JP2634047B2 - ER based on alpha-tocopherol - Google Patents

ER based on alpha-tocopherol

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JP2634047B2 JP61505720A JP50572086A JP2634047B2 JP 2634047 B2 JP2634047 B2 JP 2634047B2 JP 61505720 A JP61505720 A JP 61505720A JP 50572086 A JP50572086 A JP 50572086A JP 2634047 B2 JP2634047 B2 JP 2634047B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、二重層(bilayers)を形成することのでき
るアルファートコフェロール(ビタミンE)の有機酸誘
導体の塩から構成されている小胞体内に化合物を取り込
む方法及び組成物に関するものである。有機酸の塩のよ
うな親水性部分が結合されているアルファートコフェロ
ールは、マルチラメラ(multilamellar)小胞体(vesic
les)又は小さなッユニラメラ(unilamellar)小胞体の
懸濁液を調製するのに用いられることができる。これら
の小胞体は、有機溶剤を使用し、あるいは使用せずに作
ることができ、水溶性化合物、部分的水溶性化合物及び
水不溶性化合物を取り込み、あるいはそれらと会合する
ことができる。便宜上、本発明の小胞体を単に“アルフ
ァートコフェロール小胞体”と呼ぶが、小胞体を作るに
際しては、アルファートコフェロールの有機酸の塩が常
に用いられていることを理解しなければならない。
Description: BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to a method of incorporating a compound into an endoplasmic reticulum composed of a salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol (vitamin E) capable of forming bilayers. And compositions. Alpha-tocopherol, which has a hydrophilic moiety attached to it, such as a salt of an organic acid, is known as a multilamellar endoplasmic reticulum (vesic).
les) or small unilamellar ER suspensions. These vesicles can be made with or without organic solvents and can incorporate or associate with water-soluble compounds, partially water-soluble compounds and water-insoluble compounds. For convenience, the endoplasmic reticulum of the present invention will be referred to simply as "alpha-tocopherol endoplasmic reticulum", but it should be understood that salts of alpha-tocopherol organic acids are always used in making the endoplasmic reticulum.

ここに述べられているアルファートコフェロール小胞
体は、生体内に投与することのできる生物学的に活性な
化合物又は医薬化合物を取り込むか、又はそれらの化合
物と会合するのに、特に有用である。一方、本発明の小
胞体は、試験管内で用いてもよい。例えば、ここに述べ
られているアルファートコフェロールのコハク酸ヘミエ
ステルは、2価カチオン依存定量法において、試験管内
で用いてもよい。
The alpha tocopherol vesicles described herein are particularly useful for incorporating or associating biologically active or pharmaceutical compounds that can be administered in vivo. On the other hand, the endoplasmic reticulum of the present invention may be used in a test tube. For example, the hemi-succinate of alpha-tocopherol described herein may be used in vitro in a divalent cation-dependent assay.

本発明のアルファートコフェロール小胞体は、リポソ
ームである。リポソームは、被包された水相を含む完全
閉鎖二重層膜(二分子膜bilayer membranes)である。
リポソームは、任意の種類のマルチラメラ小胞体(水層
によってそれぞれ分離された二重層膜で特徴づけられる
玉ねぎ状構造)であっても、またユニラメラ小胞体(単
一の二重層膜を有する)であってもよい。
The alpha-tocopherol vesicle of the present invention is a liposome. Liposomes are completely closed bilayer membranes containing an encapsulated aqueous phase.
Liposomes can be of any type, multilamellar vesicles (an onion-like structure characterized by a bilayer membrane separated by an aqueous layer) or unilamellar vesicles (having a single bilayer membrane). There may be.

リポソーム製造の2つのパラメーターは、小胞体の大
きさと脂質濃度の関係である:(1)一定量の脂質によ
って封入された容量として定義される捕捉容量は、全脂
質のモル当りの取り込まれたリットル単位として表わさ
れる(1mol-1)。取り込み容量は、ラメラの数及びリポ
ソームの半径に依存し、更には小胞体の脂質組成物及び
媒質のイオン性組成物によって影響を受ける。(2)被
包効率は、二重層膜によって分離された初期の水相の割
合として定義される。〔ディーマー及びアスター(Deam
er and Uster)、1983、リポソームの製造:方法及び機
構、リポソームについて、エム オストロ(M.Ostro)
編集、マーセル、デッカー、インコーポレイテッド(Ma
rcel Dekker,Inc.)、ニューヨーク、pp.27〜51〕 最初のリポソーム製造法〔バンガム等(Bangham et a
l.)ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー
(J.Mol.Biol.)13:228(1965)〕では、有機溶剤中に
リン脂質を懸濁させ、次いでその溶剤を蒸発乾固して、
反応容器上にワックス状のリン脂質を析出させた。次い
で、適当量の水相を加え、混合物を“膨潤”させ、マル
チラメラ小胞体(以下MLVと云う)から成る生成リポソ
ームを機械的手段により分散させた。生成二重層膜の構
造は、脂質の疎水性(非極性)“尾”が二重層膜の中心
に向って配向し、親水性(極性)“頭”が水相に向って
配向するようになっている。この技術は、パパハジョポ
ウロス及びミラー(Papahadjopoulos and Miller)〔バ
イオヒミカ ウント バイオフィジカ オブ アクタ
(Bioehim.Biophys.Acta.)135:624(1967)〕が述べて
いる音波処理された小さいユニラメラ小胞体(以下SUV
と云う)の開発の基礎となった。
Two parameters of liposome production are the relationship between endoplasmic reticulum size and lipid concentration: (1) The capture volume, defined as the volume entrapped by a fixed amount of lipid, is the liters incorporated per mole of total lipid. Expressed as units (1 mol -1 ). The uptake capacity depends on the number of lamellae and the radius of the liposomes and is further influenced by the lipid composition of the endoplasmic reticulum and the ionic composition of the medium. (2) Encapsulation efficiency is defined as the percentage of the initial aqueous phase separated by the bilayer membrane. [Deamer and Astor (Deam
er and Uster), 1983, Production of liposomes: methods and mechanisms, liposomes, M. Ostro
Editing, Marcel, Decker, Incorporated (Ma
rcel Dekker, Inc.), New York, pp. 27-51] First liposome production method [Bangham et al.
l.) Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.) 13: 228 (1965)] suspends phospholipids in an organic solvent, then evaporates the solvent to dryness,
A waxy phospholipid was precipitated on the reaction vessel. Then, an appropriate amount of aqueous phase was added, the mixture was "swelled" and the resulting liposomes composed of multilamellar vesicles (MLV) were dispersed by mechanical means. The structure of the resulting bilayer membrane is such that the hydrophobic (non-polar) “tail” of the lipid is oriented toward the center of the bilayer membrane and the hydrophilic (polar) “head” is oriented toward the aqueous phase. ing. This technique is based on the sonicated small unilamellar vesicles described by Papahadjopoulos and Miller (Bioehim. Biophys. Acta. 135: 624 (1967)). (Hereinafter SUV
) Became the basis of the development.

被包効率を高めようとして、リポソーム前駆物質又は
ミセル、即ち、極性頭部基が水相の方向へ向くように配
向された脂質分子の一層(一分子層monolayar)によっ
て包まれた水相を含む小胞体を形成することがまず行な
われた。リポソーム前駆物質は、被包しようとする水溶
液を、極性脂質の有機溶剤溶液に添加し、音波処理する
ことによって形成される。次いで、このリポソーム前駆
物質を、過剰の脂質の存在下で第二の水相中に乳化さ
せ、蒸発させる。生成したリポソームは、脂質二重層膜
によって被包された水相から成り、水相中に分散してい
る〔1980年9月23日にエムシュナイダー(M.Schneide
r)に発行された米国特許第4,224,179号参照〕。
In order to increase the encapsulation efficiency, it contains liposome precursors or micelles, ie an aqueous phase wrapped by one layer of lipid molecules (monolayer monolayar) oriented such that the polar head group is oriented towards the aqueous phase ER formation was first performed. The liposome precursor is formed by adding an aqueous solution to be encapsulated to an organic solvent solution of a polar lipid and sonicating. The liposome precursor is then emulsified in a second aqueous phase in the presence of excess lipid and evaporated. The resulting liposomes consist of an aqueous phase encapsulated by a lipid bilayer membrane and are dispersed in the aqueous phase [M. Schneide on September 23, 1980.
r) US Pat. No. 4,224,179].

被包効率も最大にしようとする他の試みとして、パパ
ハジョポウロス(Papahadjopoulos)(1980年11月25日
発行された米国特許第4,235,871号)は、逆相蒸発小胞
体(以下REVと云う)としても知られているオリゴラメ
ラ脂質小胞体を作る“逆相蒸発法”について述べてい
る。この方法によれば、被包しようとする水性物質を有
機溶剤中の極性脂質混合物に添加する。次いで、均一な
油中水型エマルジョンを作り、ゲルが形成されるまで有
機溶剤を蒸発する。その後、ゲル状混合物を水性媒質中
に分散させて、ゲルを懸濁液にする。生成したREVは、
ほとんどがユニラメラ小胞体(大きいユニラメラ小胞
体、LUV)から成り、更に、大きい内部水性空間を有す
るほんのわずかな同心二重層膜であることを特徴とする
若干のオリゴラメラ小胞体から成っている。
In another attempt to maximize encapsulation efficiency, Papahadjopoulos (U.S. Pat. No. 4,235,871 issued Nov. 25, 1980) uses reverse-phase evaporative vesicles (hereinafter referred to as REVs). ) Describes "reverse-phase evaporation," which produces oligolamellar lipid vesicles, also known as. According to this method, an aqueous substance to be encapsulated is added to a polar lipid mixture in an organic solvent. The organic solvent is then evaporated until a uniform water-in-oil emulsion is formed and a gel is formed. Thereafter, the gel-like mixture is dispersed in an aqueous medium to make the gel into a suspension. The generated REV is
It consists mostly of unilamellar vesicles (large unilamellar vesicles, LUV), and also consists of some oligolamellar vesicles, characterized by only a few concentric bilayer membranes with a large internal aqueous space.

また、リポソームは、次の形で製造することができ
る。(a)レンク等(Lenk et.al.)、米国特許第4,52
2,803号に記載された方法による安定なマルチラメラ小
胞体(SPLV)、(b)フォンティン等(Fountain et.a
l.)、米国特許第4,588,578号の方法による単一相(mon
ophasic)小胞体(MPV)及び(c)バリー等(Bally e
t.al.)、1985年11月21日出願の米国特許出願番号第80
0,545号(関連米国特許第4,975,282号)の方法による連
結−解凍マルチラメラ小胞体(FATMLV)。
In addition, liposomes can be produced in the following manner. (A) Lenk et al., US Patent No. 4,52.
Stable multilamellar endoplasmic reticulum (SPLV), (b) Fontin et al. (Fountain et.a.
l.), a single phase (mon) by the method of U.S. Pat. No. 4,588,578.
ophasic) endoplasmic reticulum (MPV) and (c) Barry et al.
t.al.), U.S. Patent Application No. 80, filed November 21, 1985.
Ligated-thawed multilamellar endoplasmic reticulum (FATMLV) according to the method of US Pat. No. 0,545 (US Pat. No. 4,975,282).

リポソームは、脱水及び再水和が可能である。ジャノ
フ等(Janoff et al.)、“脱水リポソーム”、1986年
2月27日公表のPCT出願番号第8601103号参照(ヨーロッ
パ特許第0190315号)。
Liposomes can be dehydrated and rehydrated. See Janoff et al., "Dehydrated Liposomes," PCT Application No. 8601103, published February 27, 1986 (European Patent No. 0190315).

薬物供給システムにリポソームを使用することの可能
性に関しては、多くの記載が行われている。例えば、19
76年11月23日にユエー エル ラーマン及びエリザベス
エイ サーニー(Yuch−Erh Rahman and Elizabeth
A.Cerny)に発行された米国特許第3,993,754号及び1979
年3月20日にバリー ディ シアーズ(Barry D.Sear
s)に発行された米国特許第4,145,410号の記載参照。リ
ポソーム薬物供給システムにおいては、リポソーム形成
中に薬剤が取り込まれ、次いで治療しようとする患者に
投与される。薬剤は、水又は非極性溶剤に可溶であって
もよい。このような記載の代表的なものとして、1980年
11月25日にパパハジャポウロス及びソカ(Papahadjapou
ls and Szoka)に発行された米国特許第4,235,871号及
び1980年9月23日にエム シェナイダー(M.Schnerde
r)に発行された米国特許第4,224,179号がある。生体内
で使用するリポソームを作る場合には、(1)リポソー
ム形成中に有機溶剤を使用する必要性をなくすこと及び
(2)一回の投与量当り、より大きい容量及びより高い
濃度の取り込まれた物質を供給することができるよう
に、被包効率及び捕捉容量を最高にすることが有利であ
ろう。
Much has been said about the potential use of liposomes in drug delivery systems. For example, 19
On November 23, 76, Yuch-Erh Rahman and Elizabeth
U.S. Patent Nos. 3,993,754 and 1979 issued to A. Cerny)
Barry D. Sear on March 20, 2013
See U.S. Pat. No. 4,145,410 issued to s). In liposome drug delivery systems, the drug is taken up during liposome formation and then administered to the patient to be treated. The drug may be soluble in water or a non-polar solvent. A typical example of such a statement is 1980
On November 25, Papajajapoulos and Soca (Papahadjapou)
U.S. Pat. No. 4,235,871 issued to M. Schnerde on September 23, 1980.
No. 4,224,179 issued to r). When making liposomes for use in vivo, (1) eliminate the need to use organic solvents during liposome formation; and (2) incorporate larger volumes and higher concentrations per dose. It may be advantageous to maximize the encapsulation efficiency and the capture capacity so that the material can be supplied.

発明の要約 本発明は、二重層膜がアルファートコフェロールの有
機酸誘導体の塩を含んでいる小胞体に種々の物質を取り
込み、投与する方法及びその組成物を含むものである。
本発明の小胞体は、取り込まれた化合物を生体内に投与
するのに特に有用であり、その場合には、小胞体を作る
のに、D−アルファートコフェロールの有機酸誘導体の
生体適合性塩を使用すべきである。事実、生体内投与に
関しては、アルファートコフェロールの有機酸誘導体の
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩(トリス−
塩)が、小胞体二重層膜成分として特に有用である。こ
のような誘導体は、コハク酸のエステル又はヘミエステ
ルでもよく、小胞体は、ホルモン、抗真菌剤、抗緑内障
剤(これらに限定させるものではない)のような生物活
性剤を取り込んでいてもよい。小胞体は、これらに限定
されるものではないが、局所的、非経口的、経口的及び
経膣的を含む種々の経路で投与される。
SUMMARY OF THE INVENTION The present invention includes methods and compositions for incorporating and administering various substances to the endoplasmic reticulum where the bilayer membrane contains salts of organic acid derivatives of alpha-tocopherol.
The endoplasmic reticulum of the present invention is particularly useful for administering an incorporated compound into a living body, in which case a biocompatible salt of an organic acid derivative of D-alpha-tocopherol is used to form the endoplasmic reticulum. Should be used. In fact, for in vivo administration, the tris (hydroxymethyl) aminomethane salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol (Tris-
Salts) are particularly useful as ER bilayer membrane components. Such derivatives may be esters or hemiesters of succinic acid, and the endoplasmic reticulum may incorporate bioactive agents such as, but not limited to, hormones, antifungals, antiglaucoma agents. The endoplasmic reticulum is administered by a variety of routes, including, but not limited to, topical, parenteral, oral and vaginal.

アルファートコフェロール小胞体を製造する方法は、
水性区分を取り込む完全閉鎖二重層膜を形成するのに十
分な量の閉鎖二重層膜を形成するアルファートコフェロ
ールの有機酸誘導体の塩を、緩衝水溶液に添加すること
を含む。混合物を振とうすることによって、小胞体の懸
濁液を作る。緩衝水溶液も、溶液中の塩の対イオンを含
んでいる場合は、小胞体の形成が促進される。更に、ア
ルファートコフェロールの有機酸誘導体の解離塩が、中
性pHにおいて負に荷電している場合は、緩衝水溶液は実
質的に二価のカチオンを含むべきでない。同様に、アル
ファートコフェロールの有機酸誘導体の解離塩が、中性
pHにおいて正に荷電している場合は、緩衝水溶液は実質
的に多価のアニオンを含むべきでない。懸濁エネルギー
の適用、即ち音波処理によって、マルチラメラ小胞体が
ユニラメラ小胞体に変る。
A method for producing alpha tocopherol ER comprises:
Adding to the buffered aqueous solution a salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol that forms a closed bilayer membrane in an amount sufficient to form a fully closed bilayer membrane incorporating the aqueous compartment. A suspension of ER is made by shaking the mixture. When the buffered aqueous solution also contains a counter ion of the salt in the solution, the formation of endoplasmic reticulum is promoted. Furthermore, if the dissociated salt of the organic acid derivative of alpha-tocopherol is negatively charged at neutral pH, the aqueous buffer solution should be substantially free of divalent cations. Similarly, dissociated salts of organic acid derivatives of alpha-tocopherol are neutral
If positively charged at pH, the aqueous buffer solution should be substantially free of polyvalent anions. By the application of suspension energy, ie sonication, the multilamellar vesicles are transformed into unilamellar vesicles.

水溶性化合物、部分的水溶性化合物及び水不溶性化合
物を本発明のアルファートコフェロール小胞体に取り込
むためには、多数のアプローチが可能である。アルファ
ートコフェロール二重層膜内に分配する化合物(例え
ば、水不溶性化合物)又は水溶性化合物を、小胞体の形
成前に水相へ添加し、形成中に小胞体内へ取り込むよう
にしてもよい。一方、水不溶性又は脂質可溶性の化合物
を、小胞体形成後に小胞体の懸濁液へ添加してもよく、
この場合は、化合物がアルファートコフェロール二重層
膜内に分配する。他の例では、水不溶性化合物とアルフ
ァートコフェロールの有機酸誘導体の塩とを、両者が可
溶性する(共に可溶化する)ように有機溶剤へ添加する
こともできる。次いで、有機溶剤を蒸発させて、水不溶
性化合物とアルファートコフェロール誘導体とが均一に
分布しているフィルムを残す。このフィルムに、撹拌し
ながら緩衝水溶液を加えると、水不溶性化合物を取り込
んだアルファートコフェロール小胞体が形成される。次
いで、このような小胞体を音波処理して、ユニラメラ小
胞体を形成することができる。
Numerous approaches are possible for incorporating water-soluble, partially water-soluble and water-insoluble compounds into the alpha-tocopherol vesicles of the present invention. A compound (for example, a water-insoluble compound) or a water-soluble compound that partitions into the alpha-tocopherol bilayer membrane may be added to the aqueous phase before the formation of the endoplasmic reticulum, and incorporated into the endoplasmic reticulum during the formation. On the other hand, a water-insoluble or lipid-soluble compound may be added to the suspension of vesicles after vesicle formation,
In this case, the compound partitions into the alpha-tocopherol bilayer membrane. In another example, a water-insoluble compound and a salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol can be added to an organic solvent so that both are soluble (both are solubilized). The organic solvent is then evaporated, leaving a film in which the water-insoluble compound and the alpha-tocopherol derivative are evenly distributed. When an aqueous buffer solution is added to the film with stirring, alpha-tocopherol vesicles incorporating the water-insoluble compound are formed. Such vesicles can then be sonicated to form unilamellar vesicles.

本発明のアルファートコフェロール小胞体は、水不溶
性生物活性剤又は水にほんのわずかに溶解する生物活性
剤を取り込むのに使用すると、特に有利である。これに
よって、薬剤のような水不溶性生物活性剤の生体内投与
が可能となる。更に投与量:容積比が変更され得るの
で、水不溶性化合物がより高濃度で生体内に投与され
る。本発明のアルファートコフェロール小胞体は、水溶
性生物活性剤を取り込むのに使用する場合も、同様な利
点を示す。アルファートコフェロール小胞体は、有機酸
の誘導形成エステル又はヘミエステルでもよく、更に、
これらの有機酸誘導体は、ピロカルピンとの塩のような
生物活性剤の塩であってもよい。本発明の小胞体は、試
験管内での診断試験に用いられることもできる。
The alpha-tocopherol vesicles of the present invention are particularly advantageous when used to incorporate water-insoluble or only sparingly soluble bioactive agents in water. This allows for the in vivo administration of a water-insoluble bioactive agent, such as a drug. Furthermore, since the dose: volume ratio can be changed, the water-insoluble compound is administered in vivo at a higher concentration. The alpha-tocopherol vesicles of the present invention show similar advantages when used to incorporate water-soluble bioactive agents. The alpha-tocopherol vesicle may be an ester-formed ester or hemiester of an organic acid,
These organic acid derivatives may be salts of bioactive agents, such as salts with pilocarpine. The endoplasmic reticulum of the present invention can also be used for in vitro diagnostic tests.

本発明は、アルファートコフェロールの有機酸誘導体
の塩、特に生物活性剤を有するものを含む組成物を包含
している。塩は、イオン化しうる生物活性剤から誘導す
ることができる。ピロカルピンアルファートコフェロー
ル小胞体の場合は、アルファートコフェロールの有機酸
誘導体のピロカルピン塩が用いられ、1:1のモル比で用
いられるのが好ましい。
The present invention includes compositions comprising salts of organic acid derivatives of alpha-tocopherol, particularly those having a bioactive agent. Salts can be derived from ionizable bioactive agents. In the case of pilocarpine alpha-tocopherol vesicles, a pilocarpine salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol is used, and is preferably used in a molar ratio of 1: 1.

本発明は、次の点で多くの利点をもたらす。 The invention offers many advantages in the following respects.

アルファートコフェロール小胞体が、 (1)容易にかつ速く形成される。 Alpha tocopherol vesicles are (1) easily and quickly formed.

(2)リン脂質MLVに比較して、高被包効率を有してい
る。
(2) It has a higher encapsulation efficiency than the phospholipid MLV.

(3)それらの製造に際し、有機溶剤の使用を必要とし
ない (本発明のアルファートコフェロール小胞体は、有機溶
剤を用いて製造することができるが)。
(3) The use of an organic solvent is not required for their production (although the alphatocopherol vesicle of the present invention can be produced using an organic solvent).

(4)高捕捉容量を有している。(4) It has a high capture capacity.

(5)生体内に投与されたとき、放出され、代謝される
生物活性剤又は薬剤を取り込むことができる。生体内で
の取り込まれた剤の帰すうは、投与方式に依存する。
(5) It can take up bioactive agents or drugs that are released and metabolized when administered in vivo. Attribution of the incorporated agent in vivo depends on the mode of administration.

更に、本発明のアルファートコフェロール小胞体は、
アルファートコフェロール小胞体に取り込ませることに
よって、取り込もうとする物質をまず可溶化し、次い
で、取り込まれた物質を含むアルファートコフェロール
小胞体自身を通常のリポソーム内に取り込ませるという
2段階法で用いることができる。
Furthermore, the alpha-tocopherol vesicle of the present invention
It can be used in a two-step method in which the substance to be taken up is first solubilized by incorporation into the alpha-tocopherol vesicles, and then the alpha-tocopherol vesicles containing the incorporated substance are taken up in ordinary liposomes. .

図面の簡単な説明 次の図面を参照することによって、本発明を更に容易
に理解することができよう。
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The invention can be more readily understood with reference to the following drawings.

第1図及び第2図は、アルファートコフェロールのコ
ハク酸ヘミエステルトリス塩、コレステロールのコハク
酸ヘミエステルトリス塩及び会合サイクロスポリンを含
む複合小胞体の形成に及ぼす成分濃度の影響をグラフで
示したものであり、それぞれ70℃の場合と60℃の場合と
である。
FIGS. 1 and 2 graphically illustrate the effect of component concentration on the formation of complex vesicles containing alpha-tocopherol succinate hemiester tris salt, cholesterol succinate hemiester tris salt and associated cyclosporine. At 70 ° C. and at 60 ° C., respectively.

第3図は、アルファートコフェロールのコハク酸ヘミ
エステルトリス塩、コレステロールのコハク酸ヘミエス
テルトリス塩及び会合ミコナゾールを含む複合小胞体の
形成に及ぼす成分濃度の影響をグラフで示したものであ
る。
FIG. 3 is a graph showing the effect of the component concentration on the formation of a composite vesicle containing alpha-tocopherol succinate hemiester tris salt, cholesterol succinate hemiester tris salt and associated miconazole.

第4図は、下垂体を切除したラットの成長に及ぼす遊
離及び小胞体に取り込まれた牛の成長ホルモンの影響
を、時間の関数で示される重量変化として成長を測定し
て、グラフに示したものである。
FIG. 4 graphically illustrates the effect of free and endoplasmic reticulum-incorporated bovine growth hormone on the growth of hypophysectomized rats, measuring growth as a weight change as a function of time. Things.

発明の詳細な説明 アルファートコフェロール小胞体は、水溶性、部分水
溶液又は水不溶性化合物を小胞体内に取り込むのに用い
ることができ、その二重層膜は、閉鎖二重層膜を形成す
ることのできるアルファートコフェロールの有機酸誘導
体の塩を含んでいる。従って、本発明のアルファートコ
フェロール小胞体を製造して、(1)水性区分内に水溶
性化合物を取り込むか、(2)小胞体二重層膜内に分配
する水不溶性化合物を取り込むか、又は(3)水溶性化
合物と水不溶性化合物の両者を一つの小胞体製剤内に取
り込むことができる。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Alphatocopherol vesicles can be used to incorporate water-soluble, partially aqueous or water-insoluble compounds into the endoplasmic reticulum, the bilayer membrane of which is capable of forming a closed bilayer membrane. Contains salts of organic acid derivatives of tocopherol. Thus, the alpha tocopherol vesicles of the present invention may be prepared to (1) incorporate a water-soluble compound into the aqueous compartment, (2) incorporate a water-insoluble compound that partitions into the ER bilayer membrane, or (3) ) Both water-soluble and water-insoluble compounds can be incorporated into one ER preparation.

本発明の実施においては、リポソームと同様な水溶液
中で完全閉鎖二重層膜を形成することのできるアルファ
ートコフェロールの有機酸誘導体の任意の塩を用いるこ
とができる。アルファートコフェロールの有機酸誘導体
の特定の塩の適合性は、水溶性化合物を外界と接触しな
いように隔離できるかどうかにかかっている。
In the practice of the present invention, any salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol that can form a completely closed bilayer membrane in an aqueous solution similar to liposomes can be used. The suitability of certain salts of organic acid derivatives of alpha-tocopherol depends on the ability to sequester the water-soluble compounds from contact with the outside world.

小胞体の水性区分内への取り込みが行われたことを明
確に決定するために、リポソームについて次の基準が確
立されており、それは類推適用されてもよい。〔セッサ
及びワイズマン(Sessa and Weissmann)、バイオロジ
カル ケミストリー(Biol.Chem.)245:3295(1970)参
照〕。
The following criteria have been established for liposomes, which may be applied by analogy, to clearly determine that uptake of the endoplasmic reticulum into the aqueous compartment has taken place. [See Sessa and Weissmann, Biol. Chem. 245: 3295 (1970)].

(a)ゲル濾過によって、隔離された化合物を含まない
はっきりとした分離が行われていなければならない。
(b)最外部の小胞体二重層膜と取り込まれた化合物と
の間に、疏水性又は電荷−電荷相互作用があってはなら
ない。何故ならば、このために、分子ふるい操作によっ
て小胞体から遊離化合物を分離することが失敗する結果
となり、それによって、見掛け隔離効率が人為的に高く
なるからである。この可能性を排除するためには、前に
形成された小胞体の懸濁液に添加される水溶性化合物
が、小胞体と共に溶出しないことを示さなければならな
い。(c)界面活性剤又は他の膜摂動剤を用いることに
よるゲル濾過された小胞体の崩壊によって、隔離された
分子のゲル濾過パターンが、小胞体ピークと一致する位
置から遊離分子と共に溶出する位置へシフトしなければ
ならない。
(A) A clear separation free of sequestered compounds must be obtained by gel filtration.
(B) There must be no hydrophobic or charge-charge interactions between the outermost ER bilayer membrane and the incorporated compound. This results in failure to separate free compounds from the endoplasmic reticulum by molecular sieving operations, thereby artificially increasing the apparent isolation efficiency. To exclude this possibility, it must be shown that the water-soluble compounds added to the previously formed ER suspension do not elute with the ER. (C) the location at which the gel filtration pattern of the isolated molecule elutes with free molecules from the location that coincides with the ER peak by disruption of the gel-filtered vesicle by use of a surfactant or other membrane perturbant. Have to shift to

アルファートコフェロールを誘導化するのに用いるこ
とのできる有機酸には、ジカルボン酸、ポリカルボン
酸、アミノ酸及びポリアミノ酸があるが、これらに限定
されるものではない。このような誘導体は、エステルで
あっても、またヘミエステルであってもよい。塩は、有
機酸の水溶性を増大させるので、アルファートコフェロ
ールを誘導体化するのに、任意の有機酸を用いることが
できる。しかし、有機酸部分それ自体が水溶性であれ
ば、有利であろう。このような水溶性有機酸部分には、
マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリ
ン酸、マレイン酸等のような水溶性脂肪族ジカルボン酸
(注意:鎖長が短かいほど、水に溶け易くなることが認
められる。水への溶解度の境界線は、C6〜C7にある);
ヘミメリト酸、トリメシン酸、スクシンイミド等のよう
な水溶性芳香族ジカルボン酸;ポリカルボン酸並びに任
意のアミノ酸及びポリアミノ酸があるが、これらに限定
されるものではない。
Organic acids that can be used to derivatize alpha-tocopherol include, but are not limited to, dicarboxylic acids, polycarboxylic acids, amino acids, and polyamino acids. Such a derivative may be an ester or a hemiester. Any organic acid can be used to derivatize alpha-tocopherol since salts increase the water solubility of the organic acid. However, it would be advantageous if the organic acid moiety itself was water soluble. Such water-soluble organic acid moieties include
Water-soluble aliphatic dicarboxylic acids such as malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, maleic acid, etc. (Note: It is recognized that the shorter the chain length, the easier it is to dissolve in water. the solubility of the boundary line is in the C 6 ~C 7);
Water-soluble aromatic dicarboxylic acids such as hemimelitic acid, trimesic acid, succinimide and the like; polycarboxylic acids and any amino acids and polyamino acids, but are not limited thereto.

誘導体化されたアルファートコフェロールの塩は、ア
ルファートコフェロールの有機酸誘導体と塩の対イオン
(例えば塩の遊離塩基)の両者を適当な揮発性溶剤に溶
解し、蒸発又は同じような手法で溶剤を解除して、アル
ファートコフェロールの有機酸誘導体の塩から成る残留
物を残すことによって作ることができる。用いることの
できる対イオンには、対応する塩を形成するトリス、2
−アミノ−2−メチル−1−3−プロパンジオール、2
−アミノエタノール、ビスートリスプロパン、トリエタ
ノールアミン等があるが、これらに限定されるものでは
ない。事実、ミコナゾール遊離塩基等のようなイオン化
しうる生物活性剤の遊離塩基を、対イオンとして用いる
こができる。
The derivatized salt of alpha-tocopherol is obtained by dissolving both the organic acid derivative of alpha-tocopherol and the counterion of the salt (eg, the free base of the salt) in a suitable volatile solvent and removing the solvent by evaporation or a similar technique. And leaving a residue consisting of a salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol. Counterions which can be used include Tris, which forms the corresponding salt, 2
-Amino-2-methyl-1-propanediol, 2
-Aminoethanol, bistrispropane, triethanolamine and the like, but are not limited thereto. In fact, the free base of an ionizable bioactive agent, such as miconazole free base, can be used as a counterion.

一般に、生物活性剤の遊離塩基とアルファートコフェ
ロールのジカルボン酸誘導体とのモル比は、対応する生
物活性剤塩を作るのに、1:1が用いられる。両出発物質
を溶解する有機溶剤には、メタノール、エタノール、ク
ロロホルム、ジメチルスルホミドのようなものがある。
出発物質は、好ましくは約20〜50℃、更に好ましくは約
20〜30℃で溶剤に添加される。反応に続いて、減圧下で
の溶剤除去、蒸発、結晶化又は技術上既知の他の方法に
よって、生成生物活性剤塩を単離することができる。好
ましいジカルボン酸誘導体は、コハク酸の誘導体であ
る。好ましいアルファートコフェロールは、D−アルフ
ァートコフェロールである。
Generally, a 1: 1 molar ratio of the free base of the bioactive agent to the dicarboxylic acid derivative of alpha-tocopherol is used to make the corresponding bioactive agent salt. Organic solvents that dissolve both starting materials include those such as methanol, ethanol, chloroform, dimethylsulfamide.
The starting material is preferably at about 20-50 ° C, more preferably at about 20 ° C.
Added to the solvent at 20-30 ° C. Following the reaction, the resulting bioactive agent salt can be isolated by solvent removal under reduced pressure, evaporation, crystallization, or other methods known in the art. Preferred dicarboxylic acid derivatives are succinic acid derivatives. A preferred alpha-tocopherol is D-alpha-tocopherol.

生物活性剤遊離塩基がピロカルピンであり、ジカルボ
ン酸がコハク酸である場合は、ピロカルピン:D−アルフ
ァートコフェロールのモル比は1:0.5から1:1の範囲で用
いることができる。出発物質の最も好ましい等モル量
を、クロロホルムや塩化メチレンのような極性有機溶剤
中に溶解する。塩化メチレンについては、好ましくは約
30〜60℃、より好ましくは約40〜60℃、最も好ましくは
55℃で出発物質を添加し、加熱還流する。反応完了後、
溶剤を減圧下に除去して、アルファートコフェロールコ
ハク酸ヘミエステルのピロカルピン塩から成る生成物を
得た。
When the bioactive agent free base is pilocarpine and the dicarboxylic acid is succinic acid, the pilocarpine: D-alpha-tocopherol molar ratio can be used in the range of 1: 0.5 to 1: 1. The most preferred equimolar amount of the starting material is dissolved in a polar organic solvent such as chloroform or methylene chloride. For methylene chloride, preferably about
30-60 ° C, more preferably about 40-60 ° C, most preferably
Add starting material at 55 ° C. and heat to reflux. After the reaction is completed
The solvent was removed under reduced pressure to give a product consisting of the pilocarpine salt of alpha-tocopherol succinic acid hemiester.

ミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソ
コナゾール、チオコナゾール、ビフォナゾール、クロト
リマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イトラ
コナゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、
ナイスタチン,ナフチファイン、アンホテリシンB,ジノ
コナゾール及びシクロピロックスオラミンのような抗真
菌剤、特にミコナゾール又はテルコナゾールが、イオン
化しうる生物活性剤として用いられる。
Miconazole, terconazole, econazole, isoconazole, thioconazole, bifonazole, clotrimazole, ketoconazole, butaconazole, itraconazole, oxyconazole, fenticonazole,
Antifungal agents such as nystatin, naftifine, amphotericin B, dinoconazole and ciclopirox olamine, especially miconazole or terconazole, are used as ionizable bioactive agents.

本発明のアルファートコフェロール小胞体は、誘導体
化されたアルファートコフェロールが小胞体(即ち、取
り込まれた水性区分を含む完全閉鎖二重層膜)を形成す
るのに十分な量で存在するように、アルファートコフェ
ロールの有機酸誘導体の塩を水性相に添加することによ
って製造してもよい。次いで、小胞体、通常はマルチラ
メラの乳状懸濁液が形成されるまで、生成物を振とうす
る。好ましい実施態様においては、小胞体形成を促進す
るために、水相は溶液中に塩を含有すべきである。更
に、アルファートコフェロールの有機酸誘導体の解離塩
が、中性pHにおいて負に荷電している場合は、緩衝水溶
液は実質的に多価のカチオンを含むべきでない。同様
に、アルファートコフェロールの有機酸誘導体の解離塩
が、中性pHにおいて正に荷電している場合は、緩衝水溶
液は実質的に多価のアニオンを含むできでない。
The alpha-tocopherol vesicles of the present invention are prepared so that the derivatized alpha-tocopherol is present in an amount sufficient to form an endoplasmic reticulum (ie, a fully closed bilayer membrane containing an incorporated aqueous compartment). May be added to the aqueous phase. The product is then shaken until an ER, usually a multilamellar milky suspension, is formed. In a preferred embodiment, the aqueous phase should contain salts in solution to promote vesicle formation. Furthermore, if the dissociated salt of the organic acid derivative of alpha-tocopherol is negatively charged at neutral pH, the aqueous buffer solution should be substantially free of polyvalent cations. Similarly, if the dissociated salt of the organic acid derivative of alpha-tocopherol is positively charged at neutral pH, the aqueous buffer solution cannot contain substantially multivalent anions.

本発明の小胞体は、マルチラメラ小胞体として用いて
もよく、また濾過や音波処理のような技術上知られてい
る多くの技法を用いて、大きさを小さくしてもよい。ま
た、ホープ等(Hope et.al.)、BBA 812巻、1985、pp.5
5〜56及び1985年10月16日出願の、課題が“ユニラメラ
小胞体を製造する押出方法”である、カリス等(Cullis
et.al.)の同時係属米国特許出願番号第788,017号(関
連米国特許第5,008,050号)に記載されているように、V
ET法(小胞体押出技法)を用いて、小胞体の大きさを小
さくしてもよい。小胞体の大きさを合せる他の技法に、
小胞体ポンプによってフィルターユニットから連続的に
押し出すCSR法(連続サイズ低減)がある。
The vesicles of the present invention may be used as multilamellar vesicles and may be reduced in size using many techniques known in the art, such as filtration and sonication. Also, Hope et al., BBA 812, 1985, pp.5
Cullis et al., Filed on Oct. 5-56 and Oct. 16, 1985, the subject of which is the "extrusion process for producing unilamellar vesicles".
et.al.), co-pending U.S. Patent Application No. 788,017 (related U.S. Patent No. 5,008,050).
The size of the endoplasmic reticulum may be reduced using the ET method (endoplasmic reticulum extrusion technique). Other techniques for matching the size of the ER
There is a CSR method (continuous size reduction) in which an ER pump continuously extrudes from a filter unit.

マルチラメラ小胞体形成について報告されている方法
〔例えばブロッカーホッフ及びラムサミイ(Brockerhof
f and Ramsammy)、バイオヒミカ ウント バイオフィ
ジカ オブ アクタ(Biochim,Biophys,Acta.)691:227
(1982)のリン脂質小胞体又はコレステロールのリポソ
ーム〕とは完全に異なり、本発明のアルファートコフェ
ロールマルチラメラ小胞体の形成方法は、有機溶剤を使
用する必要がない。更に、ブロッカーホッフ及びラムサ
ミイの方法とは異なり、マルチラメラ小胞体を形成する
のに音波処理は必要でない。しかしながら、本発明のア
ルファートコフェロールマルチラメラ小胞体の乳状懸濁
液に音波処理を施すこと、又はフレンプレス(エス エ
ル エム−アミンコ(SLM−Aminco)社、イリノイ州、
アーバナ(Urbana))の使用に引続いて音波処理を施す
ことが、マルチラメラアルファートコフェロール小胞体
の乳剤懸濁液をユニラメラ小胞体の透明な懸濁液に変え
るために行われてもよい。音波処理を行わずにフレンチ
プレスを使用すると、ユニラメラ小胞体になることが多
い。
Methods reported for multilamellar endoplasmic reticulum formation [eg Brockerhof and Brockerhof
f and Ramsammy), Bio-Himika und Bio-Physica of Acta (Biochim, Biophys, Acta.) 691: 227
(1982), and the method for forming alpha-tocopherol multilamellar vesicles of the present invention does not require the use of an organic solvent. Further, unlike the blocker Hoff and Ramsamii methods, no sonication is required to form multilamellar vesicles. However, sonication of the milky suspension of the alpha-tocopherol multilamellar vesicles of the present invention or Flempress (SLM-Aminco), Ill.,
Subsequent sonication following the use of Urbana may be performed to convert the emulsion suspension of multilamellar alpha-tocopherol vesicles into a clear suspension of unilamellar vesicles. Using a French press without sonication often results in unilamellar vesicles.

前に説明したように、アルファートコフェロールの任
意の有機酸誘導体のトリス−塩は、本発明の実施におい
て有利に用いられよう、例えば、アルファートコフェロ
ールコハク酸ヘミエステルやコハク酸ヘミエステルの混
合物のようなアルファートコフェロールジカルボン酸ヘ
ミエステルのトリス−塩は、生体内に投与するためのア
ルファートコフェロール小胞体の小胞体二重層膜を形成
するのに特に有用である。例えば、アルファートコフェ
ロールのコハク酸ヘミエステルを用いる場合、約5〜70
0マイクロモルのトリス−塩を、トリス−HCl(トリス
(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩)を含む約5.
0mlの緩衝水溶液に添加して、小胞体を形成することが
できる。この場合、緩衝水溶液は実質的に2価のカチオ
ンを含むべきでない。
As previously described, tris-salts of any organic acid derivative of alpha-tocopherol may be advantageously used in the practice of the present invention, e.g., alpha-tocopherol, such as alpha-tocopherol succinate hemiester or a mixture of succinate hemiesters. Tris-salts of dicarboxylic acid hemiesters are particularly useful for forming ER bilayer membranes of alpha-tocopherol vesicles for in vivo administration. For example, when using a hemiester succinate of alpha-tocopherol, about 5-70
0 micromolar of the tris-salt, including Tris-HCl (tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride) at about 5.
It can be added to 0 ml of buffered aqueous solution to form vesicles. In this case, the aqueous buffer solution should be substantially free of divalent cations.

本発明によれば、水溶性化合物、水不溶性化合物又は
わずかに可溶性の化合物を、アルファートコフェロール
の有機酸誘導体の塩で構成されているリポソームに、多
くの方法で取り込み又は会合させることができる。
According to the invention, water-soluble, water-insoluble or slightly soluble compounds can be incorporated or associated with liposomes composed of salts of organic acid derivatives of alpha-tocopherol in a number of ways.

(1)水不溶性化合物を、アルファートコフェロールの
有機酸誘導体の適当な塩を用いて上述のように作ったア
ルファートコフェロール小胞体(マルチラメラ又はユニ
ラメラのいずれか)の懸濁液に添加することができる。
この化合物は、アルファートコフェロール二重層膜内に
分配するために、小胞体内に取り込まれる。この実施態
様は、次のようにして便利に実施される。水不溶性化合
物を適当な有機溶剤に溶解し、次いでその溶剤を蒸発さ
せて、化合物のフィルム又は残留物を残す。あらかじめ
形成したアルファートコフェロール小胞体の水分散液を
残留物に加えると、残留物は小胞体の二重層膜に取り込
まれるであろう。好ましい実施態様においては、ユニラ
メラ小胞体が用いられるべきである。代りにマルチラメ
ラ小胞体が用いられると、水不溶性化合物は、小胞体の
最外部二分膜だけに取り込まれて、最内部二重層膜は変
らないままで残り、誘導体化されたアルファートコフェ
ロールを無駄に使うとこになるかもしれない。
(1) The water-insoluble compound can be added to a suspension of alpha-tocopherol vesicles (either multilamella or unilamella) made as described above using a suitable salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol. .
This compound is incorporated into the endoplasmic reticulum for distribution within the alpha-tocopherol bilayer membrane. This embodiment is conveniently implemented as follows. The water-insoluble compound is dissolved in a suitable organic solvent and the solvent is evaporated, leaving a film or residue of the compound. If an aqueous dispersion of preformed alpha-tocopherol vesicles is added to the residue, the residue will be incorporated into the ER bilayer membrane. In a preferred embodiment, unilamellar vesicles should be used. When multilamellar vesicles are used instead, the water-insoluble compounds are incorporated only into the outermost bilayer of the vesicles, leaving the innermost bilayer membrane unchanged, wasting derivatized alpha-tocopherol. May be used.

(2)水不溶性化合物及びアルファートコフェロールの
有機酸誘導体の塩を、有機溶剤に共に可溶化させ、次い
でその溶剤を蒸発させて、均一に分布した水不溶性化合
物とアルファートコフェロールとを含むフィルムを残す
ことができる。振とうしながら水相をフィルムに加える
と、取り込まれた化合物を含有するアルファートコフェ
ロール小胞体の懸濁液が形成される。前に述べたよう
に、マルチラメラ小胞体をユニラメラ小胞体に変えるこ
とができる。
(2) solubilizing the water-insoluble compound and the salt of the organic acid derivative of alpha-tocopherol together in an organic solvent, and then evaporating the solvent to leave a film containing the water-insoluble compound and alpha-tocopherol evenly distributed; Can be. When the aqueous phase is added to the film with shaking, a suspension of alpha-tocopherol vesicles containing the incorporated compound is formed. As mentioned earlier, multilamellar vesicles can be turned into unilamellar vesicles.

(3)水溶性化合物又は水溶性化合物を、小胞体の製造
に用いられる水相に添加することによって、この化合物
をアルファートコフェロール小胞体小に取り込むことが
できる。即ち、アルファートコフェロールの有機酸誘導
体の塩を添加する前又はそれと同時に、化合物を水相に
添加することができる。この場合、水不溶性化合物は、
それが小胞体形成中に二重層膜内に分配する際に、取り
込まれるようになり、一方、水溶性化合物は、小胞体の
水性区分に取り込まれるようになる。いずれの場合も、
前に述べたうよに、マルチラメラ小胞体をユニラメラ小
胞体に変えることができる。
(3) By adding a water-soluble compound or a water-soluble compound to the aqueous phase used for the production of the endoplasmic reticulum, the compound can be incorporated into alphatocopherol vesicles. That is, the compound can be added to the aqueous phase before or simultaneously with the addition of the salt of the organic acid derivative of alpha-tocopherol. In this case, the water-insoluble compound is
As it partitions into the bilayer membrane during ER formation, it becomes incorporated, while water-soluble compounds become incorporated into the aqueous compartment of the ER. In either case,
As mentioned earlier, multilamellar vesicles can be turned into unilamellar vesicles.

(4)生物活性剤がイオン化可能であれば、アルファー
トコフェロールの有機酸誘導体の塩を作るための対イオ
ンとして、生物活性剤の遊離塩基を用いることができ
る。生成組成物は、溶解度又は安定性を高めることがで
きる。更に、アルファートコフェロールの有機酸誘導体
の生物活性剤塩を用いて、前述の任意の方法により、ア
ルファートコフェロール小胞体を製造してもよい。例え
ば、ミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イ
ソコナゾール、チオコナゾール、ビフォナゾール、クロ
トリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イト
ラコナゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾー
ル、ナイスタチン、ナフチファイン、アンホテリシン
B、ジコナゾール及びシクロピロックスオラミンのよう
な抗真菌剤の遊離塩基を、本発明の一実施態様において
塩誘導体を作るのに用いることができる。また、ピロカ
ルピンの遊離塩も、本発明の一実施態様において塩誘導
体を作るのに用いることができる。アルファートコフェ
ロールコハク酸ヘミエステルのピロカルピン塩誘導体を
用いるリポソームは、30〜40℃の温度で、乾燥したアル
ファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのピロカル
ピン塩に水溶液を加え、懸濁液を撹拌することによって
作られることができる。作用できる水溶液の例には、米
国薬局方、注射用蒸留水があり、次のもののいずれか単
独又は組合せたものである。0.01%(w/v)塩化ベンザ
ルコニウム、0.025〜0.1%(w/v)ソルビン酸EDTA(エ
チレンジアミンテトラ酢酸)、1.4%(w/v)ポリビニル
アルコール及び0.05〜0.50%(w/v)ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース。ここに名前を挙げた他のイオン化
しうる生物活性剤を使用してもよい。
(4) If the bioactive agent is ionizable, the free base of the bioactive agent can be used as a counter ion for forming a salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol. The resulting composition can have increased solubility or stability. Further, alpha-tocopherol vesicles may be produced by any of the methods described above using a bioactive agent salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol. For example, miconazole, terconazole, econazole, isoconazole, thioconazole, bifonazole, clotrimazole, ketoconazole, butaconazole, itraconazole, oxyconazole, fenticonazole, nystatin, naftifine, amphotericin B, ziconazole and cyclopyroxolamine The antifungal free base can be used to make salt derivatives in one embodiment of the present invention. Also, free salts of pilocarpine can be used to make salt derivatives in one embodiment of the present invention. Liposomes using pilocarpine salt derivatives of alpha-tocopherol succinic acid hemiester can be made by adding an aqueous solution to dried pilocarpine salt of alpha-tocopherol succinic acid hemiester at a temperature of 30-40 ° C and stirring the suspension. . Examples of aqueous solutions that can work include USP, Distilled Water for Injection, and any of the following, alone or in combination: 0.01% (w / v) benzalkonium chloride, 0.025-0.1% (w / v) sorbic acid EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 1.4% (w / v) polyvinyl alcohol and 0.05-0.50% (w / v) hydroxy Propyl methylcellulose. Other ionizable bioactive agents named herein may be used.

本発明の組成物は、アルファートコフェロールの有機
酸の塩に加えて、小胞体の二重層膜内又はその間に取り
込まれた生物活性剤を含有していてもよく、あるいは生
物活性剤が二重層膜と会合していてもよい。このような
会合によって、生物活性剤が小胞体の外部に位置する結
果とする。
The compositions of the present invention may contain, in addition to the salt of the organic acid of alpha-tocopherol, a bioactive agent incorporated within or between the bilayer membranes of the endoplasmic reticulum, or wherein the bioactive agent is a bilayer membrane. You may have met with Such association results in the bioactive agent being located outside the endoplasmic reticulum.

本発明の組成物は、緑内障のような眼病の治療におけ
る目への投与に用いることができる。このような用途で
は、点眼瓶又はアプリケーターのような技術上知られて
いる目への供給システムによって、組成物を投与するこ
とができる。組成物は、更に、ヒアルロン酸、コンドロ
イチン硫酸、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース又
はポリビニルアルコールのような凝性粘液剤(mucomime
tics)、上記パーセントの、ソルビン酸EDTA又は塩化ベ
ンザルコニウムのような防腐剤、通常量の希釈剤及び/
又は担体物質を含有することができる。
The compositions of the present invention can be used for administration to the eye in the treatment of eye diseases such as glaucoma. In such applications, the composition may be administered by an art-known delivery system such as an eye dropper or applicator. The composition may further comprise a cohesive mucus such as hyaluronic acid, chondroitin sulfate, hydroxylpropyl methylcellulose or polyvinyl alcohol.
tics), a preservative, such as EDTA or benzalkonium chloride, in the above percentages, the usual amount of diluent and / or
Or it may contain a carrier material.

緑内障のような眼病の治療において人に投与する際に
は、結局は、処方箋を書く医師が所定の患者に適当な投
与量を決定し、それは患者の症状の性質及び重さと共
に、個人の年令、体重、応答に応じて変えるものと予期
することができる。代表的には、組成物の目への投薬量
は、薬として受け入れられる適当な希釈剤又は担体に
て、平均成人患者に1日1〜2回投与させる4%ピロカ
ルピン溶液で、25〜50μの範囲内にあるであろう。し
かし、これらの数字は、単に説明上のものであり、場合
によっては、この限界外の投薬量を用いる必要があるか
もしれない。
When administering to a person in the treatment of an eye disease such as glaucoma, the prescribing physician will ultimately determine the appropriate dose for a given patient, which, along with the nature and severity of the patient's symptoms, will be determined by the individual. It can be expected to change depending on age, weight and response. Typically, the ophthalmic dosage of the composition will be in the form of a 4% pilocarpine solution administered to the average adult patient once or twice daily in a suitable pharmaceutically acceptable diluent or carrier, from 25 to 50 μl. Would be in range. However, these numbers are merely illustrative and in some cases it may be necessary to use dosages outside this limit.

上記4方法のいずれかを用いて、水溶性化合物及び水
不溶性化合物の両者を一つのアルファートコフェロール
小胞体生成物に取り込むことができる。
Using any of the above four methods, both water-soluble and water-insoluble compounds can be incorporated into a single alpha-tocopherol ER product.

本発明のアルファートコフェロール小胞体を用いて水
不溶性化合物を取り込むための上記方法によれば、一
旦、水不溶性化合物が二重層膜に分配すれば、小胞体が
そのままである必要はない。事実、一旦、化合物が二重
層膜に分配すれば、小胞体が乱されたりあるいは破壊さ
れたりして、取り込まれた水性化合物を漏出又は放出す
ることになる。これらの“漏出性”小胞体は、取り込ま
れた水不溶性化合物を供給するのに用いることができる
が、水溶性物質を被包あるいは供給するのに用いるべき
ではない。
According to the above method for incorporating a water-insoluble compound using the alpha-tocopherol vesicle of the present invention, once the water-insoluble compound is distributed to the bilayer membrane, the vesicle does not need to remain as it is. In fact, once the compound partitions into the bilayer membrane, the endoplasmic reticulum is disturbed or destroyed, thereby leaking or releasing the entrapped aqueous compound. These "leaky" vesicles can be used to deliver entrapped water-insoluble compounds, but should not be used to encapsulate or deliver water-soluble materials.

本発明の一実施態様によれば、アルファートコフェロ
ールコハク酸ヘミエステルのトリス塩を用いて、次のよ
うなリポソームを製造することができる。0.01Mのトリ
ス−HCl、0.14MのNaClを含む緩衝水溶液1ml当りに、ア
ルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリス
塩を約1〜400mg添加する。混合物を振とうして、アル
ファートコフェロールコハク酸ヘミエステルの乳状懸濁
液を形成する。小胞体を遠心分離によってペレットに
し、緩衝水溶液をくりかえし洗浄してもよい。アルファ
ートコフェロールコハク酸ヘミエステルマルチラメラ小
胞体(AHS−MLV)を音波処理して、アルファートコフェ
ロールコハク酸ヘミエステルの小さなユニラメラ小胞体
(AHS−SUV)を形成することもできる。小胞体は、2価
のカチオンが存在すると不安定である。即ち、2価のカ
チオンにさらすと、取り込まれた水性区分及び水溶性化
合物が放出される。従って、小胞体の製造中は貯蔵中に
用いる水性媒質は、実質的に2価のカチオンを含むべき
ではない。
According to one embodiment of the present invention, the following liposomes can be produced using the tris salt of alpha-tocopherol succinic acid hemiester. About 1-400 mg of alpha-tocopherol succinic acid hemiester tris salt is added per 1 ml of a buffered aqueous solution containing 0.01 M Tris-HCl and 0.14 M NaCl. The mixture is shaken to form a milky suspension of alpha-tocopherol succinic acid hemiester. The endoplasmic reticulum may be pelletized by centrifugation, and the buffered aqueous solution may be repeatedly washed. Alpha-tocopherol succinate hemiester multilamellar vesicles (AHS-MLV) can also be sonicated to form small unilamellar vesicles of alpha-tocopherol succinate hemiester (AHS-SUV). The endoplasmic reticulum is unstable in the presence of divalent cations. That is, upon exposure to divalent cations, the entrapped aqueous fraction and water-soluble compounds are released. Thus, the aqueous medium used during storage during production of the endoplasmic reticulum should be substantially free of divalent cations.

本発明の方法によって取り込まれた化合物は、種々の
方法で用いることができる。例えば、化合物が生物活性
剤である場合は、アルファートコフェロール小胞体に取
り込まれた化合物を生体内に投与することができる。こ
れは、通常、水溶液に不溶性であるか又はわずかに可溶
性である生物活性剤の生体内供給を促進する。アルファ
ートコフェロールの有機酸誘導体の塩から構成されてい
る小胞体に取り込むことによって、より高い投与量:容
積比でのこのような不溶性化合物の投与を容易にするこ
とができる。事実、生体内へ供給するために、一つ又は
それ以上の生物活性剤を取り込むのに小胞体が用いられ
るので、本発明のアルファートコフェロール小胞体が、
特に有利に用いられる。更に、本発明の小胞体は、有機
溶剤を使用せずに製造することができるので、生体内で
用いられる場合、通常の脂質小胞体又はリポソームより
も優った利点を呈する。
The compounds incorporated by the method of the present invention can be used in various ways. For example, if the compound is a bioactive agent, the compound incorporated into alpha-tocopherol vesicles can be administered in vivo. This facilitates the in vivo delivery of bioactive agents that are usually insoluble or slightly soluble in aqueous solutions. Incorporation into the endoplasmic reticulum composed of salts of organic acid derivatives of alpha-tocopherol can facilitate administration of such insoluble compounds at higher dose: volume ratios. In fact, since the vesicles are used to incorporate one or more bioactive agents for delivery into the body, the alpha-tocopherol vesicles of the invention
It is particularly advantageously used. Furthermore, since the vesicles of the present invention can be produced without using an organic solvent, they show advantages over ordinary lipid vesicles or liposomes when used in vivo.

生物活性剤である化合物を、本発明のアルファートコ
フェロール小胞体内に取り込むことができる。このよう
な化合物には、ゲンタマイシンのような抗菌性化合物、
リファンパシンのような抗ウィルス性化合物、アンホテ
リシンBのような抗真菌性化合物、アンチモン誘導体の
ような駆虫性化合物、アドリアマイシンのような殺腫瘍
性化合物、抗代謝物質、ペプチド、アルブミンのような
たんぱく質、ジフテリア毒素のような毒素、カタラーゼ
のような酵素、サイクロスポリンAのようなポリペプチ
ド、エストロゲンのようなホルモン、ホルモン拮抗物
質、アセチルコリンのような神経伝達拮抗物質、ヒアル
ロン酸のような糖たんぱく質、アルファートリポたんぱ
く質のようなリポたんぱく質、IgGのような免疫グロブ
リン、インターフェロン又はインターロイキンのような
免疫調節剤、アルセナゾIIIのような染料、14Cのような
放射性標識、90Teのような放射線不透過性化合物、カル
ボキシフルオレセインのような蛍光化合物、エストロゲ
ン受容体たんぱく質のような受容体結合分子、インドメ
タシンのような抗炎症性化合物、ピロカルピンのような
抗緑内障剤、散瞳性化合物、リドカインのような局所麻
酔剤、コデインのような麻酔剤、アルファートコフェロ
ールのようなビタミン、チミンのような核酸、RNAポリ
マーのようなポリヌクレオチド、ジアゼパムのような精
神活性剤又は抗安定剤、単糖類、二糖類又は多糖類等が
あるが、これらに限定されるものではない。取り込むこ
とのできる多くの特定化合物のうちのいくつかを挙げる
と、ピロカルピン;人の成長ホルモン、牛の成長ホルモ
ン及び豚の成長ホルモンのようなポリペプチド成長ホル
モン;インドメタシン;ジアゼパム;アルファートコフ
ェロールそれ自体及びチロシンがある。抗真菌性化合物
には、ミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、
イソコナゾール、チオコナゾール、ビフォナゾール、ク
ロトリマゾール、ケトコナゾール、ブタコナゾール、イ
トラコナゾール、オキシコナゾール,フェンチコナゾー
ル、ナイスタチン、ナフチファイン、アンホテリシン
B、ジノコナゾール及びシクロピロックスオラミンがあ
り、ミコナゾール又はテルコナゾールが好ましい。2つ
又はそれ以上の化合物を同時に取り込むことは、それら
の化合物が捕足的又は相乗的効果を奏する場合には、特
に望ましいかもしれない。リポソームに入れて投与され
る薬剤の量は、一般に遊離薬剤の場合と同じであろう
が、投与回数は少なくなるかもしれない。
Compounds that are bioactive agents can be incorporated into the alpha-tocopherol vesicles of the invention. Such compounds include antimicrobial compounds such as gentamicin,
Antiviral compounds such as rifampin, antifungal compounds such as amphotericin B, anthelmintic compounds such as antimony derivatives, tumoricidal compounds such as adriamycin, antimetabolites, peptides, proteins such as albumin, diphtheria Toxins such as toxins, enzymes such as catalase, polypeptides such as cyclosporin A, hormones such as estrogen, hormone antagonists, neurotransmission antagonists such as acetylcholine, glycoproteins such as hyaluronic acid, alpha Lipoproteins such as trypoproteins, immunoglobulins such as IgG, immunomodulators such as interferon or interleukin, dyes such as arsenazo III, radiolabels such as 14 C, radiopaque such as 90 Te Compound, carboxyfluorescein Such as fluorescent compounds, receptor binding molecules such as estrogen receptor proteins, anti-inflammatory compounds such as indomethacin, anti-glaucoma agents such as pilocarpine, mydriatic compounds, local anesthetics such as lidocaine, and codeine Various anesthetics, vitamins such as alpha-tocopherol, nucleic acids such as thymine, polynucleotides such as RNA polymers, psychoactive or anti-stabilizing agents such as diazepam, monosaccharides, disaccharides or polysaccharides, etc. It is not limited to these. Some of the many specific compounds that can be incorporated are pilocarpine; polypeptide growth hormones such as human growth hormone, bovine growth hormone and pig growth hormone; indomethacin; diazepam; alpha tocopherol itself and There is tyrosine. Antifungal compounds include miconazole, terconazole, econazole,
There are isoconazole, thioconazole, bifonazole, clotrimazole, ketoconazole, butaconazole, itraconazole, oxyconazole, fenticonazole, nystatin, naphthyfine, amphotericin B, dinoconazole and ciclopirox olamine, with miconazole or terconazole being preferred. The simultaneous incorporation of two or more compounds may be particularly desirable where those compounds exert a captive or synergistic effect. The amount of drug administered in the liposome will generally be the same as for the free drug, but may be administered less frequently.

アルファートコフェロール小胞体に取り込まれるかあ
るいはそれと会合している薬剤は、非経口接種又注射
(例えば静脈注射、腹膜注射、筋肉注射、皮下注射、耳
内注射、乳房内注射等)、局所的適用(例えば目、皮膚
のような部分の上に、耳内に、又は傷及び火傷のような
患部の上に)及び上皮又は粘膜皮膚層からの吸収(例え
ば鼻、口、膣、直腸、胃腸の粘膜等)を含む適当な経路
により、生体内に投与されることができるが、これらに
限定されるものではない。
Drugs that are taken up or associated with alpha-tocopherol vesicles can be injected parenterally or injected (eg, intravenous, peritoneal, intramuscular, subcutaneous, intra-aural, intramammary, etc.), topically ( Absorption from the epithelial or mucosal skin layers (eg, nose, mouth, vagina, rectum, gastrointestinal mucosa), for example on parts like eyes, skin, in ears or on affected areas such as wounds and burns And the like, can be administered in vivo by any suitable route, including, but not limited to.

これらの使用の別の例においては、アルファートコフ
ェロール小胞体に取り込まれた化合物を、脂質小胞体又
はリポソーム、ゲル、オイル、エマルジョン等を含む広
い範囲の物質に取り入れることができるが、これらに限
定されるものではない。例えば、任意のタイプのリポソ
ーム生成物(例えばリン脂質SPLV、MPV、FATMLV、MLV、
SUV、LUV、REV及びその他)における成分として、取り
込まれた化合物を含む懸濁液を水相に添加してもよい。
これによって、水不溶性化合物がリン脂質リポソームに
取り込まれる。
In another example of these uses, compounds incorporated into alpha-tocopherol vesicles can be incorporated into lipid vesicles or a wide range of substances including, but not limited to, liposomes, gels, oils, emulsions, and the like. Not something. For example, any type of liposome product (eg, phospholipids SPLV, MPV, FATMLV, MLV,
As a component in SUVs, LUVs, REVs and others), a suspension containing the incorporated compound may be added to the aqueous phase.
Thereby, the water-insoluble compound is incorporated into the phospholipid liposome.

本発明のアルファートコフェロール小胞体は、1985年
9月10日出願で、表題が“ステロイダルリポソーム”で
ある同時係属米国特許出願番号第773,429号(関連米国
特許第4,891,208号)に記載されている如き、コレステ
ロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩小胞体のような
ステロールの有機酸誘導体の塩の小胞体と共に、有利に
使用することができる。このようなステロイドのリポソ
ームは、二重層膜小胞体を形成し、多分ユニラメラ又は
マルチラメラであり、生物活性剤である化合物を取り込
むことができる。
The alpha-tocopherol vesicles of the present invention are described in co-pending U.S. Patent Application No. 773,429, filed September 10, 1985, entitled "Steroidal Liposomes" (Related U.S. Patent No. 4,891,208). It can be used advantageously with the vesicles of salts of organic acid derivatives of sterols, such as the vesicles of the cholesterol succinic acid hemiester tris salts. Such steroid liposomes form bilayer vesicles, are probably unilamellar or multilamellar, and can incorporate compounds that are bioactive agents.

一般に、有機酸の結合によって改質されうるステロー
ルであれば、用いることができる。例えば、そのような
ステロールには、コレステロール、ビタミンD、フィト
スアロール(シトステロール、カンペステロール、スチ
グマステロール等を含むが、これらに限定されるもので
はない)、ステロイドホルモン等があるが、これらに限
定されるものではない。
Generally, any sterol that can be modified by the binding of an organic acid can be used. For example, such sterols include, but are not limited to, cholesterol, vitamin D, phytosalol (including, but not limited to, sitosterol, campesterol, stigmasterol, and the like), steroid hormones, and the like. It is not limited.

ステロールを誘導体化するのに用いることのできる有
機酸としては、前述のようなアルファートコフェロール
を誘導体化するのに用いる有機酸が挙げられる。
Organic acids that can be used to derivatize sterols include the organic acids used to derivatize alpha-tocopherol as described above.

有機酸は、通常の方法を用い、エステル又はエーテル
結合を介して、ステロールのヒドロキシル基に結合され
ることができる(例えば、米国特許第3,859,047号、米
国特許第4,040,784号、米国特許第4,042,330号、米国特
許第4,183,847号及び米国特許第4,189,400号参照)。誘
導体化されたステロールの塩は、ステロールの有機酸誘
導体と塩の対イオン(例えば塩の遊離塩基)の両者を適
当な揮発性溶剤に溶解し、蒸発又は同じような手法で溶
剤を除去して、ステロールの有機酸誘導体の塩から成る
残留物を残すことによって作ることができる。用いるこ
とのできる対イオンには、対応する塩を形成するトリ
ス、2−アミノ−2−メチル−1、3−プロパンジオー
ル、2−アミノエタノール、ビス−トリスプロパン、ト
リエタノールアミン等があるが、これらに限定されるも
のではない。事実、ミコナゾール遊離塩基等のようなイ
オン化しうる生物活性剤の遊離塩基を、対イオンとして
用いることができる。このように、生物活性剤を、対イ
オンとして用いることができる。
The organic acid can be attached to the sterol hydroxyl group via an ester or ether linkage using conventional methods (e.g., U.S. Patent No. 3,859,047, U.S. Patent No. 4,040,784, U.S. Patent No. 4,042,330, See U.S. Pat. Nos. 4,183,847 and 4,189,400). Derivatized sterol salts are prepared by dissolving both the sterol organic acid derivative and the salt counterion (eg, the free base of the salt) in a suitable volatile solvent and removing the solvent by evaporation or a similar technique. Can be made by leaving a residue consisting of salts of organic acid derivatives of sterols. Counterions which can be used include tris, 2-amino-2-methyl-1, 3-propanediol, 2-aminoethanol, bis-trispropane, triethanolamine, etc. which form the corresponding salt, It is not limited to these. In fact, the free base of an ionizable bioactive agent, such as miconazole free base, can be used as a counterion. Thus, a bioactive agent can be used as a counterion.

本発明の小胞体において、ステロールの有機酸誘導体
をアルファートコフェロールと共に用いる場合は、アル
ファートコフェロールに対するステロールの比は、0:10
0〜100:0モル%で用いられる。
In the endoplasmic reticulum of the present invention, when an organic acid derivative of sterol is used together with alpha-tocopherol, the ratio of sterol to alpha-tocopherol is 0:10.
It is used at 0 to 100: 0 mol%.

本発明のアルファートコフェロール小胞体は、種々の
物質を可溶化するために、従来のリポソームと共に用い
ることもできる。物質を、まずアルファートコフェロー
ル小胞体内に取り入れ、かくして取り込まれたものを、
リポソーム内に取り入れることができる。一方、可溶化
しようとする物質が、2種類の小胞体を作るのに必要と
するすべての物質と共に、始めに存在していてもよい。
The alpha-tocopherol vesicles of the present invention can also be used with conventional liposomes to solubilize various substances. The substance is first taken into the alphatocopherol vesicles,
It can be incorporated into liposomes. On the other hand, the substance to be solubilized may initially be present, together with all the substances required to make the two vesicles.

生成物の特殊な性質による他の用途については、当業
者が想像できるであろう。例えば、本発明のアルファー
トコフェロールコハク酸ヘミエステル小胞体は、2価の
カチオンに対する感度が高いので、生体内での比色診断
法に使用するために、2価のカチオンに鋭敏な支持染料
を取り込んで作られることができる。
Other uses for the particular properties of the product will occur to those skilled in the art. For example, the alpha-tocopherol succinic acid hemiester vesicles of the present invention are highly sensitive to divalent cations, and thus incorporate a support dye sensitive to divalent cations for use in in vivo colorimetric diagnostics. Can be made.

次の実施例は、説明のために示すもので、発明の範囲
を限定するために示すものではない。
The following examples are provided for illustrative purposes and are not intended to limit the scope of the invention.

実施例 1 アルフェートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリ
ス塩の製造 アルファートコフェロール水素コハク酸エステル〔シ
グマ ケミカル カンパニー(Sigma Chemical Co.)、
ミズリー州、セントルイス〕5グラムをジエチルエーテ
ル100mlに溶解した。次いで、約5mlの水に溶かしたトリ
ス塩基〔フッシャー(Fisher)社、ニュージャージー
州、フェアローン〕(1.14g)を0.5mlずつ撹拌又は振と
うしながらエーテル溶液に加えた。その溶液を回転蒸発
乾固し、次いで、更に高真空下で乾燥して、ゴム状の黄
色残留物の形で題記化合物を作った。
Example 1 Preparation of Tris Salt of Alcotocopherol Hemisuccinate Alphatocopherol hydrogen succinate [Sigma Chemical Co.,
5 g of St. Louis, Mo.) was dissolved in 100 ml of diethyl ether. Tris base (Fisher, Fairlawn, NJ) (1.14 g) dissolved in about 5 ml of water was then added to the ether solution with stirring or shaking in 0.5 ml portions. The solution was rotary evaporated to dryness and then further dried under high vacuum to yield the title compound in the form of a gummy yellow residue.

実施例 2 アルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリ
ス塩の製造 熱水3ml中のトリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタ
ン2.28gを、500mlの丸底フラスコ中にて塩化メチレン10
0mlにD−アルファートコフェロール酸性コハク酸エス
テル10gを25℃で溶かした溶液に、かきまぜながら添加
した。反応混合物は、恒温槽で55℃に15分間維持しなが
ら、ロータリエバポレータで回転させた。
Example 2 Preparation of Tris Salt of Alpha-Tocopherol Succinic Acid Hemiester 2.28 g of tris [hydroxymethyl] aminomethane in 3 ml of hot water was mixed with 10 ml of methylene chloride in a 500 ml round bottom flask.
To a solution of 10 g of D-alpha-tocopherol acidic succinate in 0 ml at 25 ° C. was added with stirring. The reaction mixture was rotated on a rotary evaporator while maintaining at 55 ° C. for 15 minutes in a thermostat.

溶剤を減圧下で除去し、生成物質を24時間凍結させ
た。この物質を取り出し、乳鉢と乳棒ですり砕き、過剰
溶剤を24時間真空下で除去した。生成題記化合物(4.8
g)を、密閉ガラスびん中に保存し、遮光した。
The solvent was removed under reduced pressure and the product was frozen for 24 hours. The material was removed, triturated with a mortar and pestle, and excess solvent was removed under vacuum for 24 hours. Generated title compound (4.8
g) was stored in a closed vial and protected from light.

若しくは、この物質を48時間凍結させた。 Alternatively, this material was frozen for 48 hours.

別の製造方法においては、溶剤を凍結乾燥により除去
した。
In another manufacturing method, the solvent was removed by lyophilization.

実施例 3 アルファートコフェロール小胞体へのアルセナゾIII(A
rsenazo III)の取り込み 上述のようにして調製したアルファートコフェロール
コハク酸ヘミエステルのトリス塩100ミリグラムを、0.0
1Mトリス−HCl、0.14M NaCl及び4.5mMアルセナゾIII(A
rsenazo III)をすべてpH7.3で含有する溶液1mlに加
え、3mmのガラスビーズの存在下で懸濁液を旋回混合し
た。生成したアルファートコフェロールコハク酸エミエ
ステルのトリス塩小胞体を、10,000xgで15分間遠心分離
することによって、ペレット化し、その後、ペレットを
洗浄し、0.01Mトリス−HCl及び0.14M NaClを含むpH7.3
の溶液10ml中で3回再遠心分離した。生成ペレットは、
アルセナゾIIIの取り込みにより赤色を呈した。取り込
み度は、30%と測定された。
Example 3 Arsenazo III (A) to alpha-tocopherol ER
Incorporation of 100 mg of Tris salt of alpha-tocopherol succinic acid hemiester prepared as above
1M Tris-HCl, 0.14M NaCl and 4.5mM Arsenazo III (A
rsenazo III) was added to 1 ml of a solution containing all at pH 7.3 and the suspension was swirled in the presence of 3 mm glass beads. The resulting Tris salt vesicles of alpha-tocopherol succinic acid succinate are pelleted by centrifugation at 10,000 xg for 15 minutes, after which the pellet is washed and pH 7.3 containing 0.01 M Tris-HCl and 0.14 M NaCl.
Was re-centrifuged three times in 10 ml of the solution. The resulting pellet is
Red color was exhibited by the incorporation of Arsenazo III. The degree of incorporation was measured as 30%.

実施例 4 プログナノロン(Pregnanolone)の可溶化 アルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのト
リス塩50mg、コレステロールコハク酸ヘミエステルのト
リス塩50mg及び5−β−プレグナン−3−オール−20−
オン〔カビビトラム(KabiVitrum)社、スエーデン、ス
トックホルム)20mgを過剰量のメタノールに加え、丸底
フラスコ中で真空下に乾燥した。次いで、140mM NaClを
含むpH7.4の10mMトリス−HCl緩衝液1.0ml中に、ガラス
ビーズの存在下で、強固なゲルが形成されるまで振とう
しながら、生成フィルムを再懸濁させた。ブランソン
(Branson)E−モデュール(40KHZ)5ガロン水浴音波
発生器で、広範な音波処理を行うことによって、ゲルの
粘度を低下させ、直径が0.2〜0.4ミクロンの小胞体を生
成した。
Example 4 Solubilization of Prognanolone 50 mg of alpha-tocopherol succinic acid hemiester tris salt, 50 mg of cholesterol succinic acid hemiester tris salt and 5-β-pregnan-3-ol-20-
20 mg of ON (KabiVitrum, Stockholm, Sweden) was added to excess methanol and dried in a round bottom flask under vacuum. The resulting film was then resuspended in 1.0 ml of 10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 140 mM NaCl, in the presence of glass beads, with shaking until a firm gel was formed. Extensive sonication with a Branson E-Module (40 KHZ) 5 gallon water bath sonicator reduced the gel viscosity and produced vesicles 0.2-0.4 microns in diameter.

コレステロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩を次
のようにして調製した。オハイオ州、クリーブランドの
ICN社製のコレステロール水素コハク酸エステル(50.3
g、0.11モル)を1.5のジエチルエーテルに溶解した。
ニュージャージー州、フェアローンのフィッシャー(Fi
sher)社製のトリス塩(12.1g、0.1モル)を30mlの水に
溶解した。次いで、トリス溶液をコレステロール溶液に
加え、生成溶液を回転蒸発させて、乳状湿潤残留物とし
た。乳状残留物を12時間凍結乾燥し、その後、約5リッ
トル容量の沸とう酢酸エチルから、コレステロールコハ
ク酸ヘミエステルのトリス塩生成物を3回再結晶化させ
た。
A tris salt of cholesterol succinic acid hemiester was prepared as follows. Ohio, Cleveland
Cholesterol hydrogen succinate (50.3) manufactured by ICN
g, 0.11 mol) was dissolved in 1.5 diethyl ether.
Fairlawn Fisher, New Jersey
Sher) (12.1 g, 0.1 mol) was dissolved in 30 ml of water. The Tris solution was then added to the cholesterol solution and the resulting solution was rotary evaporated to a milky wet residue. The milky residue was lyophilized for 12 hours, after which the tris salt product of cholesterol succinic acid hemiester was recrystallized three times from a volume of about 5 liters of boiling ethyl acetate.

沸とう酢酸エチル溶液を熱いうちに濾過し、室温にま
で冷却した。ゲル状コレステロールコハク酸ヘミエステ
ルのトリス塩が生じ、100mlの焼結がガラス漏斗でそれ
を濾過し、酢酸エチルを除去した。溶剤の最初の除去
は、圧搾によった。別の製造法においては、最初の溶剤
除去を機械的圧縮によって行った。更に、0.1mmHgの真
空下で12時間溶剤除去を行った。その時、銀貨の大きさ
の23gの円板の形をした固くてもろい白色物質が認めら
れた。
The boiling ethyl acetate solution was filtered while hot and cooled to room temperature. A gel-like cholesterol succinic acid hemiester tris salt formed and a 100 ml sinter filtered it through a glass funnel to remove ethyl acetate. Initial removal of the solvent was by squeezing. In another manufacturing method, the initial solvent removal was performed by mechanical compression. Further, the solvent was removed under a vacuum of 0.1 mmHg for 12 hours. At that time, a hard, brittle white substance in the form of a 23-g disk of silver coin size was observed.

白色円板を乳鉢と乳棒で粉末にして、その物質を50℃
に加熱し、0.1mmHgの真空にすることによって、酢酸エ
チルの最後の痕跡を除去した。生成粉末55mgを、0.14M
NaClを含むpH7.4の0.01Mトリス−HCl緩衝液1.0ml中に懸
濁させた。乳状の懸濁液が生じ、それを水浴音波発生器
で音波処理して、透明なコレステロールコハク酸ヘミエ
ステルのトリス塩小胞体溶液を作った。
Powder the white disc with a mortar and pestle and bring the substance to 50 ° C.
And the last traces of ethyl acetate were removed by applying a vacuum of 0.1 mmHg. 55 mg of the resulting powder, 0.14M
The suspension was suspended in 1.0 ml of 0.01 M Tris-HCl buffer containing NaCl at pH 7.4. A milky suspension formed, which was sonicated with a water bath sonicator to produce a clear cholesterol succinate hemiester tris salt vesicle solution.

実施例 5 サイクロスポリンA(Cyclosporin A)の可溶化 サイクロスポリンA〔サンドズ、インコーポレイテッ
ド(Sandoz,Inc.)、ニュージャージー州、イーストハ
ノーバー〕、コレステトロールコハク酸ヘミエステルの
トリス塩及びアルファートコフェロールコハク酸ヘミエ
ステルのトリス塩を、第1表に示した相対割合でメタノ
ールに溶解した。
Example 5 Solubilization of Cyclosporin A Cyclosporin A (Sandoz, Inc., East Hanover, NJ), Tris salt of cholesterol succinic hemiester and alpha tocopherol succinic acid Hemiester tris salts were dissolved in methanol in the relative proportions shown in Table 1.

最終水性懸濁液の容量を0.25mlにするのに十分な量の
溶液の一部分を、13×100mmの試験管中で、試験管を70
℃の水浴中の500ml丸底フラスコに入れ、回転蒸発で溶
剤を除去することによって乾燥して、薄いフィルムにし
た。
A portion of the solution, sufficient to bring the final aqueous suspension volume to 0.25 ml, was placed in a 13 x 100 mm test tube,
Placed in a 500 ml round bottom flask in a water bath at 0 ° C. and dried to a thin film by removing the solvent by rotary evaporation.

このようにして得たフィルムに、0.14M NaClを含むpH
7.3の0.01Mトリス−HCl緩衝液0.25mlを加え、ガラスビ
ーズの存在下で懸濁液を旋回混合させながら、フィルム
を再水和させた。
The film obtained in this manner is adjusted to pH containing 0.14 M NaCl.
0.25 ml of 7.3 0.01 M Tris-HCl buffer was added and the film was rehydrated while swirling the suspension in the presence of glass beads.

第1表に挙げた種々の条件下で、顕微鏡観察によりサ
イクロスポリンA結晶の有無を調べ、その結果を第1図
に示した。第1図に示すように、コレステロールコハク
酸ヘミエステルのトリス塩及び/又はアルファートコフ
ェロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩の濃度が低す
ぎる場合は、サイクロスポリンAの結晶が観察された。
Under the various conditions listed in Table 1, the presence or absence of cyclosporin A crystals was examined by microscopic observation, and the results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, when the concentration of the tris salt of cholesterol succinic acid hemiester and / or the tris salt of alpha-tocopherol succinic acid hemiester was too low, crystals of cyclosporin A were observed.

60℃の水浴を使用して実験を繰り返した。その結果を
第2図に示す。
The experiment was repeated using a 60 ° C. water bath. The result is shown in FIG.

実施例 6 ミコナゾールの可溶化 ミコナゾール遊離塩基(MCZ)、コレステロールコハ
ク酸ヘミエステルのトリス塩(CHS)及びD−アルファ
ートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩(TH
S)の貯蔵溶液を、無水エタノールの50ml溶液として調
製した。
Example 6 Solubilization of miconazole Miconazole free base (MCZ), cholesterol succinic hemiester tris salt (CHS) and D-alpha-tocopherol succinic hemiester tris salt (TH
A stock solution of S) was prepared as a 50 ml solution of absolute ethanol.

貯蔵溶液の適量を、50mlの丸底フラスコにピペットで
入れた。各フラスコには、第2表に示した相対割合で、
合計0.1mmolの物質が含まれていた。
An appropriate amount of the stock solution was pipetted into a 50 ml round bottom flask. Each flask has the relative proportions shown in Table 2,
A total of 0.1 mmol of material was included.

60℃での回転蒸発により、溶剤を除去した。次いで、
0.01Mトリス−HClを含むpH7.4の0.15M NaCl1.0mlに、物
質を再懸濁させた、生成物について、2週間以上にわた
り、ミコナゾール結晶の形跡を顕微鏡で、また相分離の
形跡を肉眼で調べた。結晶も相分離も観察されなけれ
ば、生成物は満足なものであると判定された(第3図参
照)。
Solvent was removed by rotary evaporation at 60 ° C. Then
The material was resuspended in 1.0 ml of 0.15 M NaCl, pH 7.4, containing 0.01 M Tris-HCl. For more than 2 weeks, the product was observed microscopically for evidence of miconazole crystals and macroscopically for evidence of phase separation. I checked in. If no crystals or phase separation were observed, the product was deemed satisfactory (see FIG. 3).

実施例 7 下垂体を切除したラットへの牛成長ホルモンの持続供給 本発明の可溶化性及び徐放出特性を実証するために、
牛成長ホルモン(BGH)が会合した2つのタイプの小胞
体を調製した。一つのタイプの小胞体は、卵ホスファチ
ジルコリン(EPC又はレシチン)及びBGHと会合したアル
ファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩
を含んでいた。もう一方の小胞体は、同じ成分に加え
て、卵ホスファチヂルエタノールアミン(EPE)を含ん
でいた。
Example 7 Sustained Supply of Bovine Growth Hormone to Hypophysectomized Rats To demonstrate the solubilizing and sustained release properties of the present invention,
Two types of endoplasmic reticulum associated with bovine growth hormone (BGH) were prepared. One type of endoplasmic reticulum contained egg phosphatidylcholine (EPC or lecithin) and the tris salt of alpha-tocopherol succinate hemiester associated with BGH. The other endoplasmic reticulum contained egg phosphatidylethanolamine (EPE) in addition to the same components.

EPEが存在しない小胞体は、次のようにして調製し
た。溶剤相は、37℃での回転蒸発により、〔EPCシグマ
ケミカル カンパニー(Sigma Chemical Co.)、ミズ
リー州、セントルイス〕400mgを含むクロロホルム溶液
から溶剤を除去して調製した。次いで残留物をジエチル
エーテル5mlに溶解した。アルファートコフェロール小
胞体と会合したBGHを含む水相は、0.14M NaClを含むpH
7.4の0.01Mトリス−HCl1mlにアルファートコフェロール
のコハク酸ヘミエステル25mgを加えることによって調製
した。不透明な懸濁液が生じ、それを、500nmにおいて
0.3と0.6との間の光学濃度が得られるまで、上述のよう
に音波処理して、透明にした。0.3の示度が好ましい。
粉末BGH〔イーライリリィ(Eli Lilly)社、インディア
ナ州、インディアナポリス〕28mgを、粉末を分散させる
ために短時間の音波処理を行って旋回させることによ
り、0.3mlの小胞体生成物に添加した。乳状懸濁液が生
じ、それは粉末そのままの形跡を示さなかった。この水
相懸濁液を溶剤相に滴下した。その場合、かき乱されな
ければ、液滴は沈み、不透明な底層を作るであろう。
The endoplasmic reticulum without EPE was prepared as follows. The solvent phase was prepared by removing the solvent from a chloroform solution containing 400 mg [EPC Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.] by rotary evaporation at 37 ° C. Then the residue was dissolved in 5 ml of diethyl ether. The aqueous phase containing BGH associated with alpha-tocopherol vesicles is pH adjusted with 0.14M NaCl.
Prepared by adding 25 mg of succinic acid hemiester of alpha-tocopherol to 1 ml of 0.01 M Tris-HCl at 7.4. An opaque suspension forms, which at 500 nm
Sonication was performed as described above until an optical density between 0.3 and 0.6 was obtained, which was clarified. A reading of 0.3 is preferred.
28 mg of powdered BGH (Eli Lilly, Indianapolis, IN) was added to 0.3 ml of endoplasmic reticulum product by swirling with brief sonication to disperse the powder. A milky suspension resulted, which did not show any evidence of a powder as such. This aqueous phase suspension was dropped into the solvent phase. If not disturbed, the droplets would sink and create an opaque bottom layer.

しかしながら、溶剤相への水相の添加に関し、容器上
にチッ素気流を流しながらエーテル相中の水滴を音波処
理することによって、安定なマルチラメラ小胞体〔SPL
V、レンク等(Lenk et al.)、米国特許第4.522.803
号〕の形成が促進された。溶剤を蒸発させ、ペーストを
残し、最終濃度の10mM CaCl2を含む上記トリス−HCl緩
衝液10ml中でそれを再水和させた。カルシウムは、アル
ファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩
によって与えられた電荷を中和し、遠心分離におけるリ
ポソームの強固なペレット化を促進した。ゆっくり旋回
混合することによって、再水和が促進された。
However, regarding the addition of the aqueous phase to the solvent phase, stable multilamellar vesicles (SPL) can be obtained by sonicating water droplets in the ether phase while flowing a nitrogen stream over the vessel.
V, Lenk et al., US Patent No. 4.522.803.
No.] was promoted. The solvent was evaporated, leaving a paste, was it rehydrated the above Tris -HCl buffer 10ml containing 10 mM CaCl 2 final concentration. Calcium neutralized the charge imparted by the tris salt of alpha-tocopherol succinate hemiester and promoted strong liposome pelleting on centrifugation. Slow vortexing promoted rehydration.

生成SPLVsを、10,000×gで10分間遠心分離してペレ
ット化し、4バッチからのペレットをプールして、トリ
ス−HCl/カルシウム緩衝液で更に2回洗浄した。上澄み
液をデカントして粘性ペレットを残し、その約0.5ml部
を以下の研究に使用した。
The resulting SPLVs were pelleted by centrifugation at 10,000 xg for 10 minutes, and the pellets from the four batches were pooled and washed twice more with Tris-HCl / calcium buffer. The supernatant was decanted to leave a viscous pellet, about 0.5 ml of which was used for the following studies.

EPEを更に含有する小胞体は、EPC 1.54を含むクロロ
ホルム溶液とEPE〔アバンティ ポーラー リピッズ、
インコーポレイテッド(Avanti Polar Lipids,Inc.)、
アラバマ州、バーミンガム〕52.8mgを含むクロロホルム
溶液とを丸底フラスコ中で混合し、37℃での回転蒸発に
よってクロロホルムを除去して調製した。生成乾燥脂質
フィルムを20mlのジエチルエーテルを溶解し、アルファ
ートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩小胞
体を会合したBGMを含む水相を添加した。
The endoplasmic reticulum further containing EPE is a chloroform solution containing EPC 1.54 and EPE [Avanti Polar Lipids,
Inc. (Avanti Polar Lipids, Inc.),
Birmingham, Alabama] was prepared by mixing a chloroform solution containing 52.8 mg in a round bottom flask and removing the chloroform by rotary evaporation at 37 ° C. The resulting dried lipid film was dissolved in 20 ml of diethyl ether and an aqueous phase containing BGM associated with tris salt vesicles of alpha-tocopherol succinic acid hemiester was added.

水相は、0.14M NaClを含むpH7.4の0.01Mトリス−HCl
緩衝液の25mg/mlアルファートコフェロールコハク酸ヘ
ミエステルトリス塩液1.2mlに、112mgのBGHを可溶化す
ることによって調製した。アルファートコフェロール懸
濁液を、前もって40,000ポンド/平行インチの圧力でフ
レンチ圧力セルプレス〔エス エム エル インストル
メンツ、インコーポレィテッド(SLM Instruments,In
c.)、イリノイ州、アーバナ〕に通し、550nmにおける
光学濃度を0.3〜0.6にした。
The aqueous phase was 0.01 M Tris-HCl at pH 7.4 containing 0.14 M NaCl.
Prepared by solubilizing 112 mg of BGH in 1.2 ml of 25 mg / ml alphatocopherol succinic acid hemiester tris salt in buffer. The alphatocopherol suspension was previously prepared at a pressure of 40,000 pounds / parallel inch by a French pressure cell press [SML Instruments, Inc. (SLM Instruments, Incorporated).
c.), Urbana, Illinois] to give an optical density at 550 nm of 0.3-0.6.

上述のように、チッ素下で音波処理しながら、エーテ
ル相に水相を加えることによって、粘性のSPLVペースト
が作られ、0.01Mトリス、0.14M NaCl及び10mM CaCl2
含むpH7.4の緩衝液20mlでそれを再水和させた。再水和
は、ガラスビーズの存在下で旋回混合しながら行われ
た。生成リポソームを合計20mlの上記緩衝液で3回洗浄
し、JA−14ロータを用いたバックマン(Backman J2−21
遠心分離機で、10,000rpmにて45分間遠心分離した。生
成した粘性ペレットの約0.5ml部を以下の研究に使用し
た。
As described above, while sonicated under nitrogen for, by adding water phase in ether phase, the viscosity of the SPLV paste made, buffering pH7.4 containing 0.01M Tris, 0.14 M NaCl and 10 mM CaCl 2 It was rehydrated with 20 ml of liquid. Rehydration was performed with orbital mixing in the presence of glass beads. The resulting liposomes were washed three times with a total of 20 ml of the above buffer solution, and then washed with a Backman J2-21 using a JA-14 rotor.
Centrifugation was performed at 10,000 rpm for 45 minutes in a centrifuge. Approximately a 0.5 ml portion of the resulting viscous pellet was used for the following studies.

小胞体の徐放性を、マサチューセッツ州、ウィルミン
グトンのチャールズ リバー ブリーディング ラブラ
トリィズ インコーポレィテッド(Charles River Bree
ding Laboratories,nc.)から生後25日の雌の下垂体切
除ラットで調べた。到着時に動物の体重を測り、2日間
5%グルコースの規定食を取らせ、その後、任意に水と
ラット用食事に切り替えた。動物の体重を生後32日と39
日に測り、この期間中に10g以上増えたものは、下垂体
切除が不完全なものとして除外した。次いで、8匹の動
物のグループに、遊離BGH又は小胞体調製物のうちの一
つに取り込まれたBGHを、筋肉注射(I.M.)又は皮下注
射(S.C.)した。遊離BGHを与える動物には、毎日S.C.
を行った。一方、小胞体会合BGHを与える動物には、第
4図に示したルートで、EPC/EPE製剤に関しては約9.8mg
の会合ホルモン(小胞体製造中に70%会合と推定)を、
又、5.6mg(EPC製剤に関しては会合40%と推定される)
を、最初の日に一回だけ注射した。比較動物には、処理
を施さなかった。データは、各グループの8匹の動物に
ついての平均体重変化値を示す。
Sustained release of the endoplasmic reticulum was confirmed by Charles River Breeze, Inc., of Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, Mass.
ding Laboratories, nc.) in female hypophysectomized rats at 25 days of age. Upon arrival, animals were weighed and fed a 5% glucose diet for 2 days, after which they were switched to water and rat diet ad libitum. Animal weight 32 days and 39
Measured daily and those that gained more than 10 g during this period were excluded as incomplete pituitary resections. Groups of eight animals were then injected intramuscularly (IM) or subcutaneously (SC) with free BGH or BGH incorporated into one of the ER preparations. Animals receiving free BGH receive SC daily.
Was done. On the other hand, for animals receiving endoplasmic reticulum-associated BGH, the route shown in FIG.
Association hormone (estimated 70% associated during ER production)
5.6mg (assumed to be 40% of association for EPC products)
Was injected only once on the first day. Control animals received no treatment. The data shows the average weight change value for 8 animals in each group.

第4図に示す略号は次の通りである。(1)EPC:EPE/
−THS−BGH S.C.は、卵ホスファチジルコリン、卵ホス
ファチジルエターノールアミン及びアルファートコフェ
ロールコハク酸ヘミエステルのトリス塩を含む小胞体と
会合した牛成長ホルモンが、皮下に投与されたことを意
味する。(2)EPC/−THS−BGH S.C.は、卵ホスファチ
ジルコリン及びアルファートコフェロールコハク酸ヘミ
エステルのトリス塩を含む小胞体(卵ホスファチジルエ
タノールアミンは存在しない)と会合した牛成長ホルモ
ンが、皮下に投与されたことを意味する。(3)EPC/−
THS−BGH I.M.は、筋肉内に投与することを除けば、
(2)と同じである。
The abbreviations shown in FIG. 4 are as follows. (1) EPC: EPE /
-THS-BGH SC means that bovine growth hormone associated with the endoplasmic reticulum containing egg phosphatidylcholine, egg phosphatidylethanolamine and the tris salt of alpha-tocopherol succinate hemiester was administered subcutaneously. (2) EPC / -THS-BGH SC was administered subcutaneously with bovine growth hormone associated with endoplasmic reticulum containing egg phosphatidylcholine and tris salt of alpha-tocopherol succinic acid hemiester (egg phosphatidylethanolamine is not present). Means (3) EPC / −
THS-BGH IM, except for intramuscular administration,
Same as (2).

第4図に示すように、本処理比較動物は、実験過程で
目立った体重増加を示さなかった。遊離BGHによって、
著しい成長が生じたが、遊離BGHの投与は、毎日行われ
た。種々の会合BGH−小胞体調製物によって生ずる成長
促進は、幾分低いが、これらの生成物をたった1回注射
するだけであるという事実を考えると、顕著なものであ
った。EPC:EPE/THS小胞体と会合したBGHを皮下に投与し
た場合に、最良の結果が認められた。
As shown in FIG. 4, the treated animals did not show significant weight gain during the course of the experiment. By free BGH,
Administration of free BGH occurred daily, although significant growth occurred. The growth promotion produced by the various associated BGH-ER preparations, although somewhat lower, was significant given the fact that only one injection of these products was made. The best results were seen when BGH associated with EPC: EPE / THS ER was administered subcutaneously.

実施例 8 アルファートコフェロールコハク酸ヘミエステルのトリ
ス塩の溶質取り込み 第3表に示す種々の量のD−アルファートコフェロー
ルコハク酸ヘミエステルのトリス塩(“トリス塩”)粉
末を、5マイクロリットルの51Crを添加した0.01Mトリ
ス/0.14M NaCl緩衝液(pH7.4)5.0ml量ずつに、丸底フ
ラスコ中で加てた。懸濁液を2分間かきまぜて、トリス
塩を溶解し、2時間静置して、MLVを形成した。一方、
トーマスサイエンティフィック スペクトレイパー(Th
omas Scientific Spectrapor)12,000MWCO1/4″透析チ
ューブを7インチの長さに切り、蒸溜水を2回とりかえ
ながら1時間煮沸した。バッグを一端でしばり、各MLV
生成物から1.0mlをバッグ内にピペットで入れた。バッ
グを上端でプラスチックファスナーにより閉じ、ティー
エムエーナリティック(TMA nalytic)モデル1191ガン
マカウンターで、1分間放射能を計測した。次いで、10
0mlのトリス/NaClの緩衝液中で、撹拌しながら、各バッ
グを透析した。6時間後、透析物を新しい緩衝液と交換
した。透析は、20時間継続した。次いで、バッグの放射
能を計測し、取り込まれた51Crのパーセントを次のよう
にして計算した。
Example 8 Solute Incorporation of Tris Salt of Alpha-Tocopherol Succinate Hemiester Various amounts of the D-alpha-tocopherol succinate hemiester tris salt ("Tris salt") powder shown in Table 3 were added with 5 microliters of 51 Cr. 5.0 ml of the 0.01 M Tris / 0.14 M NaCl buffer (pH 7.4) was added in a round bottom flask. The suspension was stirred for 2 minutes to dissolve the Tris salt and allowed to stand for 2 hours to form MLV. on the other hand,
Thomas Scientific Spectra (Th
omas Scientific Spectrapor) 12,000 MWCO 1/4 "dialysis tubing was cut into 7 inch lengths and boiled for 1 hour with 2 changes of distilled water.
1.0 ml from the product was pipetted into the bag. The bag was closed at the top with a plastic zipper and the radioactivity was counted for 1 minute on a TMA nalytic model 1191 gamma counter. Then 10
Each bag was dialyzed in 0 ml of Tris / NaCl buffer with stirring. After 6 hours, the dialysate was replaced with fresh buffer. Dialysis continued for 20 hours. The radioactivity of the bag was then measured and the percentage of incorporated 51 Cr was calculated as follows.

捕捉された容量(溶質)値は、次のようにして計算し
た。トリス塩のサンプル量当り3回の試験から得られた
計測数を平均し、計算された取り込みパーセント(上
記)と既知のマイクロリットルで表わされるサンプル容
量(5.0ml=5000μ)とから、脂質のマイクロモル当
りの1/mol51Crを次のようにして計算した。
The captured volume (solute) value was calculated as follows. The counts from three tests per sample volume of Tris salt were averaged, and the percent uptake calculated (above) and the sample volume expressed in known microliters (5.0 ml = 5000μ) were used to calculate the lipid microparticles. 1 / mol 51 Cr per mole was calculated as follows.

結果を第3表に示す。 The results are shown in Table 3.

実施例 9 ピロカルピン−アルファートコフェロールコハク酸ヘミ
エステル ピロカルピン塩基5gを、秤量した500mlの栓付き丸底
フラスコに入れ、全質量をグラムで記録した。D−アル
ファートコフェロール酸性コハク酸エスエル(12.75g、
ピロカルピン:D−アルファートコフェロールの1:1のモ
ル比に相当)フラスコに加え、内容物を再度秤量した。
メチレンクロライド(50ml)を加え、フラスコをかきま
ぜ、固体を溶解させ、フラスコを再度秤量した。フラス
コを、55℃の水浴中のロータリエバポレータに載せ、30
分間回転させた(真空は適用せず)。30分後、フラスコ
と内容物を再度秤量し、次いで、55℃にて真空で回転蒸
発させた。その後、2回の連続した秤量が0.1g以内にな
るまで、フラスコの重量を30分毎に記録した。次いで、
生成物を室温(25℃)に冷却し、栓をして、4℃で貯蔵
した。
Example 9 Pilocarpine-Alphatocopherol succinic acid hemiester 5 g of pilocarpine base was placed in a weighed 500 ml round-bottomed flask with a stopper, and the total mass was recorded in grams. D-alpha-tocopherol acid succinic acid sul (12.75 g,
(Corresponding to a 1: 1 molar ratio of pilocarpine: D-alpha-tocopherol)) and the contents weighed again.
Methylene chloride (50 ml) was added, the flask was stirred, the solids dissolved, and the flask was weighed again. Place the flask on a rotary evaporator in a 55 ° C water bath,
Spin for minutes (no vacuum applied). After 30 minutes, the flask and contents were weighed again, then rotary evaporated in vacuo at 55 ° C. Thereafter, the weight of the flask was recorded every 30 minutes until two consecutive weighings were within 0.1 g. Then
The product was cooled to room temperature (25 ° C), stoppered and stored at 4 ° C.

実施例 10 ピロカルピン−アルファートコフェロールコハク酸ヘミ
エステル 5.0リットルの栓付丸底フラスコ、ピロカルピン塩基3
0g、D−アルファートコフェロールコハク酸エステル
(ピロカルピン:D−アルファートコフェロール1:1のモ
ル比に相当)、及びメチレンクロライド300mlを使用し
て、実施例9の材料、方法で実施した。
Example 10 Pilocarpine-Alphatocopherol succinic acid hemiester 5.0 liter stoppered round bottom flask, pilocarpine base 3
Using the materials and methods of Example 9, using 0 g, D-alpha-tocopherol succinate (corresponding to a molar ratio of pilocarpine: D-alpha-tocopherol 1: 1), and 300 ml of methylene chloride.

実施例 11 ピロカルピン−アルファートコフェロールコハク酸ヘミ
エステルリポソームの製造 上記実施例9の生成物を含む500mlの丸底フラスコを
ロータリエバポレータに載せ、水浴温度を55℃にセット
した。塩を30分間暖めた後、水浴温度を35℃に低下させ
た。0.1%(w/v)ソルビン酸と0.1%(w/v)EDTAナトリ
ウム二水和物の水溶液(92ml)を加え、懸濁液を旋回混
合した。水相を加えて、最終容量を125mlに調節した。
生成リポソームを、CSR(連続サイズ低減)、即ち大き
い容量のリポソームを連続処理して、均一な平均直径を
有するサイズの小さいリポソームを作る方法及び装置で
処理した。
Example 11 Preparation of pilocarpine-alpha-tocopherol succinic acid hemiester liposome A 500 ml round bottom flask containing the product of Example 9 above was placed on a rotary evaporator, and the water bath temperature was set at 55 ° C. After warming the salt for 30 minutes, the water bath temperature was reduced to 35 ° C. An aqueous solution (92 ml) of 0.1% (w / v) sorbic acid and 0.1% (w / v) sodium EDTA dihydrate was added and the suspension was swirled. The final volume was adjusted to 125 ml by adding the aqueous phase.
The resulting liposomes were treated with CSR (continuous size reduction), a method and apparatus for continuously treating large volumes of liposomes to produce small liposomes having a uniform average diameter.

サイズ低減装置は、(a)高圧ピストンポンプ、
(b)所定の細孔サイズを有するイン−ライン フィル
ターエレメント、(c)供給ストック(リポソーム懸濁
液)を入れる貯槽及び(d)処理した供給ストックを集
める貯槽から構成されている。このシステムは、再循環
のために供給容器へ原料を逆流させるか、あるいは処理
収集容器へ流すかを方向づけるバルブユニットを含んで
もよい。これらに限定されるものではないが、ポンプヘ
ッドそれ自身のピストン作用によるポンプヘッドのくみ
上げ、及び/又は外部装置による供給ストックの外部ポ
ンピングを含む任意の通常手段で、供給ストックをポン
プへ供給することができる。ポンプヘッドによって、供
給ストックをフィルターユニットに循環させるエネルギ
ーが与えられる。
The size reduction device is (a) a high pressure piston pump,
It consists of (b) an in-line filter element with a predetermined pore size, (c) a reservoir for the supply stock (liposome suspension) and (d) a reservoir for collecting the treated supply stock. The system may include a valve unit that directs the feed back to the supply vessel for recirculation or to the process collection vessel. Supplying the supply stock to the pump by any conventional means, including but not limited to pumping the pump head by the piston action of the pump head itself and / or externally pumping the supply stock by an external device. Can be. The pump head provides energy to circulate the feed stock to the filter unit.

上記実施例においては、公称細孔サイズが500nmのス
テンレススケールフィルターに、リポソームを10回通し
た。
In the above example, the liposomes were passed 10 times through a stainless steel scale filter with a nominal pore size of 500 nm.

上記方法は、第4表による水相組成物を用いて行われ
た。
The above method was carried out using the aqueous phase composition according to Table 4.

実施例 12 ピロカルピンアルファートコフェロールコハク酸ヘミエ
ステル小胞体のサイズ測定検討 実施例11の生成物を、凍結破面電子顕微鏡検査によっ
て調べた。その結果、サイズ範囲が約30〜225nmで主に
ユニラメラのリポソーム集団が認められる。実施例11の
ようにして作った小胞体については、準弾性光散乱を用
いても測定した。
Example 12 Investigation of sizing of pilocarpine alfa-tocopherol succinic acid hemiester vesicles The product of Example 11 was examined by freeze fracture electron microscopy. The result is a predominantly unilamellar liposome population in the size range of about 30-225 nm. The vesicles prepared as in Example 11 were also measured using quasi-elastic light scattering.

実施例 13 ピロカルピン−アルファートコフェロールコハク酸ヘミ
エステル 細孔サイズが400nmの2枚のヌクレオポア(Nucleopor
e)フィルターを通してサイズを小さくするVET400法
(小胞体押出技法)を使用して、実施例11の材料、方法
で実施した。VET400法は、1985年10月16日出願の、標題
が“ユニラメラ小胞体を製造する押出方法”である、カ
リス等(Cullis et al.)の同時係属米国特許出願番号
第788、017号(関連米国特許第5,008,050号)に記載さ
れている。
Example 13 Pilocarpine-Alphatocopherol succinic acid hemiester Two nucleopores with a pore size of 400 nm (Nucleopor
e) Using the material and method of Example 11, using the VET400 method (ER extrusion technique) to reduce the size through a filter. The VET400 process is described in co-pending U.S. Patent Application No. 788,017, filed October 16, 1985, entitled "Extrusion Process for Producing Unilamellar Endoplasmic Reticulum" by Cullis et al. U.S. Pat. No. 5,008,050).

水相として、0.1%(w/v)EDTAと共に、0.1%(w/v)
ソルビン酸を用いて、上記方法を実施した。
0.1% (w / v) with 0.1% (w / v) EDTA as aqueous phase
The above method was performed using sorbic acid.

実施例 14 ピロカルピン−アルファートコフェロールコハク酸ヘミ
エステル結合バッチリポソームの製造 実施例11の材料及び方法で実施し、大きさをそろえた
バッチを全容量が750mlとなるように合せた。次いで、
実施例11と同様にしてリポソームを処理した。
Example 14 Preparation of pilocarpine-alpha-tocopherol succinic acid hemiester conjugated batch liposomes The materials and methods of Example 11 were used and the sized batches were combined to a total volume of 750 ml. Then
The liposome was treated in the same manner as in Example 11.

また、第6表による水相組成物を使用して、上記方法
を実施した。
The above method was also carried out using the aqueous phase composition according to Table 6.

実施例 15 ピロカルピン−アルファートコフェロールオハク酸ヘミ
エステルリポソームの製造 上記実施例10の生成物を含む5の丸底フラスコをロ
ータリエバポレータに載せ、水浴温度を55℃にセットし
た。塩を30分間暖めた後、水浴温度を35℃に低下させ
た。0.01%(w/v)ソルビン酸0.01%(w/v)EDTA−ナト
リウム二水和物の水溶液(550ml)を加え、懸濁液を撹
拌翼を用いて1〜1.5時間混合した。水相を加えて、最
終容量を750mlに調節した。生成リポソームをCSR(連続
サイズ低減)で処理した。即ち、公称細孔サイズが500n
mであるステンレススチールフィルターに、リポソーム
を10回通した。
Example 15 Preparation of pilocarpine-alpha-tocopherol succinic hemiester liposome A round bottom flask containing the product of Example 10 above was placed on a rotary evaporator, and the water bath temperature was set at 55 ° C. After warming the salt for 30 minutes, the water bath temperature was reduced to 35 ° C. An aqueous solution (550 ml) of 0.01% (w / v) sorbic acid 0.01% (w / v) EDTA-sodium dihydrate was added and the suspension was mixed for 1-1.5 hours using a stirring blade. The final volume was adjusted to 750 ml by adding the aqueous phase. The resulting liposomes were treated with CSR (continuous size reduction). That is, the nominal pore size is 500n
The liposomes were passed 10 times through a stainless steel filter, m.

また、第7表による水相を利用して、上記方法を実施
した。
The above method was carried out using the aqueous phase shown in Table 7.

実施例 16 ピロカルピン−アルファートコフェロールコハク酸ヘミ
エステル ピロカルピン1.0g、D−アルファートコフェロール、
1.28gに相当するピロカルピン:D−アルファートコフェ
ロールのモル比1:0.5を用いて、実施例11の方法及び材
料を繰返した。実施例12の方法によりリポソームを形成
した。この場合、添加した水相は、米国薬局方の注射用
蒸溜水であり、ピロカルピンの最終濃度が4%となるよ
うにした。上記リポソーム溶液の粘度に関する結果を、
第8表に挙げる。
Example 16 Pilocarpine-alpha-tocopherol succinic acid hemiester 1.0 g of pilocarpine, D-alpha-tocopherol,
The method and materials of Example 11 were repeated using a pilocarpine: D-alpha-tocopherol molar ratio of 1: 0.5, equivalent to 1.28 g. Liposomes were formed by the method of Example 12. In this case, the added aqueous phase was distilled water for injection according to the United States Pharmacopeia, so that the final concentration of pilocarpine was 4%. The results regarding the viscosity of the liposome solution,
It is listed in Table 8.

0.1%(w/v)ソルビン酸と0.1%(w/v)EDTA−ナトリ
ウム二水和物の米国特許薬局方注射用蒸溜水を用いて、
上記方法を繰り返した。
Using distilled water for injection of 0.1% (w / v) sorbic acid and 0.1% (w / v) EDTA-sodium dihydrate in the United States Patent
The above method was repeated.

実施例 17 ピロカルピン1.0g、D−アルファートコフェロール5.
1gに相当するピロカルピン:D−アルファートコフェロー
ルのモル比1:2を用いて、実施例16の方法及び材料を繰
返した。実施例12の方法によりリポソームを形成した。
この場合、添加した水相は、米国薬局方注射用蒸溜水で
あり、ピロカルピンの最終濃度が4%となるようにし
た。上記リポソーム溶液に関する濃度の結果を第8表に
挙げる。
Example 17 1.0 g of pilocarpine, D-alpha-tocopherol 5.
The method and materials of Example 16 were repeated using a molar ratio of pilocarpine: D-alpha-tocopherol of 1: 2 equivalent to 1 g. Liposomes were formed by the method of Example 12.
In this case, the added aqueous phase was distilled water for injection in the United States Pharmacopeia, so that the final concentration of pilocarpine was 4%. Table 8 lists the concentration results for the liposome solution.

0.1(w/v)ソルビン酸と0.1%(w/v)EDTA−ナトリウ
ム二水和物の米国薬局方注射用蒸溜水水溶液を用いて、
上記方法を繰り返した。
Using distilled water solution of 0.1 (w / v) sorbic acid and 0.1% (w / v) EDTA-sodium dihydrate in the United States Pharmacopeia for injection,
The above method was repeated.

実施例 18 ピロカルピン1.0g、D−アルファートコフェロール1
0.2gに相当するピロカルピン:D−アルファートコフェロ
ールのモル比1:4を用いて、実施例16の方法及び材料を
繰返した。実施例12の方法によりリポソームを形成し
た。この場合、添加した水相は、米国薬局方注射用蒸溜
水であり、ピロカルピンの最終濃度が4%となるように
した。上記リポソーム溶液に関する濃度の結果を第8表
に挙げる。
Example 18 1.0 g of pilocarpine, D-alpha-tocopherol 1
The method and materials of Example 16 were repeated using a molar ratio of pilocarpine: D-alpha-tocopherol of 1: 4 corresponding to 0.2 g. Liposomes were formed by the method of Example 12. In this case, the added aqueous phase was distilled water for injection in the United States Pharmacopeia, so that the final concentration of pilocarpine was 4%. Table 8 lists the concentration results for the liposome solution.

0.1%(w/v)ソルビン酸と0.1%(w/v)EDTA−ナトリ
ウム二水和物の米国薬局方注射用蒸溜水水溶液を用い
て、上記方法を繰り返した。
The above procedure was repeated using 0.1% (w / v) sorbic acid and 0.1% (w / v) EDTA-sodium dihydrate in distilled water for injection in the United States Pharmacopeia.

第 5 表 準弾性光散乱法によるピロカルピン−THS小胞体の測定ピローTHS:人口涙液 直径(nm) 混合せず 205 4: 1 202 1:11 206 1:10 233 Table 5 Measurement of pilocarpine- THS endoplasmic reticulum by quasi-elastic light scattering method Pillow THS: artificial tear diameter (nm) without mixing 205 4: 1 202 1:11 206 1:10 233

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ボルクサック,ロイス,イー アメリカ合衆国 ニュ−ジャ−ジー州 08648,ローレンスビレ,タワー プレ ース 11 (72)発明者 ウェイナー,アラン,エル アメリカ合衆国 ニュ−ジャ−ジー州 08648,ローレンスビレ,オアクリン テラス 117 (72)発明者 トレンブレイ,ポール,エー アメリカ合衆国 ニュ−ジャ−ジー州 08619,ハミルトン,ノッティンガム ウェイ 2633 (72)発明者 ベルガミニ,マイケル,ヴィ.,ダブリ ュー アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 18942,イーストン,サリバン トレイ ル 941 (56)参考文献 Biochemistry,Vol. 24,No.7(1985)P.1646〜1653 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (72) Inventor Volksack, Lois, E. United States New Jersey 08648, Lawrenceville, Tower Place 11 (72) Inventor Weiner, Alan, El United States of America New Jersey State 08648, Lawrenceville, Oacrin-Terrace 117 (72) Inventor Trenbraye, Paul, A. Nottingham Way, Nottingham Way, Hamilton, New York, 08619, USA 2633 (72) Inventor Bergamini, Michael, Vi. Sullivan Trail, Easton, 18942, Pennsylvania, USA 941 (56) References Biochemistry, Vol. 7 (1985) p. 1646-1653

Claims (31)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】アルファートコフェロール有機酸誘導体の
イオン化し得る生物活性剤塩を含む完全閉鎖二重層膜を
含むアルファートコフェロール小胞体。
An alpha-tocopherol vesicle comprising a completely closed bilayer membrane comprising an ionizable bioactive agent salt of an alpha-tocopherol organic acid derivative.
【請求項2】イオン化し得る生物活性剤が、抗真菌性化
合物を含む請求の範囲第1項記載のアルファートコフェ
ロール小胞体。
2. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 1, wherein the ionizable bioactive agent comprises an antifungal compound.
【請求項3】抗真菌性化合物が、ミコナゾール、テルコ
ナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、チオコナゾ
ール、ビフォナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾ
ール、ブタコナゾール、イトラコナゾール、オキシコナ
ゾール、フェンチコナゾール、ナイスチタン、ナフチフ
ァイン、アンホテリシンB、ジノコナゾール又はシクロ
ピロックスオラミンである請求の範囲第2項記載のアル
ファートコフェロール小胞体。
3. An antifungal compound comprising miconazole, terconazole, econazole, isoconazole, thioconazole, bifonazole, clotrimazole, ketoconazole, butaconazole, itraconazole, oxyconazole, fenticonazole, nice titanium, naftifine, amphotericin B, The alphatocopherol vesicle according to claim 2, which is dinoconazole or ciclopirox olamine.
【請求項4】イオン化し得る生物活性剤が、ペプチド、
たんぱく、糖たんぱく又はリポたんぱくを含む請求の範
囲第1項記載のアルファートコフェロール小胞体。
4. The method of claim 1, wherein the ionizable bioactive agent is a peptide,
2. The alphatocopherol vesicle according to claim 1, comprising a protein, a glycoprotein or a lipoprotein.
【請求項5】イオン化し得る生物活性剤が、ピロカルピ
ンである請求の範囲第1項記載のアルファートコフェロ
ール小胞体。
5. The alphatocopherol vesicle according to claim 1, wherein the ionizable bioactive agent is pilocarpine.
【請求項6】有機酸誘導体が、コハク酸ヘミエステルで
ある請求の範囲第1項によるアルファートコフェロール
小胞体。
6. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 1, wherein the organic acid derivative is a succinic hemiester.
【請求項7】アルファートコフェロールに対するピロカ
ルピンのモル比が、約1:0.5から1:1までの間にある請求
の範囲第5項記載のアルファートコフェロール小胞体。
7. The alpha-tocopherol vesicle of claim 5, wherein the molar ratio of pilocarpine to alpha-tocopherol is between about 1: 0.5 and 1: 1.
【請求項8】有機酸がジカルボン酸又はポリカルボン酸
である請求の範囲第1項記載のアルファートコフェロー
ル小胞体。
8. The alphatocopherol vesicle according to claim 1, wherein the organic acid is a dicarboxylic acid or a polycarboxylic acid.
【請求項9】ジカルボン酸が、脂肪族ジカルボン酸であ
る請求の範囲第8項記載のアルファートコフェロール小
胞体。
9. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 8, wherein the dicarboxylic acid is an aliphatic dicarboxylic acid.
【請求項10】脂肪族ジカルボン酸が、7個以下の炭素
原子を有するものである請求の範囲第9項記載のアルフ
ァートコフェロール小胞体。
10. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 9, wherein the aliphatic dicarboxylic acid has 7 or less carbon atoms.
【請求項11】脂肪族ジカルボン酸が、コハク酸である
請求の範囲第10項記載のアルファートコフェロール小胞
体。
11. The alphatocopherol vesicle according to claim 10, wherein the aliphatic dicarboxylic acid is succinic acid.
【請求項12】有機酸がアミノ酸又はポリアミノ酸であ
る請求の範囲第1項記載のアルファートコフェロール小
胞体。
12. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 1, wherein the organic acid is an amino acid or a polyamino acid.
【請求項13】アルファートコフェロールがD−アルフ
ァートコフェロールである請求の範囲第1項記載のアル
ファートコフェロール小胞体。
13. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 1, wherein the alpha-tocopherol is D-alpha-tocopherol.
【請求項14】アルファートコフェロールの有機酸誘導
体のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩、2−
アミノ−2−メチル−1、3−プロパンジオール塩、2
−アミノエタロール塩、ビス−トリスプロパン塩又はト
リエタノールアミン塩を含む完全二重層膜を含む請求項
1記載のアルファートコフェロール小胞体。
14. Tris (hydroxymethyl) aminomethane salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol, 2-
Amino-2-methyl-1,3-propanediol salt, 2
2. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 1, comprising a complete bilayer membrane comprising -aminoetalol salt, bis-trispropane salt or triethanolamine salt.
【請求項15】アルファートコフェロールのコハク酸ヘ
ミエステル誘導体のトリス(ヒドロキシメチル)アミノ
メタン塩を含む請求の範囲第14項記載のアルファートコ
フェロール小胞体。
15. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 14, comprising a tris (hydroxymethyl) aminomethane salt of a succinic acid hemiester derivative of alpha-tocopherol.
【請求項16】アルファートコフェロールの有機酸誘導
体のイオン化し得る生物活性剤塩を含む完全閉鎖二重層
膜を含み、更に、生物活性剤を含有するアルファートコ
フェロール小胞体。
16. An alpha-tocopherol vesicle comprising a completely closed bilayer membrane comprising an ionizable bioactive agent salt of an organic acid derivative of alpha-tocopherol, and further comprising a bioactive agent.
【請求項17】更に含有する生物活性剤が、抗性化合
物、抗真菌性化合物、抗ウイルス性化合物及び駆虫性化
合物から成る群より選ばれる請求の範囲第16項記載のア
ルファートコフェロール小胞体。
17. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 16, wherein the bioactive agent further comprises a compound selected from the group consisting of an antibacterial compound, an antifungal compound, an antiviral compound and an anthelmintic compound.
【請求項18】抗性化合物が、タイロシン(tylosin)
である請求項の範囲第17項記載のアルファートコフェロ
ール小胞体。
18. The method according to claim 18, wherein the antitumor compound is tylosin.
18. The alpha tocopherol vesicle according to claim 17, which is:
【請求項19】抗真菌性化合物が、ミコナゾール、テル
コナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、チオコナ
ゾール、ビフォナゾール、クロトリマゾール、ケトコナ
ゾール、ブタコナゾール、イトラコナゾール、オキシコ
ナゾール、フェンチコナゾール、ナイスチタン、ナフチ
ファイン、アンホテリシンB、ジノコナゾール又はシク
ロピロックスオラミンである請求の範囲第17項記載のア
ルファートコフェロール小胞体。
19. The antifungal compound may be miconazole, terconazole, econazole, isoconazole, thioconazole, bifonazole, clotrimazole, ketoconazole, butaconazole, itraconazole, oxyconazole, fenticonazole, nice titanium, naftifine, amphotericin B, 18. The alpha tocopherol vesicle according to claim 17, which is dinoconazole or ciclopirox olamine.
【請求項20】更に含有する生物活性剤が、ペプチド、
たんぱく質、糖たんぱく質及びリポたんぱく質から成る
群より選ばれる請求の範囲第16項記載のアルファートコ
フェロール小胞体。
(20) a bioactive agent further comprising a peptide,
17. The alphatocopherol vesicle according to claim 16, which is selected from the group consisting of a protein, a glycoprotein and a lipoprotein.
【請求項21】更に含有する生物活性剤が、成長ホルモ
ンを含む請求の範囲第16項記載のアルファートコフェロ
ール小胞体。
21. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 16, wherein the bioactive agent further contains a growth hormone.
【請求項22】成長ホルモンが、牛の成長ホルモンを含
む請求の範囲第21項記載のアルファートコフェロール小
胞体。
22. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 21, wherein the growth hormone comprises bovine growth hormone.
【請求項23】更に含有する生物活性剤が、インシュリ
ンを含む請求の範囲第20記載のアルファートコフェロー
ル小胞体。
23. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 20, wherein the bioactive agent further comprises insulin.
【請求項24】更に含有する生物活性剤が、染料、放射
性標識、放射線不透過性化合物及び蛍光化合物から成る
群より選ばれる請求の範囲第16項記載のアルファートコ
フェロール小胞体。
24. The alphatocopherol vesicle according to claim 16, wherein the bioactive agent further contained is selected from the group consisting of a dye, a radiolabel, a radiopaque compound and a fluorescent compound.
【請求項25】更に含有する生物活性剤が、抗炎症性化
合物、抗緑内障化合物、散瞳性化合物、鎮痛性化合物及
び麻酔性化合物から成る群より選ばれる請求の範囲第16
項記載のアルファートコフェロール小胞体。
25. The method according to claim 16, wherein the bioactive agent is further selected from the group consisting of an anti-inflammatory compound, an anti-glaucoma compound, a mydriatic compound, an analgesic compound and an anesthetic compound.
Item 7. The alpha-tocopherol vesicle according to Item.
【請求項26】生物活性剤が、インドメタシンを含む請
求の範囲第25項記載のアルファートコフェロール小胞
体。
26. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 25, wherein the bioactive agent comprises indomethacin.
【請求項27】生物活性剤が、ピロカルピンを含む請求
の範囲第25項記載のアルファートコフェロール小胞体。
27. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 25, wherein the bioactive agent comprises pilocarpine.
【請求項28】生物活性剤が、麻酔剤、精神活性剤又は
抗不安剤を含む請求の範囲第16項記載のアルファートコ
フェロール小胞体。
28. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 16, wherein the bioactive agent comprises an anesthetic, a psychoactive agent or an anxiolytic.
【請求項29】生物活性剤が、ジアゼパムを含む請求の
範囲第28項記載のアルファートコフェロール小胞体。
29. The alphatocopherol vesicle according to claim 28, wherein the bioactive agent comprises diazepam.
【請求項30】生物活性剤が、ビタミンを含む請求の範
囲第16項記載のアルファートコフェロール小胞体。
30. The alpha-tocopherol vesicle according to claim 16, wherein the bioactive agent comprises a vitamin.
【請求項31】アルファートコフェロールがD−アルフ
ァートコフェロールである請求の範囲第16項記載のアル
ファートコフェロール小胞体。
31. The alpha tocopherol vesicle according to claim 16, wherein the alpha tocopherol is D-alpha tocopherol.
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