JP2024515777A - 植物調節エレメント及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、植物におけるＣＲＩＳＰＲ媒介標的遺伝子修飾に有用な新規合成核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）プロモーターを提供する。本発明はまた、修飾ゲノムを含む植物及び植物細胞の発育のためのガイドＲＮＡ及びノンコーディングＲＮＡの発現を駆動するｓｎＲＮＡプロモーターに使用するための方法及び組成物を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の参照
本出願は、２０２１年４月３０日に出願された米国仮出願第６３／１８２，２８８号及び２０２１年１２月３０日に出願された米国仮出願第６３／２９５，０６１号の利益を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の援用
「ＭＯＮＳ４９２ＷＯ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ」という名称のファイルに含まれる配列表は、３７キロバイト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）での計測）であり、２０２２年４月２８日に作成されたものであり、電子申請により本明細書と共に提出され、参照により本明細書に援用される。

本開示は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本開示は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム修飾のための非タンパク質コード低分子ＲＮＡの発現に有益な新規合成植物プロモーターを提供する。

部位特異的組換えは、バイオテクノロジー関連の幅広い分野に応用される可能性を有する。ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインを含むメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）により、ゲノム修飾が可能になる。メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、及びＴＡＬＥＮは、効果的かつ特異的であるが、これらの技術では、修飾のために選択されたゲノム部位ごとに１つ以上の構成要素を、タンパク質工学を介して生成する必要がある。クラスター化された規則的に間隔をあけられた短い回文反復ＣＲＩＳＰＲの適用の進歩により、迅速に操作できる利点を有するゲノム修飾方法が示されている。

クラスター化された規則的に間隔をあけられた短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、侵入したファージのエンドヌクレオチド切断を標的とする原核生物の適応免疫系を構成する。このシステムは、タンパク質成分（Ｃａｓ）と、Ｃａｓタンパク質をエンドヌクレオチド切断のための特定の遺伝子座に向けるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とで構成されている。このシステムは、哺乳動物、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫、細菌、酵母、及び植物のゲノムのエンドヌクレオチド切断で特定の遺伝子座を標的とするように操作することに成功している。

ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を転写するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写されることが好ましい。Ｕ６ ｓｎＲＮＡプロモーターなどのネイティブプロモーターは、多くの場合、ｇＲＮＡの発現を駆動するために使用される。多重標的化実験は、多くの場合、ｇＲＮＡをそれぞれ駆動する同じプロモーターに依存する。これは、複数のＵ６／ｇＲＮＡカセットを含むプラスミドをクローニングまたは維持するときに、カセット間の配列重複から生じる組換えイベントまたは欠失などの技術的問題を引き起こし得る。多様なＤＮＡ配列を有する複数のｓｎＲＮＡプロモーターを使用することにより、この技術的問題を軽減する助けとなる。したがって、本発明者らは、既知のネイティブＵ６ｓｎＲＮＡプロモーターとの配列相同性及び相互の配列相同性をほとんど有しない、新規合成ｓｎＲＮＡプロモーターを本明細書に開示する。これらの新規合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、植物細胞中で、ｇＲＮＡなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物の発現を駆動することができる。

一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１～１０のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列；（ｂ）配列番号１～１０のいずれかを含む配列；及び（ｃ）配列番号１～１０のいずれかの断片、からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む、合成核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）プロモーターを提供する。一実施形態では、合成ｓｎＲＮＡプロモーター配列は、配列番号１～１０のいずれかのＤＮＡ配列に対して少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する。別の実施形態では、合成ｓｎＲＮＡプロモーター配列は、配列番号１～１０のいずれかのＤＮＡ配列に対して少なくとも９５パーセントの配列同一性を有する。さらに別の実施形態では、合成ｓｎＲＮＡプロモーター断片は、遺伝子調節活性を含む。

本発明の別の態様は、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物を提供し、ここで、合成ｓｎＲＮＡプロモーターの配列は、（ａ）配列番号１～１０のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列；（ｂ）配列番号１～１０のいずれかを含む配列；及び（ｃ）配列番号１～１０のいずれかの断片、からなる群から選択され：ここで、合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、ｇＲＮＡを発現することができる。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、転写終結配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物はまた、クラスター化された規則的に間隔をあけられた、短い回文反復ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターをコードするＤＮＡ配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、合成ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。組換えＤＮＡ構築物の特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）にさらに作動可能に連結され得る。さらに、企図される組換えＤＮＡ構築物の特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られる）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、及びＭａｄ７からなる群から選択される。特定の実施形態では、構築物は、それぞれ長さが約２～１２００ｂｐである、隣接する左及び右の相同性アーム（ＨＡ）を含む。特定の実施形態では、相同性アームの長さは、約２３０～約１００３ｂｐである。

本発明の別の態様は、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーターと、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターと、を含む組換えＤＮＡ構築物を提供し、ここで、第１及び第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターの配列は、（ａ）配列番号１～１０のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列；（ｂ）配列番号１～１０のいずれかを含む配列；及び（ｃ）配列番号１～１０のいずれかの断片、からなる群から独立して選択され：ここで、断片は、ｇＲＮＡを発現することができる。特定の実施形態では、第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターとは異なる。特定の実施形態では、第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって発現される１つ以上のｇＲＮＡをコードする配列は、第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって発現される１つ以上のｇＲＮＡをコードする配列とは異なる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードする配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１６／０６１４８１に記載の１つ以上のｔＲＮＡをコードする配列をさらに含む。特定の実施形態では、構築物は、それぞれ長さが約２～１２００ｂｐである、隣接する左及び右の相同性アーム（ＨＡ）を含む。特定の実施形態では、相同性アームの長さは、約２３０～約１００３ｂｐである。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、転写終結配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物はまた、クラスター化された規則的に間隔をあけられた、短い回文反復ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターをコードするＤＮＡ配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムから選択される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、合成ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。組換えＤＮＡ構築物の特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）にさらに作動可能に連結され得る。さらに、企図される組換えＤＮＡ構築物の特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られる）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、及びＭａｄ７からなる群から選択される。

本発明の別の態様は、ノンコーディングＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物を提供し、ここで、合成ｓｎＲＮＡプロモーターの配列は、（ａ）配列番号１～１０のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列；（ｂ）配列番号１～１０のいずれかを含む配列；及び（ｃ）配列番号１～１０のいずれかの断片、からなる群から選択され、ここで、断片は、遺伝子調節活性を含む。いくつかの実施形態では、ノンコーディングＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ前駆体、成熟ｍｉＲＮＡ、デコイｍｉＲＮＡ（参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／００２９８４に記載）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ＲＮＡ（長さ２２～２６ｎｔ）及びそれをコードする前駆体、ヘテロクロマティックｓｉＲＮＡ（ｈｃ－ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、及び天然に存在するアンチセンスｓｉＲＮＡ（ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、２つ以上のノンコーディングＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のノンコーディングＲＮＡをコードする配列は、１つ以上のｔＲＮＡをコードする配列をさらに含む。

本発明のさらに別の態様は、ａ）第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーターと、ｂ）第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターと、を含む、組換えＤＮＡ構築物を含み：第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、（ａ）配列番号１～１０のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列；（ｂ）配列番号１～１０のいずれかを含む配列；及び（ｃ）配列番号１～１０のいずれかの断片、からなる群から選択され、断片は、遺伝子調節活性を含み、ノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されており；第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、（ａ）配列番号１～１０のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列；（ｂ）配列番号１～１０のいずれかを含む配列；及び（ｃ）配列番号１～１０のいずれかの断片、からなる群から選択され、断片は、遺伝子調節活性を含み、ノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されており、ここで、第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーターと第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターとは異なる。組換えＤＮＡ構築物の特定の実施形態では、第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーターをコードする配列及び第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターをコードする配列はそれぞれ、配列番号１～１０のいずれか、またはその断片を含み、ここで、断片は、遺伝子調節活性を含む。また、組換えＤＮＡ構築物が、配列番号１～１０、またはその断片からなる群から選択される１つ以上の追加の合成ｓｎＲＮＡプロモーターを指定する配列をさらに含む実施形態も企図され、ここで、断片は、遺伝子調節活性を含み、ノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結され、ここで、第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーター、第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーター、及び１つ以上の追加のｓｎＲＮＡプロモーターのそれぞれは異なる。特定の実施形態では、１つ以上の追加の合成ｓｎＲＮＡプロモーターを指定する組換えＤＮＡ構築物配列は、配列番号１～１０またはその断片からなる群から選択され、ここで、断片は、遺伝子調節活性を含む。さらに他の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、３、４、または５つの合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、植物細胞の染色体中の異なる選択された標的部位を標的とするｇＲＮＡであるノンコーディングＲＮＡを含む。他の企図される実施形態では、組換えＤＮＡは、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターをコードするＤＮＡ配列をさらに含む。さらなる実施形態では、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、クラスター化され、規則的に間隔をあけられた、短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、合成ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られる）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、及びＭａｄ７から選択される。

本発明の別の態様は、上記の組換えＤＮＡ構築物のいずれかを含む細胞を提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、植物細胞である。いくつかの実施形態では、植物細胞は、単子葉植物細胞である。他の実施形態では、植物細胞は、双子葉植物細胞である。さらに別の実施形態では、植物細胞は、トウモロコシ植物細胞、ダイズ植物細胞、ワタ植物細胞、ピーナッツ植物細胞、オオムギ植物細胞、オートムギ植物細胞、カモガヤ植物細胞、イネ植物細胞、モロコシ植物細胞、サトウキビ植物細胞、トールフェスク植物細胞、芝草植物細胞、コムギ植物細胞、アルファルファ植物細胞、キャノーラ植物細胞、キャベツ植物細胞、マスタード植物細胞、ルタバガ植物細胞、カブ植物細胞、ケール植物細胞、ブロッコリー植物細胞、カリフラワー植物細胞、コショウ植物細胞、マメ植物細胞、ササゲ植物細胞、ヒヨコマメ植物細胞、ヒョウタン植物細胞、レタス植物細胞、キュウリ植物細胞、メロン植物細胞、ニンジン植物細胞、トマト植物細胞、ダイコン植物細胞、ジャガイモ植物細胞、及び観賞用植物細胞からなる群から選択される。

配列の詳細な説明
配列番号１は、合成ｓｎＲＮＡプロモーター、Ｐ－ＧＳＰ２２６２のＤＮＡ配列である。

配列番号２は、合成ｓｎＲＮＡプロモーター、Ｐ－ＧＳＰ２２６８のＤＮＡ配列である。

配列番号３は、合成ｓｎＲＮＡプロモーター、Ｐ－ＧＳＰ２２６９のＤＮＡ配列である。

配列番号４は、合成ｓｎＲＮＡプロモーター、Ｐ－ＧＳＰ２２７２のＤＮＡ配列である。

配列番号５は、合成ｓｎＲＮＡプロモーター、Ｐ－ＧＳＰ２２７３のＤＮＡ配列である。

配列番号６は、Ｐ－ＧＳＰ２２６２に由来する、短縮バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーターＰ－ＧＳＰ２２６２＿ＴＲのＤＮＡ配列である。

配列番号７は、Ｐ－ＧＳＰ２２６８に由来する、短縮バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーターＰ－ＧＳＰ２２６８＿ＴＲのＤＮＡ配列である。

配列番号８は、Ｐ－ＧＳＰ２２６９に由来する、短縮バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーターＰ－ＧＳＰ２２６９＿ＴＲのＤＮＡ配列である。

配列番号９は、Ｐ－ＧＳＰ２２７２に由来する、短縮バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーターＰ－ＧＳＰ２２７２＿ＴＲのＤＮＡ配列である。

配列番号１０は、Ｐ－ＧＳＰ２２７３に由来する、短縮バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーターＰ－ＧＳＰ２２７３＿ＴＲのＤＮＡ配列である。

配列番号１１は、Ｚｅａ ｍａｙｓ亜種ｍｅｘｉｃａｎａユビキチン遺伝子由来のプロモーター、リーダー、及びイントロンからなるＥＸＰ、ＥＸＰ－Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：９のＤＮＡ配列である。

配列番号１２は、核標的化Ｃａｓ１２ａタンパク質、Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳをコードするＤＮＡ配列である。

配列番号１３は、３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｏｓ．ＬＴＰ：２のＤＮＡ配列である。

配列番号１４は、ガイドＲＮＡスペーサー、ＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２６９１のＤＮＡ配列である。

配列番号１５は、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２６９１のＤＮＡ配列である。

配列番号１６は、ガイドＲＮＡスペーサー、ＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿３１７０のＤＮＡ配列である。

配列番号１７は、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿３１７０のＤＮＡ配列である。

配列番号１８は、ゲノム編集の標的となるＺｅａ ｍａｙｓ ｂｒｏｗｎ ｍｉｄｒｉｂ ３（Ｂｍｒ３）ゲノム領域のＤＮＡ配列である。

配列番号１９は、配列番号１２によってコードされるＣａｓ１２ａ＿ＮＬＳのアミノ酸配列である。

配列番号２０は、ガイドＲＮＡスペーサー、ＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿９０のＤＮＡ配列である。

配列番号２１は、ガイドＲＮＡスペーサー、ＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２２７のＤＮＡ配列である。

配列番号２２は、ガイドＲＮＡスペーサー、ＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿３２７９のＤＮＡ配列である。

配列番号２３は、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿９０＿３２７９のＤＮＡ配列である。

配列番号２４は、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２２７＿３２７９のＤＮＡ配列である。

配列番号２５は、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２６９１＿２のＤＮＡ配列である。

配列番号２６は、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿３１７０＿２のＤＮＡ配列である。

配列番号２７は、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２６９１＿３１７０のＤＮＡ配列である。

配列番号２８は、ゲノム編集の標的となるＺｅａ ｍａｙｓ Ｚｍ７ゲノム領域のＤＮＡ配列である。

配列番号２９は、ガイドＲＮＡスペーサー、ＮＲ－Ｚｍ．７．１ｂのＤＮＡ配列である。

配列番号３０は、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．７．１ｂのＤＮＡ配列である。

配列番号３１は、ガイドＲＮＡスペーサー、ＮＲ－Ｚｍ．７．１ｃのＤＮＡ配列である。

配列番号３２は、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．７．１ｃのＤＮＡ配列である。

配列番号３３は、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－７．１ｃ＿７．１ｂのＤＮＡ配列である。

本明細書では、植物において活性を有する新規合成ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）プロモーターが提供される。これらの核内低分子ＲＮＡプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１～１０として提供される。これらの核内低分子ＲＮＡプロモーターは、植物組織におけるガイドＲＮＡなどのノンコーディングＲＮＡの発現に影響を与えることができ、したがって植物におけるノンコーディングＲＮＡをコードする作動可能に連結された配列の発現を調節することができる。また、提供された核内低分子ＲＮＡプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子を修飾、産生、及び使用する方法も提供される。また、本発明の核内低分子ＲＮＡプロモーターを含むトランスジェニック植物細胞、植物、植物部分、及び種子を含む組成物、ならびにこれらを調製し使用するための方法も提供する。

いくつかの実施形態では、配列番号１～１０から選択される核内低分子ＲＮＡプロモーターのバリアントが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１～１０のいずれかとして本明細書に提供される参照配列に対して最適にアラインしたときに、参照配列に対して、少なくとも約８５パーセントの同一性、少なくとも約８６パーセントの同一性、少なくとも約８７パーセントの同一性、少なくとも約８８パーセントの同一性、少なくとも約８９パーセントの同一性、少なくとも約９０パーセントの同一性、少なくとも約９１パーセントの同一性、少なくとも約９２パーセントの同一性、少なくとも約９３パーセントの同一性、少なくとも約９４パーセントの同一性、少なくとも約９５パーセントの同一性、少なくとも約９６パーセントの同一性、少なくとも約９７パーセントの同一性、少なくとも約９８パーセントの同一性、または少なくとも約９９パーセントの同一性を有し、本明細書に開示されるプロモーター活性を有するバリアントが提供される。配列番号１～１０のいずれかのバリアントは、塩基配列の活性、例えば塩基配列のプロモーター活性を有し得る。

いくつかの実施形態では、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約３２５、少なくとも約３５０、少なくとも約３７５、少なくとも約４００の連続ヌクレオチド、少なくとも約４２５、少なくとも約４５０、少なくとも約４７５、またはそれ以上の、本明細書に開示のプロモーター活性を有するＤＮＡ分子を含む配列番号１～１０から選択される核内低分子ＲＮＡプロモーターの断片が提供される。特定の実施形態では、遺伝子発現活性を有する、本明細書で提供される核内低分子ＲＮＡプロモーターの断片が提供される。出発プロモーター分子からそのような断片を産生する方法は、当技術分野でよく知られている。配列番号１～１０のいずれかの断片は、塩基活性の活性、例えば塩基配列のプロモーター活性を有し得る。

配列番号１～１０のいずれかに含まれる（例えば、内部もしくは５’欠失）プロモーターエレメントのいずれかに由来する組成物は、発現を改善または改変するために、当技術分野で知られている方法を用いて、例えば、発現に正もしくは負いずれかの効果を有するエレメントの除去、発現に正もしくは負の効果を有するエレメントの重複、及び／または発現に組織特異的もしくは細胞特異的な効果を有するエレメントの重複もしくは除去を含む方法により、産生することができる。ＴＡＴＡボックスエレメントまたはその同等配列及び下流配列が除去された、３’欠失からなる配列番号１～１０のいずれかに含まれるプロモーターエレメントのいずれかに由来する組成物を使用して、例えばエンハンサーエレメントを作製し得る。これらのエンハンサーエレメントは、他の合成またはネイティブのｓｎＲＮＡプロモーターに作動可能に連結して、発現を増強することができる。さらに欠失を行って、発現に正または負の効果を有する任意のエレメントを除去することができる。配列番号１～１０のいずれかに含まれるプロモーターエレメントのいずれか、及びそれに由来する断片またはエンハンサーを使用して、キメラ転写調節エレメント組成物を作製することができる。

いくつかの実施形態では、本開示は、新規合成ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）プロモーター、及びクラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）編集システムによる植物ゲノムの標的遺伝子修飾のためのガイドＲＮＡの発現を含む、その使用方法を提供する。例えば、本開示は、一実施形態において、本明細書に開示される合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセット及び１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ構築物を提供する。ＣＲＩＳＰＲシステムに標的ゲノムを修飾させるための方法も提供され、そのようなシステムの使用によって修飾された植物のゲノム相補体も提供される。したがって、本開示は、植物ゲノム内の遺伝子、遺伝子座、連結ブロック、及び染色体を挿入、除去、または修飾することが可能になるツール及び方法を提供する。

本開示は、別の実施形態において、本明細書に開示されるプロモーター及び非タンパク質コード低分子ＲＮＡ（ｎｐｃＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの発現カセットをコードするＤＮＡ構築物を提供する。これらの構築物は、ｎｐｃＲＮＡ分子の発現に有用である。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、侵入ファージのＤＮＡ及びＲＮＡのエンドヌクレオチド切断を標的とする原核生物における適応免疫系を構成する（Ｗｅｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ４６：３１１－３９，２０１２にて概説）。配列特異的な検出及び破壊のための外来核酸の標的化を低分子ＲＮＡに依存する、６つ型のＣＲＩＳＰＲシステム（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型）が知られている。細菌ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び短い回文反復が点在するゲノム標的配列（プロトスペーサー）を含むＣＲＩＳＰＲアレイ（複数可）である。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの場合、プロトスペーサー／リピートエレメントが、前駆体ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）分子に転写された後、トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子とｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ回文リピート間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる酵素切断が生じる。得られたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、スペーサーのコピー１つと、Ｃａｓヌクレアーゼと複合体を形成できる足場１つで構成される。次に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ｃｒＲＮＡスペーサー配列に相補的なＤＮＡ配列（プロトスペーサー）に向けられ、このＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体は、標的ＤＮＡを、両方の鎖の酵素的切断（二本鎖破断；ＤＳＢ）を介して、サイレンシングさせる。

ネイティブ細菌のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、外因性ＤＮＡの標的化切断に４つの分子構成要素：Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、ハウスキーピングＲＮａｓｅＩＩＩ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、及びトランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とする。後の２つの構成要素は、ｄｓＲＮＡ複合体を形成し、Ｃａｓ９に結合して、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ複合体を形成する。真核生物における標的化ゲノム修飾のために、このシステムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の２つの構成要素に単純化された。最初に真核生物系で行われた実験では、標的化ＤＮＡ切断を達成するためには、ＲＮａｓｅＩＩＩ構成要素が必要ではないことが判明した。Ｃａｓ９と、唯一の標的特異的構成要素としてｇＲＮＡを含む最小限の２構成要素システムにより、このＣＲＩＳＰＲシステムの標的化ゲノム修飾システムは、標的となる各ＤＮＡ部位での修飾のためのタンパク質操作を必要とするメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼなどの他の標的化プラットフォームよりもコスト効率が高く、柔軟性が高くなる。さらに、ｇＲＮＡの設計及び産生が容易であるため、ＣＲＩＳＰＲシステムには、標的化ゲノム修飾の適用において、いくつかの利点がもたらされる。例えば、１つ以上のゲノム標的部位用に設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、及び任意によりゲノムへ組み込むための外因性ＤＮＡ）は、１回の形質転換に多重化できるか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素の導入は、空間的及び／または時間的に分離できる。

本明細書で使用される場合、「ガイド核酸」または「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、標的ＤＮＡ配列に相補的である（及びハイブリダイズする）スペーサー配列と、Ｃａｓタンパク質に結合する足場配列とを含む核酸を意味する。いくつかの実施形態では、足場配列及びスペーサー配列は共有結合により連結しており、本明細書では「一本鎖ガイドＲＮＡ」（または「ｓｇＲＮＡ」）と呼ばれる１つのＲＮＡ転写物または分子として発現される。いくつかの実施形態では、足場配列及びスペーサー配列は、本明細書では「デュアルガイドＲＮＡ」（または「ｄｇＲＮＡ」）と呼ばれる、別個の転写物または分子として発現される。スペーサー配列は、足場配列の５’末端及び／または３’末端に共有結合または非共有結合のいずれかにより連結され得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含むが、ｔｒａｃｒＲＮＡは含まない。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列及び足場配列の両方を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの設計は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに基づいていてもよい。

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのアレイは、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーターから発現される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、２つ以上の足場スペーサー（及び／またはスペーサー－足場）配列（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の足場－スペーサー（及び／またはスペーサー－足場）配列）（例えば、足場－スペーサー－足場、例えば、スペーサー－足場－スペーサー、例えば、足場－スペーサー－足場－スペーサー－足場－スペーサー－足場－スペーサー－足場－スペーサー、例えば、スペーサー－足場－スペーサー－足場－スペーサー－足場－スペーサー－足場－スペーサー－足場など）に作動可能に連結させ得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡアレイは、ＷＯ／２０１６／０６１４８１に記載されているとおり、１つ以上のｔＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡアレイは、足場配列とスペーサー配列とを分離する１つ以上のｔＲＮＡを含む（例えば、足場－スペーサー－ｔＲＮＡ－足場－スペーサー、例えば、スペーサー－足場－ｔＲＮＡ－スペーサー－足場、例えば、足場－スペーサー－ｔＲＮＡ－足場－スペーサー－ｔＲＮＡ－足場－スペーサー－ｔＲＮＡ－足場－スペーサー－ｔＲＮＡ－足場－スペーサー、例えば、スペーサー－足場－ｔＲＮＡ－スペーサー－足場－ｔＲＮＡ－スペーサー－足場－ｔＲＮＡ－スペーサー－足場－ｔＲＮＡ－スペーサー－足場など）。いくつかの実施形態では、足場配列は、以下からなる群から選択される：Ｃａｓ１２ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ１２ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ１２ｃ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ１２ｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ１２ｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃ２ｃ１ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃ２ｃ３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ１３ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ１３ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ１３ｃ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ１３ｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ１Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ３’ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ３’’ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ４ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ５ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ６ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ７ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ８ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃａｓ１０ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｙ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｙ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｙ３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｅ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｅ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｃ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｃ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓａ５ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｎ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｍ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｍ３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｍ５ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｍ６ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｍｒ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｍｒ３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｍｒ４ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｍｒ５ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｍｒ６ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｂ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｂ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｂ３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｘ１０ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｘ１４ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｘ１５ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｘ１６ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｘ１７ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；ＣｓａＸ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｘ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｘ３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｆ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｆ３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；Ｃｓｆ４ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片；及びＣｓｆ５ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの反復配列またはその断片。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーターから発現されるガイドＲＮＡは、２つ以上のｃｒＲＮＡ配列（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のｃｒＲＮＡ配列）を含み得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列を分離する１つ以上のｔＲＮＡを含む（例えば、ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ、例えば、ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｃｒＲＮＡなど）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーターから発現されるガイドＲＮＡアレイは、２つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を含み得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を分離する１つ以上のｔＲＮＡを含む（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡなど）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーターから発現されるガイドＲＮＡアレイは、２つ以上のｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ（及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ）配列（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ（及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ）配列）（例えば、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ、例えば、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡアレイは、ｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを分離する１つ以上のｔＲＮＡを含む（例えば、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ、例えば、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ－ｔＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡなど）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーターから発現されるガイドＲＮＡは、アプタマー配列（例えば、ＭＳ２アプタマー）をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、アプタマー配列は、デアミナーゼを動員する。いくつかの実施形態では、アプタマー配列は、逆転写酵素を動員する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、１つまたは２つまで、またはそれ以上のアプタマー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアプタマー）を含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーターから発現されるガイドＲＮＡは、逆転写酵素のＲＮＡ鋳型をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、プライム編集ガイドＲＮＡ（「ＰｅｇＲＮＡ」）に作動可能に連結される。

Ｃａｓ９は、クラス２ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である。クラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９などの１成分エフェクタータンパク質に依存し、１つのｇＲＮＡ結合Ｃａｓタンパク質が、標的配列を認識して切断する。Ｃａｓ９は、そのガイドＲＮＡ結合部位に対して３’にあるＧ－リッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｋａｎｄｌｅｒｉａ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、及び／またはＯｌｓｅｎｅｌｌａ属に由来するＣａｓ９タンパク質であり得る。クラス２Ｃａｓエフェクタータンパク質の追加のファミリー：Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても知られる）、Ｃ２ｃ１、ＣａｓＸ及びＣａｓＹが発見されている（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５４２：２３７－２４１，２０１７）。

Ｃａｓ１２ａは、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムに属し、ｔｒａｃｒＲＮＡを含まない１つのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを利用する。Ｃａｓ１２ａシステムは、Ｔ－リッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する。Ｔ－リッチＰＡＭは、特にＡＴリッチゲノムを有する生物またはＡＴが豊富な目的領域でのゲノム編集での適用が可能になる。ＣＲＩＳＰＲアレイは、プロセシングを受けて、４２～４４ヌクレオチド長の短い成熟ｃｒＲＮＡとなる。各成熟ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドの直接反復足場で始まり、その後に２３～２５ヌクレオチドのスペーサー配列が続く。このｃｒＲＮＡの配置は、成熟ｃｒＲＮＡが２０～２４ヌクレオチドのスペーサー配列で始まり、その後に約２２ヌクレオチドの直接反復足場が続くＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの配置とは対照的である（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３：７５９－７７１，２０１５）。Ｃａｓ１２ａは、二本鎖ＤＮＡ分子を切断するときに千鳥状の切断を生じさせる。これは、平滑末端切断（Ｃａｓ９によって生成されるものなど）とは対照的である。細胞の核へ送達するための輸送ペプチドを含むＣａｓ１２ａコード配列の例は、配列番号１２として示され、配列番号１９として示されるタンパク質をコードする。

本発明で有用なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼとしては、限定されないが、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られる）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３’’、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４（ｄｉｎＧ）、Ｃｓｆ５及び／またはＭａｄ７ヌクレアーゼを挙げることができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃ２ｃ１０、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、及び／またはＣａｓ１４ｃエフェクタータンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、本発明で有用なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性部位（例えば、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ、例えば、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼドメインのＲｕｖＣ部位；例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインのＲｕｖＣ部位及び／またはＨＮＨ部位）中に変異を含み得る。ヌクレアーゼ活性部位中に変異を有し、したがって、もはやヌクレアーゼ活性を含まないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼは、一般に、「ｄｅａｄ」、例えば、ｄＣａｓ、例えば、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２ａと称される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性部位中に変異を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼドメインまたはポリペプチドは、変異のない同じＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、ニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼと比較して、活性の障害、または活性の減少を有し得る。近年、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ（ＣＡＳＴ）が発見され、特徴が明らかになった。ＣＡＳＴは、Ｔｎ７様トランスポザーゼサブユニットｔｎｓＢ、ｔｎｓＣ、及びｔｎｉＱで構成され、Ｖ－Ｋ型ＣＲＩＳＰＲエフェクターであるＣａｓ１２ｋは、部位指向性ＤＮＡ転移を触媒する。Ｃａｓ１２ｋは、部分的に相補的なノンコーディングＲＮＡ種であるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡと複合体を形成し、三部分からなるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在及びｃｒＲＮＡの可変部分と標的ＤＮＡとの間の相補性に基づいて、染色体転位部位を認識する。関連するトランスポザーゼ、ｔｎｓＢ、ｔｎｓＣ、及びｔｎｉＱは、保存された「左端」（ＬＥ）及び「右端」（ＲＥ）境界によってトランスポゾンを認識し、Ｃａｓ１２ｋによって認識される標的配列近く（優先的には、ＴＡジヌクレオチドの間）の染色体部位にトランスポゾンを挿入する。シアノバクテリア種Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ ｈｏｆｍａｎｎｉ（ＵＴＥＸ Ｂ２３４９）及びＡｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ（ＰＣＣ７１２２）に固有の２つの相同ＣＡＳＴシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での転位に機能することが示されている（Ｓｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６５（６４４８）：４８－５３，２０１９）。

ｇＲＮＡの発現戦略
本開示は、特定の実施形態において、合成ｓｎＲＮＡプロモーター（及びその機能的断片）と、１つ以上のガイド核酸分子をコードするＤＮＡ配列との新規組み合わせを提供する。本明細書で提供されるガイド核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせであり得る。

一実施形態では、形質転換細胞においてｇＲＮＡ（複数可）を構成的に発現させるために、合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、１つ以上のｇＲＮＡコード配列に作動可能に連結される。これは、例えば、いくつかの実施形態では、得られるｇＲＮＡ転写物が核内に保持され、したがって核プロセスをガイドするために細胞内に最適に位置する場合に望ましい可能性がある。これは、例えばいくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムの活性が低い場合、または標的部位の発見及び切断の頻度が低い場合にも望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、生殖細胞系などの特定の細胞型のプロモーターが、目的の所与の種について知られていない場合にも望ましい場合がある。

別の実施形態では、転写を駆動するために必要なシスエレメントを含む合成ｓｎＲＮＡプロモーターの断片を使用して、１つ以上のｇＲＮＡを発現することができる。配列番号１～５として示される、開示された全長合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、それぞれ長さが約５００ｂｐである。複数の合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む構築物は、追加の発現カセットが並行してクローン化されるため、大きくなり得る。これにより、安定性及び形質転換に影響を与える問題が発生し得る。したがって、特定の例では、短縮型合成ｓｎＲＮＡプロモーターがｇＲＮＡの転写を駆動する能力を保持している限り、構築物のサイズを減少させるために、合成ｓｎＲＮＡプロモーターを短縮してもよい。このような短縮型合成ｓｎＲＮＡプロモーターの例は、配列番号６～１０として示される。

異なる配列を有する複数の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）を利用して、典型的には配列反復に関連する構築物の安定性の問題を最小限に抑えることができ、また、同じ形質転換構築物中での複数のｇＲＮＡカセットのスタッキングを容易にするために利用することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）は、１つのｇＲＮＡの発現を駆動し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のｇＲＮＡのアレイの発現を駆動し得る。それぞれの個々のガイド配列は、同じ標的配列または異なる標的配列を標的とすることができる。この構成は、多重遺伝子操作（例えば、複数の遺伝子を標的にする）に適している。１つの転写物からの個々のガイドＲＮＡのプロセシングを促進するためのいくつかの戦略が当技術分野で記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）は、発現カセットが、１つ以上のｔＲＮＡ切断配列によって分離された少なくとも２つ以上のｇＲＮＡを含む、ｇＲＮＡアレイを駆動するために使用され得る（ＵＳ２０１９０３３０６４７）。ｔＲＮＡ切断配列には、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＺ及びＲＮａｓｅＥ（細菌）などの細胞の内因性ｔＲＮＡシステムと能動的に相互作用し、それによって切断される任意の配列及び／または構造モチーフが含まれる。これには、アクセプターステム、Ｄループアーム、Ｔ Ｐｓｉ Ｃループ、及び特定の配列モチーフなどの構造認識エレメントが含まれ得る。別の実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）は、１つ以上のリボザイム切断部位によって分離された２つ以上のｇＲＮＡを含むｇＲＮＡアレイを駆動するために使用され得る（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ ９：１０８８－１０９１，２０１６）。別の実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）は、１つ以上のＣｓｙ４リボヌクレアーゼ認識部位によって分離された２つ以上のｇＲＮＡアレイを含むｇＲＮＡアレイを駆動するために使用され得る（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３２（６）：５６９－５７６，２０１４）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）は、プライム編集ｇＲＮＡ（ＰＥｇＲＮＡ）の発現を駆動するために使用され得る。プライム編集は、ポリメラーゼと連携して働く核酸プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）（例えば、Ｃａｓ９）を（例えば、融合タンパク質の形態、または、ｎａｐＤＮＡｂｐとトランスで提供される形態で）使用して、標的のＤＮＡ部位に新しい遺伝情報を直接書き込むゲノム編集方法であり、プライム編集システムは、標的部位を指定するとともに、ガイドＲＮＡ上で（例えば、５’または３’末端において、またはガイドＲＮＡの内部部分において）操作した伸長（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）による置換ＤＮＡ鎖の形態での所望の編集の合成の鋳型となる、特殊なプライム編集（ＰＥ）ガイドＲＮＡ（「ＰＥｇＲＮＡ」）でプログラムされている（ＷＯ２０２０１９１２４８）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）は、ガイドＲＮＡと、ＤＮＡ合成鋳型を含む少なくとも１つの核酸伸長アームとを含むＰＥｇＲＮＡの発現を駆動するために使用され、ここで、核酸伸長アームは、ガイドＲＮＡの３’または５’末端に位置する。

別の実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）を使用して、ＲＮＡの細胞間移動を可能にするＲＮＡ移動性配列をさらに含む増強されたｇＲＮＡの発現を駆動させ得る。ＲＮＡ移動性配列は、花成時期遺伝子（Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｔｉｍｅ（ＦＴ）遺伝子）、ＢＥＬ５、ＧＡＩ、ｔＲＮＡ様モチーフ、またはＬｅＴ６などの植物遺伝子に由来する配列であってもよい（ＷＯ２０２１０４１００１）。

他の実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、成熟ｃｒＲＮＡ、前駆体ｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ断片、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、またはｔｒａｃｒＲＮＡ断片の発現を駆動するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）は、塩基編集などの他の形態のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集と適合するｇＲＮＡを駆動するために使用され得る（Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４，２０１６；Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５１：４６４－４７１，２０１７；Ｋｏｍｏｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｖｏｌ ３：Ｎｏ．８，２０１７；及びＲｅｅｓ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．１９（１２）：７７０－７８８，２０１８）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）は、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ ｈｏｆｍａｎｎｉ（ＳｈＣＡＳＴ）及びＡｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ（ＡｃＣＡＳＴ）に由来するものなどの、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼシステム（ＣＡＳＴ）に適合するｇＲＮＡを駆動するために使用され得る（Ｓｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６５（６４４８）：４８－５３，２０１９）。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）を使用して、１つ以上の非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｐｃＲＮＡ）の発現を駆動し得る。非タンパク質コードＲＮＡの非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ前駆体、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ＲＮＡ（２２～２６ｎｔ長）、及びそれをコードする前駆体、ヘテロクロマティックｓｉＲＮＡ（ｈｃ－ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、天然に存在するアンチセンスｓｉＲＮＡ（ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）及びｔＲＮＡが挙げられる。

ＣＲＩＳＰＲクラス２、ＩＩ型またはＶ型関連遺伝子の発現戦略
本開示は、例えば、少なくとも１つのＣａｓタンパク質によるエンドヌクレアーゼ切断のための任意の部位を標的とするために使用されるスペーサー配列を含むｇＲＮＡの転写を提供することにより、分子育種のために、配列特異的ＣＲＩＳＰＲ媒介切断に使用するための新規合成ｓｎＲＮＡプロモーター（及びその機能的断片）を提供する。特定の実施形態では、標的部位は、ゲノム標的部位である。いくつかの実施形態では、ゲノム標的部位は、ネイティブまたはトランスジェニックである。さらに、ＣＲＩＳＰＲシステムは、１つ以上のゲノム標的部位において、切断を触媒するようにカスタマイズさせ得る。

本開示の一態様は、標的部位（例えば、ゲノム標的部位）に相補的なスペーサー配列のコピーなど、１つ以上のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）をコードする１つ以上のカセットを含む発現構築物、及びＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする発現構築物を、植物細胞に導入して、植物細胞またはそのような細胞からなる植物が、その後有益な形質を呈するような方法で植物細胞を修飾することである。１つの非限定的な例では、形質は、収量の改善、生物的または非生物的ストレスに対する耐性、除草剤耐性、または農業作業における他の改善などの形質である。それに由来するそのような植物細胞を生成する能力は、本明細書に記載の形質転換構築物及びカセットを使用するＣＲＩＳＰＲシステムの導入に依存する。

ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする発現構築物は、プロモーターを含み得る。特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生調節プロモーター、または細胞周期調節プロモーターである。特定の企図されるプロモーターには、とりわけ、生殖系列細胞または生殖細胞中でのみ発現するプロモーターが含まれる。このような発生調節されたプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が発現する細胞のみにＣＲＩＳＰＲシステムの活性が制限されるという利点を有する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子修飾（例えば、染色体またはエピソームｄｓＤＮＡ切断）は、ある世代から次の世代へのゲノムの伝達に関与する細胞にのみ制限される。これは、ＣＲＩＳＰＲシステムの広範な発現に遺伝毒性がある場合、またはその他の望ましくない影響を有する場合には有用であり得る。このようなプロモーターの例としては、ＤＮＡリガーゼ、リコンビナーゼ、レプリカーゼなどをコードする遺伝子のプロモーターが挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡ構築物は、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を高レベルで発現する１つ以上の合成ｓｎＲＮＡプロモーターまたはその断片を含む。特定のゲノム配列が切断されて二本鎖破断が生じ、これが二本鎖切断修復経路によって修復されるように（これには、例えば、非相同末端結合、微小相同性媒介末端結合（ＭＭＥＪ）相同組換え、合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、またはそれによってネイティブ遺伝子座を破壊するそれらの組み合わせが挙げられ得る）、エンドヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲクラス２、ＩＩ型、またはＶ型関連タンパク質を特定のゲノム配列にガイドするｇＲＮＡを発現するＤＮＡ構築物は、特に有用であり得る。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、少なくとも１つのＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と、内因性標的部位に相補的なスペーサー配列のコピーを含む１つのｇＲＮＡとを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを含むことができる。このようなエンドヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼと比較して、その標的核酸に結合する能力を保持しているが、核酸分子を切断する能力が低下または消失しているドメインを含むことになる。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９は、標的ＤＮＡ鎖の１つにニックを生成する。いくつかの実施形態では、ｄｅａｄ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）として知られる触媒的に不活性なＣａｓ９は、ヌクレアーゼ活性をすべて欠いている。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ１２ａである。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ１２ａは、標的ＤＮＡ鎖のうちの１つ中にニックを生成する。いくつかの実施形態では、ｄｅａｄ Ｃａｓ１２ａ（ｄＣａｓ１２ａ）として知られる触媒的に不活性なＣａｓ１２ａは、すべてのＤＮａｓｅ活性を欠いている。

本開示はまた、生産性を改善するか、または別の有益な形質を提供するために、組織または細胞型に特異的な様式で、目的の遺伝子または遺伝子産物の発現及び／または活性を遺伝的に改変するための、ＣＲＩＳＰＲ媒介二本鎖ＤＮＡ切断の使用を提供し、ここで、目的の核酸は、本質的に内因性であってもトランスジェニックであってもよい。したがって、一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、目的遺伝子中の特定の部位での破壊を媒介するように操作される。目的の遺伝子としては、発現レベル／タンパク質活性の改変が望まれる遺伝子が挙げられる。これらのＤＮＡ切断イベントは、コード配列内、または遺伝子内の調節エレメント内に存在し得る。

本開示は、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びその同族ｇＲＮＡ）の細胞への導入を提供する。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の例としては、以下などのヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする天然及び操作された（例えば、コドン再設計などの修飾された）ヌクレオチド配列が挙げられる；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属由来のＣａｓ９；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ（ＦｎＣｐｆ１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）のＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても知られる）；Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｉ種、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ種、α－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、またはδ－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ由来のＣ２ｃ１；Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ及びδ－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ由来のＣａｓＸ；またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｅｒｆｅｌｄｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｖｏｇｅｌｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ、またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｋｏｍｅｉｌｉｂａｃｔｅｒｉａ由来のＣａｓＹ。

特定の実施形態では、コドン再設計されたＦｎＣｐｆ１及びＬｂＣｐｆ１ヌクレオチド配列及び発現カセットは、Ｕ．Ｓ．２０２０／００８００９６に開示される組換え核酸配列を含み、その内容及び開示は参照により本明細書に組み込まれる。

触媒的に活性なＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃ２ｃ１エンドヌクレアーゼ、ＣａｓＸエンドヌクレアーゼ、ＣａｓＹエンドヌクレアーゼ、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ）は、標的細胞に導入され得るか、または標的細胞によって産生され得る。本明細書に開示されているように、これを実施するために様々な方法が使用され得る。

ＣＲＩＳＰＲの一過性発現
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及び／またはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質成分をコードする１つ以上の発現カセットが細胞へ一時的に導入される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする、導入された１つ以上の発現カセットは、細胞を修飾するのに十分な量で提供されるが、意図された期間が経過した後、または１回以上の細胞分裂後は、持続しない。このような実施形態では、修飾細胞からｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする１つ以上の発現カセットを除去または隔離するためのさらなるステップは必要ない。本開示のさらに他の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ断片も、ｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする１つ以上の発現カセットとともに細胞に一時的に導入される。このような実施形態では、導入された二本鎖ＤＮＡ断片は、細胞を修飾するのに十分な量で提供されるが、意図された期間が経過後、または１回以上の細胞分裂後は持続しない。

別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするｍＲＮＡが細胞に導入される。このような実施形態では、ｍＲＮＡは翻訳されて、細胞を修飾するのに十分な量のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を産生する（本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）によって発現が駆動される少なくとも１つのｇＲＮＡの存在下において）が、意図された時間が経過後、または１回以上の細胞分裂後は持続しない。このような実施形態では、修飾された細胞からＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を除去または隔離するためのさらなるステップは必要ない。

本開示の一実施形態では、触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、本明細書に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）によって発現が駆動される少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、植物細胞への導入前にｉｎ ｖｉｔｒｏで調製される。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を調製する方法は、その種類及び特性に依存し、当業者には知られているであろう。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が大きく、単量体である場合、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の活性型は、細菌発現、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳、酵母細胞を介して、昆虫細胞中で、または当分野で知られている他のタンパク質生産技術によって生産できる。発現後、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は単離され、必要に応じてリフォールディングされ、精製され、任意によりＨｉｓタグなどの任意の精製タグを除去する処理が行われる。粗精製、部分精製、またはより完全に精製されたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が得られたら、そのタンパク質は、例えばエレクトロポレーション、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質でコーティングされた粒子による撃ち込み、化学的トランスフェクションまたは細胞膜を通って輸送される他のいくつか手段によって、植物細胞に導入され得る。タンパク質及び核酸を植物細胞に導入するための方法は、当技術分野でよく知られている。タンパク質は、活性タンパク質と核酸との組み合わせを送達できるナノ粒子を使用して送達することもできる。有効量のｉｎ ｖｉｖｏ活性が存在するように十分な量のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、適切なｇＲＮＡとともに導入されると、ゲノム内の標的配列が切断される。当業者が、不活性であるが生来のプロセシング機構によってｉｎ ｖｉｖｏ内で活性化されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を創出し得ることも認識され、このようなＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質も本開示によって企図される。

別の実施形態では、ｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を一時的に発現する構築物が創出され、植物細胞に導入される。さらに別の実施形態では、構築物は、所望のエピソームまたはゲノム標的部位（複数可）を効果的に修飾するために、十分な量のｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を産生する。例えば、本開示は、撃ち込み、エレクトロポレーション、化学的トランスフェクト、またはいくつかの他の手段によって植物細胞内に輸送することができる構築物の調製を企図する。このような構造は、いくつかの有用な特性を有し得る。例えば、一実施形態では、構築物は、一過性発現に十分な量で産生され、かつ精製され得るように、細菌宿主内で複製させ得る。別の実施形態では、構築物は、宿主内での構築物の選択を可能にする除草剤耐性遺伝子をコードすることができるか、または構築物は、植物内でのｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現を提供するための発現カセットを含むこともできる。さらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質発現カセットは、プロモーター領域、５’非翻訳領域、発現を補助するための任意のイントロン、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列の容易な導入を可能にする複数クローニング部位、及び３’ＵＴＲを含み得る。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質発現カセットのプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または植物細胞で発現する他のタイプのプロモーターであり得る。さらなる実施形態では、ｇＲＮＡ発現カセットは、本明細書に記載のｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）、ｇＲＮＡコード配列、及び転写を終結させる短いポリＴ領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ発現カセット内のプロモーターは、配列番号１～５から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターであろう。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ発現カセット内のプロモーターは、配列番号６～１０から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターであろう。いくつかの実施形態では、発現カセットの一方または各末端に固有の制限部位を含めることが有益であり得、これにより、線状発現カセットの産生及び単離が可能になり、その後、他の構築エレメントを含まなくてもよい。特定の実施形態では、非翻訳リーダー領域は、植物由来の非翻訳領域であり得る。発現カセットが単子葉植物細胞または双子葉植物細胞に形質転換またはトランスフェクトされる場合、植物由来であり得るイントロンの使用が企図される。

他の実施形態では、構築物中の１つ以上のエレメントは、エピソーム配列またはゲノム配列内に含まれる標的部位に相補的なスペーサーを含む。これにより、発現カセット内でのＣＲＩＳＰＲ媒介修飾が促進され、プロモーター及び導入遺伝子などのエレメントの除去及び／または挿入が可能になる。

別のアプローチでは、細菌またはウイルス構築物宿主を使用して、一過性発現構築物を植物細胞に導入することができる。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、一過性発現構築物を宿主植物細胞に導入するために使用できる１つの細菌構築物である。細菌、ウイルス、または他の構築物宿主系を使用する場合、一過性発現構築物は、宿主構築物系内に含まれる。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主系が使用される場合、一過性発現カセットは、１つ以上のＴ－ＤＮＡ境界に隣接し、バイナリー構築物にクローン化される。多くのそのような構築物系が、当技術分野で確認されている（Ｈｅｌｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００で概説されている）。

ｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲシステムのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質成分のうちの１つ以上が、植物細胞を修飾するのに十分な量で一時的に導入される実施形態では、修飾された植物細胞を選択する方法が使用され得る。このような方法の１つでは、選択可能マーカーを含む第２の核酸分子が、一過性ｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質とともに同時導入される。この実施形態では、同時導入されたマーカーは、標的部位においてマーカーを導入するための分子戦略の一部であり得る。例えば、同時導入されたマーカーは、ゲノム標的部位間に挿入することによって、標的遺伝子を破壊するために使用され得る。別の実施形態では、同時導入された核酸を使用して、トランスフェクトされた細胞を細胞選別または他のいくつかの手段によって単離できるように、視覚マーカータンパク質を産生することができる。さらに別の実施形態では、同時導入されたマーカーは、ランダムに組み込まれ得るか、または第２のｇＲＮＡ：ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質複合体を介して、一次ゲノム標的部位とは独立した部位に組み込まれるように配向させ得る。さらに別の実施形態では、同時導入された分子は、例えば、ゲノム標的部位（複数可）における、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、微小相同性媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同組換え、合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、またはそれらの組み合わせを含み得る二本鎖破断修復経路を介して特定の遺伝子座を標的とすることができる。上記の実施形態では、同時導入されたマーカーは、ｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に曝露された可能性が高く、したがってＣＲＩＳＰＲによって修飾された可能性が高い細胞を同定するまたは選択するために使用され得る。

ＣＲＩＳＰＲの安定した発現
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びその同族ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上の発現構築物が、植物細胞に安定して形質転換される。この実施形態において、形質転換構築物の設計は、いつ、どのような条件下でｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が発現されるかについての柔軟性をもたらす。さらに、形質転換構築物は、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の構成要素をコードする１つ以上の発現構築物を含む、及び／またはＣＲＩＳＰＲシステムによって修飾されている細胞株を単離するかまたは効率よく選択するための手段を提供する、選択可能マーカーまたは可視マーカーを含むように設計することができる。

細胞形質転換システムは、当技術分野において説明されており、その説明には、様々な形質転換構築物が含まれる。例えば、植物の形質転換の場合、２つの主要な方法としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換及び粒子銃撃ち込み媒介（例えば、バイオリスティクス）形質転換が挙げられる。いずれの場合も、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素をコードするヌクレオチド配列は、１つ以上の発現カセットを介して導入される。さらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質発現カセットは、プロモーター領域、５’非翻訳領域、発現を補助するための任意のイントロン、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列の容易な導入を可能にする複数クローニング部位、及び３’ＵＴＲを含み得る。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質発現カセットのプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生調節プロモーター、細胞周期調節プロモーター、または生殖系列特異的プロモーターであり得る。さらなる実施形態では、ｇＲＮＡ発現カセットは、本明細書に記載のｓｎＲＮＡプロモーター（またはその機能的断片）、ｇＲＮＡコード配列、及び転写を終結させる短いポリＴ領域を含み得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ発現カセット内のプロモーターは、配列番号１～５から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターであろう。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ発現カセット内のプロモーターは、配列番号６～１０から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターであろう。

粒子撃ち込みまたはプロトプラスト形質転換の場合、発現カセットは、単離された線状断片であり得るか、または細菌複製エレメント、細菌選択マーカー、もしくは他のエレメントを含み得るより大きい構築物の一部であり得る。１つ以上のｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質発現カセット（複数可）は、マーカーカセットに物理的に連結され得るか、またはマーカーカセットをコードする第２の核酸分子とミックスされ得る。いくつかの実施形態では、マーカーカセットは、形質転換細胞を効率よく選択できるようにする視覚的マーカーまたは選択可能マーカーを発現するために必要なエレメントから構成される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の場合、１つ以上の発現カセットは、隣接するＴ－ＤＮＡ境界に隣接してまたはそれらの間に存在して、バイナリー構築物内に含まれ得る。別の実施形態では、１つ以上の発現カセットは、Ｔ－ＤＮＡの外側にあってもよい。細胞内に１つ以上の発現カセットが存在することは、ポジティブまたはネガティブ選択レジメン（複数可）によって操作され得る。さらに、選択可能マーカーカセットは、同じＴ－ＤＮＡ境界内にあるかまたは境界に隣接してもよく、あるいはバイナリー構築物（例えば、２Ｔ－ＤＮＡシステム）上の第２のＴ－ＤＮＡ内の他のいずれかの場所にあってもよい。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムによって一時的にまたは安定して修飾された細胞は、未修飾細胞とともに持続される。細胞は、独立したクローン由来の系統に細分することも、独立して派生した植物を再生するために使用することもできる。このような細胞から再生された個々の植物またはクローン集団を使用して、独立して派生した系統を生成することができる。これらの段階のいずれかにおいて、分子アッセイを使用して、修飾された細胞、植物、または系統をスクリーニングすることができる。修飾された細胞、植物、または系統は、引き続き伝播するが、未修飾細胞、植物、または系統は廃棄される。いくつかの実施形態では、細胞内に活性なＣＲＩＳＰＲシステムが存在することは、プロセス全体の効率を確保するために不可欠である。

形質転換方法
細胞を形質転換またはトランスフェクトするための方法は、当技術分野でよく知られている。ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＤＮＡコーティング粒子を使用する植物形質転換方法は、当技術分野でよく知られており、これは本明細書において組み込まれる。本開示で使用するための宿主細胞の形質転換にとって好適である方法としては、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号；同第５，５９１，６１６号；同第５，６９３，５１２号；同第５，８２４，８７７号；同第５，９８１，８４０号；及び同第６，３８４，３０１号）、ならびにＤＮＡコーティング粒子の加速（米国特許第５，０１５，５８０号；同第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８８０号；同第６，１６０，２０８号；同第６，３９９，８６１号；及び同第６，４０３，８６５号）によるなど、ＤＮＡを細胞に導入できる実質的にあらゆる方法が挙げられると考えられる。このような技術を適用することにより、事実上あらゆる種の細胞を安定して形質転換させ得る。

形質転換細胞を選択するための様々な方法が記載されている。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質などの薬物耐性マーカーを利用して、カナマイシンに対する耐性を付与し得る、または５－エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼを使用して、グリホサートに対する耐性を付与し得る。別の実施形態では、カロテノイドシンターゼを使用して、視覚的に識別できる橙色色素を作出する。これらの３つの例示的なアプローチは、それぞれ、ＣＲＩＳＰＲによって形質転換及び／または修飾された細胞または植物またはその組織を単離するために効果的に使用することができる。

選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーをコードする核酸配列がゲノム標的部位に挿入される場合、そのマーカーを使用して、ＣＲＩＳＰＲまたはその活性の有無を検出することができる。これは、細胞がＣＲＩＳＰＲによって修飾され、ＣＲＩＳＰＲをもはや含まない遺伝子修飾細胞、またはそのような修飾細胞から再生された植物の回収が望まれる場合に有用であり得る。他の実施形態では、マーカーは、ゲノム標的部位に組み込まれるように意図的に設計され得、これにより、ＣＲＩＳＰＲとは関係なく修飾された細胞を追跡するために使用できるようになる。マーカーは、種子などにおいて視覚的に検出可能な表現型を提供する遺伝子であり得、これにより、ＣＲＩＳＰＲ発現カセットを保有する種子または欠損している種子を迅速に同定することが可能になる。

本開示は、ゲノム標的部位内の修復された二本鎖破断を有する細胞から植物を再生する手段を提供する。再生物は、さらなる植物を繁殖させるために使用できる。

本開示は、合成ｓｎＲＮＡプロモーター、及びＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（複数可）及びｇＲＮＡ／発現カセットとのそれらの組み合わせを含む、新規な植物形質転換構築物及び発現カセットをさらに提供する。本開示はさらに、ＣＲＩＳＰＲ媒介切断を使用して特異的に修飾された植物細胞、全植物、及び種子または胚を得る方法を提供する。本開示はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現構築物及びｇＲＮＡ発現カセットを含む新規植物細胞にも関する。

平滑末端オリゴヌクレオチドを使用した標的化
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａシステム）を利用して、平滑末端二本鎖ＤＮＡ断片の５’挿入を目的のゲノム標的部位に標的化することができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ媒介エンドヌクレアーゼ活性は、選択されたゲノム標的部位に二重鎖破断（ＤＳＢ）を導入することができ、微小相同性駆動の非相同末端結合ＤＮＡ修復などのＤＮＡ修復の結果、平滑末端二本鎖ＤＮＡ断片がＤＳＢに挿入される。いくつかの実施形態では、平滑末端二本鎖ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片の５’末端及び３’末端の両方において、ゲノム標的部位の切断部位における５’及び３’隣接配列に対応する１～１０ｂｐの微小相同性を有するように設計することができる。

分子育種におけるＣＲＩＳＰＲシステムの使用
いくつかの実施形態では、ゲノムの知識は、ゲノムの標的遺伝子改変のために利用される。少なくとも１つのｇＲＮＡは、ゲノムの少なくとも１つの領域を標的として、その領域をゲノムから破壊するように設計することができる。本開示のこの態様は、遺伝子改変に特に有用であり得る。得られた植物は、改変された遺伝子（複数可）に応じて、修飾された表現型または他の特性を有し得る。事前に特徴が明らかにされている変異対立遺伝子または導入された導入遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ媒介修飾のために標的とされ得、それにより、改良された変異体またはトランスジェニック系統の創出が可能になる。

別の実施形態では、欠失または破壊の標的となる遺伝子は、標的植物または植物細胞に以前に導入された導入遺伝子であり得る。これには、改善された型の導入遺伝子の導入が可能になる、または選択可能マーカーをコードする配列の破壊が可能になるという利点がある。さらに別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムによる破壊の標的となる遺伝子は、目的の他の導入遺伝子（複数可）と同じ構築物または発現カセット上に導入され、別の導入遺伝子と同じ遺伝子座に存在する少なくとも１つの導入遺伝子である。このタイプのＣＲＩＳＰＲ媒介修飾が追加配列の欠失または挿入をもたらし得ることは、当業者は理解している。したがって、特定の実施形態では、欠失が生じた複数の植物または植物細胞を生成し、標準技術を使用してそのような植物または植物細胞をスクリーニングし、ＣＲＩＳＰＲ媒介修飾後のゲノムの改変が最小である特定の植物または植物細胞を同定することが好ましい場合がある。このようなスクリーニングでは、遺伝子型及び／または表現型の情報が利用され得る。このような実施形態では、残りの導入遺伝子（複数可）を無傷のままにして、特定の導入遺伝子を破壊してもよい。これにより、望ましくない導入遺伝子を含まずに、望ましい導入遺伝子を含む新規トランスジェニック系統を創出する必要がなくなる。

別の態様では、本開示は、植物のゲノムの特定の部位に目的のＤＮＡ断片を挿入するための方法を含み、目的のＤＮＡ断片は、植物のゲノム由来であるか、または植物に対して異種である。この開示により、核酸（例えば導入遺伝子）スタッキング（例えばメガ遺伝子座）のためにゲノムの特定の領域を選択または標的化することが可能になる。したがって、ゲノムの標的領域は、少なくとも１つの表現型形質に関連する目的のハプロタイプへの少なくとも１つの導入遺伝子の連結を示す可能性があり、また、結果として、導入遺伝子のスタッキング及びトランスジェニック形質の組み込みを促進するための連結ブロックを発生させること、及び／または従来の形質の組み込みも可能にしながら、連結ブロックを発生させることになり得る。

形質の組み込みにおけるＣＲＩＳＰＲシステムの使用
ＣＲＩＳＰＲ媒介切断を介した、少なくとも１つのゲノム標的部位への目的のＤＮＡ断片の指向性挿入により、同じ部位または異なる部位のいずれかにおいて、目的の複数の核酸（例えば、形質スタック）を標的とした組み込みを、植物のゲノムに追加できるようになる。標的化させた組み込みのための部位は、基礎となる育種価値、その位置における導入遺伝子の性能、その位置における基礎となる組換え率、その連結ブロックにおける既存の導入遺伝子、または他の要因の知識に基づいて選択することができる。スタックされた植物が組み立てられると、育種パイプラインで進展されている生殖質との交雑のための形質ドナーとして使用でき、または育種パイプラインで直接進展される。

本開示は、少なくとも１つの目的核酸を少なくとも１つの部位に挿入するための方法を含み、目的の核酸は、ＱＴＬもしくは対立遺伝子などの植物のゲノムに由来するか、またはトランスジェニック起源である。したがって、ゲノムの標的領域は、（米国特許出願公開第２００６／０２８２９１１号に記載のとおり）少なくとも１つの表現型形質に関連する目的のハプロタイプに対する少なくとも１つの導入遺伝子の連結、導入遺伝子のスタッキング及びトランスジェニック形質の組み込みを促進するための連結ブロックの発生、ＱＴＬまたはハプロタイプのスタッキングと従来の形質の組み込みを促進するための連結ブロックの発生などを示し得る。

本開示の別の実施形態では、複数の固有のｇＲＮＡを使用して、ゲノム配列情報の知識と当該技術分野で説明されているカスタムｇＲＮＡを設計する能力を利用することによって、１つの染色体上に含まれる１つの連結ブロック内の複数の遺伝子座を修飾することができる。非標的対立遺伝子を含む遺伝子座の上流にあるゲノム標的部位に特異的な、またはそのゲノム標的部位に向けることができるｇＲＮＡは、必要に応じて設計または操作される。非標的対立遺伝子を含む標的遺伝子座の下流にあるゲノム標的部位に特異的な、またはそのゲノム標的部位に向けることができる第２のｇＲＮＡも設計または操作される。ｇＲＮＡは、標的対立遺伝子を含む非標的遺伝子座と相同性のないゲノム領域を補完するように設計され得る。いずれのｇＲＮＡも、上記の方法のうちの１つを使用して、細胞に導入され得る。

標的化組み込みを実施できる能力は、ｇＲＮＡ：ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の作用に依存する。この利点により、少なくとも１つのゲノム修飾を含む、植物または細胞などの目的の植物を操作するための方法が提供される。

カスタムｇＲＮＡをＣＲＩＳＰＲシステムで利用して、少なくとも１つの形質ドナーを生成して、カスタムゲノム修飾イベントを創出し、それを植物など、少なくとも１つの第２の目的の植物と交雑させる。ここで、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質送達は、ゲノム編集に使用する、目的のｇＲＮＡと結合させ得る。他の態様では、１つ以上の目的の植物が、ＣＲＩＳＰＲシステム及び指向性挿入のための少なくとも１つの目的の二本鎖ＤＮＡ断片で直接形質転換される。この方法は、植物の配偶子など、様々な細胞、組織、及び発育の種類において実施され得ることが認識されている。本明細書に記載されているエレメントのうちの１つ以上が、減数分裂特異的プロモーターなど、特定の細胞、組織、植物部分及び／または発育段階に特異的なプロモーターの使用と組み合わされ得ることがさらに予想される。

さらに、本開示は、ゲノム内にすでに存在するトランスジェニックエレメントを欠失または破壊の標的とすることを企図する。これにより、例えば、導入遺伝子の改良型の導入、選択可能マーカーの除去が可能になる。さらに別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ媒介切断による破壊の標的となる遺伝子は、目的の他の導入遺伝子（複数可）と同じ構築物または発現カセット上に導入され、別の導入遺伝子と同じ遺伝子座に存在する少なくとも１つの導入遺伝子である。

一態様では、本開示は、細胞内の目的の遺伝子座を修飾するための方法を提供し、本方法は、（ａ）ＤＮＡ配列内の少なくとも１つの目的の遺伝子座を同定することと；（ｂ）ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、配列番号１～１０から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む発現カセット及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された植物発現可能なプロモーターを含む発現カセットを細胞に導入することであって、ここで、ｇＲＮＡ及び／またはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、一時的にまたは安定して発現される、導入することと；（ｄ）目的遺伝子座を構成する、またはそれに隣接するＤＮＡにおけるＣＲＩＳＰＲ媒介修飾について細胞をアッセイすることと；（ｅ）細胞またはその子孫細胞を、目的の遺伝子座に修飾を含むものとして同定することと、を含む。

別の態様は、細胞内の複数の目的の遺伝子座を修飾するための方法を提供し、本方法は、（ａ）ゲノム内の複数の目的の遺伝子座を同定することと；（ｂ）ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号１～１０から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む複数の発現カセットを少なくとも１つの細胞に導入することであって、合成ｓｎＲＮＡプロモーターは独立して選択され、少なくとも１つの発現カセットは、本開示によるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された植物発現可能なプロモーターを含み、細胞は、ゲノム標的部位を含み、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、一時的または安定的に発現し、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ媒介切断事象を含む修飾された遺伝子座または複数の遺伝子座を創出する、導入することと；（ｄ）目的の各遺伝子座を構成する、またはそれに隣接するＤＮＡ中のＣＲＩＳＰＲ媒介修飾について細胞をアッセイすることと；（ｅ）目的の遺伝子座に修飾されたヌクレオチド配列を含む細胞またはその子孫細胞を同定することと；を含む。

本開示は、本開示による２つ以上のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質による目的の遺伝子座の逐次修飾をさらに企図する。このような第１のＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム修飾の作用によって追加された遺伝子または他の配列は、第２のＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム修飾の作用によって保持され得るか、さらに修飾され得るか、または除去され得る。

本開示は、以下などの作物植物における目的の遺伝子座を修飾するための組成物及び方法を含む；トウモロコシ（トウモロコシ：Ｚｅａ ｍａｙｓ ｓｕｂｓｐ．ｍａｙｓ）、トウモロコシの品種（フラワーコーン（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｖａｒ．ａｍｙｌａｃｅａ）、ポップコーン（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｖａｒ． ｅｖｅｒｔａ）、デントコーン（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｖａｒ．ｉｎｄｅｎｔａｔａ）、フリントコーン（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｖａｒ．ｉｎｄｕｒａｔｅ）、スイートコーン（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｖａｒ．ｓａｃｃｈａｒａｔａ 及びＺｅａ ｍａｙｓ ｖａｒ．ｒｕｇｏｓｅ）、ワクシーコーン（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｖａｒ．ｃｅｒａｔｉｎａ）、アミロメイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ポッドコーン（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｖａｒ．ｔｕｎｉｃａｔａ Ｌａｒｒａｎａｇａ ｅｘ Ａ．Ｓｔ．Ｈｉｌ．）、ｓｔｒｉｐｅｄ ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃａ）；大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）；綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ；Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐ．）；落花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）；大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）；エンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）；カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）；イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、インディカ種とジャポニカ種を含む）；モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）；サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．）；トールフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）；芝草種（例えば、種：Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ、Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ ｓｅｃｕｎｄａｔｕｍ）；小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）；アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）；Ｂｒａｓｓｉｃａ属のメンバー、これらに限定されないが、キャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ及びＢｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、アブラナ属のメンバー（例えば種：チンゲンサイ（Ｂ．ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ））、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｖａｒ．ｇｌａｂｒａ）、サイシン（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ．ｏｌｅｉｆｅｒａ）、コマツナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ．ｐｅｒｖｉｒｉｄｉｓ、白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ．ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）、カブ（ｒａｐｉｎｉ）（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｖａｒ．ｒａｐｉｆｅｒａ）、タアサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ．ｎａｒｉｎｏｓａ）、カブ（ｔｕｒｎｉｐ）（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ．ｒａｐａ）、ｙｅｌｌｏｗ ｓａｒｓｏｎ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ．ｔｒｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ）、白菜、カブ（ｔｕｒｎｉｐ）、カブ（ｒａｐｉｎｉ）、コマツナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ（ｓｙｎ．Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、Ｍａｌｌｏｒｃａ ｃａｂｂａｇｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｂａｌｅａｒｉｃａ）、Ａｂｙｓｓｉｎｉａｎ ｍｕｓｔａｒｄまたはＡｂｙｓｓｉｎｉａｎ ｃａｂｂａｇｅ、バイオディーゼル（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）の製造に使用される、ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｍｕｓｔａｒｄ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｃａｂｂａｇｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ．ｆｒｕｔｉｃｕｌｏｓａ）、Ｓｔ Ｈｉｌａｒｉｏｎ ｃａｂｂａｇｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｈｉｌａｒｉｏｎｉｓ）、インディアンマスタード、ブラウンマスタード及びリーフマスタード、Ｓａｒｅｐｔａ ｍｕｓｔａｒｄ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、セイヨウアブラナ、キャノーラ、ルタバガ（スウェーデン（ｓｗｅｄｅ）、スウェーデンカブ（ｓｗｅｄｅ ｔｕｒｎｉｐ）、スウェーデンカブ（Ｓｗｅｄｉｓｈ ｔｕｒｎｉｐ））（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ｂｒｏａｄｂｅａｋｅｄ ｍｕｓｔａｒｄ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｒｉｎｏｓａ）、クロガラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）、ケール、キャベツ、ｃｏｌｌａｒｄ ｇｒｅｅｎｓ、ブロッコリー、カリフラワー、カイラン、芽キャベツ、コールラビ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ｔｅｎｄｅｒ ｇｒｅｅｎ、コマツナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｐｅｒｖｉｒｉｄｉｓ）、ブラウンマスタード（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ）、ｓｅｖｅｎｔｏｐ ｔｕｒｎｉｐ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｅｔｉｃｅｐｓ）、Ａｓｉａｎ ｍｕｓｔａｒｄ（Ｂｒａｓｓｉｃａ．ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉｉ）、ブロッコリー（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）；コショウ（例えば、種：クロコショウ、ホワイトペッパーとグリーンペッパー（Ｐｉｐｅｒ ｎｉｇｒｕｍ）、クベバ（Ｐｉｐｅｒ ｃｕｂｅｂａ）、ヒハツ（Ｐｉｐｅｒ ｌｏｎｇｕｍ）、ヒハツモドキ（Ｐｉｐｅｒ ｒｅｔｒｏｆｒａｃｔｕｍ）、Ｖｏａｔｓｉｐｅｒｉｆｅｒｙ（Ｐｉｐｅｒ ｂｏｒｂｏｎｅｎｓｅ）、Ａｓｈａｎｔｉ ｐｅｐｐｅｒ（Ｐｉｐｅｒ ｇｕｉｎｅｅｎｓｅ）、バナナペッパー、ピーマン、カイエンペッパー、ハラペーニョ、Ｆｌｏｒｉｎａ ｐｅｐｐｅｒ、（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍの栽培品種）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍの栽培品種、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ、及びＣａｐｓｉｃｕｍ ｂａｃｃａｔｕｍ）、及びｄａｔｉｌ ｐｅｐｐｅｒ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅの栽培品種）；マメ科植物種（例えば、ソラマメ（ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ）またはソラマメ（ｆａｖａ ｂｅａｎ）（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）、インゲン豆；例えば、ピントビーンズ、インゲンマメ、ブラックビーン、Ａｐｐａｌｏｏｓａ ｂｅａｎ及びインゲンマメ、及び他の多く（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、テパリービーン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｃｕｔｉｆｏｌｉｕｓ）、ベニバナインゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｕｎａｔｕｓ）、別名Ｐ．デュモサス、１９９５年に別の種として認識された（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｐｏｌｙａｎｔｈｕｓ）、モスビーン（Ｖｉｇｎａ ａｃｏｎｉｔｉｆｏｌｉａ）、アズキ（Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）、ケツルアズキ（Ｖｉｇｎａ ｍｕｎｇｏ）、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）、バンバラ豆（Ｂａｍｂａｒａ ｂｅａｎまたはｇｒｏｕｎｄ－ｂｅａｎ）（Ｖｉｇｎａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、タケアズキ（Ｖｉｇｎａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ）、ササゲ；また、ｂｌａｃｋ－ｅｙｅｄ ｐｅａ、ｙａｒｄｌｏｎｇ ｂｅａｎ及びその他を含む（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）、ヒヨコマメ（ｃｈｉｃｋｐｅａまたは ｇａｒｂａｎｚｏ ｂｅａｎ）（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、グラスピー（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、キュウコンエンドウ（Ｌａｔｈｙｒｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）、フジマメ（Ｌａｂｌａｂ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）、シカクマメ（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）、キマメ（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ）、ハッショウマメ（Ｍｕｃｕｎａ ｐｒｕｒｉｅｎｓ）、グアー豆（Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂａ）、タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｎｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）、ナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｇｌａｄｉａｔａ）、ホースグラム（Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ）、ザッショクノボリフジ（Ｌｕｐｉｎｕｓ ｍｕｔａｂｉｌｉｓ）、ルピナス豆（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）；ウリ科のメンバー（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ、例えば、属名：ｓｑｕａｓｈ、ｐｕｍｐｋｉｎ、ズッキーニ、いくつかのｇｏｕｒｄ類（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ユウガオ（Ｌａｇｅｎａｒｉａ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｃｏｌｏｃｙｎｔｈｉｓなどのＣｉｔｒｕｌｌｕｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、様々なメロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｔｕｌｉｆｅｒｕｓ）；ほうれん草（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ）；ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ ｓｕｂｓｐ．ｓａｔｉｖｕｓ）；トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）；タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ｌ．）；ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｒａｐｈａｎｉｓｔｒｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｓａｔｉｖｕｓ）；ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）；観賞用植物；油糧作物、例えば、大豆、キャノーラ、油糧種子菜種、アブラヤシ、ひまわり、オリーブ、トウモロコシ、綿実、落花生、亜麻仁、ベニバナ、及びココナッツ。

ゲノム修飾には、修飾された連結ブロック、２つ以上のＱＴＬの連結、２つ以上のＱＴＬの連結の破壊、遺伝子挿入、遺伝子置換、遺伝子変換、遺伝子の欠失または破壊、トランスジェニックイベント選択、トランスジェニック形質ドナー選択、導入遺伝子の置換、または少なくとも１つの目的の核酸の標的化挿入が含まれ得る。

定義
提供される定義及び方法は、本開示を定義し、当業者が本開示を実施する際の指針となる。特に断りのない限り、用語は、関連分野の当業者による従来の用法に従って理解されるべきである。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７；Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１５ ２２４７；及びＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７にも見い出され得る。３７ＣＦＲ§１．８２２に規定されているＤＮＡ塩基の命名法が使用される。

本明細書で使用する場合、「合成ヌクレオチド配列」または「人工ヌクレオチド配列」とは、自然界で生じることが知られていないか、または天然に生じないヌクレオチド配列である。本発明の遺伝子調節エレメントは、合成ヌクレオチド配列を含む。好ましくは、合成ヌクレオチド配列は、天然配列に対して拡張した相同性をほとんどまたは全く共有しない。この文脈における拡張した相同性とは、一般に、１００％の配列同一性が約２５ヌクレオチドの連続配列を超えて拡張していることを指す。

本出願における「単離されたＤＮＡ分子」、または等価の用語もしくは表現への言及は、ＤＮＡ分子が、単独で、または他の組成物と組合せて存在するが、その自然環境内ではないものであることを意味するように意図されている。例えば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列等のような、生物のゲノムのＤＮＡ内で天然に見出される核酸エレメントは、当該エレメントが生物のゲノム内にあり、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にある限りは、「単離された」とは見なされない。ただし、これらのエレメントの各々、及びこれらのエレメントの下位部分は、当該エレメントが生物のゲノム内になく、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内で「単離されている」ものである。一実施形態では、「単離された」という用語は、そのネイティブ状態または天然状態で通常はＤＮＡ分子に隣接するいくつかの核酸から少なくとも部分的に分離されているＤＮＡ分子を指す。したがって、例えば組換え技術の結果として、通常は関連しない調節配列またはコード配列に融合されたＤＮＡ分子は、本明細書では単離されたものとみなされる。そのような分子は、宿主細胞の染色体に組み込まれるか、または他のＤＮＡ分子と共に核酸溶液中に存在する場合であっても、単離されたと見なされ、すなわち、これらは、ネイティブ状態ではない。本開示の目的において、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノム内に挿入されるか、または染色体外構築物内に存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが、細胞の形質転換に使用されるプラスミドもしくは同様の構造内に存在しても、植物もしくは細菌のゲノム内に存在しても、または植物もしくは細菌に由来する組織、後代、生物学的試料、もしくは商品生産物の中に検出可能量で存在しても、単離されたヌクレオチド配列であると見なされる。

「異種ＤＮＡ分子」とは、ＤＮＡ分子が、作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列に対して異種であることを意味する。

本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、第２のＤＮＡ分子に連結した第１のＤＮＡ分子を指し、ここで、第１及び第２のＤＮＡ分子は、第１のＤＮＡ分子が第２のＤＮＡ分子の機能に影響するよう配置される。２つのＤＮＡ分子は、単一の連続したＤＮＡ分子の一部である場合もそうでない場合もあり、隣接する場合もそうでない場合もある。例えば、プロモーターが細胞内の目的のＤＮＡ分子の転写を調節する場合、このプロモーターは、ＤＮＡ分子と作動可能に連結されている。例えば、リーダーは、ＤＮＡ配列の転写または翻訳に影響を及ぼすことができる場合、ＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。

本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ分子」とは、人間の介入なしには天然に一緒に生じないであろうＤＮＡ分子の組合せを含むＤＮＡ分子である。例えば、組換えＤＮＡ分子とは、互いに対して異種である少なくとも２つのＤＮＡ分子から構成されているＤＮＡ分子、自然界に存在するＤＮＡ配列から逸脱するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、合成ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、または遺伝子形質転換もしくは遺伝子編集によって宿主細胞のＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子であってもよい。

本明細書で使用する場合、「配列同一性」という用語は、２つの最適にアラインメントしたポリヌクレオチド配列または２つの最適にアラインメントしたポリペプチド配列が同一である程度を指す。最適な配列アラインメントは、２つの配列、例えば、参照配列ともう１つの配列とを手動でアラインメントして、適切な内部ヌクレオチド挿入、欠失、またはギャップを伴った配列アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を最大化することによって作出される。本明細書で使用する場合、「参照配列」という用語は、配列番号１～１０として提供されるＤＮＡ配列を指す。

本明細書で使用する場合、「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」または「同一性％」という用語は、同一性の割合に１００を掛けたものである。参照配列に対して最適にアラインメントした配列についての「同一性の割合」は、最適アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を、参照配列内のヌクレオチド総数、例えば、全長の参照配列全体のヌクレオチド総数で割ったものである。故に、本発明の１つの実施形態は、本明細書で配列番号１～１０のいずれかとして提供される参照配列に対して最適にアラインメントした場合に、参照配列に対して少なくとも約８５パーセントの同一性、少なくとも約８６パーセントの同一性、少なくとも約８７パーセントの同一性、少なくとも約８８パーセントの同一性、少なくとも約８９パーセントの同一性、少なくとも約９０パーセントの同一性、少なくとも約９１パーセントの同一性、少なくとも約９２パーセントの同一性、少なくとも約９３パーセントの同一性、少なくとも約９４パーセントの同一性、少なくとも約９５パーセントの同一性、少なくとも約９６パーセントの同一性、少なくとも約９７パーセントの同一性、少なくとも約９８パーセントの同一性、少なくとも約９９パーセントの同一性、または少なくとも約１００パーセントの同一性を有する配列を含む、ＤＮＡ分子を提供する。さらに特定の実施形態では、配列番号１～１０のいずれかに対して同一性パーセントを有する配列は、それが由来する出発配列が有するプロモーター活性を呈するものとして定義され得る。配列番号１～１０のいずれかと同一性パーセントを有する配列は、「最小プロモーター」をさらに含み得、これは、転写の基礎レベルを提供し、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ複合体を認識し、結合するためのＴＡＴＡボックスまたは同等の配列で構成される。本発明によれば、プロモーター、プロモーターバリアント、またはプロモーター断片は、既知のプロモーターエレメント、すなわち、ＴＡＴＡボックス及び他の既知の転写因子結合部位モチーフなどのＤＮＡ配列特性の存在について分析され得る。このような公知のプロモーターエレメントの識別情報は、当業者により、元のプロモーターと同様の発現パターンを有するプロモーターのバリアントを設計するために使用され得る。

「ゲノム」という用語は、核内に見出される染色体ＤＮＡのみでなく、細胞の細胞内成分（例えば、ミトコンドリアまたは色素体）内に見出される細胞小器官ＤＮＡも包含する。

本明細書で使用される場合、「ゲノム編集」または「編集」という用語は、部位特異的様式でのヌクレオチド配列の任意の修飾を指す。本開示において、ゲノム編集技術としては、エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヘリカーゼ、及びそれらの任意の組み合わせの使用が挙げられる。一態様では、「修飾」は、シチジンまたはデオキシシチジンからそれぞれウリジンまたはデオキシウリジンへの加水分解的脱アミノ化を含む。いくつかの実施形態では、配列特異的編集システムは、アデニンデアミナーゼを含む。一態様では、「修飾」は、アデニンまたはアデノシンの加水分解的脱アミノ化を含む。一態様では、「修飾」は、アデノシンまたはデオキシアデノシンからそれぞれイノシンまたはデオキシイノシンへの加水分解的脱アミノ化を含む。一態様では、「修飾」は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００のヌクレオチドの挿入を含む。別の態様では、「修飾」は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００のヌクレオチドの欠失を含む。さらなる態様では、「修飾」は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００のヌクレオチドの逆位を含む。さらに別の態様では、「修飾」は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００のヌクレオチドの置換を含む。さらに別の態様では、「修飾」は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００のヌクレオチドの重複を含む。いくつかの実施形態では、「修飾」は、核酸配列における「Ａ」の「Ｃ」、「Ｇ」または「Ｔ」への置換を含む。いくつかの実施形態では、「修飾」は、核酸配列における「Ｃ」の「Ａ」、「Ｇ」または「Ｔ」への置換を含む。いくつかの実施形態では、「修飾」は、核酸配列における「Ｇ」の「Ａ」、「Ｃ」または「Ｔ」への置換を含む。いくつかの実施形態では、「修飾」は、核酸配列における「Ｔ」の「Ａ」、「Ｃ」または「Ｇ」への置換を含む。いくつかの実施形態では、「修飾」は、核酸配列における「Ｃ」の「Ｕ」への置換を含む。いくつかの実施形態では、「修飾」は、核酸配列における「Ｇ」の「Ａ」への置換を含む。いくつかの実施形態では、「修飾」は、核酸配列における「Ａ」の「Ｇ」への置換を含む。いくつかの実施形態では、「修飾」は、核酸配列における「Ｔ」の「Ｃ」への置換を含む。

本明細書で使用される場合、「標的部位」とは、標的化した修飾のために選択されたＤＮＡ配列内に位置する、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質システムが結合し、及び／または活性を発揮するヌクレオチド配列（例えば、プロトスペーサー及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ））を指す。標的部位は、遺伝子性であっても非遺伝子性であってもよい。標的部位は、細胞の染色体、エピソーム、遺伝子座、またはゲノム内の任意の他のＤＮＡ分子（染色体、葉緑体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなど）上にあってもよい。標的部位は、細胞のゲノムにおける内因性部位であり得るか、あるいは、標的部位は、細胞にとって異種であり得、したがって、細胞のゲノム中に天然に存在しないものであり得るか、または標的部位は、自然界で存在する場所と比較して、異種ゲノム位置で見い出すことができる。

本明細書で使用する場合、「ゲノム標的部位」とは、標的化修飾のために選択された宿主ゲノム内に位置する標的部位（例えば、プロトスペーサー及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ））を指す。

本明細書で使用される場合、「プロトスペーサー」とは、ｇＲＮＡ中のスペーサー配列との相補的塩基対形成によってガイドされる、ＣＲＩＳＰＲシステムによって標的とされ得る短いＤＮＡ配列（１２～４０ｂｐ）を指す。

本明細書で使用される場合、「微小相同性」とは、異なるポリヌクレオチド分子において塩基の同じ短い配列（１～１０ｂｐ）が存在することを指す。

本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」とは、特定の植物のコドン使用の偏りを利用するために修飾されたポリヌクレオチド配列を指す。修飾されたポリヌクレオチド配列は、依然として元の配列と同じ、または実質的に同様のポリペプチドをコードするが、特定の植物においてより高い頻度で見出されるコドンヌクレオチドトリプレットを使用する。

本明細書で使用される場合、「非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｐｃＲＮＡ）」は、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を指し、これは、前駆体低分子非タンパク質コードＲＮＡであるか、もしくは完全にプロセシングされた非タンパク質コードＲＮＡである、タンパク質に翻訳されない機能的ＲＮＡ分子である。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（またはタンパク質コード領域）の翻訳開始コドンの上流または５’に位置する核酸配列を指し、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ及び他のタンパク質（転写因子を処理する）の認識及び結合に関与する。「植物プロモーター」は、植物細胞中で機能するネイティブまたは非ネイティブプロモーターである。構成的プロモーターは、植物の発育を通じて植物のほとんどまたはすべての組織中で機能する。組織、器官、または細胞に特異的なプロモーターは、それぞれ特定の組織、器官、または細胞型中でのみまたは主に発現する。プロモーターは、特定の組織、植物部分、または細胞型中で、「特異的に」発現するのではなく、植物の１つの細胞型、組織、または植物部分において、植物の他の部分と比較して「増強された」発現、すなわちより高いレベルの発現を示し得る。時間的に調節されるプロモーターは、例えば概日リズムに関連する遺伝子の場合のように、植物の発育の特定の期間中または一日の特定の時間帯にのみまたは主に機能する。誘導性プロモーターは、例えば化学化合物（化学誘導物質）による内因性または外因性の刺激の存在に応答して、または環境、ホルモン、化学、及び／または発生シグナルに応答して、作動可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現する。誘導性プロモーターまたは調節プロモーターには、例えば、光、熱、ストレス、洪水または干ばつ、植物ホルモン、損傷、または、エタノール、ジャスモン酸塩、サリチル酸、毒性緩和剤などの化学物質によって調節されるプロモーターが含まれる。

本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、作動可能に連結された第２のポリヌクレオチド配列の転写を開始することができる少なくとも第１のポリヌクレオチド配列、及び任意により第２のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写終結配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。

回文配列は、一方の鎖の５’から３’で読んでも、二重らせんを形成する相補鎖の３’から５’で読んでも同じである核酸配列である。ヌクレオチド配列がその逆相補配列と等しい場合、そのヌクレオチド配列は回文であると言われる。回文配列は、ヘアピンを形成し得る。

いくつかの実施形態では、本開示の特定の実施形態を説明し、特許請求するために使用される、成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表す数字は、場合によっては「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるものとする。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、値が、その値を決定するために使用される装置または方法の平均標準偏差を含むことを示すために使用される。いくつかの実施形態では、書面による説明及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって、解釈されるべきである。本開示のいくつかの実施形態の広範な範囲を示す数値範囲及びパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載される数値は、実施される限り正確に報告される。本開示のいくつかの実施形態で提示される数値は、それぞれの試験測定で見つかった標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む場合がある。本明細書中の値の範囲の列挙はその範囲に入る各別々の値を個々に言及する省略法として働くと単に意図される。本明細書に別段の指示がない限り、個々の値は、あたかも本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態において、特定の実施形態を記載する文脈において（特に以下の請求項のうちの特定の文脈において）使用される「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語、ならびに類似する参照物は、別段具体的に指摘されない限り、単数及び複数の両方をカバーすると解釈され得る。いくつかの実施形態では、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される「または」という用語は、選択肢のみを参照することが明示的に示されている場合、または選択肢が相互に排他的でない場合を除き、「及び／または」を意味するために使用される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」「有する（ｈａｖｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、オープンエンドの連結動詞である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」など、これらの動詞の１つ以上のいずれの語形または時制もまたオープンエンドである。例えば、１つまたは複数のステップを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、任意の方法は、それらの１つまたは複数のステップをのみ保持することに限定されず、他のリストされないステップもカバーし得る。同様に、１つまたは複数の特色を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、任意の組成物またはデバイスは、それらの１つまたは複数の特色をのみ保持することに限定されず、他のリストされない特色もカバーし得る。

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別様が示されない限り、または文脈によって別様が明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行され得る。任意の及びすべての例、または本明細書におけるある特定の実施形態に関して提供される例示的な文言（例えば「等の」）の使用は、本開示をより明らかにすることを単に意図し、特許請求の範囲に記載されない限り、本開示の範囲に対する限定をもたらさない。本明細書のいかなる言葉も、本開示の実施にとって必須として任意の請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。

本明細書に開示される本開示の代替の要素または実施形態のグループ化は限定として解釈されるべきでない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーまたは本明細書に記載の他の要素と組み合わせて、参照及び特許請求することができる。グループの１以上のメンバーは、利便性または特許性の理由から、グループに含めること、またはグループから除くことが可能である。

本開示を詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲で定義される本開示の範囲から逸脱せずに、修飾、変形、及び同等な実施形態が可能であることは明らかであろう。さらに、本開示における実施例はすべて非限定的な例として提供されることが理解されるべきである。

以下の実施例は、本開示の実施形態を実証するために含まれる。当業者であれば、本開示の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態に多くの変更を加えても、同様または類似の結果が得られることを理解されたい。より具体的には、同一または類似の結果が達成される限り、化学的及び生理学的の両方に関連する特定の作用物質が、本明細書に記載される作用物質に置き換えられてもよいことが明らかであろう。当業者に明確な全てのこうした類似の置換及び修正は、添付の特許請求の範囲により定義される本開示の趣旨、範囲、及び概念の範囲内にあるとみなされる。

実施例１
ｇＲＮＡを発現させるためのプロモーターの合成
新規の合成転写調節エレメントは、アルゴリズム法によって設計された合成発現エレメントである。本発明の合成プロモーターエレメントは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子などの核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）分子の転写をもたらす。設計された合成ｓｎＲＮＡプロモーターエレメントは、自然界に存在する任意の既知の核酸配列に対して拡張した相同性を有しないものの、天然に存在するｓｎＲＮＡプロモーターと同様に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列の転写に影響を与える。本発明の完全長合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、相互に配列同一性をほとんど共有せず；約３８パーセントの同一性～約４７パーセントの同一性の範囲である。合成ｓｎＲＮＡプロモーターの短縮バリアントも産生された。短縮型合成ｓｎＲＮＡプロモーターも、互いに配列同一性をほとんど共有せず；約４１～約５１パーセントの同一性の範囲である。合成ｓｎＲＮＡプロモーター間の同一性パーセントが低いため、プロモーター間での組換えの可能性が低くなり、合成ｓｎＲＮＡプロモーターが、複数のＲＮＡ発現カセットのスタッキングにとって理想的になる；ここで、各カセットは、異なる合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む。以下の実施例でさらに説明するように、完全長合成ｓｎＲＮＡプロモーター及び短縮型合成ｓｎＲＮＡプロモーターの両方が、ｇＲＮＡの発現を駆動する能力を示した。以下の表１は、異なる合成ｓｎＲＮＡプロモーター、対応する短縮型バリアント（「＿ＴＲ」で示す）、及び各合成ｓｎＲＮＡプロモーターのそれぞれの長さを示す。

実施例２
トランスフェクトされたトウモロコシ葉プロトプラスト中での合成ｓｎＲＮＡプロモーターの分析
トウモロコシの葉のプロトプラストは、構成的プロモーターによって駆動されるＣａｓ１２ａエンドヌクレアーゼを発現させるための発現カセット；及び合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動されるｇＲＮＡを発現させるための第２の発現カセットを含むプラスミド構築物でトランスフェクトされる。

プラスミド構築物は、２つの導入遺伝子カセットを含む当技術分野で公知の方法を使用して構築され、第１の導入遺伝子カセットは、核標的化Ｃａｓ１２ａタンパク質の発現に使用され、それはＥＸＰ、ＥＸＰ－Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：９（配列番号１１）を含み、それはコード配列、Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳ（配列番号１２）に５’で作動可能に連結され、それは核標的化Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳタンパク質（配列番号１９）をコードし、５’で３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｏｓ．ＬＴＰ：２（配列番号１３）に作動可能に連結され；第２の導入遺伝子カセットは、配列番号１～１０からなる群から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含み、それは５’でガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２６９１（配列番号１５）に作動可能に連結され、それはガイドＲＮＡスペーサー、ＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２６９１（配列番号１４）を含む。ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２６９１は、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼによって、ｂｒｏｗｎ ｍｉｄｒｉｂ ３（Ｂｍｒ３）ゲノム配列（配列番号１８として示される）内を切断するように設計されている。ｂｒｏｗｎ ｍｉｄｒｉｂ変異は、トウモロコシ中で最も早期に報告されたものの１つである。ｂｒｏｗｎ ｍｉｄｒｉｂ変異を含む植物は、葉が４～６枚になった時から、葉の中肋に赤褐色の色素沈着を呈する。これらの変異は、植物のリグニン組成及び消化率を変えることが知られており、したがってコーンサイレージの育種における主要な候補となる。Ｂｍｒ３遺伝子は、リグニン生合成に関与する酵素Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）をコードする（Ｖｉｇｎｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７，４０７－４１６）。

トウモロコシ葉プロトプラストは、当技術分野で知られているものと同様のＰＥＧベースのトランスフェクション法を使用してトランスフェクトされる。合成ｓｎＲＮＡプロモーターの各々の有効性を評価するために、トランスフェクトされたプロトプラスト細胞の集団に由来する単離されたゲノムＤＮＡから、切断部位領域を含むＤＮＡ断片の増幅を可能にするプライマーを使用して、アンプリコン断片を生成する。アンプリコン断片の配列をアラインして、切断部位領域におけるＤＮＡの欠失などの変異を含む任意の断片配列を同定する。このような変異の存在は、合成ｓｎＲＮＡプロモーターがｇＲＮＡの発現を駆動する能力を示している。

実施例３
トランスフェクトされたトウモロコシ葉プロトプラスト中での２つの合成ｓｎＲＮＡプロモーターの分析
トウモロコシ葉プロトプラストは、構成的プロモーターによって駆動されるＣａｓ１２ａエンドヌクレアーゼを発現させるための発現カセット；及びそれぞれ合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動される２つの異なるｇＲＮＡを発現させるための２つの発現カセットを含むプラスミド構築物でトランスフェクトされる。

プラスミド構築物は、３つの導入遺伝子カセットを含む当技術分野で公知の方法を使用して構築され、第１の導入遺伝子カセットは、核標的化Ｃａｓ１２ａタンパク質の発現に使用され、ＥＸＰ、ＥＸＰ－Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：９（配列番号１１）を含み、それはコード配列、Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳ（配列番号１２）の５’に作動可能に連結され、それは核標的化Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳタンパク質（配列番号１９）をコードし、３’ＵＴＲ、Ｔ－Ｏｓ．ＬＴＰ：２（配列番号１３）に５’で作動可能に連結され；第２の導入遺伝子カセットは、配列番号１～１０からなる群から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含み、それは５’でガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２６９１（配列番号１５）に作動可能に連結され、それはガイドＲＮＡスペーサー、ＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２６９１（配列番号１４）を含み；第３の導入遺伝子カセットは、配列番号１～１０からなる群から選択される第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーター（第２の導入遺伝子カセットで使用される合成ｓｎＲＮＡプロモーターとは異なる）を含み、それは５’でガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿３１７０（配列番号１７）に作動可能に連結され、それはガイドＲＮＡスペーサー、ＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿３１７０（配列番号１６）を含む。ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２６９１及びｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿３１７０は、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼによって、ｂｒｏｗｎ ｍｉｄｒｉｂ ３（Ｂｍｒ３）ゲノム配列（配列番号１８として示される）内を切断するように設計されている。

トウモロコシ葉プロトプラストは、当技術分野で知られているものと同様のＰＥＧベースのトランスフェクション法を使用してトランスフェクトされる。構築物スタック中の合成ｓｎＲＮＡプロモーターの各々の有効性を評価するために、トランスフェクトされたプロトプラスト細胞の集団に由来する単離されたゲノムＤＮＡから、両方の切断部位領域を含むＤＮＡ断片の増幅を可能にするプライマーを使用して、アンプリコン断片を生成する。切断部位の各々で検出された変異または約４８０塩基対の欠失は、合成プロモーターの各々が、それぞれのｇＲＮＡの発現を駆動する能力を示している。

実施例４
細胞のゲノムに標的化二本鎖破断を導入
この実施例は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、または他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとともに提示された場合に、ｇＲＮＡ発現を駆動して、細胞のゲノムに標的化二本鎖破断を行うための合成ｓｎＲＮＡプロモーター配列の使用を示す。

配列番号１～１０として示される、本発明の合成ｓｎＲＮＡプロモーター及び短縮型バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、植物細胞中でのｇＲＮＡ発現を駆動するために使用することができる。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとともに細胞の核に提示された場合、ｇＲＮＡのスペーサー領域に相補的な配列を含む選択された標的領域で、ＤＮＡ破断が生じる。

必要な成分を植物細胞に導入できる複数の手段がある。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に５’で作動可能に連結された合成ｓｎＲＮＡプロモーターまたは短縮型合成ｓｎＲＮＡプロモーター、及び転写を終結させる３’ポリＴストレッチを含むＤＮＡ断片から発現され得る。あるいは、ｇＲＮＡをコードする配列をプラスミド構築物にクローニングしてもよい。プラスミド構築物は、植物由来のプロトプラストをトランスフェクトするために使用される構築物であってもよく、または構築物は、植物細胞を安定に形質転換するために使用されるバイナリー植物形質転換構築物であってもよい。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、または他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、タンパク質として、またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、または他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを発現するために使用される異種ＤＮＡを介して、植物細胞に導入され得る。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、または他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、細胞の核内でエンドヌクレアーゼの切断がより効率よく生じるようにするために、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。

植物細胞は、粒子撃ち込みによってトランスフェクトできる。この場合、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、または他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをタンパク質として、あるいは、任意により、５’から３’ＵＴＲに動作可能に連結された少なくとも１つのＮＬＳを含む、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、または他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをコードするコード配列に対して５’で作動可能に連結されたイントロンに対して、５’で作動可能に連結された、植物発現可能なプロモーターを含むＤＮＡ断片として、導入できる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、転写を終了するために、３’ポリＴストレッチも含むｇＲＮＡをコードする配列に対して、５’で作動可能に連結された合成ｓｎＲＮＡプロモーターまたは短縮型合成ｓｎＲＮＡプロモーター（配列番号１～１０）を含む異種ＤＮＡ断片で細胞に導入することができる。プロトプラスト細胞はまた、上記と同じ試薬を使用して、トランスフェクトすることができる。

プロトプラスト細胞は、１つまたは２つのプラスミド構築物を使用してトランスフェクトすることもできる。こうした方法の１つは、上記の実施例２に記載の２つの構築物が使用され、第１の構築物は、ｇＲＮＡを発現させるための導入遺伝子カセットを含み、第２の構築物は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、または他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを発現させるために使用される導入遺伝子カセットを含む。あるいは、ｇＲＮＡ導入遺伝子カセット、及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２、または他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ導入遺伝子カセットの両方を、トランスフェクションに使用する１つの構築物中に含めることもできる。

植物細胞を安定して形質転換するには、ｇＲＮＡ発現カセット、及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、または他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ発現カセットの両方を、１つのバイナリー植物形質転換プラスミド構築物に含めることができる。あるいは、２つの構築物を使用して植物細胞を同時形質転換することもでき、第１の構築物は、ｇＲＮＡ発現カセットを含み；第２の構築物は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ発現カセットを含む。

導入遺伝子カセットを植物のゲノムに取り込まずにＤＮＡ中において二本鎖破断を誘導するために、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、または他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ発現カセットを、カセットを構成した構築物（複数可）から線状断片として切り出すことができる。発現カセット及び平滑末端ＤＮＡ断片は、粒子撃ち込みによって植物細胞に送達できる。撃ち込みを受けた細胞が誘導されて、カルスが形成される。次に、カルスは、全植物を形成するために使用される。

細胞のゲノムに導入された結果生じる破断は、オリゴＤＮＡ断片の導入に使用できる；または、エラーが発生しやすい非相同末端結合によって配列を改変または破壊させ得る。

実施例５
平滑末端二本鎖ＤＮＡ断片の組み込みによるゲノム修飾
この例では、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとともに提示された場合に、合成ｓｎＲＮＡプロモーター配列を使用して、ｇＲＮＡ発現を駆動し、平滑末端の二本鎖ＤＮＡ断片を、選択された標的部位に組み込む方法を示す。

相補的オリゴヌクレオチドは、プレアニーリングされて、平滑末端の二本鎖ＤＮＡ断片を形成する。ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ発現カセットを含むＤＮＡ断片及び構築物は、植物プロトプラストに同時トランスフェクトされる。オリゴヌクレオチドは、ゲノム標的部位中の切断部位にある、対応する５’及び３’隣接配列に対して、約３つの塩基対の微小相同領域を含むように、または微小相同領域を含まないように設計できる。微小相同領域は、ゲノム標的部位での微小相同駆動の非相同末端結合のメカニズムを介して、平滑末端の二本鎖ＤＮＡ断片の組み込みを促進し得る。

ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを発現するには、１つまたは２つの構築物が使用され得る。１つの構築物では、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９発現カセットの両方が、１つのプラスミド構築物にクローン化される。２つの構築物が望ましい場合、第１の構築物は、ｇＲＮＡ発現カセットを含み、第２の構築物は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを発現するためのカセットを含むことになる。ｇＲＮＡ発現カセットは、配列番号１～１０として示される、本発明の合成ｓｎＲＮＡプロモーターまたは短縮型バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーターのうちの１つを含むことになる。

プロトプラストトランスフェクションの場合、ｇＲＮＡ発現カセット及びＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ発現カセットを含む構築物（複数可）は、平滑末端の二本鎖ＤＮＡ断片とともに同時トランスフェクトされる。平滑末端の二本鎖ＤＮＡ断片の組み込みの検出は、標的部位組み込みの周囲の領域の増幅、及び高分解能キャピラリー電気泳動を使用したアンプリコンの検出、及びアンプリコンの直接的配列決定によって、実施され得る。

平滑末端ＤＮＡ断片を選択された標的部位に組み込み、安定に改変された植物を得るために、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ発現カセットを、カセットを構成する構築物（複数可）から線状断片として切り出すことができる。発現カセット及び平滑末端ＤＮＡ断片は、粒子撃ち込みによって植物細胞に送達することができる。撃ち込みを受けた細胞が誘導されて、カルスを形成する。次に、カルスは、全植物を形成するために使用される。次いで、再生された植物は、植物のゲノムにＤＮＡ断片を含む植物を同定するために、増幅及び配列決定などの当技術分野で知られている方法を使用してアッセイされる。

実施例６
ｇＲＮＡ多重化による複数の固有のゲノム部位の標的化
他のゲノム工学プラットフォームと比較した場合のＣＲＩＳＰＲシステムの主な利点は、個別の固有のゲノム標的部位に向けられた複数のｇＲＮＡを、個別の構成要素として送達して標的化を実現できることである。あるいは、個別の固有のゲノム標的部位に向けられた複数のｇＲＮＡを１つの発現構築物内で多重化して、標的化を実現することもできる。複数の標的化エンドヌクレオチド切断を必要とし得る適用の例には、トランスジェニックイベントからのマーカー遺伝子の除去が含まれる。ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、トランスジェニックインサートから選択マーカーを除去し、これにより、目的の遺伝子（複数可）を残すことができる。

このようなＣＲＩＳＰＲシステムが有用であり得る適用のもう１つの例は、複数の標的化エンドヌクレオチド切断が必要な場合、例えば、量的形質の背後にある原因遺伝子の同定が、遺伝子候補を互いに分離するＱＴＬ領域における減数分裂組換えがないことによって妨げられる場合である。これは、目的の遺伝子を同時に標的とする複数のＣＲＩＳＰＲ構築物で形質転換することにより回避され得る。これらの構築物は、フレームシフト変異によって遺伝子候補をノックアウトするか、欠失によって遺伝子候補を除去する。このような形質転換により、無傷遺伝子座と変異遺伝子座とのランダムな組み合わせが得られ、原因遺伝子の同定が可能になる。

ｇＲＮＡ発現カセットは、配列番号１～１０として示され、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ活性を植物細胞ゲノム領域内の特定の部位に向けるように設計された独自のｇＲＮＡコード配列に５’で作動可能に連結している本発明の２つ以上の合成ｓｎＲＮＡプロモーター及び／または短縮型バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む。植物細胞の形質転換前の細菌宿主中において、短縮型バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーターのサイズが小さいほど、より小さい構築物の構築が可能になり、複製エラーが起こる確率が低下するという点で、短縮型バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーター（配列番号６～１０）を使用することは有利であり得る。

バイナリー植物形質転換構築物は、実施例３で上述したものと同様に構築されるが、複数のｇＲＮＡ発現カセットを含み、それぞれが、独自のｇＲＮＡコード配列に５’で作動可能に連結された独自の合成ｓｎＲＮＡプロモーターまたは短縮型バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーターを有する。バイナリー植物形質転換構築物は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの発現に使用される発現カセットも含む。植物細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法を使用して、形質転換される。形質転換後、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを、各ｇＲＮＡのスペーサー配列に相補的な配列に隣接するＰＡＭ配列を含むゲノム領域に指向させて、それぞれの標的配列中のゲノムＤＮＡ内で、エンドヌクレアーゼ切断を引き起こす。切断後、標的部位間のゲノムＤＮＡが切り出され、ゲノムＤＮＡは、非相同末端結合によって修復される。ゲノムＤＮＡの断片の切除は、当該技術分野で利用可能な様々な増幅または配列決定方法を介して確認され得る。切除するために標的化されるゲノム領域の性質に応じて、表現型、代謝、または他の特性の変化が観察され得る。

実施例７
相同組換えによる標的化組み込み
所望の導入ＤＮＡ配列の標的化組み込みによるゲノム修飾は、染色体の二本鎖破断部位で生じる。ＤＮＡ配列の組み込みは、宿主細胞のＤＮＡ修復機構を利用した非相同末端結合機構または相同組換えによって媒介される。細胞ゲノム中の二本鎖破断は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼと、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをゲノムＤＮＡの標的領域に指向させるｇＲＮＡを使用して実現できる。相同組換えを必要とし得る適用例は、植物ゲノムの特定領域内での植物細胞ゲノムへの発現カセットの組み込みとなる。

相同組換えを用いたＤＮＡ断片の組み込みには、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによる切断後に組み込みが好ましい領域と同一の相同領域（本明細書では「相同性アーム」（ＨＡ）と呼ぶ）が必要である。相同性アームは、ＤＮＡ断片の５’末端と３’末端に隣接している。左ＨＡは、標的組み込みのための二本鎖破断部位の５’側に隣接する配列に基づいて設計されている。右ＨＡは、標的組み込みのための二本鎖破断部位の３’側に隣接する配列に基づいて設計されている。相同性アームは、約２～約１２００塩基対にすることができるが、相同性アームが長いほど、効率よく働き得る。相同性アームのサイズの望ましい範囲は、長さ２３０塩基対～１，００３塩基対であり得る。

プロトプラストをトランスフェクトするために、トランスフェクションに使用される構築物（複数可）は、実施例５で上述したものと同様である。ｇＲＮＡ発現カセットは、配列番号１～１０として示される、本発明の合成ｓｎＲＮＡプロモーターまたは短縮型バリアント合成ｓｎＲＮＡプロモーターのうちの１つを含む。構築物（複数可）は、相同性アームを含むＤＮＡ断片とともに同時トランスフェクトされ得る。あるいは、発現カセットをプラスミド構築物（複数可）から切り出すことができ、線状発現カセット断片を、相同性アームを含むＤＮＡ断片とともに同時トランスフェクトすることができる。

ＤＮＡ断片を含む安定に形質転換された植物をもたらす、相同性アームを含むＤＮＡ断片の安定した組み込みのために、発現カセットをプラスミド構築物（複数可）から切り出すことができ、線状発現カセット断片は、粒子撃ち込みによって、相同性アームを含むＤＮＡ断片とともに同時形質転換することができる。あるいは、合成ｓｎＲＮＡプロモーターまたは短縮型合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む発現カセットを、粒子撃ち込みによって相同性アームを含むＤＮＡ断片とともに同時形質転換することができる。形質転換された組織は、全植物を形成するように誘導され、植物は、組み込まれたＤＮＡ断片の存在について選択され、標的部位への挿入に関して、当技術分野で知られている方法を使用して特性評価される。

ＤＮＡ断片を含む安定な形質転換植物をもたらす、相同性アームを含むＤＮＡ断片のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介安定組み込みについては、当技術分野で知られている方法を使用して、１つのバイナリー形質転換構築物を構築することができる。この構築物は、右のＴ－ＤＮＡ境界領域；例えば、第１の導入遺伝子カセット（除草剤または抗生物質のいずれかを使用して形質転換された植物細胞を選択するために使用される）に隣接する左の相同性アーム；第２の導入遺伝子カセット（目的の遺伝子の発現の発現カセットを含む）；右の相同性アーム；第３の導入遺伝子カセット（核標的ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをコードするコード配列に５’で作動可能に連結され、５’で３’ＵＴＲに作動可能に連結された植物発現可能なプロモーターを含む）；第４の導入遺伝子カセット（配列番号１～１０として示される、本発明の合成ｓｎＲＮＡプロモーターまたは短縮型合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含み、転写を終結させるために３’末端にポリＴストレッチを含むｇＲＮＡコード配列に５’で作動可能に連結される）；及び右のＴ－ＤＮＡ境界を含む。形質転換体を選択し、特性評価した後に、選択マーカーカセット、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼカセット、及びｇＲＮＡカセットが、Ｃｒｅリコンビナーゼによって切断されるＬｏｘ部位などの選択可能マーカーの切り出しが可能になる部位と隣接させることも好ましい場合がある。

２つの右側のＴ－ＤＮＡ境界領域を使用することにより、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる複製プロセスの結果、Ｔ－ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡを形成する。相同性アームに隣接した選択及び発現カセットは、標的部位に組み込まれる。完全長Ｔ－ＤＮＡまたは部分Ｔ－ＤＮＡの染色体組み込みの喪失はいずれも、標的部位中に選択及び発現カセットのみを有する分離体を選択することによる育種及び分離を通じて、後続の世代で達成できる。選択可能マーカーカセットの除去は、選択及び発現カセットを含む植物を、Ｃｒｅ－リコンビナーゼを発現する形質転換植物と交配することによって達成することができる。その後、Ｃｒｅ－リコンビナーゼ発現カセットは、次世代の分離を介して選択することもできる。

実施例８
Ｐ－ＧＳＰ２２６２＿ＴＲは、ｇＲＮＡの発現を駆動できる
トウモロコシ植物を、植物発現可能なプロモーターによって駆動されるＣａｓ１２ａの発現のための発現カセットと、合成ｓｎＲＮＡプロモーターＧＳＰ２２６２＿ＴＲによって駆動されるｇＲＮＡの発現のための発現カセットと、を含むプラスミド構築物で形質転換し、Ｂｍｒ３標的配列（配列番号１８）の特定の領域内の編集について評価した。

トウモロコシ植物は、２つの異なるプラスミド構築物、構築物－１及び構築物－２を使用して形質転換させた。各構築物は、グリホサート選択を使用して、形質転換植物細胞を選択するための発現カセット及びＣａｓ１２ａの発現のための発現カセットを含んでいた。構築物－１はまた、合成ｓｎＲＮＡプロモーターＧＳＰ２２６２＿ＴＲ（配列番号６）によって駆動されるｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿９０＿３２７９（配列番号２３）を発現するための発現カセットを含んでいた。ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿９０＿３２７９は、Ｃａｓ１２ａがＢｍｒ３標的配列（配列番号１８）内で切断するように指示する２つのスペーサー配列、ＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿９０（配列番号２０）及びＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿３２７９（配列番号２２）を含んでいた。構築物－２はまた、合成ｓｎＲＮＡプロモーターＧＳＰ２２６２＿ＴＲ（配列番号６）によって駆動されるｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２２７＿３２７９（配列番号２４）を発現するための発現カセットを含んでいた。ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２２７＿３２７９は、Ｃａｓ１２ａがＢｍｒ３標的配列（配列番号１８）内で切断するように指示する２つのスペーサー配列、ＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿２２７（配列番号２１）及びＮＲ－Ｚｍ．Ｂｍｒ３＿３２７９（配列番号２２）を含んでいた。

トウモロコシ植物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法を使用して、上記の２つのプラスミド構築物で形質転換した。形質転換細胞は、当技術分野で知られている方法によって植物の形成を誘導された。形質転換されたＲ_０植物から葉組織サンプルを採取し、各サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した。標的部位にまたがる領域を配列決定した。少なくとも１つの編集された対立遺伝子を含む植物の割合を、切断部位ごとに計算した。編集された標的部位の割合を以下の表２に示す。

上記の表２で確認できるように、合成ｓｎＲＮＡプロモーターＰ－ＧＳＰ２２６２＿ＴＲ（配列番号６）は、各ｇＲＮＡに特異的な編集部位の割合によって示されるように、ｇＲＮＡ発現を駆動することができた。

実施例９
トランスフェクトされたプロトプラストを使用した、Ｂｍｒ３ゲノム遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの発現の駆動における合成ｓｎＲＮＡプロモーターのアッセイ
トウモロコシ葉プロトプラストを構築物でトランスフェクトし、Ｂｍｒ３標的配列（配列番号１８）内で編集を誘導する有効性について評価した。ここで、第１の構築物は、植物発現可能なプロモーターによって駆動されるＣａｓ１２ａの発現のための発現カセットを含み、第２の構築物は、合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動されるＢｍｒ３ゲノム遺伝子座を標的とするように設計されたｇＲＮＡの発現のための発現カセットを含む。

トウモロコシ葉プロトプラストに複数の構築物をトランスフェクトし、ｇＲＮＡの発現を駆動する合成ｓｎＲＮＡプロモーターの能力をアッセイし、その結果、Ｂｍｒ３標的部位（配列番号１８）内の特定の配列を編集した。各プロトプラスト調製物を４つの異なる構築物でトランスフェクトした。第１の構築物は、構成的プロモーターを使用して、プロトプラスト細胞におけるＣａｓ１２ａ（Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳ、配列番号１２）の発現を駆動するために使用される。第２の構築物を使用して、配列番号１～１０からなる群から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動される、Ｂｍｒ３遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの発現を駆動した。第３及び第４の構築物を使用して、それぞれ構成的プロモーターを使用して、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子及びホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を駆動し、プロトプラストトランスフェクションの成功を評価した。

配列番号１～１０からなる群から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動される、ｇＲＮＡの発現を駆動するために使用される第２の構築物は、３つの異なるｇＲＮＡのうちの１つを含んでいた：（１）ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿２６９１＿２（配列番号２５）（スペーサーＮＲ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿２６９１（配列番号１４）を含み、Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳタンパク質がＢｍｒ３標的配列内で切断するように指示する）；（２）ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿３１７０＿２（配列番号２６）（スペーサーＮＲ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿３１７０（配列番号１６）を含み、Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳタンパク質がＢｍｒ３標的配列内で切断するよう指示する）；及び（３）ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿２６９１＿３１７０（配列番号２７）（Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳがＢｍｒ３標的配列の両方の位置内で切断するよう指示する）。１０個の合成ｓｎＲＮＡプロモーターのそれぞれに、３つすべてのｇＲＮＡを提供するために、合計３０個の構築物を作製した。

トウモロコシ葉プロトプラストを、当技術分野で知られているものと同様のＰＥＧベースのトランスフェクション法を使用して、上記の５種類の構築物（第１、第２、第３、第４、及び第５）でトランスフェクトした。ゲノムＤＮＡは、トランスフェクション及びインキュベーション後に、プロトプラスト細胞から単離した。Ｂｍｒ３標的部位の標的領域の周囲でＤＮＡ配列決定を実施した。各トランスフェクションを４回繰り返し、平均％ＩｎＤｅｌを４回の繰り返しに基づいて計算した。ＩｎＤｅｌのパーセンテージは次のように計算した：％ＩｎＤｅｌ＝１００ｘ［（Ｉｎ＋Ｄｅｌ）／（ＴｏｔａｌＲＣ）］。式中、「Ｉｎ」は、挿入の読み取り数である。「Ｄｅｌ」は、欠失の読み取り数である。「ＴｏｔａｌＲＣ」は、野生型及び変異型読み取り数を含む、特定のサンプルからのすべての配列の読み取り数である。各ガイドＲＮＡは、二本鎖破断の誘導効率に関して異なるため、１０個の合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動される各ｇＲＮＡの％ＩｎＤｅｌは、最も高い％ＩｎＤｅｌを有する１０個のｓｎＲＮＡプロモーターのいずれかからの繰り返しを１００％として正規化した。表３は、２つの単一標的ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿２６９１＿２（配列番号２５）及びｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿３１７０＿２（配列番号２６）に対応する平均％ＩｎＤｅｌ及び平均正規化％ＩｎＤｅｌを示す。表４は、２標的ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿２６９１＿３１７０（配列番号２７）に対応する平均％ＩｎＤｅｌ及び平均正規化％ＩｎＤｅｌを示す。

表３及び４に見られるように、合成ｓｎＲＮＡプロモーターのそれぞれは、ｇＲＮＡ発現を駆動して、標的部位におけるＣａｓ１２ａ編集を指示することができた。これらの実験では、ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿２６９１＿２は、他の２つのｇＲＮＡより効率が低いと考えられ、特にプロモーターＧＳＰ２２６２、ＧＳＰ２２７２、及びＧＳＰ２２７２＿ＴＲの平均％ＩｎＤｅｌが低くなった。しかし、これら３つの合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿３１７０＿２及びｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿２６９１＿３１７０を駆動する場合、他の合成ｓｎＲＮＡプロモーターと同様の％ＩｎＤｅｌを示した。

実施例１０
トランスフェクトされたプロトプラストを使用した、Ｚｍ７ゲノム遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの発現の駆動における合成ｓｎＲＮＡプロモーターのアッセイ
トウモロコシ葉プロトプラストを構築物でトランスフェクトし、Ｚｍ７標的配列（配列番号２８）内で編集を誘導する有効性について評価した。ここで、第１の構築物は、植物発現可能なプロモーターによって駆動されるＣａｓ１２ａの発現のための発現カセットを含み、第２の構築物は、合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動されるＢｍｒ３ゲノム遺伝子座を標的とするように設計されたｇＲＮＡの発現のための発現カセットを含む。

トウモロコシ葉プロトプラストに複数の構築物をトランスフェクトし、ｇＲＮＡの発現を駆動する合成ｓｎＲＮＡプロモーターの能力をアッセイし、その結果、Ｚｍ７標的部位（配列番号２８）内の特定の配列を編集した。各プロトプラスト調製物を４つの異なる構築物でトランスフェクトした。第１の構築物は、構成的プロモーターを使用して、プロトプラスト細胞におけるＣａｓ１２ａ（Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳ、配列番号１２）の発現を駆動するために使用した。第２の構築物を使用して、配列番号１～１０からなる群から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動される、Ｚｍ７遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの発現を駆動した。第３及び第４の構築物を使用して、それぞれ構成的プロモーターを使用して、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子及びホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を駆動し、プロトプラストトランスフェクションの成功を評価した。

ｇＲＮＡの発現を駆動するために使用される第２の構築物は、配列番号１～１０からなる群から選択される合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動され、以下の３つの異なるｇＲＮＡのうちの１つを含む：（１）ｇＲＮＡ－Ｚｍ．７．１ｂ（配列番号３０）（スペーサーＮＲ－Ｚｍ．７．１ｂ（配列番号２９）を含み、Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳタンパク質がＺｍ７標的配列内で切断するように指示する）；（２）ｇＲＮＡ－Ｚｍ．７．１ｃ（配列番号３２）（スペーサーＮＲ－Ｚｍ．７．１ｃ（配列番号３１）を含み、Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳタンパク質がＺｍ７標的配列内で切断するように指示する）；及び（３）ｇＲＮＡ－７．１ｃ＿７．１ｂ（配列番号３３）（Ｃａｓ１２ａ＿ＮＬＳにＺｍ７標的配列の両方の位置内で切断するように指示する）。１０個の合成ｓｎＲＮＡプロモーターのそれぞれに、３つすべてのｇＲＮＡを提供するために、合計３０個の構築物を作製した。

トウモロコシ葉プロトプラストを、当技術分野で知られているものと同様のＰＥＧベースのトランスフェクション法を使用して、上記の５種類の構築物（第１、第２、第３、第４、及び第５）でトランスフェクトした。ゲノムＤＮＡは、トランスフェクション及びインキュベーション後に、プロトプラスト細胞から単離した。Ｂｍｒ３標的部位の標的領域の周囲でＤＮＡ配列決定を実施した。各トランスフェクションを４回繰り返し、平均％ＩｎＤｅｌを４回の繰り返しに基づいて計算した。％ＩｎＤｅｌ及び％ＩｎＤｅｌの正規化は、上記の実施例９に記載のとおり計算した。

表５は、２つの単一標的ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．７．１ｂ（配列番号３０）及びｇＲＮＡ－Ｚｍ．７．１ｃ（配列番号３２）に対応する平均％ＩｎＤｅｌ及び平均正規化％ＩｎＤｅｌを示す。表６は、２標的ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－７．１ｃ＿７．１ｂ（配列番号３３）に対応する平均％ＩｎＤｅｌ及び平均正規化％ＩｎＤｅｌを示す。

表３及び４で確認できるように、各合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、ｇＲＮＡ発現を駆動して、標的部位におけるＣａｓ１２ａ編集を指示することができた。Ｚｍ．７．１ｂ部位の編集は、Ｚｍ．７．１ｃ部位よりも低い効率であった。しかし、合成ｓｎＲＮＡプロモーターは、ｇＲＮＡの発現を駆動し、Ｃａｓ１２ａによる編集に影響を与えることができた。

実施例１１
安定に形質転換されたトウモロコシ植物におけるＢｍｒ３ゲノム遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの発現の駆動における合成ｓｎＲＮＡプロモーターのアッセイ
トウモロコシ植物を、植物発現可能なプロモーターによって駆動されるＣａｓ１２ａの発現のための発現カセットと、配列番号６～１０として示される合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動されるｇＲＮＡの発現のための発現カセットと、を含むプラスミド構築物で形質転換し、Ｂｍｒ３標的配列（配列番号１８）の特定の領域内の編集について評価した。

トウモロコシ植物を、以下の３つの発現カセットを含む５つのプラスミド構築物で形質転換した；グリホサート選択を使用して形質転換植物細胞を選択するための第１の発現カセット、植物発現可能なプロモーターを使用してＣａｓ１２ａを発現するための第２の発現カセット、及びｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－Ｚｍ．Ｂｒｍ３＿２６９１＿３１７０（配列番号２７）（Ｂｍｒ３標的配列（配列番号１８）の２つの領域内を切断するように、Ｃａｓ１２ａに指示する配列番号６～１０として示される合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動される）の発現のための第３の導入遺伝子カセット。

トウモロコシ植物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法を使用して、上記の２つのプラスミド構築物で形質転換した。形質転換細胞は、当技術分野で知られている方法によって植物の形成を誘導された。形質転換されたＲ_０植物から葉組織サンプルを採取し、各サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した。１つ及び２つのコピーイベントを選択し、標的部位にわたる領域の配列決定を実施した。平均ＩｎＤｅｌパーセンテージは、各標的部位で観察された挿入及び欠失の数に基づいて計算した。表７は、Ｂｍｒ３標的配列内の２つの標的部位のそれぞれについて計算した平均ＩｎＤｅｌパーセンテージを示す。

上記の表７で確認できるように、合成ｓｎＲＮＡプロモーターの各々は、ｇＲＮＡ発現を駆動して、Ｂｍｒ３標的配列の標的部位におけるＣａｓ１２ａ編集を指示することができた。

実施例１２
安定に形質転換されたトウモロコシ植物におけるＺｍ７ゲノム遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの発現の駆動における合成ｓｎＲＮＡプロモーターのアッセイ

トウモロコシ植物を、植物発現可能なプロモーターによって駆動されるＣａｓ１２ａの発現のための発現カセットと、配列番号６～１０として示される合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動されるｇＲＮＡの発現のための発現カセットと、を含むプラスミド構築物で形質転換し、Ｚｍ７標的配列（配列番号２８）の特定の領域内の編集について評価した。

トウモロコシ植物を、以下の３つの発現カセットを含む５つのプラスミド構築物で形質転換した；グリホサート選択を使用して形質転換植物細胞を選択するための第１の発現カセット、植物発現可能なプロモーターを使用してＣａｓ１２ａを発現するための第２の発現カセット、及びｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ－７．１ｃ＿７．１ｂ（配列番号３３）（Ｚｍ７標的配列（配列番号２８）の２つの領域内を切断するように、Ｃａｓ１２ａに指示する配列番号６～１０として示される合成ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動される）の発現のための第３の導入遺伝子カセット。

トウモロコシ植物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法を使用して、上記の２つのプラスミド構築物で形質転換した。形質転換細胞は、当技術分野で知られている方法によって植物の形成を誘導された。形質転換されたＲ_０植物から葉組織サンプルを採取し、各サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した。１つ及び２つのコピーイベントを選択し、標的部位にわたる領域の配列決定を実施した。平均ＩｎＤｅｌパーセンテージは、各標的部位で観察された挿入及び欠失の数に基づいて計算した。表８は、Ｚｍ７標的配列（配列番号２８）内の２つの標的部位のそれぞれについて計算した平均ＩｎＤｅｌパーセンテージを示している。

上記の表８で確認できるように、合成ｓｎＲＮＡプロモーターの各々は、ｇＲＮＡ発現を駆動して、Ｚｍ７標的配列の標的部位におけるＣａｓ１２ａ編集を指示することができた。
＊＊＊＊＊＊＊

本発明の原理を例示及び説明したが、かかる原理から逸脱することなく、本発明の編成及び詳細を変更することができることが、当業者には明らかであるはずである。発明者らは、特許請求の範囲の趣旨及び範囲内にある全ての変更を特許請求する。本明細書で引用される全ての刊行物及び公開された特許文献は、あたかも個々の刊行物または特許出願の各々が参照により援用されることが明確かつ個別に示されているのと同じ程度まで、これにより本明細書に援用される。

Claims (29)

1. 以下からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む合成核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）プロモーター：
   ａ．配列番号１～１０のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列；
   ｂ．配列番号１～１０のいずれかを含む配列；及び
   ｃ．配列番号１～１０のいずれかの断片。
2. 前記配列が、配列番号１～１０のいずれかのＤＮＡ配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター。
3. 前記配列が、配列番号１～１０のいずれかのＤＮＡ配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター。
4. 前記断片が、遺伝子調節活性を含む、請求項１に記載の合成ｓｎＲＮＡプロモーター。
5. ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物であって、前記合成ｓｎＲＮＡプロモーターの配列が、配列番号１～１０のいずれか、またはその断片であり、前記断片が、遺伝子調節活性を含む、前記組換えＤＮＡ構築物。
6. 転写終結配列をさらに含む、請求項５に記載の組換えＤＮＡ構築物。
7. Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に作動可能に連結されたプロモーターをコードするＤＮＡ配列をさらに含む、請求項５に記載の組換えＤＮＡ構築物。
8. ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）にさらに作動可能に連結されている、請求項７に記載の組換えＤＮＡ構築物。
9. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、及びＭａｄ７からなる群から選択される、請求項７に記載の組換えＤＮＡ構築物。
10. ノンコーディングＲＮＡを指定する配列に作動可能に連結された合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物であって、前記合成ｓｎＲＮＡプロモーターの配列が、配列番号１～１０のいずれかまたはその断片であり、前記断片が、遺伝子調節活性を含む、前記組換えＤＮＡ構築物。
11. 前記ノンコーディングＲＮＡが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｃｒＲＮＡ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ＰＥｇＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ前駆体、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ＲＮＡ（長さ２２～２６ｎｔ）及びそれをコードする前駆体、ヘテロクロマチンｓｉＲＮＡ（ｈｃ－ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ヘアピン二本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、及び天然に存在するアンチセンスｓｉＲＮＡ（ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の組換えＤＮＡ構築物。
12. ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む少なくとも第１の発現カセットを含む組換えＤＮＡ構築物であって、前記プロモーターの配列は、配列番号１～１０のいずれかまたはその断片を含み、前記断片は、遺伝子調節活性を含む、前記組換えＤＮＡ構築物。
13. 少なくとも第２の発現カセットをさらに含み、前記第１のｇＲＮＡをコードする前記配列が、前記第２のｇＲＮＡをコードする前記配列とは異なる、請求項１２に記載の組換えＤＮＡ構築物。
14. 前記第１のｇＲＮＡをコードする前記配列に作動可能に連結された前記合成ｓｎＲＮＡプロモーターが、前記第２のｇＲＮＡをコードする前記配列に作動可能に連結された前記合成ｓｎＲＮＡプロモーターとは異なる、請求項１３に記載の組換えＤＮＡ構築物。
15. それぞれ長さが約２００～１２００ｂｐである隣接する左及び右の相同性アーム（ＨＡ）を含む、請求項１４に記載の構築物。
16. 前記相同性アームの長さが、約２３０～１００３ｂｐである、請求項１５に記載の構築物。
17. ａ．配列番号１～１０またはその断片からなる群から選択される第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーターであって、前記断片が、遺伝子調節活性を含み、ノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されている、前記第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーターと；
    ｂ．配列番号１～１０またはその断片からなる群から選択される第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターであって、前記断片が、遺伝子調節活性を含み、ノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されている、前記第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターと；
    を含む、組換えＤＮＡ構築物であって、
    ここで、前記第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーターと前記第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターとが異なる、前記組換えＤＮＡ構築物。
18. 前記第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーターをコードする前記配列及び前記第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーターをコードする前記配列はそれぞれ、配列番号１～１０のいずれか、またはその断片を含み、ここで、前記断片は、遺伝子調節活性を含む、請求項１７に記載の組換えＤＮＡ構築物。
19. 配列番号１～１０またはその断片からなる群から選択される１つ以上の追加の合成ｓｎＲＮＡプロモーターを指定する配列をさらに含む、請求項１７～１８のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、ここで、前記断片は、遺伝子調節活性を含み、ノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されており、ここで、前記第１の合成ｓｎＲＮＡプロモーター、前記第２の合成ｓｎＲＮＡプロモーター、及び前記１つ以上の追加の合成ｓｎＲＮＡプロモーターのそれぞれが異なる、前記組換えＤＮＡ構築物。
20. 前記１つ以上の追加の合成ｓｎＲＮＡプロモーターを指定する前記配列が、配列番号１～１０またはその断片からなる群から選択され、ここで、前記断片が、遺伝子調節活性を含む、請求項１９に記載の組換えＤＮＡ構築物。
21. 前記組換えＤＮＡ構築物が３、４、５、６、７、または８個の合成ｓｎＲＮＡプロモーターを含む、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ構築物。
22. 前記ノンコーディングＲＮＡが、植物細胞の染色体中の異なる選択された標的部位を標的とするｇＲＮＡである、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ構築物。
23. ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターをコードするＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ構築物。
24. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、及びＭａｄ７からなる群から選択される、請求項２３に記載のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質。
25. 請求項５、請求項１０、請求項１２、及び請求項１７からなる群から選択される組換えＤＮＡ構築物を含む細胞。
26. 前記細胞が、植物細胞である、請求項２５に記載の細胞。
27. 前記植物細胞が、単子葉植物細胞である、請求項２６に記載の植物細胞。
28. 前記植物細胞が、双子葉植物細胞である、請求項２６に記載の植物細胞。
29. 前記植物細胞が、トウモロコシ植物細胞、ダイズ植物細胞、ワタ植物細胞、ピーナッツ植物細胞、オオムギ植物細胞、オートムギ植物細胞、カモガヤ植物細胞、イネ植物細胞、モロコシ植物細胞、サトウキビ植物細胞、トールフェスク植物細胞、芝草植物細胞、コムギ植物細胞、アルファルファ植物細胞、キャノーラ植物細胞、キャベツ植物細胞、マスタード植物細胞、ルタバガ植物細胞、カブ植物細胞、ケール植物細胞、ブロッコリー植物細胞、カリフラワー植物細胞、コショウ植物細胞、マメ植物細胞、ササゲ植物細胞、ヒヨコマメ植物細胞、ヒョウタン植物細胞、レタス植物細胞、キュウリ植物細胞、メロン植物細胞、ニンジン植物細胞、トマト植物細胞、ダイコン植物細胞、ジャガイモ植物細胞、及び観賞用植物細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載の植物細胞。