以上のアミノ酸残基であつてもよい。The amino acid sequence of a polypeptide produced by expressing the DNA of the present invention can be predicted and determined from the nucleotide sequence of the DNA. The partial amino acid sequence constituting the N-terminal part of the peptide can be determined as follows. That is, a lipase gene-donating microorganism having lipase-producing ability is cultured in a nutrient medium to produce and accumulate lipase in the cells.After completion of the culture, the cells are collected by means such as excess or centrifugation. Then, the cells are destroyed by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme, and if necessary, EDTA and / or a suitable surfactant are added, so that the lipase is solubilized and separated and collected as an aqueous solution. Is done. The aqueous solution of the lipase thus obtained is concentrated or treated without concentration by ammonium sulfate fractionation, gel permeation, adsorption chromatography, ion-exchange chromatography to obtain a high-purity lipase. Using a purity lipase, a partial amino acid sequence constituting the N-terminal portion of the peptide which is a lipase is determined by a liquid-phase protein sequencer (BECKMAN System 890ME). It was also confirmed that at least the partial amino acid sequence was identical to the N-terminal partial amino acid sequence of lipase obtained by genetic manipulation. The amino acid sequence determined as described above from the base sequence shown in FIG. 4 is as shown in FIG. In the amino acid sequence of FIG. 3, the upstream amino acid residue represented by Ala at the N-terminus consists of one or more amino acids, and preferably includes a hydrogen atom, Met or a signal peptide. Further, the downstream one represented by C-terminal Val may be as it is or may be an acid amide,
It may be one or more amino acid residues.
かくして得られる形質転換体は、栄養培地にて培養す
ることにより多量のリパーゼ活性を有するポリペプチド
を安定に産生する。The transformant thus obtained stably produces a polypeptide having a large amount of lipase activity when cultured in a nutrient medium.
形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養
生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常
多くの場合は、液体培養で行うか、工業的には深部通気
撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源として
は、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され
得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であれば
よく、例えばグルコース、シユークロース、ラクトー
ス、マルトース、フラクトース、糖蜜等が使用される。
窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例
えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分
解物等が使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸
塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガ
ン、亜鉛等の塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン等
が必要に応じて使用される。The culture form of the host microorganism, which is a transformant, may be selected in consideration of the nutritional and physiological properties of the host.In most cases, the culture is usually performed in liquid culture or industrially by deep aeration and stirring culture. It is advantageous to do so. As the nutrient source of the medium, those commonly used for culturing microorganisms can be widely used. The carbon source may be any assimilable carbon compound, and for example, glucose, sucrose, lactose, maltose, fructose, molasses and the like are used.
Any available nitrogen compound may be used as the nitrogen source. For example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate and the like are used. In addition, salts such as phosphate, carbonate, sulfate, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, and the like are used as necessary.
培養温度は菌が発育し、リパーゼを生産する範囲で適
宜変更し得るが、宿主微生物がエシエリヒア・コリの場
合、好ましくは20〜42℃程度であり、宿主微生物がバチ
ルス・ズブチルスの場合、好ましくは30〜37℃程度であ
り、宿主微生物がサツカロマイセス・セレビシアの場
合、好ましくは25〜35℃である。培養時間は、条件によ
つて多少異なるが、リパーゼが最高収量に達する時期を
見計らつて適当な時期に培養を終了すればよく、通常
は、宿主微生物がエシエリヒア・コリの場合12〜48時間
程度であり、宿主微生物がバチルス・ズブチルスの場合
18〜42時間程度であり、宿主微生物がサツカロマイセス
・セレビシアの場合24〜48時間程度である。培地pHは菌
が発育し、リパーゼ生産する範囲で適宜変更し得るが、
特に好ましくは、宿主微生物がエシエリヒア・コリの場
合pH6〜8程度であり、宿主微生物がバチルス・ズブチ
ルスの場合pH7程度であり、宿主微生物がサツカロマイ
セス・セレビシアの場合pH5〜7程度である。The culture temperature can be appropriately changed within the range in which the bacteria grow and produce lipase.When the host microorganism is Escherichia coli, it is preferably about 20 to 42 ° C., and when the host microorganism is Bacillus subtilis, it is preferably used. The temperature is about 30 to 37 ° C, and preferably 25 to 35 ° C when the host microorganism is Saccharomyces cerevisiae. The cultivation time varies somewhat depending on the conditions, but it is sufficient to terminate the cultivation at an appropriate time in anticipation of the time when the lipase reaches the maximum yield, and usually about 12 to 48 hours when the host microorganism is Escherichia coli. And the host microorganism is Bacillus subtilis
It is about 18 to 42 hours, and about 24 to 48 hours when the host microorganism is Saccharomyces cerevisiae. The medium pH can be appropriately changed within the range in which the bacteria grow and produce lipase,
Particularly preferably, the pH is about 6 to 8 when the host microorganism is Escherichia coli, the pH is about 7 when the host microorganism is Bacillus subtilis, and the pH is about 5 to 7 when the host microorganism is Saccharomyces cerevisiae.
培養物中のリパーゼは、菌体を含む培養液そのままを
採取し、利用することもできるが、一般には常法に従つ
て、リパーゼが培養液中に存在する場合には、濾過、遠
心分離などによりリパーゼ含有溶液と微生物菌体とを分
離した後に利用される。リパーゼが菌体内に存在する場
合には、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手
段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法
またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要
に応じてEDTA等のキレート剤および/または界面活性剤
を添加してリパーゼを可溶化し水溶液として分離採取す
る。The lipase in the culture can be used by directly collecting and using the culture solution containing the cells, but generally, if the lipase is present in the culture solution, filtration, centrifugation, etc. Is used after separating the lipase-containing solution from the microbial cells. If lipase is present in the cells, the obtained culture is collected by filtration or centrifugation, and then the cells are collected.Then, the cells are disrupted by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme. If necessary, a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant are added to solubilize the lipase and separate and collect it as an aqueous solution.
この様にして得られたリパーゼ含有溶液を、例えば、
減圧濃縮、膜濃縮、更に硫安、硫酸ナトリウム等の塩析
処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エ
タノール、アセトン等による分別沈澱法により沈澱せし
めればよい。次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜
にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去するこ
とができる。また吸着剤あるいはゲル濾過剤等によるゲ
ル濾過、吸着クロマトグラフイー,イオン交換クロマト
グラフイーにより精製し、これらの手段を用いて得られ
るリパーゼ含有溶液は減圧濃縮、凍結乾燥等の処理によ
り精製されたリパーゼを得ることができる。The lipase-containing solution thus obtained is, for example,
Concentration under reduced pressure, membrane concentration, salting-out treatment with ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or precipitation by a fractional precipitation method with a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or the like may be used. The precipitate can then be dissolved in water and dialyzed through a semi-permeable membrane to remove lower molecular weight impurities. Further, the solution was purified by gel filtration using an adsorbent or a gel filtration agent, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and the lipase-containing solution obtained using these means was purified by processes such as concentration under reduced pressure and freeze-drying. Lipase can be obtained.
斯くして得られるリパーゼの活性測定法は次の通りで
ある。The method for measuring the activity of the lipase thus obtained is as follows.
<反応液組成> 0.2Mトリス塩酸緩衝液(pH7.5) 0.2 (ml) 27.5mMジリノレオイルグリセリド(15%トリトンX−10
0) 0.05 50mM CaCl2 0.01 200mM ATP 0.005 100mM CoASH 0.005 アシルCoAシンセターゼ(50U/ml) 0.01 水 全体を0.5mlとする量 上記組成の反応液0.5mlを試験管に分取し、37℃、2
〜3分予備加温した後、酵素液50μ(10mM PIPES−Na
OH緩衝液,pH7.3,0.1%牛血清アルブミン加)を加えて37
℃、10分間反応を行い、次いで10mMN−エチルマレイミ
ド0.5mlおよび下記組成の試薬(R−2)0.5mlを加えて
37℃、5分間反応させる。次に1.5mlの0.5%ドデシル硫
酸ナトリウムを加えて反応を停止させた後に550nmの波
長にて比色定量する。1分間に1μmoleのリノール酸を
遊離する活性を1単位(1U)とする。<Reaction solution composition> 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) 0.2 (ml) 27.5 mM dilinoleoyl glyceride (15% Triton X-10
0) 0.05 50 mM CaCl 2 0.01 200 mM ATP 0.005 100 mM CoASH 0.005 Acyl CoA synthetase (50 U / ml) 0.01 Amount of water to 0.5 ml 0.5 ml of the reaction solution having the above composition is dispensed into a test tube.
After pre-warming for ~ 3 minutes, the enzyme solution 50μ (10mM PIPES-Na
OH buffer, pH 7.3, 0.1% bovine serum albumin)
The reaction was carried out at a temperature of 10 ° C. for 10 minutes.
Incubate at 37 ° C for 5 minutes. Next, the reaction is stopped by adding 1.5 ml of 0.5% sodium dodecyl sulfate, and colorimetrically determined at a wavelength of 550 nm. The activity of releasing 1 μmole of linoleic acid per minute is defined as 1 unit (1 U).
<試薬組成(R−2)> 0.2M PIPES−NaOH緩衝液(pH7.3) 0.05(ml) 0.3% 4−アミノアンチピリン 0.05 0.3% TOOS* ) 0.05 ペルオキシダーゼ(45U/ml) 0.05 アシルCoAオキシダーゼ(500U/ml) 0.02 0.2M ATP 0.01 水 0.27 *):N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプ
ロピル−メタ−トルイジン) 本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核酸、核酸関
連物質、その他に関する略号は、それらの当該分野にお
ける慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記
する。またすべてのアミノ酸はL体を示すものとする。<Reagent composition (R-2)> 0.2 M PIPES-NaOH buffer (pH 7.3) 0.05 (ml) 0.3% 4-aminoantipyrine 0.05 0.3% TOOS * ) 0.05 Peroxidase (45 U / ml) 0.05 Acyl CoA oxidase (500 U / ml) 0.02 0.2M ATP 0.01 water 0.27 *): N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl-meta-toluidine) Amino acids, peptides, nucleic acids, nucleic acid-related substances, etc. described in this specification Abbreviations for are based on their conventional abbreviations in the art, examples of which are listed below. In addition, all amino acids show L-form.
DNA:デオキシリボ核酸 RNA:リボ核酸 A:アデニン T:チミン G:グアニン C:シトシン Ala:アラニン Arg:アルギニン Asn:アスパラギン Asp:アスパラギン酸 Cys:システイン Gln:グルタミン Glu:グルタミン酸 Gly:グリシン His:ヒスチジン Ile:イソロイシン Leu:ロイシン Lys:リジン Met:メチオニン Phe:フエニルアラニン Pro:プロリン Ser:セリン Thr:スレオニン Trp:トリプトフアン Tyr:チロシン Val:バリン 〔実施例〕 以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明は
何らこれらによつて限定されるものではない。DNA: deoxyribonucleic acid RNA: ribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine Ala: alanine Arg: arginine Asn: asparagine Asp: aspartic acid Cys: cysteine Gln: glutamine Glu: glutamic acid Gly: glycine His: histidine Ile: Isoleucine Leu: Leucine Lys: Lysine Met: Methionine Phe: Phenylalanine Pro: Proline Ser: Serine Thr: Threonine Trp: Tryptophan Tyr: Tyrosine Val: Valine (Example) Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples. However, the present invention is not limited by these.
実施例1〔染色体DNAの分離〕 クロモバクテリウム・ビスコスム・バリエタス・パラ
リポリテイカム(特公昭46−29787号)の染色体DNAを次
の方法で分離した。同菌株を150mlの普通ブイヨン培地
(0.5%チオ硫酸ソーダ含有)で37℃一晩振盪培養後遠
心(3,000回転10分)により集菌した。10%サツカロー
ス、50mMトリス塩酸(pH8.0)、50mM EDTAを含んだ溶液
5mlに懸濁させ、1mlのリゾチーム溶液(10mg/ml)を加
えて37℃、15分間保温し、次いで1mlの10%SDS(ドデシ
ル硫酸ナトリウム)溶液を加えた。この懸濁液に等量の
クロロホルム−フエノール混液(1:1)を加え、撹拌混
合し、10,000rpm3分の遠心で水層と溶媒層に分け、水層
を分取した。この水層に2倍量のエタノールを静かに重
層し、ガラス棒でゆつくり撹拌しながらDNAをガラス棒
にまきつかせて分離した。これを10mlの10mMトリス塩酸
(pH8.0)、1mM EDTAを含んだ溶液(以下TEと略す)溶
解した。これを等量のクロロホルム−フエノール混液で
処理後、遠心により水層を分取し、2倍量のエタノール
を加えて上記の方法でもう一度DNAを分離し、2mlのTEで
溶解した。Example 1 [Separation of chromosomal DNA] Chromosomal DNA of Chromobacterium biscosum varietas paralipolyticum (JP-B-46-29787) was isolated by the following method. The strain was cultured with shaking overnight at 37 ° C. in 150 ml of normal broth medium (containing 0.5% sodium thiosulfate), and then collected by centrifugation (3,000 rpm, 10 minutes). Solution containing 10% sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA
The suspension was suspended in 5 ml, 1 ml of lysozyme solution (10 mg / ml) was added, the mixture was kept at 37 ° C. for 15 minutes, and then 1 ml of 10% SDS (sodium dodecyl sulfate) solution was added. An equal volume of a chloroform-phenol mixture (1: 1) was added to the suspension, mixed by stirring, separated into an aqueous layer and a solvent layer by centrifugation at 10,000 rpm for 3 minutes, and the aqueous layer was separated. The aqueous layer was gently overlaid with twice the volume of ethanol, and the DNA was sprinkled on the glass rod with gentle stirring with a glass rod to separate the DNA. This was dissolved in a solution (hereinafter abbreviated as TE) containing 10 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA. This was treated with an equal volume of a mixed solution of chloroform and phenol, the aqueous layer was separated by centrifugation, twice the amount of ethanol was added, the DNA was separated again by the above method, and dissolved with 2 ml of TE.
実施例2〔pACYC184プラスミドDNAの分離〕 pACYC184を保有するエシエリヒア・コリpM191(J.Bac
teriol134,1141(1981);ATCC37033)を1のBHI培地
(Difco社製)で振盪培養した。濁度がOD660=1.0に増
殖したとき、スペクチノマイシン(最終濃度300μg/m
l)を加え、さらに37℃で16時間以上振盪を続けた。Example 2 [Isolation of pACYC184 plasmid DNA] Escherichia coli pM191 carrying pACYC184 (J. Bac
teriol 134 , 1141 (1981); ATCC37033) was cultured with shaking in 1 BHI medium (manufactured by Difco). When the turbidity grew to OD 660 = 1.0, spectinomycin (final concentration 300 μg / m
l) was added and shaking was continued at 37 ° C. for more than 16 hours.
3,000rpm、10分間の遠心により集菌し、リゾチーム−
SDS法とセシウムクロライド−エチジウムブロマイド法
(Maniatisら:Molecular Cloning pp86〜94 Cold Sprin
g Harbor(1982))に従いプラスミドDNAを調製した。The cells were collected by centrifugation at 3,000 rpm for 10 minutes, and lysozyme was collected.
SDS method and cesium chloride-ethidium bromide method (Maniatis et al .: Molecular Cloning pp. 86-94 Cold Sprin
g Harbor (1982)).
実施例3〔リパーゼ遺伝子を有するプラスミドpLIP1の
作成〕 (i) 実施例1で調製したクロモバクテリウム・ビス
コスム・バリエタス・パラリポリテイカムの染色体DNA2
μ(約0.5μg)と10倍濃度のH緩衝液(前述Molecul
ar Cloning,pp104)1μ,Bel II(宝酒造製10unit/μ
)1μ,水6μを混合し、37℃1時間切断した。
別に調製したプラスミドpACYC184DNA約0.3μgを同様の
方法を用いてBamH Iで切断し、さらにアルカリ性フオス
フアターゼ(以下BAPと略すことがある。宝酒造製)0.6
unitを加え、65℃1時間処理した。これらの切断した2
種のDNA溶液を混合し、その1/10量の3M酢酸ナトリウム
を加え、さらに全体量と等量のクロロホルム−フエノー
ル混液で処理し、遠心分離により水層を分取した。この
水層に2倍容のエタノールを加え、遠心でDNAを沈澱さ
せたのち減圧乾燥した。水89μで溶解後、10倍濃度の
ライゲーシヨンバツフア(0.5Mトリス塩酸(pH7.6),0.
1M MgCl2,0.1Mジチオスレイトール,10mMスペルミジン,1
0mM ATP)10μとT4DNAリガーゼ1μ(宝酒造製350u
nit)を加え混合し4℃で一晩放置した。このDNA溶液を
クロロホルム−フエノール処理し、エタノール沈澱を集
め減圧乾燥した後、10μのTEで溶解した。Example 3 [Preparation of plasmid pLIP1 having lipase gene] (i) Chromosomal DNA, chromosome, biscosum, varietas, paralipolyticum prepared in Example 1
μ (about 0.5 μg) and 10 times concentration of H buffer (Molecule described above)
ar Cloning, pp104) 1μ, Bel II (Takara Shuzo 10unit / μ)
) 1μ and water 6μ were mixed and cut at 37 ° C for 1 hour.
Approximately 0.3 μg of the separately prepared plasmid pACYC184 DNA is digested with BamHI using the same method, and furthermore, alkaline phos-phatase (hereinafter abbreviated as BAP; manufactured by Takara Shuzo) 0.6
The unit was added and treated at 65 ° C. for 1 hour. These cut 2
The seed DNA solutions were mixed, 1/10 volume of 3M sodium acetate was added, and the mixture was treated with a chloroform-phenol mixed solution equivalent to the whole volume, and the aqueous layer was separated by centrifugation. Two volumes of ethanol was added to the aqueous layer, DNA was precipitated by centrifugation, and dried under reduced pressure. After dissolving in 89 μm of water, ligation buffer (0.5 M Tris-HCl (pH 7.6), 0.1% concentration) was added.
1M MgCl 2 , 0.1M dithiothreitol, 10mM spermidine, 1
0mM ATP) 10μ and T4 DNA ligase 1μ (Takara Shuzo 350u)
nit) was added, mixed, and left at 4 ° C. overnight. This DNA solution was treated with chloroform-phenol, and the ethanol precipitate was collected and dried under reduced pressure, and then dissolved with 10 µ of TE.
(ii) 100mlのBHI培地(Brain Heart Infusion,Difco
社製)で培養した対数増殖期の大腸菌DH1株〔国立遺伝
学研究所より分与を受けた、ストック番号ME8569;ATCC3
3849〕を遠心分離により集菌し(10,000rpm,2分間)40m
lの氷冷した30mM酢酸カリウム、100mM RbCl、10mM CaCl
2、50mM MnCl2および15%グリセリンを含んだ溶液(pH
5.8)で懸濁した。0℃で5分間放置後、遠心し上清を
すて、さらに4mlの10mM MOPS緩衝液(ドータイト社
製)、75mM CaCl2、10mM RbClおよび15%グリセリンを
含んだ溶液(pH6.5)で懸濁し、0℃で15分間放置して
コンピテント細胞とした。(Ii) 100 ml of BHI medium (Brain Heart Infusion, Difco
E. coli DH1 strain in the logarithmic growth phase (stock number ME8569; ATCC3
3849] by centrifugation (10,000 rpm, 2 minutes) 40m
l of ice-cold 30 mM potassium acetate, 100 mM RbCl, 10 mM CaCl
2 , a solution containing 50 mM MnCl 2 and 15% glycerin (pH
5.8). After standing at 0 ° C. for 5 minutes, the mixture was centrifuged, the supernatant was discarded, and the suspension was further suspended with a solution (pH 6.5) containing 4 ml of 10 mM MOPS buffer (manufactured by Dotite), 75 mM CaCl 2 , 10 mM RbCl, and 15% glycerin. It became turbid and left at 0 ° C. for 15 minutes to obtain competent cells.
(iii) この大腸菌懸濁液200μに(i)で調製した
DNA溶液10μを加え、30分間0℃で放置した。BHI培地
1mlを加え、37℃で90分間保温後、この100μをクロラ
ムフエニコール(25μg/ml)を含んだBHI寒天プレート
にまき、37℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形質
転換体をクロスリー寒天培地(栄研化学)のプレートに
レプリカし、37℃でさらに一晩培養した。(Iii) 200 μl of this E. coli suspension was prepared in (i)
10 μl of the DNA solution was added and left at 0 ° C. for 30 minutes. BHI medium
After adding 1 ml and keeping the mixture at 37 ° C for 90 minutes, 100 µl of this was spread on a BHI agar plate containing chloramphenicol (25 µg / ml) and cultured at 37 ° C overnight to obtain a transformant. This transformant was replicated on a plate of a Crosley agar medium (Eiken Chemical Co., Ltd.) and further cultured at 37 ° C. overnight.
約50,000コロニーの形質転換体を調べたところ、コロ
ニーが青色に変色したもの1株を得、この株をエシエリ
ヒア・コリDH1・pLIP1株と命名した。When a transformant of about 50,000 colonies was examined, one strain in which the colony turned blue was obtained, and this strain was named Escherichia coli DH1 / pLIP1 strain.
実施例4〔pLIP1のマツピングおよびリパーゼ遺伝子の
塩基配列の決定〕 実施例3で得たエシエリヒア・コリDH1・pLIP1株から
pACYC184と同様の方法でプラスミドpLIP1 DNAを調製し
た。Example 4 [Mapping of pLIP1 and determination of base sequence of lipase gene] From Escherichia coli DH1 / pLIP1 strain obtained in Example 3
Plasmid pLIP1 DNA was prepared in the same manner as for pACYC184.
pLIP1DNAについて制限酵素BamH I,Cla I,EcoR V,Sal
I,Mlu I,Pst I,Xho I(いずれも宝酒造製)による切断
地図を作成した。その結果を第1図に示す。pLIP1 DNA restriction enzymes BamH I, Cla I, EcoR V, Sal
Cut maps were prepared using I, Mlu I, Pst I, and Xho I (all manufactured by Takara Shuzo). The result is shown in FIG.
実施例5 エシエリヒア・コリDH1・pLIP1株から前記実施例2の
方法で分離したプラスミドpLIP1DNA約1.0μg(8μ
)に10倍濃度のM緩衝液(前述ManiatisらMolecular
Cloning p 104)1μとCla I(宝酒造10unit/μ)
1μを加え37℃で2時間切断した。電気泳動により約
3.2kbのDNA断片を分離し、フエノール処理エタノール沈
澱後20μのTE(10mMトリス塩酸、1mM EDTA pH8.0)に
溶解した。別に実施例2の方法で分離精製したpBR322プ
ラスミドDNA約0.2μg(1μ)に10倍濃度M緩衝液1
μ、水7μとCla I(宝酒造10unit/μ)1μを
加え、37℃2時間切断したのち、1Mトリス塩酸(pH8.
0)5μ、水80μ、アルカリ性ホスフアターゼ(宝
酒造0.5u/μ)5μを加え、65℃2時間反応させ
た。反応後等量のクロロホルム−フエノール液で3回処
理したのち、エタノール沈澱によりDNAを回収し、20μ
のTEで溶解した。以上の如く調製した2種のDNA溶液
5μずつを混合し10倍濃度ライゲーシヨン緩衝液2μ
、水7μとT4DNAリガーゼ(宝酒造175unit/μ)
1μを加え4℃1晩放置した。このDNA溶液をクロロ
ホルム−フエノール処理をしエタノール沈澱後TE10μ
に溶解し、実施例3(ii)と同様の方法で調製したエシ
エリヒア・コリDH1コンピテント細胞を形質転換した。
アンピシリン(50μg/ml)を含んだBHI寒天培地に拡
げ、37℃1晩培養後、生じたコロニーを実施例3(ii
i)と同様にクロスリー寒天培地にレプリカし、リパー
ゼ産生大腸菌を得た。これをエシエリヒア・コリDH1・p
LIP10と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第9926号(FERM P−9926)として寄託した。Example 5 Approximately 1.0 μg (8 μl) of plasmid pLIP1 DNA isolated from the Escherichia coli DH1 / pLIP1 strain by the method of Example 2 above.
) To a 10-fold concentration of M buffer (Maniatis et al.
Cloning p 104) 1μ and Cla I (Takara Shuzo 10unit / μ)
1 μm was added and the mixture was cut at 37 ° C. for 2 hours. About by electrophoresis
A 3.2 kb DNA fragment was separated, precipitated with phenol-treated ethanol, and dissolved in 20 µ of TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8.0). Separately, about 0.2 μg (1 μ) of pBR322 plasmid DNA separated and purified by the method of Example 2 was added to a 10-fold concentration of M buffer solution 1
μ, 7 μ of water and 1 μ of Cla I (Takara Shuzo 10 units / μ), cut at 37 ° C. for 2 hours, and then 1M Tris-HCl (pH 8.
0) 5 μ, 80 μ of water and 5 μ of alkaline phosphatase (Takara Shuzo 0.5 u / μ) were added and reacted at 65 ° C. for 2 hours. After the reaction, the mixture was treated three times with an equal volume of a chloroform-phenol solution, and the DNA was recovered by ethanol precipitation.
Dissolved in TE. 5 μl of each of the two DNA solutions prepared as described above was mixed, and a 10-fold concentration ligation buffer 2 μm was mixed.
, Water 7μ and T4 DNA ligase (Takara Shuzo 175unit / μ)
1 μm was added and left at 4 ° C. overnight. This DNA solution was treated with chloroform and phenol, and precipitated with ethanol.
And transformed into competent Escherichia coli DH1 cells prepared in the same manner as in Example 3 (ii).
After spreading on a BHI agar medium containing ampicillin (50 μg / ml) and culturing at 37 ° C. overnight, the resulting colonies were subjected to Example 3 (ii).
Replicate was performed on Crosley agar medium in the same manner as in i) to obtain lipase-producing Escherichia coli. This is Escherichia coli DH1 / p
It was named LIP10 and deposited with the Institute of Microbial Industry and Technology of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as Microbiological Laboratory Bacteria No. 9926 (FERM P-9926).
この菌を純粋分離後BHI培地で37℃一晩培養し、リパ
ーゼの生産性を前述のリパーゼ活性測定法により調べた
ところ、約0.01U/mlのリパーゼ活性を有していた。After pure isolation of the bacterium, the bacterium was cultured overnight at 37 ° C. in a BHI medium, and the lipase productivity was determined by the lipase activity measurement method described above. As a result, the lipase activity was about 0.01 U / ml.
この菌株の保有していたプラスミドを実施例2と同様
にして分離し、リパーゼ遺伝子を含み、プラスミドpBR3
22遺伝子を含むプラスミドをpLIP10と命名した。The plasmid contained in this strain was isolated in the same manner as in Example 2 and contained the lipase gene.
The plasmid containing the 22 genes was named pLIP10.
実施例6〔pLIP10のマツピングおよびリパーゼ遺伝子の
塩基配列の決定〕 エシエリヒア・コリDH1・pLIP10株からpACYC184と同
様の方法でpLIP10プラスミドDNAを調製した。Example 6 [Mapping of pLIP10 and Determination of Lipase Gene Nucleotide Sequence] pLIP10 plasmid DNA was prepared from Escherichia coli DH1 / pLIP10 strain in the same manner as for pACYC184.
pLIP10 DNAについて制限酵素BamH I、Cla I、Sal I、
Mlu I、Pst I、Xho I(いずれも宝酒造製)による切断
地図を作成した。その結果を第2図に示す。なお、本発
明のリパーゼ遺伝子の制限酵素地図は、特開昭60−1880
72号に報告されているクロモバクテリウム・ビスコサン
の遺伝子を含むDNAフラグメントの制限酵素地図と明ら
かに異なり(特開昭60−188072号の第7及び8図で示さ
れたHpa I、Bal IIは、本発明の遺伝子のDNAには存在し
ない)、両者は別の遺伝子である。リパーゼ遺伝子を含
んだDNAの塩基配列をM13フアージを用いたジデオキシ法
(Science 214,1205−1210(1981))を用いて決定し
た。リパーゼの構造遺伝子の塩基配列並びにアミノ酸配
列を第4図および第3図に示した。For pLIP10 DNA, restriction enzymes BamH I, Cla I, Sal I,
Cut maps were prepared using Mlu I, Pst I, and Xho I (all manufactured by Takara Shuzo). The result is shown in FIG. In addition, the restriction enzyme map of the lipase gene of the present invention is disclosed in
This is clearly different from the restriction enzyme map of the DNA fragment containing the chromobacterium biscosan gene reported in Japanese Patent No. 72 (Hpa I and Bal II shown in FIGS. 7 and 8 of JP-A-60-188072). Are not present in the DNA of the gene of the present invention). The nucleotide sequence of the DNA containing the lipase gene was determined by the dideoxy method using M13 phage (Science 214 , 1205-1210 (1981)). The nucleotide sequence and amino acid sequence of the lipase structural gene are shown in FIGS. 4 and 3.
実施例7〔リパーゼの製造〕 エシエリヒア・コリDH1・pLIP10株を20のBHI培地
(Difco社製)で37℃18時間ジヤーフアーメンター(30
用)により培養し、培養後培養物を5,000rpm、10分間
遠心して集菌した。次いでこの菌体を、生理食塩水2
で洗浄後、2の0.1Mリン酸アルブミン緩衝液(13.61g
KH2PO4,3.92g NaOH,1g牛血清アルブミン,1g NaN3,水1
,pH8.0)に懸濁し、リゾチーム1mg/ml、EDTA−2Naを2
mM、トリトンX−100を0.1%となるように加えて37℃30
分間保温し、5,000rpm10分間の遠心により上清液を分離
した。この上清液1.9についてアセトン沈澱(50%〜8
0%)を行い沈澱物を遠心(5,000rpm,30分間)により集
めた。この沈澱物を100mlのリン酸アルブミン緩衝液に
溶かし、DEAE−セフアロースCL−6Bを用いてイオン交換
クロマトグラフイーを行い活性画分を分取後脱塩し、凍
結乾燥により、粉末標品を得た。この酵素標品を前述の
リパーゼ活性測定法により測定した結果350uのリパーゼ
を得ることができた。Example 7 [Manufacture of lipase] Escherichia coli DH1 / pLIP10 strain was incubated in 20 BHI medium (manufactured by Difco) at 37 ° C. for 18 hours using a jar amenter (30 minutes).
), And the culture was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes to collect the cells. Then, the cells were added to physiological saline 2
After washing with 2, 0.1 M albumin phosphate buffer (13.61 g)
KH 2 PO 4 , 3.92 g NaOH, 1 g bovine serum albumin, 1 g NaN 3 , water 1
, pH 8.0), lysozyme 1 mg / ml, EDTA-2Na
mM and Triton X-100 at 0.1%.
The supernatant was separated by centrifugation at 5,000 rpm for 10 minutes. The supernatant 1.9 was subjected to acetone precipitation (50% to 8%).
0%) and the precipitate was collected by centrifugation (5,000 rpm, 30 minutes). The precipitate was dissolved in 100 ml of albumin phosphate buffer, subjected to ion exchange chromatography using DEAE-Sepharose CL-6B, and the active fraction was collected, desalted, and freeze-dried to obtain a powder preparation. Was. As a result of measuring this enzyme preparation by the lipase activity measurement method described above, 350 u of lipase could be obtained.
本発明によれば、安定性が高いリパーゼ活性を有する
ポリペプチドを大量に生産することができる。このよう
なリパーゼは、トリグリセリドから脂肪酸の生産、トリ
グリセリドの定量試薬などとして利用できるほか、エス
テル交換反応を利用した油脂の改質のための材料として
有用である。According to the present invention, a polypeptide having a highly stable lipase activity can be produced in large quantities. Such a lipase can be used as a reagent for producing fatty acids from triglyceride, a reagent for quantifying triglyceride, and the like, and is also useful as a material for modifying fats and oils using a transesterification reaction.
第1図はプラスミドpLIP1の制限酵素地図を示す図面で
ある。第2図はプラスミドpLIP10の制限酵素地図を示す
図面である。第3図は実施例6で得られたDNAの塩基配
列に対応するアミノ酸配列を示す図面である。第4図は
実施例6で得られたDNAの塩基配列を示す図面である。FIG. 1 is a drawing showing a restriction map of plasmid pLIP1. FIG. 2 is a drawing showing a restriction map of plasmid pLIP10. FIG. 3 is a drawing showing an amino acid sequence corresponding to the nucleotide sequence of the DNA obtained in Example 6. FIG. 4 is a drawing showing the nucleotide sequence of the DNA obtained in Example 6.
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 9/20 C12R 1:19) Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Reference number in the agency FI Technical indication (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 9/20 C12R 1:19)
Claims (7)
(Ala)から319番目(Val)までのアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を含むことを特徴とするリパーゼの遺伝
情報を有するDNA。1. A DNA having lipase genetic information, comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence from the N-terminal side to the amino acid sequence from the 1st (Ala) to the 319th (Val) shown in FIG. .
わされる957塩基である請求項第1項記載のDNA。2. The DNA according to claim 1, wherein the base sequence is 957 bases as shown in FIG. 4 from the 5 'end.
ー。[3] a vector having the DNA of [1];
である請求項第3項記載のベクター。4. The vector is a plasmid pLIP1 or pLIP10.
The vector according to claim 3, which is
載のDNAを保持することを特徴とする形質転換体。[5] a transformant, which comprises the DNA of [1], which is exogenous to a host;
ある請求項第5項記載の形質転換体。6. The transformant according to claim 5, wherein the host is a microorganism belonging to the genus Escherichia.
ヒア・コリである請求項第6項記載の形質転換体。7. The transformant according to claim 6, wherein the microorganism belonging to the genus Escherichia is Escherichia coli.
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