JP2535583B2 - Mutant Escherichia coli ribonuclease H - Google Patents
Mutant Escherichia coli ribonuclease HInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、酵素活性を改良された変異大腸菌リボヌク
レアーゼH、該変異酵素をコードしている遺伝子、該遺
伝子を含有し、大腸菌内で発現可能は発現ベクター、該
発現ベクターを含有している形質転換体および該形質転
換体を用いて変異大腸菌リボヌクレアーゼHを製造する
方法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Field of Industrial Application] The present invention provides a mutant Escherichia coli ribonuclease H with improved enzyme activity, a gene encoding the mutant enzyme, and a gene containing the gene, which can be expressed in E. coli. Relates to an expression vector, a transformant containing the expression vector, and a method for producing a mutant Escherichia coli ribonuclease H using the transformant.
[従来技術とその問題点] 大腸菌のリボヌクレアーゼH(以下、本明細書中では
単にリボヌクレアーゼHと称する)は155アミノ酸から
なる分子量約17Kdの加水分解酵素であって、DNA・RNAハ
イブリッドのRNA鎖のみを特異的にエンド作用で切断す
るという基質特異性を有する。そのような基質特異性に
基づき、近年その発達の著しい遺伝子工学において、下
記の如き様々な作用を有する酵素として極めて利用価値
の高い酵素として注目されている。[Prior Art and Problems Thereof] Escherichia coli ribonuclease H (hereinafter, simply referred to as ribonuclease H in the present specification) is a hydrolase consisting of 155 amino acids and having a molecular weight of about 17 Kd. It has the substrate specificity that it specifically cleaves by endo action. Based on such substrate specificity, in recent years, in genetic engineering, which has undergone remarkable development, it has been attracting attention as an enzyme having an extremely high utility value as an enzyme having various actions as described below.
1)cDNAのクローニングの際の鋳型mRNAの除去。1) Removal of template mRNA during cloning of cDNA.
2)mRNAのポリA領域の除去。2) Removal of the poly A region of mRNA.
3)RNAの断片化。3) Fragmentation of RNA.
本酵素の重要性は遺伝子工学の発展に伴ってますます
増大すると確信される。該酵素は、大腸菌内での産生量
が極めて低いことから、遺伝子工学によるクローン化酵
素が製造され、既にBRL、ファルマシアおよび宝酒造等
から供給されている。しかし、これらの市販のクローン
化酵素も、生産性が低い上、単離、精製工程中の損失お
よび失活等によって収率が低く、高価なものとなってい
る。従って、上記の様々な研究を推し進める上で有用な
酵素活性を有するリボヌクレアーゼHが入手し易くなる
ことが強く望まれている。It is believed that the importance of this enzyme will increase with the development of genetic engineering. Since the production amount of this enzyme in E. coli is extremely low, a cloned enzyme by genetic engineering has been produced and already supplied from BRL, Pharmacia, Takara Shuzo and the like. However, these commercially available cloned enzymes also have low productivity and are expensive due to low yield due to loss and inactivation during the isolation and purification steps. Therefore, it is strongly desired that ribonuclease H having an enzymatic activity useful for promoting the above-mentioned various studies be easily available.
一般に、酵素の有効量はその量の多少に拘わらず、触
媒活性の高低に基づいて判断される。従って、酵素の比
活性を高めれば、実質上、酵素供給量が増大されたこと
になる。ところで、酵素、抗体等のタンパク質の機能を
変化させるために、それらのタンパク質をコードしてい
るDNA配列に突然変異を誘発してアミノ酸配列を改変す
る方法がしばしば用いられる。そのような操作の結果、
基質特異性および/または抗原との結合性を改良された
抗体、基質特異性や至適PHの変化した酵素、熱安定性を
改良された酵素等が得られている。しかしながら触媒活
性を増大された酵素が得られたという例は殆どなく、リ
ボヌクレアーゼHについても、本発明以前にそのような
報告はなれていない。Generally, the effective amount of an enzyme is judged based on the level of catalytic activity, regardless of the amount of the enzyme. Therefore, if the specific activity of the enzyme is increased, the enzyme supply amount is substantially increased. By the way, in order to change the functions of proteins such as enzymes and antibodies, a method of inducing mutation in the DNA sequences encoding these proteins to modify the amino acid sequence is often used. As a result of such an operation,
Antibodies with improved substrate specificity and / or antigen binding, enzymes with altered substrate specificity and optimal PH, enzymes with improved thermostability, etc. have been obtained. However, there are almost no examples in which an enzyme having an increased catalytic activity was obtained, and no such report has been made for ribonuclease H before the present invention.
従って、比活性の高められた、変異型のリボヌクレア
ーゼHを得ることができれば、実質上、該酵素の供給量
が増大されたことになる。しかも、変異リボヌクレアー
ゼH精製標品には、天然型のリボヌクレアーゼHに通常
伴っているヌクレアーゼ等の夾雑タンパク質の混入が少
ないので、酵素試薬としてより高品質の精製標品の調製
が可能になるといえる。即ち、高比活性の酵素を得るこ
とによって、高品質の酵素標品を安価に供給することが
できることになる。Therefore, if it is possible to obtain a mutant ribonuclease H having an increased specific activity, it means that the supply amount of the enzyme is substantially increased. In addition, since the purified sample of mutant ribonuclease H is less contaminated with contaminating proteins such as nucleases normally associated with natural ribonuclease H, it can be said that a purified sample of higher quality can be prepared as an enzyme reagent. That is, by obtaining an enzyme having a high specific activity, a high quality enzyme preparation can be supplied at a low cost.
[問題点を解決するための手段] 本発明者らは、上記の観点から、リボヌクレアーゼH
の触媒活性を高めることを目的として、該酵素の遺伝子
に部位特異的突然変異を導入して様々なアミノ酸置換を
有する変異体を調製し、その酵素活性への影響を検討し
た結果、第13番目のCys(システイン)がSer(セリン)
で置換されたアミノ酸配列を有する変異リボヌクレアー
ゼHが、天然型のリボヌクレアーゼHの約2倍の活性を
有することを見出し、本発明を完成するに至った。[Means for Solving Problems] From the above viewpoints, the present inventors have found that ribonuclease H
For the purpose of enhancing the catalytic activity of the enzyme, site-specific mutation was introduced into the gene of the enzyme to prepare mutants having various amino acid substitutions, and the effect on the enzyme activity was examined. Cys (Cysteine) is Ser (Serine)
The present inventors have found that the mutant ribonuclease H having the amino acid sequence substituted with is about twice as active as the natural ribonuclease H, and completed the present invention.
即ち、本発明は、第13番目のシステインがセリンで置
換されたアミノ酸配列を有する変異リボヌクレアーゼH
を提供するものである。That is, the present invention provides a mutant ribonuclease H having an amino acid sequence in which the 13th cysteine is replaced with serine.
Is provided.
また本発明は、リボヌクレアーゼH構造遺伝子のCys
13をコードしているTGTが部位特異的突然変異によってS
erをコードしているTCTに変換されている。変異リボヌ
クレアーゼH遺伝子を提供するものである。The present invention also provides Cys of the ribonuclease H structural gene.
TGT, which encodes 13 , was transformed into S by site-directed mutagenesis.
has been converted to a TCT encoding er. It provides a mutant ribonuclease H gene.
また本発明は変異リボヌクレアーゼHを大腸菌で発現
させるための発現ベクターであって、tacプロモーター
の支配下に上記変異リボヌクレアーゼH遺伝子を含有し
ているベクターを提供するものである。本発明の発現ベ
クターは、プラスミドpUC18由来の複製起源を含有して
いるので、大腸菌内で複製可能である。The present invention also provides an expression vector for expressing mutant ribonuclease H in Escherichia coli, the vector containing the mutant ribonuclease H gene under the control of the tac promoter. Since the expression vector of the present invention contains the origin of replication derived from the plasmid pUC18, it can replicate in E. coli.
また本発明は、上記の発現ベクターで形質転換され
た、変異リボヌクレアーゼH産生性の形質転換体を提供
するものである。The present invention also provides a mutant ribonuclease H-producing transformant transformed with the above expression vector.
さらに本発明は、該形質転換体を培養することによっ
て、高いリボヌクレアーゼH酵素活性を有する変異リボ
ヌクレアーゼHを製造する方法を提供するものである。Further, the present invention provides a method for producing a mutant ribonuclease H having a high ribonuclease H enzyme activity by culturing the transformant.
本発明の変異リボヌクレアーゼHをコードしている遺
伝子は、以下の工程に従って得られた。The gene encoding the mutant ribonuclease H of the present invention was obtained according to the following steps.
1)リボヌクレアーゼH構造遺伝子(rnh)のM13mp18RF
DNAへのサブクローニング rnh遺伝子は、本発明者等(カナヤおよびクラウチ、
ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー、25
8、1276−1281[1983])によって大腸菌染色体からク
ローニングされている。このクローン化されたプラスミ
ドpSK750をrnh遺伝子の供給源として用い、第1図記載
の行程に従ってM13mp18RFDNAにサブクローニングする。1) M13mp18RF of ribonuclease H structural gene (rnh)
Subcloning into DNA The rnh gene was cloned by the inventors (Kanaya and Crouch,
Journal of Biological Chemistry, 25
8 , 1276-1281 [1983]). This cloned plasmid pSK750 is used as a source of the rnh gene and subcloned into M13mp18RF DNA according to the procedure described in FIG.
まず、プラスミドpSK750の820bpEcoRI−PstI断片を切
り出し、該断片を市販のプラスミドpUC19のEcoRI−PstI
部位に挿入し、プラスミドpSK820を得る。このプラスミ
ドpSK820を制限酵素HgiAIで切断してrnh遺伝子を含む80
1bpHgiAI断片を得、T4DNAポリメラーゼ処理によって
3′突出部分を平滑末端化した後、市販のプラスミドpU
C18のSmaI部位に挿入する。rnh遺伝子の向きがプラスミ
ドpUC18のlacプロモーターと逆向きのものを選択してプ
ラスミドpKS801と命名し、以後の実験に用いる。First, a 820 bp EcoRI-PstI fragment of plasmid pSK750 was cut out, and the fragment was cut into commercially available plasmid pUC19, EcoRI-PstI.
Insert at the site to obtain plasmid pSK820. This plasmid pSK820 was digested with the restriction enzyme HgiAI and contained the rnh gene.
1bpHgiAI fragment was obtained, the 3'overhang was blunt-ended by treatment with T4 DNA polymerase, and then commercially available plasmid pU
Insert at the SmaI site of C18. The rnh gene whose orientation is opposite to that of the lac promoter of the plasmid pUC18 is selected and named plasmid pKS801, which will be used in the subsequent experiments.
プラスミドpKS801からrnh遺伝子を含む600bpEcoRI−P
stI断片を切り出し、市販のM13mp18RFDNAのEcoRI−PstI
部位に挿入してM13mp18(rnh)RFDNAを作成する。M13mp
18(rnh)RFDNAの組み立て模式図を第1図に示す。600 bp EcoRI-P containing rnh gene from plasmid pKS801
The stI fragment was cut out and EcoRI-PstI of commercially available M13mp18RFDNA
Insert into the site to create M13mp18 (rnh) RF DNA. M13mp
A schematic diagram of the assembly of 18 (rnh) RF DNA is shown in FIG.
2)rnh遺伝子への部位特異的突然変異の導入 上記のM13mp18(rnh)RFDNAで大腸菌TG−1を形質転
換し、得られた形質転換体を培養する。その上清から常
法に従ってM13mp18(rnh)環状1本鎖DNAを調製する。
このM13mp18(rnh)環状1本鎖DNAを、化学合成した25m
er(量体)のオリゴヌクレオチドと混合し、エックスタ
インら(Eckstein)の方法(Taylor,J.W.,Ott,J.and Ec
ketein,F.(1985)ニュークレイック・アシッズ・リサ
ーチ、13、8764−8785)を利用した市販のキット(アマ
ーシャム)を用い、その指示に従って操作し、部位特異
的な点突然変異を導入する。この操作によって、Cys13
のコドンTGTがSerのコドンTCTで置き換えられた変異rnh
遺伝子を有するM13mp18(rnh−13S)RFDNAが得られる
(第2図参照)。以下、この変異rnh遺伝子によってコ
ードされている変異リボヌクレアーゼHを天然型リボヌ
クレアーゼHと区別するためにリボヌクレアーゼH(13
S)と称する。2) Introduction of site-specific mutation into rnh gene Escherichia coli TG-1 is transformed with the above M13mp18 (rnh) RFDNA, and the obtained transformant is cultured. From the supernatant, M13mp18 (rnh) circular single-stranded DNA is prepared according to a conventional method.
25m of this M13mp18 (rnh) circular single-stranded DNA was chemically synthesized.
er (mer) oligonucleotide and mixed with the method of Eckstein et al. (Taylor, JW, Ott, J. and Ec
Using a commercially available kit (Amersham) using ketein, F. (1985) Nucleic Acids Research, 13 , 8674-8785), it operates according to the instruction | indication and introduces a site-specific point mutation. By this operation, Cys 13
Mutation rnh in which the codon TGT of is replaced by the codon TCT of Ser
M13mp18 (rnh-13S) RF DNA carrying the gene is obtained (see FIG. 2). Hereinafter, in order to distinguish the mutant ribonuclease H encoded by this mutant rnh gene from the natural ribonuclease H, ribonuclease H (13
S).
3)リボヌクレアーゼH(13S)発現ベクターの構築 前記のプラスミドpKS801から230bpEcoRI断片を削除
し、同時にSalIリンカーを用いてEcoRI部位をSalI部位
に変換してプラスミドpKS600を得る。次いで、プラスミ
ドpKS600からrnh遺伝子を含む600bpXbaI−SalI断片を切
り出す。該断片を、大腸菌プロテアーゼIII発現用プラ
スミドベクターpDR42S(特許出願番号第62−218973号)
のptr遺伝子を含有する4.3kbXbaI−SalI断片と置換する
ことにより、天然型リボヌクレアーゼH発現用プラスミ
ドpDR600を得る。次いで、このプラスミドpDR600の500b
pXbaI−SalII断片をM13mp18(rnh−13S)RFDNA由来の50
0bpXbaI−SalII断片で置換することにより、本発明のリ
ボヌクレアーゼH(13S)発現用プラスミドpDR601を得
る。プラスミドpDR601の組み立て模式図を第3図に、そ
の制限酵素切断地図を第4図に示す。3) Construction of ribonuclease H (13S) expression vector The 230 bp EcoRI fragment was deleted from the above plasmid pKS801, and at the same time, the EcoRI site was converted into a SalI site using a SalI linker to obtain a plasmid pKS600. Then, a 600 bp XbaI-SalI fragment containing the rnh gene is excised from the plasmid pKS600. The fragment was used as a plasmid vector for expressing Escherichia coli protease III pDR42S (Patent Application No. 62-218973).
By substituting the 4.3 kb XbaI-SalI fragment containing the ptr gene of p. Then this plasmid pDR600 500b
The pXbaI-SalII fragment was cloned from M13mp18 (rnh-13S) RF DNA
Substitution with the 0 bp XbaI-SalII fragment gives the plasmid pDR601 for expressing the ribonuclease H (13S) of the present invention. A schematic diagram of the construction of plasmid pDR601 is shown in FIG. 3, and its restriction enzyme cleavage map is shown in FIG.
4)リボヌクレアーゼH(13S)の大腸菌内での発現 上記のプラスミドpDR601を用いて大腸菌K−12株JM10
9を形質転換し、得られた形質転換体をアンピシリン含
有培地で培養する。対数増殖期にイソプロピルβ−D−
チオガラクトシッド(IPTG)を添加して培養することに
より、リボヌクレアーゼH(13S)を発現させる。4) Expression of ribonuclease H (13S) in Escherichia coli Escherichia coli K-12 strain JM10 was prepared by using the above plasmid pDR601.
9 is transformed, and the obtained transformant is cultured in a medium containing ampicillin. Isopropyl β-D- during logarithmic growth phase
Ribonuclease H (13S) is expressed by adding thiogalactoside (IPTG) and culturing.
次いで、リボヌクレアーゼH(13S)産生性形質転換
体の菌体を集菌し、リゾチーム−EDTA処理および超音波
処理によって可溶化し、遠心して得られた上清を透析し
た後、DEAE−セルロース、P−11セルロースおよびセフ
ァクリルS−300(Super Fine)各カラムクロマトグラ
フィーに順次かけることにより、リボヌクレアーゼH
(13S)の精製標品を調製する。ことによりにして得ら
れリボヌクレアーゼH(13S)は、SDS−PAGEで単一のバ
ンドを与える程度にまで精製されている。上記の方法に
おける天然型リボヌクレアーゼHの混入の程度は、大腸
菌K−12株JM109の通常のリボヌクレアーゼH産生量が
極めて低いことから、極く僅かであると考えられる。所
望の突然変異が導入されていることを、アミノ末端から
アミノ酸の配列決定によって確認した。Then, the cells of the ribonuclease H (13S) -producing transformant were harvested, solubilized by lysozyme-EDTA treatment and ultrasonic treatment, and the supernatant obtained by centrifugation was dialyzed, followed by DEAE-cellulose, P -11 Cellulose and Sephacryl S-300 (Super Fine)
Prepare a purified preparation of (13S). The ribonuclease H (13S) thus obtained is purified to the extent that it gives a single band on SDS-PAGE. The degree of contamination with natural ribonuclease H in the above method is considered to be extremely small because the amount of normal ribonuclease H produced by Escherichia coli K-12 strain JM109 is extremely low. The introduction of the desired mutation was confirmed by amino acid sequencing from the amino terminus.
[発明の作用] 本発明の変異リボヌクレアーゼHは、[32P]poly(rA)p
oly(dT)を基質として測定した場合、天然型リボヌクレ
アーゼHの約2倍の酵素活性を有している。その酵素活
性は、前記の様々な遺伝子の工学の分野で、天然型リボ
ヌクレアーゼHと全く同等に用い得るものである。従っ
て、本発明は、高いリボヌクレアーゼH活性を有する変
異リボヌクレアーゼHを提供することによって、該酵素
活性の供給を増大するものである。[Operation of the Invention] The mutant ribonuclease H of the present invention is [ 32 P] poly (rA) p
When oly (dT) is used as a substrate, it has about twice the enzymatic activity of natural ribonuclease H. Its enzymatic activity can be used in the field of engineering of various genes described above, just like the natural ribonuclease H. Accordingly, the present invention provides a mutant ribonuclease H having a high ribonuclease H activity, thereby increasing the supply of the enzyme activity.
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明す
る。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
実施例1 rnh遺伝子のM13mp18RF DNAへのサブクローニ
ング rnh遺伝子としてpSK750を用いた。プラスミドpSK750
(10μg)を100μlの反応溶液中、50ユニットずつのP
stIとEcoRIにより、37℃で1時間消化した。次いで消化
物を1.5%アガロースゲル電気泳動にかけた。rnh遺伝子
を含む820bp EcoRI−PstI断片をエレクトロエリューシ
ョン(電気溶出)によりアガロースゲルから抽出した
後、DE−52カラムクロマトグラフィーにより精製した。
エタノール沈澱により回収された820bp EcoRI−PstI断
片の量は約1μgであった。一方、プラスミドベクター
pUC19(TOYOBO製)(2μg)を50μlの反応溶液中10
ユニットずつのPstIとEcoRIにより、37℃で1時間完全
に消化した。消化物を0.7%アガロースゲル電気泳動に
かけ。2.7kb EcoRI−PstI断片を820bp断片と同様に溶出
・精製した。回収率はほぼ100%であった。Example 1 Subcloning of the rnh gene into M13mp18RF DNA pSK750 was used as the rnh gene. Plasmid pSK750
(10 μg) in 100 μl reaction solution,
Digested with stI and EcoRI for 1 hour at 37 ° C. The digest was then subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis. The 820 bp EcoRI-PstI fragment containing the rnh gene was extracted from agarose gel by electroelution (electroelution) and then purified by DE-52 column chromatography.
The amount of 820 bp EcoRI-PstI fragment recovered by ethanol precipitation was about 1 μg. On the other hand, plasmid vector
pUC19 (TOYOBO) (2 μg) in 50 μl reaction solution
It was completely digested with each unit of PstI and EcoRI at 37 ° C for 1 hour. The digest is run on 0.7% agarose gel. The 2.7 kb EcoRI-PstI fragment was eluted and purified in the same manner as the 820 bp fragment. The recovery rate was almost 100%.
以上のようにして得られた820bp及び2.7kb EcoRI−Ps
tI断片それぞれ0.1μgを混合し、20μlの反応溶液
中、5ユニットのT4DNAリガーゼ(TOYOBO製)と共に16
℃で30分間反応させ、プラスミドの環化を行なった。次
いで環化したプラスミドで大腸菌JM109を形質転換し、
形質転換体よりプラスミドpSK820を得た。820 bp and 2.7 kb EcoRI-Ps obtained as described above
0.1 µg of each tI fragment was mixed, and 5 units of T4 DNA ligase (manufactured by TOYOBO) were used in 20 µl of the reaction solution to mix with 16 units.
The reaction was carried out at 30 ° C for 30 minutes to circularize the plasmid. E. coli JM109 was then transformed with the circularized plasmid,
Plasmid pSK820 was obtained from the transformant.
次いで、このプラスミドpSK820(10μg)を100μl
反応溶液中、100ユニットのHgiAIにより37℃で1時間消
化した。フェノール−クロロホルム抽出後エタノール沈
澱によりDNAを回収した後、20μlの反応溶液中、2.5ユ
ニットのT4 DNAポリメラーゼを加え、37℃で15分間反応
させた。65℃で5分間処理することにより反応を停止し
た後、反応溶液を1.5%アガロースゲル電気泳動にか
け、rnh遺伝子を含む801bp HgiAI断片を、820bp EcoRI
−PstI断片の場合と同様に溶出・精製した。DNAの回収
量は2μgであった。一方プラスミドベクターpUC18(T
OYOBO製)(2μg)を50μlの反応溶液中、10ユニッ
トのSmaIにより37℃で1時間完全に消化し、次いで1ユ
ニットの大腸菌アルカリ性フォスファターゼを加え、更
に30分間37℃で反応させた。フェノール−クロロホルム
抽出法により反応を停止した後、DNAをエタノール沈澱
により回収した。回収率はほぼ100%であった。Then, 100 μl of this plasmid pSK820 (10 μg)
The reaction solution was digested with 100 units of HgiAI at 37 ° C for 1 hour. DNA was recovered by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation, and then 2.5 units of T4 DNA polymerase was added to 20 μl of the reaction solution, followed by reaction at 37 ° C. for 15 minutes. After stopping the reaction by treating at 65 ° C for 5 minutes, the reaction solution was subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis, and the 801 bp HgiAI fragment containing the rnh gene was treated with 820 bp EcoRI.
-Eluted and purified in the same manner as for the PstI fragment. The recovered amount of DNA was 2 μg. On the other hand, plasmid vector pUC18 (T
(Manufactured by OYOBO) (2 μg) was completely digested with 10 units of SmaI at 37 ° C. for 1 hour in 50 μl of reaction solution, and then 1 unit of Escherichia coli alkaline phosphatase was added and further reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After stopping the reaction by the phenol-chloroform extraction method, the DNA was recovered by ethanol precipitation. The recovery rate was almost 100%.
以上のようにして得られた801bp HgiAI断片と、SmaI
で消化した後、大腸菌アルカリ性フォスファターゼで処
理したpUC18、それぞれ0.1μgを混合し、20μlの反応
溶液中、5ユニットのT4 DNAリガーゼと共に16℃で、30
分間反応させ、プラスミドの環化を行なった。次いで環
化したプラスミドで大腸菌JM109を形質転換し、形質転
換体よりプラスミドpKS801を得た。The 801 bp HgiAI fragment obtained as described above and SmaI
PUC18 treated with Escherichia coli alkaline phosphatase and 0.1 μg each were mixed in 20 μl reaction solution with 5 units of T4 DNA ligase at 16 ° C.
After reacting for minutes, the plasmid was circularized. Next, Escherichia coli JM109 was transformed with the circularized plasmid, and the plasmid pKS801 was obtained from the transformant.
次いで、このプラスミドpKS801(10μg)を100μl
の反応溶液中、50ユニットのEcoRIと50ユニットのPstI
により37℃で1時間、完全消化し、消化物を1.5%アガ
ロースゲル電気泳動にかけた。rnh遺伝子を含む600bpEc
oRI−PstI断片を、820bp EcoRI−PstI断片の場合と同様
に溶出・精製した。DNAの回収量は約1μgであった。
一方、M13mp18RFDNA(タカラ酒造製)2μgを、20μl
の反応溶液中、10ユニットのEcoRIと10ユニットのPstI
により37℃で1時間、完全に消化した。消化物を0.7%
アガロースゲル電気泳動にかけ、7.2kb EcoRI−PstI断
片を820bp EcoRI−PstI断片と同様に溶出・精製した。D
NAの回収量は約1.5μgであった。以上のようにして得
られた600bp及び7.2kb EcoRI−PstI断片をそれぞれ0.1
μgを混合し、20μlの反応溶液中、5ユニットのT4 D
NAリガーゼ(TOYOBO製)と共に、16℃で30分間反応さ
せ、RF DNAの環化を行なった。次いで、環化したRF DNA
で大腸菌TG−1を形質転換し、形質転換体より、M13mp1
8RF DNAにrnh遺伝子が挿入されたM13mp18(rnh)RF DNA
を得た(第1図参照)。Then, 100 μl of this plasmid pKS801 (10 μg)
50 units of EcoRI and 50 units of PstI in the reaction solution of
Was completely digested at 37 ° C for 1 hour and the digest was subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis. 600bp Ec including rnh gene
The oRI-PstI fragment was eluted and purified as in the case of the 820bp EcoRI-PstI fragment. The recovered amount of DNA was about 1 μg.
On the other hand, 2 μg of M13mp18RFDNA (Takara Shuzo) was added to 20 μl.
10 units of EcoRI and 10 units of PstI in the reaction solution of
It was completely digested at 37 ° C for 1 hour. 0.7% digest
The 7.2 kb EcoRI-PstI fragment was subjected to agarose gel electrophoresis and eluted and purified in the same manner as the 820 bp EcoRI-PstI fragment. D
The amount of NA recovered was about 1.5 μg. The 600 bp and 7.2 kb EcoRI-PstI fragments obtained as described above were used respectively in 0.1
5g T4 D in 20μl reaction solution
RF DNA was circularized by reacting with NA ligase (TOYOBO) at 16 ° C for 30 minutes. Then circularized RF DNA
E. coli TG-1 was transformed with E. coli and the transformant was used to transform M13mp1
8 M13mp18 (rnh) RF DNA with rnh gene inserted in RF DNA
Was obtained (see FIG. 1).
実施例2 rnh遺伝子への部位特異的突然変異の導入 実施例1で得たM13mp18(rnh)RF DNAで形質転換した
大腸菌TG−1の培養上清からの一本鎖DNAの調製、オリ
ゴヌクレオチドのリン酸化およびrnh遺伝子への点突然
変異の導入は、いずれも、アマ−シヤムから市販されて
いるキット(オリゴヌクレオチド ディレクテッド イ
ンビトロ ミュータゲネシス システム)を用い、添付
の説明書に正確に従って行なわれた。オリゴヌクレオチ
ドとしては、化学合成した25merの5′−CCGATGGTTCGTC
TCTGGGCAATCC−3′を用いた。Cys13のコドンTGTがSer
のコドンTCTに改変された変異リボヌクレアーゼH遺伝
子を含有するRF DNAをM13mp18(rnh−13S)(第2図参
照)と命名し、以後の実験に用いた。Example 2 Introduction of Site-Directed Mutation in rnh Gene Preparation of single-stranded DNA from the culture supernatant of Escherichia coli TG-1 transformed with M13mp18 (rnh) RF DNA obtained in Example 1 Both phosphorylation and introduction of point mutations into the rnh gene were performed using a kit (Oligonucleotide-Directed In Vitro Mutagenesis System) commercially available from Amersham, exactly following the attached instructions. As the oligonucleotide, chemically synthesized 25-mer 5'-CCGATGGTTCGTC
TCTGGGCAATCC-3 'was used. Cys 13 codon TGT is Ser
The RF DNA containing the mutant ribonuclease H gene modified at the codon TCT of was named M13mp18 (rnh-13S) (see FIG. 2) and used in the subsequent experiments.
実施例3 リボヌクレアーゼH(13S)発現用プラスミ
ドpDR601の構築 1.天然型リボヌクレアーゼH発現用プラスミドpDR601の
構築 実施例1で得たプラスミドpKS801(第1図参照)2μ
gを20μlの反応溶液中、10ユニットのEcoRIにより37
℃で1時間完全に消化した。エタノール沈澱によりDNA
を回収した後、20μlの反応溶液中、2ユニットのDNA
ポリメラーゼ(クレソウ)を加えて37℃で30分間反応さ
せ、次いで、65℃で10分間処理した。エタノール沈澱に
より回収したDNAを20μlの反応溶液中、1ユニットの
大腸菌アルカリ性フォスファターゼを加えて37℃で30分
間処理した後、反応溶液を0.7%アガロースゲル電気泳
動にかけた。3.3kb DNA断片を実施例1記載の820bp Eco
RI−PstI断片の場合と同様に溶出・精製した。DNAの回
収量は約1μgであった。得られたDNA0.1μgをSelIリ
ンカー(宝酒造製)0.01μgと混合(モル比1:50)し、
20μlの反応溶液中、5ユニットのT4 DNAリガーゼを加
えて16℃で30分間処理した。このようにして環化したプ
ラスミドで大腸菌JM109を形質転換し、形質転換体より
プラスミドpKS600を得た。Example 3 Construction of plasmid pDR601 for expression of ribonuclease H (13S) 1. Construction of plasmid pDR601 for expression of natural ribonuclease H Plasmid pKS801 (see FIG. 1) 2 μ obtained in Example 1
37 g with 20 units of EcoRI in 20 μl reaction solution
Digested completely at 1 ° C for 1 hour. DNA by ethanol precipitation
2 units of DNA in 20 μl reaction solution after
Polymerase (Kreso) was added and reacted at 37 ° C for 30 minutes, and then treated at 65 ° C for 10 minutes. The DNA recovered by ethanol precipitation was added with 1 unit of E. coli alkaline phosphatase in 20 µl of the reaction solution and treated at 37 ° C for 30 minutes, and then the reaction solution was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis. The 3.3 kb DNA fragment was converted to 820 bp Eco described in Example 1.
Elution and purification were carried out in the same manner as for the RI-PstI fragment. The recovered amount of DNA was about 1 μg. 0.1 μg of the obtained DNA was mixed with 0.01 μg of SelI linker (Takara Shuzo) (molar ratio 1:50),
In 20 μl of the reaction solution, 5 units of T4 DNA ligase was added and treated at 16 ° C. for 30 minutes. Escherichia coli JM109 was transformed with the plasmid thus cyclized, and plasmid pKS600 was obtained from the transformant.
次いで、プラスミドpKS600(10μg)を100μlの反
応溶液中、50ユニットのXbaIと50ユニットのSalIを用い
て37℃で1時間完全消化し、1.5%アガロースゲル電気
泳動にかけた。600pb XbaI−SalI断片を切り出し、実施
例1記載の820bp EcoRI−PstI断片の場合と同様に溶出
・精製を行なった。エタノール沈澱により回収されたDN
Aの量は約1μgであった。Then, the plasmid pKS600 (10 μg) was completely digested with 50 units of XbaI and 50 units of SalI in 100 μl of the reaction solution at 37 ° C. for 1 hour and subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis. The 600 pb XbaI-SalI fragment was cut out and eluted and purified in the same manner as in the case of the 820 bp EcoRI-PstI fragment described in Example 1. DN recovered by ethanol precipitation
The amount of A was about 1 μg.
一方、大腸菌プロテアーゼIII発現用プラスミドベク
ターpDR42S(特許出願番号62−218973)5μgと100μ
lの反応溶液中、50ユニットのXbaIと50ユニットのSalI
を用いて37℃で1時間消化し、0.7アガロースゲル電気
泳動にかけた。3.0kb XbaI−SalI断片を切り出し、実施
例1記載の820bp EcoRI−PstI断片の場合と同様に溶出
・精製を行なった。エタノール沈澱により回収されたDN
Aの量は約1μgであった。On the other hand, plasmid vector pDR42S (patent application No. 62-218973) for expression of Escherichia coli protease III, 5 μg and 100 μm
50 units XbaI and 50 units SalI in 1 reaction solution
Was digested for 1 hour at 37 ° C. and subjected to 0.7 agarose gel electrophoresis. The 3.0 kb XbaI-SalI fragment was cut out and eluted and purified in the same manner as in the case of the 820 bp EcoRI-PstI fragment described in Example 1. DN recovered by ethanol precipitation
The amount of A was about 1 μg.
以上のようにして得られた600bp XbaI−SalI断片0.1
μgと3.0kb XbaI−SalI断片0.1μgとを混合し、20μ
lの反応溶液中、5ユニットのT4 DNAリガーゼにより16
℃で30分間処理し、プラスミドを環化した。環化したプ
ラスミドで大腸菌JM109を形質転換し、形質転換体より
天然型リボヌクレアーゼH発現用プラスミドベクターpD
R600を得た。600 bp XbaI-SalI fragment 0.1 obtained as described above
μg and 0.1 μg of 3.0 kb XbaI-SalI fragment were mixed,
16 units with 5 units of T4 DNA ligase in 1 l of reaction solution
C. for 30 minutes to circularize the plasmid. Escherichia coli JM109 was transformed with the circularized plasmid, and a plasmid vector pD for expressing native ribonuclease H was obtained from the transformant.
I got R600.
2.リボヌクレアーゼH(13S)発現用プラスミドpDR601
の構築 1で得たプラスミドpDR600の天然型rnh遺伝子を、以
下のようにして、変異型rnh遺伝子で置換した。まず、
プラスミドpDR600(2μg)を50μlの反応溶液中、10
ユニットのXbaIと10ユニットのSatIIを用いて37℃で1
時間、完全消化し、0.7%アガロースゲル電気泳動にか
けた。3.1kb XbaI−SatII断片を切り出し、前記820bp E
coRI−PstI断片の場合と同様に溶出・精製を行なった。
エタノール沈澱により回収されたDNAの量は約1.5μgで
あった。一方、実施例2で得たM13mp18(rnh−13S)RF
DNA(5μg)を100μlの反応溶液中、50ユニットのXb
aIおよび50ユニットのSatIIにより37℃で1時間、完全
消化し、消化物を1.5%アガロースゲル電気泳動にかけ
た。500bp XbaI−SatII断片を切り出し、上記820bp Eco
RI−PstI断片の場合と同様に溶出・精製を行なった。エ
タノール沈澱により回収されたDNAの量は約0.2μgであ
った。以上のようにして得られた500bpおよび3.1kbのXb
aI−SatII断片、それぞれ0.1μgを混合し、20μlの反
応溶液中、5ユニットのT4 DNAリガーゼにより16℃で30
分間処理し、プラスミドを環化した。環化したプラスミ
ドで大腸菌JM109を形質転換し、形質転換体よりプラス
ミドpDR601を得た。2. Ribonuclease H (13S) expression plasmid pDR601
Construction of plasmid pDR600 obtained in 1 was replaced with the mutant rnh gene as follows. First,
Plasmid pDR600 (2 μg) was added to 10 μl of the reaction solution in 50 μl.
1 unit at 37 ° C using 1 unit of XbaI and 10 units of SatII
It was completely digested for a period of time and subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis. The 3.1 kb XbaI-SatII fragment was excised and the 820 bp E
Elution and purification were performed as in the case of the coRI-PstI fragment.
The amount of DNA recovered by ethanol precipitation was about 1.5 μg. On the other hand, M13mp18 (rnh-13S) RF obtained in Example 2
DNA (5 μg) in 100 μl reaction solution, 50 units Xb
It was completely digested with aI and 50 units of SatII for 1 hour at 37 ° C. and the digest was subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis. The 500 bp XbaI-SatII fragment was cut out and the above 820 bp Eco
Elution and purification were performed in the same manner as for the RI-PstI fragment. The amount of DNA recovered by ethanol precipitation was about 0.2 μg. 500 bp and 3.1 kb Xb obtained as described above
0.1 μg of each aI-SatII fragment was mixed, and 30 μl was added to 5 μl of T4 DNA ligase in 20 μl of reaction solution at 16 ° C.
It was treated for minutes and the plasmid was circularized. Escherichia coli JM109 was transformed with the cyclized plasmid, and the plasmid pDR601 was obtained from the transformant.
上記のようにして得たリボヌクレアーゼH(13S)発
現用プラスミドpDR601の詳細な制限酵素切断地図を第4
図に示した。形質転換菌エシエリシア・コリ(E.col
i)JM109/pDR601は、工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている(微工研菌寄第9708号、寄託日:昭和
62年11月14日)。The detailed restriction enzyme digestion map of the ribonuclease H (13S) expression plasmid pDR601 obtained as described above is shown in
As shown in the figure. Transformant Escherichia coli ( E. col
i ) JM109 / pDR601 has been deposited at the Institute of Microbial Science and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (Ministry of Microbiology Research Institute No. 9708, deposit date: Showa era)
November 14, 62).
実施例4 リボヌクレアーゼH(13S)の大腸菌におけ
る生産と精製 1.形質転換体JM109/pDR601の培養 形質転換体JM109/pDR601を、800μgのアンピシリン
を含むLB培地1中、37℃で振盪培養した。培養液の濁
度がクレット値で100前後まで生育した時点で、IPTG
を、最終濃度0.8mMとなるように添加し、更に5時間振
盪を続けた後、集菌した。この時のクレット値は約12
0、菌体の湿重量は約1.5gであった。Example 4 Production and purification of ribonuclease H (13S) in Escherichia coli 1. Culture of transformant JM109 / pDR601 Transformant JM109 / pDR601 was shake-cultured at 37 ° C. in LB medium 1 containing 800 μg of ampicillin. When the turbidity of the culture solution grew to a Klett value of around 100, IPTG
Was added to a final concentration of 0.8 mM, and the mixture was further shaken for 5 hours, and then the cells were collected. The cret value at this time is about 12
0, the wet weight of the cells was about 1.5 g.
2.菌体からのリボヌクレアーゼH(13S)の抽出・精製 上記1で得た菌体を5mlの0.1M NaClと25%シュークロ
ースを含む10mMトリス塩酸緩衝液(pH8)に懸濁した
後、5.2mgのリゾチームと0.1M EDTAを含む0.3Mトリス塩
酸緩衝液(pH8)1.33mlを加えた。氷中に5分放置した
後、超音波処理により菌を破砕した。15000rpmで30分
間、4℃で遠心して得た遠心上清(粗抽出液)を、1mM
EDTA、1mMβ−メルカプトエタノール及び10%グリセリ
ンを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に対して透析
した。次いで、同緩衝液で平衡化したDE−52カラム(〜
6ml)及びP−11カラム(〜4ml)にこの順序で通した。
この条件下、リボヌクレアーゼH(13S)は、DE−52カ
ラムを素通りし、P−11カラムに吸着する。NaCl濃度を
直線的に上昇させることによりP−11カラムからリボヌ
クレアーゼH(13S)を溶出した。最後にP−11カラム
からの溶出画分を、1mM DTT、1mM EDTA、0.08M NaCl及
び10%グリセリンを含む、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.
5)で平衡化したセファクリルS−300(スーパーファイ
ン)カラム(φ1.6×190cm)にかけることにより、リボ
ヌクレアーゼH(13S)を、SDS−PAGEで単一バンドを与
えるまでに精製した。以上の全精製操作を通じてのリボ
ヌクレアーゼH(13S)の回収率は、約60%であった。
精製収量は、約3mg/l培養液であり、これは、JM109/pDR
600からの天然型リボヌクレアーゼHの精製収量5mg/lと
比較してそれほど変化なかった。なお、天然型リボヌク
レアーゼHとリボヌクレアーゼH(13S)は、上記精製
操作では分離しないので、リボヌクレアーゼH(13S)
精製標品には、宿主として用いたJM109に由来する天然
型リボヌクレアーゼHが混入している。しかし、大腸菌
JM109からの天然型リボヌクレアーゼHの精製収量は、
通常、約5μg/lであることから、混入している割合
は、約0.16%と極めて低い。従って、本精製標品の性質
は、リボヌクレアーゼH(13S)の性質を反映している
とみなすことができる。精製標品の同定は、アミノ末端
からのアミノ酸配列を分析し、13番目のアミノ酸がSer
に変異していることを確認することにより行った。2. Extraction and purification of ribonuclease H (13S) from bacterial cells After suspending the bacterial cells obtained in 1 above in 5 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8) containing 0.1 M NaCl and 25% sucrose, 1.33 ml of 0.3 M Tris-HCl buffer (pH 8) containing mg lysozyme and 0.1 M EDTA was added. After allowing to stand in ice for 5 minutes, the bacteria were disrupted by ultrasonic treatment. Centrifuge supernatant (crude extract) obtained by centrifugation at 15000 rpm for 30 minutes at 4 ° C.
It was dialyzed against 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing EDTA, 1 mM β-mercaptoethanol and 10% glycerin. Then, a DE-52 column (~
6 ml) and a P-11 column (-4 ml) in this order.
Under this condition, ribonuclease H (13S) passes through the DE-52 column and is adsorbed on the P-11 column. Ribonuclease H (13S) was eluted from the P-11 column by increasing the NaCl concentration linearly. Finally, the elution fraction from the P-11 column was mixed with 10 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7. mM) containing 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.08 M NaCl and 10% glycerin.
Ribonuclease H (13S) was purified by SDS-PAGE to give a single band by loading on a Sephacryl S-300 (Superfine) column (φ1.6 × 190 cm) equilibrated in 5). The recovery rate of ribonuclease H (13S) was about 60% through the above entire purification procedure.
The purification yield is about 3 mg / l culture, which is equivalent to JM109 / pDR
There was little change compared to the purified yield of native ribonuclease H from 600 of 5 mg / l. Since the natural ribonuclease H and ribonuclease H (13S) are not separated by the above-mentioned purification operation, ribonuclease H (13S)
The purified sample is contaminated with natural ribonuclease H derived from JM109 used as a host. However, E. coli
The purified yield of native ribonuclease H from JM109 is
Usually, since it is about 5 μg / l, the mixing ratio is about 0.16%, which is extremely low. Therefore, it can be considered that the properties of this purified preparation reflect the properties of ribonuclease H (13S). To identify the purified sample, the amino acid sequence from the amino terminus was analyzed and the 13th amino acid was the Ser
It was carried out by confirming that it was mutated.
実施例4でエタノールリボヌクレアーゼH(13S)の
酵素活性を以下の実施例の記載の如くにして評価した。The enzymatic activity of ethanol ribonuclease H (13S) in Example 4 was evaluated as described in the Examples below.
実施例 リボヌクレアーゼH(13S)の酵素活性の評価 天然型リボヌクレアーゼHの酵素活性とリボヌクレア
ーゼH(13S)の酵素活性を[32P]poly(rA)poly(dT)を基
質として測定し、比較した。その結果を表1に示す。表
1から、リボヌクレアーゼH(13S)の比活性は天然型
に比べて約2倍に上昇していることが分る。Example Evaluation of Enzyme Activity of Ribonuclease H (13S) The enzyme activity of natural ribonuclease H and that of ribonuclease H (13S) were measured using [ 32 P] poly (rA) poly (dT) as a substrate and compared. Table 1 shows the results. From Table 1, it can be seen that the specific activity of ribonuclease H (13S) is increased about twice as much as that of the natural type.
[発明の効果] 本発明によって得られる変異リボヌクレアーゼHは、
その酵素活性が天然型リボヌクレアーゼHの約2倍であ
ることから、従来の酵素試薬よりも少量で同等の触媒作
用を示すこととなる。従って、本発明によって、実質
上、該酵素の供給量が増大されたことになる。また、本
発明方法によれば天然型リボヌクレアーゼHに伴なって
いる夾雑タンパク質の混入を減少し得るので、より高品
質の精製標品を得ることができる。 [Effects of the Invention] The mutant ribonuclease H obtained by the present invention is
Since its enzymatic activity is about twice as high as that of natural ribonuclease H, a smaller amount than the conventional enzyme reagent will show an equivalent catalytic action. Therefore, the present invention substantially increases the supply amount of the enzyme. Further, according to the method of the present invention, the contamination of contaminating proteins with the native ribonuclease H can be reduced, so that a higher quality purified preparation can be obtained.
第1図はrnh遺伝子のM13mpRF DNAへのサブクローニング
の概略を示す模式図である。第2図は合成オリゴヌクレ
オチド(25mer)を用いて天然型リボヌクレアーゼH遺
伝子に部位特異的突然変異を導入してリボヌクレアーゼ
H(13S)遺伝子を得る反応を示す模式図である。図
中、点突然変異導入部位には☆印、突然変異に該当する
アミノ酸には下線を付して示した。第3図はプラスミド
pDR601の組立て模式図である。第4図はプラスミドpDR6
01の制限酵素切断地図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the outline of subcloning of the rnh gene into M13mpRF DNA. FIG. 2 is a schematic diagram showing a reaction for introducing a site-specific mutation into a natural ribonuclease H gene using a synthetic oligonucleotide (25mer) to obtain a ribonuclease H (13S) gene. In the figure, the point mutation site is indicated by a star, and the amino acid corresponding to the mutation is underlined. Figure 3 is a plasmid
FIG. 7 is a schematic diagram of assembly of pDR601. Figure 4 shows plasmid pDR6
It is a restriction enzyme digestion map of 01.
Claims (8)
において、第13番目のシステインがセリンで置換された
アミノ酸配列を有する変異大腸菌リボヌクレアーゼH。1. A mutant Escherichia coli ribonuclease H having an amino acid sequence in which the 13th cysteine in the E. coli ribonuclease H amino acid sequence is replaced with serine.
る構造遺伝子において、第13番目のシステインのTGTコ
ドンが部位特異的突然変異によってセリンのTCTコドン
に変換された変異大腸菌リボヌクレアーゼH構造遺伝
子。2. A structural gene encoding Escherichia coli ribonuclease H, wherein the TGT codon of the 13th cysteine is converted to the TCT codon of serine by site-directed mutation.
変異大腸菌リボヌクレアーゼH構造遺伝子を含有してい
る、大腸菌内で複製および発現可能な発現ベクター。3. An expression vector capable of replication and expression in Escherichia coli, which contains the mutant Escherichia coli ribonuclease H structural gene according to claim 2 under the control of the tac promoter.
子を含有している第3項記載の発現ベクター。4. The expression vector according to claim 3, which contains an ampicillin resistance gene as a selectable marker.
載の発現ベクター。5. The expression vector according to claim 3 or 4, which is the plasmid pDR601.
ーで形質転換された形質転換体。6. A transformant transformed with the expression vector according to any one of claims 3-5.
質転換体。7. The transformant according to claim 6, which is Escherichia coli JM109 / pDR601.
クレアーゼH遺伝子の発現に適した条件下で培養し、得
られた培養液から変異大腸菌リボヌクレアーゼHを回収
することからなる変異大腸菌リボヌクレアーゼHの製造
方法。8. A mutant Escherichia coli ribonuclease H comprising culturing the transformant according to claim 6 or 7 under conditions suitable for expression of a ribonuclease H gene and recovering the mutant Escherichia coli ribonuclease H from the resulting culture solution. Manufacturing method.
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EP0984065A4 (en) * | 1997-02-14 | 2002-07-24 | Higeta Shoyu Kk | Modified treponema pallidum-derived antigen protein |
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- 1988-02-05 JP JP2626188A patent/JP2535583B2/en not_active Expired - Lifetime
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