JP2024516638A

JP2024516638A - 血管新生に関連する眼疾患の処置のための組成物および方法

Info

Publication number: JP2024516638A
Application number: JP2023565505A
Authority: JP
Inventors: クリスチャンバーンズ，; メリッサカルトン，; メレディスレオン，; ポールシマンスキ，
Original assignee: ４ディーモレキュラーセラピューティクスインコーポレイテッド
Priority date: 2021-04-27
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2024-04-16
Also published as: CA3215812A1; EP4330411A1; WO2022232178A1; IL307416A; AR125454A1; TW202309281A; AU2022266774A9; US20240131195A1; KR20240004316A; CN117242183A; AU2022266774A1

Abstract

本開示は、血管新生に関連する眼疾患、特に、湿性加齢黄斑変性症の処置のための組成物および方法を提供する。眼血管疾患、例えば、加齢黄斑変性症および糖尿病性網膜症は、それぞれ、異常な脈絡膜または網膜新生血管に起因する。網膜は、ニューロン、グリアおよび脈管要素の十分に規定された層からなるので、脈管増殖または浮腫で見られるものなどの比較的小さい混乱が、視覚機能の有意な喪失をもたらし得る。遺伝性網膜変性、例えば、網膜色素変性症は、脈管異常、例えば、細動脈狭小化および脈管萎縮症にも関連する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年４月２７日出願の米国仮特許出願第６３／１８０，２４７号の利益を主張し、その全開示は、参照によって本明細書に援用される。

ＥＦＳ－ＷＥＢを介した配列表提出
２０２２年４月２２日当日かその前後に作成された、約８３ＫＢのファイルサイズを有する表題「０９０４００－５０１８－ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ」のコンピュータ可読テキストファイルは、本出願のための配列表を含有し、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。

発明の背景
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）タンパク質およびそれらの受容体（ＶＥＧＦＲ）は、初期分化中の内皮細胞からの胚性脈管構造の発生である脈管形成、既存の血管から新たな血管を形成するプロセスである血管新生、および新たなリンパ管を形成するプロセスであるリンパ管新生において、重要な役割を果たす。

眼血管疾患、例えば、加齢黄斑変性症および糖尿病性網膜症は、それぞれ、異常な脈絡膜または網膜新生血管に起因する。網膜は、ニューロン、グリアおよび脈管要素の十分に規定された層からなるので、脈管増殖または浮腫で見られるものなどの比較的小さい混乱が、視覚機能の有意な喪失をもたらし得る。遺伝性網膜変性、例えば、網膜色素変性症は、脈管異常、例えば、細動脈狭小化および脈管萎縮症にも関連する。

ＶＥＧＦの機能を遮断するための戦略が使用されてきた。現行の標準治療処置には、その受容体への結合を防止するための、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ）に結合するタンパク質治療、例えば、アフリベルセプト、ラニビズマブおよびブロルシズマブの硝子体内（ＩＶＴ）注射が含まれる。安全かつ有効であることが示された抗ＶＥＧＦ治療のレジメンは、視覚を維持するために、毎月～隔月の反復ＩＶＴ投与を必要とし、多くの患者が、過少処置に起因して、初期の視力利益を維持することができない。反復注射を必要とすることは、患者および介護人にとってかなりの負担になり得、一部の患者は、十年にわたる処置にもかかわらず、定期的な抗ＶＥＧＦ注射を必要とする。最近の研究は、現実世界の使用では、多くの患者が、推奨される注射よりも少ない注射を受け、臨床試験設定において示されたのと同じ利益を受けることも維持することもなく、最初の２年間は視覚獲得があるが、５年の時点では維持されないことを示している。

したがって、血管新生性眼疾患、例えば、湿性ＡＭＤの処置のための新たなまたは改善された化合物および治療が依然として必要である。

発明の概要
湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；網膜静脈閉塞から生じる網膜新生血管；糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全てのステージを含む）；近視性黄斑変性症；網膜静脈分枝閉塞症、半側網膜静脈閉塞症（ｈｅｍｉ－ｒｅｔｉｎａｌｖｅｉｎｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）および網膜中心静脈閉塞症；未熟児網膜症；特発性脈絡膜新生血管；近視黄斑変性症（ｍｙｏｐｉａｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管；網膜毛細血管拡張症；血管新生緑内障；硝子体出血；ブドウ膜炎、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および／または脈絡膜疾患、眼の腫瘍、角膜および虹彩新生血管が含まれるがこれらに限定されない網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管が含まれるがこれらに限定されない眼血管新生に関連する眼疾患の処置のための組成物および方法が開示される。一部の実施形態では、血管新生性眼疾患は、湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；糖尿病性黄斑浮腫；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；糖尿病性網膜症；および近視性脈絡膜新生血管から選択される。

一部の実施形態では、（ｉ）第１の抗血管新生ポリペプチド（例えば、アフリベルセプト）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）１つまたは複数の血管新生促進性標的遺伝子の発現を低減させる１つまたは複数の干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。一部の態様では、ＲＮＡ分子は、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。他の態様では、ＲＮＡ分子は、一次ｍｉＲＮＡ分子である。一部の態様では、核酸は、（ｉ）発現制御配列に作動可能に連結した、第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）発現制御配列に作動可能に連結した、１つまたは複数の血管新生促進性標的遺伝子の発現を低減させる干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。一部の実施形態では、抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列とは、別個の発現制御配列に作動可能に連結される。好ましい実施形態では、抗血管新生ポリペプチドおよび干渉ＲＮＡ分子の発現は、共通の（即ち、同じ）発現制御配列によって駆動される。一部の態様では、発現制御配列（複数可）は、構成的プロモーター、例えば、ＣＡＧまたはＣＢＡプロモーターを含む。他の態様では、発現制御配列（複数可）は、細胞特異的プロモーターを含む。

一部の実施形態では、核酸は、アンジオポエチン－２（Ａｎｇ２またはＡｎｇ－２としても公知）を標的化する干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む。代表的なヒトＡｎｇ２配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号０１５１２３ならびに米国特許第８，９８７，４２０号の配列番号５１７および５１８において見出すことができ、その内容は、参照によって本明細書に援用される。好ましい実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、Ａｎｇ－２を標的化し、以下の表１に列挙されるものから選択される配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む：

一部の実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、それらの一方または両方は、表１に列挙されるものから選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一な配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一部の特に好ましい実施形態では、核酸は、アフリベルセプトである第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびヒトアンジオポエチン－２を標的化する干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む。

一部の好ましい実施形態では、核酸は、ＶＥＧＦ－Ｃを標的化する干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む。代表的なヒトＶＥＧＦ－Ｃ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５４２９およびＸ９４２１６において見出すことができる。好ましい実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、ＶＥＧＦ－Ｃを標的化し、以下の表２に列挙されるものから選択される配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む：

一部の実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、それらの一方または両方は、表２に列挙されるものから選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一な配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。ＶＥＧＦ－Ｃを標的化するさらなる干渉ＲＮＡ分子には、米国特許出願公開第２０１１／０２９３６２５号Ａ１の表１に列挙されるものが含まれ、その内容は、参照によって本明細書に援用される。一部の特に好ましい実施形態では、核酸は、アフリベルセプトである第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびヒトＶＥＧＦ－Ｃを標的化する干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む。

関連の実施形態では、核酸は、第１の抗血管新生タンパク質（例えば、アフリベルセプト）をコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトＶＥＧＦ－Ｃを標的化する干渉ＲＮＡ分子およびヒトＡｎｇ－２を標的化する干渉ＲＮＡ分子をさらに含む。

他の実施形態では、核酸は、ＶＥＧＦＲ－３を標的化する干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む。代表的なヒトＶＥＧＦＲ－３配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６８２０３において見出すことができる。好ましい実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、ＶＥＧＦＲ－３を標的化し、以下の表３に列挙されるものから選択される配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む：

一部の実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、それらの一方または両方は、表３に列挙されるものから選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一な配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。ＶＥＧＦＲ－３を標的化するさらなる干渉ＲＮＡ分子には、米国特許第７，５１７，８６４号の表２に列挙されるものが含まれ、その内容は、参照によって本明細書に援用される。一部の特に好ましい実施形態では、核酸は、アフリベルセプトである第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびヒトＶＥＧＦＲ－３を標的化する干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。一部の態様では、ｓｈＲＮＡは、配列ＣＴＣＧＡＧまたはそれと少なくとも７０％もしくは少なくとも８０％同一な配列を（５’から３’に）含むループを有する。

一部の好ましい実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。一部の実施形態では、人工ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－２２、ｍｉＲ－１５、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１０３またはｍｉＲ－１０７に由来するｍｉＲＮＡ「足場」中に埋め込まれた本明細書に記載されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。一部の好ましい態様では、人工ｍｉＲＮＡは、ｍｉｒ－３０中に埋め込まれた本明細書に記載されるセンスおよびアンチセンス鎖を含む：

、式中、（Ｘ）_ｎは、表１～３のうちのいずれか１つからのセンス鎖を含み、（Ｙ）_ｎは、表１～３のうちのいずれか１つからのセンス鎖を含む。

特に好ましい態様では、人工ｍｉＲＮＡは、ｍｉｒ－Ｅ中に埋め込まれた本明細書に記載されるセンスおよびアンチセンス鎖を含む：

一部の実施形態では、（ｉ）第１の抗血管新生ポリペプチド（例えば、アフリベルセプト）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。一部の態様では、核酸は、（ｉ）発現制御配列に作動可能に連結した、第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）発現制御配列に作動可能に連結した、第２の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。一部の実施形態では、第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、第２の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とは、別個の発現制御配列に作動可能に連結される。好ましい実施形態では、第１および第２の抗血管新生ポリペプチドの発現は、共通の（即ち、同じ）発現制御配列によって駆動される。一部の態様では、発現制御配列（複数可）は、構成的プロモーター、例えば、ＣＡＧまたはＣＢＡプロモーターを含む。他の態様では、発現制御配列（複数可）は、細胞特異的プロモーターを含む。

一部の態様では、第１および／または第２の抗血管新生ポリペプチド（即ち、血管新生を阻害するポリペプチド）は、エンドスタチン；タムスタチン；アンジオスタチン；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）から選択される。一部の態様では、第１および／または第２の抗血管新生ポリペプチドは、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ－Ａ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ１６８８９を参照されたい）、ＶＥＧＦ－Ｂ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４８８０１を参照されたい）、ＶＥＧＦ－Ｃ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９４２１６を参照されたい）、ＶＥＧＦ－Ｄ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ０００１８５を参照されたい）および／または胎盤成長因子（ＰＩＧＦ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５４９３６を参照されたい））に結合しその活性を阻害する「デコイ」融合タンパク質（例えば、可溶性受容体融合タンパク質）であり、その代表的な例には、可溶性ＶＥＧＦＲ－１（Ｆｌｔ－１としても公知；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５１６０２を参照されたい）受容体融合タンパク質、可溶性ＶＥＧＦＲ－２（Ｆｌｋ－１としても公知；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５９３９７を参照されたい）受容体融合タンパク質、可溶性ＶＥＧＦＲ－３（Ｆｌｔ－４としても公知；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６８２０３およびＳ６６４０７を参照されたい）受容体融合タンパク質、ならびにＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２およびＶＥＧＦＲ－３のうちの少なくとも２つ由来の結合領域を含むキメラ可溶性受容体融合タンパク質が含まれる。ＶＥＧＦ－Ａは、ＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦＲ－２に結合し；ＶＥＧＦ－ＢおよびＰＩＧＦは、ＶＥＧＦＲ－２に結合し；ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄは、ＶＥＧＦＲ－３に結合する。

一部の好ましい態様では、第１の抗血管新生ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ部分に必要に応じて融合された、ＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦＲ－２の細胞外ドメイン由来のＶＥＧＦ結合性部分を含む可溶性融合タンパク質である。特に好ましい態様では、第１の抗血管新生ポリペプチドは、アフリベルセプトである。アフリベルセプトは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ部分に融合された、ヒトＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦＲ－２の細胞外ドメイン由来のＶＥＧＦ結合性部分からなる組換え融合タンパク質である。アフリベルセプトは、新生血管（湿性）加齢黄斑変性症、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫および糖尿病性網膜症の処置のために示される。

他の好ましい態様では、第１および／または第２の抗血管新生ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ－３の細胞外ドメイン由来の１つまたは複数のＶＥＧＦ結合性部分を含む可溶性融合タンパク質である。

他の態様では、第１および／または第２の抗血管新生ポリペプチドは、血管新生促進性タンパク質、例えば、ＶＥＧＦおよび／またはアンジオポエチン（アンジオポエチン－１／Ａｎｇ１／Ａｎｇ－１、アンジオポエチン－２／Ａｎｇ２／Ａｎｇ－２）に結合しその活性を阻害する抗体またはその抗原結合性断片である。一部の態様では、第１および／または第２の抗血管新生ポリペプチドは、Ａｎｇ１および／またはＡｎｇ２に対する抗体である。他の態様では、第１および／または第２の抗血管新生ポリペプチドは、その同族受容体へのＶＥＧＦの結合を遮断する、ＶＥＧＦ－Ａに対する抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ－Ｂに対する抗体、ＶＥＧＦ－Ｃに対する抗体、ＶＥＧＦ－Ｄに対する抗体またはＰＩＧＦに対する抗体（例えば、ＴＢ－４０３、１６Ｄ３）である。他の態様では、第１および／または第２の抗血管新生ポリペプチドは、ＶＥＧＦへの受容体の結合を遮断する、ＶＥＧＦＲ－１に対する抗体（例えば、イクルクマブ（ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、Ｄ１６Ｆ７、ＫＭ１７３０／ＫＭ１７３２）、ＶＥＧＦＲ－２に対する抗体（例えば、ラムシルマブ）またはＶＥＧＦＲ－３に対する抗体である。一部の態様では、抗体は、二機能性抗体である。一部の好ましい実施形態では、第１および／または第２の抗血管新生ポリペプチドは、Ａｎｇ－２に結合する抗体またはその抗原結合性断片である。

一部の実施形態では、核酸は、第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および第２の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、第２の抗血管新生ポリペプチドは、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）である。

一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸を含む（例えば、第１および／もしくは第２の抗血管新生ポリペプチドならびに／または１つもしくは複数の血管新生促進性標的遺伝子の発現を低減させる干渉ＲＮＡ干渉ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む）ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドベクター）が、本明細書で提供される。好ましい実施形態では、ベクターは、組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）発現ベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ネイティブカプシド（例えば、ＡＡＶ血清型２またはＡＡＶ血清型５またはＡＡＶ血清型８のカプシド）を含む。他の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ネイティブＡＡＶカプシドと比較して改変された（例えば、１つまたは複数のペプチド挿入および／あるいは１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、チロシンからフェニルアラニンへの）および／またはアミノ酸挿入もしくはアミノ酸欠失を含む）（例えば、血清型２、５もしくは８のＡＡＶカプシドと比較して１つまたは複数の改変を含む）カプシドを含む。

好ましい実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、以下のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、９０％、９５％もしくは９９％同一な配列を含むバリアントカプシドタンパク質を有するカプシドを含む：

配列番号４８のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ２カプシドと比較して、以下の改変を含有する：（ｉ）アセンブルされたカプシド（ＶＰ１タンパク質のみ）の内側に位置する、アミノ酸位置３４におけるプロリン（Ｐ）からアラニン（Ａ）への変異、ならびに（ｉｉ）ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３中に存在する、アミノ酸位置５８８における１０アミノ酸（ロイシン－アラニン－イソロイシン－セリン－アスパラギン酸－グルタミン－スレオニン－リシン－ヒスチジン－アラニン／ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号４９））の挿入。一部の実施形態では、カプシドは、配列番号４８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一な配列を含み、Ｐ３４Ａ置換と、カプシドのＧＨループ中に、例えば、ＶＰ１のアミノ酸５７０とアミノ酸６１１との間の、好ましくは、ＶＰ１のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９との間の位置において、２つの隣接するアミノ酸間にＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号４９）ペプチド挿入とを含む、バリアントカプシドタンパク質を含む（番号付けは、ネイティブＡＡＶ２ＶＰ１カプシドに対するものである）。

別の実施形態では、本明細書に記載される核酸を含む宿主細胞が、本明細書で提供される。一部の態様では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞またはＶ２７細胞が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物細胞である。他の態様では、宿主細胞は、光受容体細胞（例えば、杆体；錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、グリア細胞（例えば、ミュラーグリア細胞、ミクログリア細胞）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である。

一部の実施形態では、本開示は、対象（例えば、ヒト対象）における眼血管新生に関連する眼疾患を処置する方法であって、本明細書に記載される核酸分子またはベクターを対象に投与するステップを含む、方法を提供する。

二重導入遺伝子構築。多機構的抗血管新生遺伝子治療を構築するためのアプローチが示される。図１Ａ：この構築物は、アフリベルセプトと第２の抗血管新生タンパク質とをコードする核酸の代表的な実施形態である。図１Ｂ：この構築物は、アフリベルセプトと血管新生促進性遺伝子を標的化する干渉ＲＮＡとをコードする核酸の代表的な実施形態である。遍在性プロモーター（ＣＢＡ）が、両方の構築物において使用される。

代表的な構築物の描写。ｐＰ１４１．００１は、ＣＡＧプロモーターを、ＣＡＧイントロン内（スプライスドナー部位の十分に後）に配置されたｍｉＲ－Ｅ－Ａｎｇ２配列と、その後のアフリベルセプトをコードするコドン最適化された配列と共に含む。ｐＰ１４５．００１は、ＣＡＧイントロン内にｍｉｒ－Ｅ－ＶＥＧＦ－Ｃ配列が配置されていることを除き、ｐＰ１４１．００１と同一である。ｐＰ１５１．００１は、アフリベルセプト遺伝子の３’ＵＴＲ内にｍｉＲ－Ｅ－Ａｎｇ２配列が配置されていることを除き、ｐＰ１４５．００１と同一である。ｐＰ１５１．００２は、アフリベルセプトコード配列内にｍｉＲ－Ｅ－Ａｎｇ２配列が配置されていることを除き、ｐＰ１４５．００１と同一である。ｐＰ１５３．００１は、ＣＡＧプロモーターを、ＣＡＧイントロン内に配置されたｍｉＲ－Ｅ－Ａｎｇ２およびｍｉＲ－Ｅ－ＶＥＧＦ－Ｃ配列（アフリベルセプトをコードするコドン最適化された配列が後に続く）と共に含む。ＣＢＡＰｒｏｍ．：遍在性ニワトリｂ－アクチンプロモーター、ＣＢＡＥｘ１／Ｉｎｔ１：ニワトリｂ－アクチンエクソン１／ハイブリッドニワトリｂ－アクチンおよびウサギベータグロブリンイントロン、ＲＧＢＳＡ／ＰＰＴ：ウサギベータグロブリンエクソン３断片（スプライスアクセプター）／ポリピリミジントラクト、Ｔ２Ａ：自己切断性ペプチド、ＡＦＬＢ：アフリベルセプト。

図３Ａは、両方の配列がＣＢＡプロモーターの制御下にある第２のポリペプチド（ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦＲ３、抗Ａｎｇ２ｓｃＦａｂ（ＬＨおよびＨＬ））と共にアフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶプラスミドによるトランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ培地中のアフリベルセプトを検出するための、抗ヒトＩｇＧＦｃを使用するウエスタンブロットである。図３Ｂは、指し示されたプロモーターの制御下にアフリベルセプトと第２のポリペプチド（ＰＥＤＦ、抗Ａｎｇ２ｓｃＦａｂ）とをコードするまたはアフリベルセプトと干渉ＲＮＡとをコードするＡＡＶプラスミドによるトランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ培地におけるアフリベルセプトの発現を例示するグラフである。結果は、ＣＢＡプロモーターの制御下にアフリベルセプト単独をコードするＡＡＶプラスミドによるトランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ培地におけるアフリベルセプトの発現に対して正規化される。誤差は、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。Ｎ＝６の生物学的複製。一元配置ＡＮＯＶＡによって解析した。^＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。構築物は、それらの適した対照に対して統計的に加重しただけである。％は、ＣＢＡ－ＡＦＬＢと比較した平均差異を示す。

図４は、指定されたＭＯＩでの、配列番号４８のカプシドと指し示された導入遺伝子をコードする異種核酸とを含むｒＡＡＶによるＲＰＥ細胞の形質導入の８日後の培地中の遊離の活性なアフリベルセプト（ＡＦＬＢ）を例示する（１条件当たりＮ＝３の生物学的複製；マッチしたＭＯＩについてのみ計算した統計値）。

図５Ａおよび５Ｂは、５Ｋおよび１ＫのＭＯＩでの、配列番号４８のカプシドと指し示された導入遺伝子をコードする異種核酸とを含むｒＡＡＶによるＲＰＥ細胞の形質導入の７日後（図５Ａ）および１１日後（図５Ｂ）の培地中の遊離の活性なアフリベルセプト（ＡＦＬＢ）を例示する。図５Ｃは、ＡＦＬＢのみをコードする構築物を含むｒＡＡＶによるＲＰＥ細胞の形質導入後のＡＦＬＢを、ＡＦＬＢ＋ＶＥＧＦ－Ｃに対するＲＮＡｉをコードする構築物を含むｒＡＡＶと比較する。同上。同上。

図６Ａ～Ｂは、ＡＦＬＢのみをコードする構築物を含むｒＡＡＶによる形質導入後のＲＰＥ細胞の培地中の遊離および活性ＡＦＬＢの、ＡＦＬＢ＋ＶＥＧＦ－Ｃに対するＲＮＡｉをコードする構築物を含むｒＡＡＶとの時間経過比較を例示する。同上。

図７Ａ～Ｂは、配列番号４８のカプシドタンパク質と指し示された構築物とを含むｒＡＡＶによる、指定されたＭＯＩでの形質導入後の７日目（図７Ａ）および１１日目（図７Ｂ）のＲＰＥ上清におけるＶＥＧＦ－Ａ中和（ＥＬＩＳＡによって評価した）の比較を例示する。

図８Ａ～Ｄは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後の二重タンパク質構築物（ＡＦＬＢ＋ＬＨまたはＨＬ構成の抗Ａｎｇ２ｓｃＦａｂをコードするプラスミド）からの機能的抗Ａｎｇ２ｓｃＦａｂの発現を例示する（競合ＥＬＩＳＡおよびＴｉｅ２受容体競合アッセイによって評価した）。同上。

図９は、ＭＯＩ５０００および１０００での、配列番号４８のカプシドタンパク質とＡＦＬＢ＋抗Ａｎｇ２ｓｃＦａｂ（ＨＬおよびＬＨコンフォメーション）をコードする異種核酸とを含むｒＡＡＶによる形質導入後のＲＰＥ細胞の培地からの抗Ａｎｇ２ｓｃＦａｂ（および抗ＡＦＬＢ）ウエスタンブロット結果を例示し、ＬＨおよびＨＬ形態の類似の発現レベルが観察された。

図１０Ａ～Ｂは、５０００および１０００のＭＯＩでの、図９に記載されるｒＡＡＶによる形質導入の１１日後のＲＰＥ細胞由来の培地に対する抗Ａｎｇ２機能的ＥＬＩＳＡ（ＡＮＧ２でコーティングされたプレート）（図１０Ａ）および競合ＥＬＩＳＡ（図１０Ｂ）の結果を例示する。同上。

図１１は、図９に記載されるｒＡＡＶによってコードされる抗Ａｎｇ２ｓｃＦａｂの結合親和性（Ｂｉａｃｏｒｅによって評価した）を例示する。

図１２Ａ～Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプラスミドトランスフェクション後の二重タンパク質構築物（ＡＦＬＢ＋ＰＥＤＦをコードする）からのＰＥＤＦ発現を例示する。

図１３Ａ～Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプラスミドトランスフェクション後の二重タンパク質構築物（ＡＦＬＢ＋ＶＥＧＦＲ３－Ｆｃをコードする）からのＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ発現を例示する。ヘテロダイマー化から生じるアフリベルセプトの劇的な喪失が、ＥＬＩＳＡによって示される。

図１４は、Ａｎｇ２ｍｉＲ－Ｅ（ｍｉＲ－Ｅ骨格内に埋め込まれたＲＮＡｉセンスおよびアンチセンス鎖）およびＲＰＦ６５７（ｐＰ１４３．００１）またはＡＦＬＢ（ｐＰ１４１．００１）をコードする構築物ｐＰ１４３．００１（ｍｉＲＮＡのみの有効性対照）およびｐＰ１４１．００１を例示する。

図１５Ａ～Ｂは、対照に対して正規化した（図１５Ａ）または正規化していない（図１５Ｂ）、指し示されたｓｈＡｎｇ２構築物によるＨＵＶＥＣの形質導入後のＥＬＩＳＡによるＡｎｇ２（分泌型および細胞性）のｋＤを例示する。

図１６Ａは、配列番号４８のカプシドタンパク質と、ｍｉＲ－Ｅ骨格内に埋め込まれたｓｈＲＮＡ＃５（図１５Ａ～Ｂに記載される）のセンスおよびアンチセンス鎖を含むｍｉＲＮＡをコードする核酸とを含むｒＡＡＶによるヒトＲＭＶＥＣ細胞の形質導入後のＡｎｇ２ＥＬＩＳＡ（分泌型および細胞性）の結果を例示する。図１６Ｂは、Ａｎｇ２ｑＰＣＲによって評価した、ＲＭＶＥＣからのＡｎｇ２分泌における有意な減少を例示する。

図１７Ａ～Ｂは、指定されたＭＯＩでの、図１６に記載されるｒＡＡＶ（ＡＦＬＢのみまたは対照として機能するＧＦＰをコードするｒＡＡＶ）による形質導入の８日後のヒトＲＰＥ細胞におけるＡｎｇ２ＲＮＡレベル（ＲＴ－ｑＰＣＲ；図１７Ａ）およびタンパク質レベル（ＥＬＩＳＡ；図１７Ｂ）を例示する。

図１８Ａ～Ｂは、配列番号４８のカプシドタンパク質と指定された核酸構築物とを含むｒＡＡＶによる指定されたＭＯＩでの形質導入の８日後のＲＭＶＥＣ細胞における遊離ＡＦＬＢタンパク質レベル（図１８Ａ）およびＡＦＬＢｍＲＮＡレベル（図１８Ｂ）を例示する。

図１９Ａ～Ｃは、配列番号４８のカプシドタンパク質と指定された核酸構築物とを含むｒＡＡＶによる形質導入の８日後のＲＭＶＥＣ細胞におけるＡｎｇ２分泌（図１９Ａ）およびＡｎｇ２ＲＮＡレベル（図１９Ｂおよび１９Ｃ）を例示する。同上。

図２０は、指し示されたｓｈＶＥＧＦ－Ｃ構築物による形質導入後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＶＥＧＦ－ＣＲＮＡレベルのパーセンテージ（ＲＰＬ３２に対して正規化；ｑＰＣＲによるＲＮＡ解析）を例示する。

図２１Ａ～Ｃは、配列番号４８のカプシドタンパク質と指定された核酸構築物とを含むｒＡＡＶによる、指定されたＭＯＩでのヒトＲＰＥ細胞の形質導入後のＶＥＧＦ－Ｃタンパク質（ＥＬＩＳＡによる；図２１Ａ）およびＶＥＧＦ－ＣｍＲＮＡ（ｑＰＣＲによる；図２１Ｂ）を例示する。図２１Ｃは、細胞におけるＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡの発現における用量依存的な増加を例示する。同上。

図２２Ａ～Ｃは、配列番号４８のカプシドタンパク質と指定された核酸構築物とを含むｒＡＡＶによる、指定されたＭＯＩでの形質導入の８日後のＲＰＥ細胞における内因性ＶＥＧＦ－Ａ中和（図２２Ａ）ならびにＶＥＧＦ－Ｃタンパク質（図２２Ｂ）およびｍＲＮＡレベル（図２２Ｃ）を例示する。同上。

図２３は、配列番号４８のカプシドタンパク質（Ｒ１００）とＧＦＰをコードする核酸とを含む１．２×１０^１２ｖｇのｒＡＡＶによる硝子体内注射後のＮＨＰ眼由来の網膜内皮細胞におけるＧＦＰおよびＣＤ３１の共局在化についての組織病理学的染色を例示する。

図２４は、配列番号４８のカプシドタンパク質と、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡとをコードする核酸とを含むｒＡＡＶの硝子体内投与後のＮＨＰの眼房（ａｑｕｅｏｕｓ）、硝子体（ｖｉｔｒｅｏｕｓ）および網膜＋脈絡膜におけるアフリベルセプト（ＡＦＬＢ）発現を例示する。

図２５は、ＮＨＰの網膜中のｍｉＲＮＡコピー（図２４に記載される、左パネル）、およびＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡを、ＮＨＰ網膜中の優勢なｍｉＲＮＡ種として確認する、ＭｉＳｅｑデータを例示する。

図２６は、脈絡膜新生血管のＮＨＰモデルにおけるビヒクル対照と比較した、指定された用量で投与した、配列番号４８のカプシドタンパク質と、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡとをコードする核酸とを含むｒＡＡＶの保護効果を例示する。

図２７は、（ｉ）アフリベルセプト、およびＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡ、（ｉｉ）アフリベルセプトのみ、または（ｉｉｉ）ＧＦＰのみをコードするプラスミドによる電気穿孔後のＨＵＶＥＣ細胞の細胞増殖（左）および遊走（右）を示す。

図２８は、（ｉ）配列番号４８のカプシドタンパク質と、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードする核酸（配列番号１９および２０に対応するセンスおよびアンチセンス鎖ならびに配列番号６９に対応する完全構築物を含む）とを含むｒＡＡＶ、または（ｉｉ）配列番号４８のカプシドタンパク質とアフリベルセプトのみをコードする核酸とを含むｒＡＡＶ、の指定された用量での単回硝子体内投与後のＮＨＰの房水におけるアフリベルセプト濃度（ｎｇ／ｍｌ）を例示する。

図２９は、ビヒクル処置した対照眼と比較した、スリットランプ生体顕微鏡によって評価した、指定された時点における、（ｉ）配列番号４８のカプシドタンパク質と、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードする核酸（配列番号１９および２０に対応するセンスおよびアンチセンス鎖ならびに配列番号６９に対応する完全構築物を含む）とを含むｒＡＡＶ、または（ｉｉ）配列番号４８のカプシドタンパク質とアフリベルセプトのみをコードする核酸とを含むｒＡＡＶ、の指定された用量での単回硝子体内投与後のＮＨＰにおける眼内炎症を例示する。

図３０は、ベースラインから、（ｉ）配列番号４８のカプシドタンパク質と、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードする核酸（配列番号１９および２０に対応するセンスおよびアンチセンス鎖ならびに配列番号６９に対応する完全構築物を含む）とを含むｒＡＡＶ、または（ｉｉ）配列番号４８のカプシドタンパク質とアフリベルセプトのみをコードする核酸とを含むｒＡＡＶ、の指定された用量での単回硝子体内投与の２２週間後までの、ＮＨＰにおける網膜体積の総計の平均値および平均網膜中心厚を示す。

図３１は、（ｉ）配列番号４８のカプシドタンパク質と、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードする核酸（配列番号１９および２０に対応するセンスおよびアンチセンス鎖ならびに配列番号６９に対応する完全構築物を含む）とを含むｒＡＡＶ、または（ｉｉ）配列番号４８のカプシドタンパク質とアフリベルセプトのみをコードする核酸とを含むｒＡＡＶ、の指定された用量での単回硝子体内投与後８４日目および２２週目の、ＮＨＰにおける全視野網膜電図検査（ｆｕｌｌｆｉｅｌｄｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｙ）（ｆｆＥＲＧ）の結果を例示する。

発明の詳細な説明
定義

「コドン適応指数」は、本明細書で使用される場合、コドン使用バイアスの尺度を指す。コドン適応指数（ＣＡＩ）は、遺伝子の参照セットに関しての、所与のタンパク質コード遺伝子配列の偏差を測定する（Sharp P M and Li W H, Nucleic Acids Res. 15(3):1281-95 (1987)）。ＣＡＩは、遺伝子配列の長さ（コドンで測定した）にわたる、各コドンに関連付けられた重みの幾何平均を決定することによって計算される：

各アミノ酸について、ＣＡＩにおけるそのコドンの各々の重みは、そのアミノ酸についての、コドンの観察された頻度（ｆｉ）と同義のコドンの頻度（ｆｊ）との間の比として計算される：

用語「単離された」は、その元の環境（それが天然に存在する環境）から取り出された生物学的材料（細胞、核酸またはタンパク質）を指定する。例えば、植物または動物中に天然の状態で存在するポリヌクレオチドは、単離されていないが、それがその中に天然に存在する隣接する核酸から分離された同じポリヌクレオチドは、「単離された」とみなされる。

本明細書で使用される場合、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸へと翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は、典型的には、アミノ酸へと翻訳されないが、コード領域の一部とみなすことができ、しかし、任意の隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。コード領域の境界は、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドンおよび得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳停止コドンによって、典型的には決定される。２つまたはそれよりも多くのコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば、単一のベクター上に、または別々のポリヌクレオチド構築物中に、例えば、別々の（異なる）ベクター上に存在し得る。すると、単一のベクターは、単一のコード領域だけを含有し得る、または２つもしくはそれよりも多くのコード領域を含み得るという結果になる。

「２Ａペプチド」は、複数の遺伝子を同じｍＲＮＡから等モルレベルで産生し、マルチシストロン性ベクター中でＩＲＥＳエレメントの代わりに使用され得る、約２０アミノ酸の「自己切断性」ペプチドを指す。非限定的な例には、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａペプチド配列が含まれる。異種核酸が複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む実施形態では、複数の（例えば、２つの）遺伝子産物の発現は、複数の（例えば、２つの）独立したプロモーターによって媒介され得るか、または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）もしくは２Ａペプチド配列によって分離された複数の導入遺伝子で、単一のプロモーターによって媒介され得る。

本明細書で使用される場合、用語「調節領域」は、コード領域の上流（５’非コード配列）、内側または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節領域には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム－ループ構造が含まれ得る。コード領域が真核生物細胞における発現を意図したものである場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が通常、コード配列の３’側に位置する。

本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」と相互交換可能であり、ヌクレオチドのポリマーが意図される。

遺伝子産物、例えばポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数のコード領域に作動可能に関連したプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な関連状態では、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域は、遺伝子産物の発現を調節領域（複数可）の影響下または制御下に置くような方法で、１つまたは複数の調節領域に関連している。例えば、プロモーター機能の誘導が、コード領域によってコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じる場合、およびプロモーターとコード領域との間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示するプロモーターの能力を妨害することも、ＤＮＡ鋳型が転写される能力を妨害することもない場合、コード領域とプロモーターとは、「作動可能に関連している」。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルもまた、遺伝子産物発現を指示するために、コード領域に作動可能に関連し得る。

「転写制御配列」または「発現制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供するＤＮＡ調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを指す。種々の転写制御領域が、当業者に公知である。これらには、例えば、サイトメガロウイルス（イントロン－Ａと併せた、最初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントであるがこれらに限定されない、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が含まれるがこれらに限定されない。他の転写制御領域には、脊椎動物遺伝子に由来するもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギベータ－グロビン、ならびに真核生物細胞における遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が含まれる。

「ＣＡＧプロモーター」は、（Ｃ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント、（Ａ）ニワトリベータ－アクチン遺伝子のプロモーター、第１のエクソンおよび第１のイントロン、（Ｇ）ウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプター、から構成される。その内容が参照によって本明細書に援用される、Miyazaki, J., Takaki, S., Araki, K., Tashiro, F., Tominaga, A., Takatsu, K., & Yamamura, K. (1989). Expression vector system based on the chicken β-actin promoter directs efficient production of interleukin-5. Gene, 79(2), 269-277を参照されたい。

同様に、種々の翻訳制御エレメントが、当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる内部リボソーム進入部位、即ちＩＲＥＳ）が含まれるがこれらに限定されない。

用語「発現」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。これには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、一次ｍｉＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物へのポリヌクレオチドの転写、およびポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が含まれるがこれらに限定されない。発現により、「遺伝子産物」が産生される。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物には、転写後改変、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸、または翻訳後改変、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合もしくはタンパク質分解性切断を有するポリペプチドがさらに含まれる。

「ベクター」は、核酸のクローニングおよび／または宿主細胞中への核酸の移入のためのあらゆる任意の輸送手段を指す。ベクターは、結合したセグメントの複製をもたらすように、別の核酸セグメントを結合させることができる、レプリコンであり得る。用語「ベクター」は、核酸を細胞中にｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏで導入するためのウイルスビヒクルおよび非ウイルスビヒクルの両方を含む。例えば、プラスミド、改変された真核生物ウイルスまたは改変された細菌ウイルスが含まれる多数のベクターが、当該分野で公知であり使用される。適切なベクター中へのポリヌクレオチドの挿入は、適したポリヌクレオチド断片を、相補的な付着末端を有する選ばれたベクター中にライゲーションすることによって達成され得る。

ベクターは、ベクターを取り込んだ細胞の選択または同定を提供する選択可能なマーカーまたはレポーターをコードするように操作され得る。選択可能なマーカーまたはレポーターの発現は、ベクターを取り込み、そのベクター上に含有される他のコード領域を発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。当該分野で公知であり使用される選択可能なマーカー遺伝子の例には、以下が含まれる：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を提供する遺伝子；および表現型マーカーとして使用される遺伝子、即ち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンテニル（isopentanyl）トランスフェラーゼ遺伝子など。当該分野で公知であり使用されるレポーターの例には、以下が含まれる：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など。選択可能なマーカーは、レポーターともみなされ得る。

使用され得る真核生物ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。非ウイルスベクターには、プラスミド、リポソーム、電気的に荷電した脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ－タンパク質複合体およびバイオポリマーが含まれる。

「プロモーター」および「プロモーター配列」は、相互交換可能に使用され、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それらの全体がネイティブ遺伝子に由来していてもよく、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されていてもよく、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階において、または異なる環境的もしくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることが、当業者に理解される。ほとんどの時点におけるほとんどの細胞型において遺伝子が発現されるようにするプロモーターは一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。特定の細胞型において遺伝子が発現されるようにするプロモーターは一般に、「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。特定の発生段階または細胞分化段階において遺伝子が発現されるようにするプロモーターは一般に、「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する作用物質（agent）、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処置後に誘導され、遺伝子が発現されるようにするプロモーターは一般に、「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合において、調節配列の正確な境界は完全には定義されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識される。

用語「プラスミド」は、細胞の中枢代謝の一部ではない遺伝子を保有する場合が多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外エレメントを指す。かかるエレメントは、任意の供給源に由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、直線状、環状またはスーパーコイル状の、自律的に複製する配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であり得、それにおいて、いくつかのヌクレオチド配列が、プロモーター断片と選択された遺伝子産物のためのＤＮＡ配列とを適した３’非翻訳配列と共に細胞中に導入することが可能な独自の構造に繋がれまたは組み換えられている。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定のパーセント「配列同一性」を有し、これは、アラインされた場合に、塩基またはアミノ酸のそのパーセンテージが、２つの配列を比較した場合に同じであることを意味している。配列類似性は、いくつかの異なる様式で決定され得る。配列同一性を決定するために、配列は、ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてワールドワイドウェブ上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータープログラムを使用してアラインされ得る。別のアラインメントアルゴリズムは、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡのＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージにおいて利用可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技法は、Methodsin Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc.に記載されている。配列中にギャップを許容するアラインメントプログラムが、特に目的とされる。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメント中にギャップを許容するアルゴリズムの１つの型である。Meth.Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)を参照されたい。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアラインメント法を使用するＧＡＰプログラムが、配列をアラインするために利用され得る。J.Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)を参照されたい。

第１の抗血管新生ポリペプチドおよび抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸

一部の実施形態では、第１および第２の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、第１の抗血管新生ポリペプチドが、アフリベルセプトであり、第２の抗血管新生ポリペプチドが、血管新生促進性タンパク質に結合しその活性を阻害する抗体またはその抗原結合性断片である、核酸が提供される。

ヒトでの発現のためにコドン最適化された、アフリベルセプトをコードする好ましいヌクレオチド配列は、以下に提供される：

一部の実施形態では、配列は、配列番号５０のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％同一であり、および／または配列の最後に、停止コドン（例えば、ＴＧＡ）を含む。一部の実施形態では、アフリベルセプト遺伝子産物は、以下のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む：

一部の好ましい実施形態では、第２の抗血管新生ポリペプチドは、アンジオポエチン（アンジオポエチン－１／Ａｎｇ１／Ａｎｇ－１、アンジオポエチン－２／Ａｎｇ２／Ａｎｇ－２）に結合しその活性を阻害する抗体または抗原結合性断片である。一部の態様では、第２の抗血管新生ポリペプチドは、Ａｎｇ１および／またはＡｎｇ２に対する抗体である。一部の好ましい実施形態では、第２の抗血管新生ポリペプチドは、Ａｎｇ－２に結合する抗体またはその抗原結合性断片である。特に好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＨＣＤＲ１＝ＧＹＹＭＨ（配列番号５２）；ＨＣＤＲ２＝ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５３）およびＨＣＤＲ３＝ＳＰＮＰＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹＰＧＡＦＤＩ（配列番号５４）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、ＬＣＤＲ１＝ＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨ（配列番号５５）、ＬＣＤＲ２＝ＤＤＳＤＲＰＳ（配列番号５６）およびＬＣＤＲ３＝ＱＶＷＤＳＳＳＤＨＷＶ（配列番号５７）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含むか、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一なＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを含む。関連の実施形態では、抗体は、ＬＨまたはＨＬ配向の単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）断片である。一部の特に好ましい実施形態では、第１の抗血管新生ポリペプチドは、アフリベルセプトであり、第２の抗血管新生ポリペプチドは、ヒトＡｎｇ－２に結合する抗体またはその抗原結合性断片（例えば、ｓｃＦａｂ断片）である。

Ａｎｇ－２は、血管新生および脈管透過性を促進する。Ａｎｇ－２発現は、とりわけ、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、湿性加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）および網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）患者の硝子体において増加する。高いＡｎｇ－２発現は、ｗＡＭＤ患者における減少したＢＶＣＡ（最高矯正視力）および高い中心黄斑厚（ＣＭＴ）と相関する。

他が具体的に指し示されない限り、用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（即ち、「完全抗体分子」）ならびにその抗原結合性断片を包含すると理解するものとする。抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性断片」などという用語には、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に取得可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。抗体の「抗原結合性断片」または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体断片には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含有する断片、または単離されたＣＤＲが含まれ得る。ある特定の実施形態では、用語「抗原結合性断片」は、多重特異性抗原結合分子のポリペプチド断片を指す。抗体の抗原結合性断片は、例えば、完全抗体分子から、任意の適切な標準的な技法、例えば、タンパク質分解性消化、または抗体可変および（必要に応じて）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現が関与する組換え遺伝子操作技法を使用して、誘導され得る。かかるＤＮＡは公知である、および／または、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ－抗体ライブラリーが含まれる）から容易に入手可能である、または合成され得る。ＤＮＡは、例えば、１つもしくは複数の可変および／もしくは定常ドメインを適切な構成に配置するため、またはコドンを導入し、システイン残基を創出し、アミノ酸を改変、付加もしくは欠失させるためなどに、化学的に、または分子生物学の技法を使用することによって、配列決定および操作され得る。

抗原結合性断片の非限定的な例には、以下が含まれる：（ｉ）Ｆａｂ断片（例えば、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片（単一ドメイン抗体、即ち、ナノボディまたはＶＨＨドメイン）；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＣＤＲ３ペプチド）、または拘束されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（ｍｉｎｉｍａｌｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｕｎｉｔ）。他の操作された分子、例えば、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインもまた、本明細書で使用される場合、表現「抗原結合性断片」内に包含される。

抗体の抗原結合性断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであり得、一般に、１つまたは複数のフレームワーク配列に隣接するまたはそれとインフレームの、少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと会合したＶＨドメインを含む抗原結合性断片では、ＶＨおよびＶＬドメインは、任意の適切な配置になるような、互いに対する位置にあり得る。例えば、可変領域は、ダイマー性であり得、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬダイマーを含有し得る。あるいは、抗体の抗原結合性断片は、モノマー性ＶＨまたはＶＬドメインを含有し得る。

ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合的に連結された少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合性断片内で見出され得る可変および定常ドメインの非限定的な例示的な構成には、以下が含まれる：（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬ。上に列挙した例示的な構成のいずれかが含まれる、可変および定常ドメインの任意の構成において、可変および定常ドメインは、互いに直接連結され得、または完全もしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域によって連結され得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中の隣接する可変および／または定常ドメイン間での可撓性または半可撓性の連結を生じる、少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個またはそれよりも多くの）アミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合性断片は、互いと、および／または１つもしくは複数のモノマー性ＶＨもしくはＶＬドメインと（例えば、ジスルフィド結合（複数可）により）非共有結合的に会合した、上に列挙した可変および定常ドメイン構成のいずれかのホモダイマーまたはヘテロダイマー（または他のマルチマー）を含み得る。

完全抗体分子と同様、抗原結合性断片は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合性断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別々の抗原に、または同じ抗原上の異なるエピトープに、特異的に結合することが可能である。本明細書で開示される例示的な二重特異性抗体形式が含まれる任意の多重特異性抗体形式は、当該分野で利用可能な慣用的な技法を使用して、本発明の抗体の抗原結合性断片に関連する使用のために適応され得る。

一部の好ましい実施形態では、（ｉ）アフリベルセプト＋抗Ａｎｇ２ＨＬｓｃＦａｂ、（ｉｉ）アフリベルセプト＋抗Ａｎｇ２ＬＨｓｃＦａｂ、（ｉｉｉ）アフリベルセプト＋抗Ａｎｇ２ＨＬｓｃＦｖ、または（ｉｖ）アフリベルセプト＋抗Ａｎｇ２ＬＨｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、好ましくは、ｓｃＦａｂまたはｓｃＦＶが、配列番号５２～５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と配列番号５５～５７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲとを含む、発現カセットが提供される。

第１の抗血管新生ポリペプチドおよび可溶性融合タンパク質をコードする核酸

一部の実施形態では、第１および第２の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、第１の抗血管新生ポリペプチドが、アフリベルセプトであり、第２の抗血管新生ポリペプチドが、血管新生促進性ポリペプチドの活性を阻害する可溶性融合タンパク質である、核酸が提供される。

一部の好ましい実施形態では、第１の抗血管新生ポリペプチドは、アフリベルセプトであり、第２の抗血管新生ポリペプチドは、ＶＥＧＦ受容体の可溶性形態である（例えば、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２および／またはＶＥＧＦＲ－３の１つまたは複数のＶＥＧＦ結合ドメインを含む）。

一部の好ましい実施形態では、第１の抗血管新生ポリペプチドは、アフリベルセプトであり、第２の抗血管新生ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ－３の細胞外ドメイン由来の１つまたは複数のＶＥＧＦ結合性部分を含む可溶性融合タンパク質であり、その代表的な例には、米国特許第７，０３４，１０５号、同第５，９５２，１９９号および同第７，４２２，７４１号に記載される可溶性融合タンパク質が含まれ、その各々の内容は、参照によって本明細書に援用される。

ＶＥＧＦ－Ｃは、血管新生およびリンパ管新生を促進し、脈管透過性および漏出を増加させる。ＶＥＧＦ－Ｃは、抗ＶＥＧＦ処置後にｗＡＭＤ患者の眼において上昇する。アフリベルセプト（これは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－ＢおよびＰＩＧＦに結合する）と組み合わせた、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄに結合するＶＥＧＦＲ－３－ＦＣの送達は、ｗＡＭＤおよびＤＭＥなどの眼疾患のための改善された治療を提供する。

ＶＥＧＦ－Ａの標的化とＶＥＧＦＲ３の遮断との組合せは、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の前臨床モデルにおいて有効であり、臨床試験において評価されている。新生血管ＡＭＤを有する対象における第２ｂ相臨床試験において、硝子体内ラニビズマブおよびＶＥＧＦＣ／ＤアンタゴニストＯＰＴ－３０２の組合せは、ラニビズマブ単独による処置と比較して、２４週の時点で、平均最高矯正視力における３．４文字の利益を生じた（ｐ＝０．０１０７）。

特に好ましい態様では、第２の抗血管新生ポリペプチドは、その内容が参照によって本明細書に援用される米国特許第９，７４５，５５８号に記載される、ヒトＶＥＧＦＲ－３の細胞外ドメイン１～３を含むＶＥＧＦＲ－３の可溶性形態と、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄに結合し、内因性ＶＥＧＦＲ－２およびＶＥＧＦＲ－３に対するそれらの活性を阻害するヒトＩｇＧ１のＦｃ断片とである、Ｏｐｔ－３０２である。

ヒトでの発現のためにコドン最適化された、ＯＰＴ－３０２をコードする好ましいヌクレオチド配列は、以下に提供される：

ヒトでの発現のためにコドン最適化された、代替的ＩｇＧ２Ｆｃドメインを含有する可溶性ＶＥＧＦＲ－３をコードする好ましいヌクレオチド配列は、以下に提供される：

一部の好ましい実施形態では、（ｉ）アフリベルセプト＋ＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ、または（ｉｉ）アフリベルセプト＋ＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ－ＩｇＧ２をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットが提供される。好ましくは、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５０の配列もしくはそれと少なくとも９０％同一な配列を含み、および／またはＶＥＧＦＲ３－Ｆｃをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５８の配列を含み、および／またはＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ－ＩｇＧ２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５９の配列を含む。

第１および第２の抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸

一部の実施形態では、第１および第２の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、第１の抗血管新生ポリペプチドが、アフリベルセプトであり、第２の抗血管新生ポリペプチドが、エンドスタチン；タムスタチン；アンジオスタチン；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）から選択される、核酸が提供される。

一部の好ましい実施形態では、核酸は、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列およびＰＥＤＦをコードするヌクレオチド配列を含む（例えば、その各々の内容が参照によって本明細書に援用される、Dawson et al., Science 285:245, 1999；米国特許第５，８４０，６８６号ならびに国際特許出願ＷＯ９３／２４５２９およびＷＯ９９／０４８０６を参照されたい）。ＰＥＤＦは、セリンプロテアーゼ阻害剤のセルピンファミリーのメンバーに対して相同性を有する分泌型タンパク質である。ＰＥＤＦは、網膜色素上皮細胞によって主に産生され、ほとんどのヒト組織において発現され、抗血管新生性および神経保護薬の性質を有する（例えば、Dawson D W et al., Science. 1999 July 9; 285(5425):245-8を参照されたい）。ＰＥＤＦは、光受容体の変性を防止し、ＰＥＤＦの欠損は、ｗＡＭＤなどの血管新生疾患に関連する。前臨床データは、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）のマウスおよびブタモデルにおけるＶＥＧＦおよびＦＧＦの阻害的な役割を指摘している（例えば、Lei XL, Oxid Med Cell Longev.; Vol. 2020, Art. ID 8941057を参照されたい）。

代表的なヒトＰＥＤＦ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＰ３６９５５（例えば、Ｐ３６９５５．４）において見出される。一部の態様では、ヒトでの発現のためにコドン最適化された、ヒトＰＥＤＦをコードする好ましいヌクレオチド配列は、以下の配列またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を有する：

一部の好ましい実施形態では、アフリベルセプト＋ＰＥＤＦをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、好ましくは、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列が、配列番号５０の配列を含み、および／またはＰＥＤＦをコードするヌクレオチド配列が、配列番号６０の配列を含む、発現カセットが提供される。

第１の抗血管新生ポリペプチドとアンジオポエチンの発現を低減させる干渉ＲＮＡ分子とをコードする核酸

一部の実施形態では、第１の抗血管新生ポリペプチドとアンジオポエチンを標的化する干渉ＲＮＡ分子とをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、第１の抗血管新生ポリペプチドが、アフリベルセプトである、核酸が提供される。

好ましい態様では、干渉ＲＮＡ分子は、ヒトアンジオポエチン－１（Ａｎｇ１またはＡｎｇ－１としても公知）を標的化する、および／またはヒトアンジオポエチン－２（Ａｎｇ２またはＡｎｇ－２としても公知）を標的化する。代表的なヒトＡｎｇ２配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号０１５１２３ならびに米国特許第８，９８７，４２０号の配列番号５１７および５１８において見出すことができ、その内容は、参照によって本明細書に援用される。ヒトＡｎｇ－２遺伝子内の適切な標的配列ならびにヒトＡｎｇ－２を標的化する代表的な干渉ＲＮＡ分子には、米国特許第７，９９４，３０５号（例えば、米国特許第７，９９４，３０５号の配列番号２２８～４２７）および同第８，８２９，１７９号（例えば、米国特許第８，８２９，１７９号の配列番号２～６９および７３～１０４）中のものが含まれ、その各々の内容は、参照によって本明細書に援用される。特に好ましい実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、ヒトＡｎｇ－２を標的化し、表１に従うセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。

好ましい実施形態では、アフリベルセプトと表１に記載される１つまたは複数の干渉ＲＮＡとをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットが提供される。好ましくは、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５０の配列を含む。

第１の抗血管新生ポリペプチドとＶＥＧＦ－Ｃおよび／またはＶＥＧＦ－Ｄの発現を低減させる干渉ＲＮＡ分子とをコードする核酸

一部の好ましい実施形態では、第１の抗血管新生ポリペプチドとＶＥＧＦ－Ｃおよび／またはＶＥＧＦ－Ｄを標的化する干渉ＲＮＡ分子とをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、第１の抗血管新生ポリペプチドが、アフリベルセプトである、核酸が提供される。

特に好ましい態様では、干渉ＲＮＡ分子は、ヒトＶＥＧＦ－Ｃおよび／またはヒトＶＥＧＦ－Ｄを標的化する。代表的なヒトＶＥＧＦ－Ｃ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５４２９およびＸ９４２１６において見出すことができる。代表的なヒトＶＥＧＦ－Ｄ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ０００１８５．１において見出すことができる。ヒトＶＥＧＦ－Ｃ遺伝子内の適切な標的配列ならびにヒトＶＥＧＦ－Ｃを標的化する代表的な干渉ＲＮＡ分子には、米国特許第７，５１７，８６４号（例えば、表ＩＩ）および米国特許出願公開第２０１１／０２９３６２５号（例えば、配列番号１～３および７～１２）中のものが含まれ、その各々の内容は、参照によって本明細書に援用される。特に好ましい実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、ヒトＶＥＧＦ－Ｃを標的化し、表２に従うセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。

ＶＥＧＦ－Ｃ標的配列（複数可）は、特異性のｉｎｓｉｌｉｃｏ決定、ヒトおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）配列に対する相同性、ならびにＶＥＧＦ－Ｃのｉｎｖｉｔｒｏノックダウンに基づいて選択した（実施例を参照されたい）。ＲＮＡｉ分子（複数可）によって標的化されるＶＥＧＦ－Ｃの領域は、ヒト配列とＮＨＰ配列との間で１００％の相同性を有するが、マウスＶＥＧＦ－Ｃは、この標的配列がマウスにおいて有効である能力に影響する可能性が高い２つの点変異を有する。ＶＥＧＦ－Ｃ標的領域の配列アラインメントは、以下に提供される：

湿性ＡＭＤ（ｗＡＭＤ）は、脈絡膜層からブルッフ膜を介して網膜中への、異常な漏出性の血管の成長によって特徴付けられ、中心視野の迅速な喪失をもたらし得る、網膜状態である。現行の承認された処置には、抗血管新生タンパク質治療、例えば、アフリベルセプト、ラニビズマブもしくはブロルシズマブ、またはＶＥＧＦ－Ａを介したシグナル伝達を遮断するアプタマーペガプタニブナトリウム（pegaptinib sodium）の注射が含まれる。しかし、これらの注射される治療は、視覚を維持するために反復硝子体内（ＩＶＴ）投与を必要とする。多くの患者が、負担となる頻度の要求される処置通院に関連する過少処置に起因して、初期の視覚利益を維持することができない。ＶＥＧＦ－Ａを標的化する抗血管新生ポリペプチド（例えば、アフリベルセプト）とＶＥＧ－Ｃを標的化するＲＮＡｉ分子とを含む本明細書に記載される核酸は、現行の抗ＶＥＧＦ治療の投与後に上方調節されるＶＥＧＦ－Ｃなどのさらなる血管新生因子の発現を低減させることによって、湿性ＡＭＤ患者に、改善された有効性を提供する。

好ましい実施形態では、アフリベルセプトと表２に記載される１つまたは複数の干渉ＲＮＡとをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットが提供される。好ましくは、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５０の配列を含む。

第１の抗血管新生ポリペプチドとＶＥＧＦＲ－３の発現を低減させる干渉ＲＮＡ分子とをコードする核酸
一部の実施形態では、第１の抗血管新生ポリペプチドとＶＥＧＦＲ－３を標的化する干渉ＲＮＡ分子とをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、第１の抗血管新生ポリペプチドが、アフリベルセプトである、核酸が提供される。

好ましい態様では、干渉ＲＮＡ分子は、ヒトＶＥＧＦＲ－３を標的化する。代表的なヒトＶＥＧＦＲ－３配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６８２０３において見出すことができる。ヒトＶＥＧＦＲ－３遺伝子内の適切な標的配列ならびにヒトＶＥＧＦＲ－３を標的化する代表的な干渉ＲＮＡ分子には、米国特許第７，５１７，８６４号の表ＩＩに列挙されるものが含まれ、その各々の内容は、参照によって本明細書に援用される。特に好ましい実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、ヒトＶＥＧＦＲ－３を標的化し、表３に従うセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。

好ましい実施形態では、アフリベルセプトと表３に記載される１つまたは複数の干渉ＲＮＡとをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットが提供される。好ましくは、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５０の配列を含む。

核酸が第１の抗血管新生ポリペプチドと１つまたは複数の干渉ＲＮＡとをコードする実施形態では、干渉ＲＮＡ（複数可）をコードする配列は、天然または人工イントロン（例えば、転写制御配列内、遺伝子の５’ＵＴＲ領域内、遺伝子のコード配列内、または遺伝子の３’ＵＴＲ領域内の人工イントロン）内に配置され得る。一部の態様では、干渉ＲＮＡは、合成Ｕ２もしくはＵ１２ベースのイントロン内またはインターフェロン調節因子７イントロン４（ＩＲＦ７ｉｎｔ４；９３ｂｐ）内に配置される。

一部の好ましい態様では、干渉ＲＮＡは、転写制御配列中の人工イントロン内に配置される。一部の好ましい態様では、イントロンは、ＣＡＧプロモーターのハイブリッドニワトリβ－アクチンおよびウサギβ－グロビンイントロン内に位置し、それにより、イントロンは、Ｐｏｌ－ＩＩによってｐｒｅ－ｍＲＮＡ内で共転写され、ＲＮＡスプライシングによってｐｒｅ－ｍＲＮＡから切断される。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ構造を含有するスプライシングされたイントロンは、血管新生促進性標的遺伝子をサイレンシングすることが可能な成熟ｍｉＲＮＡへとさらにプロセシングされる。

他の態様では、干渉ＲＮＡは、遺伝子（例えば、アフリベルセプトをコードする）のコード配列内に位置する人工イントロン内に配置され、それにより、イントロンは、Ｐｏｌ－ＩＩによってｐｒｅ－ｍＲＮＡ内で共転写され、ＲＮＡスプライシングによってｐｒｅ－ｍＲＮＡから切断される。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ構造を含有するスプライシングされたイントロンは、血管新生促進性標的遺伝子をサイレンシングすることが可能な成熟ｍｉＲＮＡへとさらにプロセシングされる。

他の態様では、干渉ＲＮＡをコードする配列は、遺伝子の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域内に配置されるが、イントロン内にはなく、この場合、転写されたｐｒｅ－ｍＲＮＡの一部の部分（例えば、５０％）は、コードされたタンパク質へと翻訳され、転写されたｐｒｅ－ｍＲＮＡの一部の部分（例えば、５０％）は、活性なｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。一部の好ましい態様では、干渉ＲＮＡは、遺伝子の３’ＵＴＲ領域内に配置される。

コドン最適化された核酸配列

一部の実施形態では、本発明は、ヒトでの発現のためにコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＰＥＤＦをコードし、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む、またはそれからなる。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＯＰＴ－３０２をコードし、配列番号５８に示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む、またはそれからなる。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ－ＩｇＧ２をコードし、配列番号５９に示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む、またはそれからなる。

用語「コドン最適化された」は、種々の宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域を指す場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することなしに宿主生物の典型的なコドン使用を反映するような、核酸分子の遺伝子またはコード領域中のコドンの変更を指す。かかる最適化は、少なくとも１つ、または１つよりも多くの、または有意な数のコドンを、その生物の遺伝子においてより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンで置き換えることを含む。

任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列におけるゆれ（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は、その遺伝子をコードする配列におけるバリエーションを可能にする。各コドンは、３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは、４つの特定の塩基に制限されるので、ヌクレオチドの６４個の可能な組合せが存在し、そのうち６１個がアミノ酸をコードする（残り３個のコドンは、翻訳を終わらせるシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝コード」は、本明細書で表１として再現される。結果として、多くのアミノ酸は、１つよりも多くのコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは、４つのトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは、６つのトリプレットによってコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンは、たった１つのトリプレットによってコードされる。この縮重性は、ＤＮＡ塩基組成が、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更することなしに広い範囲にわたって変動するのを可能にする。

多くの生物は、成長中のペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンの使用について偏りを示す。生物間でのコドン使用における差異である、コドン優先度またはコドンバイアスは、遺伝コードの縮重性によってもたらされ、多くの生物において十分に報告されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関する場合が多く、そしてこれは、とりわけ、翻訳されているコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために適合するようにされ得る。

広範な種々の動物、植物および微生物種にとって利用可能な多数の遺伝子配列を考慮して、コドン使用の相対的頻度が計算されてきた。コドン使用表は利用可能であり、例えば、www.kazusa.or.jp/codon/（２０１２年６月１８日にアクセス）において利用可能な「コドン使用データベース（ＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＤａｔａｂａｓｅ）」である。Nakamura,Y., et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照されたい。

所与のポリペプチド配列をコードするのに最適化された頻度でコドンをランダムに割り当てることは、各アミノ酸についてコドン頻度を計算し、次いで、コドンをポリペプチド配列にランダムに割り当てることによって、手動で実施され得る。さらに、種々のアルゴリズムおよびコンピューターソフトウェアプログラムが、最適な配列を計算するために使用され得る。

非ウイルスベクター

一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のヌクレオチド配列を含む非ウイルスベクター（例えば、発現プラスミド）が提供される。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、本明細書に記載される第１の抗血管新生ポリペプチド（例えば、アフリベルセプト）と、本明細書に記載される１つもしくは複数の干渉ＲＮＡおよび／または本明細書に記載される第２の抗血管新生ポリペプチドとをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、非ウイルスベクターは、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含む発現カセットを含むプラスミドである。

ウイルスベクター

一部の実施形態では、本明細書に記載される改変された（コドン最適化された）核酸を含むウイルスベクターが提供される。好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、第１の抗血管新生ポリペプチド（例えば、アフリベルセプト）をコードするヌクレオチドと、本明細書に記載される１つもしくは複数の干渉ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む、ならびに／または第１および第２の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を含む。適切なウイルスベクターの例には、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれるがこれらに限定されない。

好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスゲノムの一部分、例えば、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が欠失された、ならびに／または第１の抗血管新生ポリペプチド（例えば、アフリベルセプト）をコードする配列と、本明細書に記載される１つもしくは複数の干渉ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む、ならびに／または第１および第２の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットならびにそれらの関連する発現制御配列によって置き換えられた、ＡＡＶゲノムを含む。発現カセットは、典型的には、ウイルスｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードする核酸の代わりに、ウイルス複製に適当な１つまたは２つのＡＡＶＴＲまたはＴＲエレメントに隣接して挿入される（即ち、ＡＡＶＴＲまたはＴＲエレメントに挟まれる）（Xiao et al., 1997, J. Virol. 71(2): 941-948）。標的細胞における組織特異的発現を促進する際の使用のために適切な他の調節配列もまた含められ得る。

一部の実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、（ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）転写制御配列、（ｃ）第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｄ）本明細書に記載されるＲＮＡｉ分子をコードするヌクレオチド配列（複数可）、（ｄ）ポリアデニル化配列、および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸を含む。

他の実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、（ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）転写制御配列、（ｃ）第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｄ）２Ａ配列、（ｅ）第２の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｆ）ポリアデニル化配列、および（ｇ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸を含む。
特に好ましい実施形態では、ＡＡＶウイルスベクターは、配列番号６４～７０のうちのいずれかの配列を含む、より好ましくは、配列番号６８～７０のうちのいずれかの配列またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む、核酸（導入遺伝子カセット）を含む。

一部の実施形態では、５’ＩＴＲは、以下の配列を有する：

一部の実施形態では、３’ＩＴＲは、以下の配列を有する：

一部の実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、以下の配列を有する：

当業者は、導入遺伝子を含み、ウイルス複製に必要なウイルスタンパク質（例えば、ｃａｐおよびｒｅｐ）を欠如するＡＡＶベクターが、かかるタンパク質がウイルスの複製およびパッケージングのために必要であるために、複製することができないことを理解する。ヘルパーウイルスには、典型的には、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスが含まれる。あるいは、以下で考察されるように、ヘルパー機能（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡＲＮＡ）は、種々のヘルパーエレメントをコードする１つもしくは複数の核酸でパッケージング細胞をトランスフェクトすることによってを含めて（including by transfecting the cell）パッケージング細胞に提供され得、および／または細胞は、ヘルパータンパク質をコードする核酸を含み得る。例えば、ＨＥＫ２９３は、ヒト細胞をアデノウイルス５ＤＮＡで形質転換することによって生成され、現在、Ｅ１およびＥ３が含まれるがこれらに限定されないいくつかのアデノウイルス遺伝子を発現する（例えば、Grahamet al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59-72を参照されたい）。したがって、これらのヘルパー機能は、例えば、それらをコードするプラスミドによってそれらを細胞に供給することを必要とせずに、ＨＥＫ２９３パッケージング細胞によって提供され得る。

ウイルスベクターは、任意の適切な核酸構築物、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物であり得、一本鎖、二本鎖または二重鎖（即ち、ＷＯ２００１／９２５５１に記載されるように自己相補的）であり得る。

パッケージングされたウイルスベクターのウイルスカプシド成分は、パルボウイルスカプシドであり得る。ＡＡＶＣａｐおよびキメラカプシドが好ましい。例えば、ウイルスカプシドは、ＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、および現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶであり得る。例えば、Fields et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4.sup.th ed.,Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。

一部の実施形態では、パッケージングされたウイルスベクターのウイルスカプシド成分は、ネイティブＡＡＶカプシドのバリアント（即ち、ネイティブＡＡＶカプシドと比較して１つまたは複数の改変を含む）である。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８カプシドのバリアントである。好ましい実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ２カプシドのバリアント、例えば、米国特許出願公開第２０１９／０２５５１９２号Ａ１に記載されるもの（例えば、配列番号４２～５９のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む）であり、この全内容は、参照によって本明細書に援用される。特に好ましい実施形態では、カプシドは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるＶＰ１カプシドタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、カプシドタンパク質のＧＨループ中にペプチド挿入を含み、ペプチド挿入は、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号７４）を含み、好ましくは、ペプチド挿入は、アミノ酸配列Ｙ_１Ｙ_２ＩＳＤＱＴＫＨＹ_３（配列番号７５）を含み、Ｙ_１～Ｙ_３の各々は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＰｒｏから独立して選択される。具体的な実施形態では、ペプチド挿入は、アミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号４９）を含み、好ましくは、挿入の部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７に対応するアミノ酸とアミノ酸５８８に対応するアミノ酸との間、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の対応する位置にある。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１カプシドと比較して１つもしくは複数のアミノ酸置換を含む、または別のＡＡＶ血清型における１つもしくは複数の対応する置換を含み、好ましくは、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１カプシドと比較してＰ３４Ａアミノ酸置換を含む、または別のＡＡＶ血清型における対応する置換を含む。

ＡＡＶＣａｐタンパク質の完全な相補体は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む。ＡＡＶＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、完全な相補体ではないＡＡＶＣａｐタンパク質を含み得、またはＡＡＶＣａｐタンパク質の完全な相補体が提供され得る。

さらに別の実施形態では、本発明は、治療的ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療における使用のための祖先ＡＡＶベクターの使用を提供する。具体的には、ｉｎｓｉｌｉｃｏで誘導された配列を、ｄｅｎｏｖｏ合成し、生物学的活性について特徴付けた。この試みは、９つの機能的な推定祖先ＡＡＶの生成ならびにＡＡＶ血清型１、２、８および９の予測された祖先であるＡｎｃ８０の同定をもたらした（Zinn et al., 2015, Cell Reports 12:1056-1068）。ウイルス粒子へとアセンブルすることに加えた、かかる祖先配列の予測および合成は、ＷＯ２０１５／０５４６５３に記載された方法を使用することによって達成され得、その内容は、参照によって本明細書に援用される。特に、祖先ウイルス配列からアセンブルされたウイルス粒子の使用は、現代のウイルスまたはその部分よりも、今日のヒト集団における既存の免疫に対して感受性の低減を呈し得る。

本発明は、本発明のパッケージングされたウイルスベクターを産生するために培養され得る「宿主細胞」によって包含されるパッケージング細胞を含む。本発明のパッケージング細胞には一般に、異種の（１）ウイルスベクター機能（複数可）、（２）パッケージング機能（複数可）および（３）ヘルパー機能（複数可）を有する細胞が含まれる。これらのコンポーネント機能の各々は、次のセクションにおいて考察される。

最初に、ベクターは、当業者に公知のいくつかの方法によって作製され得る（例えば、ＷＯ２０１３／０６３３７９を参照されたい）。好ましい方法は、Grieger, et al. 2015, Molecular Therapy 24(2):287-297に記載されており、その内容は、全ての目的のために参照によって本明細書に援用される。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞の効率的なトランスフェクションを出発点として使用し、ここで、適格な臨床的マスター細胞バンクからの接着性ＨＥＫ２９３細胞系を使用して、迅速かつスケーラブルなｒＡＡＶ産生を可能にする振盪フラスコおよびＷＡＶＥバイオリアクターにおいて、動物性成分非含有の懸濁条件で成長させる。三重トランスフェクション法（例えば、ＷＯ９６／４０２４０）を使用して、懸濁ＨＥＫ２９３細胞系は、トランスフェクションの４８時間後に回収される場合、１０^５ベクターゲノム含有粒子（ｖｇ）／細胞よりも高いまたは１０^１４ｖｇ／Ｌよりも高い細胞培養物を生成する。より具体的には、三重トランスフェクションは、パッケージング細胞が３つのプラスミドでトランスフェクトされるという事実を指す：１つのプラスミドは、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードし、別のプラスミドは、種々のヘルパー機能（例えば、アデノウイルスまたはＨＳＶタンパク質、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡＲＮＡ）をコードし、別のプラスミドは、導入遺伝子およびその種々の制御エレメント（例えば、改変されたＲＰＧＲｏｒｆ１５遺伝子およびｈＧＲＫプロモーター）をコードする。

所望の収量を達成するために、いくつかの変数、例えば、成長およびトランスフェクションの両方を支持する適合性無血清懸濁培地の選択、トランスフェクション試薬、トランスフェクション条件および細胞密度の選択が、最適化される。ＡＡＶ血清型１～６、８、９および種々のキメラカプシドの高純度ベクター調製物を生じる、イオン交換クロマトグラフィー法に基づく汎用的な精製戦略もまた開発された。このユーザーフレンドリーなプロセスは、１週間以内に完了し得、満たされた粒子の空の粒子に対する高い比（＞９０％の満たされた粒子）を生じ、臨床適用に適切な精製後収量（＞１×１０^１３ｖｇ／Ｌ）および純度を提供し、全ての血清型およびキメラ粒子に関して汎用的である。このスケーラブルな製造技術は、網膜血管新生（ＡＡＶ２）、血友病Ｂ（ｓｃＡＡＶ８）、巨大軸索ニューロパチー（ｓｃＡＡＶ９）および網膜色素変性症（ＡＡＶ２）のためのＧＭＰ第Ｉ相臨床ＡＡＶベクターを製造するために利用されており、これらは患者に投与されてきた。さらに、トランスフェクション後の多数の時点において培養培地からｒＡＡＶを回収することを必然的に伴う灌流方法を実行することによる、全体的ベクター産生における最低５倍の増加。

パッケージング細胞は、パッケージング機能およびベクター機能と共に、ウイルスベクター機能を含む。ウイルスベクター機能は、典型的には、パルボウイルスゲノムの一部分、例えば、ｒｅｐおよびｃａｐが欠失され、ＶＥＧＦ－Ａの活性を阻害する第１の抗血管新生ポリペプチド配列および少なくとも１つの合成ＲＮＡ分子または第２の抗血管新生ポリペプチド配列ならびにその関連する発現制御配列によって置き換えられた、ＡＡＶゲノムを含む。ウイルスベクター機能は、パッケージングのためのウイルスベクターの複製を生じるのに十分な発現制御配列を含む。典型的には、ウイルスベクターは、パルボウイルスゲノムの一部分、例えば、ｒｅｐおよびｃａｐが欠失され、導入遺伝子およびその関連する発現制御配列によって置き換えられたＡＡＶゲノムを含む。導入遺伝子は、典型的には、欠失されたウイルスｒｅｐおよびｃａｐＯＲＦの代わりに、２つのＡＡＶＴＲに挟まれている。適した発現制御配列、例えば、組織特異的プロモーター、および標的細胞における導入遺伝子の組織特異的発現を促進する際の使用のために適切な他の調節配列が含められる。導入遺伝子は、典型的には、治療的ポリペプチドまたはマーカーポリペプチドを産生するために発現され得る核酸配列である。

ウイルスベクターにおける使用のために選択された末端反復（ＴＲ（複数可））（分離可能なおよび分離可能でない）は、好ましくは、ＡＡＶ配列であり、血清型１、２、３、４、５および６が好ましい。ＴＲが所望の機能、例えば、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなどを媒介する限り、分離可能なＡＡＶＴＲは、野生型ＴＲ配列を有する必要はない（例えば、野生型配列は、挿入、欠失、短縮またはミスセンス変異によって変更され得る）。ＴＲは、ＡＡＶ逆位末端反復として機能する合成配列、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第５，４７８，７４５号に記載される「二重－Ｄ配列」であり得、その全開示は、参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。典型的には、必ずではないが、ＴＲは、同じパルボウイルス由来である、例えば、両方のＴＲ配列がＡＡＶ２由来である。

パッケージング機能は、カプシド成分を含む。カプシド成分は、好ましくは、パルボウイルスカプシド、例えば、ＡＡＶカプシドまたはキメラＡＡＶカプシド機能由来である。適切なパルボウイルスのウイルスカプシド成分の例は、パルボウイルス科、例えば、自律的パルボウイルスまたはディペンドウイルス由来のカプシド成分である。例えば、カプシド成分は、ＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶＨｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２ＮおよびＡＡＶ－ＬＫ０３、ならびにまだ同定されていないまたは非ヒト霊長類供給源由来の他の新規カプシドから選択され得る。カプシド成分は、２つまたはそれよりも多くのＡＡＶカプシド由来の成分を含み得る。

パッケージングされたウイルスベクターは、一般に、ベクターＤＮＡのパッケージングならびに形質導入された細胞（例えば、光受容体）における干渉ＲＮＡおよび／または遺伝子配列の引き続く発現を生じるのに十分な、本明細書で「導入遺伝子」または「導入遺伝子発現カセット」と呼ばれる、ＴＲエレメントに挟まれた本明細書に記載される１つまたは複数の抗血管新生ポリペプチドおよび／または干渉ＲＮＡをコードする配列ならびに対応する発現制御配列（複数可）を含む。ウイルスベクター機能は、例えば、プラスミドまたはアンプリコンの成分として細胞に供給され得る。ウイルスベクター機能は、細胞系内で染色体外に存在し得る、および／または細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれ得る。

電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが含まれるがこれらに限定されない、ウイルスベクター機能を保有するヌクレオチド配列を複製およびパッケージングのための細胞宿主中に導入する任意の方法が使用され得る。ウイルスベクター機能がウイルスベクターを使用するトランスフェクションによって提供される実施形態では、ウイルス感染を引き起こすための標準的な方法が使用され得る。

パッケージング機能は、ウイルスベクターの複製およびパッケージングのための遺伝子を含む。したがって、例えば、パッケージング機能は、ウイルス遺伝子発現、ウイルスベクター複製、組み込まれた状態からのウイルスベクターのレスキュー、ウイルス遺伝子発現、およびウイルス粒子へのウイルスベクターのパッケージングのために必要な機能を、必要に応じて含み得る。パッケージング機能は、遺伝子構築物、例えば、プラスミドもしくはアンプリコン、バキュロウイルス、またはＨＳＶヘルパー構築物を使用して、パッケージング細胞に一緒にまたは別々に供給され得る。パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在し得るが、好ましくは、細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれる。例には、ＡＡＶＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。

ヘルパー機能は、ウイルスベクターのパッケージングを開始するために要求されるパッケージング細胞の活動性感染を確立するために必要なヘルパーウイルスエレメントを含む。例には、ウイルスベクターのパッケージングを生じさせるのに十分な、アデノウイルス、バキュロウイルスおよび／またはヘルペスウイルスに由来する機能が含まれる。例えば、アデノウイルスヘルパー機能は、典型的には、アデノウイルス成分Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡＲＮＡを含む。パッケージング機能は、要求されるウイルスによるパッケージング細胞の感染によって供給され得る。パッケージング機能は、遺伝子構築物、例えば、プラスミドまたはアンプリコンを使用して、パッケージング細胞に一緒にまたは別々に供給され得る。例えば、Rabinowitz et al., 2002, J. Virol. 76:791に記載されるｐＸＲヘルパープラスミドおよびGrimmet al., 1998, Human Gene Therapy 9:2745-2760に記載されるｐＤＧプラスミドを参照されたい。パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在し得るが、好ましくは、細胞の染色体ＤＮＡ（例えば、ＨＥＫ２９３細胞中のＥ１またはＥ３）中に組み込まれる。

任意の適切なヘルパーウイルス機能が使用され得る。例えば、パッケージング細胞が昆虫細胞である場合、バキュロウイルスがヘルパーウイルスとして機能し得る。ヘルペスウイルスもまた、ＡＡＶパッケージング方法におけるヘルパーウイルスとして使用され得る。ＡＡＶＲｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、よりスケーラブルなＡＡＶベクター産生スキームを有利に促進し得る。

電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性リポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが含まれるがこれらに限定されない、ヘルパー機能を保有するヌクレオチド配列を複製およびパッケージングのための細胞宿主中に導入する任意の方法が使用され得る。ヘルパー機能が、ウイルスベクターを使用するトランスフェクションまたはヘルパーウイルスを使用する感染によって提供される実施形態は、ウイルス感染を引き起こすための標準的な方法が使用され得る。

当該分野で公知の任意の適切な許容性細胞またはパッケージング細胞が、パッケージングされたウイルスベクターの産生において使用され得る。哺乳動物細胞または昆虫細胞が好ましい。本発明の実施におけるパッケージング細胞の産生のために有用な細胞の例には、例えば、ヒト細胞系、例えば、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３細胞（これらは、構成的プロモーターの制御下で機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｂ－５０または任意の他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、およびＨＴ１０８０細胞系が含まれる。一態様では、パッケージング細胞は、懸濁培養で成長させることが可能であり、より好ましくは、細胞は、無血清培養で成長させることが可能である。一実施形態では、パッケージング細胞は、無血清培地中で懸濁下で成長するＨＥＫ２９３である。別の実施形態では、パッケージング細胞は、米国特許第９，４４１，２０６号に記載され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ１３２７４として寄託されたＨＥＫ２９３細胞である。ＷＯ２００２／４６３５９に開示されたものが含まれるがそれらに限定されない多数のｒＡＡＶパッケージング細胞系が、当該分野で公知である。別の態様では、パッケージング細胞は、セルスタックの形態で培養される（例えば、ＨＥＫ２９３細胞を播種した１０層のセルスタック）。

パッケージング細胞としての使用のための細胞系には、昆虫細胞系が含まれる。ＡＡＶの複製を可能にし、培養物中で維持され得る任意の昆虫細胞が、本発明に従って使用され得る。例には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、例えば、Ｓｆ９もしくはＳｆ２１細胞系、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｓｐｐ．細胞系、または蚊細胞系、例えば、Ａｅｄｅｓａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来の細胞系が含まれる。好ましい細胞系は、ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａＳｆ９細胞系である。以下の参考文献が、異種ポリペプチドの発現のための昆虫細胞の使用、核酸をかかる細胞中に導入する方法、および培養物中でかかる細胞を維持する方法に関するそれらの教示について、本明細書に取り込まれる：Methods in Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, N J (1995)；O'Reillyet al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press(1994)；Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:3822-3828；Kajigaya et al., 1991,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-4650；Ruffing et al., 1992, J. Virol.66:6922-6930；Kimbauer et al., 1996, Virol. 219:37-44; Zhao et al., 2000, Virol.272:382-393；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、米国特許第６，２０４，０５９号。

本発明に従うウイルスカプシドは、当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、バキュロウイルスからの発現によって、産生され得る（Brown et al., (1994) Virology 198:477-488）。さらなる代替法として、本発明のウイルスベクターは、例えば、Urabeetal., 2002, Human Gene Therapy 13:1935-1943によって記載されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶ鋳型を送達するためにバキュロウイルスベクターを使用して、昆虫細胞において産生され得る。

別の態様では、本発明は、昆虫細胞におけるｒＡＡＶ産生の方法を提供し、ここで、バキュロウイルスパッケージングシステムまたはベクターは、これらの遺伝子を、バキュロウイルスベクターのポリヘドリンコード領域中に操作し、宿主細胞中へのトランスフェクションによってウイルス組換え体を産生することによって、ＡＡＶＲｅｐおよびＣａｐコード領域を保有するように構築され得る。特に、ＡＡＶのためにバキュロウイルス産生を使用する場合、好ましくは、ＡＡＶＤＮＡベクター産物は、ＡＡＶＩＴＲへの変異を使用することのない、自己相補的なＡＡＶ様分子である。これは、機能的Ｒｅｐ酵素活性の欠如による、自己相補的なＤＮＡ分子を生じる昆虫細胞における非効率的なＡＡＶｒｅｐニッキングの副産物であるようである。宿主細胞は、バキュロウイルス感染した細胞であり、またはバキュロウイルスヘルパー機能をコードするさらなる核酸がその中に導入されており、またはその中にこれらのバキュロウイルスヘルパー機能を含む。これらのバキュロウイルスのウイルスは、ＡＡＶ成分を発現し得、引き続いて、カプシドの産生を促進し得る。

産生の間に、パッケージング細胞は、一般に、ウイルスベクターの複製およびパッケージングを生じるのに十分なヘルパー機能およびパッケージング機能と共に、１つまたは複数のウイルスベクター機能を含む。これらの種々の機能は、遺伝子構築物、例えば、プラスミドまたはアンプリコンを使用して、パッケージング細胞に一緒にまたは別々に供給され得、細胞系内で染色体外に存在し得る、または細胞の染色体中に組み込まれ得る。

染色体外に取り込まれたもしくは細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた１つもしくは複数のベクター機能を有する細胞系、染色体外に取り込まれたもしくは細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた１つもしくは複数のパッケージング機能を有する細胞系、または染色体外に取り込まれたもしくは細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれたヘルパー機能を有する細胞系など、細胞には、既に取り込まれた述べられた機能のうちいずれか１つまたは複数が供給され得る。

ｒＡＡＶベクターは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配などの、当該分野で標準的な方法によって精製され得る。ｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該分野で公知であり、これには、Clark et al., 1999, Human Gene Therapy 10(6):1031-1039；Schenpp andClark, 2002, Methods Mol. Med. 69:427-443；米国特許第６，５６６，１１８号およびＷＯ９８／０９６５７に記載される方法が含まれる。

処置方法

一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸－またはかかる核酸と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物－は、眼内で、好ましくは、網膜下、脈絡膜上または硝子体内注射によって、対象（例えば、ヒト）に投与される。一部の好ましい実施形態では、核酸または医薬組成物は、ＶＥＧＦ関連眼疾患を処置するために、硝子体内および／または網膜下注射を介して、より好ましくは、単回硝子体内注射によって、投与される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ関連眼疾患は、ＶＥＧＦ－Ａ関連眼疾患である。他の実施形態では、核酸または医薬組成物は、外用的にまたは前房内に投与される。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ関連眼疾患は、湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；網膜静脈閉塞から生じる網膜新生血管；糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全てのステージを含む）、近視性黄斑変性症、網膜静脈分枝閉塞症、半側網膜静脈閉塞症および網膜中心静脈閉塞症；未熟児網膜症；特発性脈絡膜新生血管；近視黄斑変性症ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管；網膜毛細血管拡張症；血管新生緑内障；硝子体出血；ブドウ膜炎、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および／または脈絡膜疾患、眼の腫瘍、角膜および虹彩新生血管が含まれるがこれらに限定されない網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管から選択される。好ましい実施形態では、核酸は、ベクター、好ましくは、本明細書に記載される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターまたはかかるベクターと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物中で対象に送達され、好ましくは、ｒＡＡＶベクターは、配列番号４８またはそれと少なくとも９０％の同一性を含む配列のカプシドタンパク質を含む。

関連の態様では、ＶＥＧＦ関連眼疾患（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ関連眼疾患）の処置における使用のための、またはＶＥＧＦ関連眼疾患の処置のための医薬の製造のための、本明細書に記載される核酸が提供される。他の関連の態様では、ＶＥＧＦ関連眼疾患の処置における使用のための、またはＶＥＧＦ関連眼疾患の処置のための医薬の製造のための、本明細書に記載される核酸を含むｒＡＡＶが提供される。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号４８またはそれと少なくとも９０％の同一性を含む配列のカプシド配列を含み、ＶＥＧＦ関連眼疾患を処置するために、好ましくは、単回硝子体内注射によって、対象に硝子体内で投与される。

ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載される核酸を含むｒＡＡＶまたはかかるｒＡＡＶと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物の有効量を対象に投与することによる、対象（例えば、ヒト対象）における、湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；糖尿病性黄斑浮腫；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；糖尿病性網膜症；または近視性脈絡膜新生血管、ならびに特発性網膜新生血管、血管新生緑内障、未熟児網膜症、放射線網膜症、中心性漿液性網膜症、糖尿病性硝子体出血、弾性線維性仮性黄色腫、コーツおよび他の形態の末梢網膜新生血管（neovasculation）が含まれるがこれらに限定されない全ての他の形態の異常な眼および網膜血管新生の処置ならびに／または予防のための方法が提供される。好ましくは、ｒＡＡＶは、配列番号４８またはそれと少なくとも９０％の同一性を含む配列のカプシドタンパク質を含む。特に好ましい実施形態では、湿性加齢黄斑変性症の処置のための方法が提供される。

一部の態様では、核酸は、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列および第２の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。関連の態様では、第２の抗血管新生ポリペプチドは、エンドスタチン；タムスタチン；アンジオスタチン；および色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）から選択される。一部の好ましい実施形態では、第２の抗血管新生ポリペプチドは、ＰＥＤＦである。特に好ましい実施形態では、配列番号４８のカプシドタンパク質と以下の配列（アフリベルセプト＋ＰＥＤＦ二重構築物）またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む核酸とを含むｒＡＡＶベクター：

ならびに湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；糖尿病性黄斑浮腫；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；糖尿病性網膜症；または近視性脈絡膜新生血管を処置する際のその使用が、本明細書で提供され、好ましくは、ベクターは、ヒト対象に眼内で投与され、好ましくは、眼内投与は、硝子体内注射（例えば、単回硝子体内注射）、網膜下注射または脈絡膜上注射を含む。

他の態様では、核酸は、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列およびＶＥＧＦＲ－３の細胞外ドメイン由来の１つまたは複数のＶＥＧＦ結合性部分を含む可溶性融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。特に好ましい実施形態では、配列番号４８のカプシドタンパク質と、以下の配列（アフリベルセプト＋ＯＰＴ－３０２二重構築物）またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む核酸とを含むｒＡＡＶベクター：

他の態様では、核酸は、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列および血管新生促進性タンパク質に結合しその活性を阻害する抗体またはその抗原結合性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトａｎｇ－１またはヒトａｎｇ－２に結合する。特に好ましい実施形態では、配列番号４８のカプシドタンパク質と以下の配列（アフリベルセプト＋抗Ａｎｇ－２ＨＬ構築物）またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む核酸とを含むｒＡＡＶベクター：

ならびに配列番号４８のカプシドタンパク質と以下の配列（アフリベルセプト＋抗Ａｎｇ－２ＬＨ構築物）またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む核酸とを含むｒＡＡＶベクター：

ならびに湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；糖尿病性黄斑浮腫；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；糖尿病性網膜症；または近視性脈絡膜新生血管を処置する際のそれらの使用が、本明細書で提供され、好ましくは、ベクターは、ヒト対象に眼内で投与され、好ましくは、眼内投与は、硝子体内注射（例えば、単回硝子体内注射）、網膜下注射または脈絡膜上注射を含む。

一部の態様では、核酸は、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列および血管新生促進性タンパク質の発現を低減させる干渉ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、干渉ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、血管新生促進性タンパク質の発現を低減させるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む天然または人工ｍｉＲＮＡをコードする。

関連の態様では、干渉ＲＮＡは、ヒトａｎｇ－１および／またはヒトａｎｇ－２の発現を低減させる。特に好ましい実施形態では、配列番号４８のカプシドタンパク質と以下の配列（アフリベルセプト＋ヒトＡｎｇ－２干渉ＲＮＡ（配列番号１３）構築物））またはそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む核酸とを含むｒＡＡＶベクター：

ならびに湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；糖尿病性黄斑浮腫；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；糖尿病性網膜症；または近視性脈絡膜新生血管を処置する際のその使用が提供され、好ましくは、ベクターは、ヒト対象に眼内で投与され、好ましくは、眼内投与は、硝子体内注射（例えば、単回硝子体内注射）、網膜下注射または脈絡膜上注射を含む。

関連の態様では、干渉ＲＮＡは、ヒトＶＥＧＦ－Ｃの発現を低減させる。特に好ましい実施形態では、配列番号４８のカプシドタンパク質と以下の配列（アフリベルセプト＋ヒトＶＥＧＦ－Ｃ干渉ＲＮＡ（配列番号１９／２０）構築物）またはそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む核酸とを含むｒＡＡＶベクター：

関連の態様では、干渉ＲＮＡは、ヒトＶＥＧＦＲ－３の発現を低減させる。特に好ましい実施形態では、配列番号４８のカプシドタンパク質と以下の配列（アフリベルセプト＋ヒトＶＥＧＦＲ－３干渉ＲＮＡ（配列番号３７）構築物）またはそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む核酸とを含むｒＡＡＶベクター：

ならびに湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；糖尿病性黄斑浮腫；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；糖尿病性網膜症；または近視性脈絡膜新生血管を処置する際のその使用が提供され、好ましくは、ベクターは、ヒト対象に眼内で投与され、好ましくは、眼内投与は、硝子体内注射（例えば、単回硝子体内注射）、網膜下注射または脈絡膜上注射を含み、湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；糖尿病性黄斑浮腫；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；糖尿病性網膜症；または近視性脈絡膜新生血管を処置するために、好ましくは、硝子体内注射（例えば、単回硝子体内注射）によって、対象に投与される。

ａ）好ましくはｒＡＡＶ（好ましくは、配列番号４８のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ）内にカプシド封入された本明細書に記載される核酸および；およびｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または緩衝液を含む医薬組成物もまた、本明細書で提供される。一部の好ましい実施形態では、核酸は、配列番号６４～７０から選択されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または緩衝液は、ヒトまたは非ヒト患者における使用に適切である。かかる賦形剤、担体、希釈剤および緩衝液には、過度の毒性なしに投与され得る任意の薬学的作用物質が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体が含まれるがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などが、その中に含められ得る。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などが、かかるビヒクル中に存在し得る。広範な種々の薬学的に許容される賦形剤は、当該分野で公知であり、本明細書で詳細に考察する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins；およびHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.が含まれる種々の刊行物に十分に記載されている。

一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）および非イオン性界面活性剤（例えば、好ましくは約０．００５％の、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８）を含む。

一部の実施形態では、医薬組成物は、１×１０^８～１×１０^１５個のベクター粒子もしくはベクターゲノム、１×１０^１０～１×１０^１３個のベクター粒子もしくはベクターゲノム、または約１×１０^１０、約２×１０^１０、３×１０^１０、約４×１０^１０、約５×１０^１０、約６×１０^１０、約７×１０^１０、約８×１０^１０、約９×１０^１０、約１×１０^１１、約２×１０^１１、約３×１０^１１、約４×１０^１１、約５×１０^１１、約６×１０^１１、約７×１０^１１、約８×１０^１１、約９×１０^１１、約１×１０^１２、約２×１０^１２、約３×１０^１２、約４×１０^１２、約５×１０^１２、約６×１０^１２、約７×１０^１２、約８×１０^１２、約９×１０^１２もしくは約１×１０^１３個のベクター粒子もしくはベクターゲノムを含む。一部の態様では、医薬組成物は、約１×１０^１１～約１×１０^１２個のベクター粒子またはベクターゲノムを含む。

一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は、ＶＥＧＦ関連の眼障害を有するヒトに眼内で投与され、好ましくは、医薬組成物は、硝子体内、網膜下および／または脈絡膜上注射を介して、より好ましくは、単回硝子体内注射を介して投与される。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示しており、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。本発明は、その好ましい実施形態に関して記載されてきたが、その種々の改変が、本出願を読んだ当業者に明らかとなる。

（実施例１）
以下の実施例は、多数の網膜細胞の改善された形質導入を付与する遺伝子改変されたカプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）による抗血管新生遺伝子治療のための多機構的アプローチを記載する。以下に記載されるｒＡＡＶ構築物は、単回硝子体内用量からの、抗血管新生剤の持続的な送達を提供し、単一の抗血管新生剤の送達と比較して、反復注射の負担を制限し、関連の網膜細胞における治療的遺伝子産物の一貫したレベルを維持し、治療的応答を改善する。以下に記載される代表的な構築物の各々は、アフリベルセプト単独の送達を超えて有効性を増強するために、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－ＢおよびＰＩＧＦを標的化する）と少なくとも１つの他の抗血管新生剤とをコードする核酸を含む。

代表的な構築物設計（ＡＡＶベクター骨格）は、図１Ａ～Ｂに例示される。第１のアプローチ（図１Ａ）では、ＦＴ２Ａ（リボソームスキッピングペプチド）配列によって分離されたアフリベルセプトと第２の抗血管新生ポリペプチドとをコードするヌクレオチド配列は、遍在性ＣＢＡプロモーターによって制御される（これは、バイシストロン性構築物である）。本明細書で例示される第２の抗血管新生ポリペプチドには、血管新生および／または脈管透過性の低減におけるそれらの機能に基づいて選択される、ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦＲ－３－Ｆｃ融合タンパク質および抗Ａｎｇ－２ｓｃＦａｂ断片が含まれる。各場合において、コードする遺伝子を、ヒト発現のためにコドン最適化した。第２のアプローチ（図１Ｂ）では、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列は、血管新生促進性タンパク質を標的化する干渉ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と共に、ＣＡＧプロモーターによって駆動される。各場合において、ＲＮＡｉ配列を、十分に特徴付けられたｍｉＲ－Ｅ骨格（例えば、その内容が参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１５－００１８５３９号、およびFellmann et al., Cell Reports, 5(6):1704-1713 (2013)に記載される）中に埋め込み、ハイブリッドニワトリｂ－アクチン／ウサギｂ－グロビンイントロン内に配置した（図１Ｂを参照されたい）。ＣＢＡプロモーターは、持続性の高レベルの発現を駆動することが可能な、十分に特徴付けられた遍在性プロモーターである。ＣＢＡプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）上流エンハンサーとニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターとのハイブリッドであり、ニワトリｂ－アクチンエクソン１、ハイブリッドニワトリｂ－アクチンおよびウサギｂ－グロビンイントロン、ならびにウサギｂ－グロビンエクソン３断片（人工スプライス部位を創出する）もまた含有する。ｍｉＲ－Ｅ骨格の使用およびＣＡＧプロモーターのイントロン内の配置を、モデル抗原を使用して検証した（データは示さず）。

二重タンパク質構築物の構築－色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、ＶＥＧＦ受容体３（ＶＥＧＦＲ３）－Ｆｃ融合タンパク質および抗アンジオポエチン－２（ＡＮＧ２）単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）断片のコドン最適化された遺伝子を、シャトルベクターから切り出し、ＮｈｅＩ－ＭｌｕＩ断片上で、ＣＢＡプロモーターとＳＶ４０後期ポリＡ（ＳＶ４０ｐＡ）配列との間で、ＡＡＶベクター骨格中に挿入した。アフリベルセプトとの共発現のために、合成ＤＮＡは、アフリベルセプト（ＡＦＬＢ）のＣ末端部分、フューリン切断部位、およびＰＥＤＦ、ＶＥＧＦＲ３－Ｆｃまたは抗ＡＮＧ２ｓｃＦａｂ配列の上流のＴ２Ａリボソームスキッピングペプチドをコードする配列を含んだ。これらの合成ＤＮＡを、シャトルベクターから切り出し、ＡｖｒＩＩ－ＭｌｕＩ断片上でｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＳＶ４０ｐＡ中に挿入した。プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で拡大増殖させ、精製したプラスミドＤＮＡを、制限消化および配列決定によって検証した。

タンパク質＋ＲＮＡｉ構築物についての構築の詳細

ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｍｉＲ－Ｅ－（「標的配列」）－ＡＦＬＢ－ＳＶ４０の構築

ヒトコドン最適化されたアフリベルセプトを発現するｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＳＶ４０構築物を、以前に記載されたように合成した。ＡＮＧＰＴ２、ＶＥＧＦ－ＣまたはＶＥＧＦＲ３を標的化するヘアピンをコードし、ＳｇｒＡＩ制限クローニング部位とＮｈｅＩ制限クローニング部位との間にコードされたＣＡＧベータ－アクチンイントロンの領域を含有するｍｉＲ－Ｅ－（標的）ｍｉＲＮＡ導入遺伝子を合成し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によりｐＵＣ５７中にクローニングした。ｐＵＣ５７プラスミドおよびｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＳＶ４０－Ｋａｎ－Ｓｔｕｆｆｅｒプラスミドを、指し示されたように、種々の制限酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で切断し、骨格ＤＮＡを、消化の間に組換えエビアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ、Ｍ０３７１Ｌ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）でも処理して、切断されたＤＮＡ末端上の遊離ホスフェートを除去した。ＤＮＡ断片を、７：１のモル比の挿入物：骨格で添加し、ＱｕｉｃｋＬｉｇａｓｅ（＃Ｍ２２００Ｌ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を製造業者の指示に従って用いてライゲーションさせた。ライゲーションされたプラスミドを、製造業者の指示に従ってＮＥＢＳｔａｂｌｅ細菌コンピテント細胞（＃Ｃ３０４０Ｈ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）中に形質転換し、細胞を、カナマイシン５０ｍｇ／ｍｌプレート（＃Ｌ１０２５、Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）上に広げ、３０℃で成長させた。

ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｍｉＲ－Ｅ－ＡＦＬＢ－ＳＶ４０の調製

Ｍｉｎｉｐｒｅｐ培養物を、得られたコロニーから成長させ、ＤＮＡを、ＧｅｎｅＪＥＴＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号０５０３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて調製し、制限消化して、陽性クローンを同定した。ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ中の５０ｍｌ培養物を、各構築物の１つの陽性クローンから成長させ、ＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎＥｎｄｏＦｒｅｅＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉキット（カタログ番号１２３６２、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調製した。

ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＲＦＰ６５７－ｍｉＲＮＡプラスミドバリアントの制限消化および配列決定

ＭａｘｉｐｒｅｐプラスミドＤＮＡ（０．５ｍｇ）を、製造業者の指示に従って種々の制限酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって解析した。ＳａｎｇｅｒＤＮＡ配列決定を、プライマーを使用するＥＬＩＭによって実施した。

本明細書の実施例で設計および検査した構築物の要約は以下に提供される：

アフリベルセプトは、配列番号４８のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオン中での送達後に、ヒトＲＰＥおよびＲＧＣ細胞において治療的レベルで発現され、これらの細胞におけるＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－ＢおよびＰＩＧＦ媒介性活性の効率的な遮断を生じる。その内容が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０２０／０２８２０７７号Ａ１を参照されたい。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後のアフリベルセプトの発現に対する、ＡＡＶ発現プラスミド中に第２の導入遺伝子（タンパク質またはＲＮＡｉをコードする）を含めることの影響を評価するための研究を実施した。

簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２ウェルプレート中に、１．０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中２．０×１０^５細胞／ウェルで播種した。次の日、３．０ｍｌのＦｕＧｅｎｅＨＤ（カタログ番号Ｅ２６９１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と複合体化した１．０ｍｇのプラスミドＤＮＡ（同じプロモーターの制御下にアフリベルセプトおよび第２の導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む）を、細胞に三連ウェルで添加した。トランスフェクションの４８時間後、細胞上清を回収し、２０００ｇでスピンして、細胞デブリを除去した。次いで、培地を、ＥＬＩＳＡを介して、アフリベルセプト（ＡＬＦＢ）の存在についてアッセイした。

ウエスタンブロット解析のために、形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの培地を、３つの複製からプールし、４×ＬＤＳ（Ｂ０００７、Ｔｈｅｒｍｏ）、１０×還元剤（Ｂ０００９、Ｔｈｅｒｍｏ）と混合し、７０℃で１０分間変性させた。試料を、１０ウェルＢｏｌｔ４～１２％Ｂｉｓ－ＴｒｉｓＰｌｕｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＷ０４１２０ＢＯＸ）上にローディングし、１×ＭＯＰＳ緩衝液（ＮＰ０００１０２、Ｔｈｅｒｍｏ）中で２００Ｖで３２分間泳動した。分離されたタンパク質を、ＢｉｏＲａｄＴｒａｎｓＢｌｏｔＴｕｒｂｏデバイス（ＢｉｏＲａｄ）を７分間用いてニトロセルロースフィルター（１７０４１５８、ＢｉｏＲａｄ）に転写し、ｉＢｉｎｄＦｌｅｘ溶液（ＳＬＦ２０２０、Ｔｈｅｒｍｏ）中１：５００の抗ヒトＩｇＧＦｃ交差吸着二次抗体、ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、３１４１３）でプローブした。タンパク質を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＤｕｒａ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ３４０７６）を用いて可視化し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で撮像した。

ＥＬＩＳＡ（分泌型遊離ＡＦＬＢ、ＡＮＧＰＴ２およびＶＥＧＦ－Ａレベル）のための細胞溶解物を、製造業者の指示に従って、１×Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（７８４４０、Ｔｈｅｒｍｏ）を補充したＭ－ＰＥＲ溶解緩衝液（＃７８５０１、Ｔｈｅｒｍｏ）中で調製した。細胞培地および溶解物を、各試料について適切に希釈し、それを使用して、提供者の指示に従ってアフリベルセプトＥＬＩＳＡキット（遊離ＡＦＬＢレベルを測定するため）（カタログ番号ＩＧ－ＡＡ１１５、ＥａｇｌｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎａｓｈｕａ、ＮＨ）、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＶＥＧＦ－ＡＥＬＩＳＡキット（ＤＶＥ００、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）およびＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＡＮＧＰＴ２ＥＬＩＳＡキット（ＤＡＮＧ２０、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して、分泌型分析物レベルを評価した。光学密度（ＯＤ）を、停止溶液をピペッティングして１５分以内に、Ｃｙｔａｔｉｏｎ３（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）光度計を４５０ｎｍ（ＯＤ６２０ｎｍが参照）で用いて測定した。培地濃度を、生成された標準曲線に基づいて規定した。

図３Ａは、ＣＡＧプロモーターの制御下にＡＦＬＢおよび第２の導入遺伝子（ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦＲ３、抗ＡｎｇＨＬまたは抗ＡｎｇＬＨ）をコードするＡＡＶプラスミドによるトランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培地からのＡＦＬＢのウエスタンブロット解析の結果を実証する。結果を、ＣＢＡプロモーターの制御下にＡＦＬＢのみをコードするＡＡＶプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培地中のＡＦＬＢレベルに対して正規化する。Ｅｌｙｅａ（市販の調製物）が、アフリベルセプトの陽性対照として提供される。ポリペプチド産物をコードする第２の導入遺伝子の追加は、アフリベルセプトの発現を約５０～６０％、有意に低減させる。

図３Ｂは、ＣＢＡプロモーターの制御下にＡＦＬＢのみをコードするＡＡＶプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培地中のＡＦＬＢレベルに対して正規化した、第２のポリペプチド（ＰＥＤＦ、抗Ａｎｇ２ＬＨ、抗Ａｎｇ２ＨＬ）または干渉ＲＮＡ（Ａｎｇ２、ＦＥＧＲ３またはＶＥＧＦ－Ｃを標的化する）のいずれかをコードする種々の構築物からのアフリベルセプトの発現を実証する。特に、ＡＦＬＢおよび干渉ＲＮＡをコードするプラスミドでは、アフリベルセプト発現における有意な低減は起こらない。ＣＡＧプロモーターからの発現は、ＣＢＡプロモーターからの発現よりも２５％高いことが観察された。

次に、配列番号４８のカプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶウイルスによるヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の形質導入後のアフリベルセプトの発現に対する、ＡＡＶ発現プラスミド中に第２の導入遺伝子（タンパク質またはＲＮＡｉをコードする）を含めることの影響を評価するための研究を実施した。

ＲＰＥ形質導入のために、ヒト幹細胞由来網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）を、公開されたプロトコール（Buchholz D 2013、Leach L 2015）に従って、胚性幹細胞（ＥＳＩ－０１７）から分化させた。ＲＰＥ細胞を、９６ウェルプレート形式でＸＶＩＶＯ－１０培地（Ｌｏｎｚａ）中で３０日間にわたってＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で成長させた。形質導入前に、３つのウェルを回収し、感染多重度（ＭＯＩ）の正確な計算のために計数した。ウイルスを、１ウェル当たり１００μＬの総体積中で、各ウイルス力価に基づいて、ＸＶＩＶＯ－１０培地中で４８時間、細胞に添加した。培地を、３、７、１１、１５および１９日目に収集し、１ウェル当たり２００μＬの培地で置き換えた。培地試料を、処理まで４℃で貯蔵した。

ＥＬＩＳＡ（分泌型遊離ＡＦＬＢ、ＡＮＧＰＴ２およびＶＥＧＦ－Ａレベルを評価するため）のための細胞溶解物を、製造業者の指示に従って、１×Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（７８４４０、Ｔｈｅｒｍｏ）を補充したＭ－ＰＥＲ溶解緩衝液（＃７８５０１、Ｔｈｅｒｍｏ）中で調製した。細胞培地および溶解物を、各試料について適切に希釈し、それを使用して、提供者の指示に従ってアフリベルセプトＥＬＩＳＡキット（遊離ＡＦＬＢレベルを測定するため）（カタログ番号ＩＧ－ＡＡ１１５、ＥａｇｌｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎａｓｈｕａ、ＮＨ）、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＶＥＧＦ－ＡＥＬＩＳＡキット（ＤＶＥ００、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）およびＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＡＮＧＰＴ２ＥＬＩＳＡキット（ＤＡＮＧ２０、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して、分泌型分析物レベルを評価した。光学密度（ＯＤ）を、停止溶液をピペッティングして１５分以内に、Ｃｙｔａｔｉｏｎ３（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）光度計を４５０ｎｍ（ＯＤ６２０ｎｍが参照）で用いて測定した。培地濃度を、生成された標準曲線に基づいて規定した。

図４から理解できるように、アフリベルセプト発現における用量依存的な増加が、対照（ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結したアフリベルセプト単独を発現するｒＡＡＶ）のものと近い高い感染多重度（ＭＯＩ）で、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するＲＮＡｉとを発現するｒＡＡＶによって見られる（８日目が示される）。アフリベルセプトを発現する全ての構築物は、検査した全ての感染多重度（ＭＯＩ）で、内因性ＶＥＧＦ－Ａを完全に中和することができる。図４に示される量は、形質導入後のＲＰＥ細胞の培地中の遊離の活性なアフリベルセプトである。

図５Ａおよび５Ｂは、指し示された発現カセット（および配列番号４８のカプシドタンパク質）を保有するｒＡＡＶによる形質導入後の７日目（図５Ａ）および１１日目（図５Ｂ）のＲＰＥ上清中の遊離アフリベルセプトの解析を例示する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と同様、第２のタンパク質の発現は、形質導入されたＲＰＥ細胞におけるアフリベルセプト発現のレベルを劇的に低減させる。対照的に、アフリベルセプト発現におけるいくらかの低減が、干渉ＲＮＡの共発現によって観察されたが、アフリベルセプト発現は、両方のＭＯＩにおいてロバストなままであった。ＣＢＡプロモーターは、ＲＰＥ細胞における発現を駆動するにあたり、ＣＡＧプロモーターよりもはるかに弱いことが、驚くべきことに決定された。第２のポリペプチドの共発現の場合よりもはるかにはっきりしないが、干渉ＲＮＡの共発現の場合には、より高いＭＯＩにおけるアフリベルセプト発現におけるいくらかの減少を例示する図６Ａ～Ｂもまた参照されたい。

重要なことに、干渉ＲＮＡと共に共発現させたアフリベルセプトは、機能的であり、ＲＰＥ細胞によって産生されるＶＥＧＦ－Ａに結合することができた（ＡＦＬＢ＋ＶＥＧＦＣ－ＲＮＡｉおよびＡＦＬＢ＋ＡＮＧ２ＲＮＡｉ構築物について４０を上回るＭＯＩでＶＥＧＦ－Ａの中和を例示する図７Ａ～Ｂを参照されたい）。

結論

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、アフリベルセプト発現は、ＣＢＡプロモーターによって駆動される場合、ＣＡＧプロモーターと比較して約２０％低減される；ＲＰＥ細胞では、アフリベルセプトの発現は、ＣＢＡプロモーターによって駆動される場合、ＣＡＧプロモーターと比較して、約１３分の１の弱さであった。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、ＲＮＡｉは、対照（同じプロモーターの制御下のアフリベルセプト単独）と比較して、導入遺伝子発現に対して有意な影響を有さないが、全ての二重タンパク質構築物は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、対照（同じプロモーターの制御下のアフリベルセプト単独）と比較して、アフリベルセプトにおける約５０％の低減を示した。ＲＰＥ細胞では、ほとんどの条件下で、対照と比較して、遊離アフリベルセプトレベルにおける僅かではあるが有意ではない低減が、ＲＮＡｉを含有する構築物について、ＲＰＥ細胞において観察されたが、全ての二重タンパク質構築物は、それらの対照対応物よりも約５～１０分の１の少なさのアフリベルセプトを発現した。

（実施例２）
二重タンパク質構築物の特徴付け
アフリベルセプト＋抗Ａｎｇ－２ｓｃＦａｂを発現する構築物の特徴付け

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＣＡＧプロモーターによって駆動されるバイシストロン性構成でアフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列および抗Ａｎｇ－２ｓｃＦａｂを発現するヌクレオチド配列を含むＡＡＶプラスミドでトランスフェクトした（図１Ａを参照されたい）。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２ウェルプレート中に、１．０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中２．０×１０^５細胞／ウェルで播種した。次の日、３．０ｍｌのＦｕＧｅｎｅＨＤ（カタログ番号Ｅ２６９１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と複合体化した１．０ｍｇのプラスミドＤＮＡを、細胞に三連ウェルで添加した。トランスフェクションの４８時間後、細胞上清を回収し、２０００ｇでスピンして、細胞デブリを除去した。次いで、培地を、ＥＬＩＳＡを介して、ＡＬＦＢの存在についてアッセイした。

ウエスタンブロット－トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの培地（６．２５μｌ）を、１２．５μｌの４×ＬＤＳ、５μｌの１０×還元剤および２６．２５１×ＰＢＳと混合し（最終体積＝５０μｌ）、７０℃で１０分間変性させた。４０μｌの試料を、１０ウェルＢｏｌｔ４～１２％Ｂｉｓ－ＴｒｉｓＰｌｕｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＷ０４１２０ＢＯＸ）上にローディングし、１×ＭＯＰＳ緩衝液中で２００Ｖで３２分間泳動した。分離されたタンパク質を、ｉＢｌｏｔ２デバイス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を７分間用いてニトロセルロースフィルターに転写し、ｉＢｉｎｄＦｌｅｘデバイス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ３１４８２１：１０００）でプローブした。タンパク質を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＤｕｒａ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ３４０７６）を用いて可視化し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で撮像した。

ＡＮＧ２でコーティングされたプレートを用いた機能的抗ＡＮＧ２ＥＬＩＳＡ－ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐ平底プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４４－２４０４－２１）を、ＰＢＳ中１．０μｇ／μｌの組換えヒトアンジオポエチン－２（Ｒ＆Ｄ、６２３－ＡＮ／ＣＦ）１００μｌでコーティングし、粘着シートで密封し、４℃に一晩置いた。次の日、コーティング溶液を吸引し、プレートを、３００μｌのＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）で３回洗浄した。プレートを、２００μｌのＰＢＳ／２．０％ＢＳＡで室温で２時間ブロッキングした。２時間のインキュベーション後、ブロッキング溶液を吸引し、プレートを、３００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの培地を、ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ中に希釈し、希釈した培地１００μｌをプレートに添加し、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートを、３００μｌのＰＢＳＴで再度３回洗浄した。１００μｌの抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ３１４８２、１：２０，０００）をプレートに添加し、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを、３００μｌのＰＢＳＴで再度３回洗浄した。プレートを、１００μｌのＴＭＢＥＬＩＳＡ基質（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７１５２２）を用いて室温で５～１５分間発色させた。ＴＭＢ反応を、ＴＭＢ基質用４５０ｎｍ停止溶液（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７１５２９）１００μｌを用いて停止させた。プレートを、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５デバイス（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して４５０ｎｍおよび５４０ｎｍ（プレート用の参照ブランクとして）で読み取った。

ＡＮＧ２競合ＥＬＩＳＡ－トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの培地を、ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ中に希釈し、等体積の２．０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトアンジオポエチン－２（Ｒ＆Ｄ、６２３－ＡＮ／ＣＦ）と混合し、室温で一晩インキュベートした（最終ＡＮＧ２濃度＝１，０００ｐｇ／ｍｌ）。次の日、遊離ＡＮＧ２の濃度を、新たに作製した組換えヒトアンジオポエチン－２（Ｒ＆Ｄ、６２３／ＡＮ－ＣＦ）標準から内挿して、アンジオポエチン－２ヒトＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＫＨＣ１６４１）を用いて決定した。

ＡＮＧ２受容体競合アッセイ－ｎｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐ平底プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４４－２４０４－２１）を、ＰＢＳ中１．０μｇ／ｍｌの組換えヒトＴｉｅ－２Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ、３１３－ＴＩ／ＣＦ）１００μｌでコーティングし、粘着シートで密封し、４℃に一晩置いた。競合ミックスを、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの培地の、等体積の８０ｎｇ／ｍｌのＮ末端ＦＬＡＧタグを有するヒトアンジオポエチン－２（Ａｄｉｐｏｇｅｎ、ＡＧ－４０Ｂ－０１１４－Ｃ０１０）による希釈を使用して調製した（最終ＡＮＧ２－Ｆｌａｇ濃度＝８０ｎｇ／ｍｌ）。次の日、コーティング溶液を吸引し、プレートを、３００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。プレートを、２００μｌのＰＢＳ／２．０％ＢＳＡで室温で２時間ブロッキングした。２時間のインキュベーション後、ブロッキング溶液を吸引し、プレートを、３００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌの競合ミックス試料を、新たに作製したＡＮＧ２－Ｆｌａｇ標準と共に、プレートに添加し、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレート中の試料を吸引し、３００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌのＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号７１）エピトープタグ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（Ｒ＆ＤＨＡＭ８５２９１１：１００００）をプレートに添加し、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを、３００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌのＴＭＢＥＬＩＳＡ基質（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７１５２２）を用いて室温で５～１５分間発色させた。ＴＭＢ反応を、ＴＭＢ基質用４５０ｎｍ停止溶液（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７１５２９）１００μｌを用いて停止させた。プレートを、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５デバイス（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して４５０ｎｍおよび５４０ｎｍ（プレート用の参照ブランクとして）で読み取り、ＡＮＧ２－Ｆｌａｇの濃度を、ＡＮＧ２－Ｆｌａｇ標準から内挿した。

図８Ａは、抗Ａｎｇ－２ＨＬおよびＨＬＦａｂについて予期されたサイズのタンパク質産物の発現を例示する。図８Ｂは、発現された抗Ａｎｇ－２Ｆａｂが機能的であることを例示する（Ａｎｇ－２でコーティングされたプレートへの発現されたタンパク質の結合が示される）。図８Ｃは、発現された抗Ａｎｇ－２Ｆａｂが、抗体でコーティングされたプレートへのＡｎｇ－２の結合を遮断することを例示する（競合ＥＬＩＳＡ）。図８Ｄは、発現された抗Ａｎｇ－２Ｆａｂが、Ｔｉｅ－２へのＡｎｇ－２の結合を遮断することを例示する（受容体競合アッセイ）。

二重タンパク質構築物からの抗Ａｎｇ－２Ｆａｂ（ＬＨおよびＨＬ形式）の用量依存的な発現は、トランスフェクトされたＨＥＫ細胞から示された。発現された抗Ａｎｇ－２Ｆａｂタンパク質は、正確なサイズであり、Ａｎｇ２に結合し、その受容体へのＡｎｇ２結合を遮断するにあたり機能的であった。

次に、配列番号４８のカプシドタンパク質とアフリベルセプトおよび抗Ａｎｇ－２Ｆａｂ（ＬＨまたはＨＬ）をコードする核酸とを含む組換えＡＡＶウイルスによるヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の形質導入後のアフリベルセプトおよび抗Ａｎｇ－２Ｆａｂの発現を特徴付けるための研究を実施した。

図９は、ＬＨおよびＨＬコンフォメーションの類似の発現レベルと共に、抗Ａｎｇ－２ｓｃＦａｂ（ＬＨおよびＨＬ）について正確なサイズ（５３ｋＤ）の単一のタンパク質の発現を例示する。簡潔に述べると、ＲＰＥ細胞を、９６ウェルプレート中で、ＭＯＩ５，０００および１，０００で、配列番号４８のカプシドタンパク質とアフリベルセプトおよび抗Ａｎｇ－２ｓｃＦａｂをコードする核酸とを含むｒＡＡＶで形質導入した。培地（０．２ｍｌ）を、形質導入後３日目に交換し、７日目に収集した。ＭＯＩ５，０００試料の培地２５ｍｌを、４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で泳動し、ｉＢｌｏｔを用いてニトロセルロースに転写し、ｉＢｉｎｄＦｌｅｘ上でプローブして、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｕ－Ｆａｂ抗体を用いて抗Ａｎｇ－２ｓｃＦａｂを検出し、抗Ｈｕ－Ｆｃ抗体を用いてアフリベルセプトを検出した。

図１０Ａは、１，０００および５０００のＭＯＩで形質導入されたＲＰＥ細胞における機能的抗Ａｎｇ－２ｓｃＦａｂの用量依存的な発現を例示する。簡潔に述べると、形質導入されたＲＰＥ細胞からの培地（１１日目）の希釈物を、Ａｎｇ－２でコーティングされたプレート上でインキュベートした。Ａｎｇ－２に結合した抗Ａｎｇ－２ｓｃＦａｂを、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｕ－Ｆａｂ抗体を用いて検出した。ＬＨ形式は、より低いＭＯＩにおいて特に、ＨＬ形式よりもＡｎｇ２への結合にあたり僅かに有効であった。

図１０Ｂは、形質導入されたＲＰＥにおける１１日目の試料を用いた競合ＥＬＩＳＡの結果を例示する。簡潔に述べると、１０００ｐｇ／ｍｌのＡｎｇ２タンパク質を、形質導入されたＲＰＥ細胞からの培地の希釈系列と共に一晩インキュベートした。競合混合物を、Ａｎｇ－２ＥＬＩＳＡ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＫＨＣ１６４１）によってアッセイした。

次に、抗Ａｎｇ－２ｓｃＦａｂＬＨおよびＨＬの結合親和性を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔにおいて実施したＢｉａｃｏｒｅアッセイによってＳＰＲを介して比較した。

ＣＭ５センサーチップ上へのアンジオポエチン－２の固定化。アンジオポエチン－２の固定化を、２５℃下で実施し、一方で、ＨＢＳ－ＥＰ＋をランニング緩衝液として使用した。フローセル１、２のセンサーチップ表面を、新たに混合した５０ｍｍｏｌ／ＬのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および２００ｍｍｏｌ／Ｌの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）によって４２０秒間活性化した（１０μＬ／分）。その後、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＡＣ（ｐＨ４．５）中に希釈したアンジオポエチン－２を、フローセル２中に注入して、２４３．１応答単位のコンジュゲーションを達成した。アミンカップリング反応の後、チップ表面上の残存する活性なカップリング部位を、１ｍｏｌ／Ｌのエタノールアミン塩酸塩の４２０秒間の注入によってブロッキングした。親和性測定のために、アッセイを２５℃で実施し、ランニング緩衝液はＨＢＳ－ＥＰ＋であった。希釈したＶ２．２／Ｖ２．３を、フローセル１、２の表面上に会合相として注入し、その後、ランニング緩衝液を解離相として注入した。ランニング構成を以下に列挙した（試料濃度（ｎＭ）＝１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００）。

結果は図１１に提供される。ＬＨ構成（Ｖ２．３）は、ＨＬ構成（Ｖ２．２）よりも５．６倍速い会合（より高いｋａ値）を有し、これは、より強い結合を示唆する。ＬＨ構成は、ＨＬよりも９１倍速い解離（より高いｋｄ値）を有し、これは、より弱い結合を示唆する。ＨＬ構成は、１．４６ｎＭの全体的結合親和性を有し、ＬＨは、２３．８ｎＭの結合親和性を有する。したがって、ＬＨ構成は、ＨＬ構成よりも約１６倍高いＡｎｇ－２結合親和性を有する。これらの値は、ファリシマブの抗Ａｎｇ２アームについての公開された親和性と一致している。

次に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＥＤＦ発現を、アフリベルセプトおよびＰＥＤＦをコードするＡＡＶプラスミド二重タンパク質構築物によるトランスフェクション後に評価した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２ウェルプレート中に、１．０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中２．０×１０^５細胞／ウェルで播種した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、それらの高いトランスフェクト可能性（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）およびタンパク質発現に起因して使用した。次の日、３．０ｍｌのＦｕＧｅｎｅ６（カタログ番号Ｅ２６９１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と複合体化した１．０ｍｇのプラスミドＤＮＡを、二連ウェルで細胞に添加した。トランスフェクションの２日後、上清を収集した。細胞デブリを、１２，０００ｇで４℃で１０分間の微量遠心機中での遠心分離によってペレット化した。上清を収集し、４℃で貯蔵した。プラスミドなしの条件を、陰性対照としてトランスフェクション中に含めた。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットのために、ＰＥＤＦ試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットアッセイを実行する前に１：１０希釈した。アフリベルセプト試料を１：５０希釈した。希釈した培地を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒｉＢｌｏｔシステムに従って、４×試料緩衝液および１０×還元緩衝液と合わせた。次いで、試料を、９０℃で５分間煮沸した。４～１２％のＢｉｓ／Ｔｒｉｓ還元性ゲルを、１×ＭＯＰＳ緩衝液中で１２５Ｖで１．５時間泳動した。タンパク質を、プリセットＭＩＸＥＤプロトコールを使用するＢｉｏＲａｄＴｒａｎｓＢｌｏｔＴｕｒｂｏＳｙｓｔｅｍを７分間使用して、ニトロセルロース上に転写した。メンブレンを、ｉＢｉｎｄＦｌｅｘ緩衝液中で１～２分間ブロッキングし、その後、製造業者の指示に従ってｉＢｉｎｄＦｌｅｘＷｅｓｔｅｒｎＤｅｖｉｃｅにローディングした。一次抗体（抗ＰＥＤＦＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：１０００、抗ヒトＦＣＨＲＰＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ１：２０００）をＨＲＰにコンジュゲートした種特異的二次抗体（１：１００００）と共に使用し、ＦｅｍｔｏＥＣＬ基質を用いて検出し、ＢｉｏＲａｄＣｈｅｍｉＤｏｃシステムで撮像した。

ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ、ヒトセルピンＦ１／ＰＥＤＦＥＬＩＳＡカタログ番号ＤＹ１１７７）を、製造業者の指示に従って実施した。培地を、アッセイを実行する前に、１：１０００または１：１００００希釈した。

図１２Ａ～Ｂは、約１７ｍｇ／ｍｌのＰＥＤＦの産生を伴う、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのＰＥＤＦの予期されたサイズの単一のタンパク質産物の発現を例示する。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ発現を、アフリベルセプトおよびＶＥＧＦＲ３－ＦｃをコードするＡＡＶプラスミド二重タンパク質構築物によるトランスフェクション後に評価した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２ウェルプレート中に、１．０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中２．０×１０^５細胞／ウェルで播種した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、それらの高いトランスフェクト可能性およびタンパク質発現に起因して使用した。次の日、３．０ｍｌのＦｕＧｅｎｅ６（カタログ番号Ｅ２６９１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と複合体化した１．０ｍｇのプラスミドＤＮＡを、二連ウェルで細胞に添加した。トランスフェクションの２日後、上清を収集した。細胞デブリを、１２，０００ｇで４℃で１０分間の微量遠心機中での遠心分離によってペレット化した。上清を収集し、４℃で貯蔵した。プラスミドなしの条件を、陰性対照としてトランスフェクション中に含めた。

還元的ウエスタンブロッティングのために、細胞スープ（２０ｍｌ）を、１０ｍｌの４×ＬＤＳ、４ｍｌの１０×還元剤および６ｍｌの水と混合し（最終体積＝４０ｍｌ）、７０℃で１０分間変性させた。試料を、１２ウェルＢｏｌｔ４～１２％Ｂｉｓ－ＴｒｉｓＰｌｕｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＷ０４１２２ＢＯＸ）上にローディングし、１×ＭＯＰＳ緩衝液中で１００Ｖで７５分間泳動した。分離されたタンパク質を、ｉＢｌｏｔ２デバイス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を１０分間用いてニトロセルロースフィルターに転写し、ｉＢｉｎｄＦｌｅｘデバイス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１４１３、１：２０００）でプローブした。タンパク質を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＤｕｒａ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ３４０７６）を用いて可視化し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で撮像した。

非還元的ウエスタンブロッティングのために、細胞上清（３０ｍｌ）を、１０ｍｌの４×ＬＤＳと混合し（最終体積＝４０ｍｌ）、７０℃で１０分間変性させた。試料を、１２ウェルＢｏｌｔ４～１２％Ｂｉｓ－ＴｒｉｓＰｌｕｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＷ０４１２２ＢＯＸ）上にローディングし、１×ＭＯＰＳ緩衝液中で１００Ｖで１２０分間泳動した。分離されたタンパク質を、ｉＢｌｏｔ２デバイス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を１０分間用いてニトロセルロースフィルターに転写し、ｉＢｉｎｄＦｌｅｘデバイス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１４１３、１：２０００）でプローブした。タンパク質を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＤｕｒａ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ３４０７６）を用いて可視化し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で撮像した。

図１３Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後のアフリベルセプトの発現を、ＰＥＤＦ、ＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ、抗Ａｎｇ－２ＨＬまたは抗Ａｎｇ－２ＬＨもまたコードする二重タンパク質ＡＡＶ構築物と比較する。図１３Ｂは、ＶＥＧＦＲ３－Ｆｃと共に共発現させた場合の、ＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ／アフリベルセプトヘテロダイマーの形成に起因する、アフリベルセプトにおける劇的な低減を例示する。

（実施例３）
アフリベルセプト＋ＲＮＡｉをコードする構築物の特徴付け
使用した一般的戦略は、以下を行うことであった：（ｉ）ヒト標的に対するｓｈＲＮＡを設計すること、（ｉｉ）（ａ）レンチウイルスを使用する標的の内因性発現のノックダウンおよび（ｂ）ＮＨＰ配列に対する相同性に基づいて、ｓｈＲＮＡ配列を選択すること、（ｉｉｉ）抗ＶＥＧＦ発現プラスミド中のＣＡＧのイントロン内に、またはＲＮＡｉ機能単独を評価するためにＲＦＰと組み合わせて、選択されたｓｈＲＮＡからの配列を含有するｍｉＲ－Ｅを埋め込むこと。

Ａｎｇ２およびＶＥＧＦＲ３は共に、内皮細胞によって発現される－配列番号４８のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶによる内皮細胞の形質導入を確認した。

Ａｎｇ－２を標的化するＲＮＡｉを含む構築物の特徴付け

ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｍｉＲ－Ｅ（Ａｎｇ－２）－ＡＦＬＢ－ＳＶ４０の構築（図１４を参照されたい；構築物ｐＰ１４３．００１は、ＲＦＰ６７５をコードし、ｐＰ１４１．００１は、アフリベルセプトをコードするが、他の点では同一である；ｐＰ１４３．００１は、ｉｎｖｉｔｒｏ研究のためのｍｉＲＮＡのみの有効性対照である）。ヒトコドン最適化されたアフリベルセプトＶＥＧＦ－Ａ／ＢＴｒａｐを発現するｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＳＶ４０構築物を合成した。ＳｇｒＡＩ制限クローニング部位とＮｈｅＩ制限クローニング部位との間にコードされたＣＡＧベータ－アクチンイントロンの領域を含有するｍｉＲ－Ｅ－（ＡＮＧ－２）ｍｉＲＮＡ導入遺伝子を合成し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によりｐＵＣ５７中にクローニングした。ｐＵＣ５７プラスミドおよびｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＳＶ４０－Ｋａｎ－Ｓｔｕｆｆｅｒプラスミドを、指し示されたように、種々の制限酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で切断し、骨格ＤＮＡを、消化の間に組換えエビアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ、Ｍ０３７１Ｌ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）でも処理して、切断されたＤＮＡ末端上の遊離ホスフェートを除去した。ＤＮＡ断片を、７：１のモル比の挿入物：骨格で添加し、ＱｕｉｃｋＬｉｇａｓｅ（＃Ｍ２２００Ｌ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を製造業者の指示に従って用いてライゲーションさせた。ライゲーションされたプラスミドを、製造業者の指示に従ってＮＥＢＳｔａｂｌｅ細菌コンピテント細胞（＃Ｃ３０４０Ｈ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）中に形質転換し、細胞を、カナマイシン５０ｍｇ／ｍｌプレート（＃Ｌ１０２５、Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）上に広げ、３０℃で成長させた。

Ｍｉｎｉｐｒｅｐ培養物を、得られたコロニーから成長させ（７．１）、ＤＮＡを、ＧｅｎｅＪＥＴＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号０５０３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて調製し、制限消化して、陽性クローンを同定した。ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ中の５０ｍｌの培養物を、１つの陽性クローンから成長させ、ＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎＥｎｄｏＦｒｅｅＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉキット（カタログ番号１２３６２、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調製した。ＭａｘｉｐｒｅｐプラスミドＤＮＡ（０．５ｍｇ）を、製造業者の指示に従って種々の制限酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって解析した。ＳａｎｇｅｒＤＮＡ配列決定を、プライマーを使用するＥＬＩＭによって実施した。

Ａｎｇ－２を標的化するいくつかのｓｈＲＮＡ配列（表１中に列挙される５つの配列）を、ＨＵＶＥＣ細胞においてＡｎｇ－２の発現を低減させるそれらの能力について評価した。簡潔に述べると、プールしたヒト臍帯静脈内皮細胞を、Ｌｏｎｚａから調達し（カタログ番号Ｃ２５１９Ａ）、製造業者の指示に従ってＬｏｎｚａ内皮細胞成長培地（ＥＧＭ－２、カタログ番号ＣＣ－３１６２）中で培養した。ＨＵＶＥＣを、ＰＢＳ（ＣａおよびＭｇなし）、トリプシン０．０５％および規定トリプシン阻害剤を使用して継代した。ＨＵＶＥＣを、プラスチック（コーティングされていない）細胞培養器具中に、１ｃｍ^２当たり２，５００細胞の密度で播種した。アッセイは、典型的には、２４ウェル細胞培養プレートにおいて実施し、０．５ｍＬ体積のＥＧＭ－２を一日おきにリフレッシュした。ＨＵＶＥＣは、典型的には、継代８の前にのみ使用し、継代８になった際に、新たな培養を開始する。

ＨＵＶＥＣ形質導入－ＨＵＶＥＣを、アッセイプレート中に、１ｃｍ^２当たり２，５００細胞で播種した。２日後、細胞はコンフルエントであり、単一のウェルを解離させ、計数した。感染多重度を、ｑＰＣＲ由来のウイルス力価および細胞計数を使用して計算した。適した体積のＡＡＶを、０．５ｍＬのＥＧＭ－２培地中の細胞に適用した。これを４８時間インキュベートし、最終アッセイの解体を、形質導入の１週間後に実施した。

ＡＮＧ２ｓｈＲＮＡレンチウイルス系の生成－ｐＬＫＯ．１－ｓｈＡＮＧ２プラスミドを、ＢｒｏａｄＲＮＡｉコンソーシアムから同定されたヒトＡＮＧ２中の５つの独自の標的配列（表１）に対応するアニールしたリン酸化オリゴの、ｐＬＫＯ．１ベクター（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＳＣＨ００１）中へのＥｃｏＲＩおよびＡｇｅＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）制限クローニングを介したライゲーションによって生成した。プラスミドを、ＡＡＶベクターと同様に、配列決定によって確認した。ＭａｘｉｐｒｅｐＤＮＡを、ＡＡＶベクターと同様に生成した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレート中に、２．０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中５．０×１０^５細胞／ウェルで播種した。次の日、２．７ｕｌのＦｕＧｅｎｅ６（カタログ番号Ｅ２６９１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と複合体化した０．５ｕｇのｐＳＦ－ＧＦＰプラスミドＤＮＡ、４．６ｕＬのＭＩＳＳＩＯＮレンチウイルスパッケージングミックス（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＳＨＰ００１）を、細胞に添加した。次の日、培地を、２ｍＬの新たな培地で置き換えた。翌々日に、レンチウイルスを含有する培地を収集し、細胞上で、新たな培地で置き換えた。上清を収集し、０．４５ｕｍシリンジフィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、カタログ番号ＳＬＨＶＭ３３ＲＳ）で濾過し、アリコートに分け、－８０℃で貯蔵した。レンチウイルスを、ｑＰＣＲ製造業者の指示を介してＬｅｎｔｉ－Ｘ（商標）ｑＲＴ－ＰＣＲ滴定キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３１２３５）を使用して滴定した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（＃ＰＣＳ－１００－０１３、ＡＴＣＣ）を、６ウェルプレート中に、２ｍｌの完全ＥＧＭ－２培地（ＣＣ－３１６２、Ｌｏｎｚａ）中２．０×１０^５細胞／ウェルで播種した。プレーティングの直後、細胞を、細胞１つ当たり２５ウイルスゲノムの感染多重度（ＭＯＩ）で、レンチウイルスで形質導入した。４８時間後、レンチウイルスを含有する培地を除去し、１．５ｕｇ／ｍＬのピューロマイシン（１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ９６２０－１０ｍｌ）を含有する新たな培地で置き換えた。ピューロマイシンによる７２時間の選択後、死んだ未感染細胞を含有する培地を除去した。ｓｈＲＮＡを発現する細胞を、全ての実験において１．０ｕｇ／ｍＬのピューロマイシン中で継続的に培養して、ｓｈＲＮＡ発現を保持した。感染したＨＵＶＥＣの培地および溶解物を、ＡＮＧＰＴ２についてのＥＬＩＳＡによって解析した。

図１５Ａ～Ｂは、候補ｓｈＲＮＡの各々を含有するレンチウイルスによる形質導入後のＨＵＶＥＣ細胞におけるＡｎｇ－２（分泌型および細胞性）のパーセントを例示する。全ての構築物が良好に機能し（分泌型Ａｎｇ－２では＞５０％ＫＤ）、ｓｈＲＮＡ＃５が、ＨＵＶＥＣからのＡｎｇ－２タンパク質の最も大きい低減を示した。特に、ｓｈＲＮＡ＃１、＃４および＃５は、非ヒト霊長類において完全なマッチである。ｓｈＲＮＡ＃５を、アフリベルセプトとＡｎｇ－２を標的化するｍｉＲＮＡとをコードするＡＡＶプラスミド構築物中に含めるために選択した。Ａｎｇ－２ｓｈＲＮＡ＃１～５は、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列を含む：

次に、ヒト網膜微小血管内皮細胞を、配列番号４８のカプシドタンパク質とｓｈＲＮＡ＃５のセンスおよびアンチセンス鎖を含むｍｉＲＮＡをコードする核酸とを含むｒＡＡＶで形質導入した（ｓｈＲＮＡ＃５のセンスおよびアンチセンス鎖をｍｉｒ－Ｅ内に埋め込み、ｍｉＲＮＡを、ＣＡＧプロモーターのハイブリッドイントロン内に配置した）。配列番号４８のカプシドタンパク質とＣＡＧプロモーターの制御下にＧＦＰをコードする核酸とを含むｒＡＡＶを、対照として使用した。

簡潔に述べると、ヒト網膜微小血管内皮細胞を、培地、コーティングマトリクスおよび継代試薬を含有する「ＴｈｅＳｙｓｔｅｍ」（カタログ番号ＣＳＳ－Ａ１０１）と共に、ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓから購入した（カタログ番号ＡＣＢＲＩ１８１）。全ての継代、凍結保存および細胞解凍を、製造業者の指示に従って実施した。培養物は、継代３の時点でＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓによってバイアルに入れられ、受け取りの際に、このバイアルを拡大増殖させ、バンクとして凍結保存した。実験を、継代９の前の培養物に対してのみ実施した。実験は、典型的には、２４ウェルプレート中で実施し、１：３の比で継代した（１ｃｍ^２当たり１Ｅ＋４細胞）。培地体積は、１ウェル当たり１ｍＬであり、培地を、継代まで一日おきに補充した。

ＲＭＶＥＣ形質導入のために、ＲＭＶＥＣを、付着因子（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｆａｃｔｏｒ）でコーティングされた２４ウェル細胞培養プレート中に１Ｅ＋４細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。この密度は、播種の３日後にコンフルエンスになるのに十分である。ＣＡＧ－ＧＦＰペイロードを保有するＡＡＶを、形質導入の時点での細胞計数およびｑＰＣＲ由来のウイルス力価によって計算したＭＯＩで、細胞に添加し４８時間置いた。形質導入体積は、標準的な培養体積（２４ウェルプレートの１ウェル当たり１ｍｌ）と同じであった。形質導入後、培地を、形質導入の７日後の最終読み出しまで、その後一日おきに補充した。

分泌型遊離ＡＦＬＢ、ＡＮＧＰＴ２およびＶＥＧＦ－ＡレベルについてのＥＬＩＳＡ－ＥＬＩＳＡのための細胞溶解物を、製造業者の指示に従って、１×Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（７８４４０、Ｔｈｅｒｍｏ）を補充したＭ－ＰＥＲ溶解緩衝液（＃７８５０１、Ｔｈｅｒｍｏ）中で調製した。細胞培地および溶解物を、各試料について適切に希釈し、それを使用して、提供者の指示に従ってアフリベルセプトＥＬＩＳＡキット（遊離ＡＦＬＢレベルを測定するため）（カタログ番号ＩＧ－ＡＡ１１５、ＥａｇｌｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎａｓｈｕａ、ＮＨ）、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＶＥＧＦ－ＡＥＬＩＳＡキット（ＤＶＥ００、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）およびＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＡＮＧＰＴ２ＥＬＩＳＡキット（ＤＡＮＧ２０、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して、分泌型分析物レベルを評価した。光学密度（ＯＤ）を、停止溶液をピペッティングして１５分以内に、Ｃｙｔａｔｉｏｎ３（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）光度計を４５０ｎｍ（ＯＤ６２０ｎｍが参照）で用いて測定した。培地濃度を、生成された標準曲線に基づいて規定した。

形質導入された細胞からの成熟ｍｉＲＮＡおよび標的のＲＴ－ｑＰＣＲ－細胞を、プレート上でＲＬＴ中で溶解させ、ｍｉＲＮＡを含有する総ＲＮＡを、製造業者の補足的プロトコール中で示唆されたｍｉＲＮＡを単離するための改変を伴って、製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキット（＃７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。簡潔に述べると、ＲＬＴ溶解物を、ｇＤＮＡ除去カラムを介して濾過し、その後、１．５体積の１００％エタノールを溶解物に添加した。ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉカラムにかけた後に、ＲＷ１による洗浄ステップをスキップし、緩衝液ＲＰＥによる洗浄に直接進めた。総ｃＤＮＡを、１００ｎｇの総ＲＮＡから、製造業者の指示に従ってＭａｘｉｍａＲＴｗｉｔｈｄｓＤＮＡキット（＃Ｍ１６８１、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して産生した。ｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒｍｉｘ（＃４４４４９６３、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）およびＡＮＧＰＴ２を標的化する事前設計されたＴａｑｍａｎプローブセット（Ｈｓ００１６９８６７＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ）、本発明者らのヒト最適化されたＡＦＬＢ（ＡＲ７ＤＴＨＺ、Ｔｈｅｒｍｏ）および正規化のためのハウスキーピング対照としてのＲＰＬ３２（Ｈｓ０７２９１８１９＿ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏ）に対するカスタムＴａｑｍａｎアッセイを使用して実施した。ＶＥＧＦ－ＣおよびＡＦＬＢの測定されたレベルを、ＲＰＬ３２発現に対して正規化し、未処理のまたはビヒクル処理した対照からのパーセント低減の関数として表した。ｍｉＲＮＡ特異的ｃＤＮＡを、１０ｎｇの総ＲＮＡ、およびＦＬ成熟ｍｉＲＮＡガイド配列：５’－ＡＡＵＧＵＵＣＡＵＡＣＡＡＵＧＡＧＵＡＡＧＣ－３’（配列番号７２）を標的化する、ＡＮＧ２カスタムｍｉＲＮＡＴａｑｍａｎアッセイで提供されるカスタムＲＴプライマー（ＣＴＵ６２４９、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、製造業者の指示に従ってＴａｑＭａｎｍｉＲＮＡＲＴキット（＃４３６６５９６、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して産生した。ｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒｍｉｘ（＃４４４４９６３、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）およびＡＮＧ２を標的化するカスタムＴａｑｍａｎプローブセット（ＣＴＵ６２４９、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して実施した。標準曲線を、１反応当たり１ｅ９～１ｅ２コピーの範囲のｍｉＲＮＡ模倣物ＲＴ産物の投入で、ＡＮＧ２のカスタムｍｉＲｖａｎａｍｉＲＮＡ模倣物（ＡＫＳ０６３Ｌ、Ｔｈｅｒｍｏ）から生成した。ｍｉＲＮＡ濃度を、生成された標準曲線から計算した。

図１６Ａは、形質導入されたＲＭＶＥＣ細胞におけるＡｎｇ－２を標的化するｍｉＲＮＡの発現による、分泌型および細胞性Ａｎｇ－２タンパク質（ＲＭＶＥＣ細胞によって内因的に作製される）の低減を示すＡｎｇ－２ＥＬＩＳＡの結果を例示する。Ａｎｇ－２分泌における有意な減少が、１００ＫのＭＯＩにおいて観察される；減少した分泌の傾向は、ＭＯＩ１０ｋにおいても観察される。Ａｎｇ－２における際立った減少が、細胞性試料において観察された。図１６Ｂは、Ａｎｇ－２ｑＰＣＲによる、形質導入されたＲＭＶＥＣ細胞における１００ｋＭＯＩでのＡｎｇ－２ｍＲＮＡの発現における有意な減少を例示する。

次に、Ａｎｇ－２レベルを、ｒＡＡＶ（ＲＭＶＥＣ細胞について上記したのと同じ）による形質導入後にヒトＲＰＥ細胞において評価した。図１７Ａ～Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲ（図１７Ａ－ｍＲＮＡレベル）およびＥＬＩＳＡ（図１７Ｂ－タンパク質レベル）による、ＲＰＥ細胞における８日目（形質導入後）におけるＡｎｇ－２レベルを例示する。Ａｎｇ－２ＲＮＡレベルにおける強い減少が観察され、ＫＤは、ＭＯＩの増加と共に増加する。特に、ＲＰＥにおけるＡｎｇ－２タンパク質レベルは、極めて低い；しかし、ＭＯＩの増加と共により高いＫＤに向かう傾向を伴って、全てのＭＯＩにおいて、ＧＦＰ対照で形質導入された細胞と比較して、Ａｎｇ－２タンパク質のＫＤの増加に向かう傾向が観察される。有意性が、マッチしたＭＯＩで観察される。

次に、アフリベルセプト発現に対する、Ａｎｇ－２またはＶＥＧＦ－Ｃを標的化するＲＮＡｉを二重構築物中に含めることの影響を、ＲＭＶＥＣ細胞において評価した。簡潔に述べると、ＲＭＶＥＣ細胞を、配列番号４８のカプシドタンパク質と、（ｉ）ＡＦＬＢのみをコードする核酸（ＣＡＧ－ＡＦＬＢ）、（ｉｉ）ＡＦＬＢとＡｎｇ－２を標的化するｍｉＲＮＡとをコードする核酸（ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＡＮＧ２－ＲＮＡｉ）、または（ｉｉｉ）ＡＦＬＢとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡとをコードする核酸（ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＶＥＧＦＣ－ＲＮＡｉ）、とを含むｒＡＡＶで形質導入した。

ＲＭＶＥＣを、付着因子でコーティングされた２４ウェル細胞培養プレート中に１Ｅ＋４細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。この密度は、播種の３日後にコンフルエンスになるのに十分である。ＣＡＧ－ＧＦＰペイロードを保有するＡＡＶを、形質導入の時点での細胞計数およびｑＰＣＲ由来のウイルス力価によって計算したＭＯＩで、細胞に添加し４８時間置いた。形質導入体積は、標準的な培養体積（２４ウェルプレートの１ウェル当たり１ｍｌ）と同じであった。形質導入後、培地を、形質導入の７日後の最終読み出しまで、その後一日おきに補充した。

アフリベルセプト発現を、８日目に評価した。図１８Ａは、ＡＮＧ２およびＶＥＧＦ－ＣＲＮＡｉの両方における、ＣＡＧ－ＡＦＬＢ対照による形質導入と比較した、ｍｉＲＮＡ構築物による形質導入後の遊離アフリベルセプトレベルにおける増加を例示する。図１９Ｂは、アフリベルセプトｍｉＲＮＡにおける対応する用量依存的な増加を例示する。

Ａｎｇ－２発現を、８日目に評価した。図１９Ａは、アフリベルセプトをコードする全ての構築物での、Ａｎｇ－２タンパク質レベルにおける有意な減少を例示し、１００ｋＭＯＩにおいて、他の構築物と比較して、Ａｎｇ－２におけるさらなる低減が、Ａｎｇ－２を標的化するｍｉＲＮＡで観察された。図１９Ｂは、Ａｎｇ－２を標的化するＲＮＡｉによる、Ａｎｇ－２転写物における減少に関する用量応答を例示する。アフリベルセプト単独は、Ａｎｇ－２に転写的には影響しないようであるが、ＶＥＧＦ－Ａによって刺激される分泌を予防し得、上清中で観察された減少をもたらす（図１９Ａ）。抗Ａｎｇ－２ｍｉＲＮＡにおける用量依存的な増加（ＭＯＩの関数として）が観察される（図１９Ｃ）。

ＶＥＧＦｍｉＲＮＡ含有ベクターの特徴付け
ＡＡＶプラスミドｐＰ１４５．００１（ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｍｉＲ－Ｅ－（ＶＥＧＦＣ）－ＡＦＬＢ－ＳＶ４０）（図２を参照されたい）を、以下のように構築した。

ヒトコドン最適化されたアフリベルセプトＶＥＧＦ－Ａ／ＢＴｒａｐを発現するｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＳＶ４０構築物を合成した。ＳｇｒＡＩ制限クローニング部位とＮｈｅＩ制限クローニング部位との間にコードされたＣＡＧベータ－アクチンイントロンの領域を含有するｍｉＲ－Ｅ－（ＶＥＧＦ－Ｃ）ｍｉＲＮＡ導入遺伝子を合成し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によりｐＵＣ５７中にクローニングした。ｐＵＣ５７プラスミドおよびｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＳＶ４０－Ｋａｎ－Ｓｔｕｆｆｅｒプラスミドを、指し示されたように、種々の制限酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で切断し、骨格ＤＮＡを、消化の間に組換えエビアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ、Ｍ０３７１Ｌ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）でも処理して、切断されたＤＮＡ末端上の遊離ホスフェートを除去した。ＤＮＡ断片を、７：１のモル比の挿入物：骨格で添加し、ＱｕｉｃｋＬｉｇａｓｅ（＃Ｍ２２００Ｌ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を製造業者の指示に従って用いてライゲーションさせた。ライゲーションされたプラスミドを、製造業者の指示に従ってＮＥＢＳｔａｂｌｅ細菌コンピテント細胞（＃Ｃ３０４０Ｈ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）中に形質転換し、細胞を、カナマイシン５０ｍｇ／ｍｌプレート（＃Ｌ１０２５、Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）上に広げ、３０℃で成長させた。

Ｍｉｎｉｐｒｅｐ培養物を、得られたコロニーから成長させ（７．１）、ＤＮＡを、ＧｅｎｅＪＥＴＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号０５０３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて調製し、制限消化して、陽性クローンを同定した。ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ中の５０ｍｌの培養物を、１つの陽性クローンから成長させ、ＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎＥｎｄｏＦｒｅｅＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉキット（カタログ番号１２３６２、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調製した。

ＶＥＧＦ－Ｃを標的化するいくつかのｓｈＲＮＡ配列を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＶＥＧＦ－Ｃの発現を低減させるそれらの能力について評価した。

ＶＥＧＦ－ＣｓｈＲＮＡレンチウイルス系の生成－ｐＬＫＯ．１－ｓｈＶＥＧＦＣプラスミドを、ＢｒｏａｄＲＮＡｉコンソーシアムから同定されたヒトＶＥＧＦ－Ｃ中の５つの独自の標的配列（表１）に対応するアニールしたリン酸化オリゴの、ｐＬＫＯ．１ベクター（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＳＣＨ００１）中へのＥｃｏＲＩおよびＡｇｅＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）制限クローニングを介したライゲーションによって生成した。プラスミドを、ＡＡＶベクターと同様に、配列決定によって確認した。ＭａｘｉｐｒｅｐＤＮＡを、ＡＡＶベクターと同様に生成した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレート中に、２．０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中５．０×１０＾５細胞／ウェルで播種した。次の日、２．７ｕｌのＦｕＧｅｎｅ６（カタログ番号Ｅ２６９１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と複合体化した０．５ｕｇのｐＳＦ－ＧＦＰプラスミドＤＮＡ、４．６ｕＬのＭＩＳＳＩＯＮレンチウイルスパッケージングミックス（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＳＨＰ００１）を、細胞に添加した。次の日、培地を、２ｍＬの新たな培地で置き換えた。翌々日に、レンチウイルスを含有する培地を収集し、細胞上で、新たな培地で置き換えた。上清を収集し、０．４５ｕｍシリンジフィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、カタログ番号ＳＬＨＶＭ３３ＲＳ）で濾過し、アリコートに分け、－８０℃で貯蔵した。レンチウイルスを、ｑＰＣＲ製造業者の指示を介してＬｅｎｔｉ－Ｘ（商標）ｑＲＴ－ＰＣＲ滴定キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３１２３５）を使用して滴定した。ＭＣＦ７細胞（＃ＨＴＢ－２２、ＡＴＣＣ）を、６ウェルプレート中に、０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト組換えインスリン（＃Ｉ９２７８－５ＭＬ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を補充した２ｍｌのＥＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中５．０×１０^５細胞／ウェルで播種した。プレーティングの直後、細胞を、細胞１つ当たり２５ウイルスゲノムの感染多重度（ＭＯＩ）で、レンチウイルスで形質導入した。４８時間後、レンチウイルスを含有する培地を除去し、０．７５ｕｇ／ｍＬのピューロマイシン（１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ９６２０－１０ｍｌ）を含有する新たな培地で置き換えた。ピューロマイシンによる７２時間の選択後、死んだ未感染細胞を含有する培地を除去した。ｓｈＲＮＡを発現する細胞を、全ての実験において０．５ｕｇ／ｍＬのピューロマイシン中で継続的に培養して、ｓｈＲＮＡ発現を保持した。ピューロマイシンと共に培養した細胞を、ＲＬＴ中で溶解させ、総ＲＮＡを、製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎＲＮＥａｓｙキットを使用して精製した。

ＭＣＦ７ＶＥＧＦ－ＣノックダウンのｑＰＣＲ解析－ピューロマイシンと共に培養した細胞を、プレート上でＲＬＴ中で溶解させ、総ＲＮＡを、製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキット（＃７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。総ｃＤＮＡを、５ｕｇの総ＲＮＡから、製造業者の指示に従ってＭａｘｉｍａＲＴｗｉｔｈｄｓＤＮＡキット（＃Ｍ１６８１、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して産生した。ｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒｍｉｘ（＃４４４４９６３、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）およびＶＥＧＦ－Ｃを標的化する事前設計されたＴａｑｍａｎプローブセット（Ｈｓ０１０９９２０３＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ）、ならびに正規化のためのハウスキーピング対照としてのＲＰＬ３２（Ｈｓ０７２９１８１９＿ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して実施した。ＶＥＧＦ－Ｃの測定されたレベルを、ＲＰＬ３２発現に対して正規化し、非標的化ｓｈＲＮＡからのパーセント低減の関数として表した。

形質導入された細胞からの成熟ｍｉＲＮＡおよび標的のＲＴ－ｑＰＣＲ－細胞を、プレート上でＲＬＴ中で溶解させ、ｍｉＲＮＡを含有する総ＲＮＡを、製造業者の補足的プロトコール中で示唆されたｍｉＲＮＡを単離するための改変を伴って、製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキット（＃７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。簡潔に述べると、ＲＬＴ溶解物を、ｇＤＮＡ除去カラムを介して濾過し、その後、１．５体積の１００％エタノールを溶解物に添加した。ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉカラムにかけた後に、ＲＷ１による洗浄ステップをスキップし、緩衝液ＲＰＥによる洗浄に直接進めた。総ｃＤＮＡを、１００ｎｇの総ＲＮＡから、製造業者の指示に従ってＭａｘｉｍａＲＴｗｉｔｈｄｓＤＮＡキット（＃Ｍ１６８１、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して産生した。ｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒｍｉｘ（＃４４４４９６３、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）およびＶＥＧＦ－Ｃを標的化する事前設計されたＴａｑｍａｎプローブセット（Ｈｓ０１０９９２０３＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ）、本発明者らのヒト最適化されたＡＦＬＢ（ＡＲ７ＤＴＨＺ、Ｔｈｅｒｍｏ）および正規化のためのハウスキーピング対照としてのＲＰＬ３２（Ｈｓ０７２９１８１９＿ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏ）に対するカスタムＴａｑｍａｎアッセイを使用して実施した。ＶＥＧＦ－ＣおよびＡＦＬＢの測定されたレベルを、ＲＰＬ３２発現に対して正規化し、未処理のまたはビヒクル処理した対照からのパーセント低減の関数として表した。ｍｉＲＮＡ特異的ｃＤＮＡを、１０ｎｇの総ＲＮＡ、およびＦＬ成熟ｍｉＲＮＡガイド配列：５’－ＡＡＵＡＡＣＧＵＣＵＵＧＣＵＧＡＧＧＵＡＧＣ－３’（配列番号７３）を標的化する、ＶＥＧＦ－ＣカスタムｍｉＲＮＡＴａｑｍａｎアッセイが提供されるカスタムＲＴプライマー（ＣＴＴＺ９ＫＣ、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、製造業者の指示に従ってＴａｑＭａｎｍｉＲＮＡＲＴキット（＃４３６６５９６、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して産生した。ｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒｍｉｘ（＃４４４４９６３、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）およびＶＥＧＦ－Ｃを標的化するカスタムＴａｑｍａｎプローブセット（ＣＴＴＺ９ＫＣ、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して実施した。標準曲線を、１反応当たり１ｅ９～１ｅ２コピーの範囲のｍｉＲＮＡ模倣物ＲＴ産物の投入で、ＶＥＧＦ－ＣのカスタムｍｉＲｖａｎａｍｉＲＮＡ模倣物（ＡＫＴ９４９Ｔ、Ｔｈｅｒｍｏ）から生成した。ｍｉＲＮＡ濃度を、生成された標準曲線から計算した。

図２０は、ｓｈＲＮＡによる形質導入後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＶＥＧＦ－ＣＲＮＡレベルのパーセンテージ（ＲＰＬ３２に対して正規化した）を例示する。全ての構築物においてＶＥＧＦ－Ｃの強力なＫＤが観察され、ｓｈＲＮＡ＃２は、ＶＥＧＦ－Ｃの＞９０％のノックダウンを生じた。ｓｈＲＮＡ＃２を、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡとをコードするＡＡＶプラスミド構築物中に含めるために選択した。ＶＥＧＦ－ＣｓｈＲＮＡ＃１～５は、以下のセンスおよびアンチセンス鎖配列を含む：

次に、ヒトＲＰＥ細胞を、配列番号４８のカプシドタンパク質とｓｈＲＮＡ＃２のセンスおよびアンチセンス鎖を含むｍｉＲＮＡをコードする核酸とを含むｒＡＡＶで形質導入した（ｓｈＲＮＡ＃２のセンスおよびアンチセンス鎖をｍｉｒ－Ｅ内に埋め込み、ｍｉＲＮＡを、ＣＡＧプロモーターのハイブリッドイントロン内に配置した）。配列番号４８のカプシドタンパク質とＣＡＧプロモーターの制御下にＧＦＰをコードする核酸とを含むｒＡＡＶを、対照として使用した。

ＲＰＥ形質導入－ヒト幹細胞由来網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）を、公開されたプロトコール（Buchholz D 2013、Leach L 2015）に従って、胚性幹細胞（ＥＳＩ－０１７）から分化させた。ＲＰＥ細胞を、９６ウェルプレート形式でＸＶＩＶＯ－１０培地（Ｌｏｎｚａ）中で３０日間にわたってＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で成長させた。形質導入前に、３つのウェルを回収し、感染多重度（ＭＯＩ）の正確な計算のために計数した。ウイルスを、１ウェル当たり１００μＬの総体積中で、各ウイルス力価に基づいて、ＸＶＩＶＯ１０培地中で４８時間、細胞に添加した。培地を、３、７、１１、１５および１９日目に収集し、１ウェル当たり２００μＬの培地で置き換えた。培地試料を、処理まで４℃で貯蔵した。

図２１Ａは、指し示された構築物を保有するｒＡＡＶによる形質導入後のＲＰＥ細胞におけるＶＥＧＦ－Ｃレベル（ＥＬＩＳＡによる）を例示する。ＶＥＧＦ－ＣｍｉＲＮＡ構築物に特異的な、ＲＰＥ細胞（ＶＥＧＦ－Ｃを内因的に作製する）の上清中のＶＥＧＦ－Ｃにおける用量依存的な減少が観察される。他の構築物でのＶＥＧＦ－Ｃにおける僅かな減少が、最も高いＭＯＩで観察される。ＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡは、機能的である。

図２１Ｂは、ＶＥＧＦ－Ｃ構築物に特異的な、ＶＥＧＦ－ＣｍＲＮＡにおける対応する用量依存的な減少（１．６、１０００および５０００のＭＯＩ）を例示する。

図２１Ｃは、ＲＰＥ細胞におけるＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡの発現における用量依存的な増加を例示する。

二重構築物（アフリベルセプト＋ＶＥＧＦ－ＣまたはＡｎｇ－２を標的化するｍｉＲＮＡをコードする）がＲＰＥ細胞においてＶＥＧＦ－Ａを中和する能力を、配列番号４８のカプシドタンパク質と二重構築物（「ＶＥＧＦ－ＣＲＮＡｉ－ＡＦＬＢ」、「Ａｎｇ－２ＲＮＡｉ－ＡＦＬＢ」「ＡＦＬＢ」）を含む核酸とを含むｒＡＡＶベクターによる形質導入後８日目に評価した。図２２Ａは、ＡＦＬＢを発現する全ての構築物が、検査した全てのＭＯＩにおいて、内因性ＶＥＧＦ－Ａを完全に中和することができることを例示している。特に、ＡＦＬＢを発現しない構築物（「ＧＦＰ」、「Ａｎｇ２ＲＮＡｉ」）は、培地中のＶＥＧＦ－Ａレベルに対していかなる有意な影響も有さない。図２１Ｂ～Ｃは、ＶＥＧＦ－Ｃタンパク質（図２２Ｂ；ＥＬＩＳＡ）およびｍＲＮＡレベル（図２２Ｃ；ＲＴ－ｑＰＣＲ）が、ＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡをコードするｒＡＡＶによる形質導入後のＲＰＥレベルにおいて、用量依存的様式で低減したことを例示している。

（実施例４）
二重ＲＮＡｉベクター
二重ＲＮＡｉアプローチ（ＶＥＧＦ－ＣおよびＡｎｇ－２を標的化する）を調査した。代表的な実施形態は、ｐＰ１５１．００１、ｐＰ１５２．００１およびｐＰ１５３．００１を含んだ（図２を参照されたい）。

ｐＰ１５１は、アフリベルセプトコード領域の３’ＵＴＲ中に位置する人工イントロン内に配置されたＡｎｇ－２を標的化するｍｉＲＮＡと、ＣＡＧプロモーターのハイブリッドイントロン内に配置されたＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡとを含む。ｐＰ１５２は、アフリベルセプトコード領域内に位置する人工イントロン内に配置されたＡｎｇ－２を標的化するｍｉＲＮＡと、ＣＡＧプロモーターのハイブリッドイントロン内に配置されたＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡとを含む。ｐＰ１５３は、ＣＡＧプロモーターのハイブリッドイントロン内の異なる位置に各々が配置された、Ａｎｇ－２を標的化するｍｉＲＮＡとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡとを含む。

配列番号４８を含むカプシドを含むｒＡＡＶは、総ＣＤ３１＋細胞の２５％以下の形質導入効率で、非ヒト霊長類への硝子体内投与（１×１０^１２ｖｇ／眼）後にＣＤ３１＋内皮細胞を形質導入することが示されている（図２３Ａを参照されたい－ｒＡＡＶは、ＧＦＰレポーター遺伝子をコードする核酸を含んだ）。

（実施例５）
血管新生のＮＨＰモデル
パイロット薬理学研究を、以下を行うために非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において実施した：配列番号４８のカプシドタンパク質と、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含むｒＡＡＶの硝子体内投与後の、（ｉ）急性の眼安全性を評価するため、（ｉｉ）アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化する細胞内ｍｉＲとの発現を測定するため、および（ｉｉｉ）優勢なｍｉＲＮＡ種をｉｎｖｉｖｏで確認するため。核酸は、配列番号１９および２０に対応するセンスおよびアンチセンス鎖ならびに配列番号６９に対応する完全構築物を含む。

図２４に示されるように、眼房および硝子体アフリベルセプト（ＡＦＬＢ）レベルは、有効性について報告された範囲内に十分入る／かかる範囲を十分に上回った。ロバストな網膜ＡＦＬＢレベルが検出された。研究の間、ブドウ膜炎の証拠も網膜異常の証拠も存在しなかった。

図２５に示されるように、高いｍｉＲＮＡコピー数が、研究におけるＮＨＰの全ての眼の全ての網膜にわたって検出された。動物間発現レベルは、ＡＦＬＢＥＬＩＳＡで観察されたものと匹敵する。ＭｉＳｅｑデータにより、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔおよび形質導入されたＲＰＥ細胞において示されたのと同様に優勢なｍｉＲＮＡ種として、ＶＥＧＦ－Ｃを標的化する全長２２ｂｐが確認される。

次に、概念実証研究を開始して、血管新生のＮＨＰモデルにおけるｒＡＡＶの有効性を調査した。例えば、Goody et al., Experimental Eye Research, 92(6):464-472 (2011)を参照されたい。簡潔に述べると、アフリカミドリザルＮＨＰ、１群当たりｎ＝７に、ｒＡＡＶ（配列番号４８のカプシドタンパク質と、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードするヌクレオチド配列を含む核酸とを含む）またはビヒクルを、３つの用量（１×１０^１１ｖｇ／眼、３×１０^１１ｖｇ／眼または１×１０^１２ｖｇ／眼において両側的に）で硝子体内で投与した。ステロイド（Ｄ－１に開始する毎週の４０ｍｇメチルプレドニゾロンＩＭ、および２ｍｇトリアムシノロンアセトニドテノン嚢下事後注射）を、４週間後（投与後）に中止した。レーザーを、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）を誘導するために、投与の４２日後に投与し、病変を、ＣＮＶレーザーの２週間後および４週間後にスコアリングした。

図２６に例示されるように、グレードＩＶの病変発生率の評価により、全ての処置群における（即ち、ｒＡＡＶの全ての検査した用量における）臨床的に関連するグレードＩＶの病変の完全な非存在によって実証されるように、ｒＡＡＶの全ての用量による処置が、ＣＮＶを有意に遮断したことが明らかになった。ビヒクル対照と比較して、図２６を参照されたい。用量応答は観察されず、これは、投与した全ての用量におけるｒＡＡＶの完全な有効性を示唆している。

本明細書で以後ｒＡＡＶ配列番号４８ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＶＥＧＦＣ－ＲＮＡｉと呼ばれる、配列番号４８のカプシドタンパク質と、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードする核酸（配列番号１９および２０に対応するセンスおよびアンチセンス鎖ならびに配列番号６９に対応する完全構築物を含む）とを含むｒＡＡＶの硝子体内投与の２１日後にＮＨＰから収集した房水試料を、アフリベルセプトタンパク質発現について解析した。図２８に示されるように、アフリベルセプトの眼房レベルは、用量依存的である。さらに、１×１０^１２ｖｇ／眼の用量では、ｒＡＡＶ配列番号４８ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＶＥＧＦＣ－ＲＮＡｉを投与した眼からのアフリベルセプト発現は、本明細書で以後ｒＡＡＶ配列番号４８ＣＡＧ－ＡＦＬＢと呼ばれる、配列番号４８のカプシドタンパク質とアフリベルセプトのみをコードする核酸とを含むｒＡＡＶよりも劣ってはいなかった。

ＮＨＰにおける眼内炎症を、指定された時点において、スリットランプ生体顕微鏡を用いて試験した。スコアリングを、試験成分に由来する要約スコアと共に非ヒト霊長類眼科試験スコアリングシステムを使用する定性的臨床眼科所見に適用した。指定された時点において、眼内圧（ＩＯＰ）測定値を、イヌ（ｄ）較正設定に設定したＴｏｎｏＶｅｔ（ｉＣａｒｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）眼圧計を使用して収集した。３つの尺度を、各眼から各時点において採取し、平均ＩＯＰを規定した。

一貫して低い積分した臨床スコアを示したビヒクル処置した眼と比較して、１×１０^１２ｖｇ／眼のｒＡＡＶ配列番号４８ＣＡＧ－ＡＦＬＢまたは１×１０^１２ｖｇ／眼のｒＡＡＶ配列番号４８ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＶＥＧＦＣ－ＲＮＡｉを受けた眼は、軽度から中等度の眼内炎症を示し、ＩＶＴ注射のおおよそ２８日後にピークを迎えた（図２９を参照されたい）。

２２週目には、ビヒクル、１×１０^１１ｖｇ／眼または３×１０^１１ｖｇ／眼のｒＡＡＶ配列番号４８ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＶＥＧＦＣ－ＲＮＡｉで処置した眼において眼内炎症は存在しなかったか、または軽度の眼内炎症のみが存在したが、１×１０^１２ｖｇ／眼のｒＡＡＶ配列番号４８ＣＡＧ－ＡＦＬＢまたは１×１０^１２ｖｇ／眼のｒＡＡＶ配列番号４８ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＶＥＧＦＣ－ＲＮＡｉで処置した眼の半分またはそれよりも多くが、軽度から中等度の眼内炎症を示した。図２９を参照されたい。炎症応答は、軽度の眼房細胞、角膜後面沈着物、硝子体細胞所見、および水晶体の前嚢膜上の沈着物を主に含んだ。眼内圧（ＩＯＰ）は、全ての群において正常なままであった。

網膜体積および網膜中心厚を、ＮＨＰにおいて評価した。簡潔に述べると、指定された時点において、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）を、視線追跡を伴うＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＳｐｅｃｔｒａｌｉｓＯＣＴＰｌｕｓならびにＨＥＹＥＸ画像捕捉および解析ソフトウェアを使用して実施した。後部網膜を包含する総体積スキャンを実施した。レーザーの前の試験の時点で、網膜厚マップおよび断面表示画像を得た。

ＯＣＴ由来の網膜体積および網膜厚は、ベースラインから２２週まで、安定な包括的網膜厚を示し、これは、任意の処置後の観察期間の間に網膜浮腫も変性関連の菲薄化も起こらなかったことを指し示している。適用されたＥＴＤＲＳグリッド内の網膜体積の総計の平均値および平均網膜中心厚は、研究を通じて安定なままであった（図３０を参照されたい）。

全視野網膜電図検査（ｆｆＥＲＧ）を、８４日目および２２週目に実施して、ＮＨＰにおける網膜機能の変化を比較した。簡潔に述べると、最低２５分間の期間の暗順応が、暗所ｆｆＥＲＧ記録に先行した。暗順応を、暗所赤色光がアクセスする暗室中に位置させた移動ケージ中に鎮静下のサルを保持することによって達成した。瞳孔を、フェニレフリン（１０％）で散大させ、暗順応の開始時、および潜在的には、刺激曝露の前に再度、シクロペントレート（１％）で増大させて、動物が刺激誘導の時点で最大瞳孔散大を有することを確実にした。

最低１０分間の期間の明順応が、眼を開けたままにし、ＤＴＬ電極を適所に維持する明所ｆｆＥＲＧ記録に先行した。瞳孔を、フェニレフリン（１０％）で散大させ、明順応の開始時、および潜在的には刺激曝露の前に再度、シクロペントレート（１％）で増大させて、サルが刺激誘導の時点で最大瞳孔散大を有することを確実にした。

以下の手順は、毒物学研究のためのＩＳＣＥＶ標準へのＶｅｒｉｓプラットフォームを使用して実施し、以下の刺激曝露を含んだ：

・暗所０．１６ｃｄ－ｓｍ２刺激（測定されたオン型双極細胞の杆体駆動性の応答、ｂ波）

・暗所２．５１ｃｄ－ｓｍ２刺激（両方の光受容体の杆体および錐体駆動性の応答、ａ波、およびオン型双極細胞、ｂ波）

・明所２．５１ｃｄ－ｓｍ２刺激（両方の光受容体の錐体駆動性の応答、ａ波、ならびにオン型およびオフ型双極細胞、ｂ波）

・２．５１ｃｄ－ｓｍ２刺激における明所３０Ｈｚフリッカー刺激（錐体駆動性の応答）

ＮＨＰは、明所試験前に暗所試験を受け、常に、所与の順応のために、漸増する刺激強度の刺激曝露順序を受けた。網膜順応を褪色（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）させ、それに影響を与えるのを回避するために、単一の刺激曝露が、フリッカー刺激曝露に常に先行した。

一貫性を検証し、ｆｆＥＲＧにおいて固有の変動性の範囲を確立するために、各時点における各刺激を、２回の独立した試行によって捕捉した。各試行は、３回の別々の逐次の刺激誘導の複合であった。

データ記録は、ＩＳＣＥＶ標準によってガイドされる形式に従った。

・刺激誘導をマーカーによって示した

・刺激だけでなく背景の、時間積分した輝度を、絶対値で記録した

・刺激誘導の時間および日付

・瞳孔直径

・角膜電極の型および位置

暗所Ａ波、暗所Ｂ波および明所フリッカーの統計的に有意な差異は、同じ時点における処置群間でも、同じ処置群の異なる時点間でも、観察されなかった（全てｐ＞０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡとその後のテューキー・クレーマー（Tukey-Krammer）ＨＳＤ）。暗所Ａ波、暗所Ｂ波および明所フリッカーの平均振幅は、図３１に示される。

結論－配列番号４８のカプシドタンパク質とアフリベルセプト＋ＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲをコードする核酸とを含むｒＡＡＶは、ビヒクル処置した対照と比較して、グレードＩＶの病変発達を完全に無効にし、ＣＮＶ発達を有意に減弱させ、このことは、眼血管新生に関連する種々の疾患、例えば、湿性ＡＭＤの処置におけるｒＡＡＶの安全性および有効性を支持している。

（実施例６）
ＨＵＶＥＣの増殖および遊走アッセイ
ｉｎｖｉｔｒｏ血管新生アッセイを実施して、電気穿孔後のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖および遊走に対する、（ｉ）アフリベルセプト＋ＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲＮＡ（ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＶＥＧＦＣ－ＲＮＡｉ）、（ｉｉ）アフリベルセプトのみ（ＣＡＧ－ＡＦＬＢ）、または（ｉｉｉ）ＧＦＰ（ＣＡＧ－ＧＦＰ）をコードするプラスミドの影響を評価した。簡潔に述べると、ＨＵＶＥＣを、０．０５％トリプシンＥＤＴＡを使用して浮き上がらせ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＮｅｏｎＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒキットの指示に従って電気穿孔した。１条件当たり２百万個の細胞を、適した量のプラスミドと共に、Ｒ緩衝液中に再懸濁した。１条件当たり１マイクログラムの総ＤＮＡをトランスフェクトした（ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＶＥＧＦＣ－ＲＮＡｉ、ＣＡＧ－ＡＦＬＢまたはＣＡＧ－ＧＦＰ）。等モル濃度のＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＶＥＧＦＣ－ＲＮＡｉプラスミドおよびＣＡＧ－ＡＦＬＢプラスミドをトランスフェクトした。ＣＡＧ－ＡＦＬＢプラスミドの長さ（６，６６０ｂｐ；１．４×１０^１１コピー／μｇ）は、ＣＡＧ－ＡＦＬＢ－ＶＥＧＦＣ－ＲＮＡｉプラスミド（１０，７１１ｂｐ：８．６×１０^１０コピー／μｇ）よりも短かったので、余分なＣＡＧ－ＧＦＰプラスミドをＣＡＧ－ＡＦＬＢ条件に加えて、総ＤＮＡを等しくした。モックトランスフェクション「ショック」もまた、対照として実施した。細胞を、１３５０Ｖで３０ミリ秒間の単一のパルスによって電気穿孔した。培地を、電気穿孔の４時間後に交換して、残留Ｒ緩衝液を除去した。電気穿孔後、細胞を、増殖または遊走アッセイのためにプレーティングした。

増殖アッセイのためのＨＵＶＥＣ細胞計数

電気穿孔の４日後、細胞を、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで浮き上がらせた。トリプシンを、等体積の完全培地でクエンチした。細胞を、４００×ｇで５分間遠心分離し、５０μｌの完全培地中に再懸濁した。細胞懸濁物を、ＢＤｃｏｕｎｔｅｓｓ細胞計数器を使用して計数した。１条件当たり６つの複製を計数した。実験全体を、別個に３回試行した。

遊走アッセイのためのＨＵＶＥＣ細胞計数

電気穿孔の４日後、細胞を、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで浮き上がらせた。トリプシンを、等体積の完全培地でクエンチした。細胞を、４００×ｇで５分間遠心分離し、計数した。２５，０００個の細胞を、Nareshkumar et al. Scientific reports. 8.1 (2018): 1-16に従って、０．１％ゼラチンでコーティングした８μｍ孔ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの上部区画中に、飢餓ＥＧＭ－２培地（ＶＥＧＦなし）中で播種した。下部区画は、完全ＥＧＭ－２培地を含有し、成長因子勾配を創出した。播種の４時間後、培養物を固定し、ＰＢＳで洗浄した。核を、ＤＡＰＩで室温で５分間対比染色した。次いで、上部区画を、ゴムスクレーパーを用いて完全にかき取った。画像を、ＺｅｉｓｓＡｘｉｏＶｅｒｔ．Ａ１蛍光顕微鏡を使用して、５０倍の倍率で取得した。インサート１つ当たり４つの画像を、トランスフェクション条件１つ当たり３つの複製で、偏りのないグリッドパターンで取得した。実験全体を、別個に３回試行した。ＤＡＰＩの定量を、ＦＩＪＩソフトウェアを使用して実施した。Schindelin, et al. Nature methods. 9.7 (2012): 676-682。簡潔に述べると、閾値を各画像に適用し、バイナリマスクに変換した。次いで、ＤＡＰＩポイントを、「粒子を解析する」機能を使用して定量した。閾値は、各実験内で同じであったが、ＤＡＰＩ染色強度における変動性に起因して、実験的複製間では異なった。

図２７に示されるように、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードする核酸を含むプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞は、ＣＡＧプロモーターの制御下にＧＦＰを含有するプラスミドまたはショック条件対照と比較して、培養システム中に存在する細胞数の減少をもたらした（図２７Ａ）。アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードする核酸は、配列番号１９および２０に対応するセンスおよびアンチセンス鎖ならびに配列番号６９に対応する完全構築物を含む。さらに、ショック条件と比較して、より少ない細胞が、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードする核酸を含むプラスミドＤＮＡによるトランスフェクション後に、ｔｒａｎｓｗｅｌｌメンブレンを通って遊走した（図２７Ｂ）。重要なことに、両方のアッセイにおいて、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードする核酸を含有するプラスミドは、ＣＡＧプロモーターの制御下にアフリベルセプトのみを含有するプラスミドでトランスフェクトされた細胞よりも劣っていなかった。これらのデータは、ＨＵＶＥＣ細胞における、アフリベルセプトとＶＥＧＦ－Ｃを標的化するｍｉＲとをコードする核酸による内皮細胞の増殖および遊走のロバストな阻害を実証している。

本発明の材料および方法は、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなしに、本明細書に記載される方法にバリエーションが適用され得ることが、当業者に明らかである。当業者に明らかな全てのかかる同様の代替物および改変は、本発明の精神、範囲および概念の内であるとみなされる。

本発明の材料および方法は、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなしに、本明細書に記載される方法にバリエーションが適用され得ることが、当業者に明らかである。当業者に明らかな全てのかかる同様の代替物および改変は、本発明の精神、範囲および概念の内であるとみなされる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
それぞれ、配列番号１９、１６、２２、２５、２８、１、４、７、１０、１３、３１、３４、３７、４０および４３から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むセンス鎖と、配列番号２０、１７、２３、２６、２９、２、５、８、１１、１４、３２、３５、３８、４１および４４から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を含むアンチセンス鎖とを含む合成リボ核酸（ＲＮＡ）分子であって、好ましくは、配列番号１９と少なくとも９０％の配列同一性を含むセンス鎖と、配列番号２０と少なくとも９０％の配列同一性を含むアンチセンス鎖とを含む、合成ＲＮＡ分子。
（項目２）
前記ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、項目１に記載の合成ＲＮＡ分子。
（項目３）
前記ＲＮＡが、配列ＣＴＣＧＡＧまたはそれと少なくとも９０％同一な配列を含むループを含むｓｈＲＮＡである、項目１に記載の合成ＲＮＡ分子。
（項目４）
前記ＲＮＡが、配列番号４６または４７に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むＲＮＡを含む人工ｍｉＲＮＡであり、それぞれ、（Ｘ） _ｎが、配列番号１９、１６、２２、２５、２８、１、４、７、１０、１３、３１、３４、３７、４０および４３から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むセンス配列を含み、（Ｙ） _ｎが、配列番号２０、１７、２３、２６、２９、２、５、８、１１、１４、３２、３５、３８、４１および４４から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むアンチセンス配列を含む、項目１に記載の合成ＲＮＡ分子。
（項目５）
５’および／または３’末端において、対合していないオーバーハング配列をさらに含み、前記オーバーハング配列が、反復塩基の配列を必要に応じて含み、前記反復塩基が、反復ウラシル（Ｕ）塩基を必要に応じて含む、項目１から４のいずれか一項に記載の合成ＲＮＡ。
（項目６）
（ｉ）項目１から４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの合成ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
（項目７）
（ｉｉ）ＶＥＧＦ－Ａの活性を阻害する第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、（ｉ）および（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結される、項目６に記載の核酸。
（項目８）
前記第１の抗血管新生ポリペプチドが、アフリベルセプトであり、好ましくは、前記アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列が、配列番号５０のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％同一な配列を含む、項目７に記載の核酸。
（項目９）
（ｉ）および（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結される、項目７または８に記載の核酸。
（項目１０）
前記第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、１つまたは複数の前記合成ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列とが、同じ発現制御配列の制御下にある、項目９に記載の核酸。
（項目１１）
前記発現制御配列が、遍在性プロモーターを含む、項目１０に記載の核酸。
（項目１２）
前記プロモーターが、ＣＡＧまたはＣＢＡプロモーターである、項目１１に記載の核酸。
（項目１３）
配列番号６９、６８および７０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９５％同一な配列を含む、項目８に記載の核酸。
（項目１４）
項目１から４のいずれか一項に記載の合成ＲＮＡおよび／または項目６から１３のいずれか一項に記載の核酸を含む、組成物。
（項目１５）
薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
項目１から４のいずれか一項に記載の合成ＲＮＡ分子および／または項目６から１３のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
（項目１７）
発現プラスミドである、項目１６に記載のベクター。
（項目１８）
ウイルスベクターである、項目１６または１７に記載のベクター。
（項目１９）
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであり、好ましくは、前記ｒＡＡＶベクターが、血清型２、５もしくは８のＡＡＶカプシドまたはそれらのバリアントを含む、項目１８に記載のベクター。
（項目２０）
前記ｒＡＡＶが、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、カプシドタンパク質のＧＨループ中に共有結合的に挿入された７、８、９、１０または１１アミノ酸の長さを有する異種ペプチド挿入を含むカプシドタンパク質を含むカプシドを有し、前記ペプチド挿入が、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号７４）を含む、項目１９に記載のベクター。
（項目２１）
前記挿入ペプチドが、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号７４）のアミノおよび／またはカルボキシル末端において、１～３個のスペーサーアミノ酸（Ｙ _１～Ｙ _３）を有する、項目２０に記載のベクター。
（項目２２）
前記挿入ペプチドがＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号４９）である、項目２０または２１に記載のベクター。
（項目２３）
前記挿入の部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０とアミノ酸６１１との間の位置、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の対応する位置において、２つの隣接するアミノ酸間に位置する、項目２０から２２のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２４）
前記挿入の部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７に対応するアミノ酸とアミノ酸５８８に対応するアミノ酸との間、もしくはＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８８に対応するアミノ酸とアミノ酸５８９に対応するアミノ酸との間、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の対応する位置に位置する、項目２０から２３のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２５）
前記カプシドタンパク質が、ＡＡＶ２のＶＰ１と比較して１つもしくは複数のアミノ酸置換を含む、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の１つもしくは複数の対応する置換を含む、項目２０から２４のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２６）
前記カプシドタンパク質が、ＡＡＶ２のＶＰ１と比較して以下：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、１６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１ＬおよびＬ７３５Ｑのアミノ酸置換のうちの１つもしくは複数を含む、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の１つもしくは複数の対応する置換を含む、項目２０から２５のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２７）
前記バリアントカプシドタンパク質が、ＡＡＶ２のＶＰ１と比較してＶ７０８Ｉアミノ酸置換を含む、または別のカプシドタンパク質中の対応する位置にアミノ酸置換を含む、項目２０から２６のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２８）
前記ｒＡＡＶが、配列番号４８と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、好ましくは、配列番号４８と少なくとも９５％同一なアミノ酸を含む、より好ましくは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含むカプシドを有する、項目２０から２７のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２９）
前記ｒＡＡＶが、配列番号６９、６４、６５、６６、６７、６８および７０のうちのいずれか１つに示される配列を含む異種核酸を含む、項目２８に記載のベクター。
（項目３０）
項目１６から２９のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目３１）
項目１６から２９のいずれか一項に記載のベクターを含む組成物。
（項目３２）
薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）
対象における眼血管新生に関連する眼疾患、好ましくは、ＶＥＧＦ－Ａに関連する眼疾患を処置するための方法であって、項目６から１３のいずれか一項に記載の核酸、項目１５に記載の医薬組成物、項目１６から２９のいずれか一項に記載のベクターまたは項目３２に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
（項目３４）
前記対象に、項目３２に記載の医薬組成物が投与され、好ましくは、前記医薬組成物が、項目２８または２９に記載のｒＡＡＶビリオンを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記ｒＡＡＶビリオンまたは医薬組成物が、前記対象に、眼内で、好ましくは、硝子体内注射、脈絡膜上注射または網膜下注射によって、好ましくは、単回硝子体内注射によって投与され、前記ｒＡＡＶビリオンまたは医薬組成物のさらなる用量が前記対象に投与されない、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記医薬組成物が、１×１０ ^８～１×１０ ^１５個のベクター粒子、好ましくは、１×１０ ^１９～１×１０ ^１４個のベクター粒子または約１×１０ ^１０～約５×１０ ^１３個のベクター粒子を含む、項目３４または３５に記載の方法。
（項目３７）
前記眼血管新生に関連する疾患が、湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；網膜静脈閉塞から生じる網膜新生血管；糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全てのステージを含む）、近視性黄斑変性症、網膜静脈分枝閉塞症、半側網膜静脈閉塞症および網膜中心静脈閉塞症；未熟児網膜症；特発性脈絡膜新生血管；近視黄斑変性症ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管；網膜毛細血管拡張症；血管新生緑内障；硝子体出血；ブドウ膜炎、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および／または脈絡膜疾患、眼の腫瘍、角膜および虹彩新生血管が含まれるがこれらに限定されない網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管からなる群より選択される、項目２３から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記眼血管新生に関連する疾患が、湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；糖尿病性黄斑浮腫；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；糖尿病性網膜症；および近視性脈絡膜新生血管から選択され、好ましくは、前記眼血管新生に関連する疾患が、湿性加齢黄斑変性症である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
眼血管新生に関連する疾患の処置のための医薬の製造における使用のための、項目６から１３のいずれか一項に記載の核酸、項目１５に記載の医薬組成物、項目１６から２９のいずれか一項に記載のベクターまたは項目３２に記載の医薬組成物。
（項目４０）
前記ベクターが、ｒＡＡＶビリオンであり、眼内で、好ましくは、網膜下、脈絡膜上または硝子体内注射によって投与される、項目３９に記載の使用のためのベクター。
（項目４１）
眼血管新生に関連する疾患の処置における使用のための、項目６から１３のいずれか一項に記載の核酸、項目１４に記載の医薬組成物、項目１６から２９のいずれか一項に記載のベクターまたは項目３２に記載の医薬組成物。
（項目４２）
合成ＲＮＡを網膜細胞に送達するための方法であって、前記網膜細胞を、項目１から５のいずれか一項に記載の合成ＲＮＡと接触させるステップを含む、方法。
（項目４３）
異種核酸を網膜細胞に送達するための方法であって、前記網膜細胞を、項目６から１３のいずれか一項に記載の核酸と接触させるステップを含む、方法。

Claims

それぞれ、配列番号１９、１６、２２、２５、２８、１、４、７、１０、１３、３１、３４、３７、４０および４３から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むセンス鎖と、配列番号２０、１７、２３、２６、２９、２、５、８、１１、１４、３２、３５、３８、４１および４４から選択される配列と少なくとも９０％の同一性を含むアンチセンス鎖とを含む合成リボ核酸（ＲＮＡ）分子であって、好ましくは、配列番号１９と少なくとも９０％の配列同一性を含むセンス鎖と、配列番号２０と少なくとも９０％の配列同一性を含むアンチセンス鎖とを含む、合成ＲＮＡ分子。
前記ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の合成ＲＮＡ分子。
前記ＲＮＡが、配列ＣＴＣＧＡＧまたはそれと少なくとも９０％同一な配列を含むループを含むｓｈＲＮＡである、請求項１に記載の合成ＲＮＡ分子。
前記ＲＮＡが、配列番号４６または４７に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むＲＮＡを含む人工ｍｉＲＮＡであり、それぞれ、（Ｘ）_ｎが、配列番号１９、１６、２２、２５、２８、１、４、７、１０、１３、３１、３４、３７、４０および４３から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むセンス配列を含み、（Ｙ）_ｎが、配列番号２０、１７、２３、２６、２９、２、５、８、１１、１４、３２、３５、３８、４１および４４から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むアンチセンス配列を含む、請求項１に記載の合成ＲＮＡ分子。
５’および／または３’末端において、対合していないオーバーハング配列をさらに含み、前記オーバーハング配列が、反復塩基の配列を必要に応じて含み、前記反復塩基が、反復ウラシル（Ｕ）塩基を必要に応じて含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の合成ＲＮＡ。
（ｉ）請求項１から４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの合成ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
（ｉｉ）ＶＥＧＦ－Ａの活性を阻害する第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、（ｉ）および（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結される、請求項６に記載の核酸。
前記第１の抗血管新生ポリペプチドが、アフリベルセプトであり、好ましくは、前記アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列が、配列番号５０のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％同一な配列を含む、請求項７に記載の核酸。
（ｉ）および（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結される、請求項７または８に記載の核酸。
前記第１の抗血管新生ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、１つまたは複数の前記合成ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列とが、同じ発現制御配列の制御下にある、請求項９に記載の核酸。
前記発現制御配列が、遍在性プロモーターを含む、請求項１０に記載の核酸。
前記プロモーターが、ＣＡＧまたはＣＢＡプロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
配列番号６９、６８および７０のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９５％同一な配列を含む、請求項８に記載の核酸。
請求項１から４のいずれか一項に記載の合成ＲＮＡおよび／または請求項６から１３のいずれか一項に記載の核酸を含む、組成物。
薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である、請求項１４に記載の組成物。
請求項１から４のいずれか一項に記載の合成ＲＮＡ分子および／または請求項６から１３のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
発現プラスミドである、請求項１６に記載のベクター。
ウイルスベクターである、請求項１６または１７に記載のベクター。
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであり、好ましくは、前記ｒＡＡＶベクターが、血清型２、５もしくは８のＡＡＶカプシドまたはそれらのバリアントを含む、請求項１８に記載のベクター。
前記ｒＡＡＶが、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、カプシドタンパク質のＧＨループ中に共有結合的に挿入された７、８、９、１０または１１アミノ酸の長さを有する異種ペプチド挿入を含むカプシドタンパク質を含むカプシドを有し、前記ペプチド挿入が、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号７４）を含む、請求項１９に記載のベクター。
前記挿入ペプチドが、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号７４）のアミノおよび／またはカルボキシル末端において、１～３個のスペーサーアミノ酸（Ｙ_１～Ｙ_３）を有する、請求項２０に記載のベクター。
前記挿入ペプチドがＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号４９）である、請求項２０または２１に記載のベクター。
前記挿入の部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０とアミノ酸６１１との間の位置、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の対応する位置において、２つの隣接するアミノ酸間に位置する、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のベクター。
前記挿入の部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７に対応するアミノ酸とアミノ酸５８８に対応するアミノ酸との間、もしくはＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８８に対応するアミノ酸とアミノ酸５８９に対応するアミノ酸との間、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の対応する位置に位置する、請求項２０から２３のいずれか一項に記載のベクター。
前記カプシドタンパク質が、ＡＡＶ２のＶＰ１と比較して１つもしくは複数のアミノ酸置換を含む、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の１つもしくは複数の対応する置換を含む、請求項２０から２４のいずれか一項に記載のベクター。
前記カプシドタンパク質が、ＡＡＶ２のＶＰ１と比較して以下：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、１６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１ＬおよびＬ７３５Ｑ
のアミノ酸置換のうちの１つもしくは複数を含む、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の１つもしくは複数の対応する置換を含む、請求項２０から２５のいずれか一項に記載のベクター。
前記バリアントカプシドタンパク質が、ＡＡＶ２のＶＰ１と比較してＶ７０８Ｉアミノ酸置換を含む、または別のカプシドタンパク質中の対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２０から２６のいずれか一項に記載のベクター。
前記ｒＡＡＶが、配列番号４８と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、好ましくは、配列番号４８と少なくとも９５％同一なアミノ酸を含む、より好ましくは、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含むカプシドを有する、請求項２０から２７のいずれか一項に記載のベクター。
前記ｒＡＡＶが、配列番号６９、６４、６５、６６、６７、６８および７０のうちのいずれか１つに示される配列を含む異種核酸を含む、請求項２８に記載のベクター。
請求項１６から２９のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
請求項１６から２９のいずれか一項に記載のベクターを含む組成物。
薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である、請求項３１に記載の組成物。
対象における眼血管新生に関連する眼疾患、好ましくは、ＶＥＧＦ－Ａに関連する眼疾患を処置するための方法であって、請求項６から１３のいずれか一項に記載の核酸、請求項１５に記載の医薬組成物、請求項１６から２９のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３２に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
前記対象に、請求項３２に記載の医薬組成物が投与され、好ましくは、前記医薬組成物が、請求項２８または２９に記載のｒＡＡＶビリオンを含む、請求項３３に記載の方法。
前記ｒＡＡＶビリオンまたは医薬組成物が、前記対象に、眼内で、好ましくは、硝子体内注射、脈絡膜上注射または網膜下注射によって、好ましくは、単回硝子体内注射によって投与され、前記ｒＡＡＶビリオンまたは医薬組成物のさらなる用量が前記対象に投与されない、請求項３４に記載の方法。
前記医薬組成物が、１×１０^８～１×１０^１５個のベクター粒子、好ましくは、１×１０^１９～１×１０^１４個のベクター粒子または約１×１０^１０～約５×１０^１３個のベクター粒子を含む、請求項３４または３５に記載の方法。
前記眼血管新生に関連する疾患が、湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；網膜静脈閉塞から生じる網膜新生血管；糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全てのステージを含む）、近視性黄斑変性症、網膜静脈分枝閉塞症、半側網膜静脈閉塞症および網膜中心静脈閉塞症；未熟児網膜症；特発性脈絡膜新生血管；近視黄斑変性症ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管；網膜毛細血管拡張症；血管新生緑内障；硝子体出血；ブドウ膜炎、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および／または脈絡膜疾患、眼の腫瘍、角膜および虹彩新生血管が含まれるがこれらに限定されない網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管からなる群より選択される、請求項２３から３６のいずれか一項に記載の方法。
前記眼血管新生に関連する疾患が、湿性（新生血管、滲出型）加齢黄斑変性症；糖尿病性黄斑浮腫；網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫；糖尿病性網膜症；および近視性脈絡膜新生血管から選択され、好ましくは、前記眼血管新生に関連する疾患が、湿性加齢黄斑変性症である、請求項３７に記載の方法。
眼血管新生に関連する疾患の処置のための医薬の製造における使用のための、請求項６から１３のいずれか一項に記載の核酸、請求項１５に記載の医薬組成物、請求項１６から２９のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３２に記載の医薬組成物。
前記ベクターが、ｒＡＡＶビリオンであり、眼内で、好ましくは、網膜下、脈絡膜上または硝子体内注射によって投与される、請求項３９に記載の使用のためのベクター。
眼血管新生に関連する疾患の処置における使用のための、請求項６から１３のいずれか一項に記載の核酸、請求項１４に記載の医薬組成物、請求項１６から２９のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項３２に記載の医薬組成物。
合成ＲＮＡを網膜細胞に送達するための方法であって、前記網膜細胞を、請求項１から５のいずれか一項に記載の合成ＲＮＡと接触させるステップを含む、方法。
異種核酸を網膜細胞に送達するための方法であって、前記網膜細胞を、請求項６から１３のいずれか一項に記載の核酸と接触させるステップを含む、方法。