JP2024515347A - キメラ抗原受容体（ｃａｒ）－ｔ細胞 - Google Patents

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Abstract

本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞に関し、特に、排他的ではないが、抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－β ＣＡＲ、免疫療法におけるそれらの使用、並びにＴ細胞リンパ腫等の癌、ＨＩＶ及びＴＢ等の様々な微生物感染症、並びに自己免疫疾患の治療、予防又は改善のための使用に関する。本発明は、ＣＡＲ操作された粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞の使用、並びに高度に精製されたＭＡＩＴ細胞を刺激し、単離し、及び拡大させるための新規方法に関し、その後、そのようなＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞に操作することができる。本発明は、遺伝子構築体それ自体、並びにＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の作製におけるそれらの使用、及び形質導入されたＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞それ自体に及ぶ。本発明はまた、構築物及び形質導入ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の様々な医学的使用、並びにこれらの構築物及びＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を含む医薬組成物にも及ぶ。【選択図】図１０

Description

本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞に関し、特に、排他的ではないが、抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－β ＣＡＲ、免疫療法におけるそれらの使用、並びにＴ細胞リンパ腫等の癌、ＨＩＶ及びＴＢ等の様々な微生物感染症、並びに自己免疫疾患の治療、予防又は改善のための使用に関する。本発明は、ＣＡＲ操作された粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞の使用、並びに高度に精製されたＭＡＩＴ細胞を刺激し、単離し、及び拡大させるための新規方法に関し、その後、そのようなＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞に操作することができる。本発明は、遺伝子構築体それ自体、並びにＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の作製におけるそれらの使用、及び形質導入されたＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞それ自体に及ぶ。本発明はまた、構築物及び形質導入ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の様々な医学的使用、並びにこれらの構築物及びＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を含む医薬組成物にも及ぶ。
Ｔ細胞リンパ腫は、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）によって引き起こされる成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）等の末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、及びセザリー症候群（ＳＳ）等の皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を含む、臨床的に侵攻性の疾患の不均一な群である。Ｔ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞悪性腫瘍よりも治療が困難である。ＡＴＬ及びＳＳは、稀でしばしば侵襲性のＴ細胞リンパ腫型であり、治療基準を確立するために十分な患者がランダム化試験に登録されていない。結果として、使用される一般的な第１選択療法は、他のタイプのＴ細胞リンパ腫を治療するために使用されるものと同じである。例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍を治療するための現在認可されている薬物には、化学療法剤、生物学的応答調節剤（例えば、インターフェロン、ベキサロテン及びＨＤＡＣ阻害剤）、モノクローナル抗体（アレムツズマブ、モガムリズマブ、ブレンツキシマブ）、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）及び体外光フェレーシス（ＥＣＰ）が含まれる。しかしながら、単一の治療レジメンが、その全奏効率又は奏効期間において他よりも優れていることは知られていない。同種異系（ＨＳＣＴ）が唯一の潜在的な治癒的レジメンであったにもかかわらず、かなりの数の患者が、ＨＳＣＴに関連する死亡率に加えて高齢及び併存症のためにＨＳＣＴに適合しない可能性がある。したがって、ＡＴＬに対する現在の治療による生存期間中央値はわずか８ヶ月（Ｋａｔｓｕｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）であるので、より効果的な治療が必要とされている。
最近ＦＤＡが承認したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ベースのＴ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）は、ほぼ１００％の寛解を達成するＣＤ１９抗原を標的とすることによるＢ細胞悪性腫瘍の治療における最も重要な突破口の１つと見なされている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。しかしながら、Ｂ細胞悪性腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ治療の有効性にもかかわらず、Ｔ細胞由来悪性腫瘍を標的とするための同様のアプローチは十分に確立されていない。免疫グロブリン遺伝子（すなわち、クローン）の同一の再構成を含み、ＣＤ１９等のｐａｎ－Ｂ細胞マーカーを発現するほとんどのＢ細胞悪性腫瘍と同様に、ＡＴＬ及びＣＴＣＬの大部分（＞９５％）は、定義されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（すなわち、クローンＴＣＲ－Ｖβ鎖）及びｐａｎ－Ｔヘルパー細胞マーカーＣＤ４を発現する優性Ｔ細胞クローンに由来する。したがって、Ｔリンパ腫の治療のためのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＣＤ４又はＴＣＲ－Ｖｂ鎖等のｐａｎ－Ｔ細胞マーカーの標的化が試験されているが、小規模臨床試験では部分的な退縮しかもたらされていない。
現在のＣＡＲ－Ｔ療法は、主に従来のαβＴ細胞に基づく。しかしながら、αβＴ細胞の抗原認識はＭＨＣによって著しく制限され、それにより、自己治療には適しているが、同種異系養子移入には非常に困難になる。更に、αβ Ｔ細胞の不適切な腫瘍浸潤のために、従来のＣＡＲ－Ｔ療法は、ＣＴＣＬ等の固形腫瘍において低い有効性を示すが、液体腫瘍療法において有望な可能性を示す。しかしながら、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、その更なる適用を制限するいくつかの大きな欠点を有する。例えば、現在のＣＡＲ－Ｔ療法は、（ｉ）移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）による自己輸血によって制限され、（ｉｉ）サイトカイン放出症候群を伴うオンターゲット／オフ腫瘍毒性によって制限され、（ｉｉｉ）患者のＴ細胞機能の変動性、製品の標準化及びコスト等の自己ＣＡＲ－Ｔの欠点である。
したがって、ＰＴＣＬ及びＣＴＣＬを含むＴ細胞リンパ腫等のＴ細胞悪性腫瘍、並びにＨＩＶ及びＴＢ等の微生物感染症を治療するための改善された免疫療法を提供する必要がある。
Ｔ細胞悪性腫瘍を治療するために、本発明者らは、自然のエフェクター様の性質を示す免疫系のＴ細胞のサブセットである粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ細胞）に注目した。ＭＡＩＴ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）－Ｉｂ関連タンパク質ＭＲ１によって制限されるＴ細胞受容体鎖Ｖα７．２の不変の使用によって定義され、Ｃ型レクチンＣＤ１６１及びＩＬ１８受容体の高い発現を示す。ヒトでは、ＭＡＩＴ細胞は、血液、肝臓、肺及び粘膜に見られ、微生物活性及び感染を防御する。ＭＨＣクラスＩ様タンパク質ＭＲ１は、細菌産生ビタミンＢ代謝産物、例えば５－ＯＰ－ＲＵをＭＡＩＴ細胞に提示する役割を果たす。ＭＲ１による外来抗原の提示後、ＭＡＩＴ細胞は炎症促進性サイトカインを分泌し、細菌感染細胞を溶解することができる。
現在のＭＡＩＴ細胞増殖方法は、インビトロ培養でのＭＡＩＴ細胞の増殖を支援するためにヒト同種異系フィーダー細胞の使用を必要とし、これはヒトにおける適応免疫療法のための大規模生産及び品質管理にとって困難である。加えて、これらの公知の方法を使用して作製されたＭＡＩＴ細胞は、ある割合の他の細胞サブセット（例えば、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞等）を含有し、したがって、得られたＭＡＩＴ単離体は、それらの細胞サブセットが移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こすので、同種異系養子移入におけるその使用に完全に適さなくなる。
したがって、ＭＡＩＴ細胞産生をスケールアップするために、同種異系フィーダー細胞を必要とせずに純粋なＭＡＩＴ細胞培養物を刺激及び単離するための改善された方法、したがって同種異系養子移入において使用される方法もまた必要とされている。
実施例に記載されるように、本発明者らは、ヒトＰＢＭＣからのＭＡＩＴ細胞の高純度培養物を刺激及び単離するための新規な方法を開発した。本発明者らはまた、それぞれがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、次いで純粋なＭＡＩＴ細胞に形質導入され、それによりＴ細胞上のＣＤ４分子（「ＣＡＲＴ４」を使用）又はＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖（「ＣＡＲＴＶｂ７．１」を使用）のいずれかを特異的に標的とするＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を産生するいくつかの新規な遺伝子構築物及びベクター（本明細書では「ＣＡＲＴ４」及び「ＣＡＲＴＶｂ７．１」と呼ばれる）を開発した。これは、第３世代ＣＡＲを形成するためのＣＤ２８／４－１ＢＢ／ＣＤ３ζ鎖シグナル伝達部分を有する、（ｉ）抗ＣＤ４ｍＡｂ（例えば、Ｈｕ５Ａ８）又は（ｉｉ）抗ＴＣＲ－Ｖｂ７．１ｍＡｂ（例えば３Ｇ５）のいずれかのｓｃＦｖを含む新規遺伝子構築物を作製することによって達成された。次いで、これらのＣＡＲを、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製されたＭＡＩＴ細胞に形質導入して、Ｔ細胞上のＣＤ４又はＴ細胞上のＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖のいずれかを標的とする得られたＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を作製した。本発明者らは、これらのＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞が、驚くべきことに、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と同等の、更には優れた抗Ｔリンパ腫活性を示したことを明らかにした。
Ｋａｔｓｕｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８
したがって、本発明の第１の態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞が提供される。
本明細書で論じられるように、ＭＡＩＴ細胞は、哺乳動物の進化の間に高度に保存され、ＭＲ１タンパク質によって提示される微生物抗原を認識し、ヒト血液中に存在し、広範な抗菌応答性のために組織ホメオスタシスを維持する、インバリアントＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する非従来型の自然様Ｔ細胞である。更に、有利には、ＭＡＩＴ細胞の抗原認識機構はＭＨＣ非依存性であり、これにより、ＭＡＩＴ細胞は、ＭＨＣ依存性である現在のＴ細胞療法におけるような自己療法に限定されないように、同種異系Ｔ細胞殺傷療法の刺激的な候補となる。換言すれば、ＭＡＩＴ細胞は、低い同種異系反応性を有し、ヒトにおいて移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を誘導する傾向がより低く、したがって、同種異系ＣＡＲ－Ｔ療法のための理想的なＴ細胞サブセットを表す。比較して、本発明のＣＡＲＴ－ＭＡＩＴ細胞及び結果として生じる細胞療法は、容易に同種異系移入することができ、ＭＡＩＴ細胞の内因性特性により、固形腫瘍治療のために末梢組織に浸潤する有望な候補となる。したがって、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は固形腫瘍に効果的に浸潤することができ、これにより、ＭＡＩＴ細胞ベースの細胞療法が固形腫瘍並びに液体腫瘍の有望な治療法となる。
有利には、本発明のＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、Ｔ細胞悪性腫瘍、例えばヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）によって引き起こされる成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）及び皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、例えばセザリー症候群を治療するために使用され得る。Ｔ細胞悪性腫瘍は、臨床的に攻撃的な疾患の不均一な群であり、Ｂ細胞悪性腫瘍よりも有意に治療が困難であることが理解されよう。有利には、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ療法は、固形腫瘍に対して増大した有効性を示し、同種異系であることが予想され、それにより、自己移植の必要性がなくなり、したがって、それを既製の療法として位置付ける。
好ましくは、一実施形態では、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、Ｔ細胞上のＣＤ４抗原を標的とするＣＡＲを発現する。したがって、好ましくは、ＣＡＲはＴ細胞上のＣＤ４抗原に特異的である。ＣＤ４抗原は、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージ及び樹状細胞（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ４［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０１７３０．１；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００６０７．１）等の免疫細胞の表面に見られる糖タンパク質であることが理解されよう。ＣＤ４抗原のポリペプチド配列の一実施形態は、本明細書では以下のように配列番号１として表される。
ＭＮＲＧＶＰＦＲＨＬ ＬＬＶＬＱＬＡＬＬＰ ＡＡＴＱＧＫＫＶＶＬ ＧＫＫＧＤＴＶＥＬＴ ＣＴＡＳＱＫＫＳＩＱ ＦＨＷＫＮＳＮＱＩＫ ＩＬＧＮＱＧＳＦＬＴ ＫＧＰＳＫＬＮＤＲＡ ＤＳＲＲＳＬＷＤＱＧ ＮＦＰＬＩＩＫＮＬＫ ＩＥＤＳＤＴＹＩＣＥ ＶＥＤＱＫＥＥＶＱＬ ＬＶＦＧＬＴＡＮＳＤ ＴＨＬＬＱＧＱＳＬＴ ＬＴＬＥＳＰＰＧＳＳ ＰＳＶＱＣＲＳＰＲＧ ＫＮＩＱＧＧＫＴＬＳ ＶＳＱＬＥＬＱＤＳＧ ＴＷＴＣＴＶＬＱＮＱ ＫＫＶＥＦＫＩＤＩＶ ＶＬＡＦＱＫＡＳＳＩ ＶＹＫＫＥＧＥＱＶＥ ＦＳＦＰＬＡＦＴＶＥ ＫＬＴＧＳＧＥＬＷＷ ＱＡＥＲＡＳＳＳＫＳ ＷＩＴＦＤＬＫＮＫＥ ＶＳＶＫＲＶＴＱＤＰ ＫＬＱＭＧＫＫＬＰＬ ＨＬＴＬＰＱＡＬＰＱ ＹＡＧＳＧＮＬＴＬＡ ＬＥＡＫＴＧＫＬＨＱ ＥＶＮＬＶＶＭＲＡＴ ＱＬＱＫＮＬＴＣＥＶ ＷＧＰＴＳＰＫＬＭＬ ＳＬＫＬＥＮＫＥＡＫ ＶＳＫＲＥＫＡＶＷＶ ＬＮＰＥＡＧＭＷＱＣ ＬＬＳＤＳＧＱＶＬＬ ＥＳＮＩＫＶＬＰＴＷ ＳＴＰＶＱＰＭＡＬＩ ＶＬＧＧＶＡＧＬＬＬ ＦＩＧＬＧＩＦＦＣＶ ＲＣＲＨＲＲＲＱＡＥ ＲＭＳＱＩＫＲＬＬＳ ＥＫＫＴＣＱＣＰＨＲ ＦＱＫＴＣＳＰＩ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１］
したがって、好ましくは、ＣＡＲは、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含むＣＤ４抗原に特異的である。
好ましくは、別の実施形態では、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域（Ｖβ）を標的とするＣＡＲを発現する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして抗原の断片を認識する役割を果たす、Ｔ細胞又はＴリンパ球の表面に見られるタンパク質複合体であることが理解されよう。ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖から構成される。ヒトでは、Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲは、ＴＲＡによってコードされるアルファ（α）鎖と、ＴＲＢによってコードされるベータ（β）鎖とからなる。
以下の表１は、関連するコード遺伝子と共にＴ細胞上のＶβ領域を列挙し、これらのうちのいずれか１つ又は複数が本発明のＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞上のＣＡＲによって標的化され得る。
ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、Ｔ細胞上の複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域（Ｖβ）を標的とするＣＡＲを発現し得る。好ましくは、複数のＶβ領域は、表１に示すＶβ領域の群から選択されてもよい。例えば、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、好ましくは表１に列挙されるように、Ｔ細胞上の少なくとも２つ又は少なくとも３つ又は少なくとも４つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域（Ｖβ）を標的とするＣＡＲを発現し得る。ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、好ましくは表１に列挙されるように、Ｔ細胞上の少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、又は少なくとも７つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域（Ｖβ）を標的とするＣＡＲを発現し得る。複数のＴＣＲ Ｖβ領域は、同じ又は異なるＶβ領域であり得る。
以下のＶｂファミリーは、Ｔ細胞リンパ腫、すなわちＶｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７及びＶｂ ２０に頻繁に関連すると考えられている。したがって、好ましい実施形態では、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、以下のＶβ領域：Ｖｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７及びＶｂ ２０からなる群から選択されるＴ細胞上の１つ又は複数のＴＣＲ Ｖβ領域を標的とするＣＡＲを発現する。好ましくは、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、以下のＶβ領域：Ｖｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７及びＶｂ ２０からなる群から選択されるＴ細胞上の少なくとも２つ又は３つのＴＣＲ Ｖβ領域を標的とするＣＡＲを発現する。
したがって、好ましくは、ＣＡＲは、Ｔ細胞上の少なくとも１つ又は複数のＴＣＲ Ｖβ領域、最も好ましくはＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖に特異的である。ＴＣＲ Ｖβ７．１領域（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓが再配列したＴＣＲ Ｖβ７．１ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ａ０Ａ５７７．１）のポリペプチド配列の一実施形態は、本明細書では以下のように配列番号２として表される。
ＭＧＣＲＬＬＣＣＡＶＬＣＬＬＧＡＶＰＩＤＴＥＶＴＱＴＰＫＨＬＶＭＧＭＴＮＫＫＳＬＫＣＥＱＨＭＧＨＲＡＭＹＷＹＫＱＫＡＫＫＰＰＥＬＭＦＶＹＳＹＥＫＬＳＩＮＥＳＶＰＳＲＦＳＰＥＣＰＮＳＳＬＬＮＬＨＬＨＡＬＱＰＥＤＳＡＬＹＬＣＡＳＳＱ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２］
したがって、好ましくは、ＣＡＲは、実質的に配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含む少なくとも１つ又は複数のＴＣＲ Ｖβ領域（及びより好ましくはＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖）に特異的である。
好ましくは、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、アポトーシスを誘導することによって標的Ｔ細胞を直接死滅させるように構成される。
好ましくは、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、例えば患者の有害反応の場合に、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を制御可能に又は誘導可能に排除することを可能にする１つ又は複数のコード配列を含む。１つ又は複数のコード配列は、いわゆる「自殺遺伝子」として当業者に公知であり得る。
したがって、一実施形態では、１つ又は複数のコード配列は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）又は切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）（ｒｅｆｓ）（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ００５３３；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１３３３８２６．１）をコードし得る。ｔＥＧＦＲの発現は、患者におけるＣＡＲ－Ｔ細胞のモニタリング又は枯渇のための抗ＥＧＦＲｍＡｂ（セツキシマブ）によって制御することができる。ＥＧＦＲは、ヒトにおいてＨＥＲ１として知られており、細胞外タンパク質リガンド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０１１３３；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１７１６０１．１）の上皮成長因子（ＥＧＦ）のメンバーの受容体である膜貫通タンパク質であることが理解されよう。
別の実施形態において、１つ又は複数のコード配列は、誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｄｉａｃｏｎｕ ｅｔ ａｌ．，５８０，２５，３，Ｍａｒｃｈ ２０１７）をコードし得る。ｉＣ９は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ６２９４２；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００７９２．１）に融合して、融合タンパク質を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のアポトーシスを誘発する、二量体化化学誘導物質（カスパーゼ誘導性薬物（ＣＩＤ）、Ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）を用いた条件付き二量体化を可能にする改変ヒトカスパーゼ－９（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ５５２１１；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２２０．２）である。
好ましくは、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）及び／又は誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）をコードするコード配列を含む。より好ましくは、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）及び誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）をコードするコード配列を含む。
ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸又は遺伝子構築物をＭＡＩＴ細胞に形質導入することによって産生されることが理解されるであろう。Ｔ細胞特異的かつ活性なＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を産生するために、ＭＡＩＴ細胞の高度に精製された培養物がＣＡＲ形質導入工程において使用されることが重要である。したがって、本発明者らは、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）法及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法を組み合わせることによって、ヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）から精製ＭＡＩＴ細胞を単離するための効果的な方法を開発し、その結果、得られた方法は、高い増殖倍率で大量のＭＡＩＴ細胞を生じる。
したがって、好ましくは、ＭＡＩＴ細胞は、ヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。好ましくは、ＭＡＩＴ細胞は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）及び／又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、より好ましくはＭＡＣＳ及びＦＡＣＳの両方によってＰＢＭＣから単離される。本発明者らは、それらのＭＡＩＴ単離方法がそれ自体新規であると考えている。
したがって、第２の態様では、ＭＡＩＴ細胞を単離する方法が提供され、
（ｉ）末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を提供することと、
（ｉｉ）ＰＢＭＣを磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）及び／又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に供して、そこからＭＡＩＴ細胞を単離することと、
を含む。
好ましくは、本発明の方法は、純粋なエクスビボＭＡＩＴ細胞の単離をもたらす。一実施形態では、方法は、ＰＢＭＣをＭＡＣＳ又はＦＡＣＳのいずれかに供して、そこからＭＡＩＴ細胞を単離することを含む。しかしながら、好ましくは、方法は、ＰＢＭＣをＭＡＣＳ及びＦＡＣＳの両方に供して、そこからＭＡＩＴ細胞を単離することを含む。好ましくは、ＰＢＭＣは、最初にＭＡＣＳに供され、続いてＦＡＣＳに供される。好ましくは、方法は、ＭＡＣＳによってＰＢＭＣからＴＣＲ Ｖα７．２＋細胞を単離すること、次いで、ＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ四量体染色によってそれらの細胞をＦＡＣＳに供して、ＭＡＩＴ細胞を単離することを含む。
ＭＡＣＳ手順（工程（ｉｉ））は、ＰＢＭＣを回収し、次いで、細胞を結合緩衝液で洗浄することを含み得る。上清を捨て、得られた細胞ペレットをＭＡＣＳ緩衝液（例えば、１×１０７／１００μｌの濃度で）に再懸濁してもよい。溶液をフィコエリトリン（ＰＥ）抗ヒトＴＣＲ Ｖα７．２抗体（例えば、１：１００の比で）と接触させることができる。溶液を混合し、次いでそれをインキュベートすることができる（例えば氷上で３０分間）。細胞をＭＡＣＳ緩衝液（例えば、３００×ｇで５分間遠心分離することによって）で洗浄することができる。細胞をＭＡＣＳ緩衝液（例えば１０７／８０μｌの濃度で）に再懸濁し得る。懸濁液を抗ＰＥマイクロビーズと接触させ、次いで、それをインキュベートすることができる（例えば氷上で２０分間）。細胞を洗浄することができる（例えば、１０倍体積のＭＡＣＳ緩衝液）。溶液を遠心分離することができる（例えば、３００×ｇで５分間）。細胞を再懸濁し得る（例えば１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液中）。ＭＳカラムをＭＡＣＳ緩衝液で予備洗浄し、磁石上に組み立てることができる。細胞をカラムに適用し、ＭＡＣＳを実施してもよい。次いで、カラムを１回又は複数回洗浄することができる（例えば、毎回ＭＡＣＳ緩衝液）。カラムを磁石から除去し、結合した細胞をカラムから溶出させることができる（例えば、ＭＡＣＳ緩衝液中）。
（工程（ｉｉ）における）ＦＡＣＳ手順は、磁石分離された細胞を収集し、次いで遠心分離すること（例えば、３００×ｇで５分間）を含み得る。細胞を再懸濁し得る（例えば、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて１０７／１００μｌの濃度で）。溶液を、ＢＶ４２１標識ヒト５－ＯＰ－ＲＵ ＭＲ１四量体（例えば、１：５００の比で）及びＡＰＣ－Ｈ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ３（例えば、１：２００の比で）と接触させ得る。次いで、溶液をインキュベートすることができる（例えば氷上で２０分間）。細胞を洗浄することができる（例えば、１０倍体積のＦＡＣＳ緩衝液）。溶液を遠心分離することができる（例えば、３００×ｇで５分間）。細胞を再懸濁し得る（例えば２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中）。次いで、ＦＡＣＳ選別機（例えば、ＢＤ Ｐｒｏｄｉｇｙ Ｓｏｒｔｅｒ）に細胞試料を負荷し、ＦＡＣＳを行うことができる。
単離されたＭＡＩＴ細胞にＣＡＲをコードする核酸を形質導入する前に、好ましくは、ＭＡＩＴ細胞は、第２の態様の方法における工程（ｉｉ）の後の後続の工程において活性化される。したがって、この方法は、単離されたＭＡＩＴ細胞を抗ＣＤ３抗体で、好ましくはインビトロで活性化することを更に含む。この方法は、単離されたＭＡＩＴ細胞を抗ＣＤ２８抗体で、好ましくはインビトロで活性化することを含む。好ましくは、単離されたＭＡＩＴ細胞は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の両方により、実質的に同時に又は順次に活性化される。逐次活性化は、ＭＡＩＴ細胞を最初に抗ＣＤ３と接触させ、続いて抗ＣＤ２８抗体と接触させること、又は最初に抗ＣＤ２８抗体と接触させ、次いで抗ＣＤ３抗体と接触させることを含み得る。抗体との接触は、少なくとも１日間、２日間又は３日間であり得る。
ＭＡＩＴ細胞活性化手順は、遠心分離（例えば、３００×ｇで５分間）によって選別されたＭＡＩＴ細胞を回収することを含み得る。上清を廃棄してもよく、ペレットを再懸濁してもよい（例えば、Ｒ１０培地中１０６細胞／ｍｌまで）。溶液をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８と接触させ得る（例えば、３０秒間ボルテックスすることによって）。所望の体積のＤｙｎａｂｅａｄｓをチューブに移してもよい。等体積の緩衝液をチューブに加えてもよく、これを混合してもよい（例えば、５秒間ボルテックスすることによって）。チューブを磁石（例えば１分間）上に置き、上清を廃棄してもよい。チューブを磁石から取り出し、洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓを再懸濁してもよい（例えば、Ｒ１０培地中で）。所望の体積のＤｙｎａｂｅａｄｓを細胞懸濁液（例えば、３７℃のインキュベーターにおいて２４ウェルプレート中１００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２で約１：１のビーズ対細胞比を得るために）と接触させ得る。
次いで、この方法は、単離され、活性化されたＭＡＩＴ細胞に、ＣＡＲをコードする核酸を形質導入することを含み得る。
ＭＡＩＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ様分子ＭＲ１を認識するＣＤ３＋ＴＣＲＶａ７．２＋ＣＤ１６１＋細胞として定義される自然Ｔ細胞のサブセットである。以前の研究は、ＭＡＩＴ細胞がインビトロで拡大され得るが、同種異系フィーダー細胞の存在を必要とすることを示している。しかしながら、この方法の問題は、大規模な生産及び品質管理が困難であることである。実施例１０に記載されるように、また、図１５に示されるように、本発明者らはここで、様々なサイトカインの組合せの存在下でＰＢＭＣを抗原（５－ＯＰ－ＲＵ）ロードＭＲ１テトラマービーズ又は５－ＯＰ－ＲＵ（単独）により最初に刺激することによってインビトロにおけるＭＡＩＴ細胞の拡大培養のための驚くほど効果的な方法を最大６日間にわたってインビトロで開発した。次いで、ＭＡＩＴ細胞をＭＡＣＳ又はＦＡＣＳ選別によって単離し、その後、上記のように、ＣＡＲに基づく治療のために抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによって更に拡大させた。
したがって、好ましい実施形態では、方法は、ＭＡＣＳ及び／又はＦＡＣＳ工程（すなわち、工程ｉｉ）に供される前にＰＢＭＣを刺激することを含み得る。好ましくは、この初期の刺激する工程は、ＰＢＭＣを（ａ）ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ又は５－ＯＰ－ＲＵのいずれかを含む抗原並びに／あるいは（ｂ）サイトカインと接触させることを含む。好ましくは、刺激する工程は、ＰＢＭＣを（ａ）ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ又は５－ＯＰ－ＲＵのいずれかを含む抗原並びに（ｂ）サイトカインと接触させることを含む。刺激工程は、ＰＢＭＣを抗原及び／又はサイトカインと少なくとも１日、２日又は３日間接触させることを含み得る。刺激工程は、少なくとも４日間、５日間又は６日間継続し得る。好ましくは、刺激工程は、インビトロ培養においてＰＢＭＣを抗原及び／又はサイトカインと接触させることを含む。
ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ及び５－ＯＰ－ＲＵは国際公開第２０１５／１４９１３０号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。したがって、好ましくは、抗原は、国際公開第２０１５／１４９１３０号（ＰＣＴ／ＡＵ２０１５／０５０１４８）に記載されているように、ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ又は５－ＯＰ－ＲＵのいずれかを含む。
サイトカインは、どのようなインターロイキンであってもよい。しかしながら、好ましくは、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３からなる群から選択される１つ又は複数のインターロイキン、又はそれらの任意の組合せであり得る。インターロイキンの濃度は、少なくとも５、１０又は２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも３０、４０又は５０ｎｇ／ｍｌであり得る。
例えば、１つ又は複数のインターロイキンは、（ｉ）ＩＬ－２のみ（図１５の条件１）、（ｉｉ）ＩＬ－１２及びＩＬ－１８（図１５の条件１１）、（ｉｉｉ）ＩＬ－２、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８（図１５の条件３）、（ｉｖ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３（図１５の条件１２）、（ｖ）ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３（図１５の条件１３）、又は（ｖｉ）ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８（図１５の条件８）。
最も好ましくは、１つ又は複数のインターロイキンは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３の組合せを含み得る。したがって、好ましくは、刺激する工程は、ＰＢＭＣを（ａ）ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ又は５－ＯＰ－ＲＵのいずれかを含む抗原及び（ｂ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３の組合せと接触させることを含む。
本発明者らは、ＰＢＭＣの培養物中のＭＡＩＴ細胞を刺激するための新規な方法を考案したと考えている。
したがって、別の態様では、ＰＢＭＣの培養物中のＭＡＩＴ細胞を刺激する方法であって、方法は、ＰＭＢＣの培養物を、（ａ）ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ若しくは５－ＯＰ－ＲＵを含む抗原、並びに／又は（ｂ）ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３、若しくはそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ又は複数のインターロイキンと接触させることを含む。
好ましくは、１つ又は複数のインターロイキンは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及び／又はＩＬ－２３である。より好ましくは、１つ又は複数のインターロイキンは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３である。
本発明者らは、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を作製する本発明者らの方法もまた、それ自体が新規であると考える。
したがって、第３の態様では、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を作製する方法が提供され、方法は、
（ｉ）末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を提供することと、
（ｉｉ）ＰＢＭＣをＭＡＣＳ及び／又はＦＡＣＳに供して、そこからＭＡＩＴ細胞を単離することと、
（ｉｉｉ）単離されたＭＡＩＴ細胞を、場合により抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体と接触させることによって、活性化することと、
（ｉｖ）活性化されたＭＡＩＴ細胞を、ＣＡＲをコードする核酸で形質導入し、それにより、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を作製することと、
を含む。
第３の態様の方法の工程（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）は、第２の態様の方法に関して本明細書に記載された工程と同じであってもよく、したがって、これらの方法工程は交換可能である。更に、好ましくは、この方法は、ＰＢＭＣをＭＡＣＳ及び／又はＦＡＣＳ工程（すなわち、工程ｉｉ）に供する前に刺激することを含む。好ましくは、この初期の刺激する工程は、ＰＢＭＣを（ａ）ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ又は５－ＯＰ－ＲＵのいずれかを含む抗原並びに／あるいは（ｂ）サイトカインと接触させることを含む。好ましくは、刺激する工程は、ＰＢＭＣを（ａ）ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ又は５－ＯＰ－ＲＵのいずれかを含む抗原並びに（ｂ）サイトカインと接触させることを含む。サイトカインは、上記のように、第２の態様に関連して記載されるインターロイキン、好ましくはＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３からなる群から選択される１つ又は複数のインターロイキン、又はそれらの任意の組合せであり得る。
最も好ましくは、１つ又は複数のインターロイキンは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３の組合せを含み得る。したがって、好ましくは、刺激する工程は、ＰＢＭＣを（ａ）ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ又は５－ＯＰ－ＲＵのいずれかを含む抗原及び（ｂ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３の組合せと接触させることを含む。
ＭＡＩＴ細胞は、単離されたＭＡＩＴ細胞が工程（ｉｖ）においてＣＡＲをコードする核酸で形質導入される前に工程（ｉｉｉ）において活性化されることが好ましい。単離されたＭＡＩＴ細胞は、抗ＣＤ３抗体で、好ましくはインビトロで活性化され得る。単離されたＭＡＩＴ細胞は、抗ＣＤ２８抗体で、好ましくはインビトロで活性化され得る。好ましくは、単離されたＭＡＩＴ細胞は、第２の態様の方法に関連して記載されるように、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の両方により、実質的に同時に又は順次に活性化される。
ＭＡＩＴ細胞形質導入手順（すなわち、工程（ｉｖ））は、ＣＡＲをコードする核酸でＭＡＩＴ細胞を形質導入することを含み得る。形質導入工程はウイルス形質導入を含み得る。好ましくは、ＭＡＩＴ細胞形質導入手順は、ＣＡＲをコードする核酸でＭＡＩＴ細胞をレトロウイルス形質導入することを含む。ＭＡＩＴ細胞は、本明細書に記載されるような、例えば第５の態様によるＣＡＲ又は第６の態様によるベクターをコードする任意の核酸で形質導入され得る。核酸は、Ｔ細胞上のＣＤ４抗原又は少なくとも１つ又は複数のＴＣＲ Ｖβ領域を標的とするＣＡＲをコードし得る。好ましくは、核酸は、Ｔ細胞上の表１に示される１つ又は複数のＴＣＲ Ｖβ領域（及びより好ましくはＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖）を標的とするＣＡＲをコードし得る。核酸は、以下のＶβ領域：Ｖｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７及びＶｂ ２０からなる群から選択されるＴ細胞上の１つ又は複数のＴＣＲ Ｖβ領域を標的とするＣＡＲをコードし得る。
好ましくは、形質導入は、ＭＡＩＴ細胞活性化の少なくとも３４時間後、３６時間後又は４８時間後に行われる。形質導入の前に（例えば、約１日前）、レトロネクチン被覆プレートを調製することができる。レトロネクチン（例えば約１５μｇ）をＰＢＳ（例えば約１ｍｌ）と接触させて溶液を形成することができる。この方法は、非組織培養処理２４ウェルプレートの一方のウェルに溶液を導入することを含み得る。プレートを包み（例えば、粘着フィルムによる）、約４℃で保存してもよい（例えば冷蔵庫で一晩）。遺伝子導入の日に、未結合のレトロネクチンをウェルから取り出す。ウェルを洗浄してもよい（例えば、２ｍｌのＰＢＳで１回又は２回）。好ましくは、ウェルを乾燥させない。レトロウイルス上清を解凍することができる（例えば、３７℃の水浴中で）。ウイルス上清を、好ましくはレトロネクチン被覆プレートの各ウェルに移す（例えば約１ｍｌ）。プレートは、粘着フィルムによって包まれてもよい。プレートを遠心分離することができる（例えば、１０００×ｇ、３２℃で２時間）。遠心分離中に、活性化ＭＡＩＴ細胞を収集することができる。回収した細胞を再懸濁してもよい（例えば、１×１０６／ｍｌの濃度まで１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含有する新鮮なＲ１０培地において）。遠心分離が完了したら、上清をプレートから廃棄することができる。細胞懸濁液（例えば１ｍｌ）を各ウェルに添加してもよい。プレートを遠心分離することができる（例えば、５００×ｇで１０分間）。次いで、プレートをインキュベートすることができる（例えば、３７℃のインキュベーター内で）。必要に応じて、より高い形質導入効率を達成するために形質導入工程を繰り返してもよい。形質導入効率は、形質導入の約４８時間後にフローサイトメトリによって検出され得る。
本発明の方法は、好ましくは、第３の態様の方法における工程（ｉｖ）の後の後続の工程においてＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を拡大する工程を含む。ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞増殖工程は、形質導入の１又は２日後に、好ましくはレトロウイルス又はウイルスを用いて、形質導入されたＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を回収することを含み得る。回収した細胞を計数することができる（例えば、血球計によって）。次いで、回収した細胞をプレートのウェルに（例えば、１×１０７個の細胞をＧｒｅｘ６Ｍウェルプレートのウェルに）移すことができる。次いで、回収した細胞をインターロイキンと接触させることができる。例えば、インターロイキンは、Ｒ１０培地（例えば１３０ｍｌ）等の適切な培地に含まれるＩＬ－２（例えば約１００ＩＵ／ｍｌ）であり得る。プレートをインキュベーターに戻してもよい。次いで、ＩＬ－２をリフレッシュすることができる（例えば、３日ごとに１００ＩＵ／ｍｌの最終濃度まで）。ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を８～１２日間の培養後に回収することができる。拡大されたＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞が、表現型試験、機能的アッセイのために使用される場合があり、かつ／又は、その後の使用のために凍結される場合がある（例えば液体窒素中で）。
有利には、実施例に記載されるように、１１日間の培養により、１００倍の拡大レベルのＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞がもたらされ、形質導入効率が５０％を超えた。本発明者らは、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞が、驚くべきことに、従来のＣＡＲ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞と少なくとも同等の細胞傷害性効力を示したことを認めた。
第４の態様において、第３の態様の方法によって得られるか又は得ることができるＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞が提供される。
本明細書中に記載されるように、第２の態様又は第３の態様のいずれかの方法を使用して得られる単離されたＭＡＩＴ細胞が活性化され得、最終的には、ＣＡＲをコードする核酸構築物により形質導入されて、第１の態様又は第４の態様のＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞が作製される。本明細書で論じられるように、本発明者らは、Ｔ細胞上のＣＤ４分子（この場合、構築物及びベクターは本明細書で「ＣＡＲＴ４」と呼ばれる）又は１つ若しくは複数のＴＣＲ－Ｖβ領域、例えばＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖（この場合、構築物及びベクターは本明細書で「ＣＡＲＴＶｂ７．１」と呼ばれる）のいずれかを特異的に標的とするＣＡＲをコードする新規な遺伝子構築物及び組換えベクターを開発した。これらの構築物及びベクターのいずれかが、第３の態様又は第４の態様の方法においてＭＡＩＴ細胞を形質導入するために使用され得る。
遺伝子構築物は、第３世代ＣＡＲを形成するためのＣＤ２８／４－１ＢＢ／ＣＤ３－ゼータ鎖シグナル伝達部分を有する、（ｉ）抗ＣＤ４ｍＡｂ（例えば、Ｈｕ５Ａ８）又は（ｉｉ）抗ＴＣＲ－ＶｂｍＡｂ、例えば抗ＴＣＲ－Ｖｂ７．１ｍＡｂ（例えば３Ｇ５）のいずれかのｓｃＦｖを含む。ＣＡＲをコードする構築物は、切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）及び／又は誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）等のいわゆる自殺遺伝子によってコードされる少なくとも１つの安全スイッチを更に含み、所望に応じて結果として生じるＣＡＲ－Ｔ細胞の除去を可能にし、そのため、ＣＡＲ－Ｔ細胞を治療に使用する場合に洗練されたモニタリングシステム又は安全機構を提供する。ｔＥＧＦＲの発現は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を監視又は枯渇させるための抗ＥＧＦＲｍＡｂ（例えば、セツキシマブ）によって認識することができ、ｉＣ９は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質に融合された改変ヒトＣａｓｐａｓｅ－９であり、融合タンパク質を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のアポトーシスを誘発する二量体化の化学的誘導物質（例えば、Ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）を用いた条件付き二量体化を可能にする。本発明者らは、本発明者らが開発したＣＡＲコード核酸構築物がそれ自体新規であると考える。図１Ａ（１及び２）を参照すると、本発明によるＣＡＲコード化構築物の２つの実施形態に含まれる機能的要素を示す概略図が示され、すなわち、「ＣＡＲＴ４」が図１Ａ（１）に示されており、「ＣＡＲＴＶｂ７．１」が図１Ａ（２）に示されている。しかしながら、Ｖβ７．１ファミリーを標的とする抗ＴＣＲ－Ｖｂ７．１を有する「ＣＡＲＴＶｂ７．１」は純粋に例示的なものであり、任意のＶβ領域、例えば表１に示されるＶβのいずれか、特にＶｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７及びＶｂ ２０のいずれかがＣＡＲによって標的とされ得ることが理解されよう。
したがって、第５の態様では、抗ＣＤ４キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－β ＣＡＲのいずれかをコードする、第１のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物が提供される。
プロモータは、構成的プロモータ、活性化可能なプロモータ、誘導可能なプロモータ、又は組織特異的プロモータを含む任意の適切なプロモータであり得る。
構成的プロモータは、異種遺伝子（導入遺伝子とも呼ばれる）が宿主細胞において構成的に発現されることを可能にする。本明細書で企図される例示的な構成的プロモータには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ヒト伸長因子－１α（ｈＥＦｌａ）、ユビキチンＣプロモータ（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモータ（ＰＧＫ）、シミアンウイルス４０初期プロモータ（ＳＶ４０）、及びＣＭＶ初期エンハンサーとカップリングされたニワトリβ－アクチンプロモータ（ＣＡＧＧ）が含まれるが、これらに限定されない。誘導性プロモータは、調節プロモータのカテゴリーに属する。誘導性プロモータは、１つ又は複数の条件、例えば、物理的条件、操作された免疫エフェクター細胞の微小環境、又は操作された免疫エフェクター細胞の生理学的状態、誘導物質（すなわち、誘導剤）、又はそれらの組合せによって誘導することができる。いくつかの態様において、誘導条件は、操作された哺乳動物細胞において、及び／又は薬学的組成物を受ける被験体において内因性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態では、誘導条件は、誘導物質、照射（電離放射線、光等）、温度（熱等）、酸化還元状態、腫瘍環境、及び操作された哺乳動物細胞の活性化状態からなる群から選択される。
一実施形態では、プロモータはＰＧＫプロモータ（ＥＭＢＬ番号：Ａ１９２９７．１）であり得る。一実施形態では、ＰＧＫプロモータは、以下のように、本明細書では配列番号３と呼ばれる。
ＧＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＴＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧＧＣＧＣＴＡＣＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＡＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＡＧＣＴＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＣＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＧＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＡＴＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＣＧＴＣＴＧＣＣＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴＣＣＧＧＧＣＣＴＴＴＣＧ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３］
したがって、好ましくは、プロモータは、実質的に配列番号３に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得る。
核酸構築物は、シグナル伝達ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。有利には、シグナル伝達ペプチドは、ＣＡＲ（すなわち、融合タンパク質である）をＴ細胞外膜に導くように構成される。好ましくは、シグナル伝達ペプチドをコードする配列は、プロモータの３’側に配置される。好ましくは、シグナル伝達ペプチドはＩｇκシグナル伝達ペプチドである。一実施形態では、シグナル伝達ペプチドは、以下のように、本明細書で配列番号４と呼ばれるアミノ酸配列を有することができる。
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するシグナル伝達ペプチド、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、シグナル伝達ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本明細書では以下のように配列番号５と呼ばれる。
ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＣ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号５に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、第１のコード配列は、シグナル伝達ペプチドをコードする配列の３’に配置される。核酸構築物の第１の実施形態では、第１のコード配列が抗ＣＤ４キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。好ましくは、ＣＡＲは、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含むＣＤ４抗原に特異的である。
図１Ａ（１）（「ＣＡＲＴ４」）に示されるように、第１のコード配列は、ＶＬ（可変軽鎖）配列及びＶＨ（可変重鎖）配列を含み得るｓｃＦｖ領域をコードし得る。好ましくは、ＶＬ配列はＶＨ配列の上流（すなわち、５’）にある。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＶＨ配列はＶＬ配列の上流にあり得る。
ＶＬ配列及びＶＨ配列は、一実施形態では、Ｔ細胞上のＣＤ４抗原に結合するためのＨｕ５Ａ８（すなわち、抗ＣＤ４モノクローナル抗体のハイブリドーマクローン名）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域であり得る。
したがって、一実施形態では、第１のコード配列（ＣＤ４に結合するためのＶＬ配列をコードし得る）は、以下のように、本明細書では配列番号６と呼ばれるアミノ酸配列をコードする。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：６］
したがって、好ましくは、第１のコード配列は、実質的に配列番号６に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、第１のコード配列（ＣＤ４に結合するためのＶＬ配列をコードし得る）は、以下のように、本明細書では配列番号７と呼ばれるヌクレオチド配列を含む：
ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＴＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣＣＣＧＡＧＡＧＴＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＴＡＧＣＴＣＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＴＡＴＡＧＣＴＡＣＣＧＡＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：７］
したがって、好ましくは、第１のコード配列は、実質的に配列番号７に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
一実施形態では、第１のコード配列（ＣＤ４に結合するためのＶＨ配列をコードし得る）は、以下のように、本明細書では配列番号８と呼ばれるアミノ酸配列をコードする。
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８］
したがって、好ましくは、第１のコード配列は、実質的に配列番号８に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、第１のコード配列（ＣＤ４に結合するためのＶＨ配列をコードし得る）は、以下のように、本明細書では配列番号９と呼ばれるヌクレオチド配列を含む：
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＣＣＡＧＡＧＧＴＧＧＴＣＡＡＡＣＣＣＧＧＣＧＣＴＡＧＣＧＴＣＡＡＡＡＴＧＴＣＣＴＧＴＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＴＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＣＧＧＧＴＡＣＡＴＴＡＡＣＣＣＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＧＡＣＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＡＧＴＣＴＧＡＧＧＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＧＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣＡＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＡＴＣＣ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：９］
したがって、好ましくは、第１のコード配列は、実質的に配列番号９に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、ＶＨ（例えば、配列番号９）及びＶＬ（例えば、配列番号７）配列は、いずれかの配向にある場合、リンカー配列によって分離されている。一実施形態では、リンカー配列は、本明細書では以下のように配列番号１０と呼ばれるＧ４Ｓリンカー配列であり得る。
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１０］
したがって、好ましくは、第１のコード配列は、実質的に配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、リンカー配列は、以下のように、本明細書では配列番号１１と呼ばれるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１１］
したがって、好ましくは、リンカー配列は、実質的に配列番号１１に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
しかしながら、核酸構築物の第２の実施形態（「ＣＡＲＴＶｂ７．１」）では、第１のコード配列は抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－β領域ＣＡＲをコードする。任意のＶβ領域がＣＡＲによって標的化され得ることが理解されるであろう。例えば、表１に列挙されるＶβ領域のいずれかは、第１のコード配列によってコードされるＣＡＲによって標的化され得る。
第１のコード配列は、複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域（Ｖβ）ＣＡＲをコードし得る。好ましくは、複数のＶβ領域は、表１に示すＶβ領域の群から選択されてもよい。同じ構築物上で２つ以上のＶβ領域標的化ＣＡＲを組み合わせることも可能である。例えば、構築物は、好ましくは表１に列挙されるような、少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は少なくとも４つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域（Ｖβ）標的ＣＡＲをコードするコード配列を含み得る。構築物は、好ましくは表１に列挙されるように、少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、又は少なくとも７つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域（Ｖβ）標的ＣＡＲをコードするコード配列を含み得る。複数のＴＣＲ Ｖβ領域は、同じ又は異なるＶβ領域であり得る。
以下のＶｂファミリーは、Ｔ細胞リンパ腫、すなわちＶｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７及びＶｂ ２０に頻繁に関連すると考えられている。したがって、好ましい実施形態では、構築物は、以下のＶβ領域：Ｖｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７、及びＶｂ ２０からなる群から選択されるＴ細胞上の１つ又は複数のＴＣＲ Ｖβ領域を標的とする少なくとも１つのＣＡＲをコードするコード配列を含む。好ましくは、構築物は、以下のＶβ領域：Ｖｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７、及びＶｂ ２０からなる群から選択されるＴ細胞上の少なくとも２つ又は３つのＴＣＲ Ｖβ領域を標的とする少なくとも１つのＣＡＲをコードするコード配列を含む。
したがって、好ましくは、複数の抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－β ＣＡＲをコードする第１のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物が提供され、ここで、Ｔ細胞上の異なるＶ－β領域が標的化される。
好ましくは、ＣＡＲは、実質的に配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含むＴＣＲ Ｖβ領域（好ましくは、ＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖）に特異的である。
図１Ａ（２）に示されるように、第１のコード配列は、ＶＬ（可変軽鎖）配列及びＶＨ（可変重鎖）配列を含み得るｓｃＦｖ領域をコードし得る。好ましくは、ＶＬ配列はＶＨ配列の上流（すなわち、５’）にある。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＶＨ配列はＶＬ配列の上流にあり得る。好ましくは、いずれかの向きのＶＨ及びＶＬコード配列は、Ｇ４Ｓリンカー配列等のリンカー配列によって分離されている。
ＶＬ配列及びＶＨ配列は、一実施形態では、ＴＣＲ Ｖ－β７．１抗原に結合するための３Ｇ５（すなわち、抗ＴＣＲ Ｖβ７．１モノクローナル抗体のハイブリドーマクローン名）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域であり得る。
一実施形態では、第１のコード配列（これは、ＴＣＲ Ｖ－β、好ましくはＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖に結合するためのＶＬ配列をコードし得る）は、本明細書で以下の配列番号１２と呼ばれるアミノ酸配列をコードする。
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＷＩＴＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＹＰＧＳＧＦＴＫＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＧＧＮＹＷＹＦＤＶＷＧＴＧＴＴＶＴＶＳＳ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１２］
したがって、好ましくは、第１のコード配列は、実質的に配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、第１のコード配列（これは、ＴＣＲ Ｖ－β、好ましくはＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖に結合するためのＶＬ配列をコードし得る）は、本明細書で以下の配列番号１３と呼ばれるヌクレオチド配列を含む。
ＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＣＴＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＣＴ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１３］
したがって、好ましくは、第１のコード配列は、実質的に配列番号１３に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
一実施形態では、第１のコード配列（これは、ＴＣＲ Ｖ－β、好ましくはＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖に結合するためのＶＨ配列をコードし得る）は、本明細書で以下の配列番号３４と呼ばれるアミノ酸配列をコードする。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＧＫＶＴＬＴＣＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＡＷＹＱＨＫＰＧＫＧＰＲＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＲＤＹＳＦＳＩＳＮＬＥＰＥＤＶＡＴＹＹＣＬＱＹＤＮＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＤ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３４］
したがって、好ましくは、第１のコード配列は、実質的に配列番号３４に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、第１のコード配列（これは、ＴＣＲ Ｖ－β、好ましくはＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖に結合するためのＶＨ配列をコードし得る）は、本明細書で以下の配列番号３５と呼ばれるヌクレオチド配列を含む。
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＴＣＴＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＴＡＴＡＴＣＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＧＧＡＣＡＧＡＴ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３５］
したがって、好ましくは、第１のコード配列は、実質的に配列番号３５に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、ＶＨ（例えば、配列番号３５）及びＶＬ（例えば、配列番号１３）配列は、いずれかの配向にある場合、リンカー配列によって分離されている。一実施形態では、リンカー配列は、配列番号１０に実質的に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含み得るか又はそれからなり得るＧ４Ｓリンカー配列であり得る。したがって、好ましくは、リンカー配列は、実質的に配列番号１１に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
核酸構築物は、ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通（ＴＭ）構造ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。有利には、ヒンジ及びＴＭドメインは、ＣＡＲの表示及びＣＡＲ－Ｔ細胞への固定のために構成される。好ましくは、ヒンジ及びＴＭドメインをコードする配列は、第１のコード配列の３’に配置される。
一実施形態では、ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、本明細書では以下のように配列番号１４と呼ばれる。
ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列は、以下のように、本明細書では配列番号１５と呼ばれる。
ＴＴＣＧＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１５］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号１５に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
核酸構築物は、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及び／又はＣＤ３ζ鎖、より好ましくはＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ鎖を含み得る細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。これらの成分は、第３世代ＣＡＲの基礎を形成し、細胞内シグナル伝達経路を誘発するために必要であることが理解されよう。好ましくは、細胞内ドメインは、ヒンジ及び膜貫通ドメインをコードする配列の３’側に配置される。ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインの５’であり得る。４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖の５’であり得る。
ＣＤ２８シグナル伝達ドメインの一実施形態は、以下のように、本明細書では配列番号１６と呼ばれるアミノ酸配列を有することができる。
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１６］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、以下のように、本明細書では配列番号１７と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
ＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１７］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号１７に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
４－１ＢＢシグナル伝達ドメインの一実施形態は、以下のように、本明細書では配列番号１８と呼ばれるアミノ酸配列を有することができる。
ＲＦＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１８］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインは、以下のように、本明細書では配列番号１９と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
ＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１９］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号１９に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
ＣＤ３ζ鎖の一実施形態は、以下のように、本明細書において配列番号２０と呼ばれるアミノ酸配列を有することができる。
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２０］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ＣＤ３ζ鎖は、以下のように、本明細書では配列番号２１と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２１］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号２１に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、核酸構築物は、少なくとも１つの自殺タンパク質、より好ましくは少なくとも２つの自殺タンパク質をコードする第２のコード配列を含む。本発明の構築物は、少なくとも１つの自殺タンパク質をコードする第２のコード配列の存在が、その構築物により形質導入された得られたＣＡＲ－Ｔ細胞が、例えば、有害な患者反応の場合に、制御可能に又は誘導可能に検出され得るか又は排除され得ることを意味するという点で有利である。
したがって、好ましくは、一実施形態では、抗ＣＤ４キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のコード配列、及び少なくとも１つの自殺タンパク質、より好ましくは少なくとも２つの自殺タンパク質をコードする第２のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物が提供される。
好ましくは、別の実施形態では、抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－β ＣＡＲをコードする第１のコード配列、及び少なくとも１つの自殺タンパク質、より好ましくは少なくとも２つの自殺タンパク質をコードする第２のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物が提供される。
更に別の実施形態では、好ましくは、Ｔ細胞上の異なるＶ－β領域が標的とされる複数の抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－β ＣＡＲをコードする第１のコード配列、及び少なくとも１つの自殺タンパク質、より好ましくは少なくとも２つの自殺タンパク質をコードする第２のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物が提供される。
一実施形態では、第２のコード配列は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）又は切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ００５３３；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ００１３３３８２６．１）をコードし得る。ｔＥＧＦＲの発現は、患者におけるＣＡＲ－Ｔ細胞のモニタリング又は枯渇のための抗ＥＧＦＲｍＡｂ（セツキシマブ）によって制御することができる。一実施形態では、ｔＥＧＦＲのアミノ酸配列は、本明細書では以下のように配列番号２２と呼ばれ得る。
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２２］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号２２に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ｔＥＧＦＲは、以下のように、本明細書では配列番号２３と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
ＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＴＣＣＣＡＣＧＣＡＡＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＧＧＡＡＴＡＧＧＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＣＴＣＡＣＴＣＴＣＣＡＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣＧＡＡＴＡＴＴＡＡＡＣＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＡＴＴＴＡＧＧＧＧＴＧＡＣＴＣＣＴＴＣＡＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＣＡＣＡＧＧＧＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＧＧＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＣＣＴＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＣＧＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＣＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＣＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＴＡＡＣＡＴＣＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＣＣＴＣＣＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＴＧＣＣＡＴＧＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＣＧＴＣＴＣＴＴＧＣＣＧＧＡＡＴＧＴＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＧＣＡＴＡＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＣＣＣＣＡＣＴＧＣＧＴＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＧＧＡＡＧＴＡＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＣＡＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＧＡＡＴＧＧＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＣＧＴＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２３］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号２３に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
別の実施形態において、第２のコード配列は、誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）をコードし得る。ｉＣ９は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ６２９４２；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００７９２．１）に融合して、融合タンパク質を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のアポトーシスを誘発する、二量体化化学誘導物質（カスパーゼ誘導性薬物（ＣＩＤ）、Ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）を用いた条件付き二量体化を可能にする改変ヒトカスパーゼ－９（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ５５２１１；ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２２０．２）である。一実施形態では、ｉＣ９のアミノ酸配列は、本明細書では以下のように配列番号２４と呼ばれ得る。
ＭＬＥＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＳＧＧＧＳＧＶＤＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＶＤＹＰＹＤＶＰＤＹＡＬＤ＊
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２４］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ｉＣ９は、以下のように、本明細書では配列番号２５と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
ＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＣＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＴＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＧＴＡＣＧＡＣＧＴＡＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＡＣＴＣＧＡＣＴＡＡ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２５］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号２５に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、本発明の核酸構築物は、ＥＧＦＲ若しくは切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）及び／又は誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）をコードするコード配列を含む。１つの自殺遺伝子を有することは、治療において使用される場合、ＣＡＲ及びＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の発現に対する（検出及び／又は排除のための）ロバストな制御を提供する。
しかしながら、より好ましくは、核酸構築物は、切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）及び誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）の両方をコードするコード配列を含む。有利には、２つの自殺遺伝子を有することは、治療に使用される場合、ＣＡＲ及びＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の発現に対する（検出及び／又は排除のための）更に厳密な制御を提供する。
好ましくは、核酸構築物は、消化される（又は自己切断される）ように構成されたペプチドスペーサーをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより、スペーサーの両側にコードされたポリペプチドを別個の分子、例えば、細胞内ドメイン及び自殺遺伝子コードタンパク質（ｔＥＧＦＲ及び／又はｉＣ９であり得る）として産生する。したがって、ペプチドスペーサーは、自己切断性ペプチドとして知られ得る。
好ましくは、スペーサー配列は、ウイルスペプチドスペーサー配列、より好ましくはウイルス２Ａペプチドスペーサー配列（Ｆｕｒｌｅｒ Ｓ，Ｐａｔｅｒｎａ Ｊ－Ｃ，Ｗｅｉｂｅｌ Ｍ ａｎｄ Ｂｕｅｌｅｒ Ｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ２Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｆｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒａｔ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｎｅｕｒｏｎｓ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１，ｖｏｌ．８，ＰＰ：８６４－８７３）を含み、コードする。
好ましくは、２Ａペプチド配列をコードするスペーサー配列は、細胞内ドメインをコードする配列を自殺タンパク質をコードする配列に接続する。構築物が２つの自殺タンパク質（例えば、ＥＧＦＲ／ｔＥＧＦＲ及びｉＣ９）をコードする実施形態では、核酸構築物は、細胞内ドメインをコードする配列と第１の自殺タンパク質をコードする配列との間に配置された第１のスペーサー配列、及び第１の自殺タンパク質をコードする配列と第２の自殺タンパク質をコードする配列との間に配置された第２のスペーサー配列を含む。第１の自殺タンパク質はＥＧＦＲ／ｔＥＧＦＲであり得、第２の自殺タンパク質はｉＣ９であり得る。別の実施形態では、第１の自殺タンパク質はｉＣ９であり得、第２の自殺タンパク質はＥＧＦＲ／ｔＥＧＦＲであり得る。
２Ａスペーサー配列は、Ｗａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１５，５に開示されているように、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ及びＴ２Ａと呼ばれる配列を含む任意の既知のバリアントであり得る。好ましくは、自己切断性ペプチドはＰ２Ａである。一実施形態では、Ｐ２Ａスペーサーは、本明細書で以下の配列番号２６と呼ばれるアミノ酸配列を有する。
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２６］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号２６に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、２Ａスペーサーは、以下のように、本明細書では配列番号２７と呼ばれる核酸配列によってコードされ得る。
ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＴＣＣＴ
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号２７に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
更なる実施形態では、構築物は、導入遺伝子の発現を増強するウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をコードするヌクレオチド配列を更に含み得る。好ましくは、ＷＰＲＥコード配列は、自殺タンパク質をコードする配列の３’に配置される。特に、ＷＰＲＥ配列は、好ましくはｉＣ９コード配列の３’である。
ＷＰＲＥの一実施形態は、以下のように、ガンマ－アルファ－ベータ要素を含めて５９２ｂｐ長であり、本明細書では配列番号２８と呼ばれる。
ＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＧ
［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８］
好ましくは、核酸は、実質的に配列番号２８に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
好ましくは、構築物は、左（すなわち、５’）及び／又は右（すなわち、３’）の長末端反復配列（ＬＴＲ）を含む。好ましくは、各ＬＴＲは、構築物の５’及び／又は３’末端に配置される。
好ましい実施形態では、核酸構築物は、この指定された順序で、５’プロモータ、ＣＤ４又はＴＣＲ Ｖ－β領域に特異的なｓｃＦｖをコードする配列；及び細胞内ドメインをコードする３’配列を含む。５’及び３’の使用は、特徴が上流又は下流のいずれかであることを示し、特徴が必然的に終端特徴であることを示すことを意図しない。
好ましい実施形態では、核酸構築物は、この指定された順序で、５’プロモータ；ＣＤ４又はＴＣＲ Ｖ－β領域に特異的なｓｃＦｖをコードする配列；細胞内ドメインをコードする配列；及び少なくとも１つの自殺タンパク質をコードする３’配列を含む。
より好ましい実施形態では、核酸構築物は、この指定された順序で、５’プロモータ（好ましくは、ＰＧＫプロモータ）；ＣＤ４又は１つ若しくは複数のＴＣＲ Ｖ－β領域（好ましくは、ＶＬドメイン及び／又はＶＨドメイン）に特異的なｓｃＦｖをコードする配列；細胞内ドメイン（好ましくは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ及び／又はＣＤ３ζ鎖）をコードする配列；少なくとも１つの自殺タンパク質（好ましくは、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｔ及び／又はｉＣ９）をコードする３’配列を含む。
更により好ましい実施形態では、核酸構築物は、この指定された順序で、５’プロモータ（好ましくは、ＰＧＫプロモータ）；シグナル伝達ペプチド（ＳＰ）をコードする配列；ＣＤ４又は１つ若しくは複数のＴＣＲ Ｖ－β領域（好ましくは、Ｇ４Ｓリンカーによって分離されたＶＬドメイン及びＶＨドメイン）に特異的なｓｃＦｖをコードする配列；ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通ドメインをコードする配列；細胞内ドメイン（好ましくは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ鎖）をコードする配列；細胞内ドメインをコードする配列と自殺タンパク質をコードする配列との間に自己切断ペプチドスペーサーを有していてもよい、少なくとも１つの自殺タンパク質（好ましくは、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｔ及びｉＣ９）をコードする３’配列を含む。
第１の最も好ましい実施形態（「ＣＡＲＴ４」として知られる）では、核酸構築物は、この指定された順序で、５’ＰＧＫプロモータ；シグナル伝達ペプチド（ＳＰ）をコードする配列；ＣＤ４に特異的なｓｃＦｖのＶＬドメイン及びＶＨドメインをコードする配列（好ましくは、Ｇ４Ｓリンカーによって分離される）；ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通ドメインをコードする配列；細胞内ドメインのＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ鎖をコードする配列；第１の自己切断ペプチドスペーサーをコードする配列；ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｔをコードする配列；第２の自己切断ペプチドスペーサーをコードする配列；ｉＣ９をコードする３’配列を含む。
第２の最も好ましい実施形態（「ＣＡＲＴＶｂ７．１」として知られる）では、核酸構築物は、この指定された順序で、５’ＰＧＫプロモータ；シグナル伝達ペプチド（ＳＰ）をコードする配列；１つ又は複数のＴＣＲ Ｖ－β領域、好ましくはＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖に特異的なｓｃＦｖのＶＬドメイン及びＶＨドメインをコードする配列（好ましくは、Ｇ４Ｓリンカーによって分離される）；ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通ドメインをコードする配列；細胞内ドメインのＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ鎖をコードする配列；第１の自己切断ペプチドスペーサーをコードする配列；ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｔをコードする配列；第２の自己切断ペプチドスペーサーをコードする配列；ｉＣ９をコードする３’配列を含む。
したがって、核酸構築物（「ＣＡＲＴ４」として知られる）の好ましい一実施形態は、以下の通り、本明細書では配列番号２９と呼ばれるアミノ酸配列を有する。
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＴＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＩＨＷＶＲＱＫＰＧＱＧＬＤＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＤＹＤＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＤＮＹＡＴＧＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＦＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＬＥＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＳＧＧＧＳＧＶＤＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＶＤＹＰＹＤＶＰＤＹＡＬＤ＊
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２９］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
好ましくは、核酸構築物（「ＣＡＲＴ４」として知られている）の実施形態は、以下の通り、本明細書では配列番号３０と呼ばれるヌクレオチド配列を有する。
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［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３０］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号３０に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
したがって、核酸構築物の第２の好ましい実施形態（「ＣＡＲＴＶｂ７．１」として知られている）は、以下の通り、本明細書では配列番号３１と呼ばれるアミノ酸配列を有する。
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［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３１］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号３１に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
好ましくは、核酸構築物の実施形態（「ＣＡＲＴＶｂ７．１」として知られている）は、以下の通り、本明細書では配列番号３２と呼ばれるヌクレオチド配列を有する。
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［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３２］
したがって、好ましくは、構築物は、実質的に配列番号３２に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
したがって、第２又は第３の態様のいずれかの方法を使用して得られた単離されたＭＡＩＴ細胞は活性化され得、最終的には、ＣＡＲをコードする第５の態様による核酸構築物で形質導入されて、それにより、第１の態様又は第４の態様のＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞が作製されることが理解されるであろう。
第６の態様では、第５の態様の核酸構築物をコードする発現ベクターが提供される。
好ましくは、ベクターは組換え体である。好ましくは、ベクターはウイルスベクター、より好ましくはレトロウイルスベクターである。本発明のベクターの２つの好ましい実施形態の特徴を示すマップを図９及び図１０に示す。
一実施形態（ＣＡＲＴ４：ＣＡＲ４－ｔＥＧＦＲ－ｉＣ９；図９を参照）では、ベクターは、以下の通り、本明細書では配列番号３３と呼ばれる核酸配列を有する。
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［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３］
好ましくは、ベクターは、実質的に配列番号３３に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
一実施形態（ＣＡＲＴＶｂ７．１：ＣＡＲＴＶｂ７．１－ｔＥＧＦＲ－ｉＣ９；図１０を参照されたい）では、ベクターは、以下の通り、本明細書では配列番号３６と呼ばれる核酸配列を有する。
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［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６］
好ましくは、ベクターは、実質的に配列番号３６に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む。
したがって、第２又は第３の態様のいずれかの方法を使用して得られた単離されたＭＡＩＴ細胞が活性化され得、最終的には、ＣＡＲをコードする第６の態様の発現ベクターで形質導入され、それにより、第１の態様又は第４の態様のＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞が作製されることが理解されるであろう。
第１１の態様では、場合により抗ＣＤ４キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は抗Ｖβ ＣＡＲを発現する、第５の態様に記載の構築物又は第６の態様に記載のベクターを含むＴ細胞が提供される。
好ましくは、Ｔ細胞は粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞である。
第７の態様では、第１１の態様によるＴ細胞、好ましくは第１の態様又は第４の態様によるＭＡＩＴ細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。
好ましくは、医薬組成物は、本発明のＴ細胞又はＭＡＩＴ細胞を複数含む。例えば、組成物は、少なくとも１００、１０００又は１０，０００個のＴ細胞又はＭＡＩＴ細胞を含み得る。好ましくは、組成物は、少なくとも１００，０００個、又は少なくとも１，０００，０００個、又は少なくとも１０，０００，０００個のＴ細胞又はＭＡＩＴ細胞を含む。
第８の態様では、治療に使用するための、第１１の態様のＴ細胞、又は第１の態様若しくは第４の態様のＭＡＩＴ細胞、又は第７の態様の医薬組成物が提供される。
第９の態様において、（ｉ）免疫療法における、（ｉｉ）癌を治療、予防若しくは改善するための、（ｉｉ）微生物感染症を治療、予防若しくは改善するための、又は（ｉｖ）自己免疫疾患を治療、予防若しくは改善するための、使用のための、第１１の態様に記載のＴ細胞、又は第１の態様若しくは第４の態様に記載のＭＡＩＴ細胞、又は第７の態様の医薬組成物が提供される。
第１０の態様では、本発明は、（ｉ）免疫療法で被験体の疾患を治療、予防若しくは改善するための、（ｉｉ）癌を治療、予防若しくは改善するための、（ｉｉｉ）被験体における微生物感染を治療、予防若しくは改善するための、又は（ｉｖ）被験体の自己免疫疾患を治療、予防若しくは改善するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に、治療有効量の第１１の態様のＴ細胞若しくは第１の態様若しくは第４の態様のＭＡＩＴ細胞、又は第７の態様の医薬組成物を投与すること、又は投与したことがあることを含む方法が提供される。
好ましくは、Ｔ細胞、ＭＡＩＴ細胞又は医薬組成物は、固形腫瘍又は液体腫瘍であり得るＴ細胞悪性腫瘍の治療、予防又は改善に使用するためのものである。
Ｔ細胞悪性腫瘍は、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）であり得る。
末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、患者のＴ細胞が癌性になる、稀で攻撃的な疾患の多様な群を含む。ＰＴＣＬは、３つのカテゴリー、すなわち、結節性、節外性及び白血病性に分けられ、これらはそれぞれ本発明に包含される。
ＰＴＣＬは、成人Ｔ細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病（ＡＴＬ）；腸疾患関連リンパ腫；肝脾リンパ腫；皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫（ＳＰＴＣＬ）；前駆Ｔ細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病；及び血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）からなる群から選択されるＰＴＣＬサブタイプであり得る。
成人Ｔ細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病（ＡＴＬ）は、米国よりも日本及びメキシコでより一般的に見られ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）に関連する。腸症関連リンパ腫は、セリアック病（小麦、ライ麦及び大麦に見られるグルテンタンパク質に対する過敏症によって引き起こされる慢性腸障害）に関連する。症状には、通常、胃痛、体重減少、胃腸出血又は腸穿孔が含まれる。腸症関連Ｔ細胞リンパ腫の患者の治療には、アントラサイクリン系化学療法レジメン、栄養補助食品、及び適切な場合はグルテンフリー食が含まれる。肝脾リンパ腫は、肝臓又は脾臓で始まり、通常２０歳代及び３０歳代の若年成人が罹患する極めて稀で侵襲性の疾患である。肝脾Ｔ細胞リンパ腫の患者の治療には、アントラサイクリンをベースとした化学療法及び場合によっては幹細胞移植が含まれる。
皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫（ＳＰＴＣＬ）は、Ｔ細胞リンパ腫の中で最も少なく、最も明確に定義されていない。このリンパ腫は主に皮下脂肪組織に発生し、そこで結節を形成させる。症状としては、発熱、悪寒、体重減少及び口腔粘膜潰瘍が挙げられる。ＳＰＴＣＬは、急速な侵襲性であるか、又は緩徐進行性（ゆっくりと成長する）のいずれかであり得る。治療には、アントラサイクリンに基づく併用化学療法又は局所放射線が含まれる。前駆Ｔ細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病は、白血病又はリンパ腫又はその両方と診断され得る。この癌は小児及び成人の両方に見られ、最も一般的には青年及び成人男性で診断される。前駆Ｔ細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病を有する新たに診断された患者の治療は、積極的な化学療法及び放射線療法である。ネララビン（Ａｒｒａｎｏｎ（登録商標））は、成人及び小児における再発性又は難治性前駆体Ｔ細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病の治療に承認されている。
血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）は、その臨床的、病理学的、細胞的及び生物学的特性によって証明されるように、強い炎症反応及び免疫反応を特徴とする新生物の一例である。腫瘍細胞は、表現型が濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞に似ているため、反応性濾胞性過形成に見られる非腫瘍性Ｔｆｈ細胞とある程度類似して機能すると考えられる。しかしながら、濾胞は過形成性ではなく、むしろ大部分のＡＩＴＬ症例において枯渇又は破壊される。ＡＩＴＬは最近、ＰＴＣＬの３６．１％を占めると報告された。
皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、原発性皮膚リンパ腫の約７０～７５％を構成する。ＣＴＣＬは、以下からなる群から選択されるＣＴＣＬサブタイプであり得る：菌状息肉症（ＭＦ）；セザリー症候群（ＳＳ）；及びＣＤ４＋小中多形性Ｔ細胞リンパ増殖性障害。
菌状息肉症（ＭＦ）は、最も一般的なサブタイプである。セザリー症候群（ＳＳ）は、より攻撃的なタイプのＣＴＣＬである。ＳＳ患者は、紅皮症（すなわち、＞８０％の体表面積に影響を及ぼす発疹［ＢＳＡ］）、リンパ節症、及び末梢血中の多数の循環新生物ＣＤ４＋Ｔ細胞を有する。
他の実施形態では、Ｔ細胞、ＭＡＩＴ細胞又は医薬組成物は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＴＬＶ、ＥＢＶ、ＨＰＶ）、細菌（例えばＴＢ）又は真菌感染症を治療、予防又は改善するのに使用され得る。
他の実施形態では、Ｔ細胞、ＭＡＩＴ細胞又は医薬組成物は、自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は重症筋無力症を治療、予防又は改善するのに使用され得る。
好ましくは、方法は、自殺タンパク質をコードする配列を誘発することを含む。したがって、核酸構築物がＥＧＦＲ又はｔＥＧＦＲをコードする配列を含む実施形態では、方法は、好ましくは、被験体に抗ＥＧＦＲ抗体を投与することを含む。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、モノクローナル抗体Ｃｅｔｕｘｉｍａｂであり得る。抗体の投与は、被験体におけるＣＡＲ－Ｔ細胞のモニタリング又は枯渇を可能にする。
核酸構築物がｉＣ９をコードする配列を含む実施形態では、方法は、被験体にカスパーゼ誘導性薬物（ＣＩＤ）を投与することを含み得る。例えば、ＣＩＤは、Ｒｉｍｉｄｕｃｉｄを含み得る。ＣＩＤの投与は、カスパーゼの条件付き二量体化を可能にし、これは、融合タンパク質を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のアポトーシス、及び結果としての被験体におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の枯渇を引き起こす。
最も好ましい実施形態では、構築物は、ｉＣ９及びｔＥＧＦＲの両方を含む２つの自殺タンパク質をコードするので、抗ＥＧＦＲ抗体及びＣＩＤの使用は、治療を受けている被験体におけるＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の寿命の精巧な制御を可能にする。
本発明によるＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞（本明細書中で集合的に「作用物質」と称される）は、単剤療法（例えば、Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞単独の使用）において、治療のために、好ましくは免疫療法において、（ｉ）癌又はＴ細胞悪性腫瘍を治療、改善又は予防する、又は（ｉｉ）微生物感染症を治療、予防若しくは改善する、又は（ｉｉｉ）自己免疫疾患を治療、予防若しくは改善するために使用され得ることが理解されるであろう。あるいは、本発明によるＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、公知の免疫療法の補助として、又は公知の免疫療法と組み合わせて、又は微生物感染症並びに癌若しくは自己免疫疾患を治療するために使用され得る。
本発明による薬剤は、特に組成物が使用される様式に応じて、多数の異なる形態を有する組成物中で組み合わせることができる。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、又は治療を必要とする人若しくは動物に投与され得る任意の他の適切な形態であり得る。本発明による医薬のビヒクルは、それが与えられる被験体によって十分に許容されるものでなければならないことが理解されるであろう。
本発明の薬剤を含む医薬品は、いくつかの方法で使用することができる。例えば、経口投与が必要とされ得、その場合、薬剤は、例えば、錠剤、カプセル又は液体の形態で経口摂取され得る組成物内に含有され得る。本発明の薬剤及び医薬品を含む組成物は、吸入（例えば鼻腔内）によって投与することができる。組成物はまた、局所使用のために製剤化され得る。例えば、クリーム又は軟膏を皮膚に塗布することができる。
本発明による薬剤及び医薬品はまた、徐放又は遅延放出デバイス内に組み込まれてもよい。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上又は下に挿入されてもよく、医薬品は、数週間又は数ヶ月にわたって放出されてもよい。デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して配置されてもよい。このようなデバイスは、本発明に従って使用される薬剤による長期治療が必要であり、通常は頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）を必要とする場合に特に有利であり得る。
好ましい実施形態では、本発明による薬剤及び医薬は、血流への注射又は治療を必要とする部位への直接注射によって被験体に投与され得る。注射は、静脈内（ボーラス又は注入）又は皮下（ボーラス又は注入）又は皮内（ボーラス又は注入）であり得る。
必要とされる遺伝子構築物又はベクター（すなわち、薬剤）の量は、その生物学的活性及び生物学的利用能によって決定され、これは、投与様式、薬剤の物理化学的特性、及び単剤療法として使用されているか、又は併用療法で使用されているかに依存することが理解されよう。投与の頻度はまた、治療される被験体内での薬剤の半減期によって影響されるであろう。投与される最適な投与量は、当業者によって決定され得、使用中の特定の薬剤、医薬組成物の強度、投与様式、及び治療される疾患、例えば癌、Ｔ細胞悪性腫瘍、微生物感染、又は自己免疫疾患の進行によって変化する。被験体の年齢、体重、性別、食事及び投与時間を含む、治療される特定の被験体に依存する更なる因子は、投薬量を調節する必要性をもたらすであろう。
一般に、０．００１μｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の本発明による作用物質の１日用量を、いずれかの作用物質に依存して、治療のために、特に癌、Ｔ細胞悪性腫瘍、微生物感染又は自己免疫疾患を治療、改善又は予防するために使用することができる。より好ましくは、薬剤の１日用量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重～１ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重～１００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ体重～１０μｇ／ｋｇ体重である。
あるいは、被験体に投与される用量は、０．５×１０７～５×１０１２形質導入単位（ＴＵ）／体重Ｋｇであり得る。より好ましくは、被験体に投与される用量は、０．５×１０８～５×１０１１ＴＵ／ｋｇ体重であり得る。最も好ましくは、被験体に投与される用量は、０．５×１０９～５×１０１０ＴＵ／ｋｇ体重であり得る。
薬剤は、癌、Ｔ細胞悪性腫瘍、微生物感染又は自己免疫疾患の発症前、発症中又は発症後に投与され得る。毎日の用量は、単回投与（例えば、１日１回の注射）として与えられ得る。あるいは、薬剤は、１日に２回以上の投与を必要とし得る。一例として、薬剤は、０．０７μｇ～７００ｍｇ（すなわち、体重を７０ｋｇと仮定する）の１日２回（又は治療される疾患、例えば癌の重症度に応じて更に）用量として投与され得る。治療を受けている患者は、起床時に第１の用量を服用し、次いで夕方に第２の用量を服用してもよく（２回の用量計画の場合）、又はその後３時間又は４時間間隔で服用してもよい。あるいは、薬剤は、週に１回、更には月に１回の投与を必要とし得る。あるいは、徐放装置を使用して、反復用量を投与する必要なく、本発明による薬剤の最適用量を患者に提供することができる。公知の手順、例えば、製薬業界によって従来から使用されている手順（例えば、インビボ実験、臨床試験等）を使用して、本発明による薬剤の特定の製剤及び正確な治療レジメン（例えば、薬剤の１日用量及び投与頻度）を形成することができる。
本発明の医薬組成物は、好ましくは免疫療法治療組成物、又は自己免疫疾患治療組成物、又は抗感染組成物、又は抗癌組成物、すなわち被験体における癌の治療的改善、予防又は治療に使用される医薬製剤である。
本発明はまた、第１１の態様において、第７の態様による医薬組成物を製造するためのプロセスであって、第１又は第４の態様による治療有効量のＭＡＩＴ細胞と薬学的に許容され得るビヒクルとを組み合わせることを含む、プロセスを提供する。
「被験体」は、脊椎動物、哺乳動物、又は家畜であり得る。したがって、本発明による医薬品は、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えば、ウマ）、ペットを治療するために使用されてもよく、又は他の獣医学的用途で使用されてもよい。最も好ましくは、被験体はヒトである。
遺伝子構築物又はベクターの「治療有効量」は、被験体に投与された場合、治療される疾患、例えば癌を治療するために必要な、又は所望の効果をもたらす薬剤の量である任意の量である。
例えば、使用される遺伝子構築物又はベクターの治療有効量は、約０．００１ｎｇ～約１ｍｇ、好ましくは約０．０１ｎｇ～約１００ｎｇであり得る。遺伝子構築物又はベクターの量は、約０．１ｎｇ～約１０ｎｇ、最も好ましくは約０．５ｎｇ～約５ｎｇの量であることが好ましい。
本明細書で言及される「薬学的に許容され得るビヒクル」は、医薬組成物の製剤化に有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物又は既知の化合物の組合せである。
一実施形態では、薬学的に許容され得るビヒクルは固体であり得、組成物は粉末又は錠剤の形態であり得る。固体の薬学的に許容され得るビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味料、保存剤、染料、コーティング又は錠剤崩壊剤としても作用し得る１つ又は複数の物質を含み得る。ビヒクルはまた、封入材料であってもよい。粉末において、ビヒクルは、本発明による微粉化された活性剤と混合された微粉化された固体である。錠剤では、活性剤を、必要な圧縮特性を有するビヒクルと適切な割合で混合し、所望の形状及びサイズに圧縮することができる。散剤及び錠剤は、好ましくは最大９９％の活性剤を含有する。適切な固体ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス及びイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態では、医薬ビヒクルはゲルであってもよく、組成物はクリーム等の形態であってもよい。
しかしながら、医薬ビヒクルは液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル及び加圧組成物の調製に使用される。本発明による活性剤は、水、有機溶媒、両方又は薬学的に許容され得る油又は脂肪の混合物等の薬学的に許容され得る液体ビヒクルに溶解又は懸濁され得る。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味料、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤又は浸透圧調整剤等の他の適切な医薬添加剤を含むことができる。経口及び非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例としては、水（上記のような添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールを含む）及びそれらの誘導体、並びに油（例えば、分画されたヤシ油及び落花生油）が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルは油性エステル、例えばオレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルであってもよい。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与のための滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容され得る噴射剤であり得る。
滅菌溶液又は懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内及び特に皮下注射によって利用することができる。薬剤は、滅菌水、生理食塩水、又は他の適切な滅菌注射用媒体を使用して、投与時に溶解又は懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。
本発明の薬剤及び組成物は、他の溶質又は懸濁化剤（例えば、溶液を等張性にするのに十分な生理食塩水又はグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０（エチレンオキシドと共重合されたソルビトール及びその無水物のオレイン酸エステル）等を含有する滅菌溶液又は懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明に従って使用される薬剤は、液体又は固体の組成物形態のいずれかで経口投与することもできる。経口投与に適した組成物には、固体形態、例えば丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤及び散剤、並びに液体形態、例えば液剤、シロップ剤、エリキシル剤及び懸濁剤が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液、エマルジョン、及び懸濁液が含まれる。
本発明は、本明細書で言及される任意の配列（そのバリアント又は断片を含む）のアミノ酸又は核酸配列を実質的に含む任意の核酸又はペプチド又はそのバリアント、誘導体又は類似体に及ぶことが理解されよう。「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「バリアント」及び「断片」という用語は、本明細書で言及される配列のいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性、例えば配列番号１～３６として識別される配列と４０％の配列同一性を有する配列等であり得る。
言及される配列のいずれかと６５％超、より好ましくは７０％超、更により好ましくは７５％超、更により好ましくは８０％超の配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列も想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、更により好ましくは少なくとも９２％の同一性、更により好ましくは少なくとも９５％の同一性、更により好ましくは少なくとも９７％の同一性、更により好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
当業者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージを計算する方法を理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセントを計算するために、２つの配列のアライメントを最初に調製し、続いて配列同一性値を計算しなければならない。２つの配列の同一性率は、以下に応じて異なる値をとることができる：－（ｉ）配列を整列させるために使用される方法、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実施される）、又は３Ｄ比較からの構造的整列；（ｉｉ）位置合わせ方法によって使用されるパラメータ、例えば、局所対全体位置合わせ、使用されるペアスコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔ等）、及びギャップペナルティ、例えば、関数形及び定数。
アライメントを行った後、２つの配列間の同一性パーセントを計算する多くの異なる方法がある。例えば、識別情報の数を以下で割ることができる。（ｉ）最短配列の長さ；（ｉｉ）アライメントの長さ；（ｉｉｉ）配列の平均長さ；（ｉｖ）非ギャップ位置の数；又は（ｖ）オーバーハングを除く等価な位置の数。更に、同一性パーセントもまた、長さに強く依存することが理解されよう。したがって、配列のペアが短いほど、偶然に生じると予想される配列同一性が高くなる。
したがって、タンパク質又はＤＮＡ配列の正確なアライメントは複雑なプロセスであることが理解されよう。一般的な多重アライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３－４６８０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４８７６－４８８２）は、本発明に従ってタンパク質又はＤＮＡの多重アライメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの適切なパラメータは以下の通りであり得る：ＤＮＡアライメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、及び行列＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。タンパク質アライメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、及び行列＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡ及びタンパク質のアライメントの場合：ＥＮＤＧＡＰ＝－１、及びＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者は、最適な配列アライメントのためにこれら及び他のパラメータを変化させることが必要であり得ることを認識するであろう。
好ましくは、次いで、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージの計算は、（Ｎ／Ｔ）＊１００のようなアライメントから計算することができ、式中、Ｎは配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔはギャップを含み、オーバーハングを含むか又は除外して比較される位置の総数である。好ましくは、オーバーハングが計算に含まれる。したがって、２つの配列間の同一性パーセンテージを計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）適切なパラメータセットを使用してＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して、例えば上記のように配列アライメントを調製することと、（ｉｉ）Ｎ及びＴの値を以下の式：－配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することと、を含む。
類似の配列を同定するための代替方法は、当業者に公知である。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下でＤＮＡ配列又はそれらの相補体にハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件とは、本発明者らは、３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でフィルターに結合したＤＮＡ又はＲＮＡへのヌクレオチドハイブリッド形成、続いて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、約２０～６５℃で少なくとも１回の洗浄を意味する。あるいは、実質的に類似のポリペプチドは、例えば、アミノ酸配列である配列番号１～配列番号３６に示される配列と少なくとも１個、５、１０、２０、５０又は１００個未満のアミノ酸が異なっていてもよい。
遺伝暗号の縮重のために、本明細書に記載の任意の核酸配列は、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく変化又は変更されて、その機能的バリアントを提供することができることは明らかである。適切なヌクレオチドバリアントは、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変更された配列を有し、したがってサイレント（同義）変化を生じるものである。他の適切なバリアントは、相同なヌクレオチド配列を有するが、保存的変化をもたらすために、アミノ酸をコードする異なるコドンを、それが置換するアミノ酸と類似の生物物理学的特性の側鎖で置換することによって変化する配列の全部又は一部を含むバリアントである。例えば、小さな非極性の疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンが挙げられる。大きな非極性疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、リジン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸を、類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸と置き換えることができるかが理解され、当業者は、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知るであろう。
本明細書に記載の全ての特徴（添付の特許請求の範囲、要約、及び図面を含む）、及び／又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスの全ての工程は、そのような特徴及び／又は工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組合せを除いて、任意の組合せで上記の態様のいずれかと組み合わせることができる。
本発明をよりよく理解するために、及び本発明の実施形態をどのように実施することができるかを示すために、ここで、例として、添付の図面を参照する。
本発明の一実施形態による第３世代ＣＤ４標的化Ｔ細胞の生成を示す図である。Ａ（１）．図は、本発明によるＣＡＲ構築物（「ＣＡＲＴ４」として知られる）の一実施形態に含まれる機能的要素を表す。モノクローナル抗体Ｈｕ５Ａ８由来のｓｃＦｖを、ＣＤ８膜貫通ドメイン（ＴＭ）、ＣＤ２８エンドドメイン、４－１ＢＢエンドドメイン及びＣＤ３ζ鎖と融合した。ｔＥＧＦＲ（切断型上皮成長因子受容体）及びｉＣ９（誘導性カスパーゼ－９）の遺伝子配列を、自己切断性２Ａリンカーを介してＣＡＲの後ろにタグ付けした。Ａ（２）．この図は、本発明によるＣＡＲ構築物の別の実施形態（「ＣＡＲＴＶｂ７．１」として知られる）に含まれる機能的要素を表す。モノクローナル抗体３Ｇ５由来のｓｃＦｖを、ＣＤ８膜貫通ドメイン（ＴＭ）、ＣＤ２８エンドドメイン、４－１ＢＢエンドドメイン及びＣＤ３ζ鎖と融合した。ｔＥＧＦＲ（切断型上皮成長因子受容体）及びｉＣ９（誘導性カスパーゼ－９）の遺伝子配列を、自己切断性２Ａリンカーを介してＣＡＲの後ろにタグ付けした。Ｂ．形質導入されたＴ細胞を抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ）’２抗体及び抗ＥＧＦＲ抗体によって染色した。細胞をＣＤ３＋単一リンパ球上で増殖させ、数はＣＡＲ＋／ｔＥＧＦＲ＋細胞の割合を示す。Ｃ．ＣＡＲのレトロウイルス形質導入後、初代Ｔ細胞を毎日サンプリングし、ＣＤ３及びｔＥＧＦＲを含む表面マーカーについて染色した。青色ヒストグラムは、形質導入されていない細胞の結果であった。ＣＡＲ及びマーカーについて陽性の細胞の割合をプロットに示す。Ｄ．生存率は、示された用量のＣＩＤへの曝露の２４時間後の未治療条件及び二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ、リミズシド）治療条件からのＥＧＦＲ陽性（Ａ）又はＥＧＦＲ高（Ｂ）パーセンテージの比として定義した。Ｅ．生存細胞におけるＥＧＦＲ発現の平均蛍光強度を示す。データは、別々のドナーからの３回の反復からの典型的な結果を反映する。各試料を３連で実施した。データを平均±ＳＥＭとして表す。両側対応のないスチューデントのｔ検定によって判定して、群間に統計学的有意差が認められた。＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＝ｐ＜０．０５。 本発明によるＣＡＲＴ４ Ｔ細胞の一実施形態のインビトロでの機能検証を示す図である。Ａ．ＰＢＭＣをＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ及びＩＬ７／ＩＬ１５によって活性化した。活性化ＰＢＭＣは、Ｔ細胞の２つのサブセット、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋を含んでいた（左）。細胞をＣＡＲＴ２０（中央）又はＣＡＲＴ４（右）レトロウイルス粒子によって形質導入した。形質導入後３日目から、細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体によって染色し、フローサイトメトリによって分析した。ＣＤ４＋比の統計をＢに要約した。データは、５人の健康な個体からの典型的な結果を反映する。Ｃ．初代ＣＤ４＋Ｔ細胞（左）又はＣＤ２０＋Ｂ細胞（右）を、自己ＣＡＲＴ４細胞、ＣＡＲＴ２０細胞、又は非形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかと４時間共培養した。フローサイトメトリ分析によりＣｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズを使用して、生存した標的細胞の絶対量をカウントした。Ｄ．２つのＴ細胞株ＣＥＭ－ｓｓ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞及び１つのＢ細胞株を抗ＣＤ４抗体によって染色した。ＣＤ４発現レベルをフローサイトメトリ分析によって評価した。Ｅ．Ｔ腫瘍細胞を死滅させるＣＡＲＴ４細胞の代表的な結果。各試料を３連で実施した。データは、３つの独立した実験からの典型的な結果を反映する。Ｆ．異なる標的細胞と共培養したＣＡＲＴ４細胞の細胞内サイトカイン発現。各試料を３連で実施した。データは、３つの独立した実験からの典型的な結果を反映する。 ＣＡＲＴ４細胞がＣＤ４＋Ｔ腫瘍細胞を特異的に死滅させることを示す図である。ＡＴＬＬ患者由来のＰＢＭＣバイアルを液体窒素から復活させ、フローサイトメトリ分析及び共培養実験の前に一晩インキュベーター内で休ませた。Ａ．ＰＢＭＣを抗ＣＤ４、ＣＤ８及び特異的ＴＣＲ Ｖβによって染色した。ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメトリを行った。再生したＡＴＬＬ（Ｂ）又はＣＴＣＬ（Ｃ）ＰＢＭＣを同種異系ＣＡＲＴ４又はＣＡＲＴ２０細胞と４時間共培養した後、フローサイトメトリ分析を行った。各条件を３回繰り返した。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ＣＡＲＴ４細胞がインビボで抗白血病効果を効率的に媒介することを示す図である。Ａ．ＮＲＧ免疫不全マウスに、１×１０５個のＧｌｕｃ／ＧＦＰ形質導入ＣＥＭ－ｓｓ細胞を注射し、続いて後眼窩経路を介して４×１０６個のＴ細胞を更に注入した。ＮＴＤ ｎ＝５、ＣＡＲＴ４ ｎ＝７。Ｂ．５０μｌの各マウスの末梢血を採血し、血漿をルシフェラーゼ活性の測定に使用した。ルシフェラーゼ活性の連続測定は、ＮＴＤ ＣＤ８＋Ｔ細胞ではなくＣＡＲＴ４ Ｔ細胞によるＣＤ４＋白血病の阻害を示した。Ｃ．カプラン・マイヤー生存分析による、示されたＣＡＲＴ４細胞又は対照ＮＴＤ Ｔ細胞で治療したマウスの全生存。Ｄ．エンドポイントで、マウスを解剖した。脾臓及び骨髄を粉砕し、残留腫瘍細胞を検出するために抗ＣＤ４ ｍＡｂ及びＤＡＰＩによって染色した。腫瘍細胞をＤＡＰＩ－ＣＤ４＋ＧＦＰ＋として同定した。Ｅ．脾臓における残存腫瘍細胞のＣＤ４発現レベル。灰色線－培養したＣＥＭｓｓ細胞、黒色線－ＮＴＤ対照マウス由来のＣＥＭｓｓ細胞、赤色線－ＣＡＲＴ４治療マウス由来のＣＥＭｓｓ細胞。Ｆ．脾臓細胞を、ＣＡＲＴ４細胞又はＮＴＤ Ｔ細胞と１：５の比で４時間共培養した後、フローサイトメトリによって分析した。データを平均±ＳＥＭとして表す。両側対応のないスチューデントｔ試験を有意性分析に使用した。＊＝ｐ＜０．０５。 ＧＭＰに準拠したＣＡＲ－Ｔ細胞製造方法の開発を示す図である。Ａ．ＣＡＲ－Ｔ細胞製造の時間経過。ヒトＰＢＭＣを、ＣＡＲのレトロウイルス形質導入の前に、フラスコ内でＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ及びＩＬ７／ＩＬ１５によって活性化する。形質導入の２日後に、形質導入された細胞をＧ－Ｒｅｘプレート（１×１０６／平方メートル）に移す。サイトカインは、１２日目まで２日～３日ごとに補充される。Ｂ．製造手順中の細胞増殖。１２日目のＣＡＲ形質導入比（Ｃ）及び分化状態（Ｄ）の代表的なフロープロット。Ｅ．Ｔ細胞分化の統計。ＣＭ、中央メモリ；ＥＭ、エフェクターメモリー。各試料を３連で実施した。各試料を３連で実施した。データを平均±ＳＥＭとして表す。データは、４人の健康な個体からの典型的な結果を反映する。 ＣＡＲＴＶｂ７．１の生成及び機能検証を示す図である。Ａ．形質導入されたＴ細胞を抗ＥＧＦＲ抗体で染色して、ＣＡＲ発現を検出した。細胞をＣＤ３＋単一リンパ球上で増殖させ、数はｔＥＧＦＲ＋細胞の割合を示す。Ｂ．ＣＡＲ形質導入の５日後の内因性ＴＣＲＶｂ７．１＋集団検出。Ｃ．ＴＣＲＶｂ７．１＋初代ＡＴＬ試料をＣＦＳＥによって染色し、異なる数のエフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞と混合した。６時間のインキュベーション後、細胞を回収し、ＤＡＰＩ、３Ｇ５及びＣＤ３抗体によって１５分間染色した。定容量の５ｕＬのＣｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズを各試料に添加した。絶対定量のために試料をフローサイトメトリにロードした。Ｄ．Ｔ腫瘍細胞を死滅させるＣＡＲＴＶｂ７．１細胞の代表的な結果。各試料を３連で実施した。 ＭＡＩＴ－ＣＡＲＴ細胞の産生を示す図である。Ａ．ＭＡＩＴ細胞染色の代表的なフローサイトメトリの例。ＰＢＭＣをＢＶ４２１ ＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ四量体及びＰＥ抗ＴＣＲ Ｖα７．２抗体によって２０分間染色した。細胞をＰＢＳによって２回洗浄した後、フローサイトメトリによって特徴付けた。Ｂ．ＭＡＩＴ細胞のフローサイトメトリ選別のためのゲーティング戦略。ＴＣＲ Ｖα７．２＋細胞をＰＢＭＣから磁気分離法によって単離した後、ＢＶ４２１ ＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ四量体及びＰＥ抗ＣＤ３抗体によって２０分間染色した。細胞をＰＢＳによって２回洗浄した後、Ｍｅｌｏｄｙ細胞選別機にロードした。ＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ四量体陽性集団を選別し、培養した。Ｃ．対照としてのインビトロ培養ＭＡＩＴ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖曲線。Ｄ．１２～１４日の培養後、拡大したＭＡＩＴ細胞の９０％超がＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ四量体特異的であった。Ｅ．ＣＡＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＭＡＩＴ細胞を抗ＥＧＦＲフロー抗体によって染色して、形質導入効率を検出した。 拡大したＭＡＩＴ及びＣＤ８ Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ ０：１、１：１、３：１及び５：１でＣＦＳＥ染色ＣＤ４＋細胞株ＣＥＭｓｓと共培養したことを示す。インキュベーションの２０時間後に共培養系を回収した。フローサイトメトリ分析によりＣｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズを使用して、生存した腫瘍細胞の絶対量をカウントした。（Ａ）３：１ Ｅ：Ｔ条件のフローサイトメトリ図。（Ｂ）細胞傷害性の統計結果。データを平均±ＳＥＭとして表す。 ＭＡＩＴ細胞に形質導入するために使用される発現ベクター「ＣＡＲＴ４」の第１の実施形態を示すマップである。 ＭＡＩＴ細胞に形質導入するために使用される発現ベクター「ＣＡＲＴＶｂ７．１」の第２の実施形態を示すマップである。 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのヒトＭＡＩＴ細胞の検出を示す図である。リンパ球をゲーティングし、ＭＡＩＴ細胞をＣＤ３の発現及び５－ＯＰ－ＲＵ／ＭＲ１四量体との反応性（Ａ）又はＣＤ１６１及びＴＣＲＶα７．２の発現（Ｂ）によって同定した。 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのヒトＭＡＩＴ細胞の単離を示す図である。Ｖα７．２発現による磁気ビーズを介した分離後、Ｖα７．２陽性細胞集団を２．２％（Ａ）から＞９７％に濃縮した。ＭＡＩＴ細胞を、５－ＯＰ－ＲＵ／ＭＲ１四量体（Ｂ）との反応性によって選別した。 ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の産生を示す図である。１２～１４日の培養後、拡大したＭＡＩＴ細胞の９０％超がＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ四量体特異的であった（Ａ）。ＣＡＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＭＡＩＴ細胞を抗ＥＧＦＲフロー抗体によって染色して、形質導入効率を検出した（Ｂ）。 ＣＡＲ－ＭＡＩＴ４細胞がインビボで効率的な抗白血病機能を示すことを表す図である。Ａ．ＮＳＧ免疫不全マウスに、１×１０６個のＧｌｕｃ／ＧＦＰ形質導入ＣＥＭ－ｓｓ細胞をｉ．ｖ．注射し、続いて４×１０６個のＣＡＲ形質導入細胞をもう１回ｉ．ｖ．注入した。
生物発光イメージングを、腫瘍注射後４５日目まで週に２回行った。Ｂ．カプラン・マイヤー生存分析による、示されたＣＡＲ形質導入細胞で治療したマウスの全生存。Ｃ．腫瘍注射後４０日目のマウスの生物発光イメージング（ＢＬＩ）。Ｄ．４０日目の個々のマウスの放射輝度。ｎ＝５又は６マウス／群。＊スチューデントのｔ検定によりＰ＜０．０５。Ｐｈ、光子；ｓｒ、ステラジアン
ＰＢＭＣにおけるＭＡＩＴ細胞の濃縮を示す。ＰＢＭＣを、表に示すように異なるサイトカインの存在下で、１：１のビーズ対細胞比でＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ複合体ビーズ又は１０ｎＭで５－ＯＰ－ＲＵ抗原のいずれかによって６日間刺激した。ＭＡＩＴ細胞増加の倍数を、６日目の生存ＭＡＩＴ（ＣＤ３＋Ｖａ７．２＋ＣＤ１６１＋）細胞の頻度を０日目のＭＡＩＴ細胞の元の頻度で割ることによって計算した。上位５つの群をオレンジ色で強調した（すなわち、条件１、３、１１、１２及び１３）。ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３の組合せは、ＰＢＭＣ中のＭＡＩＴ細胞の増加の最大倍数を与える。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に基づくＴ細胞療法は、ｐａｎ－Ｂ細胞特異的抗原を標的とすることによってＢ細胞悪性腫瘍の治療において大きな成功を収めている。しかし、Ｔ細胞リンパ腫についての同様の戦略はこれまで実現されておらず、主に、Ｂ細胞悪性腫瘍と比較して、Ｔリンパ腫における全体的なＴ細胞枯渇及び正常Ｔ細胞の機能不全／低頻度による潜在的な重篤な毒性のためである。これらの制限を克服するために、本発明者らは、２つの新規なＣＡＲ構築物を操作し、第１のＣＡＲ構築物は、ｐａｎ－Ｔ細胞マーカー（ＣＤ４）に特異的である「ＣＡＲＴ４」と呼ばれ、第２のＣＡＲ構築物は、ＴＣＲ－Ｖｂアイソタイプ鎖に特異的である「ＣＡＲＴＶｂ７．１」と呼ばれる。両方のＣＡＲ構築物は、切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）及び誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）から選択される１つ又は２つの安全スイッチを組み込んでいる。しかしながら、図１に示すように、両方の安全スイッチが示されている。本発明者らは、同種異系反応性が低い粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞が、ＣＡＲ構築物で形質導入された後、従来のＴ細胞と同様の抗腫瘍殺傷活性を示すかどうかを調査した。
更に、ＭＡＩＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ様分子ＭＲ１を認識するＣＤ３＋ＴＣＲＶａ７．２＋ＣＤ１６１＋細胞として定義される自然Ｔ細胞のサブセットであることが知られている。以前の研究は、ＭＡＩＴ細胞をインビトロで拡大させることができるが、同種異系フィーダー細胞の存在を必要とすることを示しているが、この方法は大規模生産及び品質管理にとって困難である。本研究では、本発明者らは、両方とも様々なサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３）の組合せの存在下で、インビトロ培養で最大６日間、抗原（５－ＯＰ－ＲＵ）ロードＭＲ１四量体ビーズ又は５－ＯＰ－ＲＵ単独でＰＢＭＣを最初に刺激することによって、インビトロでＭＡＩＴ細胞を増殖させるための効果的な方法を開発した。次いで、得られたＭＡＩＴ細胞を、先の実施例に記載されるように、ＭＡＣＳ又はＦＡＣＳ選別によって単離し、ＣＡＲに基づく治療のために抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによって更に拡大させた。
材料及び方法
ＣＡＲプラスミドの構築
Ｈｕ５Ａ８及びＬｅｕ１６のｓｃＦｖ及びヒトＩｇκリーディング配列をコードするＤＮＡ断片をＧｅｎｅｗｉｚによって合成した。ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩを使用して、これらの断片並びにＭＳＣＶ ＣＡＲ発現レトロウイルスベクターを切断した。ＭＳＣＶ ＣＡＲ発現ベクターを、ＩＲＥＳ－ＧＦＰ領域をヒトＣＤ８膜貫通ドメイン及び第３世代ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８及び４－１ＢＢの共刺激ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）で置き換えることによって、ＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）から改変した。ｔＥＧＦＲの配列は、ヒトＥＧＦＲタンパク質の細胞外部分及び細胞内ドメインのドメインＩ及びＩＩを欠失させた米国特許第８８０２３４７号から得た。ｔＥＧＦＲを、自己切断性Ｔ２Ａ配列及びヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）受容体のリーダーペプチドと共にＧｅｎｅｗｉｚによって合成した。ｉＣ９のＤＮＡ配列は、Ｐｒｏｆ．Ｌｉｓｈａｎ Ｓｕ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ）の厚意により提供された。ｉＣ９のＤＮＡ断片は、短いＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＳ）フレキシブルリンカーを介して、一つの１２ｋＤａヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）に連結されたカスパーゼ分子の大サブユニット及び小サブユニットを含む、切断型カスパーゼ９からなる。
レトロウイルスベクターの作製
Ｐｌａｔ－ＧＰ細胞（Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ）を、７ｕｌのＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を介してＭＳＣＶ－レトロウイルスプラスミド及びｐＣＭＶ－ＶＳＶＧベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）でトランスフェクトして、ＶＳＶエンベロープを有するウイルスを作製した。高力価のＣＡＲコードレトロウイルス上清を産生するために、その後のＰＧ－１３（ＡＴＣＣ）を含む安定なウイルス産生細胞株を行った。ＰＧ－１３細胞を、８ｕｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰｌａｔ－ＧＰからのウイルス上清によって形質導入した。プレートを粘着フィルムで包み、１０００ｇ、３２℃で２時間遠心分離した。高力価ウイルス粒子を産生するために、コンフルエントな細胞をトリプシン処理によって２つに１つ通過させる。２４時間後に上清を回収する。培地を等分し、３００ｇで５分間遠心分離した後、－８０℃で保存する。
初代Ｔ細胞及び腫瘍細胞
健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＡＲ－Ｔ細胞を操作するためのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ密度勾配遠心分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって単離した。ＡＴＬ又はＣＴＣＬ患者から作製したＴリンパ腫細胞株をＤ１０培地（１０％ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２ｍＭ Ｌ－グルタミンを含むＤＭＥＭ）中で培養し、Ｔ白血病細胞株（Ｊｕｒｋｅｔ又はＣＥＭ）をＲ１０培地（１０％ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２ｍＭ Ｌ－グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０）中で維持した。
ＭＡＩＴ細胞の単離及び増殖
ＭＡＩＴ細胞を、抗ヒトＴＣＲ Ｖα７．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５１７２４）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９０－４８５）、続いてＰｒｏｆ Ｊｉｍ ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の厚意により提供されたＢＶ４２１ ＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ四量体を使用する２段階法によって健康なＰＢＭＣから単離した。簡潔には、製造手順（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に従ってビオチン化抗ヒトＴＣＲ Ｖα７．２抗体及び抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅａｄｓキットを使用して、ＴＣＲ Ｖα７．２＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離した。次いで、ＢＶ４２１ ＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ四量体を染色し、ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ）を使用してＦＡＣＳ選別することによって、ＭＡＩＴ細胞をＴＣＲ Ｖα７．２＋Ｔ細胞から単離した。
ＭＡＩＴ細胞をＰＢＭＣから２段階法によって分離した。ＰＢＭＣ細胞を計数し、１５ｍＬチューブ中のＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液中で１×１０８細胞／ｍＬに希釈する。１０８細胞当たり５μＬのビオチン抗ヒトＴＣＲ Ｖα７．２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５１７２４）を添加し、４℃で２０分間インキュベートする。１０倍容量のＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液を添加することによって細胞を洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を完全に吸引する。総細胞１０８個当たり、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液８００μＬ及びＡｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９０－４８５）２００μＬを添加する。よく混合し、４℃で１５分間インキュベートする。１０倍容量のＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液を添加することによって細胞を洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を完全に吸引する。最大１０８個の細胞を１ｍＬのＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁する。ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を適切なＭＡＣＳセパレータの磁場中に置く。ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液５００μＬですすぐことによってカラムを調製する。細胞懸濁液をカラムに適用する。カラムを３×５００μＬのＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄する。保持した細胞を、１ｍＬのＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液を添加することによって磁場の外側に溶出させる。ＴＣＲ Ｖα７．２＋細胞を回収し、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＢＶ４２１ ＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ四量体（１：５００）で４℃で３０分間染色する。１０倍容量のＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液を添加することによって細胞を洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を完全に吸引する。総細胞１０８個当たり１ｍＬのＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液を添加する。ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ）により、ＣＤ３＋ＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ＋細胞集団をフロー選別する。
ＭＡＩＴ細胞の活性化及び拡大
選別したＭＡＩＴ細胞を計数し、Ｒ１０培地（９０％ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋２ｍＭ Ｌ－グルタミン）に１０６／ｍＬまで再懸濁する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞を活性化して、３７℃のインキュベーターにおいて２４ウェルプレート中１００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２で１：１のビーズ対細胞比を得る。形質導入の２日後、細胞を回収し、細胞を６ウェルプレートに移す。Ｒ１０を０．５～１×１０６／ｍＬにリフレッシュする。２～３日ごとに細胞をＲ１０培地でリフレッシュする。
ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の作製
精製ＰＢＭＣ又はＭＡＩＴ細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含有するＲ１０培地中のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で４８時間刺激した。次いで、活性化細胞を、ＣＡＲ構築物をコードするレトロウイルスでトランスフェクトし、Ｒ１０中で更に４８時間培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を、回収前に更に７日間、組換えＩＬ７及びＩＬ１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の存在下でＧ－Ｒｅｘ６ウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎｗｏｌｆ）において維持した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の作製
レトロウイルス形質導入を、Ｔ細胞活性化の４８時間後に行った。必要に応じて、２４時間後により高い形質導入効率を達成するために形質導入工程を繰り返す。１０×１０６個の細胞を移入し、１１０ｍＬのＲ１０培地を含むＧ－Ｒｅｘ６ウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎｗｏｌｆ）中で更に培養した。サイトカインＩＬ７／１５を２日又は３日ごとに補充した。細胞をＧ－Ｒｅｘ中で１週間培養した後、回収した。
共培養細胞傷害性アッセイ
この非放射性殺傷アッセイを以前に報告されたように行った（Ｒｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。簡潔には、標的細胞を３７℃で１５分間、１ｕＭのＣＦＳＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後、１００，０００個の標的細胞を、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞と１：１、１：３、１：５の比率で混合した。２００ｕｌ共培養物を３７℃のインキュベーター中で４時間インキュベートした。１ｕｌのＤＡＰＩ及び５ｕｌのＣｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を試料に添加した。試料を一定速度でフローサイトメトリによって取得した。生存している標的細胞の数を、チューブ中の細胞＝（収集された細胞／収集されたビーズ）×チューブに加えられた総ビーズとして計算した。
細胞内サイトカイン染色
ＣＡＲＴ４又はＣＡＲＴ２０Ｔ細胞を、９６ウェル底プレートにおいて特定の標的細胞と共培養した。全ての細胞を、２００ｕＬ／ウェルのＲ１０培地に２×１０５細胞／ウェルで播種した。陰性対照として単独で培養したＴ細胞、及び１０ｕｇ／ｍｌ ＰＭＡと１０ｕｇ／ｍｌイオノマイシン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の複合刺激で培養したＴ細胞を陽性対照として含めた。１０ｕｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、１時間のインキュベーション後に全てのウェルに加えた。共培養系を更に５時間インキュベートした後、回収した。細胞を、暗所で３０分間、抗体を使用して表面マーカーについて染色した。ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて室温で１５分間細胞を固定した。固定緩衝液で更に洗浄した後、細胞内染色抗体を含む混合物によって細胞を再懸濁した。細胞を４℃で３０分間インキュベートした後、固定緩衝液で洗浄する。それらを、蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照を用いたフローサイトメトリによって分析して、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの発現レベルを決定した。
インビトロ自殺アッセイ
ｉＣ９細胞を有する、又は有さないＣＡＲＴ４を、ＣＡＲＴ４又はｉＣ９構築物を有さないＣＡＲＴ４によるレトロウイルス形質導入を用いて作製した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を形質導入後５～７日間拡大させ続けた。カスパーゼ誘導性薬物（ＣＩＤ）、Ｂ／Ｂホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を様々な濃度でＴ細胞培養物に添加した。ＣＩＤによって誘導されたアポトーシスの誘導を、アネキシン－ｖ／７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）染色及びフローサイトメトリ分析を用いて２４時間後に評価した。生存細胞を、ビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をカウントすることによって定量した。生存指数を以下のように計算した：未処理対照試料中の生ｔＥＧＦＲ＋細胞の数／生ｔＥＧＦＲ＋細胞の数。
インビボマウス異種移植実験
６～８週齢のＮＲＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、Ｔ白血病細胞株を用いたインビボ実験に使用した。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ及びＥＧＦＰを共発現する０．５×１０６個のＣＥＭ－ｓｓ細胞を、後軌道を介してマウスに注射した。その後、Ｔ細胞注射の前にマウスをランダム化した。健康なドナー由来のＰＢＭＣを活性化し、形質導入して、ＣＡＲＴ４ Ｔ細胞又は非形質導入Ｔ細胞を作製した。輸血日に、製造業者の指示に従って、未接触マイクロビーズヒトＣＤ８ Ｔ細胞キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用することによって、ＣＡＲＴ４ ＣＤ８＋Ｔ細胞及び非形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＡＲＴ４ Ｔ細胞又は非形質導入Ｔ細胞から負に単離した。４×１０６個の単離された細胞をＰＢＳによって２回洗浄し、１００μｌに再懸濁し、眼窩後注射によって異種移植されたマウスに注入した。３０～５０μｌの末梢血を、週に１回、尾静脈を介して採血した。５００ｇで５分間遠心分離した後、血漿を分離して、製造業者の機器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってルシフェラーゼ活性を検出した。赤血球溶解後、細胞を、ヒトＣＤ４５、マウスＣＤ４５、ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ８、ヒトＥＧＦＲ及び生／死色素を含む表面マーカー染色用の１００ｕｌ抗体マスターミックスで再懸濁した。細胞サブセットの組成を、フローサイトメトリ（ＢＤ ＡｒｉａＩＩＩ）を用いて分析した。記載された全ての研究を通してマウスを密接に監視した。マウスは、初期体重の２０％超の減少、顕著な嗜眠、しゃがみ姿勢、重度の下痢又は重度の皮膚炎の症状の１つを示したときに安楽死させた。
統計解析
統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６．０（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用することによって行った。両側対応のないスチューデントｔ試験を用いて、２群間のデータを比較した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーを有する全てのデータは、平均値±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として提示されている。０．０５未満のＰ値を有意と見なした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８）を使用してデータを分析した。
１．詳細な方法
１．１．ＭＡＩＴ細胞の検出
１．１．１．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製
１．１．１．１．ボランティアドナーからの５ｍＬの末梢血をヘパリン処理チューブに移す。
１．１．１．２．全血を等体積のＰＢＳで希釈する。
１．１．１．３．５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７を１５ｍｌ遠心管に入れる。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７上にチューブの壁に沿って希釈血液溶液１０ｍｌを慎重に穏やかに添加する；液体界面を破壊しない。
１．１．１．４．室温で３０分間、４００×ｇで遠心分離する。
注：ブレーキ及び加速度が遠心分離機の最低設定にあることを確認し、激しいブレーキ及び加速度が層分離に影響を及ぼす可能性がある。
１．１．１．５．遠心分離後、単核細胞を含む不透明界面から０．５ｃｍ以内までパスツールピペットで上層を慎重に吸引する。上層を破棄する。
１．１．１．６．回収したＰＢＭＣを１０ｍｌのＰＢＳで２５０×ｇで１０分間の遠心分離によって２回洗浄する。
１．１．１．７．ＲＰＭＩ１６４０培地を用いてＰＢＭＣペレットを再懸濁する。
１．１．２．ＢＶ４２１標識５－ＯＰ－ＲＵ／ＭＲ１テトラマーの調製
１．１．２．１．０．５ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン－ＢＶ４２１ ６．８μｌをＰＢＳ１０．２μｌに希釈し、よく混合する。
１．１．２．２．１／１０のストレプトアビジン－ＢＶ４２１溶液（１．７μｌ）を１８μｌのＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ溶液（５μｇ）に１０分ごとに添加し、ピペットで混合し、工程間に暗所で室温でインキュベートする。
１．１．２．３．ＢＶ４２１標識５－ＯＰ－ＲＵ／ＭＲ１溶液を４℃に保つ。
四量体は、使用のために滴定されるべきである；典型的には、１：５００希釈で十分である。
１．１．３．フローサイトメトリによるヒトＭＡＩＴ細胞の検出
ヒトＭＡＩＴ細胞は、５－ＯＰ－ＲＵを負荷したＭＲ１四量体によって、又はＣＤ１６１及びＴＣＲ Ｖα７．２鎖に対する抗体との共染色によって、フローサイトメトリで検出することができる。一般に、ＭＡＩＴ細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞のうちの末梢血において０．１～１０％である。
１．１．３．１．１００μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液当たり１×１０６細胞の濃度でＰＢＭＣを再懸濁する。
１．１．３．２．ＦＡＣＳ抗体及び／又は５－ＯＰ－ＲＵ／ＭＲ１四量体を試料に添加する。
ヒトＭＡＩＴ細胞の検出のために、２つの方法を使用することができる。
ａ）四量体染色：ＢＶ４２１標識ヒト５－ＯＰ－ＲＵ ＭＲ１四量体（１：５００）及びＡＰＣ－Ｈ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ３（１：２００）を使用する。
ｂ）置換マーキング：ＰＥコンジュゲート抗ヒトＴＣＲ Ｖａ７．２（１：２００）、ＡＰＣ－Ｈ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ３（１：２００）、及びＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ１６１（１：２００）。
１．１．３．３．暗所で４℃で３０分間インキュベートする。
１．１．３．４．４℃で５分間、３００×ｇで遠心分離することによって細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で洗浄し、３００μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液で再懸濁する。
１．１．３．５．フローサイトメトリによってＭＡＩＴ細胞を分析する（図１１を参照のこと）。
１．２．ＭＡＩＴ細胞の単離
１．２．１．Ｖα７．２＋細胞の磁気ビーズ分離。
１．２．１．１．ＰＢＭＣを回収し、細胞をＢｉｎｄｉｎｇ緩衝液で洗浄する。上清を捨て、細胞ペレットを１×１０７／１００μｌの濃度のＭＡＣＳ緩衝液で再懸濁する。ＰＥ抗ヒトＴＣＲ Ｖα７．２抗体（１：１００）を添加する。均一に混合し、氷上で３０分間インキュベートする。
１．２．１．２．３００×ｇで５分間遠心分離することによって、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で１回洗浄する。
１．２．１．３．細胞をＭＡＣＳ緩衝液で１０７／８０μｌの濃度で再懸濁する。１０７細胞当たり２０μｌの抗ＰＥマイクロビーズを添加し、氷上で２０分間インキュベートする。
１．２．１．４．細胞を１０倍容量のＭＡＣＳ緩衝液で一回洗浄する。３００×ｇで５分間遠心分離する。１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。
１．２．１．５．ＭＳカラムを１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で前洗浄し、磁石上で組み立てる。細胞をカラムに適用し、カラムを３回、毎回１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で洗浄する。
１．２．１．６．カラムを磁石から取り出し、結合した細胞を１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液中で溶出させる。
１．２．２．ＭＡＩＴ細胞のフロー選別
１．２．２．１．磁石で分離した細胞を回収し、３００×ｇで５分間遠心分離する。
１．２．２．２．細胞をＭＡＣＳ緩衝液で１０７／１００μｌの濃度で再懸濁する。ＢＶ４２１標識ヒト５－ＯＰ－ＲＵＭＲ１四量体（１：５００）及びＡＰＣ－Ｈ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ３（１：２００）を添加する。氷上で２０分間インキュベートする。
１．２．２．３．細胞を１０倍容量のＭＡＣＳ緩衝液で一回洗浄する。３００×ｇで５分間遠心分離する。２ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。
１．２．２．４．ＢＤ Ｐｒｏｄｉｇｙ選別機をオンにし、細胞試料をロードする。ＣＤ３＋四量体＋細胞集団を選別する（図１２を参照のこと）。
１．３．ＭＡＩＴ細胞の単離
１．３．１．選別したＭＡＩＴ細胞を回収し、３００×ｇで５分間遠心分離する。
１．３．２．上清を捨て、Ｒ１０培地に１０６細胞／ｍｌに再懸濁する。
１．３．３．Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８をボルテックスによって３０秒間再懸濁する。
１．３．４．所望の体積のＤｙｎａｂｅａｄｓをチューブに移す。
１．３．５．等体積の緩衝液を加え、ボルテックスによって５秒間混合する。チューブを磁石上に１分間置き、上清を廃棄する。
１．３．６．チューブを磁石から取り出し、洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓをＲ１０培地に再懸濁する。
１．３．７．所望の体積のＤｙｎａｂｅａｄｓを細胞懸濁液に添加して、３７℃インキュベーター中２４ウェルプレート中１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２で１：１のビーズ対細胞比を得る。
１．４．ＭＡＩＴ細胞のレトロウイルス形質導入
１．４．１．レトロウイルス形質導入を、ＭＡＩＴ細胞活性化の４８時間後に行った。
１．４．２．形質導入の１日前に、レトロネクチン被覆プレートを調製する。１５μｇのレトロネクチンを１ｍｌのＰＢＳに加える。よく混合し、非組織培養処理２４ウェルプレートの一方のウェルに添加する。
１．４．３．プレートをフィルムで包み、４℃の冷蔵庫で一晩保存する。
１．４．４．遺伝子導入の日に、ウェルから未結合のレトロネクチンを除去する。ＰＢＳ２ｍｌで２回洗浄する。ウェル乾燥を避ける。
１．４．５．３７℃の水浴中でレトロウイルス上清を解凍する。１ｍｌのウイルス上清をレトロネクチン被覆プレートの各ウェルに移す。
１．４．６．プレートをフィルムで包み、プレートを１０００×ｇ、３２℃で２時間遠心分離する。
１．４．７．遠心分離中、活性化されたＭＡＩＴ細胞を回収する。１００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含有する新鮮なＲ１０培地によって細胞を１×１０６／ｍｌの濃度に再懸濁する。
１．４．８．スピンが終了したら、プレートから上清を廃棄する。１ｍｌの細胞懸濁液を各ウェルに添加する。
１．４．９．プレートを５００×ｇで１０分間遠心分離する。
１．４．１０．プレートを３７℃のインキュベーターに戻す。
１．４．１１．必要に応じて、形質導入工程を繰り返して、より高い形質導入効率を達成する。
注：形質導入効率は、形質導入の４８時間後にフローサイトメトリによって検出することができる。
１．５．ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の増殖
１．５．１．レトロウイルス形質導入の２日後、細胞を回収し、血球計によって細胞を計数する。
１．５．２．１×１０７細胞をＧｒｅｘ６Ｍウェルプレートの１つのウェルに移す。１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含有する１３０ｍｌの新鮮なＲ１０培地を添加し、プレートをインキュベーターに戻す。
１．５．３．ＩＬ－２を３日ごとに１００ＩＵ／ｍｌの最終濃度にリフレッシュする。
１．５．４．ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を８～１２日間の培養後に回収することができる（図１３を参照のこと）。
注：拡大ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、表現型試験、機能アッセイのために使用され得るか、又は液体窒素中で凍結され得る。
結果
実施例１－ＣＤ４標的化Ｔ細胞及びＴＣＲ Ｖβ７．１標的化Ｔ細胞の作製
図１Ａ（１）及び（２）を参照すると、本発明によるＣＡＲ構築物の２つの異なる実施形態に含まれる機能的要素を示す概略図が示されている。
各実施形態において、構築物は、上流及び下流の長い末端反復配列（ＬＴＲ）に隣接している。５’プロモータは、５’ＬＴＲの下流に配置され、ＰＧＫプロモータであり得る。プロモータの３’側には、融合タンパク質をＴ細胞外膜に導くためのＩｇκシグナリングペプチドであるＳＰが配置されている。ＳＰの３’側には、上流ＶＬ（可変軽鎖）配列、中央Ｇ４Ｓ配列及び下流ＶＨ（可変重鎖）配列を含むｓｃＦｖ領域が提供される。ＶＬ配列及びＶＨ配列は、一実施形態では（図１Ａ（１）に示すように）、ＣＤ４抗原に結合するためのＨｕ５Ａ８軽鎖可変領域及び重鎖可変領域であり得る。他の実施形態において（図１Ａ（２）に示されるように）、ＶＬ配列及びＶＨ配列は、ＴＣＲ－Ｖｂ７．１に結合するための３Ｇ５軽鎖可変領域及び重鎖可変領域であり得る。
ｓｃＦｖ領域の３’側には、ＣＡＲの表示及び固定のためのＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通（ＴＭ）ドメイン構造ドメインが存在する。ヒンジ及びＴＭの３’側には、細胞内シグナル伝達経路を誘発するための、ＣＤ２８、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ鎖のシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインが提供される。Ｐ２Ａ自己切断ペプチドは、ζ鎖の３’側及び切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）の５’側に配置され、これを追跡し、第１の安全スイッチとして作用する。第２のＰ２Ａ自己切断ペプチドが、ＥＧＦＲｔの３’側及び第２の安全スイッチとして作用する誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）の５’側に配置される。この構築物は、発現を増強するウッドチャック肝炎制御エレメント（ＷＰＲＥ）（図９及び図１０のプラスミドを参照のこと）を含み、最後に、末端の３’ＬＴＲを含む。
ヒトＣＤ４に対する免疫特異性を有するヒト化５Ａ８（Ｈｕ５Ａ８）マウスＩｇＧ抗体のＤＮＡ配列は、ＣＮ１０３２８２３８５から見出された。ＴＮＸ－３５５又はイバリズマブとしても知られているＨｕ５Ａ８は、ＣＤ４分子のＨＩＶ結合部位を遮断することによってＨＩＶ侵入を阻害するための第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験で広く評価された。対照として、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（Ｌｅｕ１６）のＶＨ鎖及びＶＬ鎖も合成し、前臨床及び臨床ＣＡＲ－Ｔ研究におけるその有効性について評価した。ｓｃＦｖ断片を、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、４－１ＢＢエンドドメイン及びＣＤ３ζ鎖とインフレームで第３世代ＣＡＲプラスミドの骨格にクローニングした。第３世代ＣＡＲを、第１世代及び第２世代ＣＡＲに対するその優位性を実証する研究のために使用した。ｔＥＧＦＲの有用性を、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の除去のための選択、インビボ追跡マーカーとして、また第１の安全スイッチとして調べた。したがって、この残留ｔＥＧＦＲ配列を、Ｔ２Ａ－リボソームスキップ配列によってＣＡＲ配列と連結した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗ＣＤ１９及び抗ＨＩＶ ＣＡＲ試験の場合のように、時には数十年もの間、患者に残存し得る。Ｂ細胞形成不全とは異なり、長期のＣＤ４＋Ｔ細胞形成不全は生命を脅かす。したがって、腫瘍若しくはウイルス枯渇後、又はＣＡＲ－Ｔ療法中の重篤な副作用に起因する緊急症例において、患者から本発明のＣＡＲＴ４細胞を除去するための安全方法を確立することが必要である。二量体化薬物誘発カスパーゼ－９（ｉＣ９）自殺スイッチは、カスパーゼ誘導性薬物（ＣＩＤ）と呼ばれる、低化学分子薬物ＡＰ２０１８７の存在下での条件付き二量体化を可能にする、変異ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）へのヒトカスパーゼ－９の融合に基づく。ｉＣ９の使用は、ハプロタイプ一致ＨＳＣ移植の臨床試験において安全かつ有効であることが既に証明されている。したがって、ＣＤ４ ＣＡＲ、ｔＥＧＦＲ及びｉＣ９を含有する遺伝子断片を次に合成し（図１Ａ．１）、レトロウイルスＭＳＣＶ（マウス幹細胞ウイルス）ベクターに挿入した（図９に示す；１０，３４８ｂｐ）。また、その後、ＴＣＲ Ｖβ７．１ ＣＡＲ、ｔＥＧＦＲ及びｉＣ９を含有する遺伝子断片を合成し（図１Ａ．２）、レトロウイルスＭＳＣＶ（マウス幹細胞ウイルス）ベクターに挿入した（図１０に示す；１０，３４７ｂｐ）。
ＣＡＲ及びｔＥＧＦＲの共発現を実証するために、ヒトＰＢＭＣをＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ－アクチベーターで活性化し、図９及び図１０に示すプラスミドのレトロウイルス形質導入によって遺伝子操作して、ＣＡＲ／ｔＥＧＦＲ／ｉＣ９遺伝子構築物を発現させた。実際、ＥＧＦＲ特異的抗体と組み合わせたマウスｓｃＦｖ特異的抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２抗体での表面染色時の二重陽性細胞集団の検出によって示されるように、ＣＡＲ及びｔＥＧＦＲの発現レベルは密接に相関することが見出された（図１Ｂ）。Ｔ細胞増殖と共に、ｔＥＧＦＲ＋細胞集団は、全細胞の約５０％を占めるその割合を維持した。（図１Ｃ）。
インビトロでのｉＣ９安全スイッチの効率を評価するために、ｉＣ９遺伝子を含まないＣＡＲＴ４変異（ｉＣ９を含まないＣＡＲＴ４）を対照としてクローニングした。ＣＡＲＴ４又はｉＣ９構築物を含まないＣＡＲＴ４で形質導入されたＴ細胞を、増加する濃度のＣＩＤ ＡＰ２０１８７（０．１ｎＭ～１００ｎＭ）に２４時間曝露した。７ＡＡＤ及びアネキシンＶを用いたフローサイトメトリ分析によって細胞死を評価した。生存した集団におけるｔＥＧＦＲ陽性パーセンテージは、ＣＩＤの濃度の増加と共に低下した。６９．１％のｔＥＧＦＲ高細胞が、１００ｎＭの単回用量のＣＩＤ後に排除された（図１Ｄ）。他の研究からの観察結果と一致して、死滅から逃れる細胞は、ＣＩＤ後にｔＥＧＦＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）が５０％減少した低レベルの導入遺伝子を発現する細胞であった（図１Ｅ）。したがって、非応答性Ｔ細胞は、ＣＩＤの機能的活性化のためには不十分なｉＣ９を発現した。臨床適用のために、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、投与前に十分な導入遺伝子発現のために選別されなければならない場合がある。
実施例２－インビトロでのＣＡＲＴ４ Ｔ細胞の機能検証
ＣＡＲ形質導入後４日以内に、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、形質導入されていない（ＮＴＤ）及び細胞の約４５％がＣＤ４陽性のままであるＣＡＲＴ２０対照と比較して、ほぼ完全に枯渇した（図２Ａ）。これらのデータは、Ｔ細胞増殖中のＣＡＲＴ４細胞のＣＤ４に対する強力な活性を示した。
自己初代健康ドナーＰＢＭＣに対して共培養を確立した。ＣＦＳＥ標識自己ＰＢＭＣをＣＤ８＋ＣＡＲＴ４細胞又はＣＡＲＴ２０細胞のいずれかと共培養した。両方の設定において、ＣＡＲＴ４／２０細胞は、それぞれの標的細胞に対する高レベルの細胞傷害性を媒介した。ＰＢＭＣ中のＣＤ４＋細胞の９４％を、４時間の共培養中にＥ：Ｔ比３：１の条件でＣＡＲＴ４細胞によって溶解した。しかしながら、ＮＴＤ Ｔ細胞と比較して、ＣＤ２０＋細胞に応答したＣＡＲＴ４の特異的Ｔ細胞細胞傷害性はなかった（図２Ｃ）。
ＣＡＲＴ４細胞の機能を更に評価するために、本発明者らは、Ｊｕｒｋａｔ細胞株及びＣＥＭ－ｓｓ細胞株を使用して、ＣＡＲＴ４細胞の抗腫瘍効果を試験した。Ｊｕｒｋａｔ及びＣＥＭ－ｓｓ細胞株は、Ｔ細胞白血病又はヒトＴ４リンパ芽球性白血病の患者の末梢血から最初に樹立されたＴ細胞株であった。両方の細胞株はＣＤ４を発現し、一方、ＣＥＭ－ｓｓ細胞株はより高レベルのＣＤ４を発現する（図２Ｄ）。実際、ＣＡＲＴ４細胞は、ＣＤ４発現レベルに基づいてＴ腫瘍細胞株を標的とした。短時間のインキュベーションの後、ＣＡＲＴ４細胞は、５：１のＥ：Ｔ（エフェクター：標的）比でＣＥＭ－ｓｓ細胞を首尾よく排除した。対照として、ＣＡＲＴ４細胞を、ＣＤ４を発現しないヒトＢ細胞株（ＢＣＬ）であるＣＤ４－リンパ腫細胞に対するそれらの活性についても試験した（図２Ｄ）。フローサイトメトリ分析は、ＣＡＲＴ４細胞がＢＣＬを標的化することができないことを実証した（図２Ｅ）。更に、ＣＤ４＋腫瘍細胞と共に培養したＣＡＲＴ４細胞は、細胞内サイトカイン染色によって有意なＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α応答を示した（図２Ｆ）。したがって、これらのデータは、ＣＤ４発現に対するＣＡＲＴ４の強い用量依存的応答を証明した。ＣＡＲＴ４細胞をＣＤ４陰性細胞とインキュベートした場合、殺滅効果は観察されなかった。したがって、これらの結果は、ＣＡＲＴ４細胞除去がＣＤ４に特異的であることを示している。
実施例３－ＣＡＲＴ４細胞はＣＤ４＋Ｔ腫瘍細胞を特異的に死滅させる
患者試料に対するＣＡＲＴ４の機能を調べるために、ＡＴＬＬ患者由来のＰＢＭＣを解凍し、表現型解析した。全ての試料は、６７．４％～９７．７％の範囲のＣＤ４発現を有していた。ＣＤ４＋細胞のほとんどは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ Ｖβ）の１つのユニークなβ鎖を発現し、Ｔ細胞白血病２０２～２０４のクローン発生を示している（図３Ａ）。フローサイトメトリ分析によって定量化されるように、４時間にわたるＣＡＲＴ４細胞とのＡＴＬＬ患者試料の共培養は、ＣＤ４＋悪性腫瘍の迅速かつ完全な消失をもたらした。以前に示された芽球Ｔ細胞株の消失と一致して（図３Ｂ）、全てのＡＴＬＬ共培養物について約８０％の消失が観察された。６人のＣＴＣＬ患者由来の試料を用いて試験も行った。同様に、融解したばかりの初代ＣＴＣＬ細胞に対するＣＡＲＴ４細胞の強い細胞傷害性が観察され、４時間の共培養後に悪性Ｔ細胞の約６０％～８０％の減少をもたらした（図３Ｃ）。したがって、ＣＡＲＴ４細胞は、患者試料から直接単離された攻撃的なＣＤ４＋Ｔ悪性腫瘍を効率的に排除した。これらの結果は、ＣＤ４がＣＤ４＋Ｔ悪性腫瘍の有望な治療標的であることを示している。
実施例４－ＣＡＲＴ４細胞はインビボで抗白血病効果を効率的に媒介する
インビボ抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ発現ＣＥＭ－ｓｓ細胞株を使用して異種マウスモデルを開発した。彼らはまず、ＣＡＲＴ４細胞の単回用量（４×１０６個）でＮＲＧマウスにおける白血病の出現を遅延させるＣＡＲＴ４細胞の能力を試験した。フローサイトメトリ分析によって実証されるように、注射前に、細胞の約５０％が抗ＣＤ４ ＣＡＲを発現した。マウスは、ＣＥＭ－ｓｓ細胞の後眼窩注射を受けた。腫瘍生着の４日後、ＣＡＲＴ４細胞又はＮＴＤＣＤ８＋Ｔ細胞の後眼窩注射の単回用量を白血病を有するマウスに投与した（図４Ａ）。腫瘍負荷を、末梢血中のルシフェラーゼ活性を毎週測定することによってモニターした。注入されたＣＡＲＴ４細胞は、白血病進行に対する堅固な保護を提供し（図４Ｂ）、マウスの生存期間中央値を有意に延長した（対照群では３８日間対ＣＡＲＴ４群では６０日間、マンテル・コックス・ログランク検定によりＰ＝０．０２６）（図４Ｃ）。実際、エンドポイントにより、ｅＧＦＰ＋腫瘍の進行は、フローサイトメトリ分析により脾臓及び骨髄で劇的に遅延した（図４Ｄ）。
再発腫瘍細胞はＣＤ４の発現を保持したが、発現レベルは対照群と比較して約４０％のＭＦＩまで低下した（図４Ｅ）。しかし、この下方制御は、再発腫瘍を排除するＣＡＲＴ４細胞の能力を損なうには不十分であった（図４Ｆ）。この結果は、抗原回避ではなくＣＡＲ－Ｔ細胞持続性の欠如が腫瘍再発の主な理由であることを示していた。
実施例５－ＧＭＰに準拠したＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法の開発
スケーラビリティを評価し、ＣＡＲ－Ｔ細胞製造を単純化するために、ＣＡＲ－Ｔ製造のためのガス透過性静的細胞培養システム（Ｇ－Ｒｅｘ）を使用して、最適化された標準的な操作手順を確立した（図５Ａ）。Ｇ－Ｒｅｘシステムは、プレートの底部にシリコーン膜を含む。膜を横切るＯ２及びＣＯ２を含むガス交換は、培養培地の深さを増加させ、より多くの栄養素を提供し、廃棄物を希釈することを可能にする。ＰＢＭＣを活性化し、形質導入し、１０×１０６細胞を移入し、更にＧ－Ｒｅｘ６ウェルプレート中で培養した。細胞にサイトカインＩＬ－７及びＩＬ－１５を２～３日ごとに補充した。細胞は、初期数の２×１０６細胞から３×１０８を超えて拡大し、１５日間で１５０倍増加した（図５Ｂ）。次に、Ｇ－Ｒｅｘ系におけるＴ細胞増殖後の最終生成物の形質導入効率を確認した。ＣＡＲＴ４の最終形質導入効率は、図５Ｃに示すように、従来のフラスコから産生された細胞（５３．７％±５．３％）と同様に、５７．６％±７．１％であった。予想通り、内因性ＣＤ４＋集団は最終生成物中で完全に枯渇し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗ＣＤ４活性を示した。
興味深いことに、Ｇ－Ｒｅｘにおいて産生されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、セントラルメモリー表現型に対する分化優先性を示した。メモリーマーカーＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌの評価は、従来の培養フラスコで培養した細胞と比較して、より高いＣＤ４５ＲＯ ＣＤ６２Ｌ二重陽性集団割合（７７％±７．１％対４１％±５．５％）を示した（図５Ｄ）。ＣＤ４５ＲＯ ＣＤ６２Ｌ二重陽性細胞は、セントラルメモリーＴ細胞であり、インビボでの長期持続に必要であると考えられている。したがって、このバイオプロセス最適化方法は、ＣＡＲ－Ｔ製造の技術者介入の数及びコストを減少させながら、細胞出力及びセントラルメモリー表現型を有する割合を増加させた。
実施例６－ＴＣＲ Ｖβ７．１特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
Ｔ細胞悪性腫瘍は、通常、ユニークなＴＣＲを発現する１つのモノクローナルな癌性細胞から発生する。ＴＣＲ β（Ｖβ）鎖の可変（Ｖ）領域に対する広範囲の抗体が、２５のＶβファミリーのうち２２の評価を可能にする直接コンジュゲート多色フォーマットで利用可能になり、正常な循環Ｔ細胞レパートリーの７５％をカバーする。したがって、本発明者らは、ＴＣＲ ＶβがＴ細胞悪性腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ療法の潜在的な標的であると考える。ＣＡＲ－Ｔ（ＣＡＲＴＶｂ７．１）細胞を標的とするＴＣＲ Ｖβを開発するために、本発明者らは、図１Ａ（２）に示されるように、ヒトＴＣＲ Ｖβ７．１（オックスフォードのＡｎｄｒｅｗの研究室のＤｒ Ｍａｒｇｒｅｔ Ｃａｌｌａｍ）に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞３Ｇ５のｓｃＦｖ領域をＣＡＲ構築物にクローン化した。ＣＡＲ形質導入の５日後、内因性ＴＣＲ Ｖβ７．１＋集団は、細胞の約１．２％がＴＣＲ Ｖβ７．１陽性のままであるＣＡＲＴ２０対照と比較して、ほぼ完全に枯渇した（図６Ｂ）。これらのデータは、Ｔ細胞拡大中のＣＡＲ－Ｔ細胞のＴＣＲ Ｖβ７．１に対する強力な活性を示した。
ＣＡＲＴＶｂ７．１細胞の機能を更に評価するために、本発明者らは、ＴＣＲ Ｖβ７．１陽性腫瘍と診断されたＡＴＬ患者から単離された腫瘍細胞を使用して抗腫瘍効果を試験した。実際、フローサイトメトリ分析によって定量化されるように、６時間にわたるＣＡＲＴＶｂ７．１細胞とのＡＴＬ患者試料の共培養は、ＣＤ４＋悪性腫瘍の迅速かつ完全な消失をもたらした。約６０％の消失が、全てのＡＴＬ共培養物について観察された（図６Ｃ、図６Ｄ）。これらの結果は、ＴＣＲ ＶβがＴ悪性腫瘍の有望な治療標的であることを示している。
実施例７－ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の開発
現在、ＣＡＲ－Ｔ療法のほとんどは、自己の従来のＣＤ３＋Ｔ細胞を利用する。しかしながら、癌患者由来の免疫細胞は、機能性が低いか、又は少数で存在し得る。特に、腫瘍細胞をＣＡＲで操作することが可能であるため、Ｔ悪性腫瘍患者のＰＢＭＣを拡大させ、遺伝子改変することは危険であろう。したがって、第３者の同種異系細胞を製造することができる免疫療法を開発することが望ましい。ここで、本発明者らは、磁気分離とフローサイトメトリ選別の組合せによってＰＢＭＣから粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ細胞）を単離する２段階法を開発した。ＴＣＲ Ｖα７．２発現に基づく第１段階の分離の後、ＭＡＩＴ細胞パーセンテージは０．７４％から３３．３％に増加した（図７Ａ、図７Ｂ）。次の工程のフロー選別は、ＭＡＩＴ純度を９５％まで更に増加させ得る。選別した細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化し、サイトカインのカクテル（ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５）の存在下で拡大させた。増殖方法は、１２～１４日以内に約１００倍の増殖をもたらした（図７Ｃ）。回収時に、拡大した細胞の９０．９％がＭＲ１－５－ＯＰ－ＲＵ四量体に対する特異性を維持した（図７Ｄ）。また、拡大したＭＡＩＴ細胞を、レトロウイルス形質導入によってＣＡＲ遺伝子によって首尾よく操作することができた（図７Ｅ）。ＣＡＲ形質導入ＭＡＩＴ（ＣＡＲ－ＭＡＩＴ）細胞は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と同等の細胞傷害能力を有する（図８）。
実施例８－ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞はインビボで抗白血病効果を効率的に媒介する
ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞の抗腫瘍機能をインビボで評価するために、本発明者らは、ＣＡＲ細胞の単回用量（４×１０６個）でＮＳＧマウスにおいて白血病の進行を遅延させる抗ＣＤ４ ＣＡＲ－ＭＡＩＴ（ＣＡＲ－ＭＡＩＴ４）細胞の能力を試験した。マウスは、ＣＥＭ－ｓｓ細胞の後眼窩注射を受けた。腫瘍生着の４日後、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ４細胞又はＣＡＲＴ４細胞の静脈内注射の単回用量を白血病を有するマウスに投与した（図１４Ａ）。抗ＣＤ２０ ＣＡＲ－ＭＡＩＴ（ＣＡＲ－ＭＡＩＴ－Ｃｔｒｌ）細胞又は抗ＣＤ２０ ＣＡＲＴ（ＣＡＲＴ－Ｃｔｒｌ）細胞を対照群として投与した。腫瘍負荷を、ルシフェラーゼ活性を毎週測定することによってモニターした。注入されたＣＡＲ－ＭＡＩＴ４細胞及びＣＡＲＴ４細胞は、白血病進行に対する同等の保護を提供し（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）、腫瘍担持マウスの生存を有意に延長した（図１４Ｂ）。
実施例９－ヒトＭＡＩＴ細胞の検出、単離、拡大及び操作
本明細書中に記載される方法を使用して、ヒトＭＡＩＴ細胞を検出し、単離し、拡大し、操作した。
図１１に示されるように、ヒトＭＡＩＴ細胞をフローサイトメトリによって分析した。
図１２に示されるように、ＭＡＩＴ細胞をフロー選別した。
次いで、ＭＡＩＴ細胞を活性化し、ＣＡＲ発現ベクターで形質導入してＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を作製し、次いで、これを図１３に示されるように拡大培養した。
実施例１０－ＰＭＢＣを刺激することによるＭＡＩＴ細胞の増殖
ＭＡＩＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ様分子ＭＲ１を認識するＣＤ３＋ＴＣＲＶａ７．２＋ＣＤ１６１＋細胞として定義される自然Ｔ細胞のサブセットである。以前の研究は、ＭＡＩＴ細胞をインビトロで拡大させることができるが、同種異系フィーダー細胞の存在を必要とすることを示しているが、この方法は大規模生産及び品質管理にとって困難である。本研究では、本発明者らは、両方とも様々なサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３）の組合せの存在下で、インビトロ培養で最大６日間、抗原（５－ＯＰ－ＲＵ）ロードＭＲ１四量体ビーズ又は５－ＯＰ－ＲＵ単独でＰＢＭＣを最初に刺激することによって、インビトロでＭＡＩＴ細胞を増殖させるための非常に新規かつ効果的な方法を開発した。次いで、得られたＭＡＩＴ細胞を、先の実施例に記載されるように、ＭＡＣＳ又はＦＡＣＳ選別によって単離し、ＣＡＲに基づく治療のために抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによって更に拡大させた。
材料及び方法
１．ＰＢＭＣの単離
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配での遠心分離を介して、健常血液ドナーのバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣのアリコートを凍結し、使用するまで液体窒素中で保存した。実験を開始する前に、凍結ＰＢＭＣストックを解凍し、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中で３７℃でインキュベートした。
２．ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ複合ビーズの調製
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のストレプトアビジン及びビオチン化ＭＲ１モノマーを含むＭ－２８０ ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用することによって、ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵテトラマーコーティングビーズを生成した。５－ＯＰ－ＲＵロードＭＲ１モノマーは、Ｄｒ Ｊｉｍ ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の厚意により提供された。ビーズを混合し、ロッカー上で４℃で１２時間、５－ＯＰ－ＲＵロードＭＲ１モノマー（５ｕｇ／３×１０７ビーズ）でコーティングした。過剰な未結合タンパク質を、ＰＢＳにおける２回の１０分間の洗浄によって除去した。調製したＭＲ１テトラマーコーティングビーズをＰＢＳに再懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
３．ＰＢＭＣ中のＭＡＩＴ細胞の濃縮
ＰＢＭＣ（ウェル当たり２×１０５細胞）を、Ｒ１０培地（９０％ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋２ｍＭ Ｌ－グルタミン）を含む９６ウェルプレート中で３７℃インキュベーター中で培養し、インビトロで６日間、異なるサイトカインと組み合わせて、１：１のビーズ対細胞比でＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ複合体被覆ビーズ又は精製５－ＯＰ－ＲＵ抗原（１０ｎＭ）（Ｄｒ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｍａｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ，Ａｕｓｔｒａｌｉａによって提供された）のいずれかによって刺激した。サイトカインＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ）、ＩＬ－７（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＩＬ－１２（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍｌ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＩＬ－２３（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を、図１５の表に示されるように、１から１５まで番号が付された１５の異なる組合せで添加した。６日目に、拡大させた細胞を回収し、分析して、以下に記載されるようにフローサイトメトリによってＭＡＩＴ細胞の割合を決定した。
４．ＰＢＭＣ中のＭＡＩＴ細胞頻度のＦＡＣＳ分析
拡大させたＰＢＭＣを、暗所で３０分間、抗体を使用して表面マーカーについて染色した。ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ３（クローンＢＷ２６４／５６、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＰＥコンジュゲートＶａ７．２（クローン３Ｃ１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣコンジュゲートＣＤ１６１（クローンＤＸ１２、ＢＤ）を１：１００で使用して細胞を標識した。ＭＡＩＴ細胞は、ＣＤ３＋Ｖａ７．２＋ＣＤ１６１＋細胞として定義される。死細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して除外した。染色した細胞を５～１０体積のＰＢＳで洗浄し、５００×ｇで５分間遠心分離し、２００μｌのＰＢＳで再懸濁した後、フローサイトメトリ分析を行った。フローサイトメトリの結果をＦｌｏｗＪｏによって分析した。
結果
図１５を参照すると、ＰＢＭＣ中のＭＡＩＴ細胞を濃縮した結果が示されている。ＰＢＭＣを、（ｉ）１：１のビーズ対細胞比でのＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ複合体ビーズ又は（ｉｉ）１０ｎＭでの５－ＯＰ－ＲＵ抗原のいずれかによって、表に示すようにそれぞれ異なるサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３）の存在下で６日間刺激した。例えば、条件１はＩＬ－２のみに対応し、条件２はＩＬ－７及びＩＬ－１５に対応し、条件３はＩＬ－２、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８に対応する等である。
ＭＡＩＴ細胞増加の倍数を、６日目の生存ＭＡＩＴ（ＣＤ３＋Ｖａ７．２＋ＣＤ１６１＋）細胞の頻度を０日目のＭＡＩＴ細胞の元の頻度で割ることによって計算した。上位５つの群をオレンジ色で強調した（すなわち、条件１、３、１１、１２及び１３）。
見られ得るように、（ドナー１については）ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ複合体ビーズについて、１、１３、１２、３及び１１のサイトカインの組合せは、ＰＢＭＣ中のＭＡＩＴ細胞の増加の最大倍を与えた。ＭＲ１／５－ＯＰ－ＲＵ複合体ビーズ（ドナー２について）では、１２、１３、１、１１及び３のサイトカインの組合せは、ＰＢＭＣ中のＭＡＩＴ細胞の増加の最大倍を与えた。
見られ得るように、５－ＯＰ－ＲＵ（ドナー１について）について、３、１、１２、１３及び１１のサイトカインの組合せは、ＰＢＭＣ中のＭＡＩＴ細胞の増加の最大倍数を与えた。５－ＯＰ－ＲＵ（ドナー２について）の場合、８、１３、１２、１１及び３のサイトカインの組合せは、ＰＢＭＣ中のＭＡＩＴ細胞の増加の最大倍数を与えた。
これらのデータに基づいて、異なるサイトカイン及びサイトカインの組合せ（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３）が異なるレベルの刺激をもたらし、ＰＢＭＣ中のＭＡＩＴ細胞の濃縮の改善をもたらしたことが明らかである。全体として、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＩＬ－２３の組合せは、ＰＢＭＣ中のＭＡＩＴ細胞の増加の最大倍数を与える。
考察
現在、Ｔ細胞リンパ腫についての十分に確立された治療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍と比較して利用可能ではなく、唯一の可能性のある治癒的レジメンは、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）であり、それ自体は有意な治療関連死亡率を有する。Ｔ細胞リンパ腫の大部分（＞９５％）は、定義されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を発現する優性Ｔ細胞クローン（すなわち、クローンＴＣＲ－Ｖｂ鎖）に由来し、ｐａｎ－Ｔは細胞マーカーＣＤ４を助けるので、これらのマーカーを標的とするモノクローナル抗体は、Ｔ細胞リンパ腫の治療について検討されており、いくつかは小規模臨床試験で部分的な退縮をもたらした（ｄ’Ａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｈａｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
ＣＡＲ－Ｔは、ｐａｎ－Ｂ細胞マーカーＣＤ１９を標的化することによるＢ細胞悪性腫瘍の非常に有効な治療法であるにもかかわらず、このアプローチは、Ｔ細胞リンパ腫の治療に適用する場合に重大な障害に直面している。第１に、Ｂ細胞枯渇とは異なり、持続性Ｔ細胞形成不全、特にＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇は、慢性ＨＩＶ感染中に観察される日和見感染症等の重度の毒性をもたらすであろう。第２に、Ｔ細胞リンパ腫に関連するＴ細胞機能障害及び優性Ｔ細胞腫瘍成長によって引き起こされる正常Ｔ細胞数の低下は、自己ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するために使用することができず、したがって、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞リンパ腫の治療のために必要である。最後に、ほとんどのＴ細胞リンパ腫は、リンパ節及び皮膚組織に関連する固形腫瘍であり、これらは、それらのより低い組織浸潤能力並びに厳しい腫瘍微小環境のために従来のＣＡＲ－Ｔによって治療することが困難である。
これらの問題に対処するために、本発明者らは、腫瘍細胞を根絶した後にＣＡＲＴ４形質導入Ｔ細胞を選択的に排除するための安全スイッチとしてｔＥＧＦＲ及びｉＣ９を含有するＣＡＲ標的化ＣＤ４抗原（ＣＡＲＴ４）を設計し、自己造血幹細胞又は同種ＨＳＣＴからの正常なＣＤ４＋Ｔ細胞の回収を可能にした。ＣＤ４＋Ｔ細胞の輸送枯渇は、抗ＣＤ４抗体による自己免疫疾患の治療において安全かつ忍容可能であることが示されている（Ｈａｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＣＡＲＴ４形質導入ヒトＴ細胞は、ＡＴＬＬ又はＣＴＣＬ患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ腫細胞株をインビトロで死滅させ、マウス異種移植モデルにおいてインビボで腫瘍成長を阻害することができた。より重要なことには、これらのＣＡＲＴ４＋Ｔ細胞は、抗ＥＧＦＲ抗体によって検出されるｔＥＧＦＲ及びインビトロ及びインビボでのＣＡＲＴ４＋Ｔ細胞のＣＩＤ薬物誘発性アポトーシスによって決定されるｉＣ９の両方と共にＣＡＲを共発現する。ｔＥＧＦＲの発現は、ＣＡＲＴ４＋Ｔ細胞増殖をモニタリングするため、又はインビボで抗ＥＧＦＲ抗体を用いてＣＡＲＴ４＋Ｔ細胞を排除するためのいずれかに使用することができる。
一般に、正常Ｔ細胞は、病原体感染に対する細胞性免疫を維持するための非常に多様なＴＣＲレパートリーからなる。ＴＣＲは、Ｎ末端可変領域及びＣ末端定常領域を含むａ鎖及びｂ鎖のヘテロ二量体からなる。ＴＣＲ－Ｖｂ領域（鎖）は、ＴＣＲ－Ｖａよりも多型であり、免疫応答又はＴ細胞悪性腫瘍のクローン性を分析するためにしばしば使用される。現在、７５％のＴＣＲレパートリーをカバーするＴＣＲ－Ｖｂ鎖ファミリーに特異的な２２ｍＡｂが存在する。Ｔ細胞リンパ腫のほとんどは、同じＴＣＲ Ｖｂ鎖を発現する単一のＴ細胞クローンに由来するので、したがって、残りの正常なＴ細胞レパートリーを維持しながら腫瘍クローンに定義されたＴＣＲ－Ｖｂ鎖を標的とするＣＡＲＴは、日和見感染症を最小限に抑えるための理想的なアプローチであり、輸血後にＣＡＲＴ細胞を除去する必要はない。
抗ＴＣＲ－Ｖｂベースの免疫療法の概念実証として、本発明者らは、ＴＣＲ－Ｖｂ７．１鎖（ＣＡＲＴＶｂ７．１）を特異的に標的とするＣＡＲを操作し、ＣＡＲＴＶｂ７．１形質導入Ｔ細胞が、ＡＴＬ患者から単離されたＴＣＲ－Ｖｂ７．１陽性腫瘍細胞を効果的に排除することができることを示し、抗ＴＣＲ－Ｖｂ ＣＡＲがＴ細胞リンパ腫の代替免疫療法を提供し得ることを示唆した。
最後に、本発明者らは、ＭＡＩＴ細胞が従来のＴ細胞を超えるいくつかの利点を有するので、ＭＡＩＴ細胞がＣＡＲに基づく治療のためのエフェクター細胞として使用され得るかどうかを調べた：
（１）哺乳動物進化の間に高度に保存された不変のＴＣＲを発現することによる低い同種反応性（すなわち、移植片対宿主病、ＧＶＨＤを誘発する）；
（２）マウスモデルにおけるＧＶＨＤの阻害を含む調節機能；
（３）活性化誘導性のＧｒＢ、パーフォリン及びＧｒＡによる殺滅活性；及び
（４）腸粘膜、皮膚及び肺における分布等の組織ホーミング。
本明細書中に記載されるように、ＣＡＲを形質導入されたＭＡＩＴ細胞（ＣＡＲ－ＭＡＩＴ）は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞が示したのと少なくとも同等な抗腫瘍活性をインビトロ及びインビボにおいて示した。
結論として、本発明者らは、オン標的／オフ腫瘍毒性及びサイトカイン放出症候群又は特異的ＴＣＲ－Ｖｂ鎖（全体的な免疫抑制を回避するために悪性Ｔ細胞に固有である）を減少させるために切り替え可能なＣＡＲ－Ｔによりｐａｎ－Ｔ細胞マーカーＣＤ４のいずれかを標的化することによって、Ｔ細胞悪性腫瘍の効果的な治療のための新規なＣＡＲ－ＭＡＩＴに基づく免疫療法を開発した。より重要なことには、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞は、Ｔ細胞リンパ腫の治療に必要とされる同種異系ＣＡＲに基づく療法を開発する可能性を有し得る。一貫して製造される場合、すなわち、大量のエクスビボ増殖である場合、それらは既製の開発に使用することができる。本発明者らは、ＣＡＲ－ＭＡＩＴが、Ｔ細胞悪性腫瘍のためだけでなく、他の非免疫細胞型腫瘍のための効果的な治療のための新しいアプローチを提供し得ると考える。
結論
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に基づくＴ細胞療法は、ｐａｎ－Ｂ細胞特異的抗原を標的とすることによってＢ細胞悪性腫瘍の治療において大きな成功を収めている。しかし、Ｔ細胞リンパ腫についての同様の戦略はこれまで実現されておらず、主に、Ｂ細胞悪性腫瘍と比較して、Ｔリンパ腫における全体的なＴ細胞枯渇及び正常Ｔ細胞の機能不全／低頻度による潜在的な重篤な毒性のためである。これらの制限を克服するために、本発明者らは、２つの安全スイッチ：切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）及び誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）を組み込んだ、ｐａｎ－Ｔ細胞マーカー（ＣＤ４）又はＴＣＲ－Ｖｂアイソタイプ鎖に特異的な新規ＣＡＲ構築物を操作した。本発明者らは、同種異系反応性が低い粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞が、ＣＡＲ構築物で形質導入された後、従来のＴ細胞と同様の抗腫瘍殺傷活性を示すかどうかを調査した。
驚くべきことに、ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞は、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ腫細胞又はＴＣＲ－Ｖｂ特異的Ｔ白血病クローンの特異的殺滅を示しただけでなく、インビトロ及びインビボでの誘導剤による処理時に排除された。更に、本発明者らは、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞がインビトロ及びインビボで従来のＴ細胞と同程度に効率的に腫瘍成長を阻害することができることを初めて示した。この研究は、Ｔ細胞リンパ腫の治療のための新規な戦略を提供する。
したがって、広範囲の感染性疾患及び非感染性疾患への関与、並びに主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ様タンパク質ＭＲ１によって提示される微生物リボフラビン誘導体抗原に対する異常な特異性で知られている免疫細胞の一種である本発明の粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞は、Ｔリンパ腫を特異的に認識し、攻撃することを可能にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する遺伝子改変ＭＡＩＴ細胞によって癌患者を治療するための新規な形態の免疫療法に開発される。
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｆ．，Ｒａｄｆｏｒｄ，Ｊ．，Ｒｅｌａｎｄｅｒ，Ｔ．，Ｊｅｒｋｅｍａｎ，Ｍ．，Ｔｉｌｌｙ，Ｈ．，Ｏｓｔｅｒｂｏｒｇ，Ａ．，Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ，Ｆ．，Ｇｒａｍａｔｚｋｉ，Ｍ．，Ｄｒｅｙｌｉｎｇ，Ｍ．，Ｂａｎｇ，Ｂ．，＆Ｈａｇｂｅｒｇ，Ｈ．（２０１０）．Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕＭａｘ－ＣＤ４）ｉｎ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｎｏｎ－ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１５０（５），５６５－５７３．ｈｔｔｐｓ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／ｆｕｌｌ／１０．１１１１／ｊ．１３６５－２１４１．２０１０．０８２９８．ｘ
Ｈａｇｂｅｒｇ，Ｈ．，Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｂｊｅｒｎｅｒ，Ｔ．，＆Ｅｎｂｌａｄ，Ｇ．（２００５）．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｄａｌ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ（Ａｎｇｉｏｉｍｍｕｎｏｂｌａｓｔｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）ｗｉｔｈ ａ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ＣＤ４ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨｕＭａｘ－ＣＤ４）．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｎｏｒｔｈｗｏｏｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ），２２（２），１９１－１９４．ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／１０．１３８５／ＭＯ：２２：２：１９１
Ｋａｔｓｕｙａ，Ｈ．，Ｉｓｈｉｔｓｕｋａ，Ｋ．，Ｕｔｓｕｎｏｍｉｙａ，Ａ．，Ｈａｎａｄａ，Ｓ．，Ｅｔｏ，Ｔ．，Ｍｏｒｉｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｓａｂｕｒｉ，Ｙ．，Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｍ．，Ｓｕｅｏｋａ，Ｅ．，Ｕｉｋｅ，Ｎ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ｔｓｕｋａｓａｋｉ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｓｈｉｍａ，Ｈ．，Ｏｈｎｏ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｈ．，Ｊｏ，Ｔ．，Ａｍａｎｏ，Ｍ．，Ｈｉｎｏ，Ｒ．，… Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ａ．－Ｐ．Ｉ．（２０１５）．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｍｏｎｇ １５９４ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＴＬ．Ｂｌｏｏｄ，１２６（２４），２５７０－２５７７．ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｈｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ｏｒｇ／ｂｌｏｏｄ／ａｒｔｉｃｌｅ／１２６／２４／２５７０／３４７０１／Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－ａｎｄ－ｓｕｒｖｉｖａｌ－ａｍｏｎｇ－１５９４－ｐａｔｉｅｎｔｓ－ｗｉｔｈ
Ｋｉｍ，Ｙ．Ｈ．，Ｄｕｖｉｃ，Ｍ．，Ｏｂｉｔｚ，Ｅ．，Ｇｎｉａｄｅｃｋｉ，Ｒ．，Ｉｖｅｒｓｅｎ，Ｌ．，Ｏｓｔｅｒｂｏｒｇ，Ａ．，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｓ．，Ｉｌｌｉｄｇｅ，Ｔ．Ｍ．，Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｔ．，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｒ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｋ．，Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｌｉｓｂｙ，Ｓ．，Ｂａａｄｓｇａａｒｄ，Ｏ．，＆Ｋｎｏｘ，Ｓ．Ｊ．（２００７）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕＭａｘ－ＣＤ４）：ｔｗｏ ｐｈａｓｅ ２ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ，１０９（１１），４６５５－４６６２．ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｈｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ｏｒｇ／ｂｌｏｏｄ／ａｒｔｉｃｌｅ／１０９／１１／４６５５／２３０８３／Ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｅｆｆｉｃａｃｙ－ｏｆ－ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ－ＨｕＭａｘＣＤ４－ｔｗｏ
Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｈ．，Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｉ．，Ｇｏｎｅｎ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｓｅｎｅｃｈａｌ，Ｂ．，Ｃｕｒｒａｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｓａｕｔｅｒ，Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｓａｎｔｏｍａｓｓｏ，Ｂ．，Ｍｅａｄ，Ｅ．，Ｒｏｓｈａｌ，Ｍ．，Ｍａｓｌａｋ，Ｐ．，Ｄａｖｉｌａ，Ｍ．，Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｒ．Ｊ．，＆Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．（２０１８）．Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｏｆ ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０５６／ｎｅｊｍｏａ１７０９９１９
Ｒｏｗａｎ，Ａ．Ｇ．，Ｓｕｅｍｏｒｉ，Ｋ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．，Ｙａｓｕｋａｗａ，Ｍ．，Ｔａｎａｋａ，Ｙ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｇ．Ｐ．，＆Ｂａｎｇｈａｍ，Ｃ．Ｒ．Ｍ．（２０１４）．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＴＬＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｌｉｍｉｔｅｄ ｂｙ ｗｅａｋ ＨＢＺ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｂｕｔ ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｘ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ，１１（１），１１２－１１６．ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／１０．１１８６／ｓ１２９７７－０１４－０１１６－６
条項
１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞。
２．ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞が、Ｔ細胞上のＣＤ４抗原を標的とするＣＡＲを発現する、条項１に記載のＭＡＩＴ細胞。
３．ＣＡＲが、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸、又はそのバリアント若しくは断片を含むＣＤ４抗原に特異的である、条項２に記載のＭＡＩＴ細胞。
４．Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域（Ｖβ）、好ましくは表１に示されるＶβ領域のいずれか１つを標的とするＣＡＲを発現する、条項１～３のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞。
５．ＣＡＲがＴ細胞上の複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域（Ｖβ）を標的とし、好ましくは、複数のＶβ領域が表１に示されるＶβ領域の群から選択され、場合により、複数のＴＣＲ Ｖβ領域が同じ又は異なるＶβ領域である、条項４に記載のＭＡＩＴ細胞。
６．ＣＡＲが、以下のＶβ領域：Ｖｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７及びＶｂ ２０からなる群から選択されるＴ細胞上の１つ又は複数のＴＣＲ Ｖβ領域を標的とする、条項４又は条項５に記載のＭＡＩＴ細胞。
７．ＣＡＲが、実質的に配列番号２に示されるアミノ酸、又はそのバリアント若しくは断片を含むＴＣＲ Ｖβ領域に特異的である、条項４～６のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞。
８．ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞が、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞が制御可能に又は誘導可能に排除されることを可能にする１つ又は複数のコード配列を含む、条項１～７のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞。
９．１つ又は複数のコード配列が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）又は切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）をコードする、条項８に記載のＭＡＩＴ細胞。
１０．１つ又は複数のコード配列が誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）をコードする、条項８又は９に記載のＭＡＩＴ細胞。
１１．磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）及び／又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、より好ましくはＭＡＣＳ及びＦＡＣＳの両方によってヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）から単離される、条項１～１０のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞。
１２．抗ＣＤ４キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－β ＣＡＲのいずれかをコードする、第１のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物。
１３．プロモータがＰＧＫプロモータであり、場合により、プロモータが、実質的に配列番号３に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項１２に記載の構築物。
１４．第１のコード配列が抗ＣＤ４キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、場合によりＣＡＲが、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ４抗原、又はそのバリアント若しくは断片に特異的である、条項１２又は１３に記載の構築物。
１５．
（ｉ）第１のコード配列は、実質的に配列番号６に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第１のコード配列が、実質的に配列番号７に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、
（ｉｉｉ）第１のコード配列は、実質的に配列番号８に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び／又は
（ｉｖ）第１のコード配列は、実質的に配列番号９に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、
条項１４に記載の構築物。
１６．第１のコード配列が、抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－β領域ＣＡＲ、場合により表１に列挙されるＶβ領域のいずれかをコードする、条項１２又は１３に記載の構築物。
１７．第１のコード配列が複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域（Ｖβ）ＣＡＲをコードし、好ましくは複数のＶβ領域が表１に示されるＶβ領域の群から選択される、条項１６に記載の構築物。
１８．以下のＶβ領域：Ｖｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７、及びＶｂ ２０からなる群から選択されるＴ細胞上の１つ又は複数のＴＣＲ Ｖβ領域を標的とする少なくとも１つのＣＡＲをコードするコード配列を含み、場合により以下のＶβ領域：Ｖｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７、及びＶｂ ２０からなる群から選択されるＴ細胞上の少なくとも２つ又は３つのＴＣＲ Ｖβ領域を標的とする少なくとも１つのＣＡＲをコードするコード配列を含む、条項１６又は１７に記載の構築物。
１９．ＣＡＲが、実質的に配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含むＴＣＲ Ｖβ領域（好ましくは、ＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖）に特異的である、条項１６～１８のいずれか一項に記載の構築物。
２０．
（ｉ）第１のコード配列は、実質的に配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第１のコード配列が、実質的に配列番号１３に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、
（ｉｉｉ）第１のコード配列は、実質的に配列番号３４に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び／又は
（ｉｖ）第１のコード配列は、実質的に配列番号３５に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、
条項１６～１９のいずれか一項に記載の構築物。
２１．ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通（ＴＭ）構造ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、配列番号１４に実質的に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び／又は配列番号１５に実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項１２～２０のいずれか一項に記載の構築物。
２２．ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及び／又はＣＤ３ζ鎖、より好ましくはＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ鎖を含む、細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、条項１２～２１のいずれか一項に記載の構築物。
２３．
（ｉ）構築物が、実質的に配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）構築物が、実質的に配列番号１７に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、
（ｉｉｉ）構築物が、実質的に配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、
（ｉｖ）構築物が、実質的に配列番号１９に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、
（ｖ）構築物が、実質的に配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、並びに／あるいは
（ｖｉ）構築物が、実質的に配列番号２１に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、
条項２２に記載の構築物。
２４．核酸構築物が、少なくとも１つの自殺タンパク質、より好ましくは少なくとも２つの自殺タンパク質をコードする第２のコード配列を含む、条項１２～２３のいずれか一項に記載の構築物。
２５．第２のコード配列が、（ｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）若しくは切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）、及び／又は（ｉｉ）誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）をコードする、条項２４に記載の構築物。
２６．（ｉ）構築物は、実質的に配列番号２２に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、実質的に配列番号２３に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含み、並びに／あるいは（ｉｉ）構築物は、配列番号２４に実質的に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、構築物は、配列番号２５に実質的に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項２５に記載の構築物。
２７．実質的に配列番号２９に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、実質的に配列番号３０に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項１２から２６のいずれか一項に記載の構築物。
２８．実質的に配列番号３１に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、実質的に配列番号３２に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項１２から２６のいずれか一項に記載の構築物。
２９．場合により、実質的に配列番号３３若しくは３６に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、条項１２～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物をコードする発現ベクター。
３０．ＭＡＩＴ細胞を単離する方法であって、
（ｉ）末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を提供することと、
（ｉｉ）ＰＢＭＣを磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）及び／又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に供して、そこからＭＡＩＴ細胞を単離することと、
を含む、ＭＡＩＴ細胞を単離する方法。
３１．ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を作製する方法であって、
（ｉ）末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を提供することと、
（ｉｉ）ＰＢＭＣをＭＡＣＳ及び／又はＦＡＣＳに供して、そこからＭＡＩＴ細胞を単離することと、
（ｉｉｉ）単離されたＭＡＩＴ細胞を、場合により抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体と接触させることによって、活性化することと、
（ｉｖ）活性化されたＭＡＩＴ細胞を、ＣＡＲをコードする核酸で形質導入し、それにより、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を作製することと、
を含む、ＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を作製する方法。
３２．方法が、ＰＢＭＣをＭＡＣＳ及びＦＡＣＳの両方に供してそこからＭＡＩＴ細胞を単離することを含み、場合によりＰＢＭＣをＭＡＣＳに供し、引き続いてＦＡＣＳに供する、条項３０又は３１に記載の方法。
３３．単離されたＭＡＩＴ細胞が抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で活性化される、条項３０～３２のいずれか一項に記載の方法。
３４．工程（ｉｖ）が、ＣＡＲをコードする核酸でＭＡＩＴ細胞をウイルス的又はレトロウイルス的に形質導入することを含み、好ましくは、核酸が、（ｉ）ＣＤ４抗原、又は（ｉｉ）Ｔ細胞上の少なくとも１つ若しくは複数のＴＣＲ Ｖβ領域、好ましくは表１に示される１つ若しくは複数のＴＣＲ Ｖβ領域、又は以下のＶβ領域：Ｖｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７、及びＶｂ ２０からなる群から選択されるＴ細胞上の１つ若しくは複数のＴＣＲ Ｖβ領域を標的とするＣＡＲをコードする、条項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
３５．ＭＡＩＴ細胞が、請求項１２～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物又は請求項２９に記載の発現ベクターで形質導入される、条項３０～４３のいずれか一項に記載の方法。
３６．方法が、工程（ｉｖ）の後の後続の工程においてＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞を拡大させることを含む、条項３０～３５のいずれか一項に記載の方法。
３７．条項３０～３６のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、又は得ることができるＣＡＲ－ＭＡＩＴ細胞。
３８．条項１～１１又は３７のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
３９．治療に使用するための、条項１～１１若しくは３７のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞、又は条項３８に記載の医薬組成物。
４０．（ｉ）免疫療法における、（ｉｉ）癌を治療、予防若しくは改善するための、（ｉｉ）微生物感染症を治療、予防若しくは改善するための、又は（ｉｖ）自己免疫疾患を治療、予防若しくは改善するための、使用のための、条項１～１１又は３７のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞又は条項３８に記載の医薬組成物。
４１．Ｔ細胞悪性腫瘍、場合により固形腫瘍又は液体腫瘍を治療、予防又は改善する際に使用するための、条項３９又は条項４０のいずれか一項に記載の使用のための、条項１～１１若しくは条項３７のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞、又は３８項に記載の医薬組成物。
４２．Ｔ細胞悪性腫瘍が末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である、条項４１に従って使用するための、条項１～１１又は３７のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞、又は条項３８に記載の医薬組成物。
４３．（ｉ）ＰＴＣＬが、成人Ｔ細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病（ＡＴＬ）；腸疾患関連リンパ腫；肝脾リンパ腫；皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫（ＳＰＴＣＬ）；前駆Ｔ細胞急性リンパ芽球性リンパ腫又は白血病；及び血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）からなる群から選択されるＰＴＣＬサブタイプであり、
（ｉｉ）ＣＴＣＬが、菌状息肉症（ＭＦ）；セザリー症候群（ＳＳ）；及びＣＤ４＋小中多形性Ｔ細胞リンパ増殖性障害からなる群から選択されるＣＴＣＬサブタイプである、
条項４１に記載の使用のための、条項１～１１、又は３７のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞又は条項３８に記載の医薬組成物。
４４．ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＴＬＶ、ＥＢＶ、ＨＰＶ）、細菌（例えばＴＢ）若しくは真菌感染症を治療、予防若しくは改善するため、又は自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチ若しくは重症筋無力症を治療、予防若しくは改善するための、条項４０～４３のいずれか一項に記載の使用のための、条項１～１１若しくは３７のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞、又は条項３８に記載の医薬組成物。
４５．使用が、自殺タンパク質をコードする配列を引き起こすことを含み、場合により方法が、抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はカスパーゼ誘導性薬物（ＣＩＤ）を被験体に投与することを含む、条項４０～４４のいずれか一項に記載の使用のための、条項１～１１若しくは３７のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞、又は条項３８に記載の医薬組成物。
４６．条項３８に記載の医薬組成物を製造するためのプロセスであって、治療有効量の条項１－１１又は条項３７のいずれか一項に記載のＭＡＩＴ細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを組み合わせることを含む、プロセス。

Claims (38)

  1. 抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－βキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸構築物。
  2. 前記プロモータが、構成的プロモータ、活性化可能プロモータ、誘導性プロモータ又は組織特異的プロモータである、請求項１に記載の構築物。
  3. 前記プロモータが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ヒト伸長因子－１α（ｈＥＦｌａ）、ユビキチンＣプロモータ（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモータ（ＰＧＫ）、シミアンウイルス４０初期プロモータ（ＳＶ４０）、又はＣＭＶ初期エンハンサーとカップリングされたニワトリβ－アクチンプロモータ（ＣＡＧＧ）である、請求項１又は請求項２に記載の構築物。
  4. 前記プロモータがＰＧＫプロモータであり、場合により、前記プロモータが、実質的に配列番号３に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の構築物。
  5. 前記第１のコード配列が、抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－β領域ＣＡＲ、場合により表１に列挙されるＶβ領域のいずれかをコードする、請求項１～４のいずれか一項に記載の構築物。
  6. 前記第１のコード配列が、複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖可変領域（Ｖβ）ＣＡＲをコードする、請求項１～５のいずれか一項に記載の構築物。
  7. 前記複数のＶβ領域が、表１に示されるＶβ領域の群から選択される、請求項６に記載の構築物。
  8. 前記構築物が、以下のＶβ領域：Ｖｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７、及びＶｂ ２０からなる群から選択されるＴ細胞上の１つ又は複数のＴＣＲ Ｖβ領域を標的とする少なくとも１つのＣＡＲをコードするコード配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の構築物。
  9. 前記構築物が、以下のＶβ領域：Ｖｂ １、Ｖｂ ２、Ｖｂ ３、Ｖｂ ５．１、Ｖｂ ７．１、Ｖｂ ８、Ｖｂ １２、Ｖｂ １３．１、Ｖｂ １７、及びＶｂ ２０からなる群から選択されるＴ細胞上の少なくとも２つ又は３つのＴＣＲ Ｖβ領域を標的とする少なくとも１つのＣＡＲをコードするコード配列を含む、請求項８に記載の構築物。
  10. 前記ＣＡＲが、実質的に配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくは断片を含むＴＣＲ－Ｖβ７．１鎖に特異的である、請求項１～９のいずれか一項に記載の構築物。
  11. 前記第１のコード配列が、実質的に配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記第１のコード配列が、実質的に配列番号１３に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の構築物。
  12. 前記第１のコード配列が、実質的に配列番号３４に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記第１のコード配列が、実質的に配列番号３５に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の構築物。
  13. ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通（ＴＭ）構造ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の構築物。
  14. 前記構築物が、実質的に配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記構築物が、実質的に配列番号１５に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項１３に記載の構築物。
  15. 前記構築物が、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及び／又はＣＤ３ζ鎖、より好ましくはＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ鎖を含む、細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の構築物。
  16. 前記構築物が、実質的に配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記構築物が、実質的に配列番号１７に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項１５に記載の構築物。
  17. 前記構築物が、実質的に配列番号１８に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記構築物が、実質的に配列番号１９に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項１５又は１６に記載の構築物。
  18. 前記構築物が、実質的に配列番号２０に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記構築物が、実質的に配列番号２１に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の構築物。
  19. 前記核酸構築物が、少なくとも１つの自殺タンパク質、より好ましくは少なくとも２つの自殺タンパク質をコードする第２のコード配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の構築物。
  20. 前記第２のコード配列が、（ｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）若しくは切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）、及び／又は（ｉｉ）誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）をコードする、請求項１９に記載の構築物。
  21. （ｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）又は切断型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）、及び（ｉｉ）誘導性カスパーゼ－９（ｉＣ９）をコードする、請求項１９又は２０に記載の構築物。
  22. （ｉ）前記構築物が、実質的に配列番号２２に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記構築物が、実質的に配列番号２３に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の構築物。
  23. 前記構築物が、実質的に配列番号２４に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含み、及び／又は前記構築物が、実質的に配列番号２５に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の構築物。
  24. 前記構築物が、実質的に配列番号３１に示されるアミノ酸配列、又はその断片若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の構築物。
  25. 前記構築物が、実質的に配列番号３２に示されるヌクレオチド配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の構築物。
  26. 請求項１～２５のいずれか一項に記載の核酸構築物をコードする発現ベクター。
  27. 実質的に配列番号３６に示される核酸配列、又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項２６に記載の発現ベクター。
  28. 請求項１～２５のいずれか一項に記載の構築物、又は請求項２６若しくは２７に記載のベクターを含むＴ細胞であって、場合により抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖ－βキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、Ｔ細胞。
  29. 前記Ｔ細胞が、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞である、請求項２８に記載のＴ細胞。
  30. 請求項２８又は２９に記載のＴ細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
  31. 治療に使用するための、請求項２８若しくは２９に記載のＴ細胞、又は請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. （ｉ）免疫療法における、（ｉｉ）癌を治療、予防若しくは改善するための、（ｉｉ）微生物感染症を治療、予防若しくは改善するための、又は（ｉｖ）自己免疫疾患を治療、予防若しくは改善するための、使用のための、請求項２８若しくは２９に記載のＴ細胞、又は請求項３０に記載の医薬組成物。
  33. Ｔ細胞悪性腫瘍、場合により固形腫瘍又は液体腫瘍を治療、予防又は改善する際に使用するための、請求項３１又は請求項３２に記載の使用のための、請求項２８若しくは２９に記載のＴ細胞、又は請求項３０に記載の医薬組成物。
  34. 前記Ｔ細胞悪性腫瘍が、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である、請求項３３に記載の使用のための、請求項２８若しくは２９に記載のＴ細胞、又は請求項３０に記載の医薬組成物。
  35. （ｉ）前記ＰＴＣＬが、成人Ｔ細胞急性リンパ芽球性リンパ腫若しくは白血病（ＡＴＬ）；腸疾患関連リンパ腫；肝脾リンパ腫；皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫（ＳＰＴＣＬ）；前駆Ｔ細胞急性リンパ芽球性リンパ腫若しくは白血病；及び血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）からなる群から選択されるＰＴＣＬサブタイプであり、並びに／又は
    （ｉｉ）前記ＣＴＣＬが、菌状息肉症（ＭＦ）；セザリー症候群（ＳＳ）；及びＣＤ４＋小中多形性Ｔ細胞リンパ増殖性障害からなる群から選択されるＣＴＣＬサブタイプである、
    請求項３４に記載の使用のための、請求項２８若しくは２９に記載のＴ細胞、又は請求項３０に記載の医薬組成物。
  36. （ｉ）ウイルス感染症、場合によりＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＴＬＶ、ＥＢＶ若しくはＨＰＶ、（ｉｉ）細菌感染症、場合によりＴＢ、又は（ｉｉｉ）真菌感染症を治療、予防又は改善するための、あるいは自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチ又は重症筋無力症を治療、予防又は改善するための、請求項３２に記載の使用のための、請求項２８若しくは２９に記載のＴ細胞、又は請求項３０に記載の医薬組成物。
  37. 前記使用が、自殺タンパク質をコードする配列を引き起こすことを含み、場合により、前記方法が、抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はカスパーゼ誘導性薬物（ＣＩＤ）を前記被験体に投与することを含む、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の使用のための、請求項２８若しくは２９に記載のＴ細胞、又は請求項３０に記載の医薬組成物。
  38. 請求項２５に記載の医薬組成物を製造するためのプロセスであって、治療有効量の請求項２３又は２４に記載のＴ細胞と、薬学的に許容され得る賦形剤とを組み合わせることを含む、プロセス。
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