JP2517561B2 - Category Estrogen Immunoassay Kit - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 （技術分野） この発明は、カテコールエストロゲンのイムノアッセ
イに関するものである。さらに詳しくは、カテコールエ
ストロゲンのイムノアッセイキッドに関するものであ
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a catechol estrogen immunoassay. More specifically, it relates to a catechol estrogen immunoassay kid.
（背景技術） カテコールエストロゲンは、乳ガンに関係するホルモ
ンとして重要なエストロゲンの主要な代謝産物のひとつ
であり、生理・代謝の観点から注目されている物質であ
る。(Background Art) Catechol estrogen is one of the major metabolites of estrogen, which is an important hormone related to breast cancer, and is a substance that is drawing attention from the viewpoint of physiology and metabolism.
エストロゲンとの類似性については、すでにカテコー
ルエストロゲンには乳ガン細胞に対して促進的に作用す
る場合と、抑制的に作用する場合があることが報告され
ており、エストロゲンと同様に、カテコールエストロゲ
ンは乳ガンに深くかかわっている物質であることが知ら
れている。Regarding the similarity with estrogen, it has already been reported that catechol estrogen may act in a promoting manner on breast cancer cells and may act in a suppressive manner. It is known to be a substance that is deeply involved in.
また一方では、このカテコールエストロゲンについて
は、黄体形成ホルモンやプロラクチン分泌に及ぼす影響
などの脳内生理作用、子宮向性作用など、中枢、末梢に
おけるその特異な作用についての関心が高まっている。On the other hand, regarding this catechol estrogen, there is a growing interest in its specific actions in the central and peripheral areas such as physiological actions in the brain such as the influence on luteinizing hormone and prolactin secretion, and uterotropic action.
しかしながら、このカテコールエストロゲンは体内に
極微量（フェントモルのオーダー）しか存在しないた
め、その検出は極めて難しく、カテコールエストロゲン
の生理、代謝作用について正確に判定することは困難で
あった。However, this catechol estrogen is present in the body in a very small amount (of the order of femtomoles), and therefore its detection is extremely difficult, and it has been difficult to accurately determine the physiological and metabolic actions of catechol estrogen.
このため、カテコールエストロゲンの極微量検出の方
法を実現することが強く望まれていた。Therefore, it has been strongly desired to realize a method for detecting a trace amount of catechol estrogen.
特にこのことは、今後の乳ガンの診断にとっても重要
なことである。カテコールエストロゲンと乳ガンとの関
連が正確に判定できるようになるならば、現在、必ずし
も明確にその根拠が明らかにされていない卵巣除去によ
るホルモンコントロール、その乳ガン治療への応用につ
いても妥当性が明らかになる。乳ガンの適正な診断と、
乳ガン患者からの卵巣摘出の可否の判定などに大きな福
音をもたらすことになる。This is especially important for future diagnosis of breast cancer. If the relationship between catechol estrogens and breast cancer can be accurately determined, it is now clear that the hormonal control by ovarian ablation and its application to the treatment of breast cancer are not always clearly clarified. Become. With proper diagnosis of breast cancer,
It will bring a great gospel to the decision of ovariectomy from breast cancer patients.
（発明の目的） この発明は、以上のような事情を鑑みてなされたもの
であり、生理、代謝作用が注目されているカテコールエ
ストロゲンの極微量の検出、測定をも可能とするカテコ
ールエストロゲンのイムノアッセイキッドを提供するこ
とを目的としている。(Object of the Invention) The present invention has been made in view of the above circumstances, and is an immunoassay for catechol estrogen, which enables detection and measurement of an extremely small amount of catechol estrogen, which is attracting attention for its physiological and metabolic effects. Intended to serve Kid.
（発明の開示） この発明のイムノアッセイキッドは、カテコールエス
トロゲンに対して特異性を有する抗体の産生のために、
次式で示されるカテコールエストロゲンのタンパク質複
合体をひとつの要素として用いることを最も大きな特徴
としている。DISCLOSURE OF THE INVENTION The immunoassay kid of the present invention is for the production of antibodies having specificity for catechol estrogen,
The greatest feature is that the protein complex of catechol estrogen represented by the following formula is used as one element.
（式中のＡは、＝Ｎ−Ｏ−または−Ｏ−CO−、ｎは、１
〜４の整数、−NH−Ｐはタンパク質からアミノ基の水素
原子１個を除いた残基、R1およびR2は、各々別異にＨま
たはOHを示す） このカテコールエストロゲンのタンパク質複合体
（ｉ）は、たとえば、Ａが＝Ｎ−Ｏ−、ｎが１、−NH−
Ｐがウシ血清アルブミン残基である場合（ii）には、２
−ヒドロキシエストロンまたは４−ヒドロキシエストロ
ン（iii）より、次の反応式に従って製造することがで
きる。 (A in the formula is = N-O- or -O-CO-, and n is 1
To 4 integer, -NH-P is the residue obtained by removing one hydrogen atom of the amino group from a protein, R 1 and R 2 are each different, represent H or OH in) protein complex of this catechol estrogens ( i) is, for example, A = N—O—, n is 1, —NH—
When P is a bovine serum albumin residue (ii), 2
It can be produced from -hydroxyestrone or 4-hydroxyestrone (iii) according to the following reaction formula.
すなわち、２−ヒドロキシエストロンまたは４−ヒド
ロキシエストロン（iii）をカルボキシメチルハイドロ
キシルアミンと縮合反応させて２−ヒドロキシエストロ
ン−17−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシムまたは４−
ヒドロキシエストロン−17−（Ｏ−カルボキシメチル）
オキシム（iv）に誘導し、キャリアタンパクとしてのウ
シ血清アルブミン（BSA）と結合させて、目的のタンパ
ク質複合体のハプテン−BSA（ii）を合成する。出発物
質の２−ヒドロキシエストロンまたは４−ヒドロキシエ
ストロン（iii）は、エストロン（３−ヒドロキシエス
トラ−1,3,5（10）−トリエン−17−オン）（ｖ）よ
り、次の反応式に従って合成することができる。 That is, 2-hydroxyestrone or 4-hydroxyestrone (iii) is condensed with carboxymethylhydroxylamine to give 2-hydroxyestrone-17- (O-carboxymethyl) oxime or 4-hydroxyestrone-17- (O-carboxymethyl) oxime
Hydroxyestrone-17- (O-carboxymethyl)
It is induced by oxime (iv) and bound to bovine serum albumin (BSA) as a carrier protein to synthesize the target protein complex hapten-BSA (ii). The starting material 2-hydroxyestrone or 4-hydroxyestrone (iii) was synthesized from estrone (3-hydroxyestra-1,3,5 (10) -trien-17-one) (v) according to the following reaction formula. can do.
この発明のイムノアッセイの対象となるカテコールエ
ストロゲンは、式中の（vi）（vii）の４種の物質（カ
テコールエストラジオールおよびカテコールエストロ
ン）である。The catechol estrogens to be the targets of the immunoassay of the present invention are four substances (catechol estradiol and catechol estrone) of (vi) and (vii) in the formula.
この発明の抗体産生に用いるカテコールエストロゲン
の式（ｉ）で示される−NH−Ｐ基を形成するタンパク質
は、ウシ血清アルブミンに限定されることなく、通常に
免疫化学の分野でハプテンに対して使用されているもの
であれば特に制限はない。普通には、アルブミン、グロ
ブリンなどを使用する。特にウシ血清アルブミンやウサ
ギ血清アルブミンが好適に用いられる。 The protein that forms the —NH—P group represented by the formula (i) of catechol estrogen used for antibody production of the present invention is not limited to bovine serum albumin, and is commonly used for haptens in the field of immunochemistry. There is no particular limitation as long as it is provided. Usually, albumin, globulin, etc. are used. Particularly, bovine serum albumin and rabbit serum albumin are preferably used.
得られたカテコールエストロゲン、タンパク質複合体
（ｉ）を用いて、カテコールエストロゲンに対して特異
的な抗体を産生するには、この複合体（ｉ）を動物（ウ
シ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスな
ど）の生体に非経口投与し、該生体内に抗体を産生させ
る。その後、該生体から体液（たとえば血液）を採取す
る。通常は、抗体を含む血清、すなわち抗血清の形態に
おいて使用する。To produce an antibody specific to catechol estrogen using the obtained catechol estrogen-protein complex (i), the complex (i) is treated with an animal (cattle, horse, sheep, goat, rabbit, It is parenterally administered to a living body of a rat, a mouse, etc., and an antibody is produced in the living body. Then, body fluid (for example, blood) is collected from the living body. Usually, it is used in the form of serum containing antibody, that is, antiserum.
この発明は、以上の抗体を用いてカテコールエストロ
ゲンのイムノアッセイを行うものであるが、抗体との組
合せで用いる標識抗原としては、カテコールエストロゲ
ンを適宜な方法で標識化したものを使用する。この標識
化のためには放射性物質、酵素、蛍光物質、発光物質、
などの適宜なものを用いることができる。また、これら
の標識物質のカテコールエストロゲン内への導入位置
は、得られた標識抗原の免疫活性が保持されている限
り、特に制限はない。3H、14C、135I、131Iなどの放射
性元素による標識化も有効である。In the present invention, the catechol estrogen immunoassay is carried out using the above-mentioned antibody. As the labeled antigen used in combination with the antibody, catechol estrogen labeled by an appropriate method is used. For this labeling, radioactive substances, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances,
An appropriate one such as can be used. In addition, the position of introduction of these labeling substances into catechol estrogen is not particularly limited, as long as the immunoactivity of the obtained labeled antigen is retained. Labeling with radioactive elements such as 3 H, 14 C, 135 I and 131 I is also effective.
この発明のイムノアッセイのキッドは、これらの標識
化されたカテコールエストロゲンと、上記の抗体とから
なっている。このイムノアッセイキッドは、特に、乳ガ
ンの発生、増殖、あるいは抑制にかかわっていることが
推察されるカテコールエストロゲン特性の検出、定量に
有用なものである。その他、乳ガンに限定されずに、生
体の脳をはじめとする諸組織での生理、代謝を判断する
ためにも欠かせないものである。The immunoassay kid of this invention consists of these labeled catechol estrogens and the antibodies described above. This immunoassay kid is particularly useful for detecting and quantifying catechol estrogen properties that are presumed to be involved in the development, proliferation, or suppression of breast cancer. In addition, it is not limited to breast cancer, and is also essential for determining the physiology and metabolism of various tissues including the brain of the living body.
乳ガンについては、生体の体液中のカテコールエスト
ロゲンの極微量の検出によって、ガン発生、その進行、
さらには卵巣摘出の判断に重要な指標を与えるものと示
唆される。この点に関しては、たとえば、乳ガンとの関
係が示唆されているエストロゲンの場合と同様に、カテ
コールエストロゲンスルホトランスフェラーゼおよびカ
テコールエストロゲンスルファターゼの酵素活性のアッ
セイ方法、アッセイキッドとしても、この発明は有用で
ある。Regarding breast cancer, the occurrence of cancer, its progression,
Furthermore, it is suggested that it gives an important index for the judgment of ovariectomy. In this regard, the present invention is also useful as a method for assaying the enzymatic activity of catechol estrogen sulfotransferase and catechol estrogen sulfatase, or an assay kid, as in the case of estrogen, which has been suggested to be associated with breast cancer.
以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発明を説明す
る。この発明は、これら実施例に限定されるものではな
い。イムノアッセイの具体操作条件などは、適宜に選択
できるものである。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The present invention is not limited to these examples. Specific operating conditions of the immunoassay can be appropriately selected.
実施例 １ （カテコールエストロゲン抗体産生試薬の合成） （ａ）2,3−ジヒドロキシエストラ−1,3,5（10）−トリ
エン−17−オン（式（iii））100mgおよびアスコルビン
酸50mgをメタノール10mlに溶解し、カルボキシメチルヒ
ドロキシルアミン塩酸塩100mgを加え、窒素気流中、室
温で一夜撹拌した。Example 1 (Synthesis of catechol estrogen antibody-producing reagent) (a) 100 mg of 2,3-dihydroxyestra-1,3,5 (10) -trien-17-one (formula (iii)) and 50 mg of ascorbic acid were added to 10 ml of methanol. , 100 mg of carboxymethylhydroxylamine hydrochloride was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature in a nitrogen stream.
減圧下に反応液の溶媒を留去し、残渣に0.05N−塩酸1
0mlを加え、酢酸エチルエステルで３回抽出処理した。
有機層を２回水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減
圧下に溶媒を留去した。The solvent of the reaction solution was distilled off under reduced pressure, and 0.05N-hydrochloric acid 1 was added to the residue.
0 ml was added, and the mixture was extracted 3 times with ethyl acetate.
The organic layer was washed twice with water, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
残渣分を酢酸エチルエステル−エーテルで再結晶し、
２−ヒドロキシエストロン−17−（Ｏ−カルボキシメチ
ル）オキシム（式（iv））60mgを黄色針状晶として得
た。The residue was recrystallized from acetic acid ethyl ester-ether,
60 mg of 2-hydroxyestrone-17- (O-carboxymethyl) oxime (formula (iv)) was obtained as yellow needles.
（ｂ）上記生成物オキシム（式（iv））50mgをジオキサ
ン2mlに溶解し、ウシ血清アルブミン（BSA）70mgおよび
１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩100mgの1Mリン酸緩衝液（pH6.5）40ml溶液
中に滴下し、遮光し、pH6.5、40℃の温度で一夜撹拌し
た。(B) 50 mg of the above product oxime (formula (iv)) is dissolved in 2 ml of dioxane, 70 mg of bovine serum albumin (BSA) and 100 mg of 1-ethyl- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride 1M phosphate buffer solution. The mixture was added dropwise to a 40 ml (pH 6.5) solution, protected from light, and stirred overnight at pH 6.5 and 40 ° C.
反応液は0.001％アスコルビン酸２中で１時間透析
し、さらに透析操作を繰り返し、凍結乾燥後、ハプテン
−BSA（式（ii）、R1＝OH、R2＝Ｈ）120mgを淡黄色粉末
として得た。The reaction solution was dialyzed in 0.001% ascorbic acid 2 for 1 hour, and the dialysis operation was repeated, and after freeze-drying, 120 mg of hapten-BSA (formula (ii), R 1 = OH, R 2 = H) was obtained as a pale yellow powder. Obtained.
実施例 ２ （抗カテコールエストロゲン抗血清の産生） 実施例１において得られたハプテン−BSA4mgを注射用
生理食塩水0.5mlに溶解し、フロインド完全アジュバン
ド（Frcund's Complete adjuva−nt）0.5mlを加えて30
分間激しく撹拌した。Example 2 (Production of anti-catechol estrogen antiserum) 4 mg of the hapten-BSA obtained in Example 1 was dissolved in 0.5 ml of physiological saline for injection, and 0.5 ml of Freund's Complete adjuva-nt was added. 30
Stir vigorously for a minute.
懸濁液1mlを白色雄性家兎（1.5〜2.5kg）に２ヶ月間
は隔週で、それ以後は１ヶ月に１回の頻度で脚部および
背部に皮下投与した。投与開始２ヶ月以後、１ヶ月ごと
に最終投与から８〜10日後、耳静脈から採血（１〜2m
l）した。1 ml of the suspension was subcutaneously administered to white male rabbits (1.5 to 2.5 kg) every two weeks for two months, and once a month thereafter thereafter to the legs and back. Two months after the start of administration, 8 to 10 days after the last administration every month, blood is collected from the ear vein (1 to 2 m).
l) did.
室温で１時間放置後、800×ｇ、４℃で15分間遠心処
理し、抗血清を得た。After leaving it at room temperature for 1 hour, it was centrifuged at 800 xg and 4 ° C for 15 minutes to obtain an antiserum.
さらに７〜８ヶ月後、最終投与から８日目、頚動脈か
ら全採血したのち、上記と同様の操作に従い、抗血清を
得た。得られた抗血清は−20℃で冷却保存した。After 7 to 8 months, 8 days after the final administration, whole blood was collected from the carotid artery, and antiserum was obtained by the same procedure as above. The obtained antiserum was stored by cooling at -20 ° C.
実施例 ４ （抗血清の抗体価、希釈度） 実施例３において得られた抗血清の力価は、×50、×
100、×200、×500、×1000、×5000倍の各希釈率によ
って標準曲線を作成した。Example 4 (Antibody titer and dilution of antiserum) The titer of the antiserum obtained in Example 3 was x50, x
A standard curve was prepared with 100, × 200, × 500, × 1000, and × 5000 dilutions.
抗体価は次のようにして測定した。 The antibody titer was measured as follows.
〔3H〕カテコールエストロゲン（約5,000dpm）およびカ
テコールエストロゲン（0.05〜1.0ng）に、希釈抗血清
（1:50、100、200、500、1,000、5,000）0.05Mホウ酸緩
衝液（pH7.4）（0.05％BSA、0.06％ウシ血清γ−グロブ
リン、0.01％NaN3、0.05％アスコルビン酸）溶液（0.25
ml）を加え、37℃の温度で１時間インキュベートした。
次いで50％（NH4）2SO4（0.25ml）を加え、撹拌し、室
温で15分間放置した。[ 3 H] catechol estrogen (approximately 5,000 dpm) and catechol estrogen (0.05 to 1.0 ng), diluted antiserum (1:50, 100, 200, 500, 1,000, 5,000) 0.05 M borate buffer (pH 7.4) ) (0.05% BSA, 0.06% bovine serum γ-globulin, 0.01% NaN 3 , 0.05% ascorbic acid) solution (0.25
ml) was added and incubated at a temperature of 37 ° C. for 1 hour.
Then 50% (NH 4 ) 2 SO 4 (0.25 ml) was added, stirred and left at room temperature for 15 minutes.
800×ｇで15分間遠心分離したのち、その上清（0.2m
l）にシンチレーター（10ml）を加え、放射活性を液体
シンチレーションカウンターで測定した。After centrifugation at 800 xg for 15 minutes, the supernatant (0.2m
A scintillator (10 ml) was added to l) and the radioactivity was measured with a liquid scintillation counter.
このようにして、抗血清と50％の結合を示す希釈倍率
を抗体価とした。このとき、アッセイに最適な希釈倍率
を求め、標準曲線を作成した。In this way, the antibody titer was determined as the dilution ratio showing 50% binding to the antiserum. At this time, the optimum dilution ratio for the assay was determined and a standard curve was prepared.
２−ヒドロキシエストロンは、0.05〜1.0ngの測定範
囲において、×200、×500、×2,000倍希釈抗血清での
阻害差（％）は、それぞれ20、40、０（％）であったた
め、500倍を最適希釈率とし、標準曲線を作成した（添
附図面の第１図）。また、４−ヒドロキシエストロンの
0.05〜1.0ngの測定範囲での抗血清の最適希釈倍率は500
倍であった（第２図参照）。2-Hydroxyestrone had a difference of inhibition (%) of × 200, × 500, and × 2,000-fold diluted antiserum in the measurement range of 0.05 to 1.0 ng of 20, 40, 0 (%), respectively. A standard curve was prepared by setting the fold to the optimum dilution rate (Fig. 1 of the attached drawings). Also, of 4-hydroxyestrone
Optimal dilution ratio of antiserum in the measurement range of 0.05 to 1.0 ng is 500
It was twice (see FIG. 2).
実施例 ５ （交叉反応性・ラジオイムノアッセイ） 得られた抗血清について、他のカテコールエストロゲ
ンとの交叉反応性について検討した。Example 5 (Cross Reactivity / Radioimmunoassay) The obtained antiserum was examined for cross reactivity with other catechol estrogens.
すなわち、〔6.7−3H〕２−ヒドロキシエストロンま
たは〔6.7−3H〕２−ヒドロキシエストラジオールを用
いたとき、抗ヒドロキシエストロン抗血清に対する４種
のカテコールエストロゲン（２−ヒドロキシエストロ
ン、２−ヒドロキシエストラジオール、４−ヒドロキシ
エストロン、４−ヒドロキシエストラジオール）の交叉
反応性をラジオイムノアッセイによって求めた。That is, [6.7- 3 H] 2-hydroxy-estrone or [6.7- 3 H] when using the 2-hydroxy estradiol, 4 kinds of catechol estrogens to anti hydroxy estrone antiserum (2-hydroxy estrone, 2-hydroxy estradiol, Cross-reactivity of 4-hydroxyestrone, 4-hydroxyestradiol) was determined by radioimmunoassay.
ラジオイムノアッセイは次の方法によって行った。 Radioimmunoassay was performed by the following method.
〔3H〕カテコールエストロゲン（約5,000dpm）および
カテコールエストロゲン（0.05〜10.0ng）または試料
に、希釈抗血清（1:500）（0.25ml）を加え、４℃で18
時間インキュベートした。次いで50％（NH4）2SO4（0.2
5ml）を加え、撹拌し、室温で15分間放置した。Dilute antiserum (1: 500) (0.25 ml) was added to [ 3 H] catechol estrogen (approximately 5,000 dpm) and catechol estrogen (0.05-10.0 ng) or a sample, and the mixture was incubated at 4 ° C for 18
Incubated for hours. Then 50% (NH 4 ) 2 SO 4 (0.2
5 ml) was added, and the mixture was stirred and allowed to stand at room temperature for 15 minutes.
800×ｇで15分間遠心分離し、その上清（0.2ml）にシ
ンチレーター（10ml）を加え、放射活性を液体シンチレ
ーションカウンターで測定した。After centrifugation at 800 xg for 15 minutes, a scintillator (10 ml) was added to the supernatant (0.2 ml), and radioactivity was measured with a liquid scintillation counter.
〔6.7−3H〕４−ヒドロキシエストロンまたは〔6.7−
3H〕４−ヒドロキシエストラジオールについても同様に
行った。[6.7- 3 H] 4-hydroxy-estrone or [6.7-
The same was done for 3 H] 4-hydroxyestradiol.
交叉反応性は、抗血清の結合に対して標識抗原の50％
阻害を示す値により交叉反応性を算出した。Cross-reactivity is 50% of labeled antigen for antiserum binding
The cross-reactivity was calculated by the value indicating inhibition.
次の表に示したように、それぞれほぼ100％の交叉反
応性を示した。As shown in the following table, each showed almost 100% cross-reactivity.
このことは、17位のカルボニル基を介してBSAと縮合
させた実施例１の抗原を免疫して得られた抗血清である
ため、エストロゲンの構造上の17位のカルボニル基ある
いは水酸基の変化に影響されないことを示している。こ
のため、カテコールエストロゲンとカテコールエストラ
ジオールとからなるカテコールエストロゲンの総量とし
て、アッセイが可能となる。This is an antiserum obtained by immunizing with the antigen of Example 1 condensed with BSA via the carbonyl group at the 17-position, and therefore changes in the carbonyl group or the hydroxyl group at the 17-position on the structure of estrogen are observed. It is not affected. Therefore, the assay is possible as the total amount of catechol estrogen composed of catechol estrogen and catechol estradiol.
実施例 ６ （カテコールエストロゲン スルホトランスフェラーゼ
・アッセイ） ４種のカテコールエストロゲンを基質としたときの、
細胞質および細胞膜分画におけるスルホトランスフェラ
ーゼによって生成するカテコールエストロゲンの硫酸抱
合体の量をラジオイムノアッセイにより測定し、この酵
素の活性を求めた。ラジオイムノアッセイには、実施例
４〜５によって確立された方法を用いた。 Example 6 (Catechol Estrogen Sulfotransferase Assay) Using four catechol estrogens as substrates,
The amount of catechol estrogen sulfate conjugate produced by sulfotransferase in the cytoplasmic and cell membrane fractions was measured by radioimmunoassay to determine the activity of this enzyme. The method established by Examples 4-5 was used for the radioimmunoassay.
すなわち、カテコールエストロゲン（0.5〜10μＭ）
およびPAPS（40μＭ）に、乳ガン細胞（ラット乳ガン）
の細胞質分画（0.5mg/0.5ml）あるいは細胞膜分画（0.5
mg/0.5ml）を加え、37℃で30分間インキュベートした。
ついでエーテルで抽出（0.5ml×２）し、水層（0.05m
l）にアリールスルファターゼ（10μｇ）0.2Mアセテー
ト緩衝液（pH5.5）溶液（0.5ml）を加え、55℃で１時間
インキュベートした。さらに反応液をエーテルで抽出
（0.5ml×２）し、有機層を窒素ガスで乾固した。That is, catechol estrogen (0.5-10 μM)
And PAPS (40 μM), breast cancer cells (rat breast cancer)
Cytoplasmic fraction (0.5 mg / 0.5 ml) or cell membrane fraction (0.5
(mg / 0.5 ml) was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes.
Then, extract with ether (0.5 ml x 2), and extract the water layer (0.05 m
Arylsulfatase (10 μg) 0.2 M acetate buffer (pH 5.5) solution (0.5 ml) was added to the above l), and the mixture was incubated at 55 ° C. for 1 hour. Further, the reaction solution was extracted with ether (0.5 ml × 2), and the organic layer was dried with nitrogen gas.
実施例５に従ってカテコールエストロゲンの量を測定
した。同時にブランクテストとして、熱処理各分画を用
いたものについても行って測定値を補正した。The amount of catechol estrogen was measured according to Example 5. At the same time, as a blank test, a test using each heat-treated fraction was also performed to correct the measured values.
４−ヒドロキシエストロンについて、このアッセイに
よって得られた硫酸抱合体の生成量は、第３図のとおり
であった。添加回収テストの結果は、次の表に示したと
おりである。For 4-hydroxyestrone, the amount of sulfate conjugate produced by this assay was as shown in FIG. The results of the addition recovery test are shown in the following table.
２−ヒドロキシエストロン−モノ−サルフェート、４
−ヒドロキシエストラジオール−モノ−サルフェートは
10〜50ngの範囲で、また２−ヒドロキシエストラジオー
ル−モノ−サルフエート、４−ヒドロキシエストロン−
モノ−サルフェートは５〜50ngの範囲で一定の回収率で
あり、良好な再現性で定量できることが明らかになっ
た。2-hydroxyestrone-mono-sulfate, 4
-Hydroxyestradiol-mono-sulfate is
In the range of 10 to 50 ng, 2-hydroxyestradiol-mono-sulfate, 4-hydroxyestrone-
It was revealed that mono-sulfate had a constant recovery rate in the range of 5 to 50 ng and could be quantified with good reproducibility.
また、カテコールエストロゲンスルホトランスフェラ
ーゼのVmax（酵素最大速度）とKm（ミハイル定数）を求
めたところ、細胞質分画にこの酵素は局在化しているこ
とがわかった。In addition, when Vmax (maximum enzyme rate) and Km (Mikhail constant) of catechol estrogen sulfotransferase were determined, it was found that this enzyme was localized in the cytoplasmic fraction.
第１図および第２図は、各々２−ヒドロキシエストロン
および４−ヒドロキシエストロンの標準曲線を示したも
のである。 第３図は、４−ヒドロキシエストロンの硫酸抱合体生成
量との関係を示したものである。1 and 2 show the standard curves of 2-hydroxyestrone and 4-hydroxyestrone, respectively. FIG. 3 shows the relationship between 4-hydroxyestrone and the amount of sulfate conjugate formation.
Claims (4)
〜４の整数、−NH−Ｐはタンパク質からアミノ基の水素
原子１個を除いた残基、R1およびR2は、各々別異にＨま
たはOHを示す） で示される抗体産生用試薬を抗原とすることにより製造
されたカテコールエストロゲンに対して特異性を示す抗
体と、標識化したカテコールエストロゲンとからなるカ
テコールエストロゲンのイムノアッセイキッド。1. The following formula (A in the formula is = N-O- or -O-CO-, and n is 1
To 4 integer, -NH-P is the residue obtained by removing one hydrogen atom of the amino group from a protein, R 1 and R 2, the antibody-producing reagent represented by each represents H or OH in different,) A catechol estrogen immunoassay kid comprising an antibody having specificity for catechol estrogen produced by using it as an antigen, and a labeled catechol estrogen.
ールエストロゲンを用いる特許請求の範囲第（１）項記
載のカテコールエストロゲンのイムノアッセイキッド。2. The immunoassay kit for catechol estrogen according to claim 1, which uses catechol estrogen labeled with a radioisotope.
性の検出に用いる特許請求の範囲第（１）項または第
（２）項記載のカテコールエストロゲンのイムノアッセ
イキッド。3. The immunoassay kid of catechol estrogen according to claim 1, which is used for detecting catechol estrogen properties in breast cancer.
（１）項または第（２）項記載のカテコールエストロゲ
ンのイムノアッセイキッド。4. A catechol estrogen immunoassay kid according to claim (1) or (2), which is used for diagnosis of breast cancer.
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|---|---|---|---|
| JP61235647A JP2517561B2 (en) | 1986-10-03 | 1986-10-03 | Category Estrogen Immunoassay Kit |
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- 1986-10-03 JP JP61235647A patent/JP2517561B2/en not_active Expired - Lifetime
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