JP2024517988A - Rag1に関連する重症複合免疫不全症(scid)の治療のための遺伝子治療 - Google Patents
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Abstract
本発明は、概して、ゲノム工学(遺伝子編集)の分野に関し、より具体的には、RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)の治療のための遺伝子治療に関する。特に、本発明は、長期造血再構築能を持つ造血幹細胞(HSC)におけるRAG1欠損の治療に関する。本発明は、重症複合免疫不全症(SCID)を引き起こす少なくとも1つの変異を含む非機能性内在性RAG1遺伝子を特異的に標的とする遺伝子編集試薬(例えばTALEヌクレアーゼ)を含み、それによって、正常な細胞表現型の回復を可能にする、HSCを遺伝子修飾するための手段および方法を提供する。また本発明は、HSCのゲノムにおいて非機能性RAG1内在性遺伝子座に組み込まれ、機能性RAG1ポリペプチドの発現をもたらす、機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列を含む外来性配列を含む、RAG1が編集された改変HSCも提供する。本発明はさらに、該改変HSCを含む細胞の集団、該改変HSCまたは細胞の集団を含む薬学的組成物、およびRAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)の治療のための遺伝子治療におけるそれらの使用を提供する。
Description
発明の分野
本発明は、概して、ゲノム工学(遺伝子編集)の分野に関し、より具体的には、RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)の治療のための遺伝子治療に関する。特に、本発明は、長期造血再構築能を持つ造血幹細胞(HSC)におけるRAG1欠損の治療に関する。本発明は、重症複合免疫不全症(SCID)を引き起こす少なくとも1つの変異を含む非機能性内在性RAG1遺伝子を特異的に標的とする遺伝子編集試薬(例えばTALEヌクレアーゼ)を含み、それによって、正常な細胞表現型の回復を可能にする、HSCを遺伝子修飾するための手段および方法を提供する。本発明は、HSCのゲノム内の非機能性RAG1内在性遺伝子座に組み込まれ、機能性RAG1ポリペプチドの発現をもたらす、機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列を含む外来性配列を含む、RAG1が編集された改変されたHSCも提供する。本発明は、改変されたHSCを含む細胞の集団、改変されたHSCまたは細胞の集団を含む薬学的組成物、およびRAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)の治療のための遺伝子治療におけるそれらの使用をさらに提供する。
本発明は、概して、ゲノム工学(遺伝子編集)の分野に関し、より具体的には、RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)の治療のための遺伝子治療に関する。特に、本発明は、長期造血再構築能を持つ造血幹細胞(HSC)におけるRAG1欠損の治療に関する。本発明は、重症複合免疫不全症(SCID)を引き起こす少なくとも1つの変異を含む非機能性内在性RAG1遺伝子を特異的に標的とする遺伝子編集試薬(例えばTALEヌクレアーゼ)を含み、それによって、正常な細胞表現型の回復を可能にする、HSCを遺伝子修飾するための手段および方法を提供する。本発明は、HSCのゲノム内の非機能性RAG1内在性遺伝子座に組み込まれ、機能性RAG1ポリペプチドの発現をもたらす、機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列を含む外来性配列を含む、RAG1が編集された改変されたHSCも提供する。本発明は、改変されたHSCを含む細胞の集団、改変されたHSCまたは細胞の集団を含む薬学的組成物、およびRAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)の治療のための遺伝子治療におけるそれらの使用をさらに提供する。
発明の背景
重症複合免疫不全症(SCID)の18を超える異なる型の遺伝学的基盤が同定されている。全ての場合において、遺伝子欠陥が、T細胞発達またはT細胞機能の不全につながる[1]。種々の欠陥は、影響される経路によって、または変異から生じる特定の免疫学的表現型によって、カテゴリー化され得る。SCID集団における種々の遺伝学的欠陥の分布は、IL2RG遺伝子の変異から最も高頻度に生じるX連鎖SCID(X-SCID)が、SCID表現型のおよそ40~50%を占めることを示している。SCID症例の約30%を占める2番目に高頻度のSCID型は、組換え活性化遺伝子RAG1および/またはRAG2におけるヌル変異に起因する。有病率は出生100.000人に約1~9人である。患者は、日和見性の真菌性、ウイルス性、および細菌性の微生物による生命を脅かす重症の再発性の感染の新生児期発症を呈し、皮膚発疹、慢性下痢、成長障害、および発熱も呈する。細胞レベルでは、RAG1/2欠損は、B細胞およびT細胞における野生型V(D)J組換え活性を1%未満にする。その結果としての免疫学的観察には、重篤なTリンパ球減少症およびBリンパ球減少症、正常なNK数、ならびに低いかまたは存在しない血清免疫グロブリンが含まれる。V(D)J組換え活性を損なうが、消失させない低形質RAG変異は、紅皮症、好酸球増加症、慢性大腸炎、リンパ節腫脹、および重篤な免疫不全に関連する重症免疫不全症であるオーメン症候群につながる[2]。
重症複合免疫不全症(SCID)の18を超える異なる型の遺伝学的基盤が同定されている。全ての場合において、遺伝子欠陥が、T細胞発達またはT細胞機能の不全につながる[1]。種々の欠陥は、影響される経路によって、または変異から生じる特定の免疫学的表現型によって、カテゴリー化され得る。SCID集団における種々の遺伝学的欠陥の分布は、IL2RG遺伝子の変異から最も高頻度に生じるX連鎖SCID(X-SCID)が、SCID表現型のおよそ40~50%を占めることを示している。SCID症例の約30%を占める2番目に高頻度のSCID型は、組換え活性化遺伝子RAG1および/またはRAG2におけるヌル変異に起因する。有病率は出生100.000人に約1~9人である。患者は、日和見性の真菌性、ウイルス性、および細菌性の微生物による生命を脅かす重症の再発性の感染の新生児期発症を呈し、皮膚発疹、慢性下痢、成長障害、および発熱も呈する。細胞レベルでは、RAG1/2欠損は、B細胞およびT細胞における野生型V(D)J組換え活性を1%未満にする。その結果としての免疫学的観察には、重篤なTリンパ球減少症およびBリンパ球減少症、正常なNK数、ならびに低いかまたは存在しない血清免疫グロブリンが含まれる。V(D)J組換え活性を損なうが、消失させない低形質RAG変異は、紅皮症、好酸球増加症、慢性大腸炎、リンパ節腫脹、および重篤な免疫不全に関連する重症免疫不全症であるオーメン症候群につながる[2]。
マウス造血幹細胞(HSC)へのレンチウイルスベースの遺伝子導入は、マウスモデルにおける疾患を、ある程度、修正し得ることが示されているが[3,4]、RAG1/2の天然の時空間的に厳密に調節された発現は、これらのウイルス遺伝子導入アプローチでは再現され得なかった。結果としての不完全な胸腺再構成およびヒトオーメン症候群に類似した疾患表現型は、遺伝毒性と、RAG欠損に関連する自己免疫の回避との間のバランスを見出す上でのジレンマを明らかにした。さらに、レンチウイルスベクターは、ヒトゲノムへの非ランダムな組み込みパターンを示し、遺伝子発現を調節不全にする可能性を有する。したがって、将来、臨床的に使用するため、初代ヒトHSCにおけるRAG1/2の効果的な編集のためのヌクレアーゼテクノロジーを開発し、試験することは、重要である。RAG欠陥の完全な修正には、生理学的に調節された発現が必要であるため、これは、特に重要である。
したがって、重症複合免疫不全症(SCID)を治療するための新規治療アプローチが、現在、必要とされている。
本発明は、HSC、特に、長期造血再構築能を持つHSC(LT-HSC)におけるRAG1欠損の修正を可能にする、RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)を治療するための改善された遺伝子治療アプローチを提供することによって、この必要性に対処する。具体的には、本発明は、重症複合免疫不全症(SCID)を引き起こす少なくとも1つの変異を含む非機能性内在性RAG1遺伝子座を特異的に標的とする遺伝子編集試薬、例えば、TALEヌクレアーゼを含む、HSCを遺伝子修飾するための手段および方法を提供する。結果として、HSCのゲノム内の非機能性内在性RAG1遺伝子座に組み込まれ、それによって、機能性RAG1タンパク質の発現を可能にすることによって、正常な細胞表現型を回復させる、機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列を含む外来性配列を含む、RAG1が編集された改変されたHSCが提供される。
本発明は、以下の項によって、さらに要約され得る:
1. 5'末端から3'末端へ、核酸配列SEQ ID NO:12と、機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列と、ポリAシグナルとを含む外来性配列を含む、RAG1が編集された改変造血幹細胞(HSC)であって、該外来性配列が該HSCのゲノム内の非機能性内在性RAG1遺伝子座のイントロン1(SEQ ID NO:28)に組み込まれている、RAG1が編集された改変造血幹細胞(HSC)。
2. 前記RAG1タンパク質をコードする核酸配列が、コドンが最適化された核酸配列である、項1に記載の改変HSC。
3. 前記RAG1のコドンが最適化された核酸配列が、核酸配列SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:68、またはSEQ ID NO:71;好ましくは、SEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:71を含む、項2に記載の改変HSC。
4. 前記ポリAシグナルが核酸配列SEQ ID NO:27を含む、項1~3のいずれか一項に記載の改変HSC。
5. 前記外来性配列が、前記核酸配列SEQ ID NO:12と、前記機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列との間に配置されたSEQ ID NO:29の5'UTRをさらに含む、項1~4のいずれか一項に記載の改変HSC。
6. 前記外来性配列が核酸配列SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:69、またはSEQ ID NO:72;好ましくは、SEQ ID NO:69またはSEQ ID NO:72を含む、項1~5のいずれか一項に記載の改変HSC。
7. 項1~6のいずれか一項に記載の改変HSCを含む細胞の集団。
8. 少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%の、RAG1が編集された改変HSCを含む、項7に記載の細胞の集団。
9. 長期造血再構築能を持つHSCを含む、項7または8に記載の細胞の集団。
10. 前記長期造血再構築能を持つHSCの少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、または少なくとも30%が、RAG1が編集された改変HSCである、項9に記載の細胞の集団。
11. HSC内の内在性RAG1遺伝子座のイントロン1(SEQ ID NO:28)を標的とするTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
12. SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列を標的とする、項11に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
13. SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を標的とする第1のモノマーと、SEQ ID NO:43のポリヌクレオチド配列を標的とする第2のモノマーとを含む、項11または12に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
14. SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む第1のモノマー、またはSEQ ID NO:4に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつSEQ ID NO:42の配列を標的とするそのバリアントと、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む第2のモノマー、またはSEQ ID NO:5に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつSEQ ID NO:43の配列を標的とするそのバリアントとを含む、項11~13のいずれか一項に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
15. SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む第1のモノマーと、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む第2のモノマーとを含む、項11~13のいずれか一項に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
16. SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列を標的とする、項11に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
17. SEQ ID NO:39のポリヌクレオチド配列を標的とする第1のモノマーと、SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を標的とする第2のモノマーとを含む、項11または16に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
18. SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む第1のモノマー、またはSEQ ID NO:2に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつSEQ ID NO:39の配列を標的とするそのバリアントと、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む第2のモノマー、またはSEQ ID NO:3に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつSEQ ID NO:40の配列を標的とするそのバリアントとを含む、項11、16、または17によるTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
19. SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む第1のモノマーと、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む第2のモノマーとを含む、項11、16、17、または18によるTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
20. 項11~19のいずれか一項に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーをコードする単離された核酸またはベクター。
21. mRNAである、項20に記載の単離された核酸。
22. 項1~6のいずれか一項において定義された外来性配列を含む単離された核酸またはベクターであって、該外来性配列が、その5'末端にある左側相同領域とその3'末端にある右側相同領域との間に配置されており、該相同領域が、RAG1のSEQ ID NO:28のイントロン1の一部に対するものである、単離された核酸またはベクター。
23. 非組み込み型ウイルスベクター、例えば、AAVベクターまたはIDLVベクターである、項22に記載のベクター。
24. AAVベクター、例えば、AAV6ベクターである。項22または23に記載のベクター。
25. 一本鎖DNAである、項22に記載の単離された核酸。
26. 項11~19のいずれか一項に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーを含み、かつ項1~6のいずれか一項において定義された外来性配列、および/または項22~25のいずれか一項に記載の単離された核酸もしくはベクターを含むHSC、を含む細胞の集団。
27. 項12~15のいずれか一項に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーを含み、かつ項1~6のいずれか一項において定義された外来性配列、および/または項22~25のいずれか一項に記載の単離された核酸もしくはベクターを含むHSC、を含む、項26に記載の集団。
28. 項16~19のいずれか一項に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーを含み、かつ項1~6のいずれか一項において定義された外来性配列、および/または項22~25のいずれか一項に記載の単離された核酸もしくはベクターを含むHSC、を含む、項26に記載の集団。
29. 項1~6のいずれか一項に記載の改変HSC、または項7~10および26~28のいずれか一項に記載の細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤および/または担体とを含む薬学的組成物。
30. RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)の治療において使用するための、項1~6のいずれか一項に記載の改変HSC、項7~10および26~28のいずれか一項に記載の細胞の集団、または項29に記載の薬学的組成物。
31. 造血幹細胞移植において使用するための、項1~6のいずれか一項に記載の改変HSC、項7~10および26~28のいずれか一項に記載の細胞の集団、または項29に記載の薬学的組成物。
32. 項1~6のいずれか一項に記載の改変HSC、項7~10および26~28のいずれか一項に記載の細胞の集団、または項29に記載の薬学的組成物を患者に投与することを含む、それを必要とする患者におけるRAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)を治療する方法。
33. 項1~6のいずれか一項に記載の改変HSC、項7~10および26~28のいずれか一項に記載の細胞の集団、または項29に記載の薬学的組成物を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における造血幹細胞移植の方法。
34. (i) 少なくとも1つの項22~25のいずれか一項に記載の単離された核酸またはベクターと、
(ii) 項11~19のいずれか一項に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーをコードする少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと
を含むキット。
(ii) 項11~19のいずれか一項に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーをコードする少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと
を含むキット。
35. 核酸配列SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26、70、またはSEQ ID NO:73を含む単離された核酸またはベクターと、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸またはベクターとを含む、項34に記載のキット。
36. HSCの非機能性RAG1内在性遺伝子座のSEQ ID NO:28のイントロン1への機能性RAG1配列の組み込みにおける、項11~19のいずれか一項に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー、または該TALEヌクレアーゼヘテロダイマーをコードする単離された核酸もしくはベクター、または項34もしくは35によるキットのエクスビボでの使用。
37. RAG1が編集された改変造血幹細胞を調製する方法であって、改変対象のHSCに
(i) 項1~6のいずれか一項において定義された外来性配列を含む少なくとも1つの単離された核酸またはベクターであって、該外来性配列が、その5'末端にある左側相同領域とその3'末端にある右側相同領域との間に配置されており、該相同領域が、RAG1のSEQ ID NO:28のイントロン1の一部に対するものである、少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと;
(ii) 該HSCの内在性RAG1遺伝子座のSEQ ID NO:28のイントロン1の中の配列を標的としかつ切断することができる、DNA切断を誘導する配列特異的試薬をコードする、少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと
を導入する工程を含み、それによって、RAG1が編集された改変造血幹細胞が得られる、方法。
(i) 項1~6のいずれか一項において定義された外来性配列を含む少なくとも1つの単離された核酸またはベクターであって、該外来性配列が、その5'末端にある左側相同領域とその3'末端にある右側相同領域との間に配置されており、該相同領域が、RAG1のSEQ ID NO:28のイントロン1の一部に対するものである、少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと;
(ii) 該HSCの内在性RAG1遺伝子座のSEQ ID NO:28のイントロン1の中の配列を標的としかつ切断することができる、DNA切断を誘導する配列特異的試薬をコードする、少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと
を導入する工程を含み、それによって、RAG1が編集された改変造血幹細胞が得られる、方法。
38. 前記DNA切断を誘導する配列特異的試薬が、項11~19のいずれか一項に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーである、項37に記載の方法。
39. 前記DNA切断を誘導する配列特異的試薬が、項12~15のいずれか一項に記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーである、項37または38に記載の方法。
40. 前記(i)の核酸またはベクターが、核酸配列SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:70、またはSEQ ID NO:73を含む外来性配列を含み、前記(ii)の核酸またはベクターが、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、項37~39のいずれか一項に記載の方法。
41. (i)において、前記ベクターが非組み込み型ウイルスベクター、例えば、AAVまたはIDLVである、項37~40のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記ベクターがAAVベクター、例えば、AAV6ベクターである、項41に記載の方法。
43. (i)において、前記単離された核酸が一本鎖DNAである、項37~40のいずれか一項に記載の方法。
44. (ii)において、前記単離された核酸が電気穿孔によってmRNAとしてHSCに導入される、項37~43のいずれか一項に記載の方法。
45. p53タンパク質のドミナントネガティブ断片、例えば、SEQ ID NO:10のGSE56、および/またはp53結合タンパク質1(53BP1)阻害剤、例えば、SEQ ID NO:11のp53結合タンパク質1阻害剤、もしくは腫瘍抑制因子p53結合タンパク質1のドミナントネガティブ型を導入することを含む、項37~44のいずれか一項に記載の方法。
46. ドミナントネガティブp53断片、例えば、SEQ ID NO:10のGSE56をコードする核酸配列を含む核酸、および/またはp53結合タンパク質1阻害剤、例えば、SEQ ID NO:11のp53結合タンパク質1阻害剤、もしくは腫瘍抑制因子p53結合タンパク質1のドミナントネガティブ型をコードする核酸配列を含む核酸配列を導入することを含む、項37~45のいずれか一項に記載の方法。
47. HSCが、ヒトドナーに由来する組織試料から単離される、項37~46のいずれか一項に記載の方法。
48. ヒトドナーが、RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)に罹患しているヒト患者である、項47に記載の方法。
49. 組織試料が末梢血試料である、項47または48に記載の方法。
50. 組織試料が、組織試料を得る前に少なくとも1つのHSC動員剤を投与されたヒトドナーから得られる、項47~49のいずれか一項に記載の方法。
51. HSC動員剤がG-CSFおよび/またはプレリキサホルである、項50に記載の方法。
52. 項37~51のいずれか一項に記載の方法によって得られ得る、RAG1が編集された改変造血幹細胞。
53. RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)の治療において使用するための、項37~51のいずれか一項に記載の方法によって得られ得る、RAG1が編集された改変造血幹細胞。
54. 改変されるHSCのドナーであった患者におけるRAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)の治療において使用するための、項37~51のいずれか一項に記載の方法によって得られ得る、RAG1が編集された改変造血幹細胞。
55. 造血幹細胞移植において使用するための、項37~51のいずれか一項に記載の方法によって得られ得る、RAG1が編集された改変造血幹細胞。
発明の詳細な説明
本明細書において特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書において特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書に記載されるものと類似または同等の全ての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得るが、適切な方法および材料が本明細書に記載される。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照によって組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は、他に明示されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。
本発明の実施は、他に示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を利用するが、これらは当業者の技能の範囲内である。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology[Frederick M.AUSUBEL(2000)Wiley and son Inc,Library of Congress,USA;Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition][Sambrook et al(2001)Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press];Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984);Mullisら、米国特許第4,683,195号;Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higgins eds.1984);Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984);Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York)、特に、Vol.154および155(Wu et al.eds.)ならびにVol.185,"Gene Expression Technology"(D.Goeddel,ed.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986);ならびにManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)を参照すること。
本発明の細胞および細胞集団
上述のように、本発明は、HSC、特に、長期造血再構築能を持つ(HSC)におけるRAG1欠損の修正を可能にする、RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)を治療するための改善された遺伝子治療アプローチである。具体的には、本発明は、重症複合免疫不全症(SCID)を引き起こす少なくとも1つの変異を含む非機能性内在性RAG1遺伝子座を特異的に標的とする遺伝子編集試薬、例えば、TALEヌクレアーゼを含む、HSCを遺伝子修飾するための手段および方法を提供する。結果として、HSCのゲノム内の非機能性内在性RAG1遺伝子座に組み込まれ、それによって、機能性RAG1タンパク質の発現を可能にすることによって正常な細胞表現型を回復させる、機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列を含む外来性配列を含む、RAG1が編集された改変されたHSCが提供される。
上述のように、本発明は、HSC、特に、長期造血再構築能を持つ(HSC)におけるRAG1欠損の修正を可能にする、RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)を治療するための改善された遺伝子治療アプローチである。具体的には、本発明は、重症複合免疫不全症(SCID)を引き起こす少なくとも1つの変異を含む非機能性内在性RAG1遺伝子座を特異的に標的とする遺伝子編集試薬、例えば、TALEヌクレアーゼを含む、HSCを遺伝子修飾するための手段および方法を提供する。結果として、HSCのゲノム内の非機能性内在性RAG1遺伝子座に組み込まれ、それによって、機能性RAG1タンパク質の発現を可能にすることによって正常な細胞表現型を回復させる、機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列を含む外来性配列を含む、RAG1が編集された改変されたHSCが提供される。
重症複合免疫不全症(SCID)は、RAG1タンパク質全体をコードするRAG1遺伝子のエクソン2の中の1つまたは複数の変異によって引き起こされるため、本発明は、具体的には、HSC、特に、SCIDに罹患している患者に由来するHSCにおいて、内在性RAG1遺伝子座のイントロン1の下流の欠陥RAG1遺伝子配列を、修正RAG1コード配列に交換することを目標とする。さらに、実施例において示されるように、驚くべきことに、人工スプライス部位、特に、SEQ ID NO:12の人工スプライス部位が、外来性配列内のRAG1コード配列の5'側に置かれたとき、天然スプライス部位が代わりに使用された構築物と比較して、RAG1発現が大幅に改善されることを、本発明者らは見出した。
したがって、一般的な局面において、本発明は、5'末端から3'末端へ、SEQ ID NO:12の核酸配列と、機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列と、ポリAシグナルとを含む外来性配列を含む、RAG1が編集された改変された造血幹細胞(HSC)に関し、ここで、該外来性配列は、該HSCのゲノム内の非機能性内在性RAG1遺伝子座のイントロン1(SEQ ID NO:28)に組み込まれている。
「機能性RAG1タンパク質」とは、SEQ ID NO:1のRAG1タンパク質を意味する。例示的な非限定的なコード配列は、SEQ ID NO:13に示される。
「非機能性内在性RAG1遺伝子座」とは、疾患状態、例えば、重症複合免疫不全症(SCID)を引き起こす1つまたは複数の変異を含有している内在性RAG1遺伝子の少なくとも1つのアレルを意味する。現在までに、103のミスセンス変異、18のナンセンス変異、29のフレームシフト変異を含む150のRAG1変異が、SCID患者において同定されている[5]。
通常、内在性RAG1遺伝子座に組み込まれると、当該外来性配列は、SEQ ID NO:1のRAG1タンパク質の発現を可能にする。
改変HSCは、初代細胞であり得る。初代細胞は、より機能的であり、腫瘍形成性が低いと見なされるため、細胞治療において一般的に使用されている。通常、初代HCS細胞は、当技術分野において公知の多様な方法を通じて、SCIDに罹患している患者から得られ得る。例えば、初代HSCは、針または注射器を使用して、骨髄から、より具体的には、骨盤の腸骨稜から採取され得る。あるいは、細胞が骨髄を離れ、血管内を循環するよう誘導するHSC動員剤、例えば、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4(CXCR4)アンタゴニスト、例えば、AMD3100(プレリキサホルおよびMOZOBIL(Genzyme(Boston,Mass.))としても公知)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、ならびにケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド2(CXCL2、GROβとも呼ばれる)を、血液ドナーに注射しながら、循環末梢血からHSCを採集してもよい。HSCは、臍帯血から採集されてもよい。
いくつかの態様によると、改変HSCは、哺乳動物HSC、好ましくは、ヒトHSCである。
いくつかの態様によると、改変HSCは、長期造血再構築能を持つHSC(LT-HSC)である。
いくつかの態様によると、改変HSCは、短期造血再構築能を持つHSC(ST-HSC)である。
いくつかの態様によると、改変HSCは、少なくともCD34+である。
いくつかの態様によると、改変HSCは、少なくともCD34+、CD90+、かつCD133+である。
いくつかの態様によると、改変HSCは、少なくともCD34+、CD38-、CD45RA-、CD90+、かつCD133+である。
いくつかの態様によると、改変HSCは、少なくともCD34+、CD38-、かつCD45RA-である。
いくつかの態様によると、改変HSCは、少なくともCD34+、CD38-、CD45RA-、CD90-、かつCD133-である。
機能性RAG1ポリペプチドの発現を改善するため、そして内在性RAG1コード配列との相同組換えを回避するため、RAG1タンパク質をコードする核酸配列は、コドンが最適化されてもよい。したがって、いくつかの態様によると、RAG1タンパク質をコードする核酸配列は、コドンが最適化された核酸配列である。
「コドンが最適化された」とは、少なくとも1つの、または複数の、または相当数のコドンを、その脊椎動物の遺伝子においてより高頻度に使用される1つまたは複数のコドンに交換することによって、所定の脊椎動物、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物の細胞における発現のため、ポリヌクレオチド配列が適合化されていることを意味する。したがって、RAG1タンパク質をコードする核酸配列は、コドン最適化に基づき、所定の生物における最適な遺伝子発現のため、調整され得る。コドン最適化は、例えば、(Kazusa DNA Research Institute(Japan)によって管理されている)http://www.kazusa.or.jp/codon/において入手可能な「コドン使用データベース(Codon Usage Database)」にある、確立されたコドン使用表、またはその他の種類のコンピュータアルゴリズムに基づき、実施され得る。非限定的な例は、タンパク質発現の種々の段階に関与する多様な重要因子、例えば、コドン適合性、mRNA構造、ならびに転写および翻訳における様々なシスエレメントを考慮に入れる、GenScript(登録商標)のOptimumGene PSOアルゴリズムである。コドン使用表またはその他の種類のコンピュータアルゴリズムを活用することによって、当業者は、任意の所定のポリペプチド配列に頻度を適用し、そのポリペプチドをコードするが、所定の生物にとって最適なコドンを使用するコドンが最適化されたコード領域の核酸断片を作製することができる。
好ましくは、コドン最適化は、クリプティックスプライシング部位の除去も含み、マイクロRNA標的部位、および/または翻訳を妨害するmRNA二次構造を生成するであろう配列の除去も含む。したがって、いくつかの態様によると、コドンが最適化された核酸配列は、少なくとも1つのクリプティックスプライシング部位を除去するため、かつ/または少なくとも1つのマイクロRNA標的部位、および/もしくは翻訳を妨害するmRNA二次構造を生成するであろう配列を除去するため、さらに最適化されている。クリプティックスプライシング部位の予測を可能にするコンピュータアルゴリズムは、当業者に周知であり、例えば、http://wangcomputing.com/assp/において入手可能なスプライス予測ツールを含む。同様に、当業者は、miRNA標的部位を同定するため、確立されたコンピュータアルゴリズム、例えば、http://mirdb.org/において入手可能なmiRNA標的予測ツールを使用することができる。
いくつかの態様によると、RAG1のコドンが最適化された核酸配列は、SEQ ID NO:19またはSEQ ID NO:20の核酸配列を含む。
いくつかの態様によると、RAG1のコドンが最適化された核酸配列は、SEQ ID NO:19の核酸配列を含む。
いくつかの態様によると、RAG1のコドンが最適化された核酸配列は、SEQ ID NO:20の核酸配列を含む。
さらなる態様によると、RAG1のコドンが最適化された核酸配列は、SEQ ID NO:68またはSEQ ID NO:71の核酸配列を含む。
さらに、mRNAの核外輸送、翻訳、および安定性を容易にするため、外来性配列は、ポリAシグナルを含む。ポリAシグナルの非限定的な例には、SV40、hGH(ヒト成長ホルモン)、bGH(ウシ成長ホルモン)、およびrbGlob(ウサギβグロビン)に由来するポリAシグナルが含まれる。いくつかの態様によると、ポリAシグナルは、SEQ ID NO:27の核酸配列を含む。
さらに、mRNAからのコード配列の翻訳の調節を可能にするため、外来性配列は、SEQ ID NO:12の核酸配列と、機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列との間に配置された(リーダー配列、転写物リーダー、またはリーダーRNAとしても公知の)5'非翻訳領域(5'UTR)をさらに含み得る。そのような5'UTRの非限定的な例は、SEQ ID NO:29に示される。
いくつかの態様によると、外来性配列は、SEQ ID NO:23を含む。
いくつかの態様によると、外来性配列は、SEQ ID NO:25を含む。
いくつかの態様によると、外来性配列は、SEQ ID NO:69を含む。
いくつかの態様によると、外来性配列は、SEQ ID NO:72を含む。
本発明は、本発明によるRAG1が編集された改変HSCを含む細胞の集団をさらに提供する。
好ましくは、細胞の集団は、少なくとも約1%、例えば、少なくとも10%の、RAG1が編集された改変HSCを含む。
いくつかの態様によると、細胞の集団の全細胞の少なくとも20%、例えば、少なくとも30%または少なくとも40%が、RAG1が編集された改変HSCである。
いくつかの態様によると、細胞の集団の全細胞の少なくとも50%、例えば、少なくとも60%または少なくとも70%が、RAG1が編集された改変HSCである。
いくつかの態様によると、細胞の集団の全細胞の少なくとも80%、例えば、少なくとも90%または少なくとも95%が、RAG1が編集された改変HSCである。
本発明による細胞の集団は、長期造血再構築能を持つHSC(LT-HSC)を含み得る。いくつかの態様によると、LT-HSCの少なくとも10%、例えば、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、または少なくとも30%が、本発明のRAG1が編集された改変HSCである。
本発明は、本明細書に開示される作製方法のいずれかによって得られ得る、RAG1が編集された改変HSC、およびRAG1が編集された改変HSCの集団をさらに提供する。
本発明による遺伝子編集のための手段および方法
本発明は、重症複合免疫不全症(SCID)を引き起こす少なくとも1つの変異を含む非機能性内在性RAG1遺伝子を特異的に標的とする遺伝子編集試薬を含み、それによって、正常な細胞表現型の回復を可能にする、HSCを遺伝子修飾するための手段および方法をさらに提供する。遺伝子機能を達成するための標的特異的(即ち、部位特異的)な組み込みは、DNA切断を誘導する配列特異的試薬、例えば、低頻度切断エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼと、標的部位に対する相同性を保持しかつ修正配列を含む外来性ポリヌクレオチドドナーテンプレートとを使用することによって、適切に実施される。標的特異的組み込みは、Ownsら[6]、Voigtら[7]、またはBhattおよびChalmers[8]に記載されているような、転位を誘導する配列特異的試薬を使用しても達成され得る。
本発明は、重症複合免疫不全症(SCID)を引き起こす少なくとも1つの変異を含む非機能性内在性RAG1遺伝子を特異的に標的とする遺伝子編集試薬を含み、それによって、正常な細胞表現型の回復を可能にする、HSCを遺伝子修飾するための手段および方法をさらに提供する。遺伝子機能を達成するための標的特異的(即ち、部位特異的)な組み込みは、DNA切断を誘導する配列特異的試薬、例えば、低頻度切断エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼと、標的部位に対する相同性を保持しかつ修正配列を含む外来性ポリヌクレオチドドナーテンプレートとを使用することによって、適切に実施される。標的特異的組み込みは、Ownsら[6]、Voigtら[7]、またはBhattおよびChalmers[8]に記載されているような、転位を誘導する配列特異的試薬を使用しても達成され得る。
したがって、本発明は、内在性RAG1遺伝子座のイントロン1の中の配列を標的としかつ切断することができる、DNA切断を誘導する配列特異的試薬を提供する。
本発明による「DNA切断を誘導する配列特異的試薬」の非限定的な例には、ニッカーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有する試薬が含まれる。配列特異的試薬は、DNA結合ドメインと触媒活性を示すもう1つのドメインとを含むキメラポリペプチドであり得る。そのような触媒活性は、例えば、遺伝子不活性化を実施するためのヌクレアーゼ、または相同組換えによる遺伝子組み込みを容易にするための付着末端を作出することによって遺伝子挿入を優先的に実施するための、もしくはKomorら[9]に記載されているような塩基編集を実施するためのニッカーゼもしくはダブルニッカーゼであり得る。
通常、本発明の配列特異的試薬は、HSC内の内在性RAG1遺伝子座のイントロン1(SEQ ID NO:28)の中の「標的配列」を認識し、それに結合する能力を有する。配列特異的試薬が認識し、結合する「標的配列」は、ヒトゲノムデータベース、例えば、http://www.ensembl.org/index.htmlから入手可能なソフトウェアおよびデータを使用して決定され得るように、通常、イントロン1において稀であるか、または独特であるよう選択される。そのような「標的配列」は、好ましくは、SEQ ID NO:41(TALEN-6の標的領域)またはSEQ ID NO:38(TALEN-2の標的領域)に示されるものである。
したがって、本発明によると、SEQ ID NO:41またはSEQ ID NO:38に示される配列を標的としかつ切断することができる、DNA切断を誘導する配列特異的試薬が提供される。
いくつかの態様によると、DNA切断を誘導する配列特異的試薬は、低頻度切断エンドヌクレアーゼである。「低頻度切断エンドヌクレアーゼ」とは、認識配列が、通常、10~50の連続する塩基対、好ましくは、12~30bp、より好ましくは、14~20bpの範囲である限りにおいて選択される配列特異的エンドヌクレアーゼ試薬である。
いくつかの態様によると、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、「改変された」または「プログラミング可能な」低頻度切断エンドヌクレアーゼ、例えば、例えば、Arnould S.ら(W02004067736)によって記載されているようなホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、Urnov F.ら[10]によって記載されているようなジンフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、例えば、Mussolinoら[11]によって記載されているようなTALEヌクレアーゼ、または、例えば、Boisselら[12]によって記載されているようなMegaTALヌクレアーゼである。
例えば、Mussolinoら[13]によって報告されているように、より高い特異性のため、TALEヌクレアーゼは、特に、ヘテロダイマーの形態において、即ち、(「5’」または「順方向」とも呼ばれる)「右」モノマーと(「3’」または「逆」とも呼ばれる)「左」モノマーとの対で作用する形態において、治療的適用のための特に適当な配列特異的ヌクレアーゼ試薬であることが判明している。したがって、いくつかの好ましい態様によると、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼである。
したがって、本発明は、HSC内の内在性RAG1遺伝子座のイントロン1を標的とするTALEヌクレアーゼヘテロダイマーを提供する。
具体的には、本発明は、SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列(TALEN-6の標的領域)を標的とするTALEヌクレアーゼヘテロダイマーを提供する。
いくつかの態様によると、前記TALEヌクレアーゼヘテロダイマーは、SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を標的とする第1のモノマーと、SEQ ID NO:43のポリヌクレオチド配列を標的とする第2のモノマーとを含む。
いくつかの態様によると、前記TALEヌクレアーゼヘテロダイマーは、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む第1のモノマー、またはSEQ ID NO:4に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列42を標的とするそのバリアントと、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む第2のモノマー、またはSEQ ID NO:5に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列43を標的とするそのバリアントとを含む。
いくつかの態様によると、前記TALEヌクレアーゼヘテロダイマーは、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む第1のモノマーと、アミノ酸配列SEQ ID NO:5を含む第2のモノマーとを含む。
これらのモノマーおよびそれらのバリアントは、それぞれの標的ポリヌクレオチド配列SEQ ID NO:42およびSEQ ID NO:43に結合するよう設計されており、それぞれ、RVD配列NI-NG-NN-NI-NG-HD-NI-NN-HD-NI-HD-HD-NG-NI-NI-NGおよびRVD配列NI-NG-NN-NG-NI-NG-NG-NI-NI-NI-NG-HD-NG-NG-HD-NGを含む。切断は、標的配列の間の内在性RAG1配列において起こる。
本発明は、SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列(TALEN-2の標的領域)を標的とするTALEヌクレアーゼヘテロダイマーも提供する。
いくつかの態様によると、前記TALEヌクレアーゼヘテロダイマーは、SEQ ID NO:39のポリヌクレオチド配列を標的とする第1のモノマーと、SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を標的とする第2のモノマーとを含む。
いくつかの態様によると、前記TALEヌクレアーゼヘテロダイマーは、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む第1のモノマー、またはSEQ ID NO:2に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列39を標的とするそのバリアントと、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む第2のモノマー、またはSEQ ID NO:3に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列40を標的とするそのバリアントとを含む。
いくつかの態様によると、TALEヌクレアーゼヘテロダイマーは、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む第1のモノマーと、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む第2のモノマーとを含む。
これらのモノマーおよびそれらのバリアントは、それぞれの標的ポリヌクレオチド配列SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40に結合するよう設計されており、それぞれ、RVD配列HD-NG-NI-NG-NN-NI-NG-HD-NI-NN-HD-NI-HD-HD-NG-NGおよびRVD配列NN-NG-NI-NG-NG-NI-NI-NI-NG-HD-NG-NG-HD-NG-NI-NGを含む。切断は、標的配列の間の内在性RAG1配列において起こる。
いくつかの態様によると、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、とりわけ、Doudna,J.ら[14]およびZetsche,B.ら[15]による教示に従って、RNAガイドと共に使用される、RNA誘導(guided)エンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9またはCpf1である。RNAガイドは、標的配列にハイブリダイズするよう設計される。
いくつかの態様によると、DNA切断を誘導する配列特異的試薬は、ニッカーゼである。
本発明は、本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬をコードする単離された核酸をさらに提供する。
いくつかの態様によると、単離された核酸は、mRNAである。
本発明は、本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、ウイルスベクター、より具体的には、非組み込み型ウイルスベクター、例えば、AAVベクターまたはIDLVベクターをさらに提供する。
本発明は、HSC、特に、RAG1に関連するSCIDに罹患している患者のHSCの遺伝子編集における、本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬、それをコードする本発明の単離された核酸、またはそれをコードするベクターのエクスビボでの使用も提供する。
本発明は、前記定義の外来性配列を、それを含む単離された核酸またはベクターの形態で、さらに提供する。単離された核酸またはベクターは、ポリヌクレオチドドナーテンプレートとして機能する。
相同組換えを介した外来性配列の標的特異的(即ち、部位特異的)組み込みを容易にするため、外来性配列は、内在性RAG1遺伝子座のイントロン1の一部に対して少なくとも80%の配列同一性を有する左および/または右側の相同配列の間に配置される。具体的には、外来性配列は、その5'末端にある左側相同領域とその3'末端にある右側相同領域との間に配置され、相同領域は、RAG1のSEQ ID NO:28のイントロン1の一部に対するものである。
切断された遺伝子座におけるNHEJ修復機序を介した外来性配列の標的特異的(即ち、部位特異的)組み込みを容易にするため、外来性配列は、マイクロホモロジー、即ち、短い相同DNA配列を含み得る。
本発明は、外来性配列を含む単離された核酸をさらに提供する。外来性配列を含む単離された核酸は、電気穿孔によって細胞に導入され得る二本鎖もしくは一本鎖のポリヌクレオチド、例えば、一本鎖DNA(「ssDNA」)および二本鎖DNA(「dsDNA」)として提供されてもよいし、またはウイルス形質導入を通じてウイルスベクター(例えば、AAV)の一部として提供されてもよい。ポリヌクレオチドドナーテンプレートとして機能する外来性配列を含むこの単離された核酸は、当技術分野において周知の方法によって細胞に導入される。
本発明は、外来性配列を含むベクター、例えば、外来性配列を含むウイルスベクター、より具体的には、非組み込み型ウイルスベクター、例えば、AAVベクターまたはIDLVベクターをさらに提供する。したがって、いくつかの態様によると、ベクターは、AAVベクター、好ましくは、AAV6ベクターである。例えば、Sather,B.D.ら[16]によって記載されているように、AAVベクター、具体的には、AAV6は、ポリヌクレオチドドナーテンプレートの細胞への形質導入のため、そして低頻度切断エンドヌクレアーゼによって指図される相同組換えによる組み込みを実施するため、特に適している。
本発明は、外来性配列を含む一本鎖核酸、例えば、一本鎖DNA(「ssDNA」)をさらに提供する。
本発明は、外来性配列を含む二本鎖核酸、例えば、二本鎖DNA(「dsDNA」)も提供する。
本発明において、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAは、いくつかの点でウイルスベクターより有利であり得る。例えば、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAは、ベクター特異的配列、例えば、LTRおよびITRを含有しておらず、作製過程における望ましくないプラスミド配列の混入を回避することができる。いくつかの態様によると、一本鎖DNAまたは二本鎖DNAは、DNA末端の保護、またはドナーテンプレートを分解から保護する特定の構造(例えば、ヘアピン、ループ)を含み得る。それらは、WO2012065143に記載されているような修飾、例えば、修飾された糖部分または修飾されたヌクレオシド間結合も含み得る。いくつかの態様において、dsDNA末端は共有結合的に閉鎖され得る。ssDNAおよびdsDNAの配列は、通常、インビトロで合成され、したがって、修飾された塩基(例えば、メチル化、ビオチン化等)の任意での組み入れを可能にするため、より容易に最適化され得る。いくつかの態様において、ssDNAおよびdsDNAの配列には、部位特異的ヌクレアーゼの配列、例えば、本発明に記載されるものを組み入れることができる。さらに、ssDNAおよびdsDNAは、宿主細胞において作製されるウイルスベクターより安価に優良製造規範(good manufacturing practices)(GMP)下で作製可能である。特異性に関して、ssDNAは、古典的な相同組換え(rad51依存性)ではなく、rad51非依存性の機序に主に頼るため、より特異的で安定的なゲノム組み込みを可能にすると見なされている。そのような組み込みは、特定の分子、例えば、53BP1の阻害剤および/もしくはGSE56;ならびに/またはsiRNA、例えば、rad51siRNA;ならびに/またはRad59mRNAもしくはヘリカーゼmRNA、例えば、Srs2、UvrD、PcrA、Rep、もしくはFBH1で細胞を処理することによって、さらに促進され得る。
本発明は、HSC、特に、RAG1に関連するSCIDに罹患している患者のHSCの遺伝子編集における、本明細書において定義される外来性配列を含む本発明の単離された核酸またはベクターのエクスビボでの使用も提供する。
本発明は、HSC、特に、RAG1に関連するSCIDに罹患している患者のHSCの遺伝子編集において使用するための、本明細書において定義される外来性配列を含む本発明の単離された核酸またはベクターと組み合わせられた、本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬、それをコードする本発明のポリヌクレオチド、またはそれをコードするベクターのエクスビボでの使用も提供する。
本発明は、
(i) 本明細書において定義される外来性配列を含む少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと、
(ii) 本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬をコードする少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと
を含むキットをさらに提供する。
(i) 本明細書において定義される外来性配列を含む少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと、
(ii) 本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬をコードする少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと
を含むキットをさらに提供する。
いくつかの態様によると、前記キットは、核酸配列SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:70、またはSEQ ID NO:73を含む単離された核酸またはベクターと、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸またはベクターとを含む。
いくつかの態様によると、前記キットは、核酸配列SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:70、またはSEQ ID NO:73を含む単離された核酸またはベクターと、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸またはベクターとを含む。
本発明は、HSC、特に、RAG1に関連するSCIDに罹患している患者のHSCの遺伝子編集における、本発明のキットのエクスビボでの使用も提供する。
本発明は、RAG1が編集された改変造血幹細胞を調製する方法であって、改変されるHSCに
(i) 本明細書において定義される外来性配列を含む少なくとも1つの単離された核酸またはベクターであって、該外来性配列が、その5'末端にある左側相同領域とその3'末端にある右側相同領域との間に配置されており、該相同領域が、RAG1のSEQ ID NO:28のイントロン1の一部に対するものである、少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと;
(ii) 本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬をコードする少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと
を導入することを含み、それによって、RAG1が編集された改変造血幹細胞が得られる、方法をさらに提供する。
(i) 本明細書において定義される外来性配列を含む少なくとも1つの単離された核酸またはベクターであって、該外来性配列が、その5'末端にある左側相同領域とその3'末端にある右側相同領域との間に配置されており、該相同領域が、RAG1のSEQ ID NO:28のイントロン1の一部に対するものである、少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと;
(ii) 本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬をコードする少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと
を導入することを含み、それによって、RAG1が編集された改変造血幹細胞が得られる、方法をさらに提供する。
方法は、具体的には、遺伝子治療によって、より具体的には、本明細書に記載される外来性配列およびDNA切断を誘導する配列特異的試薬を使用して、非機能性内在性RAG1遺伝子座に修正RAG1コード配列を組み込むことによって、RAG1に関連するSCIDに罹患している患者の治療のための、RAG1が編集された改変HSCを得るために、設計されている。
方法は、好ましくは、安定的に改変されたRAG1が編集されたHSCを得るため、エクスビボで実施される。次いで、得られた改変HSCは、本明細書に詳述される外来性配列を含む改変された細胞の長期インビボ作製のため、それを必要とする患者に生着させられ得る。
いくつかの態様によると、(i)の核酸またはベクターは、核酸配列SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:70、またはSEQ ID NO:73を含む外来性配列を含み、(ii)の核酸またはベクターは、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
いくつかの態様によると、(i)の核酸またはベクターは、核酸配列SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:70、またはSEQ ID NO:73を含む外来性配列を含み、(ii)の核酸またはベクターは、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
いくつかの態様によると、DNA切断を誘導する配列特異的試薬、例えば、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、細胞内に一過性に発現されるか、または送達され、即ち、該試薬は、RNA、より具体的には、mRNA、タンパク質、またはタンパク質と核酸とが混合された複合体(例えば、リボ核タンパク質)の場合のように、ゲノムに組み込まれるか、または長期間にわたって持続することは想定されていない。好ましくは、DNA切断を誘導する配列特異的試薬、例えば、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、配列特異的試薬をコードする核酸分子、例えば、DNA分子またはRNA分子、好ましくは、mRNA分子の形態で細胞に導入され、トランスフェクトされた細胞によって発現される。mRNA形態のDNA切断を誘導する配列特異的試薬、例えば、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、好ましくは、例えば、Kore A.L.ら(Locked nucleic acid (LNA)-modified dinucleotide mRNA cap analogue:synthesis,enzymatic incorporation,and utilization(2009)J Am Chem Soc.131(18):6364-5)によって記載されているように、当技術分野において周知の技術に従って、安定性を増強するためのキャップを含んで合成される。
いくつかの態様によると、DNA切断を誘導する配列特異的試薬は、ベクターを介してHSCに導入される。
いくつかの態様によると、DNAを誘導する配列特異的試薬は、電気穿孔によってmRNAとしてHSCに導入される。
いくつかの態様によると、DNA切断を誘導する配列特異的試薬は、ナノ粒子、好ましくは、HSC表面タンパク質、例えば、CD105(Uniprot#P17813)に対して特異的な親和性を有するリガンド、例えば、抗体によってコーティングされたナノ粒子を介して、HSCに導入される。好ましいナノ粒子は、ポリヌクレオチド形態の配列特異的試薬が、ポリβアミノエステルのポリマーと複合体化され、ポリグルタミン酸(PGA)によってコーティングされている、生分解性ポリマーナノ粒子である。
いくつかの態様によると、外来性配列および/またはDNA切断を誘導する配列特異的試薬の非ウイルス送達の方法、例えば、電気穿孔、リポフェクション、微量注入、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、または脂質:核酸コンジュゲート、裸のDNA、裸のRNA、キャッピングされたRNA、人工ビリオン、および薬剤によって増強されるDNA取り込みが使用され得る。例えば、Sonitron 2000系(Rich-Mar)を使用したソノポレーションも、送達のために使用され得る。
いくつかの態様によると、電気穿孔工程が、細胞をトランスフェクトするために使用され得る。通常、細胞をトランスフェクトするために使用される電気穿孔工程は、典型的には、WO/2004/083379、具体的には、23頁25行目~29頁11行目に記載されているような、処理体積全体で実質的に均一な100ボルト/cmより大きく、5,000ボルト/cmより小さいパルス電場を平行平板電極間に生成する、平行平板電極を含む密閉チャンバーにおいて実施される。1つのそのような電気穿孔チャンバーは、好ましくは、電極間隙の2乗(cm2)をチャンバー体積(cm3)で割った商によって定義される幾何学的因子(cm-1)を有し、ここで、幾何学的因子は0.1cm-1以下であり、細胞の懸濁物および配列特異的試薬は、培地が0.01~1.0ミリシーメンスに及ぶ範囲の伝導度を有するよう調整された培地の中にある。通常、細胞の懸濁物は、1つまたは複数の電場パルスを受ける。この方法では、懸濁物の処理体積はスケーラブルであり、チャンバー内の細胞の処理の時間は実質的に均一である。
方法は、HSCの相同組換えおよび/または生存度を増強する1つまたは複数のポリペプチド、例えば、ドミナントネガティブp53断片、例えば、GSE56、および/またはp53結合タンパク質1阻害剤、もしくは腫瘍タンパク質p53結合タンパク質のドミナントネガティブ型の使用をさらに含み得る。
いくつかの態様によると、方法は、ドミナントネガティブp53断片、例えば、SEQ ID NO:10のGSE56、および/またはp53結合タンパク質1阻害剤、例えば、SEQ ID NO:11のp53結合タンパク質1阻害剤、もしくは腫瘍タンパク質p53結合タンパク質1のドミナントネガティブ型を導入することをさらに含む。
いくつかの態様によると、方法は、ドミナントネガティブp53断片、例えば、SEQ ID NO:10のGSE56をコードする核酸配列を含む核酸、および/またはp53結合タンパク質1阻害剤、例えば、SEQ ID NO:11のp53結合タンパク質1阻害剤、もしくは腫瘍タンパク質p53結合タンパク質1のドミナントネガティブ型をコードする核酸配列を含む核酸配列を導入することをさらに含む。
いくつかの態様によると、HSCは、ヒトドナー、例えば、RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)に罹患しているヒト患者に由来する組織試料から単離される。
例えば、RAG1に関連するSCIDに罹患しているヒト患者は、R314W、C328Y、C358Y、K391E、R394Q、R394W、R396C、R396H、R396L、S401P、T403P、R404Q、R410Q、R410W、L411P、D429G、V433M、M435V、A444V、L454Q、R474C、L506F、L514R、G516A、W522C、D539V、R559S、R561H、H612R、R624H、R699Q/W、E722K、Y728H、C730F、L732P、R737H、R764P、R764H、E770K、R778Q、R778W、P786L、R841W、W896R、Y912C、I956T、F974L、R975Q、R975W、Q981P、およびK992Eからなる群より選択される少なくとも1つのRAG1変異を有し得る。
いくつかの態様によると、前記組織試料は、末梢血試料である。
いくつかの態様によると、前記組織試料は、組織試料を得る前に少なくとも1つのHSC動員剤、例えば、G-CSFおよび/またはプレリキサホルを投与されたヒトドナーから得られる。
本発明は、本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬と、本明細書において定義される外来性配列とを含むHSC、を含む細胞の集団をさらに提供する。
いくつかの態様によると、前記集団は、本発明によるTALEヌクレアーゼヘテロダイマーと、本明細書において定義される外来性配列とを含むHSCを含む。
HSCの活性化および遺伝子編集
動員された末梢血(MPB)の白血球アフェレーシスのため、通常、免疫磁気ビーズ、例えば、CliniMACSを使用して、CD34+細胞を処理し、濃縮する。精製されたCD34+細胞を、細胞培養グレードの幹細胞因子(SCF)(好ましくは、300ng/ml)の存在下で、好ましくは、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3L)(300ng/ml)、およびトロンボポエチン(TPO)(好ましくは、およそ100ng/ml)、さらにインターロイカインIL-3(好ましくは、60ng/ml超)(全て、CellGenix)を含む、無血清培地において、1×106細胞/mlで、好ましくは、12~24時間、培養バッグに播種した後、配列特異的試薬をコードするmRNAを含む電気穿孔緩衝液に移す。電気穿孔後、好ましくは、細胞を凍結保存する。
動員された末梢血(MPB)の白血球アフェレーシスのため、通常、免疫磁気ビーズ、例えば、CliniMACSを使用して、CD34+細胞を処理し、濃縮する。精製されたCD34+細胞を、細胞培養グレードの幹細胞因子(SCF)(好ましくは、300ng/ml)の存在下で、好ましくは、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3L)(300ng/ml)、およびトロンボポエチン(TPO)(好ましくは、およそ100ng/ml)、さらにインターロイカインIL-3(好ましくは、60ng/ml超)(全て、CellGenix)を含む、無血清培地において、1×106細胞/mlで、好ましくは、12~24時間、培養バッグに播種した後、配列特異的試薬をコードするmRNAを含む電気穿孔緩衝液に移す。電気穿孔後、好ましくは、細胞を凍結保存する。
本発明の治療方法、組成物、および使用
上記の本発明は、SCIDを引き起こす欠陥を元々有していた内在性RAG1遺伝子配列を、修正RAG1配列に交換し、かつ/または修正RAG1配列を組み込み、それによって、機能性RAG1タンパク質の発現を可能にすることによって、正常な細胞表現型を回復させた、RAG1が編集された改変HSC、またはそのような改変された細胞を含む集団の作製を可能にする。したがって、本発明のRAG1が編集された改変HSC、それぞれ、細胞の集団は、RAG1に関連するSCIDの治療において特に有用である。本発明によるこれらのRAG1が編集されたHSCまたは細胞の集団は、医薬、例えば、RAG1に関連するSCIDの治療において使用するための医薬の製造においても使用され得る。
上記の本発明は、SCIDを引き起こす欠陥を元々有していた内在性RAG1遺伝子配列を、修正RAG1配列に交換し、かつ/または修正RAG1配列を組み込み、それによって、機能性RAG1タンパク質の発現を可能にすることによって、正常な細胞表現型を回復させた、RAG1が編集された改変HSC、またはそのような改変された細胞を含む集団の作製を可能にする。したがって、本発明のRAG1が編集された改変HSC、それぞれ、細胞の集団は、RAG1に関連するSCIDの治療において特に有用である。本発明によるこれらのRAG1が編集されたHSCまたは細胞の集団は、医薬、例えば、RAG1に関連するSCIDの治療において使用するための医薬の製造においても使用され得る。
したがって、本発明は、RAG1に関連するSCIDの治療において使用するための、本発明による改変されたRAG-1編集HSCを提供する。
本発明は、造血幹細胞移植において使用するための、本発明による改変されたRAG-1編集HSCをさらに提供する。
本発明は、RAG1に関連するSCIDの治療において使用するための、本発明による細胞の集団をさらに提供する。
本発明は、造血幹細胞移植において使用するための、本発明による細胞の集団をさらに提供する。
本発明は、本発明によるRAG1が編集された改変HSCまたは本発明による細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤および/または担体とを含む薬学的組成物をさらに提供する。
適切には、そのような組成物は、本発明のRAG1が編集された改変HSC、または本発明の細胞の集団を、治療的に有効な量、含む。「有効量」または「治療的に有効な量」とは、対象に投与された時に、治療的または予防的な利益を提供するために十分である、即ち、疾患の治療を助ける、本明細書に記載される組成物の量をさす。「治療的に有効な量」を構成する組成物の量は、細胞調製物、状態およびその重症度、投与様式、ならびに治療される対象の年齢に依って変動し得るが、自身の知識および本開示を考慮して、当業者によってルーチンに決定され得る。
したがって、本発明は、より具体的には、改変されたRAG-1編集HSCの治療的に有効な集団に関し、ここで、集団内の細胞の少なくとも20%、好ましくは、50%、より好ましくは、80%が、本明細書に記載される方法のいずれかによって修飾されている。本発明による改変HSCの治療的に有効な集団は、機能性RAG1タンパク質の発現を可能にする修正された内在性RAG1遺伝子座を有する細胞を含む。
適切な薬学的に許容される賦形剤および担体は、当業者に周知であり、文献、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,the Handbook of Pharmaceutical Additives or the Handbook of Pharmaceutical Excipientsに記載されている。
いくつかの態様において、本発明は、(a)本発明のRAG1が編集された改変HSCの生存可能な組成物と;(b)HSCの凍結保存のために十分な量の凍結保存剤と;(c)薬学的に許容される担体とを含む凍結保存された薬学的組成物を提供する。
本明細書において使用されるように、「凍結保存」とは、低い氷点下の温度、例えば、(典型的には)77Kまたは-196℃(液体窒素の沸点)に冷却することによる細胞の保存をさす。これらの低温では、細胞死につながる生化学的反応を含む、任意の生物学的活性が、効果的に停止する。凍結保護剤は、低温での凍結または室温への加温による損傷から細胞を保存するため、氷点下の温度で、しばしば使用される。凍結に関連する有害作用は、(a)凍結保護剤の使用、(b)凍結速度の制御、および(c)分解反応を最小限に抑えるために十分に低い温度での保管によって回避され得る。使用され得る凍結保護剤には、ジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセロール、ポリビニルピロリジン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、ショ糖、エチレングリコール、i-エリスリトール、D-ソルビトール、D-マンニトール、D-ソルビトール、i-イノシトール、D-ラクトース、塩化コリン、アミノ酸、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート、および無機塩が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましい態様において、低濃度では細胞に対して無毒である液体、DMSOが使用される。低分子であるDMSOは、細胞内に自由に透過し、水と結びついて、凍結可能性を修飾し、氷形成による損傷を防止することによって、細胞内オルガネラを保護する。(例えば、20~25%の濃度への)血漿の添加は、DMSOの保護効果を強化することができる。約1%というDMSO濃度は、4℃より高い温度では毒性であるため、DMSOの添加後、細胞は、凍結するまで0~4℃に維持されなければならない。
本発明は、RAG1に関連するSCIDの治療において使用するための、本発明の薬学的組成物を提供する。
本発明は、造血幹細胞移植において使用するための、本発明の薬学的組成物も提供する。
本発明は、RAG1に関連するSCIDの治療において使用するための、本明細書において定義される外来性配列を含む本発明の単離された核酸またはベクターも提供する。
本発明は、RAG1に関連するSCIDの治療において使用するための、本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬、それをコードする本発明の単離された核酸、またはそれをコードするベクターも提供する。
本発明は、RAG1に関連するSCIDの治療において使用するための、本明細書において定義される外来性配列を含む本発明の単離された核酸もしくはベクターと組み合わせられた、本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬、それをコードする本発明の単離された核酸、またはそれをコードするベクターも提供する。
本発明は、RAG1に関連するSCIDの治療において使用するための本発明のキットも提供する。
本発明は、HSC、特に、RAG1に関連するSCIDに罹患している患者のHSCにおけるインビボ遺伝子編集において使用するための、本明細書において定義される外来性配列を含む本発明の単離された核酸またはベクターと組み合わせられた、本発明のDNA切断を誘導する配列特異的試薬、それをコードする本発明のポリヌクレオチド、またはそれをコードするベクターも提供する。
本発明は、本発明のRAG1が編集された改変HSC、本発明の細胞の集団、または本発明の薬学的組成物を患者に投与することを含む、それを必要とする患者、例えば、ヒト患者におけるRAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)を治療する方法をさらに提供する。
本発明は、本発明のRAG1が編集された改変HSC、本発明の細胞の集団、または本発明の薬学的組成物を患者に投与することを含む、それを必要とする患者、例えば、ヒト患者における造血幹細胞移植の方法をさらに提供する。
通常、本発明によるRAG1に関連する(SCID)の治療は、寛解的、完治的、または予防的なものであり得る。
本発明による改変HSCまたは細胞の集団の投与は、注射、注入、植込み、または移植を含む任意の便利な様式で実施され得る。本発明による改変HSCまたは細胞の集団は、静脈内注射によって患者に投与され得る。
HSCまたは細胞の集団の投与は、体重1kg当たり104~108個の遺伝子編集細胞、好ましくは、体重1kg当たり105~106個の細胞(これらの範囲内の全ての整数値の細胞数を含む)の投与からなることができる。したがって、本発明は、単一の患者の試料採取に由来する体重1kg当たり104~106個の遺伝子編集細胞を含む10を超える用量を提供することができる。
本発明の改変HSCまたは細胞の集団は、1つまたは複数の用量として投与され得る。いくつかの態様によると、細胞の治療的に有効な量は、単一用量として投与される。いくつかの態様によると、治療的に有効な量の細胞は、一定期間にわたって複数の用量として投与される。投与のタイミングは、主治医の判断の範囲内にあり、患者の臨床状態に依存する。投与される投与量は、処置を受ける患者の年齢、健康状態、および体重、同時処置がある場合、その種類、処置の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存する。
いくつかの定義
ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、1文字記号に従って、本明細書において表記され、例えば、Qは、Glnまたはグルタミン残基を意味し、Rは、Argまたはアルギニン残基を意味し、Dは、Aspまたはアスパラギン酸残基を意味する。
ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、1文字記号に従って、本明細書において表記され、例えば、Qは、Glnまたはグルタミン残基を意味し、Rは、Argまたはアルギニン残基を意味し、Dは、Aspまたはアスパラギン酸残基を意味する。
アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基のもう1つのアミノ酸残基への交換を意味し、例えば、ペプチド配列内のアルギニン残基のグルタミン残基への交換は、アミノ酸置換である。
ヌクレオチドは、以下のように表記される:ヌクレオシドの塩基を表記するための1文字記号が使用される:aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについて、rはgまたはa(プリンヌクレオチド)を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc(ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。
本明細書において使用されるように、「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片をさす。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)、または天然に存在するヌクレオチドの類似体(例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体)、または両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾型ヌクレオチドは、糖部分および/またはピリミジン塩基もしくはプリン塩基の部分に変更を有し得る。糖修飾には、例えば、1つもしくは複数のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基への交換が含まれ、またはエーテルもしくはエステルとして糖が官能化されてもよい。さらに、糖部分全体が、立体的かつ電子的に類似した構造、例えば、アザ糖および炭素環式糖類似体に交換されてもよい。塩基部分における修飾の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換体が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
「変異」とは、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)またはポリペプチド配列における最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、またはそれ以上のヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入を意味する。変異は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響し得る。また、ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造/安定性にも影響し得る。
「遺伝子」とは、特定のタンパク質またはタンパク質のセグメントをコードする、染色体上に直線的に配置されたDNAのセグメントからなる遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、典型的には、プロモーター、5'非翻訳領域、1つまたは複数のコード配列(エクソン)、任意で、イントロン、3'非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー、および/またはサイレンサーをさらに含み得る。
本明細書において使用されるように、「遺伝子座」という用語は、ゲノム内のDNA配列(例えば、遺伝子、例えば、RAG1遺伝子)の特定の物理的位置である。「遺伝子座」という用語は、染色体上の低頻度切断エンドヌクレアーゼ標的配列の特定の物理的位置をさし得る。そのような遺伝子座は、本発明による配列特異的試薬によって認識され、かつ/または切断される標的配列を含み得る。細胞の遺伝材料の本体(即ち、染色体)に存在する核酸配列のみならず、遺伝材料の本体とは独立に存在し得る遺伝材料、例えば、非限定的な例として、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン、またはオルガネラ、例えば、ミトコンドリアの一部分も、本発明の関心対象の遺伝子座であり得ることが理解される。
「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的DNA配列」、「核酸標的配列」、または「標的配列」とは、本発明による配列特異的試薬によって標的とされ、プロセシングされ得るポリヌクレオチド配列を意味する。これらの用語は、特定のDNA位置、好ましくは、細胞内のゲノム位置のみならず、遺伝材料の本体とは独立に存在し得る遺伝材料、例えば、非限定的な例として、プラスミド、エピソーム、ウイルス、トランスポゾン、またはオルガネラ、例えば、ミトコンドリアの一部分もさす。標的配列は、標的の1つの鎖の5'から3'への配列によって定義される。通常、標的配列は、上流(5'側の位置)または下流(3'側の位置)のいずれかにおいて、プロセシングされる遺伝子座に隣接または近接している。好ましい態様において、標的配列およびタンパク質は、プロセシングされる遺伝子座が、2つのそのような標的配列の間に位置するよう、設計される。タンパク質の触媒ドメインに依って、標的配列は、5~50塩基(bp)、好ましくは、10~40bp、より好ましくは、15~30、さらに好ましくは、15~25bp、離れていてよい。これらの後者の距離は、本明細書および実施例において言及されるスペーサーを定義する。それは、同じ分子上の、標的配列と、触媒ドメインによってプロセシングされる核酸配列との間の距離を定義することもできる。
本明細書において使用されるように、「外来性」配列とは、一般的に、選択された遺伝子座に元々存在しなかったヌクレオチドまたは核酸配列をさす。反対に、「内在性配列」とは、遺伝子座に元々存在する細胞ゲノム配列を意味する。したがって、「外来性」配列は、細胞に導入された外来配列であり、したがって、この外来性配列が遺伝子座に組み込まれていない姉妹細胞と、改変された細胞との区別を可能にする。
「DNA切断を誘導する配列特異的試薬」とは、好ましくは、少なくとも9bp長、より好ましくは、少なくとも10bp長、さらに好ましくは、少なくとも12bp長の、ゲノム遺伝子座内の選択されたポリヌクレオチド配列を特異的に認識する能力を有し、ポリヌクレオチドの共有結合骨格の破壊を触媒する活性分子を意味する。本発明による「DNA切断を誘導する配列特異的試薬」の非限定的な例には、ニッカーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を有する試薬が含まれる。配列特異的試薬は、DNA結合ドメインと、触媒活性を示すもう1つのドメインとを含むキメラポリペプチドであり得る。そのような触媒活性は、例えば、遺伝子不活性化を実施するためのヌクレアーゼ、または相同組換えによる遺伝子組み込みを容易にするための付着末端を作出することによって遺伝子挿入を優先的に実施するための、もしくはKomor et al.(2016)Nature 19;533(7603):420-4に記載されているような塩基編集を実施するためのニッカーゼもしくはダブルニッカーゼであり得る。
「エンドヌクレアーゼ」という用語は、一般的に、DNA分子またはRNA分子、好ましくは、DNA分子において核酸間の結合の加水分解(切断)を触媒することができる野生型または変異型の酵素をさす。エンドヌクレアーゼは、その配列に関係なくDNA分子またはRNA分子を切断するのではなく、「標的配列」または「標的部位」とも呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列において、DNA分子またはRNA分子を認識し、切断する。エンドヌクレアーゼは、典型的には、10塩基対(bp)を超える長さ、より好ましくは、14~55bpのポリヌクレオチド認識部位を有する時、低頻度切断エンドヌクレアーゼとして分類され得る。低頻度切断エンドヌクレアーゼは、明確な遺伝子座においてDNA二本鎖切断(DSB)を誘導することによって相同組換えを有意に増加させ、それによって、遺伝子修復治療または遺伝子挿入治療を可能にする(Pingoud,A.and G.H.Silva(2007).Precision genome surgery.Nat.Biotechnol.25(7):743-4)。
「切断」という用語は、ポリヌクレオチドの共有結合骨格の破壊をさす。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解を含むが、これらに限定されるわけではない、多様な方法によって開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、2つの異なる一本鎖切断イベントの結果として二本鎖切断が起こることもある。二本鎖のDNA、RNA、またはDNA/RNAハイブリッドの切断は、平滑末端または突出末端のいずれかの生成をもたらし得る。
「ベクター」とは、連結されているもう1つの核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、PCR産物、RNAベクター、または染色体、非染色体、半合成、もしくは合成の核酸からなっていてよい直鎖状もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましいベクターは、自律複製が可能なもの(エピソーマルベクター)および/または連結された核酸の発現が可能なもの(発現ベクター)である。多数の適切なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えば、アデノ随伴ウイルス、AAV)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルトミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹およびセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびに二本鎖DNAウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス)、ならびにポックスウイルス(例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス)が含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。
「造血幹細胞」(「HSC」)とは、自己再生能を有し、かつ顆粒球(例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球)、赤血球(例えば、網状赤血球、赤血球)、血小板(thrombocytes)(例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板(platelets))、単球(例えば、単球、マクロファージ)、樹状細胞、ミクログリア、破骨細胞、ならびにリンパ球(例えば、NK細胞、B細胞、およびT細胞)を含むが、これらに限定されるわけではない、骨髄系またはリンパ系の細胞系譜の種々の細胞型および組織の全てに分化する独特な能力を有する、骨髄由来の多能性幹細胞を意味する。そのような細胞は、CD34+細胞を含む場合もあるし、含まない場合もあることが、当技術分野において公知である。CD34+細胞は、CD34細胞表面マーカーを発現する未熟細胞である。ヒトにおいて、CD34+細胞は、前記定義の幹細胞特性を有する細胞の亜集団を含むと考えられているが、マウスにおいて、HSCはCD34-である。さらに、HSCは、長期造血再構築能を持つHSC(LT-HSC)および短期造血再構築能を持つHSC(ST-HSC)もさす。LT-HSCとST-HSCとは、機能的な可能性および細胞表面マーカー発現に基づき区別される。例えば、いくつかの態様において、ヒトLT-HSCは、CD34+、CD38-、CD45RA-、CD90+、CD133+であり、ST-HSCは、CD34+、CD38-、CD45RA-、CD90-、CD133-である。さらに、ST-HSCは、ホメオスタシス条件下で、LT-HSCより静止状態でなく(即ち、より高活性であり)、より増殖性である。しかしながら、LT-HSCは、より大きい自己再生可能性を有する(即ち、成人期を通して生存し、連続的なレシピエントに連続移植され得る)のに対し、ST-HSCは、限定された自己再生を有する(即ち、限定された期間しか生存せず、連続移植可能性を保有しない)。これらのHSCのうちの任意のものが、本明細書に記載される方法のうちの任意のものにおいて使用され得る。いくつかの態様において、ST-HSCは、高度に増殖性であり、したがって、分化した子孫をより迅速に発生させることができるため、有用である。
「長期造血再構築能を持つHSC」または「LT-HSC」とは、一生涯を通して自己再生および多系譜分化の可能性を維持し得るタイプの造血幹細胞を意味する。LT-HSCに特徴的な表現型マーカーには、CD34+、CD38-、CD45RA-、CD90+、およびCD133+が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
「初代細胞」とは、生体組織(例えば、生検材料または血液試料)から直接採取され、限定された量の時間のインビトロ増殖のために確立された細胞を意味し、即ち、それらは、限定された数の集団倍化を経ることができる。初代細胞は、持続的な腫瘍形成性の細胞株または人工的に不死化された細胞株とは対照的である。そのような細胞株の非限定的な例は、CHO-K1細胞;HEK293細胞;Caco2細胞;U2-OS細胞;NIH 3T3細胞;NSO細胞;SP2細胞;CHO-S細胞;DG44細胞;K-562細胞、U-937細胞;MRC5細胞;IMR90細胞;ジャーカット細胞;HepG2細胞;HeLa細胞;HT-1080細胞;HCT-116細胞;Hu-h7細胞;Huvec細胞;Molt 4細胞である。
「に由来する」とは、細胞、例えば、HSCが、RAG1に関連するSCIDに罹患している患者から得られたことを意味する。一般的に、細胞は、当技術分野において公知の多様な方法を通じて、例えば、Schwartz J.ら[Guidelines on the use of therapeutic apheresis in clinical practice-evidence-based approach from the Writing Committee of the American Society for Apheresis:the sixth special issue(2013)J.Clin.Apher.28(3):145-284]によって概説されたような白血球アフェレーシス技術によって、患者から提供される。HSCは、針または注射器を使用して、骨髄から、より具体的には、骨盤の腸骨稜から採取され得る。あるいは、細胞が骨髄を離れ、血管内を循環するよう誘導するHSC動員剤、例えば、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)および/またはプレリキサホルまたはCXCL2をドナーに注射しながら、循環末梢血からHSCを採集してもよい。HSCは、臍帯血から採集されてもよい。HSCは、患者由来の人工多能性幹(iPS)細胞から得られてもよい。
「同一性」とは、2つの核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性をさす。同一性は、比較の目的のため整列化され得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列の位置が同じ塩基によって占拠されている時、それらの分子は、その位置において同一である。核酸配列またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、それらの核酸配列によって共有されている位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ(University of Wisconsin(Madison,Wis.))の一部として入手可能であり、例えば、デフォルト設定で使用され得るFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび/またはプログラムが、2つの配列の間の同一性を計算するために使用され得る。例えば、本明細書に記載される特定のポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有し、好ましくは、実質的に同じ機能を示すポリペプチドが企図され、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも企図される。他に記されない限り、本明細書に記載されるものと同じ機能を有し、少なくとも80%、一般的には、少なくとも85%、好ましくは、少なくとも90%、より好ましくは、少なくとも95%、さらに好ましくは、少なくとも97%を共有するポリペプチドおよびポリヌクレオチドが、本発明に包含される。
「対象」または「患者」という用語は、本明細書において使用されるように、ヒト、より具体的には、RAG1に関連するSCIDに罹患しているヒトを意味する。
本明細書において使用されるように、「約」という用語は、それと共に使用されている数の数値の±10%を意味する。
数的な限度または範囲が本明細書に記される場合、エンドポイントが含まれる。数的な限度または範囲に含まれる全ての値および部分範囲も、明示的に書き出されたかのごとく具体的に含まれる。
本明細書において使用されるように、不定冠詞「a」および「an」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、「少なくとも1つ」または「1つまたは複数」を意味する。
本明細書において使用されるように、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「有する」という用語、およびそれらの文法的変化形は、記された特色、工程、または成分を指定するものとして解釈されるべきであり、1つまたは複数の付加的な特色、工程、成分、またはそれらの群の追加を除外するものではない。
本発明の上記の説明は、この分野の当業者が、本発明を製造し、使用することができるよう、本発明の製造および使用の様式およびプロセスを提供しており、この実施可能性(enablement)は、具体的には、最初の明細書の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題について提供される。
本発明を一般的に説明したが、例示の目的のために本明細書において提供されるに過ぎず、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するためのものではない、いくつかの具体例を参照することによって、さらなる理解を得ることが可能である。
実施例
実施例1:材料および方法
細胞培養
HSC
製造業者の説明に従って、CD34 MicroBead Kit UltraPure(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-100-453)を使用して、動員された末梢血から、CD34+造血幹細胞(HSC)を精製した。精製されたCD34+細胞を、1×106細胞/mlの濃度で、CryoStor CS10(StemCell Technologies、カタログ番号07930)で凍結させ、使用時まで液体窒素中に保管した。
CD34+細胞を、組換えヒトサイトカイン:SCF 300ng/ml、Flt3-L 300ng/ml、TPO 100ng/ml、IL-3 60ng/ml(SCF;カタログ番号11343327、Flt3-L;カタログ番号11343307、IL-3;カタログ番号11340037、全て、Immunotools;TPO;カタログ番号300-18、PeproTech)が補足されたCellGenix GMP SCGM(CellGenix、カタログ番号20806-0500)で3日間培養した後、電気穿孔および形質導入を実施した。フローサイトメトリー分析実験のため、低分子:750nMのStemRegenin 1(StemCell Technologies;カタログ番号72342)および35nMのUM171(StemCell Technologies;カタログ番号72912)を培地にさらに補足した。電気穿孔および形質導入の後、IL-3を培養培地から除去した。処理後、さらに48時間、細胞を培養し、採集した。細胞は、他に示されない場合、5%CO2で37℃で培養された。
実施例1:材料および方法
細胞培養
HSC
製造業者の説明に従って、CD34 MicroBead Kit UltraPure(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-100-453)を使用して、動員された末梢血から、CD34+造血幹細胞(HSC)を精製した。精製されたCD34+細胞を、1×106細胞/mlの濃度で、CryoStor CS10(StemCell Technologies、カタログ番号07930)で凍結させ、使用時まで液体窒素中に保管した。
CD34+細胞を、組換えヒトサイトカイン:SCF 300ng/ml、Flt3-L 300ng/ml、TPO 100ng/ml、IL-3 60ng/ml(SCF;カタログ番号11343327、Flt3-L;カタログ番号11343307、IL-3;カタログ番号11340037、全て、Immunotools;TPO;カタログ番号300-18、PeproTech)が補足されたCellGenix GMP SCGM(CellGenix、カタログ番号20806-0500)で3日間培養した後、電気穿孔および形質導入を実施した。フローサイトメトリー分析実験のため、低分子:750nMのStemRegenin 1(StemCell Technologies;カタログ番号72342)および35nMのUM171(StemCell Technologies;カタログ番号72912)を培地にさらに補足した。電気穿孔および形質導入の後、IL-3を培養培地から除去した。処理後、さらに48時間、細胞を培養し、採集した。細胞は、他に示されない場合、5%CO2で37℃で培養された。
ジャーカット
ジャーカット細胞(ATCC;クローンE6-1)は、10%FCS(Cytiva、カタログ番号SH30070.02)および1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich、カタログ番号P4333)が補足されたRPMI培地(Gibco、カタログ番号11879020)において培養された。
ジャーカット細胞(ATCC;クローンE6-1)は、10%FCS(Cytiva、カタログ番号SH30070.02)および1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich、カタログ番号P4333)が補足されたRPMI培地(Gibco、カタログ番号11879020)において培養された。
初代T細胞
凍結保存されたヒトPBMCを、ALLCELLS(カタログ#PB006F)から取得した。PBMCは、IL-2(Miltenyi、#130-097-748)およびヒト血清AB(Gemini、#100-318)を含有するX-vivo-15培地(Lonza、#BE04-418Q)において培養された。T細胞を活性化するため、ヒトT活性化CD3/CD28ダイナビーズ(Thermo Fisher Scientific)またはTransAct(Miltenyi、#130-097-743)を使用した。
凍結保存されたヒトPBMCを、ALLCELLS(カタログ#PB006F)から取得した。PBMCは、IL-2(Miltenyi、#130-097-748)およびヒト血清AB(Gemini、#100-318)を含有するX-vivo-15培地(Lonza、#BE04-418Q)において培養された。T細胞を活性化するため、ヒトT活性化CD3/CD28ダイナビーズ(Thermo Fisher Scientific)またはTransAct(Miltenyi、#130-097-743)を使用した。
遺伝子編集試薬およびmRNA作製:
RAG1特異的TALEヌクレアーゼ、TALEN-2(SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3)、TALEN-6(SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5)、TALEN-A(SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:7)、TALEN-B(SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9)、GSE56(SEQ ID NO:10)、ならびに53BP1阻害剤(SEQ ID NO:11)をコードするmRNAを、製造業者の説明に従って、HiScribe T7 ARCA mRNAキット(NEB、カタログ番号E2065S)を使用して作製した。
RAG1特異的TALEヌクレアーゼ、TALEN-2(SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3)、TALEN-6(SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5)、TALEN-A(SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:7)、TALEN-B(SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9)、GSE56(SEQ ID NO:10)、ならびに53BP1阻害剤(SEQ ID NO:11)をコードするmRNAを、製造業者の説明に従って、HiScribe T7 ARCA mRNAキット(NEB、カタログ番号E2065S)を使用して作製した。
RAG1特異的TALEヌクレアーゼをコードする核酸配列は、以下の通りであった:TALEN-2についてはSEQ ID NO:30およびSEQ ID NO:31、TALEN-6についてはSEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、TALEN-AについてはSEQ ID NO:34およびSEQ ID NO:35、TALEN-BについてはSEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:37。TALEN-2のモノマーは、それぞれ、SEQ ID NO:39およびSEQ ID NO:40の核酸配列を標的とし、TALEN-6のモノマーは、それぞれ、SEQ ID NO:42およびSEQ ID NO:43の核酸配列を標的とする。TALEN-Aのモノマーは、それぞれ、SEQ ID NO:44およびSEQ ID NO:45の核酸配列を標的とし、TALEN-Bのモノマーは、それぞれ、SEQ ID NO:46およびSEQ ID NO:47の核酸配列を標的とする。
GSE56をコードする核酸配列は、SEQ ID NO:48であり、53BP1阻害剤をコードする核酸配列は、SEQ ID NO:49であった。
外来性ポリヌクレオチドドナーテンプレート構築物:
RAG1遺伝子座に挿入すべきSEQ ID NO:19のコドンが最適化されたRAG1配列を含む様々なドナーテンプレートは、Vigeneによって作出され、AAV6粒子にベクター化された。これらのテンプレートは、コドンが最適化されたRAG1配列の上流の領域においてのみ異なっている。構築物#1~#4は、エクソン2に先行する内在性RAG1イントロン配列の一部を、変動する長さ(50~140bp)で含有している。構築物#5は、合成スプライスアクセプター部位(SEQ ID NO:12)を有する短い配列を含有している(図2A)。
RAG1遺伝子座に挿入すべきSEQ ID NO:19のコドンが最適化されたRAG1配列を含む様々なドナーテンプレートは、Vigeneによって作出され、AAV6粒子にベクター化された。これらのテンプレートは、コドンが最適化されたRAG1配列の上流の領域においてのみ異なっている。構築物#1~#4は、エクソン2に先行する内在性RAG1イントロン配列の一部を、変動する長さ(50~140bp)で含有している。構築物#5は、合成スプライスアクセプター部位(SEQ ID NO:12)を有する短い配列を含有している(図2A)。
遺伝子編集プロトコル
HSC
遺伝子編集のため、1×106個の細胞を採集し(300×g、10分)、培地を除去した。CD34+細胞を、50μlのCliniMACS電気穿孔緩衝液(Miltenyi Biotec、カタログ番号170-076-625)に再懸濁させた。その後、細胞を、予め混合されたmRNA(2μgのGSE56 mRNAおよび/または4μgの53BP1阻害剤mRNAを含む/含まない1μgの各TALEN mRNA)と短時間混合し、2mm電気穿孔キュベット(VWR、カタログ番号732-1136)に移し、CliniMACS Prodigy装置(Miltenyi Biotec)を使用して電気穿孔を行った。細胞を直ちに0.5mlの(IL-3を含まない)完全培地に再懸濁させ、96穴プレートのウェルに分割した(0.25×106細胞/ウェル)。37℃で15分間、細胞を回復させた後、AAV6粒子を1×104ゲノムコピー(GC)/細胞の濃度で添加した。32℃で24時間、試料を培養した。次いで、100μlの新鮮な培地を添加し、37℃で24時間、細胞を培養した後、採集し(300×g、10分)、ゲノムDNAを抽出した。
HSC
遺伝子編集のため、1×106個の細胞を採集し(300×g、10分)、培地を除去した。CD34+細胞を、50μlのCliniMACS電気穿孔緩衝液(Miltenyi Biotec、カタログ番号170-076-625)に再懸濁させた。その後、細胞を、予め混合されたmRNA(2μgのGSE56 mRNAおよび/または4μgの53BP1阻害剤mRNAを含む/含まない1μgの各TALEN mRNA)と短時間混合し、2mm電気穿孔キュベット(VWR、カタログ番号732-1136)に移し、CliniMACS Prodigy装置(Miltenyi Biotec)を使用して電気穿孔を行った。細胞を直ちに0.5mlの(IL-3を含まない)完全培地に再懸濁させ、96穴プレートのウェルに分割した(0.25×106細胞/ウェル)。37℃で15分間、細胞を回復させた後、AAV6粒子を1×104ゲノムコピー(GC)/細胞の濃度で添加した。32℃で24時間、試料を培養した。次いで、100μlの新鮮な培地を添加し、37℃で24時間、細胞を培養した後、採集し(300×g、10分)、ゲノムDNAを抽出した。
ジャーカット
0.8×106個の細胞を採集し(300×g、5分)、培地を除去した。製造業者の説明に従って、SE Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S(Lonza、カタログ番号V4XP-1032)と組み合わせてLonza 4D-Nucleofector装置を使用したヌクレオフェクションを介して、TALEN mRNAの導入を実施した。簡単に説明すると、20μlの補足されたSE Cell Line溶液に細胞を再懸濁させ、予め混合されたTALEN mRNA(1μgの各TALEN mRNA)と組み合わせ、電気穿孔キュベットに移し、プログラムCK116を使用して電気穿孔を行った。ヌクレオフェクトされた細胞を、室温で15分間、インキュベートした。キュベットを100μlの予め加温された培地で洗浄し、細胞を150μlの培地で1×105細胞/ウェルで96穴培養プレートの8つのウェルに分割した。37℃で15分間、細胞を回復させた後、AAV6粒子を1×105GC/細胞の濃度で添加した。32℃で24時間、細胞を培養した後、37℃でさらに72時間インキュベートし、その後、採集し(300×g、5分)、gDNAを抽出した。
0.8×106個の細胞を採集し(300×g、5分)、培地を除去した。製造業者の説明に従って、SE Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S(Lonza、カタログ番号V4XP-1032)と組み合わせてLonza 4D-Nucleofector装置を使用したヌクレオフェクションを介して、TALEN mRNAの導入を実施した。簡単に説明すると、20μlの補足されたSE Cell Line溶液に細胞を再懸濁させ、予め混合されたTALEN mRNA(1μgの各TALEN mRNA)と組み合わせ、電気穿孔キュベットに移し、プログラムCK116を使用して電気穿孔を行った。ヌクレオフェクトされた細胞を、室温で15分間、インキュベートした。キュベットを100μlの予め加温された培地で洗浄し、細胞を150μlの培地で1×105細胞/ウェルで96穴培養プレートの8つのウェルに分割した。37℃で15分間、細胞を回復させた後、AAV6粒子を1×105GC/細胞の濃度で添加した。32℃で24時間、細胞を培養した後、37℃でさらに72時間インキュベートし、その後、採集し(300×g、5分)、gDNAを抽出した。
初代T細胞
ハイスループットスクリーニングのため、活性化の4日後に、製造業者のプロトコルに従って、4D-Nucleofector/96穴Shuttle Device(Lonza、#AAM-1001Sおよび#AAF-1002B)を使用して、1×106個のPBMCを、2μg(各TALENアームにつき1μg)のmRNAによって電気穿孔を行った。次いで、トランスフェクトされた細胞を、完全培地(20ng/mLヒトIL-2および5%ヒトAB血清が補足されたX-Vivo 15培地)中で、30℃、5%CO2で一晩インキュベートした。次いで、トランスフェクトされた細胞を、完全培地中で、37℃、5%CO2でさらに48時間培養した。
ハイスループットスクリーニングのため、活性化の4日後に、製造業者のプロトコルに従って、4D-Nucleofector/96穴Shuttle Device(Lonza、#AAM-1001Sおよび#AAF-1002B)を使用して、1×106個のPBMCを、2μg(各TALENアームにつき1μg)のmRNAによって電気穿孔を行った。次いで、トランスフェクトされた細胞を、完全培地(20ng/mLヒトIL-2および5%ヒトAB血清が補足されたX-Vivo 15培地)中で、30℃、5%CO2で一晩インキュベートした。次いで、トランスフェクトされた細胞を、完全培地中で、37℃、5%CO2でさらに48時間培養した。
TALENバリデーションのため、活性化の4日後に、AgilePulse MAX系(Harvard Apparatus)を使用して、5×106個のPBMCを、5~10μg(各TALENアームにつき2.5~5μg)のmRNAによって電気穿孔を行った。トランスフェクトされた細胞を、完全培地(20ng/mLヒトIL-2および5%ヒトAB血清が補足されたX-Vivo 15培地)中で、30℃、5%CO2で一晩インキュベートした。トランスフェクションの1日後、細胞を、1×106細胞/mlの密度で新鮮な完全培地に分割し、37℃、5%CO2で48時間培養した。
次いで、トランスフェクションの3日後、細胞を収集し、製造業者の説明(Qiagen、#69504)に従って、gDNAを精製した。
TALEN活性評価
T7E1アッセイのため、カスタムオリゴヌクレオチド(Integrated DNA Technologies、TALEN-2についてのSEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:51)によって標的特異的PCRを実施した(NEB、M0271L)。次いで、PCR産物を、以下の工程によって、アニーリング緩衝液(アニーリング緩衝液10×:Tris 10mM、EDTA 1mM、NaCl 0.1M)中で変性/再アニールさせた:(1)95℃、10分、(2)3℃/sで85℃まで降下、(3)0.3℃/sで25℃まで降下。次いで、再アニールした産物を、NE2緩衝液中で、T7E1酵素を使用して、37℃で15分間消化し、5%プレキャストポリアクリルアミドゲルで分析した。標的とされた遺伝子座においてTALENによって媒介されたインデル形成を査定するため、いずれもカスタムオリゴヌクレオチド(Integrated DNA Technologies)を使用して、最初にプライマー(TALEN-6についてのSEQ ID NO:52およびSEQ ID NO:53、TALEN-AについてのSEQ ID NO:54およびSEQ ID NO:55、TALEN-BについてのSEQ ID NO:56およびSEQ ID NO:57)によって標的特異的PCRを実施し、続いて、2回目のインデックス付加PCRを実施した(NEB、M0531L)。IlluminaのMiSeqシステムユーザーガイドに従って、2×250サイクルIllumina MiSeq v2試薬キット(Illumina、#15033625)を使用して、NGS配列決定を実施した。使用されたプライマーの配列は、表1に提供される。
T7E1アッセイのため、カスタムオリゴヌクレオチド(Integrated DNA Technologies、TALEN-2についてのSEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:51)によって標的特異的PCRを実施した(NEB、M0271L)。次いで、PCR産物を、以下の工程によって、アニーリング緩衝液(アニーリング緩衝液10×:Tris 10mM、EDTA 1mM、NaCl 0.1M)中で変性/再アニールさせた:(1)95℃、10分、(2)3℃/sで85℃まで降下、(3)0.3℃/sで25℃まで降下。次いで、再アニールした産物を、NE2緩衝液中で、T7E1酵素を使用して、37℃で15分間消化し、5%プレキャストポリアクリルアミドゲルで分析した。標的とされた遺伝子座においてTALENによって媒介されたインデル形成を査定するため、いずれもカスタムオリゴヌクレオチド(Integrated DNA Technologies)を使用して、最初にプライマー(TALEN-6についてのSEQ ID NO:52およびSEQ ID NO:53、TALEN-AについてのSEQ ID NO:54およびSEQ ID NO:55、TALEN-BについてのSEQ ID NO:56およびSEQ ID NO:57)によって標的特異的PCRを実施し、続いて、2回目のインデックス付加PCRを実施した(NEB、M0531L)。IlluminaのMiSeqシステムユーザーガイドに従って、2×250サイクルIllumina MiSeq v2試薬キット(Illumina、#15033625)を使用して、NGS配列決定を実施した。使用されたプライマーの配列は、表1に提供される。
RT-qPCRによるジャーカット細胞におけるcoRAG1発現の定量化
遺伝子編集されたジャーカット細胞を、製造業者の説明に従って、RNeasy Miniキット(Qiagen、カタログ番号74104)を使用したRNA抽出に供した。提供されたマニュアルに従って、QuantiTect逆転写キット(Qiagen、カタログ番号205314)を使用した逆転写によって、抽出されたRNAからcDNAを作製した。coRAG1の発現を、RT-qPCRによって定量化した。この目的のため、製造業者の説明に従って、Luna(登録商標)Universal qPCR Master Mix(NEB、カタログ番号M3003E)を使用して、MasterCycler RealPlex 4 Gradient S装置(Eppendorf)で、試料を分析した。使用されたプライマーは、エクソン1(#5278)およびcoRAG1(#4938)に結合する。
遺伝子編集されたジャーカット細胞を、製造業者の説明に従って、RNeasy Miniキット(Qiagen、カタログ番号74104)を使用したRNA抽出に供した。提供されたマニュアルに従って、QuantiTect逆転写キット(Qiagen、カタログ番号205314)を使用した逆転写によって、抽出されたRNAからcDNAを作製した。coRAG1の発現を、RT-qPCRによって定量化した。この目的のため、製造業者の説明に従って、Luna(登録商標)Universal qPCR Master Mix(NEB、カタログ番号M3003E)を使用して、MasterCycler RealPlex 4 Gradient S装置(Eppendorf)で、試料を分析した。使用されたプライマーは、エクソン1(#5278)およびcoRAG1(#4938)に結合する。
コロニー形成単位(CFU)アッセイ
StemCell Technologiesによって提供された説明に従って、CFUアッセイを実施した。単一の3.5cm CFUアッセイディッシュにおいて、500~2500個の細胞を、IMDM(StemCell Technologies、カタログ番号07700)での希釈後、MethoCult(商標)H4034 Optimumマトリックス(StemCell Technologies、カタログ番号04044)に、3ccシリンジ(StemCell Technologies、カタログ番号28230)およびブラントエンドニードル(StemCell Technologies、カタログ番号28110)を使用して播種した。5%CO2で37℃で14~17日間、細胞を培養した後、コロニー数および系譜分布を分析し、さらなる分析のため、シングルコロニーを採集した。
StemCell Technologiesによって提供された説明に従って、CFUアッセイを実施した。単一の3.5cm CFUアッセイディッシュにおいて、500~2500個の細胞を、IMDM(StemCell Technologies、カタログ番号07700)での希釈後、MethoCult(商標)H4034 Optimumマトリックス(StemCell Technologies、カタログ番号04044)に、3ccシリンジ(StemCell Technologies、カタログ番号28230)およびブラントエンドニードル(StemCell Technologies、カタログ番号28110)を使用して播種した。5%CO2で37℃で14~17日間、細胞を培養した後、コロニー数および系譜分布を分析し、さらなる分析のため、シングルコロニーを採集した。
CFUコロニーの遺伝子型決定
シングルコロニーをCFUアッセイプレートから取り出し、PCRチューブに移し、19.6μlのDirectPCR溶解試薬(Viagen、カタログ番号301-C)および0.4μlのプロテイナーゼK(Thermo Scientific、カタログ番号EO0491)を含有している20μlの溶解緩衝液に再懸濁させた。TProfessional TRIOサーモサイクラー(Biometra)において、56℃での90分間のインキュベーションによって、溶解を実施した後、85℃で45分間、溶解緩衝液を不活性化した。細胞溶解物のうち、9μlを単一のPCR反応の鋳型として使用した。表2に記載されるように、5'末端(#4938)および3'末端(#4939)におけるcoRAG1の組み込み/非組み込みを識別するため、各反応において、3つのプライマーを使用した。
シングルコロニーをCFUアッセイプレートから取り出し、PCRチューブに移し、19.6μlのDirectPCR溶解試薬(Viagen、カタログ番号301-C)および0.4μlのプロテイナーゼK(Thermo Scientific、カタログ番号EO0491)を含有している20μlの溶解緩衝液に再懸濁させた。TProfessional TRIOサーモサイクラー(Biometra)において、56℃での90分間のインキュベーションによって、溶解を実施した後、85℃で45分間、溶解緩衝液を不活性化した。細胞溶解物のうち、9μlを単一のPCR反応の鋳型として使用した。表2に記載されるように、5'末端(#4938)および3'末端(#4939)におけるcoRAG1の組み込み/非組み込みを識別するため、各反応において、3つのプライマーを使用した。
ddPCRによるノックイン効率の定量化
HSCにおけるノックイン効率を測定するためのddPCRアッセイを、基本的に製造業者の説明に従って実施した。簡単に説明すると、表3に示されるように、20~50ngのgDNAを、QX200 ddPCR EvaGreen Supermix(Bio-Rad、カタログ番号1864034)と、3つのプライマー対#4937/#4938(5'接合部)、#4939/4940(3'接合部)、または#4948/#5020(参照)のうちのいずれかとを含有しているPCR反応物に合わせた。
HSCにおけるノックイン効率を測定するためのddPCRアッセイを、基本的に製造業者の説明に従って実施した。簡単に説明すると、表3に示されるように、20~50ngのgDNAを、QX200 ddPCR EvaGreen Supermix(Bio-Rad、カタログ番号1864034)と、3つのプライマー対#4937/#4938(5'接合部)、#4939/4940(3'接合部)、または#4948/#5020(参照)のうちのいずれかとを含有しているPCR反応物に合わせた。
QX200ドロップレットジェネレーター(Bio-Rad)を使用して、DG8ガスケット(Bio-Rad、カタログ番号1864009)によってカバーされたDG8カートリッジ(Bio-Rad、カタログ番号1864008)において、EvaGreen用QX200ドロップレットジェネレーションオイル(Bio-Rad、カタログ番号1864006)を使用して、ドロップレットを生成した。ドロップレットを、ddPCR 96穴プレート(Bio-Rad、カタログ番号12001925)に移し、PX1 PCRプレートシーラー(Bio-Rad)および貫通可能なホイルヒートシール(Bio-Rad、カタログ番号1814040)を使用してプレートをシーリングした。表4に提供されるプログラム「ddPCR」を使用して、標準的なPCRサイクラーで、PCR反応を実施した。
QX200ドロップレットリーダー(Bio-Rad)でドロップレットを読み取り、QuantaSoft Analysis Pro 1.0.596を使用してデータを分析した。
HSC亜集団の分析
MoFlo Astrios(Beckman Coulter)を使用したFACSによって、HSC亜集団を選別した。6×106個の細胞を、5%FCS(Cytiva、カタログ番号SH30070.02)が補足されたPBSからなる200~300μlのFACS緩衝液に再懸濁させられた、表5に記載される抗体混合物によって、氷上で60~90分間、染色した。
MoFlo Astrios(Beckman Coulter)を使用したFACSによって、HSC亜集団を選別した。6×106個の細胞を、5%FCS(Cytiva、カタログ番号SH30070.02)が補足されたPBSからなる200~300μlのFACS緩衝液に再懸濁させられた、表5に記載される抗体混合物によって、氷上で60~90分間、染色した。
染色後、細胞を1mlのFACS緩衝液で3回洗浄し(300×g、10分)、300~500μlのFACS緩衝液に再懸濁させ、選別した。長期造血再構築能を持つ造血幹細胞(LT-HSC)を表現型CD34+/CD38-/CD45RA-/CD90+/CD133-1+によって識別し、短期造血再構築能を持つ造血幹細胞(ST-HSC)を表現型CD34+/CD38-/CD45RA-/CD90-/CD133-1-によって識別した。
実施例2:RAG1イントロン1を標的とするTALENのスクリーニング
RAG1のイントロン1を標的とするいくつかのTALEN(そのうちの4つが図3Aに提示される)を設計し、ハイスループットフォーマットで作製し、T7E1によって測定される切断活性、または次世代配列決定アッセイによるより正確なバリデーションについて、初代T細胞においてスクリーニングした。図3Bは、このスクリーニングによって同定された最も優れたTALENのうちの1つ(TALEN-2)を示す。図3Cは、同定されたもう1つの極めて優れたTALENであるTALEN-6が、およそ80%のインデル(挿入/欠失)イベントを誘導することができたのに対し、TALEN-AおよびTALEN-Bは、およそ50%または40%のインデルを誘導することができたことを明らかにしている。
RAG1のイントロン1を標的とするいくつかのTALEN(そのうちの4つが図3Aに提示される)を設計し、ハイスループットフォーマットで作製し、T7E1によって測定される切断活性、または次世代配列決定アッセイによるより正確なバリデーションについて、初代T細胞においてスクリーニングした。図3Bは、このスクリーニングによって同定された最も優れたTALENのうちの1つ(TALEN-2)を示す。図3Cは、同定されたもう1つの極めて優れたTALENであるTALEN-6が、およそ80%のインデル(挿入/欠失)イベントを誘導することができたのに対し、TALEN-AおよびTALEN-Bは、およそ50%または40%のインデルを誘導することができたことを明らかにしている。
実施例3:coRAG1の標的特異的組み込みはジャーカット細胞株におけるRAG1発現を可能にした
coRAG1の組み込みを誘発するため、ジャーカットへのmRNAの電気穿孔とその後のcoRAG1ドナーテンプレートを含むAAV6ベクターによる形質導入を介して、2つのTALEN対(TALEN-2およびTALEN-6)を、形質導入されたcoRAG1と組み合わせて、最初に試験した。修正DNAの正確なスプライシングおよび効率的な転写を確実にするため、コドンが最適化されたRAG1配列の上流の領域においてのみ異なる様々なドナーテンプレートを試験した。構築物#1~#4は、エクソン2に先行する内在性RAG1イントロン1配列の一部を、変動する長さ(50~140bp)で含有している。構築物#5は、合成スプライスアクセプター部位を有する短い配列を含有している(図2A)。
coRAG1の組み込みを誘発するため、ジャーカットへのmRNAの電気穿孔とその後のcoRAG1ドナーテンプレートを含むAAV6ベクターによる形質導入を介して、2つのTALEN対(TALEN-2およびTALEN-6)を、形質導入されたcoRAG1と組み合わせて、最初に試験した。修正DNAの正確なスプライシングおよび効率的な転写を確実にするため、コドンが最適化されたRAG1配列の上流の領域においてのみ異なる様々なドナーテンプレートを試験した。構築物#1~#4は、エクソン2に先行する内在性RAG1イントロン1配列の一部を、変動する長さ(50~140bp)で含有している。構築物#5は、合成スプライスアクセプター部位を有する短い配列を含有している(図2A)。
5つ全ての構築物の発現を、代理としてのジャーカット細胞において試験した。これらの細胞は、初代HSCとは対照的に、RAG1遺伝子座を恒常的に発現している。驚くべきことに、内在性スプライスアクセプター部位を含有している構築物(#1~#4)は、全て、coRAG1の類似した中程度の発現を示したが、AAV6ドナー#5(「AAV#5」)によって形質導入された細胞においては、構築物#1(「AAV#1」)と比べて4倍より多く、発現が増強された(図2B)。
実施例4:HSCにおけるcoRAG1の標的特異的組み込み
AAV#5が優れたドナーテンプレートとして同定されたため、この構築物の組み込みを、TALEN-2およびTALEN-6と組み合わせて、初代ヒトHSCにおいて試験した。両方のTALENについて、1×104GC/細胞による細胞の形質導入は、TALENによって媒介される切断の後に、RAG1アレルの15~20%におけるcoRAG1の組み込みを与えた(図4Aおよび4C)。AAV6粒子の数の増加は、組み込み効率を改善しなかった(図4C)。
AAV#5が優れたドナーテンプレートとして同定されたため、この構築物の組み込みを、TALEN-2およびTALEN-6と組み合わせて、初代ヒトHSCにおいて試験した。両方のTALENについて、1×104GC/細胞による細胞の形質導入は、TALENによって媒介される切断の後に、RAG1アレルの15~20%におけるcoRAG1の組み込みを与えた(図4Aおよび4C)。AAV6粒子の数の増加は、組み込み効率を改善しなかった(図4C)。
組み込みを推進するため、阻害剤53BP1および/またはGSE56を発現させた。53BP1阻害剤は、非相同末端結合(NHEJ)に基づくDNA修復に関与する因子である53BP1を阻害するが(Canny et al.,2018,Nat.Biotechnol.36(1):95-102)、GSE56は、細胞周期制御タンパク質p53を阻害する(Ossovskaya et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:10309-10314)。53BP1阻害剤をコードするmRNAとTALEN mRNAとの組み合わせは、coRAG1組み込みをおよそ1.5倍改善し、それぞれ、TALEN-2を使用した時には、アレルのおよそ22%(図4A)、TALEN-6では、およそ23%(図4C)において組み込みが起こった。GSE56を使用した時には、標的特異的組み込みのおよそ2倍の増加が観察され、組み込み頻度は、RAG1アレルのおよそ30~35%であった(図4BおよびC)。両方の因子を組み合わせた時、相加効果は観察されなかった(図4C)。
一生涯の治癒のためのホールマークは、自己再生能を持ち長期造血再構築能を持つ造血幹細胞(LT-HSC)の修正である。この亜集団におけるcoRAG1の組み込みを、GSE56を含む最適化された条件を使用して決定した。編集された細胞のFACSによるLT-HSC亜集団および短期HSC(ST-HSC)亜集団への選別と、その後のcoRAG1組み込みの分析は、ST-HSC(32%)における標的特異的組み込みのレベルが、バルクの編集された細胞(28%)と比較して、わずかに高いことを明らかにした。一方、ナイーブLT-HSC集団(19%)においては、編集頻度がより低かった(図4D)。
実施例5:遺伝子編集されたHSCのクローン分析
遺伝子編集された細胞において完全な分化可能性が保存されているか否かを試験するため、未処理のHSC、またはTALEN-6およびAAV#5によって処理されたHSCに対してコロニー形成単位(CFU)アッセイを実施した。未処理細胞において観察されたものと高度に類似した頻度での全コロニータイプの成長は、細胞の大きい割合におけるcoRAG1の組み込みが、全体的な分化プロファイルをアンバランスにしないことを確認した(図5A)。
遺伝子編集された細胞において完全な分化可能性が保存されているか否かを試験するため、未処理のHSC、またはTALEN-6およびAAV#5によって処理されたHSCに対してコロニー形成単位(CFU)アッセイを実施した。未処理細胞において観察されたものと高度に類似した頻度での全コロニータイプの成長は、細胞の大きい割合におけるcoRAG1の組み込みが、全体的な分化プロファイルをアンバランスにしないことを確認した(図5A)。
coRAG1ノックインの安定性を確認するため、個々のコロニーをCFUアッセイプレートから収集し、片アレルノックインと両アレルノックインとの識別を可能にするPCRによって、組み込まれたドナーテンプレートの存在について分析した。20の個々のクローンを分析したが、そのうち10は、TALENおよびAAV#5ドナーによって処理されたものであり、残りの10クローンは、TALEN+53BP1阻害剤+AAV#5ドナーによって処理されたものであった。組み込まれたcoRAG1の存在は、全クローンのうちの15(75%)において確認された。クローンの過半数(60%)が片アレル編集を示した一方で、両方のアレルにおける標的特異的組み込みは、3クローン(15%)において達成された(図5B)。これは、遺伝子編集された細胞が一般的な増殖上の不利益を有していないこと、そして達成されたノックインが、ddPCR(図4A~D)によって決定されたよりさらに高い可能性があることを示しており、したがって、可能性のある臨床的利益を増加させる。
Claims (33)
- 5'末端から3'末端へ、核酸配列SEQ ID NO:12と、機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列と、ポリAシグナルとを含む外来性配列を含む、RAG1が編集された改変造血幹細胞(HSC)であって、該外来性配列が該HSCのゲノム内の非機能性内在性RAG1遺伝子座のイントロン1に組み込まれている、RAG1が編集された改変造血幹細胞(HSC)。
- 前記RAG1タンパク質をコードする核酸配列が、コドンが最適化された核酸配列である、請求項1記載の改変HSC。
- 前記外来性配列が、前記核酸配列SEQ ID NO:12と、前記機能性RAG1タンパク質をコードする核酸配列との間に配置されたSEQ ID NO:29の5'UTRをさらに含む、請求項1または2記載の改変HSC。
- 前記外来性配列が、核酸配列SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:69、またはSEQ ID NO:72を含む、請求項1~3のいずれか一項記載の改変HSC。
- 請求項1~4のいずれか一項記載の改変HSCを含む、細胞の集団。
- 少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%の、前記RAG1が編集された改変HSCを含む、請求項5記載の細胞の集団。
- 長期造血再構築能を持つHSCを含む、請求項5または6記載の細胞の集団。
- 前記長期造血再構築能を持つHSCの少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%が、RAG1が編集された改変HSCである、請求項7記載の細胞の集団。
- SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列を標的とする、TALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
- SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を標的とする第1のモノマーと、SEQ ID NO:43のポリヌクレオチド配列を標的とする第2のモノマーとを含む、請求項9記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
- SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む第1のモノマー、またはSEQ ID NO:4に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつSEQ ID NO:42の配列を標的とするそのバリアントと、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む第2のモノマー、またはSEQ ID NO:5に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつSEQ ID NO:43の配列を標的とするそのバリアントとを含む、請求項9または10記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
- SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む第1のモノマーと、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む第2のモノマーとを含む、請求項9または10記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
- SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列を標的とするTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
- SEQ ID NO:39のポリヌクレオチド配列を標的とする第1のモノマーと、SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を標的とする第2のモノマーとを含む、請求項13記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
- SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む第1のモノマー、またはSEQ ID NO:2に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつSEQ ID NO:39の配列を標的とするそのバリアントと、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む第2のモノマー、またはSEQ ID NO:3に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつSEQ ID NO:40の配列を標的とするそのバリアントとを含む、請求項13または14記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
- SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む第1のモノマーと、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む第2のモノマーとを含む、請求項13または14記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー。
- 請求項9~16のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーをコードする、単離された核酸またはベクター。
- mRNAである、請求項17記載の単離された核酸。
- 請求項1~4のいずれか一項において定義された外来性配列を含む単離された核酸またはベクターであって、該外来性配列が、その5'末端にある左側相同領域とその3'末端にある右側相同領域との間に配置されており、相同領域が、RAG1のSEQ ID NO:28のイントロン1の一部に対するものである、単離された核酸またはベクター。
- 請求項9~16のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーを含み、かつ請求項1~4のいずれか一項において定義された外来性配列および/または請求項19記載の単離された核酸もしくはベクターを含むHSCを含む、細胞の集団。
- 請求項9~12のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーを含み、かつ請求項1~4のいずれか一項において定義された外来性配列および/または請求項19記載の単離された核酸もしくはベクターを含むHSCを含む、請求項20記載の集団。
- 請求項1~4のいずれか一項記載の改変HSC、または請求項5~8、20、および21のいずれか一項記載の細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤および/または担体とを含む、薬学的組成物。
- RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)の治療において使用するための、請求項1~4のいずれか一項記載の改変HSC、請求項5~8、20、および21のいずれか一項記載の細胞の集団、または請求項22記載の薬学的組成物。
- 造血幹細胞移植において使用するための、請求項1~4のいずれか一項記載の改変HSC、請求項5~8、20、および21のいずれか一項記載の細胞の集団、または請求項22記載の薬学的組成物。
- (i) 少なくとも1つの請求項19記載の単離された核酸またはベクターと、
(ii) 請求項9~16のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーをコードする少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと
を含む、キット。 - 核酸配列SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:70、またはSEQ ID NO:73を含む単離された核酸またはベクターと、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸またはベクターとを含む、請求項25記載のキット。
- HSCの非機能性RAG1内在性遺伝子座のSEQ ID NO:28のイントロン1への機能性RAG1配列の組み込みにおける、請求項9~16のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマー、または該TALEヌクレアーゼヘテロダイマーをコードする単離された核酸もしくはベクター、または請求項25もしくは26記載のキットの、エクスビボでの使用。
- RAG1が編集された改変造血幹細胞を調製する方法であって、改変対象のHSCに
(i) 請求項1~4のいずれか一項において定義された外来性配列を含む少なくとも1つの単離された核酸またはベクターであって、該外来性配列が、その5'末端にある左側相同領域とその3'末端にある右側相同領域との間に配置されており、相同領域が、RAG1のSEQ ID NO:28のイントロン1の一部に対するものである、少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと;
(ii) 該HSCの内在性RAG1遺伝子座のSEQ ID NO:28のイントロン1の中の配列を標的としかつ切断することができる、DNA切断を誘導する配列特異的試薬をコードする、少なくとも1つの単離された核酸またはベクターと
を導入する工程を含み、それによって、RAG1が編集された改変造血幹細胞が得られる、方法。 - 前記DNA切断を誘導する配列特異的試薬が、請求項9~16のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーである、請求項28記載の方法。
- 前記DNA切断を誘導する配列特異的試薬が、請求項9~12のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーである、請求項28または29記載の方法。
- 前記(i)の核酸またはベクターが、核酸配列SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:70、またはSEQ ID NO:73を含む外来性配列を含み、前記(ii)の核酸またはベクターが、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項28~30のいずれか一項記載の方法。
- 前記HSCが、RAG1に関連する重症複合免疫不全症(SCID)に罹患しているヒト患者に由来する組織試料から単離される、請求項28~31のいずれか一項記載の方法。
- 前記組織試料が末梢血試料である、請求項32記載の方法。
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