JP2500312B2 - Human growth hormone production method - Google Patents
Human growth hormone production methodInfo
- Publication number
- JP2500312B2 JP2500312B2 JP61003499A JP349986A JP2500312B2 JP 2500312 B2 JP2500312 B2 JP 2500312B2 JP 61003499 A JP61003499 A JP 61003499A JP 349986 A JP349986 A JP 349986A JP 2500312 B2 JP2500312 B2 JP 2500312B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- base sequence
- dna
- gene
- bacillus
- growth hormone
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 title claims description 64
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 title claims description 62
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 title claims description 61
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 201
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 84
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 83
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 77
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 claims description 56
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims description 56
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 42
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 41
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 38
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 34
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 26
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 17
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 15
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 claims description 13
- 239000002585 base Substances 0.000 description 110
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 25
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 22
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 22
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 20
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 17
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 14
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 14
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 13
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 9
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 9
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 9
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 8
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 6
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 6
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 5
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 5
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 4
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 108700031632 somatrem Proteins 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 101900345593 Escherichia coli Alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L adenosine triphosphate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 2
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 2
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 2
- JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium bromide Chemical compound [Br-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,4-dinitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C([N+]([O-])=O)=C1O WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LNQVTSROQXJCDD-KQYNXXCUSA-N 3'-AMP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H]1O LNQVTSROQXJCDD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 208000031872 Body Remains Diseases 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- -1 phosphate ester Chemical group 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 208000003068 pituitary dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子の発現およびその結果産生された蛋
白質の分泌に関与する領域を含むDNA塩基配列の下流
に、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を含むDNA塩
基配列を結合させたDNA塩基配列が、バチルス属細菌で
複製可能なプラスミドに由来するDNAに結合しているこ
とを特徴とする組み換え体DNA分子に関するものであ
る。本発明は、特に、組み換え体DNA分子を用いて、バ
チルス属細菌を形質転換し、得られた形質転換株を培養
し、その培養上清からヒト成長ホルモンを回収すること
を特徴とするヒト成長ホルモンの生産法に関するもので
ある。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention binds a DNA base sequence containing a gene encoding human growth hormone downstream of a DNA base sequence containing a region involved in gene expression and secretion of a protein produced as a result. The present invention relates to a recombinant DNA molecule, characterized in that the DNA base sequence is bound to DNA derived from a plasmid capable of replicating in Bacillus bacteria. The present invention is particularly characterized in that a recombinant DNA molecule is used to transform a bacterium of the genus Bacillus, the obtained transformant is cultured, and human growth hormone is recovered from the culture supernatant thereof. It relates to the production method of hormones.
以下本発明の背景を説明する。The background of the present invention will be described below.
一般的に、動物の成長ホルモンは、脳下垂体好酸球性
細胞から分泌されるペプチドホルモンの一つである。ヒ
ト、ウシ、トリ、ヒツジなどの成長ホルモンは、いずれ
も191個のアミノ酸残基より成り、分子量は、22000であ
る。これらの成長ホルモンのアミノ酸残基については、
ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタではほぼ等しいが、ヒトの場
合は、これらと約35％の差がある。成長ホルモンの特徴
は、ヒトに対してはヒトの成長ホルモンのみが有効で、
一般的に、系統発生的に上位の動物の成長ホルモンは下
位の動物に有効であるが、逆方向は、無効である。ヒト
成長ホルモンの生理活性としては、成長促進作用の他、
タンパク質同化作用、脂質代謝作用糖代謝作用などが知
られている。Generally, animal growth hormone is one of the peptide hormones secreted by pituitary eosinophilic cells. Human, bovine, avian and ovine growth hormones are all composed of 191 amino acid residues and have a molecular weight of 22000. For the amino acid residues of these growth hormones,
In cows, horses, sheep and pigs, they are almost equal, but in humans there is a difference of about 35%. The characteristic of growth hormone is that only human growth hormone is effective for humans,
Generally, growth hormones in phylogenetically higher animals are effective in lower animals, but in the opposite direction are ineffective. The physiological activities of human growth hormone include growth-promoting action and
Protein anabolic action, lipid metabolism action, sugar metabolism action and the like are known.
たとえば、逆子出産などが原因で成長ホルモンの分泌
が停止すると身長が著しく低い下垂体性小人症となる。
この場合、成長期にある子供のうちに成長ホルモンを投
与して治療することにより、ほぼ正常の身長に到達する
ことが可能である。しかしながら、現在のヒト成長ホル
モンの生産は、ヒト遺体の脳下垂体摘出によってなされ
ている。この方法では、ヒト成長ホルモンの生産性は極
めて低いことから、ヒト成長ホルモンの充分な供給が不
可能である。更に、遺体からのヒト成長ホルモン生産に
伴う大きな問題点としてウイルスの混入による投与患者
の死亡が指摘される（Annals of Internal Medisine 10
3（２）288（1985））に至り、遺体に依存しない新たな
ヒト成長ホルモンの生産法の確立が熱望されることとな
った。遺体に依存しない生産方法としては、組み換えDN
A利用技術の応用が考えられる。しかしながら、現在時
点において実用化可能な遺伝子組み換えの方法は、宿主
として通常大腸菌を用いる。この場合は、大腸菌の菌体
内にヒト成長ホルモンが蓄積されるので、ヒト成長ホル
モンの精製は非常に困難となり、また、発熱物質の混入
が避けられず大きな問題となっている。さらに、大腸菌
で生産されるヒト成長ホルモンは、天然型ヒト成長ホル
モンと異なり、Ｎ−末端にメチオニンが付加しているメ
チオニル・ヒト成長ホルモンである。しかも、このメチ
オニル・ヒト成長ホルモンは、患者に対する血中抗体産
生レベルを上昇させる点から、該メチオニン残基のない
ヒト成長ホルモンの組み換えDNA利用技術を用いる生産
法の確立が望まれる。For example, when growth hormone secretion ceases due to birth of a child in babies, it causes pituitary dwarfism, which is extremely short in height.
In this case, it is possible to reach almost normal height by administering growth hormones to a growing child and treating the child. However, the current production of human growth hormone is performed by pituitary gland resection of human remains. Since the productivity of human growth hormone is extremely low in this method, it is impossible to supply human growth hormone sufficiently. Furthermore, death of treated patients due to virus contamination is pointed out as a major problem with human growth hormone production from the body (Annals of Internal Medisine 10
3 (2) 288 (1985)), it became eager to establish a new human growth hormone production method that does not depend on the body. Recombinant DN is a production method that does not depend on the body
A Possible application of utilization technology. However, the method of gene recombination which can be put into practical use at the present time usually uses E. coli as a host. In this case, since human growth hormone is accumulated in the cells of Escherichia coli, it is very difficult to purify human growth hormone, and contamination with a pyrogen is unavoidable, which is a serious problem. Further, human growth hormone produced in Escherichia coli is a methionyl human growth hormone in which methionine is added to the N-terminal, unlike natural human growth hormone. Moreover, since this methionyl human growth hormone increases the antibody production level in the blood for patients, it is desirable to establish a production method using recombinant DNA utilization technology of human growth hormone without the methionine residue.
この点に鑑み本発明者は、バチルス属細菌でのヒト成
長ホルモンの分泌生産に着目した。バチルス属細菌は、
優れた安全性と多量の蛋白質を菌体外へ分泌する能力を
有しており、古来納豆の製造にも用いられ、また、酵
素、アミノ酸、抗生物質等の生産用工業微生物としての
使用経験も長い（Debanov,“The Molecuar Biology of
the Bacilli"1 322,（1982） Academic Press）点から
安全性の高い優れた宿主であると考えられるものであ
る。In view of this point, the present inventor has focused on secretory production of human growth hormone in Bacillus bacteria. Bacillus bacteria are
It has excellent safety and the ability to secrete large amounts of protein outside the cells, and it has been used for the production of natto since ancient times, and also has experience in using it as an industrial microorganism for the production of enzymes, amino acids, antibiotics, etc. Long (Debanov, “The Molecuar Biology of
From the viewpoint of the Bacilli "1 322, (1982) Academic Press), it is considered to be an excellent host with high safety.
また、発現の結果産生された蛋白質の菌体内から菌体
外への分泌には、通常シグナル配列と呼ばれるポリペプ
チドが重要な働きをし、該シグナル配列は、菌体外に存
在する成熟蛋白質のＮ末端上流に結合した形で合成さ
れ、分泌の際の細胞膜通過の過程で除かれることが知ら
れている（G.Blobel,J.Cell.Biol.67,（1975））。即
ち、一般に分泌蛋白質は、菌体内でその成熟蛋白質のＮ
−末端上流ポリペプチドが付加した形の前駆体として合
成され、分泌時に成熟蛋白質のＮ−末端上流に存在する
ポリペプチド（一般にシグナルポリペプチドと呼ばれ
る）がプロセスされる訳である。この点から、バチルス
属細菌を宿主として、バチルス属細菌により多量に分泌
される蛋白質の前駆体における成熟蛋白質のＮ−末端上
流に存在するポリペプチドをヒト成長ホルモンのＮ−末
端上流に結合した形の融合蛋白質を菌体内で発現させる
と、該ポリペプチドの働きで融合蛋白質は、菌体内から
菌体外へ移動し、細胞膜通過の際に該ポリペプチドが除
かれる。即ち、このことによりメチオニル・ヒト成長ホ
ルモンでないヒト成長ホルモンの分泌生産が可能とな
る。菌体外に分泌されたヒト成長ホルモンは、菌体内に
蓄積された場合と異なり、精製が容易で、しかも、異物
混入の恐れを顕著に減少出来る。また、菌体あたりの生
産性も増加させることができる。これらのことから、バ
チルス属細菌を宿主としてヒト成長ホルモンを分泌生産
させることは、安全性と工業生産性の観点から、大きな
意義を有するものである。In addition, a polypeptide usually called a signal sequence plays an important role in the secretion of the protein produced as a result of the expression from the inside of the cell to the outside of the cell, and the signal sequence is a mature protein existing outside the cell. It is known that it is synthesized in a form linked to the N-terminal upstream and is eliminated in the process of cell membrane passage during secretion (G. Blobel, J. Cell. Biol. 67, (1975)). That is, in general, a secretory protein is the mature protein N
A polypeptide (-generally referred to as a signal polypeptide) existing upstream of the mature protein at the time of secretion is synthesized by being synthesized as a precursor in which the -terminal upstream polypeptide is added. From this point, in the case where a Bacillus bacterium is used as a host, a form in which a polypeptide existing upstream of the N-terminal of the mature protein in the precursor of a protein secreted in a large amount by the Bacillus is bound to the upstream of the N-terminal of human growth hormone When the above fusion protein is expressed in the microbial cells, the fusion protein moves from the microbial cells to the outside of the microbial cells, and the polypeptide is removed when passing through the cell membrane. That is, this enables the secretory production of human growth hormone that is not methionyl-human growth hormone. Human growth hormone secreted outside the cells is easy to purify, unlike the case where it is accumulated inside the cells, and the risk of contamination by foreign substances can be significantly reduced. Also, the productivity per cell can be increased. From these, secretory production of human growth hormone using Bacillus bacterium as a host has great significance from the viewpoint of safety and industrial productivity.
本発明者らはバチルス属細菌によるヒト成長ホルモン
の分泌生産法を確立するため、検討を重ねた結果、バチ
ルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼの遺
伝子の発現およびその結果産生された中性プロテアーゼ
の分泌に関与する領域を含むDNA塩基配列の下流に、ヒ
ト成長ホルモンをコードする遺伝子を含むDNA塩基配列
を結合させたDNA塩基配列が、バチルス属細菌で複製可
能なプラスミド、または、それに由来するDNA塩基配列
に結合していることを特徴とする組み換え体DNA分子を
創製し、該組み換え体DNA分子を用いて形質転換したバ
チルス属細菌を用いて、ヒト成長ホルモンを多量に菌体
外に分泌せしめることに成功し本発明を完成した。As a result of repeated studies to establish a secretory production method of human growth hormone by Bacillus bacterium, the present inventors have found that the expression of the neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens and the neutral protease produced as a result. A DNA base sequence in which a DNA base sequence containing a gene encoding human growth hormone is ligated to the downstream of the DNA base sequence containing a region involved in the secretion of bacillus A recombinant DNA molecule characterized by binding to a DNA base sequence was created, and a large amount of human growth hormone was extracellularly secreted using a Bacillus bacterium transformed with the recombinant DNA molecule. The present invention was completed successfully.
以下本発明を更に詳細に説明する。 The present invention will be described in more detail below.
本発明で言う遺伝子の発現に関与する領域とは、RNA
ポリメラーゼが認識し結合する領域である−35および−
10領域を含むプロモーター領域、およびRNAポリメラー
ゼにより合成されたmRNAがリボゾームと結合するための
DNA塩基配列をコードするリボゾーム結合領域を含むも
のである。これらの領域が遺伝子の発現に重要な役割を
果たし、これらの領域の構造は直接的に発現量に関係し
ていることは今日広く知られている（Rosenberg,M.,Cou
rt,D.:Ann.Rev.Genetics.1319（1979））。The region involved in the expression of a gene referred to in the present invention means RNA
Regions recognized and bound by polymerases -35 and-
Promoter region containing 10 regions, and mRNA synthesized by RNA polymerase for binding to ribosome
It contains a ribosome binding region encoding a DNA base sequence. It is widely known today that these regions play important roles in gene expression, and the structure of these regions is directly related to the expression level (Rosenberg, M., Cou.
rt, D.: Ann.Rev.Genetics.1319 (1979)).
バチルス属細菌を宿主菌として所望の蛋白質の遺伝子
を発現させる場合は、バチルス属細菌のRNAポリメラー
ゼおよびリボゾームが、プロモーター領域およびリボゾ
ーム結合領域の認識に関して厳格な特異性をもつため
（Charles P.Moran Jr.,らMol,Gen,Genent.,186 339（1
982））それらの領域が、バチルス属由来のものである
ことが望ましい（Goldfarb.D.S.,らNature 293,309（19
81））。When a gene of a desired protein is expressed using a Bacillus bacterium as a host bacterium, RNA polymerase and ribosomes of Bacillus have a strict specificity for recognition of a promoter region and a ribosome binding region (Charles P. Moran Jr. ., Et al Mol, Gen, Genent., 186 339 (1
982)) It is desirable that those regions are derived from the genus Bacillus (Goldfarb.DS, et al. Nature 293 , 309 (19
81)).
また、発現の結果産生された蛋白質の菌体内から菌体
外への分泌に関与する領域については、菌体外に存在す
る成熟蛋白質の上流部分に存在するポリペプチドをコー
ドするDNA塩基配列が重要なことがよく知られており、
該ポリペプチドは、菌体内で成熟蛋白のアミノ末端上流
に結合した形で合成され、分泌の際に細胞膜通過におい
て重要な役割を果たすことが明らかになっている（G.Bl
obel,J.Cell.Biol.67,835（1975））。Regarding the region involved in the secretion of the protein produced as a result of expression from the intracellular body to the extracellular body, the DNA base sequence encoding the polypeptide existing in the upstream portion of the mature protein existing outside the bacterial body is important. It is well known that
It has been revealed that the polypeptide is synthesized in the bacterial cell in a form linked to the amino-terminal upstream of the mature protein, and plays an important role in cell membrane passage during secretion (G.Bl).
obel, J. Cell. Biol. 67 , 835 (1975)).
実用上の観点からは、遺伝子の発現およびその結果産
生され蛋白質の分泌に関与する領域を含むDNA塩基配列
の下流に、異種遺伝子をコードするDNA塩基配列を含むD
NA塩基配列を結合させることが可能で、しかもバチルス
属細菌で複製可能な組み換え体DNA分子を創製する場合
は、高発現および大量分泌生産という点で菌体外に短時
間のうちに多量に分泌生産される菌体外酵素遺伝子を用
いることが非常に重要である。そのような酵素として
は、菌体外プロテアーゼ、α−アミラーゼ、レバンシュ
ークラーゼ等が知られておりそれらのいずれの酵素の遺
伝子も該組み換え体DNA分子の構築に用いられるが、本
発明者らは先に述べたような観点から、特にバチルス・
アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼが該細菌で
短時間の間に多量に分泌される蛋白質であることに注目
し、該中性プロテアーゼ遺伝子をバチルス・ズブチリス
を宿主菌としてクローン化し（MT-0150（FERM-BP-42
5））、そのDNA塩基配列をすでに決定し、該中性プロテ
アーゼ遺伝子の発現に関与するプロモーター領域および
発現した蛋白質の分泌に関与する領域を含む、中性プロ
テアーゼ遺伝子の全DNA塩基配列を明らかにした（特願
昭59-175158）。その結果、該中性プロテアーゼ遺伝子
には、分泌された中性プロテアーゼをコードするDNA塩
基配列の上流に663塩基対からなるオーブン・リーディ
ング・フレームが存在していることを見出した（H.Shim
ada.ら,J.Biotechnol.2 75（1985））。このことより、
該中性プロテアーゼ遺伝子には、菌体外中性プロテアー
ゼをコードするDNA塩基配列の上流に221アミノ酸からな
るプレプロペプチドをコードするDNA塩基配列が存在す
ることが明らかになった。該中性プロテアーゼは、菌体
内ではプレプロペプチドを結合した形の前駆体として、
合成される。しかしながら、菌体外に分泌された中性プ
ロテアーゼには、このプレプロペプチドが存在していな
い。このことは、このプレプロペプチドが、中性プロテ
アーゼの分泌の際に除去されるものであり、また、該中
性プロテアーゼの分泌において重要な役割を果たしてい
ると考えられる。即ち、従来知られている菌体外酵素の
前駆体蛋白質のＮ−末端に存在するペプチドは、20アミ
ノ酸から40アミノ酸からなるものである（Perlman.D.
J.,Mol.Biol.67,391（1983））。しかし、これらは、該
中性プロテアーゼのプレプロペプチドに比べ著しく小さ
い。然も、これらのペプチドを有する菌体外酵素の分泌
効率は、バチルス・アミロリキシファシエンスの中性プ
ロテアーゼに比べて低いものである。これらのことか
ら、該中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与する領域と
該中性プロテアーゼのプレプロペプチドは、この中性プ
ロテアーゼの高発現・多量分泌という性質に大きな影響
を与えていると考えられる。そこで、本発明者らは、従
来知られている菌体外酵素の前駆体のＮ−末端に存在す
るペプチドとこの中性プロテアーゼのプレプロペプチド
の相違点に着目しプレプロペプチドによりヒト成長ホル
モンの分泌を可能ならしめる組み換え体DNA分子の創製
を企図した。即ち、中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関
与する領域およびプレプロペプチドをコードするDNA塩
基配列とからなるDNA塩基配列（第１図）の下流に、ヒ
ト成長ホルモンをコードするDNA塩基配列を結合するこ
との可能なバチルス属で複製可能な組み換え体DNA分子p
ES150を作成した。次に、該組み換え体DNA分子pES150に
含まれる第１図に示したDNA塩基配列の下流にヒト成長
ホルモンをコードするDNA塩基配列を含むDNA塩基配列を
結合させた組み換え体DNA分子pES150-GH（MT-0155（FER
M BP-943））を作成した。From a practical point of view, a DNA base sequence encoding a heterologous gene is located downstream of a DNA base sequence containing a region involved in gene expression and the resulting protein secretion.
In the case of creating a recombinant DNA molecule capable of binding NA base sequence and capable of replicating in Bacillus bacterium, it is secreted in a large amount in a short period of time from the outside in terms of high expression and large-scale secretory production. It is very important to use the produced extracellular enzyme gene. As such an enzyme, extracellular protease, α-amylase, levansucrase, etc. are known, and the gene of any of these enzymes can be used for the construction of the recombinant DNA molecule. From the point of view mentioned above, especially Bacillus
Focusing on the fact that amyloliquefaciens neutral protease is a protein secreted in large quantities in the bacterium in a short time, the neutral protease gene was cloned using Bacillus subtilis as a host bacterium (MT-0150 ( FERM-BP-42
5)), its DNA base sequence has already been determined, and the entire DNA base sequence of the neutral protease gene including the promoter region involved in the expression of the neutral protease gene and the region involved in the secretion of the expressed protein is clarified. (Japanese Patent Application 59-175158). As a result, it was found that the neutral protease gene has an oven reading frame consisting of 663 base pairs upstream of the DNA base sequence encoding the secreted neutral protease (H. Shim.
ada. et al., J. Biotechnol. 275 (1985)). From this,
It was revealed that the neutral protease gene has a DNA base sequence encoding a prepropeptide consisting of 221 amino acids upstream of the DNA base sequence encoding extracellular neutral protease. The neutral protease, as a precursor in the form of a prepropeptide bound in the cells,
Is synthesized. However, this prepropeptide does not exist in the neutral protease secreted outside the cells. This suggests that this prepropeptide is removed during the secretion of the neutral protease and also plays an important role in the secretion of the neutral protease. That is, the peptide existing at the N-terminal of the precursor protein of a conventionally known extracellular enzyme is composed of 20 to 40 amino acids (Perlman.D.
J., Mol. Biol. 67, 391 (1983)). However, they are significantly smaller than the prepropeptide of the neutral protease. However, the secretion efficiency of the extracellular enzyme having these peptides is lower than that of the neutral protease of Bacillus amylolyxifaciens. From these, it is considered that the region involved in the expression of the neutral protease gene and the prepropeptide of the neutral protease have a great influence on the property of high expression and large secretion of the neutral protease. Therefore, the present inventors have paid attention to the difference between the peptide existing at the N-terminal of the precursor of a conventionally known extracellular enzyme and the prepro peptide of this neutral protease, and secreted human growth hormone by the prepro peptide. We attempted to create a recombinant DNA molecule that would enable That is, a DNA base sequence encoding human growth hormone can be linked downstream of a DNA base sequence (FIG. 1) consisting of a region involved in expression of a neutral protease gene and a DNA base sequence encoding a prepropeptide. A possible recombinant Bacillus-replicating recombinant DNA molecule p
Created ES150. Next, a recombinant DNA molecule pES150-GH (wherein a DNA base sequence containing a DNA base sequence encoding human growth hormone is linked downstream of the DNA base sequence shown in FIG. 1 contained in the recombinant DNA molecule pES150 ( MT-0155 (FER
M BP-943)) was created.
次に、該組み換え体DNA分子pES150-GHで形質転換した
バチルス属細菌によるヒト成長ホルモンの発現・分泌に
検討を加えた。その結果、本発明者らが期待したよう
に、該中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与する領域お
よびプレプロペプチドをコードするDNA塩基配列とから
なるDNA塩基配列を用いることにより、ヒト成長ホルモ
ン遺伝子を強力に発現させその結果産生されたヒト成長
ホルモンを培地中に極めて多量に分泌させうることを見
出し、本発明を完成した。分泌されたヒト成長ホルモン
の量は、培地１あたり50mgに到達した。この量は、人
脳下垂体から抽出した場合、12.5人分の人脳下垂体を必
要とするものである。Next, the expression / secretion of human growth hormone by Bacillus bacteria transformed with the recombinant DNA molecule pES150-GH was examined. As a result, as expected by the present inventors, by using a DNA base sequence consisting of a region involved in the expression of the neutral protease gene and a DNA base sequence encoding a prepropeptide, the human growth hormone gene was The present invention has been completed by finding that human growth hormone produced as a result of being expressed in Escherichia coli can be secreted into a medium in an extremely large amount. The amount of human growth hormone secreted reached 50 mg / medium. This amount requires 12.5 human pituitary glands when extracted from human pituitary glands.
更に、本発明者らは、該中性プロテアーゼの発現に関
与する領域をコードするDNA塩基配列と該中性プロテア
ーゼのプレプロペプチドをコードするDNA塩基配列に種
々の長さの欠失を設けたDNA塩基配列とからなるDNA塩基
配列にも該中性プロテアーゼの高発現・多量分泌に関与
する性質が存在しているかどうかという点に着目しプレ
プロペプチド部分に欠失を設けたペプチドによりヒト成
長ホルモンの分泌を可能ならしめる組み換え体DNA分子
の創製を企画した。即ち、該中性プロテアーゼの発現に
関与する領域をコードするDNA塩基配列と該中性プロテ
アーゼのプレプロペプチドをコードするDNA塩基配列に
種々の長さの欠失を設けたDNA塩基配列とからなるDNA塩
基配列を作成した。次に、これらのDNA塩基配列と、ア
ミラーゼ遺伝子の発現に関与する領域をコードするDNA
塩基配列とアミラーゼの前駆体のＮ−末端に存在するポ
リペプチドをコードするDNA塩基配列とを欠くα−アミ
ラーゼ遺伝子を結合させた種々の組み換え体DNA分子を
作成した。さらに、これらの組み換え体DNA分子で形質
転換したバチルス属細菌が分泌産生するα−アミラーゼ
の量を調べることにより、これらのDNA断片の有する、
該α−アミラーゼ遺伝子を発現させてその結果産生され
たα−アミラーゼを分泌させる能力（産生・分泌能）に
検討を加えた。その結果、驚くべきことに、中性プロテ
アーゼの発現に関与する領域をコードするDNA塩基配列
と、該プレプロペプチドをコードするDNA塩基配列に欠
失を設けたDNA塩基配列とからなるDNA塩基配列のうち、
あるDNA塩基配列には、中性プロテアーゼの発現に関与
する領域およびプレプロペプチドをコードするDNA塩基
配列とからなるDNA塩基配列と同程度に、しかも、本来
のα−アミラーゼの発現に関与する領域をコードするDN
A塩基配列とアミラーゼの前駆体のＮ−末端に存在する
ポリペプチドをコードするDNA塩基配列とからなるDNA塩
基配列よりもα−アミラーゼ遺伝子を強力に発現させそ
の結果産生されたα−アミラーゼを多量に分泌させる能
力が存在していることを発見し、このような性質を有す
るDNA塩基配列を決定することに成功した。次に、該DNA
塩基配列（第２図）の下流に、たとえば、ヒト成長ホル
モンなどの異種遺伝子をコードするDNA塩基配列を含むD
NA塩基配列を結合させることが可能で、しかも、バチル
ス属細菌で複製可能な組み換え体DNA分子pES84を作成し
た。次に、該組み換え体DNA分子pES84に含まれる第２図
に示したDNA塩基配列の下流にヒト成長ホルモンをコー
ドするDNA塩基配列を結合させた組み換え体DNA分子phGH
928を作成した。Furthermore, the inventors of the present invention have prepared a DNA having various length deletions in the DNA base sequence encoding the region involved in the expression of the neutral protease and the DNA base sequence encoding the prepropeptide of the neutral protease. Focusing on whether or not the DNA base sequence consisting of the base sequence also has the property of being involved in high-expression / multi-secretion of the neutral protease, a peptide having a deletion in the prepropeptide portion of human growth hormone We planned to create a recombinant DNA molecule that would enable secretion. That is, a DNA consisting of a DNA base sequence encoding a region involved in the expression of the neutral protease and a DNA base sequence having various length deletions in the DNA base sequence encoding the prepropeptide of the neutral protease. A base sequence was created. Next, these DNA nucleotide sequences and the DNA encoding the region involved in the expression of the amylase gene
Various recombinant DNA molecules in which the α-amylase gene lacking the nucleotide sequence and the DNA nucleotide sequence encoding the polypeptide existing at the N-terminal of the amylase precursor were linked were prepared. Furthermore, by examining the amount of α-amylase secreted and produced by Bacillus bacteria transformed with these recombinant DNA molecules, these DNA fragments have,
The ability (production / secretion ability) of expressing the α-amylase gene and secreting the resulting α-amylase was examined. As a result, surprisingly, a DNA base sequence consisting of a DNA base sequence encoding a region involved in the expression of neutral protease and a DNA base sequence having a deletion in the DNA base sequence encoding the prepropeptide home,
A certain DNA base sequence has a region which is involved in the expression of neutral protease and a region which is involved in the expression of the original α-amylase, to the same extent as the DNA base sequence consisting of the DNA base sequence encoding the prepro peptide. DN to code
The α-amylase gene was expressed more strongly than the DNA base sequence consisting of the A base sequence and the DNA base sequence encoding the polypeptide existing at the N-terminal of the amylase precursor, and the resulting α-amylase was produced in large amounts. It was discovered that there is an ability to be secreted into Escherichia coli, and succeeded in determining a DNA base sequence having such a property. Next, the DNA
For example, D containing a DNA base sequence encoding a heterologous gene such as human growth hormone downstream of the base sequence (Fig. 2).
We have constructed a recombinant DNA molecule pES84 that can bind NA base sequence and is replicable in Bacillus bacterium. Next, a recombinant DNA molecule phGH in which a DNA base sequence encoding human growth hormone is bound downstream of the DNA base sequence shown in FIG. 2 contained in the recombinant DNA molecule pES84.
Created 928.
さらに、該組み換え体DNA分子phGH928でバチルス属細
菌（MT-0928（FERM BP-944））を形質転換した。次に、
得られた形質転換株によるヒト成長ホルモンの発現・分
泌に検討を加えた。その結果、驚くべきことに、本発明
者らは、該中性プロテアーゼの発現に関与するDNA塩基
配列と該プレプロペプチドをコードするDNA塩基配列に
或る長さの欠失を設けたDNA塩基配列とからなるDNA塩基
配列（第２図）に、中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関
与する領域およびプレプロペプチドをコードするDNA塩
基配列とからなるDNA塩基配列（第１図）と同程度にヒ
ト成長ホルモン遺伝子を強力に発現させその結果産生さ
れたヒト成長ホルモンを多量に培地中に分泌させる能
力、すなわち、培地１あたり30mgものヒト成長ホルモ
ンを分泌させる能力が存在していることを発見した。Further, a bacterium of the genus Bacillus (MT-0928 (FERM BP-944)) was transformed with the recombinant DNA molecule phGH928. next,
Studies were conducted on the expression and secretion of human growth hormone by the obtained transformants. As a result, surprisingly, the present inventors have found that a DNA nucleotide sequence involved in the expression of the neutral protease and a DNA nucleotide sequence encoding the prepropeptide have a certain length of deletion. To the same extent as the DNA base sequence (Fig. 1) consisting of a DNA base sequence consisting of and a DNA base sequence encoding the region involved in the expression of the neutral protease gene and the prepropeptide (Fig. 1). It has been discovered that there is the ability to strongly express the gene and to secrete large amounts of the human growth hormone produced in the medium, ie as much as 30 mg of human growth hormone per medium.
本発明のpES150及びpES84に含まれる第１図、第２図
に示したDNA塩基配列それぞれにヒト成長ホルモンを含
むDNA塩基配列を結合させる方法は、種々考えられる
が、pES150及びpES84にヒト成長ホルモンをコードするD
NA塩基配列を含むDNA塩基配列を結合させることが可能
であればいかなる方法を用いることも可能である。Although various methods can be considered for binding a DNA base sequence containing human growth hormone to each of the DNA base sequences shown in FIGS. 1 and 2 contained in pES150 and pES84 of the present invention, human growth hormone can be added to pES150 and pES84. Code D
Any method can be used as long as it can bind to a DNA base sequence containing an NA base sequence.
また、本発明の組み換え体DNA分子を構成するプラス
ミドとしては、バチルス属細菌で複製可能なものであれ
ばいかなるものでも使用可能であるが、通常よく用いら
れるものとしてはスタフィロコッカス由来のpUB110,pTP
5,pC194,pE194,pSA0510,pBD6等およびその誘導体を挙げ
ることができる。Further, as the plasmid constituting the recombinant DNA molecule of the present invention, any one can be used as long as it can be replicated in Bacillus bacterium, but as a commonly used one, pUB110 derived from Staphylococcus, pTP
5, pC194, pE194, pSA0510, pBD6 and the like and derivatives thereof can be mentioned.
本発明者らは、本発明の組み換え体DNA分子pES150-GH
及びphGH928を宿主菌となるバチルス属細菌へ導入する
ことにより、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を宿
主菌で発現させその結果産生されたヒト成長ホルモン
を、該宿主菌の培養液中に多量に分泌生産させて、培養
上清から簡単な工程で回収精製することが可能とならし
めた。We have found that the recombinant DNA molecule pES150-GH of the present invention.
And phGH928 were introduced into a bacterium belonging to the genus Bacillus to express a gene encoding human growth hormone in the host bacterium, and the resulting human growth hormone was secreted in a large amount in the culture solution of the host bacterium. It was made possible to produce and collect and purify from the culture supernatant by a simple process.
実際に、本発明組み換え体DNA分子pES150-GHとphGH92
8それぞれを用いて、バチルス・ズブチリスで、世界に
先駆けてヒト成長ホルモンを極めて効率的に培地中に分
泌生産させることに成功した。In fact, the recombinant DNA molecules of the invention, pES150-GH and phGH92
Using each of these, we succeeded in producing the human growth hormone in the medium extremely efficiently in secretory production in Bacillus subtilis, the first in the world.
以下具体例によって、本発明の組み換え体DNA分子pES
150及びpES150-GH及びpES84及びphGH928の創製法および
バチルス・ズブチリスを宿主菌としたヒト成長ホルモン
遺伝子の発現とその結果産生されたヒト成長ホルモンの
分泌生産について説明する。なお、本発明は以下の実施
例により何ら制限されるものでない。The recombinant DNA molecule pES of the present invention will be described below with reference to specific examples.
The method of creating 150 and pES150-GH and pES84 and phGH928, the expression of the human growth hormone gene using Bacillus subtilis as a host bacterium, and the secretory production of the resulting human growth hormone will be described. The present invention is not limited to the examples below.
実施例１ （バチルス アミロリキファシエンスの中性プロテアー
ゼ遺伝子を含むプラスミドの調製） バチルス・アミロリキファシエンスＦ株（ATCC2335
0）を肉汁培地（Difco社製ニュートリエントブロス）2l
を用いて37℃で15時間培養した後集菌し、Saito-Miura
の方法（Saito,H.,and Miura,K-I.,Biochem.Biophys ac
ta 72,619（1963））に従い10mgの精製染色体DNAを得
た。この染色体DNA500μｇを制限酵素Sau3AI（宝酒造
製）100単位を用いて37℃で５分間反応させた。反応系
の組成は10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、7mM MgC
l2、100mM NaClである。反応後１μｇのDNAを供試し１
％アガロースゲル電気泳動により調べた結果、本反応物
は2kb-8kbのサイズのDNAフラグメントを主とする供与染
色体の部分切断物であることが認められた。そこで本反
応物の残り全量を0.7％低融点アガロースゲル電気泳動
により100V3時間泳動しおよそ1.5kb-9kb部分のゲルを切
り出し、フェノール抽出およびクロロホルム抽出により
精製しエタノール沈澱によりDNAを回収した。この回収D
NAは、50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）200μｌに溶解
し、以後の反応に使用した。Example 1 (Preparation of plasmid containing neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens) Bacillus amyloliquefaciens F strain (ATCC2335
0) 2 liters of broth medium (Difco Nutrient Broth)
After culturing at 37 ℃ for 15 hours, the cells were collected, and Saito-Miura
Method (Saito, H., and Miura, KI., Biochem.Biophys ac
According to ta 72 , 619 (1963)), 10 mg of purified chromosomal DNA was obtained. 500 μg of this chromosomal DNA was reacted with 100 units of the restriction enzyme Sau3AI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 5 minutes. The composition of the reaction system is 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 7 mM MgC
l 2 , 100 mM NaCl. After the reaction, test 1 μg of DNA 1
As a result of examination by% agarose gel electrophoresis, it was confirmed that this reaction product was a partial cleavage product of a donor chromosome mainly consisting of a DNA fragment of 2 kb-8 kb in size. Then, the remaining whole amount of this reaction product was electrophoresed on 0.7% low melting point agarose gel for 100 V for 3 hours to cut out a gel of about 1.5 kb-9 kb portion, purified by phenol extraction and chloroform extraction, and recovered by ethanol precipitation. This recovery D
NA was dissolved in 200 μl of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and used in the subsequent reaction.
このようにして得た供与染色体のDNA断片を、制限酵
素BamHI（宝酒造製）で完全に切断して大腸菌アルカリ
性ホスファターゼ（Worthigton社製）で末端リン酸エス
テルを加水分解したプラスミドpUB110に結合した。The DNA fragment of the donor chromosome thus obtained was completely cleaved with the restriction enzyme BamHI (manufactured by Takara Shuzo) and ligated to the plasmid pUB110 in which the terminal phosphate ester was hydrolyzed with Escherichia coli alkaline phosphatase (manufactured by Worthigton).
pUB110のBamHI処理は、pUB110 100μｇ、BamHI（宝酒
造製）50単位で37℃４時間のインキュベーションで行っ
た。反応系の組成は、10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.
0）、7mM MgCl2、100mM NaCl、2mM 2−メルカプトエタ
ノール、0.01％ウシ血清アルブミンである。得られたBa
mHI切断pUB110はフェノール抽出を３回行いエタノール
沈澱で回収した。回収pUB110は次に大腸菌アルカリ性ホ
スファターゼ（Worthington社製BAPF）５単位、0.1Mト
リス−塩酸緩衝液（pH8.0）で65℃４時間インキュベー
ションすることで反応を行った。その後フェノール抽出
とエタノール沈澱を行いpUB110を回収した。回収pUB110
は100μｌの50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）で溶解し
た。BamHI treatment of pUB110 was performed by incubating 100 μg of pUB110 and 50 units of BamHI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 4 hours. The composition of the reaction system is 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.
0), 7 mM MgCl 2 , 100 mM NaCl, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0.01% bovine serum albumin. Obtained Ba
The mHI-cut pUB110 was extracted with phenol three times and recovered by ethanol precipitation. The recovered pUB110 was then reacted by incubating 5 units of Escherichia coli alkaline phosphatase (BAPF manufactured by Worthington) and 0.1 M Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0) at 65 ° C. for 4 hours. Then, phenol extraction and ethanol precipitation were performed to recover pUB110. Recovery pUB110
Was dissolved in 100 μl of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5).
かくして得られたBamHIおよびホスファターゼで処理
したpUB110と先に得た供与染色体DNA断片との結合をT4
リガーゼ（宝酒造製）を用いて行った。反応系の組成は
供与染色体断片50μｌ、pUB110 20μｌ、T4リガーゼ５
単位、66mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、6.6mM MgC
l2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP（アデノシン３
リン酸）である。反応は15℃で４時間行った。反応後一
部を用いて１％アガロースゲル電気泳動を行った結果、
ベクターであるpUB110と供与染色体DNAとが結合し組み
換え体DNA分子を形成していることが認められた。Thus obtained BamHI and the binding of the donor chromosomal DNA fragments obtained in pUB110 and previously treated with phosphatase T 4
Ligase (Takara Shuzo) was used. The composition of the reaction system is 50 μl of donor chromosome fragment, 20 μl of pUB110, T 4 ligase 5
Unit, 66 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 6.6 mM MgC
l 2 , 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP (adenosine 3
Phosphoric acid). The reaction was carried out at 15 ° C for 4 hours. As a result of 1% agarose gel electrophoresis using a part after the reaction,
It was found that the vector pUB110 and the donor chromosomal DNA bound to form a recombinant DNA molecule.
このようにして得られた組み換え体DNA分子による形
質転換はChangのプロトプラスト法（Chang,S.and Cohe
n,S.N.,Mol.Gen.Genet.168,111（1978））に従って実施
した。プロトプラストの再生培地には硫酸カナマイシン
を最終濃度100μg/mlとなるように加えた。クローニン
グの宿主菌にはバチルス・スプチリス1A274株（オハイ
オ大学バチルスストックセンター保存株）を用いた。Transformation with the recombinant DNA molecule thus obtained was carried out by the Chang's protoplast method (Chang, S. and Cohe
n, SN, Mol. Gen. Genet. 168 , 111 (1978)). Kanamycin sulfate was added to the protoplast regeneration medium to a final concentration of 100 μg / ml. The Bacillus subtilis 1A274 strain (Ohio University Bacillus Stock Center conserved strain) was used as the host bacterium for cloning.
形質転換によって得られたカナマイシン耐性株は、0.
8％カゼイン−40μg/mlカナマイシンを含むTBAB寒天培
地（Difco社製）に植え継ぎ37℃で14時間培養してコロ
ニーのまわりのハロー形成の有無を調べた。約１万株の
カナマイシン耐性株について調べた結果、１株（＃15
0）はコロニーのまわりに顕著に大きいハローを形成し
ていた。The kanamycin-resistant strain obtained by transformation was 0.
It was subcultured to TBAB agar medium (manufactured by Difco) containing 8% casein-40 μg / ml kanamycin and cultured at 37 ° C. for 14 hours to examine the presence or absence of halo formation around colonies. As a result of examining about 10,000 kanamycin resistant strains, one strain (# 15
0) formed a significantly large halo around the colony.
このようにして得た大ハローを形成する形質転換株＃
150をシングルコロニー単離して得た大ハロー形成株を
ペンアッセイ培地（Difco社製）50mlを用いて37℃14時
間培養集菌した。集菌菌体を50mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.5）、5mM EDTA、50mM NaClで洗浄したあとでアル
カリ法（Birnboim,H.C.and Poly,J.,Nucleic acidres.7
1513（1979））に依りプラスミドを調製した。得られ
たプラスミドを制限酵素EcoRIおよびBglII、BamHIで処
理した後１％アガロースゲル電気泳動で調べたところEc
oRI、BglIIで該プラスミドは１ケ所切断され、サイズは
6.2kbのものであることが、およびBamHIでは切断されな
いことが見出された。ベクターとして用いたpUB110のサ
イズは4.5kbでEcoRI、BglIIおよびBamHIにより１ケ所切
断されるものであるから大ハロー形成形質転換株から得
られたプラスミドにはpUB110のBamHI部位に約1.7kbの供
与染色体DNAすなわちバチルス アミロリキファシエン
スの中性プロテアーゼ遺伝子が挿入した組み換え体DNA
分子であることがわかった。この組み換え体プラスミド
をpNP150と名付けた。Transformant strain forming a large halo thus obtained #
The large halo-forming strain obtained by isolating 150 single colonies was cultured and collected at 37 ° C. for 14 hours using 50 ml of Pen assay medium (Difco). 50mM Tris harvested cells -. HCl buffer (pH7.5), 5mM EDTA, alkali method after washing with 50mM NaCl (Birnboim, HCand Poly, J., Nucleic acidres 7
1513 (1979)). The obtained plasmid was treated with restriction enzymes EcoRI, BglII, and BamHI and then examined by 1% agarose gel electrophoresis.
The plasmid was cut at one site with oRI and BglII, and the size was
It was found to be 6.2 kb and uncut with BamHI. The size of pUB110 used as a vector is 4.5 kb and it is cleaved at one site with EcoRI, BglII and BamHI. DNA, a recombinant DNA in which the neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens is inserted
It turned out to be a molecule. This recombinant plasmid was named pNP150.
このようにして得られた組み換え体プラスミドpNP150
はコンピテント法によりバチルス・ズブチリス1A20株
（オハイオ大学バチルスストックセンター保存株）を形
質転換した。コンピテント法の形質転換はAnagnostopou
los-Spizizenの方法（Anagnostopoulos,C.,and Spizize
n,J.J.Bacteriol.81 741（1961）に従った。約５μｇの
組み換え体DNA分子取り込み後の培養液（1ml）は0.8％
カゼイン−40μg/mlカナマイシン含有TBAB寒天培地に50
μｌずつプレーティングした。得られたカナマイシン耐
性形質転換株の100％が大ハロー形成株であった。The recombinant plasmid pNP150 thus obtained
Used the competent method to transform Bacillus subtilis 1A20 strain (Ohio University Bacillus Stock Center stock strain). Transformation of competent method is Anagnostopou
los-Spizizen method (Anagnostopoulos, C., and Spizize
n, JJBacteriol. 81 741 (1961). 0.8% of the culture solution (1 ml) after incorporating about 5 μg of recombinant DNA molecule
Casein-40 μg / ml 50 on TBAB agar containing kanamycin
μl was plated. 100% of the obtained kanamycin-resistant transformants were large halo-forming strains.
この形質転換株バチルスズブチルスMT-0150（FERM BP
-425）から、常法によりバチルス アミロリキファシエ
ンスの中性プロテアーゼを含むDNA塩基配列がプラスミ
ドpUB110に結合したプラスミドpNP150を調製した。This transformant Bacillus subtilis MT-0150 (FERM BP
-425), a plasmid pNP150 in which a DNA base sequence containing a neutral protease of Bacillus amyloliquefaciens was bound to the plasmid pUB110 was prepared by a conventional method.
実施例２ （第３図に示した工程に従った組み換え体DNA分子pES15
0の作成法） 実施例１で得たプラスミドpNP150を、制限エンドヌク
レアーゼSphIで切断すると約5.4kbの大フラグメントと
約1kbの小フラグメントを得た（第３図（ａ））。Example 2 (Recombinant DNA molecule pES15 according to the process shown in FIG. 3)
Construction method of 0) The plasmid pNP150 obtained in Example 1 was digested with the restriction endonuclease SphI to obtain a large fragment of about 5.4 kb and a small fragment of about 1 kb (Fig. 3 (a)).
この大フラグメントを低融点アガロースゲル電気泳動
法により分離回収した。回収したDNAは常法に従いカラ
ムクロマトグラフィーおよびフェノール抽出、エーテル
抽出、エタノール沈澱により精製した。This large fragment was separated and recovered by low melting point agarose gel electrophoresis. The recovered DNA was purified by column chromatography, phenol extraction, ether extraction, and ethanol precipitation according to a conventional method.
該精製DNA0.1μｇをT4リガーゼ５単位を用いて結合し
環状プラスミドとした（第３図（ｂ））。結合反応系の
組成は66mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、6.6MM MgCl
2、10mMジチオスライトール、2mM ATPである。反応は15
℃で３時間行なった。0.1 μg of the purified DNA was ligated with 5 units of T 4 ligase to give a circular plasmid (FIG. 3 (b)). The composition of the binding reaction system 66m M Tris - HCl buffer (pH7.5), 6.6M M MgCl
2, 10m M dithiothreitol, a 2m M ATP. Reaction is 15
It was performed at ℃ for 3 hours.
この反応混液を用いてバチルス ズブチリス1A510
（オハイオ大学バチルス ストックセンター保存株）を
プロトプラスト法により形質転換した。Bacillus subtilis 1A510 using this reaction mixture
(Ohio University Bacillus Stock Center stock strain) was transformed by the protoplast method.
得られたカナマイシン耐性形質転換株（MT-1150（FER
M BP-722）からアルカリ法によりプラスミドを抽出して
各種制限エンドヌクレアーゼを用いて物理地図を作成し
た。The resulting kanamycin-resistant transformant (MT-1150 (FER
Plasmids were extracted from M BP-722) by the alkaline method and physical maps were prepared using various restriction endonucleases.
その結果、得られたこのプラスミドpES150はバチルス
アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子の発
現に関与するDNA塩基配列およびプレープロ構造をコー
ドするDNA塩基配列（第２図に記載するDNA塩基配列）を
有し、プロ構造の切断点近傍のDNA塩基配列に存在するS
phI切断部位から下流の成熟菌体外中性プロテアーゼを
コードするDNA塩基配列が削除された形のプラスミドで
あることが確認された。As a result, the obtained plasmid pES150 has a DNA base sequence involved in the expression of the neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens and a DNA base sequence encoding the prepro structure (the DNA base sequence shown in FIG. 2). S that exists in the DNA base sequence near the breakpoint of the pro structure
It was confirmed that the plasmid was a form in which the DNA base sequence encoding the mature extracellular neutral protease downstream from the phI cleavage site was deleted.
第３図に示す様に、本プラスミドは唯一のSphI切断部
位を有し、該部位に直接或いはリンカー等を用いて間接
に所望の蛋白質をコードする領域を含むDNA塩基配列を
コドンの読みとりのずれがおきない様に結合すれば所望
の蛋白質を分泌生産する際に用いられる組換え体DNAが
容易に構築できる発現・分泌ベクターである。As shown in FIG. 3, this plasmid has a unique SphI cleavage site, and a DNA base sequence containing a region encoding a desired protein is directly or indirectly linked to the site by using a linker or the like to shift the codon reading. It is an expression / secretion vector that can be easily constructed to construct a recombinant DNA used for secretory production of a desired protein if it is ligated in such a way that it does not occur.
更にpES150 1μｇをSphIで切断して開環した後T4ポリ
メラーゼの有するエキソヌクレアーゼ活性を用いて突出
末端を除去し、第４図に示すDNA塩基配列を平滑末端ラ
イジェーションによって結合して第３図に示す組み換え
体DNA分子pSB150およびpBS150を構築した。Furthermore, 1 μg of pES150 was cleaved with SphI to open the ring, and then the protruding end was removed using the exonuclease activity of T 4 polymerase. The DNA base sequence shown in FIG. The recombinant DNA molecules pSB150 and pBS150 shown in the figure were constructed.
本発現・分泌ベクターは中性プロテアーゼのプロ構造
切断点をコードするDNA塩基配列の下流に第４図に示すD
NA塩基配列が結合しており、該配列中には制限エンドヌ
クレアーゼSmaIおよびBamHIの切断部位が存在する。This expression / secretion vector has a D sequence shown in Fig. 4 downstream of the DNA sequence encoding the pro-structural breakpoint of the neutral protease.
The NA base sequences are linked, and there are cleavage sites for the restriction endonucleases SmaI and BamHI in the sequences.
従って該切断部位のいずれかに所望の蛋白質をコード
する領域を含むDNA塩基配列をコドンの読みとりのずれ
がおきないように直接或いはリンカー等を用いて間接に
結合すれば所望の蛋白質を分泌生産する際に用いられる
組み換え体DNAが容易に構築できるものである。Therefore, if a DNA base sequence containing a region encoding the desired protein is bound to any of the cleavage sites directly or indirectly by using a linker or the like so as not to shift the codon reading, the desired protein is secreted and produced. Recombinant DNA used at that time can be easily constructed.
以下にpES150からのpSB150およびpBS150の造成に就い
て述べる。The construction of pSB150 and pBS150 from pES150 is described below.
１μｇのpES150をSphIを用いて常法に従い切断開環し
た。得られた線状pES150をフェノール抽出、エーテル抽
出およびエタノール沈澱に依って精製した。このものを
乾燥後32μｌの蒸留水に溶解し10倍濃度のT4ポリメラー
ゼ緩衝液４μｌ、2mMαNTP 2μｌおよびT4DNAポリメラ
ーゼ（宝酒造製）３単位を加えて37℃でインキュベート
した。1 μg of pES150 was cleaved and opened with SphI according to a conventional method. The linear pES150 obtained was purified by phenol extraction, ether extraction and ethanol precipitation. T 4 polymerase buffer 4μl of 10-fold concentration was dissolved in distilled water of the ones after drying 32 [mu] l, and incubated at 37 ° C. by adding 2m M αNTP 2μl and T 4 DNA polymerase (Takara Shuzo) 3 units.
30分後に150μｌのDNA緩衝液（10mMトリス−塩酸緩衝
液pH8.0、10mM KCl、0.1mM EDTA）を加えてフェノール
抽出、エーテル抽出、エタノール沈澱を行いDNAを精製
した。得られたDNAは乾燥後50μｌのトリス−塩酸緩衝
液（50mM、pH7.5）に溶解し、うち10μｇを以下の操作
に供した。150μl of DNA buffer after 30 minutes (10 m M Tris - HCl buffer pH8.0,10m M KCl, 0.1m M EDTA) were added phenol extraction, ether extraction, the DNA was purified perform ethanol precipitation. The DNA is tris dried 50 [mu] l - HCl buffer (50 m M, pH 7.5) was dissolved in the out 10μg was subjected to the following operation.
即ち、このDNA10μｌに別途合成法に依り調製した第
４図に示すDNA塩基配列0.2μｇを加えT4リガーゼにより
結合反応を行った。That is, to 10 μl of this DNA, 0.2 μg of the DNA base sequence shown in FIG. 4, which was separately prepared by a synthetic method, was added and a ligation reaction was performed with T 4 ligase.
反応系はT4リガーゼ（宝酒造製）20単位、66mMトリス
塩酸−緩衝液（pH7.5）、6.6mM MgCl2、10mMジチオス
ライトール、2mM ATPで、反応は４℃で20時間行なっ
た。Reaction system T 4 ligase (Takara Shuzo) 20 units, 66m M Tris-HCl - buffer (pH7.5), 6.6m M MgCl 2 , 10m M dithiothreitol, at 2m M ATP, reaction 20 hours at 4 ° C. I did.
尚、反応液は全量で50μｌとなるようにした。The total volume of the reaction solution was 50 μl.
かくして得られた反応液20μｌを用い、バチルス ズ
ブチリス1A510をプロトプラスト法により形質転換し
た。得られたカナマイシン耐性株からプラスミドを調製
し、常法に従い物理地図を作成した結果得られたプラス
ミドはSphI切断部位を有さず、SmaI、BamHIの切断部位
が各１か所存在するものであった。Using 20 μl of the reaction solution thus obtained, Bacillus subtilis 1A510 was transformed by the protoplast method. A plasmid was prepared from the obtained kanamycin-resistant strain and a physical map was prepared according to a conventional method. The resulting plasmid had no SphI cleavage site and had one SmaI and one BamHI cleavage site. It was
このものは第４図に示すDNA塩基配列の挿入方向によ
り２種類ありそれぞれpSB150およびpBS150と命名した。There are two types of these depending on the insertion direction of the DNA base sequence shown in FIG. 4, and they were named pSB150 and pBS150, respectively.
実施例３ 第５図に示した工程に従った本発明の組み換え体DNA分
子pES150-GHの作成法と該組み換え体DNA分子pES150-GH
によるヒト成長ホルモンの分泌生産 プラスミドpGH20は、ヒト成長ホルモンの分泌に関与
する分泌シグナル部分を削除した成長ホルモンの成熟蛋
白質をコードするDNA塩基配列を含むDNA塩基配列の両端
に制限酵素EcoRI切断部位および制限酵素PvuII切断部位
が存在するように、合成DNAリンカーを用いて造成した
ものである。Example 3 A method for producing the recombinant DNA molecule pES150-GH of the present invention according to the process shown in FIG. 5 and the recombinant DNA molecule pES150-GH
Secretory production of human growth hormone by the plasmid pGH20 contains a restriction enzyme EcoRI cleavage site at each end of the DNA base sequence containing the DNA base sequence encoding the mature protein of growth hormone in which the secretory signal part involved in the secretion of human growth hormone is deleted. It was constructed using a synthetic DNA linker so that a restriction enzyme PvuII cleavage site exists.
まず、該プラスミドpGH20を制限酵素EcoRIと制限酵素
PvuIIとで分解し約900bpからなるヒト成長ホルモンをコ
ードするDNA塩基配列を含むDNA塩基配列（hGH構造遺伝
子）を得た（第５図ａ）。次いで、該hGH構造遺伝子の
両末端を、T4DNAポリメラーゼＩ（宝酒造製）を用い
て、平滑末端としたDNA断片（DNA断片Ａ）を得た（第５
図ｂ）。反応系及び反応条件は、hGH構造遺伝子0.5μ
ｇ、それぞれ2mMのdATP,dCTP,dGTP,dTTP（いずれも宝酒
造製）の混合液１μｌ、ニック トランスレーション
バッファー（0.5Mトリス塩酸緩衝液（pH7.2）、0.1M Mg
Cl2、1mMジチオスレイトール,500μg/mlウシ血清アルブ
ミン）2.5μｌ、水10μｌで、反応温度22℃、反応時間1
5分,T4DNAポリメラーゼI 2Unitsである。First, the plasmid pGH20 was digested with the restriction enzyme EcoRI and the restriction enzyme.
After digestion with PvuII, a DNA base sequence (hGH structural gene) containing a DNA base sequence encoding human growth hormone of about 900 bp was obtained (Fig. 5a). Then, using T4 DNA polymerase I (Takara Shuzo), both ends of the hGH structural gene were blunt-ended to obtain a DNA fragment (DNA fragment A) (5th).
Figure b). The reaction system and reaction conditions are hGH structural gene 0.5μ
g, 2 μM each of dATP, dCTP, dGTP, dTTP (all manufactured by Takara Shuzo) 1 μl, Nick Translation
Buffer (0.5M Tris-HCl buffer (pH7.2), 0.1M Mg
Cl 2 , 1 mM dithiothreitol, 500 μg / ml bovine serum albumin) 2.5 μl, water 10 μl, reaction temperature 22 ° C., reaction time 1
5 minutes, T4 DNA Polymerase I 2 Units.
一方、制限酵素BamHIで切断したpES150の両末端を、T
4DNAポリメラーゼＩ（宝酒造製）を用いて平滑末端とし
たDNA断片（DNA断片Ｂ）を得た（第５図ｃ）。反応系及
び反応条件は、前述の通りである。On the other hand, both ends of pES150 cleaved with the restriction enzyme BamHI were
A blunt-ended DNA fragment (DNA fragment B) was obtained using 4DNA polymerase I (Takara Shuzo) (Fig. 5c). The reaction system and reaction conditions are as described above.
次に、DNA断片0.2μｇとDNA断片B0.3μｇとをT4DNAポ
リメラーゼ（宝酒造製）を用いて結合させた（第５図
ｄ）。反応系及び反応条件は、前述の通りである。Next, 0.2 μg of the DNA fragment and 0.3 μg of the DNA fragment B were ligated using T4 DNA polymerase (Takara Shuzo) (FIG. 5d). The reaction system and reaction conditions are as described above.
この反応混液を用いてバチルス ズブチリス1A289株
をプロトプラスト法を用いて形質転換し、１％澱粉を含
有するDM-3−カナマイシン（150μg/ml）培地上で大型
ハローを形成しないコロニーから20株を選択した。Using this reaction mixture, Bacillus subtilis 1A289 strain was transformed by the protoplast method, and 20 strains were selected from colonies that did not form a large halo on DM-3-kanamycin (150 μg / ml) medium containing 1% starch. did.
該形質転換株をBY培地（カナマイシン５μg/ml添加）
で30℃18時間培養し、その培養上清を用いてEIA法によ
りヒト成長ホルモン活性を測定した。The transformant is used in BY medium (kanamycin 5 μg / ml added)
After culturing at 30 ° C. for 18 hours, human growth hormone activity was measured by the EIA method using the culture supernatant.
その結果、＃25形質転換株（MT-0155（FERM BP-94
3））は、50mg/lのヒト成長ホルモンを培地上清中に分
泌していることが認められた。As a result, the # 25 transformant (MT-0155 (FERM BP-94
3)) was found to secrete 50 mg / l human growth hormone into the culture medium supernatant.
次に、pES150GHDNAのDNA塩基配列をマキサム・ギルバ
ート法で決定した。その結果、該組み換え体DNA分子pES
150GHは、第２図に示した中性プロテアーゼ遺伝子の発
現に関与する領域およびプレプロタンパクをコードする
DNA塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコードするD
NA塩基配列が、合成DNAリンカーを介して結合しているD
NA塩基配列（第９図）を含んでいる組み換え体DNA分子
であることが認められた。Next, the DNA base sequence of pES150GHDNA was determined by the Maxam-Gilbert method. As a result, the recombinant DNA molecule pES
150GH encodes a region and preproprotein involved in the expression of the neutral protease gene shown in FIG.
D, which encodes human growth hormone, is located downstream of the DNA sequence.
NA base sequence is linked via synthetic DNA linker D
It was confirmed to be a recombinant DNA molecule containing the NA base sequence (Fig. 9).
実施例４ プレプロタンパクをコードするDNA塩基配列に種々の長
さの欠失を設けたDNA塩基配列を有するDNA断片の作成法
およびその分泌能の検定。Example 4 A method for preparing a DNA fragment having a DNA base sequence having deletions of various lengths in a DNA base sequence encoding a preproprotein and an assay of its secretory ability.
中性プロテアーゼ遺伝子の発現およびその結果産生され
た蛋白質の分泌に関与する領域は、バチルス・アミロリ
キファシエンス由来の中性プロテアーゼ遺伝子とプラス
ミドpUB110 DNAから成るプラスミドpNP150 DNAから、エ
キソヌクレアーゼ（Ba131）を用いて、中性プロテアー
ゼ遺伝子のプレプロペプチドをコードするDNA塩基配列
に種々の長さの欠失を設けたDNA塩基配列を含むDNA断片
を調製した。pNP150DNAは、実施例１に述べた様にして
調製した。このようにして得られたプラスミドpNP150DN
A 10μｇを制限酵素PvuI（ベーリンガー・マンハイム社
製）10単位を用いて、37℃で１時間反応させ完全に切断
した（第７図（ａ））。そのPvuI切断DNAは、フェノー
ル抽出を三回繰り返し、残留するフェノールをエーテル
抽出により除去したのち、エタノール沈澱を行って回収
した。その回収DNAは、エキソヌクレアーゼBa131（ベー
リンガー・マンハイム社製）10単位を用いて30℃で50分
間反応させた（第７図（ｂ））。反応系の組成は、20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH8.1）1mM EDTA,12mM CaCl2,12m
M MgCl2,600mM NaClである。反応終了後、フェノール抽
出、エーテル抽出、エタノール沈澱を順次行った後、DN
Aを回収した。回収DNA（以後、エキソヌクレアーゼ処理
DNAと称す。）は、50μｌの50mMトリス−塩酸緩衝液（p
H7.5）（以後、DNAバッファーと称す。）に溶解した。
その溶解液のDNA濃度を定量したところ、エキソヌクレ
アーゼ処理DNA溶液のDNA濃度は、0.1μg/μｌであっ
た。この行程によりプラスミドpNP150のプレプロペプチ
ドをコードするDNA塩基配列に種々の長さの欠失を設け
たDNA断片が得られた。これらのDNA断片が有する種々の
長さのプレプロペプチドをコードする領域の分泌能を調
べるためにそれ自身の分泌シグナルを欠くα−アミラー
ゼ遺伝子を用いてα−アミラーゼの菌体外へ分泌生産さ
れる量について調べた。The region involved in the expression of the neutral protease gene and the secretion of the resulting protein is exonuclease (Ba131) from the plasmid pNP150 DNA consisting of the neutral protease gene from Bacillus amyloliquefaciens and the plasmid pUB110 DNA. It was used to prepare a DNA fragment containing a DNA base sequence having a deletion of various lengths in the DNA base sequence encoding the prepropeptide of the neutral protease gene. pNP150 DNA was prepared as described in Example 1. The plasmid pNP150DN thus obtained
A 10 μg of A was reacted with 10 units of a restriction enzyme PvuI (manufactured by Boehringer Mannheim) at 37 ° C. for 1 hour for complete cleavage (FIG. 7 (a)). The PvuI digested DNA was recovered by repeating phenol extraction three times, removing residual phenol by ether extraction, and then performing ethanol precipitation. The recovered DNA was reacted with 10 units of exonuclease Ba131 (manufactured by Boehringer Mannheim) at 30 ° C. for 50 minutes (FIG. 7 (b)). The composition of the reaction system is 20 mM
Tris-HCl buffer (pH 8.1) 1 mM EDTA, 12 mM CaCl 2 , 12 m
It is M MgCl 2 , 600 mM NaCl. After completion of the reaction, perform phenol extraction, ether extraction, and ethanol precipitation in that order, and then DN
A was recovered. Recovered DNA (hereafter treated with exonuclease
It is called DNA. ) Is 50 μl of 50 mM Tris-HCl buffer (p
H7.5) (hereinafter referred to as DNA buffer).
When the DNA concentration of the lysate was quantified, the DNA concentration of the exonuclease-treated DNA solution was 0.1 μg / μl. By this step, DNA fragments having deletions of various lengths in the DNA base sequence encoding the prepropeptide of plasmid pNP150 were obtained. To investigate the secretory ability of various length prepropeptide-encoding regions of these DNA fragments, the α-amylase gene is secreted and produced extracellularly using the α-amylase gene lacking its own secretion signal. I checked the quantity.
次に、分泌シグナルを欠くα−アミラーゼ遺伝子を、
該遺伝子を含むプラスミドpAM29を用いて調製した。プ
ラスミドpAM29は、α−アミラーゼの分泌に関与する分
泌シグナル部分を削除した成熟型α−アミラーゼをコー
ドするDNA塩基配列のＮ−末端側に制限酵素SmaI切断部
位、制限酵素BamHI切断部位を、またＣ末端側に制限酵
素HindIII切断部位、制限酵素PvuII切断部位が存在する
ように、合成DNAを用いて造成したものである。該プラ
スミド（10μｇ）を制限酵素SmaI（宝酒造製）10単位と
制限酵素PvuII（宝酒造製）10単位とで分解したのち、
１％アガロースゲル電気泳動を行って、1700塩基対から
成るα−アミラーゼの分泌に関与する分泌シグナル部分
を削除した成熟型α−アミラーゼをコードするDNA塩基
配列で、そのＮ末端には制限酵素BamHI切断部位をま
た、そのＣ末端には制限酵素HindIII切断部位を有するD
NA断片（以後、α−アミラーゼ構造遺伝子と称す。）を
３μｇ調製した（第７図（ｃ））。これを、30μｌのDN
Aバッファーに溶解した。ここで、得られたDNA断片と先
に述べたpNP150のプレプロペプチドをコードするDNA塩
基配列に種々の長さの欠失を設けたDNA断片との結合に
よる組み換え体DNA分子の作成は、下記の様にして行っ
た。すなわち、α−アミラーゼ構造遺伝子を溶解したDN
Aバッファー10μｌとエキソヌクレアーゼ処理DNA溶液10
μｌとを、大腸菌T4リガーゼ（宝酒造製）10単位を用い
て10℃で18時間反応させ、組み換え体DNA分子を作成し
た（第７図（ｄ））。この反応系の組成は、66mMトリス
−塩酸緩衝液（pH7.5）,6.6mM MgCl2,10mMジチオスレイ
トール、2mM ATP（アデノシン三リン酸）である。組み
換え体DNA分子を用いてバチルス・ズブチリスをプロト
プラスト法（Chang.S ＆ Cohen.S.N.,Mol.Gen.Genet.,1
68 111（1978））により形質転換した。該プロトプラス
ト再生培地には、硫酸カナマイシン（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）を100μg/ml、および可溶性デンプンを
最終の濃度１％になるように加えた。形質転換に用いた
宿主菌は、アミラーゼ生産能を欠くバチルス・ズブチリ
ス1A289株（オハイオ大学、バチルスストックセンター
保存株）を用いた。アミラーゼを分泌産生している形質
転換株の選択は、ヨード・ヨードカリ法（J.Bacteriol
119 416（1974））により行った。その結果、アミラー
ゼを分泌産生している形質転換株を78株得た。これらの
株をBY培地（0.5％肉エキス、0.2％イースト・エクスト
ラクト、0.2％NaCl、１％ポリペプトンおよびカナマイ
シン５μg/ml）で37℃で10時間振とう培養した後、遠心
分離法により菌体と培養上清とに分離した。次に、培養
上清に存在するα−アミラーゼの活性を、ジニトロサリ
チル酸を用いる可溶性デンプンからの還元基の生成を調
べる方法（Biochemica information IIp28-30 ベーリ
ンガー・マンハイム社製カタログ）により行った。この
方法により、得られた形質転換株の中から最も多量に
（野性株の300倍）α−アミラーゼを菌体外へ分泌する
形質転換株（＃84）を選択した。該形質転換株（＃84）
から、アルカリ法（Birnboim.H.C.らNucleic.Acids.Re
s.7 1513（1979））で組み換え体DNA分子（pNPA84）を
得た。該組み換え体DNA分子（pNPA84）のDNA塩基配列を
マキサム・ギルバート法（Maxam,A.M.＆ Gilbert,W.Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74 560（1977））で決定した。
その結果、pNPA84は、第１図に示したDNA塩基配列から
なるDNA断片の下流にα−アミラーゼ構造遺伝子が結合
したプラスミドであることが判明した。該α−アミラー
ゼ構造遺伝子は、それ自身の発現および分泌に関与する
領域を欠いている。このことから、第１図に示したDNA
塩基配列を有するDNA断片は、遺伝子を発現させその結
果産生された蛋白質を極めて効率よく分泌させる機能を
有していることが明らかになった。Next, the α-amylase gene, which lacks a secretory signal, is
It was prepared using the plasmid pAM29 containing the gene. The plasmid pAM29 has a restriction enzyme SmaI cleavage site and a restriction enzyme BamHI cleavage site at the N-terminal side of the DNA base sequence encoding mature α-amylase in which the secretion signal part involved in the secretion of α-amylase is deleted, and C It was constructed using synthetic DNA so that the restriction enzyme HindIII cleavage site and the restriction enzyme PvuII cleavage site were present on the terminal side. The plasmid (10 μg) was digested with 10 units of restriction enzyme SmaI (Takara Shuzo) and 10 units of restriction enzyme PvuII (Takara Shuzo),
A DNA base sequence encoding mature α-amylase in which the secretory signal portion that is involved in the secretion of α-amylase consisting of 1700 base pairs was deleted by 1% agarose gel electrophoresis, and the restriction enzyme BamHI was added at the N-terminus. D has a cleavage site and a restriction enzyme HindIII cleavage site at its C-terminus.
3 μg of NA fragment (hereinafter referred to as α-amylase structural gene) was prepared (FIG. 7 (c)). Add this to 30 μl DN
It was dissolved in A buffer. Here, preparation of a recombinant DNA molecule by ligation of the obtained DNA fragment and a DNA fragment having deletions of various lengths in the DNA base sequence encoding the prepropeptide of pNP150 described above was prepared by the following procedure. I went like this. That is, DN in which α-amylase structural gene was dissolved
A buffer 10 μl and exonuclease treated DNA solution 10
μl was reacted with 10 units of E. coli T 4 ligase (Takara Shuzo) at 10 ° C. for 18 hours to prepare a recombinant DNA molecule (FIG. 7 (d)). The composition of this reaction system is 66 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 6.6 mM MgCl 2 , 10 mM dithiothreitol, and 2 mM ATP (adenosine triphosphate). Using recombinant DNA molecules, Bacillus subtilis was protoplasted (Chang.S & Cohen.SN, Mol.Gen.Genet., 1
68 111 (1978)). To the protoplast regeneration medium, 100 μg / ml of kanamycin sulfate (Boehringer Mannheim) and soluble starch were added to a final concentration of 1%. As a host bacterium used for transformation, Bacillus subtilis 1A289 strain lacking amylase-producing ability (Ohio University, Bacillus stock center preservation strain) was used. The transformant that secretes and produces amylase is selected by the iodine-iodokali method (J. Bacteriol
119 416 (1974)). As a result, 78 transformants secreting and producing amylase were obtained. These strains were cultivated in BY medium (0.5% meat extract, 0.2% yeast extract, 0.2% NaCl, 1% polypeptone and kanamycin 5 µg / ml) at 37 ° C for 10 hours with shaking, and then the cells were centrifuged. And the culture supernatant were separated. Next, the activity of α-amylase present in the culture supernatant was measured by a method (Biochemica information IIp28-30 Boehringer Mannheim catalog) for examining the production of reducing groups from soluble starch using dinitrosalicylic acid. By this method, the transformant (# 84) which secreted the most abundant amount of α-amylase (300 times that of the wild-type strain) out of the cells was selected from the transformants obtained. The transformant (# 84)
From the alkaline method (Birnboim.HC et al. Nucleic.Acids.Re
s. 7 1513 (1979)), a recombinant DNA molecule (pNPA84) was obtained. The DNA base sequence of the recombinant DNA molecule (pNPA84) was determined by the Maxam-Gilbert method (Maxam, AM & Gilbert, W.Pro.
c.Natl.Acad.Sci.USA 74 560 (1977)).
As a result, it was revealed that pNPA84 was a plasmid in which the α-amylase structural gene was bound downstream of the DNA fragment consisting of the DNA base sequence shown in FIG. The α-amylase structural gene lacks regions involved in its own expression and secretion. From this, the DNA shown in FIG.
It was revealed that the DNA fragment having a nucleotide sequence has a function of expressing a gene and secreting the protein produced as a result thereof with extremely high efficiency.
実施例５ 第８図に示した工程に従った組み換え体DNA分子pES84の
作成法 実施例４により第１図に示したDNA塩基配列は異種遺
伝子の発現・分泌に有効であることが判明した。そこで
この領域を有する組み換え体DNA分子すなわち、中性プ
ロテアーゼ遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白
質の分泌に関与する領域の下流に所望の蛋白質の遺伝子
が結合可能な制限酵素切断部位を有するDNA塩基配列が
結合し、かつ、バチルス属細菌で複製可能な組み換え体
DNA分子pES84を創製した。以下、その創製法（第８図）
を示す。Example 5 Method for constructing recombinant DNA molecule pES84 according to the process shown in FIG. 8 It was revealed from Example 4 that the DNA base sequence shown in FIG. 1 is effective for expression / secretion of a heterologous gene. Therefore, a recombinant DNA molecule having this region, that is, a DNA base having a restriction enzyme cleavage site capable of binding the gene of the desired protein downstream of the region involved in the expression of the neutral protease gene and the secretion of the resulting protein Recombinant sequences that combine and are replicable in Bacillus bacteria
The DNA molecule pES84 was created. The creation method (Fig. 8)
Indicates.
中性プロテアーゼ遺伝子の発現およびその結果産生さ
れた蛋白質の分泌に関与する領域の調製は、実施例５の
第１図に示したDNA塩基配列を含むDNA断片を有する組み
換え体DNA分子pNPA84を用いて行った。該組み換え体DNA
分子pNPA84 DNAを形質転換株（＃84）よりアルカリ法
（Birnboim.H.C.らNucleic.Acids.Res.7 1513（197
9））で２μｇ調製した。続いて、このDNAを10μｌのDN
Aバッファーに溶解させた。このpNPA84DNAを含む溶液10
μｌを制限酵素BamHI（宝酒造製）と制限酵素HindIII
（宝酒造製）で分解したのち（第８図（ａ））、アガロ
ースゲル電気泳動法により、α−アミラーゼ構造遺伝子
を削除したDNA断片（以後、DNA断片Ｃと称す。）0.2μ
ｇを調製し、（第８図（ｂ））。これを２μｌのDNAバ
ッファーで溶解した。The region involved in the expression of the neutral protease gene and the secretion of the resulting protein was prepared by using the recombinant DNA molecule pNPA84 having a DNA fragment containing the DNA base sequence shown in FIG. 1 of Example 5. went. The recombinant DNA
Molecular pNPA84 DNA was transformed from the transformant (# 84) by the alkaline method (Birnboim.HC et al. Nucleic Acids.Res. 7 1513 (197
2 μg was prepared in 9)). Then, add this DNA to 10 μl of DN
It was dissolved in A buffer. Solution containing this pNPA84 DNA 10
µl of restriction enzyme BamHI (Takara Shuzo) and restriction enzyme HindIII
After digestion (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) (Fig. 8 (a)), 0.2 µm of a DNA fragment (hereinafter referred to as DNA fragment C) from which the α-amylase structural gene was deleted by agarose gel electrophoresis.
g (FIG. 8 (b)). This was dissolved in 2 μl of DNA buffer.
次に、所望の蛋白質を結合させることが可能な制限酵
素切断部位を有するDNA断片の化学合成を以下のように
行った（第８図（ｃ））。Next, a DNA fragment having a restriction enzyme cleavage site capable of binding a desired protein was chemically synthesized as follows (FIG. 8 (c)).
所望の蛋白質を結合させることが可能な制限酵素切断
部位を有するDNA断片の塩基配列は、第13図に示したご
とくである。第13図に示したDNA塩基配列の両方の鎖を
それぞれ定法に従い化学合成し精製した（大塚栄子、化
学の領域、35（10）762（1981））。合成DNA1μｇをそ
れぞれ10μｌのDNAバッファーに溶解させた。次に、両
一本鎖DNA間で再構成を行わせ第13図に示したDNA塩基配
列を有する二本鎖DNAを得た。再構成は、一本鎖DNAを含
むそれぞれ５μｌを混合後、90℃で５分間処理し、更
に、０℃で１時間放置する方法により二本鎖DNAを作成
した。（第８図（ｃ）） 前述の二本鎖DNAを含む溶液10μｌとDNA断片Ａを含む
溶液２μｌを大腸菌T4 DNAリガーゼ（宝酒造製）10単位
を用いて、４℃で16時間反応させることにより（第８図
（ｄ））、合成二本鎖DNAとDNA断片Ａとからなる組み換
え体DNA分子を作成した。この反応系の組成は、66mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.5）,6.6mM MgCl2、10mMジチオ
スレイトール、2mM ATP（アデノシン三リン酸）であ
る。これらの組み換え体DNA分子を用いてプロトプラス
ト法（前述）でバチルス・ズブチリス1A289株を形質転
換し、該形質転換株から、アルカリ法（前述）で組み換
えDNA分子を得た。該組み換え体DNA分子のDNA塩基配列
をマキサム・ギルバート法（前述）で決定した。その結
果、該組み換え体DNA分子は中性プロテアーゼ遺伝子の
発現およびその結果産生された蛋白質の分泌に関与する
領域の下流に、所望の蛋白質を結合させることの可能な
制限酵素切断部位を有するDNA塩基配列が結合したDNA断
片を有する組み換え体DNA分子pES84であることが判明し
た。さらに、組み換え体DNA分子pES84をプロトプラスト
法（前述）により、バチルス属細菌（MT-0207（FERM BP
-926））へ導入し、組み換え体DNA分子pES84を含む形質
転換株（MT-8400（FERM BP-923））を得た。The nucleotide sequence of a DNA fragment having a restriction enzyme cleavage site capable of binding a desired protein is as shown in FIG. Both strands of the DNA base sequence shown in Fig. 13 were chemically synthesized and purified according to a standard method (Etsuko Otsuka, Chemistry, 35 (10) 762 (1981)). 1 μg of synthetic DNA was dissolved in 10 μl of DNA buffer. Next, reconstitution was performed between both single-stranded DNAs to obtain double-stranded DNAs having the DNA base sequence shown in FIG. For reconstitution, 5 μl of each containing single-stranded DNA was mixed, treated at 90 ° C. for 5 minutes, and then left at 0 ° C. for 1 hour to prepare double-stranded DNA. (Fig. 8 (c)) 10 µl of the solution containing the double-stranded DNA and 2 µl of the solution containing DNA fragment A were reacted with 10 units of E. coli T 4 DNA ligase (Takara Shuzo) at 4 ° C for 16 hours. (FIG. 8 (d)), a recombinant DNA molecule composed of the synthetic double-stranded DNA and the DNA fragment A was prepared. The composition of this reaction system is 66 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 6.6 mM MgCl 2 , 10 mM dithiothreitol, and 2 mM ATP (adenosine triphosphate). These recombinant DNA molecules were used to transform the Bacillus subtilis 1A289 strain by the protoplast method (described above), and recombinant DNA molecules were obtained from the transformed strain by the alkaline method (described above). The DNA base sequence of the recombinant DNA molecule was determined by the Maxam-Gilbert method (described above). As a result, the recombinant DNA molecule has a DNA base having a restriction enzyme cleavage site capable of binding a desired protein downstream of the region involved in the expression of the neutral protease gene and the secretion of the resulting protein. It was found to be a recombinant DNA molecule pES84 with a DNA fragment with sequence ligation. Furthermore, recombinant DNA molecule pES84 was transformed into Bacillus bacterium (MT-0207 (FERM BP) by the protoplast method (described above).
-926)) to obtain a transformant containing the recombinant DNA molecule pES84 (MT-8400 (FERM BP-923)).
実施例６ 第10図に示した工程に従った本発明の組み換え体DNA分
子phGH928を用いたヒト成長ホルモン遺伝子のバチルス
・ズブチリスにおける発現とヒト成長ホルモンの分泌生
産 ヒト成長ホルモン遺伝子は、実施例３で示した該遺伝
子を含むプラスミドphGH20を用いて調製した。前述のよ
うに、該プラスミドphGH20を制限酵素EcoRI（宝酒造
製）と制限酵素PvuII（宝酒造製）とで分解し、約900塩
基対のヒト成長ホルモンをコードするDNA塩基配列を含
むDNA塩基配列（前述、DNA断片Ａ）を調製した（第10図
（ａ））。次に、T4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を用
いて該DNA断片Ｂの両末端を平滑末端としたDNA断片（DN
A断片Ｄ）を調製した（第10図（ｂ））（反応系及び反
応条件も前述の通りである）。実施例５で示した組み換
え体DNA分子pES84は、先ず制限酵素BamHI（宝酒造製）
で切断し（第10図（ｃ））、次いで、生じた両末端をT4
DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を用いて平滑末端とし
（第10図（ｄ））、DNA断片（DNA断片Ｅ）を得た（いず
れの反応系及び反応条件も前述の通りである）。このよ
うにして得られたDNA断片Ｅ（0.1μｇ）とDNA断片Ｄ
（0.1μｇ）とを、大腸菌T4DNAリガーゼ（宝酒造製）を
用いて反応させ、組み換え体DNA分子を作成した（第10
図（ｅ））、（反応条件、反応系の組成は、前述の通
り）。該組み換え体DNA分子を用い、バチルス・ズブチ
リス（MT-0207）をプロトプラスト法（前述）により、
形質転換し形質転換株（MT-0928（FERM BP-944））を得
た。次に、該形質転換株（MT-0928）をペンアッセイ培
地（Difco社製）を用いて、30℃で16時間振とう培養し
た後、遠心分離法により培養上清と菌体を分離した。培
養上清に含まれるヒト成長ホルモンの免疫活性の測定に
は、抗ヒト成長ホルモン血清を用いた酵素免疫測定法
（前述）を用いた。該形質転換株（MT-0928）の培養上
清に、ヒト成長ホルモンに対する免疫活性が認められ
た。その分泌生産量は、30mg/lであった。Example 6 Expression of human growth hormone gene in Bacillus subtilis and secretory production of human growth hormone using the recombinant DNA molecule phGH928 of the present invention according to the process shown in FIG. It was prepared using the plasmid phGH20 containing the gene shown in. As described above, the plasmid phGH20 was digested with a restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) and a restriction enzyme PvuII (Takara Shuzo) to obtain a DNA base sequence containing a DNA base sequence encoding human growth hormone of about 900 base pairs (see above). , DNA fragment A) was prepared (FIG. 10 (a)). Next, using T4 DNA polymerase (Takara Shuzo), both ends of the DNA fragment B were blunt-ended (DN
A fragment D) was prepared (Fig. 10 (b)) (the reaction system and reaction conditions are as described above). First, the recombinant DNA molecule pES84 shown in Example 5 was prepared using the restriction enzyme BamHI (Takara Shuzo).
(Fig. 10 (c)), and then both ends were cut with T4.
A blunt end was prepared using DNA polymerase (Takara Shuzo) (FIG. 10 (d)) to obtain a DNA fragment (DNA fragment E) (all reaction systems and reaction conditions are as described above). Thus obtained DNA fragment E (0.1 μg) and DNA fragment D
(0.1 μg) was reacted with E. coli T 4 DNA ligase (Takara Shuzo) to prepare a recombinant DNA molecule (No. 10).
(E)), (Reaction conditions and composition of reaction system are as described above). Using the recombinant DNA molecule, Bacillus subtilis (MT-0207) was prepared by the protoplast method (described above).
Transformation was performed to obtain a transformant (MT-0928 (FERM BP-944)). Next, the transformant (MT-0928) was shake-cultured for 16 hours at 30 ° C. using a pen assay medium (manufactured by Difco), and then the culture supernatant was separated from the cells by centrifugation. The enzyme immunoassay using anti-human growth hormone serum (described above) was used to measure the immune activity of human growth hormone contained in the culture supernatant. Immune activity against human growth hormone was observed in the culture supernatant of the transformant (MT-0928). Its secretory production was 30 mg / l.
該形質転換株（MT-0928）から、組み換え体DNA分子を
調製して調べた結果、第11図に示すもの（phGH928と命
名）であることが確認された。phGH928DNAのDNA塩基配
列をマキサム・ギルバート法（前述）で決定した。その
結果、該組み換え体DNA分子phGH928は、第１図に示した
遺伝子の発現およびその結果産生された蛋白質の分泌に
関与するDNA塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコ
ードするDNA塩基配列が、合成DNAリンカーを介して結合
しているDNA塩基配列（第12図）を含んでいる組み換え
体DNA分子であることが認められた。As a result of preparing and examining a recombinant DNA molecule from the transformant (MT-0928), it was confirmed to be the one shown in FIG. 11 (named phGH928). The DNA base sequence of phGH928DNA was determined by the Maxam-Gilbert method (described above). As a result, the recombinant DNA molecule phGH928 has a DNA base sequence encoding human growth hormone downstream of the DNA base sequence involved in the expression of the gene shown in FIG. 1 and the secretion of the protein produced as a result. It was found to be a recombinant DNA molecule containing a DNA base sequence (Fig. 12) linked via a synthetic DNA linker.
第１図は、組み換え体DNA分子pES84に含まれる遺伝子の
発現及びその結果産生された蛋白質の分泌に関与するDN
A塩基配列を示す図であり、 第２図は、組み換え体DNA分子pES150に含まれる遺伝子
の発現及びその結果産生された蛋白質の分泌に関与する
DNA塩基配列を示す図であり、 第３図は、組み換え体DNA分子pES150、pBS150、pSB150
の作成法を示す図であり、 第４図は、制限酵素切断部位を有するDNA断片を示す図
であり、 第５図は、組み換え体DNA分子pES150-GHの作成法を示す
図であり、 第６図は、組み換え体DNA分子pES150-GHの制限酵素地図
を示す図であり、 第７図は、中性プロテアーゼのプレプロタンパクをコー
ドするDNA塩基配列に種々の長さの欠失を設けたDNA断片
を作成し、分泌シグナルを欠くα−アミラーゼ遺伝子を
結合させた組み換え体DNA分子の作成法を示す図であ
り、 第８図は、組み換え体DNA分子pES84の作成法を示す図で
あり、 第９図は、組み換え体DNA分子pES150-GHに含まれている
DNA塩基配列を示す図であり、 第10図は、組み換え体DNA分子phGH928の作成法を示す図
であり、 第11図は、組み換え体DNA分子phGH928に含まれているDN
A塩基配列を示す図であり、 第12図は、組み換え体DNA分子phGH928の制限酵素地図を
示す図であり、 第13図は、制限酵素切断部位を有するDNA断片を示す図
である。 なお、第１図、第２図、第４図、第９図、第11図、第13
図において、Ａは、アデニンを、Ｃは、シトシンを、Ｇ
は、グアニンを、Ｔは、チミンをそれぞれ示す。 また、第３図、第５図、第６図、第７図、第８図、第10
図、第12図において Ｐは、中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与する領域で
あり、 P-Pは、中性プロテアーゼのプレプロペプチドをコード
するDNA塩基配列であり、 P-P′は、pES84に含まれる蛋白質の分泌に関与する領域
であり、 Mat.は、中性プロテアーゼをコードするDNA塩基配列で
あり、 アミで囲った部分は、α−アミラーゼをコードするDNA
塩基配列であり、 ぬり潰した部分は、ヒト成長ホルモンをコードするDNA
塩基配列であり、 小さいＶ字を記入した部分は、第13図に示すDNA塩基配
列からなるフラグメントである。FIG. 1 is a DN involved in the expression of the gene contained in the recombinant DNA molecule pES84 and the secretion of the resulting protein.
FIG. 2 is a diagram showing the A base sequence, and FIG. 2 is involved in the expression of the gene contained in the recombinant DNA molecule pES150 and the secretion of the resulting protein.
FIG. 3 is a diagram showing a DNA base sequence, and FIG. 3 shows recombinant DNA molecules pES150, pBS150, pSB150.
Fig. 4 is a diagram showing a method for constructing a recombinant DNA molecule pES150-GH, Fig. 4 is a diagram showing a DNA fragment having a restriction enzyme cleavage site, and Fig. 5 is a diagram showing a method for constructing a recombinant DNA molecule pES150-GH. FIG. 6 is a diagram showing a restriction enzyme map of recombinant DNA molecule pES150-GH, and FIG. 7 is a DNA in which deletions of various lengths are provided in a DNA base sequence encoding a preproprotein of a neutral protease. FIG. 8 is a diagram showing a method for producing a recombinant DNA molecule in which a fragment is produced and an α-amylase gene lacking a secretory signal is bound thereto, and FIG. 8 is a diagram showing a method for producing a recombinant DNA molecule pES84. Figure 9 contains the recombinant DNA molecule pES150-GH
FIG. 10 is a diagram showing a DNA base sequence, FIG. 10 is a diagram showing a method for producing a recombinant DNA molecule phGH928, and FIG. 11 is a DN contained in the recombinant DNA molecule phGH928.
FIG. 12 is a diagram showing a base sequence A, FIG. 12 is a diagram showing a restriction enzyme map of a recombinant DNA molecule phGH928, and FIG. 13 is a diagram showing a DNA fragment having a restriction enzyme cleavage site. Incidentally, FIG. 1, FIG. 2, FIG. 4, FIG. 9, FIG. 11, FIG.
In the figure, A is adenine, C is cytosine and G
Represents guanine, and T represents thymine. In addition, FIG. 3, FIG. 5, FIG. 6, FIG. 7, FIG.
In Fig. 12 and Fig. 12, P is a region involved in the expression of a neutral protease gene, PP is a DNA base sequence encoding a prepropeptide of neutral protease, and PP 'is a protein contained in pES84. It is a region involved in secretion, Mat. Is a DNA base sequence encoding a neutral protease, and a portion surrounded by amid is a DNA encoding α-amylase.
The nucleotide sequence is the DNA that encodes human growth hormone.
The base sequence, in which the small V-letter is entered, is a fragment consisting of the DNA base sequence shown in FIG.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 審査官 新見 浩一 (56)参考文献 特開 昭60−210986（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−203194（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−36499（ＪＰ，Ａ) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page Examiner Koichi Niimi (56) References JP-A-60-210986 (JP, A) JP-A-60-203194 (JP, A) JP-A-56-36499 (JP, A)
Claims (12)
プロテアーゼ遺伝子に由来し、該遺伝子の発現およびそ
の結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含むDN
A塩基配列の片方の鎖が下記に示す順序であることを特
徴とする塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコード
する遺伝子を含むDNA塩基配列を結合させたDNA塩基配列
が、バチルス属細菌で複製可能なプラスミド、または、
それに由来するDNA塩基配列に結合していることを特徴
とする組み換え体DNA分子。 1. A DN derived from a neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens and including a region involved in expression of the gene and secretion of a protein produced as a result.
One strand of the A base sequence is in the order shown below, downstream of the base sequence, a DNA base sequence in which a DNA base sequence containing a gene encoding human growth hormone is bound, in Bacillus bacteria A replicable plasmid, or
A recombinant DNA molecule characterized in that it is bound to a DNA base sequence derived from it.
プロテアーゼ遺伝子に由来し、該遺伝子の発現およびそ
の結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含むDN
A塩基配列の片方の鎖が下記に示す順序であることを特
徴とする塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコード
する遺伝子を含むDNA塩基配列を結合させたDNA塩基配列
が、バチルス属細菌で複製可能なプラスミド、または、
それに由来するDNA塩基配列に結合していることを特徴
とする組み換え体DNA分子。 2. A DN derived from a neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens and including a region involved in expression of the gene and secretion of a protein produced as a result.
One strand of the A base sequence is in the order shown below, downstream of the base sequence, a DNA base sequence in which a DNA base sequence containing a gene encoding human growth hormone is bound, in Bacillus bacteria A replicable plasmid, or
A recombinant DNA molecule characterized in that it is bound to a DNA base sequence derived from it.
プロテアーゼ遺伝子に由来し、該遺伝子の発現およびそ
の結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含むDN
A塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコードする遺
伝子を含むDNA塩基配列を結合させたDNA塩基配列の片方
の鎖が下記に示す順序であることを特徴とする塩基配列
が、バチルス属細菌で複製可能なプラスミド、または、
それに由来するDNA塩基配列に結合していることを特徴
とする組み換え体DNA分子。 3. A DN derived from a neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens and including a region involved in expression of the gene and secretion of the protein produced as a result.
A base sequence characterized by the fact that one strand of the DNA base sequence in which the DNA base sequence containing the gene encoding human growth hormone is bound downstream of the A base sequence is in the order shown below is a Bacillus bacterium. A replicable plasmid, or
A recombinant DNA molecule characterized in that it is bound to a DNA base sequence derived from it.
プロテアーゼ遺伝子に由来し、該遺伝子の発現およびそ
の結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含むDN
A塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコードする遺
伝子を含むDNA塩基配列を結合させたDNA塩基配列の片方
の鎖が下記に示す順序であることを特徴とする塩基配列
が、バチルス属細菌で複製可能なプラスミド、または、
それに由来するDNA塩基配列に結合していることを特徴
とする組み換え体DNA分子。 4. A DN derived from a neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens and containing a region involved in expression of the gene and secretion of the protein produced as a result.
A base sequence characterized by the fact that one strand of the DNA base sequence in which the DNA base sequence containing the gene encoding human growth hormone is bound downstream of the A base sequence is in the order shown below is a Bacillus bacterium. A replicable plasmid, or
A recombinant DNA molecule characterized in that it is bound to a DNA base sequence derived from it.
体DNA分子phGH928。5. A recombinant DNA molecule phGH928 shown in the restriction map of FIG.
体DNA分子pES150GH。6. A recombinant DNA molecule pES150GH shown in the restriction map of FIG.
プロテアーゼ遺伝子に由来し、該遺伝子の発現およびそ
の結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含むDN
A塩基配列の片方の鎖が下記に示す順序であることを特
徴とする塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコード
する遺伝子を含むDNA塩基配列を結合させたDNA塩基配列
が、バチルス属細菌で複製可能なプラスミド、または、
それに由来するDNA塩基配列に結合していることを特徴
とする組み換え体DNA分子で形質転換したバチルス属細
菌。 7. A DN derived from a neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens and including a region involved in expression of the gene and secretion of the protein produced as a result.
One strand of the A base sequence is in the order shown below, downstream of the base sequence, a DNA base sequence in which a DNA base sequence containing a gene encoding human growth hormone is bound, in Bacillus bacteria A replicable plasmid, or
A bacterium belonging to the genus Bacillus transformed with a recombinant DNA molecule, which is bound to a DNA base sequence derived from it.
プロテアーゼ遺伝子に由来し、該遺伝子の発現およびそ
の結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含むDN
A塩基配列の片方の鎖が下記に示す順序であることを特
徴とする塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコード
する遺伝子を含むDNA塩基配列を結合させたDNA塩基配列
が、バチルス属細菌で複製可能なプラスミド、または、
それに由来するDNA塩基配列に結合していることを特徴
とする組み換え体DNA分子で形質転換したバチルス属細
菌。 8. A DN derived from a neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens and including a region involved in expression of the gene and secretion of the protein produced as a result.
One strand of the A base sequence is in the order shown below, downstream of the base sequence, a DNA base sequence in which a DNA base sequence containing a gene encoding human growth hormone is bound, in Bacillus bacteria A replicable plasmid, or
A bacterium belonging to the genus Bacillus transformed with a recombinant DNA molecule, which is bound to a DNA base sequence derived from it.
プロテアーゼ遺伝子に由来し、該遺伝子の発現およびそ
の結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含むDN
A塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコードする遺
伝子を含むDNA塩基配列を結合させたDNA塩基配列の片方
の鎖が下記に示す順序であることを特徴とする塩基配列
が、バチルス属細菌で複製可能なプラスミド、または、
それに由来するDNA塩基配列に結合していることを特徴
とする組み換え体DNA分子で形質転換したバチルス属細
菌。 9. A DN derived from a neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens and including a region involved in expression of the gene and secretion of a protein produced as a result.
A base sequence characterized by the fact that one strand of the DNA base sequence in which the DNA base sequence containing the gene encoding human growth hormone is bound downstream of the A base sequence is in the order shown below is a Bacillus bacterium. A replicable plasmid, or
A bacterium belonging to the genus Bacillus transformed with a recombinant DNA molecule, which is bound to a DNA base sequence derived from it.
性プロテアーゼ遺伝子に由来し、該遺伝子の発現および
その結果産生された蛋白質の分泌に関与する領域を含む
DNA塩基配列の下流に、ヒト成長ホルモンをコードする
遺伝子を含むDNA塩基配列を結合させたDNA塩基配列の片
方の鎖が下記に示す順序であることを特徴とする塩基配
列が、バチルス属細菌で複製可能なプラスミド、また
は、それに由来するDNA塩基配列に結合していることを
特徴とする組み換え体DNA分子で形質転換したバチルス
属細菌。 10. A neutral protease gene of Bacillus amyloliquefaciens, which contains a region involved in expression of the gene and secretion of the protein produced as a result.
The base sequence characterized in that one strand of the DNA base sequence in which a DNA base sequence containing a gene encoding human growth hormone is bound downstream of the DNA base sequence is in the order shown below is a Bacillus bacterium. A bacterium belonging to the genus Bacillus transformed with a recombinant DNA molecule, which is bound to a replicable plasmid or a DNA base sequence derived therefrom.
え体DNA分子phGH928で形質転換したバチルス属細菌。11. A bacterium belonging to the genus Bacillus transformed with the recombinant DNA molecule phGH928 shown in the restriction map of FIG.
え体DNA分子pES150GHで形質転換したバチルス属細菌。12. A bacterium belonging to the genus Bacillus transformed with the recombinant DNA molecule pES150GH shown in the restriction enzyme map of FIG.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61003499A JP2500312B2 (en) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | Human growth hormone production method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61003499A JP2500312B2 (en) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | Human growth hormone production method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62163691A JPS62163691A (en) | 1987-07-20 |
| JP2500312B2 true JP2500312B2 (en) | 1996-05-29 |
Family
ID=11559040
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61003499A Expired - Lifetime JP2500312B2 (en) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | Human growth hormone production method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2500312B2 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1228925B (en) * | 1987-08-07 | 1991-07-10 | Eniricerche Spa | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF THE HUMAN GROWTH HORMONE |
| JP3869874B2 (en) * | 1995-11-15 | 2007-01-17 | 大日本住友製薬株式会社 | Acute liver failure treatment |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA802992B (en) * | 1979-06-01 | 1981-10-28 | Univ California | Human pre-growth hormone |
| JPH0634720B2 (en) * | 1984-04-03 | 1994-05-11 | 工業技術院長 | DNA sequences containing regions involved in protein expression and secretion |
| JPS60203194A (en) * | 1984-03-27 | 1985-10-14 | Takeda Chem Ind Ltd | Dna |
-
1986
- 1986-01-13 JP JP61003499A patent/JP2500312B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62163691A (en) | 1987-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cornet et al. | Characterization of two cel (cellulose degradation) genes of Clostridium thermocellum coding for endoglucanases | |
| JPH07108221B2 (en) | Rennin production method | |
| JPH0759193B2 (en) | Cloning vector for foreign protein expression | |
| JPH0687788B2 (en) | Method for producing bioactive peptide containing cysteine residue | |
| US5015574A (en) | DNA sequence involved in gene expression and protein secretion, expression-secretion vector including the DNA sequence and the method of producing proteins by using the expression-secretion vector | |
| EP0409098B1 (en) | The expression and secretion of mature human beta interleukin-1 in bacillus subtilis and means and methods for its achievement | |
| GB2171703A (en) | Expression-secretion vector | |
| JP3492935B2 (en) | Plasmid vector | |
| JP2500312B2 (en) | Human growth hormone production method | |
| US5084383A (en) | Bacillus subtilis strain whose extracellular protease activities are reduced, method for obtaining the strain and method for secreting proteins by using the strain | |
| JPH05284973A (en) | Recombinant plasmid and process for secreting and producing foreign protein using the plasmid as vector | |
| EP0216080B1 (en) | Novel plasmids and transformants | |
| JP2500311B2 (en) | Protein production method | |
| JP3504955B2 (en) | Novel DNA fragment, plasmid vector carrying the same, recombinant microorganism and method for producing protein using the same | |
| JPS6398389A (en) | Development of improved gene in yeast | |
| JP2560214B2 (en) | DNA sequence encoding a secretory signal peptide | |
| JP2507874B2 (en) | DNA sequence encoding a secretory signal peptide | |
| JPH0638741A (en) | Production of flounder growth hormone | |
| JPH0634720B2 (en) | DNA sequences containing regions involved in protein expression and secretion | |
| JP2538200B2 (en) | Polypeptide secretion expression vector and transformed microorganism | |
| JP2616784B2 (en) | High expression plasmid for human interleukin 1 polypeptide production | |
| JPH01273591A (en) | Human growth hormonal secretory plasmid, transformant using the same plasmid and method for secreting protein | |
| JP2671008B2 (en) | DNA encoding cyclomaltodextrin glucenotransferase, recombinant plasmid containing the same, and transformed microorganism containing the plasmid | |
| JPS61166400A (en) | Protein production | |
| JP2524695B2 (en) | Protein production method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |