JP2542766B2 - Immobilization method of microorganisms and non-aqueous microbial conversion reaction method by immobilized microorganisms - Google Patents
Immobilization method of microorganisms and non-aqueous microbial conversion reaction method by immobilized microorganismsInfo
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Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、微生物の固定化法及び
固定化微生物を用いる水不溶性ないし難溶性の有機化合
物の微生物変換反応法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for immobilizing microorganisms and a method for microbial conversion reaction of water-insoluble or sparingly soluble organic compounds using immobilized microorganisms.
【0002】[0002]
【従来の技術とその課題】従来、水不溶性の基質に酵素
または微生物菌体を作用させる場合、界面活性剤を用い
て酵素または微生物菌体分散液中に基質を乳化し、反応
系を液/液界面系であるエマルジョン状態となし反応を
行なうことが一般的であった。しかし、この場合には、
油滴と酵素または菌体との比重差が小さいことにより、
反応後の酵素または菌体の分離が困難であったり、酵素
または微生物に対する基質の毒性を回避するために、投
入基質量または基質濃度を低くする結果、小さい反応速
度、低収量を回避することができなかった。さらに、基
質分散性向上と酸素供給のために大きな通気量と撹拌力
を要するなどの多くの問題点があった。2. Description of the Related Art Conventionally, when an enzyme or microbial cell is allowed to act on a water-insoluble substrate, a surfactant is used to emulsify the substrate in the enzyme or microbial cell dispersion to prepare a reaction system. It was common to carry out a reaction with an emulsion state that is a liquid interface system. But in this case,
Due to the small difference in specific gravity between oil droplets and enzymes or cells,
It is difficult to separate the enzyme or bacterial cells after the reaction, and to avoid the toxicity of the substrate to the enzyme or microorganism, lower the input substrate mass or the substrate concentration, and as a result, it is possible to avoid the low reaction rate and low yield. could not. Further, there are many problems such as requiring a large amount of aeration and stirring force for improving the substrate dispersibility and supplying oxygen.
【0003】一方、微生物にとって有害な水不溶性もし
く難溶性の有機化合物を微生物に接触させる際に発現す
る毒性を回避するために、二価のカチオンを添加する方
法(J.Gen.Microbiol.,Vol.11
9,155(1980)参照)、結晶発酵法(J.Ge
n.Appl.Microbiol.Vol.7,11
3(1961)参照)、有機溶媒耐性微生物を活用する
方法(NatureVol.338,264(198
9);特開昭63‐216473参照)などの方法が試
みられている。On the other hand, a method of adding a divalent cation (J. Gen. Microbiol., In order to avoid the toxicity which occurs when a water-insoluble or sparingly soluble organic compound harmful to the microorganism is brought into contact with the microorganism. Vol.11
9, 155 (1980)), crystal fermentation method (J. Ge.
n. Appl. Microbiol. Vol. 7,11
3 (1961)), a method of utilizing an organic solvent resistant microorganism (Nature Vol. 338, 264 (198).
9); Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-216473) has been tried.
【0004】しかしながら、二価のカチオンの添加はさ
ほどの効果はなく、また、結晶発酵法や有機溶媒耐性微
生物を活用する方法は適用できる微生物あるいは変換反
応の種類が限られるといった問題点があった。However, the addition of divalent cations has not been so effective, and the crystal fermentation method and the method utilizing organic solvent-resistant microorganisms have a problem that the types of applicable microorganisms or conversion reactions are limited. .
【0005】さらに、微生物に対する有機化合物の毒性
を回避するために、微生物の包括固定化も試みられてい
る(Biocatalysis in Organic
Media P51,Elsevier,Amste
rdam(1986)参照)。微生物の固定化に関して
は 非水系の酵素反応または微生物変換反応に固定化酵
素または固定化微生物菌体を用いる方法も広く行なわれ
ており、酵素または微生物菌体の固定化方法も種々提案
されている。固定化酵素または固定化微生物菌体を用い
る反応は、高い反応速度と高収率で長期にわたる連続的
操業が可能なこと、高価な酵素をくりかえし使用できる
ことなど、コスト面での利点が多く、固定化酵素または
固定化菌体はバイオリアクター用触媒として注目されて
いる。Furthermore, in order to avoid the toxicity of organic compounds to microorganisms, entrapment of microorganisms has been attempted (Biocatalysis in Organic).
Media P51, Elsevier, Amste
rdam (1986)). Regarding the immobilization of microorganisms, a method of using an immobilized enzyme or immobilized microbial cells in a non-aqueous enzyme reaction or a microbial conversion reaction has been widely performed, and various methods for immobilizing enzymes or microbial cells have been proposed. . The reaction using immobilized enzymes or immobilized microbial cells has many cost advantages such as high reaction rate and high yield, long-term continuous operation, and the ability to repeatedly use expensive enzymes. Immobilized enzymes or immobilized cells have been attracting attention as catalysts for bioreactors.
【0006】しかしながら、包括固定化法では、固定化
担体内での該有機化合物およびその微生物変換産物の透
過拡散が悪いために毒性を発現する場合が多く、また、
微生物の増殖を阻害するため、非水系反応において、固
定化酵素を用いた例は多くみられるが、一方、固定化微
生物菌体を用いたものとして、非増殖菌体を固定化して
用いた例があるが(特公昭57−41918号公報参
照)、固定化菌体を増殖させて用いた例は見当らない。
固定化微生物菌体は、生物体から抽出、精製した酵素を
固定化した固定化酵素とは異なり、菌体固有の生理、代
謝等に基づく反応を利用することができるが、非増殖菌
体ではこれら菌体活性のごく一部しか利用できない。However, in the entrapping immobilization method, toxicity is often exhibited due to poor permeation and diffusion of the organic compound and its microbial conversion product in the immobilization carrier, and
In order to inhibit the growth of microorganisms, there are many examples of using immobilized enzymes in non-aqueous reactions, while on the other hand, examples of using immobilized microbial cells as immobilized non-proliferating cells. However, there is no example in which immobilized cells are grown and used.
Immobilized microbial cells can utilize reactions based on the physiology, metabolism, etc. peculiar to the cells, unlike immobilized enzymes in which enzymes extracted and purified from organisms are immobilized, but in non-growing cells Only a small portion of these cell activity is available.
【0007】したがって、微生物にとって毒性を有する
有機化合物に対し、その毒性から微生物を保護しつつ固
定化微生物菌体を増殖させる効果的な培養方法を開発す
ること、並びに非水系反応において固定化増殖菌体を用
いて、増殖菌体特有の活性を十分に利用できる非水系バ
イオリアクターを開発することが、近年、水不溶性の製
品を取り扱う産業分野で強く望まれており、特に固定化
増殖菌体を用いた非水系微生物変換反応方法の開発は、
次世代バイオリアクターとして強く望まれている。Therefore, it is necessary to develop an effective culture method for proliferating immobilized microbial cells while protecting the microorganisms from the toxicity of organic compounds that are toxic to the microorganisms, and to immobilize the immobilized microorganisms in a non-aqueous reaction. It has been strongly desired in recent years to develop a non-aqueous bioreactor in which the activity peculiar to growing cells can be fully utilized in the industrial field handling water-insoluble products. Development of the non-aqueous microbial conversion reaction method used
It is strongly desired as a next-generation bioreactor.
【0008】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記したよ
うに、非水系反応において問題点となっている固定化微
生物菌体の増殖方法並びに固定化増殖菌体を用いた微生
物変換反応について鋭意検討を重ねた結果、微生物菌体
を付着固定化させた親水性担体を、栄養源を含む水性媒
体の存在下に、有機溶媒に接触させると、有機溶媒と固
定化担体との界面で微生物菌体が旺盛に増殖して担体上
に菌体相を形成し、この菌体相が菌体固有の微生物変換
反応を触媒し得ることを見出し、本発明を完成するに至
った。Means for Solving the Problems As described above, the present inventors have described a method for growing immobilized microbial cells and a microbial conversion reaction using the immobilized microbial cells, which are problems in non-aqueous reactions. As a result of extensive studies, when a hydrophilic carrier to which microbial cells have been adhered and immobilized is brought into contact with an organic solvent in the presence of an aqueous medium containing a nutrient source, microorganisms are present at the interface between the organic solvent and the immobilized carrier. The inventors have found that the bacterial cells proliferate vigorously to form a bacterial cell phase on the carrier, and that this bacterial cell phase can catalyze a microbial conversion reaction specific to the bacterial cells, and have completed the present invention.
【0009】かくして本発明の第一の態様に従えば、親
水性固定化担体に微生物を付着させ、該微生物の栄養源
を含む水性媒体の存在下に、実質的に水に不溶性ないし
難溶性の有機溶媒を該担体上の該微生物に接触させ、担
体と有機溶媒との接触界面で該微生物を増殖させ、該担
体上に固定化菌体相を形成させることを特徴とする微生
物の固定化法が提供される。Thus, according to the first aspect of the present invention, a microorganism is attached to a hydrophilic immobilization carrier and is substantially insoluble or sparingly soluble in water in the presence of an aqueous medium containing a nutrient source for the microorganism. A method for immobilizing a microorganism, which comprises contacting an organic solvent with the microorganism on the carrier, growing the microorganism at a contact interface between the carrier and the organic solvent, and forming an immobilized bacterial cell phase on the carrier. Will be provided.
【0010】また、本発明の第二の態様に従えば、親水
性固定化担体に微生物を付着固定化し、基質としての実
質的に水に不溶性ないし難溶性の有機化合物を、該微生
物の栄養源を含む水性媒体の存在下に、該担体上の固定
化菌体相と接触せしめることを特徴とする有機化合物の
変換方法が提供される。Further, according to the second aspect of the present invention, microorganisms are adhered and immobilized on a hydrophilic immobilization carrier, and a substantially water-insoluble or sparingly soluble organic compound as a substrate is used as a nutrient source for the microorganisms. There is provided a method for converting an organic compound, which comprises contacting with an immobilized bacterial cell phase on the carrier in the presence of an aqueous medium containing.
【0011】本発明の前記第一の態様の特徴は、親水性
固定化担体に微生物を増殖可能な状態で付着させ、それ
に該微生物の栄養源を含む水性媒体(以下、培養液とい
う)を供給しつつ、実質的に水に不溶性ないし難溶性の
有機溶媒を担体上の微生物に接触させ、担体と有機溶媒
との界面で該微生物を増殖させて、担体上に固定化菌体
相を形成させる点にある。The feature of the first aspect of the present invention is that a microorganism is attached to a hydrophilic immobilization carrier in a state in which it can grow, and an aqueous medium (hereinafter referred to as a culture solution) containing a nutrient source for the microorganism is supplied thereto. At the same time, a substantially water-insoluble or sparingly soluble organic solvent is brought into contact with the microorganisms on the carrier, and the microorganisms are grown at the interface between the carrier and the organic solvent to form an immobilized bacterial cell phase on the carrier. In point.
【0012】上記の担体上の微生物に接触させる有機溶
媒は、付着微生物菌体に対して実質的に毒性を示さない
ものが好ましいことはいうまでもないが、本発明の固定
化法によれば意外にも、該有機溶媒が微生物にとって有
害な有機化合物を含んでいても有機溶媒と担体との界面
で微生物菌体が旺盛に増殖することが明らかになり、そ
の結果、本発明の方法により、微生物にとっての有害物
質を微生物に接触させる際に発現する毒性を回避し、有
害物質の微生物阻害から微生物を保護することができる
ことが明らかになった。It goes without saying that it is preferable that the organic solvent to be brought into contact with the microorganisms on the above-mentioned carrier is one that does not substantially show toxicity to the adherent microbial cells, but according to the immobilization method of the present invention, Surprisingly, it became clear that the microbial cells actively grow at the interface between the organic solvent and the carrier even if the organic solvent contains an organic compound harmful to the microorganism, and as a result, by the method of the present invention, It has been clarified that it is possible to avoid the toxicity that occurs when a harmful substance for a microorganism comes into contact with the microorganism and protect the microorganism from the microbial inhibition of the harmful substance.
【0013】本発明の前記第二の態様の特徴は、例えば
前記第一の態様の方法の如くして、親水性固定化担体に
微生物を増殖可能な状態で付着固定化し、それに該微生
物の栄養源を含む水性媒体(培養液)を供給しつつ該担
体上に固定化菌体相を形成させ且つそこで該微生物を増
殖させ、該固定化菌体相に、基質としての実質的に水に
不溶性ないし難溶性の有機化合物又はその有機溶媒溶液
と接触させて、固定化菌体相と有機液相との界面で基質
の有機化合物を微生物的に変換する点にある。The feature of the second aspect of the present invention is that, for example, as in the method of the first aspect, microorganisms are adhered and immobilized on a hydrophilic immobilization carrier in a proliferative state, and the nutrients of the microorganisms are immobilized. An immobilized microbial phase is formed on the carrier while supplying an aqueous medium (culture solution) containing a source and the microorganism is grown there, and the immobilized microbial phase is converted into substantially water as a substrate. The point is that it is brought into contact with an insoluble or sparingly soluble organic compound or an organic solvent solution thereof to convert the organic compound of the substrate into a microorganism at the interface between the immobilized bacterial cell phase and the organic liquid phase.
【0014】本発明の方法によって形成される固定化菌
体相を用いれば、基質としての有機化合物が微生物によ
って毒性を示す場合であっても、前記のように、微生物
にとっての有害物質の毒性を回避することができ、有害
物質による微生物阻害から保護できるため、基質を固定
化菌体相に高濃度で接触させることが可能となることが
判明した。If the immobilized bacterial cell phase formed by the method of the present invention is used, even if the organic compound as the substrate is toxic by the microorganism, the toxicity of the harmful substance to the microorganism is as described above. It has been found that the substrate can be contacted with the immobilized bacterial cell phase at a high concentration because it can be avoided and protected from microbial inhibition by harmful substances.
【0015】なお、これらの固定化菌体相に接触させる
有機溶媒及び基質又はその有機溶媒溶液を、以下、有機
液相ということがある。The organic solvent and the substrate or the organic solvent solution thereof brought into contact with the immobilized bacterial cell phase may be hereinafter referred to as an organic liquid phase.
【0016】固定化菌体への培養液の供給は、担体が例
えば寒天のように培養液を充分に含有保持しうるもので
あれば、担体に予め含ませておくことにより行うことが
でき、及び/又は例えば、上記有機液相に培養液を加
え、形成される有機液相と培養液相の界面に微生物固定
化担体を介在させることにより行なうこともできる。The supply of the culture solution to the immobilized cells can be carried out by preliminarily including it in the carrier as long as the carrier can sufficiently contain and retain the culture solution, such as agar. And / or for example, the culture liquid may be added to the organic liquid phase, and the microorganism-immobilized carrier may be interposed at the interface between the organic liquid phase and the culture liquid phase to be formed.
【0017】本発明で使用可能な固定化担体は、親水性
のものであれば特に制約はなく、栄養源を含む水溶液を
含浸もしくは接触させて有機溶媒との界面に存在する微
生物にこれを供給することができるものであれば、いか
なる素材であっても使用可能であり、具体的には例え
ば、アルギン酸、カラギーナン、デンプンマトリック
ス、寒天、濾紙のようなセルロース材などの天然高分
子;ポリビニルアルコール、ウレタンポリマー、ポリア
クリルアミド、ポリアクリル酸などの合成高分子;泡ガ
ラス、シリカゲルなどの無機物などが挙げられる。The immobilization carrier usable in the present invention is not particularly limited as long as it is hydrophilic, and it is supplied to a microorganism existing at the interface with an organic solvent by impregnating or contacting it with an aqueous solution containing a nutrient source. Any material can be used as long as it can be used. Specifically, for example, natural polymers such as alginic acid, carrageenan, starch matrix, agar, and cellulose materials such as filter paper; polyvinyl alcohol, Examples include synthetic polymers such as urethane polymers, polyacrylamide, and polyacrylic acid; inorganic materials such as foam glass and silica gel.
【0018】これら固定化用担体の形状には特に制約は
なく、繊維状、膜状、粒状等の任意の形状に成形されて
いることができ、また布、不織布、紙、ボール紙等の形
態に成形されたものであってもよい。There are no particular restrictions on the shape of these immobilization carriers, and they can be formed into any shape such as fibrous, film-like, and granular shapes, and can be in the form of cloth, non-woven fabric, paper, cardboard, etc. It may be molded into.
【0019】上記固定化菌体相に接触する有機相におけ
る有機溶媒又は基質溶液調製用の有機溶媒は、付着微生
物菌体に対して実質的に毒性を示さないものが好まし
く、具体的には、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナ
ン、デカン等の炭素数6〜20のメタン系炭化水素に代
表されるノルマルパラフィン類又は流動パラフィン類;
イソオクタン等のイソパラフィン類;ペンチルベンゼ
ン、ヘキシルベンゼン、ヘプチルペンゼン、オクチルベ
ンゼン等の脂肪族鎖の炭素数が5〜15のノルマルアル
キルベンゼン類;キユメン等のイソアルキルベンゼン
類;シクロヘキサン等の脂環式炭化水素類;ジエチルエ
ーテル等のエーテル類などを例示することができる。The organic solvent or the organic solvent for preparing the substrate solution in the organic phase which is in contact with the immobilized bacterial cell phase is preferably one which does not show substantial toxicity to the adherent microbial cells, and specifically, Normal paraffins or liquid paraffins represented by methane hydrocarbons having 6 to 20 carbon atoms such as hexane, heptane, octane, nonane, and decane;
Isoparaffins such as isooctane; Pentylbenzene, hexylbenzene, heptylbenzene, octylbenzene and other normal chain alkyl chains having 5 to 15 carbon atoms; Isoalkylbenzenes such as kyumen; Alicyclic hydrocarbons such as cyclohexane Examples thereof include ethers such as diethyl ether and the like.
【0020】上記固定化担体に付着させ、担体と有機液
相との界面で増殖させ得る微生物は、細菌類、カビ類、
酵母、放線菌類等のいずれの微生物であってもよくま
た、好気性、嫌気性のいずれでもよい。具体的には例え
ば、シュードモナス(Pseudomonas)属、グ
ルコノバクター(Gluconobacter)属、ア
セトバクター(Acetobacter)属、アリスロ
バクター(Arithrobactor)属、コリネバ
クテリウム(Corynebactrium)属、ロド
コッカス(Rhodococcus)属、アルカリゲネ
ス(Alcaligenes)属、カンジダ(Cand
ida)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ア
スペルギルス(Aspergillus)属等に属する
微生物が挙げられる。Microorganisms which can be attached to the above-mentioned immobilized carrier and can grow at the interface between the carrier and the organic liquid phase include bacteria, fungi,
It may be any microorganism such as yeast or actinomycete, and may be either aerobic or anaerobic. Specifically, for example, Pseudomonas (Pse u domonas) genus Gluconobacter (Gluconobacter) genus Acetobacter (Acetobacter) genus, Alice Arthrobacter (Arithrobactor) genus Corynebacterium (Corynebactrium) genus Rhodococcus (Rhodococ c us ) Genus, Alcaligenes genus, Candida
Examples thereof include microorganisms belonging to the genus ida, the genus Hansenula, the genus Aspergillus, and the like.
【0021】本発明では、これらの微生物は接触する有
機溶媒が微生物にとっての有害物質を含む場合であって
も、担体と有機液相との界面で増殖させることができ
る。例えば、シュードモナス・フルオレッセンス(Ps
eudomonas fluorescens)やシュ
ードモナス・プチダ(Pseudomonas put
ida)では、ベンゼンのような強毒性有機化合物につ
いては、接触させる有機溶媒のノルマルパラフィンに対
して5%含まれていても増殖が可能である。また、四塩
化炭素やトルエン、スチレンのような中ないし強毒性有
機化合物については、10〜25%という高濃度であっ
ても増殖が可能である。更に、最も毒性の低い部類に入
る長鎖脂肪酸エステルや脂肪族炭化水素の場合には、1
00%濃度、つまりそれ自体が有機液相を形成する有機
溶媒として用いることができる。In the present invention, these microorganisms can be grown at the interface between the carrier and the organic liquid phase even when the organic solvent with which they come into contact contains harmful substances for the microorganisms. For example, Pseudomonas fluorescens (Ps
eudomonas fluorescens and Pseudomonas put
In ida), a highly toxic organic compound such as benzene can grow even if it is contained at 5% with respect to the normal paraffin of the organic solvent to be contacted. As for the carbon tetrachloride and toluene chloride, to strongly toxic organic compounds in such as styrene, it is possible to grow even at high concentration of 10% to 25%. Furthermore, in the case of long-chain fatty acid esters and aliphatic hydrocarbons, which belong to the least toxic category, 1
It can be used as an organic solvent having a concentration of 00%, that is, forming an organic liquid phase by itself.
【0022】本発明の方法により、基質としての実質的
に水に不溶性ないしは難溶性の有機化合物又はその有機
溶媒溶液を有機液相として、固定化菌体相と有機液相と
の界面で基質の有機化合物を微生物変換する場合、上記
担体に付着固定化しうる微生物は、基質としての有機化
合物を所望の生成物に転換しうる能力を有するものであ
れば特に制約はなく、好気性、嫌気性のいずれでもよ
く、また、細菌類、カビ類、酵母、放線菌類等のいずれ
であってもよい。具体的には前述した属に属する微生
物、より具体的には有機カルボン酸エステルの加水分解
能をもつシュードモナス・フラジ(Ps.frag
i)、ミクロコッカス・バリアンス(Mi.varia
ns)、有機カルボン酸とアルコールとのエステル合成
能をもつシュードモナス・フルオレッセンス(Ps.f
luorescence)、カルビノール基をカルボキ
シル基へ酸化する酸化菌のグルコノバクター・オキシダ
ンス(Gl.oxydans)、シュードモナス・プチ
ダ (Ps.putida)、アルデヒド基のカルボキ
シル基への酸化反応を行なうグルコノバクター・グルコ
ニカス(Gl.gluconicus)、2級アルコー
ルの酸化反応が可能なアセトバクター・アセチゲナス
(Ac.acetigenus)、同じく、2級アルコ
ールの酸化反応を行ない得るアセトバクター・アセトサ
ス(Ac.acetosus)、グリコール類の1−位
の水酸基を選択的に酸化するアリスロバクター・パッセ
ンス(Ar.pascens)、同じく、グリコール類
の1−位の水酸基を選択的に酸化するアルカリゲネス・
フェカリス(Al.faecalis)、アルデヒド、
ケトンをアルコールに還元する還元能を有するカンジダ
・ウチリス(Ca.utilis)、アルデヒド、ケト
ンの還元能と二重結合の水素化能をもつハンゼヌラ・ア
ノマラ(Ha.anomala)、二重結合の水酸化が
可能なアスペルギルス・オリゼ(As.oryza
e)、コレステロールの酸化的側鎖切断能を有するアリ
スロバクター・シンプレックス(Ar.simple
x)、ロドコッカス・エクイ(Rh.equi)、ノカ
ルディア・トランスバレンシス(No.transba
lensis)等を挙げることができる。According to the method of the present invention, a substantially water-insoluble or sparingly water-soluble organic compound or a solution of the organic solvent as a substrate is used as an organic liquid phase, and the substrate is immobilized at the interface between the immobilized bacterial cell phase and the organic liquid phase. When converting an organic compound into a microorganism, the microorganism that can be attached and immobilized on the carrier is not particularly limited as long as it has the ability to convert the organic compound as a substrate into a desired product, and is aerobic or anaerobic. Any of these may be used, and any of bacteria, fungi, yeasts, actinomycetes, etc. may be used. Specifically, microorganisms belonging to the above-mentioned genus, more specifically Pseudomonas frassii (Ps.
i), Micrococcus varians (Mi.varia
ns), Pseudomonas fluorescens (Ps.f) having the ability to synthesize an ester of an organic carboxylic acid and an alcohol
luorescence), Gluconobacter oxydans oxidation bacteria for oxidizing a carbinol group to Ca Ruboki <br/> sill group (Gl.oxydans), Pseudomonas putida (Ps. p utida), to the carboxyl group of an aldehyde group performing an oxidation reaction Gluconobacter-Gurukonikasu (Gl.gluc o nicus), 2 grade oxidation reaction capable Acetobacter Asechigenasu alcohol (Ac.acetigenus), similarly, Acetobacter which may perform oxidation reaction of the secondary alcohol Ac.acetosus, Alysobacter pacens, which selectively oxidizes the 1-hydroxyl group of glycols, and Alcaligenes, which selectively oxidizes the 1-hydroxyl group of glycols.
Alfa facalis, aldehyde,
Candida utilis (Ca. utilis), which has the ability to reduce ketones to alcohols, hansenula anomala (Ha. Anomala), which has the ability to reduce aldehydes and ketones and the hydrogenation of double bonds, and hydroxylation of double bonds Aspergillus oryzae (As.oryza)
e), Arislovobacter simplex (Ar. simplex) which has the ability to cleave oxidative side chains of cholesterol
x), Rhodococcus Exports Lee (Rh.equi), Nocardia transformer Valentin cis (No.transba
lens) and the like.
【0023】かかる微生物の前記担体への付着固定化
は、例えば、菌体分散液を予め栄養源を含む水性媒体を
含ませた担体に塗布 又は散布するか、担体を菌体
培養液中に浸漬するか、微生物菌体を適当な手段で担体
に付着させた後担体に栄養源を含む水性媒体を供給する
等の方法で担体上に微生物菌体を付着させた後、その担
体は予め栄養源を含む水性媒体中で培養することもでき
るが、通常、基質としての有機化合物を含むか又は含ま
ない有機溶媒と接触させた状態で培養し、付着した微生
物菌体を担体と該有機溶媒との界面で増殖させ、担体上
に固定化菌体相を形成させることにより行なうことがで
きる。この培養により微生物は担体表面に強固に付着
し、固定化菌体相が担体表面から剥落するようなことは
殆んどない。The microorganisms can be adhered and immobilized on the carrier by, for example, coating or spraying the microbial cell dispersion on a carrier previously containing an aqueous medium containing a nutrient source, or immersing the carrier in the microbial cell culture solution. Or, after attaching the microbial cells to the carrier by a method such as attaching the microbial cells to the carrier by an appropriate means and then supplying an aqueous medium containing the nutrient source to the carrier, the carrier is previously fed with the nutrient source. It is also possible to culture in an aqueous medium containing, but usually, in the state of contacting with an organic solvent with or without an organic compound as a substrate, the adhered microbial cells of the carrier and the organic solvent It can be carried out by growing at the interface and forming an immobilized bacterial cell phase on the carrier. By this culturing, the microorganisms adhere strongly to the surface of the carrier, and the immobilized bacterial cell phase hardly peels off from the surface of the carrier.
【0024】上記培養において使用しうる微生物の栄養
源は、使用菌体の種類に応じて、その菌体に最適のもの
を選択することができ、例えば、グルコース等の炭素
源、尿素等の窒素源、硫酸マグネシウム等の微量金属
塩、酵母エキス等の微量栄養源よりなる一般的なもので
あることができる。As the nutrient source of the microorganisms that can be used in the above culture, an optimum one can be selected depending on the type of bacterial cells used, and for example, a carbon source such as glucose or nitrogen such as urea. The source can be a general one consisting of a trace metal salt such as magnesium sulfate and a trace nutrient such as yeast extract.
【0025】培養は一般に、恒温槽、インキュベーター
等の培養装置中で行なうことができ、或いは担体を基質
を含むか含まない有機溶媒中に浸漬し、場合によっては
さらに栄養源を含む水性媒体を加えた反応容器中で温度
調節しながら行なってもよい。培養温度、培養時間等の
培養条件は使用微生物の種類に応じて各微生物に適合し
た条件を選択することができる。Culturing can generally be carried out in a culturing apparatus such as a thermostat or an incubator, or the carrier is immersed in an organic solvent containing or not containing a substrate, and optionally an aqueous medium containing a nutrient source is added. It may be carried out while controlling the temperature in the reaction vessel. The culture conditions such as the culture temperature and the culture time can be selected according to the type of the microorganism used and suitable for each microorganism.
【0026】反応基質としての有機化合物は、上記培養
の初期から添加してもよく、又は微生物が十分に増殖し
て固定化菌体相を形成した後に添加してもよく、或いは
培養初期から固定化菌体相形成までの間の任意の時点で
加えてもよい。また、基質としての有機化合物が菌体に
対して実質的に毒性を示さない場合には、前記有機溶媒
の代りに該有機化合物を有機液相として使用することが
できる。The organic compound as a reaction substrate may be added from the initial stage of the above-mentioned culture, or may be added after the microorganisms have sufficiently grown to form an immobilized bacterial cell phase, or fixed from the early stage of the culture. It may be added at any time during the formation of the modified bacterial cell phase. When the organic compound as a substrate does not show substantial toxicity to the cells, the organic compound can be used as an organic liquid phase instead of the organic solvent.
【0027】かくして、担体上の付着させた微生物菌体
を有機溶媒との接触状態培養を続けることにより、担体
上に固定化菌体相を形成することができる。In this way, the immobilized microbial cell phase can be formed on the carrier by continuously culturing the microbial cells attached on the carrier in contact with the organic solvent.
【0028】また、担体上の固定化菌体相を、基質とし
ての有機化合物又はその有機溶媒溶液からなる有機液相
との接触状態で培養をつづけることにより、該有機化合
物の微生物変換反応を行なわせることができる。Further, the microorganism conversion reaction of the organic compound is carried out by continuing the culture of the immobilized bacterial cell phase on the carrier in contact with the organic compound as the substrate or the organic liquid phase consisting of the organic solvent solution. Can be made.
【0029】この微生物変換反応に基質として供しうる
実質的に水に難溶性ないし不溶性の有機化合物として
は、固定化微生物の変換能力等に応じて各種のものが使
用することができ、特に制限はなく、例えば、ベンゼ
ン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、スチレン、
ナフタレン、フェナントレンなどの芳香族系炭化水素;
トリデカン、テトラデカンなどの脂肪族系炭化水素;シ
クロヘキサノール、シクロヘキサノンなどの脂環式系化
合物;メチルイミダゾール、コリジン、ピコリンなどの
複素環式系化合物;ラウリン酸、パルミチン酸、ステア
リン酸、オレイン酸、リノール酸などの高級脂肪酸;オ
クチルアルコール、デシルアルコール、ラウリルアルコ
ール、セチルアルコール、ステアリルアルコールなどの
高級アルコール類;カプリル酸エチル、カプロン酸エチ
ルなどの脂肪酸エステル類等が挙げられる。As the substantially water-insoluble or insoluble organic compound that can be used as a substrate for this microbial conversion reaction, various compounds can be used depending on the conversion ability of the immobilized microorganisms, and there is no particular limitation. Without, for example, benzene, toluene, xylene, ethylbenzene, styrene,
Aromatic hydrocarbons such as naphthalene and phenanthrene;
Aliphatic hydrocarbons such as tridecane and tetradecane; alicyclic compounds such as cyclohexanol and cyclohexanone; heterocyclic compounds such as methylimidazole, collidine and picoline; lauric acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linole Higher fatty acids such as acids; higher alcohols such as octyl alcohol, decyl alcohol, lauryl alcohol, cetyl alcohol, stearyl alcohol; fatty acid esters such as ethyl caprylate and ethyl caproate.
【0030】一方、これら有機化合物を溶解するための
有機溶媒は、付着菌体に対して実質的に毒性を示さない
ものが好ましく、具体的には、前記したノルマルパラフ
ィン類、アルキルベンゼン類、脂環式炭化水素類エーテ
ル類などが挙げられる。On the other hand, the organic solvent for dissolving these organic compounds is preferably one which is not substantially toxic to adherent cells, and specifically, the above-mentioned normal paraffins, alkylbenzenes and alicyclic rings are used. Formula hydrocarbon ethers etc. are mentioned.
【0031】有機溶媒中の基質濃度は特に制限されるも
のではなく、菌体に対する毒性に応じて決めることがで
きる。例えば基質が毒性の強い上記芳香族炭化水素類の
場合は炭素数10〜15のメタン系炭化水素であるノル
マルパラフィンに対して5%〜30%程度までの濃度で
添加することができる。また、基質が比較的毒性の弱い
脂肪酸エステル類の場合はノルマルパラフィンに対して
50%以上添加することができる。The substrate concentration in the organic solvent is not particularly limited and can be determined depending on the toxicity to the bacterial cells. For example, when the substrate is the above-mentioned aromatic hydrocarbon having strong toxicity, it can be added at a concentration of about 5% to 30% with respect to normal paraffin which is a methane hydrocarbon having 10 to 15 carbon atoms. Further, when the substrate is a fatty acid ester having relatively weak toxicity, it can be added in an amount of 50% or more with respect to normal paraffin.
【0032】基質の中でも特に毒性の弱い高級脂肪酸エ
ステル類はノルマルパラフィンと混和することなく、1
00%濃度、すなわち、それ自体が固定化担体上の菌体
相と接触させる有機溶媒かつ、変換基質として用いるこ
とができる。Among the substrates, the higher fatty acid esters, which are particularly less toxic, do not mix with normal paraffin and
It can be used as a conversion substrate as well as an organic solvent which is brought into contact with the bacterial cell phase on the immobilized carrier at a concentration of 00%, that is, as a conversion substrate.
【0033】脂肪族炭化水素も高級脂肪酸エステル類と
同様に基質として使用する場合特に毒性の弱い部類に入
り、それ自体が固定化担体上の菌体相と接触させる有機
溶媒かつ、変換基質として用いられる。Similar to higher fatty acid esters, aliphatic hydrocarbons are also particularly less toxic when used as a substrate, and are themselves used as an organic solvent for contacting the bacterial phase on the immobilization carrier and as a conversion substrate. To be
【0034】以上に述べた本発明の方法によれば、脂肪
族、芳香族、脂環式、複素環式化合物等の有機化合物の
エステル化、加水分解、エステル変換、酸化還元、アミ
ノ化、脱アミノ化反応等を、固定化微生物を用いて極め
て効率よく行なうことができる。その際、副反応が生ず
る可能性がある場合には、適当な代謝あるいは変換阻害
剤の添加によってそれを遮断するか、あるいはそのよう
な副反応が生じないように育種改良した微生物を用いる
ことができる。According to the above-mentioned method of the present invention, esterification, hydrolysis, ester conversion, redox, amination and desorption of organic compounds such as aliphatic, aromatic, alicyclic and heterocyclic compounds. The amination reaction and the like can be carried out extremely efficiently using immobilized microorganisms. In that case, if a side reaction may occur, it should be blocked by the addition of an appropriate metabolic or conversion inhibitor, or a microorganism improved to prevent such side reaction should be used. it can.
【0035】本発明の方法により、親水性担体と有機液
相との接触界面で微生物菌体が旺盛に増殖して固定化増
殖菌体相が得られ、なおかつ、該微生物菌体固有の微生
物変換反応を行ない得る詳細な理由は不明であるが次の
ように考察される。すなわち、微生物に限らず、細胞の
培養増殖においては支持体に付着する方が、遊離なもの
に比べて旺盛に増殖することが知られている。また、固
体表面に付着した微生物は酸化反応、DNA合成を活発
化することも知られている。従って、本発明において微
生物を親水性担体に付着することによって、該微生物が
安定に増殖することが考えられる。これには、担体と有
機液相との界面に生ずる界面エネルギーが該微生物の安
定化に寄与している可能性もある。According to the method of the present invention, microbial cells are vigorously proliferated at the contact interface between the hydrophilic carrier and the organic liquid phase to obtain an immobilized proliferating microbial cell phase, and microbial conversion specific to the microbial cells is obtained. Although the detailed reason why the reaction can be performed is unknown, it is considered as follows . That is, it is known that not only microorganisms but also those that adhere to the support grow vigorously as compared with the free ones in the culture and growth of cells. Also solid
Microorganisms attached to the body surface activate oxidation reaction and DNA synthesis
It is also known to turn into. Therefore, in the present invention, it is considered that the microorganism grows stably by attaching it to the hydrophilic carrier. It is possible that the interfacial energy generated at the interface between the carrier and the organic liquid phase contributes to the stabilization of the microorganism.
【0036】また、エマルジョン系のような液/液界面
での微生物変換反応の場合と比較して、本発明における
担体と有機液相との界面に形成された固定化菌体相での
微生物変換反応では、有機液層での非常に高い濃度の変
換基質あるいは生成物の存在が可能であり、菌体に有害
な変換基質あるいは生成物を有機液層に存在させること
による菌体への毒性が軽減されることも考えられる。更
に、有機液相の酵素溶解度が水の数倍から10数倍大き
いために、増殖促進効果あるいは反応促進効果が生ずる
ことも考えられる。Further, as compared with the case of the microbial conversion reaction at the liquid / liquid interface such as an emulsion system, the microbial conversion at the immobilized bacterial cell phase formed at the interface between the carrier and the organic liquid phase in the present invention. In the reaction, a very high concentration of the conversion substrate or product can be present in the organic liquid layer, and the toxicity of the conversion substrate or product, which is harmful to the cells, to the cells due to the presence of the conversion substrate or product in the organic liquid layer. It may be reduced. Furthermore, since the enzyme solubility of the organic liquid phase is several to ten times greater than that of water, it is considered that a growth promoting effect or a reaction promoting effect may occur.
【0037】微生物変換反応の基質および生成物が疎水
性の場合、反応生成物は有機液層に高濃度に蓄積され
る。かくして、本発明の方法によれば、有機液層に蓄積
される反応生成物を回収し、基質を補充する等の方法を
行なうことにより、固定化菌体相と基質との接触頻度を
飛躍的に増加せしめることができ、反応速度と収率、収
量を大幅に同上させることが可能となり、連続操業も可
能になる。When the substrate and the product of the microbial conversion reaction are hydrophobic, the reaction product is accumulated at a high concentration in the organic liquid layer. Thus, according to the method of the present invention, the frequency of contact between the immobilized bacterial cell phase and the substrate is dramatically increased by collecting the reaction product accumulated in the organic liquid layer and supplementing the substrate. It is possible to increase the reaction rate, yield, and yield substantially the same, and continuous operation becomes possible.
【0038】一方、微生物変換反応の基質が疎水性で反
応生成物が親水性の場合は、反応生成物は親水性担体内
部の水層側に蓄積される。この場合、反応生成物が増殖
菌体に対して毒性を有すれば、生成物阻害を防ぐため、
水層側の蓄積生成物を回収する工夫、例えば、膜状担体
の片面のみに微生物菌体を増殖させ、増殖面を有機液層
側、反対面を水層側に接触させて、生成物を水層側より
回収する方法等を行なうことが望ましい。ただし、生成
物が毒性を有しない場合であっても、この方法で微生物
変換反応を行なってもよく、それにより生成物を水層側
から回収することができる。On the other hand, when the substrate for the microbial conversion reaction is hydrophobic and the reaction product is hydrophilic, the reaction product is accumulated inside the hydrophilic carrier on the side of the aqueous layer. In this case, if the reaction product is toxic to the growing cells, in order to prevent product inhibition,
A device to collect accumulated products on the water layer side, for example, by growing microbial cells on only one side of the membranous carrier, contacting the growth surface with the organic liquid layer side and the opposite surface with the water layer side, It is desirable to use a method such as recovery from the water layer side. However, even if the product is not toxic, the microbial conversion reaction may be carried out by this method, whereby the product can be recovered from the aqueous layer side.
【0039】本発明に従う固定化増殖菌体相に基質とし
ての有機化合物を接触せしめる微生物変換反応は、従来
の基質をエマルジョン系にした微生物変換反応に比し、
基質濃度を10倍以上、場合によっては100倍以上に
設定することが可能であり、基質分散と酸素供給のため
にはげしい通気と撹拌を行なう必要もなく、高い反応速
度と高収量で反応生成物を得ることができる等、工業的
に有利な種々の利点が得られる。The microbial conversion reaction in which an organic compound as a substrate is brought into contact with the immobilized vegetative bacterial cell phase according to the present invention is compared with a conventional microbial conversion reaction in which an emulsion system is used as a substrate,
It is possible to set the substrate concentration 10 times or more, and in some cases 100 times or more, without the need for vigorous aeration and agitation for substrate dispersion and oxygen supply, and the reaction product with high reaction rate and high yield. Can be obtained, and various industrially advantageous advantages can be obtained.
【0040】[0040]
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
でない。なお、部及び%は重量基準である。EXAMPLES The present invention will now be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. Parts and% are based on weight.
【0041】実施例 1 密栓可能なガラスビン(20ml容)にポリプペトン1
%、酵母エキス0.2%、硫酸マグネシウム0.1%及
び寒天1.5%よりなる寒天培地(pH7.0)を8m
lづつ分注し、高圧蒸気滅菌、冷却して寒天平板を調製
した。これに下記表1に示すような各種微生物を爪楊枝
を用いて植菌し、5、10、15、20、25、30%
の各濃度の四塩化炭素/ノルマルパラフィン溶液を深さ
2〜3mmになるように重層し、30℃で3日間静置培
養した。培養後、重層していないものを比較として用
い、各四塩化炭素濃度での微生物の増殖による固定化菌
体層の形成の有無をコロニー形成で判定する方法によっ
て確認した。その結果を下記表1に示す。Example 1 A glass bottle (20 ml capacity) which can be tightly closed was placed in polyppetone 1
%, Yeast extract 0.2%, magnesium sulfate 0.1%, and agar 1.5%, agar medium (pH 7.0 ) of 8 m
Each aliquot was dispensed, sterilized by high pressure steam and cooled to prepare an agar plate. Various microorganisms as shown in the following Table 1 were inoculated to this using a toothpick, and 5, 10, 15, 20, 25, 30%
The carbon tetrachloride / normal paraffin solution of each concentration was overlaid to a depth of 2 to 3 mm, and static culture was performed at 30 ° C. for 3 days. After culturing, those without overlay were used as a comparison, and the presence or absence of the formation of the immobilized cell layer due to the growth of the microorganism at each carbon tetrachloride concentration was confirmed by the method of determining the colony formation. The results are shown in Table 1 below.
【0042】表1に見られるように、シュードモナス属
では10〜25%、アリスロバクター属では10〜20
%、バチルス属では20%、その他の細菌群でも5〜1
5%という高い四塩化炭素濃度下で固定化菌体相の形成
が確認された。As can be seen in Table 1, 10-25% in the genus Pseudomonas and 10-20% in the genus Arythrobacter.
%, 20% in the genus Bacillus, 5-1 in other bacterial groups
The formation of an immobilized bacterial cell phase was confirmed under a high carbon tetrachloride concentration of 5%.
【0043】[0043]
【表1】 [Table 1]
【0044】実施例 2 実施例1と同じ方法で下記表2に示すような各種微生物
について、固/液界面におけるトルエンの毒性に対する
保護作用を検討した。その結果、シュードモナス属で1
0〜25%、アリスロバクター属で10〜20%、バチ
ルス属で10〜15%、その他の微生物でも5〜25%
という非常に高い濃度でトルエンが添加可能であること
が確認された。Example 2 In the same manner as in Example 1, various microorganisms shown in Table 2 below were examined for their protective effects against the toxicity of toluene at the solid / liquid interface. As a result, 1 in Pseudomonas
0-25%, Arislovobacter genus 10-20%, Bacillus genus 10-15%, other microorganisms 5-25%
It was confirmed that toluene can be added at a very high concentration.
【0045】[0045]
【表2】 [Table 2]
【0046】実施例 3 塩化カルシウム水溶液で凝固させたアルギン酸カルシウ
ム板を、実施例1で用いたと同じ培地組成に塩化カルシ
ウムを1%含む液体培地に浸漬してゲル内部を培地で置
換した後、下記表3に示す微生物を爪楊枝を用いて植菌
した。これに5、10、15、20、25、30%の各
濃度のスチレン/ノルマルパラフィン溶液を深さ2〜3
mmになるように重層し、30℃で5日間静置培養し
た。培養後、コロニー形成の判定によって微生物の増殖
による固定化菌体相の形成を確認した。その結果を下記
表3に示すが、シュードモナス属で10〜25%、アリ
スロバクター属で15〜25%、バチルス属で15〜3
0%、その他の微生物でも5〜25%のスチレンに対す
る耐性が確認された。Example 3 A calcium alginate plate coagulated with an aqueous solution of calcium chloride was immersed in a liquid medium containing 1% of calcium chloride in the same medium composition as used in Example 1 to replace the inside of the gel with the medium. The microorganisms shown in Table 3 were inoculated with a toothpick. A styrene / normal paraffin solution having each concentration of 5, 10, 15, 20, 25, and 30% was added to this to a depth of 2-3.
The cells were layered so that the thickness became mm, and static culture was performed at 30 ° C. for 5 days. After culturing, formation of an immobilized bacterial cell phase due to growth of microorganisms was confirmed by judging colony formation. The results are shown in Table 3 below. 10 to 25% of Pseudomonas, 15 to 25% of Alislovobacter, and 15 to 3 of Bacillus.
The resistance to styrene was confirmed to be 0%, and 5 to 25% for other microorganisms.
【0047】[0047]
【表3】 [Table 3]
【0048】実施例 4 薄層クロマトグラフィー用のシリカゲルプレートの切片
に実施例1で用いたと同じ組成の液体培地を含浸させた
後、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus
equi)JCM 6817、バチルス・ズブチリス・
サブスピーシス・ニーガー(Bacillus sub
tilis subsp.niger)IFO3108
及びハンゼヌラ・サーチュールナス(Hansenul
a saturnus)IFO 0809の培養液を塗
沫し、これらに5、10、15、20、25、30%の
各濃度のエチルベンゼン/ノルマルパラフィン溶液を植
菌した。30℃にて7日間静培養した後、固定化菌体相
の形成をコロニー形成の有無で確認した。その結果、J
CM6817で20%、IF03108で30%IFO
0809で10%のエチルベンゼン濃度でコロニー形成
が確認された。Example 4 A section of a silica gel plate for thin layer chromatography was impregnated with a liquid medium having the same composition as used in Example 1, and then Rhodococcus equi (Rhodococcus) was used.
equi) JCM 6817, Bacillus subtilis
Sub-Spithesis Nieger (Bacillus sub
tilis subsp. niger) IFO3108
And Hansenula Sir Chu Le eggplant (Hansenul
a saturnus) IFO 0809 culture medium was smeared, and these were inoculated with ethylbenzene / normal paraffin solutions having respective concentrations of 5, 10, 15, 20, 25, and 30%. After static culturing at 30 ° C. for 7 days, the formation of the immobilized bacterial cell phase was confirmed by the presence or absence of colony formation. As a result, J
CM6817 20%, IF03108 30% IFO
With 0809, colony formation was confirmed at an ethylbenzene concentration of 10%.
【0049】比較例 1 実施例1で試験に供した微生物のうち、シュードモナス
属、(IFO 13696)、アリスロバクター属(J
CM 1363)、(IFO 12959)およびバチル
ス属(IFO 3108)、(IFO 14357)の計
5株について、エマルジョン系での四塩化炭素の毒性試
験を行った。実施例1で用いたと同じ組成の液体培地に
該微生物の1日培養液を1%レベルで植菌し、これに四
塩化炭素を0.5、1.0、1.5、2.0%となるように
添加して、30℃で2日間振盪培養した。培養後波長6
60nmの吸光度測定により、増殖の有無を確認した。
その結果、いずれの株においても、四塩化炭素濃度、
1.0%以上では増殖し得ないことが確認された。Comparative Example 1 Of the microorganisms tested in Example 1, Pseudomonas spp. (IFO 13696), Arislovobacter spp. (J
CM 1363), (IFO 12959) and Bacillus (IFO 3108), (IFO 14357), a total of 5 strains, were subjected to a toxicity test of carbon tetrachloride in an emulsion system. A liquid culture medium having the same composition as that used in Example 1 was inoculated with a 1-day culture solution of the microorganism at a 1% level, and carbon tetrachloride was added thereto at 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0%. The resulting mixture was added as described above and cultured at 30 ° C. for 2 days with shaking. Wavelength 6 after culture
The presence or absence of proliferation was confirmed by measuring the absorbance at 60 nm.
As a result, in all the strains, carbon tetrachloride concentration,
It was confirmed that it could not grow at 1.0% or more.
【0050】比較例 2 実施例2で供した微生物のうち、シュードモナス属(I
FO 3238)、(IFO 13696),アリスロバ
クター属(JCM 1363)、(IFO 1295
9)、バチルス属(IFO 3108)、(IFO 14
357)コリネバクテリウム属(IFO 1268
4)、(IFO 14136)およびサッカロマイセス
属(IFO 1346))の計9株について、エマルジ
ョン系でのトルエンの毒性試験を行った。方法は比較例
1に準じた。その結果、いずれの微生物でもトルエン濃
度1.0%以上では増殖が確認されなかった。Comparative Example 2 Among the microorganisms used in Example 2, Pseudomonas sp.
FO 3238), (IFO 13696), genus Arislovobacter (JCM 1363), (IFO 1295)
9), Bacillus (IFO 3108), (IFO 14
357) Corynebacterium (IFO 1268
4), (IFO 14136) and Saccharomyces (IFO 1346)), a total of 9 strains were subjected to a toxicity test of toluene in an emulsion system. The method was according to Comparative Example 1. As a result, no growth was confirmed in any of the microorganisms at a toluene concentration of 1.0% or more.
【0051】実施例 5 リパーゼ生産菌のシュードモナス・フラジIFO 34
58を表面積38cm2の栄養寒天平板上にコンラージ
棒を用いて塗抹し、その上に40%のカプリル酸エチル
のノルマルパラフィン(炭素数10〜15のメタン系炭
化水素溶媒)溶液5mlを重層し、室温で5日間静置培
養し、寒天担体上に固定化菌体相を形成させ、カプリル
酸エチルの加水分解を行なった。培養後、ノルマルパラ
フィン層をガスクロマトグラフで分析し、4.9g/l
のカプリル酸の生成を確認した。Example 5 Pseudomonas fradi IFO 34, a lipase-producing bacterium
58 was smeared on a nutrient agar plate having a surface area of 38 cm 2 using a conradi stick, and 5 ml of a 40% solution of ethyl caprylate in normal paraffin (a methane hydrocarbon solvent having 10 to 15 carbon atoms) was overlaid thereon. After stationary culture at room temperature for 5 days, an immobilized bacterial cell phase was formed on an agar carrier, and ethyl caprylate was hydrolyzed. After culturing, the normal paraffin layer was analyzed by gas chromatography and found to be 4.9 g / l.
The production of caprylic acid was confirmed.
【0052】実施例 6 表面積1600cm2(20×40cm)のヒダ折濾紙
の折線を縦にして、反応槽(リアクター)に入れ、リパ
ーゼ生産菌のシュードモナス・フラジIFO12049
の1昼夜培養液200mlを注ぎ込み、5分間放置して
菌体を濾紙に付着させた。次に、培養液を除き、菌体を
含まない培地20mlを反応槽底部に入れ、上層にカプ
リル酸エチル150mlを注入し、反応槽に空気を導入
しながら30℃で3日間培養し、濾紙上に固定化菌体相
を形成させ、カプリル酸エチルの加水分解を行なった。
培養終了後カプリル酸エチル層を採集し、ガスクロマト
グラフでカプリル酸を定量した。結果を後記表4に示
す。Example 6 Folded folding filter paper having a surface area of 1600 cm 2 (20 × 40 cm) was placed vertically in a reaction tank (reactor), and a lipase-producing bacterium Pseudomonas fradi IFO 12049 was used.
200 ml of the culture solution for 1 day and night was poured, and the mixture was left for 5 minutes to attach the bacterial cells to the filter paper. Then, the culture solution was removed, 20 ml of a culture medium containing no bacterial cells was placed in the bottom of the reaction tank, 150 ml of ethyl caprylate was injected into the upper layer, and the mixture was cultured at 30 ° C. for 3 days while introducing air into the reaction tank, and then filtered. An immobilized bacterial cell phase was formed on and hydrolyzed with ethyl caprylate.
After completion of the culture, the ethyl caprylate layer was collected, and caprylic acid was quantified by gas chromatography. The results are shown in Table 4 below.
【0053】比較例 3 実施例6で用いた反応槽(ただし濾紙を除く)にリパー
ゼ生産菌シュードモナス・フラジIFO 12049の
1昼夜培養液200mlを入れ、カプリル酸エチルを基
質濃度5%となる様に加え、反応槽に空気を導入しなが
ら懸濁分散し、3日間培養した。培養後、カプリル酸エ
チル層を分離し、ガスクロマトグラフでカプリル酸の定
量を行なった。結果を下記表4に示す。Comparative Example 3 200 ml of a one-day culture solution of the lipase-producing bacterium Pseudomonas fradi IFO 12049 was placed in the reaction tank (excluding filter paper) used in Example 6 so that ethyl caprylate had a substrate concentration of 5%. In addition, the reaction mixture was suspended and dispersed while introducing air into the reaction tank, and cultured for 3 days. After culturing, the ethyl caprylate layer was separated, and caprylic acid was quantified by gas chromatography. The results are shown in Table 4 below.
【0054】[0054]
【表4】 [Table 4]
【0055】実施例 7 中鎖脂肪族アルコールの酸化菌であるグルコノバクター
・オキシダンスIFO3189による末端カルビノール
基酸化反応を検討した。グルコノバクター・オキシダン
スIFO 3189の1昼夜培養液200ml中にアル
ギン酸カルシウムビーズ10gを投入し、5分間静置し
てビーズ表面に微生物菌体を付着させた。その後、ビー
ズを培養液から引き上げ、余分な水分を除いた後、ノル
マルパラフィン150mlの入った実施例2の反応槽
(ただし濾紙を除く)にビーズを投入し、1昼夜通気下
に培養して、ビーズ表面に固定化菌体相を形成させた。
次いでノルマルオクタノールを5%となる様に添加し、
通気を続けながら30℃で5日間培養し、オクタノール
の酸化反応を行なった。培養後、ノルマルパラフィン中
のオクチル酸濃度をガスクロマトグラフで分析した。結
果を後記表5に示す。 比較例 4 実施例7で用いた反応槽(ただし濾紙を除く)にグルコ
ノバクター・オキシダンスIFO 3189の1昼夜培
養液200mlを入れ、基質濃度が0.5%となる様に
10%ノルマルオクタノールを含むノルマルパラフィン
を添加して、反応槽に空気を導入しながら懸濁分散し、
30℃で5日間培養した。培養後、ノルマルパラフィン
層を分離し、ガスクロマトグラフでオクチル酸の分析を
行なった。結果を下記表5に示す。Example 7 The oxidation reaction of a terminal carbinol group by Gluconobacter oxidans IFO3189, which is an oxidizing bacterium of medium chain fatty alcohol, was examined. 10 g of calcium alginate beads was added to 200 ml of a culture solution of Gluconobacter oxydans IFO 3189 for one day, and left standing for 5 minutes to attach microbial cells to the surface of the beads. After that, the beads were taken out of the culture solution to remove excess water, and then the beads were put into the reaction tank of Example 2 (excluding filter paper) containing 150 ml of normal paraffin, and cultured under aeration for one day. An immobilized bacterial cell phase was formed on the surface of the beads.
Then add normal octanol to 5%,
The cells were cultured at 30 ° C. for 5 days while continuing aeration to carry out an octanol oxidation reaction. After culturing, the concentration of octylic acid in normal paraffin was analyzed by gas chromatography. The results are shown in Table 5 below. Comparative Example 4 200 ml of a one-day culture solution of Gluconobacter oxidans IFO 3189 was placed in the reaction tank (excluding filter paper) used in Example 7, and 10% normal octanol was added so that the substrate concentration became 0.5%. Normal paraffin containing is added and suspended and dispersed while introducing air into the reaction tank,
It was cultured at 30 ° C for 5 days. After culturing, the normal paraffin layer was separated and analyzed for octylic acid by gas chromatography. The results are shown in Table 5 below.
【0056】[0056]
【表5】 [Table 5]
【0057】実施例 8 リパーゼ生産菌であるシュードモナス・フラジIFO
12049、シュードモナス・フルオレッセンスIFO
3903及びバチルス・ズブチリス・サブスピーシス
・ニーガーIFO 3108をそれぞれ密栓可能なガラ
スビン内で調製したポリペプトン10g、酵母エキス2
g、硫酸マグネシウム1g、寒天15g及び蒸留水1l
よりなる寒天平板150ml(pH7.0、表面積44
cm2)上にコンラージ棒を用いて植菌し、その上に酢
酸2‐エチルヘキシルを10ml重層して1日間静置培
養により増殖させ、寒天担体上に固定化菌体相を形成さ
せた。その後、30℃、70rpmで5日間振盪培養す
ることにより酢酸2‐エチルヘキシルの加水分解反応を
実施した。培養後、酢酸2‐エチルヘキシル層をガスク
ロマトグラフィーにより分析し、下記表6に示す結果を
得た。Example 8 Pseudomonas fradi IFO which is a lipase-producing bacterium
12049, Pseudomonas fluorescens IFO
3903 and Bacillus subtilis subsposis niger IFO 3108 each prepared in a glass bottle capable of sealing, 10 g of polypeptone, yeast extract 2
g, magnesium sulfate 1 g, agar 15 g and distilled water 1 l
Agar plate consisting of 150 ml (pH 7.0, surface area 44
cm 2 ) was inoculated with a conradi rod, 10 ml of 2-ethylhexyl acetate was layered thereon and allowed to grow by static culture for 1 day to form an immobilized bacterial cell phase on the agar carrier. Then, 2-ethylhexyl acetate was hydrolyzed by shaking culture at 30 ° C. and 70 rpm for 5 days. After culturing, the 2-ethylhexyl acetate layer was analyzed by gas chromatography, and the results shown in Table 6 below were obtained.
【0058】比較例 5 実施例8で用いたリパーゼ生産菌の1昼夜培養液を10
%レベルで実施例8と同様の組成(ただし寒天は除く)
の液体培地に植菌し、基質阻害を回避するために酢酸2
‐エチルヘキシルを10%レベルで添加した。これを3
0℃、120rpmで5日間振盪培養した後、有機溶媒
層をガスクロマトグラフィーにより分析した。その結果
を下位表6に示す。Comparative Example 5 10 day-and-night culture solution of the lipase-producing bacterium used in Example 8 was used.
% Composition similar to that of Example 8 (except agar)
Acetic acid 2 to avoid substrate inhibition.
-Ethylhexyl was added at the 10% level. This 3
After culturing with shaking at 0 ° C. and 120 rpm for 5 days, the organic solvent layer was analyzed by gas chromatography. The results are shown in Table 6 below.
【0059】[0059]
【表6】 [Table 6]
【0060】実施例 9 各種アルコールの酸化能を有するシュードモナス・プチ
ダIFO 13696及びロドコッカス・ロドニーJC
M 3203そそれぞれ実施例8と同様の組成(ただし
寒天を除く)の液体培地を含浸させた濾過板(アドバン
テック製、厚さ3mm、44cm2)上に植菌し、これ
に10%2‐オクタノールを含むノルマパラフィン溶液
を10ml重層して、5日間30℃で静置培養し、濾過
板上に固定化菌体相を形成させた。培養後、ノルマルパ
ラフィン層をガスクロマトグラフィーによって分析し、
IFO 13696で4.4g/l、JMC 3203で
0.6g/lの2‐オクタノンの蓄積を確認した。Example 9 Pseudomonas putida IFO 13696 and Rhodococcus rodney JC capable of oxidizing various alcohols
M 3203 was inoculated on a filter plate (manufactured by Advantech, thickness 3 mm, 44 cm 2 ) impregnated with a liquid medium having the same composition as in Example 8 (except for agar), and 10% 2-octanol was added thereto. 10 ml of a normal paraffin solution containing the above was layered and statically cultured at 30 ° C. for 5 days to form an immobilized bacterial cell phase on the filter plate. After culturing, the normal paraffin layer was analyzed by gas chromatography,
Accumulation of 4.4 g / l of 2-octanone with IFO 13696 and 0.6 g / l of JMC 3203 was confirmed.
【0061】実施例 10 カルボニル基の還元能を有するサッカロマイセス・ユバ
リウムJFO0565及びロデロマイセス・エロンギス
ポラスIFO 1676をそれぞれ々ペプトン5g、酵
母エキス3g、麦芽エキス3g、グルコース10g及び
蒸留水11よりなる液体培地(pH6.0)を含浸させ
たシリカゲルプレート上に植菌し、これに10%2−オ
クタノンを含むイソオクタン溶液を10ml重層して、
5日間30℃で静置培養し、シリカゲルプレート上に固
体化菌体相を形成させた。培養後、イソオクタン層をガ
スクロマトグラフィーによって分析し、IFO 056
5で1.6g/1、1FO 1676 で1.5g/1
の2−オクタノールの蓄積を確認した。[0061] Example 10 carbonyl groups each s peptone 5g Saccharomyces Yu Ba <br/> potassium JFO0565 and Roderomaisesu-Erongisuporasu IFO 1676 having reducing ability of yeast extract 3g, malt extract 3g, from glucose 10g and distilled water 11 On a silica gel plate impregnated with a liquid medium (pH 6.0), and 10 ml of an isooctane solution containing 10% 2-octanone was layered thereon,
After static culture for 5 days at 30 ° C., a solid bacterial cell phase was formed on a silica gel plate. After incubation, the isooctane layer was analyzed by gas chromatography, IFO 056
5 g at 1.6 g / 1, 1FO 1676 at 1.5 g / 1
Accumulation of 2-octanol was confirmed.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:06 1:15 1:365 1:05 1:72 1:78 1:66) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical indication C12R 1:06 1:15 1: 365 1:05 1:72 1:78 1:66)
Claims (3)
該微生物の栄養源を含む水性媒体の存在下に、実質的に
水に不溶性ないし難溶性の有機溶媒を該担体上の該微生
物に接触させ、担体と有機溶媒との接触界面で該微生物
を増殖させ、該担体上に固定化菌体相を形成させること
を特徴とする微生物の固定化法。1. A microorganism is attached to a hydrophilic immobilization carrier,
In the presence of an aqueous medium containing a nutrient source for the microorganism, a substantially water-insoluble or sparingly soluble organic solvent is contacted with the microorganism on the carrier, and the microorganism is grown at the contact interface between the carrier and the organic solvent. And a method for immobilizing a microorganism, which comprises forming an immobilized bacterial cell phase on the carrier.
し、基質としての実質的に水に不溶性ないし難溶性の有
機化合物を、該微生物の栄養源を含む水性媒体の存在下
に、該担体上の固定化菌体相と接触せしめることを特徴
とする有機化合物の変換方法。2. A hydrophilic immobilization carrier on which a microorganism is adhered and immobilized, and a substantially water-insoluble or sparingly soluble organic compound as a substrate is added to the carrier in the presence of an aqueous medium containing a nutrient source for the microorganism. A method for converting an organic compound, which comprises contacting with the above immobilized cell phase.
化を請求項1記載の方法により行なう請求項2記載の方
法。3. The method according to claim 2, wherein the microorganisms are adhered and immobilized on the hydrophilic immobilization carrier by the method according to claim 1.
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JP6579544B2 (en) * | 2015-07-02 | 2019-09-25 | 学校法人金沢工業大学 | Substance conversion method, bioreactor manufacturing method, bioreactor |
-
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- 1992-01-31 JP JP4060892A patent/JP2542766B2/en not_active Expired - Lifetime
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