JP2601329B2 - Preparation of Bifidobacterium protoplasts - Google Patents
Preparation of Bifidobacterium protoplastsInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、プロトプラスト融合に利用し得るビフィス
ズ菌のプロトプラストを調製する方法、更に詳しくは、
ビフィドバクテリウム・ロンガムのプロトプラストを調
製する方法に関する。The present invention relates to a method for preparing a protoplast of Bifidobacterium which can be used for protoplast fusion.
The present invention relates to a method for preparing a Bifidobacterium longum protoplast.
従来の技術 従来、細菌での遺伝子伝達技術としては、有生生殖に
よる形質導入や染色体または核外DNA導入による形質転
換などが用いられており、近年の分子遺伝学の基本技術
として発展してきた。特に、その取扱の容易さと科学的
知見の豊富さから、大腸菌を素材とした遺伝子伝達技術
は、急速に進展して今日に至つている。2. Description of the Related Art Conventionally, as gene transfer technology in bacteria, transduction by live reproduction or transformation by chromosome or extranuclear DNA transfer has been used, and has been developed as a basic technology of molecular genetics in recent years. In particular, gene transfer technology using Escherichia coli as a material has rapidly progressed to the present day due to its easy handling and abundant scientific knowledge.
その反面、取扱も難しく、科学的な背景も乏しい工業
微生物での遺伝子伝達技術については、進展を見せない
ままに経過してきていた。しかし、近年になり、プロト
プラストにポリエチレングリコールとカルシウムを加え
るとプロトプラスト融合が生じることが報告されたこと
により、プロトプラスト化及びプロトプラストから正常
な細胞への再生が可能な細菌では、プロトプラスト融合
法が有効な育種手段となることが示唆されている。On the other hand, gene transfer technology for industrial microorganisms, which is difficult to handle and has a poor scientific background, has been progressing without progress. However, in recent years, it has been reported that protoplast fusion occurs when polyethylene glycol and calcium are added to protoplasts.Therefore, in bacteria capable of protoplasting and regeneration from protoplasts to normal cells, the protoplast fusion method is effective. It has been suggested to be a breeding tool.
プロトプラストは、原形体質とも称し、細胞膜に包ま
れた原形質の塊で、細胞壁を除いた全細胞内容を指すも
のである。このプロトプラストは、細胞を高張液中で、
細胞壁分解酵素処理によつて調製することができる。調
製されたプロトプラストは、元の細胞の形の如何にかか
わらず球形を呈し、低張液に移すと吸水によつて膨張
し、破裂してしまうが、適当な浸透圧条件下では、細胞
としての諸活性を維持し、また高分子物質や粒子の取込
み、細胞融合など、通常の細胞では見られない現象を示
すことが知られている。Protoplasts, also called protomorphs, are clumps of plasma wrapped in the cell membrane and refer to the whole cell content excluding the cell wall. This protoplast is used to transform cells in hypertonic solution.
It can be prepared by cell wall degrading enzyme treatment. The prepared protoplasts have a spherical shape regardless of the original cell shape, and when transferred to a hypotonic solution, swell by water absorption and rupture, but under appropriate osmotic conditions, the It is known to maintain various activities and exhibit phenomena that cannot be seen in ordinary cells, such as incorporation of macromolecular substances and particles and cell fusion.
プロトプラストを調製する際は、まず、細胞壁を温和
な条件で溶解することが必要であり、したがつて、細胞
壁の温和は条件で溶解するのに、細胞壁溶解酵素が用い
られる。多くの細菌類の場合リゾチームで溶菌される
が、このリゾチームの作用には、70mM前後のNaClと菌種
に応じたpHと温度の条件が大きく影響する。When preparing protoplasts, first, it is necessary to lyse the cell wall under mild conditions. Therefore, the cell wall lytic enzyme is used to lyse the cell wall under mild conditions. Many bacteria are lysed with lysozyme, and the action of lysozyme is greatly affected by around 70 mM NaCl and pH and temperature conditions according to the species.
また、プロトプラストを安定化するためには、等張剤
と２価イオンが必要である。To stabilize protoplasts, an isotonic agent and a divalent ion are required.
現在までに、色々な細菌類のプロトプラスト化が試み
られており、ビフイズス菌のプロトプラスト化について
も以下のように報告されている。To date, attempts have been made to convert various bacteria into protoplasts, and protoplasts of bifidobacteria have also been reported as follows.
例えば、エクステクカーテらは、ビフィドバクテリウ
ム・ビフィダム・バー・ペンシルバニクス（Bifidobact
erium bifidum var.Pennsylvanicus）に対し、ショ糖存
在下で、リゾチームを作用させることにより、プロトプ
ラストを調製したと報告している〔ビオヒミカ・エト・
ビオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Act
a）219,141−154,（1970）〕。For example, Extekate et al., Bifidobacterium bifidum bar Pennsylvanics.
erium bifidum var. Pennsylvanicus), it was reported that protoplasts were prepared by the action of lysozyme in the presence of sucrose [Biohymica et.
Biochimica et Biophysica Act
a) 219, 141-154, (1970)].
ウエダらは、ビフィドバクテリウム・ビフィダムにエ
ンド−Ｎ−アセチルムラミダーゼを作用させて、プロト
プラストを調製したと報告している〔ジヤーナル・オブ
・ジェネラル・アンド・アプライド・ミクロバイオロジ
（Journal of General and Applied microbiology）29,
507（1983）〕。Ueda et al. Reported that protoplasts were prepared by reacting Bifidobacterium bifidum with endo-N-acetylmuramidase [Journal of General and Applied Microbiology (Journal of General). and Applied microbiology) 29,
507 (1983)].
森下らは、ビフィドバクテリウム属に属する微生物に
対し、ショ糖、乳糖、マルトース、ラクチュロース、あ
るいはトレハロースの二糖類の存在下で、Ｎ−アセチル
ラミダーゼを作用させることにより、プロトプラストを
製造する方法を特許出願している〔特開昭59−13588
3〕。Morishita et al. Produce a protoplast by reacting a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium with N-acetyllamidase in the presence of a disaccharide of sucrose, lactose, maltose, lactulose, or trehalose. (JP-A-59-13588)
3].
ナカイらは、ビフィドバクテリウム・ビフィダムにつ
いて、ショ糖及びペニシリンＧを含有する培地で嫌気的
に生育させて、プロトプラストを調製したと報告してい
る〔ジヤーナル・オブ・ジエネラル・アンド・アプライ
ド・ミクロバイオロジ（Journal of General and Appli
ed Microbiology）30,187（1984）〕。Nakai et al. Report that Bifidobacterium bifidum was grown anaerobically in a medium containing sucrose and penicillin G to prepare protoplasts [Journal of Generic and Applied Micron]. Biology (Journal of General and Appli
ed Microbiology) 30,187 (1984)].
小処木らは、ビフィドバクテリウム属に属する微生物
に対し、ラフィノース、メレジトース、あるいはマルト
トリオースの三糖類及びマグネシウムイオンの存在下
で、Ｎ−アセチルラムダーゼを作用させることにより、
プロトプラストを製造する方法を特許出願している〔特
開昭61−280267〕。Kodoki et al. Act on N-acetyllambidase on microorganisms belonging to the genus Bifidobacterium in the presence of raffinose, melesitose, or maltotriose trisaccharide and magnesium ions.
A patent application has been filed for a method for producing protoplasts (Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-280267).
しかし、プロトプラスト化に当たつては、それぞれの
菌種毎に、最適の条件設定が必要であり、また、プロト
プラストの再生についても同様に、最適の条件設定が必
要であり、したがつて、高収率でビフィズス菌のプロト
プラストを製造し、かつ、高率でビフィズス菌のプロト
プラストを再生する方法について未だに確立されておら
ず、ビフィズス菌の育種及び改良に関しては、他の微生
物に比べて著しく遅れているという問題があつた。However, for protoplast formation, optimal conditions must be set for each bacterial species, and also for regeneration of protoplasts, optimal conditions need to be set in the same manner. A method for producing bifidobacterium protoplasts at a high yield, and a method for regenerating bifidobacteria protoplasts at a high rate has not yet been established. Problem.
なお、ビフィズス菌は、発酵乳、乳酸菌飲料、菓子な
どの食品、整腸剤、栄養剤あるいは飼料などに広く利用
されている微生物である。Bifidobacteria are microorganisms widely used in fermented milk, lactic acid bacteria drinks, foods such as confectionery, intestinal preparations, nutrients, feeds, and the like.
発明が解決しようとする課題 本発明者らは、ビフィドバクテリウム・ロンガムのプ
ロトプラストを形成するに際し、細胞壁溶解酵素として
リゾチーム及びアクチナーゼＥを併用して菌体懸濁液を
処理することにより、良好な球状のプロトプラストを形
成することに成功し、このプロトプラストを再生するこ
とにも成功した。Problems to be Solved by the Invention The present inventors have found that when forming protoplasts of Bifidobacterium longum, the cell suspension is preferably treated by using lysozyme and actinase E as cell wall lysing enzymes in combination. We succeeded in forming a spherical protoplast and regenerated this protoplast.
したがつて、本発明は、プロトプラスト融合に利用し
得るビフィドバクテリウム・ロンガムのプロトプラスト
の形成法を提供することを課題とする。Therefore, an object of the present invention is to provide a method for forming a protoplast of Bifidobacterium longum which can be used for protoplast fusion.
以下本発明を詳しく説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
課題を解決するための手段 本発明の特徴は、ビフィドバクテリウム・ロンガムの
菌体懸濁液をリゾチームとアクチナーゼＥまたはプロテ
ィナーゼＫとを併用して同時に処理するか、もしくはリ
ゾチームで処理した後、アクチナーゼＥはプロティナー
ゼＫで処理することにより、ビフィズス菌のプロトプラ
ストを得ることにある。Means for Solving the Problems A feature of the present invention is that a cell suspension of Bifidobacterium longum is treated simultaneously with lysozyme and actinase E or proteinase K in combination, or after treatment with lysozyme, Actinase E is to obtain a protoplast of Bifidobacterium by treating with proteinase K.
本発明において、ビフィドバクテリウム・ロンガムの
細胞壁溶解酵素（以下溶菌酵素という）として、リゾチ
ームとアクチナーゼＥまたはプロティナーゼＫと上述し
た処理条件で併用することの理由は、リゾチームと種々
の酵素を併用した場合の溶菌効果を試験した結果に基い
ている。In the present invention, the reason why lysozyme and actinase E or proteinase K are used in combination as the cell wall lytic enzyme (hereinafter referred to as lytic enzyme) of Bifidobacterium longum under the above-mentioned treatment conditions is that lysozyme and various enzymes are used in combination. It is based on the results of testing the lytic effect of the case.
溶菌試験： まず、供試酵素としてリゾチーム、Ｎ−アセチルムラ
ミダーゼSG及びアクロモペプチダーゼを選択して、ビフ
ィドバクテリウム・ロンガムSBT2933−Ｒ（微工研菌寄
第8743号）に対する溶菌効果を調べた結果、Ｎ−アセチ
ルムラミダーゼSGで処理したものにプロトプラスト化が
認められた。しかしながら、Ｎ−アセチルラミダーゼSG
で処理して調製したプロトプラストは、再生培地での再
生が認められなかつた。Lysis test: First, lysozyme, N-acetylmuramidase SG and achromopeptidase were selected as test enzymes, and the lysis effect on Bifidobacterium longum SBT2933-R (Microtechnical Research Laboratories No. 8743) was examined. As a result, protoplast formation was observed in those treated with N-acetylmuramidase SG. However, N-acetyllamidase SG
No regeneration in the regeneration medium was observed in the protoplasts prepared by the treatment described above.
そこで、次にリゾチームと他の種々の酵素とを併用し
て処理した場合の溶菌効果を試験し、表１に示すような
結果を得た。Then, the lysing effect when lysozyme was treated in combination with various other enzymes was tested, and the results shown in Table 1 were obtained.
表１にみられるとおり、リゾチームとアクチナーゼＥ
またはプロティナーゼＫとを併用し、リゾチームで処理
した後アクチナーゼＥまたはプロティナーゼＫで処理す
る場合ビフィドバクテリウム・ロンガムのプロトプラス
ト化が最も優れていることがわかる。 As seen in Table 1, lysozyme and actinase E
Alternatively, when treated with lysozyme in combination with proteinase K and then treated with actinase E or proteinase K, it is found that protoplast formation of Bifidobacterium longum is most excellent.
次に、本発明においてリゾチームとアクチナーゼＥま
たはプロティナーゼＫを併用してビフィドバクテリウム
・ロンガムのプロトプラストを形成する手段について説
明する。Next, a means for forming a protoplast of Bifidobacterium longum using lysozyme and actinase E or proteinase K in combination in the present invention will be described.
本発明では、上記ビフィズス菌の菌体懸濁液に、ま
ず、リゾチームを0.5〜5mg/ml、好ましくは2mg/mlの濃
度で加えて１時間程度処理し、次いでアクチナーゼＥま
たはプロティナーゼＫを0.25〜2mg/ml、好ましくは1mg/
mlの濃度で加えて30分間程度処理することにより、プロ
トプラスト化が良好に行われる。In the present invention, first, lysozyme is added to the above cell suspension of the Bifidobacterium at a concentration of 0.5 to 5 mg / ml, preferably 2 mg / ml, and treated for about 1 hour, and then actinase E or proteinase K is added at a concentration of 0.25 to 5 mg / ml. 2 mg / ml, preferably 1 mg / ml
Protoplast formation is favorably performed by adding the mixture at a concentration of ml and treating for about 30 minutes.
特に、上記溶菌酵素としてのリゾチームとアクチナー
ゼＥまたはプロティナーゼＫの菌体懸濁液に対する処理
時間が上記時間よりそれぞれ長くなると浸透圧安定細胞
出現率が減少する傾向があり、かつ一旦形成されたプロ
トプラストが破壊されることが顕微鏡観察により認めら
れるので、処理時間に関しては留意する必要がある。In particular, when the treatment time for the cell suspension of lysozyme and actinase E or proteinase K as the lytic enzyme is longer than the above times, the osmotic pressure-stable cell appearance rate tends to decrease, and once formed protoplasts, Since destruction is observed by microscopic observation, attention must be paid to the processing time.
また、本発明では、上記溶菌酵素を併用してのプロト
プラスト化を、１〜5mM、好ましくは3mMの塩化マグネシ
ウムと0.2〜0.3Mのラフィノースの存在下に、バッフア
ーを含む菌体懸濁液中で行うと良好なプロトプラスト化
が得られる。ここで、バッフアーはトリス−HCl（pH8.
0）を30mM濃度で使用するのが好ましい。In the present invention, the protoplast formation using the above lytic enzyme in combination is performed in a cell suspension containing a buffer in the presence of 1 to 5 mM, preferably 3 mM of magnesium chloride and 0.2 to 0.3 M of raffinose. By doing so, good protoplast formation can be obtained. Here, the buffer was Tris-HCl (pH 8.
It is preferred to use 0) at a concentration of 30 mM.
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples.
実施例 ビフィドバクテリウム・ロンガムSBT 2933−Ｒ（微工
研菌寄第8743号）を、トマトジュース浸出液40％を含む
GAM培地中で、37℃の温度に一夜培養した。Example Bifidobacterium longum SBT 2933-R (Microtechnical Laboratory No. 8743) containing 40% tomato juice leachate
The cells were cultured overnight in a GAM medium at a temperature of 37 ° C.
培養により得られた菌体を、3mMのMgCl2と0.3Mのラフ
ィノースを含む30mMのトリス−HClバッフアー（ph8.0）
に懸濁させた。得られた菌体懸濁液にリゾチームを2mg/
mlの濃度に添加して１時間処理した後、アクチナーゼＥ
を1mg/mlの濃度に添加して30分間処理した。The cells obtained by culturing were washed with 30 mM Tris-HCl buffer (ph 8.0) containing 3 mM MgCl 2 and 0.3 M raffinose.
Was suspended. Lysozyme was added to the obtained cell suspension at 2 mg /
ml and treated for 1 hour.
Was added to a concentration of 1 mg / ml and treated for 30 minutes.
その結果、上記ビフィズス菌のプロトプラストが90％
以上形成し、形成されたプロトプラストも再生が可能で
あつた。As a result, the protoplasts of the Bifidobacterium were 90%
The protoplasts formed as described above could also be regenerated.
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Agency reference number FI Technical indication (C12N 1/21 C12R 1:01)
Claims (3)
bacterium longum）のプロトプラストを形成する際に、
細胞壁溶解酵素としてリゾチームとアクチナーゼＥまた
はプロティナーゼＫとを併用して菌体懸濁液を同時に処
理するか、もしくはリゾチームで処理した後アクチナー
ゼＥまたはプロティナーゼＫで処理することを特徴とす
るビフィズス菌プロトプラストの調製方法。(1) Bifidobacterium longum (Bifido
bacterium longum)
A bifidobacterial protoplast characterized by simultaneously treating a cell suspension with lysozyme and actinase E or proteinase K as a cell wall lytic enzyme, or treating with lysozyme and then treating with actinase E or proteinase K Preparation method.
ＥまたはプロティナーゼK0.25〜2mg/mlの濃度で、菌体
懸濁液をリゾチーム処理した後、アクチナーゼＥまたは
プロティナーゼＫ処理する請求項（１）に記載のビフィ
ズス菌プロトプラストの調製方法。2. The cell suspension is treated with actinase E or proteinase K at a concentration of 0.5 to 5 mg / ml lysozyme and actinase E or proteinase K at a concentration of 0.25 to 2 mg / ml. The method for preparing bifidobacterium protoplast according to the above.
グネシウムの存在下に、菌体懸濁液を処理する請求項
（１）又は（２）に記載のビフィズス菌プロトプラスト
の調製方法。3. The method for preparing a Bifidobacterium protoplast according to claim 1, wherein the cell suspension is treated in the presence of 0.2 to 0.3 M raffinose and 1 to 5 mM magnesium chloride.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20158088A JP2601329B2 (en) | 1988-08-12 | 1988-08-12 | Preparation of Bifidobacterium protoplasts |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20158088A JP2601329B2 (en) | 1988-08-12 | 1988-08-12 | Preparation of Bifidobacterium protoplasts |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02167070A JPH02167070A (en) | 1990-06-27 |
| JP2601329B2 true JP2601329B2 (en) | 1997-04-16 |
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1988
- 1988-08-12 JP JP20158088A patent/JP2601329B2/en not_active Expired - Fee Related
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| JPH02167070A (en) | 1990-06-27 |
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