JP2024524499A - 線維性疾患の処置または予防におけるテルペノイドの使用 - Google Patents

線維性疾患の処置または予防におけるテルペノイドの使用 Download PDF

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Abstract

Figure 2024524499000001
本発明は、線維性状態を予防または処置する方法であって、それを必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、ここで、前記組成物は、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorate)またはブゾロイバナ(anisomeles indica)から抽出されたトリテルペンを含む、方法。

Description

線維増殖性疾患は、多くの人にとって厄介な問題であり、肺線維症、進行性腎臓疾患、肝臓硬変、アテローム性動脈硬化症および前立腺肥大症などの多くの持続性炎症性疾患の典型的な病的続発症である。
線維増殖性疾患は、ますます多くの人にとって厄介な問題であり、肺線維症、進行性腎臓疾患、肝臓硬変、アテローム性動脈硬化症および前立腺肥大などの多くの持続性炎症性疾患の一般的な病理学的続発症である。
急性の腎臓損傷後における腎修復障害は線維症を誘導し、これは、最終的には慢性腎疾患を発症させることがある。腎臓損傷は、多能性前駆細胞を活性化することで組織を修復する。しかし、損傷が持続するにつれて、これら多能性前駆細胞は機能不全となり、線維性修復を誘導し、結果、腎線維症を引き起こす。腎線維症の発生機序は進行性であり、最終的には透析や腎移植を必要とする壊滅的な障害である末期腎不全に至る。
非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、慢性肝疾患の代表的な疾患であり、アンメットニーズの高い疾患である。NAFLDの進行性バリアントである非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、線維症、硬変、肝細胞癌につながることある。NAFLDとNASHは、特に世界的な糖尿病と肥満の流行の増加により、医学界全般の関心の的となっている疾患である。異常アミノトランスフェラーゼレベルの患者の臨床評価では、特に肥満や糖尿病の場合は、非アルコール性脂肪肝とそのスペクトルを考慮すべきである。単純なNAFLDの予後は一般に良性であるが、線維症、肝細胞の風船様変化(ballooning)、炎症およびマロリー小体があれば硬変に進行する危険性がある。
自己免疫性肝炎(AIH)は明確な病因のない慢性肝疾患であるが、肝細胞炎症を特徴とすることがある。重度のAIHは肝硬変、肝細胞癌に進行し、死に至ることもある。硬変は、観察期間にもよるが、治療された自己免疫性肝炎患者の40％に発症する。現在のレジメンの抗炎症作用と免疫抑制作用を補う抗線維化療法が出現しつつあり、これらのレジメンは自己免疫性肝炎の治療目的を肝線維症の予防、安定化、逆転に再指向させることが期待される。
心血管疾患の発症の主な原因の1つであるアテローム性動脈硬化症は、血管線維症と関連している。血管線維症には、血管中膜における細胞外マトリックス(ECM)タンパク質、特にコラーゲンおよびフィブロネクチンの蓄積が関与し、構造リモデリングおよび瘢痕形成に寄与する。血管壁のエラスチンの欠乏または過剰なコラーゲンは、血管の線維化と硬さの増加につながる。
良性前立腺肥大症(benign prostatic hyperplasia)では、前立腺におけるコラーゲン線維の沈着は、壊れた筋線維を置き換えるためのものですが、その結果、筋肉組織の硬直と弱化、および腺管内での前立腺液の沈着が生じる。前立腺線維症は、高齢男性における膀胱出口閉塞の発症において中心的な役割を果たしている。
薬用真菌類であるベニクスノキタケ(Antrodia camphorata：アントロディア カンフォラタ)(AC)は、よく知られている中国の民間薬であり、多くの生物学的活性、特にインビトロでの癌細胞およびインビボでの動物モデルにおける抗腫瘍効果を有することが知られている。その多様な生理活性化合物から、効果的な代替植物治療薬、あるいは癌治療や免疫関連疾患のアジュバントとして考えられている。現在までに、高分子(核酸、タンパク質および多糖類)、小分子(ベンゼノイド、リグナン、ベンゾキノンおよびマレイン/コハク酸誘導体)、テルペノイド(ラノスタントリテルペン、エルゴスタントリテルペン、ジテルペン、モノテルペンおよびステロイド)、ヌクレオチド(核酸塩基およびヌクレオシド)、脂肪酸および脂肪酸エステルを含む、合計225種類の化合物が単離、同定、構造解明されている。
インビトロおよびインビボでの累積的な研究により、抗糖尿病効果、抗高脂血症効果、抗高血圧降下、抗炎症効果、抗酸化効果、抗菌効果、心血管疾患予防効果、免疫調節効果、肝保護効果および神経保護効果が明らかにされている。しかし、線維症の処置におけるベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)およびその成分の有効性は評価されていない。
一般に「インディアン・キャットミント(Indian Catmint)」として知られているブゾロイバナ(anisomeles indica)は、医薬として活性な化合物の供給源であり、様々な薬理効果を有している。この植物は伝統的に、鎮痛剤、抗炎症剤として、および皮膚問題に使用されている。医薬的には、抗酸化活性、抗菌活性、抗HIV活性、抗ヘリコバクター・ピロリ活性、抗癌活性など、様々な薬理活性が証明されている。これはまた、慢性リウマチにも使用される。さらなる研究により、主にトリテルペン、β-シトステロール、スチグマステロール、フラボン、アピゲニン、オバトジオライドなど、様々な植物化学成分の存在が明らかになった。
図1は、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物からのアントシン K、デヒドロスルフレン酸/スルフレン酸、ベルシスポン酸Dおよびデヒドロエブリコ酸の分離を示す。
図2A～2C AKIマウスにおけるシスプラチン誘導性腎障害に対するベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物の保護効果。ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物の効果を分析するために、マウスにシスプラチンを初回投与後3週間から7日間毎日投与し、4週目に犠牲にした。腎臓の形態学的変化(A)。血中尿素窒素(BUN)レベル(B)。血清クレアチニン(CRE)レベル(C)。データは平均値±S.E.M.で示した(n=5)。###は対照群と比較してp＜0.001を示す。シスプラチン群と比較して、**p＜0.01および***p＜0.001。
図3 AKIマウスにおけるシスプラチン誘導性腎障害に対するベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物の保護効果。ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物の効果を分析するために、マウスにシスプラチンを初回投与後3週間から7日間毎日投与し、4週目に犠牲にした。腎臓はH&Eで染色した。シスプラチン投与後、各群の腎臓を組織学的評価のために準備する。腎臓の代表的な組織切片をH&E染色し、倍率は400倍とした。データは平均値±S.E.M.(n=5)で示した。###は対照群と比較してp＜0.001を示す。シスプラチン群と比較して、**p＜0.01、***p＜0.001。管細胞の壊死を矢印で示す；バーは50μmを示す。
図4A～4E ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物が血清中の(A)TNF-α、(B)IL-1β、(C)IL-6、(D)TGF-βおよび(E)アルブミンを調節した。TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-βおよびアルブミンの血清レベルは、市販のELISAキットで測定した。データは平均値±S.E.M.で示した(n=5)。###は対照群の試料と比較してp＜0.001を示す。シスプラチン単独群と比較して、**p＜0.01および***p＜0.001。
図5A～5B 腎臓におけるシスプラチン誘導性TWEAK、α-SMA、P53およびP21シグナル発現に対するARH005-EA(A)およびARH(B)の効果。腎臓ホモジネート中のTWEAK、α-SMA、P53およびP21タンパク質発現のタンパク質レベルは、シスプラチンチャレンジ後のウェスタンブロット分析により評価した。
図6は、CCl4誘導性線維症モデルの過程を示す。
図7A～7Cはそれぞれ、(A)デルタ重量、(B)肝臓重量、および(C)肝臓／体重比を示す。
図8A～8Cはそれぞれ、CCl4誘導性肝臓損傷後のラットにおける(A)AST、(B)ALT、および(C)AST/ALTの血清レベルを示す。
図9A～9Eは、肝臓の(A)炎症、(B)空胞化、(C)壊死、(D)線維化、(E)組織学的総スコアを示す。
図10 肝臓の代表的な組織切片をH&E染色したもの。
図11は、Con A(コンカナバリンA)誘導性急性肝炎モデルの経過を示す。
図12A～12Cは、GOT、GPTおよび体重に対するオバトジオリド(AR100-DS1)のプロセスを示す。(A)15mg/kgのCon Aチャレンジ後24時間の血清GOTおよび(B)血清GPT。(C)15mg/kgのCon Aチャレンジ前後の体重。データは平均値±SEMで示した(n=9)。t検定によりVehと比較して*p＜0.05。Veh、ビヒクル；Dex、デキサメタゾン。
図13 肝臓損傷に対するオバトジオリド(AR100-DS1)の効果。(A)ナイーブ(Naive)、(B)15mg/kgのCon A(Veh)、(C)2019-0321-1および(D)デキサメタゾンならびに(E)壊死の組織病理学的スコア。データは平均値±SEMで示した(n=9)。スチューデントのt検定によりVehと比較して***p＜0.001。Vehはビヒクル、Dexはデキサメタゾン。
図14は、アテローム性動脈硬化症のウサギモデルの過程を示す。
図15は、ウサギの初期平均体重と最終平均体重を示す。†および*はそれぞれ対照群およびHF群と比較してP＜0.05であることを示す。
図16A～16Cは、各ウサギ群におけるW0群間のAST、ALT、BUNの変化を示す。†および＊はそれぞれ、対照群およびHF群と比較してP＜0.05であることを示す。
図17A～17Dは、各ウサギ群におけるW0群間のTG、TC、HDL-C、LDL-Cの変化を示す。†および＊はそれぞれ、対照群およびHF群と比較してP＜0.05であることを示す。
図18A～18Cは、各ウサギ群におけるW4群間のAST、ALT、BUNの変化を示す。†および＊はそれぞれ、対照群およびHF群と比較してP＜0.05であることを示す。
図19A～19Dは、各ウサギ群におけるW4群間のTG、TC、HDL-C、LDL-Cの変化を示す。†および*はそれぞれ、対照群およびHF群と比較してP＜0.05であることを示す。
図20A～20Cは、各ウサギ群におけるW8群間のAST、ALT、BUNの変化を示す。†および＊はそれぞれ、対照群およびHF群と比較してP＜0.05であることを示す。
図21A～21Dは、各ウサギ群におけるW8群間のTG、TC、HDL-C、LDL-Cの変化を示す。†および＊はそれぞれ、対照群およびHF群と比較してP＜0.05であることを示す。
図22A～22Cは、各ウサギ群におけるW12群間のAST、ALT、BUNの変化を示す。†および＊はそれぞれ、対照群およびHF群と比較してP＜0.05であることを示す。
図23A～23Dは、各ウサギ群におけるW12群間のTG、TC、HDL-C、LDL-Cの変化を示す。†および＊はそれぞれ、対照群およびHF群と比較してP＜0.05であることを示す。
図24は、12週間の試験後の高コレステロール血症ウサギモデルにおける大動脈脂肪線条病変(aortic fatty streak lesion)の病理組織化学検査を示す。
図25は、各ウサギ群における屠殺後の冠動脈切片のHE染色を示す。
図26は、各ウサギ群における屠殺後の冠動脈のHE染色を示す。Nは新生内膜層；M、中膜層。
図27は、新生内膜の面積と中膜の面積の比(N/M比)で示した血管再狭窄の兆候を示す。Nは新生内膜層；M、中膜層。HFD群と比較して、それぞれ*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。
図28は、12週間の試験後の高コレステロール血症ウサギモデルにおける心臓組織の病理組織化学検査を示す。
図29は、12週間の試験後の高コレステロール血症ウサギモデルにおける肝臓の外観の写真を示す。
図30は、12週間の試験後の高コレステロール血症ウサギモデルにおける肝臓組織の病理組織化学検査を示す。
図31は、動物の体重と肺の重量を示す。
図32は、マウスにおけるブレオマイシン誘導性肺線維症における肺の組織病理学的変化を示す。
図33は、マウスにおけるブレオマイシン誘導性肺線維症における肺のマッソントリクローム染色(Masson's Trichrome staining)を示す。
図34は、ブレオマイシンによって誘導されたマウスの肺損傷におけるヒドロキシプロリン含有量に対するベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物および化合物の効果を示す。
図35A～35Dは、BALF中のベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物および化合物が(A)TNF-α、(B)IL-1β、(C)IL-6(D)およびTGF-β(E)を調整したことを示す。
図36は、BLM誘導性マウスにおける肺MPO活性に対するベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物および化合物の調節効果を示す。
図37は、HepG2細胞を異なる濃度のオレイン酸(OA)で処理する脂肪変性を誘導したものである。
図38A～38Bは、HepG2細胞における24時間-OA誘導性脂肪変性を示す。
図39は、HepG2細胞における化合物(3.7μg/mL、11.1μg/mL、33.3μg/mL、100μg/mLおよび200μg/mL)の細胞毒性試験を示す。
図40は、HepG2細胞における化合物の抗脂肪変性試験を示す。
発明の詳細な説明
本発明の説明の便宜のため、上記の発明の概要において表現している中心的な思想を、具体例によって説明する。実施態様における様々な項目は、例示に適する比率、寸法、変形量または変位で示しており、上記のような、実際の要素の比率を意味するものでない。
用語「テルペン」とは、大きく多様な有機化合物の一群を意味し、その基本構造は一般的な原則に従っている：2-メチルブタン残基(正確ではないが通常はイソプレン単位、(C5)nとも称される)でテルペンの炭素骨格を構成している。現在、文献上では約3万種のテルペンが知られている。2-メチルブタン(イソプレン)亜単位の数によって、ヘミ-(C5)、モノ-(C10)、セスキ-(C15)、ジ-(C20)、セステル(sester)-(C25)、トリ-(C30)およびテトラテルペン(C40)に区別される。
「対象」、「個体」、「宿主」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト動物を含む生きている動物を意味する。対象は、例えば、抗原性刺激に応答することができ、細胞表面受容体結合を介した刺激性および抑制性シグナルを伝達する免疫細胞を有する生物体であり得る。対象は哺乳類であってもよい。ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラットおよびマウスが挙げられる。「対象」という用語は、疾患に関して完全に正常である、またはあらゆる点で正常である個人を除外するものではない。
用語「処置」とは、治療的または予防的手段を意味する。「処置」は、医学的障害を有する対象または最終的にその障害を受ける可能性のある対象に、障害または再発する障害の1つまたはそれ以上の症状を予防、治癒、遅延、重症度の軽減または改善するために、またはそのような処置がない場合に予想される生存期間を超えて対象の生存期間を延長するために、投与することができる。
「治療有効量」とは、例えば、研究者、獣医師、医師、またはその他の臨床医が求める、組織、システム、動物またはヒトの生物学的または医学的応答など、所望の応答を引き出す可能性のある対象化合物の量を意味する。
生化学的パラメータの測定:血清クレアチニンと血清尿素は、製造業者の指示に従って比色キットを用いて評価される。前者のマーカーのキットは、(HUMAN Diagnostics Worldwide, Magdeburg, Germany)から購入される。化学分析装置(Roche Diagnostics, Cobas Mira Plus, Rotkreuz, Switzerland)。
腎臓病理組織学：各マウスの左側肝葉の前方部分を10％ホルムアルデヒドリン酸緩衝液で固定し、パラフィンに包埋し、5μmの切片に切り出し、ヘマトキシリン・エオジン(H&E)染色処理し、光学顕微鏡(Nikon, ECLIPSE, TS100, Tokyo, Japan)で組織学的検査を行う。画像はデジタルカメラ(NIS- Elements D 2.30, SP4, Build 387)で400倍の倍率で撮影する。
血清中のTNF-α、IL-6およびIL-1βサイトカイン：炎症促進性サイトカイン(すなわち、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、インターロイキン-6(IL-6)、およびIL-1β)の血清中濃度は、メーカーの指示に基づいて、関連する酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)キット(Biosource International Inc., Sunnyvale, CA, USA)で評価される。
腎臓組織のウェスタンブロット分析：0.6％ NP-40、150mM NaCl、10mM HEPES(pH7.9)、1mM EDTAおよび0.5mM PMSFからなる溶解緩衝液を用いて、4℃で肝臓組織をホモジナイズする。ホモジナイズされた試料を、4℃で10分間3000回転/分(rpm)で遠心し、上清を得る。ウシ血清アルブミン(BSA)のタンパク質標準を用いて、上清の等しい全細胞タンパク質量を測定する。タンパク質(50μg)を標準的な方法を用いて変性10％ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分解し、次に、PVDF膜(Immobilon, Millipore, Bedford, MA, USA)に移すことで10％脱脂乳によるエレクトロブロットおよびブロッキングを行った。膜を、4℃で特異的一次抗体の適切な希釈液とインキュベートし、TBS/ツイーン(TBST)緩衝液で3回洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体と37℃で1時間インキュベートする(一晩)。強化化学発光(ECL)試薬(Thermo Scientific, Hudson, NH, USA)で免疫反応性タンパク質を調べる前に、膜を3回洗浄する。スキャンした膜のバンド強度を定量し、Image J ソフトウェア(NIH, Bethesda, MD, USA)を用いて対照群と比較して相対強度として示す。
統計分析：動物実験から得られたデータは、平均値および平均値の標準誤差(±S.E.M.)で示す。複数の群間または2群間の差を調べるにはスチューデントのt検定を使用する。統計的有意性は*p＜0.05、**p＜0.01および***p＜0.001として示す。
実施例1：ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物の調製
ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)の子実体100gをメタノールで6時間還流させ、抽出液を集めて乾燥させることで、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)のメタノール抽出物を合計15g得る。
実施例2：活性成分の調製：アントシンK、デヒドロスルフレン酸/スルフレン酸、ベルシスポン酸Dおよびデヒドロエブリコ酸
ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)のメタノール抽出物を、n-ヘキサン/酢酸エチル/メタノールを溶出液とするシリカカラムクロマトグラフィーによりさらに分離することで、以下の画分ををル(図1を参照)：
ARH101-DS1(RS-アントシンK)、
ARH101-DS2(デヒドロスルフレン酸／スルフレン酸)、
ARH101-DS3(バーシスポン酸D)および
ARH101-DS4(デヒドロエブリン酸)。
実施例3：AR003抽出物の調製
ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)(ペトリディッシュ培養物(petri dish culture))100グラムをメタノールで6時間還流させ、抽出液を集めて減圧乾燥させることで、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorate)ARH003抽出物15gを得る。
実施例4：AR003-E抽出物の調製
ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)(ペトリディッシュ培養物(petri dish culture))200gをエタノールで6時間還流させ、抽出物を集めて乾燥させることで、AR003-Eベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)のエタノール抽出物を合計18g得る。
実施例5：AR004抽出物の調製
Antrodia camphorata(木材培養物(wood culture))100gをメタノールで6時間還流させ、抽出物を集めて減圧乾燥させることで、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorate)ARH004抽出物を得る。
実施例6：AR005-EA抽出物の調製
ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)(固体培養物(solid culture))100gを酢酸エチルで6時間還流させ、抽出物を集めて乾燥させることで、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)のEA抽出物を合計12g得る。
実施例7：ブゾロイバナ(anisomeles indica)抽出物の調製
ブゾロイバナ(anisomeles indica)抽出物は、以下のプロセスで調製する：(1) ブゾロイバナ(anisomeles indica)のエタノール抽出物をとり、シリカを充填したクロマトグラフカラムに加え、溶出液「n-ヘキサン/酢酸エチル」、「ヘキサン／酢酸エチル／メタノール」および「メタノール」による勾配溶出を行うことでブゾロイバナ分離液を得る。(2)該ブゾロイバナ分離液を、シリカ充填クロマトグラフカラムを用いて分離し、溶出液「ジクロロメタン」、「ジクロロメタン／メタノール」および「メタノール」による勾配溶出を行うことで分離された濃縮物を得る。(3)該分離された濃縮物を溶媒「ｎ-ヘキサン／酢酸エチル」で再結晶させることで、ブゾロイバナの微結晶を得る。
実施例8：活性成分の調製：オバトジオリド(AR100-DS1)
ブゾロイバナ(anisomeles indica)のエタノール抽出物200gをとり、シリカ充填クロマトグラフカラム(10×15cm)に加え、各溶出液：「n-ヘキサン／酢酸エチル(10／1、5／1、3／1、1／1の比率)」、「ヘキサン／酢酸エチル／メタノール(6／4／1、3／2／1の比率)」および「メタノール」1200mlで勾配溶出を行うことで、最初の分離液140gを得る。
最初の分離液140gを、シリカ充填クロマトグラフカラム(10×15cm)を用いて分離し、各溶出液：「ジクロロメタン」、「ジクロロメタン／メタノール(10／1、5／1、7／3の比率)」および「メタノール」1000mlで勾配溶出を行うことで分離された濃縮物質を得る。該分離された濃縮物質は、溶媒を：「n-ヘキサン/酢酸エチル」用いてさらに再結晶させることで結晶を得る。この結晶を核磁気共鳴スペクトロスコピー(H1-NMR)により、化学構造がオバトジオリドであるジテルペノイド化合物と同定する。この結晶を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析によりオバトジオリドの標準品と比較し、オバトジオリド化合物であることを確認した。
オバトジオリド(AR100-DS1)からの代謝物：
+O、+システイン:m/z:466、M2、M3、M4
+グルタチオン:m/z:636、M6、M7
+O:m/z:345、M8、M9
実施例9：シスプラチン誘導性腎臓損傷のマウスモデル
7～8週齢の雄性C57BL/6マウスをBioLASCO Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan)から入手した。動物を、実験前の少なくとも2週間、22±1℃の一定温度および55±5％の相対湿度で12時間の暗明サイクルでプレキシグラスケージ内に飼育する。動物には餌と水を自由に与える。すべての実験手順は施設内動物倫理委員会のガイドラインに従って実行され、プロトコールは動物実験の管理および監督を目的とした委員会によって承認されている。
低用量のシスプラチンを複数回注射することにより、腎線維症を誘導する。シスプラチン(5mg/kg/注射; P4394, Sigma-Aldrich, St Louis, MO)の腹腔内注射は、0週、1週、3週の計3回行う。マウスはシスプラチンの初回投与から6週間後に犠牲にする(n=6)。試料の影響を分析するために、マウスにシスプラチン初回投与4週後から7日間毎日腹腔内注射を行い、4週でに犠牲にする(n=6)。
実施例10：ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物により、シスプラチン誘導性マウスにおける腎機能不全および組織病理学的変化を軽減した。
腎臓の形態学的変化を図2Aに示す。CREおよびBUNは腎機能の特徴である。図2Bおよび2Cでは、対照群と比較して、3つの10mg/kg CP用量(第0週目、第1週目、第3週目)でのシスプラチン注射は、血清CREおよびBUNレベルを高度に上昇させ(p＜0.001)たことが示されており、これは、シスプラチン処理マウスにおける腎毒性の発生を示している。1000mg/kgの用量のARH005-EAおよびARH003-Eと化合物(AR101-DS4およびAR100-DS1)による処理は、CREおよびBUNの正常化によって実証されるように、シスプラチン刺激群と比較して用量依存的に有意な腎保護効果を発揮した(p＜0.001)。
実施例11：ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物により、複数回のシスプラチン処理によって引き起こされた腎機能不全および腎臓損傷を軽減する。
組織病理学的変化を分析して、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物がシスプラチン刺激マウスの腎不全に影響を与えたかどうかを判定する。対照群の腎臓組織は完全に正常であり、透明で正常な核を備えた透明な尿細管および糸球体構造を特徴とする。シスプラチン刺激マウスでは腎臓に重度の腎臓損傷があり、尿細管上皮損傷、炎症性細胞浸潤、尿細管細胞の膨張、尿細管内円柱の形成、尿細管拡張が誘発されていた。しかし、1000mg/kgの用量のベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物と化合物(AR100-DS1)での処理により、腎臓組織の壊死および炎症性浸潤性細胞が有意に改善された(図3を参照)。
実施例12：ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物は、炎症促進性サイトカインおよびアルブミンにおけるシスプラチン誘導性変化に対処した。
血清中の炎症促進性サイトカインTNF-α、IL-1β、IL-6およびTGF-βレベルの評価はELISAによって行う。シスプラチン処理腎臓損傷マウスは、対照群と比較して、血清中のNO、TNF-α、IL-1βおよびIL-6レベルが有意に増加した(それぞれ図4A～4E)。1000mg／kgの用量のベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物(AR005-EA)と化合物(AR100-DS1)での処理により、腎組織処理における壊死および炎症性浸潤細胞を有意に改善し、シスプラチンチャレンジ後のNO、TNF-α、IL-1βおよびIL-6産生を改善した。
実施例13：シスプラチン誘導性腎臓損傷TWEAK、α-SMA、P53およびP21タンパク質発現の阻害
ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物(ARH005-EA)および化合物(AR100-DS1)での前処理により、シスプラチン誘導性TWEAK、α-SMA、P53およびP21タンパク質の発現を阻害したかどうかを調べた。その結果、ARH005-EAおよびARHでの処理により、シスプラチンチャレンジ後の腎臓組織におけるTWEAK、α-SMA、P53およびP21のタンパク質の発現が阻害されたことが明らかになった(図5Aおよび5B)。
実施例14：ラットにおけるCCl4誘導性慢性肝線維症
図6に示すように、8週齢の雄SDラットに、0.4mg/kgのCCl4を8週間週2回投与する。血液試料は、第0週目、第2週目、第4週目、第6週目および第8週目に採取すｒ。動物は、組織病理学的検査のために８週間の終わりに犠牲にする。図7A、7B、7Cはそれぞれ、デルタ重量、肝臓重量、および肝臓／体重比を示す。ナイーブ(Naive)群の肝臓重量は、ビヒクル群の肝臓重量と有意な差はない。しかしながら、ナイーブ群の肝臓／体重比は、ビヒクル群の肝臓／体重比よりも有意に小さい。50mg/kgのAR100-DS1群の肝臓重量および肝臓／体重比は、ビヒクル群およびナイーブ群と比較して有意に大きい。
実施例15：血清肝酵素プロファイル
アミノトランスフェラーゼ(AST)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)などの臨床生化学のレベルを評価して、対照群および実験群の肝臓の酵素活性を決定する(図8A～8Cに示す)。ナイーブ群のAST、ALTのレベルおよびAST/ALT比では、実験中に有意な変化を示さなかった。各試験群の動物の血清中ASTおよびALTレベルは、実験の進行とともに大幅に増加した。しかしながら、ビヒクル群と比較して、50mg/kgのAR100-DS1群では、W6およびW8において、ASTおよびALTの増加がより少ないことを観察することだできる。
実施例16：肝臓組織学的評価
CCl4での誘導の8週間後、ビヒクル群は、ASTおよびALTの上昇、AST／ALT比の低下、炎症、線維化、空胞化および壊死などの肝臓損傷を有意に受けた。図9A～9Eおよび10に示すように、50mg/kgのAR100-DS1群の肝臓は、萎縮および硬化のない滑らかな表面を有し、肝臓重量および肝臓／体重比は、ビヒクル群およびナイーブ群の肝臓よりも有意に大きい。全体として、AR100-DS1はCCl4誘導性肝臓損傷を部分的に修復する可能性があることを示している。
実施例17：BALB/cマウスにおけるCon A(コンカナバリンA)誘導性急性肝炎に対するオバトジオリド(AR100-DS1)の影響
コンカナバリンA(Con A)の静脈注射は、T細胞を介する肝炎の研究に広く用いられている戦略である。Con Aは、CD4+T細胞を活性化し、サイトカインを産生し、肝細胞の損傷を引き起こすことができるレクチンである。デキサメタゾン(Dex)は長時間作用型の合成コルチコステロイドで、抗炎症薬および免疫抑制薬として使用されてきた。オバトジオリド(AR100-DS1)が、Con A誘導性急性肝炎における血清中グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GOT)、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ(GPT)、循環サイトカインおよび肝組織病理学に及ぼす影響をBALB/cマウスで評価する。
Con AおよびDexはSigma Aldrich (USA)から購入した。ProcartaPlexTM免疫測定キットtはCorning Inc.から購入した。GOPおよびGPT Fuji Dri-ChemスライドはWinning Medical Inc. (Taiwan)から購入した。
雄のBALB/cマウス(7～9週齢)はBioLASCO Taiwan Co., Ltd.またはNational Laboratory Animal Center(NLAC, Taiwan)から購入した。動物は1ケージに5匹ずつ飼育し、実験中は餌と水を自由に与える。室温は23±2℃に保ち、12時間の明暗サイクルを交互に繰り返す。動物は実験前に1週間順化させ、ストレスの影響を最小化する。動物を含むすべての実験プロトコールとそのケアは、ITRIのInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)によって承認され(ITRI-IACUC-2018-041およびITRI-IACUC-2018-050；AAALACによる認定)、台湾農業委員会の規則に従って実施する。
Con Aを3mg/mLの濃度でパイロジェン-フリー食塩水に溶解し、15mg/kg体重または20mg/kg体重で静脈注射することで肝炎を誘導する。オバトジオリド(AR100-DS1)およびDexをCon A投与30分前、4時間後、8時間後に経口投与した。Con A処理24時間後に血液および肝臓組織を採取する(図11)。血清は分析まで80℃で保存する。
Con A処理後の肝細胞障害のレベルを評価するため、血清中GPTレベルおよびGOTレベルをFuji Dri-Chemスライド(Fuji, Japan)で測定する。同じ群の血清はサイトカインアッセイのためにプールさせる。サイトカインレベルは、ProcartaPlexTM免疫アッセイキットにより、製造者の指示に従って測定する。データは平均値±SEMで示す。薬物処理群とビヒクル処理群間の差の分析にはT検定を使用する。p値が0.05未満の場合、その差は統計的に有意であるとみなされる。50mg/kgのオバトジオリド(AR100-DS1)は、Con Aによって上昇したGPT値を有意に低下させ(109±25U/L vs 368±107U/L、p＜0.05)、GOTの上昇をわずかに改善した(261±45U/L vs 410±56 U/L)(図12)。
肝臓組織を10％リン酸緩衝ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン-エオジン(H&E)で染色することで組織病変を確認する。組織病変はBioLASCO Taiwan Co., Ltd.の獣医病理学者が顕微鏡で検査する。すべての顕微鏡的病変の重症度評価システムの基準は、以下のように0から4で評価される：0＝なし、1＝個々の細胞の壊死、2＝≦30％の小葉壊死、3＝≦60％の小葉壊死、4＝＞60％以上の小葉壊死。組織病理学的分析では、オバトジオリド(AR100-DS1)は肝壊死を改善した(スコア0.2±0.2 vs 1.4±0.2、p＜0.05)(図13)。この結果は、オバトジオリド(AR100-DS1)が血清中GOPおよびGPTを低下させ、Con A誘導性肝壊死を減弱させたことを示している。
実施例18：ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物およびAR101-DS2のアテローム性動脈硬化症および肝線維症の予防効果の評価
実験モデル
2～3kgの雄のニュージーランド白ウサギを個々にケージに入れ、温度と湿度が管理された部屋で飼育する。明暗サイクルは各12時間。数日間の馴化後、動物を6つの給餌群に順次割り付ける：標準ウサギ用飼料、0.5％コレステロールを含有する標準ウサギ用飼料、0.5％コレステロールおよび10mg/kgロバスタチンの両方を含有する標準ウサギ用飼料、0.5％コレステロールおよび1％ARH003の両方を含有する標準ウサギ用飼料、0.5％コレステロールおよび1％ARH004の両方を含有する標準ウサギ用飼料、0.5％コレステロールおよび10mg/kgAR101-DS2の両方を含有する標準ウサギ用飼料。標準ウサギ用飼料群以外の群には、0.5％コレステロールを含有する標準ウサギ用飼料を4週間与えた(図14～15参照)。各ウサギの1日の給餌量は50g/kg体重/日である。飼料は動物が新しい環境に慣れた後、8週間投与する。12週間の研究の最初と最後に、ウサギについてはZoletil 50(1mL/kg)(Virbac社、フランス)の筋肉内注射で麻酔し、血液試料を採取する。最後に、さらなる組織病理学的分析のために、ウサギを犠牲にした後、大動脈(大動脈弓から腸骨動脈分岐部まで)と全肝を採取する。
2～3kgの雄性ニュージーランド白ウサギ(n=30)を以下の群に分けた：
(ND) 標準ウサギ用飼料、n=5;
(HF) 0.5％コレステロールを含有する標準ウサギ用飼料、n=6;
(L) 0.5％コレステロールおよび10mg/kgロバスタチンの両方を含有する標準ウサギ用飼料、n=4;
(AR003) 0.5％コレステロールおよび1％ARH003の両方を含有する標準ウサギ用飼料、n=5;
(AR004) 0.5％コレステロールおよび1％ARH004の両方を含有する標準ウサギ用飼料、n=5;
(AR101-DS2) 0.5％コレステロールおよび10mg/kgAR101-DS2の両方を含有する標準ウサギ用飼料、n=5;各ウサギの毎日の給餌量は、1日あたり50g/kg体重である。
血液化学分析
動物は採血前に一晩絶食させる。ウサギの辺縁耳静脈からBD Vacutainer EDTA採血管に採血する。血漿は、4℃で10分間3,000rpmでの遠心分離で分離する。図16～23は、低密度リポタンパク質(LDL)、コレステロール(Chol)、トリグリセリド(TG)、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT)およびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT)の血清レベルを含む血液化学パラメータの変化の測定値を示す。
大動脈脂肪線条染色(Aortic Fatty Streak Staining)
大動脈を縦方向に開いて内膜表面を露出させ、食塩水で穏やかに洗い流す(図24～26を参照)。大動脈を2％(w/v)スダン IV中でインキュベートし、いくつかの濃度(100％、90％、80％、70％、および 60％)のエタノールで1分間洗い流し、その後純水で洗い流す。図28に示す写真は、デジタルカメラ(Nikon D80, Japan)を使用して取得し、アルファイメージャー2200ドキュメンテーションシステム(Alpha Innotech, USA)で定量化した。大動脈脂肪線条病変の進行は、総面積に対する染色面積の割合として示す(図27)。
方法
1. 細胞または組織の水和。
i. アルコールまたはアルデヒドを基礎とする固定液で固定した凍結切片または再水和組織切片(パラフィン包埋組織の切片における工程12を参照)(Fischer et al. 2008)を含む顕微鏡スライドを使用する。
ii. スライドを手で攪拌しながら30秒間H2Oに浸す。水で洗い流すことが重要であり；ヘマトキシリンは塩および緩衝液とともに沈殿する。染色は、免疫組織化学反応または非蛍光検出システムによるハイブリダイゼーション反応後に実行できる。
2. マイヤーヘマトキシリンを含むコプリンジャーにスライドを浸し、30秒間撹拌する。
3. スライドをH2Oで1分間洗い流す。この時点での染色強度を推定し、必要に応じて工程2と3を繰り返す。
4. スライドを1％エオシンY溶液で10～30秒間撹拌しながら染色する。
5. 95％アルコールを2回交換し、100％アルコールを2回交換して、それぞれ30秒ずつ切片を脱水させる。一部の比色基質はアルコールに溶解する。
6. キシレンを2回交換してアルコールを抽出する。プラスチック製のスライドやプラスチック製の培養皿での染色を使用する場合は、プラスチックを溶解するため、キシレンまたはキシレンを基礎とする封入剤を使用しない。
7. 封入剤を1～2滴加え、カバースリップで覆う。アルコールが使用できない場合は、グリセロールまたはその他の水性封入剤を使用してカバースリップを封入する。
試薬
顕微鏡スライド上の対象の細胞または組織(工程1.iを参照)
エオシンY(1％水溶液; EM Diagnostic Systems)
エタノール(95％、100％)
エタノールの代わりに、メタノールまたはフレックスアルコール(Richard-Allan Scientific)を使用できる(工程5を参照)。
ヘマトキシリン、マイヤー(Sigma)
マイヤーのヘマトキシリンは最も使いやすく、ほとんどの比色基質と互換性がある。
封入剤(Canada Balsam, Sigma C1795)
アルコールが使用できない場合は、グリセロールまたはその他の水性封入剤を使用する(工程7を参照)。キシレン
肝臓組織の凍結切片化
ウサギ肝臓組織(図29に示す)を食塩水で灌流し、10％(v/v)ホルマリン中和溶液(J.T. Baker, Inc., USA)中で、24時間固定する。その後、組織をTissue Tek OCT Compound (#4583; Sakura Finetek Inc., USA)に包埋する。包埋した組織を厚さ10μmの切片に切断し、スダンIVおよびヘマトキシリン(Merck, USA)で染色する。簡単に説明すると、切片を純水で1分間洗浄してOCT化合物を除去し、50％(v/v)エタノールで30秒間洗浄し、次に、2％(w/v)スダンIVで1時間染色する。さらに50％(v/v)エタノールおよび純水で2分間洗浄した後、切片をヘマトキシリンで対比染色する。図30に示す写真は、10倍の対物レンズを備えた顕微鏡を使用して取得し、Alpha Imager 2200 documentation system (Alpha Innotech, USA)で定量化する。脂肪肝の進行の兆候は、肝臓組織(細胞)全体に対する油滴の面積の割合として示す。

Figure 2024524499000009
実施例19：マウスにおけるブレオマイシン誘導性肺線維症に対するベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物の保護効果
動物および処理
特定の病原体を持たないICRマウス(雄)(体重18～22g)をBioLASCO Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan)から購入した。実験前2週間以上、温度22±1℃、相対湿度55±5％、12時間明暗サイクルのプレキシガラス製ケージで飼育した。動物には餌と水を与えた。すべての実験手順は施設動物倫理委員会のガイドラインに従って実施され、プロトコールは動物実験管理監督委員会の承認を得た。
マウスにおけるBLM誘導性PF
マウスを、体重に応じて各群5匹の5つの群に分けた:対象群、BLM群、BLM+DEX群(7.5mg/kg)、BLM+ACH用量群(50mg/kg)、およびBLM+ACM用量群(25mg/kg)、BLM+ACH用量群(50mg/kg)、およびBLM+ACM用量群(25mg/kg)BLM+AH用量群(50mg/kg)、およびBLM+AM用量群(25mg/kg)BLM+BH用量群(50mg/kg)、およびBLM+BM用量群(25mg/kg) BLM+CH用量群(50mg/kg)、およびBLM+CM用量群(25mg/kg) BLM+DH用量群(50mg/kg)、およびBLM+DM用量群(25mg/kg) BLM+EH用量群(50mg/kg)、およびBLM+EM用量群(25mg/kg)BLM。肺線維化(PF)は、7.5mg/kg体重のBLMの単回気管内投与によりマウスで確立させた。BLM損傷後21日間、異なる用量の試料を毎日胃内投与し、DEXを陽性対照として使用した。対照群とモデル群には、同じスケジュールと投与経路を使用して等量のビヒクル(0.9％ NaCl)を投与した。
マウスの体重を毎日記録した。マウスを抱水クロラールヒドロクロライド麻酔で21日目に犠牲にした。ELISA分析のために血液を採取し、全肺を摘出して重量を測定した。右肺を10％ホルマリンで固定し、脱水させ、パラフィンに包埋した。左肺を用いてヒドロキシプロリンを測定した。肺係数は、肺重量/体重×100％を用いて計算した。
実験設計
雄のC57BL/6マウスを以下の8つの群にランダムに分け(n=6):
1. I群:対照;
2. II群:BLM(7.5mg/kg BW)を単回腹腔内注射したマウス
3. III群:単回用量(ACH、0.5g/kg)
4. IV群:単回用量(ACM、1.0g/kg)
5. V群:精製したAR101-DS1(50mg/kg)
6. VI群:精製したAR101-DS1(25mg/kg)
7. VII群:精製したAR101-DS2(50mg/kg)
8. VIII群:精製したAR101-DS2(25mg/kg)
7. VII群:精製したAR101-DS4(50mg/kg)
8. VIII群:精製したAR101-DS4(25mg/kg)
7. VII群:精製したAR100-DS1(50mg/kg)
8. VIII群:精製したAR100-DS1(25mg/kg)
7. VII群:精製したARH013-RA1(50mg/kg)
8. VIII群:精製したARH013-RA1(25mg/kg)
BALFのサンプリング
麻酔下で、0.7mLの食塩水を用いて気管カニューレを通してBALFを4回実施した。検査した各マウスで、約2.5mL(90％)のBAL液(BALF)をが回収した。BALFの上清は、使用するまで-80℃で保存した。
肺の病理組織学
各マウスの右肺の前方部分を10％ホルムアルデヒドリン酸緩衝液で固定し、パラフィンに包埋し、5μmの切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色で処理し、光学顕微鏡(Nikon, ECLIPSE, TS100, Tokyo, Japan)による組織学的検査を行った。画像は、デジタルカメラ(NIS-Elements D 2.30, SP4, Build 387)を使用して、元の倍率の400倍でキャプチャした。
ヒドロキシプロリンのアッセイ
ヒドロキシプロリンの含有量は、ヒドロキシプロリンアッセイキット(Biosource International Inc., Sunnyvale, CA, USA)の指示に従って肺組織で分析した。マウスの肺組織を粉砕し、6mol/L塩化カリウム溶液1mlでホモジナイズし、95℃で5時間加水分解し、pH値を6.0～6.8に調整した。説明書に従い、対応する試薬を反応系に加えてよく混合し、60℃で15分間インキュベートした。冷却後、3500rpmで10分間遠心分離し、上清を集めた。試料からの上清の吸光度値を分光光度計により550nmで測定し、各群のヒドロキシプロリン含有量を計算した。
血清中のTNF-α、IL-6およびIL-1βサイトカイン
血清中の炎症促進性サイトカイン(すなわち、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、インターロイキン-6(IL-6)、IL-1β)の血清中濃度は、製造業者の指示に基づき、関連する酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)キット(Biosource International Inc., Sunnyvale, CA, USA)で評価した。
ミエロペルオキシダーゼ(MPO)アッセイ
肺のMPO活性は、肺における炎症細胞の浸潤を推定するための信頼できる指標であった。肺組織をホモジナイズし、メーカーの指示に従ってキットを使用してMPOレベルを検出した。
組織病理学的分析
右肺をパラフィンワックスに包埋し、10％ホルマリンで固定し、切片に加工した。切片をヘマトキシリン・エオジン(H&E)で染色するか、マッソントリクローム染色(Masson’s trichrome staining)を施しました。
統計分析
動物実験から得られたデータは、平均値および平均値の標準誤差(±S.E.M.)として示した。スチューデントのt検定を用いて、複数の群間または2つの群間の差異を調べた。統計的有意性は、*p＜0.05、**p＜0.01、および***p＜0.001として示した。
実験全体の終了時点で、動物の体重と肺の重量を記録した。対照動物と比較して、ブレオマイシン(BLM)を投与した動物の体重変化は有意に減少した。他の実験群と比較して、肺指数[(肺重量/体重)×100]は、ブレオマイシン投与動物において有意な増加を示した(表1および図31)。ACH、BH、DHの肺指数が大幅に減少した。
Figure 2024524499000010
実施例20：ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物により、BLM誘導性マウスにおける肺機能不全および組織病理学的変化を軽減した。
ベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物および化合物の治療効果を調査するために、マウスの肺の組織病理学的変化を評価した。炎症性浸潤および組織構造の完全性は、H&E 染色によって観察した(図32)。肺組織の線維化の程度はマッソン染色により測定した(図33)。対照群では、薄い肺胞壁、無傷の肺胞構造、正常な肺胞中隔、および肺間葉における炎症性細胞の浸潤が少ないなどのいくつかの組織学的所見示された。BLM投与の21日後、肺胞浮腫、中隔幅の有意な増加、および炎症細胞浸潤の増加が観察された。ベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物および化合物の投与により、BLM群と比較して肺組織の炎症性浸潤および損傷した構造が改善された。
マッソン染色では、BLM投与後21日後に肺組織および中隔が広範囲に青く染まり、正常群よりもBLM群の肺線維症が重篤であることが示唆された。ベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物および化合物による処理後、青色の領域が減少し、線維化の程度が軽減された。BLMモデリングの21日後、ベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物および化合物による療法後、肺胞炎および線維化のスコアが大幅に低下した。上記の結果は、ベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物および化合物が肺線維症マウスの肺の炎症および線維化の程度を軽減することを示唆している。
実施例21：肺線維化マーカー
ヒドロキシプロリン含有量は、肺組織におけるコラーゲン沈着の重要な指標である。肺線維化の程度を定量化するために、肺組織中のヒドロキシプロリン含量を各群で測定し、図34に示す。BLMは、対照群と比較してHP含量を明らかに増加させた(p＜0.001)。ベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物(1.0g/kg)およびAH、BH、およびDHは肺のHPの有意な回復を減少させた(p＜0.001)。
実施例22：ベニクスノキタケ(Antrodia camphorata)抽出物および化合物は、炎症促進性サイトカインにおけるブレオマイシン誘導性変化に対処した。
血清中の炎症促進性サイトカインTNF-α、IL-1β、IL-6およびTGF-βレベルをELISAにより評価した。BLM処理腎損傷マウスは、対照群と比較して血清中のNO、TNF-α、IL-1βおよびIL-6レベルを有意に増加させた(図35A～34E)。1.0g/kgの用量のベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物と化合物(BHおよびDH)による処理により、壊死が有意に改善され、肺組織処理における炎症性浸潤細胞はBLMチャレンジ後にTNF-α、IL-1β、IL-6およびTGF-β産生を改善された(p＜0.001)。
実施例23：肺MPO活性に対するベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物および化合物の効果
図36に示すように、対照群と比較してBLMチャレンジに反応したMPOレベルの顕著な増加が認められた(p＜0.01)。一方、ベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物であるAH、BH、DHとDexとの両方の投与により、BLM群(p＜0.001)と比較して明らかにMPO活性を抑制し、ベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物および化合物群よりも強い効果を示した(p＜0.05)(図36)。
実施例24．HepG2細胞におけるオレイン酸誘導性脂肪変性に対するベニクスノキタケ(A. camphorata)抽出物およびオバトジオリドの組み合わせの効果
オレイン酸(OA)はHepG2細胞の脂肪変性を誘導し、ヒト脂肪肝疾患のインビトロモデルとみなされ得る。HepG2細胞をさまざまな濃度のオレイン酸(OA)で処理することで脂肪変性を誘導した。細胞内脂質をオイルレッド O(ORO)で染色し、比色アッセイで定量した。0.5mM OAを選択して、さらなる試験行った(図37および38)。HepG2細胞を試験化合物(3.7μg/mL、11.1μg/mL、33.3μg/mL、100μg/mLおよび200μg/mL)で処理し、48時間インキュベートした(図39)。HepG2細胞を24ウェルプレートに播種し、FBSを24時間遮断しました。次に、これらの細胞をさまざまな濃度の試験化合物で6時間処理した後、0.5ｍＭのOAで24時間誘導した。細胞をPBSで穏やかに洗浄し、RTでパラホルムアルデヒドを用いて固定し、次に、オイルレッド(ORO)溶液で、室温で30分間染色した。ORO染色は純粋なイソプロパノールを用いて抽出され、光学密度は510nmで検出された(図40)。AR101-DS4、AR100-DS1およびAR100-DS1+AR101-DS2は、非細胞毒性濃度でHepG2細胞におけるOA誘導性脂肪変性に対する阻害を示す。

Claims (11)

  1. 線維性状態を予防または処置する方法であって、有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、ここで、該組成物は、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorate)から抽出された4-縮合環トリテルペンを含む、方法。
  2. 前記4-縮合環トリテルペンが、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorate)のエタノール抽出物から得られる、請求項1に記載の方法。
  3. 前記4-縮合環トリテルペンが、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorate)の酢酸エチル抽出物から得られる、請求項1に記載の方法。
  4. 前記4-縮合環トリテルペンが、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorate)のメタノール抽出物から得られる、請求項1に記載の方法。
  5. 前記4-縮合環トリテルペンが、ベニクスノキタケ(Antrodia camphorate)のメタノール抽出物を順相クロマトグラフィーカラムに導入し、そのカラムをヘキサン/酢酸エチル/メタノールで溶出することによって得られる有機溶出液から得られる、請求項1に記載の方法。
  6. 前記有機溶出液が、以下の式およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つの化合物を含む、請求項5に記載の方法：
  7. 線維性状態を予防または処置する方法であって、それを必要とする対象に、以下の式およびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物の有効量を投与することを含む方法：
  8. 線維性状態が、肝線維症、腎線維症、血管線維症、肺線維症、良性前立腺肥大症を含む、請求項1または7に記載の方法。
  9. 前記組成物が、腎臓機能不全および腎臓損傷をさらに軽減する、請求項1または7に記載の方法。
  10. 前記組成物が、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、ならびに肝臓の炎症、空胞化および壊死をさらに軽減する、請求項1または7に記載の方法。
  11. 前記組成物がオバトジオリドと組み合わされて、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、ならびに肝臓の炎症、空胞化および壊死をさらに軽減する、請求項1または7に記載の方法。
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Lv et al. Anti-diabetic effects of a phenolic-rich extract from Hypericum attenuatum Choisy in KK-Ay mice mediated through AMPK/PI3K/Akt/GSK3β signaling and GLUT4, PPARγ, and PPARα expression
Li et al. Mangiferin improves hepatic damage-associated molecular patterns, lipid metabolic disorder and mitochondrial dysfunction in alcohol hepatitis rats
Huang et al. Antidiabetic activity of a Flavonoid-Rich extract from flowers of Wisteria sinensis in type 2 diabetic mice via activation of the IRS-1/PI3K/Akt/GLUT4 pathway
Wang et al. Moshen granule ameliorates membranous nephropathy by blocking intrarenal renin-angiotensin system signalling via the Wnt1/β-catenin pathway
Yang et al. Targeting mTOR/YY1 signaling pathway by quercetin through CYP7A1-mediated cholesterol-to-bile acids conversion alleviated type 2 diabetes mellitus induced hepatic lipid accumulation
Yen et al. Antrodia cinnamomea attenuates non-alcoholic steatohepatitis by suppressing NLRP3 inflammasome activation in vitro and in vivo
Zhang et al. Astragalus saponins protect against extrahepatic and intrahepatic cholestatic liver fibrosis models by activation of farnesoid X receptor
Zhang et al. Tribulus terrestris L. extract ameliorates atherosclerosis by inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation in ApoE−/− mice and A7r5 cells via suppression of Akt/MEK/ERK signaling
Kowalczuk et al. Hyoscyamus albus nortropane alkaloids reduce hyperglycemia and hyperinsulinemia induced in HepG2 cells through the regulation of SIRT1/NF-kB/JNK pathway
Hao et al. Costunolide alleviated DDC induced ductular reaction and inflammatory response in murine model of cholestatic liver disease
Cui et al. Recent advances in the pharmacological applications and liver toxicity of triptolide
Zhu et al. Danhe granule ameliorates nonalcoholic steatohepatitis and fibrosis in rats by inhibiting ceramide de novo synthesis related to CerS6 and CerK
Zhao et al. Chlorogenic acid alleviates chronic stress-induced intestinal damage by inhibiting the P38MAPK/NF-κB pathway
JP2024524499A (ja) 線維性疾患の処置または予防におけるテルペノイドの使用
US20230041859A1 (en) Use of terpenoids in the treatment or prevention of fibrotic diseases
Zhang et al. Thymoquinone attenuates hepatic lipid accumulation by inducing autophagy via AMPK/mTOR/ULK1‐dependent pathway in nonalcoholic fatty liver disease
Choi et al. Preventive Effects of Gardenia jasminoides on cerulein-induced chronic pancreatitis
Zhang et al. Tiaogan daozhuo formula attenuates atherosclerosis via activating AMPK-PPARγ-LXRα pathway
Elseweidy et al. Empagliflozin ameliorates liver fibrosis in NASH rat model via targeting hepatic NF-κB/SOX9/OPN signaling and osteocalcin level
Qin et al. Studies on the protective effect of total flavonoids from Cichorium glandulosum roots against carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in rats