JP2025524356A - ポリ（有機ホスファゼン）高分子を含む炎症性疾患の予防又は治療用組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、薬物を搭載した温度感受性ポリ（有機ホスファゼン）高分子及びそれを含む炎症性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物などに関するものであり、前記ヒドロゲルを含む注射可能な高分子ナノ粒子ヒドロゲルシステムは、長期間の抗炎症効果を有し、治療的有効濃度の薬物を徐放する効果があるため、変形性関節症などの様々な炎症疾患の予防及び治療に活用できる。

Description

本発明は、ポリ（有機ホスファゼン）高分子を含む炎症性疾患の予防又は治療用組成物などに関する。

変形性関節症（ＯＡ）は、変性関節疾患の最も一般的なタイプである。関節の退行及び炎症は、慢性疼痛、硬直及び再生することができない関節軟骨の進行性の損失につながる。変性関節は、変形性関節症の末期に人工補綴具に置き換えることができるが、人工補綴具も制限的であり、人工関節置換術のための追加の手術が必要な場合がある。自己軟骨細胞の関節内への投与（ＩＡ）、多血小板血漿などのその他の治療戦略、又は侵食された軟骨へのヒアルロン酸（ＨＡ）などの粘性物質の補充は、損傷した関節軟骨の再生のための他の解決策になり得る。しかし、このような方法の結果としての抗ＯＡ効果は、ＩＡの投与後の標的特異的作用及び体内維持時間が良くないため、満足のいくものではない。薬物療法としては、鎮痛剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、特定のシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）－２阻害剤、及びオピオイドの経口投与が可能であるが、この治療方法は、症状のある痛みの治療に制限的であり、炎症の局所治療にはほとんど効果がない［Ｂｕｃｈｍａｎ Ａ．Ｌ．Ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００１；３３（４）：２８９－２９４］。また、ＮＳＡＩＤ、ＣＯＸ－２阻害剤及びオピオイドは、胃腸（ＧＩ）システム、心臓及び脳に深刻な副作用を起こすことが知られている。したがって、胃腸関係、心臓、脳に基底疾患がある高齢者には、このような経口用薬物を慎重に処方しなければならない。標的部位における投与薬物のバイオアベイラビリティを高め、可能な限り全身の副作用を減らすために、メトトレキサート、ジクロフェナク及びトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）などのコルチコステロイドの直接的なＩＡ投与が可能である。しかし、これらの薬物の半減期は、それぞれ０．５６～２．９、５．２及び１．４７時間と知られており、体内で急速に消失することが報告されている［Ｌａｒｓｅｎ Ｃ．，Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｊ．，Ｌａｒｓｅｎ Ｓ．Ｗ．，Ｊｅｎｓｅｎ Ｈ．，Ｊａｃｏｂｓｅｎ Ｓ．，Ｌｉｎｄｅｇａａｒｄ Ｃ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ Ｐ．Ｈ．Ｉｎｔｒａ－ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｄｅｐｏｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ：ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｐａｉｎ ａｎｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２００８；９７（１１）：４６２２－４６５４．など］。このような短い滞留時間は、持続する炎症反応の減少には十分でない。

したがって、このような理由から、変形性関節症の究極の治療と初期段階での予防のための新しい方法について研究が進められている。長期間体内で活性を有する抗ＯＡ薬物送達システムを用いた潜在的な新しいＯＡ治療方法は、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、ヒドロゲルなどとして適用されており、数週から数ヶ月にわたって抗ＯＡ薬物放出持続期間がかなり延長されたことが分かった［Ｐｒａｄａｌ Ｊ．，Ｚｕｌｕａｇａ Ｍ．Ｆ．，Ｍａｕｄｅｎｓ Ｐ．，Ｗａｌｄｂｕｒｇｅｒ Ｊ．Ｍ．，Ｓｅｅｍａｙｅｒ Ｃ．Ａ．，Ｄｏｅｌｋｅｒ Ｅ．，Ｇａｂａｙ Ｃ．，Ｊｏｒｄａｎ Ｏ．，Ａｌｌｅｍａｎｎ Ｅ．Ｉｎｔｒａ－ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｐ３８ ＭＡＰＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０１５；９３：１１０－１１７．など］。しかし、このようなシステムは、標的部位の標的部位への正確な薬物送達には適しておらず、放出効率が低いことが示されている［Ｋｏｐｅｃｅｋ Ｊ．Ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：ａ ｓｍａｒｔ ｆｕｔｕｒｅ？ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００７；２８（３４）：５１８５－５１９２．］。

一方、ヒドロゲルベースの薬物送達システムは、薬物放出期間を延長することができ、滑液領域のように物理的に支持できる三次元（３Ｄ）空間を提供することができる局所薬物貯蔵所の利点を提供することができる。このような特性は、炎症性関節炎の物理的摩擦を減らすことで滑膜関節の損傷をさらに減らすことができる。さらに、温度感受性ゾル－ゲル転移特性は、非侵襲的投与の利点を提供することができる。しかし、ヒドロゲルベースの抗変形性関節症の薬物送達システムは、数日間だけ薬物放出特性を示しているという限界が報告されている［Ｐａｒｋ Ｃ．Ｗ．，Ｍａ Ｋ．Ｗ．，Ｊａｎｇ Ｓ．Ｗ．，Ｓｏｎ Ｍ．，Ｋａｎｇ Ｍ．Ｊ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｉｒｏｘｉｃａｍ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｒａｔｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａ－ａｒｔｉｃｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（Ｓｅｏｕｌ）２０１４；２２（３）：２６０－２６６．］。

ナノ薬物送達体と３Ｄヒドロゲル薬物送達体のハイブリッドシステムは、成功的なＯＡ治療のための強力なツールになり得る。そのために、疎水性及び親水性の側鎖を置換したポリ（有機ホスファゼン）は、注射可能なｉｎ ｓｉｔｕヒドロゲル形成、薬物ローディング過程及び長期薬物放出特性を有する生分解性薬物送達体として機能し得る［Ｈｏｎｇ Ｋ．Ｈ．，Ｋｉｍ Ｙ．Ｍ．，Ｓｏｎｇ Ｓ．Ｃ．Ｆｉｎｅ－ｔｕｎａｂｌｅ ａｎｄ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ３Ｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｆｏｒ ｏｎ－ｄｅｍａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｎｉｃｈｅ．Ａｄｖ．Ｓｃｉ．２０１９；６（１７）：１９００５９７．ｄｏｉ：１０．１００２／ａｄｖｓ．２０１９００５９７．］。水溶液中のこのような高分子は、温度の変化に伴う疎水性変化に応じて広がる鎖又はナノサイズの球状粒子の形で存在する。このような特性に基づいて、疎水性部分を有する様々な薬物は、高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、ＰＮ）の自己組織化工程に参加することにより高分子ナノ粒子（ＰＮ）にカプセル化することができる。さらに、高分子ナノ粒子は、特定の濃度以上で３Ｄヒドロゲルネットワークを形成することができる。

本発明者らは、このようなポリ（有機ホスファゼン）ベースのＰＮヒドロゲルシステムを用いて局所的かつ持続的なＴＣＡ送達を可能にするために研究して、本発明を完成した。

本発明が達成しようとする技術的課題は、ポリ（有機ホスファゼン）高分子を含む炎症性疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。

しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、前述した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。

課題の解決するための手段

前記の課題を解決するために、

下記の化学式１で示されるポリホスファゼン骨格のリン原子上に、

下記の化学式２で示されるアミノ酸エステルの第１モイエティと、

下記の化学式３で示されるポリエチレングリコールの第２モイエティと、

アミノエタノールと有機酸を含む第３モイエティと、をそれぞれａ：ｂ：ｃのモル比で含むポリホスファゼン系高分子、及び

治療的有効量の炎症制御及び治療用の薬物

を含む炎症性疾患の予防又は治療用組成物が提供される。

前記化学式において、

Ｒ_１は、Ｃ_１－６のアルキル、Ｃ_１－６のアルケニル、又はＣ_６－１０のアリール－Ｃ_１－６のアルキルであり、

Ｒ_２は、水素、メチル、イソプロピル、１－メチルプロピル、２－メチルプロピル、チオメチル、メチルチオエチル、ベンジル、ヒドロキシベンジル、又は２－インドリルメチルであり、

Ｒ_３は、Ｃ_１－６のアルキルであり、

ｎは、３～１００，０００の整数であり、

ｐは、１～２０の整数であり、

ａ：ｂのモル比は、５．５：１～７．５：１であり、

ａは、７０～８０モル％であってもよい。

一態様によれば、前記第３モイエティにおける前記有機酸は、グルタル酸を含んでもよい。

一態様によれば、前記Ｒ_１は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ベンジル、又は２－プロフェニルであってもよい。

一態様によれば、前記Ｒ_３はメチルであってもよい。

一態様によれば、前記炎症性疾患の治療用薬物は疎水性であってもよい。

一態様によれば、前記疎水性の炎症性疾患の治療用薬物は、トリアムシノロンアセトニド、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、セレコキシブ、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、ケトプロフェン、エトドラク、メロキシカム、ロフェコキシブ、エトリコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブ、及びジクロフェナクからなる群から選ばれるいずれか１つ以上であってもよい。

一態様によれば、前記高分子は、前記炎症性疾患の治療用薬物を徐放してもよい。

一態様によれば、前記ポリホスファゼン系高分子が、１～５０重量％の濃度で溶媒に溶解して含まれてもよい。前記溶媒は、水、緩衝溶液、酸性溶液、塩基性溶液、塩溶液、生理食塩水、注射用水、細胞培養液、及びブドウ糖食塩液からなる群から選ばれた１種以上であってもよいが、これに制限されない。

一態様によれば、前記高分子は、５～７０℃の範囲でゾル－ゲル転移の挙動を示し、予め決められた所定の温度でヒドロゲルを形成してもよい。

一態様によれば、前記高分子は、生体への適用時に、又は生体外の環境でゲル化し、予め決められた所定の温度で温度感受性を失い、温度の変化に関係なくゲルの状態を維持してもよい。

一態様によれば、前記炎症性疾患は、変形性関節症、変形関節炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、及びアキレス腱炎からなる群から選ばれるいずれか１つであってもよい。

本発明は、薬物をローディングした温度感受性ポリ（有機ホスファゼン）高分子、それを含むヒドロゲル、及びそれを含む炎症性疾患の予防又は治療用組成物などに関するものであり、前記ヒドロゲルを含む注射可能な高分子ナノ粒子ヒドロゲルシステムは、長期間体内で維持される抗炎症効果を有し、アキレス腱をはじめとする腱（ｔｅｎｄｏｎ）、靭帯（ｌｉｇａｍｅｎｔ）、筋肉（ｍｕｓｃｌｅ）、細胞（ｃｅｌｌ）などを再生する効果があるため、変形性関節症などの様々な炎症性疾患の予防及び治療に活用できる。

また、本発明者らは、ポリ（有機ホスファゼン）高分子をなす疎水性の側鎖と親水性の側鎖の比率を最適化して体内で理想の薬物放出特性を示すようにし、長期間、一定の濃度で体内に薬物を投与することができる。

本発明の効果は、上述のものに限定されず、言及されていない他の効果は、以下の説明から当業者に明確に理解されるであろう。

ＴＣＡ搭載ポリ（有機ホスファゼン）ナノ粒子の作用模式図を示す。

ポリ（有機ホスファゼン）の１Ｈ ＮＭＲデータを示す。

ポリ（有機ホスファゼン）の生体適合性の実験結果を示す。

カルボキシル末端ポリ（有機ホスファゼン）の細胞毒性データを示す。

ポリ（有機ホスファゼン）ナノ粒子の特性化を示す。（ａ）はポリ（有機ホスファゼン）ナノ粒子の構造と自己組織化挙動、自己組織化ＰＮ（ｂ）、ＴＣＡ凝集体（ｃ）、及びＴｅＰＮ（ｄ）のＴＥＭ像をそれぞれ示し、（ｅ）は自己組織化ＰＮ、ＴＣＡ集合体及びＰＢＳ溶液におけるＴｅＰＮの流体力学的直径（ｎ＝６）を示す。

マイクロサイズのＴＣＡ集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）のＴＥＭ写真である。

ＰＢＳ溶液中の自己組織化ＰＮ、ＴＣＡ及びＴｅＰＮの流体力学的直径を示す。

ＴｅＰＮヒドロゲルシステムの特性化を示す。（ａ）は温度依存的なゾル－ゲル転移及び粘度変化を示し、（ｂ）はＰＮ溶液の貯蔵及び損失弾性率に対する温度依存的変化を示し、（ｃ）はＴｅＰＮ溶液の貯蔵及び損失係数に対する温度及びＴＣＡ含量による変化を示す。

ＰＮヒドロゲルの生分解性を示す。（ａ）はマウス実験写真であり、（ｂ）は時間依存ヒドロゲル分解グラフである。

日付別に注射部位のヒドロゲル写真を示す。

試験管内質量損失実験におけるヒドロゲル体積予測値を示す。

ＴｅＰＮからのＴＣＡの徐放プロファイルを示す。（ａ）はＴｅＰＮの時間依存ヒドロゲル形態を示し、（ｂ）は累積ＴＣＡ放出量を示す。

治療の８週間後の軟骨内写真を示す。

Ｘ線写真及びＣＴ写真（ａ）と関節間軟骨距離（ｂ）で示されるＩＡ注入後のＴｅＰＮの生体内の抗炎症効率特性である。

ＴｅＰＮヒドロゲルシステムの生体内の抗炎症効率を組織染色法で示す。

抗炎症性サイトカイン発現のリアルタイムＰＣＲ分析である。

各群のラットの体重変化である。

製造されたＰＰＺのＮＭＲデータを示す。

ＩｌｅＯＥｔ／ＡＭＰＥＧのモル比変化による物性変化を示す。

ＴＣＡ濃度による炎症関連因子発現量を示す。

最適のＩｌｅＯＥｔ／ＡＭＰＥＧのモル比を確認する過程を示す。

ＡＴにＣＸＢ－ＰＰＺ複合体を投与する過程の模式図である。

合成されたＰＮＰ構造の^１Ｈ ＮＭＲ及びＧＰＣ結果を示す。

ＰＣＮＰ、ＣＸＢ及びＰＮＰのＦＴ－ＩＲ結果を示す。

ＣＸＢカプセル化と温度感受性ゲル化を示す。

ＰＮＰヒドロゲルのゲル化を示す。

ＰＮＰ及びＰＣＮＰヒドロゲルのレオロジー特性を示す。

ＰＮＰ及びＰＣＮＰの特性化を示す。

ＰＣＮＰヒドロゲルでＣＸＢ放出が持続し、ヒドロゲルネットワークが約１ヶ月間維持されることを示す。

ＰＮＰヒドロゲルの試験官内の分解を示す。

３７度におけるＰＮＰヒドロゲルの安定したモジュラスを示す。

ＰＮＰヒドロゲルの生体内の生分解を示す。

ＰＮＰヒドロゲルのＭＴＴ分析による細胞毒性の実験結果を示す。

血液サンプルのリアルタイムＰＣＲ分析結果による炎症関連因子の発現程度を示す。

ＰＣＮＰヒドロゲルシステムの長期放出による抗炎症効果として損傷アキレス腱の再生を示す。

対照群、無治療群、ＣＸＢ溶液処理群及びＰＣＮＰ処理群におけるヒドロキシプロリン含量、剛性度及び引張強度を示す。

本発明者らは、前術の技術的課題を解決するために、以下のようなポリ（有機ホスファゼン）高分子とそれを含む炎症性疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

下記の化学式１で示されるポリホスファゼン骨格のリン原子上に、

下記の化学式２で示されるアミノ酸エステルの第１モイエティと、

下記の化学式３で示されるポリエチレングリコールの第２モイエティと、

アミノエタノールと有機酸を含む第３モイエティと、をそれぞれａ：ｂ：ｃのモル比で含む、ポリホスファゼン系高分子、及び

治療的有効量の炎症制御及び治療用薬物、

を含む炎症性疾患の予防又は治療用組成物がそれである。

前記化学式において、

Ｒ_１は、Ｃ_１－６のアルキル、Ｃ_１－６のアルケニル、又はＣ_６－１０のアリール－Ｃ_１－６のアルキルであり、

Ｒ_２は、水素、メチル、イソプロピル、１－メチルプロピル、２－メチルプロピル、チオメチル、メチルチオエチル、ベンジル、ヒドロキシベンジル、又は２－インドリルメチルであり、

Ｒ_３は、Ｃ_１－６のアルキルであり、

ｎは、３～１００，０００の整数であり、

ｐは、１～２０の整数であり、

ａ：ｂのモル比は、５．５：１～７．５：１であり、

ａは、７０～８０モル％であってもよい。

一般に温度感受性高分子は、温度の変化に伴い溶解度の急激な変化を示す高分子である。温度を上げることにより、高分子と溶媒との間の水素結合が弱くなって脱水化が起こり、高分子間の疎水性引力が強化され、より疎水性の構造を有するようになる。下部臨界溶液温度（ＬＣＳＴ：ｌｏｗ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）では、高分子と水の間の水素結合よりも高分子－高分子、水－水の間の相互作用がより好まれるにつれ、高分子から急速に脱水現象が起こり、より疎水性の構造を有する。温度感受性高分子は、高分子骨格に結合されている疎水性基と親水性基のバランスにより下部臨界温度が変化し、一般に親水性基の含量が増加すると相転移温度が上がり、疎水性基が増加すると逆に相転移温度が下がる。このような特徴は、下記実施例９で開示する疎水性の側鎖と親水性の側鎖の割合変化によるＴ_ｍａｘ変化などでも確認することができる。

前記ポリ（有機ホスファゼン）高分子を構成する必須構成モイエティが所定の割合を有する場合、一定の温度以下では温度の変化により高分子溶液のゾル－ゲル転移が可逆的に起こるが、特定の温度以上に晒された後は、このような急激な可逆的転移特性を失い、ゲルの状態を長期間維持することができる。特に、これは、最初に高分子の合成時に導入した置換体の割合によってこのような特性変化を有するようにすることができる。

特に、本発明では、前記第１モイエティと第２モイエティが特定のモル比の範囲内である場合、生体内で求められる最適な薬物濃度を維持して徐放できることを確認した（下記実施例９参照）。これは、疎水性を有する前記第１モイエティと親水性を有する前記第２モイエティとの構成比に応じて、高分子の疎水性性質と相転移温度が変化する本発明者らの発見に基づいたものである。疎水性の側鎖のモル比が増加するほど、高分子は疎水性を有し、疎水性の薬物との相互作用が強くなって、薬物が体内に放出されにくくなる。したがって、疎水性の側鎖と親水性の側鎖のモル比を調整して、薬物が体内に放出される速度を調節することができる。

ＴＣＡをはじめとするステロイド系炎症疾患治療用薬物、又はセレコキシブを含む非ステロイド性薬物は、いずれも体内での作用に最も適合な濃度範囲が存在し、ＴＣＡの場合、図２０に示すように、特定の濃度範囲外である場合、むしろ炎症関連因子の発現が増えることが確認できる。

本発明者らが以下の実施例９及び図２１に示すように、好ましくは、疎水性の側鎖のモル比が親水性の側鎖に対して５．５：１～７．５：１の範囲であってもよく、より好ましくは６：１～７：１であってもよく、最も好ましくは６．１３：１であってもよい。前述のモル比の範囲において、薬物、好ましくはＴＣＡを前術の適合な濃度範囲内で徐放させることができる。上述のモル比の範囲から外れると、ＴＣＡの薬理効果が低下する可能性がある。

一態様によれば、前記第３モイエティにおける前記有機酸は、グルタル酸を含んでもよい。前記グルタル酸は、下記実施例１０－２に開示される（Ａｃｉｄ）を意味する。これは、実施例１０－２の製造方法によって製造、生成されるものであり、最終生成物においてヒドロキシ官能基とエステル結合で結合されたグルタル酸であってもよい。

前記第３モイエティの一部又は全官能基に、高分子の分解速度を調節できる物質、分解速度が調節可能なイオン基を含む置換体、架橋結合可能な置換体、組織結合を誘導できる追加の化合物、生理活性物質、及びそれらの２つ以上の機能性材料が線形に接続されて形成された複合材料からなる群から選ばれる１つ以上の機能性モイエティが直接又はリンカーを介して接続された第４モイエティをさらに含んでもよい。

この場合、前記第４モイエティは、葉酸、ヒアルロン酸、シクロデキストリン、イミダゾール系化合物、抗がん剤、ヒスチジン、リシン、アルギニン、システイン、チオールアリールアミン、スペルミン、スペルミジン、ポリエチレンイミン、ポリヒスチジン、ポリリシン、ポリアルギニン、プロタミン、ヘパリン、キトサン、及び１～２０個のアミノ酸からなるペプチドからなる群から選ばれる少なくとも１つを含んでもよい。

一態様によれば、前記Ｒ_１は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ベンジル、又は２－プロフェニルであってもよい。

一態様によれば、前記Ｒ_３はメチルであってもよい。

一態様によれば、前記炎症性疾患の治療用薬物は疎水性であってもよく、更に機能性物質を含んでもよい。

前記機能性物質は、前骨芽細胞（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、シュワン細胞（ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌ）、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）、インスリン、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、血管内皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、脳由来神経栄養因子、抗生剤及びインテグリンα－５－β－１アンタゴニストなどの新生血管阻害剤又はそれらの組み合わせであってもよい。

前記疎水性の変形性関節症治療用薬物は、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、イブプロフェン、ナプロキセン及びジクロフェナクからなる群から選ばれるいずれか１つ以上であってもよく、最も好ましくはトリアムシノロンである。

一態様によれば、前記高分子は、前記変形性関節症の治療用薬物を徐放してもよい。本明細書における「徐放」とは、少なくとも２１日以上体内に維持され、薬物を放出することを意味し、好ましくは薬物の放出濃度を薬物の治療的有効濃度に維持することである。また、前記徐放は、治療的有効量の範囲の薬物濃度で薬物を放出することであり、前記治療的有効量の範囲の薬物濃度は、好ましくは９．３７５～７５μｇ／ｍｌであり、より好ましくは１０～５０μｇ／ｍｌである。

一態様によれば、前記ポリホスファゼン系高分子が、１～５０重量％の濃度で溶媒に溶解して含まれてもよい。前記溶媒は、水、緩衝溶液、酸性溶液、塩基性溶液、塩溶液、生理食塩水、注射用水、細胞培養液、及びブドウ糖食塩液からなる群から選ばれた１種以上であってもよいが、これに制限されない。前記溶媒の存在下で、本発明のポリホスファゼン系高分子はヒドロゲル化することができ、後述するようにゾル－ゲル転移の挙動を示す。

一態様によれば、前記高分子は、５～７０℃の範囲でゾル－ゲル転移の挙動を示し、予め決められた所定の温度でヒドロゲルを形成してもよい。

一態様によれば、前記高分子は、生体への適用時に、又は生体外の環境でゲル化し、予め決められた所定の温度で温度感受性を失い、温度の変化に関係なくゲルの状態を維持してもよい。

前記炎症性疾患は、好ましくは、変形性関節症、変形関節炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、及びアキレス腱炎からなる群から選ばれるいずれか１つであってもよく、最も好ましくは変形性関節症であってもよい。

本発明の組成物は、炎症性疾患、好ましくは変形性関節症の「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」及び／又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」の用途を有する。予防的用途において、本発明の組成物は、本発明に記載された疾患又は症状を有しているか、又は発症の危険性があると疑われる個体に投与することができる。治療の用途において、本発明の医薬組成物は、本発明に記載された疾患を既に患っている患者のような個体に、本発明に記載された疾病又は症状を治療又は少なくとも部分的に停止するのに十分な量で投与される。このような用途に有効な量は、疾患又は症状の重症度と経過、以前の治療、個体の健康状態と薬物に対する反応性、及び医師又は獣医師の判断に依存している。

前記組成物は、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、内容液剤、乳剤、シロップ剤、乳剤、凍結乾燥剤、及び坐剤からなる群から選ばれるいずれか１つの剤形であってもよく、非経口又は経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、１つ以上の化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）又はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製する。また、単なる賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内容液剤、乳剤、シロップ剤等が挙げられ、通常用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にも様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオバター、ラウリン酸、グリセロゼラチンなどが用いられる。

本発明において、本発明の組成物は、非経口投与のための滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤に製剤化され、具体的に、注射剤に製剤化されてもよい。本発明の医薬組成物は、通常使用される適切な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。この場合、前記医薬組成物に含まれる有効成分である本発明の注射剤組成物の含量は特に制限されない。

本発明の組成物は、個体に薬学的に有効な量で投与することができる。

本発明における「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な利益／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は、個体の種類と重症度、年齢、性別、疾病の種類、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路と排出率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、及び他の医学分野に公知の要素によって決められる。

本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、又は他の治療剤と混合して投与することができ、従来の治療剤とは順次又は同時に投与することができ、単回又は反復投与することができる。前記要素をすべて考慮して、副作用なしで最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決められてもよい。本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態と体重、疾病の重症度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なり、投与は１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。

本発明において、本発明の組成物は、幹細胞をはじめとする前記機能性物質と混合投与することができ、これについては上述した通りである。

本発明の組成物は、変形性関節症の予防又は治療を目的とする個体であれば特に限定されず投与可能である。投与の方式は、当技術分野の常法であれば制限なく含む。前記組成物は、関節腔内（例えば、軟骨内）、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内に投与することができ、局所治療のために、必要に応じて病変、すなわち関節腔内（例えば軟骨内）投与を含む適切な方法によって投与することができる。一例として、関節腔内注射によって投与（注入）することができるが、これに制限されない。

本発明における用語「個体」とは、変形性関節症が発生しているか又は発生する可能性があるすべての動物を意味し、本発明の組成物を変形性関節症の疑いのある個体に投与することによって、個体を効率的に治療することができる。前記個体は特に制限されず、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどの動物、鳥類であってもよいが、これらに制限されない。

本発明における用語「投与」とは、ある適切な方法で変形性関節症の疑いのある個体に本発明の組成物を導入することを意味し、投与経路は、目的組織に到達することができる限り、非経口の様々な経路を介して投与することができる。本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与することができ、前記薬学的に有効な量は、前述の通りである。

実施例で使用した用語は、単に説明の目的で用いられたものであり、限定の意図で解釈されてはいけない。単数の表現は、文脈上明確に別に示さない限り、複数の表現を含む。本明細書における「含む」又は「有する」などの用語は、明細書上に記載した特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、部品又はこれらを組み合わせたものが存在することを指定するためのものであり、１つ又はそれ以上の他の特徴や数字、ステップ、動作、構成要素、部品又はこれらを組み合わせたものなどの存在又は付加可能性をあらかじめ排除しないものと理解されたい。

別段の定義がない限り、技術的又は科学的な用語を含めてここで使用されるすべての用語は、実施例が属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。一般に使用される辞典で定義されているような用語は、関連技術の文脈上有する意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本出願で明確に定義しない限り、理想的又は過度に形式的な意味で解釈されない。

本発明は、様々な変換を加えることができ、様々な実施例を有することができ、以下の特定の実施例を図面に例示し、詳細な説明で詳細に説明する。しかし、これは本発明を特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、本発明の思想及び技術的範囲に含まれるすべての変換、均等物ないし代替物を含むものを理解されたい。本発明の説明において、関連する公知技術の具体的な説明が本発明の要旨を不明瞭にすると判断される場合、その詳細な説明は省略する。
発明の実施のための形態

以下の実施例１～９では、ＴＣＡを搭載するポリ（有機ホスファゼン）について開示する。ＴＣＡ搭載ポリ（有機ホスファゼン）の作用機序の模式図を図１に示した。

実施例１．実験方法Ａ

実施例１－１．材料

Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｃｙｃｌｏｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から入手し、真空（約０．１ｍｍＨｇ）下で５５℃で昇華して精製した。ポリ（ジクロロホスファゼン）は、Ｂｒｏｍｂｅｒｇ Ｌ．らの説明に従って準備した［Ｂｒｏｍｂｅｒｇ Ｌ．，Ｔｅｍｃｈｅｎｋｏ Ｍ．Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）－ｂ－ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）－ｂ－ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）－ｂ－ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）Ｌａｎｇｍｕｉｒ．１９９９；１５：８６３３－８６３９．］。７５０Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）はα－アミノ－ω－メトキシポリ（エチレングリコール）（ＡＭＰＥＧ）に置き換えられ、ポリ（有機ホスファゼン）骨格に置換された。ｌ－Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ）（Ａ＆Ｚ ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，ＨａｎｇＺｈｏｕ，ｃｈｉｎａ，ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、ｇｌｕｔａｒｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ＵＳＡ）、４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ） ｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＤＭＡＰ）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ，ＵＳＡ）を入手した。ＴＨＦ（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）とＴＥＡ（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を乾燥窒素下でそれぞれ金属ナトリウムと酸化バリウムで還流乾燥した。Ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ ａｃｅｔｏｎｉｄｅ（ＴＣＡ）は、ＴＣＩ（日本）から入手した。他のすべての試薬は、市販のものを入手した。

実施例１－２．ポリ（有機ホスファゼン）の合成

すべての反応は、標準的なシュレンクライン（Ｓｃｈｌｅｎｋ－ｌｉｎｅ）技術を用いて乾燥窒素雰囲気下で行った。

１－２－１．前駆体重合体（ＰＰ、アミノエタノールポリ（有機ホスファゼン））の合成

前駆体重合体（ＰＰ）は、以下のように調製した。最初に、ＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ（１０．８ｇ、５５．２２ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）に懸濁し、反応フラスコを冷却した。続いて、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０．００ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解し、無水ＴＨＡ及びＴＥＡに溶解したＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ（２３．６４ｇ、１２．０８ｍｍｏｌ）を含む反応フラスコにゆっくり添加した。反応混合物をドライアイス水槽で１２時間撹拌し、４５℃で２４時間撹拌した。次に、ＡＥｔＯＨ（１．４２ｇ、２．３３ｍｍｏｌ）及びＡＭＰＥＧ７５０（１３．５９ｇ、１８．１２ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦに溶解して、反応混合物に添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、４５℃でさらに２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、ｎ－ヘキサンに注いで沈殿物を得た後、同じ溶媒システムで２回再沈殿させた。重合体生成物を、室温で４日間メタノールに対して、４℃で４日間蒸留水に対して透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＭＷＣＯ：１０～１２ｋＤａ）で透析することでさらに精製した。透析液を凍結乾燥してＰＰを得た。収率は７３．７％であり、ＮＭＲデータは次の通りであった。

^１H NMR(CDCl₃), δ(ppm)：0.8-1.0（s，6H)，1.1-1.3(b. 3H)，1.3-1.6(b，2H)，1.6-1.9(b，1H)，2.8-3.3(b，2H)，3.4-3.8(b，73H)，3.9（s，1H)，4.0-4.3(b，3H).

１－２－２．カルボン酸末端官能基化ポリ（有機ホスファゼン）（ＣＰ）の合成

ヒドロキシル末端をカルボン酸末端に置き換えるために、ＰＰ（１０ｇ、１２．２５ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦに溶解した。反応混合物を室温で１２時間攪拌した後、４０～４５℃までさらに２４時間撹拌した。最終生成物のＣＰは、室温で３日間メタノールに対して、４℃で３日間水に対して透析膜で透析した。精製されたＣＰは、凍結乾燥によって得られた。２．１～２．３２ｐｐｍ（ｂ，４Ｈ，ＣＨ２）で新たに現れたピークは、ＣＰ ^１Ｈ ＮＭＲに存在しない生成されたグルタル酸末端を示す。収率は９６％であり、ＮＭＲデータは次の通りであった。

^１H NMR(CDCl3), δ(ppm): ^１H NMR（300 MHz，CDCl₃, δ)，d（ppm)：0.8-1.0（s，6H，CH₃)，1.1-1.3（b，3H，CH₃)，1.3-1.6（b，2H，CH₂)，1.6-1.9（b，1H，CH)，2.1-2.32（b，4H，CH₂)，2.8-3.3（b，2H，CH₂)，3.4-3.8（b，62H，CH₂)，3.9（s，1H，CH)，4.0-4.3（b，3H，CH₃).

実施例１－３．ＣＰの特性確認

合成されたＣＰの構造は、^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３を用いたフーリエ変換モードで３００ＭＨｚで作動するＶａｒｉａｎ Ｇｅｍ－ｉｎｉ－３００分光計）を測定して推定した。水溶液中のＣＰの表面電荷はＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）で測定した。ＣＰの分子量（ＭＷ）は、２５℃で０．３５ｍＬ／分の流速で一列に接続された２つのＳｔｙｒａｇｅｌカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒｍｕｌｔｉｐｏｒｅＨＺ－Ｍ及びＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＨＺ－２５００）と屈折率検出器付きのゲル透過クロマトグラフィシステム（Ｔｏｓｏｈ，ＥｃｏＳＥＣ ＨＬＣ－８３２０ ＧＰＣ）により計算した。０．１ｗｔ％の臭化テトラブチルアンモニウムを含むＴＨＦを移動相として使用した。ポリスチレン（ＭＷ：１６２；５８０；１９２０；３０９０；９５９０；２７，８１０；７０，５００；１３３，５００；２９０，３００；７２９，５００；１，０７４，０００；２，７０３，０００）を標準として使用した。

実施例１－４．生体適合性の実験

１－４－１．ＣＰの細胞毒性の実験

ＣＰの細胞毒性の試験は、マウス線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）を用いて行った。細胞を９６－ウェルプレート（ＳＰＬ、Ｋｏｒｅａ）に２×１０^４／ｗｅｌｌの密度で分注し、３７℃で５％ＣＯ２の湿った雰囲気で１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍと１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に一晩付着した。培養培地は２４時間後に新しいＤＭＥＭに交換し、様々な濃度のＣＰを処理した（ＤＭＥＭで０ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、ｎ＝６）。２４時間／４８時間／７２時間後、ＭＴＴ溶液（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５ ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を処理して、培地吸引後、３時間培養した。沈殿物を１００μｌのＤＭＳＯに溶解し、生成された紫色の溶液の吸光度をＳｐｅｃｔｒａ ＭＡＸ ３４０（ＢＩＯ－ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて励起波長５７０ｎｍで測定した。細胞生存率（％）は、［ａｂ］ｔｅｓｔ／［ａｂ］ｃｏｎｔｒｏｌ×１００％で計算された。

１－４－２．ＣＰの突然変異誘発性の確認

ＣＰの突然変異誘発性は、バクテリアサルモネラチフィムリウム（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の様々な栄養要求株で評価された。復帰コロニー形成量を評価して突然変異誘発性を決定した（Ａｍｅｓテスト）。Ｔ９８及びＴ１００の検査のために滅菌した液体培地（２．５％Ｏｘｏｉｄ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ Ｎｏ．２）を用いて行った。振とう水槽（３７℃，２００ｒｐｍ）で１０時間培養した後、培養したバクテリア０．１ｍＬを、上寒天２ｍＬ、ＣＰ溶液０．１ｍＬ及びＳ９画分と混合した。その後、この混合物を、２０ｍＬの最小グルコース寒天プレートが含まれている、先に準備したシャーレに穏やかに注ぎ、固まるまで培養した。３７℃で４８時間培養した後、コロニー数を計算した。Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を陰性対照群として使用し、２－ｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｅｎｅ、ｂｅｎｚｏ（ａ）ｐｙｒｅｎｅ及びｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅを各バクテリアＴ９８及びＴ１００に特異的な陽性対照群として使用した。すべての陰性及び陽性対照群は同一の方法で行った。最小グルコース寒天プレートは、Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）、Ｖｏｇｅｌ－Ｂｏｎｎｅｒ培地Ｅ及び２％グルコースを使用して準備した。

実施例１－５．自己組織化高分子ナノ粒子（ＰＮｓ）及びＴＣＡカプセル化高分子ナノ粒子（ＴｅＰＮ）の製造

合成したＣＰを、マグネチックスターラーを用いて４℃でＰＢＳ溶液に溶解した（１２重量％ＣＰ溶液を準備して１０倍希釈した）。準備したＣＰ溶液をＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用した動的光散乱（ＤＬＳ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＣＭ３０電子顕微鏡、Ｐｈｉｌｉｐｓ、ＣＡ）で観察した。自己組織化ＰＮの観察されたサイズと形態を確認した。３つの濃度のＴＣＡ（０．３、１．０及び１．５ｍｇ／ｍＬ）でＴＣＡカプセル化高分子ナノ粒子（ＴｅＰＮ）を準備した。ＴＣＡをＰＮｓ溶液に直接添加し、穏やかに混合した。混合溶液を室温で３０分間インキュベートしてＴＣＡカプセル化を誘導した。ＴｅＰＮの特性は、ＤＬＳとＴＥＭで検証した。

実施例１－６．ＴｅＰＮ溶液の温度感受性ゾル－ゲル転移の挙動

ＰＮ水溶液（１２ｗｔ％）の粘度は、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＲＶＤＶ－ＩＩＩ＋粘度計で０．１ｓ－１の固定剪断速度で５～７５℃の範囲で測定した。測定は、０．２ｒｐｍの設定されたスピンドル速度と０．３３℃／ｍｉｎの加熱速度で処理した。レオロジー測定（ＭＳＣ １０２、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ、ＤＥ）は、ＰＮ溶液（ＰＢＳ中のＰＮ １２ｗｔ％）及びＴｅＰＮ溶液（０．３、１．０、１．５ｍｇ／ｍＬのＴＣＡを準備された１２ｗｔ％ＰＮ溶液に添加した）で行った。貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ”）の測定は、振動周波数１Ｈｚ、振動変形率５％、温度４℃及び６０℃で間隔長０．３ｍｍで行った。

実施例１－７．ＴｅＰＮヒドロゲルの生体内の分解研究

ＴｅＰＮ溶液（１．５ｍｇ／ｍＬ ｏｆ ＴＣＡ、２００μＬ）をマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ、６週齢、オス、オリエントバイオ、韓国）の背中に３１ゲージ針を用いて皮下注射した。局所的に生成されたＴｅＰＮヒドロゲルは、注入直後に確認された。残りのＴｅＰＮヒドロゲルは、予め決められた日に重量を測定した。

実施例１－８．ＴｅＰＮからのＴＣＡの体外放出

ＴｅＰＮ溶液はそれぞれ０．３、１．０及び１．５ｍｇ／ｍＬのＴＣＡを含む１２ｗｔ％ＰＮ溶液で準備した。準備したＴｅＰＮ溶液０．３ｍＬをチューブに入れ、３７℃まで昇温してヒドロゲルの形成を確認した。ヒドロゲルに６ｍＬのＰＢＳ溶液を穏やかに添加し、チューブを３７℃の水槽（ＫＭＣ－１２０５５Ｗ１、Ｖｉｓｉｏｎ、Ｋｏｒｅａ）で弱い振とう運動（５０ｒｐｍ）で培養した。ＰＢＳ溶液は、各時点で新鮮なＰＢＳ溶液と交換した。放出されたＴＣＡの量は、水／アセトニトリル（５０／５０、ｖ／ｖ％）を溶離液として使用して高性能の液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ）で測定し、２４０ｎｍでＵＶ検出を用いて確立された標準試料で計算した。

実施例１－９．ＴｅＰＮヒドロゲルシステムの生体内の抗ＯＡ効果

１－９－１．変形性関節症（ＯＡ）のラットにおけるＴｅＰＮの関節内注射

Ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ（ＭＩＡ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）（０．５ｍｇ／５０μｌ）をＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（６週齢、オス、ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ、Ｋｏｒｅａ）（各群当たりｎ＝６）の関節内の部位に注射してＯＡを誘導した。１週間後、ＯＡ誘導されたラットを、関節内注射により０．３ｍＬのＴｅＰＮ溶液で処理した。未処理のＭＩＡ誘導ＯＡラットモデルを対照群として使用した。追加分析のために、ＴｅＰＮ注射して８週間後にラットを殺した。

１－９－２．関節内構造及びＸ線、マイクロコンピュータ断層撮影（μ－ＣＴ）スキャン

注射して８週間後にラットを殺した後、分離した膝関節を大腿骨及び脛骨から切断した。分離した膝関節のサンプルは、Ｘ－ｒａｙ（Ｉｎ－Ｖｉｖｏ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＸＳ ＰＲＯ、Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ、ＵＳＡ）及びμ－ＣＴ（Ａｉｂｉｒａ ＣＴ ｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ，ＵＳＡ）を用いてスキャンした。破壊された軟骨の距離は、μ－ＣＴ画像とＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて測定した。

１－９－３．組織学的解析

集められたすべての組織をパラフィンで包埋し、ミクロトーム（厚さ８μｍ）で切片化した。組織学的評価のために組織切片を、パラフィン除去、再水和、及び染色した。Ｈ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）とｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏで染色した後、光学顕微鏡（Ｎｉｋｋｏｎ；Ｅ４００、Ｊａｐａｎ）で個々の膝関節の組織学的様子を観察した。

１－９－４．ＲＮＡ抽出及びリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応

時点（ＯＡ誘導後、ＴｅＰＮヒドロゲル処理して１週間、４週間及び８週間後）に血液サンプルを収集した。製造社の指示に従ってＲＮＡ血液キット（ＱＩＡａｍｐ、ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＲＮＡを抽出した。製造社のプロトコールに従い、Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔＲＴ Ｐｒｅ Ｍｉｘ（ｄＴ２０）（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＡＢＩ７３００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び検出を行った。ＭＭＰ－３（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３）、ＭＭＰ－１３、ＩＬ－６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６）、ＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）などの全身炎症性サイトカイン、及びＩＬなどの抗炎症性サイトカインの遺伝子発現－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３をそれぞれ調べた。各遺伝子マーカーの配列を下記表１に列挙した。

実施例２．ポリ（有機ホスファゼン）の合成及び特性

側鎖に疎水性のｌ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（ＩｌｅＯＥｔ）と親水性のα－ａｍｉｎｏ－ω－ｍｅｔｈｏｘｙ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）（ＡＭＰＥＧ）を主に含むＰｏｌｙ（ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）を合成し、温度反応性及びｉｎ ｓｉｔｕゲル化薬物貯蔵システムとして使用された。また、カルボン酸末端を導入して、主にコンドロイチン硫酸とヒアルロン酸で構成された天然軟骨の細胞外基質を模倣し、軟骨の恒常性及び再生に関わる様々なサイトカインと相互作用し、これは下記の化学式で示す通りである。

ＮＭＲスペクトルを用いて置換された側鎖のモル比を計算した。ＩｌｅＯＥｔ、ＡＭＰＥＧ及びカルボン酸の濃度はそれぞれ、最終重合体において７０％、１０．５％及び１３．５％であった。ポリマーの各複合物の置換率は、１Ｈ ＮＭＲデータとして、ＩｌｅＯＥｔの６つのプロトンに対して、０．８～１．０ｐｐｍ／カルボン酸の４つのプロトンに対して、２．１～２．３２ｐｐｍ／ＡＭＰＥＧの６２個のプロトンに対して、３．４～３．８ｐｐｍの特定のピークの積分により評価した（図２）。最終ポリマーの電荷は、ゼータ電位測定で－４．０±１．６、軟骨の細胞外マトリックスを模倣する負電荷に特性化され、ポリスチレン標準を用いたＧＰＣ分析は、５０，０８５Ｄａの分子量を示した。

また、ポリ（有機ホスファゼン）の生体適合性を次のように評価した。Ａｍｅｓテストは、一般に発がん性に関わるテスト化学物質の潜在的な突然変異誘発性を評価するためのテストである。変異原性試験のために、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＴＡ９８又はＴＡ１００を２００μｇのポリマーで処理した。ポリマー処理群は、陰性対照群とほぼ同一の復帰コロニーを示した（図３の（ａ））。このような非毒性及び突然変異反応は、合成高分子の安全性を暗示し、このような結果は、高分子が生体利用可能な物質として用いられる可能性を裏付ける。特に抗ＯＡ治療の場合、ＴＣＡキャリアは、病変部位で免疫反応を促進してはならないので、生体適合性の高い特性が必要である。このため、合成されたｐｏｌｙ（ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）の調べられた生体適合性は、抗ＯＡ薬物送達体として適切であることが確認された。

細胞毒性及び変異原性試験は、新薬又は生物学的に利用可能な物質に関する毒性データの生成に必要であり、実験を行った。合成ｐｏｌｙ（ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）の毒性をＭＴＴ ａｓｓａｙとＡｍｅｓ ｔｅｓｔで調べた。重合体の細胞毒性をＮＩＨ ３Ｔ３細胞株（培地中の重合体濃度０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬ）で処理した。処理から２４時間後、すべてのポリマー濃度で９０～９５％の細胞生存率が観察された（図３の（ｂ））。同一組成のポリマーをＣＰで４８、７２時間処理した後も細胞毒性の効果はなく、これを図４に示した。これは、ＣＰが細胞適合性物質であることを示している。

実施例３．自己組織化ＰＮ及びＴＣＡカプセル化の特性

ポリマーの側鎖は、疎水性部分と親水性部分からなり、バランスのとれた両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）を有する。ポリマーは、水分子に対するポリマーの疎水性のＩｌｅＯＥｔ単位の露出領域を最小化するために、水性環境で球状のナノ粒子として存在する。また、ＴＣＡなどの疎水性薬物は、ＰＮの疎水性コア部分と相互作用する（図５の（ａ））。自己組織化ＰＮ及びＴｅＰＮは、ＴＥＭ及びサイズ分布の研究によって調べた。丸い形のＰＮは、ＴＥＭ像で識別され（図５の（ｂ））、サイズは２５℃（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液で１２０ｍｇ／ｍＬのＰＮ）で～１４０ｎｍであり、誤差範囲は≦４ｎｍであった。水溶性の低い薬物であるＴＣＡは、ＰＢＳ溶液（ＰＢＳ内１．５ｍｇ／ｍＬのＴＣＡ）で、２３２．９ｎｍ～３３４３ｎｍの範囲（ＤＬＳ及びＴＥＭデータにおける誤差範囲≧１４５０ｎｍ）の不規則なナノ及びマイクロサイズの結晶相（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ）を示した（図５の（ｃ）及び図６）。しかし、微細なサイズのＴＣＡ凝集体は、ＰＮ分散ＰＢＳ溶液と混合及び培養した後、サイズ分布から消えた。サイズが～１４０ｎｍの粒子のみがＴＣＡとＰＮの混合溶液（ＰＢＳ溶液で１２０ｍｇ／ｍＬのＰＮ及び１．５ｍｇ／ ｍＬのＴＣＡ）で≦４ｎｍの誤差範囲で測定された（図５の（ｄ））。この結果は、ＰＮナノ粒子へのＴＣＡの成功的なカプセル化を意味する。この粒子の平均サイズと多分散指数（ＰＤＩ）の値は、図５の（ｅ）及び図７に示されている。サイズの変化と著しい減少は、ＴＣＡが疎水性相互作用によりＰＮの疎水性コアにうまくカプセル化できることを証明する。

実施例４．ＴｅＰＮ溶液の温度感受性ゾル－ゲル転移の挙動の確認

ＰＮの一定の濃度以上の水溶液では、温度の変化に伴う明らかな粘度変化と相転移が現れる。このような相転移は、昇温に従いＰＮの親水性ＰＥＧ鎖と水分子との間の水素結合が弱くなって発生するが、それに対しＰＮ間の疎水性の相互作用は増加した、本研究では、１２ｗｔ％のＰＮ溶液を、注射性が良く、十分な粘度を有し、体温でゲル状態となるように、最大貯蔵弾性率を有するように製造した。図８の（ａ）に示されたように、ＰＮ溶液は、３２℃まで０Ｐａ・ｓに近い粘度を示した。粘度の数値は３２℃で増加し続け、３７℃で５１８．７５Ｐａ・ｓを示した。同様に、貯蔵及び損失弾性率の値はいずれも３２℃で増加し、貯蔵弾性率の値（Ｇ’）は、レオロジー研究において３２℃と４４℃の間の損失弾性率値（Ｇ”）よりも大きかった。３７℃におけるＧ’及びＧ”の値はそれぞれ、１２８４．３及び７６５Ｐａと、ゲル状態を示した（図８の（ｂ））。

また、図８の（ｃ）に示されたように、薬物送達ヒドロゲルの物理的特性が薬物放出パターン又は期間に大きな影響を及ぼす可能性があるため、ＴＣＡローディング後のゾル－ゲル転移の挙動をモニターした。ＴｅＰＮ溶液の貯蔵及び損失係数は、３つの異なる用量でＴＣＡをローディングした後に測定された。すべての群で、温度の変化による貯蔵及び損失弾性率の値で類似した変化を示した。この結果は、ローディングされたＴＣＡがＰＮの内部で均質にカプセル化され、ゾル－ゲル転移の挙動にほぼ影響を及ぼしていないことを立証でき、このような特性は、様々な薬物の投与量でもヒドロゲルが類似した挙動を示すと予測可能である。

実施例５．ＴｅＰＮヒドロゲルの生体内分解

生分解は、生体材料及び薬物送達体への必須要件であるため、ＰＮヒドロゲルが局所配置された組織の周りのヒドロゲル分解速度及び一般的な症状をモニターした。準備したＰＮ溶液を３１ゲージ針でマウスの皮下に注射した。注射後、ＰＮヒドロゲルの形成を直接確認し、残りのＰＮヒドロゲルは、意図した時点で皮膚で簡単な分離過程を経て測定した（図９の（ａ））。残りのＰＮヒドロゲルの量は、４２日経時により減少した（図９の（ｂ）及び図１０）。このような生分解の特性、ＰＮヒドロゲル形成のための穏やかな条件及び注入された部位における長期滞在は、開発されたＰＮヒドロゲルシステムが長期薬物貯蔵所であり、薬物の送達キャリアとしての用途に適していることを示している。

実施例６．試験管内ＴｅＰＮからのＴＣＡの持続放出プロファイルの確認

ＴＣＡのようなステロイド性抗炎症薬は、関節内への投与後の滞留時間が短く、体内から迅速に除去される。したがって、一般的な投与時における長期間の抗炎症効果は制限的である。ＴｅＰＮヒドロゲルシステムは、強く相互作用する薬物が材料の分解特性に大きく依存する傾向があり、ＰＮヒドロゲルの解離及び分解速度を制御することにより、ＴＣＡ放出パターン及び期間を制御することができる。３つの異なる濃度のＴＣＡを含む新しく準備したＴｅＰＮ溶液を用いてＴＣＡ放出挙動を実験した。３７℃でＴｅＰＮヒドロゲルを形成した後、それぞれのＴｅＰＮヒドロゲルをＰＢＳ緩衝液に浸漬した。１日未満の速い膨潤を示すＰＮ群とは対照的に、ＴＣＡがある大部分のヒドロゲルは、１週間後に膨潤を示しており、これは、ＴＣＡとヒドロゲルとの間の疎水性相互作用が水溶液におけるポリマー構造の安定性を向上させるためであると考えられる（図１１）。また、すべてのゲルは、４週間後に質量損失が始まった（図１２の（ａ））。これは、４２日間のヒドロゲルのＴＣＡ放出パターンと密接な関係があった（図１２の（ｂ））。０．３、１．０及び１．５ｍｇ／ｍＬのＴＣＡ濃度を有する３つのＴｅＰＮヒドロゲル群で最初の２４時間の間にＴＣＡの抑制された初期放出が確認され、観察された値は、すべてのローディングされたＴＣＡの量に対してそれぞれ１４．４５％、９．５５％及び９．７２％と読み取られた。このような結果は、送達キャリアがないＴＣＡの半減期が、直接投与の場合に人体で１．２７時間に過ぎなかったこととは対照的な結果であった。各ＴｅＰＮヒドロゲル群で７日、１４日及び１６日にローディングされたＴＣＡ量の略半分が、それぞれ０．３、１．０及び１．５ｍｇ／ｍＬの値で放出された。持続放出過程は、ＴｅＰＮヒドロゲルが完全に分解されるまで続けられた。一方、ＴＣＡ濃度が最も低いＴｅＰＮヒドロゲル群は、他の２つの群よりも速い放出パターンを示した。低いＴＣＡ濃度は、疎水性ネットワークの損失、速い膨潤、及び速い溶解に影響を与えられる。１．０ｍｇ／ｍＬ及び１．５ｍｇ／ｍＬのＴＣＡを含むＴｅＰＮヒドロゲル群において、経時によるＴＣＡ放出パターンは線形的であった。ＴｅＰＮヒドロゲルの分解とＴＣＡ放出時間はほぼ類似した。抑制された初期放出及び連続ＴＣＡ放出は、ＴＣＡがポリマーと強く相互作用してＰＮにより良好にキャプセル化されることを示す。

実施例７．ＯＡラットモデルにおけるＴｅＰＮヒドロゲルの１回の注入による長期抗炎症及び軟骨退化予防効果の確認

ＴｅＰＮヒドロゲル貯蔵システムの１回の注入で、長期抗炎症及び軟骨変性抑制効果を検証した。ＴｅＰＮヒドロゲルシステムの治療のために、ＭＩＡ（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ）誘発ＯＡを有するラットモデルを準備した。ＴｅＰＮの注入は、ＯＡの初期段階を模倣するために、ＯＡ生成後１週間に行われた。ＴｅＰＮヒドロゲル群に加えて、ＴＣＡ溶液の直接注入群及び食塩水群を対照群として追加した。生理食塩水、ＴｅＰＮ、及びＴＣＡをそれぞれ３００μｌ溶液準備し、ラットの傷害部位に注入した。

治療開始から８週間後、死んだラットの膝関節を解剖した結果、ＴｅＰＮを処理した群でのみ他の群と比較して明らかに稀な炎症反応を示した（図１３）。形態学的研究のために、Ｘ線及びμ－ＣＴ画像も撮影し、これを図１４の（ａ）に示した。生理食塩水処理群は、重度の軟骨欠損及び軟骨破壊とともに、相当進行した変形性関節症を示した。しかし、各ＴｅＰＮ処理群は、良く維持された形態学的特性を示し、ＯＡの初期段階の炎症が持続放出ＴＣＡにより良好に抑制されたことを示した。さらに、すべてのＴｅＰＮヒドロゲル群は、ＴＣＡ溶液群と比較して抗ＯＡ効果において有意な改善を示した。ＴＣＡの直接溶液注入群の破壊された軟骨状態は、長期の炎症治療及び軟骨変性防止の失敗を反映する。ＴＣＡ溶液群における軟骨の病理学的状態は、生理食塩水処理群と類似しているか又はより悪かった。これは、軟骨細胞毒性に対するＴＣＡの直接ＩＡ注入の起こり得る副作用と、高用量のＴＣＡを用いた局所治療が、ヒドロキシプロリン生産を減少させ、線維芽細胞成長及びコラーゲン合成を抑制でき、これにより膝周辺の結合組織の構造的安定性が減少される可能性があるためであると予想された。統計的評価のために、関節間軟骨（ＤＩＣ）の距離を測定した（図１４の（ｂ））。多くのＤＩＣは、左右側両方において生理食塩水群とＴＣＡ溶液処理群で同様に増加したが、軟骨の左側部分で生理食塩水群と高濃度ＴＣＡ溶液（１．５ｍｇ／ｍＬ）群との間に統計的に有意な差のみが確認された。軟骨の深刻な破壊は、１）短時間で直接的な高用量のＴＣＡ曝露の毒性の可能性と、２）速いＴＣＡの除去により持続的な消炎効果が不適切であるという２つの理由で発生する可能性がある。

また、ＴｅＰＮヒドロゲル群では軟骨変性が良好に予防されたのに対し、ＴＣＡ溶液の直接注入群ではＯＡ治療が失敗した対照的な結果が、組織学的染色法により立証された（図１５）。Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）とｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ染色は、各実験群の形態的特徴を示した。生理食塩水及びＴＣＡ溶液処理群では、軟骨が薄くなり、軟骨細胞のある組織が失われ、健康な軟骨で確認されたグリコサミノグリカンの特徴的な赤色染色が消えた。このような結果は、生理食塩水及びＴＣＡ溶液の治療が初期発症後ＯＡの進行にほとんど影響を与えていないことを示している。しかし、ＴｅＰＮヒドロゲル群は、正常軟骨と形態学的類似性を示し、軟骨細胞の細胞特性が良好に維持された。この実験では、ＴｅＰＮヒドロゲルシステムの１回の注入によるＴＣＡの持続的な放出が、さらなる炎症及びＯＡの進行を効果的に予防できることを確認することができた。

実施例８．ＴｅＰＮヒドロゲルシステムを用いた持続的なＴＣＡ放出が全身炎症の遺伝子の抑制及び抗炎症の遺伝子の活性化に及ぼす影響の確認

実験期間中の炎症の遺伝子の発現の変化を評価した。較正された血液サンプルから全身炎症及び抗炎症の遺伝子の発現レベルを評価した。ＭＩＡ誘発変形性関節症の発生から１週間後、全身炎症性サイトカインであるＭＭＰ－３、ＭＭＰ－１３、ＩＬ－６、及びＴＮＦ－αの遺伝子の発現レベルは、正常群よりもそれぞれ５．６０、４．２５、４．８０、及び５．３５倍増加した（図１６の（ａ））。ＴｅＰＮ又はＴＣＡ溶液を注入してから１週間、４週間、８週間で各実験群で対照される遺伝子の発現パターンを観察した。全身炎症性サイトカインの増加した遺伝子の発現レベルは、ＴｅＰＮヒドロゲル群で経時に減少したが、ＴＣＡ溶液群は持続的に増加した。全身炎症性サイトカインとＭＭＰｓの発現が軟骨変性を引き起こすため、炎症誘発性サイトカインとＭＭＰｓサイトカインを効果的に下げることで軟骨の退化を成功裏に予防することができた。８週間後にＴＣＡ濃度が最も高いＴｅＰＮヒドロゲルで、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－１３、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αサイトカインの遺伝子のレベルは、生理食塩水処理群に比べてそれぞれ１．６２倍、１．６７倍、１．４９倍、及び１．６２倍に減少したことが確認された。対照的に、ＴＣＡ溶液群における各全身炎症性サイトカインの遺伝子のレベルは、経時に応じて持続的に増加した。直接投与されたＴＣＡは迅速に除去されるため、ＴＣＡ溶液の１回のＩＡ注入で細胞外基質の分解及び軟骨のコラーゲン分解を防止するには、抗炎症効果が不十分であった。

ＩＬ－４、ＩＬ－１０及びＩＬ－１３のような抗炎症サイトカインの遺伝子を同時にモニターした（図１６の（ｂ））。このような遺伝子の発現は、マクロファージのような免疫細胞及び特定のＴ細胞（Ｔｈ２）の生存、増殖及び分化に対する刺激と関連していることが知られている。また、このようなサイトカインの発現の度合は、インターフェロン－γ、インターロイキン、ＴＮＦ－αなどの全身炎症性サイトカインの合成を阻害する基準となり得る。ＭＩＡ誘発変形性関節症の発生から１週間後、すべての治療群でＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３遺伝子の発現レベルは、定常状態とほぼ類似していた。炎症誘発後４週間までは、治療群間に有意な差はなかった。しかし、８週間後、ＴｅＰＮヒドロゲル処理群で各遺伝子の発現量が有意に増加した。また、ローディングされたＴＣＡの濃度によって遺伝子発現の増加マージンが拡大した。８週間後、ＴＣＡ濃度が最も高いＴｅＰＮヒドロゲルで、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３遺伝子の発現レベルが生理食塩水処理群よりもそれぞれ１．９１倍、２．２５倍、１．９２倍高かった。このような結果は、持続的なＴＣＡ放出の効率と１回の注射による長期的な抗炎症効果を裏付けるものである。体重に対する異常症状はなかった（図１７）。ＴＣＡを含まないＰＮヒドロゲル処理は、全身炎症性及び抗炎症性遺伝子の発現レベルに変化を示さなかった。すなわち、キャリアＰＮヒドロゲルシステムは、全身炎症反応に影響を及ぼさないことを示す。

実施例９．ＩｌｅＯＥｔ／ＡＭＰＥＧのモル比による放出特性の最適化

ＩｌｅＯＥｔ／ＡＭＰＥＧのモル比によって、ＰＮの疎水性性質、これと関連する薬物担持能力と徐放能力が異なるため、ＩｌｅＯＥｔ／ＡＭＰＥＧのモル比を調節して最適な放出特性を有する高分子組成を確認しようとした。

ポリ［（イソロイシンエチルエステル）_１．４７（アミノメトキシポリエチレングリコール７５０）_０．２４（エタノール）_０．２１（酸）_０．０８ホスファゼン］_ｎ（以下、ＰＰＺ ４３）、ポリ［（イソロイシンエチルエステル）_１．３７（アミノメトキシポリエチレングリコール７５０）_０．２５（エタノール）_０．２７（酸）_０．１１ホスファゼン］_ｎ（以下、ＰＰＺ ４６）、及びポリ［（イソロイシンエチルエステル）_１．４４（アミノメトキシポリエチレングリコール７５０）_０．３０（エタノール）_０．０８（酸）_０．１８ホスファゼン］_ｎ（以下、ＰＰＺ ２４）を以下のように調製し、調製されたＰＰＺのＮＭＲデータを図１８に示した。

ＰＰＺ ４３は以下のように調製した。前駆体重合体（ＰＰ）は以下のように調製した。まず、ＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ（２４．６５ｇ、１１２．９８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）に懸濁し、反応フラスコを冷却した。続いて、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０．００ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解した後、無水ＴＨＡ及びＴＥＡに溶解したＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ（２４．６５ｇ、１１２．９８ｍｍｏｌ）を含有する反応フラスコにゆっくり添加した。反応混合物をドライアイス水槽で１２時間撹拌し、４５℃で２４時間撹拌した。続いて、ＡＥｔＯＨ（１．０５ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）及びＡＭＰＥＧ７５０（２２ｇ、２９．３４ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦに溶解し、反応混合物に添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、４５℃でさらに２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、ｎ－ヘキサンに注いで、沈殿物を得た後、同じ溶媒系で２回再沈殿させた。重合体生成物を、室温で４日間メタノールに対して、４℃で４日間蒸留水に対して、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＭＷＣＯ：１０～１２ｋＤａ）で透析してさらに精製した。透析液を凍結乾燥してＰＰを得た。

ヒドロキシル末端をカルボン酸末端に置換するために、ＰＰ（１０ｇ、１２．２５ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦに溶解した。これに無水グルタル酸（２．８０ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（２．９９ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）を添加した反応混合物を室温で１２時間撹拌した後、４０～４５℃まで２４時間さらに加熱した。最終生成物のＣＰは、室温で３日間メタノールに対して、４℃で３日間水に対して透析膜で透析した。精製されたＣＰは凍結乾燥して得た。２．１～２．３２ｐｐｍ（ｂ、４Ｈ、ＣＨ２）で新たに現れたピークは、ＣＰ ^１ＨＮＭＲに存在しない生成されたグルタル酸末端を示す。

ＰＰＺ ４６は以下のように調製した。前駆体重合体（ＰＰ）は以下のように調製した。まず、ＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ（２３．９８ｇ、１２２．５３ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）に懸濁し、反応フラスコを冷却した。続いて、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０．００ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解した後、無水ＴＨＡ及びＴＥＡに溶解したＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ（２３．９８ｇ、１２２．５３ｍｍｏｌ）を含有する反応フラスコにゆっくり添加した。反応混合物をドライアイス水槽で１２時間撹拌し、４５℃で２４時間撹拌した。続いて、ＡＥｔＯＨ（１．３２ｇ、２１．５７ｍｍｏｌ）及びＡＭＰＥＧ７５０（２１．３６ｇ、２８．４８ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦに溶解し、反応混合物に添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、４５℃でさらに２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、ｎ－ヘキサンに注いで、沈殿物を得た後、同じ溶媒系で２回再沈殿させた。重合体生成物を、室温で４日間メタノールに対して、４℃で４日間蒸留水に対して、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＭＷＣＯ：１０～１２ｋＤａ）で透析してさらに精製した。透析液を凍結乾燥してＰＰを得た。

ヒドロキシル末端をカルボン酸末端に置換するために、ＰＰ（１０ｇ、１２．２５ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦに溶解した。これに無水グルタル酸（２．８０ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（２．９９ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）を添加した反応混合物を室温で１２時間撹拌した後、４０～４５℃まで２４時間さらに加熱した。最終生成物のＣＰは、室温で３日間メタノールに対して、４℃で３日間水に対して透析膜で透析した。精製されたＣＰは凍結乾燥して得た。２．１～２．３２ｐｐｍ（ｂ、４Ｈ、ＣＨ２）で新たに現れたピークは、ＣＰ ^１ＨＮＭＲに存在しない生成されたグルタル酸末端を示す。

ＰＰＺ ２４は以下のように調製し、前駆体重合体（ＰＰ）は以下のように調製した。まず、ＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ（２６．４３ｇ、１３４．６１ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）に懸濁し、反応フラスコを冷却した。続いて、ポリ（ジクロロホスファゼン）（１０．００ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解した後、無水ＴＨＡ及びＴＥＡに溶解したＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ（２６．４３ｇ、１３４．６１ｍｍｏｌ）を含有する反応フラスコにゆっくり添加した。反応混合物をドライアイス水槽で１２時間撹拌し、４５℃で２４時間撹拌した。続いて、ＡＥｔＯＨ（１．０５ｇ、１７．２６ｍｍｏｌ）及びＡＭＰＥＧ７５０（１５．５３ｇ、２０．７１ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦに溶解し、反応混合物に添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、４５℃でさらに２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、ｎ－ヘキサンに注いで、沈殿物を得た後、同じ溶媒系で２回再沈殿させた。重合体生成物を、室温で４日間メタノールに対して、４℃で４日間蒸留水に対して、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＭＷＣＯ：１０～１２ｋＤａ）で透析してさらに精製した。透析液を凍結乾燥してＰＰを得た。

ヒドロキシル末端をカルボン酸末端に置換するために、ＰＰ（１０ｇ、１２．２５ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦに溶解した。これに無水グルタル酸（２．８０ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（２．９９ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）を添加した反応混合物を室温で１２時間撹拌した後、４０～４５℃まで２４時間さらに加熱した。最終生成物のＣＰは、室温で３日間メタノールに対して、４℃で３日間水に対して透析膜で透析した。精製されたＣＰは凍結乾燥して得た。２．１～２．３２ｐｐｍ（ｂ、４Ｈ、ＣＨ２）で新たに現れたピークは、ＣＰ ^１ＨＮＭＲに存在しない生成されたグルタル酸末端を示す。

製造されたＰＰＺ４３、４６及び２４のＴ_ｍａｘを測定して図１９の（ａ）に示した。図に示したように、ＩｌｅＯＥｔ／ＡＭＰＥＧのモル比が高くなるほど疎水性が強くなり、Ｔ_ｍａｘ値が減少した。図１９の（ｂ）は、それぞれの化合物にＴＣＡを担持した後、経時による累積放出量をｍｇと％でそれぞれ示したものである。疎水性性質が強くなるほど、疎水性薬物であるＴＣＡをさらに徐放する特徴を確認することができた。

実施例６及び図１２に示したＴＣＡの放出プロファイルを参照すると、ＴｅＰＮ１．５で（１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で担持されたＴＣＡカプセル化ＰＮで）ＴＣＡの放出速度は０．０１１～０．０１８ｍｇ／ｄａｙ（１１～１８μｇ／ｄａｙ）であった。ＴｅＰＮは、体内に２００～３００μｌ程度で適用され、３０日程度にわたって徐々に分解してＴＣＡを放出するようになる。したがって、１日に体内で放出されて曝露され得るＴＣＡ量を計算してｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に適用しようとし、そのために、ＴｅＰＮ１．５に担持された１．５ｍｇ／ｍｌのＴＣＡをそれぞれ２０倍～１６０倍に希釈してそれぞれ９．３７５、１８．７５、３７．５、及び７５μｇ／ｍｌの濃度で担持した。

担持したＴＣＡとＰＰＺの複合体を、炎症環境が誘導された軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）に処理して炎症関連因子の発現をＰＣＲで測定した。炎症環境の誘導は、ヒト軟骨細胞にＩＬ－１βを１０ｎｇ／ｍｌで処理してｉｎ ｖｉｔｒｏ関節炎モデルを形成した。モデルにおいて前記の各濃度で担持されたＴＣＡ－ＰＰＺ複合体を処理したときのＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＩＬ－６、及びＴＮＦ－αの相対的発現程度を測定して図２０に示した。図で分かるように、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、及びＩＬ－６（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）がＩＬ－１βを処理した後に急激に増加し、炎症環境が良好に誘導されたことを確認した。この際、９．３７５～３７．５μｇ／ｍｌのＴＣＡ－ＰＰＺ複合体を処理した場合、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、及びＩＬ－６の発現が急激に減少することが確認できたのに対し、最も高い投与量である７５μｇ／ｍｌの濃度では相対発現量の減少が少なく、炎症緩和効果が９．３７５～３７．５μｇ／ｍｌの濃度よりもされに減少することが示された。すなわち、高投与量のＴＣＡは悪影響を及ぼし得ることが示され、一定の濃度の薬物を徐々に放出する薬物送達体の特性がＯＡ治療にさらに有用であることを示唆する。

最適なＩｌｅＯＥｔ／ＡＭＰＥＧのモル比を確認するために、以下のように実験した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ放出実験で、２００ｕｌのＴＣＡ－ＰＰＺ複合体が表２に示す量で放出されることを確認した。

これに基づいて、５ｍｌのＴＣＡ－ＰＰＺ溶液で処理する場合を想定して放出されるＴＣＡの量の予想値を計算して下記表３に示した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏのＯＡモデルは、主に軟骨細胞にＩＬ－１βを処理することになり、１０ｍｌの培養培地を用いる場合が多く、培養培地の体積の半分である５ｍｌのＴＣＡ－ＰＰＺヒドロゲルを処理する場合を想定した。

前記表３の予測値に基づいて、最適なＩｌｅＯＥｔ／ＡＭＰＥＧのモル比を確認するために、以下のように計算した。まず、総培養培地の体積が１０ｍｌであるため、前記表３のＴＣＡ放出量の予想値を１０で割った数値がμｇ／ｍｌ単位のＴＣＡ放出濃度と予測された。この予測されたＴＣＡ放出濃度を各日付別に表示して図２１に示した。図２１を参照すると、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、及びＩＬ－６の発現量が最適な９．３７５μｇ／ｍｌ～３７．５μｇ／ｍｌの範囲内に１日目から４日目までのすべてが含まれる高分子組成は、４３ＧＡに該当し、そのＩｌｅＯＥｔ／ＡＭＰＥＧのモル比は約６．１２５と確認され、当該モル比の範囲で最良の徐放特性を示すことが分かった。

下記の実施例１０以降では、セレコキシブ（ＣＸＢ）搭載のためのポリ（有機ホスファゼン）の調製とその効果について開示する。アキレス腱炎（Ａｃｈｉｌｌｅｓ ｔｅｎｄｏｎｉｔｉｓ、ＡＴ）におけるセレコキシブを搭載したポリ（有機ホスファゼン）の処理に対する模式図を図２２に示した。

実施例１０．実験方法Ｂ

実施例１０－１．材料

Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｃｙｃｌｏｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）は、精製のために真空下で６０℃で再結晶化した。ポリ（ジクロロホスファゼン）は、前記実施例２に開示したように合成された。ｌ－Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ）（Ａ＆Ｚ ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ、Ｈａｎｇｚｈｏｕ、Ｃｈｉｎａ）を入手し、５５℃の真空条件で１０日間乾燥し、Ｍｅｔｈｏｘｙ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（７５０Ｄａ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より入手し、α－アミノ－ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）（ＡＭＰＥＧ）に置き換えた。Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）、ｇｌｕｔａｒｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ＵＳＡ）、４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＤＭＡＰ）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ＵＳＡ）が準備された。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）を窒素ガスに溶解し、ＴＨＦをナトリウム金属（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）及びベンゾフェノン（Ｄａｅｊｕｎｇ、韓国）を使用して乾燥した。酸化バリウム（Ｄａｅｊｕｎｇ、韓国）を使用してＴＥＡを乾燥した。セレコキシブ（Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ、ＣＸＢ）はＥＤＱＡ（ヨーロッパ）より入手した。

実施例１０－２．ＰＮＰ合成

反応は、標準的なシュレンクラインを用いて、乾燥窒素雰囲気下で行われた。ＩｌｅＯＥｔ・ＨＣｌ（１０．３８ｇ、５３．０６ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦに溶解した。反応器をドライアイス水槽で撹拌し、乾燥したＴＥＡ５０ｍＬを添加した。ポリ（ジクロロホスファゼン）（５．００ｇ、４３．１４ｍｍｏｌ）を乾燥されたＴＨＦに溶解し、反応器に添加した。反応温度５０℃、２４時間に設定し、重合体をエタノールアミン（０．９１ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）及びＡＭＰＥＧ（１３．５９ｇ、１８．１２ｍｍｏｌ）を添加して４８時間さらに反応させた。ポリマー溶液を濾過し、ロータリーエバポレータを使用して溶媒を除去した。重合体はｎ－ヘキサン（Ｄａｅｊｕｎｇ、韓国）に２回注いで沈殿させ、４日間メタノールに対して透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＭＷＣＯ：１０～１２ｋＤａ）を使用し、４日間蒸留水を使用してさらに精製した。精製された高分子溶液を０．４５μｍの気孔を有するシリンジフィルタを使用して濾過し、凍結乾燥して、アミノエタノール結合ポリ（有機ホスファゼン）を得た。乾燥ＴＨＦをアミノエタノール－ポリ（有機ホスファゼン）（１０ｇ、１５８．９３ｍｍｏｌ）に添加してカルボン酸基と結合させた。無水グルタル酸無水物（５．９８ｇ、５２．４１ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（６．４０ｇ、５２．４１ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦに溶解し、アミノエタノールＰＰＺ溶液に添加した。その後、溶液を撹拌し、４５℃で２４時間培養した。次に重合体を４日間透析膜を使用してメタノールに対して透析し、凍結乾燥する前に４日間蒸留水を使用した。このような製造工程により、（ＩｌｅＯＥｔ）、（ＡＭＰＥＧ７５０）、（ＥｔＯＨ）及び（Ａｃｉｄ）からなる高分子を得ることができた。

実施例１０－３．ＰＮＰの特性確認

^１Ｈ ＮＭＲの結果は、次の通りであった。

^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３），δ（ｐｐｍ）：０．８-１．０（ｓ，６Ｈ），１．１-１．３（ｂ，３Ｈ），１．３-１．６（ｂ，２Ｈ），１．６-１．９（ｂ，１Ｈ），２．１-２．３（ｂ，４Ｈ），２．８-３．３（ｂ，２Ｈ），３．４-３．８（ｂ，６２Ｈ），３．９（ｓ，１Ｈ），ａｎｄ ４．０-４．３（ｂ，３Ｈ）

重合体の分子量は、ゲル透過クロマトグラフィシステム（ＥｃｏＳＥＣ ＨＬＣ－８３２０ ＧＰＣ、Ｔｏｓｏｈ）及び屈折率検出器を使用して測定した。２つのＳｔｙｒａｇｅｌカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒｍｕｌｔｉｐｏｒｅＨＺ－Ｍ及びＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＨＺ－２５００）を接続し、４０℃で０．３５ｍＬ ｍｉｎ－１の流速で使用した。ＴＨＦは、移動相として０．１％（ｗ／ｖ）臭化テトラブチルアンモニウムと共に使用した。ポリスチレン（ＭＷ：１６２；５８０；１９２０；３０９０；９５９０；２７ ８１０；７０ ５００；１３３ ５００；２９０ ３００；７２９ ５００；１ ０７４ ０００；及び２ ７０３ ０００Ｄａ）が標準として使用された。フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）は、ＦＴＩＲ分光計（Ｎｉｃｏｌｅｔ ｉ２０ ＦＴＩＲ分光計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、ＰＣＮＰでＣＸＢ及びＰＮＰの存在を特性化するために行われた。サンプルをクロロホルムに１ｗｔ％で溶解し、ＫＢｒ円形セル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）にコーティングした。クロロホルムを乾燥した後、コーティングされたサンプルを分析して、波数範囲４０００～５００ｃｍ－１で３２回スキャンしてＦＴＩＲスペクトルを得た。

実施例１０－４．細胞生存率試験

ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞細胞株と連続的に希釈されたＰＮＰヒドロゲル（０～１０ｍｇ／ｍＬ）を使用した。細胞を９６ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＳＰＬ、Ｋｏｒｅａ）に２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で分注し、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に、３７℃、ＣＯ₂インキュベータで２４時間培養した。培養培地は、ＰＮＰ、ＣＸＢ、及びＰＣＮＰの濃度が異なるＦＢＳを含まないＤＭＥＭに交換された。２４時間後、ＭＴＴ溶液（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５ ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を添加した後、３７℃、ＣＯ_２インキュベータで２時間インキュベートした。Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（２００μｌ； Ｄａｅｊｕｎｇ、Ｋｏｒｅａ）を添加し、Ｓｐｅｃｔｒａ ＭＡＸ ３４０ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して５７０ｎｍで溶液の吸光度を測定した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の生存率は、実験群と対照群の吸光度を用いて次の式で計算されたた。

細胞生存率（％）＝吸光度（実験群）／吸光度（対照群）×１００

実施例１０－５．レオロジー試験

ＰＰＺの温度感受性ゾル－ゲル転移は、レオメータ（Ａｎｔｏｎ Ｐａｒｒ、ＡＴ）を使用して測定した。ＰＮＰ及びＰＣＮＰヒドロゲル溶液は、１０ｗｔ％の濃度で準備した。モジュラスは正確な温度で測定した。レオメータは、２５．０ｍｍの平行板と０．５ｍｍのゼロギャップと共に使用された。モジュラスは、周波数０．８Ｈｚ及び１０％歪み及び様々な温度で振動応力下で測定した。３７℃、１０％せん断歪みの下で周波数掃引試験も行った。すべてのモジュラスデータは、ＲｈｅｏｃｏｍｐａｓｓのＡｎｔｏｎ Ｐａｒｒソフトウェアを用いて分析した。

実施例１０－６．極低温走査電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＳＥＭ）像の取得

Ａｌｔｏ ２５００ ｃｒｙｏ－ｔｒａｎｓｆｅｒシステム（Ｇａｔａｎ、ＵＫ）を備えたＱｕａｎｔａ ３Ｄ ＦＥＧ（ＦＥＩ、オランダ）をｃｒｙｏ－ＳＥＭ実験に使用した。ＰＮＰ及びＰＣＮＰサンプルを０．５秒かけて液体窒素スラッシュに速やかに浸漬した。冷凍室は数秒後に空になり、サンプルは約－１９０℃で１０^－５ｍｂａｒで予め空にした準備チャンバに移した。金属蒸着は、６０秒間、３ｍＡの電流でプラズマスパッターにより行った。金属コーティングされたサンプルを１０^－５ｍｂａｒの圧力で予め真空処理し、－１９０℃の温度に予め冷却した顕微鏡チャンバに移した。ｃｒｙｏ－ＳＥＭ像は１１．８ｐＡで５－ｋｅＶビームで取得した。

実施例１０－７．動的光散乱（ＤＬＳ）

ＰＮＰ、ＣＸＢ及びＰＣＮＰの粒子サイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用して調べた。ナノ粒子を０．１ｗｔ％濃度のリン酸緩衝生理食塩水（Ｗｅｌｌ Ｇｅｎｅ、ＫＲ）に溶解し、粒子サイズを５、２５、３７及び４５℃で２サイクルにわたって測定した。

ゼータ電位評価のために、０．５ｗｔ％のＰＮＰとＰＣＮＰ（ＣＸＢ ４ｍｇ）を室温で準備した。測定は、ＤＬＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用して行った。

実施例１０－８．試験管内及び生体内のヒドロゲル分解

試験管内の膨潤及び分解を確認するために、２００μｌの１０ｗｔ％のＰＮＰヒドロゲルをインサートウェルで秤量し、完全なゲル化を誘導するために３７℃のオーブンで５分間インキュベートした。その後、ヒドロゲルブロックを３７℃でＰＢＳに浸漬した。決められた時点でヒドロゲルの質量の変化を測定した。

ＰＮＰの膨潤及び分解を測定するために、ＰＮＰを１０ｗｔ％でＰＢＳに溶解し、４℃で撹拌した。次に、２００μｌのポリマー溶液をそれぞれのマウス（ＣｒｌｊＯｒｉ：ＣＤ１（ＩＣＲ）、６週齢、オス、韓国オリエントバイオ）の背中にゆっくり皮下注射した。注入されたＰＮＰを抽出し、一定の時点で残量を測定した。

実施例１０－９．ＰＣＮＰにおけるＣＸＢの体外への放出

ＰＣＮＰヒドロゲルは、ＣＸＢと共に１０ｗｔ％のＰＮＰを撹拌して調製した。その後、ＰＮＣＰ（２００μｌ）をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（直径：１２ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）に入れ、３７℃で５分間オーブンに入れた。続いてＰＣＮＰを６ｍＬのＰＢＳを含む１５ｍＬの円錐形チューブに浸漬し、振とう槽（ＫＭＣ－１２－５５Ｗ１、Ｖｉｓｉｏｎ、ＫＲ）で３７℃及び５０ｒｐｍで培養した。ＰＢＳは、特定の時点で変更された。放出されたＣＸＢは、移動相としてメタノール（７５％）と水（２５％）を使用し、高性能液体クロマトグラフィ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。

キネティック・モデルは、実験データを合わせるために使用した。このモデルには、

が含まれている。各式の左辺

は、時間ｔにおける薬物放出の百分率を表す。ｋ及びｎはそれぞれ、キネティック定数及び拡散指数を示す。

実施例１０－１０．生体内の腱再生試験

マウスを用いたすべての実験は、高麗大学医療院動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）の関連法及び制度的指針に準拠して行われ、ＩＡＣＵＣ承認（承認番号ＫＯＲＥＡ－２０１８－００４９）を受けた。Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｉｎｃ．、ＵＳ、５０μＬ）を生後９週齢のマウス（ＤｏｏＹｅｏｌ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓｅｏｕｌ、ＫＲ）に注射して、１週間放置した後、ＤＭＳＯに溶解した１又は４ｍｇ／（１００μＬ）濃度のＣＸＢ溶液を注入して欠損腱を治療した。ＰＣＮＰ（ＣＸＢ １ｍｇ）及びＰＣＮＰ（ＣＸＢ ４ｍｇ）ヒドロゲルは、４℃で１００μＬの１０ｗｔ％のＰＮＰヒドロゲルに１ｍｇ又は４ｍｇのＣＸＢを撹拌して調製した。その後、ＰＣＮＰヒドロゲルを欠損腱モデルに注入した。

実施例１０－１１．リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）

血液サンプルは、ＣＸＢ溶液又はＰＣＮＰを欠損腱に注入してから４週間後に採取した。ＲＮＡ血液キット（ＱＩＡＧＥＮ、ＱＩＡａｍｐ）をＲＮＡ抽出に使用した。Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ プレミックス（ｄＴ２０）（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用してｃＤＮＡを合成した。リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）は、ＡＢＩ７３００リアルタイムの熱循環器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を使用して行い、炎症誘発性サイトカイン（ＣＯＸ－２、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－１３、及びＴＮＦ－α）、及び抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－４及びＩＬ－１０）を検査した。遺伝子マーカー配列は、次の表４に示した。

実施例１０－１２．組織学的処理及び分析

ＰＣＮＰ又はＣＸＢ溶液で処理した欠損腱を抽出し、ＤＰＢＳで洗浄した。各腱を４％パラホルムアルデヒドに２４時間浸漬して組織を固定した後、腱をすすぎ、パラフィン（５μｍの切片）で切断した。パラフィン切片を６０℃のオーブンに入れ、１００％、９０％、８０％及び７０％のエタノールが含まれたキシレンでパラフィンを除去した。セクションはＨ＆Ｅ及びＭＴで染色した。各群は３倍（ｎ＝３）であった。

実施例１０－１３．ヒドロキシプロリン含量の分析

ＰＣＮＰ及びＣＸＢ溶液処理によるＡＴの緩和を立証するために、マウスの腱組織のコラーゲン含量をヒドロキシプロリン分析により評価した。腱組織を加水分解するために、５ｍｇを６Ｎ ＨＣｌ溶液に浸漬して、１２０℃で３時間加熱した。加水分解後、腱組織を３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を集めて９６－ウェルプレートに移した。その後、９６－ウェルプレートを乾燥オーブンで６０℃、１２時間培養した。Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ Ｔ試薬（６μＬ）を酸化緩衝液（９４μＬ）と混合し、混合物を各試料又は標準溶液に添加した。得られた溶液をゆっくりと９６－ウェルプレートに移し、ｐ－ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬（１００μＬ）を各サンプル又は標準に添加した後、６０℃で９０分間培養した。ヒドロキシプロリン含量は、Ｆｌａｓｈ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ^ＴＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して光学密度４５０ｎｍで測定した。

実施例１０－１４．生体力学テスト

ＡＴの存在を確認するために、マウスから選択された踵骨－アキレス腱を使用して生体力学の検査を行った。各サンプルは、特別設計された装置を使用してＩｎｓｔｒｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｔｅｓｔｅｒ（ＡＧ－１０ＫＮＸ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）にロードした後、１Ｎの予圧でクロスヘッド速度５ｍｍ／ｍｉｎで矢状方向に引っ張った。引張強度とアキレス腱の硬直度を測定した。

実施例１０－１５．統計データの分析

すべての定量的結果は、平均値と標準偏差で表される。グラフは、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを使用して描いた。統計学的分析は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔを使用し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１で表現した。

実施例１１．ＰＣＮＰヒドロゲルの合成及び特性化

温度感受性ＰＰＺナノ粒子（ＰＮＰ）ヒドロゲルは、現場ゲル化及び疎水性薬物カプセル化のために設計された。ＰＮＰは、疎水性ＩｌｅＯＥｔと親水性ＡＭＰＥＧをＰＰＺ主鎖に置換して合成した。合成されたＰＮＰ構造は、^１Ｈ ＮＭＲ分光法で確認し、これを図２３に示した。コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸などのカルボン酸グループは、負に帯電した機能グループでポリマー骨格に置き換えられ、天然ＥＣＭを模倣し、組織再生中にサイトカインとの相互作用を誘導することが知られている。ＰＮＰのカルボン酸グループは、^１Ｈ ＮＭＲを用いて定量した。２．０及び２．５のピークは、酸性グループがＰＮＰヒドロゲル骨格に成功裏に結合したことを示した。ＧＰＣを用いてＰＮＰに対し６２，９２０Ｄａの分子量を得、ポリスチレンを標準物質として用いた（図２３の（ｃ））。置換された側鎖比率は、^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを用いて計算され、結果はそれぞれ、７１％、１７％、１％及び１１％の比率でＩｌｅＯＥｔ、ＡＭＰＥＧ、ＥｔＯＨ及びカルボン酸グループを有する側鎖の存在を示した。高疎水性のＩｌｅＯＥｔ含量は、疎水性ゲル化及びＣＸＢとの緊密な疎水性相互作用をすべて誘導した。ＰＣＮＰ、ＰＮＰ及びＣＸＢのＦＴＩＲスペクトルを分析してＰＣＮＰのＣＸＢローディングを確認し、図２４に示した。ＰＣＮＰデータで観察された１５３０～１６３０ｃｍ－１の芳香族Ｃ＝Ｃピークは、ＣＸＢローディングを示す。

ＣＸＢは一般に、有機溶剤に溶解又は化学的修飾を経て医療用に使用されるが、ＣＸＢは、溶媒や化学的修飾なしに単なる溶液の状態で混合してＰＮＰに成功裏に溶解した。ゲル状態は、ＰＮＰの温度感受性ゲル化特性により維持され、これを図２５に示した。ＰＣＮＰは、ＣＸＢを４℃で１０ｗｔ％のＰＮＰ溶液で撹拌してＰＮＰ内にＣＸＢをカプセル化することで製造した。ＰＣＮＰｓの温度依存的ゲル化は、高分子溶液を４℃と３７℃の水に注入することにより確認した。４℃の高分子溶液とは異なり、水溶液に３７℃のグループを注入すると、ゲルのような３Ｄ構造が観察され、これは図２６に示す通りである。これは、体内注入後、ゾル－ゲル転移が数秒内にゲル化する可能性が高いため、安定した３Ｄ構造が分散なしで形成できることを意味する。ＰＮＰ及びＰＣＮＰヒドロゲルの貯蔵及び損失弾性率は、ゲルの温度依存の定量的レオロジーを確認するために、５～６０℃の範囲の精密に制御された温度でモニターされた。ＰＮＰ及びＰＣＮＰヒドロゲルのゾル－ゲル転移は、特定の温度範囲（２０～２５℃）内で生じ、体温（３７℃）でゲル状態を維持した。貯蔵弾性率は温度と共に増加し始め、約３５～３８℃で最も高い値が観察された。これを図２７に示した。

ＰＣＮＰの貯蔵及び損失係数は、ＣＸＢ濃度の影響を受けた（図２７の（ｂ）～（ｄ））。ＰＮＰヒドロゲルの最大貯蔵モジュラスは、３５．１℃で４５４．３Ｐａであった。しかし、ＰＣＮＰ（ＣＸＢ １ｍｇ）及びＰＣＮＰ（ＣＸＢ ４ｍｇ）ヒドロゲルの最大貯蔵モジュラスは、それぞれ３８．１℃で６５５．０Ｐａ、３７．６℃で９９４．３Ｐａであった。ＰＮＰ及びＰＣＮＰヒドロゲルグループの温度及び最大貯蔵弾性率に有意な差は観察されなかった。しかし、最大貯蔵弾性率値はＣＸＢを統合した後に増加した。これは、ＣＸＢが疎水性架橋剤として作用するため、ＰＮＰヒドロゲルとＣＸＢ分子との間の疎水性相互作用がモジュラスを増加させることを示唆する。このようなデータは、ＰＮＰとＣＸＢ分子との間の成功的な相互作用を示す。

実施例１２．ＣＸＢとＰＮＰとの複合化

疎水性ＣＸＢは、均質に溶解することが明らかになり、ＰＮＰ溶液中で良好に分布された。ＰＣＮＰは低温での簡単な撹拌後に形成され、これはこのシステムの明らかな利点に該当する。毒性溶媒又は界面活性剤は、一般に疎水性のため、臨床試験におけるＣＸＢの溶解度の向上に必要である。しかし、ＣＸＢが毒性溶媒又は界面活性剤なしで低温でＰＮＰに容易に統合され得ることは、相当な利点である。

両親媒性ＰＮＰヒドロゲルネットワークは、高分子鎖間の疎水性相互作用により特定の濃度と体温で形成されることが観察された。しかし、ＰＮＰの両親媒性特性は、高分子構造が孤立鎖の折り畳みを介して低濃度（０．５ｗｔ％）で高分子ミセル粒子を形成するために自己組織化されることを意味する。ＰＮＰとＰＣＮＰの形態は、ゲル状態と希釈状態の両方で特性化され（図２８の（ａ））、結果は、ＰＮＰとＰＣＮＰヒドロゲルがそれぞれ６．２及び４．９μｍのサイズの気孔を有する多孔質構造であることを示している。ＰＣＮＰはＰＮＰよりも粗い表面構造を示した。しかし、ＣＸＢ凝集は観察されず、これは疎水性ＣＸＢがＰＣＮＰヒドロゲルマトリックスに良好に統合されたことを示している。２０倍希釈後、ＰＮＰとＰＣＮＰの両方で自己組織化によるミセル形成が生じ、粒子構造を観察できた。広範囲の粒子サイズが測定された。しかし、ＰＣＮＰグループの粒子はＰＮＰグループの粒子よりも小さかった。したがって、ＰＮＰ及びＰＣＮＰヒドロゲルのヒドロゲル及び粒子形態は、ＣＸＢがＰＮＰに成功裏にカプセル化され、ＰＣＮＰ形態がカプセル化されたＣＸＢにより影響を受けたことを示唆する。

ＰＮＰとＣＸＢとの間の疎水性相互作用をさらに確認するために、互いに異なるＣＸＢｓ濃度を添加して混合前後の高分子ナノ粒子のサイズ変化を調べた（図２８の（ｂ））。実験は、ＰＮＰとＣＸＢ分子との間の疎水性相互作用による粒子サイズの差を観察することができるように精密な温度条件で行った。ＰＮＰの粒子サイズは、温度が４℃から４５℃に昇温するにつれて２４０．０ｎｍから１２６．２ｎｍに漸進的に減少することが観察された。この現象は、温度と疎水性の相関の結果であった。疎水性モイエティは、高温で緊密に相互作用して収縮した形態のポリマーナノ粒子を生成する。ＰＮＰとＰＣＮＰ粒子のサイズは、温度に関係なく類似している。これは、ヒドロゲルネットワークが非共有相互作用による安定した温度感受性及び可逆的物理的特性を有し、単純な薬物ローディング及び注入性を含む様々な利点を提供することを示している。ＣＸＢがＰＮＰに統合された後、すべての温度でＣＸＢの濃度が増加するにつれて粒子サイズが減少した。これは、ＰＮＰ内部のＣＸＢ分子が疎水性架橋剤の役割をして、ＰＣＮＰがより収縮した構造を形成するように誘導することを意味する。したがって、ＣＸＢとＰＮＰヒドロゲルとの相互作用は、ＣＸＢが界面活性剤なしで様々な濃度でＰＮＰにカプセル化され得ることを意味し、治療効果を肯定的に改善し、この戦略に関連する副作用を減らすことができる。

ゼータ電位は粒子サイズと共に調べ、これを図２８の（ｃ）に示した。ＰＮＰのゼータ電位は、ＰＮＰ骨格のカルボキシルのため－１９．９ｍＶと測定された。しかし、ゼータ電位は、ＣＸＢがＰＮＰに含まれた後、ＰＣＮＰ（ＣＸＢ １ｍｇ）及びＰＣＮＰ（ＣＸＢ ４ｍｇ）に対してそれぞれ－１３．１及び－９．５ｍＶと大幅に減少した。これは、ＰＮＰよりも粒子サイズの小さい疎水性ＣＸＢがＰＣＮＰミセル構造のコアにカプセル化されているためである（図２８の（ｂ））。これは、ＰＣＮＰの表面の親水性ＰＥＧが負電荷を覆っていることを意味し、したがって疎水性相互作用は、ＣＸＢをＰＮＰに成功裏に結合して、小さな気孔と粒子サイズを有するＰＣＮＰを形成した。

実施例１３．試験管内及び生体内のＰＣＮＰヒドロゲルの質量損失及びヒドロゲルからのＣＸＢ持続放出

体内注入後のＰＣＮＰヒドロゲルの維持要求事項を予測するために、ヒドロゲルの質量損失を測定し、ヒドロゲルからのＣＸＢの放出を分析して、ＰＣＮＰヒドロゲルが長期にＣＸＢを維持及び放出できるかどうかを確認し、これを図２９に示した。体外分解データは、水性環境で膨潤及び分解パターンを示した。ＰＮＰヒドロゲルは、３日で１４７％に膨張した後、５週間にわたってゆっくりと溶解した（図３０）。図２９の（ａ）で示したように、ＰＣＮＰヒドロゲルのＣＸＢ放出速度は、ＰＮＰヒドロゲルとＣＸＢとの安定した相互作用のため、高い膨張が発生した場合でも、２９日間ほぼ一定に維持された。ＣＸＢ放出速度は、１ｍｇのＣＸＢを有する群でより高かったが、これは、より高いＣＸＢ濃度を有するＣＸＢとＰＮＰとの間の疎水性相互作用の増加がより緻密な構造を誘導するためであると思われる。

ＰＣＮＰは加水分解により生分解され、ＣＸＢは２８日にわたって放出された。分解と放出プロファイルの間に観察された相関は、ＣＸＢ放出がＰＣＮＰヒドロゲルの分解と関連していることを示す。さらに、実験初期（～７日）に観察されたＰＣＮＰ膨張は、ＣＸＢの爆発的な放出につながらず、これは放出が膨張よりもＰＣＮＰヒドロゲルの溶解と関連していることを示す。

ＣＸＢ放出データは、０次、１次、Ｈｉｇｕｃｈｉ、及びＲｉｔｇｅｒ－Ｐｅｐｐａｓモデル（以下の表５）を含む様々な動力学モデルに合わせて分析した。相関係数（Ｒ２）の比較は、Ｒｉｔｇｅｒ－ＰｅｐｐａｓモデルがＰＣＮＰ（ＣＸＢ １ｍｇ）及びＰＣＮＰ（ＣＸＢ ４ｍｇ）の両方に最も適していることを示す。Ｒｉｔｇｅｒ－Ｐｅｐｐａｓモデルを使用するとき、膨潤、侵食、及びポリマー多孔性を含む混合放出メカニズムが関連し得る。この動力学モデルは、ＣＸＢがＰＣＮＰの膨潤及び分解により放出されるため、ＰＣＮＰと共に使用するのに適している。さらに、拡散メカニズムは、拡散指数（ｎ）で説明することができる。それぞれ０．６２と０．５７と計算されたＰＣＮＰ（ＣＸＢ １ｍｇ）とＰＣＮＰ（ＣＸＢ ４ｍｇ）の拡散指数（ｎ）は、いずれもｎｏｎ－Ｆｉｃｋｉａｎ拡散を示す。

生体内の生分解率を測定するために、ＰＮＰヒドロゲルをマウスの背中に皮下注射した。ＰＮＰヒドロゲルの温度感受性のゲル化特性は、４℃で観察されるポリマー溶液の分散とは異なり、体温でゲル化が速やかに発生することを意味する（図２６）。また、ＰＮＰヒドロゲルは、３７℃で１～１００ｒａｄ／ｓの範囲の角周波数で安定したモジュラスを維持することが示された（図３１）。これは、ＰＮＰヒドロゲルが注射に適しており、生体内でゲル構造を維持することを示す。注入されたＰＮＰヒドロゲルの質量は、生体内環境で２日で１１１％に増加した後、２８日以上持続的に減少した（図２９の（ｂ））。これは、生体内のＰＮＰヒドロゲルがＰＮＰヒドロゲルネットワークへの最初の水吸収後、漸進的に分解し始めたことを示す。図３２は、生体内のＰＮＰヒドロゲルのサイズの漸進的な減少を示す。このような結果は、生体内へのＰＣＮＰヒドロゲルの注入後にＣＸＢがゆっくり放出され、ＰＣＮＰヒドロゲルが約１ヶ月間注入部位に残っていることを示す。

実施例１４．欠損腱へのＰＣＮＰヒドロゲルの全身炎症性サイトカイン抑制及び抗炎症効果

生体内実験の前に、ＰＮＰヒドロゲルの試験管内の細胞毒性を調べて副作用を確認した（図３３の（ａ））。細胞生存率は、高濃度のＰＮＰ（１０ｍｇ ｍＬ－１）でも７０％以上に維持された。生体内実験の質量損失データは、２００μｇの注入ＰＮＰヒドロゲルが３０日以内に分解されたことを示唆し、これは、注入ヒドロゲル構造で１日に約６．６μｇのＰＮＰが放出されることを示す（図２９）。したがって、ＰＮＰヒドロゲルは、副作用のない生体適合性薬物担体であることが確認され、またＰＮＰヒドロゲルは、加水分解によりリン酸塩、ポリ（エチレングリコール）、及びアンモニアなどの無毒性物質に分解される。

ＣＸＢ及びＰＣＮＰの細胞毒性も確認して、図３３の（ｂ）及び（ｃ）に示した。ＣＸＢ群は６２５μｇ／ｍｌで高い細胞毒性を示したのに対し、ＰＣＮＰ群では４０，０００μｇ／ｍｌ ＣＸＢで重大な細胞毒性は観察されなかった。これは、ＣＸＢの低い溶解度が凝集を引き起こすため、細胞が高い細胞毒性レベルの薬物に高濃度で晒されるためである。ＰＮＰは、凝集や細胞毒性なしで薬物を送達できるため、ＣＸＢに適した担体と見なされる。

ＰＣＮＰは、様々なＣＸＢ用量を効果的にカプセル化することができるため、多種の炎症性疾患を成功裏に治療できる適切な治療用量を制御するのに役立つ。本発明では、注射剤として使用される用量であるＰＣＮＰ（ＣＸＢ １ｍｇ）とＰＣＮＰ（ＣＸＢ ４ｍｇ）を用いてＡＴ治療の効果を評価した。

ＣＸＢは、ＩＬ－４、ＩＬ－１０などの抗炎症性サイトカインの発現を増加させ、炎症と疼痛を減少させる。ＣＸＢ治療はまた、軟骨と潤滑膜における全身炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＣＯＸ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－１３）の発現を減少させることが知られている。このような抗炎症性及び炎症性サイトカインは、腱の治癒に直接関連している。全身炎症性サイトカインは、ＥＣＭ恒常性と腱のリモデリングに影響するが、腱細胞のアポトーシスを促すことがある。ＩＬ－４は、腱の治癒に関連するテノサイトの増殖を増加させるが、それに対し、ＩＬ－１０は、ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を介して細胞増殖と生存に影響を与える。

開発された送達体の全身炎症性サイトカインの抑制及び抗炎症効果を分析するために、欠損のあるアキレス腱モデルにＰＣＮＰヒドロゲルを注入し、ＲＴ－ＰＣＲを用いて抗炎症性及び炎症性サイトカインのレベルを測定した（図３４）。血液中の抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－４及びＩＬ－１０）のレベルは、治療の４週間後に測定した（図３４の（ａ）及び（ｂ））。対照群と比較して、ＩＬ－４の発現は、ＣＸＢを１回処理した群では１．２倍、３回処理した群では１．３倍増加した。対照群と比較して、ＰＣＮＰ（１ｍｇ及び４ｍｇのＣＸＢ）注入群において、ＩＬ－４の発現はそれぞれ１．５倍及び１．７倍増加し、ＩＬ－１０は１．３倍及び１．５倍にそれぞれ増加する類似したパターンを示した。ＰＣＮＰ（１及び４ｍｇ ＣＸＢ）群はそれぞれ１．８倍及び２．２倍の増加を示した。対照群と比較して、無処理群で抗炎症性サイトカイン発現はあまり変化せず、これは、治療なしでは抗炎症効果が生じないことを示唆する。抗炎症サイトカイン遺伝子の発現レベルは、ＣＸＢ溶液の処理群でより高く、抗炎症サイトカインの発現は、ＰＣＮＰヒドロゲルの注入後により高かった。これは、ＣＸＢ注射が抗炎症効果を引き起こし、ＰＣＮＰ注射が欠損のあるアキレス腱でのＣＸＢの局所的かつ持続的な放出により抗炎症効果をさらに強化したことを示す。

全身炎症性サイトカイン（ＣＯＸ－２、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ１３、及びＴＮＦ－α）の発現も調べ、これは図３４の（ｃ）～（ｈ）に示した。無治療群の重度の炎症は、ＣＯＸ－２、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ１３及びＴＮＦ－αの発現において、対照群と比較してそれぞれ７．６－、６．４－、７．１－、７．１、８．１－及び７．８－倍増加した。全身炎症性サイトカインのＣＯＸ－２、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－１３及びＴＮＦ－αの発現は、対照群と比較してＣＸＢ溶液中でそれぞれ６．３－、５．４－、６．０－、５．９－、７．２－及び６．７倍増加し、これは無治療群で観察されたものより著しく低かった。ＰＣＮＰ（ＣＸＢ ４ｍｇ）ヒドロゲル注射群で、全身炎症性サイトカインの数値は、対照群と比較して５．６倍、４．７倍、５．２倍、５．１倍、６．６倍、５．８倍増加した。すべてのＰＣＮＰ注入群は、ＣＸＢ溶液注入群よりもほとんどの炎症誘発サイトカインの発現レベルが低かった。プロ炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカイン発現データは、ＰＣＮＰヒドロゲルの単一局所注入がＣＸＢ溶液の複数の注入よりもさらに高い抗炎症効果を生じることを示し、これは、再びＣＸＢが欠損領域にゆっくり放出されるためであると評価された。

実施例１５．生体内の欠損アキレス腱の再生

ＰＣＮＰヒドロゲルからのＣＸＢの局所的持続放出による生体内の腱の再生効果を分析するために、コラゲナーゼを用いて欠損アキレス腱を生成し、欠損アキレス腱の再生を調べるために、同一濃度の群を用いた（図３５）。Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎとｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）とＭａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（ＭＴ）染色データは、コラゲナーゼ５０群におけるＥＣＭ整列の破壊とコラーゲン分解を示し、コラゲナーゼによって腱が完全に損傷したことを示す（図３５の（ｂ）及び（ｈ））。損傷した腱は、４週間後にＣＸＢ溶液注入群で一部が再生された（図３５の（ｃ）及び（ｄ））。ＭＴ染色データは、１回のみのＣＸＢ注入群よりも、ＣＸＢ溶液を３回投与した群でより多くのコラーゲンが再生されたことを明らかに示した（図３５の（ｉ）及び（ｊ））。これは、欠陥のある腱がＣＸＢに晒される時間が、腱の再生に肯定的な影響を与えることを示す。Ｈ＆Ｅ染色の結果は、ＰＣＮＰヒドロゲル処理群の腱が組織整列と共にほぼ完全に回復したことを示した（図３５の（ｅ）及び（ｆ））。ＭＴ染色の結果は、ＰＣＮＰヒドロゲル群がＣＸＢ溶液注入群と比較して向上したコラーゲン再生を示すことを示した。ＰＣＮＰヒドロゲルのＣＸＢ濃度も、腱再生に影響を与えた（図３５の（ｅ）～（ｌ））。このような結果は、欠損腱の長期間の再生を誘導するためには、欠損腱の持続的なＣＸＢ曝露が必要であることを示唆する。

腱構成の生体内の再生及び機能回復は、ヒドロキシプロリン分析、機械的剛性、及び強度テストを用いて調べた（図３６）。腱の主な構成要素の１つであるコラーゲンは、硬い機械的特性を提供する。コラーゲンは、主にヒドロキシプロリンで構成されている。したがって、組織内に存在するこの物質の量は、存在するコラーゲンの量を示す。３５．５μｇ／ｍｇの正常の腱組織のヒドロキシプロリン含量は、無処理群において１１．３μｇ／ｍｇと有意に減少したことが示された（図３６の（ａ））。増加したヒドロキシプロリン含量は、ＣＸＢ溶液（１週間当たり１回及び３回の注入）群でそれぞれ１５．３及び１７．２μｇ／ｍｇの値が観察され、ＰＣＮＰヒドロゲル注入群のヒドロキシプロリン含量でさらなる増加が観察され（ＣＸＢ １ｍｇ及び４ｍｇ）、値はそれぞれ２１．４及び２４．４μｇ／ｍｇに達した。ＣＸＢ溶液の注入回数とＰＣＮＰヒドロゲルのＣＸＢ濃度は、ヒドロキシプロリン含量に比例して影響を及ぼした。ＰＣＮＰヒドロゲルは、ＣＸＢ溶液よりもアキレス腱の欠損により長いＣＸＢ暴露時間を提供し、様々な濃度のＣＸＢカプセル化は、治療効果に直接的な影響を及ぼし得る。

処理された腱の剛性と引張強度を測定し、正常な腱と比較して機械的機能再生を評価した（図３６の（ｂ）及び（ｃ））。無処理群では、正常な腱の剛性度が３６．３Ｎ／ｍｍから１３．７Ｎ／ｍｍに有意な減少を示した。ＣＸＢ溶液（１週間当たり１回及び３回の注射）で処理された群は、より高い剛性値（１６．４及び１８．６Ｎ／ｍｍ）を示したものの、剛性はＰＣＮＰヒドロゲル処理群で２４．５及び２６．４Ｎ／ｍｍに増加して（ＣＸＢ １及び４ｍｇ）、正常の腱に対して得られた値と類似した。ＣＸＢ溶液処理群は、腱再生能力が向上したが、このような効果は、ＰＣＮＰヒドロゲル処理群においてはるかに顕著であった。引張強度データは、３３．７ＭＰａの正常の腱の引張強度が無処理群で１１．４ＭＰａに減少して、剛性度の結果と類似したパターンを示した。引張強度は、ＣＸＢ溶液処理群（１週間当たり１回及び３回の注入）においてそれぞれ１２．５及び１４．７ＭＰａと観察され、ＰＣＮＰヒドロゲル処理群（ＣＸＢ１及び４ｍｇ）は、それぞれ、正常なアキレス腱組織の約６６％及び７１％の回復を示した。これは、ＰＣＮＰヒドロゲルが整列した腱ＥＣＭの再生と腱の機械的機能再生をいずれも誘導したことを示している。

以上のように、実施例が限定された図面により説明されたが、該技術分野における通常の知識を有する者であれば、上述に基づいて様々な技術的修正及び変形を適用することができる。例えば、説明された技術が説明された方法と異なる手順で行われ、及び／又は説明されたシステム、構造、装置、回路などの構成要素が説明された方法と異なる形で結合又は組み合わされ、他の構成要素又は均等物により対置され、又は置換されても、適切な結果を達成することができる。

したがって、他の具現例、他の実施例、及び特許請求の範囲と均等なものも、後述する特許請求の範囲に属する。

本発明は、災害安全のための知能型ソリューション技術開発（課題番号２Ｅ３１６００、課題期間２０２２０１０１～２０２２１２３１）、汎用的筋骨格系疾患治療のための局所型薬物伝達プラットフォーム技術開発（課題固有番号１７１１０５６０９３、課題期間２０１７０４０１～２０１７１２３１）、及びニューラルネットワークの再建のためのヒドロゲルエンジニアリング技術開発（課題固有番号１７１１１３４２３１、課題期間：２０２１０７０１～２０２１１２３１）課題の支援を受けて完成された。

Claims (13)

1. 下記の化学式１で示されるポリホスファゼン骨格のリン原子上に、
   下記の化学式２で示されるアミノ酸エステルの第１モイエティと、
   下記の化学式３で示されるポリエチレングリコールの第２モイエティと、
   アミノエタノールと有機酸を含む第３モイエティと、をそれぞれａ：ｂ：ｃのモル比で含むポリホスファゼン系高分子、及び
   治療的有効量の炎症制御及び治療用の薬物
   を含む、炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
   
   
   
   （前記化学式において、
   Ｒ_１は、Ｃ_１－６のアルキル、Ｃ_１－６のアルケニル、又はＣ_６－１０のアリール－Ｃ_１－６のアルキルであり、
   Ｒ_２は、水素、メチル、イソプロピル、１－メチルプロピル、２－メチルプロピル、チオメチル、メチルチオエチル、ベンジル、ヒドロキシベンジル、又は２－インドリルメチルであり、
   Ｒ_３は、Ｃ_１－６のアルキルであり、
   ｎは、３～１００，０００の整数であり、
   ｐは、１～２０の整数であり、
   ａ：ｂのモル比は、５．５：１～７．５：１であり、
   ａは、７０～８０モル％である。）
2. 前記第３モイエティにおける前記有機酸は、グルタル酸を含む、請求項１に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
3. 前記Ｒ_１は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ベンジル、又は２－プロフェニルである、請求項１に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
4. 前記Ｒ_３はメチルである、請求項１に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
5. 前記炎症性疾患の治療用薬物は疎水性である、請求項１に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
6. 前記疎水性の炎症性疾患の治療用薬物は、トリアムシノロンアセトニド、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、セレコキシブ、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、ケトプロフェン、エトドラク、メロキシカム、ロフェコキシブ、エトリコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブ、及びジクロフェナクからなる群から選ばれるいずれか１つ以上である、請求項５に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
7. 前記高分子は、前記炎症性疾患の治療用薬物を徐放することを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
8. 前記徐放は、治療的有効量の範囲の薬物濃度で薬物を放出する、請求項１に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
9. 前記ポリホスファゼン系高分子が、１～５０重量％の濃度で溶媒に溶解されたものである、請求項１に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
10. 前記溶媒は、水、緩衝溶液、酸性溶液、塩基性溶液、塩溶液、生理食塩水、注射用水、細胞培養液、及びブドウ糖食塩液からなる群から選ばれる１種以上である、請求項９に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
11. 前記高分子は、５～７０℃の範囲でゾル－ゲル転移の挙動を示し、予め決められた所定の温度でヒドロゲルを形成する、請求項１に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
12. 前記高分子は、生体への適用時に、又は生体外の環境でゲル化し、予め決められた所定の温度で温度感受性を喪失して温度の変化に関係なくゲル状態を維持する、請求項１に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
13. 前記炎症性疾患は、変形性関節症、変形関節炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、及びアキレス腱炎からなる群から選ばれるいずれか１つである、請求項１に記載の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。