JP2546577B2 - エイメリア・ブルネッティｄｎａプローブ - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Description
【０００１】ニワトリエイメリア（Eimeria ）種の早熟
単離体（precocious isolate）のオーシスト（接合子
嚢）の免疫原性量を堅固なゲルマトリックス中に埋め込
んだ組成物の粒子からなるコクシジウム症生ワクチン
（ＬＣＶ）はよく知られており、米国特許第４５４４５
４８号（１９８５年１０月１日発効）、第４５５２７５
９号（１９８５年１１月１２日発効）、第４７５２４７
５号（１９８８年６月２１日発効）、第４８６３７３１
号（１９８９年９月５日発効）及び特許協力条約による
国際出願ＷＯ８５／００７５２号にその例が見られる。
コクシジウム生ワクチンの性状、たとえばそのワクチン
に含まれるそれぞれの種の生存性の評価は、ワクチンの
製造および使用に関してきわめて重要である。また、生
存性を調べるのに用いる検定は、粒子中のそれぞれの種
の免疫原としての効力が予測できる程度に準定量的であ
る必要もある。
単離体（precocious isolate）のオーシスト（接合子
嚢）の免疫原性量を堅固なゲルマトリックス中に埋め込
んだ組成物の粒子からなるコクシジウム症生ワクチン
（ＬＣＶ）はよく知られており、米国特許第４５４４５
４８号（１９８５年１０月１日発効）、第４５５２７５
９号（１９８５年１１月１２日発効）、第４７５２４７
５号（１９８８年６月２１日発効）、第４８６３７３１
号（１９８９年９月５日発効）及び特許協力条約による
国際出願ＷＯ８５／００７５２号にその例が見られる。
コクシジウム生ワクチンの性状、たとえばそのワクチン
に含まれるそれぞれの種の生存性の評価は、ワクチンの
製造および使用に関してきわめて重要である。また、生
存性を調べるのに用いる検定は、粒子中のそれぞれの種
の免疫原としての効力が予測できる程度に準定量的であ
る必要もある。
【０００２】ニワトリエイメリアのオーシストの生存性
を高い信頼度で評価するには、天然宿主中における増殖
と複製によらざるを得ず、使用できる有効なインビトロ
モデルはない。ワクチンを接種したトリの腸管上皮およ
び粘膜（これらのプロトゾアの標的組織）中に寄生体が
検出できれば、これらの生物体が実際に腸管上皮を透過
して細胞間に生育し得ることがわかる。糞便中にオーシ
ストの被嚢が検出されれば、それは接種物が生活環全体
を通して生育できる十分に有効な寄生体を含んでいるこ
とを示すことになる。
を高い信頼度で評価するには、天然宿主中における増殖
と複製によらざるを得ず、使用できる有効なインビトロ
モデルはない。ワクチンを接種したトリの腸管上皮およ
び粘膜（これらのプロトゾアの標的組織）中に寄生体が
検出できれば、これらの生物体が実際に腸管上皮を透過
して細胞間に生育し得ることがわかる。糞便中にオーシ
ストの被嚢が検出されれば、それは接種物が生活環全体
を通して生育できる十分に有効な寄生体を含んでいるこ
とを示すことになる。
【０００３】歴史的には、エイメリア種は、形態学的特
徴、誘発される病理学的症状、免疫学的特異性、生活環
における特徴あるいは生化学的特徴といった種々の因子
に従って分類されてきた（Joyner and Long, Avian Pat
h. 3, 145-157[1974]; Shirley, In: McDougold, Joyne
r and Long, Eds., Research in Avian Coccidiosis,At
hens, Georgia: University of Georgia, pp.13-35 [19
85]）。しかしながらこれらの種分類方法は手間がかか
り、また定量的でもない。さらに、すべての種を明確に
区別できる単一の方法は存在しない。コクシジウム症複
合生ワクチンの感染性検定には、ワクチン調製物の半減
期（halflife）が短いと考えられることから、明確な種
分類、準定量性および合理化された手順が必要とされ
る。現在用いられている方法はこれらの要請を満足する
ものではない。
徴、誘発される病理学的症状、免疫学的特異性、生活環
における特徴あるいは生化学的特徴といった種々の因子
に従って分類されてきた（Joyner and Long, Avian Pat
h. 3, 145-157[1974]; Shirley, In: McDougold, Joyne
r and Long, Eds., Research in Avian Coccidiosis,At
hens, Georgia: University of Georgia, pp.13-35 [19
85]）。しかしながらこれらの種分類方法は手間がかか
り、また定量的でもない。さらに、すべての種を明確に
区別できる単一の方法は存在しない。コクシジウム症複
合生ワクチンの感染性検定には、ワクチン調製物の半減
期（halflife）が短いと考えられることから、明確な種
分類、準定量性および合理化された手順が必要とされ
る。現在用いられている方法はこれらの要請を満足する
ものではない。
【０００４】リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子部位
は、真核生物界間あるいはその内部における系統発生学
的関係を確立するのに使われて成功をおさめてきた数多
くの情報の宝庫である（Hasegawa et al., J. Mol. Evo
l. 22: 32-80[1985]）。トキソプラズマ・ゴンジ（Toxo
plasma gondii）（Johnson et al., Exp. Parasitol.6
3: 272-278[1987]）、プラスモジウム（Plasmodium）属
に属するもの（Dame and McCutchan, J. BIol. Chem. 2
58: 6984-6990[1983], Langsley et al., Nucleic Acid
s Res. 11: 8703-8717[1983]）およびエイメリア種（El
lis and Blumstead, Parasitol. 101: 1-6[1990]; John
son et al., System. Parasitol. 18: 1-8[1991]）がク
ローン化され、この目的に向かって特徴づけられてき
た。この種の分析はプラスモジウムについて引き続いて
行われ（McCutchan et al., Mol. Biochem. Parasitol.
28: 63-68[1988]）、小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子内
の領域のヌクレオチド配列に由来する種特異的オリゴヌ
クレオチドプローブの設計がなされている。
は、真核生物界間あるいはその内部における系統発生学
的関係を確立するのに使われて成功をおさめてきた数多
くの情報の宝庫である（Hasegawa et al., J. Mol. Evo
l. 22: 32-80[1985]）。トキソプラズマ・ゴンジ（Toxo
plasma gondii）（Johnson et al., Exp. Parasitol.6
3: 272-278[1987]）、プラスモジウム（Plasmodium）属
に属するもの（Dame and McCutchan, J. BIol. Chem. 2
58: 6984-6990[1983], Langsley et al., Nucleic Acid
s Res. 11: 8703-8717[1983]）およびエイメリア種（El
lis and Blumstead, Parasitol. 101: 1-6[1990]; John
son et al., System. Parasitol. 18: 1-8[1991]）がク
ローン化され、この目的に向かって特徴づけられてき
た。この種の分析はプラスモジウムについて引き続いて
行われ（McCutchan et al., Mol. Biochem. Parasitol.
28: 63-68[1988]）、小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子内
の領域のヌクレオチド配列に由来する種特異的オリゴヌ
クレオチドプローブの設計がなされている。
【０００５】したがって、本発明の目的は、小サブユニ
ットリボゾームＲＮＡ（ｓｓｒＲＮＡ）遺伝子をコード
し他のエイメリア核酸および他の細胞成分を含まない、
精製されたエイメリア種ＤＮＡを調製することである。
別の目的は、このｓｓｒＲＮＡのＤＮＡを適当なベクタ
ーに挿入し、そのベクターで適当な宿主を形質転換し、
そのＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することである。
さらに別の目的は、個々の種についてプローブとして用
いられるｓｓｒＲＮＡ遺伝子の種特異的な系統発生学的
多様性セグメントを提供することである。さらに別の目
的は、この多様性領域に相補的なオリゴヌクレオチドを
提供することである。さらに別の目的は、このプローブ
および検定法を用いてエイメリア種の混合物中の各エイ
メリア種を定量および／または同定することである。さ
らに別の目的は、感染した宿主組織中の複数エイメリア
種のそれぞれの相対量を定量する方法にこのプローブを
用いることである。
ットリボゾームＲＮＡ（ｓｓｒＲＮＡ）遺伝子をコード
し他のエイメリア核酸および他の細胞成分を含まない、
精製されたエイメリア種ＤＮＡを調製することである。
別の目的は、このｓｓｒＲＮＡのＤＮＡを適当なベクタ
ーに挿入し、そのベクターで適当な宿主を形質転換し、
そのＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することである。
さらに別の目的は、個々の種についてプローブとして用
いられるｓｓｒＲＮＡ遺伝子の種特異的な系統発生学的
多様性セグメントを提供することである。さらに別の目
的は、この多様性領域に相補的なオリゴヌクレオチドを
提供することである。さらに別の目的は、このプローブ
および検定法を用いてエイメリア種の混合物中の各エイ
メリア種を定量および／または同定することである。さ
らに別の目的は、感染した宿主組織中の複数エイメリア
種のそれぞれの相対量を定量する方法にこのプローブを
用いることである。
【０００６】ここに、多様性ＤＮＡ配列を含む種特異的
エイメリア・マキシマＤＮＡプローブが開示される。こ
のプローブはエイメリア・マキシマ（maxima）の小サブ
ユニットリボゾームＲＮＡ遺伝子に相補的である。
エイメリア・マキシマＤＮＡプローブが開示される。こ
のプローブはエイメリア・マキシマ（maxima）の小サブ
ユニットリボゾームＲＮＡ遺伝子に相補的である。
【０００７】以下本発明を詳細に説明する。本発明は、
複数のエイメリア種の明確な分類、種それぞれの濃度の
半定量、およびこれらのパラメータの決定に要する時間
の短縮を可能にするアッセイおよび種特異的同定プロー
ブに関する。以下の技術は、多価コクシジウムワクチン
を製造するのに用いられる複数種のエイメリアの各々に
特異的なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブを同定す
るのに用いられている。ここでＤＮＡプローブとは、遺
伝子を同定するのに用いられるＤＮＡ配列あるいは断片
を指し、放射活性アイソトープでラベルされていること
が多い。ここではＤＮＡ断片とは２塩基から２ｋｂ（キ
ロ塩基）長のヌクレオチド配列をさす。エイメリア種と
は、これに限定されないが、エイメリア・アセルブリナ
（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・ブルネッ
ティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・マキシマ
（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍ
ｉｔｉｓ）、エイメリア・ネカトリックス（Ｅ．ｎｅｃ
ａｔｒｉｘ）、エイメリア・プレコックス（Ｅ．ｐｒａ
ｅｃｏｘ）、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌ
ａ）を含む。 エイメリア属の包括的なリストは特許協
力条約公告Ｎｏ．ＷＯ８５／００７５２に載っている。
全部のあるいはどのエイメリア種の小サブユニットｒＲ
ＮＡ遺伝子もここに述べられる方法により、クローン化
され配列決定される。これらのヌクレオチド配列を比較
分析すると、配列中に系統発生的に広い生物間で高度に
保存されている複数のセグメントと、属の中でさえ多様
である（種特異的）領域があることがわかる。保存配列
とは、進化の過程で変化しなかった遺伝子のＤＮＡセグ
メントを意味し、多様性配列とは相当に変化したＤＮＡ
セグメントをさす。多様性配列は、変化したＤＮＡセグ
メントの全長にわたって相当に変化する。原核生物であ
るフランシセラ（Ｆｒａｎｓｉｓｅｌｌａ）属では、種
はｓｓｒＲＮＡ遺伝子中の１個の塩基の違いで区別する
ことができる（Forsman ら、Appl. Environ. Microbio
l. 56:949-955(1990)) 。一方トリパソノーマは、ｓｓ
ｒＲＮＡ遺伝子中に数百塩基長の複数の特有なＤＮＡセ
グメントを有する（Dansら、Nucleic Acid Res. 165: r
87-r173, (1988))。特有な多様性配列はエイメリア属の
種を同定するのに理想的なプローブとなる。多様性配列
に対応するデオキシリボオリゴヌクレオチド（一本鎖Ｄ
ＮＡ）を合成し、ハイブリダイゼーションプローブとし
て用いると有効な種特異的試薬として働く。
複数のエイメリア種の明確な分類、種それぞれの濃度の
半定量、およびこれらのパラメータの決定に要する時間
の短縮を可能にするアッセイおよび種特異的同定プロー
ブに関する。以下の技術は、多価コクシジウムワクチン
を製造するのに用いられる複数種のエイメリアの各々に
特異的なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブを同定す
るのに用いられている。ここでＤＮＡプローブとは、遺
伝子を同定するのに用いられるＤＮＡ配列あるいは断片
を指し、放射活性アイソトープでラベルされていること
が多い。ここではＤＮＡ断片とは２塩基から２ｋｂ（キ
ロ塩基）長のヌクレオチド配列をさす。エイメリア種と
は、これに限定されないが、エイメリア・アセルブリナ
（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・ブルネッ
ティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・マキシマ
（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍ
ｉｔｉｓ）、エイメリア・ネカトリックス（Ｅ．ｎｅｃ
ａｔｒｉｘ）、エイメリア・プレコックス（Ｅ．ｐｒａ
ｅｃｏｘ）、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌ
ａ）を含む。 エイメリア属の包括的なリストは特許協
力条約公告Ｎｏ．ＷＯ８５／００７５２に載っている。
全部のあるいはどのエイメリア種の小サブユニットｒＲ
ＮＡ遺伝子もここに述べられる方法により、クローン化
され配列決定される。これらのヌクレオチド配列を比較
分析すると、配列中に系統発生的に広い生物間で高度に
保存されている複数のセグメントと、属の中でさえ多様
である（種特異的）領域があることがわかる。保存配列
とは、進化の過程で変化しなかった遺伝子のＤＮＡセグ
メントを意味し、多様性配列とは相当に変化したＤＮＡ
セグメントをさす。多様性配列は、変化したＤＮＡセグ
メントの全長にわたって相当に変化する。原核生物であ
るフランシセラ（Ｆｒａｎｓｉｓｅｌｌａ）属では、種
はｓｓｒＲＮＡ遺伝子中の１個の塩基の違いで区別する
ことができる（Forsman ら、Appl. Environ. Microbio
l. 56:949-955(1990)) 。一方トリパソノーマは、ｓｓ
ｒＲＮＡ遺伝子中に数百塩基長の複数の特有なＤＮＡセ
グメントを有する（Dansら、Nucleic Acid Res. 165: r
87-r173, (1988))。特有な多様性配列はエイメリア属の
種を同定するのに理想的なプローブとなる。多様性配列
に対応するデオキシリボオリゴヌクレオチド（一本鎖Ｄ
ＮＡ）を合成し、ハイブリダイゼーションプローブとし
て用いると有効な種特異的試薬として働く。
【０００８】このタイプのアッセイは、少量接種したオ
ーシストが拡大すなわち再生産するのを検出できる感度
がなければならない。他のケースではＤＮＡハイブリダ
イゼーションプローブを使って、感染した宿主中での寄
生体の負荷を定量するのに成功している。たとえば、ラ
ットの肝臓抽出物から調製されたゲノム中におけるPlas
modium bergheiの赤血球外体（ＥＥＦ）の存在が、マラ
リア原虫の繰り返しＤＮＡプローブを用いてアッセイさ
れている（Ferreira ら、Mol. Biochem. Parasitol. 1
9:103-109(1986))。最近感染マウスの肝臓から調製され
たＲＮＡ中のPlasmokium yoelii のＥＥＦを定量するの
にｒＲＮＡ配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブ
が用いられている（Arreaza ら、Exp. Parasitol. 72:
103-105,(1991))。同様に、生コクシジウムワクチン用
のアッセイであるならば、全ニワトリの小腸上皮と粘膜
からの全核酸標品（ＲＮＡでもＤＮＡでも）中に含まれ
るエイメリアの配列を検出できなければならない。抽出
物中の遺伝情報に対するエイメリアの配列は非常にパー
セントが少ないので、ＤＮＡに対する直接のハイブリダ
イゼーションはエイメリア各種についてワクチン投与量
を検出するほどの感度はない。細胞中のＲＮＡプール内
でのｒＲＮＡの細胞による増幅があるのでエイメリア種
特異的オリゴヌクレオチドプローブを、小腸上皮および
粘膜から調製したＲＮＡ標品とハイブリダイズさせる方
法は、本発明のアッセイおよびオリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用できる１つの方法である。ワクチン投与され
たニワトリが糞中に排泄したオーシストから調製された
ゲノムＤＮＡもオリゴヌクレオチドプローブのハイブリ
ダイゼーションターゲットとしての性質を有する。
ーシストが拡大すなわち再生産するのを検出できる感度
がなければならない。他のケースではＤＮＡハイブリダ
イゼーションプローブを使って、感染した宿主中での寄
生体の負荷を定量するのに成功している。たとえば、ラ
ットの肝臓抽出物から調製されたゲノム中におけるPlas
modium bergheiの赤血球外体（ＥＥＦ）の存在が、マラ
リア原虫の繰り返しＤＮＡプローブを用いてアッセイさ
れている（Ferreira ら、Mol. Biochem. Parasitol. 1
9:103-109(1986))。最近感染マウスの肝臓から調製され
たＲＮＡ中のPlasmokium yoelii のＥＥＦを定量するの
にｒＲＮＡ配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブ
が用いられている（Arreaza ら、Exp. Parasitol. 72:
103-105,(1991))。同様に、生コクシジウムワクチン用
のアッセイであるならば、全ニワトリの小腸上皮と粘膜
からの全核酸標品（ＲＮＡでもＤＮＡでも）中に含まれ
るエイメリアの配列を検出できなければならない。抽出
物中の遺伝情報に対するエイメリアの配列は非常にパー
セントが少ないので、ＤＮＡに対する直接のハイブリダ
イゼーションはエイメリア各種についてワクチン投与量
を検出するほどの感度はない。細胞中のＲＮＡプール内
でのｒＲＮＡの細胞による増幅があるのでエイメリア種
特異的オリゴヌクレオチドプローブを、小腸上皮および
粘膜から調製したＲＮＡ標品とハイブリダイズさせる方
法は、本発明のアッセイおよびオリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用できる１つの方法である。ワクチン投与され
たニワトリが糞中に排泄したオーシストから調製された
ゲノムＤＮＡもオリゴヌクレオチドプローブのハイブリ
ダイゼーションターゲットとしての性質を有する。
【０００９】小腸上皮および粘膜から調製されたゲノム
ＤＮＡ中のｓｓｒＲＮＡ遺伝子配列を酵素的に増幅する
ことは、新しい別方向からのアプローチで濃縮すること
であり、このアッセイの感度を増すことができる。ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Saiki ら、Science 239:
287-491 (1988))と真核生物のｒＲＮＡ小サブユニット
遺伝子に効率よくハイブリダイズできるプライマーを用
いると、感染したニワトリの小腸の上皮および粘膜から
調製されたゲノムＤＮＡ中のｓｓｒＲＮＡ遺伝子ユニッ
トまたは断片の各々を選択的に増幅することが可能にな
っている。ここで用いられるプライマーとは、一本鎖テ
ンプレートの一部に特異的に付着できる比較的短いオリ
ゴヌクレオチドであって、逆転写酵素がＲＮＡ配列（ｍ
ＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡ）をコピーするため、
あるいはＤＮＡポリメラーゼが相補鎖ＤＮＡを合成する
ための起点を形成するのに必要とされるものを指す。ま
たプライマーは特殊なポリメラーゼと一緒に用いて一本
鎖ゲノムＤＮＡに相補な鎖合成を行なうのに用いられ
る。すなわちポリメラーゼ連鎖反応である。ここで用い
られる相補的塩基対形成とは、当業界でよく知られてい
る塩基対合の法則にしたがって二重鎖核酸上で塩基が結
合することとして定義される。相補的塩基配列は、同じ
塩基対合の法則にしたがって片方の核酸鎖中の塩基配列
に対応するもう一方の鎖中の塩基配列である。これはエ
イメリアｒＲＮＡ遺伝子、ニワトリｒＲＮＡ遺伝子およ
びニワトリ小腸中に存在する可能性のある真核生物由来
のｒＲＮＡ遺伝子をも含む。この増幅は、小サブユニッ
トｒＲＮＡ遺伝子だけがＰＣＲ反応の結果濃縮されると
いう意味では選択的であるが、小サブユニットｒＲＮＡ
遺伝子のそれぞれが同程度に濃縮されるという点では非
特異的である。ＰＣＲ増幅の産物は蛍光色素結合アッセ
イを用いて定量し（Labarca とPaigen, Anal, Biochem.
102: 344-352 (1980)) 、当量ずつの増幅ＤＮＡ断片を
変性させて支持膜上に固定する。ついで種特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーション
反応を行ない、エイメリアの各種が増幅ＰＣＲ産物中に
存在するか否か、すなわちワクチン投与されたニワトリ
の小腸内に存在するか否かを決定する。
ＤＮＡ中のｓｓｒＲＮＡ遺伝子配列を酵素的に増幅する
ことは、新しい別方向からのアプローチで濃縮すること
であり、このアッセイの感度を増すことができる。ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Saiki ら、Science 239:
287-491 (1988))と真核生物のｒＲＮＡ小サブユニット
遺伝子に効率よくハイブリダイズできるプライマーを用
いると、感染したニワトリの小腸の上皮および粘膜から
調製されたゲノムＤＮＡ中のｓｓｒＲＮＡ遺伝子ユニッ
トまたは断片の各々を選択的に増幅することが可能にな
っている。ここで用いられるプライマーとは、一本鎖テ
ンプレートの一部に特異的に付着できる比較的短いオリ
ゴヌクレオチドであって、逆転写酵素がＲＮＡ配列（ｍ
ＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡ）をコピーするため、
あるいはＤＮＡポリメラーゼが相補鎖ＤＮＡを合成する
ための起点を形成するのに必要とされるものを指す。ま
たプライマーは特殊なポリメラーゼと一緒に用いて一本
鎖ゲノムＤＮＡに相補な鎖合成を行なうのに用いられ
る。すなわちポリメラーゼ連鎖反応である。ここで用い
られる相補的塩基対形成とは、当業界でよく知られてい
る塩基対合の法則にしたがって二重鎖核酸上で塩基が結
合することとして定義される。相補的塩基配列は、同じ
塩基対合の法則にしたがって片方の核酸鎖中の塩基配列
に対応するもう一方の鎖中の塩基配列である。これはエ
イメリアｒＲＮＡ遺伝子、ニワトリｒＲＮＡ遺伝子およ
びニワトリ小腸中に存在する可能性のある真核生物由来
のｒＲＮＡ遺伝子をも含む。この増幅は、小サブユニッ
トｒＲＮＡ遺伝子だけがＰＣＲ反応の結果濃縮されると
いう意味では選択的であるが、小サブユニットｒＲＮＡ
遺伝子のそれぞれが同程度に濃縮されるという点では非
特異的である。ＰＣＲ増幅の産物は蛍光色素結合アッセ
イを用いて定量し（Labarca とPaigen, Anal, Biochem.
102: 344-352 (1980)) 、当量ずつの増幅ＤＮＡ断片を
変性させて支持膜上に固定する。ついで種特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーション
反応を行ない、エイメリアの各種が増幅ＰＣＲ産物中に
存在するか否か、すなわちワクチン投与されたニワトリ
の小腸内に存在するか否かを決定する。
【００１０】ハイブリダイゼーション反応とは、２本の
一本鎖ＤＮＡの間あるいは一本鎖ＤＮＡとＲＮＡ分子間
の相補的塩基対合による２本鎖分子形成として定義され
る。全真核生物の小サブユニットｒＲＮＡ中で保存され
ている領域のＰＣＲ産物に含まれる配列に由来するプロ
ーブをコントロールのハイブリダイゼーションプローブ
として用い、変性をうけフィルター上に固定されたＤＮ
Ａの量を標準化する。エイメリアの各々の種から調製さ
れたゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いたスタンダ
ードを各ハイブリダイゼーションフィルター上に置く
が、これらは標準曲線を求めるのに用いられ、またハイ
ブリダイゼーションの特異性のスタンダードともなる。
各々のフィルターの放射活性はモレキュラーダイナミッ
クスホスホルイメージャー（MolecularDynamics Phosph
orImager(Johnstoneら、Electrophoresis ：355-360 (1
990)) により測定する。以下の方法はエイメリアの小サ
ブユニットリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子をクロ
ーン化するのに用いる。以下の方法がエイメリアの小サ
ブユニットｒＲＮＡをクローン化するにの用いられる唯
一の方法ではなく当業界で知られている他の方法も用い
ることができる。実験室株であるE. acervulia、 E. ma
xima、 E. mitis 、 E. necatrix、 E. praecox とE.te
nella のオーシストは、ブロイラーのニワトリを経口感
染させて繁殖させた。Eimeria tenella のオーシストは
感染後５−７日のニワトリの盲腸の内容物から分離し
た。盲腸の内容物は蒸留水中でワーリングブレンダーを
用いて物理的に破砕し、ペプシンで消化した。消化のの
ちに蒸留水中の残渣を遠心で除いた。他のエイメリア種
はそれぞれ感染後３−８日後に糞を集めてそこから分離
した。糞は蒸留水で約１０倍に希釈し、内容物を篩いを
通した。順々に目の細かくなる篩いを通すことにより糞
の残渣は相当除かれる。部分的に精製された各エイメリ
ア種のオーシストは、約２．２Ｍショ糖に浮遊させるこ
とにより回収される（Jackson, Parasitol. 54: 87-93
(1964)、さらに５．２５％の次亜塩素酸ナトリウム水溶
液中で４０℃で約１０分間インキュベートして処理す
る。次亜塩素酸ナトリウムは滅菌リン酸緩衝整理食塩水
（ＰＢＳ）（ｐＨ７．６）で数回洗浄して除き、精製さ
れ、滅菌されたオーシストが得られる。種類によってオ
ーシストはＰＢＳまたは滅菌水中で振とうしながら約２
０℃の水浴中で２４から６０時間胞子形成させる（Edga
r, Trans. Am. Micr.Soc. 62: 237-242(1954)) 。胞子
形成後オーシストはＰＢＳで数回洗浄する。
一本鎖ＤＮＡの間あるいは一本鎖ＤＮＡとＲＮＡ分子間
の相補的塩基対合による２本鎖分子形成として定義され
る。全真核生物の小サブユニットｒＲＮＡ中で保存され
ている領域のＰＣＲ産物に含まれる配列に由来するプロ
ーブをコントロールのハイブリダイゼーションプローブ
として用い、変性をうけフィルター上に固定されたＤＮ
Ａの量を標準化する。エイメリアの各々の種から調製さ
れたゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いたスタンダ
ードを各ハイブリダイゼーションフィルター上に置く
が、これらは標準曲線を求めるのに用いられ、またハイ
ブリダイゼーションの特異性のスタンダードともなる。
各々のフィルターの放射活性はモレキュラーダイナミッ
クスホスホルイメージャー（MolecularDynamics Phosph
orImager(Johnstoneら、Electrophoresis ：355-360 (1
990)) により測定する。以下の方法はエイメリアの小サ
ブユニットリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子をクロ
ーン化するのに用いる。以下の方法がエイメリアの小サ
ブユニットｒＲＮＡをクローン化するにの用いられる唯
一の方法ではなく当業界で知られている他の方法も用い
ることができる。実験室株であるE. acervulia、 E. ma
xima、 E. mitis 、 E. necatrix、 E. praecox とE.te
nella のオーシストは、ブロイラーのニワトリを経口感
染させて繁殖させた。Eimeria tenella のオーシストは
感染後５−７日のニワトリの盲腸の内容物から分離し
た。盲腸の内容物は蒸留水中でワーリングブレンダーを
用いて物理的に破砕し、ペプシンで消化した。消化のの
ちに蒸留水中の残渣を遠心で除いた。他のエイメリア種
はそれぞれ感染後３−８日後に糞を集めてそこから分離
した。糞は蒸留水で約１０倍に希釈し、内容物を篩いを
通した。順々に目の細かくなる篩いを通すことにより糞
の残渣は相当除かれる。部分的に精製された各エイメリ
ア種のオーシストは、約２．２Ｍショ糖に浮遊させるこ
とにより回収される（Jackson, Parasitol. 54: 87-93
(1964)、さらに５．２５％の次亜塩素酸ナトリウム水溶
液中で４０℃で約１０分間インキュベートして処理す
る。次亜塩素酸ナトリウムは滅菌リン酸緩衝整理食塩水
（ＰＢＳ）（ｐＨ７．６）で数回洗浄して除き、精製さ
れ、滅菌されたオーシストが得られる。種類によってオ
ーシストはＰＢＳまたは滅菌水中で振とうしながら約２
０℃の水浴中で２４から６０時間胞子形成させる（Edga
r, Trans. Am. Micr.Soc. 62: 237-242(1954)) 。胞子
形成後オーシストはＰＢＳで数回洗浄する。
【００１１】胞子形成したオーシストは滅菌した３ｍｍ
のガラスビーズと振とうして破砕する。ガラスビーズは
オーシストの懸濁液に加えて、渦巻きミキサーで約２分
間勢いよく攪拌する。時々破砕の具合を顕微鏡で調べ、
約５０％が破壊されたらガラスビーズを沈降させビーズ
の上のサンプルを等容量のパーコール（ファルマシア）
と混合する。破壊されたオーシストは４℃約２０００×
ｇから約５０００×ｇで約１０分間遠心してスポロシス
トに富んだ画分をペレットとして得る。未破壊のオーシ
ストは５０％パーコールの上に層となるのでこれを取っ
てＰＢＳで洗浄し、ガラスビーズと混ぜて先に述べた様
に再度攪拌する。パーコール分画後に未破砕のオーシス
トがほとんど残らないようになるまでこの操作を繰り返
す（３−４回）。スポロシストペレットは一緒にしてＰ
ＢＳで数回洗浄する。
のガラスビーズと振とうして破砕する。ガラスビーズは
オーシストの懸濁液に加えて、渦巻きミキサーで約２分
間勢いよく攪拌する。時々破砕の具合を顕微鏡で調べ、
約５０％が破壊されたらガラスビーズを沈降させビーズ
の上のサンプルを等容量のパーコール（ファルマシア）
と混合する。破壊されたオーシストは４℃約２０００×
ｇから約５０００×ｇで約１０分間遠心してスポロシス
トに富んだ画分をペレットとして得る。未破壊のオーシ
ストは５０％パーコールの上に層となるのでこれを取っ
てＰＢＳで洗浄し、ガラスビーズと混ぜて先に述べた様
に再度攪拌する。パーコール分画後に未破砕のオーシス
トがほとんど残らないようになるまでこの操作を繰り返
す（３−４回）。スポロシストペレットは一緒にしてＰ
ＢＳで数回洗浄する。
【００１２】スポロシストは０．０１Ｍトリス（ｐＨ
８．０）、０．２ＭＮａＣｌでほぼ１ｍｌ当たり１０8
になる様に希釈する。懸濁液を１％ドデシル硫酸ナトリ
ウムと約１０ｍＭＥＤＴＡを含むように調整すると、膜
が溶解する。放出されたゲノムＤＮＡをプロテイナーゼ
Ｋ（１５０μｇ/ ｍｌ）で約３０分間６５℃で消化する
ことにより可溶化しゲノムＤＮＡを緩衝液で飽和したフ
ェノール（ｐＨ約７．６）で２回、フェノール/ クロロ
ホルム/ イソアミルアルコール（約２５：２４：１）で
２回、クロロホルム/ アミルアルコール（約２４：１）
で２回抽出する。最終の水層を１０ｍＭトリス（ｐＨ
８．０）、１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０）中で一晩透析する。ＤＮＡと一緒に精製され
てきたＲＮＡは、熱失活させたＲＮａｓｅＡを１５０μ
ｇ/ ｍｌの濃度で用いて消化することにより選択的に透
析物中から除去する。サンプルは約１時間約３７℃でイ
ンキュベートする。ＲＴＮａｓｅや他の混在蛋白質は再
度プロテイナーゼＫで消化して除去する（約１５０μｇ
/ ｍｌ、約３０分間３７℃処理）。ついでゲノムＤＮＡ
を上に述べたように有機溶媒により順番に抽出する。最
終の水層は約０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと約２．
５容量の約１００％のエタノールを加えて沈殿させる。
グリコーゲンを２０μｇ/ ｍｌになるように加えてキャ
リヤーとする。ペレットを約７０％のエタノールで２回
洗浄する。ゲノムＤＮＡのペレットはひっくりかえして
風乾し、約１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍ
ＭＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）または蒸留水中に約５−８×
１０8 スポロシスト相当物/ ｍｌとなるように懸濁し、
２６０ｎｍの吸収により定量する。ＤＮＡの一部をアガ
ロースゲル電気泳動により分析し、１）分光吸収による
濃度、２）残存ＲＮＡが存在しないこと、３）高分子量
に保たれていること、の３点を確認する。
８．０）、０．２ＭＮａＣｌでほぼ１ｍｌ当たり１０8
になる様に希釈する。懸濁液を１％ドデシル硫酸ナトリ
ウムと約１０ｍＭＥＤＴＡを含むように調整すると、膜
が溶解する。放出されたゲノムＤＮＡをプロテイナーゼ
Ｋ（１５０μｇ/ ｍｌ）で約３０分間６５℃で消化する
ことにより可溶化しゲノムＤＮＡを緩衝液で飽和したフ
ェノール（ｐＨ約７．６）で２回、フェノール/ クロロ
ホルム/ イソアミルアルコール（約２５：２４：１）で
２回、クロロホルム/ アミルアルコール（約２４：１）
で２回抽出する。最終の水層を１０ｍＭトリス（ｐＨ
８．０）、１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０）中で一晩透析する。ＤＮＡと一緒に精製され
てきたＲＮＡは、熱失活させたＲＮａｓｅＡを１５０μ
ｇ/ ｍｌの濃度で用いて消化することにより選択的に透
析物中から除去する。サンプルは約１時間約３７℃でイ
ンキュベートする。ＲＴＮａｓｅや他の混在蛋白質は再
度プロテイナーゼＫで消化して除去する（約１５０μｇ
/ ｍｌ、約３０分間３７℃処理）。ついでゲノムＤＮＡ
を上に述べたように有機溶媒により順番に抽出する。最
終の水層は約０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと約２．
５容量の約１００％のエタノールを加えて沈殿させる。
グリコーゲンを２０μｇ/ ｍｌになるように加えてキャ
リヤーとする。ペレットを約７０％のエタノールで２回
洗浄する。ゲノムＤＮＡのペレットはひっくりかえして
風乾し、約１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍ
ＭＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）または蒸留水中に約５−８×
１０8 スポロシスト相当物/ ｍｌとなるように懸濁し、
２６０ｎｍの吸収により定量する。ＤＮＡの一部をアガ
ロースゲル電気泳動により分析し、１）分光吸収による
濃度、２）残存ＲＮＡが存在しないこと、３）高分子量
に保たれていること、の３点を確認する。
【００１３】リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子座は
真核生物界の系統発生的関係を確立するのに用いられて
成功もたらした情報の宝庫である（Hasegawaら、J. Mo
l. Evol. 22: 32-80 (1985)) 。非常に多様な生物の小
サブユニットｒＲＮＡの配列が最近蓄積されてきている
（Damsら、Nucleic Acids Res. 16S:r87-r173 (1988)、
Neefs ら、Nucleic Acids Res. 18S:2237-2317 (199
0))。これら核酸配列の比較分析から劇的にまで保存さ
れた配列の類似性とかなりの配列のゆらぎ、すなわち多
様性を示す領域が示されている。小サブユニットｒＲＮ
Ａ（ｓｓｒＲＮＡ）のコンセンサス配列の３’と５’末
端の両方に近い領域で真核生物界に近いものを選択し
た。コンセンサス配列とは核酸の特定の領域中で類似し
ていることが観察された配列の大きな一群から得られた
ヌクレオチド配列と定義される。オリゴヌクレオチドプ
ライマーはこれらの配列から選択された。
真核生物界の系統発生的関係を確立するのに用いられて
成功もたらした情報の宝庫である（Hasegawaら、J. Mo
l. Evol. 22: 32-80 (1985)) 。非常に多様な生物の小
サブユニットｒＲＮＡの配列が最近蓄積されてきている
（Damsら、Nucleic Acids Res. 16S:r87-r173 (1988)、
Neefs ら、Nucleic Acids Res. 18S:2237-2317 (199
0))。これら核酸配列の比較分析から劇的にまで保存さ
れた配列の類似性とかなりの配列のゆらぎ、すなわち多
様性を示す領域が示されている。小サブユニットｒＲＮ
Ａ（ｓｓｒＲＮＡ）のコンセンサス配列の３’と５’末
端の両方に近い領域で真核生物界に近いものを選択し
た。コンセンサス配列とは核酸の特定の領域中で類似し
ていることが観察された配列の大きな一群から得られた
ヌクレオチド配列と定義される。オリゴヌクレオチドプ
ライマーはこれらの配列から選択された。
【化１０】 オリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムズの３
８０Ｂ機を用いて合成し、製造業者の推薦する方法にし
たがって生成した。ＥＲＩＢ １（配列番号１）プライ
マーは真核生物ｓｓｒＲＮＡ遺伝子の５’末端から１０
ヌクレオチドとは離れていないコンセンサス配列を表わ
す。ＥＲＩＢ １０（配列番号２）プライマーは、真核
生物ｓｓｒＲＮＡ遺伝子の３’末端から約２０ヌクレオ
チド離れて位置するコンセンサス配列に対し逆相補性で
ある。これら２つのオリゴヌクレオチドは一緒になると
ｓｓｒＲＮＡ遺伝子配列のほとんどをカバーする。ＥＲ
ＩＢ１とＥＲＩＢ１０だけがｓｓｒＲＮＡ遺伝子または
その選択された断片を増幅するのに用いることのできる
プライマーではない。本発明から意図するゴールに到達
できる他のプライマーを考案することも可能であると思
われる。
８０Ｂ機を用いて合成し、製造業者の推薦する方法にし
たがって生成した。ＥＲＩＢ １（配列番号１）プライ
マーは真核生物ｓｓｒＲＮＡ遺伝子の５’末端から１０
ヌクレオチドとは離れていないコンセンサス配列を表わ
す。ＥＲＩＢ １０（配列番号２）プライマーは、真核
生物ｓｓｒＲＮＡ遺伝子の３’末端から約２０ヌクレオ
チド離れて位置するコンセンサス配列に対し逆相補性で
ある。これら２つのオリゴヌクレオチドは一緒になると
ｓｓｒＲＮＡ遺伝子配列のほとんどをカバーする。ＥＲ
ＩＢ１とＥＲＩＢ１０だけがｓｓｒＲＮＡ遺伝子または
その選択された断片を増幅するのに用いることのできる
プライマーではない。本発明から意図するゴールに到達
できる他のプライマーを考案することも可能であると思
われる。
【００１４】すでに述べたように各エイメリア種のゲノ
ムＤＮＡ標品中に含まれるｓｓｒＲＮＡ遺伝子を選択的
に増幅するために、ＥＲＩＢ１（配列番号１）とＥＲＩ
Ｂ１０（配列番号２）をプライマーペアとして用いてポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、Saiki ら、Science 239:
487-491(1988))を行なった。ゲノムＤＮＡは蛍光色素結
合法を用いて定量し（Lebarca とPaige, Anal. Bioche.
102: 344-352 (1980)) 、蒸留水で最終濃度が約２．５
ｎｇ／μｌになるよう希釈して、ＰＣＲのテンプレート
として用いた。１０倍濃度の反応バッファー（約１００
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ約８．３）、約５００ｍＭＫ
Ｃｌ、約１５ｍＭＭｇＣｌ2 、約０．０１％ゼラチンか
らなる）を調製し、またトリス−ＨＣｌ（ｐＨ約７．
６）で緩衝した約１００ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰの保存原液を作成した。まず、反応混
合液は以下の成分をその最終濃度になるようこの順番で
混合した。水、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ（各約２００μＭ）、約１倍濃度の反応バッファー、
約１μＭづつの２種のオリゴヌクレオチドプライマー
（ＥＲＩＢ１とＥＲＩＢ１０）（配列番号１と２）、約
１．２５ＵＴａｑＤＮＡポリメラーゼ。反応混液はＰＣ
Ｒ専用試験管に約９０μｌの反応カクテルと１０μｌ
（２５ｎｇ）のゲノムＤＮＡを合わせて調製する。反応
液は約５０μｌの軽い鉱物油を上層し、下記のようにプ
ログラムしたパーキンエルマーシータスＤＮＡサーマル
サイクラー中に置く： １）変性のため約９４℃約６０秒間 ２）アニーリングのため約５０℃で約９０秒間 ３）ポリメライゼーションのため約７２℃で約１２０秒
間 のサイクルを約３５サイクル、ついで伸長のため７２℃
で約１０分間を１サイクル。
ムＤＮＡ標品中に含まれるｓｓｒＲＮＡ遺伝子を選択的
に増幅するために、ＥＲＩＢ１（配列番号１）とＥＲＩ
Ｂ１０（配列番号２）をプライマーペアとして用いてポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、Saiki ら、Science 239:
487-491(1988))を行なった。ゲノムＤＮＡは蛍光色素結
合法を用いて定量し（Lebarca とPaige, Anal. Bioche.
102: 344-352 (1980)) 、蒸留水で最終濃度が約２．５
ｎｇ／μｌになるよう希釈して、ＰＣＲのテンプレート
として用いた。１０倍濃度の反応バッファー（約１００
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ約８．３）、約５００ｍＭＫ
Ｃｌ、約１５ｍＭＭｇＣｌ2 、約０．０１％ゼラチンか
らなる）を調製し、またトリス−ＨＣｌ（ｐＨ約７．
６）で緩衝した約１００ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰの保存原液を作成した。まず、反応混
合液は以下の成分をその最終濃度になるようこの順番で
混合した。水、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ（各約２００μＭ）、約１倍濃度の反応バッファー、
約１μＭづつの２種のオリゴヌクレオチドプライマー
（ＥＲＩＢ１とＥＲＩＢ１０）（配列番号１と２）、約
１．２５ＵＴａｑＤＮＡポリメラーゼ。反応混液はＰＣ
Ｒ専用試験管に約９０μｌの反応カクテルと１０μｌ
（２５ｎｇ）のゲノムＤＮＡを合わせて調製する。反応
液は約５０μｌの軽い鉱物油を上層し、下記のようにプ
ログラムしたパーキンエルマーシータスＤＮＡサーマル
サイクラー中に置く： １）変性のため約９４℃約６０秒間 ２）アニーリングのため約５０℃で約９０秒間 ３）ポリメライゼーションのため約７２℃で約１２０秒
間 のサイクルを約３５サイクル、ついで伸長のため７２℃
で約１０分間を１サイクル。
【００１５】増幅反応産物を５μｌとり、ＴＡＥ緩衝液
（４０ｍＭトリス−酢酸、２ｍＭＥＤＴＡ）中でＤＮＡ
サイズ標準品とともにアガロースゲル電気泳動をおこな
った。他の真核生物ｓｓｒＲＮＡ遺伝子からの類推から
予想される大きさである約１．８ｋｂ長の特徴的なバン
ドが出現したことは、ＥＲＩＢ１（配列番号１）とＥＲ
ＩＢ１０（配列番号２）が忠実にエイメリアのｓｓｒＲ
ＮＡ遺伝子にハイブリダイズし、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼがこれらのプライマーの３’末端から伸長する反応
産物を合成したことを示唆する。定義によれば１．８ｋ
ｂＰＣＲ産物の両末端は入れたオリゴヌクレオチドに相
当し、平滑末端でなければならない。しかし、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼはテンプレートによらないヌクレオチ
ド、特にｄＡＴＰをＰＣＲ産物である２重鎖の３’末端
に付加する傾向がある（Clarke, Nucleic Acids Res. 1
6: 9677-9686 (1988))。クローニング効率を増すため、
ＰＣＲ産物の末端はＴ４ＤＮＡポリメラーゼか細菌のＤ
ＮＡポリメラーゼのクレノウ断片により平滑末端に「み
がき上げ」なけらばならない。反応産物はフェノールで
１回、フェノール/ クロロホルム/ イソアミルアルコー
ル混合物で１回、クロロホルム/ イソアミルアルコール
で１回、前に述べたように抽出する。ＤＮＡを酢酸ナト
リウム/ エタノールで沈殿させ、ペレットを７０％エタ
ノールで２回洗浄する。クレノウ断片反応のために、Ｄ
ＮＡ（約１−１０μｇ）を約１５μｌの水に懸濁し、約
２μｌの１０倍濃度ニックトランスレーションバッファ
ー（約０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１
ＭＭｇＳＯ4 、１ｍＭジチオスレイトール、５００μｇ
/ ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ペンタックスフラ
クションＶ）、１．２５ｍＭの４種のｄＮＴＰ溶液約２
μｌと１μｌ（＝５ユニット）のクレノウ断片を混合す
る。反応は約１４℃で約１時間行ない約６５℃で約１０
分間加熱して反応を終了させる。磨いた１．８ｋｂＤＮ
Ａ産物はＧ２５のカラムを通過させ、フェノールで１
回、クロロホルム/ イソアミルアルコールで２回、前に
述べたように抽出する。ＤＮＡを酢酸ナトリウム/ エタ
ノールで沈殿させ、ペレットを７０％エタノールで２回
洗浄する。ＤＮＡを約３６μｌの水に再懸濁し、約４μ
ｌの０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１０ｍＭ
スペルミジン、１ｍＭＥＤＴＡと混合する。反応混合物
は約７０℃で約５分間インキュベートし、ついで氷上で
急速に冷却する。上記の４０μｌの反応物に５μｌの１
０倍濃度平滑末端キナーゼバッファー（０．５Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．１ＭＭｇＣｌ2 、５０ｍ
Ｍジチオスレトール、５０％グリセロール）、約５μｌ
のＡＴＰの１０ｍＭ溶液および２μｌ（＝２０Ｕ）のＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを加える。反応は約３７℃
で約３０分間行ない約２μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加え
て反応を終了させる。ＴＥバッファーを加えて反応混液
を約１００μｌにし、反応産物をフェノールで１回、フ
ェノール/ クロロホルム/ イソアミルアルコール混合物
で１回、クロロホルム/ イソアミルアルコールで１回、
前に述べたように抽出する。ＤＮＡを酢酸ナトリウム/
エタノールで沈殿させ、ペレットを７０％エタノールで
２回洗浄する。ＤＮＡは２０μｌの水に再懸濁し、２６
０ｎｍの吸収で定量する。
（４０ｍＭトリス−酢酸、２ｍＭＥＤＴＡ）中でＤＮＡ
サイズ標準品とともにアガロースゲル電気泳動をおこな
った。他の真核生物ｓｓｒＲＮＡ遺伝子からの類推から
予想される大きさである約１．８ｋｂ長の特徴的なバン
ドが出現したことは、ＥＲＩＢ１（配列番号１）とＥＲ
ＩＢ１０（配列番号２）が忠実にエイメリアのｓｓｒＲ
ＮＡ遺伝子にハイブリダイズし、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼがこれらのプライマーの３’末端から伸長する反応
産物を合成したことを示唆する。定義によれば１．８ｋ
ｂＰＣＲ産物の両末端は入れたオリゴヌクレオチドに相
当し、平滑末端でなければならない。しかし、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼはテンプレートによらないヌクレオチ
ド、特にｄＡＴＰをＰＣＲ産物である２重鎖の３’末端
に付加する傾向がある（Clarke, Nucleic Acids Res. 1
6: 9677-9686 (1988))。クローニング効率を増すため、
ＰＣＲ産物の末端はＴ４ＤＮＡポリメラーゼか細菌のＤ
ＮＡポリメラーゼのクレノウ断片により平滑末端に「み
がき上げ」なけらばならない。反応産物はフェノールで
１回、フェノール/ クロロホルム/ イソアミルアルコー
ル混合物で１回、クロロホルム/ イソアミルアルコール
で１回、前に述べたように抽出する。ＤＮＡを酢酸ナト
リウム/ エタノールで沈殿させ、ペレットを７０％エタ
ノールで２回洗浄する。クレノウ断片反応のために、Ｄ
ＮＡ（約１−１０μｇ）を約１５μｌの水に懸濁し、約
２μｌの１０倍濃度ニックトランスレーションバッファ
ー（約０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１
ＭＭｇＳＯ4 、１ｍＭジチオスレイトール、５００μｇ
/ ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ペンタックスフラ
クションＶ）、１．２５ｍＭの４種のｄＮＴＰ溶液約２
μｌと１μｌ（＝５ユニット）のクレノウ断片を混合す
る。反応は約１４℃で約１時間行ない約６５℃で約１０
分間加熱して反応を終了させる。磨いた１．８ｋｂＤＮ
Ａ産物はＧ２５のカラムを通過させ、フェノールで１
回、クロロホルム/ イソアミルアルコールで２回、前に
述べたように抽出する。ＤＮＡを酢酸ナトリウム/ エタ
ノールで沈殿させ、ペレットを７０％エタノールで２回
洗浄する。ＤＮＡを約３６μｌの水に再懸濁し、約４μ
ｌの０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１０ｍＭ
スペルミジン、１ｍＭＥＤＴＡと混合する。反応混合物
は約７０℃で約５分間インキュベートし、ついで氷上で
急速に冷却する。上記の４０μｌの反応物に５μｌの１
０倍濃度平滑末端キナーゼバッファー（０．５Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．１ＭＭｇＣｌ2 、５０ｍ
Ｍジチオスレトール、５０％グリセロール）、約５μｌ
のＡＴＰの１０ｍＭ溶液および２μｌ（＝２０Ｕ）のＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを加える。反応は約３７℃
で約３０分間行ない約２μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加え
て反応を終了させる。ＴＥバッファーを加えて反応混液
を約１００μｌにし、反応産物をフェノールで１回、フ
ェノール/ クロロホルム/ イソアミルアルコール混合物
で１回、クロロホルム/ イソアミルアルコールで１回、
前に述べたように抽出する。ＤＮＡを酢酸ナトリウム/
エタノールで沈殿させ、ペレットを７０％エタノールで
２回洗浄する。ＤＮＡは２０μｌの水に再懸濁し、２６
０ｎｍの吸収で定量する。
【００１６】磨いた１．８ｋｂのＤＮＡ産物はアガロー
スゲルで精製して残存するオリゴヌクレオチドプライマ
ーと非特異的ＰＣＲ産物を除去する。目的のバンドを含
むゲルを切り出して溶かし、ＤＮＡをジェネクリーンＩ
Ｉ（Bio 101 Inc., VogelsteinとGillespie, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 76: 615-619(1979))を用い、製造業
者の指示通り溶出する。ついで溶出したＤＮＡ産物を２
６０ｎｍの吸収で定量する。
スゲルで精製して残存するオリゴヌクレオチドプライマ
ーと非特異的ＰＣＲ産物を除去する。目的のバンドを含
むゲルを切り出して溶かし、ＤＮＡをジェネクリーンＩ
Ｉ（Bio 101 Inc., VogelsteinとGillespie, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 76: 615-619(1979))を用い、製造業
者の指示通り溶出する。ついで溶出したＤＮＡ産物を２
６０ｎｍの吸収で定量する。
【００１７】ファジミドクローニングベクターｐＵＣ１
２０（Vieria, 「２レプリコン線状ファージと一本鎖プ
ラスミドＤＮＡの製造」博士論文、ミネソタ大学（１９
８９））を、そのポリリンカー中の唯一のＳｍａＩ部位
で切断する。他の適当なクローニングベクターとしては
これに限定されないがｐＧＥＭシリーズ（プロメガ）と
ｐブルースクリプトＩＩシリーズ（ストラタジーンクロ
ーニングシステム）が含まれる。切断は分析用アガロー
スゲル電気泳動でモニターする。線状化されたＤＮＡは
有機溶媒で抽出し、前に述べたように沈殿させて７０％
エタノールで洗浄する。プラスミドの各ストランドの
５’末端をコウシ小腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理
して自己連結の頻度を下げる。これは線状化プラスミド
約１０μｇを５μｌの１０倍濃度ＣＩＰバッファー（約
０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、約１０ｍＭＭ
ｇＣｌ2 、約１ｍＭＺｎＣｌ2 、約１０ｍＭスペルミジ
ン）、約１μｌ（１ユニット）のＣＩＰと混合して最終
反応容量を５０μｌとして行なう。反応は約３７℃で約
１５分間行ない、ついで約５６℃で約１５分間行なう。
ＣＩＰをさらに同じ量加え、反応を同様に行なわせる。
反応を終了させるには約４０μｌのＨ2 Ｏ、約１０μｌ
の約１０倍濃度のＳＴＥバッファー（約１００ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、約１ＭＮａＣｌ、約１０ｍ
ＭＥＤＴＡ）、約２．５μｌの約２０％ＳＤＳとを加
え、約６８℃で約１５分間加熱する。線状化され脱リン
酸化されたベクターは、前に述べたように抽出し、沈殿
させ、洗浄する。ついでゲル精製したｓｓｒＲＮＡ遺伝
子ＰＣＲ産物を平滑化したポリリンカー中のＳｍａＩ部
位に連結する。約１００ｎｇの線状化ベクターを２０μ
ｌの反応混液中等量のＰＣＲ産物のそれぞれと混合す
る。この反応混液は約６６ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、約５ｍＭＭｇＣｌ2 、約５ｍＭジチオスレイ
トール、約１ｍＭＡＴＰからなっている。反応はＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（約４００ユニット）の添加で開始し、約
１２−１６分間約４℃で進行させる。
２０（Vieria, 「２レプリコン線状ファージと一本鎖プ
ラスミドＤＮＡの製造」博士論文、ミネソタ大学（１９
８９））を、そのポリリンカー中の唯一のＳｍａＩ部位
で切断する。他の適当なクローニングベクターとしては
これに限定されないがｐＧＥＭシリーズ（プロメガ）と
ｐブルースクリプトＩＩシリーズ（ストラタジーンクロ
ーニングシステム）が含まれる。切断は分析用アガロー
スゲル電気泳動でモニターする。線状化されたＤＮＡは
有機溶媒で抽出し、前に述べたように沈殿させて７０％
エタノールで洗浄する。プラスミドの各ストランドの
５’末端をコウシ小腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理
して自己連結の頻度を下げる。これは線状化プラスミド
約１０μｇを５μｌの１０倍濃度ＣＩＰバッファー（約
０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、約１０ｍＭＭ
ｇＣｌ2 、約１ｍＭＺｎＣｌ2 、約１０ｍＭスペルミジ
ン）、約１μｌ（１ユニット）のＣＩＰと混合して最終
反応容量を５０μｌとして行なう。反応は約３７℃で約
１５分間行ない、ついで約５６℃で約１５分間行なう。
ＣＩＰをさらに同じ量加え、反応を同様に行なわせる。
反応を終了させるには約４０μｌのＨ2 Ｏ、約１０μｌ
の約１０倍濃度のＳＴＥバッファー（約１００ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、約１ＭＮａＣｌ、約１０ｍ
ＭＥＤＴＡ）、約２．５μｌの約２０％ＳＤＳとを加
え、約６８℃で約１５分間加熱する。線状化され脱リン
酸化されたベクターは、前に述べたように抽出し、沈殿
させ、洗浄する。ついでゲル精製したｓｓｒＲＮＡ遺伝
子ＰＣＲ産物を平滑化したポリリンカー中のＳｍａＩ部
位に連結する。約１００ｎｇの線状化ベクターを２０μ
ｌの反応混液中等量のＰＣＲ産物のそれぞれと混合す
る。この反応混液は約６６ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、約５ｍＭＭｇＣｌ2 、約５ｍＭジチオスレイ
トール、約１ｍＭＡＴＰからなっている。反応はＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（約４００ユニット）の添加で開始し、約
１２−１６分間約４℃で進行させる。
【００１８】細菌細胞は以下の方法によりコンピテント
となり、外来のＤＮＡを取り込むことができるようにな
る。滅菌２倍濃度ＹＴ細菌培地（１リットル当たり約１
６ｇのバクトトリプトン、約１０ｇのイーストエキス、
約５ｇのＮａＣｌ含有）の一定量（１回の形質転換に約
２ｍｌ）に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＶ１１８４のコロ
ニーを１個分植菌し、約３７℃で勢いよく攪拌しながら
６００ｎｍの光学密度が約０．６になるまで培養する。
他の適当な細菌宿主としては、ＭＮ５２２、ＪＭ１０
１、ＴＢ１およびＸＬ１−Ｂｌｕｅを挙げることができ
るがこれらとは限らない。細菌細胞は約１０００×ｇ、
約４℃で約５分間遠心して集菌する。得られた細胞のペ
レットは、もとの培養液の２分の１の量の滅菌した約５
０ｍＭＣａＣｌ2 に穏やかに懸濁する。懸濁液を氷上に
約２０分間置き、細胞を再度遠心により集菌する。つい
で細胞を１０分の１量の滅菌５０ｍＭＣａＣｌ2 に穏や
かに懸濁する。細菌懸濁液は４℃に１６−２４時間置
く。２０μｌの連結反応混合物から２μｌと１８μｌを
滅菌ポリプロピレン試験管にそれぞれ入れる。連結反応
混液の入った試験管および適当な連結と形質転換のコン
トロール試験管ごとに約１００μｌのコンピテントな細
菌を加え、氷上に４０分間置く。その後、細菌を約４２
℃で９０秒間インキュベートすることにより、ヒートシ
ョックを与え、ついで室温に５分間おいて回復させる。
各形質転換試験管内容物を２ＸＹＴ寒天平板に蒔く。こ
の培地はプラスミドを有する菌を選択し、維持するため
に、約５０ｍｇ/ Ｌのアンピシリンを含んでいる。
となり、外来のＤＮＡを取り込むことができるようにな
る。滅菌２倍濃度ＹＴ細菌培地（１リットル当たり約１
６ｇのバクトトリプトン、約１０ｇのイーストエキス、
約５ｇのＮａＣｌ含有）の一定量（１回の形質転換に約
２ｍｌ）に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＶ１１８４のコロ
ニーを１個分植菌し、約３７℃で勢いよく攪拌しながら
６００ｎｍの光学密度が約０．６になるまで培養する。
他の適当な細菌宿主としては、ＭＮ５２２、ＪＭ１０
１、ＴＢ１およびＸＬ１−Ｂｌｕｅを挙げることができ
るがこれらとは限らない。細菌細胞は約１０００×ｇ、
約４℃で約５分間遠心して集菌する。得られた細胞のペ
レットは、もとの培養液の２分の１の量の滅菌した約５
０ｍＭＣａＣｌ2 に穏やかに懸濁する。懸濁液を氷上に
約２０分間置き、細胞を再度遠心により集菌する。つい
で細胞を１０分の１量の滅菌５０ｍＭＣａＣｌ2 に穏や
かに懸濁する。細菌懸濁液は４℃に１６−２４時間置
く。２０μｌの連結反応混合物から２μｌと１８μｌを
滅菌ポリプロピレン試験管にそれぞれ入れる。連結反応
混液の入った試験管および適当な連結と形質転換のコン
トロール試験管ごとに約１００μｌのコンピテントな細
菌を加え、氷上に４０分間置く。その後、細菌を約４２
℃で９０秒間インキュベートすることにより、ヒートシ
ョックを与え、ついで室温に５分間おいて回復させる。
各形質転換試験管内容物を２ＸＹＴ寒天平板に蒔く。こ
の培地はプラスミドを有する菌を選択し、維持するため
に、約５０ｍｇ/ Ｌのアンピシリンを含んでいる。
【００１９】プラスミドを有するクローンはアンピシリ
ン存在下で平板に生育できる性質で選択する。シングル
コロニーを約５ｍｌの２×ＹＴ／ＡＭＰ（アンピシリン
５０ｍｇ/ ｌを含む２ＸＹＴ培地）に植菌し、これを勢
いよく振とうしながら約３７℃で一晩培養する。培養物
の約１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに入れ、エッ
ペンドルフ遠心機で最低１分間遠心して集菌する。培養
液の残りは約４℃で保存して遺伝ストックとする。細菌
ペレットの上の培地は吸引して除き、ペレットを約１０
０μｌの、新たに調製した約５０ｍＭグルコース、約１
０ｍＭＥＤＴＡ、約２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、約４ｍｇ/ ｍｌリゾチームの冷溶液と混合して懸
濁する。この混合物を室温で約５分間インキュベートし
てから、各チューブに新たに調製した、０．２ＮＮａＯ
Ｈ，約 1％ＳＤＳからなる冷溶液を２００μｌ加え、上
下を変えて穏やかに混合し、氷上に５分間置く。各チュ
ーブに、あらたに調製した、約５Ｍ酢酸カリウムを約６
ｍｌ、氷酢酸約１．１５ｍｌと約２．８５ｍｌの蒸留水
を含む冷溶液を約１５０μｌ加える。内容物をボルテッ
クスミキサーで穏やかに攪拌し、この混合物を氷上に約
５分間置く。細胞破片をエッペンドルフ遠心機で約４℃
１０分間遠心して除き、上清をフェノール/クロロホル
ム/ イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出す
る。最終の水層に２倍容の室温１００％エタノールを加
えて、細胞ＤＮＡとプラスミドＤＮＡを沈殿させる。５
分間室温で遠心してペレットをとり、このペレットを７
０％エタノールで１回洗って手早く乾燥させる。この核
酸ペレットを約５０μｌのＴＥ（１ｍｌ当たり約２０μ
ｇのＤＮａｓｅを含まないＲＮａｓｅを含む）中に懸濁
し、約３７℃で約１５−３０分間インキュベートして定
量的に細胞性ＲＮＡを除去する。約１０μｇをとり、バ
ッファー中でＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲ１（おのおの約
２０ユニット）で完全に切断する（約３７℃、約６０分
間）。このバッファーは約５０ｍＭＮａＣｌ、約１００
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、および約５ｍＭＭ
ｇＣｌ2 からなる。制限酵素反応の生成物は、他の既知
のＤＮＡサイズマーカーと一緒にアガロースゲル電気泳
動にかけ、適切な挿入部分を有するプラスミドを同定す
る。予想された１．８ｋｂの挿入部分を有するこれら組
換えプラスミドは２番目の制限酵素（通常ＰｓｔＩ）で
切断して、（１）プラスミド中には挿入部分がただ１つ
存在することを確認し、（２）細菌プロモーターに対す
る挿入ＤＮＡの方向を確認する。これを行なうには、細
菌核酸をＲＮａｓｅ処理した残りの４０μｌから１０μ
ｌを取り、約１００ｍＭＮａＣｌ、約１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、約１０ｍＭＭｇＣｌ2 からなる
バッファー中、約２０ユニットのＰｓｔＩで約３７℃で
約６０分間切断する。制限酵素切断物は再度アガロース
ゲル電気泳動で分離する。
ン存在下で平板に生育できる性質で選択する。シングル
コロニーを約５ｍｌの２×ＹＴ／ＡＭＰ（アンピシリン
５０ｍｇ/ ｌを含む２ＸＹＴ培地）に植菌し、これを勢
いよく振とうしながら約３７℃で一晩培養する。培養物
の約１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに入れ、エッ
ペンドルフ遠心機で最低１分間遠心して集菌する。培養
液の残りは約４℃で保存して遺伝ストックとする。細菌
ペレットの上の培地は吸引して除き、ペレットを約１０
０μｌの、新たに調製した約５０ｍＭグルコース、約１
０ｍＭＥＤＴＡ、約２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、約４ｍｇ/ ｍｌリゾチームの冷溶液と混合して懸
濁する。この混合物を室温で約５分間インキュベートし
てから、各チューブに新たに調製した、０．２ＮＮａＯ
Ｈ，約 1％ＳＤＳからなる冷溶液を２００μｌ加え、上
下を変えて穏やかに混合し、氷上に５分間置く。各チュ
ーブに、あらたに調製した、約５Ｍ酢酸カリウムを約６
ｍｌ、氷酢酸約１．１５ｍｌと約２．８５ｍｌの蒸留水
を含む冷溶液を約１５０μｌ加える。内容物をボルテッ
クスミキサーで穏やかに攪拌し、この混合物を氷上に約
５分間置く。細胞破片をエッペンドルフ遠心機で約４℃
１０分間遠心して除き、上清をフェノール/クロロホル
ム/ イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出す
る。最終の水層に２倍容の室温１００％エタノールを加
えて、細胞ＤＮＡとプラスミドＤＮＡを沈殿させる。５
分間室温で遠心してペレットをとり、このペレットを７
０％エタノールで１回洗って手早く乾燥させる。この核
酸ペレットを約５０μｌのＴＥ（１ｍｌ当たり約２０μ
ｇのＤＮａｓｅを含まないＲＮａｓｅを含む）中に懸濁
し、約３７℃で約１５−３０分間インキュベートして定
量的に細胞性ＲＮＡを除去する。約１０μｇをとり、バ
ッファー中でＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲ１（おのおの約
２０ユニット）で完全に切断する（約３７℃、約６０分
間）。このバッファーは約５０ｍＭＮａＣｌ、約１００
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、および約５ｍＭＭ
ｇＣｌ2 からなる。制限酵素反応の生成物は、他の既知
のＤＮＡサイズマーカーと一緒にアガロースゲル電気泳
動にかけ、適切な挿入部分を有するプラスミドを同定す
る。予想された１．８ｋｂの挿入部分を有するこれら組
換えプラスミドは２番目の制限酵素（通常ＰｓｔＩ）で
切断して、（１）プラスミド中には挿入部分がただ１つ
存在することを確認し、（２）細菌プロモーターに対す
る挿入ＤＮＡの方向を確認する。これを行なうには、細
菌核酸をＲＮａｓｅ処理した残りの４０μｌから１０μ
ｌを取り、約１００ｍＭＮａＣｌ、約１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、約１０ｍＭＭｇＣｌ2 からなる
バッファー中、約２０ユニットのＰｓｔＩで約３７℃で
約６０分間切断する。制限酵素切断物は再度アガロース
ゲル電気泳動で分離する。
【００２０】適切なサイズの挿入部を含むクローンは、
ジデオキシ配列決定法（Sangerら、J. Mol. Biol. 143:
161-178 (1980))を用いて配列を決定する。ＫＯ７ヘル
パーファージを用いる一本鎖ファジミド配列決定用テン
プレートは、Vieria、「２レプリコン線状ファージと一
本鎖プラスミドＤＮＡの製造」博士論文、ミネソタ大学
（１９８９））の記載に正確にしたがって作成した。フ
ァジミドクローンから一本鎖テンプレートを作成するの
に使用できる他の市販のヘルパーファージとしては、Ｒ
４０８（プロメガ、ファジミドｐＧＥＭ−Ｚｆシリーズ
と細菌宿主ＭＮ５２２またはＪＭ１０１と共に用い
る）、またはＶＣＳＭ１３、およびＲ４０８（ストラタ
ジーンクローニングシステム、ｐブルースクリプトＩＩ
ファジミドシリーズ、細菌宿主ＸＬ−１Ｂｌｕｅもしく
はＮＭ５２２と共に使用する）が含まれる。あるいは、
二本鎖配列決定用テンプレートをジデオキシ法に用いる
こともできる。これらはCheng とSeeburg(DNA 4: 165-1
70 (1985))の方法により調製される。配列決定反応は、
特別に加工されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Tabor とRi
chardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4767-4771
(1987))を用いて行なう。この酵素はファルマシアＬＫ
Ｂバイオテクノロジーから市販されているもの、または
シークエナーゼＤＮＡポリメラーゼ（United States Bi
ochemical Corporation)である。反応はそれぞれのメー
カーの指示に従って行ない、反応産物は変性ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離した（Sangerら、J. Mol.
Biol. 143:161-178 (1980))。単離精製された、エイメ
リアの小サブユニットリボゾームＲＮＡをコードする遺
伝子の例は図１−７に示してある。ｓｓｒＲＮＡ遺伝子
のヌクレオチド配列を比較して、配列の保存および多様
性領域を決定した。比較して同定された多様性領域は表
１に示すプローブにより代表される。本発明は、エイメ
リア属のｓｓｒＲＮＡ遺伝子の多様性ＤＮＡ領域のすべ
てを包含するものである。さらに多様性領域とは、約１
から約５０ヌクレオチド長、または約１から１００ヌク
レオチド長のＤＮＡ配列であって、エイメリア属を形成
する種間で保存されていないものと定義される。種特異
的多様性配列は以下のエイメリア種のｓｓｒＲＮＡ内に
見出されることが好ましい。すなわちエイメリア・アセ
ルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・
ブルネッティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・
マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス
（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・ネカトリックス
（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・プレコックス
（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔ
ｅｎｅｌｌａ）である。ヌクレオチド配列の比較により
同定された多様性配列は図１−７に示す。
ジデオキシ配列決定法（Sangerら、J. Mol. Biol. 143:
161-178 (1980))を用いて配列を決定する。ＫＯ７ヘル
パーファージを用いる一本鎖ファジミド配列決定用テン
プレートは、Vieria、「２レプリコン線状ファージと一
本鎖プラスミドＤＮＡの製造」博士論文、ミネソタ大学
（１９８９））の記載に正確にしたがって作成した。フ
ァジミドクローンから一本鎖テンプレートを作成するの
に使用できる他の市販のヘルパーファージとしては、Ｒ
４０８（プロメガ、ファジミドｐＧＥＭ−Ｚｆシリーズ
と細菌宿主ＭＮ５２２またはＪＭ１０１と共に用い
る）、またはＶＣＳＭ１３、およびＲ４０８（ストラタ
ジーンクローニングシステム、ｐブルースクリプトＩＩ
ファジミドシリーズ、細菌宿主ＸＬ−１Ｂｌｕｅもしく
はＮＭ５２２と共に使用する）が含まれる。あるいは、
二本鎖配列決定用テンプレートをジデオキシ法に用いる
こともできる。これらはCheng とSeeburg(DNA 4: 165-1
70 (1985))の方法により調製される。配列決定反応は、
特別に加工されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Tabor とRi
chardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4767-4771
(1987))を用いて行なう。この酵素はファルマシアＬＫ
Ｂバイオテクノロジーから市販されているもの、または
シークエナーゼＤＮＡポリメラーゼ（United States Bi
ochemical Corporation)である。反応はそれぞれのメー
カーの指示に従って行ない、反応産物は変性ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離した（Sangerら、J. Mol.
Biol. 143:161-178 (1980))。単離精製された、エイメ
リアの小サブユニットリボゾームＲＮＡをコードする遺
伝子の例は図１−７に示してある。ｓｓｒＲＮＡ遺伝子
のヌクレオチド配列を比較して、配列の保存および多様
性領域を決定した。比較して同定された多様性領域は表
１に示すプローブにより代表される。本発明は、エイメ
リア属のｓｓｒＲＮＡ遺伝子の多様性ＤＮＡ領域のすべ
てを包含するものである。さらに多様性領域とは、約１
から約５０ヌクレオチド長、または約１から１００ヌク
レオチド長のＤＮＡ配列であって、エイメリア属を形成
する種間で保存されていないものと定義される。種特異
的多様性配列は以下のエイメリア種のｓｓｒＲＮＡ内に
見出されることが好ましい。すなわちエイメリア・アセ
ルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・
ブルネッティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・
マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス
（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・ネカトリックス
（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・プレコックス
（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔ
ｅｎｅｌｌａ）である。ヌクレオチド配列の比較により
同定された多様性配列は図１−７に示す。
【００２１】表１は図１−７に表わされるエイメリア７
種の相同性マトリックスをしめす。このデータは、ＰＩ
ＬＥＵＰというコンピュータープログラム（ＧＣＧソフ
トウエアパッケージ、Devereux、HaeberliおよびSmithi
es (1984およびＶＡＸのための配列決定分析総合プログ
ラムセット（Nucleic Acids Research 12(1);387-395)
を用い、図１２に表わした全配列を用いて計算した。基
本的に、このプログラムは配列の組み合わせ可能なすべ
てのペアについて１つずつ塩基の比較を行なう。対角線
上は１００％相同である自己との比較を示す。分析はニ
ワトリエイメリアは密接に関連した群であることを示
す。もっとも良く似た組み合わせはE. tenellaとE. nec
atrix であり、そのｓｓｒＲＮＡ配列は９９．３％の相
同性を示す。他の観点からいうとこの一組は０．７％し
か相同でないヌクレオチド配列を有さない。これは全長
約１７５０塩基にたいし、１２ヌクレオチドが異なるこ
とを意味する。もっとも相同でない組み合わせはE. ten
ellaとE. mitisであって９６．４％が相同である。これ
は６３ヌクレオチドが違うことを意味する。したがっ
て、全体からみるとニワトリエイメリアのｓｓｒＲＮＡ
遺伝子は極めて良く似ている。幸運なことに、存在する
差異はクラスタとして多様性領域を形成しているようで
ある（図１２）。もし全部または大部分のヌクレオチド
の差異が１つの領域に見出されるならば、非常に似てい
ないオリゴヌクレオチドを合成でき、これらは種特異的
であろう。違っているヌクレオチドはそれほど１か所に
集中していないので、ここに開示される特定のオリゴヌ
クレオチドは、場合によっては全部で約２０ヌクレオチ
ドのうち２ヌクレオチドしか違っておらず、見たところ
非常に似ているように見える。非常に厳格なハイブリダ
イゼション条件を用いることが必要なのは、この配列の
相同性のためなのである。非常に厳しいハイブリダイゼ
ーション条件とは、完全なハイブリダイゼーション（す
なわちオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプロ
ーブの全塩基が完全にＰＣＲ増幅フラグメントと塩基対
合を形成する）のみがおこる条件（塩濃度、ハイブリダ
イゼーション、洗浄温度）を意味する。われわれは一貫
して、後で述べる予備ハイブリダイゼーション、ハイブ
リダイゼーション、洗浄の各操作を用いており、われわ
れはハイブダイゼーションとそれに続く洗浄の温度を厳
格性の主要な基準として用いている。ハイブリダイゼー
ションと洗浄の温度は通常約３℃から約５℃であって、
二重鎖融解温度（Ｔｍ）以下である。Ｔｍとは、標準化
された条件下で全二重鎖数の５０％がアニールする温度
である。Ｔｍは使用する塩濃度に依存し、ハイブリダイ
ゼーションおよび洗浄バッファーが変わると、種特異性
を確実にするのに必要なハイブリダイゼーションおよび
洗浄バッファーの温度が劇的に変わることは理解され
る。
種の相同性マトリックスをしめす。このデータは、ＰＩ
ＬＥＵＰというコンピュータープログラム（ＧＣＧソフ
トウエアパッケージ、Devereux、HaeberliおよびSmithi
es (1984およびＶＡＸのための配列決定分析総合プログ
ラムセット（Nucleic Acids Research 12(1);387-395)
を用い、図１２に表わした全配列を用いて計算した。基
本的に、このプログラムは配列の組み合わせ可能なすべ
てのペアについて１つずつ塩基の比較を行なう。対角線
上は１００％相同である自己との比較を示す。分析はニ
ワトリエイメリアは密接に関連した群であることを示
す。もっとも良く似た組み合わせはE. tenellaとE. nec
atrix であり、そのｓｓｒＲＮＡ配列は９９．３％の相
同性を示す。他の観点からいうとこの一組は０．７％し
か相同でないヌクレオチド配列を有さない。これは全長
約１７５０塩基にたいし、１２ヌクレオチドが異なるこ
とを意味する。もっとも相同でない組み合わせはE. ten
ellaとE. mitisであって９６．４％が相同である。これ
は６３ヌクレオチドが違うことを意味する。したがっ
て、全体からみるとニワトリエイメリアのｓｓｒＲＮＡ
遺伝子は極めて良く似ている。幸運なことに、存在する
差異はクラスタとして多様性領域を形成しているようで
ある（図１２）。もし全部または大部分のヌクレオチド
の差異が１つの領域に見出されるならば、非常に似てい
ないオリゴヌクレオチドを合成でき、これらは種特異的
であろう。違っているヌクレオチドはそれほど１か所に
集中していないので、ここに開示される特定のオリゴヌ
クレオチドは、場合によっては全部で約２０ヌクレオチ
ドのうち２ヌクレオチドしか違っておらず、見たところ
非常に似ているように見える。非常に厳格なハイブリダ
イゼション条件を用いることが必要なのは、この配列の
相同性のためなのである。非常に厳しいハイブリダイゼ
ーション条件とは、完全なハイブリダイゼーション（す
なわちオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプロ
ーブの全塩基が完全にＰＣＲ増幅フラグメントと塩基対
合を形成する）のみがおこる条件（塩濃度、ハイブリダ
イゼーション、洗浄温度）を意味する。われわれは一貫
して、後で述べる予備ハイブリダイゼーション、ハイブ
リダイゼーション、洗浄の各操作を用いており、われわ
れはハイブダイゼーションとそれに続く洗浄の温度を厳
格性の主要な基準として用いている。ハイブリダイゼー
ションと洗浄の温度は通常約３℃から約５℃であって、
二重鎖融解温度（Ｔｍ）以下である。Ｔｍとは、標準化
された条件下で全二重鎖数の５０％がアニールする温度
である。Ｔｍは使用する塩濃度に依存し、ハイブリダイ
ゼーションおよび洗浄バッファーが変わると、種特異性
を確実にするのに必要なハイブリダイゼーションおよび
洗浄バッファーの温度が劇的に変わることは理解され
る。
【表１】 表 1 トリのエイメリアの相同性マトリックス （配列全長） ─────────────────────────────────── 種 Ea Eb Emx Emt En Ep Et アセルブリナ - ブルネッテイ 97.8 - マキシマ 96.9 97.1 - ミティス 97.7 97.2 96.3 - ネカトリックス 97.4 96.5 95.5 96.5 - プレコックス 98.5 97.9 97.5 97.5 97.5 - テネラ 97.5 96.5 96.1 96.4 99.3 97.4 - ───────────────────────────────────
【００２２】表４は特定のエイメリアの同定に役立つ多
様性セグメントプローブの例を示す。表３に示すプロー
ブは、小サブユニットリボゾームＲＮＡ遺伝子中のヌク
レオチド配列で種間で異なる領域に由来し、適切なハイ
ブリダイゼーションと洗浄の条件を用いると種特異的で
ある。これらのプローブの配列中の僅かな変化（たとえ
ば末端におけるヌクレオチドの欠失または付加）は、特
に以下の式にしたがってハイブリダイゼーションの温度
を微妙に変化させた場合は、必ずしも種特異性を損なわ
ない。Ｔｈ−Ｔｍ−５℃＝２℃（Ａ−Ｔｂｐ）＋４℃
（Ｇ−Ｃｂｐ）−５℃（Suggs ら、D.D.Brown 編集、IN
C-UCLA Symp. Dev. Biol. 「精製遺伝子の使用」Academ
ic Press, Inc, N.Y. 23巻、638-693 (1981))およびＴｍ
＝ΔＨ／（ΔＳ＋Ｒｘｌｎ（Ｃ／４）−２７３．１５℃
（Freierら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373-937
7 (1986)) 。本発明が、表３の配列と逆相補性であるオ
リゴヌクレオチドを包含することは理解されよう。逆配
列はＤＮＡターゲットに対するハイブリダイゼーション
プローブとして完全に満足できるものである。
様性セグメントプローブの例を示す。表３に示すプロー
ブは、小サブユニットリボゾームＲＮＡ遺伝子中のヌク
レオチド配列で種間で異なる領域に由来し、適切なハイ
ブリダイゼーションと洗浄の条件を用いると種特異的で
ある。これらのプローブの配列中の僅かな変化（たとえ
ば末端におけるヌクレオチドの欠失または付加）は、特
に以下の式にしたがってハイブリダイゼーションの温度
を微妙に変化させた場合は、必ずしも種特異性を損なわ
ない。Ｔｈ−Ｔｍ−５℃＝２℃（Ａ−Ｔｂｐ）＋４℃
（Ｇ−Ｃｂｐ）−５℃（Suggs ら、D.D.Brown 編集、IN
C-UCLA Symp. Dev. Biol. 「精製遺伝子の使用」Academ
ic Press, Inc, N.Y. 23巻、638-693 (1981))およびＴｍ
＝ΔＨ／（ΔＳ＋Ｒｘｌｎ（Ｃ／４）−２７３．１５℃
（Freierら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373-937
7 (1986)) 。本発明が、表３の配列と逆相補性であるオ
リゴヌクレオチドを包含することは理解されよう。逆配
列はＤＮＡターゲットに対するハイブリダイゼーション
プローブとして完全に満足できるものである。
【００２３】以下の一般的ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチ
ドプライマーはE. brunetti のために選ばれたものであ
る。
ドプライマーはE. brunetti のために選ばれたものであ
る。
【化１１】 これらのオリゴヌクレオチドはそれぞれｓｓｒＲＮＡ遺
伝子の保存ドメインに由来し、したがって一般的ＰＣＲ
増幅のプライマーである。このプライマーはE. brunett
i の完全長配列（図２Ｂ参照）におけるヌクレオチドの
位置１２４０から１７４８までに相当する約５０８ヌク
レオチドをカバーする。これら２つのヌクレオチドは、
E. brunetti のゲノムＤＮＡを増幅基質とし、先にのべ
た条件を用いて全長生成物を得るためのＰＣＲ反応にお
いてプライマーとして用いられた。得られたＰＣＲ反応
生成物は、先に述べたように細菌プラスミドベクターｐ
ＵＣ１２０中にクローン化された。適当なサイズの挿入
物を含む組換えプラスミドを有する細菌のクローンを同
定し、その内の２つについてサンガーのヌクレオチド鎖
伸長停止法を用いて配列を決定した。これらのクローン
の配列は同一で表２においてＥ．ｂｒｕｎｅｔｔｉフラ
グメント４と名付けた。E. brunetti 特異的ハイブリダ
イゼーションプローブであるｐＥｂ４ｅ−ｒｃ（配列番
号３６）の塩基配列はE.burnettiフラグメント４（表
２）の塩基番号２２４から２４４と相補的である。 表２ エイメリア・ブルネッティフラグメント４
伝子の保存ドメインに由来し、したがって一般的ＰＣＲ
増幅のプライマーである。このプライマーはE. brunett
i の完全長配列（図２Ｂ参照）におけるヌクレオチドの
位置１２４０から１７４８までに相当する約５０８ヌク
レオチドをカバーする。これら２つのヌクレオチドは、
E. brunetti のゲノムＤＮＡを増幅基質とし、先にのべ
た条件を用いて全長生成物を得るためのＰＣＲ反応にお
いてプライマーとして用いられた。得られたＰＣＲ反応
生成物は、先に述べたように細菌プラスミドベクターｐ
ＵＣ１２０中にクローン化された。適当なサイズの挿入
物を含む組換えプラスミドを有する細菌のクローンを同
定し、その内の２つについてサンガーのヌクレオチド鎖
伸長停止法を用いて配列を決定した。これらのクローン
の配列は同一で表２においてＥ．ｂｒｕｎｅｔｔｉフラ
グメント４と名付けた。E. brunetti 特異的ハイブリダ
イゼーションプローブであるｐＥｂ４ｅ−ｒｃ（配列番
号３６）の塩基配列はE.burnettiフラグメント４（表
２）の塩基番号２２４から２４４と相補的である。 表２ エイメリア・ブルネッティフラグメント４
【化１２】
【００２４】生コクシジウムワクチンはエイメリアの弱
毒化株のオーシストから製造される。１例として、E. a
cervulina 、E. tenella、 E. maxima、 E. necatrix、
E.praecox 、E.mitis 、E. brunetti のような７つま
たはそれ以上のトリエイメリア種を挙げるがこれに限定
されるものではない。各種のオーシストの免疫原性であ
る用量を合し、ワックスで粒化して石膏で覆う。免疫原
性である量とは種それぞれの服用量をさし、組み合わさ
って１つまたはそれ以上の種によって引き起こされるコ
クシジウム病を防止するものである。１日令のメスのＳ
ＰＦレグホンのヒナを隔離ケージに入れ、ワクチンを含
まない飼料と水を２週令まで自由に与える。飼料はワク
チン投与の１日前に除去する。ワクチンビーズは重量を
計ってワクチン用量の０．２５倍、０．５倍、１倍、２
倍、３倍、５倍、および１０倍に相当する量を飼料（ヒ
ナあたり１５ｇ）に混合し、大体８羽から１５羽を１群
としたヒナに食べさせる。すべてのワクチンは４時間以
内に消費されなければならない。ワクチンが全部食べら
れたならばワクチンを含まない飼料を与える。実験期間
中大体８羽から１０羽の無処理のトリの１群に通常の飼
料と水を自由に与える。別に約８羽から１５羽からなる
群の１ないし３群に同数の被覆していないオーシスト
（１×、３×、１０×）を胃管により投与し、ワクチン
を含まない飼料を自由に与えた。これらのトリは感染の
陽性コントロールとなると同時に被覆後のオーシストの
生存率をチェックするのに役立つ。なぜなら被覆してい
ないオ−シストはワクチン中のオーシストと同じ生産バ
ッチから来るからである。ワクチンまたは被覆していな
いオーシストの投与後３から５日で鳥の小腸壁から小腸
上皮と粘膜をかき取る、これらの掻き取り物から抽出し
た全核酸が本プロトコルのターゲットまたはテンプレー
トとなる。被覆後の各エイメリア種の相対感染率は投与
したオーシスト数の増幅を検出することに基づいてい
る。これは種特異的32Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーションプローブを用いて行なう。各
処理群の鳥のあるものは感染後４から７日で殺して糞中
のオーシストをカウントするのに用いられる。定量はク
ローン化ワクチン株のオーシストから調製したゲノムＤ
ＮＡを用いた標準曲線に基づいておこなう。
毒化株のオーシストから製造される。１例として、E. a
cervulina 、E. tenella、 E. maxima、 E. necatrix、
E.praecox 、E.mitis 、E. brunetti のような７つま
たはそれ以上のトリエイメリア種を挙げるがこれに限定
されるものではない。各種のオーシストの免疫原性であ
る用量を合し、ワックスで粒化して石膏で覆う。免疫原
性である量とは種それぞれの服用量をさし、組み合わさ
って１つまたはそれ以上の種によって引き起こされるコ
クシジウム病を防止するものである。１日令のメスのＳ
ＰＦレグホンのヒナを隔離ケージに入れ、ワクチンを含
まない飼料と水を２週令まで自由に与える。飼料はワク
チン投与の１日前に除去する。ワクチンビーズは重量を
計ってワクチン用量の０．２５倍、０．５倍、１倍、２
倍、３倍、５倍、および１０倍に相当する量を飼料（ヒ
ナあたり１５ｇ）に混合し、大体８羽から１５羽を１群
としたヒナに食べさせる。すべてのワクチンは４時間以
内に消費されなければならない。ワクチンが全部食べら
れたならばワクチンを含まない飼料を与える。実験期間
中大体８羽から１０羽の無処理のトリの１群に通常の飼
料と水を自由に与える。別に約８羽から１５羽からなる
群の１ないし３群に同数の被覆していないオーシスト
（１×、３×、１０×）を胃管により投与し、ワクチン
を含まない飼料を自由に与えた。これらのトリは感染の
陽性コントロールとなると同時に被覆後のオーシストの
生存率をチェックするのに役立つ。なぜなら被覆してい
ないオ−シストはワクチン中のオーシストと同じ生産バ
ッチから来るからである。ワクチンまたは被覆していな
いオーシストの投与後３から５日で鳥の小腸壁から小腸
上皮と粘膜をかき取る、これらの掻き取り物から抽出し
た全核酸が本プロトコルのターゲットまたはテンプレー
トとなる。被覆後の各エイメリア種の相対感染率は投与
したオーシスト数の増幅を検出することに基づいてい
る。これは種特異的32Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーションプローブを用いて行なう。各
処理群の鳥のあるものは感染後４から７日で殺して糞中
のオーシストをカウントするのに用いられる。定量はク
ローン化ワクチン株のオーシストから調製したゲノムＤ
ＮＡを用いた標準曲線に基づいておこなう。
【００２５】全核酸の調製は以下の方法により行なう。
プロセス中にヌクレアーゼを持ち込まないようにするこ
とが重要である。たとえば可能な限り乾熱したガラス器
具を用いるまたはプラスチックを用いる、適切ならば溶
液をオートクレーブするなどである。ニワトリはワクチ
ンを投与してから３−５日後に殺す。小腸と盲腸を取り
出し、長さに添って切開し、水道水でゆすぐ。小腸の内
部壁と盲腸は顕微鏡スライドグラスでかき取り/ 剥取
る。かき取り物は約５から１０ｍｌの２×プロテイナー
ゼＫ消化バッファー（約４００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）、約１００ｍＭＥＤＴＡ、約１．０％ＳＤ
Ｓ）を入れた５０ｍｌ容遠心管に移す。懸濁液を渦巻き
ミキサーでよく混ぜる。約５ｍｇ/ ｍｌのプロテイナー
ゼＫ液２００μｌを懸濁液に加え、約５５℃で約３時間
消化させる。この時点で粘度が問題になるならばさらに
５ｍｌの消化バッファーを加える。約１００μｌの５ｍ
ｇ/ ｍｌプロテイナーゼＫ液を加え、消化を一晩行なわ
せる。その後約１００μｌの５ｍｇ/ ｍｌプロテイナー
ゼＫ液を加え、消化を２４時間まで継続する。消化物約
６００μｌを取って１．５ｍｌ容のマイクロフュージチ
ューブに入れ、バッファー飽和フェノールとクロロホル
ム１：１の混合液で１回抽出する。ついでクロロホルム
／イソアミルアルコール（２４：１）で抽出する。最終
の水層を−２０℃で保存する。最終水層の一部をエタノ
ールで沈殿させる。ほとんどの場合、約２００μｌの最
終水層を約２０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．
６）に加えてから約５００μｌのエタノールを加える。
サンプルは倒立させて混合し、ドライアイス−エタノー
ル浴中に約２０分間入れておく。ついでゲノムＤＮＡを
エッペンドルフマイクロフュージ中約１５分間遠心して
回収する。沈殿物を約２００μｌの脱イオン水中に懸濁
する。この全核酸中のＤＮＡの量はビスベンズイミドを
用いて定量する。このビスベンズイミドは以下にのべる
ようにＤＮＡと結合すると性質の変わる蛍光色素であ
る。サケ精巣ＤＮＡスタンダード（０から２０μｇ/ １
００μｌＴＥ）を原液から調製する。滅菌したチップを
用いて１２×７５ｍｍボロシリカ（ホウ珪酸塩）の試験
管中で希釈液を調製し、チップは希釈ごとに変える。同
様に最終量約１００μｌの１：１０の希釈液を各実験サ
ンプルにつき２連で作成する。滅菌水１ｍｌ当たり約２
００μｇ濃度のビスベンズイミド色素の原液は、４℃で
遮光ビンに入れて保存すれば６か月は安定である。使用
に先立ち色素原液をバッファーで１：２００に希釈す
る。このバッファーの組成は約５０ｍＭリン酸ナトリウ
ムｐＨ７．６、２ＭＮａＣｌである。この色素液２ｍｌ
をエッペンドルフのリピーターピペットで各ボロシリカ
試験管に加え、混合してから直接蛍光光度計（励起波長
３５６ｎｍ、放射波長４５８ｎｍ）で計測する。スタン
ダードで機械を校正してから実験サンプル中のＤＮＡ量
を求める。
プロセス中にヌクレアーゼを持ち込まないようにするこ
とが重要である。たとえば可能な限り乾熱したガラス器
具を用いるまたはプラスチックを用いる、適切ならば溶
液をオートクレーブするなどである。ニワトリはワクチ
ンを投与してから３−５日後に殺す。小腸と盲腸を取り
出し、長さに添って切開し、水道水でゆすぐ。小腸の内
部壁と盲腸は顕微鏡スライドグラスでかき取り/ 剥取
る。かき取り物は約５から１０ｍｌの２×プロテイナー
ゼＫ消化バッファー（約４００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）、約１００ｍＭＥＤＴＡ、約１．０％ＳＤ
Ｓ）を入れた５０ｍｌ容遠心管に移す。懸濁液を渦巻き
ミキサーでよく混ぜる。約５ｍｇ/ ｍｌのプロテイナー
ゼＫ液２００μｌを懸濁液に加え、約５５℃で約３時間
消化させる。この時点で粘度が問題になるならばさらに
５ｍｌの消化バッファーを加える。約１００μｌの５ｍ
ｇ/ ｍｌプロテイナーゼＫ液を加え、消化を一晩行なわ
せる。その後約１００μｌの５ｍｇ/ ｍｌプロテイナー
ゼＫ液を加え、消化を２４時間まで継続する。消化物約
６００μｌを取って１．５ｍｌ容のマイクロフュージチ
ューブに入れ、バッファー飽和フェノールとクロロホル
ム１：１の混合液で１回抽出する。ついでクロロホルム
／イソアミルアルコール（２４：１）で抽出する。最終
の水層を−２０℃で保存する。最終水層の一部をエタノ
ールで沈殿させる。ほとんどの場合、約２００μｌの最
終水層を約２０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．
６）に加えてから約５００μｌのエタノールを加える。
サンプルは倒立させて混合し、ドライアイス−エタノー
ル浴中に約２０分間入れておく。ついでゲノムＤＮＡを
エッペンドルフマイクロフュージ中約１５分間遠心して
回収する。沈殿物を約２００μｌの脱イオン水中に懸濁
する。この全核酸中のＤＮＡの量はビスベンズイミドを
用いて定量する。このビスベンズイミドは以下にのべる
ようにＤＮＡと結合すると性質の変わる蛍光色素であ
る。サケ精巣ＤＮＡスタンダード（０から２０μｇ/ １
００μｌＴＥ）を原液から調製する。滅菌したチップを
用いて１２×７５ｍｍボロシリカ（ホウ珪酸塩）の試験
管中で希釈液を調製し、チップは希釈ごとに変える。同
様に最終量約１００μｌの１：１０の希釈液を各実験サ
ンプルにつき２連で作成する。滅菌水１ｍｌ当たり約２
００μｇ濃度のビスベンズイミド色素の原液は、４℃で
遮光ビンに入れて保存すれば６か月は安定である。使用
に先立ち色素原液をバッファーで１：２００に希釈す
る。このバッファーの組成は約５０ｍＭリン酸ナトリウ
ムｐＨ７．６、２ＭＮａＣｌである。この色素液２ｍｌ
をエッペンドルフのリピーターピペットで各ボロシリカ
試験管に加え、混合してから直接蛍光光度計（励起波長
３５６ｎｍ、放射波長４５８ｎｍ）で計測する。スタン
ダードで機械を校正してから実験サンプル中のＤＮＡ量
を求める。
【００２６】ニワトリ小腸粘膜からかき取ったものから
調製したゲノムＤＮＡからのｓｓｒＲＮＡ配列をＰＣＲ
増幅するには以下のように行なう。本技術が極めて高感
度であることから、汚染を防ぐためにあらゆる注意をは
らわなければならない。ピペット、ピペットのチップ、
容器およびＤＮＡ標品の保存溶液、反応装置、サンプル
分析は専用にすることを勧める。理想的にはこの操作は
他のＤＮＡを扱う場所から隔離された場所で行なうべき
である。ビスベンズイミド定量に基づく約２００ｎｇの
ゲノムＤＮＡを出発標的（テンプレート）材料として用
いる。この材料をまずエタノールで沈殿させて抽出操作
に由来して残存する溶媒を除くことが肝要である。この
溶媒はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するからで
ある。エイメリア各種の精製した生物体の既知数から調
製したゲノムＤＮＡを、ニワトリ肝臓ゲノムＤＮＡ２０
０ｎｇに「打ち込む」。これらは増幅の標準およびハイ
ブリダイゼーション特異性の標準となる。日常使用する
溶液であるトリス−ＨＣｌ緩衝（ｐＨ７．６）デオキシ
ヌクレオシド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ各約１．２５ｍＭを−２０℃に保存してあ
る約１００ｍＭの原液から調製する。約１００ｍＭＫＣ
ｌ、約１５ｍＭＭｇＣｌ2 、約０．０１％ゼラチンから
なる１０倍濃度の反応溶液を調製してオートクレブす
る。これを分注し、約−２０℃で保存する。反応混液は
専用ＰＣＲ反応試験管中に最終容量が約１００μｌとな
るように整える。まず反応混液カクテルは以下の成分を
その最終濃度でこの順番で加える：水、ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（各ｄＮＴＰは約２００μ
Ｍ）、１×反応バッファー、各約１μＭの２種のプライ
マー（ＥＲＩＢ１（配列番号１）とＥＲＩＢ２（配列番
号３））もしくは非コンセンサス領域に隣接する他の適
切なプライマー：ついでこれを混合し、各チューブに約
１．２５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加え、倒立し
て混合する。他のプライマーにはこれに限定されない
が、以下の配列を含む。
調製したゲノムＤＮＡからのｓｓｒＲＮＡ配列をＰＣＲ
増幅するには以下のように行なう。本技術が極めて高感
度であることから、汚染を防ぐためにあらゆる注意をは
らわなければならない。ピペット、ピペットのチップ、
容器およびＤＮＡ標品の保存溶液、反応装置、サンプル
分析は専用にすることを勧める。理想的にはこの操作は
他のＤＮＡを扱う場所から隔離された場所で行なうべき
である。ビスベンズイミド定量に基づく約２００ｎｇの
ゲノムＤＮＡを出発標的（テンプレート）材料として用
いる。この材料をまずエタノールで沈殿させて抽出操作
に由来して残存する溶媒を除くことが肝要である。この
溶媒はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するからで
ある。エイメリア各種の精製した生物体の既知数から調
製したゲノムＤＮＡを、ニワトリ肝臓ゲノムＤＮＡ２０
０ｎｇに「打ち込む」。これらは増幅の標準およびハイ
ブリダイゼーション特異性の標準となる。日常使用する
溶液であるトリス−ＨＣｌ緩衝（ｐＨ７．６）デオキシ
ヌクレオシド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ各約１．２５ｍＭを−２０℃に保存してあ
る約１００ｍＭの原液から調製する。約１００ｍＭＫＣ
ｌ、約１５ｍＭＭｇＣｌ2 、約０．０１％ゼラチンから
なる１０倍濃度の反応溶液を調製してオートクレブす
る。これを分注し、約−２０℃で保存する。反応混液は
専用ＰＣＲ反応試験管中に最終容量が約１００μｌとな
るように整える。まず反応混液カクテルは以下の成分を
その最終濃度でこの順番で加える：水、ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（各ｄＮＴＰは約２００μ
Ｍ）、１×反応バッファー、各約１μＭの２種のプライ
マー（ＥＲＩＢ１（配列番号１）とＥＲＩＢ２（配列番
号３））もしくは非コンセンサス領域に隣接する他の適
切なプライマー：ついでこれを混合し、各チューブに約
１．２５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加え、倒立し
て混合する。他のプライマーにはこれに限定されない
が、以下の配列を含む。
【化１３】
【００２７】プライマーＥＲＩＢ１（配列番号１）はプ
ライマーＥＲＩＢ２（配列番号３）と一緒に用いられ、
プライマー５ＥＲＩＢ（配列番号４）はプライマー３Ｅ
ＲＩＢ（配列番号５）と一緒に用いられる。プライマー
５ＡＥＲＩＢ（配列番号３１）はプライマー３ＡＥＲＩ
Ｂ（配列番号３２）とともに用いられるのが好ましく、
プライマー５ＢＥＲＩＢ（配列番号３３）はプライマー
３ＢＥＲＩＢ（配列番号３４）と一緒に用いるのが好ま
しい。しかしながら５’から始まるプライマーならばど
のれも３’から始まるいかなるプライマーとでも一緒に
用いることができる。カクテルから約８０μｌずつとっ
て各反応試験管に分注する。すでに述べたビスベンズイ
ミドＤＮＡアッセイに基づいて定量した約２００ｎｇの
実験的ゲノムＤＮＡを最終容量が約２０μｌになるよう
蒸留水で調節して、反応混合物へ加える。プライマーＥ
ＲＩＢ１（配列番号１）とＥＲＩＢ２（配列番号３）を
用いて増幅を行なう場合、反応はＢＩＯＳサーマルサイ
クラー中で行なう。通常サーマルサイクラーはつぎのよ
うにプログラムする： ａ）変性のため、約９４℃で約１分間、 アニールのため、約５０℃で約３０秒間、 ポリメライゼーションのため、約７２℃で約４５秒間、
を約３サイクル ｂ）変性のため、約９４℃で約２０秒間、 アニールのため、約５０℃で約３０秒間、 ポリメライゼーションのため、約７２℃で約４５秒間、
を約２７サイクル ｃ）約７２℃で約１０分間を１サイクル。 ５ＡＥＲＩＢ／３ＡＥＲＩＢ（配列番号３１と３２）の
プライマーのペアおよび５ＢＥＲＩＢ／３ＥＲＩＢ（配
列番号３３と３４）のペアを用いる場合には、反応はパ
ーキンエルマーシータスＤＮＡサーマルサイクラーを用
いる。反応は前に述べたＥＲＩＢ１（配列番号１）とＥ
ＲＩＢ２（配列番号３）を用いて増幅を行なう場合とお
なじように行なうが、実験的ゲノムＤＮＡを加えた後、
反応物は約５０μｌの軽い鉱物油で上層し、それからパ
ーキンエルマーシータスＤＮＡサーマルサイクラー中に
入れる。このサーマルサイクラーは以下のようにプログ
ラムする： ａ）変性のため、約９４℃で約１分間、 アニールのため、約４８℃で約１分間、 ポリメライゼーションのため、約７２℃で約１分間、を
約３サイクル ｂ）変性のため、約９４℃で約１分間、 アニールのため、約５０℃で約１分３０秒間、 ポリメライゼーションのため、約７２℃で約２分間、を
約３２サイクル ｃ）約７２℃で約１０分間を１サイクル。 約５μｌの反応産物のＤＮＡ含量を、微量ビスベンズイ
ミドアッセイで検定した。この方法は上述したものと同
様であるが違うところは希釈をマイクロセントリフュー
ジチューブ中でおこない、最終アッセイ容量が約５００
μｌであり、サンプルをよみとるのをマイクロセル中で
行ない、標準曲線が約５から２００ｎｇ／ｍｌで直線で
あることである。
ライマーＥＲＩＢ２（配列番号３）と一緒に用いられ、
プライマー５ＥＲＩＢ（配列番号４）はプライマー３Ｅ
ＲＩＢ（配列番号５）と一緒に用いられる。プライマー
５ＡＥＲＩＢ（配列番号３１）はプライマー３ＡＥＲＩ
Ｂ（配列番号３２）とともに用いられるのが好ましく、
プライマー５ＢＥＲＩＢ（配列番号３３）はプライマー
３ＢＥＲＩＢ（配列番号３４）と一緒に用いるのが好ま
しい。しかしながら５’から始まるプライマーならばど
のれも３’から始まるいかなるプライマーとでも一緒に
用いることができる。カクテルから約８０μｌずつとっ
て各反応試験管に分注する。すでに述べたビスベンズイ
ミドＤＮＡアッセイに基づいて定量した約２００ｎｇの
実験的ゲノムＤＮＡを最終容量が約２０μｌになるよう
蒸留水で調節して、反応混合物へ加える。プライマーＥ
ＲＩＢ１（配列番号１）とＥＲＩＢ２（配列番号３）を
用いて増幅を行なう場合、反応はＢＩＯＳサーマルサイ
クラー中で行なう。通常サーマルサイクラーはつぎのよ
うにプログラムする： ａ）変性のため、約９４℃で約１分間、 アニールのため、約５０℃で約３０秒間、 ポリメライゼーションのため、約７２℃で約４５秒間、
を約３サイクル ｂ）変性のため、約９４℃で約２０秒間、 アニールのため、約５０℃で約３０秒間、 ポリメライゼーションのため、約７２℃で約４５秒間、
を約２７サイクル ｃ）約７２℃で約１０分間を１サイクル。 ５ＡＥＲＩＢ／３ＡＥＲＩＢ（配列番号３１と３２）の
プライマーのペアおよび５ＢＥＲＩＢ／３ＥＲＩＢ（配
列番号３３と３４）のペアを用いる場合には、反応はパ
ーキンエルマーシータスＤＮＡサーマルサイクラーを用
いる。反応は前に述べたＥＲＩＢ１（配列番号１）とＥ
ＲＩＢ２（配列番号３）を用いて増幅を行なう場合とお
なじように行なうが、実験的ゲノムＤＮＡを加えた後、
反応物は約５０μｌの軽い鉱物油で上層し、それからパ
ーキンエルマーシータスＤＮＡサーマルサイクラー中に
入れる。このサーマルサイクラーは以下のようにプログ
ラムする： ａ）変性のため、約９４℃で約１分間、 アニールのため、約４８℃で約１分間、 ポリメライゼーションのため、約７２℃で約１分間、を
約３サイクル ｂ）変性のため、約９４℃で約１分間、 アニールのため、約５０℃で約１分３０秒間、 ポリメライゼーションのため、約７２℃で約２分間、を
約３２サイクル ｃ）約７２℃で約１０分間を１サイクル。 約５μｌの反応産物のＤＮＡ含量を、微量ビスベンズイ
ミドアッセイで検定した。この方法は上述したものと同
様であるが違うところは希釈をマイクロセントリフュー
ジチューブ中でおこない、最終アッセイ容量が約５００
μｌであり、サンプルをよみとるのをマイクロセル中で
行ない、標準曲線が約５から２００ｎｇ／ｍｌで直線で
あることである。
【００２８】通常、先に述べたようにして定量した約１
００ｎｇのＰＣＲ産物を水で約１００μｌに調整し、ス
ロットブロットまたはドットブロットマニホールド中で
メーカーの説明書（Schleicher & Schuell Inc.)に従
い、前以て水で濡らしたＮｙｔｒａｎシートに載せる。
各サンプルに等量の１ＭＮａＯＨを加える。ついでサン
プッルを室温付近で約５分間インキュベートしてＤＮＡ
を変性させ、ほぼ等量の１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
３）を加えて中和する。装置を真空でひいてサンプルを
濾過する。各サンプルは約５００μｌの４Ｍ酢酸アンモ
ニウム（ｐＨ６．８）でゆすぐ。精製した各トリエイメ
リア種から調製したゲノムＤＮＡを先に述べたようにＰ
ＣＲで増幅し、やはり先にのべたようにＰＣＲ増幅した
ニワトリ肝臓ゲノムＤＮＡに「打ち込む」。打ち込んだ
ＤＮＡもまたフィルターに載せて、種特異的定量の標準
品とする。適当なバッファーコントロールおよびブラン
クコントロールも常用する。フィルターを風乾し、真空
下で約８０℃約２時間加熱する。
００ｎｇのＰＣＲ産物を水で約１００μｌに調整し、ス
ロットブロットまたはドットブロットマニホールド中で
メーカーの説明書（Schleicher & Schuell Inc.)に従
い、前以て水で濡らしたＮｙｔｒａｎシートに載せる。
各サンプルに等量の１ＭＮａＯＨを加える。ついでサン
プッルを室温付近で約５分間インキュベートしてＤＮＡ
を変性させ、ほぼ等量の１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
３）を加えて中和する。装置を真空でひいてサンプルを
濾過する。各サンプルは約５００μｌの４Ｍ酢酸アンモ
ニウム（ｐＨ６．８）でゆすぐ。精製した各トリエイメ
リア種から調製したゲノムＤＮＡを先に述べたようにＰ
ＣＲで増幅し、やはり先にのべたようにＰＣＲ増幅した
ニワトリ肝臓ゲノムＤＮＡに「打ち込む」。打ち込んだ
ＤＮＡもまたフィルターに載せて、種特異的定量の標準
品とする。適当なバッファーコントロールおよびブラン
クコントロールも常用する。フィルターを風乾し、真空
下で約８０℃約２時間加熱する。
【００２９】寄生体の生存を定量するためにオリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーションプローブをラベルす
る。好ましい方法はオリゴヌクレオチドの末端をガンマ
32Ｐ−ＡＴＰでラベルすることである。当業界で知られ
る他の方法も用いることができる。オリゴヌクレオチド
を定量し、標準化する（１ｍｇ/ ｍｌ＝２５Ａ260 ）。
約５−１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを、少なくと
も２倍モル当量のγ32Ｐ−ＡＴＰ（比活性＞５０００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ）、約５μｌの１０×キナーゼバッファー
（約０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ約７．６）、約０．
１ＭＭｇＣｌ2 、約５０ｍＭＤＴＴ、約１ｍＭスペルミ
ジン、約１ｍＭＥＤＴＡ）に加える。２０Ｕのポリヌク
レオチドキナーゼを加えてから水を加えて５０μｌにす
る。混合物を約３０分間約３７℃でインキュベートす
る。０．５ＭのＥＤＴＡ約４μｌとＴＥ４６μｌを加え
て反応を停止させる。バッファ飽和フェノールとクロロ
ホルムの１：１混液で１回抽出する。水層をメーカーの
説明書通りにストラタジーンプッシュカラム（ストラタ
ジーン）に通して遊離のアイソトープをラベルされたオ
リゴヌクレオチドから除去する。
レオチドハイブリダイゼーションプローブをラベルす
る。好ましい方法はオリゴヌクレオチドの末端をガンマ
32Ｐ−ＡＴＰでラベルすることである。当業界で知られ
る他の方法も用いることができる。オリゴヌクレオチド
を定量し、標準化する（１ｍｇ/ ｍｌ＝２５Ａ260 ）。
約５−１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを、少なくと
も２倍モル当量のγ32Ｐ−ＡＴＰ（比活性＞５０００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ）、約５μｌの１０×キナーゼバッファー
（約０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ約７．６）、約０．
１ＭＭｇＣｌ2 、約５０ｍＭＤＴＴ、約１ｍＭスペルミ
ジン、約１ｍＭＥＤＴＡ）に加える。２０Ｕのポリヌク
レオチドキナーゼを加えてから水を加えて５０μｌにす
る。混合物を約３０分間約３７℃でインキュベートす
る。０．５ＭのＥＤＴＡ約４μｌとＴＥ４６μｌを加え
て反応を停止させる。バッファ飽和フェノールとクロロ
ホルムの１：１混液で１回抽出する。水層をメーカーの
説明書通りにストラタジーンプッシュカラム（ストラタ
ジーン）に通して遊離のアイソトープをラベルされたオ
リゴヌクレオチドから除去する。
【００３０】プレハイブリダイゼーションおよびハイブ
リダイゼーションおよび洗浄は以下のようにして行な
う。プレハイブリダイゼーションは、約６×ＳＳＰＥ、
１％ＳＤＳ、１０×デンハルト液、約２０〜１００μｇ
/ ｍｌｔＲＮＡからなるバッファー中で５０μｇ/ ｍｌ
の変性サケ精子ＤＮＡの存在または非存在下でおこな
う。ＳＳＰＥは約１８０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＨ
2 ＰＯ4 、１ｍＭＥＤＴＡからなる。バッファーを調製
してから使用するまで４２℃に保って、ＳＤＳを溶液の
状態にしておく。ｎｙｔｒａｎの乾燥シートは６×ＳＳ
ＰＥで濡らしてから三方をヒートシールしたポリエチレ
ンのフリーザーバッグに入れておく。不均質ＤＮＡは沸
騰水浴中で１０分間処理して変性させた後直ちに氷の上
で冷やし、プレハイブリダイゼーション溶液（バッグ中
のｎｙｔｒａｎフィルターの数によるが２０−４０ｍ
ｌ）と混合する。プレハイブリダイゼーション溶液をバ
ッグにいれ、気泡を除いてバッグの４番目の口をシール
する。ついでバッグをガラス板のうえにゴムバンドで固
定し、４２℃の水浴中に浸し３時間から一晩おく。プレ
ハイブリダイゼーション後、バッグを切り開き、バッフ
ァーを完全に除く。ハイブリダイゼーションバッファー
は約６×ＳＳＰＥに約１％のＳＤＳを加えたものであ
る。ハイブリダイゼーションは所期のハイブリッドのＴ
ｈと同じあるいはその付近の温度でおこなう。２５ヌク
レオチドより短いプローブの場合、ハイブリダイゼーシ
ョンの条件は以下の式により決める。 Ｔｈ−Ｔｍ−５℃＝２℃（Ａ−Ｔｂｐ）＋４℃（Ｇ−Ｃ
ｂｐ）−５℃（Suggsら、D.D.Brown 編集、INC-UCLA Sy
mp. Dev. Biol. 「精製遺伝子の使用」Academic Press,
Inc, N.Y. 23巻、638-693 (1981)) Ｔｍ＝ΔＨ／（ΔＳ＋Ｒｘｌｎ（Ｃ／４）−２７３．１
５℃（Freierら、proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373
-9377 (1986)) 。末端ラベルオリゴヌクレオチドプロー
ブは６８℃で５分間加温してから、あらかじめＴｈに温
めておいた１０から２０ｍｌのハイブリダイゼーション
バッファー（バッグ中のフィルターの数によるが、約１
−５×１０6 ｄｐｍ／ｍｌ）と混合する。これをバッグ
中に注ぎ込み、バッグの口を再びシールする。バッグを
ガラス板に固定し、Ｔｈの水浴中に少なくとも１２時間
から一晩浸しておく。ハイブリダイゼーション後、バッ
グの口を切り開きバッファーを捨てる。バッグののこり
の三方を切り開き、フィルターをピンセットで取り出
し、最初の洗浄溶液を入れたパイレックスの容器に移
す。洗浄は次のように行なう。 １）振とうしながら、６×ＳＳＰＥ（１％ＳＤＳ）中
で、５−１０分間ずつ３回洗浄する。 ２）１×ＳＳＰＥ（１％ＳＤＳ）中、ハイブリッドのＴ
ｈ温度で３分間を約１回洗浄する。 ３）ＳＤＳを除くため、６×ＳＳＰＥ中室温で振とうし
ながら５分間を約３−４回洗浄する。洗浄液の量はフィ
ルターを完全に覆うために少なくとも１００ｍｌなけれ
ばならず、複数のフィルターの場合にはもっと多く用い
る。洗浄溶液はすべて使用する前にそれぞれの温度に温
めておく。フィルターを風乾し、２枚の増感スクリーン
の入ったカセットにいれ、Ｘ線フィルムを−７０℃で感
光させる。フィルムを１−３日後に現像する。
リダイゼーションおよび洗浄は以下のようにして行な
う。プレハイブリダイゼーションは、約６×ＳＳＰＥ、
１％ＳＤＳ、１０×デンハルト液、約２０〜１００μｇ
/ ｍｌｔＲＮＡからなるバッファー中で５０μｇ/ ｍｌ
の変性サケ精子ＤＮＡの存在または非存在下でおこな
う。ＳＳＰＥは約１８０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＨ
2 ＰＯ4 、１ｍＭＥＤＴＡからなる。バッファーを調製
してから使用するまで４２℃に保って、ＳＤＳを溶液の
状態にしておく。ｎｙｔｒａｎの乾燥シートは６×ＳＳ
ＰＥで濡らしてから三方をヒートシールしたポリエチレ
ンのフリーザーバッグに入れておく。不均質ＤＮＡは沸
騰水浴中で１０分間処理して変性させた後直ちに氷の上
で冷やし、プレハイブリダイゼーション溶液（バッグ中
のｎｙｔｒａｎフィルターの数によるが２０−４０ｍ
ｌ）と混合する。プレハイブリダイゼーション溶液をバ
ッグにいれ、気泡を除いてバッグの４番目の口をシール
する。ついでバッグをガラス板のうえにゴムバンドで固
定し、４２℃の水浴中に浸し３時間から一晩おく。プレ
ハイブリダイゼーション後、バッグを切り開き、バッフ
ァーを完全に除く。ハイブリダイゼーションバッファー
は約６×ＳＳＰＥに約１％のＳＤＳを加えたものであ
る。ハイブリダイゼーションは所期のハイブリッドのＴ
ｈと同じあるいはその付近の温度でおこなう。２５ヌク
レオチドより短いプローブの場合、ハイブリダイゼーシ
ョンの条件は以下の式により決める。 Ｔｈ−Ｔｍ−５℃＝２℃（Ａ−Ｔｂｐ）＋４℃（Ｇ−Ｃ
ｂｐ）−５℃（Suggsら、D.D.Brown 編集、INC-UCLA Sy
mp. Dev. Biol. 「精製遺伝子の使用」Academic Press,
Inc, N.Y. 23巻、638-693 (1981)) Ｔｍ＝ΔＨ／（ΔＳ＋Ｒｘｌｎ（Ｃ／４）−２７３．１
５℃（Freierら、proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373
-9377 (1986)) 。末端ラベルオリゴヌクレオチドプロー
ブは６８℃で５分間加温してから、あらかじめＴｈに温
めておいた１０から２０ｍｌのハイブリダイゼーション
バッファー（バッグ中のフィルターの数によるが、約１
−５×１０6 ｄｐｍ／ｍｌ）と混合する。これをバッグ
中に注ぎ込み、バッグの口を再びシールする。バッグを
ガラス板に固定し、Ｔｈの水浴中に少なくとも１２時間
から一晩浸しておく。ハイブリダイゼーション後、バッ
グの口を切り開きバッファーを捨てる。バッグののこり
の三方を切り開き、フィルターをピンセットで取り出
し、最初の洗浄溶液を入れたパイレックスの容器に移
す。洗浄は次のように行なう。 １）振とうしながら、６×ＳＳＰＥ（１％ＳＤＳ）中
で、５−１０分間ずつ３回洗浄する。 ２）１×ＳＳＰＥ（１％ＳＤＳ）中、ハイブリッドのＴ
ｈ温度で３分間を約１回洗浄する。 ３）ＳＤＳを除くため、６×ＳＳＰＥ中室温で振とうし
ながら５分間を約３−４回洗浄する。洗浄液の量はフィ
ルターを完全に覆うために少なくとも１００ｍｌなけれ
ばならず、複数のフィルターの場合にはもっと多く用い
る。洗浄溶液はすべて使用する前にそれぞれの温度に温
めておく。フィルターを風乾し、２枚の増感スクリーン
の入ったカセットにいれ、Ｘ線フィルムを−７０℃で感
光させる。フィルムを１−３日後に現像する。
【００３１】ハイブリダイゼーションシグナルの定量
は、モレキュラーダイナミクスホスホルイメジャー（Mo
lecular Dynamics) を用いて行なう。乾燥したブロット
は、メーカーの指示どおりホスホルイメジャーカセット
中プラスチックラップの下に置き、普通のハイブリダイ
ゼーションプローブの場合は２時間、特異的エイメリア
プローブの場合は３−１２時間、燐光スクリーンに曝
す。ついでスクリーンをレーザーでスキャンするが、こ
のレーザーはスクリーン中の燐光体により捕獲されたエ
ネルギーを開放する。開放されたエネルギーは装置によ
り定量される。
は、モレキュラーダイナミクスホスホルイメジャー（Mo
lecular Dynamics) を用いて行なう。乾燥したブロット
は、メーカーの指示どおりホスホルイメジャーカセット
中プラスチックラップの下に置き、普通のハイブリダイ
ゼーションプローブの場合は２時間、特異的エイメリア
プローブの場合は３−１２時間、燐光スクリーンに曝
す。ついでスクリーンをレーザーでスキャンするが、こ
のレーザーはスクリーン中の燐光体により捕獲されたエ
ネルギーを開放する。開放されたエネルギーは装置によ
り定量される。
【００３２】エイメリアのＲＮＡもまた単離して１サン
プル中の複数種エイメイリアの存在と濃度を知るために
用いることができる。ニワトリ小腸からエイメリアのＲ
ＮＡを単離するにはＲＮＡの分解を避けるように注意し
なければならない。うまく行く方法の１つは、Ｃｈｉｒ
ｇｗｉｎらの方法（Biochemistry18: 5294-5299 (1979)
と基本的に同じである。３−５日前にワクチン投与した
ニワトリから粘膜かき取り物を取り、先に述べたように
して５０ｍｌ容遠心管に移す。これらのかき取り物をた
だちに約４Ｍグアニジンチオシアネート（ｐＨ７．
０）、約０．５％Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウ
ム、約２５ｍｌクエン酸ナトリウム、約０．１Ｍ２−メ
ルカプトエタノールおよび約０．１％シグマ３０％アン
チフォームＡからなる液２４ｍｌ中に入れる。サンプル
は速やかにポリトロン（Brinkmann)を用いて最高速度で
２０秒ずつ３回ホモジナイズする。その間ポリトロンは
滅菌蒸留水で２回ゆすぐ。ついでサンプルを懸垂バケッ
トローター中約８０００ｒｐｍで１０分間（約１０℃）
で遠心する。上清を傾斜して除き、ペレットを約０．６
ｍｌの約１Ｍ酢酸と約１８ｍｌの１００％エタノールを
加え−２０℃で一晩おいて沈殿させる。サンプルを再度
１０分間１０℃、８０００ｒｐｍで遠心する。サンプル
を、約１２ｍｌの約７．５Ｍグアニジン塩酸（ｐＨ７．
０）、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、５ｍＭジチオスレ
イトールからなる液中に再度懸濁し、勢いよく振とう
し、溶解するまで６８℃に加熱する。サンプルは再度約
０．３ｍｌの１Ｍ酢酸と約６ｍｌの１００％エタノール
を加え−２０℃で一晩おいて沈殿させる。再び前のよう
にサンプルを遠心し、懸濁し、沈殿させるが、前回の容
量の２分の１とする。すなわち、それぞれ６ｍｌ、０．
１５ｍｌ、３ｍｌである。サンプルを再度ペレットに
し、約１０ｍｌの室温９５％エタノールとともに摩砕す
る。乾熱したＣｏｒｅｘ遠心管に移し、約１０，０００
ｒｐｍ、約１０℃で３０分間遠心してペレットにした。
ＲＮＡペレットはＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ（Savant Instrum
ents) を用いて真空下で乾燥し、約６８℃で約２ｍｌの
ジエチルピロカーボネート処理した滅菌蒸留水に溶解
し、再度ペレットにして、約１ｍｌのジエチルピロカー
ボネート処理した滅菌蒸留水で抽出し、再度ペレットに
する。抽出物は約３００μｌの２Ｍ酢酸カリウム（約ｐ
Ｈ５．０）、約８ｍｌの１００％エタノールを加えて−
２０℃一晩おいて沈殿させる。最終ＲＮＡ標品はペレッ
トにして、約１ｍｌのジエチルピロカーボネート処理し
た滅菌蒸留水に再懸濁する。２６０ｎｍと２８０ｎｍに
おける吸光度の読み（ベックマン分光光度計）からＲＮ
Ａ濃度を求める。約３μｇのＲＮＡを１．２％アガロー
スゲルで電気泳動を行なって、ＲＮＡの質、サイズ、相
対濃度をチェックする。ＲＮＡサンプルは−７０℃で保
存する。ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ（ＲＱ１ＤＮａ
ｓｅ、プロメガ）を用いてＲＮＡを処理した。処理は消
化を約３０−４０分間約３７℃で行なったほかはメーカ
ーの指示に従った。サンプルをほぼ等量のフェノール／
クロロホルムで抽出し、約１/ １０容の約３Ｍ酢酸ナト
リウムと約２と１/ ２容のエタノールにより約−７０℃
一晩沈殿させた。遠心してＲＮＡペレットを回収し、約
７５％エタノールで洗い、真空下で乾燥して、ジエチル
ピロカーボネート処理した滅菌蒸留水に再懸濁する。２
０から３０ｍｇのＲＮＡを１×変性溶液（４×変性溶液
は、約１ｍｌのホルムアルデヒド、５６μｌの１Ｍリン
酸ナトリウム（ｐ６．５）および３４４μｌの滅菌蒸留
水からなる）中で６８℃約２０分間変性させてから、Ｎ
ｙｔｒａｎフィルター上に２連でスロットに入れた。変
性サンプルは直ちに氷のうえに置いて冷却し、メーカー
の指示に従ってＮｙｔｒａｎフィルター上にスロット／
ドットマニホールドを用いて固定した（バイオラッドラ
ボラトリーズ）。ついでオリゴヌクレオチドプローブを
ノーザン（ＲＮＡ）ブロットするためメーカー（Schlie
cher & Schnell) の指示どおりナイロンフィルターをプ
レハイブリダイズ、ハイブリダイズ、洗浄を行なった。
オリゴヌクレオチドプローブは先にのべたように32Ｐで
末端ラベルを行なう。
プル中の複数種エイメイリアの存在と濃度を知るために
用いることができる。ニワトリ小腸からエイメリアのＲ
ＮＡを単離するにはＲＮＡの分解を避けるように注意し
なければならない。うまく行く方法の１つは、Ｃｈｉｒ
ｇｗｉｎらの方法（Biochemistry18: 5294-5299 (1979)
と基本的に同じである。３−５日前にワクチン投与した
ニワトリから粘膜かき取り物を取り、先に述べたように
して５０ｍｌ容遠心管に移す。これらのかき取り物をた
だちに約４Ｍグアニジンチオシアネート（ｐＨ７．
０）、約０．５％Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウ
ム、約２５ｍｌクエン酸ナトリウム、約０．１Ｍ２−メ
ルカプトエタノールおよび約０．１％シグマ３０％アン
チフォームＡからなる液２４ｍｌ中に入れる。サンプル
は速やかにポリトロン（Brinkmann)を用いて最高速度で
２０秒ずつ３回ホモジナイズする。その間ポリトロンは
滅菌蒸留水で２回ゆすぐ。ついでサンプルを懸垂バケッ
トローター中約８０００ｒｐｍで１０分間（約１０℃）
で遠心する。上清を傾斜して除き、ペレットを約０．６
ｍｌの約１Ｍ酢酸と約１８ｍｌの１００％エタノールを
加え−２０℃で一晩おいて沈殿させる。サンプルを再度
１０分間１０℃、８０００ｒｐｍで遠心する。サンプル
を、約１２ｍｌの約７．５Ｍグアニジン塩酸（ｐＨ７．
０）、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、５ｍＭジチオスレ
イトールからなる液中に再度懸濁し、勢いよく振とう
し、溶解するまで６８℃に加熱する。サンプルは再度約
０．３ｍｌの１Ｍ酢酸と約６ｍｌの１００％エタノール
を加え−２０℃で一晩おいて沈殿させる。再び前のよう
にサンプルを遠心し、懸濁し、沈殿させるが、前回の容
量の２分の１とする。すなわち、それぞれ６ｍｌ、０．
１５ｍｌ、３ｍｌである。サンプルを再度ペレットに
し、約１０ｍｌの室温９５％エタノールとともに摩砕す
る。乾熱したＣｏｒｅｘ遠心管に移し、約１０，０００
ｒｐｍ、約１０℃で３０分間遠心してペレットにした。
ＲＮＡペレットはＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ（Savant Instrum
ents) を用いて真空下で乾燥し、約６８℃で約２ｍｌの
ジエチルピロカーボネート処理した滅菌蒸留水に溶解
し、再度ペレットにして、約１ｍｌのジエチルピロカー
ボネート処理した滅菌蒸留水で抽出し、再度ペレットに
する。抽出物は約３００μｌの２Ｍ酢酸カリウム（約ｐ
Ｈ５．０）、約８ｍｌの１００％エタノールを加えて−
２０℃一晩おいて沈殿させる。最終ＲＮＡ標品はペレッ
トにして、約１ｍｌのジエチルピロカーボネート処理し
た滅菌蒸留水に再懸濁する。２６０ｎｍと２８０ｎｍに
おける吸光度の読み（ベックマン分光光度計）からＲＮ
Ａ濃度を求める。約３μｇのＲＮＡを１．２％アガロー
スゲルで電気泳動を行なって、ＲＮＡの質、サイズ、相
対濃度をチェックする。ＲＮＡサンプルは−７０℃で保
存する。ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ（ＲＱ１ＤＮａ
ｓｅ、プロメガ）を用いてＲＮＡを処理した。処理は消
化を約３０−４０分間約３７℃で行なったほかはメーカ
ーの指示に従った。サンプルをほぼ等量のフェノール／
クロロホルムで抽出し、約１/ １０容の約３Ｍ酢酸ナト
リウムと約２と１/ ２容のエタノールにより約−７０℃
一晩沈殿させた。遠心してＲＮＡペレットを回収し、約
７５％エタノールで洗い、真空下で乾燥して、ジエチル
ピロカーボネート処理した滅菌蒸留水に再懸濁する。２
０から３０ｍｇのＲＮＡを１×変性溶液（４×変性溶液
は、約１ｍｌのホルムアルデヒド、５６μｌの１Ｍリン
酸ナトリウム（ｐ６．５）および３４４μｌの滅菌蒸留
水からなる）中で６８℃約２０分間変性させてから、Ｎ
ｙｔｒａｎフィルター上に２連でスロットに入れた。変
性サンプルは直ちに氷のうえに置いて冷却し、メーカー
の指示に従ってＮｙｔｒａｎフィルター上にスロット／
ドットマニホールドを用いて固定した（バイオラッドラ
ボラトリーズ）。ついでオリゴヌクレオチドプローブを
ノーザン（ＲＮＡ）ブロットするためメーカー（Schlie
cher & Schnell) の指示どおりナイロンフィルターをプ
レハイブリダイズ、ハイブリダイズ、洗浄を行なった。
オリゴヌクレオチドプローブは先にのべたように32Ｐで
末端ラベルを行なう。
【００３３】糞中のオーシストのゲノムＤＮＡもまた単
離して１サンプル中の複数のエイメリア種の存在と濃度
を決めるのに利用することができる。糞を蒸留水で約１
０倍に希釈し、ついで内容物を篩い装置を通過させる。
順々に目の細かくなる篩いを通すことにより糞の残渣は
相当除かれる。部分的に精製された各エイメリア種のオ
ーシストは、約２．２Ｍショ糖に浮遊させることにより
回収される（Jackson,Parasitol. 54: 87-93 (1964)、
さらに５．２５％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液中で４
０℃で約１０分間インキュベートして処理する。次亜塩
素酸ナトリウムは滅菌リン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）
（ｐＨ７．６）で数回洗浄して除き、精製され、滅菌さ
れたオーシストが得られる。種類によってオーシストは
ＰＢＳまたは滅菌水中で振とうしながら約２０℃の水浴
中で２４から６０時間胞子形成させる（Edgar, Trans.
Am. Micr. Soc. 62: 237-242(1954)) 。胞子形成後オー
シストはＰＢＳで数回洗浄する。
離して１サンプル中の複数のエイメリア種の存在と濃度
を決めるのに利用することができる。糞を蒸留水で約１
０倍に希釈し、ついで内容物を篩い装置を通過させる。
順々に目の細かくなる篩いを通すことにより糞の残渣は
相当除かれる。部分的に精製された各エイメリア種のオ
ーシストは、約２．２Ｍショ糖に浮遊させることにより
回収される（Jackson,Parasitol. 54: 87-93 (1964)、
さらに５．２５％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液中で４
０℃で約１０分間インキュベートして処理する。次亜塩
素酸ナトリウムは滅菌リン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）
（ｐＨ７．６）で数回洗浄して除き、精製され、滅菌さ
れたオーシストが得られる。種類によってオーシストは
ＰＢＳまたは滅菌水中で振とうしながら約２０℃の水浴
中で２４から６０時間胞子形成させる（Edgar, Trans.
Am. Micr. Soc. 62: 237-242(1954)) 。胞子形成後オー
シストはＰＢＳで数回洗浄する。
【００３４】胞子形成したオーシストは滅菌した３ｍｍ
のガラスビーズと振とうして破砕する。ガラスビーズは
オーシストの懸濁液に加えて、渦巻きミキサーで約２分
間勢いよく攪拌する。時々破砕の具合を顕微鏡で調べ、
約５０％が破壊されたらガラスビーズを沈降させビーズ
の上のサンプルを等容量のパーコール（ファルマシア）
と混合する。破壊されたオーシストは４℃約２０００×
ｇから約５０００×ｇで約１０分間遠心してスポロシス
トに富んだ画分をペレットとして得る。未破壊のオーシ
ストは５０％パーコールの上に層となるのでこれを取っ
てＰＢＳで洗浄し、ガラスビーズと混ぜて先に述べた様
に再度攪拌する。パーコール分画後に未破砕のオーシス
トがほとんど残らないようになるまでこの操作を繰り返
す（３−４回）。スポロシストペレットは一緒にしてＰ
ＢＳで数回洗浄する。
のガラスビーズと振とうして破砕する。ガラスビーズは
オーシストの懸濁液に加えて、渦巻きミキサーで約２分
間勢いよく攪拌する。時々破砕の具合を顕微鏡で調べ、
約５０％が破壊されたらガラスビーズを沈降させビーズ
の上のサンプルを等容量のパーコール（ファルマシア）
と混合する。破壊されたオーシストは４℃約２０００×
ｇから約５０００×ｇで約１０分間遠心してスポロシス
トに富んだ画分をペレットとして得る。未破壊のオーシ
ストは５０％パーコールの上に層となるのでこれを取っ
てＰＢＳで洗浄し、ガラスビーズと混ぜて先に述べた様
に再度攪拌する。パーコール分画後に未破砕のオーシス
トがほとんど残らないようになるまでこの操作を繰り返
す（３−４回）。スポロシストペレットは一緒にしてＰ
ＢＳで数回洗浄する。
【００３５】スポロシストは０．０１Ｍトリス（ｐＨ
８．０）、０．２ＭＮａＣｌでほぼ１ｍｌ当たり１０8
になる様に希釈する。懸濁液を１％ドデシル硫酸ナトリ
ウムと約１０ｍＭＥＤＴＡを含むように調整すると、膜
が溶解する。放出されたゲノムＤＮＡをプロテイナーゼ
Ｋ（１５０μｇ/ ｍｌ）で約３０分間６５℃で消化する
ことにより可溶化しゲノムＤＮＡをバッファ飽和フェノ
ール（ｐＨ約７．６）で２回、フェノール/ クロロホル
ム/ イソアミルアルコール（約２５：２４：１）で２
回、クロロホルム/ アミルアルコール（約２４：１）で
２回抽出する。最終の水層を１０ｍＭトリス（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）中で一晩透析する。ＤＮＡと一緒に精製されて
きたＲＮＡは、熱失活させたＲＮａｓｅＡを１５０μｇ
/ ｍｌの濃度で用いて消化することにより選択的に透析
物中から除去する。サンプルは約１時間約３７℃でイン
キュベートする。ＲＴＮａｓｅや他の混在蛋白質は再度
プロテイナーゼＫで消化して除去する（約１５０μｇ/
ｍｌ、約３０分間３７℃処理）。ついでゲノムＤＮＡを
上に述べたように有機溶媒により順番に抽出する。最終
の水層は約０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと約２．５容
量の約１００％のエタノールを加えて沈殿させる。グリ
コーゲンを２０μｇ/ ｍｌになるように加えてキャリヤ
ーとする。ペレットを約７０％のエタノールで２回洗浄
する。ゲノムＤＮＡのペレットは逆さまにして風乾し、
約１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭＥＤＴ
Ａ緩衝液（ＴＥ）または蒸留水中に約５−８×１０8 ス
ポロシスト相当物/ ｍｌとなるように懸濁し、２６０ｎ
ｍの吸収により定量する。ＤＮＡの一部をアガロースゲ
ル電気泳動により分析し、１）分光吸収による濃度、
２）残存ＲＮＡが存在しないこと、３）高分子量に保た
れていること、の３点を確認する。
８．０）、０．２ＭＮａＣｌでほぼ１ｍｌ当たり１０8
になる様に希釈する。懸濁液を１％ドデシル硫酸ナトリ
ウムと約１０ｍＭＥＤＴＡを含むように調整すると、膜
が溶解する。放出されたゲノムＤＮＡをプロテイナーゼ
Ｋ（１５０μｇ/ ｍｌ）で約３０分間６５℃で消化する
ことにより可溶化しゲノムＤＮＡをバッファ飽和フェノ
ール（ｐＨ約７．６）で２回、フェノール/ クロロホル
ム/ イソアミルアルコール（約２５：２４：１）で２
回、クロロホルム/ アミルアルコール（約２４：１）で
２回抽出する。最終の水層を１０ｍＭトリス（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）中で一晩透析する。ＤＮＡと一緒に精製されて
きたＲＮＡは、熱失活させたＲＮａｓｅＡを１５０μｇ
/ ｍｌの濃度で用いて消化することにより選択的に透析
物中から除去する。サンプルは約１時間約３７℃でイン
キュベートする。ＲＴＮａｓｅや他の混在蛋白質は再度
プロテイナーゼＫで消化して除去する（約１５０μｇ/
ｍｌ、約３０分間３７℃処理）。ついでゲノムＤＮＡを
上に述べたように有機溶媒により順番に抽出する。最終
の水層は約０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと約２．５容
量の約１００％のエタノールを加えて沈殿させる。グリ
コーゲンを２０μｇ/ ｍｌになるように加えてキャリヤ
ーとする。ペレットを約７０％のエタノールで２回洗浄
する。ゲノムＤＮＡのペレットは逆さまにして風乾し、
約１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭＥＤＴ
Ａ緩衝液（ＴＥ）または蒸留水中に約５−８×１０8 ス
ポロシスト相当物/ ｍｌとなるように懸濁し、２６０ｎ
ｍの吸収により定量する。ＤＮＡの一部をアガロースゲ
ル電気泳動により分析し、１）分光吸収による濃度、
２）残存ＲＮＡが存在しないこと、３）高分子量に保た
れていること、の３点を確認する。
【００３６】ビスベンズイミドアッセイで定量した等し
い量のゲノムＤＮＡを変性させ、ハイブリダイゼーショ
ンのため８枚の同じＮｙｔｒａｎ紙のシート上に固定す
る。通常、先に述べたようにして定量した約１００ｎｇ
のゲノムＤＮＡを、水で１００μｌに調整し、これに約
０．１容の約３ＭＮａＯＨを加える。これを約７０℃で
約３０−６０分間インキュベートして変性させ、室温ま
で冷やして約２Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）を
約１容加えて中和する。これをＮｙｔｒａｎシートにス
ロットブロットまたはドットブロットマニホールド中で
メーカー（Schliecher & Schuell Inc.)の説明書に従っ
て載せた。真空で引いてサンプルを濾過する。精製した
各トリエイメリア種から調製したゲノムＤＮＡもフィル
ターに載せて、種特異的定量の標準品とする。適当なバ
ッファーコントロールおよびブランクコントロールも常
用する。フィルターを風乾し、真空下で約８０℃約２時
間加熱する。プレハイブリダイゼーション、オリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーション、洗浄、およびハイブ
リダイゼーションの定量はさきにのべたように行なう。
下記実施例は本発明について示すが、しかしながら本発
明をそれらに限定するわけではない。
い量のゲノムＤＮＡを変性させ、ハイブリダイゼーショ
ンのため８枚の同じＮｙｔｒａｎ紙のシート上に固定す
る。通常、先に述べたようにして定量した約１００ｎｇ
のゲノムＤＮＡを、水で１００μｌに調整し、これに約
０．１容の約３ＭＮａＯＨを加える。これを約７０℃で
約３０−６０分間インキュベートして変性させ、室温ま
で冷やして約２Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）を
約１容加えて中和する。これをＮｙｔｒａｎシートにス
ロットブロットまたはドットブロットマニホールド中で
メーカー（Schliecher & Schuell Inc.)の説明書に従っ
て載せた。真空で引いてサンプルを濾過する。精製した
各トリエイメリア種から調製したゲノムＤＮＡもフィル
ターに載せて、種特異的定量の標準品とする。適当なバ
ッファーコントロールおよびブランクコントロールも常
用する。フィルターを風乾し、真空下で約８０℃約２時
間加熱する。プレハイブリダイゼーション、オリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーション、洗浄、およびハイブ
リダイゼーションの定量はさきにのべたように行なう。
下記実施例は本発明について示すが、しかしながら本発
明をそれらに限定するわけではない。
【００３７】実施例１ アイメリア種小サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子の
クローニング方法 Ｅ．アセルブリナ（E. acervulina)、Ｅ．ブルネッティ
（E. Brunetti)、Ｅ．マキシマ（E. maxima)、Ｅ．ミチ
ス（E. mitis) 、Ｅ．ネカトリクス（E. necatrix)、
Ｅ．プラエコクス（E. praecox) 及びＥ．テネラ（E. t
enella) の実験株からの接合子嚢（オーシスト）をブロ
イラーニワトリの経口感染により増殖させた。アイメリ
ア・テネラ接合子嚢を感染後５〜７日目にニワトリの盲
腸内容物から単離した。残りのアイメリア種は感染後３
〜８日目に盲腸回収物から個別的に単離した。盲腸内容
物をワーリング・ブレンダー（Waring Blender) 内にお
いて蒸留水中で物理的に破砕し、ペプシンで消化した。
消化後、砕片を蒸留水中で遠心により除去した。糞を蒸
留水で１０倍希釈し、しかる後内容物を篩分け装置に通
した。サイズ減少スクリーンへの連続通過で多量の糞砕
片を機能的に除去した。次いで７つのアイメリア種の各
々に関して部分的に純粋な接合子嚢分画を２．２Ｍスク
ロース中で浮上法により集め〔ジャクソン、パラシトー
ル、第５４巻、第８７−９３頁、１９６４年（Jackson,
Parasitol.,５４：８７−９３（１９６４）) 〕、更に
水中５．２５％の濃度で次亜塩素酸ナトリウム中４０℃
で１０分間のインキュベートにより処理した。次亜塩素
酸ナトリウムをpH７．６の無菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）
で数回の洗浄により除去し、純粋な無菌接合子嚢を得
た。種に応じて、接合子嚢をＰＢＳ又は滅菌水中２０℃
で２４〜６０時間にわたり振盪水浴中で胞子形成させた
〔エドガー、トランスアクションズ・オブ・アメリカン
・ミクロバイオロジカル・ソサエティ、第６２巻、第２
３７−２４２頁、１９５４年（Edgar, Trans. Am. Mic
r. Soc.６２、２３７−２４２（１９５４）) 〕。胞子
形成後、接合子嚢を無菌ＰＢＳで数回洗浄した。
クローニング方法 Ｅ．アセルブリナ（E. acervulina)、Ｅ．ブルネッティ
（E. Brunetti)、Ｅ．マキシマ（E. maxima)、Ｅ．ミチ
ス（E. mitis) 、Ｅ．ネカトリクス（E. necatrix)、
Ｅ．プラエコクス（E. praecox) 及びＥ．テネラ（E. t
enella) の実験株からの接合子嚢（オーシスト）をブロ
イラーニワトリの経口感染により増殖させた。アイメリ
ア・テネラ接合子嚢を感染後５〜７日目にニワトリの盲
腸内容物から単離した。残りのアイメリア種は感染後３
〜８日目に盲腸回収物から個別的に単離した。盲腸内容
物をワーリング・ブレンダー（Waring Blender) 内にお
いて蒸留水中で物理的に破砕し、ペプシンで消化した。
消化後、砕片を蒸留水中で遠心により除去した。糞を蒸
留水で１０倍希釈し、しかる後内容物を篩分け装置に通
した。サイズ減少スクリーンへの連続通過で多量の糞砕
片を機能的に除去した。次いで７つのアイメリア種の各
々に関して部分的に純粋な接合子嚢分画を２．２Ｍスク
ロース中で浮上法により集め〔ジャクソン、パラシトー
ル、第５４巻、第８７−９３頁、１９６４年（Jackson,
Parasitol.,５４：８７−９３（１９６４）) 〕、更に
水中５．２５％の濃度で次亜塩素酸ナトリウム中４０℃
で１０分間のインキュベートにより処理した。次亜塩素
酸ナトリウムをpH７．６の無菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）
で数回の洗浄により除去し、純粋な無菌接合子嚢を得
た。種に応じて、接合子嚢をＰＢＳ又は滅菌水中２０℃
で２４〜６０時間にわたり振盪水浴中で胞子形成させた
〔エドガー、トランスアクションズ・オブ・アメリカン
・ミクロバイオロジカル・ソサエティ、第６２巻、第２
３７−２４２頁、１９５４年（Edgar, Trans. Am. Mic
r. Soc.６２、２３７−２４２（１９５４）) 〕。胞子
形成後、接合子嚢を無菌ＰＢＳで数回洗浄した。
【００３８】胞子形成した接合子嚢は３mm無菌ガラスビ
ーズを用いて砕片した。ビーズを接合子嚢懸濁液に加
え、混合液をボルテックス（Vortex) ミキサーで約２分
間激しく混ぜた。定期的に破砕度を顕微鏡で調べた。約
５０％の胞子形成接合子嚢が破砕されたときにガラスビ
ースを静置し、ビーズ上のサンプルをとり、等容量のパ
ーコール（Percoll)〔ファルマシア（Pharmacia)〕と混
ぜた。破砕された接合子嚢を２０００xg、４℃で１０分
間の遠心に付し、胞子被嚢に富んだ分画をペレット化さ
せた。５０％パーコール上で層を形成する未破砕接合子
嚢をとり、ＰＢＳで洗浄し、ガラスビースと混ぜ、前記
のように再び混ぜた。この操作は未破砕接合子嚢がパー
コール分別後にほとんど残らなくなるまで繰返し（３〜
４回）行った。胞子被嚢ペレットを合わせ、ＰＢＳで数
回洗浄した。
ーズを用いて砕片した。ビーズを接合子嚢懸濁液に加
え、混合液をボルテックス（Vortex) ミキサーで約２分
間激しく混ぜた。定期的に破砕度を顕微鏡で調べた。約
５０％の胞子形成接合子嚢が破砕されたときにガラスビ
ースを静置し、ビーズ上のサンプルをとり、等容量のパ
ーコール（Percoll)〔ファルマシア（Pharmacia)〕と混
ぜた。破砕された接合子嚢を２０００xg、４℃で１０分
間の遠心に付し、胞子被嚢に富んだ分画をペレット化さ
せた。５０％パーコール上で層を形成する未破砕接合子
嚢をとり、ＰＢＳで洗浄し、ガラスビースと混ぜ、前記
のように再び混ぜた。この操作は未破砕接合子嚢がパー
コール分別後にほとんど残らなくなるまで繰返し（３〜
４回）行った。胞子被嚢ペレットを合わせ、ＰＢＳで数
回洗浄した。
【００３９】次いで胞子被嚢を０．０１Ｍトリス（pH
８．０）、０．２Ｍ NaClで約１０8／mlの濃度に希釈
し、懸濁液を１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及
び１０mM ＥＤＴＡに調整して、膜溶解させた。放出さ
れたゲノムＤＮＡを６５℃で約３０分間にわたるプロテ
イナーゼＫ（１５０μｇ／ml）切断で可溶化させた。ゲ
ノムＤＮＡを緩衝液平衡化フェノール（pH７．６）で２
回、２５：２４：１フェノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール混合液で２回及び２４：１クロロホルム
／イソアミルアルコールで２回抽出した。最終水相を１
０mMトリス（pH８．０）、１０mM NaCl、１０mM ＥＤ
ＴＡ（pH８．０）中で一夜透析した。ＤＮＡと同時精製
されたＲＮＡは濃度１５０μｌ／mlで用いられた熱不活
化ＲＮアーゼＡによる切断で透析物から選択的に除去し
た。サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。Ｒ
Ｎアーゼ及び他の残留タンパク質はプロテイナーゼＫに
よる二次切断（１５０μｇ／ml、５５℃で３０分間）で
除去した。次いでゲノムＤＮＡを前記のように有機溶媒
で連続抽出した。最終水相を０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナ
トリウム及び２．５倍容量の１００％エタノールで沈降
させた。グリコーゲンを２０μｇ／mlまで加え、キャリ
アとして作用させた。ペレットを７０％エタノールで２
回洗浄した。ゲノムＤＮＡペレットを反転して風乾し、
しかる後５．８×１０8 胞子被嚢当量／mlの濃度で１０
mMトリスＨＣl(pH７．６）、１mM ＥＤＴＡ緩衝液（Ｔ
Ｅ）又は蒸留水に懸濁し、２６０nmの吸光度により定量
した。次いで一部のＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に
より分析して、（i)スペクトル測定濃度、（ii) 残留Ｒ
ＮＡの欠如及び（iii)その高分子量結合性について確認
した。
８．０）、０．２Ｍ NaClで約１０8／mlの濃度に希釈
し、懸濁液を１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及
び１０mM ＥＤＴＡに調整して、膜溶解させた。放出さ
れたゲノムＤＮＡを６５℃で約３０分間にわたるプロテ
イナーゼＫ（１５０μｇ／ml）切断で可溶化させた。ゲ
ノムＤＮＡを緩衝液平衡化フェノール（pH７．６）で２
回、２５：２４：１フェノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール混合液で２回及び２４：１クロロホルム
／イソアミルアルコールで２回抽出した。最終水相を１
０mMトリス（pH８．０）、１０mM NaCl、１０mM ＥＤ
ＴＡ（pH８．０）中で一夜透析した。ＤＮＡと同時精製
されたＲＮＡは濃度１５０μｌ／mlで用いられた熱不活
化ＲＮアーゼＡによる切断で透析物から選択的に除去し
た。サンプルを３７℃で１時間インキュベートした。Ｒ
Ｎアーゼ及び他の残留タンパク質はプロテイナーゼＫに
よる二次切断（１５０μｇ／ml、５５℃で３０分間）で
除去した。次いでゲノムＤＮＡを前記のように有機溶媒
で連続抽出した。最終水相を０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナ
トリウム及び２．５倍容量の１００％エタノールで沈降
させた。グリコーゲンを２０μｇ／mlまで加え、キャリ
アとして作用させた。ペレットを７０％エタノールで２
回洗浄した。ゲノムＤＮＡペレットを反転して風乾し、
しかる後５．８×１０8 胞子被嚢当量／mlの濃度で１０
mMトリスＨＣl(pH７．６）、１mM ＥＤＴＡ緩衝液（Ｔ
Ｅ）又は蒸留水に懸濁し、２６０nmの吸光度により定量
した。次いで一部のＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に
より分析して、（i)スペクトル測定濃度、（ii) 残留Ｒ
ＮＡの欠如及び（iii)その高分子量結合性について確認
した。
【００４０】リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子座は
真核生物界中における系統発生関係を確立するため用い
られて成功をもたらした豊富な情報を有している〔ハセ
ガワら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・エボルーシ
ョン（J. Mol. Evol.)、第２２巻、第３２−８０頁、１
９８５年〕。いくつかの多岐にわたる生物からの ssrＲ
ＮＡの配列が最近編集された〔ダムスら、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ、第１６Ｓ巻、第ｒ８７−ｒ１７
３頁、１９８８年（Dams et al., Nucleic Acids Res.,
16S : r８７-r１７３（１９８８））；ニーフス（Neef
s)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１８Ｓ
巻、第２２３７−２３１７頁、１９９０年〕。これらヌ
クレオチド配列の比較分析では、著しい配列類似性を有
する領域及び著しい配列ずれで特徴付けられる他の領域
を示した。真核生物界でほぼ同一のコンセンサス小サブ
ユニットｒＲＮＡ(ssrＲＮＡ）の５′及び３′末端の双
方に近い領域が選択された。これらの配列に相当するオ
リゴヌクレオチドを選択した：
真核生物界中における系統発生関係を確立するため用い
られて成功をもたらした豊富な情報を有している〔ハセ
ガワら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・エボルーシ
ョン（J. Mol. Evol.)、第２２巻、第３２−８０頁、１
９８５年〕。いくつかの多岐にわたる生物からの ssrＲ
ＮＡの配列が最近編集された〔ダムスら、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ、第１６Ｓ巻、第ｒ８７−ｒ１７
３頁、１９８８年（Dams et al., Nucleic Acids Res.,
16S : r８７-r１７３（１９８８））；ニーフス（Neef
s)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１８Ｓ
巻、第２２３７−２３１７頁、１９９０年〕。これらヌ
クレオチド配列の比較分析では、著しい配列類似性を有
する領域及び著しい配列ずれで特徴付けられる他の領域
を示した。真核生物界でほぼ同一のコンセンサス小サブ
ユニットｒＲＮＡ(ssrＲＮＡ）の５′及び３′末端の双
方に近い領域が選択された。これらの配列に相当するオ
リゴヌクレオチドを選択した：
【化１４】 オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems)３８０Ｂ装置を用いて合成し、
製造業者の推奨に従い精製した。ＥＲＩＢ１（ＳＥＱ
ＩＤ NO：１）は真核生物 ssrＲＮＡ遺伝子の５′末端
から１０ヌクレオチド未満のコンセンサス配列を示す。
ＥＲＩＢ１０（ＳＥＱ ＩＤ NO：２）は真核生物 ssr
ＲＮＡ遺伝子の３′末端から約２０ヌクレオチドに位置
したコンセンサス配列と逆相補的である。一緒にする
と、これら２つのオリゴヌクレオチドは大部分の ssrＲ
ＮＡ遺伝子配列に及ぶ。
（Applied Biosystems)３８０Ｂ装置を用いて合成し、
製造業者の推奨に従い精製した。ＥＲＩＢ１（ＳＥＱ
ＩＤ NO：１）は真核生物 ssrＲＮＡ遺伝子の５′末端
から１０ヌクレオチド未満のコンセンサス配列を示す。
ＥＲＩＢ１０（ＳＥＱ ＩＤ NO：２）は真核生物 ssr
ＲＮＡ遺伝子の３′末端から約２０ヌクレオチドに位置
したコンセンサス配列と逆相補的である。一緒にする
と、これら２つのオリゴヌクレオチドは大部分の ssrＲ
ＮＡ遺伝子配列に及ぶ。
【００４１】ＥＲＩＢ１（ＳＥＱ ＩＤ NO：１）及び
ＥＲＩＢ１０（ＳＥＱ ＩＤ NO：２）は前記のような
７つのアイメリア種の各々のゲノムＤＮＡ調製物内に含
まれる ssrＲＮＡ遺伝子を選択的に増幅させる目的でポ
リメラーゼ鎖反応〔ＰＣＲ、サイキら、サイエンス（Sc
ience)、第２３９巻、第４８７−４９１頁、１９８８
年〕でプライマー対として用いた。ゲノムＤＮＡはケイ
光色素結合アッセイ〔レバルカ及びペイゲン、アナリテ
ィカル・バイオケミストリー、第１０２巻、第３４４−
３５２頁、１９８０年（Lebarca and Paigen, Anal. Bi
ochem., １０２：３４４−３５２（１９８９）) 〕を用
いて定量し、ＰＣＲ鋳型用として最終濃度２．５ng／μ
ｌまで希釈した。１００mMトリスＨＣl(pH８．３）、５
００mM ＫＣl 、１５mM MgCl2 、０．０１％ゼラチン
からなる１０Ｘ反応緩衝液とトリスＨＣl(pH７．６）緩
衝化ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの１０
０mMストックを調製した。反応混合液は下記成分：水、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各２００
μＭ）、１Ｘ反応緩衝液、各１μＭの２種オリゴヌクレ
オチドプライマー（ＥＲＩＢ１及びＥＲＩＢ１０）（Ｓ
ＥＱ ＩＤ NO：１及びＳＥＱ ＩＤ NO：２）並びに
１．２５Ｕ ＴaqＤＮＡポリメラーゼをこの特定の順序
でこれらの最終濃度で混ぜることにより調製した。反応
混合液は反応カクテル９０μｌをゲノムＤＮＡ１０μｌ
（２５mg）と混ぜることにより専用のＰＣＲ反応チュー
ブ中で組合せた。反応液を軽質鉱油約５０μｌで覆い、
しかる後下記のようにプログラム化されたパーキン・エ
ルマー・シータス（Perkin ElmerCetus) ＤＮＡ熱サイ
クラー中にいれた： 各々（i)変性させるため９４℃で約６０秒間、（ii) ア
ニーリングするため５０℃で約９０秒間及び（iii)重合
のため７２℃で１２０秒間から構成されていた３５サイ
クル； 伸長のため７２℃で１０分間の１サイクル
ＥＲＩＢ１０（ＳＥＱ ＩＤ NO：２）は前記のような
７つのアイメリア種の各々のゲノムＤＮＡ調製物内に含
まれる ssrＲＮＡ遺伝子を選択的に増幅させる目的でポ
リメラーゼ鎖反応〔ＰＣＲ、サイキら、サイエンス（Sc
ience)、第２３９巻、第４８７−４９１頁、１９８８
年〕でプライマー対として用いた。ゲノムＤＮＡはケイ
光色素結合アッセイ〔レバルカ及びペイゲン、アナリテ
ィカル・バイオケミストリー、第１０２巻、第３４４−
３５２頁、１９８０年（Lebarca and Paigen, Anal. Bi
ochem., １０２：３４４−３５２（１９８９）) 〕を用
いて定量し、ＰＣＲ鋳型用として最終濃度２．５ng／μ
ｌまで希釈した。１００mMトリスＨＣl(pH８．３）、５
００mM ＫＣl 、１５mM MgCl2 、０．０１％ゼラチン
からなる１０Ｘ反応緩衝液とトリスＨＣl(pH７．６）緩
衝化ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの１０
０mMストックを調製した。反応混合液は下記成分：水、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各２００
μＭ）、１Ｘ反応緩衝液、各１μＭの２種オリゴヌクレ
オチドプライマー（ＥＲＩＢ１及びＥＲＩＢ１０）（Ｓ
ＥＱ ＩＤ NO：１及びＳＥＱ ＩＤ NO：２）並びに
１．２５Ｕ ＴaqＤＮＡポリメラーゼをこの特定の順序
でこれらの最終濃度で混ぜることにより調製した。反応
混合液は反応カクテル９０μｌをゲノムＤＮＡ１０μｌ
（２５mg）と混ぜることにより専用のＰＣＲ反応チュー
ブ中で組合せた。反応液を軽質鉱油約５０μｌで覆い、
しかる後下記のようにプログラム化されたパーキン・エ
ルマー・シータス（Perkin ElmerCetus) ＤＮＡ熱サイ
クラー中にいれた： 各々（i)変性させるため９４℃で約６０秒間、（ii) ア
ニーリングするため５０℃で約９０秒間及び（iii)重合
のため７２℃で１２０秒間から構成されていた３５サイ
クル； 伸長のため７２℃で１０分間の１サイクル
【００４２】反応生成物の一部５μｌをＤＮＡサイズ標
準品と共にＴＡＥ緩衝液中でアガロースゲルＤＮＡ電気
泳動に付した。鎖長約１．８kbの特徴的なバンドは、そ
のサイズは他の真核生物 ssrＲＮＡ遺伝子との相似性か
ら大ざっぱに予想されたものであるが、ＥＲＩＢ１（Ｓ
ＥＱ ＩＤ NO：１）及びＥＲＩＢ１０（ＳＥＱ ＩＤ
NO：２）が現実にアイメリア ssrＲＮＡ遺伝子とハイ
ブリッド形成し、ＴaqＤＮＡポリメラーゼがこれらプラ
イマーの３′末端からの伸長で反応生成物を合成するこ
とを示唆した。
準品と共にＴＡＥ緩衝液中でアガロースゲルＤＮＡ電気
泳動に付した。鎖長約１．８kbの特徴的なバンドは、そ
のサイズは他の真核生物 ssrＲＮＡ遺伝子との相似性か
ら大ざっぱに予想されたものであるが、ＥＲＩＢ１（Ｓ
ＥＱ ＩＤ NO：１）及びＥＲＩＢ１０（ＳＥＱ ＩＤ
NO：２）が現実にアイメリア ssrＲＮＡ遺伝子とハイ
ブリッド形成し、ＴaqＤＮＡポリメラーゼがこれらプラ
イマーの３′末端からの伸長で反応生成物を合成するこ
とを示唆した。
【００４３】定義によると、１．８kb ＰＣＲ生成物の
末端はインプットオリゴヌクレオチドに相当し、平滑化
されているべきである。しかしながら、ＴaqＤＮＡポリ
メラーゼは二重ＰＣＲ生成物の３′末端に単一の鋳型に
よらないヌクレオチド、特にｄＡＴＰを加えやすい
〔Ｊ．Ｍ．クラーク（J. M. Clarke) 、ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ、第１６巻、第９６７７−９６８６
頁、１９８８年〕。クローニング効率を高めるため、Ｐ
ＣＲ生成物の末端を細菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ
断片の作用でブラント末端に“平滑化”した。反応生成
物を前記のようにフェノールで１回、フェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコールミックスで１回及びク
ロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出した。Ｄ
ＮＡを酢酸ナトリウム／エタノールで沈降させ、ペレッ
トを７０％エタノールで２回洗浄した。クレノウ断片反
応のため、ＤＮＡ（１〜１０μｇ）を水１５μｌに懸濁
し、１０Ｘニックトランスレーション緩衝液〔０．５Ｍ
トリスＣl(pH７．２）、０．１Ｍ MgSO4 、１mMジチオ
スレイトール、５００μｇ／ml牛血清アルブミン（ＢＳ
ＡペンタックスフラクションＶ）〕２μｌ、全４種ｄＮ
ＴＰの１．２５mM溶液２μｌ及びクレノウ１μｌ（＝５
単位）と混ぜた。反応は１４℃で１時間行い、６５℃で
１０分間加熱することにより終結させた。平滑化された
１．８kbＤＮＡ生成物をＧ２５カラムに通し、前記のよ
うにフェノールで１回及びクロロホルム／イソアミルア
ルコールで２回抽出した。ＤＮＡを酢酸ナトリウム／エ
タノールで沈降させ、ペレットを７０％エタノールで２
回洗浄した。ＤＮＡを水３６μｌに再懸濁し、０．２Ｍ
トリスＨＣl(pH９．５）、１０mMスペルミジン、１mM
ＥＤＴＡ４μｌと混ぜた。この反応混合物を７０℃で５
分間インキュベートし、しかる後氷で急速に冷却した。
上記４０μｌに１０Ｘブラント末端キナーゼ緩衝液
（０．５ＭトリスＣl(pH９．５）、０．１Ｍ MgCl2、
５０mMジチオスレイトール、５０％グリセロール）５μ
ｌ、ＡＴＰの１０mM溶液５μｌ及びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ２μｌ（＝２０Ｕ）を加える。反応は３７℃
で３０分間行い、０．５Ｍ ＥＤＴＡ２μｌの添加で終
結させた。反応混合液をＴＥ緩衝液で約１００μｌに調
整し、反応生成物を前記のようにフェノールで１回、フ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールミック
スで１回及びクロロホルム／イソアミルアルコールで１
回抽出した。ＤＮＡを酢酸ナトリウム／エタノールで沈
降させ、ペレットを前記のように７０％エタノールで２
回洗浄した。ＤＮＡを水２０μｌに再懸濁し、２６０nm
の吸光度により定量した。
末端はインプットオリゴヌクレオチドに相当し、平滑化
されているべきである。しかしながら、ＴaqＤＮＡポリ
メラーゼは二重ＰＣＲ生成物の３′末端に単一の鋳型に
よらないヌクレオチド、特にｄＡＴＰを加えやすい
〔Ｊ．Ｍ．クラーク（J. M. Clarke) 、ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ、第１６巻、第９６７７−９６８６
頁、１９８８年〕。クローニング効率を高めるため、Ｐ
ＣＲ生成物の末端を細菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ
断片の作用でブラント末端に“平滑化”した。反応生成
物を前記のようにフェノールで１回、フェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコールミックスで１回及びク
ロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出した。Ｄ
ＮＡを酢酸ナトリウム／エタノールで沈降させ、ペレッ
トを７０％エタノールで２回洗浄した。クレノウ断片反
応のため、ＤＮＡ（１〜１０μｇ）を水１５μｌに懸濁
し、１０Ｘニックトランスレーション緩衝液〔０．５Ｍ
トリスＣl(pH７．２）、０．１Ｍ MgSO4 、１mMジチオ
スレイトール、５００μｇ／ml牛血清アルブミン（ＢＳ
ＡペンタックスフラクションＶ）〕２μｌ、全４種ｄＮ
ＴＰの１．２５mM溶液２μｌ及びクレノウ１μｌ（＝５
単位）と混ぜた。反応は１４℃で１時間行い、６５℃で
１０分間加熱することにより終結させた。平滑化された
１．８kbＤＮＡ生成物をＧ２５カラムに通し、前記のよ
うにフェノールで１回及びクロロホルム／イソアミルア
ルコールで２回抽出した。ＤＮＡを酢酸ナトリウム／エ
タノールで沈降させ、ペレットを７０％エタノールで２
回洗浄した。ＤＮＡを水３６μｌに再懸濁し、０．２Ｍ
トリスＨＣl(pH９．５）、１０mMスペルミジン、１mM
ＥＤＴＡ４μｌと混ぜた。この反応混合物を７０℃で５
分間インキュベートし、しかる後氷で急速に冷却した。
上記４０μｌに１０Ｘブラント末端キナーゼ緩衝液
（０．５ＭトリスＣl(pH９．５）、０．１Ｍ MgCl2、
５０mMジチオスレイトール、５０％グリセロール）５μ
ｌ、ＡＴＰの１０mM溶液５μｌ及びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ２μｌ（＝２０Ｕ）を加える。反応は３７℃
で３０分間行い、０．５Ｍ ＥＤＴＡ２μｌの添加で終
結させた。反応混合液をＴＥ緩衝液で約１００μｌに調
整し、反応生成物を前記のようにフェノールで１回、フ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールミック
スで１回及びクロロホルム／イソアミルアルコールで１
回抽出した。ＤＮＡを酢酸ナトリウム／エタノールで沈
降させ、ペレットを前記のように７０％エタノールで２
回洗浄した。ＤＮＡを水２０μｌに再懸濁し、２６０nm
の吸光度により定量した。
【００４４】次いで平滑化された１．８kb ＤＮＡ生成
物をアガロースゲル電気泳動に付して、平滑化された
１．８kb生成物から残留オリゴヌクレオチドプライマー
及び非特定ＰＣＲ生成物を分離した。関係バンドを含む
ゲルスライスを切出し、融解させ、ＤＮＡを製造業者の
指示に従いジェネクリーンII（Geneclean II) 〔バイオ
１０１社（ＢＩＯ １０１社）、ボーゲルスタイン及び
ゲレスピー、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７６巻、第６１
５−６１９頁、１９７９年（Vogelstein and Gillespi
e, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７６：６１５−６１
９、１９７９）〕で溶出させた。次いで溶出したＤＮＡ
生成物を２６０nmの吸光度により定量した。
物をアガロースゲル電気泳動に付して、平滑化された
１．８kb生成物から残留オリゴヌクレオチドプライマー
及び非特定ＰＣＲ生成物を分離した。関係バンドを含む
ゲルスライスを切出し、融解させ、ＤＮＡを製造業者の
指示に従いジェネクリーンII（Geneclean II) 〔バイオ
１０１社（ＢＩＯ １０１社）、ボーゲルスタイン及び
ゲレスピー、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７６巻、第６１
５−６１９頁、１９７９年（Vogelstein and Gillespi
e, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７６：６１５−６１
９、１９７９）〕で溶出させた。次いで溶出したＤＮＡ
生成物を２６０nmの吸光度により定量した。
【００４５】ファージミドクローニングベクターｐＵＣ
１２０〔ビーリア（Vieria) 、ビレプリコン（Bireplic
on) 線状ファージ及び一本鎖プラスミドＤＮＡの産生、
博士論文、ミネソタ大学、１９８９年〕はポリリンカー
においてその唯一のＳmaＩ部位で切断される。他の適切
なクローニングベクターとしては格別限定されず、ｐＧ
ＥＭ−Ｚf 系〔プロメガ社（Promega Corporation)〕及
びpBluescript II系〔ストラタジーン・クローニング・
システムズ（Stratagene Cloning Systems) 〕がある。
切断は分析アガロースゲル電気泳動でモニターした。次
いで直鎖化ＤＮＡを有機溶媒で抽出し、前記のように７
０％エタノールで沈降、洗浄した。プラスミドの各鎖の
５′末端を子牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）でホスファ
ターゼ処理し、自己結合現象の頻度を減少させた。これ
は直鎖化プラスミド（約１０μｇ）を１０Ｘ ＣＩＰ緩
衝液（pH９．０の０．５ＭトリスＨＣl 、１０mM MgCl
2、１mM ZnCl2 、１０mMスペルミジン）５μｌ及びＣ
ＩＰ１μｌ（１単位）と最終５０μｌ反応容量中で混ぜ
ることにより行った。反応は３７℃で１５分間しかる後
５６℃で１５分間行った。次いで２回目のＣＩＰを加
え、反応を前記のように繰返した。反応をH2O ４０μ
ｌ、１０Ｘ ＳＴＥ緩衝液（pH８．０の１００mMトリス
ＨＣl 、１Ｍ NaCl、１０mM ＥＤＴＡ）１０μｌ、２
０％ＳＤＳ２．５μｌの添加で終結させ、６８℃で１５
分間加熱した。次いで直鎖化ホスファターゼ処理ベクタ
ーを前記のように抽出、沈降及び洗浄した。次いでｐＵ
Ｃ１２０ポリリンカー内のブラントＳmaＩ部位へ、ゲル
精製 ssrＲＮＡ遺伝子ＰＣＲ生成物の結合を行った。直
鎖化ベクター約１００ngをpH７．６の６６mMトリスＨＣ
l 、５mM MgCl2 、５mMジチオスレイトール、１mMＡＴ
Ｐからなる反応混合液２０μｌ中において等モル量の各
ＰＣＲ生成物と混ぜた。反応はＴ４ＤＮＡリガーゼの添
加で開始させ、１４℃で１２〜１６時間インキュベート
した。
１２０〔ビーリア（Vieria) 、ビレプリコン（Bireplic
on) 線状ファージ及び一本鎖プラスミドＤＮＡの産生、
博士論文、ミネソタ大学、１９８９年〕はポリリンカー
においてその唯一のＳmaＩ部位で切断される。他の適切
なクローニングベクターとしては格別限定されず、ｐＧ
ＥＭ−Ｚf 系〔プロメガ社（Promega Corporation)〕及
びpBluescript II系〔ストラタジーン・クローニング・
システムズ（Stratagene Cloning Systems) 〕がある。
切断は分析アガロースゲル電気泳動でモニターした。次
いで直鎖化ＤＮＡを有機溶媒で抽出し、前記のように７
０％エタノールで沈降、洗浄した。プラスミドの各鎖の
５′末端を子牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）でホスファ
ターゼ処理し、自己結合現象の頻度を減少させた。これ
は直鎖化プラスミド（約１０μｇ）を１０Ｘ ＣＩＰ緩
衝液（pH９．０の０．５ＭトリスＨＣl 、１０mM MgCl
2、１mM ZnCl2 、１０mMスペルミジン）５μｌ及びＣ
ＩＰ１μｌ（１単位）と最終５０μｌ反応容量中で混ぜ
ることにより行った。反応は３７℃で１５分間しかる後
５６℃で１５分間行った。次いで２回目のＣＩＰを加
え、反応を前記のように繰返した。反応をH2O ４０μ
ｌ、１０Ｘ ＳＴＥ緩衝液（pH８．０の１００mMトリス
ＨＣl 、１Ｍ NaCl、１０mM ＥＤＴＡ）１０μｌ、２
０％ＳＤＳ２．５μｌの添加で終結させ、６８℃で１５
分間加熱した。次いで直鎖化ホスファターゼ処理ベクタ
ーを前記のように抽出、沈降及び洗浄した。次いでｐＵ
Ｃ１２０ポリリンカー内のブラントＳmaＩ部位へ、ゲル
精製 ssrＲＮＡ遺伝子ＰＣＲ生成物の結合を行った。直
鎖化ベクター約１００ngをpH７．６の６６mMトリスＨＣ
l 、５mM MgCl2 、５mMジチオスレイトール、１mMＡＴ
Ｐからなる反応混合液２０μｌ中において等モル量の各
ＰＣＲ生成物と混ぜた。反応はＴ４ＤＮＡリガーゼの添
加で開始させ、１４℃で１２〜１６時間インキュベート
した。
【００４６】外来ＤＮＡを取込むことができるコンピテ
ント細菌細胞は下記方法により得た。既定容量（形質転
換反応毎に約２ml）の無菌２Ｘ ＹＴ細菌培地（バクト
トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、NaCl ５ｇ／リ
ットル）に大腸菌ＭＶ１１８４の単一コロニーを接種
し、それが６００nmで０．６の光学密度に達するまで３
７℃で激しく混ぜることにより増殖させた。他の適切な
細菌宿主としては格別限定されず、ＭＮ５２２、ＪＭ１
０１、ＴＢ１及びＸＬ１−Blueがある。細菌を１０００
xg、４℃で５分間の遠心により集めた。得られた細胞ペ
レットを無菌５０mM CaCl2で原培養容量の１／２に静か
に懸濁し、しかる後懸濁液を氷上に２０分間おいた。細
胞を遠心で再度集め、しかる後１／１０容量の無菌５０
mM CaCl2に静かに懸濁した。次いで細菌懸濁液を４℃
で１６〜２４時間保った。
ント細菌細胞は下記方法により得た。既定容量（形質転
換反応毎に約２ml）の無菌２Ｘ ＹＴ細菌培地（バクト
トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、NaCl ５ｇ／リ
ットル）に大腸菌ＭＶ１１８４の単一コロニーを接種
し、それが６００nmで０．６の光学密度に達するまで３
７℃で激しく混ぜることにより増殖させた。他の適切な
細菌宿主としては格別限定されず、ＭＮ５２２、ＪＭ１
０１、ＴＢ１及びＸＬ１−Blueがある。細菌を１０００
xg、４℃で５分間の遠心により集めた。得られた細胞ペ
レットを無菌５０mM CaCl2で原培養容量の１／２に静か
に懸濁し、しかる後懸濁液を氷上に２０分間おいた。細
胞を遠心で再度集め、しかる後１／１０容量の無菌５０
mM CaCl2に静かに懸濁した。次いで細菌懸濁液を４℃
で１６〜２４時間保った。
【００４７】２０μｌ結合反応混合液から２μｌ及び１
８μｌずつ無菌ポリプロピレンチューブ中に分配した。
コンピテント細菌約１００μｌを結合反応液（並びに適
切な結合及び形質転換コントロール）含有チューブの各
々に加え、これらを氷上に４０分間おいた。この後細菌
を４２℃で９０秒間のインキュベートにより“熱処理”
し、しかる後室温で約５分間かけて回収した。次いで各
形質転換チューブを、プラスミド保有細菌の選択及びプ
ラスミド維持のために５０mg／ｌの濃度でアンピシリン
を含有した２Ｘ ＹＴ寒天プレート上にまいた。プレー
トを反転位で一夜３７℃でインキュベートした。
８μｌずつ無菌ポリプロピレンチューブ中に分配した。
コンピテント細菌約１００μｌを結合反応液（並びに適
切な結合及び形質転換コントロール）含有チューブの各
々に加え、これらを氷上に４０分間おいた。この後細菌
を４２℃で９０秒間のインキュベートにより“熱処理”
し、しかる後室温で約５分間かけて回収した。次いで各
形質転換チューブを、プラスミド保有細菌の選択及びプ
ラスミド維持のために５０mg／ｌの濃度でアンピシリン
を含有した２Ｘ ＹＴ寒天プレート上にまいた。プレー
トを反転位で一夜３７℃でインキュベートした。
【００４８】プラスミド保有細菌クローンはアンピシリ
ンの存在下プレート上で増殖しうるそれらの能力により
確認した。単一コロニーを２Ｘ ＹＴ／ＡＭＰ（即ち、
５０mg／ｌでアンピシリンを含有した２Ｘ ＹＴ培地）
５mlに接種し、これらの培養物を激しく振盪しながら３
７℃で一夜増殖させた。培養物約１．５mlをエッペンド
ルフチューブ内に注ぎ入れ、エッペンドルフ遠心管中で
少なくとも１分間の遠心により集め、残りの培養物を４
℃で貯蔵し、遺伝子ストックとして役立てた。細菌ペレ
ット上の培地を吸引し、ペレットを５０mMグルコース、
１０mM ＥＤＴＡ、２５mMトリスＨＣl(pH８．０）、４
mg／mlリゾチームの冷新鮮調製溶液１００μｌ中で攪拌
により懸濁させた。この混合液を室温で５分間インキュ
ベートした。次いで０．２Ｎ NaOH、１％ＳＤＳからな
る冷新鮮調製溶液２００μｌを各チューブに加え、反転
により静かに混ぜ、氷上に５分間おいた。この混合液に
５Ｍ酢酸カリウム６ml、氷酢酸１．１５ml、蒸留水２．
８５ml含有の冷新鮮調製溶液１５０μｌを加えた。内容
物を静かに攪拌し、この混合液を氷上で５分間貯蔵し
た。細胞砕片をエッペンドルフ遠心管中４℃で１０分間
の遠心により集め、上澄液をフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回抽出
した。プラスミドＤＮＡ及び細胞ＲＮＡを室温で２倍容
量の１００％エタノールの添加により最終水相から沈降
させた。ペレットを室温で５分間の遠心により集め、ペ
レットを７０％エタノールで１回洗浄し、しかる後短時
間で乾燥させた。次いで核酸ペレットをＤＮアーゼ無Ｒ
Ｎアーゼ２０μｇ／ml含有のＴＥ５０μｌに懸濁し、３
７℃で１５〜３０分間インキュベートして細胞ＲＮＡを
定量的に除去した。次いで一部の１０μｌを５０mM Na
Cl、１００mMトリスＨＣl(pH７．５）、５mM MgCl2 か
らなる緩衝液中３７℃で６０分間にわたりHindIII及び
ＥcoＲ１（各々約２０単位）で完全に切断した。制限酵
素反応生成物をアガロースゲル電気泳動で分離し、適切
なインサートを含んだプラスミドを確認した。次いで予
想１．８kbインサート含有の組換えプラスミドを第二制
限酵素（通常ＲstＩ）で切断して、（i)インサートの単
一コピーのみがプラスミド内に含まれていることを確認
し、（ii) 細菌プロモーターと比べたインサートＤＮＡ
の向きについて調べた。これはＲＮアーゼ切断細菌核酸
の残り４０μｌから第二の１０μｌ部分を除去し、１０
０mM NaCl、１０mMトリスＨＣl(pH７．５）、10mM MgC
l2からなる緩衝液中３７℃で６０分間にわたり約２０単
位のＰstＩでそれを切断することにより行った。再び制
限酵素切断物をアガロースゲル電気泳動で分割した。
ンの存在下プレート上で増殖しうるそれらの能力により
確認した。単一コロニーを２Ｘ ＹＴ／ＡＭＰ（即ち、
５０mg／ｌでアンピシリンを含有した２Ｘ ＹＴ培地）
５mlに接種し、これらの培養物を激しく振盪しながら３
７℃で一夜増殖させた。培養物約１．５mlをエッペンド
ルフチューブ内に注ぎ入れ、エッペンドルフ遠心管中で
少なくとも１分間の遠心により集め、残りの培養物を４
℃で貯蔵し、遺伝子ストックとして役立てた。細菌ペレ
ット上の培地を吸引し、ペレットを５０mMグルコース、
１０mM ＥＤＴＡ、２５mMトリスＨＣl(pH８．０）、４
mg／mlリゾチームの冷新鮮調製溶液１００μｌ中で攪拌
により懸濁させた。この混合液を室温で５分間インキュ
ベートした。次いで０．２Ｎ NaOH、１％ＳＤＳからな
る冷新鮮調製溶液２００μｌを各チューブに加え、反転
により静かに混ぜ、氷上に５分間おいた。この混合液に
５Ｍ酢酸カリウム６ml、氷酢酸１．１５ml、蒸留水２．
８５ml含有の冷新鮮調製溶液１５０μｌを加えた。内容
物を静かに攪拌し、この混合液を氷上で５分間貯蔵し
た。細胞砕片をエッペンドルフ遠心管中４℃で１０分間
の遠心により集め、上澄液をフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回抽出
した。プラスミドＤＮＡ及び細胞ＲＮＡを室温で２倍容
量の１００％エタノールの添加により最終水相から沈降
させた。ペレットを室温で５分間の遠心により集め、ペ
レットを７０％エタノールで１回洗浄し、しかる後短時
間で乾燥させた。次いで核酸ペレットをＤＮアーゼ無Ｒ
Ｎアーゼ２０μｇ／ml含有のＴＥ５０μｌに懸濁し、３
７℃で１５〜３０分間インキュベートして細胞ＲＮＡを
定量的に除去した。次いで一部の１０μｌを５０mM Na
Cl、１００mMトリスＨＣl(pH７．５）、５mM MgCl2 か
らなる緩衝液中３７℃で６０分間にわたりHindIII及び
ＥcoＲ１（各々約２０単位）で完全に切断した。制限酵
素反応生成物をアガロースゲル電気泳動で分離し、適切
なインサートを含んだプラスミドを確認した。次いで予
想１．８kbインサート含有の組換えプラスミドを第二制
限酵素（通常ＲstＩ）で切断して、（i)インサートの単
一コピーのみがプラスミド内に含まれていることを確認
し、（ii) 細菌プロモーターと比べたインサートＤＮＡ
の向きについて調べた。これはＲＮアーゼ切断細菌核酸
の残り４０μｌから第二の１０μｌ部分を除去し、１０
０mM NaCl、１０mMトリスＨＣl(pH７．５）、10mM MgC
l2からなる緩衝液中３７℃で６０分間にわたり約２０単
位のＰstＩでそれを切断することにより行った。再び制
限酵素切断物をアガロースゲル電気泳動で分割した。
【００４９】Ｅ．アセルブリナ、Ｅ．ブルネッティ、
Ｅ．マキシマ、Ｅ．ミチス、Ｅ．ネカトリクス、Ｅ．プ
ラエコクス及びＥ．テネラ小サブユニットリボソームＲ
ＮＡをコードする単離及び精製された遺伝子は図１〜７
で各々示されている。７種の遺伝子配列を比較し、ヌク
レオチドの多様性を確認した。これらの多様性領域に相
補的なオリゴヌクレオチドを前記のように合成し、下記
のようにバイブリッド形成プローブとして用いた。表４
は様々なアイメリア種に関する本来の多様性配列につい
て示す。表３で示された配列（“共通”グループに関す
る場合を除く）は、最も便利な種特異性ハイブリッド形
成プローブ、即ち最大多様性のヌクレオチド配列を含む
ssrＲＮＡ遺伝子の領域に対し組立てられた最大特異性
を示すプローブの例である。
Ｅ．マキシマ、Ｅ．ミチス、Ｅ．ネカトリクス、Ｅ．プ
ラエコクス及びＥ．テネラ小サブユニットリボソームＲ
ＮＡをコードする単離及び精製された遺伝子は図１〜７
で各々示されている。７種の遺伝子配列を比較し、ヌク
レオチドの多様性を確認した。これらの多様性領域に相
補的なオリゴヌクレオチドを前記のように合成し、下記
のようにバイブリッド形成プローブとして用いた。表４
は様々なアイメリア種に関する本来の多様性配列につい
て示す。表３で示された配列（“共通”グループに関す
る場合を除く）は、最も便利な種特異性ハイブリッド形
成プローブ、即ち最大多様性のヌクレオチド配列を含む
ssrＲＮＡ遺伝子の領域に対し組立てられた最大特異性
を示すプローブの例である。
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【００５０】同目的に使用できる ssrＲＮＡ遺伝子の他
の領域は表４で示されている。 ssrＲＮＡ配列多様性の
インジケーターを図１〜７で示された配列のコンピュー
ター分析により得た。ＧＣＧ（ウィスコンシン大学）プ
ログラムパッケージ内のプログラムＰＲＥＴＴＹをマル
チ配列決定プログラムの例として用いた。このプログラ
ムのアルゴリズム目的は、塩基毎の比較を行い、一致数
を最適化するために必要な付加又は欠失に相当するギャ
ップを挿入して比較された配列間の相同領域を最大にす
ることである。図１２は図１〜７で示された配列を用い
てＰＲＥＴＴＹにより作成されたアウトプットの例であ
る。“コンセンサス”と名付けられたもう一つの欄があ
ることに留意せよ。これは比較された配列の相同性に関
する位置毎のレポートである。７つのヌクレオチドが全
部一致する場合には、大文字がその事を確認するために
用いられている。単一の差異が観察される場合、それは
コンセンサス配列において（−）で示される。この“配
列決定された”フォーマットにおいて、様々なサイズの
ギャップを挿入てあるため７つの種は全部１７６６塩基
の配列鎖長で終わることにも留意すべきである。このた
め図１２におけるヌクレオチドナンバリングシステムは
用いられた配列決定プログラム及びプログラムパラメー
ターに関連している。“配列決定された”フォーマット
において興味あるヌクレオチドセグメントは各個別種に
関する絶対配列ナンバリングシステムと相互参照されね
ばならない。
の領域は表４で示されている。 ssrＲＮＡ配列多様性の
インジケーターを図１〜７で示された配列のコンピュー
ター分析により得た。ＧＣＧ（ウィスコンシン大学）プ
ログラムパッケージ内のプログラムＰＲＥＴＴＹをマル
チ配列決定プログラムの例として用いた。このプログラ
ムのアルゴリズム目的は、塩基毎の比較を行い、一致数
を最適化するために必要な付加又は欠失に相当するギャ
ップを挿入して比較された配列間の相同領域を最大にす
ることである。図１２は図１〜７で示された配列を用い
てＰＲＥＴＴＹにより作成されたアウトプットの例であ
る。“コンセンサス”と名付けられたもう一つの欄があ
ることに留意せよ。これは比較された配列の相同性に関
する位置毎のレポートである。７つのヌクレオチドが全
部一致する場合には、大文字がその事を確認するために
用いられている。単一の差異が観察される場合、それは
コンセンサス配列において（−）で示される。この“配
列決定された”フォーマットにおいて、様々なサイズの
ギャップを挿入てあるため７つの種は全部１７６６塩基
の配列鎖長で終わることにも留意すべきである。このた
め図１２におけるヌクレオチドナンバリングシステムは
用いられた配列決定プログラム及びプログラムパラメー
ターに関連している。“配列決定された”フォーマット
において興味あるヌクレオチドセグメントは各個別種に
関する絶対配列ナンバリングシステムと相互参照されね
ばならない。
【００５１】表４ 種特異的ハイブリッド形成プローブ標的として有用なニ
ワトリアイメリア種からの ssrＲＮＡ遺伝子の領域図１
２における“配列決定”に関するヌクレオチド位置
ワトリアイメリア種からの ssrＲＮＡ遺伝子の領域図１
２における“配列決定”に関するヌクレオチド位置
【化１８】 進化過程で分岐してきた７つのニワトリアイメリア種か
らの ssrＲＮＡの領域は、“コンセンサス”配列を比較
して、特にダッシュ（−）が集中する領域を捜すことに
より確認できる（図１２参照）。このタイプの分析を用
いて、有用なハイブリッド形成プローブ標識であるため
に充分な種対種ヌクレオチド配列多様性を有するニワト
リアイメリアからの ssrＲＮＡ遺伝子内における約１２
の領域、即ちオリゴヌクレオチドハイブリッド形成プロ
ーブ用の鋳型として役立つ領域が確認された。表４は
“配列決定された”ヌクレオチドナンバリングシステム
を用いてこれらの領域について示す。表５は図１〜７で
示されたような各々の種に関する絶対配列ナンバリング
システムを用いて同領域を掲示している。
らの ssrＲＮＡの領域は、“コンセンサス”配列を比較
して、特にダッシュ（−）が集中する領域を捜すことに
より確認できる（図１２参照）。このタイプの分析を用
いて、有用なハイブリッド形成プローブ標識であるため
に充分な種対種ヌクレオチド配列多様性を有するニワト
リアイメリアからの ssrＲＮＡ遺伝子内における約１２
の領域、即ちオリゴヌクレオチドハイブリッド形成プロ
ーブ用の鋳型として役立つ領域が確認された。表４は
“配列決定された”ヌクレオチドナンバリングシステム
を用いてこれらの領域について示す。表５は図１〜７で
示されたような各々の種に関する絶対配列ナンバリング
システムを用いて同領域を掲示している。
【００５２】下記表はアイメリア種の各々に関する表４
の各領域のヌクレオチド位置を示す。
の各領域のヌクレオチド位置を示す。
【化１９】
【００５３】実施例２ 感染性アッセイ 生コクシジウムワクチンのロットを弱毒化したエイメリ
ア（Eimeria)菌からのオーシストを用いて製造した。ワ
クチンは次のエイメリア種を用いて調製した：Ｅ．アセ
ルブリナ（acervulina) 、Ｅ．テネラ（tenella)、Ｅ．
マイシマ（maxima) 、Ｅ．ネカトリクス（necatrix) 、
Ｅ．プラエコックス（praecox)、Ｅ．ミチス（mitis)、
Ｅ．ブルネッティ（brunetti) 、各種からのオーシスト
の免疫原用量を一緒にし、ワックスでビーズにし、石膏
で包んだ。一日令雌ＳＰＦレグホン（Leghorn)ヒヨコを
アイソレーターケージにとり込み、ワクチンを含まない
餌と水を２週令まで任意に与えた。餌をワクチン投与の
前日に取り除いた。ワクチンビーズを計量し、０．２５
倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、５倍及び１０倍ワク
チン投与量に等しいアリコートを餌（１５ｇ／ヒヨコ）
と混合し、８〜１０個体の群のヒヨコに与えた。すべて
のワクチンを４時間以内に消費した。ワクチンを十分に
消費した後、ワクチンを含まない餌をテスト期間中与え
た。８〜１０未処理トリの群に、実験計画の期間中普通
の餌と水を任意に与えた。８〜１０トリの別の群に同数
の非被包性オーシスト（１倍）を胃管栄養法によって投
与し、任意に給餌した。これらのトリは感染に対して陽
性の対照であり、非被包性のオーシストがワクチンのも
のと同じバッチからのものであったので、被包化後の生
物体の生存力をチェックするために供された。ワクチン
又は非被包オーシストの投与の３〜５日後、粘膜及び上
皮かき取物をトリ腸壁から調製した。これらのかき取物
から抽出された全核酸を、このプロトコルにおけるハイ
ブリッド形成ターゲット又はＰＣＲ増幅鋳型として供し
た。被包化プロセス後のエイメリアの各種の相対的感染
性を、インプットオーシストの数の増幅を検出する能力
に基づいて評価した。これは、実施例１で記載した種特
異性32Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチドハイブリッド
形成プローブを用いて行った。各処理群中のトリのいく
つかを、感染後４〜７日の糞中のオーシスト数をモニタ
ーするために保存した。定量は、クローンワクチン菌オ
ーシストから調製されたゲノムＤＮＡを用いて標準カー
ブに基づいて行った。 全核酸の調製
ア（Eimeria)菌からのオーシストを用いて製造した。ワ
クチンは次のエイメリア種を用いて調製した：Ｅ．アセ
ルブリナ（acervulina) 、Ｅ．テネラ（tenella)、Ｅ．
マイシマ（maxima) 、Ｅ．ネカトリクス（necatrix) 、
Ｅ．プラエコックス（praecox)、Ｅ．ミチス（mitis)、
Ｅ．ブルネッティ（brunetti) 、各種からのオーシスト
の免疫原用量を一緒にし、ワックスでビーズにし、石膏
で包んだ。一日令雌ＳＰＦレグホン（Leghorn)ヒヨコを
アイソレーターケージにとり込み、ワクチンを含まない
餌と水を２週令まで任意に与えた。餌をワクチン投与の
前日に取り除いた。ワクチンビーズを計量し、０．２５
倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、５倍及び１０倍ワク
チン投与量に等しいアリコートを餌（１５ｇ／ヒヨコ）
と混合し、８〜１０個体の群のヒヨコに与えた。すべて
のワクチンを４時間以内に消費した。ワクチンを十分に
消費した後、ワクチンを含まない餌をテスト期間中与え
た。８〜１０未処理トリの群に、実験計画の期間中普通
の餌と水を任意に与えた。８〜１０トリの別の群に同数
の非被包性オーシスト（１倍）を胃管栄養法によって投
与し、任意に給餌した。これらのトリは感染に対して陽
性の対照であり、非被包性のオーシストがワクチンのも
のと同じバッチからのものであったので、被包化後の生
物体の生存力をチェックするために供された。ワクチン
又は非被包オーシストの投与の３〜５日後、粘膜及び上
皮かき取物をトリ腸壁から調製した。これらのかき取物
から抽出された全核酸を、このプロトコルにおけるハイ
ブリッド形成ターゲット又はＰＣＲ増幅鋳型として供し
た。被包化プロセス後のエイメリアの各種の相対的感染
性を、インプットオーシストの数の増幅を検出する能力
に基づいて評価した。これは、実施例１で記載した種特
異性32Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチドハイブリッド
形成プローブを用いて行った。各処理群中のトリのいく
つかを、感染後４〜７日の糞中のオーシスト数をモニタ
ーするために保存した。定量は、クローンワクチン菌オ
ーシストから調製されたゲノムＤＮＡを用いて標準カー
ブに基づいて行った。 全核酸の調製
【００５４】ワクチン投を受けた３〜５日後に、トリを
殺した。腸及び盲腸を取り出し、長さに沿って切り、水
道水ですすいだ。腸及び盲腸の内壁を顕微鏡スライドを
用いてかき取った。かき取り物を５０ml遠心チューブに
移し、直に操作した。２倍プロティナーゼＫ消化バッフ
ァー（４００mMトリス−ＨＣl 、pH７．６、１００mMＭ
ＥＤＴＡ、１．０％ＳＤＳ）５〜１０mlをかき取り物に
加え、サスペンジョンをボルテックスミキサーにおいて
激しく混合した。サスペンジョンに５mg／mlプロティナ
ーゼ２００μｌを加え、サスペンジョンを５５℃で３時
間消化させた。このときに粘度が問題になった場合に
は、別の消化バッファー５ml及び別の５mg／mlプロティ
ナーゼＫ１００μｌを加え、消化を一晩中続行した。一
晩中消化した後、５mg／mlプロティナーゼＫ１００μｌ
を加え、消化を３〜２４時間続行した。消化物の６００
μｌを取り出し、１．５mlマイクロフュージチューブに
置き、消化バッファーで平衡にしたフェノール及びクロ
ロホルムの１：１混合物で２回抽出した。次に、サンプ
ルをクロロホルム及びイソアミルアルコールの２４：１
混合物で抽出した。最終水性相を−２０℃で保存した。
最終水性相のアリコートをエタノールで沈澱させた。ほ
とんどの場合、２００μｌの最終水性相を３Ｍ酢酸ナト
リウム（pH４．６）に加え、次に、５００μｌのエタノ
ールと一緒に合せた。サンプルを反転によって混合し、
ドライアイス浴に２０分間置いた。次に、ゲノムＤＮＡ
をエッペンドルフマイクロ遠心機において１５分間遠心
によって集めた。沈澱物を７０％エタノールで１回洗浄
し、スピード−Ｖac（Savant) において乾燥した。沈澱
物を、脱イオン水２００μｌ中に懸濁した。全核酸調製
物中のＤＮＡの量を、ＤＮＡに結合するとその性質を変
える前述の蛍光色素であるビスベンズイミドを使用して
評価した。ＴＥ中の０〜２０μｇ／１００μｌの範囲に
あるサケ精巣ＤＮＡ標準を保存溶液から作った。希釈物
を、希釈ごとに別の滅菌チップを用いて１２×７５mmボ
ロシリケートチューブ中で調製した。同様に、１：１０
希釈物を各２個の実験サンプルについて１００μｌの最
終体積に調製した。滅菌水１ml当り２００μｇの濃度の
ベンズイミド色素ストックを調製し、暗ビン中に４℃で
保存した。使用前に、色素ストックを、その組成が５０
mMリン酸ナトリウム、pH７．６、２Ｍ NaClであるバッ
ファーで１：２００に希釈した。この２mlを各ボロシリ
ケートチューブにエッペンドルフリピーターピペットで
加え、混合し、蛍光比色計において励起波長３５６nm及
び放出波長４５８nmで直接測定した。実験サンプル中の
ＤＮＡの量は、製造者の指示に従って、適当な標準で機
械を較正した後に測定された。
殺した。腸及び盲腸を取り出し、長さに沿って切り、水
道水ですすいだ。腸及び盲腸の内壁を顕微鏡スライドを
用いてかき取った。かき取り物を５０ml遠心チューブに
移し、直に操作した。２倍プロティナーゼＫ消化バッフ
ァー（４００mMトリス−ＨＣl 、pH７．６、１００mMＭ
ＥＤＴＡ、１．０％ＳＤＳ）５〜１０mlをかき取り物に
加え、サスペンジョンをボルテックスミキサーにおいて
激しく混合した。サスペンジョンに５mg／mlプロティナ
ーゼ２００μｌを加え、サスペンジョンを５５℃で３時
間消化させた。このときに粘度が問題になった場合に
は、別の消化バッファー５ml及び別の５mg／mlプロティ
ナーゼＫ１００μｌを加え、消化を一晩中続行した。一
晩中消化した後、５mg／mlプロティナーゼＫ１００μｌ
を加え、消化を３〜２４時間続行した。消化物の６００
μｌを取り出し、１．５mlマイクロフュージチューブに
置き、消化バッファーで平衡にしたフェノール及びクロ
ロホルムの１：１混合物で２回抽出した。次に、サンプ
ルをクロロホルム及びイソアミルアルコールの２４：１
混合物で抽出した。最終水性相を−２０℃で保存した。
最終水性相のアリコートをエタノールで沈澱させた。ほ
とんどの場合、２００μｌの最終水性相を３Ｍ酢酸ナト
リウム（pH４．６）に加え、次に、５００μｌのエタノ
ールと一緒に合せた。サンプルを反転によって混合し、
ドライアイス浴に２０分間置いた。次に、ゲノムＤＮＡ
をエッペンドルフマイクロ遠心機において１５分間遠心
によって集めた。沈澱物を７０％エタノールで１回洗浄
し、スピード−Ｖac（Savant) において乾燥した。沈澱
物を、脱イオン水２００μｌ中に懸濁した。全核酸調製
物中のＤＮＡの量を、ＤＮＡに結合するとその性質を変
える前述の蛍光色素であるビスベンズイミドを使用して
評価した。ＴＥ中の０〜２０μｇ／１００μｌの範囲に
あるサケ精巣ＤＮＡ標準を保存溶液から作った。希釈物
を、希釈ごとに別の滅菌チップを用いて１２×７５mmボ
ロシリケートチューブ中で調製した。同様に、１：１０
希釈物を各２個の実験サンプルについて１００μｌの最
終体積に調製した。滅菌水１ml当り２００μｇの濃度の
ベンズイミド色素ストックを調製し、暗ビン中に４℃で
保存した。使用前に、色素ストックを、その組成が５０
mMリン酸ナトリウム、pH７．６、２Ｍ NaClであるバッ
ファーで１：２００に希釈した。この２mlを各ボロシリ
ケートチューブにエッペンドルフリピーターピペットで
加え、混合し、蛍光比色計において励起波長３５６nm及
び放出波長４５８nmで直接測定した。実験サンプル中の
ＤＮＡの量は、製造者の指示に従って、適当な標準で機
械を較正した後に測定された。
【００５５】ニワトリ腸上皮及び粘膜のかき取り物から
調製されたゲノムＤＮＡからの原生動物 ssＲＮＡ配列
のＰＣＲ増幅 この技術の鋭い感度をもっているので汚染を避けるため
に極度の注意を要する。ＤＮＡ調製用の専用ピペット、
ピペットチップ、容器及びストック溶液、反応アセンブ
リ及びサンプル分析を使用した。上記のビスベンズイミ
ドアッセイに基づいて２００ngの実験ゲノムＤＮＡを出
発ターゲット物質として使用した。この物質を、ＴaqＤ
ＮＡポリメラーゼを阻害する残り溶媒を抽出物から除去
するためにまずエタノールで沈澱させた。各エイメリア
種からの既知数の精製生物体から調製されたゲノムＤＮ
Ａをニワトリ貯蔵ゲノムＤＮＡの２００ngを“スパイク
（spike)”するために用いた。これらを増幅標準及びハ
イブリッド形成標準として供した。トリス−ＨＣl で緩
衝した（pH７．６）デオキシヌクレオシドトリホスフェ
ートｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各
１．２５mM）の日常の使用溶液を−２０℃で凍結保存し
たストック１００mMから調製した。１００mMトリス−Ｈ
Ｃl 、pH８．３、５００mM ＫＣl 、１５mM MgCl2、
０．０１％ゼラチンからなる１０倍反応バッファーを調
製し、オートクレーブした。これを次に等分し、−２０
℃で保存した。反応混合物を専用ＰＣＲ反応チューブ中
に１００μｌの最終体積に集めた。反応混合物のカクテ
ルは、次の成分をこれらの最終濃度でこの特定の順序に
おいて混合することによって調製された：水、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（ｄＮＴＰ各２０
０μＭ）、１倍反応バッファー、及び各２μＭの２増幅
プライマー（ＥＲＩＢ１及びＥＲＩＢ２）（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ NO：１及びＳＥＱ ＩＤ NO：３）、次に混合し、
反応チューブ当り１．２５Ｕ TaqＤＮＡポリメラーゼを
加え、反転によって混合した。次に、カクテルの８０μ
ｌのアリコートを各反応チューブに分配した。前記のビ
スベンズイミドＤＮＡアッセイに基づて、実験ゲノムＤ
ＮＡを蒸留水で２０μｌの最終体積に調整し、反応混合
物に加えた。ＢＩＯＳサーマルサイクラーを次のように
プログラムした： ａ）９４℃で１分間変性、５０℃で３０秒間アニーリン
グ、７２℃で４５秒間重合からなる３サイクル； ｂ）９４℃で２０秒間変性、５０℃で３０秒間アニーリ
ング、７２℃で４５秒間重合からなる２７サイクル； ｃ）７２℃で１０分間１サイクル。
調製されたゲノムＤＮＡからの原生動物 ssＲＮＡ配列
のＰＣＲ増幅 この技術の鋭い感度をもっているので汚染を避けるため
に極度の注意を要する。ＤＮＡ調製用の専用ピペット、
ピペットチップ、容器及びストック溶液、反応アセンブ
リ及びサンプル分析を使用した。上記のビスベンズイミ
ドアッセイに基づいて２００ngの実験ゲノムＤＮＡを出
発ターゲット物質として使用した。この物質を、ＴaqＤ
ＮＡポリメラーゼを阻害する残り溶媒を抽出物から除去
するためにまずエタノールで沈澱させた。各エイメリア
種からの既知数の精製生物体から調製されたゲノムＤＮ
Ａをニワトリ貯蔵ゲノムＤＮＡの２００ngを“スパイク
（spike)”するために用いた。これらを増幅標準及びハ
イブリッド形成標準として供した。トリス−ＨＣl で緩
衝した（pH７．６）デオキシヌクレオシドトリホスフェ
ートｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各
１．２５mM）の日常の使用溶液を−２０℃で凍結保存し
たストック１００mMから調製した。１００mMトリス−Ｈ
Ｃl 、pH８．３、５００mM ＫＣl 、１５mM MgCl2、
０．０１％ゼラチンからなる１０倍反応バッファーを調
製し、オートクレーブした。これを次に等分し、−２０
℃で保存した。反応混合物を専用ＰＣＲ反応チューブ中
に１００μｌの最終体積に集めた。反応混合物のカクテ
ルは、次の成分をこれらの最終濃度でこの特定の順序に
おいて混合することによって調製された：水、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（ｄＮＴＰ各２０
０μＭ）、１倍反応バッファー、及び各２μＭの２増幅
プライマー（ＥＲＩＢ１及びＥＲＩＢ２）（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ NO：１及びＳＥＱ ＩＤ NO：３）、次に混合し、
反応チューブ当り１．２５Ｕ TaqＤＮＡポリメラーゼを
加え、反転によって混合した。次に、カクテルの８０μ
ｌのアリコートを各反応チューブに分配した。前記のビ
スベンズイミドＤＮＡアッセイに基づて、実験ゲノムＤ
ＮＡを蒸留水で２０μｌの最終体積に調整し、反応混合
物に加えた。ＢＩＯＳサーマルサイクラーを次のように
プログラムした： ａ）９４℃で１分間変性、５０℃で３０秒間アニーリン
グ、７２℃で４５秒間重合からなる３サイクル； ｂ）９４℃で２０秒間変性、５０℃で３０秒間アニーリ
ング、７２℃で４５秒間重合からなる２７サイクル； ｃ）７２℃で１０分間１サイクル。
【００５６】プライマーペア５ＡＥＲＩＢ／３ＡＥＲＩ
Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ NO：３１／ＳＥＱ ＩＤ NO：３
２）又は５ＢＥＲＩＢ／３ＢＥＲＩＢ（ＳＥＱ ＩＤ
NO：３３／ＳＥＱ ＩＤ NO：３４）を使用した場合、
反応混合物は、これらの最終濃度でこの特定の順序にお
いて混合することによって調製された：水、ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（ｄＮＴＰ各２００μ
Ｍ）、１倍反応バッファー、及び各１μＭの２増幅プラ
イマー（５ＡＥＲＩＢ〔ＳＥＱ ＩＤ NO：３１〕及び
３ＡＥＲＩＢ〔ＳＥＱ ＩＤ NO：３２〕又は５ＢＥＲ
ＩＢ〔ＳＥＱ ＩＤ NO：３３〕及び３ＢＥＲＩＢ〔Ｓ
ＥＱ ＩＤ NO：３４〕）、次に混合し、反応チューブ
当り１．２５ＵＴaqＤＮＡポリメラーゼを加え、反転に
よって混合した。次に、混合物の８μｌのアリコートを
各反応チューブに分配した。前記のビスベンズイミドＤ
ＮＡアッセイに基づいて、実験ゲノムＤＮＡ２００μｇ
を蒸留水で２０μｌの最終濃度に調整した。反応物の上
に約５０μｌの軽鉱油を置いた後、次のようにプログラ
ムされたパーキンエルマーシータスＤＮＡサーマルサイ
クラーに置いた： ａ）９４℃で１分間変性、４８℃で１分間アニーリング
及び７２℃で１分間重合からなる３サイクル； ｂ）９４℃で１分間変性、５０℃で１分３０秒間アニー
リング及び７２℃で２分間重合からなる３２サイクル； ｃ）７２℃で１０分間１サイクル。 次に、反応生成物の５μｌを、前記と同様な小規模ビス
ベンズ−イミドアッセイを用いてＤＮＡ含量についてア
ッセイした。この小規模アッセイには２つのマイクロ遠
心チューブ中の希釈物を使用した。このとき最終アッセ
イ体積は５００μｌであった。このサンプルはマイクロ
セルにおいて読まれ、標準カーブは５〜２００ng／mlで
直線であった。
Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ NO：３１／ＳＥＱ ＩＤ NO：３
２）又は５ＢＥＲＩＢ／３ＢＥＲＩＢ（ＳＥＱ ＩＤ
NO：３３／ＳＥＱ ＩＤ NO：３４）を使用した場合、
反応混合物は、これらの最終濃度でこの特定の順序にお
いて混合することによって調製された：水、ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（ｄＮＴＰ各２００μ
Ｍ）、１倍反応バッファー、及び各１μＭの２増幅プラ
イマー（５ＡＥＲＩＢ〔ＳＥＱ ＩＤ NO：３１〕及び
３ＡＥＲＩＢ〔ＳＥＱ ＩＤ NO：３２〕又は５ＢＥＲ
ＩＢ〔ＳＥＱ ＩＤ NO：３３〕及び３ＢＥＲＩＢ〔Ｓ
ＥＱ ＩＤ NO：３４〕）、次に混合し、反応チューブ
当り１．２５ＵＴaqＤＮＡポリメラーゼを加え、反転に
よって混合した。次に、混合物の８μｌのアリコートを
各反応チューブに分配した。前記のビスベンズイミドＤ
ＮＡアッセイに基づいて、実験ゲノムＤＮＡ２００μｇ
を蒸留水で２０μｌの最終濃度に調整した。反応物の上
に約５０μｌの軽鉱油を置いた後、次のようにプログラ
ムされたパーキンエルマーシータスＤＮＡサーマルサイ
クラーに置いた： ａ）９４℃で１分間変性、４８℃で１分間アニーリング
及び７２℃で１分間重合からなる３サイクル； ｂ）９４℃で１分間変性、５０℃で１分３０秒間アニー
リング及び７２℃で２分間重合からなる３２サイクル； ｃ）７２℃で１０分間１サイクル。 次に、反応生成物の５μｌを、前記と同様な小規模ビス
ベンズ−イミドアッセイを用いてＤＮＡ含量についてア
ッセイした。この小規模アッセイには２つのマイクロ遠
心チューブ中の希釈物を使用した。このとき最終アッセ
イ体積は５００μｌであった。このサンプルはマイクロ
セルにおいて読まれ、標準カーブは５〜２００ng／mlで
直線であった。
【００５７】スロット−ブロット又はドット−ブロット
マニホールドにおけるナイロンサポート上への核酸の固
定化 通常通り、上で定量されたＰＣＲ生成物１００μｇを水
で１００μｌに調整し、製造業者の説明（Schleicher及
びSchvell 社）に従ってスロット−ブロット又はドット
−ブロットマニホールドのニトラン（Nytran) シート
（予め水で湿らしてある）に施与した。各サンプルへ１
体積の１Ｍ NaOHを加えた。次に、このサンプルを室温
で５時間インキュベートしてＤＮＡを変性した後、１体
積の１Ｍトリス−ＨＣl(pH７．３）を加えることによっ
て中和した。真空を次に装置に適用してサンプルを濾過
した。次に各サンプルを５００μｌの４Ｍ酢酸アンモニ
ウム（pH６．８）ですすいだ。ニワトリエイメリアの各
種を表わす精製生物体から調製されかつ前記のとおりに
ＰＣＲにかけられたゲノムＤＮＡを用いて前述のように
ＰＣＲにかけたニワトリ肝臓ゲノムＤＮＡをスパイクし
た。スパイクしたＤＮＡを濾過にかけ、種特異性定量標
準として保存した。適当なバッファー対照及びブランク
スロット対照を通常通り含ませた。濾物を空気乾燥し、
真空下に８０℃て２時間ベーキングした（任意）。
マニホールドにおけるナイロンサポート上への核酸の固
定化 通常通り、上で定量されたＰＣＲ生成物１００μｇを水
で１００μｌに調整し、製造業者の説明（Schleicher及
びSchvell 社）に従ってスロット−ブロット又はドット
−ブロットマニホールドのニトラン（Nytran) シート
（予め水で湿らしてある）に施与した。各サンプルへ１
体積の１Ｍ NaOHを加えた。次に、このサンプルを室温
で５時間インキュベートしてＤＮＡを変性した後、１体
積の１Ｍトリス−ＨＣl(pH７．３）を加えることによっ
て中和した。真空を次に装置に適用してサンプルを濾過
した。次に各サンプルを５００μｌの４Ｍ酢酸アンモニ
ウム（pH６．８）ですすいだ。ニワトリエイメリアの各
種を表わす精製生物体から調製されかつ前記のとおりに
ＰＣＲにかけられたゲノムＤＮＡを用いて前述のように
ＰＣＲにかけたニワトリ肝臓ゲノムＤＮＡをスパイクし
た。スパイクしたＤＮＡを濾過にかけ、種特異性定量標
準として保存した。適当なバッファー対照及びブランク
スロット対照を通常通り含ませた。濾物を空気乾燥し、
真空下に８０℃て２時間ベーキングした（任意）。
【００５８】オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プロ
ーブ（実施例１からのもの）をガンマー32Ｐ−ＡＴＰで
末端ラベルした。このオリゴヌクレオチドを定量し、次
の式を用いて標準化した（１mg／ml＝２５Ａ260 ）。５
〜１０ピコモルのオリゴヌクレオチドを５０μｌ反応体
積を含む水、５μｌの１０倍キナーゼバッファー（０．
５トリス−ＨＣl 、pH７．６、０．１Ｍ MgCl2 、５０
mMＤＴＴ、１mMスペルミジン、１mMＥＤＴＡ）、２０Ｕ
のポリーヌクレオチドキナーゼ、及び少なくとも２倍モ
ル過剰のガンマー32Ｐ−ＡＴＰ（比活性＞５０００Ci／
mmol）に加えた。この混合物を３７℃で３０分間インキ
ュベートした後、４μｌの０．５ＭＥＤＴＡ、４６μｌ
のＴＥの添加によって止めた。反応混合物をバッファー
で平衡にしたフェノール及びクロロホルムの１：１混合
物で１回抽出し、水性相を、製造業者の説明に従ってス
トラタジーンプッシュカラム（Stratagene) を通してラ
ベルしたオリゴヌクレオチドから非組込みアイソトープ
を除去した。
ーブ（実施例１からのもの）をガンマー32Ｐ−ＡＴＰで
末端ラベルした。このオリゴヌクレオチドを定量し、次
の式を用いて標準化した（１mg／ml＝２５Ａ260 ）。５
〜１０ピコモルのオリゴヌクレオチドを５０μｌ反応体
積を含む水、５μｌの１０倍キナーゼバッファー（０．
５トリス−ＨＣl 、pH７．６、０．１Ｍ MgCl2 、５０
mMＤＴＴ、１mMスペルミジン、１mMＥＤＴＡ）、２０Ｕ
のポリーヌクレオチドキナーゼ、及び少なくとも２倍モ
ル過剰のガンマー32Ｐ−ＡＴＰ（比活性＞５０００Ci／
mmol）に加えた。この混合物を３７℃で３０分間インキ
ュベートした後、４μｌの０．５ＭＥＤＴＡ、４６μｌ
のＴＥの添加によって止めた。反応混合物をバッファー
で平衡にしたフェノール及びクロロホルムの１：１混合
物で１回抽出し、水性相を、製造業者の説明に従ってス
トラタジーンプッシュカラム（Stratagene) を通してラ
ベルしたオリゴヌクレオチドから非組込みアイソトープ
を除去した。
【００５９】プレハイブリッド形成、ハイブリッド形成
及び洗浄 プレハイブリッド形成をその組成が６倍ＳＳＰＥ、１％
ＳＤＳ、１０倍デンハート液（Denhardt's) 、１００μ
ｇ／ml、ｔＲＮＡであるバッファー中で行った。バッフ
ァーを作り、溶液としてＳＤＳを保つために使用準備が
整うまで４２℃に保持した。ニトランの乾燥シートを６
倍ＳＳＰＥで予じめ湿らし、３側面が加熱シールされて
いるポリエチレンフリーザーバック中に置いた。プレハ
イブリッド形成溶液（２０〜４０ml、バック中のニトラ
ンのシート数による）を加え、空気泡のバルクを除去し
た後に、バックの４つ目の端をシールし、ゴムバンドで
ガラスプレートに保持し、４２℃で少なくとも３時間又
は一晩中水浴中に浸漬した。プレハイブリッド形成後、
バックを切開し、バッファーを完全に除去した。ハイブ
リッド形成バッファーは６倍ＳＳＰＥ＋１％ＳＤＳであ
った。ハイブリッド形成は望ましいハイブリッドのＴh
で行われた。長さが２５ヌクレオチド未満のプローブに
ついては、ハイブリッド形成条件は次の式を用いて決定
された。 Ｔh ＝Ｔm −５℃＝２℃（Ａ−Ｔbp）＋４℃（Ｇ−Ｃbp）−５℃ 予じめＴh で加温したハイブリッド形成バッファーの１
０〜２０ml（約１〜５×１０6 dpm ／ml、１バック当り
のフィルターの数による）と混合する前に、末端ラベル
したオリゴヌクレオチドプローブを６８℃で５分間イン
キュベートした。これをバッグに注ぎ、空気泡を除去
し、バックをはずした。バックをガラスプレートに保持
し、水浴中にＴh で少なくとも１２時間〜一晩中ハイブ
リッド形成のために浸漬した。ハイブリッド形成後、バ
ックを切開し、バッファーを捨てた。バックの残りの３
側面を切り、フィルターを最初の洗液を含むパイレック
ス皿にピンセットで取り出した。洗浄は次のとおりであ
った： ａ）３７℃で振りながら６倍ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳにお
いて各々５〜１０分間３回； ｂ）ハイブリッドのＴh で１倍ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳに
おいて３分間１回； ｃ）ＳＤＳを除去するために、室温で振りながら６倍Ｓ
ＳＰＥにおいて各々約５分間３〜４回。洗浄体積は少な
くとも１００mlであった（フィルターの数と共に増加す
る）。使用の前に、すべての洗液をそれぞれの温度に予
め加温した。フィルターを空気乾燥し、カセット（２つ
の増強スクリーンを含む）に置き、−７０℃でＸ線フィ
ルムにさらした。１〜３日後にフィルムを現像した。モ
レキュラーダイナミクスホスホルイメイジャー（Molecu
lar Dynamics Phosphorlmager)（モレキュラーダイナミ
クス（Molecular Dynamics））を用いて、ハイブリッド
形成シグナルの定量を行った。乾燥ブロットを、製造業
者の指示に従ってホスホルイメイジャーカセット中のプ
ラスチックラップの下に置き、共通のハイブリッド形成
プローブについては約２時間そして特異性エイメリアプ
ローブについては３〜１２時間蛍光体にさらした。次
に、スクリーンを、スクリーン中の蛍光体によって捕ら
えられエネルギーを放出するレーザーで走査した。放出
されたエネルギーを機械によって定量した。
及び洗浄 プレハイブリッド形成をその組成が６倍ＳＳＰＥ、１％
ＳＤＳ、１０倍デンハート液（Denhardt's) 、１００μ
ｇ／ml、ｔＲＮＡであるバッファー中で行った。バッフ
ァーを作り、溶液としてＳＤＳを保つために使用準備が
整うまで４２℃に保持した。ニトランの乾燥シートを６
倍ＳＳＰＥで予じめ湿らし、３側面が加熱シールされて
いるポリエチレンフリーザーバック中に置いた。プレハ
イブリッド形成溶液（２０〜４０ml、バック中のニトラ
ンのシート数による）を加え、空気泡のバルクを除去し
た後に、バックの４つ目の端をシールし、ゴムバンドで
ガラスプレートに保持し、４２℃で少なくとも３時間又
は一晩中水浴中に浸漬した。プレハイブリッド形成後、
バックを切開し、バッファーを完全に除去した。ハイブ
リッド形成バッファーは６倍ＳＳＰＥ＋１％ＳＤＳであ
った。ハイブリッド形成は望ましいハイブリッドのＴh
で行われた。長さが２５ヌクレオチド未満のプローブに
ついては、ハイブリッド形成条件は次の式を用いて決定
された。 Ｔh ＝Ｔm −５℃＝２℃（Ａ−Ｔbp）＋４℃（Ｇ−Ｃbp）−５℃ 予じめＴh で加温したハイブリッド形成バッファーの１
０〜２０ml（約１〜５×１０6 dpm ／ml、１バック当り
のフィルターの数による）と混合する前に、末端ラベル
したオリゴヌクレオチドプローブを６８℃で５分間イン
キュベートした。これをバッグに注ぎ、空気泡を除去
し、バックをはずした。バックをガラスプレートに保持
し、水浴中にＴh で少なくとも１２時間〜一晩中ハイブ
リッド形成のために浸漬した。ハイブリッド形成後、バ
ックを切開し、バッファーを捨てた。バックの残りの３
側面を切り、フィルターを最初の洗液を含むパイレック
ス皿にピンセットで取り出した。洗浄は次のとおりであ
った： ａ）３７℃で振りながら６倍ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳにお
いて各々５〜１０分間３回； ｂ）ハイブリッドのＴh で１倍ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳに
おいて３分間１回； ｃ）ＳＤＳを除去するために、室温で振りながら６倍Ｓ
ＳＰＥにおいて各々約５分間３〜４回。洗浄体積は少な
くとも１００mlであった（フィルターの数と共に増加す
る）。使用の前に、すべての洗液をそれぞれの温度に予
め加温した。フィルターを空気乾燥し、カセット（２つ
の増強スクリーンを含む）に置き、−７０℃でＸ線フィ
ルムにさらした。１〜３日後にフィルムを現像した。モ
レキュラーダイナミクスホスホルイメイジャー（Molecu
lar Dynamics Phosphorlmager)（モレキュラーダイナミ
クス（Molecular Dynamics））を用いて、ハイブリッド
形成シグナルの定量を行った。乾燥ブロットを、製造業
者の指示に従ってホスホルイメイジャーカセット中のプ
ラスチックラップの下に置き、共通のハイブリッド形成
プローブについては約２時間そして特異性エイメリアプ
ローブについては３〜１２時間蛍光体にさらした。次
に、スクリーンを、スクリーン中の蛍光体によって捕ら
えられエネルギーを放出するレーザーで走査した。放出
されたエネルギーを機械によって定量した。
【００６０】実施例３ 特異的アイメリア種小サブユニットリボソームＲＮＡプ
ローブの使用及びアッセイ ７種のニワトリアイメリアの各々の複数株からの精製オ
ーシストを実施例１で記載したように調製した。オーシ
スト殻を破壊した後スポロシストを精製した。スポロシ
ストの各集団からゲノムＤＮＡを調製し、ビスベンズイ
ミドアッセイを用いて定量した。ゲノムＤＮＡの各調製
物４μｇを変性し、８つの０．５μｇ等価アリコートと
してナイトラン膜に固定化した。ナイトランを取扱うと
きはいつも手袋をはめ、鉗子を用いた。一般にゲノムＤ
ＮＡ約０．５μｇを約１００μｌ（４μｇ／８００μ
ｌ）に調整し、０．１容量の３Ｍ NaOHに加えた。これ
を約７０℃で約３０〜６０分間インキュベートしてＤＮ
Ａを変性し、室温に冷却し、約１容量の２Ｍ酢酸アンモ
ニウム（pH７．０）を加えて中和し、製造業者（Schlei
cher and Schuell社) により記載されるようにスロット
・ブロット又はドッド・ブロットマニホルドのナイトラ
ンシートに加えた。装置を真空にして試料を濾過した。
適切な緩衝液対照とブランクスロット対照を慣例的に含
めた。フィルターを風乾し、真空下約８０℃で約２時間
ベークした。ニワトリゲノムＤＮＡ（Clontech Laborat
ories 社) を同様に変性し、固定化した。８個のフィル
ターを個別のバッグ中で前ハイブリッド形成させ、次い
で各々の種特異的プローブ（Ｘ７）と全真核 ssrＲＮＡ
遺伝子配列に共通なプローブとハイブリッド形成させ
た。使用した共通プローブは下記配列：ＡＧＣＣＡＴＴ
ＣＧＣＡＧＴＴＴＣＡＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ NO: ２
２）を有する共通ＲＣ′であった。共通プローブは高度
保存配列セグメントから得られた。これは単に ssrＲＮ
Ａ遺伝子内の保存配列に対して作成することができる多
くのプローブの１つの例である。特定のＰＣＲプライマ
ー対によってカバーされる配列のみが標的に対するプロ
ーブとして有用であることは理解される。これらのプロ
ーブは離れた系統分類群（即ちアイメリアとトリ（Gall
us) ）間のシグナルを標準化するために使用された。図
８はＥ．テネラ特異的プローブ（ＷＥｔ１ＲＣ）（ＳＥ
Ｑ ＩＤ NO: ２０）を用いて生じた結果を示す。Ｅ．
テネラゲノムＤＮＡを含有するグリッド中のスロットの
みがＷＥｔ１ＲＣと正のハイブリッド形成シグナル又は
応答を生じた。これらのスロット中のＤＮＡはフィール
ド単離体、実験株、早熟単離体（ワクチン株）及びワク
チン株のクローナル誘導体に由来するものである。４種
の各々はほぼ等価なハイブリッド形成シグナルを生じ
た。これはハイブリッド形成プローブが種特異的である
がワクチン株に特異的でないことを示す。
ローブの使用及びアッセイ ７種のニワトリアイメリアの各々の複数株からの精製オ
ーシストを実施例１で記載したように調製した。オーシ
スト殻を破壊した後スポロシストを精製した。スポロシ
ストの各集団からゲノムＤＮＡを調製し、ビスベンズイ
ミドアッセイを用いて定量した。ゲノムＤＮＡの各調製
物４μｇを変性し、８つの０．５μｇ等価アリコートと
してナイトラン膜に固定化した。ナイトランを取扱うと
きはいつも手袋をはめ、鉗子を用いた。一般にゲノムＤ
ＮＡ約０．５μｇを約１００μｌ（４μｇ／８００μ
ｌ）に調整し、０．１容量の３Ｍ NaOHに加えた。これ
を約７０℃で約３０〜６０分間インキュベートしてＤＮ
Ａを変性し、室温に冷却し、約１容量の２Ｍ酢酸アンモ
ニウム（pH７．０）を加えて中和し、製造業者（Schlei
cher and Schuell社) により記載されるようにスロット
・ブロット又はドッド・ブロットマニホルドのナイトラ
ンシートに加えた。装置を真空にして試料を濾過した。
適切な緩衝液対照とブランクスロット対照を慣例的に含
めた。フィルターを風乾し、真空下約８０℃で約２時間
ベークした。ニワトリゲノムＤＮＡ（Clontech Laborat
ories 社) を同様に変性し、固定化した。８個のフィル
ターを個別のバッグ中で前ハイブリッド形成させ、次い
で各々の種特異的プローブ（Ｘ７）と全真核 ssrＲＮＡ
遺伝子配列に共通なプローブとハイブリッド形成させ
た。使用した共通プローブは下記配列：ＡＧＣＣＡＴＴ
ＣＧＣＡＧＴＴＴＣＡＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ NO: ２
２）を有する共通ＲＣ′であった。共通プローブは高度
保存配列セグメントから得られた。これは単に ssrＲＮ
Ａ遺伝子内の保存配列に対して作成することができる多
くのプローブの１つの例である。特定のＰＣＲプライマ
ー対によってカバーされる配列のみが標的に対するプロ
ーブとして有用であることは理解される。これらのプロ
ーブは離れた系統分類群（即ちアイメリアとトリ（Gall
us) ）間のシグナルを標準化するために使用された。図
８はＥ．テネラ特異的プローブ（ＷＥｔ１ＲＣ）（ＳＥ
Ｑ ＩＤ NO: ２０）を用いて生じた結果を示す。Ｅ．
テネラゲノムＤＮＡを含有するグリッド中のスロットの
みがＷＥｔ１ＲＣと正のハイブリッド形成シグナル又は
応答を生じた。これらのスロット中のＤＮＡはフィール
ド単離体、実験株、早熟単離体（ワクチン株）及びワク
チン株のクローナル誘導体に由来するものである。４種
の各々はほぼ等価なハイブリッド形成シグナルを生じ
た。これはハイブリッド形成プローブが種特異的である
がワクチン株に特異的でないことを示す。
【００６１】残りのアイメリアプローブに対して種特異
的ハイブリッド形成特性を検出するために計画された同
様のタイプの実験を行ないこれらの中の３つの結果を図
９に示す。Ｅ．プラエコクス（ＷＥｐ１ＲＣ）（ＳＥＱ
ＩＤ NO: １８）、Ｅ．マキシム（ＷＥmx１ＲＣ）
（ＳＥＱ ＩＤ NO: １１）及びＥ．ネカトリクス（Ｗ
Ｅｎ１Ｍ）（ＳＥＱ ＩＤ NO: ３８）由来プローブ
（実施例２で得た）は実際に種特異的である。アイメリ
アプローブの各々によるケースのように非早熟実験単離
物及びワクチン株の両方に対するハイブリッド形成はほ
ぼ等価である。真核に共通な ssrＲＮＡ遺伝子ヌクレオ
チド配列（共通ＲＣ、ＳＥＱ ＩＤNO: ２２）由来のプ
ローブを含む８番目のフィルターのハイブリッド形成は
等価量の“ハイブリッド形成可能な”ゲノムＤＮＡが各
々の標識グリッドに固定化されることを示した。
的ハイブリッド形成特性を検出するために計画された同
様のタイプの実験を行ないこれらの中の３つの結果を図
９に示す。Ｅ．プラエコクス（ＷＥｐ１ＲＣ）（ＳＥＱ
ＩＤ NO: １８）、Ｅ．マキシム（ＷＥmx１ＲＣ）
（ＳＥＱ ＩＤ NO: １１）及びＥ．ネカトリクス（Ｗ
Ｅｎ１Ｍ）（ＳＥＱ ＩＤ NO: ３８）由来プローブ
（実施例２で得た）は実際に種特異的である。アイメリ
アプローブの各々によるケースのように非早熟実験単離
物及びワクチン株の両方に対するハイブリッド形成はほ
ぼ等価である。真核に共通な ssrＲＮＡ遺伝子ヌクレオ
チド配列（共通ＲＣ、ＳＥＱ ＩＤNO: ２２）由来のプ
ローブを含む８番目のフィルターのハイブリッド形成は
等価量の“ハイブリッド形成可能な”ゲノムＤＮＡが各
々の標識グリッドに固定化されることを示した。
【００６２】２羽からなるニワトリの群にニワトリアイ
メリアの単一種の２，５００個の精製オーシストを胃管
により投与した。別にもう一組にはオーシストを与えな
かった。５日後鶏を殺し、腸上皮と粘膜を削り、この組
織からゲノムＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡを定量
し、ＰＣＲ増幅プライマーＥＲＩＢ１（ＳＥＱ ＩＤN
O: １）及びＥＲＩＢ２（ＳＥＱ ＩＤ NO: ３）と共
にポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）における反応基質とし
て用いるために２００ngをとりわけた。次いで反応生成
物の１０％を変性し８個の同一スロットブロットグリッ
ドに固定化した。図１０はこれらのパネルの１つのＥ．
ブルネッティ特異的プローブ（ＡＥｂ１ＲＣ）（ＳＥＱ
ＩＤ NO: ８）とのハイブリッド形成の結果を示す。
Ｅ．ブルネッティオーシストを投与したニワトリのみが
このプローブで正のハイブリッド形成シグナルを示し
た。他のハイブリッド形成プローブによるこれらの及び
同様の結果は各々のハイブリッド形成プローブの種特異
的種類を再確認するばかりでなく、また２５００個のオ
ーシストから生じる感染の検出に高い感受性を示したこ
とは更に重要なことである。
メリアの単一種の２，５００個の精製オーシストを胃管
により投与した。別にもう一組にはオーシストを与えな
かった。５日後鶏を殺し、腸上皮と粘膜を削り、この組
織からゲノムＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡを定量
し、ＰＣＲ増幅プライマーＥＲＩＢ１（ＳＥＱ ＩＤN
O: １）及びＥＲＩＢ２（ＳＥＱ ＩＤ NO: ３）と共
にポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）における反応基質とし
て用いるために２００ngをとりわけた。次いで反応生成
物の１０％を変性し８個の同一スロットブロットグリッ
ドに固定化した。図１０はこれらのパネルの１つのＥ．
ブルネッティ特異的プローブ（ＡＥｂ１ＲＣ）（ＳＥＱ
ＩＤ NO: ８）とのハイブリッド形成の結果を示す。
Ｅ．ブルネッティオーシストを投与したニワトリのみが
このプローブで正のハイブリッド形成シグナルを示し
た。他のハイブリッド形成プローブによるこれらの及び
同様の結果は各々のハイブリッド形成プローブの種特異
的種類を再確認するばかりでなく、また２５００個のオ
ーシストから生じる感染の検出に高い感受性を示したこ
とは更に重要なことである。
【００６３】しかしながらワクチン投与量は２５００個
のオーシストよりかなりわずかであり、鶏アイメリアの
全７種から構成されている。次の実験では全７種から同
数のオーシストを一緒に混合し、鶏に胃管により投与し
てこの七種混合物を力価測定した。投与量力価測定範囲
は７種あたり１００個のオーシストから２５００個のオ
ーシストとした。感染５日後に腸上皮および粘膜を削
り、ゲノムＤＮＡを抽出し、定量した（実施例２に記
載）。ＥＲＩＢ１（ＳＥＱ ＩＤ NO: １）及びＥＲＩ
Ｂ２（ＳＥＱ ＩＤ NO: ３）増幅プライマーを用いる
ＰＣＲにおける反応基質として各試料２００ngを用い
た。反応は３連で行ない、これらの個々の反応からの生
成物を図１１の右欄外に示すようにスロットブロットマ
ニホルドの連いた列に固定化した。更に各反応生成物１
０μｌ（１０％）、１μｌ（１％）及び０．１μｌ
（０．１％）を各々カラムＡ．Ｂ及びＣにのせた。７個
の同一フィルターを調製し、各々を種特異的プローブの
１つとハイブリッド形成させた。Ｅ．ブルネッティ特異
的プローブ（ＡＥｂ１ＲＣ）（ＳＥＱ ＩＤ NO: ８）
を用いる結果を図１１に示す。明瞭なハイブリッド形成
シグナルを各種の１００個のオーシストを投与した鶏４
２６に検出したことは重要である。この結果はＰＣＲ／
ハイブリッド形成アッセイが１Ｘワクチンを投与した
（Ｅ．ブルネッティの１００個卵母細胞）鶏の腸におけ
る感染を検出するのに十分な感受性であることを示す。
残りの６種に特異的なプローブを用いて同様の結果を得
た。
のオーシストよりかなりわずかであり、鶏アイメリアの
全７種から構成されている。次の実験では全７種から同
数のオーシストを一緒に混合し、鶏に胃管により投与し
てこの七種混合物を力価測定した。投与量力価測定範囲
は７種あたり１００個のオーシストから２５００個のオ
ーシストとした。感染５日後に腸上皮および粘膜を削
り、ゲノムＤＮＡを抽出し、定量した（実施例２に記
載）。ＥＲＩＢ１（ＳＥＱ ＩＤ NO: １）及びＥＲＩ
Ｂ２（ＳＥＱ ＩＤ NO: ３）増幅プライマーを用いる
ＰＣＲにおける反応基質として各試料２００ngを用い
た。反応は３連で行ない、これらの個々の反応からの生
成物を図１１の右欄外に示すようにスロットブロットマ
ニホルドの連いた列に固定化した。更に各反応生成物１
０μｌ（１０％）、１μｌ（１％）及び０．１μｌ
（０．１％）を各々カラムＡ．Ｂ及びＣにのせた。７個
の同一フィルターを調製し、各々を種特異的プローブの
１つとハイブリッド形成させた。Ｅ．ブルネッティ特異
的プローブ（ＡＥｂ１ＲＣ）（ＳＥＱ ＩＤ NO: ８）
を用いる結果を図１１に示す。明瞭なハイブリッド形成
シグナルを各種の１００個のオーシストを投与した鶏４
２６に検出したことは重要である。この結果はＰＣＲ／
ハイブリッド形成アッセイが１Ｘワクチンを投与した
（Ｅ．ブルネッティの１００個卵母細胞）鶏の腸におけ
る感染を検出するのに十分な感受性であることを示す。
残りの６種に特異的なプローブを用いて同様の結果を得
た。
【００６４】図１１もまた３連のポリメラーゼ鎖反応が
等価量の同じ反応基質で開始したにもかかわらず等価量
の反応生成物を生じないことを説明するのに役立つ。こ
の観察から我々はアッセイプロトコールに２つの標準化
工程を組込むことにした。まずＰＣＲから得た生成物の
５％のみを用いて小規模ビスベンズイミドアッセイで定
量する。この結果を用いて生成物８００ngを変性させ、
各々１００ngで８つに分けナイトラン紙に固定化した。
８番目のフィルターは共通プローブ（共通ＲＣ）（ＳＥ
Ｑ ＩＤ NO: ２２）とハイブリッド形成させて等価量
の変性固定化ハイブリッド形成ターゲットがフィルター
上の各実験用スロットに存在することを確認するように
した。
等価量の同じ反応基質で開始したにもかかわらず等価量
の反応生成物を生じないことを説明するのに役立つ。こ
の観察から我々はアッセイプロトコールに２つの標準化
工程を組込むことにした。まずＰＣＲから得た生成物の
５％のみを用いて小規模ビスベンズイミドアッセイで定
量する。この結果を用いて生成物８００ngを変性させ、
各々１００ngで８つに分けナイトラン紙に固定化した。
８番目のフィルターは共通プローブ（共通ＲＣ）（ＳＥ
Ｑ ＩＤ NO: ２２）とハイブリッド形成させて等価量
の変性固定化ハイブリッド形成ターゲットがフィルター
上の各実験用スロットに存在することを確認するように
した。
【００６５】実施例４ 種特異的オリゴヌクレオチドを用いるアイメリアリボゾ
ームＲＮＡを検出するためのアッセイ法 アイメリアＲＮＡをニワトリ腸からの単離するのはＲＮ
Ａの分解を避けるように注意して行なった。プロトコー
ルは Chirgwin 等、Biochemistry第１８巻、５２９４〜
５２９９頁（１９７９年）で発表されたのと実質的に同
様である。ニワトリにＥ．アセルブリナ、Ｅ．ブルネッ
ティ、Ｅ．マキシマ、Ｅ．ミチス、Ｅ．ネカトリクス、
Ｅ．プラエコクス及びＥ．テネラの実験室株のオーシス
トを経口感染させた。５日後、鶏を殺し、それらの腸及
び盲腸を取り出し、それらの長さに切断し、流水道水で
十分に洗浄した。腸及び盲腸の内壁を顕微鏡の滅菌スラ
イドで削った。各鶏から粘膜片を取り、５０ml遠心管に
移した。これらの小片を直ちに約４Ｍチオシアン酸グア
ニジン、pH７．０、０．５％ナトリウムＮ−ラウロイル
サルコシン、２５mMクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ２−
メルカプトエタノール及び０．１％シグマ３０％アンチ
フォームＡ２４mlに入れた。試料をポリトロン（ブリン
クマン）により全速、２０秒間で３回急速にホモジナイ
ズし、試料中のポリトロンを滅菌水で２回洗浄した。次
いで試料を懸垂型バケットローター（ＪＳ−１３、ベッ
クマン）中約１０℃において約８０００ＲＰＭ、１０分
間遠心分離した。上清を傾瀉し、１Ｍ酢酸０．６ml及び
１００％エタノール１８mlで−２０℃において一夜沈降
させた。翌日試料を１０℃において８０００ＲＰＭ、１
０分間再び遠心分離した。沈降物を７．５Ｍ塩酸グアニ
ジン、pH７．０、２５mMクエン酸ナトリウム及び５mMジ
チオスレイトール１２mlに再浮遊させ、激しく振盪し、
溶解するまで６８℃に加熱した。試料を１Ｍ酢酸０．３
ml及び１００％エタノール６mlで−２０℃において一夜
沈澱させた。更に前述の容量の１／２即ち各々６ml、
０．１５ml及び３mlを用いた以外は前のように試料を遠
心分離し再浮遊させ、−２０℃で一夜沈降させた。試料
をもう一度沈降させ、室温の９５％エタノール約１０ml
で摩砕し、乾熱コレックス遠心管に移し、約１０℃にお
いて１０，０００ＲＰＭ、３０分間再沈降させた。ＲＮ
Ａ沈降物をスピード−バック（Savant Instruments) で
真空乾燥し、６８℃でジエチルピロカーボネート処理滅
菌蒸留水２mlに溶解し、再沈降させ、ジエチルピロカー
ボネート処理滅菌蒸留水約１mlで再抽出させ、再度沈降
させた。抽出液を２Ｍ酢酸ナトリウム、pH５．０、３０
０μｌ及び１００％エタノール８mlで−２０℃において
一夜再沈降させた。最終ＲＮＡを沈降させ、ジエチルピ
ロカーボネート処理滅菌水１mlに再浮遊させた。２６０
nm及び２８０nmの吸光度（ベックマン分光光度計）を読
取ってＲＮＡ濃度を決定し、次いでＲＡＮ約３μｇを
１．２％アガロースゲルによる電気泳動にかけてＲＮＡ
の質、サイズ及び相対濃度をチエックした。ＲＮＡ試料
を−７０℃で貯蔵した。ＲＮＡ１mgをＲＱ１ＤＮase(Pr
omega)を用いて３７℃で４０分間製造業者の説明書によ
りＤＮase-１消化し、次いで１／１０容量の３Ｍ NaOA
c 及び２．５容量の１００％エタノールで沈降させた。
ＲＮＡ２０μｇを含有する２回の試料を１Ｘ変性溶液
（４倍変性溶液はホルムアルデヒド１ml、１Ｍリン酸ナ
トリウム、pH６．５、５６μｌ及び滅菌蒸留水３４４μ
ｌを含有する。）１００μｌ中で６８℃で２０分間変性
した。次いで変性試料を氷上に置き、冷却した。変性Ｒ
ＮＡ試料をバイオ−ラドドッド−ブロット装置、ナイト
ランフィルター（Ｓ＆Ｓ）及び１０ＸＳＳＰＥを用いて
２連でスポットした。フィルターを８０℃オーブン中で
１時間乾燥した。フィルターを実施例２のように32Ｐ標
識オリゴでプローブした。オリゴヌクレオチドプローブ
及び前述の各オリゴヌクレオチドごとに特定されるＴh
を用い、ＲＮＡハイブリッド形成に関する製造業者の説
明書（Schleicher & Schull)に従いフィルターを前ハイ
ブリッド形成及びハイブリッド形成させた。結果を図１
３及び１４に示す。
ームＲＮＡを検出するためのアッセイ法 アイメリアＲＮＡをニワトリ腸からの単離するのはＲＮ
Ａの分解を避けるように注意して行なった。プロトコー
ルは Chirgwin 等、Biochemistry第１８巻、５２９４〜
５２９９頁（１９７９年）で発表されたのと実質的に同
様である。ニワトリにＥ．アセルブリナ、Ｅ．ブルネッ
ティ、Ｅ．マキシマ、Ｅ．ミチス、Ｅ．ネカトリクス、
Ｅ．プラエコクス及びＥ．テネラの実験室株のオーシス
トを経口感染させた。５日後、鶏を殺し、それらの腸及
び盲腸を取り出し、それらの長さに切断し、流水道水で
十分に洗浄した。腸及び盲腸の内壁を顕微鏡の滅菌スラ
イドで削った。各鶏から粘膜片を取り、５０ml遠心管に
移した。これらの小片を直ちに約４Ｍチオシアン酸グア
ニジン、pH７．０、０．５％ナトリウムＮ−ラウロイル
サルコシン、２５mMクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ２−
メルカプトエタノール及び０．１％シグマ３０％アンチ
フォームＡ２４mlに入れた。試料をポリトロン（ブリン
クマン）により全速、２０秒間で３回急速にホモジナイ
ズし、試料中のポリトロンを滅菌水で２回洗浄した。次
いで試料を懸垂型バケットローター（ＪＳ−１３、ベッ
クマン）中約１０℃において約８０００ＲＰＭ、１０分
間遠心分離した。上清を傾瀉し、１Ｍ酢酸０．６ml及び
１００％エタノール１８mlで−２０℃において一夜沈降
させた。翌日試料を１０℃において８０００ＲＰＭ、１
０分間再び遠心分離した。沈降物を７．５Ｍ塩酸グアニ
ジン、pH７．０、２５mMクエン酸ナトリウム及び５mMジ
チオスレイトール１２mlに再浮遊させ、激しく振盪し、
溶解するまで６８℃に加熱した。試料を１Ｍ酢酸０．３
ml及び１００％エタノール６mlで−２０℃において一夜
沈澱させた。更に前述の容量の１／２即ち各々６ml、
０．１５ml及び３mlを用いた以外は前のように試料を遠
心分離し再浮遊させ、−２０℃で一夜沈降させた。試料
をもう一度沈降させ、室温の９５％エタノール約１０ml
で摩砕し、乾熱コレックス遠心管に移し、約１０℃にお
いて１０，０００ＲＰＭ、３０分間再沈降させた。ＲＮ
Ａ沈降物をスピード−バック（Savant Instruments) で
真空乾燥し、６８℃でジエチルピロカーボネート処理滅
菌蒸留水２mlに溶解し、再沈降させ、ジエチルピロカー
ボネート処理滅菌蒸留水約１mlで再抽出させ、再度沈降
させた。抽出液を２Ｍ酢酸ナトリウム、pH５．０、３０
０μｌ及び１００％エタノール８mlで−２０℃において
一夜再沈降させた。最終ＲＮＡを沈降させ、ジエチルピ
ロカーボネート処理滅菌水１mlに再浮遊させた。２６０
nm及び２８０nmの吸光度（ベックマン分光光度計）を読
取ってＲＮＡ濃度を決定し、次いでＲＡＮ約３μｇを
１．２％アガロースゲルによる電気泳動にかけてＲＮＡ
の質、サイズ及び相対濃度をチエックした。ＲＮＡ試料
を−７０℃で貯蔵した。ＲＮＡ１mgをＲＱ１ＤＮase(Pr
omega)を用いて３７℃で４０分間製造業者の説明書によ
りＤＮase-１消化し、次いで１／１０容量の３Ｍ NaOA
c 及び２．５容量の１００％エタノールで沈降させた。
ＲＮＡ２０μｇを含有する２回の試料を１Ｘ変性溶液
（４倍変性溶液はホルムアルデヒド１ml、１Ｍリン酸ナ
トリウム、pH６．５、５６μｌ及び滅菌蒸留水３４４μ
ｌを含有する。）１００μｌ中で６８℃で２０分間変性
した。次いで変性試料を氷上に置き、冷却した。変性Ｒ
ＮＡ試料をバイオ−ラドドッド−ブロット装置、ナイト
ランフィルター（Ｓ＆Ｓ）及び１０ＸＳＳＰＥを用いて
２連でスポットした。フィルターを８０℃オーブン中で
１時間乾燥した。フィルターを実施例２のように32Ｐ標
識オリゴでプローブした。オリゴヌクレオチドプローブ
及び前述の各オリゴヌクレオチドごとに特定されるＴh
を用い、ＲＮＡハイブリッド形成に関する製造業者の説
明書（Schleicher & Schull)に従いフィルターを前ハイ
ブリッド形成及びハイブリッド形成させた。結果を図１
３及び１４に示す。
【００６６】図１３はＤＮase １消化全細胞ＲＮＡ約３
０μｇをスポットした５個のナイトランフィルター（Sc
hleicher & Schull)を寄せたものである。ＲＮＡはオー
シストの七種混合物を投与した２連の鶏から得た。フィ
ルターを前述のように処理した。‘Ｃ’としるした行は
非感染の鶏対照とした。‘１Ｘ’及び‘１０Ｘ’としる
した行は使用したワクチン用量を示しているが隣接した
列は２連の試料を示す。‘ＥＲＩＢ２’と示したパネル
は、同じように負荷されたことを確認する対照パネルと
した。これは ssrＲＮＡ遺伝子の高度保存領域由来であ
り、感染及び非感染対照の双方に対してハイブリッド形
成する配列のＥrib ２オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ３）でプローブした。‘Ｅｂ’と標識したパネ
ルはオリゴヌクレオチドＡＥｂ１ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ
NO: ８）でプローブし、１０Ｘ用量でわずかなＥ．ブル
ネッティシグナルが見られた。‘ＥｍＸ’を標識したパ
ネルをＷＥmx１ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ NO: １１）でプロ
ーブした。わずかなＥ．マキシムシグナルが１Ｘで見ら
れ１０Ｘ投与量でははっきりと見られた。‘Ｅｐ”と標
識したパネルはＷＥｐ１ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ NO: １
８）でプローブしＥ．プラエコクスの存在が１Ｘ及び１
０Ｘ用量において示された。‘Ｅｔ’と標識したパネル
はＷＥｔ１ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ NO: ２０）でプローブ
し、わずかなＥ．テネラシグナルが１Ｘ投与量で見られ
１０Ｘ投与量でははっきりと見られた。
０μｇをスポットした５個のナイトランフィルター（Sc
hleicher & Schull)を寄せたものである。ＲＮＡはオー
シストの七種混合物を投与した２連の鶏から得た。フィ
ルターを前述のように処理した。‘Ｃ’としるした行は
非感染の鶏対照とした。‘１Ｘ’及び‘１０Ｘ’としる
した行は使用したワクチン用量を示しているが隣接した
列は２連の試料を示す。‘ＥＲＩＢ２’と示したパネル
は、同じように負荷されたことを確認する対照パネルと
した。これは ssrＲＮＡ遺伝子の高度保存領域由来であ
り、感染及び非感染対照の双方に対してハイブリッド形
成する配列のＥrib ２オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ３）でプローブした。‘Ｅｂ’と標識したパネ
ルはオリゴヌクレオチドＡＥｂ１ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ
NO: ８）でプローブし、１０Ｘ用量でわずかなＥ．ブル
ネッティシグナルが見られた。‘ＥｍＸ’を標識したパ
ネルをＷＥmx１ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ NO: １１）でプロ
ーブした。わずかなＥ．マキシムシグナルが１Ｘで見ら
れ１０Ｘ投与量でははっきりと見られた。‘Ｅｐ”と標
識したパネルはＷＥｐ１ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ NO: １
８）でプローブしＥ．プラエコクスの存在が１Ｘ及び１
０Ｘ用量において示された。‘Ｅｔ’と標識したパネル
はＷＥｔ１ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ NO: ２０）でプローブ
し、わずかなＥ．テネラシグナルが１Ｘ投与量で見られ
１０Ｘ投与量でははっきりと見られた。
【００６７】図１４は１０Ｘ投与量のみを用い、異るオ
リゴヌクレオチドをハイブリッド形成するプローブとし
て用いた以外は図１３と同様である。‘ＥＲ１Ｂ２’と
標識したパネルはオリゴヌクレオチドＥrib ２（ＳＥＱ
ＩＤ NO: ３）でプローブし、このプローブは同等の
強度で感染及び非感染両対照に対してハイブリッド形成
した。‘Ｅｂ’と標識したパネルはオリゴヌクレオチド
ＰＥｂ４ｅ−ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ NO: ３６）でプロー
ブし、Ｅ．ブルネッティシグナルがはっきりと見られ
た。‘Ｅmt' と標識したパネルはＰＥmt４−ＲＣ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ NO: １５）でプローブし、Ｅ．ミチスはこの
レベルで検出可能であった。‘Ｅmx' と標識したパネル
はＰＥmx４ａ−ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ NO: ３７）でプロ
ーブし、Ｅ．マキシマシグナルが見られた。‘Ｅｎ’と
標識したパネルはオリゴヌクレオチドＰＥｎ４−ＲＣ
（ＳＥＱ ＩＤ NO: １７）でプローブし、Ｅ．ネカト
リクスシグナルが見られた。‘Ｅｐ”と標識したパネル
はＰＥｐ４ｄ−ＲＣ（ＳＥＱＩＤ NO: ３９）でプロー
ブし、わずかなＥ．プラエコクスシグナルが検出され
た。‘Ｅｔ’と標識したパネルはＰＥｔ４ａ−ＲＣ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ NO: ４０）でプローブし、Ｅ．テネラシグ
ナルが見られた。
リゴヌクレオチドをハイブリッド形成するプローブとし
て用いた以外は図１３と同様である。‘ＥＲ１Ｂ２’と
標識したパネルはオリゴヌクレオチドＥrib ２（ＳＥＱ
ＩＤ NO: ３）でプローブし、このプローブは同等の
強度で感染及び非感染両対照に対してハイブリッド形成
した。‘Ｅｂ’と標識したパネルはオリゴヌクレオチド
ＰＥｂ４ｅ−ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ NO: ３６）でプロー
ブし、Ｅ．ブルネッティシグナルがはっきりと見られ
た。‘Ｅmt' と標識したパネルはＰＥmt４−ＲＣ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ NO: １５）でプローブし、Ｅ．ミチスはこの
レベルで検出可能であった。‘Ｅmx' と標識したパネル
はＰＥmx４ａ−ＲＣ（ＳＥＱ ＩＤ NO: ３７）でプロ
ーブし、Ｅ．マキシマシグナルが見られた。‘Ｅｎ’と
標識したパネルはオリゴヌクレオチドＰＥｎ４−ＲＣ
（ＳＥＱ ＩＤ NO: １７）でプローブし、Ｅ．ネカト
リクスシグナルが見られた。‘Ｅｐ”と標識したパネル
はＰＥｐ４ｄ−ＲＣ（ＳＥＱＩＤ NO: ３９）でプロー
ブし、わずかなＥ．プラエコクスシグナルが検出され
た。‘Ｅｔ’と標識したパネルはＰＥｔ４ａ−ＲＣ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ NO: ４０）でプローブし、Ｅ．テネラシグ
ナルが見られた。
【００６８】実施例５ 種特異的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブ
のデザイン方法 一端、全７種のトリアイメリアの ssrＲＮＡ配列を決定
し、保存されていない配列領域を同定した。種特異的オ
リゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを構築する
のに十分な差異があるかどうかを決めるため非保存領域
中の配列を分析した。我々がハイブリッド形成プローブ
をデザインするにあたって３つの条件をつけた。１つは
プローブは種特異的であることである。アッセイの性質
からして交差ハイブリッド形成は許容することができな
かった。第２は１つのハイブリッド形成温度を使用する
ことができるように１つの温度にできる限り近い融点温
度（Ｔm)を有する一組のオリゴヌクレオチドハイブリッ
ド形成プローブを有することであった。この２つの条件
は必要というより便宜的なものであった。最後の条件は
ＤＮＡ又はＲＮＡのどちらをもプローブできるように、
オリゴヌクレオチドをセンス鎖に逆相補性になるよう作
製することであった。非保存領域の配列から始めて、１
つのオリゴヌクレオチドがＴm 約６０℃を有することが
わかった。プローブを合成し、特異性を試験した。
のデザイン方法 一端、全７種のトリアイメリアの ssrＲＮＡ配列を決定
し、保存されていない配列領域を同定した。種特異的オ
リゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブを構築する
のに十分な差異があるかどうかを決めるため非保存領域
中の配列を分析した。我々がハイブリッド形成プローブ
をデザインするにあたって３つの条件をつけた。１つは
プローブは種特異的であることである。アッセイの性質
からして交差ハイブリッド形成は許容することができな
かった。第２は１つのハイブリッド形成温度を使用する
ことができるように１つの温度にできる限り近い融点温
度（Ｔm)を有する一組のオリゴヌクレオチドハイブリッ
ド形成プローブを有することであった。この２つの条件
は必要というより便宜的なものであった。最後の条件は
ＤＮＡ又はＲＮＡのどちらをもプローブできるように、
オリゴヌクレオチドをセンス鎖に逆相補性になるよう作
製することであった。非保存領域の配列から始めて、１
つのオリゴヌクレオチドがＴm 約６０℃を有することが
わかった。プローブを合成し、特異性を試験した。
【００６９】これらの特異性研究のための標的ＤＮＡを
以下の方法で得た。７種のアイメリア種の各々から得た
ゲノムＤＮＡを、２つの増幅プライマー５ＥＲＩＢ（Ｓ
ＥＱ、ＩＤ NO: ４）及び３ＥＲＩＢ（ＳＥＱ、ＩＤ
NO: ５）を用いるＰＣＲにおけるＤＮＡ鋳型として用い
た。この特定のプライマー対を使用することは、ＤＮＡ
鋳型がニワトリ又はＥ．コリ由来である場合には増幅生
成物を生じない、即ちプライマー対はアイメリア ssrＲ
ＮＡ遺伝子に特異的であるので重要である。このプライ
マー対はオリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブ
がデザインされた非保存領域に隣接する。反応はパーキ
ン−エルマ−シータスＤＮＡサーマルサイクラーで行な
った。反応物はアイメリアゲノムＤＮＡ約２５ngを含有
し、この機械について前に述べたように調製した。パー
キン−エルマ−シータスＤＮＡサーマルサイクラーは下
記のようにプログラムされた： ａ）変性に９４℃、約１分間、アニールに約５０℃約
１．５分間及び重合に約７２℃約２分間からなる約３５
サイクル。 ｂ）約７２℃で約１０分間約１サイクル。次いで小規模
ビスベンズイミドアッセイを用いてＤＮＡ含有量につい
て反応混合液約５μｌをアッセイする。反応混合液約５
μｌを約２％アガロースゲル電気泳動にかけて反応が単
一の増幅生成物を生じたことを確かめる。ＰＣＲ生成物
約１０ngを水で最終容量約１００μｌに調整し、スロッ
ト−ブロットマニホルド中のナイトランシート（水に前
湿潤させた）に製造業者の説明書（Schleicher andSchu
ell社) に記載されるように置いた。各試料に約１容量
の１Ｍ NaOHを添加した。次いで試料をほぼ室温で約５
分間インキュベートしてＤＮＡを変性させ、約１容量の
１Ｍトリス−ＨＣｌ（pH７．３）を添加することにより
中和した。次いで装置を真空にして試料を濾過した。次
いで各試料を４Ｍ酢酸アンモニウム（pH６．８）約５０
０μｌで洗浄した。適切な緩衝液対照とブランク対照を
含めて行った。ナイトランシートを風乾し次いで真空下
約８０℃で約２時間以上ベークした。試験プローブをハ
イブリッド形成のため放射標識した。好ましい方法は前
述の方法によって試験オリゴヌクレオチドをγ32Ｐ−Ａ
ＴＰで末端標識することであった。前ハイブリッド形
成、ハイブリッド形成及び洗浄もまた前述のように行な
った。特異性は目的とする主要な点であるので標的種の
ＤＮＡを含有するスロットのみがシグナルを生じた場合
にプローブを種特異的とみなした。他のスロットにシグ
ナルが生じる場合にはプローブは種特異的でなく、した
がって有用ではなかった。
以下の方法で得た。７種のアイメリア種の各々から得た
ゲノムＤＮＡを、２つの増幅プライマー５ＥＲＩＢ（Ｓ
ＥＱ、ＩＤ NO: ４）及び３ＥＲＩＢ（ＳＥＱ、ＩＤ
NO: ５）を用いるＰＣＲにおけるＤＮＡ鋳型として用い
た。この特定のプライマー対を使用することは、ＤＮＡ
鋳型がニワトリ又はＥ．コリ由来である場合には増幅生
成物を生じない、即ちプライマー対はアイメリア ssrＲ
ＮＡ遺伝子に特異的であるので重要である。このプライ
マー対はオリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブ
がデザインされた非保存領域に隣接する。反応はパーキ
ン−エルマ−シータスＤＮＡサーマルサイクラーで行な
った。反応物はアイメリアゲノムＤＮＡ約２５ngを含有
し、この機械について前に述べたように調製した。パー
キン−エルマ−シータスＤＮＡサーマルサイクラーは下
記のようにプログラムされた： ａ）変性に９４℃、約１分間、アニールに約５０℃約
１．５分間及び重合に約７２℃約２分間からなる約３５
サイクル。 ｂ）約７２℃で約１０分間約１サイクル。次いで小規模
ビスベンズイミドアッセイを用いてＤＮＡ含有量につい
て反応混合液約５μｌをアッセイする。反応混合液約５
μｌを約２％アガロースゲル電気泳動にかけて反応が単
一の増幅生成物を生じたことを確かめる。ＰＣＲ生成物
約１０ngを水で最終容量約１００μｌに調整し、スロッ
ト−ブロットマニホルド中のナイトランシート（水に前
湿潤させた）に製造業者の説明書（Schleicher andSchu
ell社) に記載されるように置いた。各試料に約１容量
の１Ｍ NaOHを添加した。次いで試料をほぼ室温で約５
分間インキュベートしてＤＮＡを変性させ、約１容量の
１Ｍトリス−ＨＣｌ（pH７．３）を添加することにより
中和した。次いで装置を真空にして試料を濾過した。次
いで各試料を４Ｍ酢酸アンモニウム（pH６．８）約５０
０μｌで洗浄した。適切な緩衝液対照とブランク対照を
含めて行った。ナイトランシートを風乾し次いで真空下
約８０℃で約２時間以上ベークした。試験プローブをハ
イブリッド形成のため放射標識した。好ましい方法は前
述の方法によって試験オリゴヌクレオチドをγ32Ｐ−Ａ
ＴＰで末端標識することであった。前ハイブリッド形
成、ハイブリッド形成及び洗浄もまた前述のように行な
った。特異性は目的とする主要な点であるので標的種の
ＤＮＡを含有するスロットのみがシグナルを生じた場合
にプローブを種特異的とみなした。他のスロットにシグ
ナルが生じる場合にはプローブは種特異的でなく、した
がって有用ではなかった。
【００７０】図１５は領域１０におけるＥ．アセルブリ
ナに対する種特異的ハイブリッド形成プローブの展開を
例示する。合成した最初のオリゴヌクレオチドはＥ．ア
セルブリナ標的並びにＥ．ブルネッティ、Ｅ．ミチス、
Ｅ．マキシマ及びＥ．プラエコクスとハイブリッド形成
するｐＥａ４−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ NO: ７）であっ
た。更に分析すると１つの塩基が取り除かれている（位
置＃１２のＴ）ことが示されたのでこのプローブを再合
成するとｐＥａ４ａ−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、NO:４６）
を生じ、これはＥ．アセルブリナ及びＥ．マキシマに対
してハイブリッド形成した。１つの塩基を付加すること
により種特異性に関する劇的な改良が得られたが、いく
らかの交差ハイブリッド形成が生じた。試験された次の
オリゴヌクレオチドは、標的Ｅ．アセルブリナに対して
ハイブリッド形成するばかりでなくＥ．マキシマ及び
Ｅ．プラエコクスともハイブリダイズするｐＥａ４ｂ−
ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、NO: ４７）であった。オリゴヌク
レオチドｐＥａ４ｃ−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、NO: ４８）
を合成し、試験するとｐＥａ４ａ−ＲＣ（ＳＥＱ、Ｉ
Ｄ、NO: ４６）と同様に良好であることがわかった。ｐ
Ｅａ４ｄ−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、NO: ４９）を合成した
場合もｐＥａ４ａ−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、NO: ４６）と
同様に良好であることがわかった。最後にオリゴヌクレ
オチドｐＥａ４ｅ−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、No. ３５）を
合成し試験したところ種特異性が証明された。他の６種
の鶏アイメリア種に対して種特異的ハイブリッド形成プ
ローブを展開するために同様の方法を用いた。
ナに対する種特異的ハイブリッド形成プローブの展開を
例示する。合成した最初のオリゴヌクレオチドはＥ．ア
セルブリナ標的並びにＥ．ブルネッティ、Ｅ．ミチス、
Ｅ．マキシマ及びＥ．プラエコクスとハイブリッド形成
するｐＥａ４−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ NO: ７）であっ
た。更に分析すると１つの塩基が取り除かれている（位
置＃１２のＴ）ことが示されたのでこのプローブを再合
成するとｐＥａ４ａ−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、NO:４６）
を生じ、これはＥ．アセルブリナ及びＥ．マキシマに対
してハイブリッド形成した。１つの塩基を付加すること
により種特異性に関する劇的な改良が得られたが、いく
らかの交差ハイブリッド形成が生じた。試験された次の
オリゴヌクレオチドは、標的Ｅ．アセルブリナに対して
ハイブリッド形成するばかりでなくＥ．マキシマ及び
Ｅ．プラエコクスともハイブリダイズするｐＥａ４ｂ−
ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、NO: ４７）であった。オリゴヌク
レオチドｐＥａ４ｃ−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、NO: ４８）
を合成し、試験するとｐＥａ４ａ−ＲＣ（ＳＥＱ、Ｉ
Ｄ、NO: ４６）と同様に良好であることがわかった。ｐ
Ｅａ４ｄ−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、NO: ４９）を合成した
場合もｐＥａ４ａ−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、NO: ４６）と
同様に良好であることがわかった。最後にオリゴヌクレ
オチドｐＥａ４ｅ−ＲＣ（ＳＥＱ、ＩＤ、No. ３５）を
合成し試験したところ種特異性が証明された。他の６種
の鶏アイメリア種に対して種特異的ハイブリッド形成プ
ローブを展開するために同様の方法を用いた。
【００７１】実施例６ 寄生体検出及び定量方法としての糞オーシストから調製
したゲノムＤＮＡに対する直接ハイブリッド形成 アイメリアオーシストの一価又は混合接種物に感染させ
た鳥類の糞オーシストを採取した。胞子形成オーシスト
からスポロシストを単離し精製した。オーシストの採
取、精製及び胞子形成並びに後のスポロシストの精製方
法は実施例１に記載されている。一価の各採取試料中の
スポロシストの数を Coulterカウンター又は血球計数器
によって計数した。既知数の各単一スポロシスト集団並
びに鳥類の七種混合感染群からの混合スポロシスト集団
からゲノムＤＮＡを調製した。スポロシストからゲノム
ＤＮＡの単離は実施例１に記載される。変性及びハイブ
リッド形成のためのゲノムＤＮＡのナイロン膜への固定
化は実施例３に記載される。図１６におけるパネルＩ及
びIIはこの特定方法の可能性を証明する代表的な結果を
示す。２つのパネルは同一に負荷され、負荷の順序はパ
ネルの間の字句により示される。一種に感染した鳥類の
糞のオーシストから調製したゲノムは１〜１３行に固定
化される。この各々の種のスポロシストに換算したゲノ
ムＤＮＡの異る量はカラムＡ、Ｂ及びＣに置かれる。し
かしながらスポロシスト等価物の絶対数は種の間で異な
る。例えばスロット７Ａは１．２４×１０6 Ｅ．マキシ
マスポロシスト等価物であるが、スロット１１Ａは１．
０×１０6 Ｅ．テネラスポロシスト等価物である。スロ
ット１５Ａ、Ｂ及びＣはニワトリゲノムＤＮＡの異る量
を含み、ハイブリッド形成の陰性対照となるように含ま
れる。スロット１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ及び１８Ａは４
つの別々の実験用七種感染から精製した未知数のスポロ
シストから調製した１０％のゲノムＤＮＡを含有する。
したゲノムＤＮＡに対する直接ハイブリッド形成 アイメリアオーシストの一価又は混合接種物に感染させ
た鳥類の糞オーシストを採取した。胞子形成オーシスト
からスポロシストを単離し精製した。オーシストの採
取、精製及び胞子形成並びに後のスポロシストの精製方
法は実施例１に記載されている。一価の各採取試料中の
スポロシストの数を Coulterカウンター又は血球計数器
によって計数した。既知数の各単一スポロシスト集団並
びに鳥類の七種混合感染群からの混合スポロシスト集団
からゲノムＤＮＡを調製した。スポロシストからゲノム
ＤＮＡの単離は実施例１に記載される。変性及びハイブ
リッド形成のためのゲノムＤＮＡのナイロン膜への固定
化は実施例３に記載される。図１６におけるパネルＩ及
びIIはこの特定方法の可能性を証明する代表的な結果を
示す。２つのパネルは同一に負荷され、負荷の順序はパ
ネルの間の字句により示される。一種に感染した鳥類の
糞のオーシストから調製したゲノムは１〜１３行に固定
化される。この各々の種のスポロシストに換算したゲノ
ムＤＮＡの異る量はカラムＡ、Ｂ及びＣに置かれる。し
かしながらスポロシスト等価物の絶対数は種の間で異な
る。例えばスロット７Ａは１．２４×１０6 Ｅ．マキシ
マスポロシスト等価物であるが、スロット１１Ａは１．
０×１０6 Ｅ．テネラスポロシスト等価物である。スロ
ット１５Ａ、Ｂ及びＣはニワトリゲノムＤＮＡの異る量
を含み、ハイブリッド形成の陰性対照となるように含ま
れる。スロット１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ及び１８Ａは４
つの別々の実験用七種感染から精製した未知数のスポロ
シストから調製した１０％のゲノムＤＮＡを含有する。
【００７２】フィルターＩ及びIIを個別バッグ中で前ハ
イブリッド形成させ、それぞれＩはＥ．マキシマ（ＷＥ
mxＩＲＣ、ＳＥＱ ＩＤ NO: １１）とIIはＥ．テネラ
（ＷＥｔＩＲＣ、ＳＥＱ ＩＤ NO: ２０）種特異的プ
ローブとハイブリッド形成させた。パネルＩにおいてハ
イブリッド形成特異性はＥ．マキシマＤＡＮ標的を含有
する行７のみが著しいシグナルを示す観察により証明さ
れる。更にその上シグナル強度はスロット７Ａから７
Ｂ、７Ｃに低下し、これらのスロット中の固定化標的Ｄ
ＮＡの力価測定と関係している。七種感染鳥類からのゲ
ノムＤＮＡを含有する４つの実験用スロット（番号１９
Ａ）の１つだけがＥ．マキシマプローブとハイブリッド
形成した。シグナルの強度はスロット７Ｃのシグナルで
見られる強度即ち約０．３×１０6 スポロシスト等価物
に対応する。全実験用試料の１０％をスロット１９Ａに
のせたので我々は混合スポロシスト集団中Ｅ．マキシマ
スポロシストの全体数が約３×１０6 であったと推定す
る。スロット１７Ａ、１７Ｂ及び１７Ｃに固定化したＤ
ＮＡに対してハイブリッド形成が無いことはこれらの実
験用試料が１×１０6 以下のＥ．マキシマスポロシスト
等価物を含有することを示す。
イブリッド形成させ、それぞれＩはＥ．マキシマ（ＷＥ
mxＩＲＣ、ＳＥＱ ＩＤ NO: １１）とIIはＥ．テネラ
（ＷＥｔＩＲＣ、ＳＥＱ ＩＤ NO: ２０）種特異的プ
ローブとハイブリッド形成させた。パネルＩにおいてハ
イブリッド形成特異性はＥ．マキシマＤＡＮ標的を含有
する行７のみが著しいシグナルを示す観察により証明さ
れる。更にその上シグナル強度はスロット７Ａから７
Ｂ、７Ｃに低下し、これらのスロット中の固定化標的Ｄ
ＮＡの力価測定と関係している。七種感染鳥類からのゲ
ノムＤＮＡを含有する４つの実験用スロット（番号１９
Ａ）の１つだけがＥ．マキシマプローブとハイブリッド
形成した。シグナルの強度はスロット７Ｃのシグナルで
見られる強度即ち約０．３×１０6 スポロシスト等価物
に対応する。全実験用試料の１０％をスロット１９Ａに
のせたので我々は混合スポロシスト集団中Ｅ．マキシマ
スポロシストの全体数が約３×１０6 であったと推定す
る。スロット１７Ａ、１７Ｂ及び１７Ｃに固定化したＤ
ＮＡに対してハイブリッド形成が無いことはこれらの実
験用試料が１×１０6 以下のＥ．マキシマスポロシスト
等価物を含有することを示す。
【００７３】Ｅ．テネラプローブとのハイブリッド形成
特異性はパネルIIで７つの一種感染実験用試料の１つだ
け（行１１）が正のシグナルを生じるという事実により
証明される。ハイブリッド形成シグナルはスロット１１
Ａ、１１Ｂ及び１１Ｃに固定化したＥ．テネラスポロシ
ストゲノムＤＮＡ等価物の相対量と関係づける方法で力
価測定する。およそのスポロシスト等価物数はこれらの
スロット上の数字によって示される。七種感染鳥類から
のゲノムＤＮＡを含有する４つの実験用スロットの２つ
（番号１７Ｃ及び１９Ａ）はＥ．テネラプローブとハイ
ブリッド形成した。行１１のハイブリッド形成シグナル
との比較により我々はスロット１７Ｃ及び１９Ａが各々
＜０．２５×１０6 及び０．５×１０6 スポロシスト等
価物を含有すると推定する。されらのスロットは実験用
試料から調製した前ゲノムＤＮＡの１０％を含有するの
で混合スポロシスト集団中のＥ．テネラスポロシストの
全体数は各々約＜２．５×１０6 及び５×１０6 であっ
た。同様にスロット１７Ａ及び１７Ｂに対応する七種感
染実験用試料は１×１０6 以下のＥ．テネラスポロシス
ト等価物を含有すると思われる。
特異性はパネルIIで７つの一種感染実験用試料の１つだ
け（行１１）が正のシグナルを生じるという事実により
証明される。ハイブリッド形成シグナルはスロット１１
Ａ、１１Ｂ及び１１Ｃに固定化したＥ．テネラスポロシ
ストゲノムＤＮＡ等価物の相対量と関係づける方法で力
価測定する。およそのスポロシスト等価物数はこれらの
スロット上の数字によって示される。七種感染鳥類から
のゲノムＤＮＡを含有する４つの実験用スロットの２つ
（番号１７Ｃ及び１９Ａ）はＥ．テネラプローブとハイ
ブリッド形成した。行１１のハイブリッド形成シグナル
との比較により我々はスロット１７Ｃ及び１９Ａが各々
＜０．２５×１０6 及び０．５×１０6 スポロシスト等
価物を含有すると推定する。されらのスロットは実験用
試料から調製した前ゲノムＤＮＡの１０％を含有するの
で混合スポロシスト集団中のＥ．テネラスポロシストの
全体数は各々約＜２．５×１０6 及び５×１０6 であっ
た。同様にスロット１７Ａ及び１７Ｂに対応する七種感
染実験用試料は１×１０6 以下のＥ．テネラスポロシス
ト等価物を含有すると思われる。
【００７４】 配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２０】
【００７５】 配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２１】
【００７６】 配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２２】
【００７７】 配列番号：４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２３】
【００７８】 配列番号：５ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２４】
【００７９】 配列番号：６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２５】
【００８０】 配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２６】
【００８１】 配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２７】
【００８２】 配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２８】
【００８３】 配列番号：１０ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２９】
【００８４】 配列番号：１１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３０】
【００８５】 配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３１】
【００８６】 配列番号：１３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３２】
【００８７】 配列番号：１４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３３】
【００８８】 配列番号：１５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３４】
【００８９】 配列番号：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３５】
【００９０】 配列番号：１７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３６】
【００９１】 配列番号：１８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３７】
【００９２】 配列番号：１９ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３８】
【００９３】 配列番号：２０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３９】
【００９４】 配列番号：２１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化４０】
【００９５】 配列番号：２２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化４１】
【００９６】 配列番号：２３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化４２】
【００９７】 配列番号：２４ 配列の長さ：１７４８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化４３】
【００９８】 配列番号：２５ 配列の長さ：１７４４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化４４】
【００９９】 配列番号：２６ 配列の長さ：１７５０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化４５】
【０１００】 配列番号：２７ 配列の長さ：１７４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化４６】
【０１０１】 配列番号：２８ 配列の長さ：１７５６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化４７】
【０１０２】 配列番号：２９ 配列の長さ：１７４７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化４８】
【０１０３】 配列番号：３０ 配列の長さ：１７５６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化４９】
【０１０４】 配列番号：３１ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化５０】
【０１０５】 配列番号：３２ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化５１】
【０１０６】 配列番号：３３ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化５２】
【０１０７】 配列番号：３４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化５３】
【０１０８】 配列番号：３５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化５４】
【０１０９】 配列番号：３６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化５５】
【０１１０】 配列番号：３７ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化５６】
【０１１１】 配列番号：３８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化５７】
【０１１２】 配列番号：３９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化５８】
【０１１３】 配列番号：４０ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化５９】
【０１１４】 配列番号：４１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化６０】
【０１１５】 配列番号：４２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化６１】
【０１１６】 配列番号：４３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化６２】
【０１１７】 配列番号：４４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化６３】
【０１１８】 配列番号：４５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化６４】
【０１１９】 配列番号：４６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化６５】
【０１２０】 配列番号：４７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化６６】
【０１２１】 配列番号：４８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化６７】
【０１２２】 配列番号：４９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化６８】
【０１２３】 配列番号：５０ 配列の長さ：５０８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列：
【化６９】
【図１】Ｅ．アセルブリナ小サブユニットｒＲＮＡ遺伝
子の一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２
４）
子の一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２
４）
【図２】図１の続きである。
【図３】Ｅ．ブルネッティ小サブユニットｒＲＮＡ遺伝
子の一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２
５）
子の一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２
５）
【図４】図３の続きである。
【図５】Ｅ．マキシマ小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の
一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２６）
一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２６）
【図６】図５の続きである。
【図７】Ｅ．ミティス小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の
一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２７）
一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２７）
【図８】図７の続きである。
【図９】Ｅ．ネカトリックス小サブユニットｒＲＮＡ遺
伝子の一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２
８）
伝子の一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２
８）
【図１０】図９の続きである。
【図１１】Ｅ．プレコックス小サブユニットｒＲＮＡ遺
伝子の一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２
９）
伝子の一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：２
９）
【図１２】図１１の続きである。
【図１３】Ｅ．テネラ小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の
一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：３０）
一本鎖ヌクレオチド配列である。（配列番号：３０）
【図１４】図１３の続きである。
【図１５】エイメリアの精製調製物から単離されたゲノ
ムＤＮＡへの種特異的ハイブリダイゼーションであり、
Ｅ．テネラプローブの特異性を示す。
ムＤＮＡへの種特異的ハイブリダイゼーションであり、
Ｅ．テネラプローブの特異性を示す。
【図１６】エイメリアの精製調製物から単離されたゲノ
ムＤＮＡへの種特異的ハイブリダイゼーションであり、
このエイメリアプローブが非早熟実験室単離体およびワ
クチン株の両方にハイブリダイズすることを示す。
ムＤＮＡへの種特異的ハイブリダイゼーションであり、
このエイメリアプローブが非早熟実験室単離体およびワ
クチン株の両方にハイブリダイズすることを示す。
【図１７】感染したニワトリの腸管粘膜中でのエイメリ
アの種特異的検出である。
アの種特異的検出である。
【図１８】７種に感染したニワトリの腸管粘膜中でのエ
イメリアの種特異的検出である。
イメリアの種特異的検出である。
【図１９】図１〜図１４を用いたニワトリエイメリアの
複数ヌクレオチド配列の整合である。
複数ヌクレオチド配列の整合である。
【図２０】図１９の続きである。
【図２１】図２０の続きである。
【図２２】図２１の続きである。
【図２３】図２２の続きである。
【図２４】全ＲＮＡおよび種特異的オリゴヌクレオチド
を用いたＲＮＡドットブロット分析である。
を用いたＲＮＡドットブロット分析である。
【図２５】全ＲＮＡおよび種特異的オリゴヌクレオチド
を用いたＲＮＡドットブロット分析である。
を用いたＲＮＡドットブロット分析である。
【図２６】種特異的オリゴヌクレオチドプローブの設計
である。
である。
【図２７】糞便中のオーシストのＤＮＡを直接ターゲッ
トとしたプローブハイブリダイゼーション／寄生体定量
検定である。
トとしたプローブハイブリダイゼーション／寄生体定量
検定である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 プラサンタ アール．チャクラボーティ アメリカ合衆国，07076 ニュージャー シィ，スコッチ プレインズ，ニューア ーク アヴェニュー 2242 (72)発明者 アレックス エルブレヒト アメリカ合衆国，07060 ニュージャー シィ，ウォチュング，メイプル ストリ ート 65 (72)発明者 スコット デー．フェイナー アメリカ合衆国，07076 ニュージャー シィ，スコッチ プレインズ，ウッドサ イド ロード 1185 (72)発明者 ポール エー．リベレイター アメリカ合衆国，08527 ニュージャー シィ，ジヤクソン，ブリッジ コート 11 (72)発明者 ヘレン プロフォウス−ジュチェルカ アメリカ合衆国，10309 ニューヨーク, スタテン アイランド，ポプラー アヴ ェニュー 39
Claims (6)
- 【請求項１】 下記エイメリア・ブルネッティの小サブ
ユニットリボゾームＲＮＡ遺伝子中の種特異的ＤＮＡ配
列である配列番号８、９、１０及び３６からなる群から
選ばれるＤＮＡ配列、またはそれに相補的な配列を１つ
またはそれ以上含み、厳格なハイブリダイゼーション条
件下で該遺伝子に特異的にハイブリダイズすることを特
徴とするエイメリア・ブルネッティＤＮＡプローブ。 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 - 【請求項２】 配列が 【化５】 である請求項１記載のＤＮＡプローブ。
- 【請求項３】 配列が 【化６】 である請求項１記載のＤＮＡプローブ。
- 【請求項４】 配列が 【化７】 である請求項１記載のＤＮＡプローブ。
- 【請求項５】 配列が 【化８】 である請求項１記載のＤＮＡプローブ。
- 【請求項６】 ヌクレオチド配列 【化９】 【化１０】 を有し、他のエイメリア核酸を含まないことを特徴とす
るエイメリア・ブルネッティ小サブユニットリボゾーム
ＲＮＡ遺伝子。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70671791A | 1991-05-29 | 1991-05-29 | |
| US879584 | 1992-05-12 | ||
| US07/879,584 US5278298A (en) | 1991-05-29 | 1992-05-12 | Eimeria brunetti 16s rDNA probes |
| US706717 | 1992-05-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06125792A JPH06125792A (ja) | 1994-05-10 |
| JP2546577B2 true JP2546577B2 (ja) | 1996-10-23 |
Family
ID=27107743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4181511A Expired - Lifetime JP2546577B2 (ja) | 1991-05-29 | 1992-05-29 | エイメリア・ブルネッティｄｎａプローブ |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5278298A (ja) |
| EP (1) | EP0516391B1 (ja) |
| JP (1) | JP2546577B2 (ja) |
| AU (1) | AU1725192A (ja) |
| CA (1) | CA2069533A1 (ja) |
| DE (1) | DE69213823D1 (ja) |
| NZ (1) | NZ242917A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5576197A (en) * | 1995-04-07 | 1996-11-19 | Molecular Bio-Products | Polymerase chain reaction container and methods of using the same |
| US20020150921A1 (en) * | 1996-02-09 | 2002-10-17 | Francis Barany | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
| US6852487B1 (en) * | 1996-02-09 | 2005-02-08 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
| EP2369007B1 (en) * | 1996-05-29 | 2015-07-29 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions |
| US7014994B1 (en) | 1999-03-19 | 2006-03-21 | Cornell Research Foundation,Inc. | Coupled polymerase chain reaction-restriction-endonuclease digestion-ligase detection reaction process |
| US6506594B1 (en) * | 1999-03-19 | 2003-01-14 | Cornell Res Foundation Inc | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
| WO2001079548A2 (en) | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method of designing addressable array for detection of nucleic acid sequence differences using ligase detection reaction |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2849226A1 (de) * | 1977-11-14 | 1979-05-17 | Unilever Nv | Verfahren zur wachstumsfoerderung von gefluegel, mittel zu seiner durchfuehrung und deren herstellung |
| EP0155360B1 (en) * | 1981-09-25 | 1988-12-14 | John A. Webster, Jr. | Method for identifying and characterizing organisms |
| GB8326633D0 (en) * | 1983-08-04 | 1983-11-09 | Unilever Plc | Compositions |
-
1992
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Non-Patent Citations (4)
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