JP2024527872A - タンパク質組成物および生成方法 - Google Patents

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Abstract

Figure 2024527872000001
培養物中に生成される不純物を減少させつつ、操作された微生物における組換えタンパク質を産生するためのシステムおよび方法が、提供される。一部の局面において、目的の異種タンパク質を産生するための組換え宿主細胞が提供される。一部の実施形態において、その宿主細胞は酵母であり得、宿主細胞はβ－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように操作され得、過小発現は、過小発現を達成するための遺伝子操作の前の宿主細胞との比較であり得、宿主細胞は目的の異種タンパク質および異種マンノシダーゼを発現するように操作され得る。

Description

相互参照
本出願は、２０２１年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６３／２２５，３５５号および２０２２年６月２９日に出願された米国特許仮出願第６３／３５６，９４４号の利益を主張し、これらの両方が参照により全体が本明細書中に援用される。
背景
産業的タンパク質生産において、コスト削減の目標は、組換え生物におけるそのタンパク質生成物の発現を最大化することである。メチロトローフ酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）は重要なタンパク質生産システムである。それらの広範な使用にも関わらず、特に、異種動物由来タンパク質の発現についての高収量発現は、困難なままである。この困難は、大規模発酵環境において特に明らかである。組み込まれたコピーの数を増加することはタンパク質発現の増加をもたらし得るが、コピー数を増加させることに伴って生成される転写産物の量には限界が存在するように見える。
アニマルフリータンパク質についての需要の増加が、特に、食品製品ベースの成分において存在する。例えば、健康志向のファストフードの選択肢についての明瞭な好みの傾向は、近年過去最高の卵白の需要を生じさせている。健康志向が増加中である消費者基盤とは別に、産業的孵化場の非人道的側面に対する嫌悪が、工場で飼育された卵よりもアニマルフリー卵白代替物の受容および最終的選好を助長し得る。したがって、食物タンパク質（例えば、代替アニマルフリー卵タンパク質）の高収量の産業的生産についての新規な方法の必要性が存在する。
概要
一部の局面において、目的の異種タンパク質を産生するための組換え宿主細胞が提供される。一部の実施形態において、その宿主細胞は酵母であり得、宿主細胞はβ－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように操作され得、過小発現は、過小発現を達成するための遺伝子操作の前の宿主細胞との比較であり得、宿主細胞は目的の異種タンパク質および異種マンノシダーゼを発現するように操作され得る。
一部の実施形態において、その過小発現は、前記宿主細胞のゲノムからマンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードするポリヌクレオチドをノックアウトすること、その宿主細胞においてマンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードするポリヌクレオチドを破壊すること、マンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードする前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結され得るプロモーターを破壊すること、マンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードする前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結され得るプロモーターを、より低いプロモーター活性を有する別のプロモーターで置き換えること、あるいはマンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログの発現制御配列を破壊することを各マンノシルトランスフェラーゼタンパク質について独立的に行うことによって達成され得、その機能的ホモログはマンノシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも７０％配列同一性を有する。
一部の実施形態において、その宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであり得る。
一部の実施形態において、そのＢＭＴ１タンパク質は、配列番号１２と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、そのＢＭＴ２タンパク質は、配列番号１３と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＢＭＴ１を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ないＢＭＴ１を発現するように操作され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＢＭＴ１を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、または少なくとも９５％少ないＢＭＴ１を発現するように操作され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＢＭＴ１をノックアウトするように操作され得、そのノックアウトはその組換え宿主細胞においてＢＭＴ１の活性を無くす。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＢＭＴ２を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ないＢＭＴ２を発現するように操作され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＢＭＴ２を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、または少なくとも９５％少ないＢＭＴ２を発現するように操作され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＢＭＴ２をノックアウトするように操作され得、そのノックアウトはその組換え宿主細胞においてＢＭＴ２の活性を無くす。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＢＭＴ１およびＢＭＴ２を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して減少したサイズの菌体外多糖を産生する。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、α－１，２－マンノシルトランスフェラーゼＭＮＮ２を過小発現するようにさらに操作され得る。
そのＭＮＮ２タンパク質は、配列番号１のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＭＮＮ２を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、または少なくとも９５％少ないＭＮＮ２を発現するように操作され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＭＮＮＦ１を過小発現するようにさらに操作され得る。
一部の実施形態において、そのＭＮＮＦ１タンパク質は、配列番号２のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＭＮＮＦ１を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、または少なくとも９５％少ないＭＮＮＦ１を発現するように操作され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＭＮＮＦ２を過小発現するようにさらに操作され得る。
一部の実施形態において、そのＭＮＮＦ２タンパク質は、配列番号３のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＭＮＮＦ２を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、または少なくとも９５％少ないＭＮＮＦ２を発現するように操作され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ＢＭＴ１およびＢＭＴ２に加えて１種または複数種の酵素を過小発現するようにさらに操作され得る。
一部の実施形態において、その１種または複数種の酵素は、配列番号４～１１、１４～１５、および７２～８５のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、１種または複数種の酵素を、前記１種または複数種の酵素を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少なく、少なくとも１５％少なく、少なくとも２０％少なく、少なくとも３０％少なく、少なくとも４０％少なく、少なくとも５０％少なく、少なくとも６０％少なく、少なくとも７０％少なく、少なくとも８０％少なく、少なくとも９０％少なく、または少なくとも９５％少なく発現するように操作され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、その組換え宿主細胞とは異なる種に由来するマンノシダーゼを組換え発現する。
一部の実施形態において、そのマンノシダーゼは、その組換え宿主細胞とは異なる属に由来し得る。
一部の実施形態において、そのマンノシダーゼは、配列番号４１～５６のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、そのマンノシダーゼが前記組換え宿主細胞の表面に発現され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、マンノシダーゼの触媒ドメインとグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質のアンカードメインとを含み得る、表面に提示される融合タンパク質を発現し、アンカードメインは少なくとも約２００アミノ酸を含み得、かつ／あるいはアンカードメイン中の残基の少なくとも約３０％はセリンまたはスレオニンである。
一部の実施形態において、そのアンカードメインは、少なくとも約２２５アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約２７５アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３２５アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約３７５アミノ酸、または少なくとも約４００アミノ酸を含み得る。
一部の実施形態において、そのアンカードメイン中の残基の少なくとも約３５％がセリンまたはスレオニンであるか、そのアンカードメイン中の残基の少なくとも約４０％がセリンまたはスレオニンであるか、そのアンカードメイン中の残基の少なくとも約４５％がセリンまたはスレオニンであるか、あるいはそのアンカードメイン中の残基の少なくとも約５０％がセリンまたはスレオニンである。
一部の実施形態において、そのアンカードメイン中のそのセリンまたはスレオニンはＯ－マンノシル化され得る。
一部の実施形態において、少なくとも約３２５アミノ酸を含み得るアンカードメインを有する融合タンパク質は、約３００アミノ酸未満を含み得るアンカードメインを有する融合タンパク質と比較して大きな酵素活性を提供する。
一部の実施形態において、少なくとも約３００アミノ酸を含み得るアンカードメインを有する融合タンパク質は、約２５０アミノ酸未満を含み得るアンカードメインを有する融合タンパク質と比較して大きな酵素活性を提供する。
一部の実施形態において、その融合タンパク質は、ＧＰＩアンカー型タンパク質のそのアンカードメインを含み得る。
一部の実施形態において、その融合タンパク質は、そのＧＰＩアンカー型タンパク質をその天然シグナルペプチドなしで含み得る。
一部の実施形態において、そのＧＰＩアンカー型タンパク質は、その組換え宿主細胞に固有ではなくてもよい。
一部の実施形態において、そのＧＰＩアンカー型タンパク質は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞によって天然で発現され得、その組換え宿主細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞ではなくてもよい。
一部の実施形態において、そのＧＰＩアンカー型タンパク質は、Ｔｉｒ４、Ｄａｎ１、Ｄａｎ４、Ｓａｇ１、Ｆｉｇ２、およびＳｅｄ１から選択され得る。
一部の実施形態において、そのＧＰＩアンカー型タンパク質のそのアンカードメインは、配列番号５７～配列番号７１のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、そのＧＰＩアンカー型タンパク質のそのアンカードメインは、配列番号５７～配列番号７１のうちの１つのアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、その融合タンパク質を発現するゲノム改変を含み得、かつ／またはその融合タンパク質を発現する染色体外改変を含み得る。
一部の実施形態において、その融合タンパク質は、そのマンノシダーゼの一部をその触媒ドメインに加えて含み得る。
一部の実施形態において、その融合タンパク質は、そのマンノシダーゼの実質的に全アミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、その融合タンパク質、その触媒ドメインは、そのアンカードメインのＮ末端側にあり得る。
一部の実施形態において、その融合タンパク質は、その触媒ドメインとそのアンカードメインとの間にリンカーを含み得る。
一部の実施形態において、その融合タンパク質は、配列番号３１６～３２１のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を有するリンカーを含み得る。
一部の実施形態において、翻訳されると、その融合タンパク質は、シグナルペプチドおよび／または分泌シグナルを含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、２種以上の融合タンパク質、３種以上の融合タンパク質、または４種の融合タンパク質を含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、そのＡＯＸ１遺伝子および／またはそのＡＯＸ２遺伝子中に変異を含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、目的の分泌型異種タンパク質を過剰発現するゲノム改変を含み得、かつ／または目的の分泌型タンパク質を過剰発現する染色体外改変を含み得る。
一部の実施形態において、その目的の分泌型タンパク質は、動物タンパク質であり得る。
一部の実施形態において、その動物タンパク質は、卵タンパク質であり得る。
一部の実施形態において、その卵タンパク質は、オボアルブミン、オボムコイド、リゾチーム、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、α－オボムチン、β－オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、フラボプロテイン、オボマクログロブリン、オボスタチン、シスタチン、アビジン、オボアルブミン関連タンパク質Ｘ、およびオボアルブミン関連タンパク質Ｙからなる群より選択され得る。
一部の実施形態において、その分泌型組換えタンパク質を過剰発現するそのゲノム改変および／またはその染色体外改変は、誘導性プロモーターを含み得る。
一部の実施形態において、その誘導性プロモーターは、ＡＯＸ１プロモーター、ＤＡＫ２プロモーター、ＰＥＸ１１プロモーター、ＦＬＤ１プロモーター、ＦＧＨ１プロモーター、ＤＡＳ１プロモーター、ＤＡＳ２プロモーター、ＣＡＴ１プロモーター、ＭＤＨ３プロモーター、ＨＡＣ１プロモーター、ＢｉＰプロモーター、ＲＡＤ３０プロモーター、ＲＶＳ１６１－２プロモーター、ＭＰＰ１０プロモーター、ＴＨＰ３プロモーター、ＴＬＲプロモーター、ＧＢＰ２プロモーター、ＰＭＰ２０プロモーター、ＳＨＢ１７プロモーター、ＰＥＸ８プロモーター、ＰＥＸ４プロモーター、またはＴＫＬ３プロモーターであり得る。
一部の実施形態において、分泌型組換えタンパク質を過剰発現するそのゲノム改変および／またはその染色体外改変は、ＡＯＸ１ターミネーター、ＴＤＨ３ターミネーター、ＭＯＸターミネーター、ＲＰＳ２５Ａターミネーター、またはＲＰＬ２Ａターミネーターを含み得る。
一部の実施形態において、分泌型組換えタンパク質を過剰発現するそのゲノム改変および／またはその染色体外改変は、シグナルペプチドおよび／または分泌シグナルをコードする。
一部の実施形態において、分泌型組換えタンパク質を過剰発現するそのゲノム改変および／またはその染色体外改変は、その組換え宿主細胞のその種に対して最適化されているコドンを含み得る。
一部の実施形態において、その分泌型組換えタンパク質は、その細胞から分泌されるように設計され得、かつ／またはその細胞から分泌され得る。
一部の実施形態において、追加のそのゲノム改変は、その組換え宿主細胞により発現される天然細胞壁タンパク質の数を減らし、それによりその表面に提示される融合タンパク質の局在化のための追加の空間が可能になる。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ｐ２４複合体に関連するタンパク質を過剰発現するさらなるゲノム改変を含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ｐ２４複合体に関連する２種以上のタンパク質を過剰発現するものを含み得るさらなるゲノム改変を含み得る。
一部の実施形態において、そのｐ２４複合体に関連するそのタンパク質は、Ｅｒｐ１、Ｅｒｐ２、Ｅｒｐ３、Ｅｒｐ５、Ｅｍｐ２４、およびＥｒｖ２５から選択され得る。
一部の実施形態において、そのｐ２４複合体に関連するそのタンパク質は、配列番号８６～配列番号９１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
一部の局面において、本明細書に記載されるのは、目的の異種タンパク質を発現させるための方法である。一部の実施形態において、その方法は、本明細書に記載の組換え宿主細胞を取得する工程、および目的の異種タンパク質の発現を可能にする条件下で組換え宿主細胞を培養する工程を含む。
一部の実施形態において、その単離された目的の異種タンパク質は、本明細書に記載の方法にしたがって発現され得る。
一部の局面において、本明細書に提供されるのは、目的の異種タンパク質を発現させるための方法である。一部の実施形態において、その方法は、低下したレベルの菌体外多糖のものを有することを含み得、その方法は、本明細書に記載の組換え宿主細胞を取得する工程、および目的の異種タンパク質の発現を可能にする条件下で組換え宿主細胞を培養する工程を含み得る。
一部の局面において、本明細書に提供されるのは、菌体外多糖のレベルが低下している目的の異種タンパク質を発現させるための方法である。その方法は、宿主細胞を取得する工程であって、宿主細胞は酵母であり得、宿主細胞はβ－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように操作され得、過小発現は遺伝子操作前の宿主細胞との比較であり得、宿主細胞は目的の異種タンパク質および異種マンノシダーゼを発現するように操作され得る、工程；ならびに目的の異種タンパク質の発現を可能にする条件下で組換え宿主細胞を培養する工程を含み得る。
一部の実施形態において、そのＢＭＴ１タンパク質は、配列番号１２と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含み得、そのＢＭＴ２タンパク質は、配列番号１３と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、配列番号１～１１、１４～１５、および７２～８５のうちの１つのアミノ酸配列を含み得る１種または複数種の酵素を過小発現するようにさらに操作され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞あ、その組換え宿主細胞とは異なる種に由来するマンノシダーゼを組換え発現する。
一部の実施形態において、そのマンノシダーゼは、配列番号４１～５６のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であり得るアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態において、そのマンノシダーゼは、その組換え宿主細胞の表面に発現され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、マンノシダーゼの触媒ドメインとグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質のアンカードメインとを含み得る表面に提示される融合タンパク質を発現し、アンカードメインは少なくとも約２００アミノ酸を含み得、かつ／またはアンカードメイン中の残基の少なくとも約３０％はセリンまたはスレオニンである。
一部の実施形態において、その目的の異種タンパク質は、その組換え宿主細胞から分泌され得る。
一部の実施形態において、その分泌された目的の異種タンパク質は、動物タンパク質であり得る。
一部の実施形態において、その動物タンパク質は、卵タンパク質であり得る。
一部の実施形態において、その卵タンパク質は、オボアルブミン、オボムコイド、リゾチーム、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、α－オボムチン、β－オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、フラボプロテイン、オボマクログロブリン、オボスタチン、シスタチン、アビジン、オボアルブミン関連タンパク質Ｘ、およびオボアルブミン関連タンパク質Ｙからなる群より選択され得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞は、ｐ２４複合体に関連するタンパク質を過剰発現するさらなるゲノム改変を含み得る。
一部の局面において、本明細書に提供されるのは、菌体外多糖のレベルが低下している目的の異種タンパク質を製造するための組換え宿主細胞を製造するための方法である。一部の実施形態において、その方法は、目的の異種タンパク質および／または異種マンノシダーゼを発現するように操作されている酵母細胞を取得する工程；ならびにβ－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように酵母細胞を改変する工程を含む。
一部の局面において、本明細書に提供されるのは、菌体外多糖のレベルが低下している目的の異種タンパク質を製造するための組換え宿主細胞を製造するための方法である。その方法は、β－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように操作され、異種マンノシダーゼを発現するように操作されている、酵母細胞を取得する工程；ならびに目的の異種タンパク質を発現するように酵母細胞を改変する工程を含み得る。
一部の局面において、本明細書に提供されるのは、菌体外多糖のレベルが低下している目的の異種タンパク質を製造するための組換え宿主細胞を製造するための方法である。一部の実施形態において、その方法は、β－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように操作され、目的の異種タンパク質を発現するように操作された、酵母細胞を取得する工程；ならびに異種マンノシダーゼを発現するように酵母細胞を改変する工程を含む。
一部の局面において、本明細書に提供されるのは、菌体外多糖のレベルが低下している目的の異種タンパク質を製造するための組換え宿主細胞を製造するための方法である。一部の実施形態において、その方法は、酵母細胞を取得する工程、β－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように操作され、目的の異種タンパク質を発現するように操作された、酵母細胞を改変する工程；目的の異種タンパク質を発現するように酵母細胞を改変する工程；ならびに異種マンノシダーゼを発現するように酵母細胞を改変する工程を含む。
一部の局面において、本明細書に提供されるのは、目的の異種タンパク質を製造するための組換え宿主細胞である。一部の実施形態において、その宿主細胞は酵母細胞であり得る。その宿主細胞は、過小発現を達成するための遺伝子操作の前の宿主細胞との比較して、マンノシルトランスフェラーゼまたはその機能的ホモログをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを過小発現するように操作され得、その宿主細胞は目的の異種タンパク質を発現するように操作される。
一部の実施形態において、その過小発現は、前記宿主細胞のゲノムからマンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードするポリヌクレオチドをノックアウトすること、その宿主細胞においてマンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードするポリヌクレオチドを破壊すること、マンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードする前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結され得るプロモーターを破壊すること、マンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードする前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結され得るプロモーターをより低いプロモーター活性を有する別のプロモーターで置き換えること、あるいはマンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログの発現制御配列を破壊することによって、達成され得、その機能的ホモログはマンノシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも７０％配列同一性を有する。
一部の実施形態において、その宿主細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであり得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞はマンノシダーゼを発現する。
一部の実施形態において、そのマンノシダーゼはその宿主細胞に対して異種であり得る。
一部の実施形態において、そのマンノシダーゼはその組換え宿主細胞の表面に発現され得る。
一部の実施形態において、その目的のタンパク質は栄養性タンパク質であり得る。
一部の実施形態において、そのマンノシルトランスフェラーゼはβ－マンノシルトランスフェラーゼであり得る。
一部の実施形態において、そのβ－マンノシルトランスフェラーゼは、ＸＰ＿００２４９３８８２．１、ＸＰ＿００２４９３８８３．１、ＸＰ＿００２４９０７６０．１、およびＸＰ＿００２４９３９０２．１からなる群より選択されるタンパク質配列であり得る。
一部の実施形態において、そのマンノシルトランスフェラーゼは、ＸＰ＿００２４９２５９３．１、ＸＰ＿００２４９０１４９．１、およびＸＰ＿００２４９３０２０．１からなる群より選択されるタンパク質配列であり得る。
一部の実施形態において、その宿主細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであり得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞はマンノシダーゼを発現する。
一部の実施形態において、そのマンノシダーゼはその宿主細胞に対して異種であり得る。
一部の実施形態において、そのマンノシダーゼはその組換え宿主細胞の表面に発現され得る。
一部の実施形態において、その目的のタンパク質は栄養性タンパク質であり得る。
一部の局面において、目的の異種タンパク質を産生するための組換え宿主細胞が、本明細書において提供される。一部の実施形態において、その宿主細胞は酵母細胞であり得る。その宿主細胞は、オリゴ糖トランスフェラーゼ複合体由来のタンパク質またはその機能的ホモログをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを、過小発現を達成するための遺伝子操作の前のその宿主細胞と比較して過小発現するように操作され得、その宿主細胞は目的の異種タンパク質を発現するように操作されている。
一部の実施形態において、その過小発現は、前記宿主細胞のゲノムからオリゴ糖トランスフェラーゼ複合体由来のタンパク質またはそのホモログをコードするポリヌクレオチドをノックアウトすること、その宿主細胞においてオリゴ糖トランスフェラーゼ複合体由来のタンパク質またはそのホモログをコードするポリヌクレオチドを破壊すること、オリゴ糖トランスフェラーゼ複合体由来のタンパク質またはそのホモログをコードする前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結され得るプロモーターを破壊すること、オリゴ糖トランスフェラーゼ複合体由来のタンパク質またはそのホモログをコードする前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結され得るプロモーターをより低いプロモーター活性を有する別のプロモーターで置き換えること、あるいはオリゴ糖トランスフェラーゼ複合体由来のタンパク質またはそのホモログの発現制御配列を破壊することによって、達成され得、その機能的ホモログはオリゴ糖トランスフェラーゼ複合体由来のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％配列同一性を有する。
一部の実施形態において、その宿主細胞はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであり得る。
一部の実施形態において、その組換え宿主細胞はマンノシダーゼを発現する。
一部の実施形態において、そのマンノシダーゼはその宿主細胞に対して異種であり得る。
一部の実施形態において、そのマンノシダーゼはその組換え宿主細胞の表面に発現され得る。
一部の実施形態において、その目的のタンパク質は栄養性タンパク質であり得る。
参照による援用
本明細書において言及されたすべての公開物、特許、および特許出願は、各個の公開物、特許、または特許出願が参照により援用されると具体的および個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書中に援用される。参照により援用される公開物、および特許または特許出願が、本明細書中に含まれる開示と矛盾する範囲において、本明細書が、あらゆるそのような矛盾する材料に取って代わり、かつ／またはあらゆるそのような矛盾する材料に優先すると、意図される。
本発明の新規な特徴が、特に添付の特許請求の範囲において示される。本発明の特徴および利点のより良い理解が、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明と、その添付の図面を参照することによって得られる。
図１は、ＢＭＴ１遺伝子およびＢＭＴ２遺伝子の破壊後にゲル電気泳動を使用した菌体外多糖のサイズのシフトを示し、これは、ＥＰＳがマンナン多糖の形態であることを示唆する。
図２は、単一炭素源としてマンノースを使用するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の成長を示す。
図３は、表面に提示されるマンノシダーゼを発現する細胞とともに２日間のインキュベーション後に親株から精製されたＥＰＳのクロマトグラムを示す。その純粋なＥＰＳ副産物のサイズは、細胞とのインキュベーション後に変わらない。
図４は、表面に提示されるマンノシダーゼ酵素を発現する株１細胞から単離されたＥＰＳのクロマトグラムを示す。株は、ＥＰＳ濃度またはその副産物分子のサイズにおける識別可能な減少を何も示さない。
図５は、表面に提示されるマンノシダーゼ酵素を発現する株２細胞から単離されたＥＰＳのクロマトグラムを示し、これらの酵素は両方とも、そのＥＰＳの溶出プロファイルにおける右へのシフトを引き起こし、その多糖分子のサイズの有意な変化を示唆する。
図６は、ＥＰＳサンプルのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。株３は、５種の天然Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓマンノシルトランスフェラーゼの欠失後の株1である。
図7は、マンノシダーゼ表面提示についての概略図を示す。
図８は、ＥＰＳサンプルのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。天然マンノシルトランスフェラーゼの欠失を、表面に提示されるＢ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎマンノシダーゼの発現と組み合わせること（coupling）によって、株４は、そのＥＰＳ副産物のサイズを減少させることが可能である。 図９は、天然マンノシルトランスフェラーゼの破壊が、Ｂ．ｔｈｅｔａ酵素がマンナンを切断のための基質として認識するために重要であることを示す。欠失とマンノシダーゼとを有する株は、そのＥＰＳ溶出プロファイルにおいて右へのシフトを誘発する。
詳細な説明
本発明の種々の実施形態が本明細書において示され記載されてきたが、そのような実施形態は例示目的のためだけに提示されていることが、当業者には明らかである。多数の変化形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく当業者には思い浮かび得る。本明細書において記載されている発明の実施形態の種々の代替形が使用され得ることが、理解されるべきである。
高収量組換えタンパク質発現は、種々の産業（例えば、治療用タンパク質、食品産業、化粧品など）の土台である。しかし、組換えタンパク質発現には、その宿主細胞により産生される不純物がほぼ常に伴う。各宿主細胞はタンパク質、炭水化物、低分子およびポリマーを産生し分泌し、それらは、純粋なタンパク質組成物を生成するためにはその目的のタンパク質（ＰＯＩ）から分離されなければならない。本発明はこの必要性に取り組む。本システムおよび方法は大規模生産における組換えタンパク質の高力価発現を提供し、本システムおよび方法は、微生物宿主において純粋な異種動物由来タンパク質を発現させるために特に有用である。
本発明は、宿主細胞におけるグリカンの産生に関連する遺伝子の操作に関係する。その操作された宿主は有意により少ない量の菌体外多糖不純物を産生する増強された能力を有し、したがって、その細胞により産生される不純物の量を減少させると同時に、目的の組換えタンパク質の高い収量を維持することが、驚くべきことに見出された。
第一局面において、本発明は、目的のタンパク質を産生するための組換え宿主細胞を提供し、その宿主細胞は、マンノシルトランスフェラーゼまたはその機能的ホモログをコードする少なくとも１種（例えば、少なくとも２種、または少なくとも３種）のポリヌクレオチドを過小発現するように操作されており、その機能的ホモログは、これらのタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも３０％配列同一性を有する。
本発明の目的のために、用語「タンパク質」はまた、記載されたタンパク質の機能的ホモログも包含することが意図される。
ノックアウト（ＫＯ）タンパク質
酵母細胞は、種々の目的（例えば、その細胞壁の強化）のために高度に複雑な分枝型の多糖を一般的には産生する。これらの複合多糖としては、β－１，２－マンノシル結合を有するマンナンが挙げられる。マンナン生成経路における変化が酵母または他の宿主細胞において産生される組換えタンパク質の純度の増加をもたらし得るとは、未だ示唆されていない。本出願の発明者らは、マンノシルトランスフェラーゼ経路および／あるいはオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）経路における１種または複数種のタンパク質の過小発現が、最初の細胞により産生されるグリカンのサイズまたは量の減少をもたらし得、それによって、宿主細胞により産生される組換えタンパク質に関連する菌体外多糖不純物を減少させることを、初めて発見した。
一部の実施形態において、１種または複数種のＫＯタンパク質を過小発現するように操作された宿主細胞は、その宿主細胞により産生される菌体外多糖の濃度を低減する。菌体外多糖濃度の減少は、操作された宿主細胞から得られた菌体外多糖濃度が、操作の前の宿主細胞（すなわち、操作されていない宿主細胞）から得られた濃度と比較された場合に、決定され得る。
一部の実施形態において、１種または複数種のＫＯタンパク質を過小発現するように操作された宿主細胞は、その宿主細胞により産生される菌体外多糖の型を変化させる。菌体外多糖濃度の変化は、操作された宿主細胞から得られた菌体外多糖の量（mass）および／または形態が、操作の前の宿主細胞（すなわち、操作されていない宿主細胞）から得られた量および／または形態と比較された場合に、決定され得る。
一部の実施形態において、マンノシルトランスフェラーゼ経路由来の１種または複数種のタンパク質が、宿主細胞において過小発現される。マンノシルトランスフェラーゼ経路由来の１種または複数種のタンパク質の過小発現は、その宿主細胞におけるマンナンの産生の減少をもたらし得る。
例示的な一実施形態において、細胞壁マンナンにおいてβ－１，２－マンノシル結合を形成することに関与する１種または複数種の酵素が、ＫＯタンパク質であり得、宿主細胞において過小発現され得る。この例において、その酵母のマンナン構造は、減少した量のβ－１，２－マンノシル結合を生成するように変化され得る。そのようなタンパク質の例としては、β－１，２－マンノシル結合を形成することに関与する酵素をコードする遺伝子によりコードされるタンパク質、例えば、ＢＭＴ２（配列番号１３、ＸＰ＿００２４９３８８２．１）、ＢＭＴ１（配列番号１２、ＸＰ＿００２４９３８８３．１）、ＢＭＴ３（配列番号１４、ＸＰ＿００２４９０７６０．１）、およびＢＭＴ４（配列番号１５、ＸＰ＿００２４９３９０２．１）が挙げられるが、それらに限定はされない。
一部の実施形態において、その宿主細胞は、少なくとも１種のマンノシルトランスフェラーゼ酵素（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３またはＢＭＴ４）を過小発現するように操作され得る。一部の実施形態において、その宿主細胞は、少なくとも２種のマンノシルトランスフェラーゼ酵素を過小発現するように操作され得る。一部の実施形態において、その宿主細胞は、少なくとも３種のマンノシルトランスフェラーゼ酵素を過小発現するように操作され得る。一部の実施形態において、その宿主細胞は、少なくとも４種のマンノシルトランスフェラーゼ酵素を過小発現するように操作され得る。
別の例示的な実施形態において、宿主細胞は、１種または複数種のＫＯタンパク質を過小発現することによって、より複雑度が低いマンナン構造を発現するように操作され得る。この例において、マンノシルトランスフェラーゼ経路由来のタンパク質（例えば、マンノシルトランスフェラーゼタンパク質）が、α－１，６結合型マンノース単位を含む直鎖状マンナン構造を生成するように過小発現され得る。このα－１，６結合型マンノース単位は、組換え産生されたＰＯＩからのより容易な分離を提供し得る。そのようなタンパク質の例としては、遺伝子によりコードされるタンパク質、例えば、ＭＮＮ２（配列番号１、ＸＰ＿００２４９２５９３．１）、ＭＮＮ２ ５ホモログ１（配列番号２、ＸＰ＿００２４９０１４９．１）、およびＭＮＮ２ ５ホモログ２（配列番号３、ＸＰ＿００２４９３０２０．１）が挙げられるが、それらに限定はされない。
一部の実施形態において、その宿主細胞は、２種のマンノシルトランスフェラーゼ酵素を過小発現するように操作され得る。例示的な一実施形態において、その宿主細胞は、ＢＭＴ１およびＢＭＴ２を過小発現するように操作され得る。例示的な一実施形態において、その宿主細胞は、ＢＭＴ１およびＢＭＴ２に加えて１種または複数種の酵素を過小発現するように操作され得る。一例において、その宿主細胞は、ＢＭＴ１およびＢＭＴ２に加えて１種または複数種の酵素（例えば、ＭＮＮ２、ＭＮＮ２／５ホモログ１もしくはＭＮＮ２／５ホモログ２）を過小発現するように操作され得る。
さらに別の例示的な実施形態において、宿主細胞において過小発現される１種または複数種のタンパク質としては、ＫＴＲ１（配列番号４、ＸＰ＿００２４９２４２４／ＧＱ６８＿０３２２７Ｔ０）、ＫＴＲ１（選択的開始部位、配列番号５）、ＫＲＥ２（配列番号６、ＸＰ＿００２４９２４２３／ＧＱ６８＿０３２２６Ｔ０）バリアント１、ＫＴＲ２（配列番号７、ＸＰ＿００２４９２１０２／ＧＱ６８＿００１４８Ｔ０）、ＫＴＲ３（配列番号８、ＸＰ＿００２４８９４７９／ＧＱ６８＿０２８５５Ｔ０）、ＫＴＲ４（配列番号９、ＸＰ＿００２４９０１６２／ＧＱ６８＿０２１５２Ｔ０）、ＫＴＲ５（配列番号１０、ＸＰ＿００２４９１９９９／ＧＱ６８＿００２５２Ｔ０）、ＭＮＮ４（配列番号１１、ＸＰ＿００２４９０５３８／ＧＱ６８＿０１７６８Ｔ０）などのタンパク質が挙げられ得る。過小発現され得るタンパク質の例示的な配列が、表１に提示される。一部の場合において、そのＫＯタンパク質配列は、表１中の１つもしくは複数の配列と、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一であり得る。一部の例示的な実施形態において、その宿主細胞は、ＢＭＴ１ならびにＢＭＴ２に加えて１種または複数種の酵素（例えば、ＫＴＲ１、ＫＲＥ２、ＫＴＲ２、ＫＴＲ３、ＫＴＲ４、ＫＴＲ５および／もしくはＭＮＮ４）を過小発現するように操作され得る。
さらに別の例示的な実施形態において、アスパラギン結合型解糖（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）（ＡＬＧ）経路由来の１種または複数種のタンパク質が、宿主細胞において過小発現され得る。さらなる一実施形態において、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）由来の１種または複数種のタンパク質が、宿主細胞において過小発現され得る。１つまたは複数の実施形態において、過小発現され得るＡＬＧ経路またはＯＳＴ経路中のタンパク質としては、表７中の１つもしくは複数の配列と少なくとも７０％同一性、少なくとも７５％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性、または少なくとも９５％同一性、または少なくとも９９％同一性を有する、タンパク質が挙げられ得る。
一部の実施形態において、本明細書において記載される１種または複数種のＫＯタンパク質を過小発現するように操作された宿主細胞は、その宿主細胞によって産生されるＰＯＩの収量に負の影響を与えない。一部の実施形態において、本明細書において記載される１種または複数種のＫＯタンパク質を過小発現するように操作された宿主細胞は、その宿主細胞によって産生されるＰＯＩの収量を増加する。用語「収量」とは、本明細書において記載されるＰＯＩまたはモデルタンパク質（これは、例えば、操作された宿主細胞から採取される）の量を指し、増加した収量は、その宿主細胞によるＰＯＩの増加した産生量または分泌量に起因し得る。収量は、宿主細胞の（細胞乾燥重量または細胞湿重量として測定される）バイオマス１ｇ当たりのＰＯＩのｍｇによって示され得る。用語「力価」とは、本明細書において使用される場合は、培養上清１Ｌ当たりのＰＯＩのｍｇとして示される、産生されるＰＯＩまたはモデルタンパク質の量を同様に指す。収量の増加は、操作された宿主細胞から得られた収量が、操作の前の宿主細胞（すなわち、操作されていない宿主細胞）から得られた収量と比較された場合に、決定され得る。
一部の実施形態において、その宿主細胞は、ＫＯタンパク質を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、または少なくとも９５％少ない、前記ＫＯタンパク質を発現するように操作されている。一部の実施形態において、その宿主細胞は、そのＫＯタンパク質をノックアウトするように操作されており、そのノックアウトは、その宿主細胞においてそのＫＯタンパク質の活性を無くす。
一部の実施形態において、その宿主細胞は、ＫＯタンパク質を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して多くて１０％、多くて１５％、多くて２０％、多くて３０％、多くて４０％、多くて５０％、多くて６０％、多くて７０％、多くて８０％、多くて９０％、または多くて９５％の前記ＫＯタンパク質を発現するように操作されている。
宿主細胞
本明細書において使用される場合、「宿主細胞」とは、タンパク質発現が可能であり、必要に応じてタンパク質分泌が可能である、細胞を指す。そのような宿主細胞は、本発明の方法において適用される。その目的のために、その宿主細胞がポリペプチドを発現するために、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、その細胞中に存在するかまたはその細胞中に導入されている。本発明により提供される宿主細胞は、原核生物であってもよく、または真核生物であってもよい。当業者によって認識されるとおり、原核生物細胞が膜に囲まれた核を欠く一方で、真核生物細胞は膜に囲まれた核を有する。真核生物細胞の例としては、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、線形動物細胞、昆虫細胞、幹細胞、真菌細胞または酵母細胞が挙げられるが、それらに限定はされない。
酵母細胞の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ）、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｎｄａｎｕｓ）、Ｃａｎｄｉｄａ属（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｆｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｃａｏｉ）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属（例えば、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ならびにＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｆｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられるが、それらに限定はされない。
Ｐｉｃｈｉａ属が特に目的とされる。Ｐｉｃｈｉａは多くの種を含み、それらの種としては、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ種、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ種、Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ種、およびＰｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ種が挙げられる。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ種が最も好ましい。
以前のＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ種はＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓとＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉとに分割され改名された。したがって、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉの両方と同義である。
一部の実施形態において、その宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、およびＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅである。
本明細書において使用される用語法は、特定の場合を記載することだけを目的とし、限定することは意図されない。
本明細書において使用される場合、別途示されない限りは、用語「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、そうではないことを文脈が明示しない限りは、複数形ならびに単数形を含むことが意図される。
本開示中および／または特許請求の範囲中のいずれかで使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含むこと（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（含む）（ｗｉｔｈ）」、またはそれらの変化形は、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様の様式で含むことが意図される。
用語「約」または「およそ」は、特定の値について当業者によって決定される許容可能な誤差範囲内を意味し、その許容可能な誤差範囲は、その値がどのように測定または決定されるか（例えば、その測定システムの限界）に部分的に依存する。例えば、「約」は、記載値よりも１０％大きいことまたは１０％小さいことを意味し得る。別の例において、「約」は、所定の値における慣行にしたがって、１標準偏差以内または１よりも大きい標準偏差以内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲において記載される場合、別途記載されない限りは、用語「約」は、その特定の値について許容可能な誤差範囲を意味すると考えられるべきである。
用語「実質的に」は、ほとんどの場合、または本質的には、かなりの程度であることが意味される。換言すると、実質的にという用語は、望まれる性質にほぼ一致すること、またはその厳密な性質とはわずかに異なることを意味し得る。実質的にとは、その望まれる性質とは区別不能であり得る。実質的にとは、その望まれる性質とは区別可能であり得るが、その差異は重要ではないかまたは無視可能である。
本明細書において使用される場合、「操作された」宿主細胞とは、遺伝子工学を使用して（すなわち、ヒトの介入によって）操作された、宿主細胞である。宿主細胞が、所定のタンパク質を「過小発現するように操作され」ている場合、その宿主細胞は、その宿主細胞が、記載されたタンパク質またはその機能的ホモログを発現する能力をもはや有しないように操作されている（例えば、操作されていない宿主細胞）。
「操作の前」とは、本発明の宿主細胞の文脈において使用される場合は、そのような宿主細胞が、ノックアウト（ＫＯ）タンパク質またはその機能的ホモログをコードするポリヌクレオチドが過小発現されるように操作されてはいないことを意味する。したがって、前記用語はまた、宿主細胞が、ＫＯタンパク質またはその機能的ホモログをコードするポリヌクレオチドを過小発現しないか、あるいはＫＯタンパク質またはその機能的ホモログをコードするポリヌクレオチドを過小発現すように操作されてはいないことを、意味する。
用語「過小発現」とは、ＫＯタンパク質または機能的ホモログの機能的発現を防止あるいは減少させるあらゆる方法を含む。これは、その既知機能を発揮する能力がないことまたはその既知機能を発揮することの減少をもたらす。過小発現の手段としては、遺伝子サイレンシング（例えば、ＲＮＡｉ遺伝子アンチセンス）、（遺伝子配列を変異誘発すること、その配列を破壊すること、挿入、付加、変異、発現制御配列を改変することなどによって）ノックアウトすること、発現レベルを変化させること、発現パターンを変化させることが挙げられ得る。
上記のとおり、本発明の宿主細胞は、好ましくは、本明細書において定義されるアミノ酸を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過小発現するように操作されている。これは、宿主細胞がそのようなポリヌクレオチドの１個よりも多いコピーを有し得る場合に、そのようなポリヌクレオチドのその他のコピーもまた過小発現されることを含む。例えば、本発明の宿主細胞は一倍体であり得るだけではなく、本発明の宿主細胞は二倍体、四倍体またはさらに多い倍数体でもあり得る。したがって、好ましい実施形態において、そのようなポリヌクレオチドのすべてのコピー（例えば、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピーまたはさらにも多いコピー）が過小発現される。
本発明における用語「過小発現する」、「過小発現している」、「過小発現される」および「過小発現」とは、その宿主細胞の遺伝子変化前または遺伝子変化されていない同等の宿主における同じ遺伝子生成物もしくはポリペプチドの発現よりも少ないレベルでの、遺伝子生成物またはポリペプチドの発現を指す。「よりも少ない（未満）」とは、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０、９０％またはそれよりも多くを含む。その遺伝子生成物またはポリペプチドの発現がないこともまた、用語「過小発現」によって含まれる。
本開示の方法の特徴
一部の実施形態において、減少した量の菌体外多糖不純物を有するタンパク質生成物は、組換え型の目的のタンパク質と菌体外多糖不純物とを含む組成物と比較して菌体外多糖不純物量において少なくとも５０％減少を含む。一部の場合において、そのＰＯＩ生成物は、組換え型のＰＯＩと菌体外多糖不純物とを含む組成物と比較して菌体外多糖不純物量において少なくとも７５％減少、少なくとも８０％減少、少なくとも９０％減少、または少なくとも９５％減少を有する。
種々の実施形態において、そのＰＯＩ生成物の重量の約１０％未満が、菌体外多糖不純物を含む。一部の場合において、そのＰＯＩ生成物の重量の約５％未満が、菌体外多糖不純物を含む。
実施形態において、その菌体外多糖不純物（ＥＰＳ）は、一般的に使用されるタンパク質精製方法（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）を使用した場合に、その組換え型のＰＯＩから一般的には分離不能である。
一部の実施形態において、そのＥＰＳ成分は、天然では、組換え細胞の細胞壁の成分である。一部の場合において、組換え型のＰＯＩを含む組成物中に存在するＥＰＳは、その組換え細胞の細胞壁中に取り込まれるのではなく、その組換え細胞から分泌された。
種々の実施形態において、そのＥＰＳは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムによって特徴付けられる見かけのサイズ約１３ｋＤａ～約２７ｋＤａを有する。
実施形態において、そのＥＰＳはマンノースを含む。一部の場合において、そのＥＰＳは、Ｎ－アセチルグルコサミンおよび／またはグルコースをさらに含む。
一部の実施形態において、そのＥＰＳは、質量分析法とともにガスクロマトグラフィーによって分析された、約９１ｍｏｌ％マンノース、約５ｍｏｌ％のＮ－アセチルグルコサミン、および約３ｍｏｌ％グルコースを含む。ＥＰＳは、Ｐｂ結合カラムを使用する方法を使用して定量され得る。分析用ＨｙｐｅｒＲＥＺ ＸＰ Ｐｂ＋＋カラム（８μｍ、３００×７．７ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）がこの測定のために使用され得、これは、流量０．６ｍＬ／ｍｉｎで操作されたＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００システム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）において水で溶出され、屈折率検出器でモニターされる。
種々の実施形態において、そのＥＰＳは、α（１，２）結合型分枝および／またはα（１，３）結合型分枝を有するα（１，６）結合型骨格を含む。
実施形態において、そのＥＰＳはマンナンである。
一部の実施形態において、その組換え細胞は、ＥＰＳを発現および／または分泌する細胞であり、真菌細胞（例えば、糸状菌もしくは酵母）、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞から選択される。
過小発現の方法
好ましくは、過小発現は、宿主細胞においてＫＯタンパク質をコードするポリヌクレオチドをノックアウトすることによって、達成される。遺伝子は、そのコード配列全体または部分的コード配列を欠失させることによって、ノックアウトされ得る。遺伝子ノックアウトを作製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、ＫｕｈｎおよびＷｕｒｓｔ（編）、Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００９年３月２７日）を参照のこと。遺伝子はまた、その遺伝子配列の一部またはすべてを除去することによってもノックアウトされ得る。あるいは、遺伝子は、ヌクレオチド配列（例えば、耐性遺伝子）の挿入によって、ノックアウトまたは不活化され得る。あるいは、遺伝子は、そのプロモーターを不活化することによって、ノックアウトまたは不活化され得る。
ある実施形態において、過小発現は、宿主細胞においてその遺伝子をコードするポリヌクレオチドを破壊することによって、達成される。
「破壊」とは、その破壊の前の元の配列と比較した場合に、１個もしくは複数個のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の、付加、欠失、または置換をもたらした、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の変化である。
「挿入」または「付加」とは、その破壊の前の元の配列と比較した場合に、１個もしくは複数個のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が追加された、核酸配列またはアミノ酸配列の変化である。
「欠失」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかにおける、１個もしくは複数個のヌクレオチドまたはアミノ酸残基がそれぞれ除去された（すなわち、存在しない）、変化として定義される。欠失は、その配列全体の欠失、そのコード配列の一部の欠失、または１個のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の欠失を含む。
「置換」とは一般的には、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を他のヌクレオチドまたはアミノ酸残基により置き換えることを指す。「置換」は、部位特異的変異、ランダム変異の作製、およびギャップ二重鎖（ｇａｐｐｅｄ－ｄｕｐｌｅｘ）アプローチによって実施され得る（例えば、米国特許第４，７６０，０２５号；Ｍｏｒｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９８４）２：６４６；およびＫｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８４）１２：９４４１を参照のこと）。部位特異的変異誘発は、望まれる変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含むＰＣＲによって、インビトロで達成され得る。部位特異的変異誘発はまた、その親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド中のある部位における制限酵素による切断と、その変異を含むオリゴヌクレオチドのそのポリヌクレオチド中でのその後の連結とを含む、カセット変異誘発によって、インビトロで達成され得る。通常は、そのプラスミドとそのオリゴヌクレオチドとを消化する制限酵素は同じであり、これにより、そのプラスミドの付着末端とその挿入物とが互いと連結することを可能にする。例えば、ＳｃｈｅｒｅｒおよびＤａｖｉｓ、１９７９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９～４９５５；およびＢａｒｔｏｎら、１９９０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：７３４９～４９６６を参照のこと。部位特異的変異誘発はまた、当該分野において公知の方法によって、インビボで達成され得る。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号；Ｓｔｏｒｉｃｉら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３～７７６；Ｋｒｅｎら、１９９８、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５～２９０；ならびにＣａｌｉｓｓａｎｏおよびＭａｃｉｎｏ、１９９６、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５～１６を参照のこと。合成遺伝子構築は、目的のポリペプチドをコードするために設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成を必然的に伴う。遺伝子合成は、多くの技術、例えば、Ｔｉａｎらによって記載された多重マイクロチップベースの技術（２００４、Ｎａｔｕｒｅ、４３２：１０５０～１０５４）、およびオリゴヌクレオチドが光プログラム可能なマイクロ流体チップ上で合成されアセンブルされる類似の技術を利用して、実施され得る。１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、および/または挿入が、変異誘発、組換え、および／またはシャッフリングの公知方法を使用して作製および試験され得、その後、適切なスクリーニング手順（例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ－ＯｌｓｏｎおよびＳａｕｅｒ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：５３～５７；ＢｏｗｉｅおよびＳａｕｅｒ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２～２１５６；ＷＯ９５／１７４１３；またはＷＯ９５／２２６２５により開示されるスクリーニング手順）が行われ得る。使用され得る他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２～１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２／０６２０４）および領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら、１９８６、Ｇｅｎｅ、４６：１４５；Ｎｅｒら、１９８８、ＤＮＡ、７：１２７）が挙げられる。変異誘発／シャッフリング方法は、宿主細胞に発現されるクローン化された変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために、ハイスループットな自動化スクリーニング方法と組み合わされ得る（Ｎｅｓｓら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７：８９３～８９６）。活性なポリペプチドをコードする変異誘発されたＤＮＡ分子は、当該分野における標準的な方法を使用して、宿主細胞から回収され得、迅速に配列決定され得る。これらの方法は、ポリペプチド中の個別のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能にする。半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築の局面、および／または部位特異的変異誘発の局面、および／またはランダム変異誘発の局面、および／またはシャッフリングの局面を組み合わせることによって、達成される。半合成構築は、合成されたポリヌクレオチドフラグメントをＰＣＲ技術と組み合わせて利用するプロセスによって、典型的に表される。したがって、遺伝子の規定された領域が新規に合成され得、一方で、部位特異的変異誘発プライマーを使用して他の領域が増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンＰＣＲ増幅もしくは非エラープローンＰＣＲ増幅に供され得る。その後、ポリヌクレオチド部分配列がシャッフルされ得る。あるいは、ホモログが、例えば、近縁微生物または遠縁微生物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、天然供給源から得られ得る。
好ましくは、破壊は、フレームシフト変異、早期終止コドン、重要な残基の点変異、ナンセンスであるかまたは他の様式である非機能的なタンパク質生成物の翻訳をもたらす。
別の実施形態において、過小発現は、ＫＯタンパク質をコードする前記ポリペプチドと作動可能に連結されたプロモーターを破壊することによって、達成される。プロモーターは、下流遺伝子の転写を指令する。このプロモーターは、所定の遺伝子を発現するためには、他の発現制御配列（例えば、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列）と一緒に、必要である。したがって、ＫＯタンパク質をコードするポリペプチドの発現を妨げるために、その発現制御配列のいずれかを破壊することもまた、可能である。
核酸は、その核酸が同じ核酸分子上の別の核酸配列と機能的関係にあるように配置された場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターは、そのプロモーターが
組換え遺伝子のコード配列の発現をもたらすことが可能である場合に、そのコード配列と作動可能に連結されている。
別の実施形態において、過小発現は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）によって達成される。当該分野において一般的に使用される技術であるＰＴＧＳは、遺伝子の発現レベルを、異種ＲＮＡ配列（頻繁には、破壊を必要とするその遺伝子のアンチセンス）の発現によって減少させる（Ｌｅｃｈｔｒｅｃｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ（２００２）１１５：１５１１～１５２２；Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０７：３１９～３２０；Ｆｕｒｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ（２００１）１１４：３８５７～３８６３；Ｒｏｈｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ（２００４）４０（４）：６１１～２１）。転写後遺伝子サイレンシングは、典型的には、低分子ＲＮＡ（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはアンチセンスＲＮＡが挙げられる）を使用して特定のｍＲＮＡ分子の破壊を引き起こすことによって、ＲＮＡ分子が遺伝子発現を阻害する生物学的プロセスである。遺伝子サイレンシングは、転写の遮断（遺伝子結合の場合）を通じてか、ｍＲＮＡ転写物の分解（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはリボヌクレアーゼＨ依存性アンチセンスによる）を通じてか、あるいは他の機能的ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡが挙げられる）の成熟のために使用されるｍＲＮＡ翻訳、プレｍＲＮＡスプライス部位、またはヌクレアーゼ切断部位のいずれかの遮断（例えば、モルフォリノオリゴもしくは他のリボヌクレアーゼＨ非依存性アンチセンスによる）を通じてかのいずれかで、起こり得る。これらの低分子ＲＮＡは他の特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に結合し得、例えば、ｍＲＮＡがタンパク質を生成するのを防止することによって、それらの活性を減少させ得る。例示的なｓｉＲＮＡ分子は、約１０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドまたはそれよりも長い長さを有する。その低分子ＲＮＡ分子は、標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を指令するのに標的ｍＲＮＡ配列と「十分に相補的」な配列を有する、少なくとも１本の鎖を含む。低分子干渉ＲＮＡは、細胞の内側から生じ得、または細胞中に外因的に導入され得る。いったん細胞中に導入されると、外因性ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によりプロセシングされる。このｓｉＲＮＡは、サイレンシングされる標的ｍＲＮＡと相補的であり、このＲＩＳＣは、この標的ｍＲＮＡを位置決定するためのテンプレートとしてこのｓｉＲＮＡを使用する。このＲＩＳＣがこの標的ｍＲＮＡに局在した後、そのＲＮＡはリボヌクレアーゼにより切断され得る。その鎖は、ＲＮＡｉ機構またはＲＮＡｉプロセスによるこの標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分な配列を有し、ｄｓ－ｓｉＲＮＡ分子の文脈においてアンチセンス鎖と一般的に呼ばれる。このｓｉＲＮＡ分子は、どの残基もその標的分子中の一残基と相補的であるように設計され得る。ＰＴＧＳは多くの生物において見出される。酵母細胞について、分裂酵母であるＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅは、ヘテロクロマチン形成およびセントロメアサイレンシングに関与する活性なＲＮＡｉ経路を有する（Ｒａｐｏｎｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００３）３１（１５）：４４８１～４４８９）。一部の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓが挙げられる）もまた、そのようなＲＮＡｉ経路を有することが見出された（Ｂａｒｔｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ、ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７６９４５、２００９年９月１０日オンライン公開）。「過小発現」は、遺伝子発現を低下させる当該分野において公知の任意の技術を用いて達成され得る。例えば、ＫＯタンパク質をコードするポリペプチドと作動可能に連結されたプロモーターは、より低いプロモーター活性を有する別のプロモーターにより置き換えられ得る。プロモーター活性は、その転写効率によって評価され得る。これは、（例えば、ノーザンブロット法、定量ＰＣＲにより）そのプロモーターからのｍＲＮＡ転写の量の測定によって直接的に、またはそのプロモーターから発現される遺伝子生成物の量の測定によって間接的に、決定され得る。
過小発現は、別の実施形態においては、発現されるＫＯタンパク質のフォールディングを妨害することによって達成され得、その結果、該ＫＯタンパク質が機能的になるのに適切には折りたたまれない。例えば、変異が、そのＫＯタンパク質のジスルフィド結合形成を除去するため、またはαヘリックスおよびβシートの形成を破壊するために、導入され得る。
目的のタンパク質
本明細書において使用される用語「目的のタンパク質」（ＰＯＩ）とは、宿主細胞において組換え技術によって産生されるタンパク質を指す。より詳細には、そのタンパク質は、その宿主細胞において天然では存在しないポリペプチド（すなわち、異種タンパク質）であり得るか、そうでなければ、その宿主細胞に固有（すなわち、その宿主細胞の同種タンパク質）であり得るかのいずれかであるが、例えば、ＰＯＩをコードする核酸配列を含む自己複製ベクターでの形質転換によってか、またはＰＯＩをコードする核酸配列の１コピーもしくは複数コピーを組換え技術によりその宿主細胞のゲノム中に組み込んだ際にか、またはＰＯＩをコードする遺伝子の発現を制御する１もしくは複数の調節配列（例えば、プロモーター配列）の組換え改変によって、産生される。一般に、本明細書中で言及される目的のタンパク質は、当業者に周知の組換え発現方法によって、産生され得る。
その目的のタンパク質（ＰＯＩ）に関して、制限は存在しない。そのＰＯＩは、通常は、真核生物もしくは原核生物の、ポリペプチド、バリアントまたはそれらの誘導体である。そのＰＯＩは、任意の原核生物タンパク質または真核生物タンパク質であり得る。そのタンパク質は、天然で分泌されるタンパク質であってもよく、または細胞内タンパク質（天然では分泌されないタンパク質）であってもよい。本発明はまた、タンパク質の生理活性フラグメントを含む。別の実施形態において、ＰＯＩは、アミノ酸鎖であり得るか、または複合体（例えば、ダイマー、トリマー、ヘテロダイマー、マルチマーまたはオリゴマー）中に存在し得る。
目的のタンパク質は、食品製品中、飼料製品中、または化粧品製品中などの栄養補給物（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、栄養補助食品（ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、消化補助物質（ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として使用される、タンパク質であり得る。その食品製品は、例えば、ブイヨン、デザート、シリアルバー、菓子類、スポーツドリング、食用製品または他の栄養製品であり得る。好ましくは、その目的のタンパク質は食品添加物である。一部の実施形態において、その目的のタンパク質は動物タンパク質である。一部の例示的な実施形態において、その目的のタンパク質は卵白タンパク質である。一部の例において、その目的のタンパク質は、１種または複数種のタンパク質、例えば、オボアルブミン、オボムコイド、リゾチーム、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、α－オボムチン、β－オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、フラボプロテイン、オボマクログロブリン、オボスタチン、シスタチン、アビジン、オボアルブミン関連タンパク質Ｘ、およびオボアルブミン関連タンパク質Ｙを含み得る。
例示的なＰＯＩ配列が表５に提示される。一部の場合において、そのＰＯＩ配列は、表５中の１つもしくは複数の配列と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一であり得る。
一部の場合において、その目的のタンパク質は、その宿主細胞から分泌され得る。
一部の場合において、ＰＯＩは、１種もしくは複数種の目的の有益なタンパク質（ＡＰＯＩ）を発現または過剰発現するように操作された宿主細胞において産生される。ＡＰＯＩは、その宿主細胞により産生されるグリカンの型または形態を変更させるタンパク質であり得る。ＡＰＯＩは、その宿主細胞によるグリカン産生を減少させるタンパク質であり得る。ＡＰＯＩは、その宿主細胞により産生されるある型のグリカンを減少させるタンパク質であり得る。一部の実施形態において、ＡＰＯＩは、ヒドロラーゼ酵素を含み得る。一例において、ＡＰＯＩは、マンノシルヒドロラーゼおよび／またはマンノシダーゼを含み得る。一部の例において、そのＡＰＯＩは、１種または複数種のヘルパー因子（ｈｅｌｐｅｒ ｆａｃｔｏｒ）タンパク質を含み得る。そのようなヘルパー因子タンパク質の例としては、配列番号８６～９１を有するタンパク質が挙げられ得る。
１種もしくは複数種のＡＰＯＩが、分泌シグナルを使用してその宿主細胞から分泌され得る。１種もしくは複数種のＡＰＯＩが、その宿主細胞の表面に発現され得る。ＡＰＯＩが、表面提示の従来の方法（ＡＰＯＩと表面提示酵素（例えば、Ｓｅｄ１（配列番号６４～６５のうちのいずれか１つ）、Ｔｉｒ４（配列番号５８～６１のうちのいずれか１つ）、Ｄａｎ１（配列番号６２～６３のうちのいずれか１つ）とのキメラ連結が挙げられるが、それらに限定はされない）を使用して、宿主細胞の表面に発現され得る。使用され得る他の表面提示タンパク質が、表４に記載される。
宿主細胞において産生されるＡＰＯＩは、その宿主細胞と同種のタンパク質であり得る。あるいは、宿主細胞において産生されるＡＰＯＩは、その宿主細胞と異種であり得る。一例において、ＡＰＯＩは、生物（一般的なヒトの腸内微生物であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎが挙げられる）よって産生されるものなどのマンノシダーゼを含む。例示的なＡＰＯＩとしては、表２中のヌクレオチド配列（配列番号１６～４０）または表３中のタンパク質配列（配列番号４１～５６、８６～９１）を有するタンパク質が挙げられる。一部の場合において、そのＡＰＯＩ配列は、表２または表３中の１つもしくは複数の配列と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一であり得る。
一例において、ＡＰＯＩは、遊離型の変化したマンナンまたは菌体外多糖構造のいくらかを、炭素回収のために使用するために細胞が天然で移入し得るマンノース単糖へと分解可能な、マンノシダーゼである。
ＡＰＯＩの表面提示
ＡＰＯＩまたは目的の有益なタンパク質（例えば、マンノシダーゼ）は、その宿主細胞の表面に提示され得る。その細胞の表面に提示されるＡＰＯＩは、融合タンパク質の一部であり得る。
一部の実施形態において、操作された真核生物細胞は、ＡＰＯＩの触媒ドメインとグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質のアンカードメインとを含む、表面に提示される融合タンパク質を発現し得る。一部の場合において、そのアンカードメインは少なくとも約２００アミノ酸を含み、かつ／またはそのアンカードメイン中の残基の少なくとも約３０％はセリンまたはスレオニンである。
一部の実施形態において、そのアンカードメインは、少なくとも約２２５アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約２７５アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３２５アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約３７５アミノ酸、または少なくとも約４００アミノ酸を含む。
一部の実施形態において、そのアンカードメイン中の残基の少なくとも約３５％はセリンまたはスレオニンであるか、そのアンカードメイン中の残基の少なくとも約４０％はセリンまたはスレオニンであるか、そのアンカードメイン中の残基の少なくとも約４５％はセリンまたはスレオニンであるか、あるいはそのアンカードメイン中の残基の少なくとも約５０％はセリンまたはスレオニンである。
一部の実施形態において、そのアンカードメイン中のセリンまたはスレオニンはＯ－マンノシル化され得る。
一部の実施形態において、少なくとも約３２５アミノ酸を含むアンカードメインを有する融合タンパク質は、約３００アミノ酸未満を含むアンカードメインを有する融合タンパク質と比較して大きな酵素活性を提供する。
一部の実施形態において、少なくとも約３００アミノ酸を含むアンカードメインを有する融合タンパク質は、約２５０アミノ酸未満を含むアンカードメインを有する融合タンパク質と比較して大きな酵素活性を提供する。
一部の実施形態において、その融合タンパク質は、ＧＰＩアンカー型タンパク質のアンカードメインを含む。
一部の実施形態において、その融合タンパク質は、ＧＰＩアンカー型タンパク質をその天然シグナルペプチドなしで含む。
一部の実施形態において、そのＧＰＩアンカー型タンパク質は、その操作された真核生物細胞に固有ではない。
一部の実施形態において、そのＧＰＩアンカー型タンパク質はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞によって天然で発現され、その操作された真核生物細胞はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞ではない。
一部の実施形態において、そのＧＰＩアンカー型タンパク質はＴｉｒ４、Ｄａｎ１、Ｄａｎ４、Ｓａｇ１、Ｆｉｇ２、またはＳｅｄ１から選択される。
一部の実施形態において、そのＧＰＩアンカー型タンパク質のアンカードメインは、表４中の１つもしくは複数の配列と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、そのＧＰＩアンカー型タンパク質のアンカードメインは、表４中の１つもしくは複数の配列のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、その融合タンパク質は、ＡＰＯＩの一部を該ＡＰＯＩの触媒ドメインに加えて含む。
一部の実施形態において、その融合タンパク質は、そのＡＰＯＩの実質的に全アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、その融合タンパク質、その触媒ドメインはそのアンカードメインのＮ末端側にある。
一部の実施形態において、その融合タンパク質は、その触媒ドメインとそのアンカードメインとの間にリンカーを含む。
一部の実施形態において、翻訳されると、その融合タンパク質はシグナルペプチドおよび／または分泌シグナルを含む。
一部の実施形態において、その操作された真核生物細胞は、２種以上の融合タンパク質、３種以上の融合タンパク質、または４種の融合タンパク質を含む。
一部の実施形態において、その２種以上の融合タンパク質は、別々の酵素型を含む。
一部の実施形態において、その２種以上の融合タンパク質は、同じ酵素型を含む。
一部の実施形態において、その３種以上の融合タンパク質のうちの２種またはその４種以上の融合タンパク質のうちの２種は、別々の酵素型を含む。
一部の実施形態において、その３種以上の融合タンパク質のうちの２種またはその４種以上の融合タンパク質のうちの２種は、同じ酵素型を含む。一部の実施形態において、その３種以上の融合タンパク質のうちの３種またはその４種以上の融合タンパク質のうちの３種は、別々の酵素型を含む。一部の実施形態において、その３種以上の融合タンパク質のうちの３種またはその４種以上融合タンパク質のうちの３種は、同じ酵素型を含む。一部の実施形態において、その２種以上、３種以上、または４種の融合タンパク質の各々は、別々の酵素型を含む。一部の実施形態において、その２種以上、３種以上、または４種の融合タンパク質の各々は、同じ酵素型を含む。
タンパク質の発現
組換えタンパク質（例えば、ＰＯＩまたはＡＰＯＩ）の発現は、発現ベクター、プラスミド、宿主ゲノム中に組み込まれた核酸、または他の手段によって、提供され得る。例えば、発現用のベクターは、（ａ）プロモーターエレメント、（ｂ）シグナルペプチド、（ｃ）異種タンパク質配列、および（ｄ）ターミネーターエレメントを含み得る。
組換え型のＰＯＩまたはＡＰＯＩの発現のために使用され得る発現ベクターとしては、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を有する発現カセットを含む発現ベクターが挙げられる。一部の実施形態において、シグナルペプチド（ｃ）は、そのベクター中に含まれる必要はない。一般に、その発現カセットは、同族宿主微生物のゲノム中に組み込まれた場合に、導入遺伝子の転写を媒介するように設計される。
宿主微生物への形質転換の前のベクターの増幅を補助するために、複製起点（ｅ）が、ベクター（例えば、ＰＵＣ＿ＯＲＩＣおよびＰＵＣ（ＤＮＡ２．０））中に含まれ得る。発現ベクターにより安定的に形質転換された微生物の選択を補助するために、そのベクターはまた、選択マーカー（ｆ）（例えば、ＵＲＡ３遺伝子およびゼオシン耐性遺伝子（ＺｅｏＲ））も含み得る。その発現ベクターはまた、宿主微生物への形質転換の前にその発現ベクターの線状化を可能にしてその宿主ゲノム中へのその発現ベクターの安定な組込みを容易にする、制限酵素部位（ｇ）も含み得る。一部の実施形態において、その発現ベクターは、上記エレメント（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）の任意のサブセット（エレメント（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）がすべて無いことを含む）を含み得る。当業者に公知の他の発現エレメントおよびベクターエレメントが、本明細書において記載されるエレメントと組み合わせて使用され得、または本明細書において記載されるエレメントの代わりに使用され得る。
例示的なプロモーターエレメント（ａ）としては、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが挙げられ得るが、それらに限定はされない。プロモーターとしては、ａｃｕ－５、ａｄｈ１＋、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ４）、ＡＨＳＢ４ｍ、ＡＩＮＶ、ａｌｃＡ、α－アミラーゼ、代替オキシダーゼ（ＡＯＤ）、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）、アルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）、ＡＸＤＨ、Ｂ２、ＣａＭＶ、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）、ｃｃｇ－１、ｃＤＮＡ１、細胞フィラメントポリペプチド（ｃｆｐ）、ｃｐｃ－２、ｃｔｒ４＋、ＣＵＰ１、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）、エノラーゼ（ＥＮＯ、ＥＮＯ１）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）、ＦＭＤ、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤＨ）、Ｇ１、Ｇ６、ＧＡＡ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ＧＡＬ４、ＧＡＬ５、ＧＡＬ６、ＧＡＬ７、ＧＡＬ８、ＧＡＬ９、ＧＡＬ１０、ＧＣＷ１４、ｇｄｈＡ、ｇｌａ－１、α－グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ、ＧＡＰ、ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ１）、グリセロールキナーゼ（ＧＵＴ１）、ＨＳＰ８２、ｉｎｖｌ＋、イソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ１）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＩＬＶ５）、ＫＡＲ２、ＫＥＸ２、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃ４）、ＬＥＵ２、ｍｅｌＯ、ＭＥＴ３、メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）、ｎｍｔ１、ＮＳＰ、ｐｃｂＣ、ＰＥＴ９、ペルオキシン８（ＰＥＸ８）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ、ＰＧＫ１）、ｐｈｏ１、ＰＨＯ５、ＰＨＯ８９、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＩＳ１）、ＰＹＫ１、ピルビン酸キナーゼ（ｐｋｉ１）、ＲＰＳ７、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）、３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳＥＲ１）、ＳＳＡ４、ＳＶ４０、ＴＥＦ、翻訳伸長因子１α（ＴＥＦ１）、ＴＨＩ１１、ホモセリンキナーゼ（ＴＨＲ１）、ｔｐｉ、ＴＰＳ１、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、ＸＲＰ２、ＹＰＴ１、およびそれらの任意の組合せが挙げられるが、それらに限定はされない。例示的な誘導性プロモーターとしては、メタノール誘導性プロモーター（例えば、ＤＡＳ１およびｐＰＥＸ１１）が挙げられる。
シグナルペプチド（ｂ）（シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、シグナルペプチド、輸送ペプチド、リーダー配列、またはリーダーペプチドとしても知られる）は、タンパク質またはポリヌクレオチドの分泌を支援し得る。宿主細胞からの組換えタンパク質または異種発現タンパク質の細胞外分泌は、タンパク質精製を容易にし得る。シグナルペプチドは、タンパク質の前駆体（例えば、プレプロペプチド、プレタンパク質）に由来し得る。シグナルペプチドは、天然の組換え型のＰＯＩまたはＡＰＯＩ中のシグナルペプチド以外のタンパク質前駆体に由来し得る。
組換え型のＰＯＩまたはＡＰＯＩをコードする任意の核酸配列が、（ｃ）として使用され得る。好ましくは、そのような配列は、宿主細胞の種／属／界についてコドン最適化されている。
例示的な転写ターミネーターエレメントとしては、ａｃｕ－５、ａｄｈ１＋、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ４）、ＡＨＳＢ４ｍ、ＡＩＮＶ、ａｌｃＡ、α－アミラーゼ、代替オキシダーゼ（ＡＯＤ）、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）、アルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）、ＡＸＤＨ、Ｂ２、ＣａＭＶ、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）、ｃｃｇ－１、ｃＤＮＡ１、細胞フィラメントポリペプチド（ｃｆｐ）、ｃｐｃ－２、ｃｔｒ４＋、ＣＵＰ１、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）、エノラーゼ（ＥＮＯ、ＥＮＯ１）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）、ＦＭＤ、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤＨ）、Ｇ１、Ｇ６、ＧＡＡ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ＧＡＬ４、ＧＡＬ５、ＧＡＬ６、ＧＡＬ７、ＧＡＬ８、ＧＡＬ９、ＧＡＬ１０、ＧＣＷ１４、ｇｄｈＡ、ｇｌａ－１、α－グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ、ＧＡＰ、ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ１）、グリセロールキナーゼ（ＧＵＴ１）、ＨＳＰ８２、ｉｎｖｌ＋、イソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ１）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＩＬＶ５）、ＫＡＲ２、ＫＥＸ２、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃ４）、ＬＥＵ２、ｍｅｌＯ、ＭＥＴ３、メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）、ｎｍｔ１、ＮＳＰ、ｐｃｂＣ、ＰＥＴ９、ペルオキシン８（ＰＥＸ８）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ、ＰＧＫ１）、ｐｈｏ１、ＰＨＯ５、ＰＨＯ８９、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＩＳ１）、ＰＹＫ１、ピルビン酸キナーゼ（ｐｋｉ１）、ＲＰＳ７、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）、３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳＥＲ１）、ＳＳＡ４、ＳＶ４０、ＴＥＦ、翻訳伸長因子１α（ＴＥＦ１）、ＴＨＩ１１、ホモセリンキナーゼ（ＴＨＲ１）、ｔｐｉ、ＴＰＳ１、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、ＸＲＰ２、ＹＰＴ１、およびそれらの任意の組合せが挙げられるが、それらに限定はされない。
例示的な選択マーカー（ｆ）としては、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ゼオシン、アンピシリン、ブラストサイジン、カナマイシン、ノーセオスリシン（ｎｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、トリクロサン、ガンシクロビル、およびそれらの任意の組合せ）、栄養要求性マーカー（例えば、ａｄｅ１、ａｒｇ４、ｈｉｓ４、ｕｒａ３、ｍｅｔ２、およびそれらの任意の組合せ）が挙げられ得るが、それらに限定はされない。
一例において、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．における発現のためのベクターは、組換え型のＰＯＩまたはＡＰＯＩをコードする核酸配列とインフレームで融合されたシグナルペプチド（α接合因子）と作動可能に連結されたＡＯＸ１プロモーター、および組換え型のＰＯＩまたはＡＰＯＩをコードする核酸配列のすぐ下流にあるターミネーターエレメント（ＡＯＸ１ターミネーター）を含み得る。
別の例において、ＤＡＳ１プロモーターを含むベクターが、組換え型のＰＯＩまたはＡＰＯＩをコードする核酸配列とインフレームで融合されたシグナルペプチド（α接合因子）、および組換え型のＰＯＩまたはＡＰＯＩすぐ下流にあるターミネーターエレメント（ＡＯＸ１ターミネーター）と、作動可能に連結される。
本明細書において開示される組換えタンパク質は、１つまたは複数の宿主細胞から分泌され得る。一部の実施形態において、組換え型のＰＯＩが、その宿主細胞から分泌される。その分泌される組換え型のＰＯＩは、遠心分離、分画、濾過、アフィニティ精製、ならびにタンパク質を細胞、液体培地成分および固体培地成分ならびに他の細胞生成物および副産物から分離するための他の方法などの方法によって、単離および精製され得る。一部の実施形態において、組換え型のＰＯＩがＰｉｃｈｉａ Ｓｐ．において産生され、その宿主細胞から培養培地中へと分泌される。その後、その分泌された組換え型のＰＯＩは、さらなる使用のために他の培地成分から分離される。
一部の場合において、ＰＯＩおよび／またはＡＰＯＩの遺伝子配列を含む複数のベクターが、１つまたは複数の宿主細胞にトランスフェクトされ得る。宿主細胞は、そのＰＯＩおよび／またはＡＰＯＩをコードする遺伝子の１つよりも多いコピーを含み得る。単一の宿主細胞が、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー、コピー、８コピー、９コピー、１０コピー、１１コピー、１２コピー、１３コピー、１４コピー、１５コピー、１６コピー、１７コピー、１８コピー、１９コピーまたは２０コピーのそのＰＯＩおよび／またはＡＰＯＩを含み得る。単一の宿主細胞は、そのＰＯＩおよび／またはＡＰＯＩの発現のための１つもしくは複数のベクターを含み得る。単一の宿主細胞は、そのＰＯＩおよび／またはＡＰＯＩの発現のために２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のベクターを含み得る。その宿主細胞中の各ベクターは、同じプロモーターを使用して、ＰＯＩの発現を駆動し得る。あるいは、別々のプロモーターが、ＰＯＩ発現のために別々のベクター中で使用され得る。
組換え型のＰＯＩまたはＡＰＯＩは、１つまたは複数の宿主細胞において組換え発現され得る。本明細書において使用される場合、「宿主」または「宿主細胞」とは、望まれる生成物を産生するように選択または遺伝子改変された、任意のタンパク質産生宿主を本明細書では示す。例示的な宿主としては、真菌（例えば、糸状菌）、ならびに細菌、酵母、植物、昆虫、および哺乳動物の細胞が挙げられる。宿主細胞は、米国食品医薬品局によって安全であると一般的に見なされているとして承認されている生物であり得る。
宿主細胞は、１つまたは複数の発現カセットを含むように形質転換され得る。例として、宿主細胞は、１つの発現カセット、２つの発現カセット、３つの発現カセットまたはそれよりも多い発現カセットを発現するように形質転換され得る。一例において、宿主細胞は、第１のＰＯＩをコードする第１の発現カセットを発現し、第２のＰＯＩをコードする第２の発現カセットを発現するように、形質転換される。
アミノ酸配列の文脈において本明細書において使用される用語「配列同一性」は、候補配列と選択された配列とをアラインメントし、かつ（必要な場合には）最大配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後、かつその配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しないで、その選択された配列中のアミノ酸残基と同一なその候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とするアラインメントは、当業者の範囲内にある種々の様式で、例えば、公に利用可能なコンピュータソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア、ＢＬＡＳＴ－２ソフトウェア、ＡＬＩＧＮソフトウェア、ＡＬＩＧＮ－２ソフトウェアまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア）を使用して、達成され得る。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメータ（比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定し得る。

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以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示することを目的として提供され、いかなる様式でも本発明を限定するとは意図されない。本実施例は、本明細書において記載される方法と一緒になって、好ましい実施形態を目下のところ表し、例示的であり、本発明の範囲に対する限定としては意図されない。特許請求の範囲の範囲によって定義される発明の趣旨の範囲内に含まれる、本実施例における変更および他の使用を、当業者は想到する。
実施例１：発現構築物、形質転換、タンパク質精製および処理
構築物を、β－マンノシルトランスフェラーゼのＢＭＴ１遺伝子およびＢＭＴ２遺伝子（それぞれ、ＸＰ＿００２４９３８８２．１およびＸＰ＿００２４９３８８３．１）を破壊するように設計し得る。さらに、発現構築物を、１種または複数種の目的のタンパク質（例えば、栄養性タンパク質）を発現するように設計し得る。それらの構築物を宿主細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）に形質転換し得る。
一実施例において、マンノシダーゼを発現する別の発現構築物を、設計し得、その宿主細胞に形質転換し得る。この実施例においてＢＭＴ１およびＢＭＴ２の破壊は、より小さい菌体外多糖の産生をもたらす。さらに、そのマンノシダーゼ産生は、その菌体外多糖を、その宿主細胞により炭素源として使用され得るマンノースへとさらに加水分解すると予期される。その宿主細胞は減少したレベルの菌体外多糖を産生し、それにより、組換え産生された栄養性タンパク質から分離されるべき不純物を減少させると、予期される。
その栄養性タンパク質はその宿主細胞から分泌され得、従来の精製方法を使用して精製され得る。
実施例２：発現構築物、形質転換、タンパク質精製および処理
構築物を、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株中のβ－マンノシルトランスフェラーゼのＢＭＴ１遺伝子およびＢＭＴ２遺伝子（それぞれ、ＸＰ＿００２４９３８８２．１およびＸＰ＿００２４９３８８３．１）を破壊するように設計した。ノックアウトを、酵母における標準的な相同組換え（ＨＲ）方法によって実施した。要約すると、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を、そのＧＯＩを囲むゲノム領域と相同性を有する線状化プラスミドを使用することによって欠失させ、それを、標準的なエレクトロポレーション技術によって酵母に形質転換した。その天然ＨＲ機構が、そのＧＯＩをその線状化プラスミドで置き換える。抗生物質耐性を有するそのプラスミドを、Ｃｒｅ／ｌｏｘリコンビナーゼシステムを使用して最終的に除去して、そのＧＯＩが最初に見出された場所に小さい挿入傷跡（small insertion scar）のみを残し得る。
この実施例において、ＢＭＴ１およびＢＭＴ２の破壊は、より小さい菌体外多糖の産生をもたらす。ゲル電気泳動およびカチオン性色素であるアルシアンブルー（これは、ホスホジエステル結合によってホスホ－マンナン部分に結合する）を使用して、そのＢＭＴ１遺伝子およびＢＭＴ２遺伝子（ＡＴ２５０＿ＧＱ６８０４７８１およびＡＴ２５０＿ＧＱ６８０４７８２）を破壊することによりＥＰＳサイズの顕著なシフトを生じることが図１に示され、これは、そのＥＰＳ副産物がマンナン多糖の形態であることを強く示唆する。
Ｐｉｃｈｉａ種がマンノースを単一炭素源として成長し得ることもまた図２に示され、これは、産生株が、破壊されるＥＰＳ／マンナンから炭素を回収可能であることを示す。
実施例３：発現構築物、形質転換、タンパク質精製および処理
糖タンパク質（オボムコイド）と転写因子（ＨＡＣ１）とを発現するように以前に形質転換された数種のＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、培養した。その培養由来の上清は、菌体外多糖（ＥＰＳ）を含んだ。そのＥＰＳをフィルター精製し、分析した。さらに、株１および株２を、マンノシダーゼ発現構築物（ｐＰＭＰ２０ ＳＤＢＴ２６２３－２６３１対ｐＴＫＬ３ ＳＤＢＴ２６２３）で形質転換した。これらの株によって産生されたＥＰＳを分析した。図３に示されるとおり、そのＥＰＳ副産物のサイズは、株を精製ＥＰＳとともにインキュベートする場合と変わらない。その株において見出されるＳｅｄ１提示構築物は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＰＭＰ２０プロモーター、およびＴＤＨ３ターミネーターを使用する。
また、それらの細胞をそれら自体の培養上清とともにインキュベートして、基質を使用する時間を増加させることがその多糖副産物の加水分解を可能にするかどうかを調べた。図４は、発現されるマンノシダーゼ（ｐＰＭＰ２０ ＳＤＢＴ２６２３－２６３１とｐＴＫＬ３ ＳＤＢＴ２６２３との比較）に関わらず、野生型マンナン（これは、高度に分枝型であり、マンノースの末端βアノマーで終端する）に対してそれらの酵素の活性が存在しないことを示す。
それらのマンノシダーゼは株１細胞において産生された「野生型」ＥＰＳに対しても精製された生成物に対して作用できなかったが、図５は、それらの酵素をマンノシルトランスフェラーゼ欠失と組み合わせた場合、それらの酵素が実際にＥＰＳを基質として使用することを示す。株２は、末端βマンノースアノマーを生成することに関与する遺伝子（ＢＭＴ１およびＢＭＴ２、それぞれＧＱ６８０４７８２およびＧＱ６８０４７８１）、ならびにα－１，２分枝酵素（ＭＮＮ２ファミリータンパク質、ＧＱ６８０２１６６）を生成することに関与する遺伝子を有しており、これは、それが産生するＥＰＳの溶出プロファイルの右へのシフトをすでに生じる。この欠失変異体を種々のマンノシダーゼ構築物の発現と組み合わせた場合、これは、そのＥＰＳ副産物の溶出時間の右へのシフトを生じ、このことは、それらの酵素が、天然マンナンマンノシルトランスフェラーゼの欠失後のマンナンの単純化された構造に対して活性を提示することを示唆する。
実施例４：マンノシダーゼの表面提示
マンナンを、ゲル電気泳動および質量分析法を使用して、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を分泌するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株由来の上清において見出された多糖不純物（ＥＰＳ（細胞外多糖）としても知られる）として同定した。マンナンは、ゴルジ装置における多くのマンノシルトランスフェラーゼの逐次作用によって生成される。そのコアグリカン部分がアスパラギン残基に結合した後に、マンナンポリメラーゼＩ（Ｍ－ｐｏｌ Ｉ）が、Ｍｎｎ９触媒サブユニットを使用してそのコア構造を約１０個のα－１，６マンノース単位伸長する。次に、Ｍ－ｐｏｌ ＩＩ複合体（触媒サブユニットＭｎｎ１０およびＭｎｎ１１）がさらに約５０個～約１００個のα－１，６マンノース単位分伸長し、このことは、α－１，６結合型糖から構成された長い直鎖状マンナン骨格を生成する。この直鎖状マンナン骨格は、α－１，２－マンノース分岐点点およびホスホ－マンノース分岐点で広範囲に修飾される。これらの修飾は、ＭＮＮファミリータンパク質およびＫＴＲファミリータンパク質のメンバー（これらのうち、合計１０種がＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて公知である）によって実行される。最後に、一部の種の酵母（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる）は、末端β－１，２結合型マンノース単位を生成してそのマンナン分子に（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅマンナンにおいて見出される末端α－１，３－マンノース単位とは対照的に）「キャップ」をし、これらの反応は、ＢＭＴファミリーのマンノシルトランスフェラーゼ（これらのファミリーメンバーのうちの４種がＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて見出され、そのうちの２種（ＢＭＴ１／２）は触媒的に活性であると決定されている）によって実行される。実施例２において議論したマンノシルトランスフェラーゼの同定の後に、それらのマンノシルトランスフェラーゼを欠失させて、マンナン／ＥＰＳ分子のサイズおよび複雑度を減少させた。図６におけるクロマトグラムに示されるとおり、複数の天然マンノシルトランスフェラーゼの欠失は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して溶出したＥＰＳの保持時間を実際に増加させた（その分子のサイズ減少を示す）。株３を、５種の天然マンノシルトランスフェラーゼ（ＢＭＴ１（配列番号１２）、ＢＭＴ２（配列番号１３）、ＭＮＮ２（配列番号１）、ＭＮＮＦ１（配列番号２）、ＭＮＮＦ２（配列番号３））の逐次欠失によって株１から構築し、これは、８分と９分との間のＥＰＳピークにおいて顕著な右へのシフトを引き起こした。
この株をまた、一般的なヒト腸内細菌であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎにより通常発現されるマンナン加水分解酵素（マンナナーゼ／マンノシダーゼ）を発現するように、改変した。ほとんどの酵母はそれ自体の細胞壁材料を破壊する酵素を産生するとは知られていないが、Ｂ．ｔｈｅｔａは、ヒトの腸において酵母細胞壁材料からマンノースの形態で炭素を収集することが示されている。表面提示アプローチ（図７）を使用して、本実施例は、これらの酵素が使用して、（選択した天然マンノシルトランスフェラーゼの欠失後に）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにより産生されるＥＰＳ分子を破壊し得ることを示し、これは、ＳＥＣ分析後のＥＰＳの溶出プロファイルのシフトによって再び証明された（図８）。
いくつかのマンノシルトランスフェラーゼ欠失が、Ｂ．ｔｈｅｔａマンノシダーゼがＥＰＳを切断のための基質として認識するために必要とされる。図９において、株１および株２（株１＋３種の欠失したマンノシルトランスフェラーゼ）が全く同じマンノシダーゼ構築物を発現する場合に、株２＋マンノシダーゼ構造のみが、その表面に提示される酵素が基質として使用し得るＥＰＳを産生することが、示されている。天然マンノシルトランスフェラーゼの破壊が、Ｂ．ｔｈｅｔａ酵素がマンナンを切断のための基質として認識するために重要である。欠失とマンノシダーゼとを有する株のみが、そのＥＰＳ溶出プロファイルにおいて右へのシフトを誘発する。

Claims (88)

  1. 目的の異種タンパク質を産生するための組換え宿主細胞であって、該宿主細胞は酵母であり、該宿主細胞はβ－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように操作されており、該過小発現は、過小発現を達成するための遺伝子操作の前の該宿主細胞との比較であり、該宿主細胞は目的の異種タンパク質および異種マンノシダーゼを発現するように操作されている、組換え宿主細胞。
  2. 過小発現が、
    前記宿主細胞のゲノムから前記マンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードするポリヌクレオチドをノックアウトすること、
    前記宿主細胞において前記マンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードするポリヌクレオチドを破壊すること、
    前記マンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードする前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを破壊すること、
    前記マンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログをコードする前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを、より低いプロモーター活性を有する別のプロモーターで置き換えること、あるいは
    前記マンノシルトランスフェラーゼタンパク質またはそのホモログの発現制御配列を破壊すること
    を各マンノシルトランスフェラーゼタンパク質について独立的に行う事によって達成され、前記機能的ホモログがマンノシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも７０％配列同一性を有する、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
  3. Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項１または請求項２に記載の組換え宿主細胞。
  4. 前記ＢＭＴ１タンパク質が、配列番号１２と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  5. 前記ＢＭＴ２タンパク質が、配列番号１３と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  6. ＢＭＴ１を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ないＢＭＴ１を発現するように操作されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  7. ＢＭＴ１を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、または少なくとも９５％少ないＢＭＴ１を発現するように操作されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  8. ＢＭＴ１をノックアウトするように操作されており、該ノックアウトは前記組換え宿主細胞においてＢＭＴ１の活性を無くす、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  9. ＢＭＴ２を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ないＢＭＴ２を発現するように操作されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  10. ＢＭＴ２を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、または少なくとも９５％少ないＢＭＴ２を発現するように操作されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  11. ＢＭＴ２をノックアウトするように操作されており、該ノックアウトは前記組換え宿主細胞においてＢＭＴ２の活性を無くす、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  12. ＢＭＴ１およびＢＭＴ２を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して減少したサイズの菌体外多糖を産生する、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  13. α－１，２－マンノシルトランスフェラーゼＭＮＮ２を過小発現するようにさらに操作されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  14. 前記ＭＮＮ２タンパク質が、配列番号１のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の組換え宿主細胞。
  15. ＭＮＮ２を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、または少なくとも９５％少ないＭＮＮ２を発現するように操作されている、請求項１３に記載の組換え宿主細胞。
  16. ＭＮＮＦ１を過小発現するようにさらに操作されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  17. 前記ＭＮＮＦ１タンパク質が、配列番号２のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の組換え宿主細胞。
  18. ＭＮＮＦ１を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、または少なくとも９５％少ないＭＮＮＦ１を発現するように操作されている、請求項１６に記載の組換え宿主細胞。
  19. ＭＮＮＦ２を過小発現するようにさらに操作されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  20. 前記ＭＮＮＦ２タンパク質が、配列番号３のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の組換え宿主細胞。
  21. ＭＮＮＦ２を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、または少なくとも９５％少ないＭＮＮＦ２を発現するように操作されている、請求項１９に記載の組換え宿主細胞。
  22. ＢＭＴ１およびＢＭＴ２に加えて１種または複数種の酵素を過小発現するようにさらに操作されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  23. 前記１種または複数種の酵素が、配列番号４～１１、１４～１５、および７２～８５のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の組換え宿主細胞。
  24. １種または複数種の酵素を、該１種または複数種の酵素を過小発現するように操作されてはいない宿主細胞と比較して少なくとも１０％少なく、少なくとも１５％少なく、少なくとも２０％少なく、少なくとも３０％少なく、少なくとも４０％少なく、少なくとも５０％少なく、少なくとも６０％少なく、少なくとも７０％少なく、少なくとも８０％少なく、少なくとも９０％少なく、または少なくとも９５％少なく発現するように操作されている、請求項２２に記載の組換え宿主細胞。
  25. 前記組換え宿主細胞とは異なる種に由来するマンノシダーゼを組換え発現する、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  26. 前記マンノシダーゼが前記組換え宿主細胞とは異なる属に由来する、請求項２５に記載の組換え宿主細胞。
  27. 前記マンノシダーゼが、配列番号４１～５６のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２５または請求項２６に記載の組換え宿主細胞。
  28. 前記マンノシダーゼが前記組換え宿主細胞の表面に発現される、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  29. 請求項２５～２８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞であって、マンノシダーゼの触媒ドメインとグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質のアンカードメインとを含む表面に提示される融合タンパク質を発現し、
    該アンカードメインは少なくとも約２００アミノ酸を含み、かつ／あるいは該アンカードメイン中の残基の少なくとも約３０％はセリンまたはスレオニンである、
    組換え宿主細胞。
  30. 前記アンカードメインが少なくとも約２２５アミノ酸、少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約２７５アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３２５アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約３７５アミノ酸、または少なくとも約４００アミノ酸を含む、請求項２９に記載の組換え宿主細胞。
  31. 前記アンカードメイン中の残基の少なくとも約３５％がセリンまたはスレオニンであるか、前記アンカードメイン中の残基の少なくとも約４０％がセリンまたはスレオニンであるか、前記アンカードメイン中の残基の少なくとも約４５％がセリンまたはスレオニンであるか、あるいは前記アンカードメイン中の残基の少なくとも約５０％がセリンまたはスレオニンである、請求項２９または請求項３０に記載の組換え宿主細胞。
  32. 前記アンカードメイン中の前記セリンまたはスレオニンがＯ－マンノシル化され得る、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  33. 少なくとも約３２５アミノ酸を含むアンカードメインを有する融合タンパク質が、約３００アミノ酸未満を含むアンカードメインを有する融合タンパク質と比較して大きな酵素活性を提供する、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  34. 少なくとも約３００アミノ酸を含むアンカードメインを有する融合タンパク質が、約２５０アミノ酸未満を含むアンカードメインを有する融合タンパク質と比較して大きな酵素活性を提供する、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  35. 前記融合タンパク質がＧＰＩアンカー型タンパク質の前記アンカードメインを含む、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  36. 前記融合タンパク質が、前記ＧＰＩアンカー型タンパク質を該ＧＰＩアンカー型タンパク質の天然シグナルペプチドなしで含む、請求項２９～３５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  37. 前記ＧＰＩアンカー型タンパク質が前記組換え宿主細胞に固有ではない、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  38. 前記ＧＰＩアンカー型タンパク質がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞によって天然で発現され、前記組換え宿主細胞がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞ではない、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  39. 前記ＧＰＩアンカー型タンパク質がＴｉｒ４、Ｄａｎ１、Ｄａｎ４、Ｓａｇ１、Ｆｉｇ２、およびＳｅｄ１から選択される、請求項２９～３８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  40. 前記ＧＰＩアンカー型タンパク質の前記アンカードメインが、配列番号５７～配列番号７１のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項２９～３９のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  41. 前記ＧＰＩアンカー型タンパク質の前記アンカードメインが配列番号５７～配列番号７１のうちの１つのアミノ酸配列を含む、請求項２９～４０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  42. 前記融合タンパク質を発現するゲノム改変を含み、かつ／または前記融合タンパク質を発現する染色体外改変を含む、請求項２９～４１のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  43. 前記融合タンパク質が、前記マンノシダーゼの一部を該マンノシダーゼの触媒ドメインに加えて含む、請求項２９～４２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  44. 前記融合タンパク質が前記マンノシダーゼの実質的に全アミノ酸配列を含む、請求項２９～４３のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  45. 前記融合タンパク質において、前記触媒ドメインが前記アンカードメインのＮ末端側にある、請求項２９～４４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  46. 前記融合タンパク質が前記触媒ドメインと前記アンカードメインとの間にリンカーを含む、請求項２９～４５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  47. 前記融合タンパク質が、配列番号３１６～３２１のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するリンカーを含む、請求項２９～４６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  48. 翻訳されると、前記融合タンパク質がシグナルペプチドおよび／または分泌シグナルを含む、請求項２９～４７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  49. ２種以上の融合タンパク質、３種以上の融合タンパク質、または４種の融合タンパク質を含む、請求項２９～４８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  50. そのＡＯＸ１遺伝子および／またはそのＡＯＸ２遺伝子中に変異を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  51. 目的の分泌型異種タンパク質を過剰発現するゲノム改変を含み、かつ／または目的の分泌型タンパク質を過剰発現する染色体外改変を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  52. 前記目的の分泌型タンパク質が動物タンパク質である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  53. 前記動物タンパク質が卵タンパク質である、請求項５２に記載の組換え宿主細胞。
  54. 前記卵タンパク質がオボアルブミン、オボムコイド、リゾチーム、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、α－オボムチン、β－オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、フラボプロテイン、オボマクログロブリン、オボスタチン、シスタチン、アビジン、オボアルブミン関連タンパク質Ｘ、およびオボアルブミン関連タンパク質Ｙからなる群より選択される、請求項５３に記載の組換え宿主細胞。
  55. 前記分泌型組換えタンパク質を過剰発現する前記ゲノム改変および／または前記染色体外改変が誘導性プロモーターを含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  56. 前記誘導性プロモーターがＡＯＸ１プロモーター、ＤＡＫ２プロモーター、ＰＥＸ１１プロモーター、ＦＬＤ１プロモーター、ＦＧＨ１プロモーター、ＤＡＳ１プロモーター、ＤＡＳ２プロモーター、ＣＡＴ１プロモーター、ＭＤＨ３プロモーター、ＨＡＣ１プロモーター、ＢｉＰプロモーター、ＲＡＤ３０プロモーター、ＲＶＳ１６１－２プロモーター、ＭＰＰ１０プロモーター、ＴＨＰ３プロモーター、ＴＬＲプロモーター、ＧＢＰ２プロモーター、ＰＭＰ２０プロモーター、ＳＨＢ１７プロモーター、ＰＥＸ８プロモーター、ＰＥＸ４プロモーター、またはＴＫＬ３プロモーターである、請求項５５に記載の組換え宿主細胞。
  57. 分泌型組換えタンパク質を過剰発現する前記ゲノム改変および／または前記染色体外改変が、ＡＯＸ１ターミネーター、ＴＤＨ３ターミネーター、ＭＯＸターミネーター、ＲＰＳ２５Ａターミネーター、またはＲＰＬ２Ａターミネーターを含む、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  58. 分泌型組換えタンパク質を過剰発現する前記ゲノム改変および／または前記染色体外改変が、シグナルペプチドおよび／または分泌シグナルをコードする、請求項５２～５７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  59. 分泌型組換えタンパク質を過剰発現する前記ゲノム改変および／または前記染色体外改変が、前記組換え宿主細胞の前記種に対して最適化されているコドンを含む、請求項５２～５８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  60. 前記分泌型組換えタンパク質が、前記細胞から分泌されるように設計されており、かつ／または前記細胞から分泌され得る、請求項５２～５９のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  61. 追加の前記ゲノム改変が、前記組換え宿主細胞により発現される天然細胞壁タンパク質の数を減らし、それにより前記表面に提示される融合タンパク質の局在化のための追加の空間が可能になる、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  62. ｐ２４複合体に関連するタンパク質を過剰発現するさらなるゲノム改変を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  63. 前記ｐ２４複合体に関連する２種以上のタンパク質を過剰発現するものを含むさらなるゲノム改変を含む、請求項６２に記載の組換え宿主細胞。
  64. 前記ｐ２４複合体に関連する前記タンパク質がＥｒｐ１、Ｅｒｐ２、Ｅｒｐ３、Ｅｒｐ５、Ｅｍｐ２４、およびＥｒｖ２５から選択される、請求項６２または請求項６３に記載の組換え宿主細胞。
  65. 前記ｐ２４複合体に関連する前記タンパク質が配列番号８６～配列番号９１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６２～６４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  66. 目的の異種タンパク質を発現させるための方法であって、
    請求項１～６５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を取得する工程、および
    該目的の異種タンパク質の発現を可能にする条件下で該組換え宿主細胞を培養する工程
    を含む、方法。
  67. 請求項６６に記載の方法にしたがって発現された、単離された目的の異種タンパク質。
  68. 食品製品中、飼料製品中、または化粧品製品中などの栄養補給物、栄養補助食品、もしくは消化補助物質の製造における、請求項６７に記載の単離された目的の異種タンパク質の使用。
  69. 菌体外多糖のレベルが低下している目的の異種タンパク質を発現させるための方法であって、
    請求項１～６５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を取得する工程、および
    該目的の異種タンパク質の発現を可能にする条件下で該組換え宿主細胞を培養する工程
    を含む、方法。
  70. 請求項６９に記載の方法にしたがって発現された、単離された目的の異種タンパク質。
  71. 食品製品中、飼料製品中、または化粧品製品中などの栄養補給物、栄養補助食品、もしくは消化補助物質の製造における、請求項７０に記載の単離された目的の異種タンパク質の使用。
  72. 菌体外多糖のレベルが低下している目的の異種タンパク質を発現させるための方法であって、
    宿主細胞を取得する工程であって、該宿主細胞は酵母であり、該宿主細胞はβ－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように操作されており、該過小発現は遺伝子操作前の該宿主細胞との比較であり、該宿主細胞は目的の異種タンパク質および異種マンノシダーゼを発現するように操作されている、工程；ならびに
    該目的の異種タンパク質の発現を可能にする条件下で該組換え宿主細胞を培養する工程
    を含む、方法。
  73. 前記ＢＭＴ１タンパク質が配列番号１２と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、前記ＢＭＴ２タンパク質が配列番号１３と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記組換え宿主細胞が、配列番号１～１１、１４～１５、および７２～８５のうちの１つのアミノ酸配列を含む１種または複数種の酵素を過小発現するようにさらに操作されている、請求項７２または請求項７３に記載の方法。
  75. 前記組換え宿主細胞が、該組換え宿主細胞とは異なる種に由来するマンノシダーゼを組換え発現する、請求項７２～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記マンノシダーゼが配列番号４１～５６のうちの１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記マンノシダーゼが前記組換え宿主細胞の表面に発現される、請求項７５または請求項７６に記載の方法。
  78. 請求項７２～７７のいずれか一項に記載の方法であって、前記組換え宿主細胞は、マンノシダーゼの触媒ドメインとグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質のアンカードメインとを含む表面に提示される融合タンパク質を発現し、
    該アンカードメインは少なくとも約２００アミノ酸を含み、かつ／または該アンカードメイン中の残基の少なくとも約３０％はセリンまたはスレオニンである、
    方法。
  79. 前記目的の異種タンパク質が前記組換え宿主細胞から分泌される、請求項７２～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記分泌された目的の異種タンパク質が動物タンパク質である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記動物タンパク質が卵タンパク質である、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記卵タンパク質がオボアルブミン、オボムコイド、リゾチーム、オボグロブリンＧ２、オボグロブリンＧ３、α－オボムチン、β－オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター、オボグリコプロテイン、フラボプロテイン、オボマクログロブリン、オボスタチン、シスタチン、アビジン、オボアルブミン関連タンパク質Ｘ、およびオボアルブミン関連タンパク質Ｙからなる群より選択される、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記組換え宿主細胞が、ｐ２４複合体に関連するタンパク質を過剰発現するさらなるゲノム改変を含む、請求項７２～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 請求項７２～８３のいずれか一項に記載の方法にしたがって発現された、単離された目的の異種タンパク質。
  85. 食品製品中、飼料製品中、または化粧品製品中などの栄養補給物、栄養補助食品、もしくは消化補助物質の製造における、請求項８４に記載の単離された目的の異種タンパク質の使用。
  86. 菌体外多糖のレベルが低下している目的の異種タンパク質を製造するための組換え宿主細胞を製造するための方法であって、
    目的の異種タンパク質および／または異種マンノシダーゼを発現するように操作されている酵母細胞を取得する工程；ならびに
    β－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように該酵母細胞を改変する工程
    を含む、方法。
    菌体外多糖のレベルが低下している目的の異種タンパク質を製造するための組換え宿主細胞を製造するための方法であって、
    β－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように操作され、異種マンノシダーゼを発現するように操作されている、酵母細胞を取得する工程；ならびに
    目的の異種タンパク質を発現するように該酵母細胞を改変する工程
    を含む、方法。
  87. 菌体外多糖のレベルが低下している目的の異種タンパク質を製造するための組換え宿主細胞を製造するための方法であって、
    β－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように操作され、目的の異種タンパク質を発現するように操作された、酵母細胞を取得する工程；ならびに
    異種マンノシダーゼを発現するように該酵母細胞を改変する工程
    を含む、方法。
  88. 菌体外多糖のレベルが低下している目的の異種タンパク質を製造するための組換え宿主細胞を製造するための方法であって、
    酵母細胞を取得する工程
    β－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）という２種のマンノシルトランスフェラーゼ、またはそれらの機能的ホモログを過小発現するように操作され、目的の異種タンパク質を発現するように操作された、該酵母細胞を改変する工程；
    目的の異種タンパク質を発現するように該酵母細胞を改変する工程；ならびに
    異種マンノシダーゼを発現するように該酵母細胞を改変する工程
    を含む、方法。
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