JP2024515158A - 光音響刺激のための方法及びデバイス - Google Patents
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Abstract
テーパー状ファイバー光音響エミッターは、レーザーパルスを放射するように構成されたナノ秒レーザーと光ファイバーを含む。光ファイバーには、レーザーパルスをガイドするように構成された先端が含まれる。先端は、拡散層及び熱膨張層を含むコーティングを有し、拡散層は、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子を含む。熱膨張層には、レーザーパルスを変換して超音波を発生するように構成されたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）とポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が含まれる。超音波の周波数は、拡散層の厚さと膨張層のＣＮＴ濃度で調整される。
Description
本出願は、２０２１年３月９日に提出された仮出願番号６３／１５８，５６６及び２０２１年４月２０日に出願された仮出願番号６３／１７７，０２９の利益を主張し、その出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、光音響刺激に関し、特に、生物療法のための光音響刺激を操作及び投与するためのデバイス及び方法に関する。
集束超音波は、低侵襲治療及びメカニズムの研究において大きな注目を集めている。高効率の生体変調には１ＭＨｚ未満の周波数が適している。しかし、典型的なサブＭＨｚ超音波技術は、空間閉じ込めが数ミリメートルと不十分で、デバイス直径が約２５ｍｍと大きいため、回折限界が生じ、さらなる応用が著しく妨げられる。低周波フレックス張力共振器、トンピルツトランスデューサー、厚み型共振器など、小型の低周波トランスデューサーを製造する努力がなされてきた。
しかし、ミリメートルスケールの横方向寸法を持つこれらのトランスデューサーの製造は困難であり、高価であると考えられている。デバイスサイズが大きいことに加えて、トランスデューサーベースの集束超音波技術は、数百ｋＨｚの超音波に対してミリメートルスケールでの回折限界焦点体積が大きいという問題がある。
一態様によれば、テーパー状ファイバー光音響エミッターが提供される。エミッターには、レーザーパルスを放射するように構成されたナノ秒レーザーと光ファイバーが含まれる。光ファイバーには、光を超音波に変換するように構成されたコーティングが施された先端が含まれる。先端コーティングは、拡散層と熱膨張層、又は単一の熱膨張層を含むことができる。拡散層には、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子が含まれる。熱膨張層には、レーザーパルスを変換して超音波を発生するように構成されたグラファイトとポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、又はカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びＰＤＭＳが含まれる。超音波の周波数は、拡散層の厚さと膨張層のＣＮＴ濃度で調整される。
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成されている。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であってもよい。
別の態様によれば、テーパー状ファイバー光音響エミッタ（ＴＦＯＥ）を動作させる方法は、ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射するステップと、先端を有する光ファイバーでレーザーパルスをガイドするステップとを含む。先端は、エポキシと酸化亜鉛を含む拡散層と熱膨張層、又はカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）とポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む単一の熱膨張層でコーティングされる。この方法はさらに、拡散層を使用して、局所的な加熱を制限しながらレーザーパルスを拡散すること；熱膨張層を用いて拡散光を変換して超音波を生成すること；及び超音波の周波数を、拡散層の厚さと膨張層のＣＮＴ濃度で調整する。
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得る。
別の態様によれば、光音響材料を介して細胞を刺激する方法が提供される。この方法は、超音波を発生するように構成された光吸収体及び拡張マトリックスを有する光音響材料を提供すること；光音響材料をフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成すること、ここで、フィブロインヒドロゲルは、超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される；及びフィブロインが超音波に応答して神経成長を刺激するように、光音響フィルムにレーザーパルスを放射することによって超音波を発生させることを含む。
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
いくつかの例示的な実施形態では、方法は、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を変更することを含む、超音波の周波数を生成することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、フィブロインヒドロゲルはシルクを含み得る。
別の態様によれば、細胞を刺激するためにテーパー状ファイバー光音響エミッタ（ＴＦＯＥ）を動作させる方法が提供される。この方法は、ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射すること、及び先端を有する光ファイバーでレーザーパルスをガイドすることを含む。次に、この方法は、ＣＮＴをフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成するステップを含み、フィブロインヒドロゲルは超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される。
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を変更することを含む、拡散光を変換して超音波を発生することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、エポキシ及び酸化亜鉛を含む拡散層でコーティングされた先端をさらに備える。拡散層は、局所的な加熱を制限しながらレーザーパルスを拡散する。
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む熱膨張層でコーティングされた先端をさらに含む。熱膨張層は拡散光を変換して超音波を発生し、フィブロインが超音波に応答して細胞内の神経成長を刺激する。いくつかの例示的な実施形態では、フィブロインヒドロゲルにはシルクが含まれる。
別の態様によれば、光音響効果を介した高精度細胞的変調のためのデバイスが提供される。いくつかの例示的な実施形態では、このデバイスは、テーパー状のファイバー光音響エミッターを含む。このデバイスには、レーザーパルスを放射するように構成できるナノ秒レーザーと、先端を備えた光ファイバーが含まれる。光ファイバーは、レーザーパルスをガイドするように構成でき、熱膨張層を含むコーティングを有することができる。熱膨張層は、レーザーパルスを変換して超音波を生成するように構成されたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含み得る。ＣＮＴをフィブロインヒドロゲルに埋め込むと、光音響フィルムを形成できる。フィブロインヒドロゲルはさらに、超音波に応答して神経成長を刺激するように構成することができる。超音波の周波数は、膨張層のＣＮＴ濃度の厚さに応じて調整できる。
いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスは、拡散層を含む先端部をさらに含む。拡散層は、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子を含むことができる。超音波の周波数は拡散層の厚さで調整できる。
いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスの光音響フィルムは平坦であり得る。いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスの光音響フィルムは湾曲していてもよい。いくつかの例示的な実施形態によれば、湾曲した光音響フィルムは、非侵襲的変調のための集束超音波を生成する。
本開示は、本開示の実施形態の非限定的な例として、言及された複数の図面を参照しながら、以下の詳細な説明でさらに説明される。いくつかの図面を通して、同様の参照番号は同様の部分を表す。
本開示のデバイス及び方法によれば、サブＭＨｚの周波数範囲を標的とする制御可能な周波数スペクトルを有する光音響エミッターが提供される。
新しい技術として、経頭蓋集束超音波は、マウス、ウサギの運動反応、及びヒトの感覚／運動反応をうまく誘発することが実証されている。しかし、超音波の空間分解能では高精度の刺激は可能ではない。本開示は、２０μｍという前例のない空間分解能を有するニューロンの光音響刺激のためのＴＦＯＥを提示し、単一ニューロン又は軸索及び樹状突起などの細胞内構造の選択的活性化を可能にする。３ナノ秒の単一レーザーパルスからＴＦＯＥによって変換された１マイクロ秒の単一音響パルスが、これまで成功したニューロン活性化のための最短の音響刺激として示されている。ＴＦＯＥによって生成される高度に局所的な超音波により、光音響刺激と単一ニューロンでの非常に安定したパッチクランプ記録を統合することが可能になった。従来の超音波刺激では困難であった、音響刺激に対する単一ニューロンの電気的応答の直接測定が初めて実証された。ＴＦＯＥをエクスビボ脳スライス電気生理学と組み合わせることで、本開示は、音響刺激に対する興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンの細胞型特異的応答を明らかにする。これらの結果は、ＴＦＯＥが非遺伝的単一細胞及び細胞内変調技術であることを示しており、神経刺激のメカニズムに新たな洞察をもたらす可能性がある。
高い空間分解能での神経調節は、少数の集団又は単一のニューロンの発動によって動物の行動や脳の状態が特異的に変化する可能性があるため、神経科学の分野における基礎知識を進歩させる上で非常に重要である。臨床的には、正確な神経刺激は、網膜刺激や選択的背側根茎切除術などの処置の基礎を築き、ここでは、小さな集団又は単一のニューロン及び軸索線維の選択的な活性化が望まれる。歴史的に、電気刺激は神経調節にとって最も重要な技術であった。脳深部刺激は、臨床的に最も処方されている神経調節法として、パーキンソン病、うつ病、てんかんなどの神経疾患及び精神疾患の治療に使用されている。ただし、電気刺激の空間分解能は電流の広がりによって制限され、電流は数ミリメートルにわたって標的領域の外側に分布する可能性がある。高い空間精度と細胞特異性を提供する光遺伝学は、げっ歯類の集団神経活動を調節する強力な方法であることが示されている。しかし、ウイルス感染が必要なため、ヒトに適用するのは困難である。非遺伝的刺激としては、水の光吸収に基づく光熱神経刺激が報告されており、基礎科学や並進用途の関心が高まっている。赤外光熱神経刺激（ＩＮＳ）では、波長１．５～２μｍの近赤外光がファイバーを通じて送られ、サブミリメートルの精度で水の温度上昇に変換される。この場合、関連する加熱により組織損傷の重大な懸念が生じる。急速に成長しているモダリティである集束超音波は、浸透深さが深く非侵襲性であるため、無数の脳神経調節用途に利用されている。しかし、超音波は音響波回折によって焦点が制限されるため、空間分解能が数ミリメートルレベルに限られており、特定の脳領域の研究が妨げられる。さらに、超音波場はギガオームシールを容易に破壊するため、超音波刺激を全細胞パッチクランプ電気生理学（神経膜とイオンチャネルの生物物理学的機構の高忠実度分析のゴールドスタンダード技術）と統合することは困難である。
本開示のファイバーベースの光音響コンバーターは、光音響効果を利用し、パルス光を吸収して超音波を生成し、ミリメートル未満の空間分解能でインビトロ及びインビボで神経刺激を達成する。小型化されたテーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）は、約２０μｍの空間閉じ込めで＞５７ｋＰａの圧力を生成することができ、超音波刺激に対して前例のない高い空間分解能を提供する。空間分解能と光音響変換効率の両方におけるＴＦＯＥの大幅な進歩は、以下の革新的な設計に基づいて達成される。第一に、以前の研究のように直径２００μｍの市販のマルチモードファイバを使用する代わりに、本開示は、開発された制御されたテーパリング対策を提供し、ファイバーを２０μｍ程度の小さい先端直径まで再現可能にテーパー付けする。第二に、２０μｍの小さなファイバー先端上に約１０μｍの均一で制御可能なコーティング厚さを実現する新しい蒸着方法が開発された。第三に、コンバーターとしてエポキシ中のグラファイト粉末を使用する代わりに、本開示の方法及びデバイスは、溶解度が改善されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マトリックスに埋め込まれたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を適用する。これにより、変換効率が１桁向上し、テーパー状のファイバー先端からの高効率な光音響信号の生成が可能になり、２０μｍの薄いコーティングからの光漏れが防止される。
本開示の実施形態によれば、ＴＦＯＥを使用することにより、ニューロン刺激の空間的及び時間的解像度が向上する。具体的には、単一細胞の刺激と、軸索及び樹状突起の細胞内刺激が実証されている。持続時間１マイクロ秒の単一音響パルスによりニューロン刺激が達成され、これは音響刺激の持続時間が最も短いことが判明した。重要なのは、ＴＦＯＥによって生成された近接場音響波により、従来の超音波の課題として報告されていた全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞反応を同時に監視しながら、光音響刺激が可能になったことである。本開示は、興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンに対する音響刺激に対する細胞型特異的応答を明らかにする。この開示は、神経系の非遺伝的高精度刺激のためのプラットフォーム技術として、また音響神経刺激のメカニズムの研究及びＭＲＩと互換性のある臨床応用のためのツールとしてのＴＦＯＥの刺激的な可能性を示している。
紹介したように、パルス励起光が対象物質に吸収され、一時的な加熱、物質の圧縮と膨張、その後の圧力変化を引き起こす光音響刺激は、超音波を発生させる新規な方法である。特に、光拡散層と熱膨張層という２つの異なる機能層でファイバー先端を設計及びコーティングすることにより、十分な超音波強度の供給と、セル変調に必要なピーク周波数と帯域幅の制御が可能になる。拡散層と吸収／熱膨張層の両方の周波数制御能力を統合することによって、本開示は、サブＭＨｚ範囲内の周波数及び１ＭＨｚを超える周波数の微調整を達成する。
このように、ＴＦＯＥは調整可能な周波数（例えば、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚ）でサブミリメートルの高さの特別な精度の超音波を送信し、ソノポレーション効果によって膜不透過性の小分子を生細胞にデリバリーする。１ＭＨｚを超える周波数と比較して、サブＭＨｚの周波数下で実行されるＳｙｔｏｘのより高いデリバリー効率により、本開示は、サブＭＨｚの周波数とサブミリメートルの精度との間でうまく妥協して、広範な生物医学用途（領域特異的な薬物デリバリー、遺伝子トランスフェクション、局所的なニューロン刺激など）を提供する。
図１Ａには、パルスレーザー１１０及び光音響信号１１２を含む光音響効果の概略図が示されている。ファイバー１１４、拡散層１１６、及び吸収／膨張層１１８を有するＦＯＥ１００ａ（２層コーティングを有するＦＯＥ）の設計及び構造も、この例示的な実施形態に示されている。参考として、図１Ｂは、ファイバーベースのエミッターと、レーザー伝送用の光ファイバー（２０Ｇ、ＩＤ０．６ｍｍ、ＯＤ０．９１ｍｍ）を使用する注射針（１３０）との間の寸法比較を提供する。ＦＯＥ１００ａ、１００ｂ、１００ｃなどは、図１Ａ、１Ｂ、１ＣなどのＦＯＥ１００を指すことに留意されたい。さらに、図１Ｃは、内側拡散層１１６及び外側吸収／膨張層１１８を視覚化するために画像の透明度が調整されたときの、製造されたＦＯＥ１００の側面図を示し、ファイバー遠位端の輪郭を描く白い破線が示されている。拡散層１１６は、層内の熱的に誘起される歪みの違いによる膨張層の局所的な加熱とその後の損傷を防ぐために導入された。図１Ｇは、パルスレーザー１１０による単一ニューロン刺激を可能にするＦＯＥ１００の追加の概略図１７０を示す。
本開示の別の態様によれば、テーパー状ＦＯＥ（ＴＦＯＥ）１００が例示的な実施形態として導入される。図１Ｄでは、単一セル変調に向けて、１層のコーティングのみを有するＴＦＯＥ１００が示されている。ＴＦＯＥ１００は、小型化された低周波超音波源として２０μｍの先端直径を備えている。本開示は、２０μｍの小さなファイバー先端に伴う課題を克服するために、いくつかの革新的な措置を講じた。光ファイバーのテーパー付けを再現可能に制御するために、マルチモードファイバ１１４は、熱テーパー付け技術によって２２５μｍの全直径から２０μｍまで徐々に引張られた。光エネルギーを最大効率で音響波に変換するために、本開示は吸収／熱膨張層１１８（光吸収の強い多層カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を熱膨張係数の高いＰＤＭＳに埋め込んで構成される）を最適化することができる。テーパー状ファイバーの光音響変換効率を高め、光漏れを最小限に抑えるために、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を導入してヒドロキシル基を持つＩＰＡコーティングされたＣＮＴを形成することにより、光音響ＣＮＴ／ＰＤＭＳコーティングを１５％という高いＣＮＴ濃度で調製できる。高濃度のＣＮＴとＩＰＡによって引き起こされるＰＤＭＳの粘度低下を克服し、テーパー端の２０μｍの断面で均一で制御されたコーティング厚さを達成するには、パンチスルー法を導入できる。コーティングの厚さは、ＩＰＡを蒸発させてマトリックスの粘度を変えることで制御できる。テーパー状ファイバー光音響エミッターは、再び図１Ｄに示されるように、厚さ９．５μｍ及び全体直径１９．８μｍのＣＮＴ／ＰＤＭＳコーティングを有し、単一細胞ターゲティングの必要性を満たしていることが顕微鏡画像によってさらに確認され得る。
本開示の実施形態によれば、次に、１０３０ｎｍナノ秒パルスレーザーがＴＦＯＥ１００にデリバリーされて、光音響信号１１２を生成することができる。図１Ｅは、グラフ線１５０によって与えられる音響波形の平均トレースを示す。近接場の超音波圧力は、針ハイドロフォンによって測定されて５６．７ｋＰａであった。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）後の音響波形の無線周波数スペクトルは、図１Ｆのグラフ線１６０で与えられるように、１．０ＭＨｚにピーク周波数を有する０～１０ＭＨｚの広帯域音響周波数を示す。これは、経頭蓋インビボ神経調節及び他の生物医学的応用で最も頻繁に使用される範囲内にある。あるいは、ＴＦＯＥ１００の適用下でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に分散された蛍光ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズ（直径９μｍ）の動きを使用して、音場の分布を視覚化することもできる。５０ミリ秒のレーザーバースト持続時間、１．７ｋＨｚの繰り返し率で７．８ｍＷのレーザー出力の下で、ＴＦＯＥ１００先端（１μｍ未満）に近い２つのビーズは５μｍの変位を示した。一方、ＴＦＯＥ先端から約２０μｍ離れた他のビーズはＴＦＯＥ処理時に静止したままであり、ＴＦＯＥによって生成された音場が２０μｍの距離内に局在していることを示している。
本開示の実施形態によれば、音響生成中に水中でＴＦＯＥによって生成される熱プロファイルを特徴付けるために、ファイバー先端の温度は、ＴＦＯＥ１００先端表面に直接接触する小型超高速熱センサー（ＤＩ－２４５、ＤａｔａＱ、オハイオ州、米国）によって測定された。図１Ｈでは、ニューロン刺激を成功させるために２つの例示的な試験条件を使用することができる：第１．グラフ線１８０での５０ミリ秒のレーザーパルス列、７．８ｍＷのレーザー出力、及び１．７ｋＨｚの繰り返し率；第２．グラフ線１９０での１ミリ秒のレーザーパルス列、１１．４ｍＷのレーザー出力、及び１．７ｋＨｚの繰り返し率である。このように、第１条件では先端表面温度は０．０９３±０．００４℃しか上昇せず、第２条件では上昇は検出されなかった。この温度上昇は、熱誘発ニューロン変調の閾値（ΔＴ≧５℃）をはるかに下回る。まとめると、これらの結果は、製造された先端直径２０μｍのＴＦＯＥ１００が点超音波源として機能し、先端から約２０μｍに高度に局所化された超音波場を生成することを示している。この前例のない空間的閉じ込めにより、熱損傷や望ましくない機械的破壊を最小限に抑えながら、単一ニューロンレベルでの高精度の刺激が可能になると考えられる。
本開示の別の態様によれば、ＴＦＯＥ１００のこの拡散層１１６は、ポリマー（エポキシ）と直径１００ｎｍの酸化亜鉛（ＺｎＯ）ナノ粒子の混合物を含み、これは、近赤外領域での高い光透過性と高い屈折率により、高エネルギーレーザーパルスをコーシー分布に拡散する。ＺｎＯナノ粒子の直径（つまり１００ｎｍ）は、使用されるレーザー波長（１０３０ｎｍ）よりもはるかに小さいため、全方向へのローリー散乱が可能になる。次に、光エネルギーを音響波に変換するために、吸収／熱膨張層１１８を第２のコーティングとして引き続き追加することができる。これは、吸収体として光吸収係数の高いナノ粒子（多層カーボンナノチューブ、ＭＷＣＮＴ）と、光音響変換効率を最大化するための膨張と圧縮を目的とした熱膨張係数の高いポリマー（ＰＤＭＳ）で構成されている。
本開示によれば、ＴＦＯＥ１００のファイバー遠位端にあるこれらの特別に設計されたナノポリマー複合層１１６及び１１８は、パルスレーザー励起時に、光音響効果を通じてＴＦＯＥ１００のファイバー先端から音響波を効果的に生成し、トランスデューサーを介して検出される。さらに、光音響理論によれば、調整可能な音圧を実現するには、圧力は入射レーザーフルエンスに比例する。したがって、レーザーフルエンスが変化したときのＴＦＯＥの振幅と周波数スペクトルも特徴付けられ、さまざまな用途に対する圧力の柔軟性が示される。
ＴＦＯＥ１００の超音波周波数の制御性を実現するために、１１６及び１１８を含む２層コーティングを、典型的なトランスデューサーの構造を模倣するように設計できることに留意されたい。トランスデューサー（図示せず）は３つの層で構成される：活性層と背面コネクタの間の特定の音響インピーダンスを整合させるためのバッキング層；活性層（電圧を印加すると超音波を発生する圧電材料）：及び媒体と活性層の間の特定の音響インピーダンスを整合させるための整合層（ＰＤＭＳの比音響インピーダンス（１．１～１．５Ｐａ・ｓ／ｍ３）は水（１．４８Ｐａ・ｓ／ｍ３）に近いため、ＴＦＯＥ１００では３番目の整合層を省略できる）。トランスデューサーでは、周波数は２つの要素によって決まる。まず、周波数と帯域幅はバッキング層の減衰効果によって制御される。第二に、周波数は活性層の厚さに反比例する。このようにして、ＴＦＯＥ１００における第１の層１１６の音響減衰及び第２の層１１８の光吸収厚さを変更することによって、周波数を正確に制御することができる。
本開示の実施形態によれば、超音波周波数は、拡散層１１６の修正を介して制御することができる。例えば、周波数の制御には、トランスデューサーのバッキング層に対応するＦＯＥ１００の拡散層１１６の修正が含まれる可能性がある。拡散層１１６内のエポキシ（比音響インピーダンス：２．５～３．５Ｐａ・ｓ／ｍ3）は、ファイバー１１４（シリカ、比音響インピーダンス：１３．１Ｐａ・ｓ／ｍ3）と活性層１１８（ＰＤＭＳ、比音響インピーダンス：１．１～１．５Ｐａ・ｓ／ｍ3）との間の比音響インピーダンスに適合するバッキング層マトリックスとして機能する。典型的な変換器におけるバッキング層の減衰効果は生成される周波数に影響を及ぼし、バッキング層として機能する拡散層１１６の厚さの変化がＴＦＯＥ１００の出力周波数を制御することが期待できる。例示的な例を続けると、ＺｎＯ／エポキシ拡散層１１６の厚さを有する製造されたＦＯＥ１００は、それぞれ３６、４２、５３、６２、７９、１００μｍからなり、厚さが１０９±２４μｍであるＣＮＴ／ＰＤＭＳの吸収／熱膨張層１１８を備えることができる。熱膨張層１１８の厚さの変化は、それらがすべて光の侵入深さを超えているため、超音波周波数を変化させないことに留意されたい。
図２Ａ～２Ｄは、拡散層１１６を修正することによる超音波周波数の制御に関するグラフを提供する。図２Ａでは、３６～１００μｍの拡散層１１６（ＺｎＯ／エポキシ）及び１０９±２４μｍの吸収／熱膨張層１１８（ＣＮＴ／ＰＤＭＳ）で製造されたＦＯＥ１００からの時間領域の超音波信号は、それぞれ時間、厚さ、及び振幅の関数として、グラフ線２１０（１００μｍ）、２１１（７９μｍ）、２１２（６２μｍ）、２１３（５３μｍ）、２１４（４２μｍ）、及び２１５（３６μｍ）で示される。図２Ｂは、超音波の０～１．０ＭＨｚ内の周波数領域を示す。ピーク周波数は、拡散層１１６の厚さを３６μｍから１００μｍまで変化させることによって０．３８４から０．０８３ＭＨｚの範囲で制御されることがグラフ２２０に示されており、拡散層１１６の厚さを増加させる間に周波数が大幅に減少することを示唆している。
続いて図２Ｃを参照すると、拡散層１１６の厚さによるグラフ２３０のピーク超音波周波数のグラフが示されており、ピーク超音波周波数は拡散層の厚さの変化によって調整可能である。線２１０（１００μｍ）、２１１（７９μｍ）、２１２（６２μｍ）、２１３（５３μｍ）、２１４（４２μｍ）、及び２１５（３６μｍ）での０～１０ＭＨｚの周波数範囲を調べると、周波数の分布はサブＭＨｚ領域でクラスタリングを示した。さらに、周波数と拡散層１１６の厚さとの線形関係は、図２Ｄのグラフ２４０においてｙ＝０．５１０８６－０．００４３１ｘの関数でＲ２が０．９３９９２であることを示している。拡散層１１６を変化させることによる周波数の制御は、光音響スペクトルのピーク周波数が拡散層１１６の質量によって変調され得るという事実によってさらに合理化され得る。光音響効果は、一般化されたフックの法則とニュートンの第２法則から推定される運動方程式の導関数である熱膨張方程式によって説明できる。光音響変換プロセス中、ＴＦＯＥ１００先端は調和振動子とみなすことができ、振動運動は熱膨張効果によって与えられる初期力から生じる。フックの法則では、振動の振幅は一定のままで、その周波数は振幅とは無関係であるが、振動子の質量と剛性によって決まる。この点に関して、エポキシ／ＺｎＯ拡散層１１６を修正することによって、０．０８３～０．３８４ＭＨｚの周波数範囲が達成される。
さらに、一般的なトランスデューサーの場合、帯域幅は、スペクトル強度が最大値（ｆupper－Ｆlower）の５０％に減衰する周波数の差と中心周波数ｆcentralの間の比によって定義される。
０．０８３～０．３８４ＭＨｚの中心周波数を有するＦＯＥ１００の帯域幅は式１から得られ、平均帯域幅は６７．８±６．８％であった。これらの結果は、ＦＯＥ１００によって生成される超音波帯域幅が、対応する周波数の市販のトランスデューサーによって生成される帯域幅（例えば、５ＭＨｚ、Ｖ３２６、Ｏｌｙｍｐｕｓの場合は６７．０９％；１０ＭＨｚ、ＸＭＳ３１０、Ｏｌｙｍｐｕｓの場合は５６．００％）に匹敵することを示している。特に、市販のトランスデューサーでは、バッキング層の厚さを変更して中心周波数を変化させても帯域幅が大きく変化しないことが判明しており、これは、わずかな周波数依存性を示すＦＯＥ１００の帯域幅と一致している。
本開示の実施形態によれば、超音波周波数は、膨張層内のＣＮＴ濃度を変更することによって調整又は制御することもできる。周波数を操作するための本開示の例示的な実施形態は、活性層（すなわち、吸収／熱膨張層１１８）の有効厚さを変更することを含む。光音響生成理論によれば、光音響の波形は光音響源の光吸収プロファイル、τ＋１／ｃα（τはレーザーのパルス幅、αは吸収体の光吸収係数）にも依存する。吸収体の有効厚さは、光の侵入深さによって決まる。このように、光音響信号波形は実効的な吸収体の厚さによって結果的に変化し、吸収体の厚さは光の侵入深さよりも小さいため、周波数は吸収体の厚さによって決定される。吸収体の厚さが光の侵入深さよりも大きい場合、周波数は一定のままであり、余分な厚さは音響の減衰のみを引き起こす。
図３Ａ～３Ｂは、周波数に対する膨張層の物理的厚さの影響の特徴を示す。本開示のこの態様によれば、２つのグループのＴＦＯＥ１００が、それぞれ３６μｍ及び１００μｍのＺｎＯ／エポキシ拡散層１１６を用いて製造された。図３Ａは、１００μｍ（グラフ線３１１）、１２０μｍ（グラフ線３１２）、１４０μｍ（グラフ線３１３）、及び１６０μｍ（グラフ線３１４）の膨張層のグラフ３１０である。図３Ｂは、１００μｍ（グラフ線３１１）、１２０μｍ（グラフ線３１２）、１５０μｍ（グラフ線３１５）、及び２１０μｍ（グラフ線３１６）の膨張層のグラフ３２０である。各グループについて、ＴＦＯＥからの超音波の時間領域を示す図３の色の凡例で示されるように、１００μｍから２１０μｍまで変化するＣＮＴ／ＰＤＭＳ膨張層を用いて４つのＴＦＯＥを作製した。波形は時間に対して同様の関数のままであったが、膨張層の厚さが増加するにつれて振幅は低下した。結果として、吸収体層１１８の厚さが光の侵入深さを超える場合、周波数は試験範囲内の膨張層の追加の物理的厚さの変化に敏感ではないが、一方、振幅の変化は、熱膨張層の余分な厚さによる音響減衰に起因する可能性がある。
追加の物理的厚さ（光の侵入深さを超えた）は周波数の制御因子ではないが、有効吸収体の厚さを変えることによって周波数を変えることができると考えられることに留意されたい。これは、吸収剤濃度を変更することで膨張層の空間吸収プロファイルを変更することで実現できる。有効厚さは主に物理的厚さではなく光吸収プロファイルによって決定されるため、このようにして、物理的厚さ及び幾何学的構造の変動の影響が最小限に抑えられ、ＴＦＯＥ１００製造の堅牢性が向上する。
超音波周波数を微調整するために吸収剤の濃度をどのように変更できるかを検証するために、拡散層１１６を使用せずに、ＦＯＥ１００をＣＮＴ／ＰＤＭＳ膨張層のみでコーティングした。異なる濃度のＣＮＴ（２．５％、５．０％、７．５％、１０．０重量％）を混合物に使用した。コーティング全体の厚さは同じ範囲に保たれた。図４Ａは、有効吸収／膨張層１１８の厚さの関数としての光音響信号周波数の図を提供する。グラフ４１０のグラフ線４１１、４１２、４１３、及び４１４は、それぞれ２．５、５．０、７．５、及び１０．０％の濃度における吸収／膨張層１１８の厚さを示す。図４Ｂは、ＣＮＴ／ＰＤＭＳ濃度の関数としてプロットされたピーク周波数を示し、４Ｂの各データ点は各濃度の２つの同一のＦＯＥの平均値であり、エラーバーは標準偏差である。したがって、本開示は、ＣＮＴ濃度に依存する周波数変化により、光音響の制御可能なピーク周波数が、グラフ４２０を介して吸収／膨張層１１８の光吸収プロファイルを変更することによっても達成できることを可能にすることを提示する。
本開示によって本明細書に記載される例示的な実施形態によれば、振幅及び周波数スペクトルに関して音響波の角度分布をさらに特徴付けることができる。そうするために、ＦＯＥ１００は、拡散層１１６（ＺｎＯ／エポキシ、厚さ４０μｍ）及び膨張層１１８（ＣＮＴ／ＰＤＭＳ、厚さ１２０μｍ）から構成され得る。ＦＯＥ１００からの音響放射は、１２７ｍＪ／ｃｍ２の一定の光入力でオシロスコープの出力電圧を測定することによって決定することができる。ファイバー軸に対するトランスデューサー検出器の角度は、制御可能な３６０°回転ステージ（米国ニュージャージー州のＴｈｏｒｌａｂｓ社など）によって±１°の精度で変更できる。光音響信号は、図５Ａのグラフ５１０に示すように、それぞれ０°、±２５°、±５０°、及び±７５°の角度で取得することができる。このように、図５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ５２０及び５３０で測定された音響振幅を示す。図５Ｃのピークツーピーク光音響振幅は、それぞれ５．２（０°で）から１．６（±７５°で）に減少することが分かる。これは、角度が大きくなるほど音響振幅が小さくなり、正面方向の振幅が最大になることを示している。ＰＡの振幅異方性は、光強度の異方性から生じると予想される。具体的には、ＺｎＯ／エポキシ（１５重量％）の一層による光強度の角度分布を事前に測定し、制御可能な３６０°回転ステージに取り付けられたフォトダイオードを使用して光強度の角度分布を測定した。５０°での光強度は、０°での光強度の約４１％であった。図５Ｃでは、５０°での音響振幅は０°での振幅の３７％であった（１．９Ｖ対５．２Ｖ）。これにより、音響振幅分布は光強度分布データと一致する。図５Ｄは、５４０で、角度を０度から±７５度まで変化させたとき、ピーク周波数が比較的一定（０．７～０．８ＭＨｚ）であり得ることを示している。これは、拡散層１１６の効果にもかかわらず、レーザーパルスエネルギーの大部分がレーザーの順方向に沿ってデリバリーされ、横方向に伝播する光がほとんどなく、横方向の光音響誘発振動が無視できるためである。拡散層１１６による分散、球状コーティングの曲率半径、ＰＤＭＳと水との間の密度及び音速の不一致を含む他の要因も、振幅異方性に寄与する可能性がある。
本開示の別の態様によれば、ＦＯＥ１００媒介分子デリバリーは周波数依存性であり、０．２ｍｍ2の空間閉じ込めを示す。例示的な実施形態によれば、様々な周波数のＦＯＥ１００によって媒介されるソノポレーション中の細胞膜不透過性蛍光分子の細胞取り込みは、サブＭＨｚ超音波の優れた性能を実証することができるとともに、ＦＯＥの空間的閉じ込めを解明することができる。ソノポレーションプロセスを視覚化するために、損傷した原形質膜を通ってのみ細胞に浸透し、核酸に結合すると蛍光増強を示す高親和性インターカレート核酸染色ＳＹＴＯＸグリーンを選択できる。したがって、２００ミリ秒の持続時間の超音波バーストは、図６Ａの概略図６１０に見られるように、１．７ｋＨｚのパルス繰り返し率で３９ｍＪ／ｃｍ２のパルスレーザーを使用して生成することができ、これはバースト当たり約３４０の音響パルスに相当する。光音響治療は、合計１０分間、バースト繰り返し率０．５Ｈｚで実行できる。ＦＯＥは、培地中の細胞の上約１００μｍに配置できる。
まず、熱誘起細胞膜透過性を除外するために、ＦＯＥ処理中のファイバー先端の温度上昇は、ファイバー先端に接触して配置された小型超高速熱プローブ（直径１００μｍ）を使用して測定できる。図６Ｂのグラフ線６２０に示すように、温度上昇は合計１０分間で０．６℃であることが分かると想定される。このような小さな温度上昇では、熱による膜の脱分極は無視できる。したがって、Ｓｙｔｏｘの取り込み結果は、ＴＦＯＥからの光音響波によって誘発された機械的破壊に起因すると考えられる。
Ｓｙｔｏｘ取り込み効率の超音波周波数依存性を研究するには、ピーク周波数８．０、５．１、１．４、及び０．３ＭＨｚのＴＦＯＥを利用できる（８．０ＭＨｚ：１５％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；５．１ＭＨｚ：１０％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；１．４ＭＨｚ：５％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；０．３ＭＨｚ：１５％ＺｎＯ／エポキシ＋１０％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ）。様々な周波数を有する超音波が、図６Ｃの時間領域６３０に示されている。同一のエネルギー入力を確保するには、レーザーフルエンスを一定に保つ必要がある。したがって、８．０ＭＨｚ信号は最大振幅（２．６５０Ｖ）を示す一方、０．３ＭＨｚ信号は最小振幅（０．０８７Ｖ）を示すはずであるが、これはトランスデューサー感度の不均一性に部分的に起因する可能性がある。図６Ｅは、ＴＦＯＥ処理前の６５２（０分、上のパネル）及びＴＦＯＥ処理後の６５４（２６分、下のパネル）の細胞培養物の蛍光画像を示す。細胞をＴＦＯＥで処理すると、蛍光シグナルの上昇によって示されるように、Ｓｙｔｏｘの細胞取り込みが大幅に増加する。具体的には、０．３ＭＨｚの超音波は、音響強度が最も低いにもかかわらず、ＴＦＯＥ処理後に最も高い蛍光増加を示し、１．４ＭＨｚ及び５．１ＭＨｚと比較して最も高いソノポレーション効率を示した。比較すると、８．０ＭＨｚの超音波で治療したグループでは、Ｓｙｔｏｘの取り込みはごくわずかであった。全体として、ソノポレーション効率は周波数依存性を示した。周波数が低いほど、細胞取り込み効率は高くなる。この結論はさらに統計的に証明することができる。図６Ｄでは、様々な周波数で処理された３０個の個々の細胞からの平均蛍光強度が時間の関数としてグラフ６４０にプロットされている。TFOEで生成されたグラフ線５．１（６４２）、１．４（６４３）、及び０．３（６４４）ＭＨｚ超音波はすべて、治療後の時間の関数としてＳｙｔｏｘ蛍光の増加を示し、Ｓｙｔｏｘの取り込みを促進する能力を確認している。図６Ｄは、処理後約２５分における蛍光のプラトーも示しており、膜の細孔が再封鎖されていることを示した。この動態は、集束超音波が数十分の時間スケールでＳｙｔｏｘの取り込みを促進したという以前に報告された研究と一致している。具体的には、０．３ＭＨｚグループの曲線は最も高い傾きを示し、これは、０．３ＭＨｚのグラフ線６４４が他のグループよりもはるかに速くＳｙｔｏｘの取り込みを促進したことを意味する。最終的な読み取り値は、０．３ＭＨｚのグラフ線６４４がＴＦＯＥ処理後に０．９２という最高のΔＦ／Ｆを示していることも示しており、これは、１．４ＭＨｚのグラフ線６４３（ΔＦ／Ｆ＝０．７４）及び５．１ＭＨｚのグラフ線６４２（ΔＦ／Ｆ＝０．３５）と比較して最も高いソノポレーション効率を示している。したがって、取り込まれるＳｙｔｏｘの総量は周波数に依存する。周波数が低いほど、一定期間内に損傷した細胞膜をより多くの分子が通過する。さらに、８．０ＭＨｚグループのグラフ線６４１は、顕著な蛍光の増加を示さないが、わずかな蛍光の減少を示す。Ｓｙｔｏｘの光漂白による潜在的な影響を考慮すると、蛍光の全体的な低下の理由は、Ｓｙｔｏｘの取り込みによって誘発される蛍光の増加が光漂白効果と比較して弱すぎるためである可能性がある。入射レーザー出力をさらに８．０ＭＨｚの超音波治療に増加すると、最終的には細胞への熱及び／又は光損傷を犠牲にして、０．３ＭＨｚグループと同等のソノポレーション及びデリバリーが得られる可能性があると考えられる。まとめると、ＴＦＯＥ誘発ソノポレーションは、低周波の方が高周波よりも高い効率を実行する周波数依存性を示す。
ソノポレーション効率を定量化するには、ΔＦ／Ｆ≧５０％で細胞をＳｙｔｏｘ陽性細胞として計数し、照射領域内のＳｙｔｏｘ陽性細胞の割合を計算する。このパーセンテージは、ＦＯＥソノポレーション効率の尺度として使用される。同じレーザーエネルギーと継続時間の下で周波数５．１、１．４、及び０．３ＭＨｚのＴＦＯＥの場合、２６分の蛍光イメージングから得られた効率は０％、７２．７％、及び８３．３％であることが確認でき、これは、低周波の方が高周波の超音波よりもソノポレーション効率が大幅に高いことを示唆している。低周波超音波の効率が高いことは、超音波が二層膜の運動を誘発するという膜内キャビテーション理論によって説明でき、組織内に空気空隙があらかじめ存在する必要はない。最大面積ひずみは周波数の平方根に反比例するため、低周波超音波の方がキャビテーション閾値が低くなり、ソノポレーションの効率が向上する。マイクロバブルの助けを借りて超音波によって誘導されるＳｙｔｏｘの取り込みの働きにおいて、取り込まれたＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の最大割合は、それぞれ４００、５００、及び６００ｋＰａで１５ミリ秒（パルス幅１００μ秒で１５０サイクル）の超音波処理後に２０％未満であった（ΔＦ／Ｆの閾値は不明）。本開示において、ＴＦＯＥは、１．１ｍｓの有効超音波処理持続時間（３４０パルス、３．３μｓ未満のパルス持続時間）で約４０ｋＰａの圧力を提供し、低周波数に対して７２．７％及び８３．３％のソノポレーション効率を可能にする。したがって、ＴＦＯＥによって生成される低周波局所光音響波は、テストセルが異なるにもかかわらず、同等の性能を示す。
ＴＦＯＥが、ソノポレーションの閉じ込めによって特定の分子を細胞に局所的にデリバリーすることにより、局所的な細胞調節を可能にする独自の戦略を提供することを検証するために、典型的なホールセルディッシュモジュレーションと比較して、細胞培養物の蛍光増加を１０倍の視野で調査した。局所的なデリバリーは、図６Ｆ及び６Ｇで見ることができる。図６Ｆは、１０倍の対物レンズで撮影されたＴＦＯＥ処置群６６０及び対照群６６５の蛍光画像を提供する。白い破線の円は、観察された顕著な蛍光強度変化の領域を示す。これは、細胞上１００μｍの距離にあるＴＦＯＥの位置の直下にある。ＴＦＯＥ処理後、面積０．２ｍｍ２の処理領域６６２は、３２％の顕著な蛍光増加を示し、横方向に０．２ｍｍ２の空間的閉じ込めを示している。位置特定をさらに検証するために、従来のトランスデューサーアレイはサブＭＨｚ範囲で回折限界があるため、２光子イメージングを使用した組織内のＦＯＥ誘発細胞変調により、３次元視覚化を介して空間閉じ込めが明らかになる。次に、２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム染色（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を使用してＴＦＯＥの生物学的安全性をテストするために、ＦＯＥ処理後の細胞生存率は９９．５５±０．０３％であり、ＴＦＯＥ処理の優れた生体適合性を示している。図６Ｇは、ＴＦＯＥ処置群６６０と対照群６６５との間の蛍光強度変化の比較のグラフ６７０であり、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。まとめると、細胞内に小分子をデリバリーするための新しい超音波源として使用されたＴＦＯＥは周波数依存性を示し、サブＭＨｚ超音波の重要性を示した。局所的な蛍光変化は、ＴＦＯＥが０．２ｍｍ2の空間的に閉じ込められていることを示しており、ニューロン刺激や遺伝子タンパク質研究のための局所的な遺伝子トランスフェクションなど、高い空間精度での細胞調節が期待される。
本明細書で提供される例示的な実施形態によれば、優れた光学的及び機械的特性を有するナノ粒子ポリマーマトリックスから構成されるファイバーベースの光音響エミッター１００が設計及び製造される。拡散層１１６及び膨張層１１８を含む２層コーティング設計は、生成される超音波の振幅及び周波数の正確な制御性を提供する。高振幅とサブＭＨｚ範囲の調整可能な周波数による局所的な音響波の生成が実現される。いくつかの実施形態では、光音響信号プロファイルを振幅及び周波数スペクトルで特徴付けることによって、ＣＮＴ／ＰＤＭＳのマトリックスが高振幅を達成するための好ましい候補であることが実証される。音響周波数を制御するための２つの効果的な戦略を実証できる。第１に、周波数は、音響インピーダンスの不整合を介して減衰材料として機能する拡散層１１６の厚さによって変えることができる。第２に、音響周波数は、活性吸収体／膨張層１１８を通る光の浸透の深さによっても制御され、これは吸収剤の濃度を変えることで間接的に制御できる。小分子を細胞膜にデリバリーするために０．３ＭＨｚから８．０ＭＨｚまでの範囲のさまざまな周波数のＴＦＯＥを使用することにより、サブＭＨｚ超音波は高周波と比較して優れた効率を示す。０．２ｍｍ２の側方空間制限は、ソノポレーション有効面積によっても確認できる。このように、小型化されたＴＦＯＥ１００を使用して、ミリメートル未満の閉じ込めを備えたサブＭＨｚ周波数の音響が生成され、他の典型的な超音波源の制限を克服した。このようなＴＦＯＥ１００デバイスの設計は、細胞膜ソノポレーションを含むがこれらに限定されない、幅広い細胞的用途に有望であると想定され、また、高い有効性と最小限の安全性の問題を備えた、局所的な薬物デリバリー、ニューロン刺激、及び遺伝子トランスフェクションのための新しいツールを提供する。
証明された高い小型化レベルを達成することにより、調整可能な光音響エミッターは低侵襲医療用途に有望であり、ここで、本開示を介して本明細書に提示されるファイバーベースの光音響デバイスは、例えば、焦点病変に近接した注射針又はカテーテルに挿入することができ、したがって、従来の集束超音波によって誘発される精度及び振幅の低下の問題を克服することができる。さらなる実施形態により性能を改善できることが想定される。例えば、最適な光音響信号生成のために高次モードを使用してレーザービームをファイバーに結合できる。第二に、ＴＦＯＥ先端の形状は、凹面構造を介して波を集中させる機会を提供する。第三に、従来のトランスデューサーアレイはサブＭＨｚ範囲で回折限界があるため、サブミリメートルの位置特定をさらに検証することは困難である。二光子イメージングを使用した組織内のＴＦＯＥ誘発細胞変調は、３次元視覚化を介して空間閉じ込めを明らかにする。より広い文脈では、この技術は、超音波パラメーターの変更を通じて各焦点標的で安定かつ可逆的なソノポレーションを生成する可能性を提供し、生物医学的超音波適用の正確な制御を可能にし、これは、既存の技術、特に薬物デリバリーや遺伝子導入ではできなかったことである。さらに、このＴＦＯＥ１００は電磁干渉の影響を受けないため、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性がある。これらの柔軟性は、その前例のない小型化及び容易な反復のしやすさとともに、本開示の方法及びデバイスを革新的な技術にする。
本開示の別の態様によれば、ＴＦＯＥ１００の２層製造は２つのステップから構成される。まず、拡散層１１６については、架橋プロセスによってエポキシ又はＰＤＭＳマトリックスを調製することができる。エポキシは、ポリエポキシド溶液（例えば、Ｄｅｖｃｏｎ社、アルバータ州、カナダ）と多官能性硬化剤を体積比１：１で混合することによって製造された。ＰＤＭＳの場合、シリコーンエラストマー（例えば、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国）を容器に直接慎重に分配して空気の閉じ込めを最小限に抑え、その後、重量比１０：１で硬化剤と混合する。続いて、ディフューザーとして機能するＺｎＯナノ粒子（例えば、～１００ｎｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州、米国）を、別途指定される１５重量％の濃度でマトリックスに添加することができる。コア直径が２００μｍで、先端が研磨されたマルチモード光ファイバー（例：ＦＴ２００ＥＭＴ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社、ニュージャージー州、米国）を混合溶液の表面から約１００μｍ下に慎重に浸し、マイクロマニピュレーターを使用して素早く引き上げた。本開示によれば、室温で垂直に置くことにより、ポリマーが架橋し、マトリックスがコーティングを形成した。エポキシで作られた拡散層１１６は、その後、エポキシの吸収／熱膨張層１１８でコーティングできることが想定される。
このようにして、特定の音響インピーダンスの不整合を最小限に抑えることができ、光音響変換効率を最大化することができる。グラファイト粉末（例えば、Ｄｉｃｋ Ｂｌｉｃｋ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ社、イリノイ州、米国）を、３０重量％の濃度でマトリックスと混合することができる。ＭＷＣＮＴ（例えば、外径＜８ｎｍ、内径２～５ｎｍ、長さ０．５～２μｍ、ＶＷＲ社、ニューヨーク州、米国）は、密度が低い（１．６５ｇ／ｃｍ２）ため、溶解度の上限に近い０～１０重量％の濃度で使用できる。同様に、ＰＤＭＳマトリックスで作られたＴＦＯＥを製造できる。サブＭＨｚ周波数を生成するＴＦＯＥの例示的な実施形態では、構造をＺｎＯ／エポキシ（拡散層１１６）及びＣＮＴ／ＰＤＭＳ（吸収／熱膨張層１１８）として変更することができ、ここでは、エポキシとＰＤＭＳが特定の音響インピーダンスの不整合を実現した。このようにして、セル変調に必要な周波数を満たしながら、圧力を妥協することができる。ファイバー先端付近にサーマルレジストインクでマークを付け、塗布前後の顕微鏡写真上でマークを位置合わせすることで、塗布後の膜厚を測定できる。特に、光漏れは、水及びトランスデューサプローブ内のパルスレーザー誘発衝撃波により、検出トランスデューサー上で音響応答を生成し、潜在的に検出器の損傷を引き起こす可能性がある。パワーメーターを使用して光透過率を測定し、光漏れを評価できる。したがって、上述した本開示の設計及び製造は、ＴＦＯＥ１００の光漏れを排除することができる。
本開示の実施形態によれば、優れた光学的及び機械的特性を有するナノ粒子ポリマーマトリックスから構成されるファイバーベースの光音響エミッターの設計及び製造が開示される。拡散層１１６及び膨張層１１８を含む２層コーティング設計は、生成される超音波の振幅及び周波数の正確な制御性を提供すると考えられる。高振幅とサブＭＨｚ範囲の調整可能な周波数による局所的な音響波の生成が達成された。光音響信号プロファイルを振幅と周波数スペクトルで特徴付けることにより、ＣＮＴ／ＰＤＭＳのマトリックスが高振幅を達成するための好ましい候補として実証できる。
本開示によれば、音響周波数を調整する（すなわち、制御する）ための２つの効果的な戦略が提供される。第１に、周波数は、音響インピーダンスの不整合によって減衰材料として機能する拡散層１１６の厚さによって変えることができる。第２に、音響周波数は、吸収／膨張層１１８を通る光の浸透の深さによっても制御することができ、これは吸収体濃度を変えることによって間接的に制御されている。小分子を細胞膜にデリバリーするために０．３ＭＨｚから８．０ＭＨｚの範囲の様々な周波数のＴＦＯＥ１００を使用することにより、サブＭＨｚの超音波は高周波と比較して優れた効率を示した。０．２ｍｍ2の側方空間制限は、ソノポレーション有効面積によっても確認できる。これにより、小型化されたＴＦＯＥを使用して、ミリメートル未満の閉じ込めを備えたサブＭＨｚ周波数の音響を生成でき、他の一般的な超音波発生源の制限を克服できる。このＴＦＯＥデバイス設計は、細胞膜ソノポレーションなどの幅広い細胞的用途やその他の例示的な用途に有望であり、また、高い有効性と最小限の安全性の問題を備えた、局所的な薬物デリバリー、ニューロン刺激、及び遺伝子トランスフェクションのための新しいツールも提供する。
本明細書の実施形態によれば、本開示のデバイス及び方法によって、単一細胞精度での一次ニューロンのＴＦＯＥ刺激を生成することができる。培養中の単一ニューロンを調節する際に、ＴＦＯＥ１００が十分な空間精度を提供するかどうかをテストするために、例示的な例には、ＧＣａＭＰ６ｆを発現する初代ラット皮質ニューロンを調製し、倒立広視野蛍光顕微鏡を使用してカルシウムイメージングを実行することが含まれる。図３４Ａ及び３４Ｂは、それぞれ５０ミリ秒及び１ミリ秒のレーザー持続時間でＴＦＯＥによって刺激されたまばらな集団における蛍光画像及びカルシウムトレースである（刺激後のピーク強度の蛍光画像は「アフター」として示されている。青い矢印：レーザーの開始）。マイクロマニピュレーターによって制御されるＴＦＯＥ１００は、標的ニューロン３４１４から約５μｍ離れたところに配置できる。１０３０ｎｍ及び１．７ｋＨｚ繰り返し周波数の３ナノ秒パルスレーザーを使用すると、８５パルスに相当する平均出力７．８ｍＷで持続時間５０ミリ秒のレーザーパルスを照射できる。これにより、図３４Ａに示すように、標的ニューロンに対するレーザー照射直後にカルシウム過渡現象を観察することができる一方、先端から約５０μｍ～７０μｍ離れた他のニューロン３４１６は影響を受けず、これはＴＦＯＥ刺激の高い空間分解能を示している。最大ΔＦ／Ｆが１３５％±８３％（３つの培養からＮ＝６、データは平均±ＳＤ）のカルシウム過渡現象は、おそらくＴＦＯＥ刺激によって誘発された複数の活動電位の発動によって標的ニューロンの活性化が成功したことを示している。時間分解能をさらに向上させるために、１１．４ｍＷの出力で１ミリ秒（２パルス）のレーザーパルス列をＴＦＯＥ１００に供給できる。図３４Ｂに示すように、単一ニューロン３４１４の活性化の成功は、１０６％±６１％の最大ΔＦ／Ｆで観察することもできる（３培養からのＮ＝８細胞、データは平均±ＳＤ）。
本開示によれば、ＴＦＯＥ１００は、それにより、光ファイバー上の光拡散層１１６及び膨張層１１８から構成される、ミリメートル未満の閉じ込めを有する小型超音波点音源として機能することができる。音響減衰と光吸収性能を変更することで、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数が実現され、周波数依存の効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導できる。回折限界を突破することで、サブＭＨｚの周波数とサブミリメートルの精度の間の妥協の問題を解決することで、ＴＦＯＥ１００が領域特異的な薬物デリバリー、遺伝子トランスフェクション、及び神経刺激を提供できることが想定されている。さらに、３μＭのテトロドトキシン（ＴＴＸ）を含む１ミリ秒のＴＦＯＥ１００の対照群は活性化を示さないことが考えられ、実験群で観察され得るカルシウムの増加がＮａ＋チャネル依存性活動電位に起因することが確認された。本明細書の実施形態によれば、コーティングのないテーパー状ファイバーを使用した１．０秒のパルス列及び１１．４ｍＷ出力のレーザーのみの群は活性化を示さないため、ニューロン活動に対するレーザーの影響を除外することができる。
本開示の実施形態によれば、ＴＦＯＥ１００は、神経活性化を確実かつ繰り返し誘発することができる。図３４Ｃは、ＴＦＯＥ１００刺激を３回繰り返したときの同じニューロン３４１４の蛍光強度を示す。各刺激には１ミリ秒のレーザー持続時間が、各記録期間の間に１分の間隔で利用されることが想定されている。同じニューロン３４１４の各刺激で活性化が成功する。これにより、ＴＦＯＥ１００刺激後のニューロン３４１４の生存率が確認できる。連続刺激ごとに最大ΔＦ／Ｆの減少が観察されたが、これはカルシウムの枯渇又はスパイク周波数の適応に起因すると考えられる。さらに、図３４Ｄでは、ＴＦＯＥ１００によって選択的に標的とされる３つのニューロンを使用するＴＦＯＥ１００刺激の空間精度を実証することができる。これらの３つのニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６は、２５±２μｍの端から端までの間隔を有する。ＴＦＯＥ１００は、３つの標的ニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６のそれぞれから約５μｍ離れて連続的に配置することができる。最大蛍光強度変化（ΔＦ／Ｆ）は、図３４Ｄに示すように、各ニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６について、それぞれ赤、黄、緑で色ラベルを付けることができる。重要なことに、蛍光の増加は、他の２つのニューロンが同時に活性化されることなく、選択的に標的とされたニューロンでのみ観察され、ＴＦＯＥ刺激が２５μｍ未満の空間分解能を提供することを示している。これらの結果は、ＴＦＯＥ１００が単一ニューロンを確実かつ再現性よく刺激できることを総合的に裏付けている。
本明細書の実施形態によれば、ニューロンに対する単一の光音響パルスの刺激効果も操作することができる。このようにして、同じナノ秒パルスレーザーを使用して、単一のレーザーパルスをＴＦＯＥに送信できる。異なるレーザーパルスエネルギーによるＧＣａＭＰ６ｆ発現一次皮質ニューロンのＴＦＯＥ刺激は、単一パルス条件下で実行できる。図３５Ａ～３５Ｃは、例えば５０μｍでのＴＦＯＥ刺激のパルスエネルギー依存性の画像である。それにより、図３５Ａ～Ｃは、単一パルスによるＴＦＯＥ１００刺激の前（図３５Ａ）及び後（３５Ｂ）のＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロン３４１４の蛍光画像を提供し、最大ΔＦ／Ｆ（３５Ｃ）も視覚化する。図３５Ｄは、単一パルス刺激を受けた標的ニューロン３４１４のカルシウムトレース３５４０のグラフである（青線：代表的な光音響波形を示すズームインによる光音響刺激の開始）。パルスエネルギーが６μＪ／パルスに達するまで、カルシウム過渡現象は観察されない。光音響波の幅は約１マイクロ秒であると想定される。この機能により、自然な神経コーディングを模倣するために必要な前例のない時間精度で神経回路の音響制御が可能になる可能性がある。図３５Ｅは、パルス数（Ｎ＝５～７）の関数としてのニューロン３４１４刺激の成功に対するパルスエネルギー閾値のグラフ３５５０である。
本開示はさらに、ニューロン刺激を成功させるために所与のパルス数に対して必要なレーザーエネルギーを考慮する。これまでの超音波研究では、さまざまな強度と持続時間の連続波超音波とパルス超音波がニューロン刺激に適用されてきた。時間平均されたＵＳ強度と応答振幅又は成功率との間の関係は、負又は正であることが判明した。これらの研究を考慮して、本開示は、複数の強度及び持続期間にわたる音響刺激に応答したニューロンの挙動の統計的調査を追求する。引き続きこの用途において、まず、刺激が成功するためのパルスエネルギーの閾値は、２０％を超える最大蛍光強度変化（ＭａｘΔＦ／Ｆ）を誘発するのに十分なレーザーパルスエネルギーとして定義される。２０％ＧＣａＭＰ６ｆの最大ΔＦ／Ｆは、活動電位１以上に対応すると特定できるためである。パルス数を１、２、４と増加させると、閾値エネルギーはそれぞれ６．３μＪ、４．９μＪから３．９μＪまで単調減少を示すことが想定され、パルス数がそれぞれ６と８に増加しても、それは３．９μＪと３．６μＪで比較的一定のままである。これらの結果は次のことを示している：第一に、レーザーパルス数が１～４の範囲で増加するときのエネルギー閾値の減少は、小さなパルスエネルギー条件下では、パルス数の増加とともに閾値以下の脱分極が蓄積することを示している。第二に、４パルスから８パルスへの閾値エネルギーの平坦化傾向は、約４μＪ／パルスにエネルギー閾値が存在することを意味しており、それ以下ではパルス列をさらに延長しても活動電位はほとんど誘発されない。
培養初代ニューロンの刺激が成功すると、本開示はさらに、ＴＦＯＥ１００が細胞内構造を標的にできるかどうかを検討する。この目的を達成するために、まず、ＴＦＯＥ１００を、細胞体が存在せずに軸索と樹状突起が密集している標的領域の上に注意深く配置する。持続時間１ミリ秒、レーザー出力１１．４ｍＷ、繰り返し率１．７ｋＨｚの１０３０ｎｍレーザーパルス列をＴＦＯＥ１００に供給できることが想定されている。図３６Ａ～Ｄに示すように、標的領域での蛍光強度の増加は、レーザー開始後に明確に観察でき、標的神経突起のＴＦＯＥ刺激が成功したことを示す。図３６Ａ及び３６Ｂはそれぞれ、ニューロンネットワーク（色付きの矢印：標的領域３６１０（紫）、ニューロン１（シアン、３６１２）、ニューロン２、３（赤、それぞれ３６１３、３６１４）に沿って伝播するカルシウム波によるＴＦＯＥ１００誘発神経突起活性化の前後の画像である。図３６Ｃは、レーザー開始４秒後のカルシウムシグナルのΔＦ／Ｆの画像である（スケールバー：５０μｍ）。図３６Ｄは、３６Ａでラベル付けされた、標的領域（紫、３６１０）、ニューロン１（シアン、３６１２）、並びにニューロン２及び３（赤、それぞれ３６１３及び３６１４）のカルシウムトレースのグラフである（挿入図：レーザー開始直後のカルシウム信号の拡大図、黒い矢印：レーザー開始）。視野全体のイメージングを通じて、３つの異なるカルシウムの動態を捉えることができる。まず、ＴＦＯＥ刺激後に、神経ネットワーク内の標的領域から始まるカルシウム波のゆっくりとした伝播が観察される。カルシウム波の伝播速度は７５．２μｍ／ｓと計算できると想定され、これは、シナプス活動又は代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）の活性及び逆伝播活動電位によって誘導される樹状カルシウム波の伝播速度と一致しており、その速度は約７０μｍ／ｓ４２であった。第２に、図３６Ｃに示すように、視野内の４つの部位は、カルシウム波が広がる前に蛍光シグナルの上昇を示す。標的領域の神経突起（図３６Ａ～Ｃの紫の３６１０）及び標的領域の神経突起に直接接続する軸索を有する特定のニューロン１（図３６Ａ～Ｃのシアンの３６１２とラベル付けされる）は、レーザー開始直後に速いカルシウム過渡現象を示した（図３６Ｄ）。これは、活動電位の逆伝播に似ている。無髄軸索が活動電位スパイクを５００μｍ／ミリ秒の速度でシナプスに伝導することを考慮すると、約１００μｍの距離にわたる神経突起からニューロン１（図３６Ａ～Ｃのシアン）への伝播には０．２ミリ秒しか必要としない。したがって、ニューロン１（図３６Ｄのシアンの３６１２）と標的領域（図３６Ｄの紫の３６１０）のカルシウム過渡開始の差は、サンプリング間隔５０ミリ秒のカメラでは検出できなくなる。第三に、近くにあるが標的領域に接続する軸索を持たないニューロン２及び３（図３６Ａ～Ｃにおいてそれぞれ赤の３６１３及び３６１４とラベル付けされている）は、同様の時間的動態で約０．２秒の活性化遅延を示した（図３６Ｄ、挿入図）。このシグナル伝達は、カルシウム波よりも速い伝播速度を示したため、シナプス伝達を通じて引き起こされる活動電位に起因すると考えられる。
細胞内構造、特に軸索と樹状突起に対するＴＦＯＥ誘発刺激のこの能力を利用して、軸索と樹状突起が光音響刺激に対して異なる応答プロファイルを持つかどうかを解明できる。図３６Ｅでは、多極ニューロン内の３つの神経突起がＴＦＯＥ１００によって選択的に標的とされた。神経突起の１つ（図３６Ｅ及びＦの赤色３６２２）に対する標的化ＴＦＯＥ刺激１００は、遅滞なく細胞体において強力なカルシウム活性化を誘導した（図３６Ｆ及びＪ）。したがって、そのような伝播する活性化は軸索における活動電位の逆伝播に似ているため、この神経突起３６２２は軸索として識別される。明らかに、他の２つの神経突起（図３６Ｅ、Ｇ、及びＨの黄色３６２３及び緑色３６２４）の標的化ＴＦＯＥ１００刺激は、体細胞でいかなる活性化も誘導しなかった（図３６Ｇ～Ｊ）。したがって、それらは樹状突起として識別できる。図３６Ｆ～Ｈは、異なる領域の刺激時のカルシウム信号の最大ΔＦを示す。ニューロンの樹状突起は、上流のニューロンからのシナプス入力を統合することが知られており、これには急速に連続して到着する刺激の合計が含まれ、別々の枝からの入力の集約が伴う。このケースの場合、単一の樹状突起の前方伝播では、細胞体で活動電位を誘発するには不十分であることが判明する可能性がある。単一細胞レベルでの音響刺激に対する軸索と樹状突起の反応の違いは、複数のニューロンにわたって再現可能であることが示されている。図３６Ｉは、３６Ｅにおいて赤の３６２２、黄色の３６２３、及び緑の３６２４の矢印でそれぞれラベル付けされている、標的神経突起において測定されたカルシウムトレースのグラフである。図３６Ｊは、異なる神経突起の刺激時に体細胞で測定されたカルシウムトレースのグラフである（３６Ｉ～Ｊの青い矢印：レーザー開始）。まとめると、これらのデータは、ＴＦＯＥ１００の細胞内ターゲティング機能によって可能になる、光音響刺激に対する軸索と樹状突起の異なる応答ダイナミクスを初めて明らかにする。
本開示によれば、単一ニューロンＴＦＯＥ１００刺激の重要な利点は、細胞内パッチクランプ記録との適合性である。刺激に対するカルシウム反応の時間分解能は限られているが、細胞内パッチクランプ記録を使用した直接記録は、閾値以下及び閾値以上のニューロン活動を研究するための黄金標準となる。従来の超音波はガラスと膜の間のパッチの付着を容易に破壊するため、従来の超音波刺激中の細胞内パッチクランプ記録は困難であった。本開示の光音響刺激方法及びデバイスは、機械的破壊が最小限に抑えられた局所的な光音響場という利点を有する。したがって、パッチを適用して記録することができ、神経システムの機械的変調に関する洞察を得る新しいテストシステムを提供する。
このように、本開示は、ＴＦＯＥ１００刺激を単一ニューロン上で記録するパッチクランプ３７１２と統合する。例示的な例として、これは、光音響単一ニューロン刺激に対する直接的な電気応答を検出するために、マウスの皮質スライス上で実行され得る。図３７Ａ～Ｂは、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン３７１５及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロン３７１４を標的とする、マウス脳スライス内のＴＦＯＥ１００と一体化されたパッチクランプ３７１０の２光子画像を提供する（パッチピペット３７１８は、細胞内電極溶液中のシアン緑色蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を使用して図３７Ｂで視覚化されている）。図３７Ａに示すように、特定の細胞型の視覚化を助けるために、ＧＡＤ２介在ニューロンにおいてｔｄＴｏｍａｔｏを発現するマウスからの脳スライスが提示される。したがって、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロン３７１４及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン３７１５を選択的に標的にすることができる。ＴＦＯＥ１００は、パッチピペット３７１８と統合して、脱分極を誘導し、標的ニューロンにおける活動電位の生成を引き起こすことができる。
また、図３７Ｃ～Ｆに示されるように、ニューロン膜電圧は、ＴＦＯＥ１００刺激時に前例のない安定性で正確に測定することができる。本開示の実施形態によれば、電流クランプ３７１２モード下の興奮性錐体細胞３７１４について、５μｍでのＴＦＯＥ刺激の直後に一連の活動電位を観察することができる（図３７Ｃに示すように）。図３７Ｃ及びＤは、約５μｍ（図３７Ｃのグラフ線３７３０）及び約１０μｍ（図３７Ｄのグラフ線３７４０）の距離でのＴＦＯＥ刺激（５ミリ秒）時の興奮性錐体細胞における膜電圧応答のグラフである。この結果は、図３４Ａ～Ｂ及び３５Ｄに示されるように、蛍光変化におけるΔＦ／Ｆが１００％を超える以前のカルシウムイメージングと一致している。ＴＦＯＥがニューロン３７１４及び３７１５から５～１０μｍ離れたところに移動すると（図３７Ｃ及びＤ）、活動電位が閾値以下の脱分極に道を譲ると考えられ、これは組織内の音場の閉じ込めが高いことを示している。
次に、本開示は、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性介在ニューロンを標的とすることを含む。図３７Ｅ及びＦは、膜電圧－７５ｍＶ（図３７Ｅのグラフ線３７５０及び３７５２）及び－４０ｍＶ（図３７Ｆのグラフ線３７６０及び３７６２）における、約５μｍでのＴＦＯＥ刺激時の抑制性介在ニューロンにおける電圧応答のグラフである（レーザー：１１．４ｍＷ、１．７ｋＨｚ、持続時間５ミリ秒）。ＴＦＯＥは、－７５ｍＶに保たれた抑制性介在ニューロンにおいて閾値下脱分極を誘導し、刺激後の経時的な電気応答は２つの成分を示した（図３７Ｅの３７５０）。図３７Ｅの最初の鋭いピーク３７５０は、音響波による膜の完全性の直接の中断によるものである可能性があり、次の広いピーク３７５２は、内向きチャネル電流による可能性が高く、イオンチャネルの関与の可能性を示している。－４０ｍＶ近くまで正の電流を注入することによって膜が脱分極されると、ＴＦＯＥ刺激時に３つの活動電位の短い列３７６２が観察された（図３７Ｆ）。音響刺激に対する興奮性錐体ニューロンと抑制性介在ニューロンの異なる応答は、これら２つの細胞型に固有の活動電位閾値や、音響放射力に対して異なる応答ダイナミクスを持つ機械感受性イオンチャネルの分布など、複数の要因によって寄与されている可能性がある。これにより、ＴＦＯＥ１００は、パッチクランプ３７１２記録と互換性のある前例のない安定した超音波源を提供し、音響誘発ニューロン刺激のメカニズムを明らかにすることが期待される。
テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）は、ナノ秒レーザー、先端が加工された光ファイバー、光音響コーティング、及び光熱効果を最小限に抑えて排除するための一連の動作パラメーターで構成されている。レーザーパルスによって励起されると、コーティングされた先端は光音響効果によってファイバー先端で局所的に全方向性音響波を生成できると考えられている。生成された音響波は、ＴＦＯＥ先端から１００μｍ未満の距離内に高度に局在しており、単一ニューロンの精度でニューロンを活性化するために利用できる。さらに、ファイバー先端は、単一ニューロンからサブミリメートル解像度までの幅広い解像度を提供するように設計でき、パッチクランプを介した単一ニューロン活性化の電気生理学的記録と連携して動作できる。
注目すべきことに、ＴＦＯＥ１００は、１００μｍ未満の精度で神経調節をデリバリーする能力において新規である。本開示のファイバー光音響発生器は、他のファイバー光音響発生器よりも発生する熱がはるかに少なく、効果的な超音波を生成できることが想定される。さらに、ＴＦＯＥは、ファイバー先端から１００μｍ未満の距離内に限定された局所的な超音波場を生成する。これは、他のファイバーベースの光音響デバイスよりも緊密である。音響強度が距離にわたって急速に減衰することを可能にする全方向音響伝播機能と併せて、ＴＦＯＥは高い空間精度でより効果的かつ効率的に神経活性化を生成できる。
本開示によれば、ＴＦＯＥはコンパクトな１０３０ｎｍ、３ナノ秒レーザーと、直径２００μｍ、先端テーパー付きの０．２２ＮＡマルチモーダルファイバーと、テーパー状ファイバー先端の層コーティング（コーティングされた先端全体の直径は、厚さ１０～１００μｍの範囲になる）から構成される。光音響プロセスを通じて、パルスレーザーエネルギーはＴＦＯＥ先端で生成される音響波に変換され、その後、その音響波が先端付近のニューロンを興奮させる。ＴＦＯＥコーティングは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得ることが想定される。
本開示では、その高い光吸収効率及び熱伝導効率により、ＴＦＯＥを構成するカーボンナノチューブがレーザーを完全に吸収し、熱に変換できることが意図される。その後、熱は周囲のＰＤＭＳに伝達され、全方向に伝播する光音響波が生成される。このように、ＴＦＯＥは光音響効果を利用して、約２０μｍの空間閉じ込めで音響波を生成し、超音波源に対して前例のない高い空間分解能を提供する。
さらに、本開示のＴＦＯＥは、繊維工学、材料の変更、及び新規な堆積方法によって達成される、空間分解能及び光音響変換効率の両方の改善をもたらす。本開示によれば、ＴＦＯＥによって生成される光音響波は、個々の培養ニューロンを直接活性化し、細胞内カルシウム過渡状態を生成することができる。これにより、ＴＦＯＥはファイバー先端の周囲半径２５μｍ以内のニューロンを活性化し、従来のピエゾベースの低周波トランスデューサーや以前のＴＦＯＥデバイスを上回る単一ニューロン分解能を実現する。
このようにして、ＴＦＯＥは単一細胞や軸索や樹状突起などの細胞内構造に音響刺激を与えることができる。時間的には、１マイクロ秒の持続時間の単一の音響パルスは、望ましいニューロン刺激、又は成功した神経調節のための既知の最短持続時間の音響刺激を達成することができる。重要なのは、ＴＦＯＥによって生成される近接場音響波は、無視できる程度の光熱効果を誘導しながら、全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞応答を同時に監視しながら、光音響刺激を可能にすることができるということである。さらに、ＴＦＯＥ先端コーティング構造、形状及び材料を変更して、さまざまな超音波空間伝播パターン、異なる超音波強度及び周波数を達成できることが考えられる。
本開示の実施形態によれば、電気刺激、超音波刺激、及び光遺伝学的刺激治療は、ＴＦＯＥ１００を介して光音響周波数をデリバリーすることによって神経突起伸長を促進することができる。これは、損傷が発生した場合に神経組織を機能的に修復するための重要なプロセスである。したがって、本開示の光音響プロセスは、神経活動の非遺伝的な時間的及び空間的に正確な刺激をもたらす。本開示の実施形態によれば、ファイバーベースの光音響エミッター１００（ＴＦＯＥ又はＴＦＯＥ）は、インビトロ及びインビボの両方で神経刺激において光音響効果を使用する実現可能性を表わす。図３９のニューロン３９１０は、一次ニューロンがオレゴングリーンで染色されているビトロカルシウム応答を介した結果であることを示している。ＴＦＯＥ１００と同様に、図４０Ａの３８４６を介して測定されるＴＦＯＥ３８００は、光音響刺激がインビボＬＦＰ応答に適用される場合、図４０Ｂの４０２０において同様に示されている。両方について、本開示の光音響プロセスを介して神経刺激を確実かつ繰り返し適用して、神経突起伸長及びその後の神経組織の修復を促進することができる。
特に、ＴＦＯＥ１００は、細胞の変調及び再生の目的で、パルス光エネルギーを超音波パルスに変換できることが想定される。この光音響材料は、拡張マトリックス内の光吸収体で構成することができ、フィルムや３Ｄ構造などのさまざまな設計で使用できることが考えられる。生成された超音波は、ＴＦＯＥ材料の近くに配置されたさまざまなタイプのニューロンなどの細胞を刺激したり、材料が集束超音波を生成するように設計されている場合は組織内のニューロンを刺激したりできる。
本開示の実施形態によれば、ヒドロゲルの土台は、ナノ複合アプローチを介して光音響機能と統合され、ニューロンの再生を可能にする。ヒドロゲルは、ニューロン培養に使用される場合、シルクフィブロインによって神経成長をサポートし、制御可能な生分解速度、調整可能な薬物負荷能力、光学的透明性、及び調整可能な機械的特性も提供する。さらに、カーボンナノチューブは、効率的な光音響剤として機能することができる。カーボンナノチューブを神経刺激に使用すると、高い光から音への変換効率が得られる。さらに、広帯域の光吸収により、将来の用途でレーザーシステムを柔軟に選択できるようになる。カーボンナノチューブは毒性が最小限であり、生体光音響イメージングの用途における確認に役立つ。
本開示の実施形態によれば、ＰＥＧ官能化は、繊維ベースの光音響エミッター１００を構成するＣＮＴ／シルクフィブロインフィルムの全水性製造方法７００を可能にする。シルクフィブロイン７１０は、図７に示すように、型に応じて、シルク溶液７３０（２ｗｔ／ｖ％）と官能化ＣＮＴ溶液７４０（２０～１００μｇ／ｍｌ）を混合することによって水溶液７２０に抽出され、続いて、生成物を７５０℃でキャスティング及び乾燥させて、それぞれＣＮＴ／シルクフィルム７６０又はＣＮＴ／シルクロールを製造した。ＰＥＧ官能基化により、ＣＮＴ水分散性が向上し、毒性が軽減された。表面機能化の結果は、図８のゼータ電位８００でうまく確認できる。
本開示の別の態様によれば、広帯域音響波は、ＣＮＴ／シルクフィブロインフィルムによって生成され得る。例えば、図９は、パルスレーザー９１０を介してマルチモード光ファイバー９１４を介してＣＮＴ／シルクフィルムにデリバリーされる、パルス幅３ｎｓの１０３０ｎｍレーザー９１０を示しており、照射面積は約０．０５ｍｍ2である。音響波９１２は、１０ＭＨｚのトランスデューサーを使用して特性評価され、オシロスコープ９２０によって記録された。その結果、音響パルス幅１μｓ、広帯域中心周波数１．２ＭＨｚ、圧力０．２６ＭＰａの光音響波９１２は、図１０Ａのグラフ線１０１０に示すように、１４．７μＪのパルスエネルギーで生成された。図１０Ｂのグラフ線１０２０は、それぞれ時間及び周波数の関数として示されている。光音響刺激には適切な圧力が必要であり、埋め込まれたＣＮＴの濃度とレーザー出力を操作することで制御できることに留意されたい。これを測定するために、以下が計算される。
式中、
であり、ｌは固有長さ、Ａは光吸収係数、Ｆはレーザーフルエンス、βは体積熱膨張係数、νは音速、Ｃpは比熱容量である。光吸収材料として、図１１のグラフ線１１１０（ＣＮＴ濃度μｇ／ｍＬの関数としてパルスエネルギーを７５μＪに固定）及び図１２のグラフ線１２１０（パルスエネルギーμＪの関数としてＣＮＴ濃度を２０μｇ／ｍＬに固定）に見られるように、埋め込まれたＣＮＴの濃度が高いほど、吸収係数が高いため、より強い音響波が発生する。
本開示の実施形態によれば、生体適合性及び無視できるほどの熱影響は、神経組織の光音響刺激を介して確認され得る。図１３Ａは、製造されたＣＮＴ／シルクロール又はフィルムをガラス対照群と比較したときの、ニューロン／面積の関数としてのインビトロ形態を確認するグラフ１３１０である。図１３Ｂは、製造されたＣＮＴ／シルクロール又はフィルムをガラス対照群と比較したときの、全長／面積の関数としてインビトロ形態を確認するグラフ１３２０である。図１３Ｃは、コントロール、ＣＮＴ／シルク、及びシルクフィルム＋ＣＮＴグループの細胞生存率をそれぞれ確認するグラフ１３３０である。
図１４は、生後１０週目のマウスのインビボ組織学における神経組織の光音響刺激による生体適合性及び無視できる熱影響をＨ＆Ｅ染色で確認する画像１４００を表わす。４倍と４０倍の倍率レベルでそれぞれ５０μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬに曝露した場合、結果は３日目と３０日目の間隔で記録された。さらに、図１５は、１５００における生体適合性及び無視できるほどの熱影響を確認するパルス列を示す概略図を表わす。繰り返し率は１．７ｋＨｚ、持続時間は３ｍｓ／５パルス、レーザーパルスエネルギーは５３μＪに設定される。図１６は、経時的な温度の関数として、グラフ線１６１０におけるＣＮＴ／シルクの性能とグラフ線１６１２における単離されたシルクの性能を示すグラフであり、ＣＮＴ／シルクの組み合わせの改善された光音響能力をさらに裏付ける。
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＣＮＴ／シルクフィルムによって生成された光音響波は、神経活動を確実かつ繰り返し刺激する。そうするために、図１７～２０に示すように、５ｍｓ（８パルス）で１４．７μＪ（２９．４ｍＪ／ｃｍ２）のレーザーパルスエネルギーを、４日目にトランスフェクトされた一次皮質ニューロンＧＣａＭＰ６ｆに適用することができる。図１７は、光（ＣＮＴ／シルク光＋）にさらされたときのＣＮＴ／シルクフィルム１６１０の性能の１００μｍの画像であり、光照射により活性化領域１７１０が決定される（破線１７１２はレーザー照射領域を示す）。図１８は、光（シルク光＋）にさらされたときのシルクフィルム１６１２の性能の１００μｍの画像であり、光照射が活性化領域１８１４を決定する（点線はレーザー照射領域１８１６を示す）。これをさらに説明するために、図１９及び２０は、ＣＮＴ／シルクの性能について、光にさらされた場合をグラフ線１９１０、光にさらされていない場合（ＣＮＴ／シルク光－）をグラフ線１９１２、シルクフィルムが経時的なΔＦ／Ｆ０の関数として光にさらされた場合をグラフ線１９１４で示すグラフである。これにより、光音響刺激により確実かつ繰り返し神経活性化を誘導できることが確認でき、また、神経機能が損傷していないことも確認できる。
本開示の別の態様によれば、光音響刺激は、神経突起伸長を促進することができる。例示的な実施形態は、図２１～２６に示すように、ラットの後根神経節（ＤＲＧ）外植片を介して観察することができる。図２１は、１．７ｋＨｚ及び５ｍｓのパラメーターでラット後根神経節外植片に経時的に適用される光音響刺激の概略図２１００を含み、パルス列は２分ごとに１時間適用される。図２２は、それぞれ、ＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するＣＮＴ／シルク光＋の従来の画像及び挿入画像を含む。図２３には、ＣＮＴ／シルク光の従来の画像と挿入画像が含まれており、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有する。図２４は光照射を受けたときの、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するガラス光制御グループの従来の画像及び挿入画像を含む。図２５は、光照射を受けていないときの、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するガラス光制御グループの従来の画像及び挿入画像を含む。
例示的な例を続けると、図２６は、面積の関数としての図２２～２５のグラフである。適用すると、光音響刺激ＤＲＧ（１８．１９±１．３７ｍｍ２）は、ガラスコントロールグループ（１０．４８±５．０６７ｍｍ２）と比較して、カバー面積が１．７４倍増加した。さらに、光音響刺激は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現を高めることができる。例示的な実施形態として、光音響刺激の２４時間後、それぞれ図２７及び２８に示すように、２つの神経栄養因子、ＢＤＮＦ及びＮＧＦをＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって測定した。その結果、光音響刺激ＤＲＧのＢＤＮＦ濃度（８６．５２±１７．０７ｐｇ／ｍｌ）は、ガラス対照群（４４．２０±２２．３１ｐｇ／ｍｌ）と比較して１．９６倍の増加を示した。ＮＧＦの発現量に有意差は認められなかった。このようにして、光音響刺激によって誘発される活動電位とそれに続くカルシウム流入は、ＢＤＮＦ経路に影響を与え、神経突起の伸長を促進する。
本開示によれば、実証された高い小型化レベルを達成することによって、調整可能な光音響エミッターを低侵襲性の医療用途に展開することができる。例えば、前述のファイバーベースの光音響デバイス１００は、焦点病変に近接した注射針又はカテーテルに挿入することができ、これにより、従来の集束超音波によって引き起こされる精度及び振幅の低下の問題を克服することができる。さらに、ＴＦＯＥ１００の先端の形状により、凹面構造を介して周波数波を集束させることができることが想定されている。図２９は、時空間符号化及び復号化を可能にする多機能ニューラルインターフェース２９００が対象を治療するために使用される例示的な例を表わす。この方法は、図３０の図にさらに示されており、コンピュータ３０１０は、２９００を介して脳３０１４に光音響刺激３０１２を提供し、その後、電気記録フィードバック３０１６を受信する。あるいは、図３１Ａ～３１Ｂは、光媒介低侵襲性ＰＮＳ刺激用の埋め込み型カフ３１００が、それぞれ２００μｍ及び１００μｍで対象を治療するために使用される例示的な実施形態を表わす。それにより、ＭＥＣＨエラストニクス３１１０は、神経線維３１１２に光音響刺激をもたらす。さらに、本開示の方法及びデバイスは、超音波パラメーターの修正を通じて、各焦点標的において安定で可逆的なソノポレーションを生成できることが想定され、これにより、生体医療用超音波用途、特に薬物デリバリーや遺伝子導入の場合、既存の技術では実現できない正確な制御が可能になる。図３２は、官能化ステップ３２１０、キャスト及びアニーリングステップ３２２０、及び得られるＣＮＴ／シルク３２３０製品の概要を提供する。図３３は、光音響刺激による興奮したニューロン３３１０の前後の画像を提供する。さらに、ＴＦＯＥ１００は電磁干渉の影響を受けないため、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性があることに留意されたい。
本開示では、約２０μｍの空間閉じ込めで音響波を生成し、単一ニューロン及び細胞内精度での光音響神経変調を可能にするＴＦＯＥが提示される。ＴＦＯＥ１００によって生成された近接場音響波は、光音響刺激と全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞反応の同時モニタリングを可能にし、これは、従来の超音波刺激では困難であると報告されている。ＴＦＯＥ１００をエクスビボ脳スライス電気生理学と組み合わせることにより、本開示は、興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンに対する音響刺激に対する細胞型特異的応答をもたらす。
本開示の実施形態によれば、光音響効果は、生物医学的イメージングに広く使用されており、さらに最近では、神経調節のために研究されている２６。以前に報告された光音響刺激デバイスと比較して、ＴＦＯＥ１００は、新しいデバイス設計と革新的な製造方法を適応させることで新しい機能を提供する。ＴＦＯＥ１００の高効率光音響変換層は、熱膨張性ＰＤＭＳマトリックスに埋め込まれた溶解度が向上したカーボンナノチューブでできており、光から音への変換効率が大幅に向上する。さらに、パンチスルーコーティング法により、非常に小さなテーパー状のファイバー先端を優れた制御性と信頼性で均一にコーティングできる。
ＴＦＯＥ１００の重要な利点は、その前例のない空間分解能であることに留意されたい。経頭蓋超音波神経調節は、げっ歯類、非ヒト霊長類、及びヒトで実証されている。ただし、波の回折限界により、集束超音波神経変調では数ミリメートルの空間精度が得られ１９、これにより、小動物の部位特異的調節や単一ニューロンの刺激が禁止され、細胞型特異的応答を研究する能力が欠けている。この制限を克服するために、ＴＦＯＥ１００は、音響波長と比較して１０００分の１小さく、約２０μｍの空間分解能で１ＭＨｚで局所音場を生成する。本開示は、局所音場を利用して、単一細胞及び細胞内精度での神経刺激を実証し、神経細胞体、樹状突起及び軸索を特異的に標的とすることによる細胞内構造のＴＦＯＥ刺激に対する示差的応答を明らかにする。
パルスレーザーの制御性を利用することにより、本開示は、単一細胞レベルでの光音響刺激の累積効果を特定し、超音波刺激が有効になるまで有限の持続時間にわたって統合され得ることを示す。ネットワークのない状態で単一ニューロンの活動を評価する機能を備えたＴＦＯＥ１００の結果は、個々のニューロンの固有の信号解釈としての刺激蓄積効果をさらに確認する。
さらに重要なことに、本開示では、成功したＴＦＯＥ刺激が、１マイクロ秒の音響パルスを生成する３ナノ秒の単一レーザーパルスで達成されたことが意図される。これまでに、１０の音響サイクルと全体の持続時間２２．７マイクロ秒のシングルトーンバースト超音波は、ニューロン変調のための最も短い音響刺激として報告されている。したがって、本開示は、現在の音響刺激技術の時間分解能の大幅な改善を表わす。
さらに、本開示では、ＴＦＯＥ１００により、音響刺激と全細胞パッチクランプ記録との統合が可能になることが意図される。ＴＦＯＥ刺激による脳スライス内の単一ニューロンの電気生理学的記録は、ＴＦＯＥ刺激に対する興奮性錐体ニューロンと抑制性介在ニューロンの異なる反応を明らかにした。異なる応答は、固有の閾値の違い、又は異なるイオンチャネルの分布の変動に起因する可能性がある。さらに、抑制性ニューロンは、興奮性ニューロンと比較して、活動電位発生の閾値の上昇を示した。これは、抑制性ニューロンの閾値が錐体細胞よりも低い電気刺激を使用した発見とは対照的である。この不一致は、音響刺激と電気刺激のメカニズムの違いに起因すると考えられている。したがって、例えば、イオンチャネルを薬理学的又は遺伝的に変更することによる音響刺激中のイオンチャネルの関与に関するさらなる研究は、機械的神経調節の電気生理学的メカニズムに新しい洞察を提供する。
本開示のデバイスの方法によって提供される遺伝子フリーの単一細胞刺激技術は、ニューロン刺激のメカニズム、及び個々のニューロンがネットワーク内でどのように連携してニューラル計算を実行するかを理解するための新しいツールを提供する。ＴＦＯＥ１００は金属コンポーネントを一切使用していないため、電磁干渉の影響を受けず、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性がある。ＭＲＩは、ヒトの患者の行動と疾患の理解に向けた将来の研究に期待されている。
前述の応用に加えて、神経調節は、脳を理解し、疾患を治療するための貴重なプラットフォームであることに留意されたい。脳や病気を解読するには、行動している被験者の脳活動を正確に操作することが重要である。最適には、変調と読み取りの両方が非侵襲的である。解決策として、超音波神経変調（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｎｅｕｒｏ－ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ、ＵＳＮＭ）は、低周波超音波が非侵襲的に脳活動を調節できるため、新しい非侵襲的神経変調技術である。ＵＳＮＭは、ＴＭＳ及びｔＤＣＳ（～ｃｍ）と比較して、より高い空間分解能（＜５ｍｍ）を持つと考えられている。しかし、ガイダンスが不足していると、正確な超音波神経調節が妨げられる。正確なＵＳＮＭには、ｍｍ未満の解像度でのリアルタイムガイダンスと脳回路の評価が必要である。このようなガイダンスを提供するために、本質的にＵＳＮＭと互換性のある超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ、ＵＳ）画像処理を行うことが理想的であると考えられている。
しかし、超音波は神経活動の感知と体積画像の提供には限界がある。例えば、血流を監視する経頭蓋ドップラー超音波（ｔＤＵＳ）は、認知科学の研究での使用に限定されている。ＵＳイメージングでは、体積モニタリングを実現するのが困難な断層画像（Ｂモード）のみが提供される。
したがって、研究や診療所での超音波神経調節には、標準化された体積測定のガイダンスが必要である。前述のことを念頭に置いて、ｆＭＲＩはＵＳＮＭを指導し評価するための最も適した候補である。これは、機能的磁気共鳴イメージング（ｆＭＲＩ）によって実現できる。ｆＭＲＩは、解像度が約２００μｍの非侵襲的体積機能イメージングである。したがって、ｆＭＲＩは、非侵襲的な神経調節のためのＵＳＮＭ（ｍｍレベル分解能）を導くための最良の候補である。
ただし、既存のＭＲＩ互換ＵＳＮＭツールは、研究者にとって制限されているか、アクセスできない。したがって、従来のＵＳＮＭを再設計するには、フェライトや金属コンポーネントをすべて取り除くなど、高度なエンジニアリングが必要である（ほとんどのＵＳトランスデューサーは、磁場を妨げるニッケル、フェライト、金などの材料を使用しているため）。さらに、これらの材料は干渉を最小限にするための電子部品のシールドを複雑にする。現時点では、新しいＭＲＩ対応ＵＳＮＭは限られている。これまでのところ、２０１６年にＦＤＡによってＩｎｓｉｇｈｔｅｃ（イスラエル、ハイファ、１９９９年設立）に対して承認されたシステムは１つだけである。現在、数千のＭＲＩシステムが使用されているが、世界中に設置されているシステムはわずか２１台である。さらに、コンパクトでポータブルなＵＳＮＭツールを作成することは困難である。ＤＢＳ（埋め込まれたパルス発生器から脳内の電極に電荷をデリバリーするために鉛繊維を利用することを含む）と同様に、ＵＳＮＭは症状の継続的な抑制を達成するために慢性的に適用する必要がある。したがって、コンパクトでポータブルな設計のＵＳＮツールが必要である。しかし、既存のＵＳＮツールは剛性が高く、大きなアンプが必要である。
したがって、非侵襲的でＭＲＩ互換性があり、ウェアラブルで広くアクセス可能な非侵襲性神経調節ツールを提供するという満たされていないニーズがある。本開示の実施形態によれば、ファイバーベースの光音響変換器（Ｆｉｂｅｒ－ｂａｓｅｄ Ｏｐｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ、ＦＯＣ）による光音響脳変調は、ＴＦＯＥ１００と同様の刺激をもたらす。例示的な例として、図３８Ａは、パルスレーザー３８１０がＦＯＣ３８００を介して神経突起組織３８５０に刺激をデリバリーするときの、ファイバーベースの光音響変換器（ＦＯＣ）による光音響脳変調の概略図を表わす。図３８Ｂは、ＦＯＣが光音響刺激を生成し、ＦＯＣ３８００を介して光音響信号３８１２を生成する際のＦＯＣの概略図を表わす。そうするために、パルスレーザー３８１０は、２００μｍのファイバー３８１４を介してデリバリーされ、それによって、ＴＦＯＥ１００と同様に、ＺｎＯ／エポキシ混合物拡散層３８１６及びグラファイト／エポキシ混合物吸収／膨張層３８１８と係合して、信号３８１２を生成する。これを説明するために、図３９Ａ～Ｃは、初代ニューロンをオレゴングリーンで染色した、培養初代ニューロンにおいてカルシウム過渡現象を誘導するＦＯＣ３８００の画像及びグラフ表示をもたらす。さらに、図４０Ａ～Ｂは、切断ツール３８４６及びＦＯＣ３８００を含む、マウスの脳においてインビボで神経活性化を誘導するＦＯＣ３８００の画像及びグラフィック描写をもたらす。ただし、ＦＯＣ３８００は侵襲的であるため、外科的特性があるため、常に最適であるとは限らない。
本開示によれば、ＡＭＲＩ互換のソフト光音響パッド（ＳＯＡＰ）を使用する非侵襲性神経変調システムは、この問題を解決する。図４１は、治療としてＡＭＲＩ互換ソフト光音響パッド（ＳＯＡＰ）を使用する非侵襲性神経変調システムの例示的な概要を提供する。ＳＯＡＰ４１００は、水４１４４、ＰＤＭＳ整合層４１４０、及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合層４１４２を利用して、神経突起組織に集束超音波治療を施す。図４２は、ＳＯＡＰ４１００がこの集束超音波４１２４を治療位置に提供する方法の例示的な概略図を提供し、同様にレーザーパルス４１１０及び光ファイバー４１１４によって可能になる。集束超音波４１２４は、ＳＯＡＰ４１００内の水の量を変更することによってさらに調整できる。図４３は、異なる超音波４１２４及び４１２５の波長をそれぞれ比較することによって、ＳＯＡＰ４１００がどのように適応焦点調整を提供できるかを示す概略図を表わす。
本明細書の例示的な実施形態によれば、この処理は、図４４Ａ～図４４Ｉに適用される。図４４Ａ～Ｃは、光音響放射における静的工学的位相プロファイルを表す湾曲光音響フィルムによる集束超音波の発生に関する例示的な実施形態を示す画像を提供する（スケールバー：５ｍｍ。ＵＳ：超音波（緑）、ＯＡ：光音響（赤））。図４４Ｄ～Ｆは、ラットの頭蓋骨が存在しない場合を示す生成された超音波画像を提供し、図４４Ｇ～Ｉは、ラットの頭蓋骨が存在する場合を示す画像を提供する。
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰ４１００（例えば、焦点で４ＭＰａ（骨なし）、＜０．６５ＭＨｚの超音波放射を伴う）の設計及び製造が意図される。さらに、経頭蓋ＵＳ送信には０．６５ＭＨｚ未満の超音波が必要であると考えられている。焦点での１ＭＰａは、損傷を与えることなくヒトの脳の反応を誘導するのに十分であることが示されている。さらに、ヒトの頭蓋骨による圧力レベルの４倍の減衰が予想される。図４５は、ＳＯＡＰ４１００システムのセットアップダイナミックの概略図を提供する。レーザーパルス４１１２は、それぞれＦＧ１及びＦＧ２を介して、光ファイバー４１１４を介してＳＯＡＰ４１００治療領域上の空気４１２６に前記パルス４１１２をもたらす。ＳＯＡＰは、調整可能な水４１４４、ＰＤＭＳ整合層４１４０、及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２からなる。
例示的な実施形態を続けると、成形によるＳＯＡＰ４１００内に挿入することができるＳＯＡＰパッド４１２２の製造が、ＳＯＡＰパッド４１２２の製造プロセスの概略図を提供する図４７を介して指示される。３０％ＣＮＦの溶液を半径２５ｍｍの金型に注入する。溶液を金型内で焼成して形成し、ＰＤＭＳを添加して発光ＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２を形成する。得られた生成物４１４２には、追加のＰＤＭＳが注入され、ＰＤＭＳ整合層４１４０と共に剥離され、ＯＤにカットされ、ＰＤＭＳ整合層４１４０及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２を含むＳＯＡＰパッド４１２２を形成する。ＳＯＡＰ４１２２は、図４６に示すように、さまざまなターゲットに合わせてさらにスケーリング及び調整でき、これは、想定されるヒトとマウスの被写体の直径と焦点距離パラメーターの概要を表形式で提供している（ヒト：直径３０ｍｍ、焦点距離２５ｍｍ、マウス：直径５ｍｍ、焦点距離３ｍｍ）。ＳＯＡＰ４１００はソフトポリマーベースであることが想定されている。
本明細書の実施形態によれば、光音響刺激の所望の強度は、型の直径及び焦点距離に応じて変化するはずである。図４８は、異なる厚さの超音波波形に関するシミュレーションデータのグラフ表示を提供する。図４９は、対応する周波数スペクトルに関連するシミュレーションデータのグラフ表示を提供する。図５０は、ヒトの頭蓋骨の厚さが６ｍｍであり、横方向のＦＷＨＭが４．６ｍｍである内部焦点に関するシミュレーションデータの画像を提供する。
これにより、マウスの脳スライス上でエクスビトロでＳＯＡＰ４１００を利用することができる。例示的な実施形態によれば、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１４～１６週齢）を標本として利用することができ、定位固定マウスの脳マップに応じて、厚さ０．５ｍｍの１２枚の連続する冠状画像スライスに焦点を合わせ、最初のスライスはブレグマの２ｍｍ吻側に配置される。図５１は、ＭＲＩチャンバ４１３６内でレーザーパルス４１１２、光ファイバー４１１４、及びＭＲＩユニット４１３０をそれぞれ介してエクスビボで神経変調を受けている拘束されたマウス被験者４１２８の図を表わす。パラメーターは、時間分解能１秒のグラディエントエコーエコープラナーイメージング（ＧＥ－ＥＰＩ）シーケンス（ＴＲ／ＴＥ＝１，０００／１２ｍｓ、フリップアングル６０°、マトリックス８０×３５、１平均）を使用したＢＯＬＤ－ｆＭＲＩイメージングが想定されている。さらに、使用する各マウスで１ｋＨｚのレーザー繰り返し速度で２００ｍｓＳＯＡＰ変調が実行されることが想定されている。
さらに、ＳＯＡＰ４１００は、自由に動くマウス被験者の神経調節によってインビボに非侵襲的に適用できる。図５２は、非侵襲的なインビボ神経調節を受けている自由に動くマウス被験者４１２９の図を表わす。ＳＯＡＰ４１００は、自由に動くマウスの実験に着用できるほど軽量でコンパクトであると考えられている。ＳＯＡＰ４１００は、レーザーパルス４１１２、光ファイバー４１１４、及びＳＯＡＰ４１００を介して、マウスの左半球の一次運動野及び二次運動野を標的とすることが想定されている。ＳＯＡＰ４１００がオンの場合、コントロールグループと比較した場合、動きのパターンが変化すると予想され（例えば、ＳＯＡＰ４１００がオンの場合の時計回りの動き）、カメラ４１３４で監視できる。
図５３は、ＳＯＡＰ４１００デバイスを要約した概略図を表わす。ＳＯＡＰ４１００は、ＭＲＩと互換性のある光動力及びポリマーベースの超音波エミッターであり、初めての非侵襲性光音響インビボ脳変調である。さらに、ＳＯＡＰ４１００は、従来の光音響エミッタ（約数十ＭＨｚ）とは異なる低周波超音波の生成を可能にする。ＳＯＡＰ４１００は、調整可能な水量と成形により、それぞれ集束超音波発生における調整可能な機能と適用性を備えている。このようにして、ＳＯＡＰ４１００は、ＭＲＩ互換の集束超音波を使用して、リアルタイムのＭＲＩガイドによるＢＢＢ開口を可能にする。さらに、ＳＯＡＰ４１００は柔軟で、空気圧ポンプなどのアクチュエータを使用して音響焦点を調整するように設計できる。
本開示の別の態様によれば、神経回路を解読し、神経疾患を治療するための強力なツールとしての神経調節の使用がさらに詳細に説明される。経頭蓋集束超音波（Ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ ｆｏｃｕｓｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ、ｔＦＵＳ）は、サブＭＨｚの周波数によりミリメートルスケールの空間分解能を提供する。ただし、小動物の脳のサブ領域をターゲットにする場合は、ミリメートル未満の精度が必要である。本開示は、ろうそくのすすナノ粒子をポリジメチルシロキサン球面に埋め込むことによって製造された軟質光音響パッド（ＳＯＡＰ）によって生成される光学駆動集束超音波（ＯＦＵＳ）を含む。ＳＯＡＰは１５ＭＨｚで横方向分解能６６μｍの超音波焦点を生成できるが、これはｔＦＵＳよりも２桁小さい。本開示は、ＯＦＵＳが、マイクロ秒未満の単一サイクル及び０．０６Ｊ／ｃｍ２で、神経刺激に首尾よく使用されたｔＦＵＳと比較して２桁少ない超音波エネルギーでインビトロで神経刺激を達成することを実証する。さらに、本開示は、インビボでのマウス運動皮質におけるミリメートル未満の経頭蓋刺激を実証する。ＯＦＵＳは、ミリメートル未満の精度を非侵襲的に提供することで、インビボでミリメートル未満の精度で非侵襲的な神経調節を行う光学駆動集束超音波を利用して、神経科学の研究と神経疾患の治療に新しい道を開く。
本明細書の例示的な実施形態によれば、脳機能がどのように行動を制御し、その機能不全が疾患を引き起こすかを理解するには、神経活動を高精度で調節するモダリティが必要である。小動物では、ミリメートル未満の精度の神経調節ツールを使用して、少数のニューロン集団を調節することによって脳のサブ領域をマッピングできる。電気刺激や光遺伝学などの侵襲的方法は、ミリメートル未満のスケールで空間分解能を提供できる。電気刺激ツールは、すでに神経調節研究と疾患治療におけるゴールドスタンダードとなっている。例えば、脳深部刺激は、埋め込まれた電極によっていくつかの病気の効果的な治療を実現する。パーキンソン病、うつ病、てんかんの臨床治療用として承認されている。しかし、現在の広がりにより、ターゲティングの正確な制御が制限されている。光遺伝学は、光を使用してトランスフェクトされたニューロンをトリガーすることにより、標的細胞タイプに比類のない細胞内空間分解能と特異性を提供し、神経科学の研究を進歩させた。マウスの経頭蓋光遺伝学はさらに手術を回避し、５～６ｍｍの貫通深さで横方向に約０．８から１ｍｍの脳領域を刺激することに成功する。ただし、経頭蓋光遺伝学の光透過率は７ｍｍで約０．０２％である。従来の光遺伝学と経頭蓋光遺伝学はどちらも、ヒトの脳での使用がまだ承認されていないウイルスのトランスフェクションに依存している。非侵襲的な方法は、手術のリスクを回避しながら効果的な神経調節を提供する。経頭蓋直流刺激（ｔＤＣＳ）と経頭蓋磁気刺激（ＴＭＳ）は非侵襲的であるが、使用される電磁波の波長が長いため、得られる空間分解能はセンチメートルレベルである。新しい経頭蓋集束超音波（ｔＦＵＳ）は、マウス、ラット、ウサギ、サル、さらにはヒトなどのさまざまなモデルで高精度の非侵襲的神経調節法として実証されている。パルス超音波処理と連続超音波処理の両方が採用されているが、パルス超音波処理の方が神経反応を引き出すための刺激閾値が低いため、より一般的である。組織損傷の可能性を最小限に抑えるために、１００Ｗ／ｃｍ２以内の低強度が使用されている。高い経頭蓋効率を達成するために、空間分解能が数ミリメートルに制限される約１ＭＨｚ以下の低い超音波周波数のｔＦＵＳが推奨される。ヒトの場合、この空間分解能により、視床の個々の核に対応する刺激量を達成できる。小動物の脳のサブ領域を数百μｍのスケールでターゲットにするには、ミリメートル未満の精度を備えた非侵襲性の神経調節ツールが必要である。
光音響効果は、超音波を生成する別の方法であることに留意されたい。光音響材料は短い光パルスを吸収し、それを一時的な温度上昇と熱膨張に変換し、その結果、超音波パルスが生成される。最近の研究は、高空間分解能の神経刺激のためのファイバーベースの光音響エミッター（ＦＯＥ）を使用してこれを実証した。これらのファイバーベースの光音響エミッターでは、ＴＦＯＥ１００によって前述したように、光音響材料を光ファイバーの先端にコーティングすることができ、コーティングされたファイバーは高度に局所的な超音波の点源として機能し、サブミリメートルから数十μｍまでの解像度を提供し、細胞内構造を選択的に活性化することができる。ただし、局所的な神経調節に近接場超音波を利用するため、ファイバーベースの光音響エミッターは神経組織に外科的に埋め込む必要があり、経頭蓋的に適用することはできない。
本開示の例示的な実施形態によれば、ミリメートル未満の精度で非侵襲的な神経調節のための光学駆動集束超音波（ＯＦＵＳ）５４００が提示される。以前に提示されたＳＯＡＰ４１００に加えて、フィルムは、非侵襲的な変調のための集束超音波を生成するように湾曲することができる。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）とカーボンベースの吸収体をベースにした湾曲したＳＯＡＰ５４１０を製造することができ、より厳密な空間集束と焦点圧力の最大化が可能になる。したがって、曲率の直径は、理論上の限界（ＮＡ＝１）に近い開口数（ＮＡ＝０．９５）に達するように調整できる。光音響効果によって光子を音響波に効率的に変換するために、ＳＯＡＰ５４００には、熱収縮膜（ＨＳＭ）、ポリジメチルシロキサン混合カーボンナノチューブ（ＣＮＴ－ＰＤＭＳ）、ＰＤＭＳ混合カーボンナノ粒子（ＣＮＰ－ＰＤＭＳ）、ＰＤＭＳ積層ろうそくのすす（ＣＳ－ＰＤＭＳ）など、４つの異なる光音響材料に基づいて設計された曲率を含めることができ、製作してテストすることも可能である。したがって、それらの光音響変換効率は、製造されたこれらのＯＦＵＳの焦点の圧力を測定することによって比較することができる。ＣＳ－ＰＤＭＳ ＯＦＵＳ５４００を使用すると、本開示は、０．６２ｍＪ／ｃｍ２のレーザー入力で超音波焦点で約４８ＭＰａをもたらす。さらに、経頭蓋能力を備えた約６６μｍの空間分解能を持つＣＳ－ＰＤＭＳ ＯＦＵＳがさらに実証され、ｔＦＵＳによって提供される数ミリメートルの分解能から２桁の向上を達成する。カルシウムイメージングにより、本開示は、インビトロでの培養ニューロンにおいて、ＳＯＡＰ５４１０による直接的かつ経頭蓋単一パルス刺激を確実かつ安全に達成する。ＳＯＡＰ５４１０の総超音波エネルギー入力は、同様のレベルのニューロン応答を引き起こす従来の超音波トランスデューサーでデリバリーされるエネルギーよりも２桁少ない。免疫蛍光イメージングを使用して、本開示は、マウスの脳におけるサブミリメートルの刺激量を視覚化することを含む。さらに、本開示は、電気生理学的記録を使用して、インビボでＳＯＡＰ５４１０を用いてマウスの運動皮質を非侵襲的に刺激することによって機能的結果を検証することを含む。
本開示は、ＳＯＡＰ５４１０の製造及び光音響効率の最適化をさらに詳細に表わす。ミリメートル以下の精度で集束超音波場を生成するために、生成される音場を予測し、ＳＯＡＰ５４１０の幾何学的設計を最適化するための数値シミュレーションが示されている。図５４Ａは、ＳＯＡＰ５４１０の概略図を示す。ナノ秒レーザー５４１２が、ＳＯＡＰ５４１０の底部から送出される。光音響効果は、湾曲したＳＯＡＰ５４１０の表面で超音波５４１４を生成し、湾曲上の異なる角度から放射された波５４１４は、同位相でその幾何学的中心５４１６に到達する。幾何学的中心５４１６は、ろうそくのすす５４１８を含み、ＰＤＭＳ層５４１９上に配置される。焦点距離２ｍｍは、超音波が頭蓋骨を貫通し、マウスの脳の皮質層に到達して刺激できるように設計されている。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）のｋ－ｗａｖｅツールボックスを使用して数値シミュレーションを実行して、生成される音場を計算できる。ＳＯＡＰ５４１０で生成されたＯＦＵＳ５４００は、適用シナリオを模倣するために、エアバッキングで水中に伝播する。したがって、炭素ベースの吸収体の報告されたデータに従って、中心周波数１５ＭＨｚと帯域幅２００％を設定できる。これにより、焦点距離と調整された半径と曲率直径が固定され、ミリメートル以下の精度が得られる。したがって、曲率直径と半径の比は、開口数（ＮＡ）に比例する。横方向の解像度は、横方向プロファイルの半値全幅として定義される。横方向解像度とＮＡの関係を図５４Ｂにプロットする。ＮＡが高いほど、横方向の解像度はより正確になる。図５４Ｂにおいて、オレンジ色の領域５４２０は、従来の超音波トランスデューサーにおけるＮＡの範囲を表わす。従来の単素子集束超音波トランスデューサーの製造プロセスでは、単結晶圧電材料に亀裂が生じるため、高いＮＡを達成することが困難であった。しかし、光音響材料では、同じ超音波周波数で従来のトランスデューサーが提供できる最良の横方向分解能の半分を提供するため、理論的限界に近い高いＮＡが実現可能である。
１５ＭＨｚで横方向の分解能を限界まで高めるには、理論上の限界に近い０．９５のＳＯＡＰの高いＮＡを選択できる。これにより、ＳＯＡＰ５４１０の半径は６．３５ｍｍに最適化され、曲率の直径は１２．２ｍｍに設定される。この幾何学的形状は、図５４Ｃ（これは、設計されたジオメトリを持つｋ波シミュレーションでＳＯＡＰ５４１０によって生成された音場の画像５４３０である）に詳述されているように、予想通り、曲率の中心にＯＦＵＳ５４００をもたらす。挿入図は音響焦点で拡大したもので、スケールバーは２００μｍである。生成されたＯＦＵＳは、－６ｄＢで７８μｍの横方向分解能、２０９μｍの軸方向分解能を備えている。この空間分解能は、小動物のサブミリメートル精度の神経刺激には十分である。
例示的な実施形態を続けると、本開示は、そのような高いＮＡがＯＦＵＳ５４００に高い横方向解像度を提供するだけでなく、焦点における高い焦点ゲインも提供することを表わす。横分解能の概念を音響分解能の光音響顕微鏡に適用することにより、ＯＦＵＳ５４００の横分解能は次の式で計算できる。
ここで、νは周囲音速、ｆは中心周波数である。この式により、ＯＦＵＳの理論的な横方向分解能Ｒ＿Ｌ＝７５μｍとなり、これはシミュレーション結果と一致する。さらに、高ＮＡ球面により、低いＦ値と高い焦点ゲインＧが得られる。これは、次の式に従って、焦点の圧力と球面上の圧力の比によって定義される。
この式において、ｆ，ｃ0，ｒ，及びｆNは、音響周波数、媒質内の音速、曲率半径、及びＦナンバー（ＳＯＡＰ５４１０の直径に対する曲率半径の比）を表す。水の減衰係数２．２×１０-3ｄＢ／（ｃｍ×ＭＨｚ2）を考えると、ＳＯＡＰ５４１０の有効焦点ゲインＧeff≒２８０を推定できる。この焦点ゲインは、ｆN＝１～４［１、３７～４１］の従来の超音波トランスデューサーの焦点ゲインと比較して５～９２倍高くなる。ＮＡを限界まで高めることにより、横方向分解能の精度を１５ＭＨｚで最大化することができ、従来の集束超音波トランスデューサーと比較して焦点の圧力を桁違いに改善することができる。
本明細書の例示的な実施形態によれば、光音響変換効率を最適化するために、ＨＳＭ５４４２、ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４、ＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４４６、及びＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を含む、記載された幾何学的設計に従ってＳＯＡＰを製造するための４つの材料の調製は、詳細は図５４Ｄに示されている。左から右、上から下に、熱収縮膜５４４２、カーボンナノチューブ－ＰＤＭＳ５４４４、カーボンナノ粒子－ＰＤＭＳ５４４６、及びろうそくのすす－ＰＤＭＳ５４４８を示す。スケールバー：５ｍｍ。ＨＳＭ５４４２の場合、弾性黒色ポリオレフィン自体が光吸収材と膨張材として同時に機能する。残りの３つの設計であるＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４、ＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４４６、及びＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８では、炭素ベースの材料が光吸収材料としてＰＤＭＳに埋め込まれており、拡張材料として機能する。これらは曲率面で混合物を形成し、光音響変換を最大化する。ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を製造する方法も本開示によって提供される。簡単に説明すると、金属球をろうそくのすすで１０～１５秒間コーティングし、ＰＤＭＳに浸す。次に、ＰＤＭＳを１１０℃で１５分間硬化することにより、このろうそくのすすの層をＰＤＭＳに転写する。金属ボールを除去すると、ＳＯＡＰのＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８が得られる。他のすべてのＳＯＡＰの作成方法については、後で説明する。
転写プロセスでＣＳとＰＤＭＳがよく混合されたマトリックスが生成されるかどうかを調査するには、ＳＯＡＰのＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を厚さ約２００μｍの薄層にスライスし、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して形態を検査する。厚さ２．７μｍのＣＳとＰＤＭＳからなる均一に混合された層が観察され、図５４Ｅの純粋なＰＤＭＳ層５４５２から分離されており、赤い破線がＣＳとＰＤＭＳの混合領域と純粋なＰＤＭＳ領域を分けている。スケールバー：１μｍ。この厚さは、ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８の最適な光音響変換のための理論上の厚さ２．１５μｍに非常に近い。ＳＥＭ画像から、ＣＳナノ粒子の直径は約５５ｎｍであることがわかる。さらに、ＣＳ層５４５２の堆積速度は約２００μｍ／ｓであり、これも文書化された速度と一致している。形態に加えて、ＣＳ－ＰＤＭＳ複合材料の構造の化学組成は、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）や光熱イメージングを使用してさらに研究できる。ＰＤＭＳにおけるＣ－Ｈ結合のフェムト秒ＳＲＳは、２つのビームが時間的に重なったとき（ｔ～０秒）、特定の位相（ここではＸチャネルとして割り当て）でのみ発生し、一方、ろうそくのすすのポンププローブ信号（Ｙチャネル）は、ほぼすべてのフェーズで発生し、減衰が非常に長くなる。したがって、１つの純粋なＣＳ５４５４サンプルとＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８サンプルを準備し、２つの材料の空間分布を化学的に区別することができる。結合画像５４５０は、ＣＳ及びＰＤＭＳの均一マトリクスが図５４Ｆによって作成されたことを示しており、赤：ＰＤＭＳ、シアン：ＣＳ、スケールバー：２μｍである。このような均一な混合物により、熱光吸収性ＣＳのＰＤＭＳへの迅速な移動が可能になり、これが効率的な光音響変換の基礎となる。
本明細書の例示的な実施形態によれば、４つの製造されたＳＯＡＰの光音響効率を特徴付けるために、８ｎｓパルス幅を有する１０６４ｎｍパルスレーザーを各設計に供給してＯＦＵＳ信号を生成することができる。図５４Ｇに詳述するように、０．６２ｍＪ／ｃｍ２のレーザー入力を用いて各ＯＦＵＳから生成された光音響信号の波形及び圧力を針ハイドロフォンによって記録した。ＨＳＭグラフ線５４６２は最小の振幅を提供し、ＣＮＴ－ＰＤＭＳグラフ線５４６４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳグラフ線５４６６と比較して５倍小さい。ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４６４とＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４６６からの信号は同じレベルであったが、ＣＳ－ＰＤＭＳグラフ線５４６８はそれらより６倍大きい約４８ＭＰａを生成した。これは以前の取り組みと一致している。ＦＦＴ変換によって波形を分析した後、ＯＦＵＳ信号の周波数スペクトルが得られ、図５４Ｈに詳細が示されている。ＨＳＭグラフ線５４７２の中心周波数は約３ＭＨｚ、ＣＮＴ－ＰＤＭＳグラフ線５４７４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳグラフ線５４７６の中心周波数は約５ＭＨｚであり、一方、ＣＳ－ＰＤＭＳグラフの線５４７８は、最高の中心周波数約１５ＭＨｚと、５ＭＨｚ及び３５ＭＨｚで定義された－６ｄＢ幅を持っている。これらの特徴に基づいて、いくつかの実施形態では、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰはさらなる実験の対象となるのに理想的である可能性がある。これは、他のＳＯＡＰと比較して光音響変換効率が最も高いためだけでなく、最も広い帯域幅により、最も厳密な焦点と最短のサイクル期間が提供され、時空間制御が向上するためでもある。このようにして、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰは、実証可能な高ＮＡ、高焦点ゲイン、及び神経刺激用の焦点におけるボード帯域幅を備えて製造できる。
本開示の別の態様によれば、ＯＦＵＳは、高い空間分解能及び経頭蓋効率を実証する。ＯＦＵＳが非侵襲的用途で頭蓋骨を貫通した後も高解像度を維持できることを実証するために、マウスの頭蓋骨の一部を貫通する前後でＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰの空間解像度を特徴付けることができる。図５５Ａは、針ハイドロフォンを備えたＳＯＡＰによって生成される超音波を特徴付けるための実験設定の概略図である。図５５Ａでは、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５５１２は、レーザーパルス５５１６で照射された水槽５５１４内に配置される。針ハイドロフォン５５１８は、ＳＯＡＰ５５１２の上部から超音波５５２０の振幅及びプロファイルを取得するために使用される。経頭蓋能力テストでは、マウスの頭蓋骨をＯＦＵＳのサイズ（厚さ～０．１５ｍｍ）に注意深くトリミングし、ハイドロフォン５５１８とＯＦＵＳの間に置く。図５５Ｂは、マウスの頭蓋骨を使用しない場合と使用する場合のＳＯＡＰ５５１２によって生成された正規化された音響波形のグラフである。ＯＦＵＳの経頭蓋効率は、図５５Ｂに示すように、経頭蓋超音波信号の振幅を元の信号の振幅と比較することによって計算することができる。これにより、経頭蓋信号が元の信号に正規化され、鮮明な表示が得られる。グラフ線５５２４におけるマウス頭蓋上のＯＦＵＳの経頭蓋効率は６９％であり、これは５ＭＨｚの従来の超音波トランスデューサーのグラフ線５５２６における３８％と比較して著しく高い。これは、ＯＦＵＳの帯域幅が広いためである。高周波成分は吸収及び反射されるが、低周波成分は依然として頭蓋骨を貫通する可能性がある。マウスの頭蓋骨の有無にかかわらず焦点サイズを特徴付けるために、図５５Ｃ及び５５Ｄで詳述するように、焦点を掃引して横方向及び軸方向のプロファイルを取得することができる。図５５Ｃは、それぞれグラフ線５５３６及び５５３４におけるマウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの横方向解像度のグラフである。図５５Ｄは、それぞれグラフ線５５４６及び５５４４におけるマウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの軸方向分解能のグラフである。ハイドロフォン５５１８はＸＹＺ移動ステージに取り付けられ、１２．７μｍのステップで移動してプロファイルを取得する。すべてのプロファイルは、比較のために元のプロファイルに正規化された。したがって、図５５Ｃ及び５５Ｄのデータは、マウス頭蓋骨の貫通後のプロファイルに明らかな変化を示していない。横方向及び軸方向の解像度は、それぞれの方向の半値全幅（ＦＷＨＭ）に従って定義される。ＯＦＵＳの横方向と軸方向の解像度は、それぞれ６６μｍと２８４μｍから８３μｍと２８７μｍに変化した。ＯＦＵＳの元の解像度はシミュレーションデータに近い。これらの分解能は、超音波神経変調で通常使用される低周波超音波の分解能（０．５ＭＨｚトランスデューサーの場合それぞれ約５ｍｍと約４０ｍｍ）と比較して２桁正確であることに留意されたい。
例示的な例を続けると、ＯＦＵＳの焦点領域の位置を調べるために、超音波焦点の伝播を光音響断層撮影システムによって視覚化することができる。レーザーパルスはＳＯＡＰ５５１２の底部から送出される。ＳＯＡＰ５５１２、マウスの頭蓋骨５５５０の位置、及び光音響信号は、１２８素子の超音波トランスデューサーアレイによって上部から記録され得る。合成された画像からは、焦点の位置に大きな変化は観察されなかった。図５５Ｅ～５５Ｆは、頭蓋骨５５５０がない場合（５５Ｅ）及び頭蓋骨５５５０がある場合（５５Ｆ）の、ＳＯＡＰ５５１２により生成された超音波伝播の画像である。白い破線はＳＯＡＰ５５１２を示す。赤い破線はマウスの頭蓋骨を示し、スケールバーは２ｍｍである。図５５Ｅ～５５Ｆでは、超音波トランスデューサーアレイの遅延を調整することによって、ＯＦＵＳの伝播プロセスを表面から焦点領域まで再構成することができる。比較のために、画像を元の伝播信号に合わせて拡大縮小した。これらの伝播結果は、緊密な焦点を生成する光音響信号の干渉プロセスを示すだけでなく、このプロセスがマウスの頭蓋骨の存在によって大きく影響されず、緊密な経頭蓋焦点を維持することも示している。
本開示の別の態様によれば、ＳＯＡＰは、一次皮質ニューロンの直接的かつ経頭蓋刺激を可能にする。ＳＯＡＰの高い光音響効率と緊密な経頭蓋焦点の実証により、ＳＯＡＰが培養ニューロンの反応を誘発できるかどうかも評価できる。例示的な例として、ＧＣａＭＰ６ｆを発現するラットからの初代皮質ニューロンをインビトロ研究に使用することができる。図５６Ａは、直接インビトロ刺激実験デバイスの概略図である。カルシウム信号は、図５６Ａに示すように、倒立広視野顕微鏡及びＣＭＯＳカメラ５６１８からなる蛍光画像化システム５６１０によって記録することができる。実験の前に、入力レーザー５６１４の光路をイメージングシステム５６１０と位置合わせする必要がある。次に、ＳＯＡＰ５６１２は、カスタマイズされたホルダーによってＸＹＺ移動ステージに取り付けられ、入力レーザー５６１４の光路と位置が合うように慎重に調整される。ＳＯＡＰは、培養ニューロン５６１６の約２ｍｍ上に配置できる。ＸＹ方向の焦点を見つけるために、９．９μｍの蛍光ビーズをインジケーターとして使用できる。レーザー５６１４がオンの場合、音響放射力によるビーズの動きによって超音波焦点の位置を視覚化できる。ビーズの動きに基づいて、直径の焦点は約１００μｍにあることが特定され、これはテストされた横方向の解像度と一致している。神経刺激の場合、パルス幅８ｎｓの１０６４ｎｍの単一パルスを送信でき、これにより光音響信号の単一サイクルが生成される。これに続いて、３７個のニューロンからのカルシウムのトレースが記録され、分析された（Ｎ＝７皿）。図５６Ｂは、５６２２及び５６２４でそれぞれ刺激の前後で３．５ｍＪ／ｃｍ２の入力レーザーエネルギーで観察されたカルシウム過渡状態の代表的な画像を示す。一番右のパネルは、５６２６での最大ΔＦ／Ｆを示している。ニューロンの活性化は視野の中心でのみ観察され、残りの部分は反応を示さなかった。これは、サブミリメートルの空間分解能を有するＳＯＡＰの局所刺激能力を実証した。３７個のニューロンの中には、一過性反応と長期反応という２種類の反応が観察される。図５６Ｃは、過渡的な動態の平均化されたカルシウムトレースのグラフである。図５６Ｃでは、これらの２つの応答は５秒の減衰時定数で分離されている。過渡応答は、τ＝４．２秒の減衰時定数を示す。反応は、レーザー開始直後の焦点でグラフ線５６３０によって観察され、最大ΔＦ／Ｆは３１％±８％（３つの培養からＮ＝６、データは平均±ＳＤ）であり、単一サイクル刺激が成功したことを示している。この１サイクルは０．２６μｓ続く。シングルサイクル刺激のデューティサイクルは、１秒間のサイクル期間として定義される。ＯＦＵＳは２．６×１０＾（－４）％という超低デューティサイクルを実現する。延長された応答の時定数はτ＝７．８秒である。これらのニューロンについては、図５６Ｄにおいてレーザー開始直後に６２％±１２％の最大ΔＦ／Ｆが観察される（４つの培養からのＮ＝３１）。図５６Ｄは、ＯＦＵＳ刺激の長期にわたる動態の平均化されたカルシウムトレースのグラフである。ここで、黄色の縦線はＯＦＵＳ刺激を示し、平均トレースは実線で、平均の標準誤差はグラフ線５６４０の影付きで示されている。これらの活性化は焦点で観察されるだけでなく、ネットワークを通じて伝播される。さまざまなダイナミクスの現象を理解するために、各応答の閾値を調べることができる。入力レーザーエネルギーは低く開始され、ニューロンの応答が記録されるまで増加する。図５６Ｅは、一時的刺激及び長期的刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。したがって、図５６Ｅは、５６５０における一時的及び長期の活性化を引き起こす平均化された閾値を示す。過渡応答の閾値は３．８±０．５ｍＪ／ｃｍ２であり、長時間応答（５．７±１．８ｍＪ／ｃｍ２）の閾値よりも大幅に低くなる（２サンプルｔ検定、７つの培養からのＮ＝３７、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ニューロンのこのような能力は機械的刺激の大きさを区別し、より長い時定数を伴うより高い振幅の刺激に対する応答はいくつかの報告とよく一致する。
例示的な例を続けると、ＳＯＡＰによる神経刺激の安全性を実証するために、ニューロンを繰り返し刺激できるかどうかも示される。このようにして、単一サイクル刺激を２分間隔で３回、同じグループのニューロンに与えることができる。レーザーエネルギーは３．５ｍＪ／ｃｍ2であった。図５６Ｆは、５０μｍのスケールバーでの各刺激の最大ΔＦ／Ｆの画像を示しており、それぞれ画像５６６２、５６６４、又は５６６６で観察される形態の目に見える変形又は損傷はない。図５６Ｇは、対応するカルシウムトレースを示すグラフである。同様の振幅の最大ΔＦ／Ｆを伴うトレースがグラフ線５６７０で記録され、繰り返しの刺激後にニューロンの機能的損傷が観察されないことが実証された。ニューロンの生存能力は、６．５ｍＪ／ｃｍ2及び８．４ｍＪ／ｃｍ2で繰り返し刺激した後にさらに実証された。これら２つのエネルギーレベルは、安全性実証のための余分なマージンを残すために、閾値より７０％高く選択された。したがって、ニューロンの５つのグループが各エネルギーレベルで研究された。各グループについて、５秒の間隔で１０個のパルスがデリバリーされた。各パルスには、１０Ｈｚの３サイクルが含まれていた。細胞生存率を計算するには、３０分間のインキュベーション後に焦点の２００×２００μｍ2の領域内の生細胞と死細胞をカウントする。対照として光のグループは実施しなかった。その結果、刺激群と対照群との間で細胞生存率に有意差は観察されなかった。これらのデータを総合すると、ＯＦＵＳがニューロンの形態や機能に損傷を与えることなく、繰り返しかつ確実にニューロンを刺激できることがわかる。
注目すべき点は、ＳＯＡＰで同様の振幅の神経反応を引き起こすのに必要な総エネルギーが、従来の超音波と比較して数桁少ないことである。神経刺激は、インビトロでのＳＯＡＰ実験とまったく同じ実験設定で、０．５ＭＨｚの従来の集束超音波トランスデューサーを使用して実行される。このプロセスは、超音波強度を低くし、持続波（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｗａｖｅ、ＣＷ）の超音波を短時間照射することから始まった。次に、最大ΔＦ／Ｆ＞１０％の神経反応が記録されるまで、強度を持続時間とともに段階的に増加させることができる。例示的な例として、実験設定において、５００ｍｓの継続時間で３．０２×１０4Ｗ／ｃｍ2の超音波強度が最大１８％のカルシウム反応を引き起こすことが実証された。従来のトランスデューサーと比較して、ＳＯＡＰはまったく同じ状況で６桁少ないエネルギーで、同様のレベルのニューロン応答を引き起こす。図５７は、同様の振幅のニューロン応答を引き起こすための実験条件及び総エネルギーを含む表である。図５７の表５７００に示すように、約１５％のカルシウム応答を誘発する従来のトランスデューサーを用いた以前の研究と比較しても、ＳＯＡＰは２桁少ないエネルギーをデリバリーした。これは、光音響効果の恩恵を受ける独自のシングルサイクル刺激モードによるＳＯＡＰの高い刺激効率を示している。
本開示の別の態様によれば、経頭蓋刺激能力を試験するために、マウスの頭蓋骨の一部を貫通することによって、ＯＦＵＳによる神経刺激をさらに研究することができる。図５８Ａは、経頭蓋インビトロ刺激実験デバイス５８１０の概略図である。例示的な例として、マウスの頭蓋骨の一部５８１２がＳＯＡＰ５８１４の曲率に埋め込まれた。ＳＯＡＰ５８１４はレーザーパルス５８１１によって上から照射され、ＧＣａＭＰ６ｆニューロン５８１６の蛍光イメージングはカメラ５８１８によって細胞培養皿の底から記録された。超音波焦点５８１３は、前述のように、移動ステージと蛍光ビーズによって位置合わせされた。したがって、図５８Ｂは、ＯＦＵＳによる経頭蓋刺激の前後のカルシウム信号の代表的な画像及びビデオ、及びそれぞれ５８２２及び５８２４における対応する最大ΔＦ／Ｆ画像を示す。一番右のパネルは、５８２６での最大ΔＦ／Ｆを示しており、全体で５０μｍのスケールバーが使用されている。視野の中央にあるニューロンのみが活性化され、高精度の刺激に対して経頭蓋焦点がまだしっかりと固定されていることが確認された。ＯＦＵＳによる単一サイクル刺激により、２７％±５％の最大ΔＦ／Ｆを有する成功した刺激が、図５８Ｃのグラフ線５８３０によって記録され（７培養からのＮ＝１８）、これは、経頭蓋ＯＦＵＳ刺激の平均カルシウム応答トレースのグラフである。ここで、黄色の縦線はＯＦＵＳ刺激を示し、平均トレースは実線で、平均値の標準誤差は影付きで示されている。直接刺激と経頭蓋刺激の閾値は図５８Ｄで比較され、これは単一パルスによる直接刺激と経頭蓋刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。直接刺激の平均閾値は５．４±１．５ｍＪ／ｃｍ２であったが、経頭蓋刺激の閾値は７．７±１．１ｍＪ／ｃｍ２であった（２サンプルｔ検定、１１培養からのＮ＝４６、＊＊＊ｐ＜０．００１）。マウス頭蓋骨の貫通の減衰によるこのレーザーエネルギーの増加は、ＯＦＵＳの経頭蓋効率の６９％という以前の結果と一致していた。まとめると、これらの結果は、ＯＦＵＳが皮質ニューロンを直接及び経頭蓋的に刺激する能力を示している。
本開示の別の態様によれば、ＯＦＵＳはインビボで高精度の神経刺激を仲介する。培養ニューロンの直接的かつ経頭蓋的な刺激に成功したことにより、本開示は、ＯＦＵＳが生きている動物のニューロンを活性化できるかどうかも含む。例示的な例として、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをインビボでの刺激に使用し、刺激の効果を免疫蛍光法及び電気生理学記録によって評価した。マウスをイソフルランで深く麻酔し、毛を剃って頭皮を露出させた。図５９Ａは、インビボでのＯＦＵＳ刺激の実験設定の概略図である。ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５９１０は、カスタマイズされた３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられ、ＸＹＺ移動ステージに取り付けられた。入力レーザー５９１２は上部からデリバリーされ、生成された超音波の焦点は定位座標（内側－外側：１．５、前－後：０．５）に基づいて運動皮質と注意深く位置合わせされた。したがって、図５９Ｂは、刺激領域５９２２及び対照領域５９２４内のｃ－Ｆｏｓ及びＤＡＰＩ染色の画像のセットである。参考として、赤：ｃ－Ｆｏｓ、青：ＤＡＰＩ、オレンジ色の輪郭：ＯＦＵＳ刺激領域、緑の輪郭：対側領域の対照群。スケールバー：中央及び下のパネル、５０μｍ。まず、刺激を受けた神経細胞のｃ－Ｆｏｓタンパク質を標識することで刺激領域を可視化する。強力なｃ－ｆｏｓ発現を誘導するために、１０Ｈｚで２０パルスのパルス列に対して１．０ｍＪ／ｃｍ2（ピークツーピーク圧力３９ＭＰａに相当）のレーザーエネルギーでＯＦＵＳ刺激を適用した。これは、３３％のデューティサイクルで３０分間続いた。ｃ－Ｆｏｓの発現を最大化するためにマウスを１時間休ませた。次にマウスの脳を抽出し、１０％ホルマリンで２４時間固定した。厚さ１５０μｍの脳スライスをｃ－ＦｏｓとＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。ＯＦＵＳ刺激領域５９２２で観察されたｃ－Ｆｏｓ陽性細胞は、対側領域で対照群５９２４よりも多かった。次に、ＯＦＵＳ群５９２２及び対照群５９２４におけるｃ－Ｆｏｓ陽性細胞の割合を計算した。図５９Ｃは、ｃ－Ｆｏｓ陽性ニューロンのパーセンテージについての統計分析を伴うグラフ５９３０である。パーセンテージは、対照と比較して、ＯＦＵＳグループで有意に増加した（２サンプルｔ検定、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１）。重要なのは、ｃ－Ｆｏｓ信号が直径約２００μｍの領域に限定されており、従来の圧電トランスデューサーベースの経頭蓋超音波刺激（１～５ｍｍ）と比較して優れた空間分解能を示していることである。さらに、ｃ－Ｆｏｓの発現は標的部位に限定されていた。この領域の大きさはＯＦＵＳの焦点サイズに近かった。これは、ｃ－Ｆｏｓの発現がＯＦＵＳの焦点によって直接誘導されたことを示している。間接的な刺激による、標的領域の外側では有意なｃ－Ｆｏｓ発現は観察されなかった。これらの結果は、ＯＦＵＳが高い空間分解能で非侵襲的にニューロンの反応を直接誘発する能力を裏付けている。
例示的な実施例を続けると、ＯＦＵＳ刺激による機能的結果のさらなる評価が、筋電図検査（ＥＭＧ）法を用いて行われた。ＳＯＡＰ５９１０の焦点はマウスの脳の一次運動野に合わせられ、筋肉のけいれんを引き起こした。筋肉活動を記録するために、図５９Ａに詳述するように、ＥＭＧ電極５９１４を大腿二頭筋と平行に後肢に挿入し、接地電極を尾に挿入した。その結果、１．０ｍＪ／ｃｍ2で２秒の持続時間のレーザーパルス列がＳＯＡＰ５９１０にデリバリーされ、同時に図５９Ｄに示されるように対側後肢から強いＥＭＧ応答（０．４５８±０．０３ｍＶ）が記録された。これは、２秒のＯＦＵＳ刺激５９４２及び光制御なしグループ５９４４の代表的なＥＭＧ記録である（オレンジ色のボックス：レーザーパルス列）。これらのＥＭＧ信号には、レーザーの開始とＥＭＧ応答の間に通常約６１±６ｍｓの遅延があることに留意されたい。バンドパスフィルターと全波整流器で処理した後、ＥＭＧ信号のエンベロープが図５９Ｅにプロットされた。これは、バンドパスフィルター、全波整流器、及びＯＦＵＳ刺激５９４２及び非光の対照群５９４４も測定したエンベロープ後の代表的なＥＭＧ信号である。超音波の聴覚効果によって引き起こされるＥＭＧ反応の可能性を排除するための対照として、定位座標に基づいて体性感覚皮質を刺激した。有意な反応は観察されなかった。この結果は、ＥＭＧ反応が超音波の聴覚効果ではなく、ＯＦＵＳ刺激によって直接誘発されることを示唆している。
本開示の別の態様によれば、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によるＯＦＵＳ刺激の安全性を評価することができる。例示的な例として、ＥＭＧ記録後、マウスを屠殺し、脳を抽出して固定した。厚さ５μｍの脳スライスを１５０μｍごとに取得し、標準的なＨ＆Ｅ染色を実行した。次に、すべての脳スライスをスライススキャナーで検査し、標的領域と対側領域の対照群とを比較した。図５９Ｆは、ＯＦＵＳ群５９６２及び対照群５９６４の安全性評価のためのインビボ刺激後の組織学的結果を詳述する一組の画像である。そこでは、これらの群間で細胞の形態の有意な変化は観察されなかった。これは、ＯＦＵＳ刺激がマウスの脳に目に見える損傷を誘発しないことを示している。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＳＯＡＰによって生成された超音波場は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標） Ｒ２０１９ｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、マサチューセッツ州）上のオープンソースのｋ－Ｗａｖｅツールボックスによって２Ｄでシミュレートされた。シミュレーションでは吸収は考慮されなかった。ＳＯＡＰは伝播媒体として水中に超音波を届けた。バッキング材料を空気と設定した。密度と音速はそれに応じて定義された。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＨＳＭ－ＳＯＡＰ５４４２を製造して、曲率を形成するために、熱収縮チューブ（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ、６３６３Ｋ２１４）に直径１２．７ｍｍのスチールビーズ（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ、９５２９Ｋ２２）を充填し、ヒートガンで加熱して完全に収縮させた。その後、チューブをスチールビーズの大円から２ｍｍ離れたところで切断し、ＨＳＭ－ＳＯＡＰを取得した。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５４４６を製造するには、５重量％多層カーボンナノチューブ（ＶＷＲ、ＭＦＣＤ０６２０２０２９）及びＣＮＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、６３３１００－２５Ｇ）は、ＰＤＭＳベース及び硬化剤マトリックス（重量比１０：１、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４）とそれぞれ混合した。この混合物を、直径１２．７ｍｍ、焦点距離２ｍｍで設計された３Ｄプリントされた型に注ぎ、真空中で３０分間脱気した。完全に硬化したＣＮＴ－ＰＤＭＳ及びＣＮＰ－ＰＤＭＳサンプルを得るために、混合物をオーブンで６０℃まで２．５時間加熱してから、型から取り出した。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を製造するために、直径１２．７ｍｍのスチールビーズをパラフィンワックスのろうそくの炎の中心に１０～１５秒間置き、火炎合成されたろうそくのすすのナノ粒子で完全にコーティングした。次いで、コーティングされたビーズを、脱気したＰＤＭＳベース及び硬化剤マトリックス（重量比１０：１）に浸漬し、ＰＤＭＳマトリックスの表面がビーズの大円面よりも２ｍｍ低く残るように調整した。ヒートプレート上で１１０℃で１５分間加熱した後、硬化サンプルが得られた。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、超音波の生成及び特性評価に、１０６４ｎｍで８ｎｓのパルスを有するＱスイッチＮｄ：ＹＡＧレーザー（Ｑｕａｎｔｅｌ Ｌａｓｅｒ、ＣＦＲ ＩＣＥ４５０）が含まれ、光音響信号を生成するためにＳＯＡＰにデリバリーされた。レーザーはファンクションジェネレーター（３３２２０Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ）によって繰り返し周波数１０Ｈｚで変調された。超音波圧力とプロファイルの測定には、４０μｍの針状ハイドロフォン（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｃｏｕｓｔｉｃ、ＭＨ００４０、５～４０ＭＨｚの範囲に最適化）、水中プリアンプ、及びＤＣカプラーで構成されるシステムが使用された。次に、信号を超音波パルサー受信機（Ｏｌｙｍｐｕｓ、モデル５０７３ＰＲ）で増幅し、４回平均した後デジタルオシロスコープ（Ｒｉｇｏｌ、ＤＳ４０２４）で収集した。針ハイドロフォンの先端は生成された焦点よりも小さいため、取得されたデータＰpeakは焦点内の圧力の一部のみを反映している。超音波焦点上の実際の圧力を推定するために、２５．４μｍステップを実行して、焦点領域のＦＷＨＭにわたる圧力をマッピングした。データを平均して空間平均圧力Ｐaveragedを取得し、係数Ｃを次の方程式Ｃ＝Ｐaveraged／Ｐpeakで取得した。圧力がハイドロフォンの動的上限に達した後、現在の圧力Ｐ0を記録し、信号の飽和とデバイスの損傷を避けるためにハイドロフォンの焦点を外した。記録された圧力はＰ0-outである。次に、レーザーエネルギーを増加させ、圧力Ｐx-outを記録した。現在のエネルギー入力によって生成される焦点Ｐxの圧力は、空間圧力分布が一定であるため、次の方程式Ｐx＝（Ｐ(x-out)／Ｐ(0-out)）×Ｐ0によって推定できる。最終的に推定される空間平均圧力は、Ｐxに係数Ｃを乗算することによって取得される。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、ＳＥＭイメージング（Ｚｅｉｓｓ、Ｓｕｐｒａ５５ＶＰ）の前に、ＳＯＡＰの薄い断面スライスがＡｕ／Ｐｄで１０秒間スパッタリングされ、アルミニウムスタブ上に取り付けられた。ＳＯＡＰのＳＥＭ画像は、加速電圧として３ｋＶ、開口サイズ２０μｍで得られる。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＳＲＳ及び光熱イメージングでは、８０ＭＨｚフェムト秒パルスレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐｈｙｓｉｃｓ、ＩｎＳｉｇｈｔＸ３）が使用され、マルチモーダルイメージングシステムに調整可能なビーム（６８０ｎｍ～１３００ｎｍ）と同期ビーム（１０４５ｎｍに固定）が提供される。ＰＤＭＳとろうそくのすすを画像化するために、固定波長ビームとともに調整可能なビームをポンプビームとして８０１ｎｍに設定した。Ｃ－Ｈ結合のフェムト秒誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡用のストークスと、ろうそくのすすのポンププローブ顕微鏡用のプローブビームを同時に使用するためである。ストークス／プローブビームが音響光学変調器（Ｉｓｏｍｅｔ社、１２０５ｃ）によって変調された後、２つのビームがダイクロイックミラーによって結合され、実験室で作成されたレーザー走査型顕微鏡に向けられた。２つのビーム間の時間的遅延は、電動遅延ステージによって制御された。６０倍の水対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＵＰｌａｎＡｐｏ６０ＸＷ、ＮＡ＝１．２）は、共線ビームをサンプル上に集束させた。サンプル上の各ビームのパワーは２ｍＷである。２つのビームはオイルコンデンサー（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ａｐｌａｎａｔ Ａｃｈｒｏｍａｔ１．４、ＮＡ＝１．４）によって前方向に集められ、次にショートパスフィルターによってフィルターされた。フィルタリング後、ポンプビームのみが実験室で製作された共振増幅器を備えたフォトダイオードによって検出された。位相感応型ロックイン増幅器（Ｚｕｒｉｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＭＦＬＩ）は、変調伝達に従って、誘導ラマン損失信号及びポンププローブ信号の検出されたポンプビームを復調した。したがって、ｘ－ｙ－ｔ画像で構図を測定することができる。
本開示によって提供される例示的な例によれば、光音響トモグラフィーシステムは、カスタマイズされた１２８素子のトランスデューサーアレイ（Ｌ２２－１４ｖ、Ｖｅｒａｓｏｎｉｃｓ社、帯域幅５０％）、及び１２８チャンネルの超音波データ収集システム（Ｖａｎｔａｇｅ１２８、Ｖｅｒａｓｏｎｉｃｓ社）からなる。ＰＡＴシステムは、ファンクションジェネレーターと遅延ジェネレーター（ＤＧ５３５、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってＱｕａｎｔｅｌと同期される。ファンクションジェネレーターはＱｕａｎｔｅｌをトリガーし、遅延ジェネレーターは１０Ｈｚの繰り返しレートのパルスモードでトリガーした。遅延発生器は、光音響信号が生成された後、異なる時間遅延で超音波信号を受信するために、別の調整可能な遅延をＶａｎｔａｇｅ１２８に追加した。遅延を調整することで、光音響信号の伝播過程を可視化できる。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、胚ニューロンの培養には、５０μｇ／ｍｌのポリ－Ｄ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングされた３５ｍｍガラス底の皿を、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター内で一晩培養し、ニューロンを播種する前に、滅菌水で３回洗浄した。一次皮質ニューロンは、性別を問わずＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（Ｅ１８）に由来し、パパインで消化された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、５％熱不活化ウマ血清（ＨＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、２ｍＭグルタミンダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む培地は、解離した細胞を洗浄及び粉砕するために使用された。細胞を細胞培養皿（直径１００ｍｍ）で湿潤インキュベーター内３７℃で３０分間培養し、線維芽細胞とグリア細胞を除去した。ニューロンを含む上清を収集し、１０％ＦＢＳ＋５％ＨＳ＋２ｍＭグルタミンＤＭＥＭ培地を含むポリ－Ｄ－リジンでコーティングした皿に播種した。１６時間後、培地を２％Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１％Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、及び２ｍＭグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に交換した。グリアの増殖を防ぎ、ＧＣａＭＰ６ｆを発現させるため、５μＭの５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び最終濃度１μｌ／ｍｌのＡＡＶ９．Ｓｙｎ．Ｆｌｅｘ．ＧＣａＭＰ６ｆ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０ウイルス（Ａｄｄｇｅｎｅ、マサチューセッツ州、米国）をそれぞれ、５日目に培地に添加した。培地の５０％を３～４日ごとに新しい培地と交換し、１０～１３日後にニューロンを刺激に使用した。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、インビトロでのＯＦＵＳ刺激は、デバイスの位置を微調整するために、３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられたＳＯＡＰを移動ステージまで移動させることを必要とした。Ｑｕａｎｔｅｌレーザーは、光音響信号生成のために自由空間のＳＯＡＰにデリバリーされた。１０倍対物レンズ（Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ、０．３ＮＡ、１６ｍｍＷＤ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を備えた倒立顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｕ、Ｎｉｋｏｎ）が、４７０ｎｍＬＥＤ（Ｍ４７０Ｌ２、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）で照明され、緑色蛍光タンパク質用のフィルターセットで濾過され（ＭＤＦ－ＧＦＰ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）、ＣＭＯＳカメラ（Ｚｙｌａ５．５、Ａｎｄｏｒ）で撮影され、蛍光イメージングに使用された。刺激前に、超音波の焦点を９．９μｍ緑色蛍光ビーズ（Ｇ１０００、Ｄｕｋｅ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｒｐ）で視覚化し、視野の中心に調整した。次に、ニューロン培養皿のＸ方向とＹ方向の同じ位置、ニューロンのＺ方向２ｍｍ上にＳＯＡＰを浸した。カメラはレーザーと同期した。カメラが２０Ｈｚで２０秒間記録している間、５秒目にレーザーが照射された。実験後、イメージングシーケンスの蛍光強度をＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉ）で分析した。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、細胞生存率の研究のために、各エネルギーレベルで各皿においてニューロンの５つのグループがランダムに選択された。一方、ニューロンの皿には、選択されたエネルギーレベルで合計３０パルスのＯＦＵＳがデリバリーされた。連続する３サイクルごとに、５秒間隔で１０Ｈｚでデリバリーされた。生細胞と死細胞は、焦点の２００×２００μｍ2の領域内で計算された。すべてのニューロンはＧＣａＭＰ６ｆで標識された。死細胞を１μＬ １００μｇ／Ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｐ１３０４ＭＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）溶液で１５分間染色した。細胞を３０分間インキュベートした後、分析のために蛍光顕微鏡で画像化した。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、インビボでのＯＦＵＳ刺激には、最初に酸素中５％イソフルランで麻酔をかけた成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１４～１６週齢）が関与し、その後、１．５～２％イソフルランで標準定位フレームに固定された。麻酔の深さを決定するために尾部のピンチが使用された。体温を維持するために、加熱パッドをマウスの下に置いた。標的となった脳の毛が除去された。３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられたＳＯＡＰは、マウスの標的運動野に位置合わせされた。Ｑｕａｎｔｅｌレーザーは、１０Ｈｚの繰り返し率で自由空間のＳＯＡＰにデリバリーされた。ｃ－ｆｏｓ発現の場合、パルス列は３３％デューティサイクル（２秒レーザーオン、４秒レーザーオフ）で３０分間デリバリーされた。ＥＭＧ記録では、２秒のパルス列がデリバリーされた。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＥＭＧの記録及び処理には、ＳＯＡＰを一次運動野と位置合わせすることが含まれる。筋肉活動を記録するために、針電極を後肢大腿二頭筋の皮下に挿入し、接地電極をフットパッドに挿入した。対照群は、刺激部位と同側の体幹部で記録された。ＥＭＧ信号はＭｕｌｔｉ－Ｃｌａｍｐ７００Ｂアンプ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録し、１～５０００Ｈｚでフィルター処理し、Ａｘｏｎ ＤｉｇｉＤａｔａ１，５５０デジタイザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）でデジタル化し、ノイズエリミネーター（Ｄ－４００、Ｄｉｇｉｔｉｍｅｒ）でフィルター処理した。ＥＭＧ信号は０．５～５００Ｈｚのバンドパスフィルターと全波整流でフィルター処理された。次に、処理された信号のエンベロープがプロットされた。
本開示によって提供される例示的な例によれば、刺激セッション後に免疫蛍光染色を行い、ｃ－ｆｏｓ発現を最大化するためにマウスを１時間休ませ、次に、これを屠殺し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１倍、ＰＨ７．４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）溶液及び１０％ホルマリンを経心的に灌流した。固定後、脳を摘出し、１０％ホルマリン溶液中で２４時間固定した。固定したマウスの脳を１倍ＰＢＳ溶液に浸漬した。脳を、振動組織スライサー（ＯＳＴ－４５００、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、厚さ１５０μｍの冠状切片にスライスした。脳スライスをブラシで１０％ホルマリン溶液に静かに移し、さらに２４時間固定し、その後５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）－ＰＢＳ溶液で室温で３０分間ブロックした。スライスを０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１６１０４０７、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）－ＰＢＳ溶液で１０分間透過処理し、濃度２μｇ／ｍＬの抗ｃ－ＦｏｓＲａｂｂｉｔ抗体（４３８４Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４℃で一晩インキュベートした。一次培養後、スライスを、濃度１μｇ／ｍＬの二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び濃度５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに暗所、室温で２時間インキュベートした。ステップ間で、スライスを０．２％Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０、東京化成工業）－ＰＢＳ溶液で５分間４回洗浄した。蛍光画像は、ＦＶ３０００共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて取得した。共焦点画像は、ＤＡＰＩの場合は４０５ｎｍ、ｃ－Ｆｏｓの場合は４８８ｎｍの励起波長で取得された。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、刺激セッション後に組織学的染色が関与し、マウスは直ちに屠殺され、前述のように灌流され、固定された。脳をパラフィンに包埋し、１５０μｍステップで５μｍの厚さにスライスして冠状切片を得た。スライシングと標準的なＨ＆Ｅ染色は、Ｍａｓｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂｒｉｇｈａｍ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｅで実施された。組織像は、ＶＳ１２０自動スライドスキャナー（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で取得した。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、温度プロファイルを記録するために熱電対（ＤＩ－２４５、ＤａｔａＱ）が使用された。熱電対の先端は、それぞれＳＯＡＰの焦点、表面に配置された。記録中、エネルギー６．２ｍＪ／ｃｍ２のレーザーを１０Ｈｚで１０秒間オンにした。表面に光がないグループもベースラインとして記録された。
本開示によって提供される例示的な例によれば、統計分析に関して、音響波形、カルシウムトレース、及び電気生理学的トレースが、Ｏｒｉｇｉｎ２０２０を使用してプロットされた。周波数スペクトルのＦＦＴ変換はＭＡＴＬＡＢ（登録商標） Ｒ２０１９ｂを使用して実行された。データは平均値±平均値の標準誤差で表示される。カルシウム画像はＩｍａｇｅＪで処理される。すべての比較データは２サンプルのｔ検定で分析される。ｐ値は次のように定義された：ｎ．ｓ．、有意ではない（ｐ＞０．０５）；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
ＯＦＵＳの生物学的安全性は、神経調節を成功させるために非常に重要であることに留意されたい。これらの例示的な実施例では、生体安全性は、インビトロでの繰り返し刺激後の細胞生存率及び損傷が結論付けられなかったインビボの組織学的画像化によって評価された。さらに、キャビテーションと熱蓄積は、超音波曝露による潜在的な２つの主要な生体影響である。安全性を評価するために、機械的指標を計算し、ＯＦＵＳの温度上昇をテストした。インビボ実験のレーザー入力では、マウスの脳に伝達される推定ピークツーピーク圧力３９ＭＰａは、組織損傷が以前に報告されなかったレベルを下回っている。ＯＦＵＳのピーク負圧は１８ＭＰａと測定され、これは軟組織内に気泡雲が発生する閾値（２５～３０ＭＰａ）を下回っている。脳組織の音響減衰係数０．９１ｄＢ／（ｃｍ×ＭＨｚ）［５３］を使用してＭＩを推定し、ＯＦＵＳ刺激のＭＩ＝３．３と計算された。比較すると、ＭＩ＝３．９でパルス幅１．４μｓの短パルス超音波照射では、脳組織にまれにキャビテーション関連の損傷が生じることが報告されている。したがって、例示的な実施形態の０．２６μｓというより短いパルス持続時間及びより低いＭＩは、組織キャビテーションの損傷閾値を十分に下回るはずである。熱的安全性を確保するために、温度プロファイルは熱センサーで記録された。６．２ｍＪ／ｃｍ2のレーザーエネルギーが適用されたが、これは、本開示のこの態様に関する例示的な実施例に従って使用される最高エネルギー閾値と一致した。ＯＦＵＳは１０秒間デリバリーされ、ＯＦＵＳの焦点、ＳＯＡＰの表面、及びＳＯＡＰの表面に光が当たらない対照群でテストされた。１０秒の加熱後、表面で最大０．４Ｋの温度上昇が観察された。したがって、この研究では、最長持続時間が２秒の場合、ＯＦＵＳの焦点では０．１Ｋを超える顕著な温度上昇は引き起こされない。さらに、考えられる最高の温度上昇は、ニューロンの活動を調節するのに必要な閾値（ΔＴ≧５Ｋ）［５５］をはるかに下回っており、細胞に損傷を与えることはない。したがって、ＯＦＵＳは生物学的証拠と物理的証拠の両方によって組織に対して安全であることが証明されている。
本開示のこの態様の例示的な実施例によれば、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰが開発され、ＯＦＵＳが生成され、空間分解能及び経頭蓋能力を特徴付け、インビトロ及びインビボでのミリメートル未満の経頭蓋神経刺激が検証された。光音響効果による大きなＮＡにより、ピエゾベースの低周波超音波の到達範囲を超える６６μｍでの厳密な焦点が可能になった。広帯域放射により、ＯＦＵＳの６９％の経頭蓋効率がマウスの頭蓋骨の一部に浸透することが可能になった。インビトロでのＧＣａＭＰ６ｆ標識ラット皮質ニューロンの直接刺激及び経頭蓋刺激を蛍光イメージングで記録した。神経反応を引き起こすためのＯＦＵＳの総超音波エネルギー入力は、従来の超音波よりも２～６桁低く、高い刺激効率を実現する。ＯＦＵＳによるインビボでの生きたマウスの運動皮質における非侵襲的刺激の成功は、免疫蛍光法とＥＭＧ記録によって実証された。ＯＦＵＳ刺激の安全性は、生物学的には細胞生存率と組織学によって、また物理的にはＭＩと温度上昇によってインビトロとインビボの両方で評価された。
ＯＦＵＳ刺激に関する重要な観察は、刺激が聴覚交絡効果などの間接効果ではなく音響波の直接効果によって引き起こされたことであることに留意されたい。インビトロでの実験では、培養ニューロンは聴覚回路なしでＯＦＵＳ刺激に反応していた。インビボでの研究では、ｃ－Ｆｏｓ陽性ニューロンは、直接刺激に対応する刺激部位に位置していた。さらに、ＥＭＧ記録において体性感覚皮質を刺激された対照群では反応が記録されず、蝸牛への骨伝導がプロセスに関与していないことを示した。このような観察は、報告されている超音波による直接刺激と一致する。
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰは、単一の固定超音波場を提供するデバイスである。複雑な脳機能は単一の部位によって制御されるわけではないが、複数の部位を刺激することで調節や治療の可能性が高まる。パターン化された神経調節を実現でき、例えば、治療のための運動制御の選択性をさらに高めることができる。製造プロセスの柔軟性の強さにより、ＯＦＵＳデバイスはマルチサイト神経調節のための大規模なアレイにスケールアップできる。従来のＰＺＴベースの超音波大規模アレイでは、電磁干渉を最小限に抑えるために各要素に接続された大規模なケーブルが銅で製造されており、これがウェアラブル臨床デバイスの適用をさらに妨げている。それに対して、軽量のＯＦＵＳデバイスは、長時間の治療における快適性を向上させる。金属部品を一切使用しないこのようなデバイスは、リアルタイム磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）ガイダンス及び機能的ＭＲＩモニタリングとの互換性をさらに向上させる。これらは、臨床応用におけるリアルタイムの複数部位刺激と治療評価の閉ループに役立つ。
特に、ＯＦＵＳは入力光のエネルギーを向上させるだけで高い超音波強度を提供できる。これは、従来の高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）の代わりにＯＦＵＳを超音波治療に適用する機会を提供する。例えば、ヒストトリプシーは、キャビテーションベースの治療のために、低周波（＜３ＭＨｚ）、短パルス（＜１０サイクル）の高強度超音波（＞２０ＭＰａ）を組織にデリバリーする。しかし、ＨＩＦＵは特定の強度に達するために高電圧を必要とし、その一方で狭い帯域幅（＜３０％）、長いリングダウン時間（＞５サイクル）、及び絶縁破壊のリスクをもたらす［７０］。ＳＯＡＰによって生成されたＯＦＵＳは、高周波数、高強度、正確なシングルサイクル制御、及び２００％の広帯域幅で実証されている。このニッチは、時空間制御が改善され、周囲組織への損傷と熱蓄積が最小限に抑えられる、超音波手術におけるＯＦＵＳ応用の将来の方向性をハイライトしている。
本開示の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰによって生成されたＯＦＵＳは、小動物及び脳サブ領域における神経学的研究に向けて非侵襲的にサブミリメートルの精度を利用する。製造における柔軟性、高い時空間分解能と強度、及び電磁適合性の向上により、超音波手術、薬物デリバリー、疼痛管理などの臨床応用がさらに可能になる。したがって、この研究は、ＯＦＵＳが神経科学研究及び臨床治療における貴重なプラットフォーム技術として利用される可能性が非常に高いことをハイライトしている。
当業者であれば、上記の説明を読むと、本開示の多くの変更及び修正が自明あるが、例示として図示し説明した特定の実施形態は、決して限定的なものとみなされるものではないことを理解されたい。さらに、特定の実施形態を参照して主題を説明したが、当業者であれば、本開示の精神及び範囲内での変形を想到できる。前述の例は単に説明を目的として提供されたものであり、本開示を限定するものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。
本発明の概念は、その例示的な実施形態を参照して特に図示及び説明されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変更を加えることができることが当業者には理解される。本発明の概念は、以下の特許請求の範囲によって定義される。
特許
代理人整理番号 ＢＯＳ－ＯＯＩＯＵＳ
［発明の名称］光音響刺激のための方法及びデバイス
［技術分野］
［０００１］
本出願は、２０２１年３月９日に提出された仮出願番号６３／１５８，５６６及び２０２１年４月２０日に出願された仮出願番号６３／１７７，０２９の利益を主張し、その出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
［０００２］
本開示は、光音響刺激に関し、特に、生物療法のための光音響刺激を操作及び投与するためのデバイス及び方法に関する。
［背景技術］
［０００３］
集束超音波は、低侵襲治療及びメカニズムの研究において大きな注目を集めている。高効率の生体変調には１ＭＨｚ未満の周波数が適している。しかし、典型的なサブＭＨｚ超音波技術は、空間閉じ込めが数ミリメートルと不十分で、デバイス直径が約２５ｍｍと大きいため、回折限界が生じ、さらなる応用が著しく妨げられる。低周波フレックス張力共振器、トンピルツトランスデューサー、厚み型共振器など、小型の低周波トランスデューサーを製造する努力がなされてきた。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
［０００４］
しかし、ミリメートルスケールの横方向寸法を持つこれらのトランスデューサーの製造は困難であり、高価であると考えられている。デバイスサイズが大きいことに加えて、トランスデューサーベースの集束超音波技術は、数百ｋＨｚの超音波に対してミリメートルスケールでの回折限界焦点体積が大きいという問題がある。
［課題を解決するための手段］
［０００５］
一態様によれば、テーパー状ファイバー光音響エミッターが提供される。エミッターには、レーザーパルスを放射するように構成されたナノ秒レーザーと光ファイバーが含まれる。光ファイバーには、光を超音波に変換するように構成されたコーティングが施された先端が含まれる。先端コーティングは、拡散層と熱膨張層、又は単一の熱膨張層を含むことができる。拡散層には、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子が含まれる。熱膨張層には、レーザーパルスを変換して超音波を発生するように構成されたグラファイトとポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、又はカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びＰＤＭＳが含まれる。超音波の周波数は、拡散層の厚さと膨張層のＣＮＴ濃度で調整される。
［０００６］
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成されている。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
［０００７］
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であってもよい。
［０００８］
別の態様によれば、テーパー状ファイバー光音響エミッタ（ＴＦＯＥ）を動作させる方法は、ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射するステップと、先端を有する光ファイバーでレーザーパルスをガイドするステップとを含む。先端は、エポキシと酸化亜鉛を含む拡散層と熱膨張層、又はカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）とポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む単一の熱膨張層でコーティングされる。この方法はさらに、拡散層を使用して、局所的な加熱を制限しながらレーザーパルスを拡散すること；熱膨張層を用いて拡散光を変換して超音波を生成すること；及び超音波の周波数を、拡散層の厚さと膨張層のＣＮＴ濃度で調整する。
［０００９］
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
［００１０］
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得る。
［００１１］
別の態様によれば、光音響材料を介して細胞を刺激する方法が提供される。この方法は、超音波を発生するように構成された光吸収体及び拡張マトリックスを有する光音響材料を提供すること；光音響材料をフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成すること、ここで、フィブロインヒドロゲルは、超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される；及びフィブロインが超音波に応答して神経成長を刺激するように、光音響フィルムにレーザーパルスを放射することによって超音波を発生させることを含む。
［００１２］
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
［００１３］
いくつかの例示的な実施形態では、方法は、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を変更することを含む、超音波の周波数を生成することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、フィブロインヒドロゲルはシルクを含み得る。
［００１４］
別の態様によれば、細胞を刺激するためにテーパー状ファイバー光音響エミッタ（ＴＦＯＥ）を動作させる方法が提供される。この方法は、ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射すること、及び先端を有する光ファイバーでレーザーパルスをガイドすることを含む。次に、この方法は、ＣＮＴをフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成するステップを含み、フィブロインヒドロゲルは超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される。
［００１５］
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
［００１６］
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を変更することを含む、拡散光を変換して超音波を発生することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得る。
［００１７］
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、エポキシ及び酸化亜鉛を含む拡散層でコーティングされた先端をさらに備える。拡散層は、局所的な加熱を制限しながらレーザーパルスを拡散する。
［００１８］
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む熱膨張層でコーティングされた先端をさらに含む。熱膨張層は拡散光を変換して超音波を発生し、フィブロインが超音波に応答して細胞内の神経成長を刺激する。いくつかの例示的な実施形態では、フィブロインヒドロゲルにはシルクが含まれる。
［００１９］
別の態様によれば、光音響効果を介した高精度細胞的変調のためのデバイスが提供される。いくつかの例示的な実施形態では、このデバイスは、テーパー状のファイバー光音響エミッターを含む。このデバイスには、レーザーパルスを放射するように構成できるナノ秒レーザーと、先端を備えた光ファイバーが含まれる。光ファイバーは、レーザーパルスをガイドするように構成でき、熱膨張層を含むコーティングを有することができる。熱膨張層は、レーザーパルスを変換して超音波を生成するように構成されたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含み得る。ＣＮＴをフィブロインヒドロゲルに埋め込むと、光音響フィルムを形成できる。フィブロインヒドロゲルはさらに、超音波に応答して神経成長を刺激するように構成することができる。超音波の周波数は、膨張層のＣＮＴ濃度の厚さに応じて調整できる。
［００２０］
いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスは、拡散層を含む先端部をさらに含む。拡散層は、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子を含むことができる。超音波の周波数は拡散層の厚さで調整できる。
［００２１］
いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスの光音響フィルムは平坦であり得る。いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスの光音響フィルムは湾曲していてもよい。いくつかの例示的な実施形態によれば、湾曲した光音響フィルムは、非侵襲的変調のための集束超音波を生成する。
［００２２］
本開示は、本開示の実施形態の非限定的な例として、言及された複数の図面を参照しながら、以下の詳細な説明でさらに説明される。いくつかの図面を通して、同様の参照番号は同様の部分を表す。
［図面の簡単な説明］
［００２３］
［図１Ａ］図１Ａは、光音響効果及び２層のファイバーベースの光音響エミッター（ＴＦＯＥ又はＴＦＯＥ）の設計の概略図である。
［図１Ｂ］図１Ｂは、ファイバーベースのエミッター及び注射針の側面図である。
［図１Ｃ］図１Ｃは、製造されたＴＦＯＥの側面図である。
［図１Ｄ］図１Ｄは、金属メッシュ上にキャストされたコーティング材料としての多層ＣＮＴ／ＰＤＭＳ混合物を示し、その後、パンチスルー法によりテーパー状ファイバーをコーティングする。
［図１Ｅ］図１Ｅ及び１Ｆは、ＴＦＯＥによって生成される代表的な音響信号をそれぞれ時間領域及び周波数領域で示し、１Ｅの斜線領域は、同じＴＦＯＥからの３つの測定値から得られた標準偏差を示す。
［図１Ｆ］図１Ｅ及び１Ｆは、ＴＦＯＥによって生成される代表的な音響信号をそれぞれ時間領域及び周波数領域で示し、１Ｅの斜線領域は、同じＴＦＯＥからの３つの測定値から得られた標準偏差を示す。
［図１Ｇ］図１Ｇは、本明細書の教示に従って単一ニューロン刺激を可能にするＴＦＯＥの概略図を示す。
［図１Ｈ］図１Ｈは、それぞれ５０ミリ秒及び１ミリ秒のレーザー励起中のＴＦＯＥ先端の表面温度のグラフである。
［図２Ａ］図２Ａ～Ｄは、拡散層１１６を修正することによる超音波周波数の制御を示す。図２Ａは、３６～１００μｍの拡散層（ＺｎＯ／エポキシ）及び１０９±２４μｍの吸収／熱膨張層（ＣＮＴ／ＰＤＭＳ）で製造されたＴＦＯＥからの時間領域の超音波信号の図を提供する。
［図２Ｂ］図２Ｂは、本発明の技術に従ってＴＦＯＥによって生成される超音波のグラフである。
［図２Ｃ］図２Ｃは、本発明の技術に従ってＴＦＯＥによって生成される超音波の周波数領域の別のグラフである。
［図２Ｄ］図２Ｄは、本発明の技術によるＴＦＯＥのＴＦＯＥの厚さによるピーク周波数のグラフである。
［図３Ａ］図３Ａ及び３Ｂは、それぞれ３６μｍ及び１００μｍのＴＦＯＥ拡散層コーティングを用いた場合の、周波数に対する膨張層の物理的厚さの影響のグラフである。
［図３Ｂ］図３Ａ及び３Ｂは、それぞれ３６μｍ及び１００μｍのＴＦＯＥ拡散層コーティングを用いた場合の、周波数に対する膨張層の物理的厚さの影響のグラフである。
［図４Ａ］図４Ａ～４Ｂは、光音響信号周波数を有効な吸収／膨張層の厚さの関数として示す。図４Ａは、異なる熱膨張層を有するＴＦＯＥの正規化された周波数スペクトルを示すグラフである。
［図４Ｂ］図４Ｂは、ＣＮＴ／ＰＤＭＳ濃度の関数としてプロットされたピーク周波数のグラフである。
［図５Ａ］図５Ａ～５Ｄは、音響角度分布の特徴を示す。図５Ａは、検出の概略図である。
［図５Ｂ］図５Ｂは、角度０°、±２５°、±５０°、及び±７５°で検出された音響のピークツーピーク振幅のグラフである。
［図５Ｃ］図５Ｃは、音響のピークツーピーク振幅の角度依存性のグラフである。
［図５Ｄ］図５Ｄは、これらの角度で検出された音響信号の周波数スペクトルのグラフである。
［図６Ａ］図６Ａ～６Ｇは、ＴＦＯＥによって誘導される細胞ソノポレーションの周波数依存性を示す。図６Ａは、レーザーパルストーンバーストの概略図である。
［図６Ｂ］図６Ｂは、ＴＦＯＥ処理中のＴＦＯＥ先端における温度変化のグラフである。
［図６Ｃ］図６Ｃは、ＴＦＯＥからの時間領域の光音響信号のグラフである。
［図６Ｄ］図６Ｄは、１０分間、周波数を変えてＴＦＯＥを処理したときの３０個の細胞の平均蛍光強度変化のグラフである。
［図６Ｅ］図６Ｅは、ＴＦＯＥ処理領域の蛍光イメージングの画像を含む。
［図６Ｆ］図６Ｆは、ＴＦＯＥ処置群及び対照群の蛍光イメージングの画像を含む。
［図６Ｇ］図６Ｅは、ＴＦＯＥ処置群と対照群との間の蛍光強度変化の比較のグラフである。
［図７］図７は、ＣＮＴ／シルクフィルム及び／又はロールを製造するための、官能化ＣＮＴ溶液を含むシルク溶液のキャスティング及び乾燥の図である。
［図８］図８は、製造されたＣＮＴ／シルクフィルム及び／又はロールからの表面官能化の成功を確認するゼータ電位のグラフである。
［図９］図９は、ＣＮＴ／シルクフィルムによって生成される広帯域音響波に関する音響測定の概略図である。
［図１０Ａ］図１０Ａ及び図１０Ｂは、図９によって生成された光音響波を示すグラフである。
［図１０Ｂ］図１０Ａ及び図１０Ｂは、図９によって生成された光音響波を示すグラフである。
［図１１］図１１は、光音響刺激がレーザー出力によって操作される場合の、７５μＪに固定されたパルスエネルギーのグラフである。
［図１２］図１２は、光音響刺激が埋め込まれたＣＮＴの濃度によって操作される場合の、２０μｇ／ｍＬに固定されたＣＮＴの濃度のグラフである。
［図１３Ａ］図１３Ａは、ニューロン／面積の関数としてのインビトロ形態を確認するグラフである。
［図１３Ｂ］図１３Ｂは、全長／面積の関数としてのインビトロ形態を確認するグラフである。
［図１３Ｃ］図１３Ｃは、それぞれ、対照、ＣＮＴ／シルク、及びシルクフィルム＋ＣＮＴグループについての細胞生存率を確認するグラフである。
［図１４］図１４は、Ｈ＆Ｅ染色による１０週齢のマウスのインビボ組織学を示す画像を含む。
［図１５］図１５は、生体適合性及び無視できるほどの熱影響を確認するパルス列を示す概略図を提供する。
［図１６］図１６は、経時的な温度の関数としてのＣＮＴ／シルク対単離シルクの性能を示すグラフである。
［図１７］図１７は、活性化領域を決定する光照射による光にさらされたときのＣＮＴ／シルクフィルムの性能の画像である。
［図１８］図１８は、活性化領域を決定する光照射による光にさらされたときのシルクフィルムの性能の画像である。
［図１９］図１９及び２０は、光にさらされたときのＣＮＴ／シルク、光にさらされなかったときのＣＮＴ／シルク、及び光にさらされたときのシルクフィルムの性能を経時的なΔＦ／Ｆ0の関数としてさらに示すグラフである。
［図２０］図１９及び２０は、光にさらされたときのＣＮＴ／シルク、光にさらされなかったときのＣＮＴ／シルク、及び光にさらされたときのシルクフィルムの性能を経時的なΔＦ／Ｆ0の関数としてさらに示すグラフである。
［図２１］図２１は、ラットの後根神経節外植片に適用したときの光音響刺激を経時的に示す概略図である。
［図２２］図２２は、ＣＮＴ／シルク光＋の画像である。
［図２３］図２３は、ＣＮＴ／シルク光－の画像である。
［図２４］図２４は、光照射を受けたときのガラス光対照群の画像である。
［図２５］図２５は、光照射を受けていないときのガラス光対照群の画像である。
［図２６］図２６は、面積の関数としての図２２～２５のグラフである。
［図２７］図２７は、ＢＤＮＦ濃度の関数としての図２２～２５のグラフである。
［図２８］図２８は、ＮＧＦ濃度の関数としての図２２～２５のグラフである。
［図２９］図２９は、コンピュータからの光音響刺激を使用して標本の脳を処置するために使用される場合に、時空間符号化及び復号化を可能にする多機能ニューラルインターフェースの画像である。
［図３０］図３０は、この動態を示す図である。
［図３１Ａ］図３１Ａ及び３１Ｂは、光媒介の低侵襲性ＰＮＳ刺激のための埋め込み型カフの画像例である。
［図３１Ｂ］図３１Ａ及び３１Ｂは、光媒介の低侵襲性ＰＮＳ刺激のための埋め込み型カフの画像例である。
［図３２］図３２は、図８のナノ複合アプローチを通じて光音響機能と統合されたヒドロゲル土台（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の図である。
［図３３］図３３は、本開示の光音響プロセスによって可能になる信頼性が高く再現可能な神経刺激を実証する前後の画像を含む。
［図３４Ａ］図３４Ａ～３４Ｄは、ＴＦＯＥ刺激に応答したＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロンの蛍光画像を示す。図３４Ａ及び３４Ｂは、それぞれ５０ミリ秒及び１ミリ秒のレーザー持続時間でＴＦＯＥによって刺激されたまばらな集団における蛍光画像及びカルシウムトレースである。
［図３４Ｂ］図３４Ａ及び３４Ｂは、それぞれ５０ミリ秒及び１ミリ秒のレーザー持続時間でＴＦＯＥによって刺激されたまばらな集団における蛍光画像及びカルシウムトレースである。
［図３４Ｃ］図３４Ｃは、ＴＦＯＥ刺激を３回繰り返した１つのニューロンの最大ΔＦ／Ｆ画像である。
［図３４Ｄ］図３４Ｄは、３つのニューロンの連続刺激の画像である。
［図３５Ａ］図３５Ａ～３５Ｃは、ＴＦＯＥ刺激のパルスエネルギー依存性の画像である。図３５Ａ～Ｃは、単一パルスによるＴＦＯＥ刺激の前後のＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロンの蛍光画像である。
［図３５Ｂ］図３５Ａ～３５Ｃは、ＴＦＯＥ刺激のパルスエネルギー依存性の画像である。図３５Ａ～Ｃは、単一パルスによるＴＦＯＥ刺激の前後のＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロンの蛍光画像である。
［図３５Ｃ］図３５Ａ～３５Ｃは、ＴＦＯＥ刺激のパルスエネルギー依存性の画像である。図３５Ａ～Ｃは、単一パルスによるＴＦＯＥ刺激の前後のＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロンの蛍光画像である。
［図３５Ｄ］図３５Ｄは、単一パルス刺激を受けた標的ニューロンのカルシウムトレースのグラフである。
［図３５Ｅ］図３５Ｅは、パルス数の関数としての成功したニューロン刺激に対するパルスエネルギー閾値のグラフである。
［図３６Ａ］図３６Ａ～３６Ｊは、神経突起に対するＴＦＯＥ誘発細胞内刺激の画像及びグラフを含む。図３６Ａ及び３６Ｂは、ニューロンネットワークに沿って伝播するカルシウム波によるＴＦＯＥ誘発神経突起活性化の前後の画像である。
［図３６Ｂ］図３６Ａ及び３６Ｂは、ニューロンネットワークに沿って伝播するカルシウム波によるＴＦＯＥ誘発神経突起活性化の前後の画像である。
［図３６Ｃ］図３６Ｃは、レーザー開始４秒後のカルシウム信号のΔＦ／Ｆの画像である。
［図３６Ｄ］図３６Ｄは、３６Ａで標識した、標的領域、ニューロン１、並びにニューロン２及び３のカルシウムトレースのグラフである。
［図３６Ｅ］図３６Ｅは、軸索及び樹状突起を選択的に標的とするＴＦＯＥで刺激された多極ニューロンの画像である。
［図３６Ｆ］図３６Ｆ～３６Ｈは、異なる領域の刺激時のカルシウム信号の最大ΔＦの画像である。
［図３６Ｇ］図３６Ｆ～３６Ｈは、異なる領域の刺激時のカルシウム信号の最大ΔＦの画像である。
［図３６Ｈ］図３６Ｆ～３６Ｈは、異なる領域の刺激時のカルシウム信号の最大ΔＦの画像である。
［図３６Ｉ］図３６Ｉは、３６Ｅにおいてそれぞれ赤色、黄色及び緑色の矢印で標識された、標的神経突起において測定されたカルシウムトレースのグラフである。
［図３６Ｊ］図３６Ｊは、異なる神経突起の刺激時に体細胞で測定されたカルシウムトレースのグラフである。
［図３７Ａ］図３７Ａ～３７Ｆは、ＴＦＯＥ刺激による単一ニューロンパッチクランプの画像及びグラフィック描写である。図３７Ａ～Ｂは、それぞれ、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロンを標的とする、マウス脳切片におけるＴＦＯＥと統合されたパッチクランプの２光子イメージングの画像である。
［図３７Ｂ］図３７Ａ～Ｂは、それぞれ、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロンを標的とする、マウス脳切片におけるＴＦＯＥと統合されたパッチクランプの２光子イメージングの画像である。
［図３７Ｃ］図３７Ｃ及び３７Ｄは、それぞれ、約５μｍ（図３７Ｃ）及び約１０μｍ（図３７Ｄ）の距離での５ミリ秒のＴＦＯＥ刺激時の興奮性錐体細胞における膜電圧応答のグラフである。
［図３７Ｄ］図３７Ｃ及び３７Ｄは、それぞれ、約５μｍ（図３７Ｃ）及び約１０μｍ（図３７Ｄ）の距離での５ミリ秒のＴＦＯＥ刺激時の興奮性錐体細胞における膜電圧応答のグラフである。
［図３７Ｅ］図３７Ｅ及びＦは、それぞれ、－７５ｍＶ（図３７Ｅ）及び－４０ｍＶ（図３７Ｆ）の膜電圧における、約５μｍでのＴＦＯＥ刺激時の抑制性介在ニューロンにおける電圧応答のグラフである。
［図３７Ｆ］図３７Ｅ及びＦは、それぞれ、－７５ｍＶ（図３７Ｅ）及び－４０ｍＶ（図３７Ｆ）の膜電圧における、約５μｍでのＴＦＯＥ刺激時の抑制性介在ニューロンにおける電圧応答のグラフである。
［図３８Ａ］図３８Ａは、ファイバーベースの光音響コンバーター（ＦＯＣ）による光音響脳変調の概略図である。
［図３８Ｂ］図３８Ｂは、光音響刺激を生成するときのＦＯＣの概略図である。
［図３９Ａ］図３９Ａ～３９Ｃは、培養初代ニューロンにおけるカルシウム過渡状態を誘導するＦＯＣの画像及びグラフを提供する。
［図３９Ｂ］図３９Ａ～３９Ｃは、培養初代ニューロンにおけるカルシウム過渡状態を誘導するＦＯＣの画像及びグラフを提供する。
［図３９Ｃ］図３９Ａ～３９Ｃは、培養初代ニューロンにおけるカルシウム過渡状態を誘導するＦＯＣの画像及びグラフを提供する。
［図４０Ａ］図４０Ａ～４０Ｂは、それぞれ、マウス脳においてインビボで神経活性化を誘導するＦＯＣの概略図及びグラフである。
［図４０Ｂ］図４０Ａ～４０Ｂは、それぞれ、マウス脳においてインビボで神経活性化を誘導するＦＯＣの概略図及びグラフである。
［図４１］図４１は、治療としてＡＭＲＩ互換のソフト光音響パッド（ＳＯＡＰ）を使用する非侵襲性神経変調システムのレンダリングである。
［図４２］図４２は、ＳＯＡＰが治療位置に集束超音波を提供する方法の概略図である。
［図４３］図４３は、ＳＯＡＰがどのように適応フォーカス調整を提供するかを示す概略図である。
［図４４Ａ］図４４Ａ～４４Ｃは、光音響放射における静的工学的位相プロファイルを表す湾曲光音響フィルムによる集束超音波の生成に関する例示的な実施形態を示す画像である。
［図４４Ｂ］図４４Ａ～４４Ｃは、光音響放射における静的工学的位相プロファイルを表す湾曲光音響フィルムによる集束超音波の生成に関する例示的な実施形態を示す画像である。
［図４４Ｃ］図４４Ａ～４４Ｃは、光音響放射における静的工学的位相プロファイルを表す湾曲光音響フィルムによる集束超音波の生成に関する例示的な実施形態を示す画像である。
［図４４Ｄ］図４４Ｄ～４４Ｆは、ラットの頭蓋骨が存在しない状態で適用された集束超音波を示す、生成された超音波画像である。
［図４４Ｅ］図４４Ｄ～４４Ｆは、ラットの頭蓋骨が存在しない状態で適用された集束超音波を示す、生成された超音波画像である。
［図４４Ｆ］図４４Ｄ～４４Ｆは、ラットの頭蓋骨が存在しない状態で適用された集束超音波を示す、生成された超音波画像である。
［図４４Ｇ］図４４Ｇ～４４Ｉは、ラットの頭蓋骨が存在する状態を示す画像である。
［図４４Ｈ］図４４Ｇ～４４Ｉは、ラットの頭蓋骨が存在する状態を示す画像である。
［図４４Ｉ］図４４Ｇ～４４Ｉは、ラットの頭蓋骨が存在する状態を示す画像である。
［図４５］図４５は、ＳＯＡＰシステムの動的セットアップの概略図である。
［図４６］図４６は、ヒト及びマウスの被写体の直径及び焦点距離パラメーターの表である。
［図４７］図４７は、モールディングによるＳＯＡＰの製造プロセスの概略図である。
［図４８］図４８は、異なる厚さの超音波波形に関するシミュレーションデータのグラフである。
［図４９］図４９は、対応する周波数スペクトルに関するシミュレーションデータのグラフである。
［図５０］図５０は、ヒトの頭蓋骨の厚さが６ｍｍ、横方向のＦＷＨＭが４．６ｍｍである内部の焦点に関するシミュレーションデータの画像である。
［図５１］図５１は、エクスビボで神経調節を受けている拘束されたマウス被験対象の図である。
［図５２］図５２は、非侵襲性インビボ神経調節を受けている自由に動くマウス被験対象の図である。
［図５３］図５３は、ＳＯＡＰデバイスの構成図である。
［図５４Ａ］図５４Ａ～Ｈは、ＳＯＡＰの設計、製造、及び特性評価をさらに詳細に示す。図５４Ａは、ＳＯＡＰの光音響効果及び幾何学的設計の概略図である。
［図５４Ｂ］図５４Ｂは、開口数と横方向解像度との間の関係のプロットである。
［図５４Ｃ］図５４Ｃは、設計された幾何学的形状を有するｋ波シミュレーションにおいてＳＯＡＰによって生成された音場の画像である。
［図５４Ｄ］図５４Ｄは、同じ幾何学的デザインを有する材料ＳＯＡＰの４つの画像を含む。
［図５４Ｅ］図５４Ｅは、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ断面のＳＥＭ画像である。
［図５４Ｆ］図５４Ｆは、ＳＲＳ及び光熱画像化による、混合物中のＰＤＭＳ及びＣＳの空間分布の画像である。
［図５４Ｇ］図５４Ｇは、同じレーザーエネルギー入力を有する４つの材料ＳＯＡＰの波形のグラフである。
［図５４Ｈ］図５４Ｈは、４つの材料ＳＯＡＰの周波数スペクトルのグラフである。
［図５５Ａ］図５５Ａ～５５Ｆは、マウス頭蓋骨を貫通するＯＦＵＳの経頭蓋効率及び高い空間分解能を示す。図５５Ａは、針ハイドロフォンを備えたＳＯＡＰによって生成される超音波を特徴付けるための実験デバイスの概略図である。
［図５５Ｂ］図５５Ｂは、マウスの頭蓋骨を使用しない場合と使用する場合のＳＯＡＰによって生成された正規化された音響波形のグラフである。
［図５５Ｃ］図５５Ｃは、マウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの横方向解像度のグラフである。
［図５５Ｄ］図５５Ｄは、マウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの軸方向分解能のグラフである。
［図５５Ｅ］図５５Ｅ～５５Ｆは、頭蓋骨なし（５５Ｅ）及び頭蓋骨あり（５５Ｆ）のＳＯＡＰ生成超音波伝播の画像である。
［図５５Ｆ］図５５Ｅ～５５Ｆは、頭蓋骨なし（５５Ｅ）及び頭蓋骨あり（５５Ｆ）のＳＯＡＰ生成超音波伝播の画像である。
［図５６Ａ］図５６Ａ～５６Ｇは、インビトロでＳＯＡＰによってデリバリーされたＯＦＵＳによって刺激された培養ニューロンを示す。図５６Ａは、直接インビトロ刺激実験設定の概略図である。
［図５６Ｂ］図５６Ｂは、刺激前後のニューロンを詳細に示す一連の画像である。
［図５６Ｃ］図５６Ｃは、過渡的な動態の平均化されたカルシウムトレースのグラフである。
［図５６Ｄ］図５６Ｄは、ＯＦＵＳ刺激の長期にわたる動態の平均カルシウムトレースのグラフである。
［図５６Ｅ］図５６Ｅは、一時的刺激及び長期的刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。
［図５６Ｆ］図５６Ｆは、安全性実証のための反復刺激の最大ΔＦ／Ｆ画像を詳細に示す一連の画像である。
［図５６Ｇ］図５６Ｇは、５６Ｅにおける反復刺激のカルシウムトレースを詳細に示すグラフである。
［図５７］図５７は、同様の振幅のニューロン応答を引き起こすための実験条件及び総エネルギーを含む表である。
［図５８Ａ］図５８Ａ～５８Ｄは、インビトロでＳＯＡＰによってデリバリーされるＯＦＵＳによる経頭蓋刺激を示す。図５８Ａは、経頭蓋インビトロ刺激実験設定の概略図である。
［図５８Ｂ］図５８Ｂは、経頭蓋刺激の前後のニューロンの画像のセットである。
［図５８Ｃ］図５８Ｃは、経頭蓋ＯＦＵＳ刺激の平均カルシウム応答トレースのグラフである。
［図５８Ｄ］図５８Ｄは、単一パルスによる直接刺激及び経頭蓋刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。
［図５９Ａ］図５９Ａ～５９Ｆは、ＯＦＵＳ刺激及びＥＭＧ記録トレースを伴う代表的な免疫蛍光検査を示す。図５９Ａは、インビボでのＯＦＵＳ刺激の実験設定の概略図である。
［図５９Ｂ］図５９Ｂは、刺激領域及び対照領域内のｃ－Ｆｏｓ及びＤＡＰＩ染色の画像のセットである。
［図５９Ｃ］図５９Ｃは、ｃ－Ｆｏｓ陽性ニューロンのパーセンテージについての統計分析を伴うグラフである。
［図５９Ｄ］図５９Ｄは、２秒のＯＦＵＳ刺激及び光なしの対照群の代表的なＥＭＧ記録である。
［図５９Ｅ］図５９Ｅは、バンドパスフィルタ、全波整流器及びエンベロープ後の代表的なＥＭＧ信号である。
［図５９Ｆ］図５９Ｆは、安全性評価のためのインビボ刺激後の組織学的結果を詳細に示す一連の画像である。
［発明を実施するための形態］
［００２４］
本開示のデバイス及び方法によれば、サブＭＨｚの周波数範囲を標的とする制御可能な周波数スペクトルを有する光音響エミッターが提供される。
［００２５］
新しい技術として、経頭蓋集束超音波は、マウス、ウサギの運動反応、及びヒトの感覚／運動反応をうまく誘発することが実証されている。しかし、超音波の空間分解能では高精度の刺激は可能ではない。本開示は、２０μｍという前例のない空間分解能を有するニューロンの光音響刺激のためのＴＦＯＥを提示し、単一ニューロン又は軸索及び樹状突起などの細胞内構造の選択的活性化を可能にする。３ナノ秒の単一レーザーパルスからＴＦＯＥによって変換された１マイクロ秒の単一音響パルスが、これまで成功したニューロン活性化のための最短の音響刺激として示されている。ＴＦＯＥによって生成される高度に局所的な超音波により、光音響刺激と単一ニューロンでの非常に安定したパッチクランプ記録を統合することが可能になった。従来の超音波刺激では困難であった、音響刺激に対する単一ニューロンの電気的応答の直接測定が初めて実証された。ＴＦＯＥをエクスビボ脳スライス電気生理学と組み合わせることで、本開示は、音響刺激に対する興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンの細胞型特異的応答を明らかにする。これらの結果は、ＴＦＯＥが非遺伝的単一細胞及び細胞内変調技術であることを示しており、神経刺激のメカニズムに新たな洞察をもたらす可能性がある。
［００２６］
高い空間分解能での神経調節は、少数の集団又は単一のニューロンの発動によって動物の行動や脳の状態が特異的に変化する可能性があるため、神経科学の分野における基礎知識を進歩させる上で非常に重要である。臨床的には、正確な神経刺激は、網膜刺激や選択的背側根茎切除術などの処置の基礎を築き、ここでは、小さな集団又は単一のニューロン及び軸索線維の選択的な活性化が望まれる。歴史的に、電気刺激は神経調節にとって最も重要な技術であった。脳深部刺激は、臨床的に最も処方されている神経調節法として、パーキンソン病、うつ病、てんかんなどの神経疾患及び精神疾患の治療に使用されている。ただし、電気刺激の空間分解能は電流の広がりによって制限され、電流は数ミリメートルにわたって標的領域の外側に分布する可能性がある。高い空間精度と細胞特異性を提供する光遺伝学は、げっ歯類の集団神経活動を調節する強力な方法であることが示されている。しかし、ウイルス感染が必要なため、ヒトに適用するのは困難である。非遺伝的刺激としては、水の光吸収に基づく光熱神経刺激が報告されており、基礎科学や並進用途の関心が高まっている。赤外光熱神経刺激（ＩＮＳ）では、波長１．５～２μｍの近赤外光がファイバーを通じて送られ、サブミリメートルの精度で水の温度上昇に変換される。この場合、関連する加熱により組織損傷の重大な懸念が生じる。急速に成長しているモダリティである集束超音波は、浸透深さが深く非侵襲性であるため、無数の脳神経調節用途に利用されている。しかし、超音波は音響波回折によって焦点が制限されるため、空間分解能が数ミリメートルレベルに限られており、特定の脳領域の研究が妨げられる。さらに、超音波場はギガオームシールを容易に破壊するため、超音波刺激を全細胞パッチクランプ電気生理学（神経膜とイオンチャネルの生物物理学的機構の高忠実度分析のゴールドスタンダード技術）と統合することは困難である。
［００２７］
本開示のファイバーベースの光音響コンバーターは、光音響効果を利用し、パルス光を吸収して超音波を生成し、ミリメートル未満の空間分解能でインビトロ及びインビボで神経刺激を達成する。小型化されたテーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）は、約２０μｍの空間閉じ込めで＞５７ｋＰａの圧力を生成することができ、超音波刺激に対して前例のない高い空間分解能を提供する。空間分解能と光音響変換効率の両方におけるＴＦＯＥの大幅な進歩は、以下の革新的な設計に基づいて達成される。第一に、以前の研究のように直径２００μｍの市販のマルチモードファイバを使用する代わりに、本開示は、開発された制御されたテーパリング対策を提供し、ファイバーを２０μｍ程度の小さい先端直径まで再現可能にテーパー付けする。第二に、２０μｍの小さなファイバー先端上に約１０μｍの均一で制御可能なコーティング厚さを実現する新しい蒸着方法が開発された。第三に、コンバーターとしてエポキシ中のグラファイト粉末を使用する代わりに、本開示の方法及びデバイスは、溶解度が改善されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マトリックスに埋め込まれたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を適用する。これにより、変換効率が１桁向上し、テーパー状のファイバー先端からの高効率な光音響信号の生成が可能になり、２０μｍの薄いコーティングからの光漏れが防止される。
［００２８］
本開示の実施形態によれば、ＴＦＯＥを使用することにより、ニューロン刺激の空間的及び時間的解像度が向上する。具体的には、単一細胞の刺激と、軸索及び樹状突起の細胞内刺激が実証されている。持続時間１マイクロ秒の単一音響パルスによりニューロン刺激が達成され、これは音響刺激の持続時間が最も短いことが判明した。重要なのは、ＴＦＯＥによって生成された近接場音響波により、従来の超音波の課題として報告されていた全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞反応を同時に監視しながら、光音響刺激が可能になったことである。本開示は、興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンに対する音響刺激に対する細胞型特異的応答を明らかにする。この開示は、神経系の非遺伝的高精度刺激のためのプラットフォーム技術として、また音響神経刺激のメカニズムの研究及びＭＲＩと互換性のある臨床応用のためのツールとしてのＴＦＯＥの刺激的な可能性を示している。
［００２９］
紹介したように、パルス励起光が対象物質に吸収され、一時的な加熱、物質の圧縮と膨張、その後の圧力変化を引き起こす光音響刺激は、超音波を発生させる新規な方法である。特に、光拡散層と熱膨張層という２つの異なる機能層でファイバー先端を設計及びコーティングすることにより、十分な超音波強度の供給と、セル変調に必要なピーク周波数と帯域幅の制御が可能になる。拡散層と吸収／熱膨張層の両方の周波数制御能力を統合することによって、本開示は、サブＭＨｚ範囲内の周波数及び１ＭＨｚを超える周波数の微調整を達成する。
［００３０］
このように、ＴＦＯＥは調整可能な周波数（例えば、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚ）でサブミリメートルの高さの特別な精度の超音波を送信し、ソノポレーション効果によって膜不透過性の小分子を生細胞にデリバリーする。１ＭＨｚを超える周波数と比較して、サブＭＨｚの周波数下で実行されるＳｙｔｏｘのより高いデリバリー効率により、本開示は、サブＭＨｚの周波数とサブミリメートルの精度との間でうまく妥協して、広範な生物医学用途（領域特異的な薬物デリバリー、遺伝子トランスフェクション、局所的なニューロン刺激など）を提供する。
［００３１］
図１Ａには、パルスレーザー１１０及び光音響信号１１２を含む光音響効果の概略図が示されている。ファイバー１１４、拡散層１１６、及び吸収／膨張層１１８を有するＦＯＥ１００ａ（２層コーティングを有するＦＯＥ）の設計及び構造も、この例示的な実施形態に示されている。参考として、図１Ｂは、ファイバーベースのエミッターと、レーザー伝送用の光ファイバー（２０Ｇ、ＩＤ０．６ｍｍ、ＯＤ０．９１ｍｍ）を使用する注射針（１３０）との間の寸法比較を提供する。ＦＯＥ１００ａ、１００ｂ、１００ｃなどは、図１Ａ、１Ｂ、１ＣなどのＦＯＥ１００を指すことに留意されたい。さらに、図１Ｃは、内側拡散層１１６及び外側吸収／膨張層１１８を視覚化するために画像の透明度が調整されたときの、製造されたＦＯＥ１００の側面図を示し、ファイバー遠位端の輪郭を描く白い破線が示されている。拡散層１１６は、層内の熱的に誘起される歪みの違いによる膨張層の局所的な加熱とその後の損傷を防ぐために導入された。図１Ｇは、パルスレーザー１１０による単一ニューロン刺激を可能にするＦＯＥ１００の追加の概略図１７０を示す。
［００３２］
本開示の別の態様によれば、テーパー状ＦＯＥ（ＴＦＯＥ）１００が例示的な実施形態として導入される。図１Ｄでは、単一セル変調に向けて、１層のコーティングのみを有するＴＦＯＥ１００が示されている。ＴＦＯＥ１００は、小型化された低周波超音波源として２０μｍの先端直径を備えている。本開示は、２０μｍの小さなファイバー先端に伴う課題を克服するために、いくつかの革新的な措置を講じた。光ファイバーのテーパー付けを再現可能に制御するために、マルチモードファイバ１１４は、熱テーパー付け技術によって２２５μｍの全直径から２０μｍまで徐々に引張られた。光エネルギーを最大効率で音響波に変換するために、本開示は吸収／熱膨張層１１８（光吸収の強い多層カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を熱膨張係数の高いＰＤＭＳに埋め込んで構成される）を最適化することができる。テーパー状ファイバーの光音響変換効率を高め、光漏れを最小限に抑えるために、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を導入してヒドロキシル基を持つＩＰＡコーティングされたＣＮＴを形成することにより、光音響ＣＮＴ／ＰＤＭＳコーティングを１５％という高いＣＮＴ濃度で調製できる。高濃度のＣＮＴとＩＰＡによって引き起こされるＰＤＭＳの粘度低下を克服し、テーパー端の２０μｍの断面で均一で制御されたコーティング厚さを達成するには、パンチスルー法を導入できる。コーティングの厚さは、ＩＰＡを蒸発させてマトリックスの粘度を変えることで制御できる。テーパー状ファイバー光音響エミッターは、再び図１Ｄに示されるように、厚さ９．５μｍ及び全体直径１９．８μｍのＣＮＴ／ＰＤＭＳコーティングを有し、単一細胞ターゲティングの必要性を満たしていることが顕微鏡画像によってさらに確認され得る。
［００３３］
本開示の実施形態によれば、次に、１０３０ｎｍナノ秒パルスレーザーがＴＦＯＥ１００にデリバリーされて、光音響信号１１２を生成することができる。図１Ｅは、グラフ線１５０によって与えられる音響波形の平均トレースを示す。近接場の超音波圧力は、針ハイドロフォンによって測定されて５６．７ｋＰａであった。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）後の音響波形の無線周波数スペクトルは、図１Ｆのグラフ線１６０で与えられるように、１．０ＭＨｚにピーク周波数を有する０～１０ＭＨｚの広帯域音響周波数を示す。これは、経頭蓋インビボ神経調節及び他の生物医学的応用で最も頻繁に使用される範囲内にある。あるいは、ＴＦＯＥ１００の適用下でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に分散された蛍光ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズ（直径９μｍ）の動きを使用して、音場の分布を視覚化することもできる。５０ミリ秒のレーザーバースト持続時間、１．７ｋＨｚの繰り返し率で７．８ｍＷのレーザー出力の下で、ＴＦＯＥ１００先端（１μｍ未満）に近い２つのビーズは５μｍの変位を示した。一方、ＴＦＯＥ先端から約２０μｍ離れた他のビーズはＴＦＯＥ処理時に静止したままであり、ＴＦＯＥによって生成された音場が２０μｍの距離内に局在していることを示している。
［００３４］
本開示の実施形態によれば、音響生成中に水中でＴＦＯＥによって生成される熱プロファイルを特徴付けるために、ファイバー先端の温度は、ＴＦＯＥ１００先端表面に直接接触する小型超高速熱センサー（ＤＩ－２４５、ＤａｔａＱ、オハイオ州、米国）によって測定された。図１Ｈでは、ニューロン刺激を成功させるために２つの例示的な試験条件を使用することができる：第１．グラフ線１８０での５０ミリ秒のレーザーパルス列、７．８ｍＷのレーザー出力、及び１．７ｋＨｚの繰り返し率；第２．グラフ線１９０での１ミリ秒のレーザーパルス列、１１．４ｍＷのレーザー出力、及び１．７ｋＨｚの繰り返し率である。このように、第１条件では先端表面温度は０．０９３±０．００４℃しか上昇せず、第２条件では上昇は検出されなかった。この温度上昇は、熱誘発ニューロン変調の閾値（ΔＴ≧５℃）をはるかに下回る。まとめると、これらの結果は、製造された先端直径２０μｍのＴＦＯＥ１００が点超音波源として機能し、先端から約２０μｍに高度に局所化された超音波場を生成することを示している。この前例のない空間的閉じ込めにより、熱損傷や望ましくない機械的破壊を最小限に抑えながら、単一ニューロンレベルでの高精度の刺激が可能になると考えられる。
［００３５］
本開示の別の態様によれば、ＴＦＯＥ１００のこの拡散層１１６は、ポリマー（エポキシ）と直径１００ｎｍの酸化亜鉛（ＺｎＯ）ナノ粒子の混合物を含み、これは、近赤外領域での高い光透過性と高い屈折率により、高エネルギーレーザーパルスをコーシー分布に拡散する。ＺｎＯナノ粒子の直径（つまり１００ｎｍ）は、使用されるレーザー波長（１０３０ｎｍ）よりもはるかに小さいため、全方向へのローリー散乱が可能になる。次に、光エネルギーを音響波に変換するために、吸収／熱膨張層１１８を第２のコーティングとして引き続き追加することができる。これは、吸収体として光吸収係数の高いナノ粒子（多層カーボンナノチューブ、ＭＷＣＮＴ）と、光音響変換効率を最大化するための膨張と圧縮を目的とした熱膨張係数の高いポリマー（ＰＤＭＳ）で構成されている。
［００３６］
本開示によれば、ＴＦＯＥ１００のファイバー遠位端にあるこれらの特別に設計されたナノポリマー複合層１１６及び１１８は、パルスレーザー励起時に、光音響効果を通じてＴＦＯＥ１００のファイバー先端から音響波を効果的に生成し、トランスデューサーを介して検出される。さらに、光音響理論によれば、調整可能な音圧を実現するには、圧力は入射レーザーフルエンスに比例する。したがって、レーザーフルエンスが変化したときのＴＦＯＥの振幅と周波数スペクトルも特徴付けられ、さまざまな用途に対する圧力の柔軟性が示される。
［００３７］
ＴＦＯＥ１００の超音波周波数の制御性を実現するために、１１６及び１１８を含む２層コーティングを、典型的なトランスデューサーの構造を模倣するように設計できることに留意されたい。トランスデューサー（図示せず）は３つの層で構成される：活性層と背面コネクタの間の特定の音響インピーダンスを整合させるためのバッキング層；活性層（電圧を印加すると超音波を発生する圧電材料）：及び媒体と活性層の間の特定の音響インピーダンスを整合させるための整合層（ＰＤＭＳの比音響インピーダンス（１．１～１．５Ｐａ・ｓ／ｍ３）は水（１．４８Ｐａ・ｓ／ｍ３）に近いため、ＴＦＯＥ１００では３番目の整合層を省略できる）。トランスデューサーでは、周波数は２つの要素によって決まる。まず、周波数と帯域幅はバッキング層の減衰効果によって制御される。第二に、周波数は活性層の厚さに反比例する。このようにして、ＴＦＯＥ１００における第１の層１１６の音響減衰及び第２の層１１８の光吸収厚さを変更することによって、周波数を正確に制御することができる。
［００３８］
本開示の実施形態によれば、超音波周波数は、拡散層１１６の修正を介して制御することができる。例えば、周波数の制御には、トランスデューサーのバッキング層に対応するＦＯＥ１００の拡散層１１６の修正が含まれる可能性がある。拡散層１１６内のエポキシ（比音響インピーダンス：２．５～３．５Ｐａ・ｓ／ｍ3）は、ファイバー１１４（シリカ、比音響インピーダンス：１３．１Ｐａ・ｓ／ｍ3）と活性層１１８（ＰＤＭＳ、比音響インピーダンス：１．１～１．５Ｐａ・ｓ／ｍ3）との間の比音響インピーダンスに適合するバッキング層マトリックスとして機能する。典型的な変換器におけるバッキング層の減衰効果は生成される周波数に影響を及ぼし、バッキング層として機能する拡散層１１６の厚さの変化がＴＦＯＥ１００の出力周波数を制御することが期待できる。例示的な例を続けると、ＺｎＯ／エポキシ拡散層１１６の厚さを有する製造されたＦＯＥ１００は、それぞれ３６、４２、５３、６２、７９、１００μｍからなり、厚さが１０９±２４μｍであるＣＮＴ／ＰＤＭＳの吸収／熱膨張層１１８を備えることができる。熱膨張層１１８の厚さの変化は、それらがすべて光の侵入深さを超えているため、超音波周波数を変化させないことに留意されたい。
［００３９］
図２Ａ～２Ｄは、拡散層１１６を修正することによる超音波周波数の制御に関するグラフを提供する。図２Ａでは、３６～１００μｍの拡散層１１６（ＺｎＯ／エポキシ）及び１０９±２４μｍの吸収／熱膨張層１１８（ＣＮＴ／ＰＤＭＳ）で製造されたＦＯＥ１００からの時間領域の超音波信号は、それぞれ時間、厚さ、及び振幅の関数として、グラフ線２１０（１００μｍ）、２１１（７９μｍ）、２１２（６２μｍ）、２１３（５３μｍ）、２１４（４２μｍ）、及び２１５（３６μｍ）で示される。図２Ｂは、超音波の０～１．０ＭＨｚ内の周波数領域を示す。ピーク周波数は、拡散層１１６の厚さを３６μｍから１００μｍまで変化させることによって０．３８４から０．０８３ＭＨｚの範囲で制御されることがグラフ２２０に示されており、拡散層１１６の厚さを増加させる間に周波数が大幅に減少することを示唆している。
［００４０］
続いて図２Ｃを参照すると、拡散層１１６の厚さによるグラフ２３０のピーク超音波周波数のグラフが示されており、ピーク超音波周波数は拡散層の厚さの変化によって調整可能である。線２１０（１００μｍ）、２１１（７９μｍ）、２１２（６２μｍ）、２１３（５３μｍ）、２１４（４２μｍ）、及び２１５（３６μｍ）での０～１０ＭＨｚの周波数範囲を調べると、周波数の分布はサブＭＨｚ領域でクラスタリングを示した。さらに、周波数と拡散層１１６の厚さとの線形関係は、図２Ｄのグラフ２４０においてｙ＝０．５１０８６－０．００４３１ｘの関数でＲ２が０．９３９９２であることを示している。拡散層１１６を変化させることによる周波数の制御は、光音響スペクトルのピーク周波数が拡散層１１６の質量によって変調され得るという事実によってさらに合理化され得る。光音響効果は、一般化されたフックの法則とニュートンの第２法則から推定される運動方程式の導関数である熱膨張方程式によって説明できる。光音響変換プロセス中、ＴＦＯＥ１００先端は調和振動子とみなすことができ、振動運動は熱膨張効果によって与えられる初期力から生じる。フックの法則では、振動の振幅は一定のままで、その周波数は振幅とは無関係であるが、振動子の質量と剛性によって決まる。この点に関して、エポキシ／ＺｎＯ拡散層１１６を修正することによって、０．０８３～０．３８４ＭＨｚの周波数範囲が達成される。
［００４１］
さらに、一般的なトランスデューサーの場合、帯域幅は、スペクトル強度が最大値（ｆupper－Ｆlower）の５０％に減衰する周波数の差と中心周波数ｆcentralの間の比によって定義される。
［数１］
［００４２］
０．０８３～０．３８４ＭＨｚの中心周波数を有するＦＯＥ１００の帯域幅は式１から得られ、平均帯域幅は６７．８±６．８％であった。これらの結果は、ＦＯＥ１００によって生成される超音波帯域幅が、対応する周波数の市販のトランスデューサーによって生成される帯域幅（例えば、５ＭＨｚ、Ｖ３２６、Ｏｌｙｍｐｕｓの場合は６７．０９％；１０ＭＨｚ、ＸＭＳ３１０、Ｏｌｙｍｐｕｓの場合は５６．００％）に匹敵することを示している。特に、市販のトランスデューサーでは、バッキング層の厚さを変更して中心周波数を変化させても帯域幅が大きく変化しないことが判明しており、これは、わずかな周波数依存性を示すＦＯＥ１００の帯域幅と一致している。
［００４３］
本開示の実施形態によれば、超音波周波数は、膨張層内のＣＮＴ濃度を変更することによって調整又は制御することもできる。周波数を操作するための本開示の例示的な実施形態は、活性層（すなわち、吸収／熱膨張層１１８）の有効厚さを変更することを含む。光音響生成理論によれば、光音響の波形は光音響源の光吸収プロファイル、τ＋１／ｃα（τはレーザーのパルス幅、αは吸収体の光吸収係数）にも依存する。吸収体の有効厚さは、光の侵入深さによって決まる。このように、光音響信号波形は実効的な吸収体の厚さによって結果的に変化し、吸収体の厚さは光の侵入深さよりも小さいため、周波数は吸収体の厚さによって決定される。吸収体の厚さが光の侵入深さよりも大きい場合、周波数は一定のままであり、余分な厚さは音響の減衰のみを引き起こす。
［００４４］
図３Ａ～３Ｂは、周波数に対する膨張層の物理的厚さの影響の特徴を示す。本開示のこの態様によれば、２つのグループのＴＦＯＥ１００が、それぞれ３６μｍ及び１００μｍのＺｎＯ／エポキシ拡散層１１６を用いて製造された。図３Ａは、１００μｍ（グラフ線３１１）、１２０μｍ（グラフ線３１２）、１４０μｍ（グラフ線３１３）、及び１６０μｍ（グラフ線３１４）の膨張層のグラフ３１０である。図３Ｂは、１００μｍ（グラフ線３１１）、１２０μｍ（グラフ線３１２）、１５０μｍ（グラフ線３１５）、及び２１０μｍ（グラフ線３１６）の膨張層のグラフ３２０である。各グループについて、ＴＦＯＥからの超音波の時間領域を示す図３の色の凡例で示されるように、１００μｍから２１０μｍまで変化するＣＮＴ／ＰＤＭＳ膨張層を用いて４つのＴＦＯＥを作製した。波形は時間に対して同様の関数のままであったが、膨張層の厚さが増加するにつれて振幅は低下した。結果として、吸収体層１１８の厚さが光の侵入深さを超える場合、周波数は試験範囲内の膨張層の追加の物理的厚さの変化に敏感ではないが、一方、振幅の変化は、熱膨張層の余分な厚さによる音響減衰に起因する可能性がある。
［００４５］
追加の物理的厚さ（光の侵入深さを超えた）は周波数の制御因子ではないが、有効吸収体の厚さを変えることによって周波数を変えることができると考えられることに留意されたい。これは、吸収剤濃度を変更することで膨張層の空間吸収プロファイルを変更することで実現できる。有効厚さは主に物理的厚さではなく光吸収プロファイルによって決定されるため、このようにして、物理的厚さ及び幾何学的構造の変動の影響が最小限に抑えられ、ＴＦＯＥ１００製造の堅牢性が向上する。
［００４６］
超音波周波数を微調整するために吸収剤の濃度をどのように変更できるかを検証するために、拡散層１１６を使用せずに、ＦＯＥ１００をＣＮＴ／ＰＤＭＳ膨張層のみでコーティングした。異なる濃度のＣＮＴ（２．５％、５．０％、７．５％、１０．０重量％）を混合物に使用した。コーティング全体の厚さは同じ範囲に保たれた。図４Ａは、有効吸収／膨張層１１８の厚さの関数としての光音響信号周波数の図を提供する。グラフ４１０のグラフ線４１１、４１２、４１３、及び４１４は、それぞれ２．５、５．０、７．５、及び１０．０％の濃度における吸収／膨張層１１８の厚さを示す。図４Ｂは、ＣＮＴ／ＰＤＭＳ濃度の関数としてプロットされたピーク周波数を示し、４Ｂの各データ点は各濃度の２つの同一のＦＯＥの平均値であり、エラーバーは標準偏差である。したがって、本開示は、ＣＮＴ濃度に依存する周波数変化により、光音響の制御可能なピーク周波数が、グラフ４２０を介して吸収／膨張層１１８の光吸収プロファイルを変更することによっても達成できることを可能にすることを提示する。
［００４７］
本開示によって本明細書に記載される例示的な実施形態によれば、振幅及び周波数スペクトルに関して音響波の角度分布をさらに特徴付けることができる。そうするために、ＦＯＥ１００は、拡散層１１６（ＺｎＯ／エポキシ、厚さ４０μｍ）及び膨張層１１８（ＣＮＴ／ＰＤＭＳ、厚さ１２０μｍ）から構成され得る。ＦＯＥ１００からの音響放射は、１２７ｍＪ／ｃｍ２の一定の光入力でオシロスコープの出力電圧を測定することによって決定することができる。ファイバー軸に対するトランスデューサー検出器の角度は、制御可能な３６０°回転ステージ（米国ニュージャージー州のＴｈｏｒｌａｂｓ社など）によって±１°の精度で変更できる。光音響信号は、図５Ａのグラフ５１０に示すように、それぞれ０°、±２５°、±５０°、及び±７５°の角度で取得することができる。このように、図５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ５２０及び５３０で測定された音響振幅を示す。図５Ｃのピークツーピーク光音響振幅は、それぞれ５．２（０°で）から１．６（±７５°で）に減少することが分かる。これは、角度が大きくなるほど音響振幅が小さくなり、正面方向の振幅が最大になることを示している。ＰＡの振幅異方性は、光強度の異方性から生じると予想される。具体的には、ＺｎＯ／エポキシ（１５重量％）の一層による光強度の角度分布を事前に測定し、制御可能な３６０°回転ステージに取り付けられたフォトダイオードを使用して光強度の角度分布を測定した。５０°での光強度は、０°での光強度の約４１％であった。図５Ｃでは、５０°での音響振幅は０°での振幅の３７％であった（１．９Ｖ対５．２Ｖ）。これにより、音響振幅分布は光強度分布データと一致する。図５Ｄは、５４０で、角度を０度から±７５度まで変化させたとき、ピーク周波数が比較的一定（０．７～０．８ＭＨｚ）であり得ることを示している。これは、拡散層１１６の効果にもかかわらず、レーザーパルスエネルギーの大部分がレーザーの順方向に沿ってデリバリーされ、横方向に伝播する光がほとんどなく、横方向の光音響誘発振動が無視できるためである。拡散層１１６による分散、球状コーティングの曲率半径、ＰＤＭＳと水との間の密度及び音速の不一致を含む他の要因も、振幅異方性に寄与する可能性がある。
［００４８］
本開示の別の態様によれば、ＦＯＥ１００媒介分子デリバリーは周波数依存性であり、０．２ｍｍ2の空間閉じ込めを示す。例示的な実施形態によれば、様々な周波数のＦＯＥ１００によって媒介されるソノポレーション中の細胞膜不透過性蛍光分子の細胞取り込みは、サブＭＨｚ超音波の優れた性能を実証することができるとともに、ＦＯＥの空間的閉じ込めを解明することができる。ソノポレーションプロセスを視覚化するために、損傷した原形質膜を通ってのみ細胞に浸透し、核酸に結合すると蛍光増強を示す高親和性インターカレート核酸染色ＳＹＴＯＸグリーンを選択できる。したがって、２００ミリ秒の持続時間の超音波バーストは、図６Ａの概略図６１０に見られるように、１．７ｋＨｚのパルス繰り返し率で３９ｍＪ／ｃｍ２のパルスレーザーを使用して生成することができ、これはバースト当たり約３４０の音響パルスに相当する。光音響治療は、合計１０分間、バースト繰り返し率０．５Ｈｚで実行できる。ＦＯＥは、培地中の細胞の上約１００μｍに配置できる。
［００４９］
まず、熱誘起細胞膜透過性を除外するために、ＦＯＥ処理中のファイバー先端の温度上昇は、ファイバー先端に接触して配置された小型超高速熱プローブ（直径１００μｍ）を使用して測定できる。図６Ｂのグラフ線６２０に示すように、温度上昇は合計１０分間で０．６℃であることが分かると想定される。このような小さな温度上昇では、熱による膜の脱分極は無視できる。したがって、Ｓｙｔｏｘの取り込み結果は、ＴＦＯＥからの光音響波によって誘発された機械的破壊に起因すると考えられる。
［００５０］
Ｓｙｔｏｘ取り込み効率の超音波周波数依存性を研究するには、ピーク周波数８．０、５．１、１．４、及び０．３ＭＨｚのＴＦＯＥを利用できる（８．０ＭＨｚ：１５％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；５．１ＭＨｚ：１０％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；１．４ＭＨｚ：５％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；０．３ＭＨｚ：１５％ＺｎＯ／エポキシ＋１０％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ）。様々な周波数を有する超音波が、図６Ｃの時間領域６３０に示されている。同一のエネルギー入力を確保するには、レーザーフルエンスを一定に保つ必要がある。したがって、８．０ＭＨｚ信号は最大振幅（２．６５０Ｖ）を示す一方、０．３ＭＨｚ信号は最小振幅（０．０８７Ｖ）を示すはずであるが、これはトランスデューサー感度の不均一性に部分的に起因する可能性がある。図６Ｅは、ＴＦＯＥ処理前の６５２（０分、上のパネル）及びＴＦＯＥ処理後の６５４（２６分、下のパネル）の細胞培養物の蛍光画像を示す。細胞をＴＦＯＥで処理すると、蛍光シグナルの上昇によって示されるように、Ｓｙｔｏｘの細胞取り込みが大幅に増加する。具体的には、０．３ＭＨｚの超音波は、音響強度が最も低いにもかかわらず、ＴＦＯＥ処理後に最も高い蛍光増加を示し、１．４ＭＨｚ及び５．１ＭＨｚと比較して最も高いソノポレーション効率を示した。比較すると、８．０ＭＨｚの超音波で治療したグループでは、Ｓｙｔｏｘの取り込みはごくわずかであった。全体として、ソノポレーション効率は周波数依存性を示した。周波数が低いほど、細胞取り込み効率は高くなる。この結論はさらに統計的に証明することができる。図６Ｄでは、様々な周波数で処理された３０個の個々の細胞からの平均蛍光強度が時間の関数としてグラフ６４０にプロットされている。TFOEで生成されたグラフ線５．１（６４２）、１．４（６４３）、及び０．３（６４４）ＭＨｚ超音波はすべて、治療後の時間の関数としてＳｙｔｏｘ蛍光の増加を示し、Ｓｙｔｏｘの取り込みを促進する能力を確認している。図６Ｄは、処理後約２５分における蛍光のプラトーも示しており、膜の細孔が再封鎖されていることを示した。この動態は、集束超音波が数十分の時間スケールでＳｙｔｏｘの取り込みを促進したという以前に報告された研究と一致している。具体的には、０．３ＭＨｚグループの曲線は最も高い傾きを示し、これは、０．３ＭＨｚのグラフ線６４４が他のグループよりもはるかに速くＳｙｔｏｘの取り込みを促進したことを意味する。最終的な読み取り値は、０．３ＭＨｚのグラフ線６４４がＴＦＯＥ処理後に０．９２という最高のΔＦ／Ｆを示していることも示しており、これは、１．４ＭＨｚのグラフ線６４３（ΔＦ／Ｆ＝０．７４）及び５．１ＭＨｚのグラフ線６４２（ΔＦ／Ｆ＝０．３５）と比較して最も高いソノポレーション効率を示している。したがって、取り込まれるＳｙｔｏｘの総量は周波数に依存する。周波数が低いほど、一定期間内に損傷した細胞膜をより多くの分子が通過する。さらに、８．０ＭＨｚグループのグラフ線６４１は、顕著な蛍光の増加を示さないが、わずかな蛍光の減少を示す。Ｓｙｔｏｘの光漂白による潜在的な影響を考慮すると、蛍光の全体的な低下の理由は、Ｓｙｔｏｘの取り込みによって誘発される蛍光の増加が光漂白効果と比較して弱すぎるためである可能性がある。入射レーザー出力をさらに８．０ＭＨｚの超音波治療に増加すると、最終的には細胞への熱及び／又は光損傷を犠牲にして、０．３ＭＨｚグループと同等のソノポレーション及びデリバリーが得られる可能性があると考えられる。まとめると、ＴＦＯＥ誘発ソノポレーションは、低周波の方が高周波よりも高い効率を実行する周波数依存性を示す。
［００５１］
ソノポレーション効率を定量化するには、ΔＦ／Ｆ≧５０％で細胞をＳｙｔｏｘ陽性細胞として計数し、照射領域内のＳｙｔｏｘ陽性細胞の割合を計算する。このパーセンテージは、ＦＯＥソノポレーション効率の尺度として使用される。同じレーザーエネルギーと継続時間の下で周波数５．１、１．４、及び０．３ＭＨｚのＴＦＯＥの場合、２６分の蛍光イメージングから得られた効率は０％、７２．７％、及び８３．３％であることが確認でき、これは、低周波の方が高周波の超音波よりもソノポレーション効率が大幅に高いことを示唆している。低周波超音波の効率が高いことは、超音波が二層膜の運動を誘発するという膜内キャビテーション理論によって説明でき、組織内に空気空隙があらかじめ存在する必要はない。最大面積ひずみは周波数の平方根に反比例するため、低周波超音波の方がキャビテーション閾値が低くなり、ソノポレーションの効率が向上する。マイクロバブルの助けを借りて超音波によって誘導されるＳｙｔｏｘの取り込みの働きにおいて、取り込まれたＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の最大割合は、それぞれ４００、５００、及び６００ｋＰａで１５ミリ秒（パルス幅１００μ秒で１５０サイクル）の超音波処理後に２０％未満であった（ΔＦ／Ｆの閾値は不明）。本開示において、ＴＦＯＥは、１．１ｍｓの有効超音波処理持続時間（３４０パルス、３．３μｓ未満のパルス持続時間）で約４０ｋＰａの圧力を提供し、低周波数に対して７２．７％及び８３．３％のソノポレーション効率を可能にする。したがって、ＴＦＯＥによって生成される低周波局所光音響波は、テストセルが異なるにもかかわらず、同等の性能を示す。
［００５２］
ＴＦＯＥが、ソノポレーションの閉じ込めによって特定の分子を細胞に局所的にデリバリーすることにより、局所的な細胞調節を可能にする独自の戦略を提供することを検証するために、典型的なホールセルディッシュモジュレーションと比較して、細胞培養物の蛍光増加を１０倍の視野で調査した。局所的なデリバリーは、図６Ｆ及び６Ｇで見ることができる。図６Ｆは、１０倍の対物レンズで撮影されたＴＦＯＥ処置群６６０及び対照群６６５の蛍光画像を提供する。白い破線の円は、観察された顕著な蛍光強度変化の領域を示す。これは、細胞上１００μｍの距離にあるＴＦＯＥの位置の直下にある。ＴＦＯＥ処理後、面積０．２ｍｍ２の処理領域６６２は、３２％の顕著な蛍光増加を示し、横方向に０．２ｍｍ２の空間的閉じ込めを示している。位置特定をさらに検証するために、従来のトランスデューサーアレイはサブＭＨｚ範囲で回折限界があるため、２光子イメージングを使用した組織内のＦＯＥ誘発細胞変調により、３次元視覚化を介して空間閉じ込めが明らかになる。次に、２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム染色（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を使用してＴＦＯＥの生物学的安全性をテストするために、ＦＯＥ処理後の細胞生存率は９９．５５±０．０３％であり、ＴＦＯＥ処理の優れた生体適合性を示している。図６Ｇは、ＴＦＯＥ処置群６６０と対照群６６５との間の蛍光強度変化の比較のグラフ６７０であり、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。まとめると、細胞内に小分子をデリバリーするための新しい超音波源として使用されたＴＦＯＥは周波数依存性を示し、サブＭＨｚ超音波の重要性を示した。局所的な蛍光変化は、ＴＦＯＥが０．２ｍｍ2の空間的に閉じ込められていることを示しており、ニューロン刺激や遺伝子タンパク質研究のための局所的な遺伝子トランスフェクションなど、高い空間精度での細胞調節が期待される。
［００５３］
本明細書で提供される例示的な実施形態によれば、優れた光学的及び機械的特性を有するナノ粒子ポリマーマトリックスから構成されるファイバーベースの光音響エミッター１００が設計及び製造される。拡散層１１６及び膨張層１１８を含む２層コーティング設計は、生成される超音波の振幅及び周波数の正確な制御性を提供する。高振幅とサブＭＨｚ範囲の調整可能な周波数による局所的な音響波の生成が実現される。いくつかの実施形態では、光音響信号プロファイルを振幅及び周波数スペクトルで特徴付けることによって、ＣＮＴ／ＰＤＭＳのマトリックスが高振幅を達成するための好ましい候補であることが実証される。音響周波数を制御するための２つの効果的な戦略を実証できる。第１に、周波数は、音響インピーダンスの不整合を介して減衰材料として機能する拡散層１１６の厚さによって変えることができる。第２に、音響周波数は、活性吸収体／膨張層１１８を通る光の浸透の深さによっても制御され、これは吸収剤の濃度を変えることで間接的に制御できる。小分子を細胞膜にデリバリーするために０．３ＭＨｚから８．０ＭＨｚまでの範囲のさまざまな周波数のＴＦＯＥを使用することにより、サブＭＨｚ超音波は高周波と比較して優れた効率を示す。０．２ｍｍ２の側方空間制限は、ソノポレーション有効面積によっても確認できる。このように、小型化されたＴＦＯＥ１００を使用して、ミリメートル未満の閉じ込めを備えたサブＭＨｚ周波数の音響が生成され、他の典型的な超音波源の制限を克服した。このようなＴＦＯＥ１００デバイスの設計は、細胞膜ソノポレーションを含むがこれらに限定されない、幅広い細胞的用途に有望であると想定され、また、高い有効性と最小限の安全性の問題を備えた、局所的な薬物デリバリー、ニューロン刺激、及び遺伝子トランスフェクションのための新しいツールを提供する。
［００５４］
証明された高い小型化レベルを達成することにより、調整可能な光音響エミッターは低侵襲医療用途に有望であり、ここで、本開示を介して本明細書に提示されるファイバーベースの光音響デバイスは、例えば、焦点病変に近接した注射針又はカテーテルに挿入することができ、したがって、従来の集束超音波によって誘発される精度及び振幅の低下の問題を克服することができる。さらなる実施形態により性能を改善できることが想定される。例えば、最適な光音響信号生成のために高次モードを使用してレーザービームをファイバーに結合できる。第二に、ＴＦＯＥ先端の形状は、凹面構造を介して波を集中させる機会を提供する。第三に、従来のトランスデューサーアレイはサブＭＨｚ範囲で回折限界があるため、サブミリメートルの位置特定をさらに検証することは困難である。二光子イメージングを使用した組織内のＴＦＯＥ誘発細胞変調は、３次元視覚化を介して空間閉じ込めを明らかにする。より広い文脈では、この技術は、超音波パラメーターの変更を通じて各焦点標的で安定かつ可逆的なソノポレーションを生成する可能性を提供し、生物医学的超音波適用の正確な制御を可能にし、これは、既存の技術、特に薬物デリバリーや遺伝子導入ではできなかったことである。さらに、このＴＦＯＥ１００は電磁干渉の影響を受けないため、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性がある。これらの柔軟性は、その前例のない小型化及び容易な反復のしやすさとともに、本開示の方法及びデバイスを革新的な技術にする。
［００５５］
本開示の別の態様によれば、ＴＦＯＥ１００の２層製造は２つのステップから構成される。まず、拡散層１１６については、架橋プロセスによってエポキシ又はＰＤＭＳマトリックスを調製することができる。エポキシは、ポリエポキシド溶液（例えば、Ｄｅｖｃｏｎ社、アルバータ州、カナダ）と多官能性硬化剤を体積比１：１で混合することによって製造された。ＰＤＭＳの場合、シリコーンエラストマー（例えば、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国）を容器に直接慎重に分配して空気の閉じ込めを最小限に抑え、その後、重量比１０：１で硬化剤と混合する。続いて、ディフューザーとして機能するＺｎＯナノ粒子（例えば、～１００ｎｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州、米国）を、別途指定される１５重量％の濃度でマトリックスに添加することができる。コア直径が２００μｍで、先端が研磨されたマルチモード光ファイバー（例：ＦＴ２００ＥＭＴ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社、ニュージャージー州、米国）を混合溶液の表面から約１００μｍ下に慎重に浸し、マイクロマニピュレーターを使用して素早く引き上げた。本開示によれば、室温で垂直に置くことにより、ポリマーが架橋し、マトリックスがコーティングを形成した。エポキシで作られた拡散層１１６は、その後、エポキシの吸収／熱膨張層１１８でコーティングできることが想定される。
［００５６］
このようにして、特定の音響インピーダンスの不整合を最小限に抑えることができ、光音響変換効率を最大化することができる。グラファイト粉末（例えば、Ｄｉｃｋ Ｂｌｉｃｋ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ社、イリノイ州、米国）を、３０重量％の濃度でマトリックスと混合することができる。ＭＷＣＮＴ（例えば、外径＜８ｎｍ、内径２～５ｎｍ、長さ０．５～２μｍ、ＶＷＲ社、ニューヨーク州、米国）は、密度が低い（１．６５ｇ／ｃｍ２）ため、溶解度の上限に近い０～１０重量％の濃度で使用できる。同様に、ＰＤＭＳマトリックスで作られたＴＦＯＥを製造できる。サブＭＨｚ周波数を生成するＴＦＯＥの例示的な実施形態では、構造をＺｎＯ／エポキシ（拡散層１１６）及びＣＮＴ／ＰＤＭＳ（吸収／熱膨張層１１８）として変更することができ、ここでは、エポキシとＰＤＭＳが特定の音響インピーダンスの不整合を実現した。このようにして、セル変調に必要な周波数を満たしながら、圧力を妥協することができる。ファイバー先端付近にサーマルレジストインクでマークを付け、塗布前後の顕微鏡写真上でマークを位置合わせすることで、塗布後の膜厚を測定できる。特に、光漏れは、水及びトランスデューサプローブ内のパルスレーザー誘発衝撃波により、検出トランスデューサー上で音響応答を生成し、潜在的に検出器の損傷を引き起こす可能性がある。パワーメーターを使用して光透過率を測定し、光漏れを評価できる。したがって、上述した本開示の設計及び製造は、ＴＦＯＥ１００の光漏れを排除することができる。
［００５７］
本開示の実施形態によれば、優れた光学的及び機械的特性を有するナノ粒子ポリマーマトリックスから構成されるファイバーベースの光音響エミッターの設計及び製造が開示される。拡散層１１６及び膨張層１１８を含む２層コーティング設計は、生成される超音波の振幅及び周波数の正確な制御性を提供すると考えられる。高振幅とサブＭＨｚ範囲の調整可能な周波数による局所的な音響波の生成が達成された。光音響信号プロファイルを振幅と周波数スペクトルで特徴付けることにより、ＣＮＴ／ＰＤＭＳのマトリックスが高振幅を達成するための好ましい候補として実証できる。
［００５８］
本開示によれば、音響周波数を調整する（すなわち、制御する）ための２つの効果的な戦略が提供される。第１に、周波数は、音響インピーダンスの不整合によって減衰材料として機能する拡散層１１６の厚さによって変えることができる。第２に、音響周波数は、吸収／膨張層１１８を通る光の浸透の深さによっても制御することができ、これは吸収体濃度を変えることによって間接的に制御されている。小分子を細胞膜にデリバリーするために０．３ＭＨｚから８．０ＭＨｚの範囲の様々な周波数のＴＦＯＥ１００を使用することにより、サブＭＨｚの超音波は高周波と比較して優れた効率を示した。０．２ｍｍ2の側方空間制限は、ソノポレーション有効面積によっても確認できる。これにより、小型化されたＴＦＯＥを使用して、ミリメートル未満の閉じ込めを備えたサブＭＨｚ周波数の音響を生成でき、他の一般的な超音波発生源の制限を克服できる。このＴＦＯＥデバイス設計は、細胞膜ソノポレーションなどの幅広い細胞的用途やその他の例示的な用途に有望であり、また、高い有効性と最小限の安全性の問題を備えた、局所的な薬物デリバリー、ニューロン刺激、及び遺伝子トランスフェクションのための新しいツールも提供する。
［００５９］
本明細書の実施形態によれば、本開示のデバイス及び方法によって、単一細胞精度での一次ニューロンのＴＦＯＥ刺激を生成することができる。培養中の単一ニューロンを調節する際に、ＴＦＯＥ１００が十分な空間精度を提供するかどうかをテストするために、例示的な例には、ＧＣａＭＰ６ｆを発現する初代ラット皮質ニューロンを調製し、倒立広視野蛍光顕微鏡を使用してカルシウムイメージングを実行することが含まれる。図３４Ａ及び３４Ｂは、それぞれ５０ミリ秒及び１ミリ秒のレーザー持続時間でＴＦＯＥによって刺激されたまばらな集団における蛍光画像及びカルシウムトレースである（刺激後のピーク強度の蛍光画像は「アフター」として示されている。青い矢印：レーザーの開始）。マイクロマニピュレーターによって制御されるＴＦＯＥ１００は、標的ニューロン３４１４から約５μｍ離れたところに配置できる。１０３０ｎｍ及び１．７ｋＨｚ繰り返し周波数の３ナノ秒パルスレーザーを使用すると、８５パルスに相当する平均出力７．８ｍＷで持続時間５０ミリ秒のレーザーパルスを照射できる。これにより、図３４Ａに示すように、標的ニューロンに対するレーザー照射直後にカルシウム過渡現象を観察することができる一方、先端から約５０μｍ～７０μｍ離れた他のニューロン３４１６は影響を受けず、これはＴＦＯＥ刺激の高い空間分解能を示している。最大ΔＦ／Ｆが１３５％±８３％（３つの培養からＮ＝６、データは平均±ＳＤ）のカルシウム過渡現象は、おそらくＴＦＯＥ刺激によって誘発された複数の活動電位の発動によって標的ニューロンの活性化が成功したことを示している。時間分解能をさらに向上させるために、１１．４ｍＷの出力で１ミリ秒（２パルス）のレーザーパルス列をＴＦＯＥ１００に供給できる。図３４Ｂに示すように、単一ニューロン３４１４の活性化の成功は、１０６％±６１％の最大ΔＦ／Ｆで観察することもできる（３培養からのＮ＝８細胞、データは平均±ＳＤ）。
［００６０］
本開示によれば、ＴＦＯＥ１００は、それにより、光ファイバー上の光拡散層１１６及び膨張層１１８から構成される、ミリメートル未満の閉じ込めを有する小型超音波点音源として機能することができる。音響減衰と光吸収性能を変更することで、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数が実現され、周波数依存の効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導できる。回折限界を突破することで、サブＭＨｚの周波数とサブミリメートルの精度の間の妥協の問題を解決することで、ＴＦＯＥ１００が領域特異的な薬物デリバリー、遺伝子トランスフェクション、及び神経刺激を提供できることが想定されている。さらに、３μＭのテトロドトキシン（ＴＴＸ）を含む１ミリ秒のＴＦＯＥ１００の対照群は活性化を示さないことが考えられ、実験群で観察され得るカルシウムの増加がＮａ＋チャネル依存性活動電位に起因することが確認された。本明細書の実施形態によれば、コーティングのないテーパー状ファイバーを使用した１．０秒のパルス列及び１１．４ｍＷ出力のレーザーのみの群は活性化を示さないため、ニューロン活動に対するレーザーの影響を除外することができる。
［００６１］
本開示の実施形態によれば、ＴＦＯＥ１００は、神経活性化を確実かつ繰り返し誘発することができる。図３４Ｃは、ＴＦＯＥ１００刺激を３回繰り返したときの同じニューロン３４１４の蛍光強度を示す。各刺激には１ミリ秒のレーザー持続時間が、各記録期間の間に１分の間隔で利用されることが想定されている。同じニューロン３４１４の各刺激で活性化が成功する。これにより、ＴＦＯＥ１００刺激後のニューロン３４１４の生存率が確認できる。連続刺激ごとに最大ΔＦ／Ｆの減少が観察されたが、これはカルシウムの枯渇又はスパイク周波数の適応に起因すると考えられる。さらに、図３４Ｄでは、ＴＦＯＥ１００によって選択的に標的とされる３つのニューロンを使用するＴＦＯＥ１００刺激の空間精度を実証することができる。これらの３つのニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６は、２５±２μｍの端から端までの間隔を有する。ＴＦＯＥ１００は、３つの標的ニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６のそれぞれから約５μｍ離れて連続的に配置することができる。最大蛍光強度変化（ΔＦ／Ｆ）は、図３４Ｄに示すように、各ニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６について、それぞれ赤、黄、緑で色ラベルを付けることができる。重要なことに、蛍光の増加は、他の２つのニューロンが同時に活性化されることなく、選択的に標的とされたニューロンでのみ観察され、ＴＦＯＥ刺激が２５μｍ未満の空間分解能を提供することを示している。これらの結果は、ＴＦＯＥ１００が単一ニューロンを確実かつ再現性よく刺激できることを総合的に裏付けている。
［００６２］
本明細書の実施形態によれば、ニューロンに対する単一の光音響パルスの刺激効果も操作することができる。このようにして、同じナノ秒パルスレーザーを使用して、単一のレーザーパルスをＴＦＯＥに送信できる。異なるレーザーパルスエネルギーによるＧＣａＭＰ６ｆ発現一次皮質ニューロンのＴＦＯＥ刺激は、単一パルス条件下で実行できる。図３５Ａ～３５Ｃは、例えば５０μｍでのＴＦＯＥ刺激のパルスエネルギー依存性の画像である。それにより、図３５Ａ～Ｃは、単一パルスによるＴＦＯＥ１００刺激の前（図３５Ａ）及び後（３５Ｂ）のＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロン３４１４の蛍光画像を提供し、最大ΔＦ／Ｆ（３５Ｃ）も視覚化する。図３５Ｄは、単一パルス刺激を受けた標的ニューロン３４１４のカルシウムトレース３５４０のグラフである（青線：代表的な光音響波形を示すズームインによる光音響刺激の開始）。パルスエネルギーが６μＪ／パルスに達するまで、カルシウム過渡現象は観察されない。光音響波の幅は約１マイクロ秒であると想定される。この機能により、自然な神経コーディングを模倣するために必要な前例のない時間精度で神経回路の音響制御が可能になる可能性がある。図３５Ｅは、パルス数（Ｎ＝５～７）の関数としてのニューロン３４１４刺激の成功に対するパルスエネルギー閾値のグラフ３５５０である。
［００６３］
本開示はさらに、ニューロン刺激を成功させるために所与のパルス数に対して必要なレーザーエネルギーを考慮する。これまでの超音波研究では、さまざまな強度と持続時間の連続波超音波とパルス超音波がニューロン刺激に適用されてきた。時間平均されたＵＳ強度と応答振幅又は成功率との間の関係は、負又は正であることが判明した。これらの研究を考慮して、本開示は、複数の強度及び持続期間にわたる音響刺激に応答したニューロンの挙動の統計的調査を追求する。引き続きこの用途において、まず、刺激が成功するためのパルスエネルギーの閾値は、２０％を超える最大蛍光強度変化（ＭａｘΔＦ／Ｆ）を誘発するのに十分なレーザーパルスエネルギーとして定義される。２０％ＧＣａＭＰ６ｆの最大ΔＦ／Ｆは、活動電位１以上に対応すると特定できるためである。パルス数を１、２、４と増加させると、閾値エネルギーはそれぞれ６．３μＪ、４．９μＪから３．９μＪまで単調減少を示すことが想定され、パルス数がそれぞれ６と８に増加しても、それは３．９μＪと３．６μＪで比較的一定のままである。これらの結果は次のことを示している：第一に、レーザーパルス数が１～４の範囲で増加するときのエネルギー閾値の減少は、小さなパルスエネルギー条件下では、パルス数の増加とともに閾値以下の脱分極が蓄積することを示している。第二に、４パルスから８パルスへの閾値エネルギーの平坦化傾向は、約４μＪ／パルスにエネルギー閾値が存在することを意味しており、それ以下ではパルス列をさらに延長しても活動電位はほとんど誘発されない。
［００６４］
培養初代ニューロンの刺激が成功すると、本開示はさらに、ＴＦＯＥ１００が細胞内構造を標的にできるかどうかを検討する。この目的を達成するために、まず、ＴＦＯＥ１００を、細胞体が存在せずに軸索と樹状突起が密集している標的領域の上に注意深く配置する。持続時間１ミリ秒、レーザー出力１１．４ｍＷ、繰り返し率１．７ｋＨｚの１０３０ｎｍレーザーパルス列をＴＦＯＥ１００に供給できることが想定されている。図３６Ａ～Ｄに示すように、標的領域での蛍光強度の増加は、レーザー開始後に明確に観察でき、標的神経突起のＴＦＯＥ刺激が成功したことを示す。図３６Ａ及び３６Ｂはそれぞれ、ニューロンネットワーク（色付きの矢印：標的領域３６１０（紫）、ニューロン１（シアン、３６１２）、ニューロン２、３（赤、それぞれ３６１３、３６１４）に沿って伝播するカルシウム波によるＴＦＯＥ１００誘発神経突起活性化の前後の画像である。図３６Ｃは、レーザー開始４秒後のカルシウムシグナルのΔＦ／Ｆの画像である（スケールバー：５０μｍ）。図３６Ｄは、３６Ａでラベル付けされた、標的領域（紫、３６１０）、ニューロン１（シアン、３６１２）、並びにニューロン２及び３（赤、それぞれ３６１３及び３６１４）のカルシウムトレースのグラフである（挿入図：レーザー開始直後のカルシウム信号の拡大図、黒い矢印：レーザー開始）。視野全体のイメージングを通じて、３つの異なるカルシウムの動態を捉えることができる。まず、ＴＦＯＥ刺激後に、神経ネットワーク内の標的領域から始まるカルシウム波のゆっくりとした伝播が観察される。カルシウム波の伝播速度は７５．２μｍ／ｓと計算できると想定され、これは、シナプス活動又は代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）の活性及び逆伝播活動電位によって誘導される樹状カルシウム波の伝播速度と一致しており、その速度は約７０μｍ／ｓ４２であった。第２に、図３６Ｃに示すように、視野内の４つの部位は、カルシウム波が広がる前に蛍光シグナルの上昇を示す。標的領域の神経突起（図３６Ａ～Ｃの紫の３６１０）及び標的領域の神経突起に直接接続する軸索を有する特定のニューロン１（図３６Ａ～Ｃのシアンの３６１２とラベル付けされる）は、レーザー開始直後に速いカルシウム過渡現象を示した（図３６Ｄ）。これは、活動電位の逆伝播に似ている。無髄軸索が活動電位スパイクを５００μｍ／ミリ秒の速度でシナプスに伝導することを考慮すると、約１００μｍの距離にわたる神経突起からニューロン１（図３６Ａ～Ｃのシアン）への伝播には０．２ミリ秒しか必要としない。したがって、ニューロン１（図３６Ｄのシアンの３６１２）と標的領域（図３６Ｄの紫の３６１０）のカルシウム過渡開始の差は、サンプリング間隔５０ミリ秒のカメラでは検出できなくなる。第三に、近くにあるが標的領域に接続する軸索を持たないニューロン２及び３（図３６Ａ～Ｃにおいてそれぞれ赤の３６１３及び３６１４とラベル付けされている）は、同様の時間的動態で約０．２秒の活性化遅延を示した（図３６Ｄ、挿入図）。このシグナル伝達は、カルシウム波よりも速い伝播速度を示したため、シナプス伝達を通じて引き起こされる活動電位に起因すると考えられる。
［００６５］
細胞内構造、特に軸索と樹状突起に対するＴＦＯＥ誘発刺激のこの能力を利用して、軸索と樹状突起が光音響刺激に対して異なる応答プロファイルを持つかどうかを解明できる。図３６Ｅでは、多極ニューロン内の３つの神経突起がＴＦＯＥ１００によって選択的に標的とされた。神経突起の１つ（図３６Ｅ及びＦの赤色３６２２）に対する標的化ＴＦＯＥ刺激１００は、遅滞なく細胞体において強力なカルシウム活性化を誘導した（図３６Ｆ及びＪ）。したがって、そのような伝播する活性化は軸索における活動電位の逆伝播に似ているため、この神経突起３６２２は軸索として識別される。明らかに、他の２つの神経突起（図３６Ｅ、Ｇ、及びＨの黄色３６２３及び緑色３６２４）の標的化ＴＦＯＥ１００刺激は、体細胞でいかなる活性化も誘導しなかった（図３６Ｇ～Ｊ）。したがって、それらは樹状突起として識別できる。図３６Ｆ～Ｈは、異なる領域の刺激時のカルシウム信号の最大ΔＦを示す。ニューロンの樹状突起は、上流のニューロンからのシナプス入力を統合することが知られており、これには急速に連続して到着する刺激の合計が含まれ、別々の枝からの入力の集約が伴う。このケースの場合、単一の樹状突起の前方伝播では、細胞体で活動電位を誘発するには不十分であることが判明する可能性がある。単一細胞レベルでの音響刺激に対する軸索と樹状突起の反応の違いは、複数のニューロンにわたって再現可能であることが示されている。図３６Ｉは、３６Ｅにおいて赤の３６２２、黄色の３６２３、及び緑の３６２４の矢印でそれぞれラベル付けされている、標的神経突起において測定されたカルシウムトレースのグラフである。図３６Ｊは、異なる神経突起の刺激時に体細胞で測定されたカルシウムトレースのグラフである（３６Ｉ～Ｊの青い矢印：レーザー開始）。まとめると、これらのデータは、ＴＦＯＥ１００の細胞内ターゲティング機能によって可能になる、光音響刺激に対する軸索と樹状突起の異なる応答ダイナミクスを初めて明らかにする。
［００６６］
本開示によれば、単一ニューロンＴＦＯＥ１００刺激の重要な利点は、細胞内パッチクランプ記録との適合性である。刺激に対するカルシウム反応の時間分解能は限られているが、細胞内パッチクランプ記録を使用した直接記録は、閾値以下及び閾値以上のニューロン活動を研究するための黄金標準となる。従来の超音波はガラスと膜の間のパッチの付着を容易に破壊するため、従来の超音波刺激中の細胞内パッチクランプ記録は困難であった。本開示の光音響刺激方法及びデバイスは、機械的破壊が最小限に抑えられた局所的な光音響場という利点を有する。したがって、パッチを適用して記録することができ、神経システムの機械的変調に関する洞察を得る新しいテストシステムを提供する。
［００６７］
このように、本開示は、ＴＦＯＥ１００刺激を単一ニューロン上で記録するパッチクランプ３７１２と統合する。例示的な例として、これは、光音響単一ニューロン刺激に対する直接的な電気応答を検出するために、マウスの皮質スライス上で実行され得る。図３７Ａ～Ｂは、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン３７１５及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロン３７１４を標的とする、マウス脳スライス内のＴＦＯＥ１００と一体化されたパッチクランプ３７１０の２光子画像を提供する（パッチピペット３７１８は、細胞内電極溶液中のシアン緑色蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を使用して図３７Ｂで視覚化されている）。図３７Ａに示すように、特定の細胞型の視覚化を助けるために、ＧＡＤ２介在ニューロンにおいてｔｄＴｏｍａｔｏを発現するマウスからの脳スライスが提示される。したがって、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロン３７１４及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン３７１５を選択的に標的にすることができる。ＴＦＯＥ１００は、パッチピペット３７１８と統合して、脱分極を誘導し、標的ニューロンにおける活動電位の生成を引き起こすことができる。
［００６８］
また、図３７Ｃ～Ｆに示されるように、ニューロン膜電圧は、ＴＦＯＥ１００刺激時に前例のない安定性で正確に測定することができる。本開示の実施形態によれば、電流クランプ３７１２モード下の興奮性錐体細胞３７１４について、５μｍでのＴＦＯＥ刺激の直後に一連の活動電位を観察することができる（図３７Ｃに示すように）。図３７Ｃ及びＤは、約５μｍ（図３７Ｃのグラフ線３７３０）及び約１０μｍ（図３７Ｄのグラフ線３７４０）の距離でのＴＦＯＥ刺激（５ミリ秒）時の興奮性錐体細胞における膜電圧応答のグラフである。この結果は、図３４Ａ～Ｂ及び３５Ｄに示されるように、蛍光変化におけるΔＦ／Ｆが１００％を超える以前のカルシウムイメージングと一致している。ＴＦＯＥがニューロン３７１４及び３７１５から５～１０μｍ離れたところに移動すると（図３７Ｃ及びＤ）、活動電位が閾値以下の脱分極に道を譲ると考えられ、これは組織内の音場の閉じ込めが高いことを示している。
［００６９］
次に、本開示は、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性介在ニューロンを標的とすることを含む。図３７Ｅ及びＦは、膜電圧－７５ｍＶ（図３７Ｅのグラフ線３７５０及び３７５２）及び－４０ｍＶ（図３７Ｆのグラフ線３７６０及び３７６２）における、約５μｍでのＴＦＯＥ刺激時の抑制性介在ニューロンにおける電圧応答のグラフである（レーザー：１１．４ｍＷ、１．７ｋＨｚ、持続時間５ミリ秒）。ＴＦＯＥは、－７５ｍＶに保たれた抑制性介在ニューロンにおいて閾値下脱分極を誘導し、刺激後の経時的な電気応答は２つの成分を示した（図３７Ｅの３７５０）。図３７Ｅの最初の鋭いピーク３７５０は、音響波による膜の完全性の直接の中断によるものである可能性があり、次の広いピーク３７５２は、内向きチャネル電流による可能性が高く、イオンチャネルの関与の可能性を示している。－４０ｍＶ近くまで正の電流を注入することによって膜が脱分極されると、ＴＦＯＥ刺激時に３つの活動電位の短い列３７６２が観察された（図３７Ｆ）。音響刺激に対する興奮性錐体ニューロンと抑制性介在ニューロンの異なる応答は、これら２つの細胞型に固有の活動電位閾値や、音響放射力に対して異なる応答ダイナミクスを持つ機械感受性イオンチャネルの分布など、複数の要因によって寄与されている可能性がある。これにより、ＴＦＯＥ１００は、パッチクランプ３７１２記録と互換性のある前例のない安定した超音波源を提供し、音響誘発ニューロン刺激のメカニズムを明らかにすることが期待される。
［００７０］
テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）は、ナノ秒レーザー、先端が加工された光ファイバー、光音響コーティング、及び光熱効果を最小限に抑えて排除するための一連の動作パラメーターで構成されている。レーザーパルスによって励起されると、コーティングされた先端は光音響効果によってファイバー先端で局所的に全方向性音響波を生成できると考えられている。生成された音響波は、ＴＦＯＥ先端から１００μｍ未満の距離内に高度に局在しており、単一ニューロンの精度でニューロンを活性化するために利用できる。さらに、ファイバー先端は、単一ニューロンからサブミリメートル解像度までの幅広い解像度を提供するように設計でき、パッチクランプを介した単一ニューロン活性化の電気生理学的記録と連携して動作できる。
［００７１］
注目すべきことに、ＴＦＯＥ１００は、１００μｍ未満の精度で神経調節をデリバリーする能力において新規である。本開示のファイバー光音響発生器は、他のファイバー光音響発生器よりも発生する熱がはるかに少なく、効果的な超音波を生成できることが想定される。さらに、ＴＦＯＥは、ファイバー先端から１００μｍ未満の距離内に限定された局所的な超音波場を生成する。これは、他のファイバーベースの光音響デバイスよりも緊密である。音響強度が距離にわたって急速に減衰することを可能にする全方向音響伝播機能と併せて、ＴＦＯＥは高い空間精度でより効果的かつ効率的に神経活性化を生成できる。
［００７２］
本開示によれば、ＴＦＯＥはコンパクトな１０３０ｎｍ、３ナノ秒レーザーと、直径２００μｍ、先端テーパー付きの０．２２ＮＡマルチモーダルファイバーと、テーパー状ファイバー先端の層コーティング（コーティングされた先端全体の直径は、厚さ１０～１００μｍの範囲になる）から構成される。光音響プロセスを通じて、パルスレーザーエネルギーはＴＦＯＥ先端で生成される音響波に変換され、その後、その音響波が先端付近のニューロンを興奮させる。ＴＦＯＥコーティングは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得ることが想定される。
［００７３］
本開示では、その高い光吸収効率及び熱伝導効率により、ＴＦＯＥを構成するカーボンナノチューブがレーザーを完全に吸収し、熱に変換できることが意図される。その後、熱は周囲のＰＤＭＳに伝達され、全方向に伝播する光音響波が生成される。このように、ＴＦＯＥは光音響効果を利用して、約２０μｍの空間閉じ込めで音響波を生成し、超音波源に対して前例のない高い空間分解能を提供する。
［００７４］
さらに、本開示のＴＦＯＥは、繊維工学、材料の変更、及び新規な堆積方法によって達成される、空間分解能及び光音響変換効率の両方の改善をもたらす。本開示によれば、ＴＦＯＥによって生成される光音響波は、個々の培養ニューロンを直接活性化し、細胞内カルシウム過渡状態を生成することができる。これにより、ＴＦＯＥはファイバー先端の周囲半径２５μｍ以内のニューロンを活性化し、従来のピエゾベースの低周波トランスデューサーや以前のＴＦＯＥデバイスを上回る単一ニューロン分解能を実現する。
［００７５］
このようにして、ＴＦＯＥは単一細胞や軸索や樹状突起などの細胞内構造に音響刺激を与えることができる。時間的には、１マイクロ秒の持続時間の単一の音響パルスは、望ましいニューロン刺激、又は成功した神経調節のための既知の最短持続時間の音響刺激を達成することができる。重要なのは、ＴＦＯＥによって生成される近接場音響波は、無視できる程度の光熱効果を誘導しながら、全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞応答を同時に監視しながら、光音響刺激を可能にすることができるということである。さらに、ＴＦＯＥ先端コーティング構造、形状及び材料を変更して、さまざまな超音波空間伝播パターン、異なる超音波強度及び周波数を達成できることが考えられる。
［００７６］
本開示の実施形態によれば、電気刺激、超音波刺激、及び光遺伝学的刺激治療は、ＴＦＯＥ１００を介して光音響周波数をデリバリーすることによって神経突起伸長を促進することができる。これは、損傷が発生した場合に神経組織を機能的に修復するための重要なプロセスである。したがって、本開示の光音響プロセスは、神経活動の非遺伝的な時間的及び空間的に正確な刺激をもたらす。本開示の実施形態によれば、ファイバーベースの光音響エミッター１００（ＴＦＯＥ又はＴＦＯＥ）は、インビトロ及びインビボの両方で神経刺激において光音響効果を使用する実現可能性を表わす。図３９のニューロン３９１０は、一次ニューロンがオレゴングリーンで染色されているビトロカルシウム応答を介した結果であることを示している。ＴＦＯＥ１００と同様に、図４０Ａの３８４６を介して測定されるＴＦＯＥ３８００は、光音響刺激がインビボＬＦＰ応答に適用される場合、図４０Ｂの４０２０において同様に示されている。両方について、本開示の光音響プロセスを介して神経刺激を確実かつ繰り返し適用して、神経突起伸長及びその後の神経組織の修復を促進することができる。
［００７７］
特に、ＴＦＯＥ１００は、細胞の変調及び再生の目的で、パルス光エネルギーを超音波パルスに変換できることが想定される。この光音響材料は、拡張マトリックス内の光吸収体で構成することができ、フィルムや３Ｄ構造などのさまざまな設計で使用できることが考えられる。生成された超音波は、ＴＦＯＥ材料の近くに配置されたさまざまなタイプのニューロンなどの細胞を刺激したり、材料が集束超音波を生成するように設計されている場合は組織内のニューロンを刺激したりできる。
［００７８］
本開示の実施形態によれば、ヒドロゲルの土台は、ナノ複合アプローチを介して光音響機能と統合され、ニューロンの再生を可能にする。ヒドロゲルは、ニューロン培養に使用される場合、シルクフィブロインによって神経成長をサポートし、制御可能な生分解速度、調整可能な薬物負荷能力、光学的透明性、及び調整可能な機械的特性も提供する。さらに、カーボンナノチューブは、効率的な光音響剤として機能することができる。カーボンナノチューブを神経刺激に使用すると、高い光から音への変換効率が得られる。さらに、広帯域の光吸収により、将来の用途でレーザーシステムを柔軟に選択できるようになる。カーボンナノチューブは毒性が最小限であり、生体光音響イメージングの用途における確認に役立つ。
［００７９］
本開示の実施形態によれば、ＰＥＧ官能化は、繊維ベースの光音響エミッター１００を構成するＣＮＴ／シルクフィブロインフィルムの全水性製造方法７００を可能にする。シルクフィブロイン７１０は、図７に示すように、型に応じて、シルク溶液７３０（２ｗｔ／ｖ％）と官能化ＣＮＴ溶液７４０（２０～１００μｇ／ｍｌ）を混合することによって水溶液７２０に抽出され、続いて、生成物を７５０℃でキャスティング及び乾燥させて、それぞれＣＮＴ／シルクフィルム７６０又はＣＮＴ／シルクロールを製造した。ＰＥＧ官能基化により、ＣＮＴ水分散性が向上し、毒性が軽減された。表面機能化の結果は、図８のゼータ電位８００でうまく確認できる。
［００８０］
本開示の別の態様によれば、広帯域音響波は、ＣＮＴ／シルクフィブロインフィルムによって生成され得る。例えば、図９は、パルスレーザー９１０を介してマルチモード光ファイバー９１４を介してＣＮＴ／シルクフィルムにデリバリーされる、パルス幅３ｎｓの１０３０ｎｍレーザー９１０を示しており、照射面積は約０．０５ｍｍ2である。音響波９１２は、１０ＭＨｚのトランスデューサーを使用して特性評価され、オシロスコープ９２０によって記録された。その結果、音響パルス幅１μｓ、広帯域中心周波数１．２ＭＨｚ、圧力０．２６ＭＰａの光音響波９１２は、図１０Ａのグラフ線１０１０に示すように、１４．７μＪのパルスエネルギーで生成された。図１０Ｂのグラフ線１０２０は、それぞれ時間及び周波数の関数として示されている。光音響刺激には適切な圧力が必要であり、埋め込まれたＣＮＴの濃度とレーザー出力を操作することで制御できることに留意されたい。これを測定するために、以下が計算される。
［数２］
式中、
［数３］
であり、ｌは固有長さ、Ａは光吸収係数、Ｆはレーザーフルエンス、βは体積熱膨張係数、νは音速、Ｃpは比熱容量である。光吸収材料として、図１１のグラフ線１１１０（ＣＮＴ濃度μｇ／ｍＬの関数としてパルスエネルギーを７５μＪに固定）及び図１２のグラフ線１２１０（パルスエネルギーμＪの関数としてＣＮＴ濃度を２０μｇ／ｍＬに固定）に見られるように、埋め込まれたＣＮＴの濃度が高いほど、吸収係数が高いため、より強い音響波が発生する。
［００８１］
本開示の実施形態によれば、生体適合性及び無視できるほどの熱影響は、神経組織の光音響刺激を介して確認され得る。図１３Ａは、製造されたＣＮＴ／シルクロール又はフィルムをガラス対照群と比較したときの、ニューロン／面積の関数としてのインビトロ形態を確認するグラフ１３１０である。図１３Ｂは、製造されたＣＮＴ／シルクロール又はフィルムをガラス対照群と比較したときの、全長／面積の関数としてインビトロ形態を確認するグラフ１３２０である。図１３Ｃは、コントロール、ＣＮＴ／シルク、及びシルクフィルム＋ＣＮＴグループの細胞生存率をそれぞれ確認するグラフ１３３０である。
［００８２］
図１４は、生後１０週目のマウスのインビボ組織学における神経組織の光音響刺激による生体適合性及び無視できる熱影響をＨ＆Ｅ染色で確認する画像１４００を表わす。４倍と４０倍の倍率レベルでそれぞれ５０μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬに曝露した場合、結果は３日目と３０日目の間隔で記録された。さらに、図１５は、１５００における生体適合性及び無視できるほどの熱影響を確認するパルス列を示す概略図を表わす。繰り返し率は１．７ｋＨｚ、持続時間は３ｍｓ／５パルス、レーザーパルスエネルギーは５３μＪに設定される。図１６は、経時的な温度の関数として、グラフ線１６１０におけるＣＮＴ／シルクの性能とグラフ線１６１２における単離されたシルクの性能を示すグラフであり、ＣＮＴ／シルクの組み合わせの改善された光音響能力をさらに裏付ける。
［００８３］
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＣＮＴ／シルクフィルムによって生成された光音響波は、神経活動を確実かつ繰り返し刺激する。そうするために、図１７～２０に示すように、５ｍｓ（８パルス）で１４．７μＪ（２９．４ｍＪ／ｃｍ２）のレーザーパルスエネルギーを、４日目にトランスフェクトされた一次皮質ニューロンＧＣａＭＰ６ｆに適用することができる。図１７は、光（ＣＮＴ／シルク光＋）にさらされたときのＣＮＴ／シルクフィルム１６１０の性能の１００μｍの画像であり、光照射により活性化領域１７１０が決定される（破線１７１２はレーザー照射領域を示す）。図１８は、光（シルク光＋）にさらされたときのシルクフィルム１６１２の性能の１００μｍの画像であり、光照射が活性化領域１８１４を決定する（点線はレーザー照射領域１８１６を示す）。これをさらに説明するために、図１９及び２０は、ＣＮＴ／シルクの性能について、光にさらされた場合をグラフ線１９１０、光にさらされていない場合（ＣＮＴ／シルク光－）をグラフ線１９１２、シルクフィルムが経時的なΔＦ／Ｆ０の関数として光にさらされた場合をグラフ線１９１４で示すグラフである。これにより、光音響刺激により確実かつ繰り返し神経活性化を誘導できることが確認でき、また、神経機能が損傷していないことも確認できる。
［００８４］
本開示の別の態様によれば、光音響刺激は、神経突起伸長を促進することができる。例示的な実施形態は、図２１～２６に示すように、ラットの後根神経節（ＤＲＧ）外植片を介して観察することができる。図２１は、１．７ｋＨｚ及び５ｍｓのパラメーターでラット後根神経節外植片に経時的に適用される光音響刺激の概略図２１００を含み、パルス列は２分ごとに１時間適用される。図２２は、それぞれ、ＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するＣＮＴ／シルク光＋の従来の画像及び挿入画像を含む。図２３には、ＣＮＴ／シルク光の従来の画像と挿入画像が含まれており、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有する。図２４は光照射を受けたときの、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するガラス光制御グループの従来の画像及び挿入画像を含む。図２５は、光照射を受けていないときの、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するガラス光制御グループの従来の画像及び挿入画像を含む。
［００８５］
例示的な例を続けると、図２６は、面積の関数としての図２２～２５のグラフである。適用すると、光音響刺激ＤＲＧ（１８．１９±１．３７ｍｍ２）は、ガラスコントロールグループ（１０．４８±５．０６７ｍｍ２）と比較して、カバー面積が１．７４倍増加した。さらに、光音響刺激は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現を高めることができる。例示的な実施形態として、光音響刺激の２４時間後、それぞれ図２７及び２８に示すように、２つの神経栄養因子、ＢＤＮＦ及びＮＧＦをＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって測定した。その結果、光音響刺激ＤＲＧのＢＤＮＦ濃度（８６．５２±１７．０７ｐｇ／ｍｌ）は、ガラス対照群（４４．２０±２２．３１ｐｇ／ｍｌ）と比較して１．９６倍の増加を示した。ＮＧＦの発現量に有意差は認められなかった。このようにして、光音響刺激によって誘発される活動電位とそれに続くカルシウム流入は、ＢＤＮＦ経路に影響を与え、神経突起の伸長を促進する。
［００８６］
本開示によれば、実証された高い小型化レベルを達成することによって、調整可能な光音響エミッターを低侵襲性の医療用途に展開することができる。例えば、前述のファイバーベースの光音響デバイス１００は、焦点病変に近接した注射針又はカテーテルに挿入することができ、これにより、従来の集束超音波によって引き起こされる精度及び振幅の低下の問題を克服することができる。さらに、ＴＦＯＥ１００の先端の形状により、凹面構造を介して周波数波を集束させることができることが想定されている。図２９は、時空間符号化及び復号化を可能にする多機能ニューラルインターフェース２９００が対象を治療するために使用される例示的な例を表わす。この方法は、図３０の図にさらに示されており、コンピュータ３０１０は、２９００を介して脳３０１４に光音響刺激３０１２を提供し、その後、電気記録フィードバック３０１６を受信する。あるいは、図３１Ａ～３１Ｂは、光媒介低侵襲性ＰＮＳ刺激用の埋め込み型カフ３１００が、それぞれ２００μｍ及び１００μｍで対象を治療するために使用される例示的な実施形態を表わす。それにより、ＭＥＣＨエラストニクス３１１０は、神経線維３１１２に光音響刺激をもたらす。さらに、本開示の方法及びデバイスは、超音波パラメーターの修正を通じて、各焦点標的において安定で可逆的なソノポレーションを生成できることが想定され、これにより、生体医療用超音波用途、特に薬物デリバリーや遺伝子導入の場合、既存の技術では実現できない正確な制御が可能になる。図３２は、官能化ステップ３２１０、キャスト及びアニーリングステップ３２２０、及び得られるＣＮＴ／シルク３２３０製品の概要を提供する。図３３は、光音響刺激による興奮したニューロン３３１０の前後の画像を提供する。さらに、ＴＦＯＥ１００は電磁干渉の影響を受けないため、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性があることに留意されたい。
［００８７］
本開示では、約２０μｍの空間閉じ込めで音響波を生成し、単一ニューロン及び細胞内精度での光音響神経変調を可能にするＴＦＯＥが提示される。ＴＦＯＥ１００によって生成された近接場音響波は、光音響刺激と全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞反応の同時モニタリングを可能にし、これは、従来の超音波刺激では困難であると報告されている。ＴＦＯＥ１００をエクスビボ脳スライス電気生理学と組み合わせることにより、本開示は、興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンに対する音響刺激に対する細胞型特異的応答をもたらす。
［００８８］
本開示の実施形態によれば、光音響効果は、生物医学的イメージングに広く使用されており、さらに最近では、神経調節のために研究されている２６。以前に報告された光音響刺激デバイスと比較して、ＴＦＯＥ１００は、新しいデバイス設計と革新的な製造方法を適応させることで新しい機能を提供する。ＴＦＯＥ１００の高効率光音響変換層は、熱膨張性ＰＤＭＳマトリックスに埋め込まれた溶解度が向上したカーボンナノチューブでできており、光から音への変換効率が大幅に向上する。さらに、パンチスルーコーティング法により、非常に小さなテーパー状のファイバー先端を優れた制御性と信頼性で均一にコーティングできる。
［００８９］
ＴＦＯＥ１００の重要な利点は、その前例のない空間分解能であることに留意されたい。経頭蓋超音波神経調節は、げっ歯類、非ヒト霊長類、及びヒトで実証されている。ただし、波の回折限界により、集束超音波神経変調では数ミリメートルの空間精度が得られ１９、これにより、小動物の部位特異的調節や単一ニューロンの刺激が禁止され、細胞型特異的応答を研究する能力が欠けている。この制限を克服するために、ＴＦＯＥ１００は、音響波長と比較して１０００分の１小さく、約２０μｍの空間分解能で１ＭＨｚで局所音場を生成する。本開示は、局所音場を利用して、単一細胞及び細胞内精度での神経刺激を実証し、神経細胞体、樹状突起及び軸索を特異的に標的とすることによる細胞内構造のＴＦＯＥ刺激に対する示差的応答を明らかにする。
［００９０］
パルスレーザーの制御性を利用することにより、本開示は、単一細胞レベルでの光音響刺激の累積効果を特定し、超音波刺激が有効になるまで有限の持続時間にわたって統合され得ることを示す。ネットワークのない状態で単一ニューロンの活動を評価する機能を備えたＴＦＯＥ１００の結果は、個々のニューロンの固有の信号解釈としての刺激蓄積効果をさらに確認する。
［００９１］
さらに重要なことに、本開示では、成功したＴＦＯＥ刺激が、１マイクロ秒の音響パルスを生成する３ナノ秒の単一レーザーパルスで達成されたことが意図される。これまでに、１０の音響サイクルと全体の持続時間２２．７マイクロ秒のシングルトーンバースト超音波は、ニューロン変調のための最も短い音響刺激として報告されている。したがって、本開示は、現在の音響刺激技術の時間分解能の大幅な改善を表わす。
［００９２］
さらに、本開示では、ＴＦＯＥ１００により、音響刺激と全細胞パッチクランプ記録との統合が可能になることが意図される。ＴＦＯＥ刺激による脳スライス内の単一ニューロンの電気生理学的記録は、ＴＦＯＥ刺激に対する興奮性錐体ニューロンと抑制性介在ニューロンの異なる反応を明らかにした。異なる応答は、固有の閾値の違い、又は異なるイオンチャネルの分布の変動に起因する可能性がある。さらに、抑制性ニューロンは、興奮性ニューロンと比較して、活動電位発生の閾値の上昇を示した。これは、抑制性ニューロンの閾値が錐体細胞よりも低い電気刺激を使用した発見とは対照的である。この不一致は、音響刺激と電気刺激のメカニズムの違いに起因すると考えられている。したがって、例えば、イオンチャネルを薬理学的又は遺伝的に変更することによる音響刺激中のイオンチャネルの関与に関するさらなる研究は、機械的神経調節の電気生理学的メカニズムに新しい洞察を提供する。
［００９３］
本開示のデバイスの方法によって提供される遺伝子フリーの単一細胞刺激技術は、ニューロン刺激のメカニズム、及び個々のニューロンがネットワーク内でどのように連携してニューラル計算を実行するかを理解するための新しいツールを提供する。ＴＦＯＥ１００は金属コンポーネントを一切使用していないため、電磁干渉の影響を受けず、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性がある。ＭＲＩは、ヒトの患者の行動と疾患の理解に向けた将来の研究に期待されている。
［００９４］
前述の応用に加えて、神経調節は、脳を理解し、疾患を治療するための貴重なプラットフォームであることに留意されたい。脳や病気を解読するには、行動している被験者の脳活動を正確に操作することが重要である。最適には、変調と読み取りの両方が非侵襲的である。解決策として、超音波神経変調（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｎｅｕｒｏ－ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ、ＵＳＮＭ）は、低周波超音波が非侵襲的に脳活動を調節できるため、新しい非侵襲的神経変調技術である。ＵＳＮＭは、ＴＭＳ及びｔＤＣＳ（～ｃｍ）と比較して、より高い空間分解能（＜５ｍｍ）を持つと考えられている。しかし、ガイダンスが不足していると、正確な超音波神経調節が妨げられる。正確なＵＳＮＭには、ｍｍ未満の解像度でのリアルタイムガイダンスと脳回路の評価が必要である。このようなガイダンスを提供するために、本質的にＵＳＮＭと互換性のある超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ、ＵＳ）画像処理を行うことが理想的であると考えられている。
［００９５］
しかし、超音波は神経活動の感知と体積画像の提供には限界がある。例えば、血流を監視する経頭蓋ドップラー超音波（ｔＤＵＳ）は、認知科学の研究での使用に限定されている。ＵＳイメージングでは、体積モニタリングを実現するのが困難な断層画像（Ｂモード）のみが提供される。
［００９６］
したがって、研究や診療所での超音波神経調節には、標準化された体積測定のガイダンスが必要である。前述のことを念頭に置いて、ｆＭＲＩはＵＳＮＭを指導し評価するための最も適した候補である。これは、機能的磁気共鳴イメージング（ｆＭＲＩ）によって実現できる。ｆＭＲＩは、解像度が約２００μｍの非侵襲的体積機能イメージングである。したがって、ｆＭＲＩは、非侵襲的な神経調節のためのＵＳＮＭ（ｍｍレベル分解能）を導くための最良の候補である。
［００９７］
ただし、既存のＭＲＩ互換ＵＳＮＭツールは、研究者にとって制限されているか、アクセスできない。したがって、従来のＵＳＮＭを再設計するには、フェライトや金属コンポーネントをすべて取り除くなど、高度なエンジニアリングが必要である（ほとんどのＵＳトランスデューサーは、磁場を妨げるニッケル、フェライト、金などの材料を使用しているため）。さらに、これらの材料は干渉を最小限にするための電子部品のシールドを複雑にする。現時点では、新しいＭＲＩ対応ＵＳＮＭは限られている。これまでのところ、２０１６年にＦＤＡによってＩｎｓｉｇｈｔｅｃ（イスラエル、ハイファ、１９９９年設立）に対して承認されたシステムは１つだけである。現在、数千のＭＲＩシステムが使用されているが、世界中に設置されているシステムはわずか２１台である。さらに、コンパクトでポータブルなＵＳＮＭツールを作成することは困難である。ＤＢＳ（埋め込まれたパルス発生器から脳内の電極に電荷をデリバリーするために鉛繊維を利用することを含む）と同様に、ＵＳＮＭは症状の継続的な抑制を達成するために慢性的に適用する必要がある。したがって、コンパクトでポータブルな設計のＵＳＮツールが必要である。しかし、既存のＵＳＮツールは剛性が高く、大きなアンプが必要である。
［００９８］
したがって、非侵襲的でＭＲＩ互換性があり、ウェアラブルで広くアクセス可能な非侵襲性神経調節ツールを提供するという満たされていないニーズがある。本開示の実施形態によれば、ファイバーベースの光音響変換器（Ｆｉｂｅｒ－ｂａｓｅｄ Ｏｐｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ、ＦＯＣ）による光音響脳変調は、ＴＦＯＥ１００と同様の刺激をもたらす。例示的な例として、図３８Ａは、パルスレーザー３８１０がＦＯＣ３８００を介して神経突起組織３８５０に刺激をデリバリーするときの、ファイバーベースの光音響変換器（ＦＯＣ）による光音響脳変調の概略図を表わす。図３８Ｂは、ＦＯＣが光音響刺激を生成し、ＦＯＣ３８００を介して光音響信号３８１２を生成する際のＦＯＣの概略図を表わす。そうするために、パルスレーザー３８１０は、２００μｍのファイバー３８１４を介してデリバリーされ、それによって、ＴＦＯＥ１００と同様に、ＺｎＯ／エポキシ混合物拡散層３８１６及びグラファイト／エポキシ混合物吸収／膨張層３８１８と係合して、信号３８１２を生成する。これを説明するために、図３９Ａ～Ｃは、初代ニューロンをオレゴングリーンで染色した、培養初代ニューロンにおいてカルシウム過渡現象を誘導するＦＯＣ３８００の画像及びグラフ表示をもたらす。さらに、図４０Ａ～Ｂは、切断ツール３８４６及びＦＯＣ３８００を含む、マウスの脳においてインビボで神経活性化を誘導するＦＯＣ３８００の画像及びグラフィック描写をもたらす。ただし、ＦＯＣ３８００は侵襲的であるため、外科的特性があるため、常に最適であるとは限らない。
［００９９］
本開示によれば、ＡＭＲＩ互換のソフト光音響パッド（ＳＯＡＰ）を使用する非侵襲性神経変調システムは、この問題を解決する。図４１は、治療としてＡＭＲＩ互換ソフト光音響パッド（ＳＯＡＰ）を使用する非侵襲性神経変調システムの例示的な概要を提供する。ＳＯＡＰ４１００は、水４１４４、ＰＤＭＳ整合層４１４０、及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合層４１４２を利用して、神経突起組織に集束超音波治療を施す。図４２は、ＳＯＡＰ４１００がこの集束超音波４１２４を治療位置に提供する方法の例示的な概略図を提供し、同様にレーザーパルス４１１０及び光ファイバー４１１４によって可能になる。集束超音波４１２４は、ＳＯＡＰ４１００内の水の量を変更することによってさらに調整できる。図４３は、異なる超音波４１２４及び４１２５の波長をそれぞれ比較することによって、ＳＯＡＰ４１００がどのように適応焦点調整を提供できるかを示す概略図を表わす。
［０１００］
本明細書の例示的な実施形態によれば、この処理は、図４４Ａ～図４４Ｉに適用される。図４４Ａ～Ｃは、光音響放射における静的工学的位相プロファイルを表す湾曲光音響フィルムによる集束超音波の発生に関する例示的な実施形態を示す画像を提供する（スケールバー：５ｍｍ。ＵＳ：超音波（緑）、ＯＡ：光音響（赤））。図４４Ｄ～Ｆは、ラットの頭蓋骨が存在しない場合を示す生成された超音波画像を提供し、図４４Ｇ～Ｉは、ラットの頭蓋骨が存在する場合を示す画像を提供する。
［０１０１］
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰ４１００（例えば、焦点で４ＭＰａ（骨なし）、＜０．６５ＭＨｚの超音波放射を伴う）の設計及び製造が意図される。さらに、経頭蓋ＵＳ送信には０．６５ＭＨｚ未満の超音波が必要であると考えられている。焦点での１ＭＰａは、損傷を与えることなくヒトの脳の反応を誘導するのに十分であることが示されている。さらに、ヒトの頭蓋骨による圧力レベルの４倍の減衰が予想される。図４５は、ＳＯＡＰ４１００システムのセットアップダイナミックの概略図を提供する。レーザーパルス４１１２は、それぞれＦＧ１及びＦＧ２を介して、光ファイバー４１１４を介してＳＯＡＰ４１００治療領域上の空気４１２６に前記パルス４１１２をもたらす。ＳＯＡＰは、調整可能な水４１４４、ＰＤＭＳ整合層４１４０、及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２からなる。
［０１０２］
例示的な実施形態を続けると、成形によるＳＯＡＰ４１００内に挿入することができるＳＯＡＰパッド４１２２の製造が、ＳＯＡＰパッド４１２２の製造プロセスの概略図を提供する図４７を介して指示される。３０％ＣＮＦの溶液を半径２５ｍｍの金型に注入する。溶液を金型内で焼成して形成し、ＰＤＭＳを添加して発光ＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２を形成する。得られた生成物４１４２には、追加のＰＤＭＳが注入され、ＰＤＭＳ整合層４１４０と共に剥離され、ＯＤにカットされ、ＰＤＭＳ整合層４１４０及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２を含むＳＯＡＰパッド４１２２を形成する。ＳＯＡＰ４１２２は、図４６に示すように、さまざまなターゲットに合わせてさらにスケーリング及び調整でき、これは、想定されるヒトとマウスの被写体の直径と焦点距離パラメーターの概要を表形式で提供している（ヒト：直径３０ｍｍ、焦点距離２５ｍｍ、マウス：直径５ｍｍ、焦点距離３ｍｍ）。ＳＯＡＰ４１００はソフトポリマーベースであることが想定されている。
［０１０３］
本明細書の実施形態によれば、光音響刺激の所望の強度は、型の直径及び焦点距離に応じて変化するはずである。図４８は、異なる厚さの超音波波形に関するシミュレーションデータのグラフ表示を提供する。図４９は、対応する周波数スペクトルに関連するシミュレーションデータのグラフ表示を提供する。図５０は、ヒトの頭蓋骨の厚さが６ｍｍであり、横方向のＦＷＨＭが４．６ｍｍである内部焦点に関するシミュレーションデータの画像を提供する。
［０１０４］
これにより、マウスの脳スライス上でエクスビトロでＳＯＡＰ４１００を利用することができる。例示的な実施形態によれば、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１４～１６週齢）を標本として利用することができ、定位固定マウスの脳マップに応じて、厚さ０．５ｍｍの１２枚の連続する冠状画像スライスに焦点を合わせ、最初のスライスはブレグマの２ｍｍ吻側に配置される。図５１は、ＭＲＩチャンバ４１３６内でレーザーパルス４１１２、光ファイバー４１１４、及びＭＲＩユニット４１３０をそれぞれ介してエクスビボで神経変調を受けている拘束されたマウス被験者４１２８の図を表わす。パラメーターは、時間分解能１秒のグラディエントエコーエコープラナーイメージング（ＧＥ－ＥＰＩ）シーケンス（ＴＲ／ＴＥ＝１，０００／１２ｍｓ、フリップアングル６０°、マトリックス８０×３５、１平均）を使用したＢＯＬＤ－ｆＭＲＩイメージングが想定されている。さらに、使用する各マウスで１ｋＨｚのレーザー繰り返し速度で２００ｍｓＳＯＡＰ変調が実行されることが想定されている。
［０１０５］
さらに、ＳＯＡＰ４１００は、自由に動くマウス被験者の神経調節によってインビボに非侵襲的に適用できる。図５２は、非侵襲的なインビボ神経調節を受けている自由に動くマウス被験者４１２９の図を表わす。ＳＯＡＰ４１００は、自由に動くマウスの実験に着用できるほど軽量でコンパクトであると考えられている。ＳＯＡＰ４１００は、レーザーパルス４１１２、光ファイバー４１１４、及びＳＯＡＰ４１００を介して、マウスの左半球の一次運動野及び二次運動野を標的とすることが想定されている。ＳＯＡＰ４１００がオンの場合、コントロールグループと比較した場合、動きのパターンが変化すると予想され（例えば、ＳＯＡＰ４１００がオンの場合の時計回りの動き）、カメラ４１３４で監視できる。
［０１０６］
図５３は、ＳＯＡＰ４１００デバイスを要約した概略図を表わす。ＳＯＡＰ４１００は、ＭＲＩと互換性のある光動力及びポリマーベースの超音波エミッターであり、初めての非侵襲性光音響インビボ脳変調である。さらに、ＳＯＡＰ４１００は、従来の光音響エミッタ（約数十ＭＨｚ）とは異なる低周波超音波の生成を可能にする。ＳＯＡＰ４１００は、調整可能な水量と成形により、それぞれ集束超音波発生における調整可能な機能と適用性を備えている。このようにして、ＳＯＡＰ４１００は、ＭＲＩ互換の集束超音波を使用して、リアルタイムのＭＲＩガイドによるＢＢＢ開口を可能にする。さらに、ＳＯＡＰ４１００は柔軟で、空気圧ポンプなどのアクチュエータを使用して音響焦点を調整するように設計できる。
［０１０７］
本開示の別の態様によれば、神経回路を解読し、神経疾患を治療するための強力なツールとしての神経調節の使用がさらに詳細に説明される。経頭蓋集束超音波（Ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ ｆｏｃｕｓｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ、ｔＦＵＳ）は、サブＭＨｚの周波数によりミリメートルスケールの空間分解能を提供する。ただし、小動物の脳のサブ領域をターゲットにする場合は、ミリメートル未満の精度が必要である。本開示は、ろうそくのすすナノ粒子をポリジメチルシロキサン球面に埋め込むことによって製造された軟質光音響パッド（ＳＯＡＰ）によって生成される光学駆動集束超音波（ＯＦＵＳ）を含む。ＳＯＡＰは１５ＭＨｚで横方向分解能６６μｍの超音波焦点を生成できるが、これはｔＦＵＳよりも２桁小さい。本開示は、ＯＦＵＳが、マイクロ秒未満の単一サイクル及び０．０６Ｊ／ｃｍ２で、神経刺激に首尾よく使用されたｔＦＵＳと比較して２桁少ない超音波エネルギーでインビトロで神経刺激を達成することを実証する。さらに、本開示は、インビボでのマウス運動皮質におけるミリメートル未満の経頭蓋刺激を実証する。ＯＦＵＳは、ミリメートル未満の精度を非侵襲的に提供することで、インビボでミリメートル未満の精度で非侵襲的な神経調節を行う光学駆動集束超音波を利用して、神経科学の研究と神経疾患の治療に新しい道を開く。
［０１０８］
本明細書の例示的な実施形態によれば、脳機能がどのように行動を制御し、その機能不全が疾患を引き起こすかを理解するには、神経活動を高精度で調節するモダリティが必要である。小動物では、ミリメートル未満の精度の神経調節ツールを使用して、少数のニューロン集団を調節することによって脳のサブ領域をマッピングできる。電気刺激や光遺伝学などの侵襲的方法は、ミリメートル未満のスケールで空間分解能を提供できる。電気刺激ツールは、すでに神経調節研究と疾患治療におけるゴールドスタンダードとなっている。例えば、脳深部刺激は、埋め込まれた電極によっていくつかの病気の効果的な治療を実現する。パーキンソン病、うつ病、てんかんの臨床治療用として承認されている。しかし、現在の広がりにより、ターゲティングの正確な制御が制限されている。光遺伝学は、光を使用してトランスフェクトされたニューロンをトリガーすることにより、標的細胞タイプに比類のない細胞内空間分解能と特異性を提供し、神経科学の研究を進歩させた。マウスの経頭蓋光遺伝学はさらに手術を回避し、５～６ｍｍの貫通深さで横方向に約０．８から１ｍｍの脳領域を刺激することに成功する。ただし、経頭蓋光遺伝学の光透過率は７ｍｍで約０．０２％である。従来の光遺伝学と経頭蓋光遺伝学はどちらも、ヒトの脳での使用がまだ承認されていないウイルスのトランスフェクションに依存している。非侵襲的な方法は、手術のリスクを回避しながら効果的な神経調節を提供する。経頭蓋直流刺激（ｔＤＣＳ）と経頭蓋磁気刺激（ＴＭＳ）は非侵襲的であるが、使用される電磁波の波長が長いため、得られる空間分解能はセンチメートルレベルである。新しい経頭蓋集束超音波（ｔＦＵＳ）は、マウス、ラット、ウサギ、サル、さらにはヒトなどのさまざまなモデルで高精度の非侵襲的神経調節法として実証されている。パルス超音波処理と連続超音波処理の両方が採用されているが、パルス超音波処理の方が神経反応を引き出すための刺激閾値が低いため、より一般的である。組織損傷の可能性を最小限に抑えるために、１００Ｗ／ｃｍ２以内の低強度が使用されている。高い経頭蓋効率を達成するために、空間分解能が数ミリメートルに制限される約１ＭＨｚ以下の低い超音波周波数のｔＦＵＳが推奨される。ヒトの場合、この空間分解能により、視床の個々の核に対応する刺激量を達成できる。小動物の脳のサブ領域を数百μｍのスケールでターゲットにするには、ミリメートル未満の精度を備えた非侵襲性の神経調節ツールが必要である。
［０１０９］
光音響効果は、超音波を生成する別の方法であることに留意されたい。光音響材料は短い光パルスを吸収し、それを一時的な温度上昇と熱膨張に変換し、その結果、超音波パルスが生成される。最近の研究は、高空間分解能の神経刺激のためのファイバーベースの光音響エミッター（ＦＯＥ）を使用してこれを実証した。これらのファイバーベースの光音響エミッターでは、ＴＦＯＥ１００によって前述したように、光音響材料を光ファイバーの先端にコーティングすることができ、コーティングされたファイバーは高度に局所的な超音波の点源として機能し、サブミリメートルから数十μｍまでの解像度を提供し、細胞内構造を選択的に活性化することができる。ただし、局所的な神経調節に近接場超音波を利用するため、ファイバーベースの光音響エミッターは神経組織に外科的に埋め込む必要があり、経頭蓋的に適用することはできない。
［０１１０］
本開示の例示的な実施形態によれば、ミリメートル未満の精度で非侵襲的な神経調節のための光学駆動集束超音波（ＯＦＵＳ）５４００が提示される。以前に提示されたＳＯＡＰ４１００に加えて、フィルムは、非侵襲的な変調のための集束超音波を生成するように湾曲することができる。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）とカーボンベースの吸収体をベースにした湾曲したＳＯＡＰ５４１０を製造することができ、より厳密な空間集束と焦点圧力の最大化が可能になる。したがって、曲率の直径は、理論上の限界（ＮＡ＝１）に近い開口数（ＮＡ＝０．９５）に達するように調整できる。光音響効果によって光子を音響波に効率的に変換するために、ＳＯＡＰ５４００には、熱収縮膜（ＨＳＭ）、ポリジメチルシロキサン混合カーボンナノチューブ（ＣＮＴ－ＰＤＭＳ）、ＰＤＭＳ混合カーボンナノ粒子（ＣＮＰ－ＰＤＭＳ）、ＰＤＭＳ積層ろうそくのすす（ＣＳ－ＰＤＭＳ）など、４つの異なる光音響材料に基づいて設計された曲率を含めることができ、製作してテストすることも可能である。したがって、それらの光音響変換効率は、製造されたこれらのＯＦＵＳの焦点の圧力を測定することによって比較することができる。ＣＳ－ＰＤＭＳ ＯＦＵＳ５４００を使用すると、本開示は、０．６２ｍＪ／ｃｍ２のレーザー入力で超音波焦点で約４８ＭＰａをもたらす。さらに、経頭蓋能力を備えた約６６μｍの空間分解能を持つＣＳ－ＰＤＭＳ ＯＦＵＳがさらに実証され、ｔＦＵＳによって提供される数ミリメートルの分解能から２桁の向上を達成する。カルシウムイメージングにより、本開示は、インビトロでの培養ニューロンにおいて、ＳＯＡＰ５４１０による直接的かつ経頭蓋単一パルス刺激を確実かつ安全に達成する。ＳＯＡＰ５４１０の総超音波エネルギー入力は、同様のレベルのニューロン応答を引き起こす従来の超音波トランスデューサーでデリバリーされるエネルギーよりも２桁少ない。免疫蛍光イメージングを使用して、本開示は、マウスの脳におけるサブミリメートルの刺激量を視覚化することを含む。さらに、本開示は、電気生理学的記録を使用して、インビボでＳＯＡＰ５４１０を用いてマウスの運動皮質を非侵襲的に刺激することによって機能的結果を検証することを含む。
［０１１１］
本開示は、ＳＯＡＰ５４１０の製造及び光音響効率の最適化をさらに詳細に表わす。ミリメートル以下の精度で集束超音波場を生成するために、生成される音場を予測し、ＳＯＡＰ５４１０の幾何学的設計を最適化するための数値シミュレーションが示されている。図５４Ａは、ＳＯＡＰ５４１０の概略図を示す。ナノ秒レーザー５４１２が、ＳＯＡＰ５４１０の底部から送出される。光音響効果は、湾曲したＳＯＡＰ５４１０の表面で超音波５４１４を生成し、湾曲上の異なる角度から放射された波５４１４は、同位相でその幾何学的中心５４１６に到達する。幾何学的中心５４１６は、ろうそくのすす５４１８を含み、ＰＤＭＳ層５４１９上に配置される。焦点距離２ｍｍは、超音波が頭蓋骨を貫通し、マウスの脳の皮質層に到達して刺激できるように設計されている。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）のｋ－ｗａｖｅツールボックスを使用して数値シミュレーションを実行して、生成される音場を計算できる。ＳＯＡＰ５４１０で生成されたＯＦＵＳ５４００は、適用シナリオを模倣するために、エアバッキングで水中に伝播する。したがって、炭素ベースの吸収体の報告されたデータに従って、中心周波数１５ＭＨｚと帯域幅２００％を設定できる。これにより、焦点距離と調整された半径と曲率直径が固定され、ミリメートル以下の精度が得られる。したがって、曲率直径と半径の比は、開口数（ＮＡ）に比例する。横方向の解像度は、横方向プロファイルの半値全幅として定義される。横方向解像度とＮＡの関係を図５４Ｂにプロットする。ＮＡが高いほど、横方向の解像度はより正確になる。図５４Ｂにおいて、オレンジ色の領域５４２０は、従来の超音波トランスデューサーにおけるＮＡの範囲を表わす。従来の単素子集束超音波トランスデューサーの製造プロセスでは、単結晶圧電材料に亀裂が生じるため、高いＮＡを達成することが困難であった。しかし、光音響材料では、同じ超音波周波数で従来のトランスデューサーが提供できる最良の横方向分解能の半分を提供するため、理論的限界に近い高いＮＡが実現可能である。
［０１１２］
１５ＭＨｚで横方向の分解能を限界まで高めるには、理論上の限界に近い０．９５のＳＯＡＰの高いＮＡを選択できる。これにより、ＳＯＡＰ５４１０の半径は６．３５ｍｍに最適化され、曲率の直径は１２．２ｍｍに設定される。この幾何学的形状は、図５４Ｃ（これは、設計されたジオメトリを持つｋ波シミュレーションでＳＯＡＰ５４１０によって生成された音場の画像５４３０である）に詳述されているように、予想通り、曲率の中心にＯＦＵＳ５４００をもたらす。挿入図は音響焦点で拡大したもので、スケールバーは２００μｍである。生成されたＯＦＵＳは、－６ｄＢで７８μｍの横方向分解能、２０９μｍの軸方向分解能を備えている。この空間分解能は、小動物のサブミリメートル精度の神経刺激には十分である。
［０１１３］
例示的な実施形態を続けると、本開示は、そのような高いＮＡがＯＦＵＳ５４００に高い横方向解像度を提供するだけでなく、焦点における高い焦点ゲインも提供することを表わす。横分解能の概念を音響分解能の光音響顕微鏡に適用することにより、ＯＦＵＳ５４００の横分解能は次の式で計算できる。
［数４］
ここで、νは周囲音速、ｆは中心周波数である。この式により、ＯＦＵＳの理論的な横方向分解能Ｒ＿Ｌ＝７５μｍとなり、これはシミュレーション結果と一致する。さらに、高ＮＡ球面により、低いＦ値と高い焦点ゲインＧが得られる。これは、次の式に従って、焦点の圧力と球面上の圧力の比によって定義される。
［数５］
この式において、ｆ，ｃ0，ｒ，及びｆNは、音響周波数、媒質内の音速、曲率半径、及びＦナンバー（ＳＯＡＰ５４１０の直径に対する曲率半径の比）を表す。水の減衰係数２．２×１０-3ｄＢ／（ｃｍ×ＭＨｚ2）を考えると、ＳＯＡＰ５４１０の有効焦点ゲインＧeff≒２８０を推定できる。この焦点ゲインは、ｆN＝１～４［１、３７～４１］の従来の超音波トランスデューサーの焦点ゲインと比較して５～９２倍高くなる。ＮＡを限界まで高めることにより、横方向分解能の精度を１５ＭＨｚで最大化することができ、従来の集束超音波トランスデューサーと比較して焦点の圧力を桁違いに改善することができる。
［０１１４］
本明細書の例示的な実施形態によれば、光音響変換効率を最適化するために、ＨＳＭ５４４２、ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４、ＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４４６、及びＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を含む、記載された幾何学的設計に従ってＳＯＡＰを製造するための４つの材料の調製は、詳細は図５４Ｄに示されている。左から右、上から下に、熱収縮膜５４４２、カーボンナノチューブ－ＰＤＭＳ５４４４、カーボンナノ粒子－ＰＤＭＳ５４４６、及びろうそくのすす－ＰＤＭＳ５４４８を示す。スケールバー：５ｍｍ。ＨＳＭ５４４２の場合、弾性黒色ポリオレフィン自体が光吸収材と膨張材として同時に機能する。残りの３つの設計であるＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４、ＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４４６、及びＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８では、炭素ベースの材料が光吸収材料としてＰＤＭＳに埋め込まれており、拡張材料として機能する。これらは曲率面で混合物を形成し、光音響変換を最大化する。ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を製造する方法も本開示によって提供される。簡単に説明すると、金属球をろうそくのすすで１０～１５秒間コーティングし、ＰＤＭＳに浸す。次に、ＰＤＭＳを１１０℃で１５分間硬化することにより、このろうそくのすすの層をＰＤＭＳに転写する。金属ボールを除去すると、ＳＯＡＰのＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８が得られる。他のすべてのＳＯＡＰの作成方法については、後で説明する。
［０１１５］
転写プロセスでＣＳとＰＤＭＳがよく混合されたマトリックスが生成されるかどうかを調査するには、ＳＯＡＰのＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を厚さ約２００μｍの薄層にスライスし、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して形態を検査する。厚さ２．７μｍのＣＳとＰＤＭＳからなる均一に混合された層が観察され、図５４Ｅの純粋なＰＤＭＳ層５４５２から分離されており、赤い破線がＣＳとＰＤＭＳの混合領域と純粋なＰＤＭＳ領域を分けている。スケールバー：１μｍ。この厚さは、ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８の最適な光音響変換のための理論上の厚さ２．１５μｍに非常に近い。ＳＥＭ画像から、ＣＳナノ粒子の直径は約５５ｎｍであることがわかる。さらに、ＣＳ層５４５２の堆積速度は約２００μｍ／ｓであり、これも文書化された速度と一致している。形態に加えて、ＣＳ－ＰＤＭＳ複合材料の構造の化学組成は、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）や光熱イメージングを使用してさらに研究できる。ＰＤＭＳにおけるＣ－Ｈ結合のフェムト秒ＳＲＳは、２つのビームが時間的に重なったとき（ｔ～０秒）、特定の位相（ここではＸチャネルとして割り当て）でのみ発生し、一方、ろうそくのすすのポンププローブ信号（Ｙチャネル）は、ほぼすべてのフェーズで発生し、減衰が非常に長くなる。したがって、１つの純粋なＣＳ５４５４サンプルとＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８サンプルを準備し、２つの材料の空間分布を化学的に区別することができる。結合画像５４５０は、ＣＳ及びＰＤＭＳの均一マトリクスが図５４Ｆによって作成されたことを示しており、赤：ＰＤＭＳ、シアン：ＣＳ、スケールバー：２μｍである。このような均一な混合物により、熱光吸収性ＣＳのＰＤＭＳへの迅速な移動が可能になり、これが効率的な光音響変換の基礎となる。
［０１１６］
本明細書の例示的な実施形態によれば、４つの製造されたＳＯＡＰの光音響効率を特徴付けるために、８ｎｓパルス幅を有する１０６４ｎｍパルスレーザーを各設計に供給してＯＦＵＳ信号を生成することができる。図５４Ｇに詳述するように、０．６２ｍＪ／ｃｍ２のレーザー入力を用いて各ＯＦＵＳから生成された光音響信号の波形及び圧力を針ハイドロフォンによって記録した。ＨＳＭグラフ線５４６２は最小の振幅を提供し、ＣＮＴ－ＰＤＭＳグラフ線５４６４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳグラフ線５４６６と比較して５倍小さい。ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４６４とＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４６６からの信号は同じレベルであったが、ＣＳ－ＰＤＭＳグラフ線５４６８はそれらより６倍大きい約４８ＭＰａを生成した。これは以前の取り組みと一致している。ＦＦＴ変換によって波形を分析した後、ＯＦＵＳ信号の周波数スペクトルが得られ、図５４Ｈに詳細が示されている。ＨＳＭグラフ線５４７２の中心周波数は約３ＭＨｚ、ＣＮＴ－ＰＤＭＳグラフ線５４７４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳグラフ線５４７６の中心周波数は約５ＭＨｚであり、一方、ＣＳ－ＰＤＭＳグラフの線５４７８は、最高の中心周波数約１５ＭＨｚと、５ＭＨｚ及び３５ＭＨｚで定義された－６ｄＢ幅を持っている。これらの特徴に基づいて、いくつかの実施形態では、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰはさらなる実験の対象となるのに理想的である可能性がある。これは、他のＳＯＡＰと比較して光音響変換効率が最も高いためだけでなく、最も広い帯域幅により、最も厳密な焦点と最短のサイクル期間が提供され、時空間制御が向上するためでもある。このようにして、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰは、実証可能な高ＮＡ、高焦点ゲイン、及び神経刺激用の焦点におけるボード帯域幅を備えて製造できる。
［０１１７］
本開示の別の態様によれば、ＯＦＵＳは、高い空間分解能及び経頭蓋効率を実証する。ＯＦＵＳが非侵襲的用途で頭蓋骨を貫通した後も高解像度を維持できることを実証するために、マウスの頭蓋骨の一部を貫通する前後でＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰの空間解像度を特徴付けることができる。図５５Ａは、針ハイドロフォンを備えたＳＯＡＰによって生成される超音波を特徴付けるための実験設定の概略図である。図５５Ａでは、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５５１２は、レーザーパルス５５１６で照射された水槽５５１４内に配置される。針ハイドロフォン５５１８は、ＳＯＡＰ５５１２の上部から超音波５５２０の振幅及びプロファイルを取得するために使用される。経頭蓋能力テストでは、マウスの頭蓋骨をＯＦＵＳのサイズ（厚さ～０．１５ｍｍ）に注意深くトリミングし、ハイドロフォン５５１８とＯＦＵＳの間に置く。図５５Ｂは、マウスの頭蓋骨を使用しない場合と使用する場合のＳＯＡＰ５５１２によって生成された正規化された音響波形のグラフである。ＯＦＵＳの経頭蓋効率は、図５５Ｂに示すように、経頭蓋超音波信号の振幅を元の信号の振幅と比較することによって計算することができる。これにより、経頭蓋信号が元の信号に正規化され、鮮明な表示が得られる。グラフ線５５２４におけるマウス頭蓋上のＯＦＵＳの経頭蓋効率は６９％であり、これは５ＭＨｚの従来の超音波トランスデューサーのグラフ線５５２６における３８％と比較して著しく高い。これは、ＯＦＵＳの帯域幅が広いためである。高周波成分は吸収及び反射されるが、低周波成分は依然として頭蓋骨を貫通する可能性がある。マウスの頭蓋骨の有無にかかわらず焦点サイズを特徴付けるために、図５５Ｃ及び５５Ｄで詳述するように、焦点を掃引して横方向及び軸方向のプロファイルを取得することができる。図５５Ｃは、それぞれグラフ線５５３６及び５５３４におけるマウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの横方向解像度のグラフである。図５５Ｄは、それぞれグラフ線５５４６及び５５４４におけるマウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの軸方向分解能のグラフである。ハイドロフォン５５１８はＸＹＺ移動ステージに取り付けられ、１２．７μｍのステップで移動してプロファイルを取得する。すべてのプロファイルは、比較のために元のプロファイルに正規化された。したがって、図５５Ｃ及び５５Ｄのデータは、マウス頭蓋骨の貫通後のプロファイルに明らかな変化を示していない。横方向及び軸方向の解像度は、それぞれの方向の半値全幅（ＦＷＨＭ）に従って定義される。ＯＦＵＳの横方向と軸方向の解像度は、それぞれ６６μｍと２８４μｍから８３μｍと２８７μｍに変化した。ＯＦＵＳの元の解像度はシミュレーションデータに近い。これらの分解能は、超音波神経変調で通常使用される低周波超音波の分解能（０．５ＭＨｚトランスデューサーの場合それぞれ約５ｍｍと約４０ｍｍ）と比較して２桁正確であることに留意されたい。
［０１１８］
例示的な例を続けると、ＯＦＵＳの焦点領域の位置を調べるために、超音波焦点の伝播を光音響断層撮影システムによって視覚化することができる。レーザーパルスはＳＯＡＰ５５１２の底部から送出される。ＳＯＡＰ５５１２、マウスの頭蓋骨５５５０の位置、及び光音響信号は、１２８素子の超音波トランスデューサーアレイによって上部から記録され得る。合成された画像からは、焦点の位置に大きな変化は観察されなかった。図５５Ｅ～５５Ｆは、頭蓋骨５５５０がない場合（５５Ｅ）及び頭蓋骨５５５０がある場合（５５Ｆ）の、ＳＯＡＰ５５１２により生成された超音波伝播の画像である。白い破線はＳＯＡＰ５５１２を示す。赤い破線はマウスの頭蓋骨を示し、スケールバーは２ｍｍである。図５５Ｅ～５５Ｆでは、超音波トランスデューサーアレイの遅延を調整することによって、ＯＦＵＳの伝播プロセスを表面から焦点領域まで再構成することができる。比較のために、画像を元の伝播信号に合わせて拡大縮小した。これらの伝播結果は、緊密な焦点を生成する光音響信号の干渉プロセスを示すだけでなく、このプロセスがマウスの頭蓋骨の存在によって大きく影響されず、緊密な経頭蓋焦点を維持することも示している。
［０１１９］
本開示の別の態様によれば、ＳＯＡＰは、一次皮質ニューロンの直接的かつ経頭蓋刺激を可能にする。ＳＯＡＰの高い光音響効率と緊密な経頭蓋焦点の実証により、ＳＯＡＰが培養ニューロンの反応を誘発できるかどうかも評価できる。例示的な例として、ＧＣａＭＰ６ｆを発現するラットからの初代皮質ニューロンをインビトロ研究に使用することができる。図５６Ａは、直接インビトロ刺激実験デバイスの概略図である。カルシウム信号は、図５６Ａに示すように、倒立広視野顕微鏡及びＣＭＯＳカメラ５６１８からなる蛍光画像化システム５６１０によって記録することができる。実験の前に、入力レーザー５６１４の光路をイメージングシステム５６１０と位置合わせする必要がある。次に、ＳＯＡＰ５６１２は、カスタマイズされたホルダーによってＸＹＺ移動ステージに取り付けられ、入力レーザー５６１４の光路と位置が合うように慎重に調整される。ＳＯＡＰは、培養ニューロン５６１６の約２ｍｍ上に配置できる。ＸＹ方向の焦点を見つけるために、９．９μｍの蛍光ビーズをインジケーターとして使用できる。レーザー５６１４がオンの場合、音響放射力によるビーズの動きによって超音波焦点の位置を視覚化できる。ビーズの動きに基づいて、直径の焦点は約１００μｍにあることが特定され、これはテストされた横方向の解像度と一致している。神経刺激の場合、パルス幅８ｎｓの１０６４ｎｍの単一パルスを送信でき、これにより光音響信号の単一サイクルが生成される。これに続いて、３７個のニューロンからのカルシウムのトレースが記録され、分析された（Ｎ＝７皿）。図５６Ｂは、５６２２及び５６２４でそれぞれ刺激の前後で３．５ｍＪ／ｃｍ２の入力レーザーエネルギーで観察されたカルシウム過渡状態の代表的な画像を示す。一番右のパネルは、５６２６での最大ΔＦ／Ｆを示している。ニューロンの活性化は視野の中心でのみ観察され、残りの部分は反応を示さなかった。これは、サブミリメートルの空間分解能を有するＳＯＡＰの局所刺激能力を実証した。３７個のニューロンの中には、一過性反応と長期反応という２種類の反応が観察される。図５６Ｃは、過渡的な動態の平均化されたカルシウムトレースのグラフである。図５６Ｃでは、これらの２つの応答は５秒の減衰時定数で分離されている。過渡応答は、τ＝４．２秒の減衰時定数を示す。反応は、レーザー開始直後の焦点でグラフ線５６３０によって観察され、最大ΔＦ／Ｆは３１％±８％（３つの培養からＮ＝６、データは平均±ＳＤ）であり、単一サイクル刺激が成功したことを示している。この１サイクルは０．２６μｓ続く。シングルサイクル刺激のデューティサイクルは、１秒間のサイクル期間として定義される。ＯＦＵＳは２．６×１０＾（－４）％という超低デューティサイクルを実現する。延長された応答の時定数はτ＝７．８秒である。これらのニューロンについては、図５６Ｄにおいてレーザー開始直後に６２％±１２％の最大ΔＦ／Ｆが観察される（４つの培養からのＮ＝３１）。図５６Ｄは、ＯＦＵＳ刺激の長期にわたる動態の平均化されたカルシウムトレースのグラフである。ここで、黄色の縦線はＯＦＵＳ刺激を示し、平均トレースは実線で、平均の標準誤差はグラフ線５６４０の影付きで示されている。これらの活性化は焦点で観察されるだけでなく、ネットワークを通じて伝播される。さまざまなダイナミクスの現象を理解するために、各応答の閾値を調べることができる。入力レーザーエネルギーは低く開始され、ニューロンの応答が記録されるまで増加する。図５６Ｅは、一時的刺激及び長期的刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。したがって、図５６Ｅは、５６５０における一時的及び長期の活性化を引き起こす平均化された閾値を示す。過渡応答の閾値は３．８±０．５ｍＪ／ｃｍ２であり、長時間応答（５．７±１．８ｍＪ／ｃｍ２）の閾値よりも大幅に低くなる（２サンプルｔ検定、７つの培養からのＮ＝３７、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ニューロンのこのような能力は機械的刺激の大きさを区別し、より長い時定数を伴うより高い振幅の刺激に対する応答はいくつかの報告とよく一致する。
［０１２０］
例示的な例を続けると、ＳＯＡＰによる神経刺激の安全性を実証するために、ニューロンを繰り返し刺激できるかどうかも示される。このようにして、単一サイクル刺激を２分間隔で３回、同じグループのニューロンに与えることができる。レーザーエネルギーは３．５ｍＪ／ｃｍ2であった。図５６Ｆは、５０μｍのスケールバーでの各刺激の最大ΔＦ／Ｆの画像を示しており、それぞれ画像５６６２、５６６４、又は５６６６で観察される形態の目に見える変形又は損傷はない。図５６Ｇは、対応するカルシウムトレースを示すグラフである。同様の振幅の最大ΔＦ／Ｆを伴うトレースがグラフ線５６７０で記録され、繰り返しの刺激後にニューロンの機能的損傷が観察されないことが実証された。ニューロンの生存能力は、６．５ｍＪ／ｃｍ2及び８．４ｍＪ／ｃｍ2で繰り返し刺激した後にさらに実証された。これら２つのエネルギーレベルは、安全性実証のための余分なマージンを残すために、閾値より７０％高く選択された。したがって、ニューロンの５つのグループが各エネルギーレベルで研究された。各グループについて、５秒の間隔で１０個のパルスがデリバリーされた。各パルスには、１０Ｈｚの３サイクルが含まれていた。細胞生存率を計算するには、３０分間のインキュベーション後に焦点の２００×２００μｍ2の領域内の生細胞と死細胞をカウントする。対照として光のグループは実施しなかった。その結果、刺激群と対照群との間で細胞生存率に有意差は観察されなかった。これらのデータを総合すると、ＯＦＵＳがニューロンの形態や機能に損傷を与えることなく、繰り返しかつ確実にニューロンを刺激できることがわかる。
［０１２１］
注目すべき点は、ＳＯＡＰで同様の振幅の神経反応を引き起こすのに必要な総エネルギーが、従来の超音波と比較して数桁少ないことである。神経刺激は、インビトロでのＳＯＡＰ実験とまったく同じ実験設定で、０．５ＭＨｚの従来の集束超音波トランスデューサーを使用して実行される。このプロセスは、超音波強度を低くし、持続波（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｗａｖｅ、ＣＷ）の超音波を短時間照射することから始まった。次に、最大ΔＦ／Ｆ＞１０％の神経反応が記録されるまで、強度を持続時間とともに段階的に増加させることができる。例示的な例として、実験設定において、５００ｍｓの継続時間で３．０２×１０4Ｗ／ｃｍ2の超音波強度が最大１８％のカルシウム反応を引き起こすことが実証された。従来のトランスデューサーと比較して、ＳＯＡＰはまったく同じ状況で６桁少ないエネルギーで、同様のレベルのニューロン応答を引き起こす。図５７は、同様の振幅のニューロン応答を引き起こすための実験条件及び総エネルギーを含む表である。図５７の表５７００に示すように、約１５％のカルシウム応答を誘発する従来のトランスデューサーを用いた以前の研究と比較しても、ＳＯＡＰは２桁少ないエネルギーをデリバリーした。これは、光音響効果の恩恵を受ける独自のシングルサイクル刺激モードによるＳＯＡＰの高い刺激効率を示している。
［０１２２］
本開示の別の態様によれば、経頭蓋刺激能力を試験するために、マウスの頭蓋骨の一部を貫通することによって、ＯＦＵＳによる神経刺激をさらに研究することができる。図５８Ａは、経頭蓋インビトロ刺激実験デバイス５８１０の概略図である。例示的な例として、マウスの頭蓋骨の一部５８１２がＳＯＡＰ５８１４の曲率に埋め込まれた。ＳＯＡＰ５８１４はレーザーパルス５８１１によって上から照射され、ＧＣａＭＰ６ｆニューロン５８１６の蛍光イメージングはカメラ５８１８によって細胞培養皿の底から記録された。超音波焦点５８１３は、前述のように、移動ステージと蛍光ビーズによって位置合わせされた。したがって、図５８Ｂは、ＯＦＵＳによる経頭蓋刺激の前後のカルシウム信号の代表的な画像及びビデオ、及びそれぞれ５８２２及び５８２４における対応する最大ΔＦ／Ｆ画像を示す。一番右のパネルは、５８２６での最大ΔＦ／Ｆを示しており、全体で５０μｍのスケールバーが使用されている。視野の中央にあるニューロンのみが活性化され、高精度の刺激に対して経頭蓋焦点がまだしっかりと固定されていることが確認された。ＯＦＵＳによる単一サイクル刺激により、２７％±５％の最大ΔＦ／Ｆを有する成功した刺激が、図５８Ｃのグラフ線５８３０によって記録され（７培養からのＮ＝１８）、これは、経頭蓋ＯＦＵＳ刺激の平均カルシウム応答トレースのグラフである。ここで、黄色の縦線はＯＦＵＳ刺激を示し、平均トレースは実線で、平均値の標準誤差は影付きで示されている。直接刺激と経頭蓋刺激の閾値は図５８Ｄで比較され、これは単一パルスによる直接刺激と経頭蓋刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。直接刺激の平均閾値は５．４±１．５ｍＪ／ｃｍ２であったが、経頭蓋刺激の閾値は７．７±１．１ｍＪ／ｃｍ２であった（２サンプルｔ検定、１１培養からのＮ＝４６、＊＊＊ｐ＜０．００１）。マウス頭蓋骨の貫通の減衰によるこのレーザーエネルギーの増加は、ＯＦＵＳの経頭蓋効率の６９％という以前の結果と一致していた。まとめると、これらの結果は、ＯＦＵＳが皮質ニューロンを直接及び経頭蓋的に刺激する能力を示している。
［０１２３］
本開示の別の態様によれば、ＯＦＵＳはインビボで高精度の神経刺激を仲介する。培養ニューロンの直接的かつ経頭蓋的な刺激に成功したことにより、本開示は、ＯＦＵＳが生きている動物のニューロンを活性化できるかどうかも含む。例示的な例として、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをインビボでの刺激に使用し、刺激の効果を免疫蛍光法及び電気生理学記録によって評価した。マウスをイソフルランで深く麻酔し、毛を剃って頭皮を露出させた。図５９Ａは、インビボでのＯＦＵＳ刺激の実験設定の概略図である。ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５９１０は、カスタマイズされた３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられ、ＸＹＺ移動ステージに取り付けられた。入力レーザー５９１２は上部からデリバリーされ、生成された超音波の焦点は定位座標（内側－外側：１．５、前－後：０．５）に基づいて運動皮質と注意深く位置合わせされた。したがって、図５９Ｂは、刺激領域５９２２及び対照領域５９２４内のｃ－Ｆｏｓ及びＤＡＰＩ染色の画像のセットである。参考として、赤：ｃ－Ｆｏｓ、青：ＤＡＰＩ、オレンジ色の輪郭：ＯＦＵＳ刺激領域、緑の輪郭：対側領域の対照群。スケールバー：中央及び下のパネル、５０μｍ。まず、刺激を受けた神経細胞のｃ－Ｆｏｓタンパク質を標識することで刺激領域を可視化する。強力なｃ－ｆｏｓ発現を誘導するために、１０Ｈｚで２０パルスのパルス列に対して１．０ｍＪ／ｃｍ2（ピークツーピーク圧力３９ＭＰａに相当）のレーザーエネルギーでＯＦＵＳ刺激を適用した。これは、３３％のデューティサイクルで３０分間続いた。ｃ－Ｆｏｓの発現を最大化するためにマウスを１時間休ませた。次にマウスの脳を抽出し、１０％ホルマリンで２４時間固定した。厚さ１５０μｍの脳スライスをｃ－ＦｏｓとＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。ＯＦＵＳ刺激領域５９２２で観察されたｃ－Ｆｏｓ陽性細胞は、対側領域で対照群５９２４よりも多かった。次に、ＯＦＵＳ群５９２２及び対照群５９２４におけるｃ－Ｆｏｓ陽性細胞の割合を計算した。図５９Ｃは、ｃ－Ｆｏｓ陽性ニューロンのパーセンテージについての統計分析を伴うグラフ５９３０である。パーセンテージは、対照と比較して、ＯＦＵＳグループで有意に増加した（２サンプルｔ検定、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１）。重要なのは、ｃ－Ｆｏｓ信号が直径約２００μｍの領域に限定されており、従来の圧電トランスデューサーベースの経頭蓋超音波刺激（１～５ｍｍ）と比較して優れた空間分解能を示していることである。さらに、ｃ－Ｆｏｓの発現は標的部位に限定されていた。この領域の大きさはＯＦＵＳの焦点サイズに近かった。これは、ｃ－Ｆｏｓの発現がＯＦＵＳの焦点によって直接誘導されたことを示している。間接的な刺激による、標的領域の外側では有意なｃ－Ｆｏｓ発現は観察されなかった。これらの結果は、ＯＦＵＳが高い空間分解能で非侵襲的にニューロンの反応を直接誘発する能力を裏付けている。
［０１２４］
例示的な実施例を続けると、ＯＦＵＳ刺激による機能的結果のさらなる評価が、筋電図検査（ＥＭＧ）法を用いて行われた。ＳＯＡＰ５９１０の焦点はマウスの脳の一次運動野に合わせられ、筋肉のけいれんを引き起こした。筋肉活動を記録するために、図５９Ａに詳述するように、ＥＭＧ電極５９１４を大腿二頭筋と平行に後肢に挿入し、接地電極を尾に挿入した。その結果、１．０ｍＪ／ｃｍ2で２秒の持続時間のレーザーパルス列がＳＯＡＰ５９１０にデリバリーされ、同時に図５９Ｄに示されるように対側後肢から強いＥＭＧ応答（０．４５８±０．０３ｍＶ）が記録された。これは、２秒のＯＦＵＳ刺激５９４２及び光制御なしグループ５９４４の代表的なＥＭＧ記録である（オレンジ色のボックス：レーザーパルス列）。これらのＥＭＧ信号には、レーザーの開始とＥＭＧ応答の間に通常約６１±６ｍｓの遅延があることに留意されたい。バンドパスフィルターと全波整流器で処理した後、ＥＭＧ信号のエンベロープが図５９Ｅにプロットされた。これは、バンドパスフィルター、全波整流器、及びＯＦＵＳ刺激５９４２及び非光の対照群５９４４も測定したエンベロープ後の代表的なＥＭＧ信号である。超音波の聴覚効果によって引き起こされるＥＭＧ反応の可能性を排除するための対照として、定位座標に基づいて体性感覚皮質を刺激した。有意な反応は観察されなかった。この結果は、ＥＭＧ反応が超音波の聴覚効果ではなく、ＯＦＵＳ刺激によって直接誘発されることを示唆している。
［０１２５］
本開示の別の態様によれば、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によるＯＦＵＳ刺激の安全性を評価することができる。例示的な例として、ＥＭＧ記録後、マウスを屠殺し、脳を抽出して固定した。厚さ５μｍの脳スライスを１５０μｍごとに取得し、標準的なＨ＆Ｅ染色を実行した。次に、すべての脳スライスをスライススキャナーで検査し、標的領域と対側領域の対照群とを比較した。図５９Ｆは、ＯＦＵＳ群５９６２及び対照群５９６４の安全性評価のためのインビボ刺激後の組織学的結果を詳述する一組の画像である。そこでは、これらの群間で細胞の形態の有意な変化は観察されなかった。これは、ＯＦＵＳ刺激がマウスの脳に目に見える損傷を誘発しないことを示している。
［０１２６］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＳＯＡＰによって生成された超音波場は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標） Ｒ２０１９ｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、マサチューセッツ州）上のオープンソースのｋ－Ｗａｖｅツールボックスによって２Ｄでシミュレートされた。シミュレーションでは吸収は考慮されなかった。ＳＯＡＰは伝播媒体として水中に超音波を届けた。バッキング材料を空気と設定した。密度と音速はそれに応じて定義された。
［０１２７］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＨＳＭ－ＳＯＡＰ５４４２を製造して、曲率を形成するために、熱収縮チューブ（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ、６３６３Ｋ２１４）に直径１２．７ｍｍのスチールビーズ（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ、９５２９Ｋ２２）を充填し、ヒートガンで加熱して完全に収縮させた。その後、チューブをスチールビーズの大円から２ｍｍ離れたところで切断し、ＨＳＭ－ＳＯＡＰを取得した。
［０１２８］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５４４６を製造するには、５重量％多層カーボンナノチューブ（ＶＷＲ、ＭＦＣＤ０６２０２０２９）及びＣＮＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、６３３１００－２５Ｇ）は、ＰＤＭＳベース及び硬化剤マトリックス（重量比１０：１、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４）とそれぞれ混合した。この混合物を、直径１２．７ｍｍ、焦点距離２ｍｍで設計された３Ｄプリントされた型に注ぎ、真空中で３０分間脱気した。完全に硬化したＣＮＴ－ＰＤＭＳ及びＣＮＰ－ＰＤＭＳサンプルを得るために、混合物をオーブンで６０℃まで２．５時間加熱してから、型から取り出した。
［０１２９］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を製造するために、直径１２．７ｍｍのスチールビーズをパラフィンワックスのろうそくの炎の中心に１０～１５秒間置き、火炎合成されたろうそくのすすのナノ粒子で完全にコーティングした。次いで、コーティングされたビーズを、脱気したＰＤＭＳベース及び硬化剤マトリックス（重量比１０：１）に浸漬し、ＰＤＭＳマトリックスの表面がビーズの大円面よりも２ｍｍ低く残るように調整した。ヒートプレート上で１１０℃で１５分間加熱した後、硬化サンプルが得られた。
［０１３０］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、超音波の生成及び特性評価に、１０６４ｎｍで８ｎｓのパルスを有するＱスイッチＮｄ：ＹＡＧレーザー（Ｑｕａｎｔｅｌ Ｌａｓｅｒ、ＣＦＲ ＩＣＥ４５０）が含まれ、光音響信号を生成するためにＳＯＡＰにデリバリーされた。レーザーはファンクションジェネレーター（３３２２０Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ）によって繰り返し周波数１０Ｈｚで変調された。超音波圧力とプロファイルの測定には、４０μｍの針状ハイドロフォン（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｃｏｕｓｔｉｃ、ＭＨ００４０、５～４０ＭＨｚの範囲に最適化）、水中プリアンプ、及びＤＣカプラーで構成されるシステムが使用された。次に、信号を超音波パルサー受信機（Ｏｌｙｍｐｕｓ、モデル５０７３ＰＲ）で増幅し、４回平均した後デジタルオシロスコープ（Ｒｉｇｏｌ、ＤＳ４０２４）で収集した。針ハイドロフォンの先端は生成された焦点よりも小さいため、取得されたデータＰpeakは焦点内の圧力の一部のみを反映している。超音波焦点上の実際の圧力を推定するために、２５．４μｍステップを実行して、焦点領域のＦＷＨＭにわたる圧力をマッピングした。データを平均して空間平均圧力Ｐaveragedを取得し、係数Ｃを次の方程式Ｃ＝Ｐaveraged／Ｐpeakで取得した。圧力がハイドロフォンの動的上限に達した後、現在の圧力Ｐ0を記録し、信号の飽和とデバイスの損傷を避けるためにハイドロフォンの焦点を外した。記録された圧力はＰ0-outである。次に、レーザーエネルギーを増加させ、圧力Ｐx-outを記録した。現在のエネルギー入力によって生成される焦点Ｐxの圧力は、空間圧力分布が一定であるため、次の方程式Ｐx＝（Ｐ(x-out)／Ｐ(0-out)）×Ｐ0によって推定できる。最終的に推定される空間平均圧力は、Ｐxに係数Ｃを乗算することによって取得される。
［０１３１］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、ＳＥＭイメージング（Ｚｅｉｓｓ、Ｓｕｐｒａ５５ＶＰ）の前に、ＳＯＡＰの薄い断面スライスがＡｕ／Ｐｄで１０秒間スパッタリングされ、アルミニウムスタブ上に取り付けられた。ＳＯＡＰのＳＥＭ画像は、加速電圧として３ｋＶ、開口サイズ２０μｍで得られる。
［０１３２］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＳＲＳ及び光熱イメージングでは、８０ＭＨｚフェムト秒パルスレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐｈｙｓｉｃｓ、ＩｎＳｉｇｈｔＸ３）が使用され、マルチモーダルイメージングシステムに調整可能なビーム（６８０ｎｍ～１３００ｎｍ）と同期ビーム（１０４５ｎｍに固定）が提供される。ＰＤＭＳとろうそくのすすを画像化するために、固定波長ビームとともに調整可能なビームをポンプビームとして８０１ｎｍに設定した。Ｃ－Ｈ結合のフェムト秒誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡用のストークスと、ろうそくのすすのポンププローブ顕微鏡用のプローブビームを同時に使用するためである。ストークス／プローブビームが音響光学変調器（Ｉｓｏｍｅｔ社、１２０５ｃ）によって変調された後、２つのビームがダイクロイックミラーによって結合され、実験室で作成されたレーザー走査型顕微鏡に向けられた。２つのビーム間の時間的遅延は、電動遅延ステージによって制御された。６０倍の水対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＵＰｌａｎＡｐｏ６０ＸＷ、ＮＡ＝１．２）は、共線ビームをサンプル上に集束させた。サンプル上の各ビームのパワーは２ｍＷである。２つのビームはオイルコンデンサー（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ａｐｌａｎａｔ Ａｃｈｒｏｍａｔ１．４、ＮＡ＝１．４）によって前方向に集められ、次にショートパスフィルターによってフィルターされた。フィルタリング後、ポンプビームのみが実験室で製作された共振増幅器を備えたフォトダイオードによって検出された。位相感応型ロックイン増幅器（Ｚｕｒｉｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＭＦＬＩ）は、変調伝達に従って、誘導ラマン損失信号及びポンププローブ信号の検出されたポンプビームを復調した。したがって、ｘ－ｙ－ｔ画像で構図を測定することができる。
［０１３３］
本開示によって提供される例示的な例によれば、光音響トモグラフィーシステムは、カスタマイズされた１２８素子のトランスデューサーアレイ（Ｌ２２－１４ｖ、Ｖｅｒａｓｏｎｉｃｓ社、帯域幅５０％）、及び１２８チャンネルの超音波データ収集システム（Ｖａｎｔａｇｅ１２８、Ｖｅｒａｓｏｎｉｃｓ社）からなる。ＰＡＴシステムは、ファンクションジェネレーターと遅延ジェネレーター（ＤＧ５３５、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってＱｕａｎｔｅｌと同期される。ファンクションジェネレーターはＱｕａｎｔｅｌをトリガーし、遅延ジェネレーターは１０Ｈｚの繰り返しレートのパルスモードでトリガーした。遅延発生器は、光音響信号が生成された後、異なる時間遅延で超音波信号を受信するために、別の調整可能な遅延をＶａｎｔａｇｅ１２８に追加した。遅延を調整することで、光音響信号の伝播過程を可視化できる。
［０１３４］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、胚ニューロンの培養には、５０μｇ／ｍｌのポリ－Ｄ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングされた３５ｍｍガラス底の皿を、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター内で一晩培養し、ニューロンを播種する前に、滅菌水で３回洗浄した。一次皮質ニューロンは、性別を問わずＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（Ｅ１８）に由来し、パパインで消化された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、５％熱不活化ウマ血清（ＨＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、２ｍＭグルタミンダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む培地は、解離した細胞を洗浄及び粉砕するために使用された。細胞を細胞培養皿（直径１００ｍｍ）で湿潤インキュベーター内３７℃で３０分間培養し、線維芽細胞とグリア細胞を除去した。ニューロンを含む上清を収集し、１０％ＦＢＳ＋５％ＨＳ＋２ｍＭグルタミンＤＭＥＭ培地を含むポリ－Ｄ－リジンでコーティングした皿に播種した。１６時間後、培地を２％Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１％Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、及び２ｍＭグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に交換した。グリアの増殖を防ぎ、ＧＣａＭＰ６ｆを発現させるため、５μＭの５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び最終濃度１μｌ／ｍｌのＡＡＶ９．Ｓｙｎ．Ｆｌｅｘ．ＧＣａＭＰ６ｆ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０ウイルス（Ａｄｄｇｅｎｅ、マサチューセッツ州、米国）をそれぞれ、５日目に培地に添加した。培地の５０％を３～４日ごとに新しい培地と交換し、１０～１３日後にニューロンを刺激に使用した。
［０１３５］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、インビトロでのＯＦＵＳ刺激は、デバイスの位置を微調整するために、３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられたＳＯＡＰを移動ステージまで移動させることを必要とした。Ｑｕａｎｔｅｌレーザーは、光音響信号生成のために自由空間のＳＯＡＰにデリバリーされた。１０倍対物レンズ（Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ、０．３ＮＡ、１６ｍｍＷＤ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を備えた倒立顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｕ、Ｎｉｋｏｎ）が、４７０ｎｍＬＥＤ（Ｍ４７０Ｌ２、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）で照明され、緑色蛍光タンパク質用のフィルターセットで濾過され（ＭＤＦ－ＧＦＰ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）、ＣＭＯＳカメラ（Ｚｙｌａ５．５、Ａｎｄｏｒ）で撮影され、蛍光イメージングに使用された。刺激前に、超音波の焦点を９．９μｍ緑色蛍光ビーズ（Ｇ１０００、Ｄｕｋｅ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｒｐ）で視覚化し、視野の中心に調整した。次に、ニューロン培養皿のＸ方向とＹ方向の同じ位置、ニューロンのＺ方向２ｍｍ上にＳＯＡＰを浸した。カメラはレーザーと同期した。カメラが２０Ｈｚで２０秒間記録している間、５秒目にレーザーが照射された。実験後、イメージングシーケンスの蛍光強度をＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉ）で分析した。
［０１３６］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、細胞生存率の研究のために、各エネルギーレベルで各皿においてニューロンの５つのグループがランダムに選択された。一方、ニューロンの皿には、選択されたエネルギーレベルで合計３０パルスのＯＦＵＳがデリバリーされた。連続する３サイクルごとに、５秒間隔で１０Ｈｚでデリバリーされた。生細胞と死細胞は、焦点の２００×２００μｍ2の領域内で計算された。すべてのニューロンはＧＣａＭＰ６ｆで標識された。死細胞を１μＬ １００μｇ／Ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｐ１３０４ＭＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）溶液で１５分間染色した。細胞を３０分間インキュベートした後、分析のために蛍光顕微鏡で画像化した。
［０１３７］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、インビボでのＯＦＵＳ刺激には、最初に酸素中５％イソフルランで麻酔をかけた成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１４～１６週齢）が関与し、その後、１．５～２％イソフルランで標準定位フレームに固定された。麻酔の深さを決定するために尾部のピンチが使用された。体温を維持するために、加熱パッドをマウスの下に置いた。標的となった脳の毛が除去された。３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられたＳＯＡＰは、マウスの標的運動野に位置合わせされた。Ｑｕａｎｔｅｌレーザーは、１０Ｈｚの繰り返し率で自由空間のＳＯＡＰにデリバリーされた。ｃ－ｆｏｓ発現の場合、パルス列は３３％デューティサイクル（２秒レーザーオン、４秒レーザーオフ）で３０分間デリバリーされた。ＥＭＧ記録では、２秒のパルス列がデリバリーされた。
［０１３８］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＥＭＧの記録及び処理には、ＳＯＡＰを一次運動野と位置合わせすることが含まれる。筋肉活動を記録するために、針電極を後肢大腿二頭筋の皮下に挿入し、接地電極をフットパッドに挿入した。対照群は、刺激部位と同側の体幹部で記録された。ＥＭＧ信号はＭｕｌｔｉ－Ｃｌａｍｐ７００Ｂアンプ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録し、１～５０００Ｈｚでフィルター処理し、Ａｘｏｎ ＤｉｇｉＤａｔａ１，５５０デジタイザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）でデジタル化し、ノイズエリミネーター（Ｄ－４００、Ｄｉｇｉｔｉｍｅｒ）でフィルター処理した。ＥＭＧ信号は０．５～５００Ｈｚのバンドパスフィルターと全波整流でフィルター処理された。次に、処理された信号のエンベロープがプロットされた。
［０１３９］
本開示によって提供される例示的な例によれば、刺激セッション後に免疫蛍光染色を行い、ｃ－ｆｏｓ発現を最大化するためにマウスを１時間休ませ、次に、これを屠殺し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１倍、ＰＨ７．４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）溶液及び１０％ホルマリンを経心的に灌流した。固定後、脳を摘出し、１０％ホルマリン溶液中で２４時間固定した。固定したマウスの脳を１倍ＰＢＳ溶液に浸漬した。脳を、振動組織スライサー（ＯＳＴ－４５００、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、厚さ１５０μｍの冠状切片にスライスした。脳スライスをブラシで１０％ホルマリン溶液に静かに移し、さらに２４時間固定し、その後５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）－ＰＢＳ溶液で室温で３０分間ブロックした。スライスを０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１６１０４０７、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）－ＰＢＳ溶液で１０分間透過処理し、濃度２μｇ／ｍＬの抗ｃ－ＦｏｓＲａｂｂｉｔ抗体（４３８４Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４℃で一晩インキュベートした。一次培養後、スライスを、濃度１μｇ／ｍＬの二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び濃度５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに暗所、室温で２時間インキュベートした。ステップ間で、スライスを０．２％Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０、東京化成工業）－ＰＢＳ溶液で５分間４回洗浄した。蛍光画像は、ＦＶ３０００共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて取得した。共焦点画像は、ＤＡＰＩの場合は４０５ｎｍ、ｃ－Ｆｏｓの場合は４８８ｎｍの励起波長で取得された。
［０１４０］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、刺激セッション後に組織学的染色が関与し、マウスは直ちに屠殺され、前述のように灌流され、固定された。脳をパラフィンに包埋し、１５０μｍステップで５μｍの厚さにスライスして冠状切片を得た。スライシングと標準的なＨ＆Ｅ染色は、Ｍａｓｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂｒｉｇｈａｍ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｅで実施された。組織像は、ＶＳ１２０自動スライドスキャナー（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で取得した。
［０１４１］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、温度プロファイルを記録するために熱電対（ＤＩ－２４５、ＤａｔａＱ）が使用された。熱電対の先端は、それぞれＳＯＡＰの焦点、表面に配置された。記録中、エネルギー６．２ｍＪ／ｃｍ２のレーザーを１０Ｈｚで１０秒間オンにした。表面に光がないグループもベースラインとして記録された。
［０１４２］
本開示によって提供される例示的な例によれば、統計分析に関して、音響波形、カルシウムトレース、及び電気生理学的トレースが、Ｏｒｉｇｉｎ２０２０を使用してプロットされた。周波数スペクトルのＦＦＴ変換はＭＡＴＬＡＢ（登録商標） Ｒ２０１９ｂを使用して実行された。データは平均値±平均値の標準誤差で表示される。カルシウム画像はＩｍａｇｅＪで処理される。すべての比較データは２サンプルのｔ検定で分析される。ｐ値は次のように定義された：ｎ．ｓ．、有意ではない（ｐ＞０．０５）；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
［０１４３］
ＯＦＵＳの生物学的安全性は、神経調節を成功させるために非常に重要であることに留意されたい。これらの例示的な実施例では、生体安全性は、インビトロでの繰り返し刺激後の細胞生存率及び損傷が結論付けられなかったインビボの組織学的画像化によって評価された。さらに、キャビテーションと熱蓄積は、超音波曝露による潜在的な２つの主要な生体影響である。安全性を評価するために、機械的指標を計算し、ＯＦＵＳの温度上昇をテストした。インビボ実験のレーザー入力では、マウスの脳に伝達される推定ピークツーピーク圧力３９ＭＰａは、組織損傷が以前に報告されなかったレベルを下回っている。ＯＦＵＳのピーク負圧は１８ＭＰａと測定され、これは軟組織内に気泡雲が発生する閾値（２５～３０ＭＰａ）を下回っている。脳組織の音響減衰係数０．９１ｄＢ／（ｃｍ×ＭＨｚ）［５３］を使用してＭＩを推定し、ＯＦＵＳ刺激のＭＩ＝３．３と計算された。比較すると、ＭＩ＝３．９でパルス幅１．４μｓの短パルス超音波照射では、脳組織にまれにキャビテーション関連の損傷が生じることが報告されている。したがって、例示的な実施形態の０．２６μｓというより短いパルス持続時間及びより低いＭＩは、組織キャビテーションの損傷閾値を十分に下回るはずである。熱的安全性を確保するために、温度プロファイルは熱センサーで記録された。６．２ｍＪ／ｃｍ2のレーザーエネルギーが適用されたが、これは、本開示のこの態様に関する例示的な実施例に従って使用される最高エネルギー閾値と一致した。ＯＦＵＳは１０秒間デリバリーされ、ＯＦＵＳの焦点、ＳＯＡＰの表面、及びＳＯＡＰの表面に光が当たらない対照群でテストされた。１０秒の加熱後、表面で最大０．４Ｋの温度上昇が観察された。したがって、この研究では、最長持続時間が２秒の場合、ＯＦＵＳの焦点では０．１Ｋを超える顕著な温度上昇は引き起こされない。さらに、考えられる最高の温度上昇は、ニューロンの活動を調節するのに必要な閾値（ΔＴ≧５Ｋ）［５５］をはるかに下回っており、細胞に損傷を与えることはない。したがって、ＯＦＵＳは生物学的証拠と物理的証拠の両方によって組織に対して安全であることが証明されている。
［０１４４］
本開示のこの態様の例示的な実施例によれば、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰが開発され、ＯＦＵＳが生成され、空間分解能及び経頭蓋能力を特徴付け、インビトロ及びインビボでのミリメートル未満の経頭蓋神経刺激が検証された。光音響効果による大きなＮＡにより、ピエゾベースの低周波超音波の到達範囲を超える６６μｍでの厳密な焦点が可能になった。広帯域放射により、ＯＦＵＳの６９％の経頭蓋効率がマウスの頭蓋骨の一部に浸透することが可能になった。インビトロでのＧＣａＭＰ６ｆ標識ラット皮質ニューロンの直接刺激及び経頭蓋刺激を蛍光イメージングで記録した。神経反応を引き起こすためのＯＦＵＳの総超音波エネルギー入力は、従来の超音波よりも２～６桁低く、高い刺激効率を実現する。ＯＦＵＳによるインビボでの生きたマウスの運動皮質における非侵襲的刺激の成功は、免疫蛍光法とＥＭＧ記録によって実証された。ＯＦＵＳ刺激の安全性は、生物学的には細胞生存率と組織学によって、また物理的にはＭＩと温度上昇によってインビトロとインビボの両方で評価された。
［０１４５］
ＯＦＵＳ刺激に関する重要な観察は、刺激が聴覚交絡効果などの間接効果ではなく音響波の直接効果によって引き起こされたことであることに留意されたい。インビトロでの実験では、培養ニューロンは聴覚回路なしでＯＦＵＳ刺激に反応していた。インビボでの研究では、ｃ－Ｆｏｓ陽性ニューロンは、直接刺激に対応する刺激部位に位置していた。さらに、ＥＭＧ記録において体性感覚皮質を刺激された対照群では反応が記録されず、蝸牛への骨伝導がプロセスに関与していないことを示した。このような観察は、報告されている超音波による直接刺激と一致する。
［０１４６］
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰは、単一の固定超音波場を提供するデバイスである。複雑な脳機能は単一の部位によって制御されるわけではないが、複数の部位を刺激することで調節や治療の可能性が高まる。パターン化された神経調節を実現でき、例えば、治療のための運動制御の選択性をさらに高めることができる。製造プロセスの柔軟性の強さにより、ＯＦＵＳデバイスはマルチサイト神経調節のための大規模なアレイにスケールアップできる。従来のＰＺＴベースの超音波大規模アレイでは、電磁干渉を最小限に抑えるために各要素に接続された大規模なケーブルが銅で製造されており、これがウェアラブル臨床デバイスの適用をさらに妨げている。それに対して、軽量のＯＦＵＳデバイスは、長時間の治療における快適性を向上させる。金属部品を一切使用しないこのようなデバイスは、リアルタイム磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）ガイダンス及び機能的ＭＲＩモニタリングとの互換性をさらに向上させる。これらは、臨床応用におけるリアルタイムの複数部位刺激と治療評価の閉ループに役立つ。
［０１４７］
特に、ＯＦＵＳは入力光のエネルギーを向上させるだけで高い超音波強度を提供できる。これは、従来の高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）の代わりにＯＦＵＳを超音波治療に適用する機会を提供する。例えば、ヒストトリプシーは、キャビテーションベースの治療のために、低周波（＜３ＭＨｚ）、短パルス（＜１０サイクル）の高強度超音波（＞２０ＭＰａ）を組織にデリバリーする。しかし、ＨＩＦＵは特定の強度に達するために高電圧を必要とし、その一方で狭い帯域幅（＜３０％）、長いリングダウン時間（＞５サイクル）、及び絶縁破壊のリスクをもたらす［７０］。ＳＯＡＰによって生成されたＯＦＵＳは、高周波数、高強度、正確なシングルサイクル制御、及び２００％の広帯域幅で実証されている。このニッチは、時空間制御が改善され、周囲組織への損傷と熱蓄積が最小限に抑えられる、超音波手術におけるＯＦＵＳ応用の将来の方向性をハイライトしている。
［０１４８］
本開示の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰによって生成されたＯＦＵＳは、小動物及び脳サブ領域における神経学的研究に向けて非侵襲的にサブミリメートルの精度を利用する。製造における柔軟性、高い時空間分解能と強度、及び電磁適合性の向上により、超音波手術、薬物デリバリー、疼痛管理などの臨床応用がさらに可能になる。したがって、この研究は、ＯＦＵＳが神経科学研究及び臨床治療における貴重なプラットフォーム技術として利用される可能性が非常に高いことをハイライトしている。
［０１４９］
当業者であれば、上記の説明を読むと、本開示の多くの変更及び修正が自明あるが、例示として図示し説明した特定の実施形態は、決して限定的なものとみなされるものではないことを理解されたい。さらに、特定の実施形態を参照して主題を説明したが、当業者であれば、本開示の精神及び範囲内での変形を想到できる。前述の例は単に説明を目的として提供されたものであり、本開示を限定するものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。
［０１５０］
本発明の概念は、その例示的な実施形態を参照して特に図示及び説明されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変更を加えることができることが当業者には理解される。本発明の概念は、以下の特許請求の範囲によって定義される。
特許
代理人整理番号 ＢＯＳ－ＯＯＩＯＵＳ
［発明の名称］光音響刺激のための方法及びデバイス
［技術分野］
［０００１］
本出願は、２０２１年３月９日に提出された仮出願番号６３／１５８，５６６及び２０２１年４月２０日に出願された仮出願番号６３／１７７，０２９の利益を主張し、その出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
［０００２］
本開示は、光音響刺激に関し、特に、生物療法のための光音響刺激を操作及び投与するためのデバイス及び方法に関する。
［背景技術］
［０００３］
集束超音波は、低侵襲治療及びメカニズムの研究において大きな注目を集めている。高効率の生体変調には１ＭＨｚ未満の周波数が適している。しかし、典型的なサブＭＨｚ超音波技術は、空間閉じ込めが数ミリメートルと不十分で、デバイス直径が約２５ｍｍと大きいため、回折限界が生じ、さらなる応用が著しく妨げられる。低周波フレックス張力共振器、トンピルツトランスデューサー、厚み型共振器など、小型の低周波トランスデューサーを製造する努力がなされてきた。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
［０００４］
しかし、ミリメートルスケールの横方向寸法を持つこれらのトランスデューサーの製造は困難であり、高価であると考えられている。デバイスサイズが大きいことに加えて、トランスデューサーベースの集束超音波技術は、数百ｋＨｚの超音波に対してミリメートルスケールでの回折限界焦点体積が大きいという問題がある。
［課題を解決するための手段］
［０００５］
一態様によれば、テーパー状ファイバー光音響エミッターが提供される。エミッターには、レーザーパルスを放射するように構成されたナノ秒レーザーと光ファイバーが含まれる。光ファイバーには、光を超音波に変換するように構成されたコーティングが施された先端が含まれる。先端コーティングは、拡散層と熱膨張層、又は単一の熱膨張層を含むことができる。拡散層には、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子が含まれる。熱膨張層には、レーザーパルスを変換して超音波を発生するように構成されたグラファイトとポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、又はカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びＰＤＭＳが含まれる。超音波の周波数は、拡散層の厚さと膨張層のＣＮＴ濃度で調整される。
［０００６］
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成されている。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
［０００７］
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であってもよい。
［０００８］
別の態様によれば、テーパー状ファイバー光音響エミッタ（ＴＦＯＥ）を動作させる方法は、ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射するステップと、先端を有する光ファイバーでレーザーパルスをガイドするステップとを含む。先端は、エポキシと酸化亜鉛を含む拡散層と熱膨張層、又はカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）とポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む単一の熱膨張層でコーティングされる。この方法はさらに、拡散層を使用して、局所的な加熱を制限しながらレーザーパルスを拡散すること；熱膨張層を用いて拡散光を変換して超音波を生成すること；及び超音波の周波数を、拡散層の厚さと膨張層のＣＮＴ濃度で調整する。
［０００９］
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
［００１０］
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得る。
［００１１］
別の態様によれば、光音響材料を介して細胞を刺激する方法が提供される。この方法は、超音波を発生するように構成された光吸収体及び拡張マトリックスを有する光音響材料を提供すること；光音響材料をフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成すること、ここで、フィブロインヒドロゲルは、超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される；及びフィブロインが超音波に応答して神経成長を刺激するように、光音響フィルムにレーザーパルスを放射することによって超音波を発生させることを含む。
［００１２］
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
［００１３］
いくつかの例示的な実施形態では、方法は、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を変更することを含む、超音波の周波数を生成することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、フィブロインヒドロゲルはシルクを含み得る。
［００１４］
別の態様によれば、細胞を刺激するためにテーパー状ファイバー光音響エミッタ（ＴＦＯＥ）を動作させる方法が提供される。この方法は、ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射すること、及び先端を有する光ファイバーでレーザーパルスをガイドすることを含む。次に、この方法は、ＣＮＴをフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成するステップを含み、フィブロインヒドロゲルは超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される。
［００１５］
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
［００１６］
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を変更することを含む、拡散光を変換して超音波を発生することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得る。
［００１７］
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、エポキシ及び酸化亜鉛を含む拡散層でコーティングされた先端をさらに備える。拡散層は、局所的な加熱を制限しながらレーザーパルスを拡散する。
［００１８］
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む熱膨張層でコーティングされた先端をさらに含む。熱膨張層は拡散光を変換して超音波を発生し、フィブロインが超音波に応答して細胞内の神経成長を刺激する。いくつかの例示的な実施形態では、フィブロインヒドロゲルにはシルクが含まれる。
［００１９］
別の態様によれば、光音響効果を介した高精度細胞的変調のためのデバイスが提供される。いくつかの例示的な実施形態では、このデバイスは、テーパー状のファイバー光音響エミッターを含む。このデバイスには、レーザーパルスを放射するように構成できるナノ秒レーザーと、先端を備えた光ファイバーが含まれる。光ファイバーは、レーザーパルスをガイドするように構成でき、熱膨張層を含むコーティングを有することができる。熱膨張層は、レーザーパルスを変換して超音波を生成するように構成されたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含み得る。ＣＮＴをフィブロインヒドロゲルに埋め込むと、光音響フィルムを形成できる。フィブロインヒドロゲルはさらに、超音波に応答して神経成長を刺激するように構成することができる。超音波の周波数は、膨張層のＣＮＴ濃度の厚さに応じて調整できる。
［００２０］
いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスは、拡散層を含む先端部をさらに含む。拡散層は、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子を含むことができる。超音波の周波数は拡散層の厚さで調整できる。
［００２１］
いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスの光音響フィルムは平坦であり得る。いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスの光音響フィルムは湾曲していてもよい。いくつかの例示的な実施形態によれば、湾曲した光音響フィルムは、非侵襲的変調のための集束超音波を生成する。
［００２２］
本開示は、本開示の実施形態の非限定的な例として、言及された複数の図面を参照しながら、以下の詳細な説明でさらに説明される。いくつかの図面を通して、同様の参照番号は同様の部分を表す。
［図面の簡単な説明］
［００２３］
［図１Ａ］図１Ａは、光音響効果及び２層のファイバーベースの光音響エミッター（ＴＦＯＥ又はＴＦＯＥ）の設計の概略図である。
［図１Ｂ］図１Ｂは、ファイバーベースのエミッター及び注射針の側面図である。
［図１Ｃ］図１Ｃは、製造されたＴＦＯＥの側面図である。
［図１Ｄ］図１Ｄは、金属メッシュ上にキャストされたコーティング材料としての多層ＣＮＴ／ＰＤＭＳ混合物を示し、その後、パンチスルー法によりテーパー状ファイバーをコーティングする。
［図１Ｅ］図１Ｅ及び１Ｆは、ＴＦＯＥによって生成される代表的な音響信号をそれぞれ時間領域及び周波数領域で示し、１Ｅの斜線領域は、同じＴＦＯＥからの３つの測定値から得られた標準偏差を示す。
［図１Ｆ］図１Ｅ及び１Ｆは、ＴＦＯＥによって生成される代表的な音響信号をそれぞれ時間領域及び周波数領域で示し、１Ｅの斜線領域は、同じＴＦＯＥからの３つの測定値から得られた標準偏差を示す。
［図１Ｇ］図１Ｇは、本明細書の教示に従って単一ニューロン刺激を可能にするＴＦＯＥの概略図を示す。
［図１Ｈ］図１Ｈは、それぞれ５０ミリ秒及び１ミリ秒のレーザー励起中のＴＦＯＥ先端の表面温度のグラフである。
［図２Ａ］図２Ａ～Ｄは、拡散層１１６を修正することによる超音波周波数の制御を示す。図２Ａは、３６～１００μｍの拡散層（ＺｎＯ／エポキシ）及び１０９±２４μｍの吸収／熱膨張層（ＣＮＴ／ＰＤＭＳ）で製造されたＴＦＯＥからの時間領域の超音波信号の図を提供する。
［図２Ｂ］図２Ｂは、本発明の技術に従ってＴＦＯＥによって生成される超音波のグラフである。
［図２Ｃ］図２Ｃは、本発明の技術に従ってＴＦＯＥによって生成される超音波の周波数領域の別のグラフである。
［図２Ｄ］図２Ｄは、本発明の技術によるＴＦＯＥのＴＦＯＥの厚さによるピーク周波数のグラフである。
［図３Ａ］図３Ａ及び３Ｂは、それぞれ３６μｍ及び１００μｍのＴＦＯＥ拡散層コーティングを用いた場合の、周波数に対する膨張層の物理的厚さの影響のグラフである。
［図３Ｂ］図３Ａ及び３Ｂは、それぞれ３６μｍ及び１００μｍのＴＦＯＥ拡散層コーティングを用いた場合の、周波数に対する膨張層の物理的厚さの影響のグラフである。
［図４Ａ］図４Ａ～４Ｂは、光音響信号周波数を有効な吸収／膨張層の厚さの関数として示す。図４Ａは、異なる熱膨張層を有するＴＦＯＥの正規化された周波数スペクトルを示すグラフである。
［図４Ｂ］図４Ｂは、ＣＮＴ／ＰＤＭＳ濃度の関数としてプロットされたピーク周波数のグラフである。
［図５Ａ］図５Ａ～５Ｄは、音響角度分布の特徴を示す。図５Ａは、検出の概略図である。
［図５Ｂ］図５Ｂは、角度０°、±２５°、±５０°、及び±７５°で検出された音響のピークツーピーク振幅のグラフである。
［図５Ｃ］図５Ｃは、音響のピークツーピーク振幅の角度依存性のグラフである。
［図５Ｄ］図５Ｄは、これらの角度で検出された音響信号の周波数スペクトルのグラフである。
［図６Ａ］図６Ａ～６Ｇは、ＴＦＯＥによって誘導される細胞ソノポレーションの周波数依存性を示す。図６Ａは、レーザーパルストーンバーストの概略図である。
［図６Ｂ］図６Ｂは、ＴＦＯＥ処理中のＴＦＯＥ先端における温度変化のグラフである。
［図６Ｃ］図６Ｃは、ＴＦＯＥからの時間領域の光音響信号のグラフである。
［図６Ｄ］図６Ｄは、１０分間、周波数を変えてＴＦＯＥを処理したときの３０個の細胞の平均蛍光強度変化のグラフである。
［図６Ｅ］図６Ｅは、ＴＦＯＥ処理領域の蛍光イメージングの画像を含む。
［図６Ｆ］図６Ｆは、ＴＦＯＥ処置群及び対照群の蛍光イメージングの画像を含む。
［図６Ｇ］図６Ｅは、ＴＦＯＥ処置群と対照群との間の蛍光強度変化の比較のグラフである。
［図７］図７は、ＣＮＴ／シルクフィルム及び／又はロールを製造するための、官能化ＣＮＴ溶液を含むシルク溶液のキャスティング及び乾燥の図である。
［図８］図８は、製造されたＣＮＴ／シルクフィルム及び／又はロールからの表面官能化の成功を確認するゼータ電位のグラフである。
［図９］図９は、ＣＮＴ／シルクフィルムによって生成される広帯域音響波に関する音響測定の概略図である。
［図１０Ａ］図１０Ａ及び図１０Ｂは、図９によって生成された光音響波を示すグラフである。
［図１０Ｂ］図１０Ａ及び図１０Ｂは、図９によって生成された光音響波を示すグラフである。
［図１１］図１１は、光音響刺激がレーザー出力によって操作される場合の、７５μＪに固定されたパルスエネルギーのグラフである。
［図１２］図１２は、光音響刺激が埋め込まれたＣＮＴの濃度によって操作される場合の、２０μｇ／ｍＬに固定されたＣＮＴの濃度のグラフである。
［図１３Ａ］図１３Ａは、ニューロン／面積の関数としてのインビトロ形態を確認するグラフである。
［図１３Ｂ］図１３Ｂは、全長／面積の関数としてのインビトロ形態を確認するグラフである。
［図１３Ｃ］図１３Ｃは、それぞれ、対照、ＣＮＴ／シルク、及びシルクフィルム＋ＣＮＴグループについての細胞生存率を確認するグラフである。
［図１４］図１４は、Ｈ＆Ｅ染色による１０週齢のマウスのインビボ組織学を示す画像を含む。
［図１５］図１５は、生体適合性及び無視できるほどの熱影響を確認するパルス列を示す概略図を提供する。
［図１６］図１６は、経時的な温度の関数としてのＣＮＴ／シルク対単離シルクの性能を示すグラフである。
［図１７］図１７は、活性化領域を決定する光照射による光にさらされたときのＣＮＴ／シルクフィルムの性能の画像である。
［図１８］図１８は、活性化領域を決定する光照射による光にさらされたときのシルクフィルムの性能の画像である。
［図１９］図１９及び２０は、光にさらされたときのＣＮＴ／シルク、光にさらされなかったときのＣＮＴ／シルク、及び光にさらされたときのシルクフィルムの性能を経時的なΔＦ／Ｆ0の関数としてさらに示すグラフである。
［図２０］図１９及び２０は、光にさらされたときのＣＮＴ／シルク、光にさらされなかったときのＣＮＴ／シルク、及び光にさらされたときのシルクフィルムの性能を経時的なΔＦ／Ｆ0の関数としてさらに示すグラフである。
［図２１］図２１は、ラットの後根神経節外植片に適用したときの光音響刺激を経時的に示す概略図である。
［図２２］図２２は、ＣＮＴ／シルク光＋の画像である。
［図２３］図２３は、ＣＮＴ／シルク光－の画像である。
［図２４］図２４は、光照射を受けたときのガラス光対照群の画像である。
［図２５］図２５は、光照射を受けていないときのガラス光対照群の画像である。
［図２６］図２６は、面積の関数としての図２２～２５のグラフである。
［図２７］図２７は、ＢＤＮＦ濃度の関数としての図２２～２５のグラフである。
［図２８］図２８は、ＮＧＦ濃度の関数としての図２２～２５のグラフである。
［図２９］図２９は、コンピュータからの光音響刺激を使用して標本の脳を処置するために使用される場合に、時空間符号化及び復号化を可能にする多機能ニューラルインターフェースの画像である。
［図３０］図３０は、この動態を示す図である。
［図３１Ａ］図３１Ａ及び３１Ｂは、光媒介の低侵襲性ＰＮＳ刺激のための埋め込み型カフの画像例である。
［図３１Ｂ］図３１Ａ及び３１Ｂは、光媒介の低侵襲性ＰＮＳ刺激のための埋め込み型カフの画像例である。
［図３２］図３２は、図８のナノ複合アプローチを通じて光音響機能と統合されたヒドロゲル土台（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の図である。
［図３３］図３３は、本開示の光音響プロセスによって可能になる信頼性が高く再現可能な神経刺激を実証する前後の画像を含む。
［図３４Ａ］図３４Ａ～３４Ｄは、ＴＦＯＥ刺激に応答したＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロンの蛍光画像を示す。図３４Ａ及び３４Ｂは、それぞれ５０ミリ秒及び１ミリ秒のレーザー持続時間でＴＦＯＥによって刺激されたまばらな集団における蛍光画像及びカルシウムトレースである。
［図３４Ｂ］図３４Ａ及び３４Ｂは、それぞれ５０ミリ秒及び１ミリ秒のレーザー持続時間でＴＦＯＥによって刺激されたまばらな集団における蛍光画像及びカルシウムトレースである。
［図３４Ｃ］図３４Ｃは、ＴＦＯＥ刺激を３回繰り返した１つのニューロンの最大ΔＦ／Ｆ画像である。
［図３４Ｄ］図３４Ｄは、３つのニューロンの連続刺激の画像である。
［図３５Ａ］図３５Ａ～３５Ｃは、ＴＦＯＥ刺激のパルスエネルギー依存性の画像である。図３５Ａ～Ｃは、単一パルスによるＴＦＯＥ刺激の前後のＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロンの蛍光画像である。
［図３５Ｂ］図３５Ａ～３５Ｃは、ＴＦＯＥ刺激のパルスエネルギー依存性の画像である。図３５Ａ～Ｃは、単一パルスによるＴＦＯＥ刺激の前後のＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロンの蛍光画像である。
［図３５Ｃ］図３５Ａ～３５Ｃは、ＴＦＯＥ刺激のパルスエネルギー依存性の画像である。図３５Ａ～Ｃは、単一パルスによるＴＦＯＥ刺激の前後のＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロンの蛍光画像である。
［図３５Ｄ］図３５Ｄは、単一パルス刺激を受けた標的ニューロンのカルシウムトレースのグラフである。
［図３５Ｅ］図３５Ｅは、パルス数の関数としての成功したニューロン刺激に対するパルスエネルギー閾値のグラフである。
［図３６Ａ］図３６Ａ～３６Ｊは、神経突起に対するＴＦＯＥ誘発細胞内刺激の画像及びグラフを含む。図３６Ａ及び３６Ｂは、ニューロンネットワークに沿って伝播するカルシウム波によるＴＦＯＥ誘発神経突起活性化の前後の画像である。
［図３６Ｂ］図３６Ａ及び３６Ｂは、ニューロンネットワークに沿って伝播するカルシウム波によるＴＦＯＥ誘発神経突起活性化の前後の画像である。
［図３６Ｃ］図３６Ｃは、レーザー開始４秒後のカルシウム信号のΔＦ／Ｆの画像である。
［図３６Ｄ］図３６Ｄは、３６Ａで標識した、標的領域、ニューロン１、並びにニューロン２及び３のカルシウムトレースのグラフである。
［図３６Ｅ］図３６Ｅは、軸索及び樹状突起を選択的に標的とするＴＦＯＥで刺激された多極ニューロンの画像である。
［図３６Ｆ］図３６Ｆ～３６Ｈは、異なる領域の刺激時のカルシウム信号の最大ΔＦの画像である。
［図３６Ｇ］図３６Ｆ～３６Ｈは、異なる領域の刺激時のカルシウム信号の最大ΔＦの画像である。
［図３６Ｈ］図３６Ｆ～３６Ｈは、異なる領域の刺激時のカルシウム信号の最大ΔＦの画像である。
［図３６Ｉ］図３６Ｉは、３６Ｅにおいてそれぞれ赤色、黄色及び緑色の矢印で標識された、標的神経突起において測定されたカルシウムトレースのグラフである。
［図３６Ｊ］図３６Ｊは、異なる神経突起の刺激時に体細胞で測定されたカルシウムトレースのグラフである。
［図３７Ａ］図３７Ａ～３７Ｆは、ＴＦＯＥ刺激による単一ニューロンパッチクランプの画像及びグラフィック描写である。図３７Ａ～Ｂは、それぞれ、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロンを標的とする、マウス脳切片におけるＴＦＯＥと統合されたパッチクランプの２光子イメージングの画像である。
［図３７Ｂ］図３７Ａ～Ｂは、それぞれ、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロンを標的とする、マウス脳切片におけるＴＦＯＥと統合されたパッチクランプの２光子イメージングの画像である。
［図３７Ｃ］図３７Ｃ及び３７Ｄは、それぞれ、約５μｍ（図３７Ｃ）及び約１０μｍ（図３７Ｄ）の距離での５ミリ秒のＴＦＯＥ刺激時の興奮性錐体細胞における膜電圧応答のグラフである。
［図３７Ｄ］図３７Ｃ及び３７Ｄは、それぞれ、約５μｍ（図３７Ｃ）及び約１０μｍ（図３７Ｄ）の距離での５ミリ秒のＴＦＯＥ刺激時の興奮性錐体細胞における膜電圧応答のグラフである。
［図３７Ｅ］図３７Ｅ及びＦは、それぞれ、－７５ｍＶ（図３７Ｅ）及び－４０ｍＶ（図３７Ｆ）の膜電圧における、約５μｍでのＴＦＯＥ刺激時の抑制性介在ニューロンにおける電圧応答のグラフである。
［図３７Ｆ］図３７Ｅ及びＦは、それぞれ、－７５ｍＶ（図３７Ｅ）及び－４０ｍＶ（図３７Ｆ）の膜電圧における、約５μｍでのＴＦＯＥ刺激時の抑制性介在ニューロンにおける電圧応答のグラフである。
［図３８Ａ］図３８Ａは、ファイバーベースの光音響コンバーター（ＦＯＣ）による光音響脳変調の概略図である。
［図３８Ｂ］図３８Ｂは、光音響刺激を生成するときのＦＯＣの概略図である。
［図３９Ａ］図３９Ａ～３９Ｃは、培養初代ニューロンにおけるカルシウム過渡状態を誘導するＦＯＣの画像及びグラフを提供する。
［図３９Ｂ］図３９Ａ～３９Ｃは、培養初代ニューロンにおけるカルシウム過渡状態を誘導するＦＯＣの画像及びグラフを提供する。
［図３９Ｃ］図３９Ａ～３９Ｃは、培養初代ニューロンにおけるカルシウム過渡状態を誘導するＦＯＣの画像及びグラフを提供する。
［図４０Ａ］図４０Ａ～４０Ｂは、それぞれ、マウス脳においてインビボで神経活性化を誘導するＦＯＣの概略図及びグラフである。
［図４０Ｂ］図４０Ａ～４０Ｂは、それぞれ、マウス脳においてインビボで神経活性化を誘導するＦＯＣの概略図及びグラフである。
［図４１］図４１は、治療としてＡＭＲＩ互換のソフト光音響パッド（ＳＯＡＰ）を使用する非侵襲性神経変調システムのレンダリングである。
［図４２］図４２は、ＳＯＡＰが治療位置に集束超音波を提供する方法の概略図である。
［図４３］図４３は、ＳＯＡＰがどのように適応フォーカス調整を提供するかを示す概略図である。
［図４４Ａ］図４４Ａ～４４Ｃは、光音響放射における静的工学的位相プロファイルを表す湾曲光音響フィルムによる集束超音波の生成に関する例示的な実施形態を示す画像である。
［図４４Ｂ］図４４Ａ～４４Ｃは、光音響放射における静的工学的位相プロファイルを表す湾曲光音響フィルムによる集束超音波の生成に関する例示的な実施形態を示す画像である。
［図４４Ｃ］図４４Ａ～４４Ｃは、光音響放射における静的工学的位相プロファイルを表す湾曲光音響フィルムによる集束超音波の生成に関する例示的な実施形態を示す画像である。
［図４４Ｄ］図４４Ｄ～４４Ｆは、ラットの頭蓋骨が存在しない状態で適用された集束超音波を示す、生成された超音波画像である。
［図４４Ｅ］図４４Ｄ～４４Ｆは、ラットの頭蓋骨が存在しない状態で適用された集束超音波を示す、生成された超音波画像である。
［図４４Ｆ］図４４Ｄ～４４Ｆは、ラットの頭蓋骨が存在しない状態で適用された集束超音波を示す、生成された超音波画像である。
［図４４Ｇ］図４４Ｇ～４４Ｉは、ラットの頭蓋骨が存在する状態を示す画像である。
［図４４Ｈ］図４４Ｇ～４４Ｉは、ラットの頭蓋骨が存在する状態を示す画像である。
［図４４Ｉ］図４４Ｇ～４４Ｉは、ラットの頭蓋骨が存在する状態を示す画像である。
［図４５］図４５は、ＳＯＡＰシステムの動的セットアップの概略図である。
［図４６］図４６は、ヒト及びマウスの被写体の直径及び焦点距離パラメーターの表である。
［図４７］図４７は、モールディングによるＳＯＡＰの製造プロセスの概略図である。
［図４８］図４８は、異なる厚さの超音波波形に関するシミュレーションデータのグラフである。
［図４９］図４９は、対応する周波数スペクトルに関するシミュレーションデータのグラフである。
［図５０］図５０は、ヒトの頭蓋骨の厚さが６ｍｍ、横方向のＦＷＨＭが４．６ｍｍである内部の焦点に関するシミュレーションデータの画像である。
［図５１］図５１は、エクスビボで神経調節を受けている拘束されたマウス被験対象の図である。
［図５２］図５２は、非侵襲性インビボ神経調節を受けている自由に動くマウス被験対象の図である。
［図５３］図５３は、ＳＯＡＰデバイスの構成図である。
［図５４Ａ］図５４Ａ～Ｈは、ＳＯＡＰの設計、製造、及び特性評価をさらに詳細に示す。図５４Ａは、ＳＯＡＰの光音響効果及び幾何学的設計の概略図である。
［図５４Ｂ］図５４Ｂは、開口数と横方向解像度との間の関係のプロットである。
［図５４Ｃ］図５４Ｃは、設計された幾何学的形状を有するｋ波シミュレーションにおいてＳＯＡＰによって生成された音場の画像である。
［図５４Ｄ］図５４Ｄは、同じ幾何学的デザインを有する材料ＳＯＡＰの４つの画像を含む。
［図５４Ｅ］図５４Ｅは、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ断面のＳＥＭ画像である。
［図５４Ｆ］図５４Ｆは、ＳＲＳ及び光熱画像化による、混合物中のＰＤＭＳ及びＣＳの空間分布の画像である。
［図５４Ｇ］図５４Ｇは、同じレーザーエネルギー入力を有する４つの材料ＳＯＡＰの波形のグラフである。
［図５４Ｈ］図５４Ｈは、４つの材料ＳＯＡＰの周波数スペクトルのグラフである。
［図５５Ａ］図５５Ａ～５５Ｆは、マウス頭蓋骨を貫通するＯＦＵＳの経頭蓋効率及び高い空間分解能を示す。図５５Ａは、針ハイドロフォンを備えたＳＯＡＰによって生成される超音波を特徴付けるための実験デバイスの概略図である。
［図５５Ｂ］図５５Ｂは、マウスの頭蓋骨を使用しない場合と使用する場合のＳＯＡＰによって生成された正規化された音響波形のグラフである。
［図５５Ｃ］図５５Ｃは、マウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの横方向解像度のグラフである。
［図５５Ｄ］図５５Ｄは、マウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの軸方向分解能のグラフである。
［図５５Ｅ］図５５Ｅ～５５Ｆは、頭蓋骨なし（５５Ｅ）及び頭蓋骨あり（５５Ｆ）のＳＯＡＰ生成超音波伝播の画像である。
［図５５Ｆ］図５５Ｅ～５５Ｆは、頭蓋骨なし（５５Ｅ）及び頭蓋骨あり（５５Ｆ）のＳＯＡＰ生成超音波伝播の画像である。
［図５６Ａ］図５６Ａ～５６Ｇは、インビトロでＳＯＡＰによってデリバリーされたＯＦＵＳによって刺激された培養ニューロンを示す。図５６Ａは、直接インビトロ刺激実験設定の概略図である。
［図５６Ｂ］図５６Ｂは、刺激前後のニューロンを詳細に示す一連の画像である。
［図５６Ｃ］図５６Ｃは、過渡的な動態の平均化されたカルシウムトレースのグラフである。
［図５６Ｄ］図５６Ｄは、ＯＦＵＳ刺激の長期にわたる動態の平均カルシウムトレースのグラフである。
［図５６Ｅ］図５６Ｅは、一時的刺激及び長期的刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。
［図５６Ｆ］図５６Ｆは、安全性実証のための反復刺激の最大ΔＦ／Ｆ画像を詳細に示す一連の画像である。
［図５６Ｇ］図５６Ｇは、５６Ｅにおける反復刺激のカルシウムトレースを詳細に示すグラフである。
［図５７］図５７は、同様の振幅のニューロン応答を引き起こすための実験条件及び総エネルギーを含む表である。
［図５８Ａ］図５８Ａ～５８Ｄは、インビトロでＳＯＡＰによってデリバリーされるＯＦＵＳによる経頭蓋刺激を示す。図５８Ａは、経頭蓋インビトロ刺激実験設定の概略図である。
［図５８Ｂ］図５８Ｂは、経頭蓋刺激の前後のニューロンの画像のセットである。
［図５８Ｃ］図５８Ｃは、経頭蓋ＯＦＵＳ刺激の平均カルシウム応答トレースのグラフである。
［図５８Ｄ］図５８Ｄは、単一パルスによる直接刺激及び経頭蓋刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。
［図５９Ａ］図５９Ａ～５９Ｆは、ＯＦＵＳ刺激及びＥＭＧ記録トレースを伴う代表的な免疫蛍光検査を示す。図５９Ａは、インビボでのＯＦＵＳ刺激の実験設定の概略図である。
［図５９Ｂ］図５９Ｂは、刺激領域及び対照領域内のｃ－Ｆｏｓ及びＤＡＰＩ染色の画像のセットである。
［図５９Ｃ］図５９Ｃは、ｃ－Ｆｏｓ陽性ニューロンのパーセンテージについての統計分析を伴うグラフである。
［図５９Ｄ］図５９Ｄは、２秒のＯＦＵＳ刺激及び光なしの対照群の代表的なＥＭＧ記録である。
［図５９Ｅ］図５９Ｅは、バンドパスフィルタ、全波整流器及びエンベロープ後の代表的なＥＭＧ信号である。
［図５９Ｆ］図５９Ｆは、安全性評価のためのインビボ刺激後の組織学的結果を詳細に示す一連の画像である。
［発明を実施するための形態］
［００２４］
本開示のデバイス及び方法によれば、サブＭＨｚの周波数範囲を標的とする制御可能な周波数スペクトルを有する光音響エミッターが提供される。
［００２５］
新しい技術として、経頭蓋集束超音波は、マウス、ウサギの運動反応、及びヒトの感覚／運動反応をうまく誘発することが実証されている。しかし、超音波の空間分解能では高精度の刺激は可能ではない。本開示は、２０μｍという前例のない空間分解能を有するニューロンの光音響刺激のためのＴＦＯＥを提示し、単一ニューロン又は軸索及び樹状突起などの細胞内構造の選択的活性化を可能にする。３ナノ秒の単一レーザーパルスからＴＦＯＥによって変換された１マイクロ秒の単一音響パルスが、これまで成功したニューロン活性化のための最短の音響刺激として示されている。ＴＦＯＥによって生成される高度に局所的な超音波により、光音響刺激と単一ニューロンでの非常に安定したパッチクランプ記録を統合することが可能になった。従来の超音波刺激では困難であった、音響刺激に対する単一ニューロンの電気的応答の直接測定が初めて実証された。ＴＦＯＥをエクスビボ脳スライス電気生理学と組み合わせることで、本開示は、音響刺激に対する興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンの細胞型特異的応答を明らかにする。これらの結果は、ＴＦＯＥが非遺伝的単一細胞及び細胞内変調技術であることを示しており、神経刺激のメカニズムに新たな洞察をもたらす可能性がある。
［００２６］
高い空間分解能での神経調節は、少数の集団又は単一のニューロンの発動によって動物の行動や脳の状態が特異的に変化する可能性があるため、神経科学の分野における基礎知識を進歩させる上で非常に重要である。臨床的には、正確な神経刺激は、網膜刺激や選択的背側根茎切除術などの処置の基礎を築き、ここでは、小さな集団又は単一のニューロン及び軸索線維の選択的な活性化が望まれる。歴史的に、電気刺激は神経調節にとって最も重要な技術であった。脳深部刺激は、臨床的に最も処方されている神経調節法として、パーキンソン病、うつ病、てんかんなどの神経疾患及び精神疾患の治療に使用されている。ただし、電気刺激の空間分解能は電流の広がりによって制限され、電流は数ミリメートルにわたって標的領域の外側に分布する可能性がある。高い空間精度と細胞特異性を提供する光遺伝学は、げっ歯類の集団神経活動を調節する強力な方法であることが示されている。しかし、ウイルス感染が必要なため、ヒトに適用するのは困難である。非遺伝的刺激としては、水の光吸収に基づく光熱神経刺激が報告されており、基礎科学や並進用途の関心が高まっている。赤外光熱神経刺激（ＩＮＳ）では、波長１．５～２μｍの近赤外光がファイバーを通じて送られ、サブミリメートルの精度で水の温度上昇に変換される。この場合、関連する加熱により組織損傷の重大な懸念が生じる。急速に成長しているモダリティである集束超音波は、浸透深さが深く非侵襲性であるため、無数の脳神経調節用途に利用されている。しかし、超音波は音響波回折によって焦点が制限されるため、空間分解能が数ミリメートルレベルに限られており、特定の脳領域の研究が妨げられる。さらに、超音波場はギガオームシールを容易に破壊するため、超音波刺激を全細胞パッチクランプ電気生理学（神経膜とイオンチャネルの生物物理学的機構の高忠実度分析のゴールドスタンダード技術）と統合することは困難である。
［００２７］
本開示のファイバーベースの光音響コンバーターは、光音響効果を利用し、パルス光を吸収して超音波を生成し、ミリメートル未満の空間分解能でインビトロ及びインビボで神経刺激を達成する。小型化されたテーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）は、約２０μｍの空間閉じ込めで＞５７ｋＰａの圧力を生成することができ、超音波刺激に対して前例のない高い空間分解能を提供する。空間分解能と光音響変換効率の両方におけるＴＦＯＥの大幅な進歩は、以下の革新的な設計に基づいて達成される。第一に、以前の研究のように直径２００μｍの市販のマルチモードファイバを使用する代わりに、本開示は、開発された制御されたテーパリング対策を提供し、ファイバーを２０μｍ程度の小さい先端直径まで再現可能にテーパー付けする。第二に、２０μｍの小さなファイバー先端上に約１０μｍの均一で制御可能なコーティング厚さを実現する新しい蒸着方法が開発された。第三に、コンバーターとしてエポキシ中のグラファイト粉末を使用する代わりに、本開示の方法及びデバイスは、溶解度が改善されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マトリックスに埋め込まれたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を適用する。これにより、変換効率が１桁向上し、テーパー状のファイバー先端からの高効率な光音響信号の生成が可能になり、２０μｍの薄いコーティングからの光漏れが防止される。
［００２８］
本開示の実施形態によれば、ＴＦＯＥを使用することにより、ニューロン刺激の空間的及び時間的解像度が向上する。具体的には、単一細胞の刺激と、軸索及び樹状突起の細胞内刺激が実証されている。持続時間１マイクロ秒の単一音響パルスによりニューロン刺激が達成され、これは音響刺激の持続時間が最も短いことが判明した。重要なのは、ＴＦＯＥによって生成された近接場音響波により、従来の超音波の課題として報告されていた全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞反応を同時に監視しながら、光音響刺激が可能になったことである。本開示は、興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンに対する音響刺激に対する細胞型特異的応答を明らかにする。この開示は、神経系の非遺伝的高精度刺激のためのプラットフォーム技術として、また音響神経刺激のメカニズムの研究及びＭＲＩと互換性のある臨床応用のためのツールとしてのＴＦＯＥの刺激的な可能性を示している。
［００２９］
紹介したように、パルス励起光が対象物質に吸収され、一時的な加熱、物質の圧縮と膨張、その後の圧力変化を引き起こす光音響刺激は、超音波を発生させる新規な方法である。特に、光拡散層と熱膨張層という２つの異なる機能層でファイバー先端を設計及びコーティングすることにより、十分な超音波強度の供給と、セル変調に必要なピーク周波数と帯域幅の制御が可能になる。拡散層と吸収／熱膨張層の両方の周波数制御能力を統合することによって、本開示は、サブＭＨｚ範囲内の周波数及び１ＭＨｚを超える周波数の微調整を達成する。
［００３０］
このように、ＴＦＯＥは調整可能な周波数（例えば、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚ）でサブミリメートルの高さの特別な精度の超音波を送信し、ソノポレーション効果によって膜不透過性の小分子を生細胞にデリバリーする。１ＭＨｚを超える周波数と比較して、サブＭＨｚの周波数下で実行されるＳｙｔｏｘのより高いデリバリー効率により、本開示は、サブＭＨｚの周波数とサブミリメートルの精度との間でうまく妥協して、広範な生物医学用途（領域特異的な薬物デリバリー、遺伝子トランスフェクション、局所的なニューロン刺激など）を提供する。
［００３１］
図１Ａには、パルスレーザー１１０及び光音響信号１１２を含む光音響効果の概略図が示されている。ファイバー１１４、拡散層１１６、及び吸収／膨張層１１８を有するＦＯＥ１００ａ（２層コーティングを有するＦＯＥ）の設計及び構造も、この例示的な実施形態に示されている。参考として、図１Ｂは、ファイバーベースのエミッターと、レーザー伝送用の光ファイバー（２０Ｇ、ＩＤ０．６ｍｍ、ＯＤ０．９１ｍｍ）を使用する注射針（１３０）との間の寸法比較を提供する。ＦＯＥ１００ａ、１００ｂ、１００ｃなどは、図１Ａ、１Ｂ、１ＣなどのＦＯＥ１００を指すことに留意されたい。さらに、図１Ｃは、内側拡散層１１６及び外側吸収／膨張層１１８を視覚化するために画像の透明度が調整されたときの、製造されたＦＯＥ１００の側面図を示し、ファイバー遠位端の輪郭を描く白い破線が示されている。拡散層１１６は、層内の熱的に誘起される歪みの違いによる膨張層の局所的な加熱とその後の損傷を防ぐために導入された。図１Ｇは、パルスレーザー１１０による単一ニューロン刺激を可能にするＦＯＥ１００の追加の概略図１７０を示す。
［００３２］
本開示の別の態様によれば、テーパー状ＦＯＥ（ＴＦＯＥ）１００が例示的な実施形態として導入される。図１Ｄでは、単一セル変調に向けて、１層のコーティングのみを有するＴＦＯＥ１００が示されている。ＴＦＯＥ１００は、小型化された低周波超音波源として２０μｍの先端直径を備えている。本開示は、２０μｍの小さなファイバー先端に伴う課題を克服するために、いくつかの革新的な措置を講じた。光ファイバーのテーパー付けを再現可能に制御するために、マルチモードファイバ１１４は、熱テーパー付け技術によって２２５μｍの全直径から２０μｍまで徐々に引張られた。光エネルギーを最大効率で音響波に変換するために、本開示は吸収／熱膨張層１１８（光吸収の強い多層カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を熱膨張係数の高いＰＤＭＳに埋め込んで構成される）を最適化することができる。テーパー状ファイバーの光音響変換効率を高め、光漏れを最小限に抑えるために、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を導入してヒドロキシル基を持つＩＰＡコーティングされたＣＮＴを形成することにより、光音響ＣＮＴ／ＰＤＭＳコーティングを１５％という高いＣＮＴ濃度で調製できる。高濃度のＣＮＴとＩＰＡによって引き起こされるＰＤＭＳの粘度低下を克服し、テーパー端の２０μｍの断面で均一で制御されたコーティング厚さを達成するには、パンチスルー法を導入できる。コーティングの厚さは、ＩＰＡを蒸発させてマトリックスの粘度を変えることで制御できる。テーパー状ファイバー光音響エミッターは、再び図１Ｄに示されるように、厚さ９．５μｍ及び全体直径１９．８μｍのＣＮＴ／ＰＤＭＳコーティングを有し、単一細胞ターゲティングの必要性を満たしていることが顕微鏡画像によってさらに確認され得る。
［００３３］
本開示の実施形態によれば、次に、１０３０ｎｍナノ秒パルスレーザーがＴＦＯＥ１００にデリバリーされて、光音響信号１１２を生成することができる。図１Ｅは、グラフ線１５０によって与えられる音響波形の平均トレースを示す。近接場の超音波圧力は、針ハイドロフォンによって測定されて５６．７ｋＰａであった。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）後の音響波形の無線周波数スペクトルは、図１Ｆのグラフ線１６０で与えられるように、１．０ＭＨｚにピーク周波数を有する０～１０ＭＨｚの広帯域音響周波数を示す。これは、経頭蓋インビボ神経調節及び他の生物医学的応用で最も頻繁に使用される範囲内にある。あるいは、ＴＦＯＥ１００の適用下でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に分散された蛍光ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズ（直径９μｍ）の動きを使用して、音場の分布を視覚化することもできる。５０ミリ秒のレーザーバースト持続時間、１．７ｋＨｚの繰り返し率で７．８ｍＷのレーザー出力の下で、ＴＦＯＥ１００先端（１μｍ未満）に近い２つのビーズは５μｍの変位を示した。一方、ＴＦＯＥ先端から約２０μｍ離れた他のビーズはＴＦＯＥ処理時に静止したままであり、ＴＦＯＥによって生成された音場が２０μｍの距離内に局在していることを示している。
［００３４］
本開示の実施形態によれば、音響生成中に水中でＴＦＯＥによって生成される熱プロファイルを特徴付けるために、ファイバー先端の温度は、ＴＦＯＥ１００先端表面に直接接触する小型超高速熱センサー（ＤＩ－２４５、ＤａｔａＱ、オハイオ州、米国）によって測定された。図１Ｈでは、ニューロン刺激を成功させるために２つの例示的な試験条件を使用することができる：第１．グラフ線１８０での５０ミリ秒のレーザーパルス列、７．８ｍＷのレーザー出力、及び１．７ｋＨｚの繰り返し率；第２．グラフ線１９０での１ミリ秒のレーザーパルス列、１１．４ｍＷのレーザー出力、及び１．７ｋＨｚの繰り返し率である。このように、第１条件では先端表面温度は０．０９３±０．００４℃しか上昇せず、第２条件では上昇は検出されなかった。この温度上昇は、熱誘発ニューロン変調の閾値（ΔＴ≧５℃）をはるかに下回る。まとめると、これらの結果は、製造された先端直径２０μｍのＴＦＯＥ１００が点超音波源として機能し、先端から約２０μｍに高度に局所化された超音波場を生成することを示している。この前例のない空間的閉じ込めにより、熱損傷や望ましくない機械的破壊を最小限に抑えながら、単一ニューロンレベルでの高精度の刺激が可能になると考えられる。
［００３５］
本開示の別の態様によれば、ＴＦＯＥ１００のこの拡散層１１６は、ポリマー（エポキシ）と直径１００ｎｍの酸化亜鉛（ＺｎＯ）ナノ粒子の混合物を含み、これは、近赤外領域での高い光透過性と高い屈折率により、高エネルギーレーザーパルスをコーシー分布に拡散する。ＺｎＯナノ粒子の直径（つまり１００ｎｍ）は、使用されるレーザー波長（１０３０ｎｍ）よりもはるかに小さいため、全方向へのローリー散乱が可能になる。次に、光エネルギーを音響波に変換するために、吸収／熱膨張層１１８を第２のコーティングとして引き続き追加することができる。これは、吸収体として光吸収係数の高いナノ粒子（多層カーボンナノチューブ、ＭＷＣＮＴ）と、光音響変換効率を最大化するための膨張と圧縮を目的とした熱膨張係数の高いポリマー（ＰＤＭＳ）で構成されている。
［００３６］
本開示によれば、ＴＦＯＥ１００のファイバー遠位端にあるこれらの特別に設計されたナノポリマー複合層１１６及び１１８は、パルスレーザー励起時に、光音響効果を通じてＴＦＯＥ１００のファイバー先端から音響波を効果的に生成し、トランスデューサーを介して検出される。さらに、光音響理論によれば、調整可能な音圧を実現するには、圧力は入射レーザーフルエンスに比例する。したがって、レーザーフルエンスが変化したときのＴＦＯＥの振幅と周波数スペクトルも特徴付けられ、さまざまな用途に対する圧力の柔軟性が示される。
［００３７］
ＴＦＯＥ１００の超音波周波数の制御性を実現するために、１１６及び１１８を含む２層コーティングを、典型的なトランスデューサーの構造を模倣するように設計できることに留意されたい。トランスデューサー（図示せず）は３つの層で構成される：活性層と背面コネクタの間の特定の音響インピーダンスを整合させるためのバッキング層；活性層（電圧を印加すると超音波を発生する圧電材料）：及び媒体と活性層の間の特定の音響インピーダンスを整合させるための整合層（ＰＤＭＳの比音響インピーダンス（１．１～１．５Ｐａ・ｓ／ｍ３）は水（１．４８Ｐａ・ｓ／ｍ３）に近いため、ＴＦＯＥ１００では３番目の整合層を省略できる）。トランスデューサーでは、周波数は２つの要素によって決まる。まず、周波数と帯域幅はバッキング層の減衰効果によって制御される。第二に、周波数は活性層の厚さに反比例する。このようにして、ＴＦＯＥ１００における第１の層１１６の音響減衰及び第２の層１１８の光吸収厚さを変更することによって、周波数を正確に制御することができる。
［００３８］
本開示の実施形態によれば、超音波周波数は、拡散層１１６の修正を介して制御することができる。例えば、周波数の制御には、トランスデューサーのバッキング層に対応するＦＯＥ１００の拡散層１１６の修正が含まれる可能性がある。拡散層１１６内のエポキシ（比音響インピーダンス：２．５～３．５Ｐａ・ｓ／ｍ3）は、ファイバー１１４（シリカ、比音響インピーダンス：１３．１Ｐａ・ｓ／ｍ3）と活性層１１８（ＰＤＭＳ、比音響インピーダンス：１．１～１．５Ｐａ・ｓ／ｍ3）との間の比音響インピーダンスに適合するバッキング層マトリックスとして機能する。典型的な変換器におけるバッキング層の減衰効果は生成される周波数に影響を及ぼし、バッキング層として機能する拡散層１１６の厚さの変化がＴＦＯＥ１００の出力周波数を制御することが期待できる。例示的な例を続けると、ＺｎＯ／エポキシ拡散層１１６の厚さを有する製造されたＦＯＥ１００は、それぞれ３６、４２、５３、６２、７９、１００μｍからなり、厚さが１０９±２４μｍであるＣＮＴ／ＰＤＭＳの吸収／熱膨張層１１８を備えることができる。熱膨張層１１８の厚さの変化は、それらがすべて光の侵入深さを超えているため、超音波周波数を変化させないことに留意されたい。
［００３９］
図２Ａ～２Ｄは、拡散層１１６を修正することによる超音波周波数の制御に関するグラフを提供する。図２Ａでは、３６～１００μｍの拡散層１１６（ＺｎＯ／エポキシ）及び１０９±２４μｍの吸収／熱膨張層１１８（ＣＮＴ／ＰＤＭＳ）で製造されたＦＯＥ１００からの時間領域の超音波信号は、それぞれ時間、厚さ、及び振幅の関数として、グラフ線２１０（１００μｍ）、２１１（７９μｍ）、２１２（６２μｍ）、２１３（５３μｍ）、２１４（４２μｍ）、及び２１５（３６μｍ）で示される。図２Ｂは、超音波の０～１．０ＭＨｚ内の周波数領域を示す。ピーク周波数は、拡散層１１６の厚さを３６μｍから１００μｍまで変化させることによって０．３８４から０．０８３ＭＨｚの範囲で制御されることがグラフ２２０に示されており、拡散層１１６の厚さを増加させる間に周波数が大幅に減少することを示唆している。
［００４０］
続いて図２Ｃを参照すると、拡散層１１６の厚さによるグラフ２３０のピーク超音波周波数のグラフが示されており、ピーク超音波周波数は拡散層の厚さの変化によって調整可能である。線２１０（１００μｍ）、２１１（７９μｍ）、２１２（６２μｍ）、２１３（５３μｍ）、２１４（４２μｍ）、及び２１５（３６μｍ）での０～１０ＭＨｚの周波数範囲を調べると、周波数の分布はサブＭＨｚ領域でクラスタリングを示した。さらに、周波数と拡散層１１６の厚さとの線形関係は、図２Ｄのグラフ２４０においてｙ＝０．５１０８６－０．００４３１ｘの関数でＲ２が０．９３９９２であることを示している。拡散層１１６を変化させることによる周波数の制御は、光音響スペクトルのピーク周波数が拡散層１１６の質量によって変調され得るという事実によってさらに合理化され得る。光音響効果は、一般化されたフックの法則とニュートンの第２法則から推定される運動方程式の導関数である熱膨張方程式によって説明できる。光音響変換プロセス中、ＴＦＯＥ１００先端は調和振動子とみなすことができ、振動運動は熱膨張効果によって与えられる初期力から生じる。フックの法則では、振動の振幅は一定のままで、その周波数は振幅とは無関係であるが、振動子の質量と剛性によって決まる。この点に関して、エポキシ／ＺｎＯ拡散層１１６を修正することによって、０．０８３～０．３８４ＭＨｚの周波数範囲が達成される。
［００４１］
さらに、一般的なトランスデューサーの場合、帯域幅は、スペクトル強度が最大値（ｆupper－Ｆlower）の５０％に減衰する周波数の差と中心周波数ｆcentralの間の比によって定義される。
［数１］
［００４２］
０．０８３～０．３８４ＭＨｚの中心周波数を有するＦＯＥ１００の帯域幅は式１から得られ、平均帯域幅は６７．８±６．８％であった。これらの結果は、ＦＯＥ１００によって生成される超音波帯域幅が、対応する周波数の市販のトランスデューサーによって生成される帯域幅（例えば、５ＭＨｚ、Ｖ３２６、Ｏｌｙｍｐｕｓの場合は６７．０９％；１０ＭＨｚ、ＸＭＳ３１０、Ｏｌｙｍｐｕｓの場合は５６．００％）に匹敵することを示している。特に、市販のトランスデューサーでは、バッキング層の厚さを変更して中心周波数を変化させても帯域幅が大きく変化しないことが判明しており、これは、わずかな周波数依存性を示すＦＯＥ１００の帯域幅と一致している。
［００４３］
本開示の実施形態によれば、超音波周波数は、膨張層内のＣＮＴ濃度を変更することによって調整又は制御することもできる。周波数を操作するための本開示の例示的な実施形態は、活性層（すなわち、吸収／熱膨張層１１８）の有効厚さを変更することを含む。光音響生成理論によれば、光音響の波形は光音響源の光吸収プロファイル、τ＋１／ｃα（τはレーザーのパルス幅、αは吸収体の光吸収係数）にも依存する。吸収体の有効厚さは、光の侵入深さによって決まる。このように、光音響信号波形は実効的な吸収体の厚さによって結果的に変化し、吸収体の厚さは光の侵入深さよりも小さいため、周波数は吸収体の厚さによって決定される。吸収体の厚さが光の侵入深さよりも大きい場合、周波数は一定のままであり、余分な厚さは音響の減衰のみを引き起こす。
［００４４］
図３Ａ～３Ｂは、周波数に対する膨張層の物理的厚さの影響の特徴を示す。本開示のこの態様によれば、２つのグループのＴＦＯＥ１００が、それぞれ３６μｍ及び１００μｍのＺｎＯ／エポキシ拡散層１１６を用いて製造された。図３Ａは、１００μｍ（グラフ線３１１）、１２０μｍ（グラフ線３１２）、１４０μｍ（グラフ線３１３）、及び１６０μｍ（グラフ線３１４）の膨張層のグラフ３１０である。図３Ｂは、１００μｍ（グラフ線３１１）、１２０μｍ（グラフ線３１２）、１５０μｍ（グラフ線３１５）、及び２１０μｍ（グラフ線３１６）の膨張層のグラフ３２０である。各グループについて、ＴＦＯＥからの超音波の時間領域を示す図３の色の凡例で示されるように、１００μｍから２１０μｍまで変化するＣＮＴ／ＰＤＭＳ膨張層を用いて４つのＴＦＯＥを作製した。波形は時間に対して同様の関数のままであったが、膨張層の厚さが増加するにつれて振幅は低下した。結果として、吸収体層１１８の厚さが光の侵入深さを超える場合、周波数は試験範囲内の膨張層の追加の物理的厚さの変化に敏感ではないが、一方、振幅の変化は、熱膨張層の余分な厚さによる音響減衰に起因する可能性がある。
［００４５］
追加の物理的厚さ（光の侵入深さを超えた）は周波数の制御因子ではないが、有効吸収体の厚さを変えることによって周波数を変えることができると考えられることに留意されたい。これは、吸収剤濃度を変更することで膨張層の空間吸収プロファイルを変更することで実現できる。有効厚さは主に物理的厚さではなく光吸収プロファイルによって決定されるため、このようにして、物理的厚さ及び幾何学的構造の変動の影響が最小限に抑えられ、ＴＦＯＥ１００製造の堅牢性が向上する。
［００４６］
超音波周波数を微調整するために吸収剤の濃度をどのように変更できるかを検証するために、拡散層１１６を使用せずに、ＦＯＥ１００をＣＮＴ／ＰＤＭＳ膨張層のみでコーティングした。異なる濃度のＣＮＴ（２．５％、５．０％、７．５％、１０．０重量％）を混合物に使用した。コーティング全体の厚さは同じ範囲に保たれた。図４Ａは、有効吸収／膨張層１１８の厚さの関数としての光音響信号周波数の図を提供する。グラフ４１０のグラフ線４１１、４１２、４１３、及び４１４は、それぞれ２．５、５．０、７．５、及び１０．０％の濃度における吸収／膨張層１１８の厚さを示す。図４Ｂは、ＣＮＴ／ＰＤＭＳ濃度の関数としてプロットされたピーク周波数を示し、４Ｂの各データ点は各濃度の２つの同一のＦＯＥの平均値であり、エラーバーは標準偏差である。したがって、本開示は、ＣＮＴ濃度に依存する周波数変化により、光音響の制御可能なピーク周波数が、グラフ４２０を介して吸収／膨張層１１８の光吸収プロファイルを変更することによっても達成できることを可能にすることを提示する。
［００４７］
本開示によって本明細書に記載される例示的な実施形態によれば、振幅及び周波数スペクトルに関して音響波の角度分布をさらに特徴付けることができる。そうするために、ＦＯＥ１００は、拡散層１１６（ＺｎＯ／エポキシ、厚さ４０μｍ）及び膨張層１１８（ＣＮＴ／ＰＤＭＳ、厚さ１２０μｍ）から構成され得る。ＦＯＥ１００からの音響放射は、１２７ｍＪ／ｃｍ２の一定の光入力でオシロスコープの出力電圧を測定することによって決定することができる。ファイバー軸に対するトランスデューサー検出器の角度は、制御可能な３６０°回転ステージ（米国ニュージャージー州のＴｈｏｒｌａｂｓ社など）によって±１°の精度で変更できる。光音響信号は、図５Ａのグラフ５１０に示すように、それぞれ０°、±２５°、±５０°、及び±７５°の角度で取得することができる。このように、図５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ５２０及び５３０で測定された音響振幅を示す。図５Ｃのピークツーピーク光音響振幅は、それぞれ５．２（０°で）から１．６（±７５°で）に減少することが分かる。これは、角度が大きくなるほど音響振幅が小さくなり、正面方向の振幅が最大になることを示している。ＰＡの振幅異方性は、光強度の異方性から生じると予想される。具体的には、ＺｎＯ／エポキシ（１５重量％）の一層による光強度の角度分布を事前に測定し、制御可能な３６０°回転ステージに取り付けられたフォトダイオードを使用して光強度の角度分布を測定した。５０°での光強度は、０°での光強度の約４１％であった。図５Ｃでは、５０°での音響振幅は０°での振幅の３７％であった（１．９Ｖ対５．２Ｖ）。これにより、音響振幅分布は光強度分布データと一致する。図５Ｄは、５４０で、角度を０度から±７５度まで変化させたとき、ピーク周波数が比較的一定（０．７～０．８ＭＨｚ）であり得ることを示している。これは、拡散層１１６の効果にもかかわらず、レーザーパルスエネルギーの大部分がレーザーの順方向に沿ってデリバリーされ、横方向に伝播する光がほとんどなく、横方向の光音響誘発振動が無視できるためである。拡散層１１６による分散、球状コーティングの曲率半径、ＰＤＭＳと水との間の密度及び音速の不一致を含む他の要因も、振幅異方性に寄与する可能性がある。
［００４８］
本開示の別の態様によれば、ＦＯＥ１００媒介分子デリバリーは周波数依存性であり、０．２ｍｍ2の空間閉じ込めを示す。例示的な実施形態によれば、様々な周波数のＦＯＥ１００によって媒介されるソノポレーション中の細胞膜不透過性蛍光分子の細胞取り込みは、サブＭＨｚ超音波の優れた性能を実証することができるとともに、ＦＯＥの空間的閉じ込めを解明することができる。ソノポレーションプロセスを視覚化するために、損傷した原形質膜を通ってのみ細胞に浸透し、核酸に結合すると蛍光増強を示す高親和性インターカレート核酸染色ＳＹＴＯＸグリーンを選択できる。したがって、２００ミリ秒の持続時間の超音波バーストは、図６Ａの概略図６１０に見られるように、１．７ｋＨｚのパルス繰り返し率で３９ｍＪ／ｃｍ２のパルスレーザーを使用して生成することができ、これはバースト当たり約３４０の音響パルスに相当する。光音響治療は、合計１０分間、バースト繰り返し率０．５Ｈｚで実行できる。ＦＯＥは、培地中の細胞の上約１００μｍに配置できる。
［００４９］
まず、熱誘起細胞膜透過性を除外するために、ＦＯＥ処理中のファイバー先端の温度上昇は、ファイバー先端に接触して配置された小型超高速熱プローブ（直径１００μｍ）を使用して測定できる。図６Ｂのグラフ線６２０に示すように、温度上昇は合計１０分間で０．６℃であることが分かると想定される。このような小さな温度上昇では、熱による膜の脱分極は無視できる。したがって、Ｓｙｔｏｘの取り込み結果は、ＴＦＯＥからの光音響波によって誘発された機械的破壊に起因すると考えられる。
［００５０］
Ｓｙｔｏｘ取り込み効率の超音波周波数依存性を研究するには、ピーク周波数８．０、５．１、１．４、及び０．３ＭＨｚのＴＦＯＥを利用できる（８．０ＭＨｚ：１５％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；５．１ＭＨｚ：１０％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；１．４ＭＨｚ：５％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；０．３ＭＨｚ：１５％ＺｎＯ／エポキシ＋１０％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ）。様々な周波数を有する超音波が、図６Ｃの時間領域６３０に示されている。同一のエネルギー入力を確保するには、レーザーフルエンスを一定に保つ必要がある。したがって、８．０ＭＨｚ信号は最大振幅（２．６５０Ｖ）を示す一方、０．３ＭＨｚ信号は最小振幅（０．０８７Ｖ）を示すはずであるが、これはトランスデューサー感度の不均一性に部分的に起因する可能性がある。図６Ｅは、ＴＦＯＥ処理前の６５２（０分、上のパネル）及びＴＦＯＥ処理後の６５４（２６分、下のパネル）の細胞培養物の蛍光画像を示す。細胞をＴＦＯＥで処理すると、蛍光シグナルの上昇によって示されるように、Ｓｙｔｏｘの細胞取り込みが大幅に増加する。具体的には、０．３ＭＨｚの超音波は、音響強度が最も低いにもかかわらず、ＴＦＯＥ処理後に最も高い蛍光増加を示し、１．４ＭＨｚ及び５．１ＭＨｚと比較して最も高いソノポレーション効率を示した。比較すると、８．０ＭＨｚの超音波で治療したグループでは、Ｓｙｔｏｘの取り込みはごくわずかであった。全体として、ソノポレーション効率は周波数依存性を示した。周波数が低いほど、細胞取り込み効率は高くなる。この結論はさらに統計的に証明することができる。図６Ｄでは、様々な周波数で処理された３０個の個々の細胞からの平均蛍光強度が時間の関数としてグラフ６４０にプロットされている。TFOEで生成されたグラフ線５．１（６４２）、１．４（６４３）、及び０．３（６４４）ＭＨｚ超音波はすべて、治療後の時間の関数としてＳｙｔｏｘ蛍光の増加を示し、Ｓｙｔｏｘの取り込みを促進する能力を確認している。図６Ｄは、処理後約２５分における蛍光のプラトーも示しており、膜の細孔が再封鎖されていることを示した。この動態は、集束超音波が数十分の時間スケールでＳｙｔｏｘの取り込みを促進したという以前に報告された研究と一致している。具体的には、０．３ＭＨｚグループの曲線は最も高い傾きを示し、これは、０．３ＭＨｚのグラフ線６４４が他のグループよりもはるかに速くＳｙｔｏｘの取り込みを促進したことを意味する。最終的な読み取り値は、０．３ＭＨｚのグラフ線６４４がＴＦＯＥ処理後に０．９２という最高のΔＦ／Ｆを示していることも示しており、これは、１．４ＭＨｚのグラフ線６４３（ΔＦ／Ｆ＝０．７４）及び５．１ＭＨｚのグラフ線６４２（ΔＦ／Ｆ＝０．３５）と比較して最も高いソノポレーション効率を示している。したがって、取り込まれるＳｙｔｏｘの総量は周波数に依存する。周波数が低いほど、一定期間内に損傷した細胞膜をより多くの分子が通過する。さらに、８．０ＭＨｚグループのグラフ線６４１は、顕著な蛍光の増加を示さないが、わずかな蛍光の減少を示す。Ｓｙｔｏｘの光漂白による潜在的な影響を考慮すると、蛍光の全体的な低下の理由は、Ｓｙｔｏｘの取り込みによって誘発される蛍光の増加が光漂白効果と比較して弱すぎるためである可能性がある。入射レーザー出力をさらに８．０ＭＨｚの超音波治療に増加すると、最終的には細胞への熱及び／又は光損傷を犠牲にして、０．３ＭＨｚグループと同等のソノポレーション及びデリバリーが得られる可能性があると考えられる。まとめると、ＴＦＯＥ誘発ソノポレーションは、低周波の方が高周波よりも高い効率を実行する周波数依存性を示す。
［００５１］
ソノポレーション効率を定量化するには、ΔＦ／Ｆ≧５０％で細胞をＳｙｔｏｘ陽性細胞として計数し、照射領域内のＳｙｔｏｘ陽性細胞の割合を計算する。このパーセンテージは、ＦＯＥソノポレーション効率の尺度として使用される。同じレーザーエネルギーと継続時間の下で周波数５．１、１．４、及び０．３ＭＨｚのＴＦＯＥの場合、２６分の蛍光イメージングから得られた効率は０％、７２．７％、及び８３．３％であることが確認でき、これは、低周波の方が高周波の超音波よりもソノポレーション効率が大幅に高いことを示唆している。低周波超音波の効率が高いことは、超音波が二層膜の運動を誘発するという膜内キャビテーション理論によって説明でき、組織内に空気空隙があらかじめ存在する必要はない。最大面積ひずみは周波数の平方根に反比例するため、低周波超音波の方がキャビテーション閾値が低くなり、ソノポレーションの効率が向上する。マイクロバブルの助けを借りて超音波によって誘導されるＳｙｔｏｘの取り込みの働きにおいて、取り込まれたＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の最大割合は、それぞれ４００、５００、及び６００ｋＰａで１５ミリ秒（パルス幅１００μ秒で１５０サイクル）の超音波処理後に２０％未満であった（ΔＦ／Ｆの閾値は不明）。本開示において、ＴＦＯＥは、１．１ｍｓの有効超音波処理持続時間（３４０パルス、３．３μｓ未満のパルス持続時間）で約４０ｋＰａの圧力を提供し、低周波数に対して７２．７％及び８３．３％のソノポレーション効率を可能にする。したがって、ＴＦＯＥによって生成される低周波局所光音響波は、テストセルが異なるにもかかわらず、同等の性能を示す。
［００５２］
ＴＦＯＥが、ソノポレーションの閉じ込めによって特定の分子を細胞に局所的にデリバリーすることにより、局所的な細胞調節を可能にする独自の戦略を提供することを検証するために、典型的なホールセルディッシュモジュレーションと比較して、細胞培養物の蛍光増加を１０倍の視野で調査した。局所的なデリバリーは、図６Ｆ及び６Ｇで見ることができる。図６Ｆは、１０倍の対物レンズで撮影されたＴＦＯＥ処置群６６０及び対照群６６５の蛍光画像を提供する。白い破線の円は、観察された顕著な蛍光強度変化の領域を示す。これは、細胞上１００μｍの距離にあるＴＦＯＥの位置の直下にある。ＴＦＯＥ処理後、面積０．２ｍｍ２の処理領域６６２は、３２％の顕著な蛍光増加を示し、横方向に０．２ｍｍ２の空間的閉じ込めを示している。位置特定をさらに検証するために、従来のトランスデューサーアレイはサブＭＨｚ範囲で回折限界があるため、２光子イメージングを使用した組織内のＦＯＥ誘発細胞変調により、３次元視覚化を介して空間閉じ込めが明らかになる。次に、２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム染色（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を使用してＴＦＯＥの生物学的安全性をテストするために、ＦＯＥ処理後の細胞生存率は９９．５５±０．０３％であり、ＴＦＯＥ処理の優れた生体適合性を示している。図６Ｇは、ＴＦＯＥ処置群６６０と対照群６６５との間の蛍光強度変化の比較のグラフ６７０であり、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。まとめると、細胞内に小分子をデリバリーするための新しい超音波源として使用されたＴＦＯＥは周波数依存性を示し、サブＭＨｚ超音波の重要性を示した。局所的な蛍光変化は、ＴＦＯＥが０．２ｍｍ2の空間的に閉じ込められていることを示しており、ニューロン刺激や遺伝子タンパク質研究のための局所的な遺伝子トランスフェクションなど、高い空間精度での細胞調節が期待される。
［００５３］
本明細書で提供される例示的な実施形態によれば、優れた光学的及び機械的特性を有するナノ粒子ポリマーマトリックスから構成されるファイバーベースの光音響エミッター１００が設計及び製造される。拡散層１１６及び膨張層１１８を含む２層コーティング設計は、生成される超音波の振幅及び周波数の正確な制御性を提供する。高振幅とサブＭＨｚ範囲の調整可能な周波数による局所的な音響波の生成が実現される。いくつかの実施形態では、光音響信号プロファイルを振幅及び周波数スペクトルで特徴付けることによって、ＣＮＴ／ＰＤＭＳのマトリックスが高振幅を達成するための好ましい候補であることが実証される。音響周波数を制御するための２つの効果的な戦略を実証できる。第１に、周波数は、音響インピーダンスの不整合を介して減衰材料として機能する拡散層１１６の厚さによって変えることができる。第２に、音響周波数は、活性吸収体／膨張層１１８を通る光の浸透の深さによっても制御され、これは吸収剤の濃度を変えることで間接的に制御できる。小分子を細胞膜にデリバリーするために０．３ＭＨｚから８．０ＭＨｚまでの範囲のさまざまな周波数のＴＦＯＥを使用することにより、サブＭＨｚ超音波は高周波と比較して優れた効率を示す。０．２ｍｍ２の側方空間制限は、ソノポレーション有効面積によっても確認できる。このように、小型化されたＴＦＯＥ１００を使用して、ミリメートル未満の閉じ込めを備えたサブＭＨｚ周波数の音響が生成され、他の典型的な超音波源の制限を克服した。このようなＴＦＯＥ１００デバイスの設計は、細胞膜ソノポレーションを含むがこれらに限定されない、幅広い細胞的用途に有望であると想定され、また、高い有効性と最小限の安全性の問題を備えた、局所的な薬物デリバリー、ニューロン刺激、及び遺伝子トランスフェクションのための新しいツールを提供する。
［００５４］
証明された高い小型化レベルを達成することにより、調整可能な光音響エミッターは低侵襲医療用途に有望であり、ここで、本開示を介して本明細書に提示されるファイバーベースの光音響デバイスは、例えば、焦点病変に近接した注射針又はカテーテルに挿入することができ、したがって、従来の集束超音波によって誘発される精度及び振幅の低下の問題を克服することができる。さらなる実施形態により性能を改善できることが想定される。例えば、最適な光音響信号生成のために高次モードを使用してレーザービームをファイバーに結合できる。第二に、ＴＦＯＥ先端の形状は、凹面構造を介して波を集中させる機会を提供する。第三に、従来のトランスデューサーアレイはサブＭＨｚ範囲で回折限界があるため、サブミリメートルの位置特定をさらに検証することは困難である。二光子イメージングを使用した組織内のＴＦＯＥ誘発細胞変調は、３次元視覚化を介して空間閉じ込めを明らかにする。より広い文脈では、この技術は、超音波パラメーターの変更を通じて各焦点標的で安定かつ可逆的なソノポレーションを生成する可能性を提供し、生物医学的超音波適用の正確な制御を可能にし、これは、既存の技術、特に薬物デリバリーや遺伝子導入ではできなかったことである。さらに、このＴＦＯＥ１００は電磁干渉の影響を受けないため、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性がある。これらの柔軟性は、その前例のない小型化及び容易な反復のしやすさとともに、本開示の方法及びデバイスを革新的な技術にする。
［００５５］
本開示の別の態様によれば、ＴＦＯＥ１００の２層製造は２つのステップから構成される。まず、拡散層１１６については、架橋プロセスによってエポキシ又はＰＤＭＳマトリックスを調製することができる。エポキシは、ポリエポキシド溶液（例えば、Ｄｅｖｃｏｎ社、アルバータ州、カナダ）と多官能性硬化剤を体積比１：１で混合することによって製造された。ＰＤＭＳの場合、シリコーンエラストマー（例えば、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国）を容器に直接慎重に分配して空気の閉じ込めを最小限に抑え、その後、重量比１０：１で硬化剤と混合する。続いて、ディフューザーとして機能するＺｎＯナノ粒子（例えば、～１００ｎｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州、米国）を、別途指定される１５重量％の濃度でマトリックスに添加することができる。コア直径が２００μｍで、先端が研磨されたマルチモード光ファイバー（例：ＦＴ２００ＥＭＴ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社、ニュージャージー州、米国）を混合溶液の表面から約１００μｍ下に慎重に浸し、マイクロマニピュレーターを使用して素早く引き上げた。本開示によれば、室温で垂直に置くことにより、ポリマーが架橋し、マトリックスがコーティングを形成した。エポキシで作られた拡散層１１６は、その後、エポキシの吸収／熱膨張層１１８でコーティングできることが想定される。
［００５６］
このようにして、特定の音響インピーダンスの不整合を最小限に抑えることができ、光音響変換効率を最大化することができる。グラファイト粉末（例えば、Ｄｉｃｋ Ｂｌｉｃｋ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ社、イリノイ州、米国）を、３０重量％の濃度でマトリックスと混合することができる。ＭＷＣＮＴ（例えば、外径＜８ｎｍ、内径２～５ｎｍ、長さ０．５～２μｍ、ＶＷＲ社、ニューヨーク州、米国）は、密度が低い（１．６５ｇ／ｃｍ２）ため、溶解度の上限に近い０～１０重量％の濃度で使用できる。同様に、ＰＤＭＳマトリックスで作られたＴＦＯＥを製造できる。サブＭＨｚ周波数を生成するＴＦＯＥの例示的な実施形態では、構造をＺｎＯ／エポキシ（拡散層１１６）及びＣＮＴ／ＰＤＭＳ（吸収／熱膨張層１１８）として変更することができ、ここでは、エポキシとＰＤＭＳが特定の音響インピーダンスの不整合を実現した。このようにして、セル変調に必要な周波数を満たしながら、圧力を妥協することができる。ファイバー先端付近にサーマルレジストインクでマークを付け、塗布前後の顕微鏡写真上でマークを位置合わせすることで、塗布後の膜厚を測定できる。特に、光漏れは、水及びトランスデューサプローブ内のパルスレーザー誘発衝撃波により、検出トランスデューサー上で音響応答を生成し、潜在的に検出器の損傷を引き起こす可能性がある。パワーメーターを使用して光透過率を測定し、光漏れを評価できる。したがって、上述した本開示の設計及び製造は、ＴＦＯＥ１００の光漏れを排除することができる。
［００５７］
本開示の実施形態によれば、優れた光学的及び機械的特性を有するナノ粒子ポリマーマトリックスから構成されるファイバーベースの光音響エミッターの設計及び製造が開示される。拡散層１１６及び膨張層１１８を含む２層コーティング設計は、生成される超音波の振幅及び周波数の正確な制御性を提供すると考えられる。高振幅とサブＭＨｚ範囲の調整可能な周波数による局所的な音響波の生成が達成された。光音響信号プロファイルを振幅と周波数スペクトルで特徴付けることにより、ＣＮＴ／ＰＤＭＳのマトリックスが高振幅を達成するための好ましい候補として実証できる。
［００５８］
本開示によれば、音響周波数を調整する（すなわち、制御する）ための２つの効果的な戦略が提供される。第１に、周波数は、音響インピーダンスの不整合によって減衰材料として機能する拡散層１１６の厚さによって変えることができる。第２に、音響周波数は、吸収／膨張層１１８を通る光の浸透の深さによっても制御することができ、これは吸収体濃度を変えることによって間接的に制御されている。小分子を細胞膜にデリバリーするために０．３ＭＨｚから８．０ＭＨｚの範囲の様々な周波数のＴＦＯＥ１００を使用することにより、サブＭＨｚの超音波は高周波と比較して優れた効率を示した。０．２ｍｍ2の側方空間制限は、ソノポレーション有効面積によっても確認できる。これにより、小型化されたＴＦＯＥを使用して、ミリメートル未満の閉じ込めを備えたサブＭＨｚ周波数の音響を生成でき、他の一般的な超音波発生源の制限を克服できる。このＴＦＯＥデバイス設計は、細胞膜ソノポレーションなどの幅広い細胞的用途やその他の例示的な用途に有望であり、また、高い有効性と最小限の安全性の問題を備えた、局所的な薬物デリバリー、ニューロン刺激、及び遺伝子トランスフェクションのための新しいツールも提供する。
［００５９］
本明細書の実施形態によれば、本開示のデバイス及び方法によって、単一細胞精度での一次ニューロンのＴＦＯＥ刺激を生成することができる。培養中の単一ニューロンを調節する際に、ＴＦＯＥ１００が十分な空間精度を提供するかどうかをテストするために、例示的な例には、ＧＣａＭＰ６ｆを発現する初代ラット皮質ニューロンを調製し、倒立広視野蛍光顕微鏡を使用してカルシウムイメージングを実行することが含まれる。図３４Ａ及び３４Ｂは、それぞれ５０ミリ秒及び１ミリ秒のレーザー持続時間でＴＦＯＥによって刺激されたまばらな集団における蛍光画像及びカルシウムトレースである（刺激後のピーク強度の蛍光画像は「アフター」として示されている。青い矢印：レーザーの開始）。マイクロマニピュレーターによって制御されるＴＦＯＥ１００は、標的ニューロン３４１４から約５μｍ離れたところに配置できる。１０３０ｎｍ及び１．７ｋＨｚ繰り返し周波数の３ナノ秒パルスレーザーを使用すると、８５パルスに相当する平均出力７．８ｍＷで持続時間５０ミリ秒のレーザーパルスを照射できる。これにより、図３４Ａに示すように、標的ニューロンに対するレーザー照射直後にカルシウム過渡現象を観察することができる一方、先端から約５０μｍ～７０μｍ離れた他のニューロン３４１６は影響を受けず、これはＴＦＯＥ刺激の高い空間分解能を示している。最大ΔＦ／Ｆが１３５％±８３％（３つの培養からＮ＝６、データは平均±ＳＤ）のカルシウム過渡現象は、おそらくＴＦＯＥ刺激によって誘発された複数の活動電位の発動によって標的ニューロンの活性化が成功したことを示している。時間分解能をさらに向上させるために、１１．４ｍＷの出力で１ミリ秒（２パルス）のレーザーパルス列をＴＦＯＥ１００に供給できる。図３４Ｂに示すように、単一ニューロン３４１４の活性化の成功は、１０６％±６１％の最大ΔＦ／Ｆで観察することもできる（３培養からのＮ＝８細胞、データは平均±ＳＤ）。
［００６０］
本開示によれば、ＴＦＯＥ１００は、それにより、光ファイバー上の光拡散層１１６及び膨張層１１８から構成される、ミリメートル未満の閉じ込めを有する小型超音波点音源として機能することができる。音響減衰と光吸収性能を変更することで、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数が実現され、周波数依存の効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導できる。回折限界を突破することで、サブＭＨｚの周波数とサブミリメートルの精度の間の妥協の問題を解決することで、ＴＦＯＥ１００が領域特異的な薬物デリバリー、遺伝子トランスフェクション、及び神経刺激を提供できることが想定されている。さらに、３μＭのテトロドトキシン（ＴＴＸ）を含む１ミリ秒のＴＦＯＥ１００の対照群は活性化を示さないことが考えられ、実験群で観察され得るカルシウムの増加がＮａ＋チャネル依存性活動電位に起因することが確認された。本明細書の実施形態によれば、コーティングのないテーパー状ファイバーを使用した１．０秒のパルス列及び１１．４ｍＷ出力のレーザーのみの群は活性化を示さないため、ニューロン活動に対するレーザーの影響を除外することができる。
［００６１］
本開示の実施形態によれば、ＴＦＯＥ１００は、神経活性化を確実かつ繰り返し誘発することができる。図３４Ｃは、ＴＦＯＥ１００刺激を３回繰り返したときの同じニューロン３４１４の蛍光強度を示す。各刺激には１ミリ秒のレーザー持続時間が、各記録期間の間に１分の間隔で利用されることが想定されている。同じニューロン３４１４の各刺激で活性化が成功する。これにより、ＴＦＯＥ１００刺激後のニューロン３４１４の生存率が確認できる。連続刺激ごとに最大ΔＦ／Ｆの減少が観察されたが、これはカルシウムの枯渇又はスパイク周波数の適応に起因すると考えられる。さらに、図３４Ｄでは、ＴＦＯＥ１００によって選択的に標的とされる３つのニューロンを使用するＴＦＯＥ１００刺激の空間精度を実証することができる。これらの３つのニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６は、２５±２μｍの端から端までの間隔を有する。ＴＦＯＥ１００は、３つの標的ニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６のそれぞれから約５μｍ離れて連続的に配置することができる。最大蛍光強度変化（ΔＦ／Ｆ）は、図３４Ｄに示すように、各ニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６について、それぞれ赤、黄、緑で色ラベルを付けることができる。重要なことに、蛍光の増加は、他の２つのニューロンが同時に活性化されることなく、選択的に標的とされたニューロンでのみ観察され、ＴＦＯＥ刺激が２５μｍ未満の空間分解能を提供することを示している。これらの結果は、ＴＦＯＥ１００が単一ニューロンを確実かつ再現性よく刺激できることを総合的に裏付けている。
［００６２］
本明細書の実施形態によれば、ニューロンに対する単一の光音響パルスの刺激効果も操作することができる。このようにして、同じナノ秒パルスレーザーを使用して、単一のレーザーパルスをＴＦＯＥに送信できる。異なるレーザーパルスエネルギーによるＧＣａＭＰ６ｆ発現一次皮質ニューロンのＴＦＯＥ刺激は、単一パルス条件下で実行できる。図３５Ａ～３５Ｃは、例えば５０μｍでのＴＦＯＥ刺激のパルスエネルギー依存性の画像である。それにより、図３５Ａ～Ｃは、単一パルスによるＴＦＯＥ１００刺激の前（図３５Ａ）及び後（３５Ｂ）のＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロン３４１４の蛍光画像を提供し、最大ΔＦ／Ｆ（３５Ｃ）も視覚化する。図３５Ｄは、単一パルス刺激を受けた標的ニューロン３４１４のカルシウムトレース３５４０のグラフである（青線：代表的な光音響波形を示すズームインによる光音響刺激の開始）。パルスエネルギーが６μＪ／パルスに達するまで、カルシウム過渡現象は観察されない。光音響波の幅は約１マイクロ秒であると想定される。この機能により、自然な神経コーディングを模倣するために必要な前例のない時間精度で神経回路の音響制御が可能になる可能性がある。図３５Ｅは、パルス数（Ｎ＝５～７）の関数としてのニューロン３４１４刺激の成功に対するパルスエネルギー閾値のグラフ３５５０である。
［００６３］
本開示はさらに、ニューロン刺激を成功させるために所与のパルス数に対して必要なレーザーエネルギーを考慮する。これまでの超音波研究では、さまざまな強度と持続時間の連続波超音波とパルス超音波がニューロン刺激に適用されてきた。時間平均されたＵＳ強度と応答振幅又は成功率との間の関係は、負又は正であることが判明した。これらの研究を考慮して、本開示は、複数の強度及び持続期間にわたる音響刺激に応答したニューロンの挙動の統計的調査を追求する。引き続きこの用途において、まず、刺激が成功するためのパルスエネルギーの閾値は、２０％を超える最大蛍光強度変化（ＭａｘΔＦ／Ｆ）を誘発するのに十分なレーザーパルスエネルギーとして定義される。２０％ＧＣａＭＰ６ｆの最大ΔＦ／Ｆは、活動電位１以上に対応すると特定できるためである。パルス数を１、２、４と増加させると、閾値エネルギーはそれぞれ６．３μＪ、４．９μＪから３．９μＪまで単調減少を示すことが想定され、パルス数がそれぞれ６と８に増加しても、それは３．９μＪと３．６μＪで比較的一定のままである。これらの結果は次のことを示している：第一に、レーザーパルス数が１～４の範囲で増加するときのエネルギー閾値の減少は、小さなパルスエネルギー条件下では、パルス数の増加とともに閾値以下の脱分極が蓄積することを示している。第二に、４パルスから８パルスへの閾値エネルギーの平坦化傾向は、約４μＪ／パルスにエネルギー閾値が存在することを意味しており、それ以下ではパルス列をさらに延長しても活動電位はほとんど誘発されない。
［００６４］
培養初代ニューロンの刺激が成功すると、本開示はさらに、ＴＦＯＥ１００が細胞内構造を標的にできるかどうかを検討する。この目的を達成するために、まず、ＴＦＯＥ１００を、細胞体が存在せずに軸索と樹状突起が密集している標的領域の上に注意深く配置する。持続時間１ミリ秒、レーザー出力１１．４ｍＷ、繰り返し率１．７ｋＨｚの１０３０ｎｍレーザーパルス列をＴＦＯＥ１００に供給できることが想定されている。図３６Ａ～Ｄに示すように、標的領域での蛍光強度の増加は、レーザー開始後に明確に観察でき、標的神経突起のＴＦＯＥ刺激が成功したことを示す。図３６Ａ及び３６Ｂはそれぞれ、ニューロンネットワーク（色付きの矢印：標的領域３６１０（紫）、ニューロン１（シアン、３６１２）、ニューロン２、３（赤、それぞれ３６１３、３６１４）に沿って伝播するカルシウム波によるＴＦＯＥ１００誘発神経突起活性化の前後の画像である。図３６Ｃは、レーザー開始４秒後のカルシウムシグナルのΔＦ／Ｆの画像である（スケールバー：５０μｍ）。図３６Ｄは、３６Ａでラベル付けされた、標的領域（紫、３６１０）、ニューロン１（シアン、３６１２）、並びにニューロン２及び３（赤、それぞれ３６１３及び３６１４）のカルシウムトレースのグラフである（挿入図：レーザー開始直後のカルシウム信号の拡大図、黒い矢印：レーザー開始）。視野全体のイメージングを通じて、３つの異なるカルシウムの動態を捉えることができる。まず、ＴＦＯＥ刺激後に、神経ネットワーク内の標的領域から始まるカルシウム波のゆっくりとした伝播が観察される。カルシウム波の伝播速度は７５．２μｍ／ｓと計算できると想定され、これは、シナプス活動又は代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）の活性及び逆伝播活動電位によって誘導される樹状カルシウム波の伝播速度と一致しており、その速度は約７０μｍ／ｓ４２であった。第２に、図３６Ｃに示すように、視野内の４つの部位は、カルシウム波が広がる前に蛍光シグナルの上昇を示す。標的領域の神経突起（図３６Ａ～Ｃの紫の３６１０）及び標的領域の神経突起に直接接続する軸索を有する特定のニューロン１（図３６Ａ～Ｃのシアンの３６１２とラベル付けされる）は、レーザー開始直後に速いカルシウム過渡現象を示した（図３６Ｄ）。これは、活動電位の逆伝播に似ている。無髄軸索が活動電位スパイクを５００μｍ／ミリ秒の速度でシナプスに伝導することを考慮すると、約１００μｍの距離にわたる神経突起からニューロン１（図３６Ａ～Ｃのシアン）への伝播には０．２ミリ秒しか必要としない。したがって、ニューロン１（図３６Ｄのシアンの３６１２）と標的領域（図３６Ｄの紫の３６１０）のカルシウム過渡開始の差は、サンプリング間隔５０ミリ秒のカメラでは検出できなくなる。第三に、近くにあるが標的領域に接続する軸索を持たないニューロン２及び３（図３６Ａ～Ｃにおいてそれぞれ赤の３６１３及び３６１４とラベル付けされている）は、同様の時間的動態で約０．２秒の活性化遅延を示した（図３６Ｄ、挿入図）。このシグナル伝達は、カルシウム波よりも速い伝播速度を示したため、シナプス伝達を通じて引き起こされる活動電位に起因すると考えられる。
［００６５］
細胞内構造、特に軸索と樹状突起に対するＴＦＯＥ誘発刺激のこの能力を利用して、軸索と樹状突起が光音響刺激に対して異なる応答プロファイルを持つかどうかを解明できる。図３６Ｅでは、多極ニューロン内の３つの神経突起がＴＦＯＥ１００によって選択的に標的とされた。神経突起の１つ（図３６Ｅ及びＦの赤色３６２２）に対する標的化ＴＦＯＥ刺激１００は、遅滞なく細胞体において強力なカルシウム活性化を誘導した（図３６Ｆ及びＪ）。したがって、そのような伝播する活性化は軸索における活動電位の逆伝播に似ているため、この神経突起３６２２は軸索として識別される。明らかに、他の２つの神経突起（図３６Ｅ、Ｇ、及びＨの黄色３６２３及び緑色３６２４）の標的化ＴＦＯＥ１００刺激は、体細胞でいかなる活性化も誘導しなかった（図３６Ｇ～Ｊ）。したがって、それらは樹状突起として識別できる。図３６Ｆ～Ｈは、異なる領域の刺激時のカルシウム信号の最大ΔＦを示す。ニューロンの樹状突起は、上流のニューロンからのシナプス入力を統合することが知られており、これには急速に連続して到着する刺激の合計が含まれ、別々の枝からの入力の集約が伴う。このケースの場合、単一の樹状突起の前方伝播では、細胞体で活動電位を誘発するには不十分であることが判明する可能性がある。単一細胞レベルでの音響刺激に対する軸索と樹状突起の反応の違いは、複数のニューロンにわたって再現可能であることが示されている。図３６Ｉは、３６Ｅにおいて赤の３６２２、黄色の３６２３、及び緑の３６２４の矢印でそれぞれラベル付けされている、標的神経突起において測定されたカルシウムトレースのグラフである。図３６Ｊは、異なる神経突起の刺激時に体細胞で測定されたカルシウムトレースのグラフである（３６Ｉ～Ｊの青い矢印：レーザー開始）。まとめると、これらのデータは、ＴＦＯＥ１００の細胞内ターゲティング機能によって可能になる、光音響刺激に対する軸索と樹状突起の異なる応答ダイナミクスを初めて明らかにする。
［００６６］
本開示によれば、単一ニューロンＴＦＯＥ１００刺激の重要な利点は、細胞内パッチクランプ記録との適合性である。刺激に対するカルシウム反応の時間分解能は限られているが、細胞内パッチクランプ記録を使用した直接記録は、閾値以下及び閾値以上のニューロン活動を研究するための黄金標準となる。従来の超音波はガラスと膜の間のパッチの付着を容易に破壊するため、従来の超音波刺激中の細胞内パッチクランプ記録は困難であった。本開示の光音響刺激方法及びデバイスは、機械的破壊が最小限に抑えられた局所的な光音響場という利点を有する。したがって、パッチを適用して記録することができ、神経システムの機械的変調に関する洞察を得る新しいテストシステムを提供する。
［００６７］
このように、本開示は、ＴＦＯＥ１００刺激を単一ニューロン上で記録するパッチクランプ３７１２と統合する。例示的な例として、これは、光音響単一ニューロン刺激に対する直接的な電気応答を検出するために、マウスの皮質スライス上で実行され得る。図３７Ａ～Ｂは、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン３７１５及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロン３７１４を標的とする、マウス脳スライス内のＴＦＯＥ１００と一体化されたパッチクランプ３７１０の２光子画像を提供する（パッチピペット３７１８は、細胞内電極溶液中のシアン緑色蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を使用して図３７Ｂで視覚化されている）。図３７Ａに示すように、特定の細胞型の視覚化を助けるために、ＧＡＤ２介在ニューロンにおいてｔｄＴｏｍａｔｏを発現するマウスからの脳スライスが提示される。したがって、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロン３７１４及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン３７１５を選択的に標的にすることができる。ＴＦＯＥ１００は、パッチピペット３７１８と統合して、脱分極を誘導し、標的ニューロンにおける活動電位の生成を引き起こすことができる。
［００６８］
また、図３７Ｃ～Ｆに示されるように、ニューロン膜電圧は、ＴＦＯＥ１００刺激時に前例のない安定性で正確に測定することができる。本開示の実施形態によれば、電流クランプ３７１２モード下の興奮性錐体細胞３７１４について、５μｍでのＴＦＯＥ刺激の直後に一連の活動電位を観察することができる（図３７Ｃに示すように）。図３７Ｃ及びＤは、約５μｍ（図３７Ｃのグラフ線３７３０）及び約１０μｍ（図３７Ｄのグラフ線３７４０）の距離でのＴＦＯＥ刺激（５ミリ秒）時の興奮性錐体細胞における膜電圧応答のグラフである。この結果は、図３４Ａ～Ｂ及び３５Ｄに示されるように、蛍光変化におけるΔＦ／Ｆが１００％を超える以前のカルシウムイメージングと一致している。ＴＦＯＥがニューロン３７１４及び３７１５から５～１０μｍ離れたところに移動すると（図３７Ｃ及びＤ）、活動電位が閾値以下の脱分極に道を譲ると考えられ、これは組織内の音場の閉じ込めが高いことを示している。
［００６９］
次に、本開示は、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性介在ニューロンを標的とすることを含む。図３７Ｅ及びＦは、膜電圧－７５ｍＶ（図３７Ｅのグラフ線３７５０及び３７５２）及び－４０ｍＶ（図３７Ｆのグラフ線３７６０及び３７６２）における、約５μｍでのＴＦＯＥ刺激時の抑制性介在ニューロンにおける電圧応答のグラフである（レーザー：１１．４ｍＷ、１．７ｋＨｚ、持続時間５ミリ秒）。ＴＦＯＥは、－７５ｍＶに保たれた抑制性介在ニューロンにおいて閾値下脱分極を誘導し、刺激後の経時的な電気応答は２つの成分を示した（図３７Ｅの３７５０）。図３７Ｅの最初の鋭いピーク３７５０は、音響波による膜の完全性の直接の中断によるものである可能性があり、次の広いピーク３７５２は、内向きチャネル電流による可能性が高く、イオンチャネルの関与の可能性を示している。－４０ｍＶ近くまで正の電流を注入することによって膜が脱分極されると、ＴＦＯＥ刺激時に３つの活動電位の短い列３７６２が観察された（図３７Ｆ）。音響刺激に対する興奮性錐体ニューロンと抑制性介在ニューロンの異なる応答は、これら２つの細胞型に固有の活動電位閾値や、音響放射力に対して異なる応答ダイナミクスを持つ機械感受性イオンチャネルの分布など、複数の要因によって寄与されている可能性がある。これにより、ＴＦＯＥ１００は、パッチクランプ３７１２記録と互換性のある前例のない安定した超音波源を提供し、音響誘発ニューロン刺激のメカニズムを明らかにすることが期待される。
［００７０］
テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）は、ナノ秒レーザー、先端が加工された光ファイバー、光音響コーティング、及び光熱効果を最小限に抑えて排除するための一連の動作パラメーターで構成されている。レーザーパルスによって励起されると、コーティングされた先端は光音響効果によってファイバー先端で局所的に全方向性音響波を生成できると考えられている。生成された音響波は、ＴＦＯＥ先端から１００μｍ未満の距離内に高度に局在しており、単一ニューロンの精度でニューロンを活性化するために利用できる。さらに、ファイバー先端は、単一ニューロンからサブミリメートル解像度までの幅広い解像度を提供するように設計でき、パッチクランプを介した単一ニューロン活性化の電気生理学的記録と連携して動作できる。
［００７１］
注目すべきことに、ＴＦＯＥ１００は、１００μｍ未満の精度で神経調節をデリバリーする能力において新規である。本開示のファイバー光音響発生器は、他のファイバー光音響発生器よりも発生する熱がはるかに少なく、効果的な超音波を生成できることが想定される。さらに、ＴＦＯＥは、ファイバー先端から１００μｍ未満の距離内に限定された局所的な超音波場を生成する。これは、他のファイバーベースの光音響デバイスよりも緊密である。音響強度が距離にわたって急速に減衰することを可能にする全方向音響伝播機能と併せて、ＴＦＯＥは高い空間精度でより効果的かつ効率的に神経活性化を生成できる。
［００７２］
本開示によれば、ＴＦＯＥはコンパクトな１０３０ｎｍ、３ナノ秒レーザーと、直径２００μｍ、先端テーパー付きの０．２２ＮＡマルチモーダルファイバーと、テーパー状ファイバー先端の層コーティング（コーティングされた先端全体の直径は、厚さ１０～１００μｍの範囲になる）から構成される。光音響プロセスを通じて、パルスレーザーエネルギーはＴＦＯＥ先端で生成される音響波に変換され、その後、その音響波が先端付近のニューロンを興奮させる。ＴＦＯＥコーティングは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得ることが想定される。
［００７３］
本開示では、その高い光吸収効率及び熱伝導効率により、ＴＦＯＥを構成するカーボンナノチューブがレーザーを完全に吸収し、熱に変換できることが意図される。その後、熱は周囲のＰＤＭＳに伝達され、全方向に伝播する光音響波が生成される。このように、ＴＦＯＥは光音響効果を利用して、約２０μｍの空間閉じ込めで音響波を生成し、超音波源に対して前例のない高い空間分解能を提供する。
［００７４］
さらに、本開示のＴＦＯＥは、繊維工学、材料の変更、及び新規な堆積方法によって達成される、空間分解能及び光音響変換効率の両方の改善をもたらす。本開示によれば、ＴＦＯＥによって生成される光音響波は、個々の培養ニューロンを直接活性化し、細胞内カルシウム過渡状態を生成することができる。これにより、ＴＦＯＥはファイバー先端の周囲半径２５μｍ以内のニューロンを活性化し、従来のピエゾベースの低周波トランスデューサーや以前のＴＦＯＥデバイスを上回る単一ニューロン分解能を実現する。
［００７５］
このようにして、ＴＦＯＥは単一細胞や軸索や樹状突起などの細胞内構造に音響刺激を与えることができる。時間的には、１マイクロ秒の持続時間の単一の音響パルスは、望ましいニューロン刺激、又は成功した神経調節のための既知の最短持続時間の音響刺激を達成することができる。重要なのは、ＴＦＯＥによって生成される近接場音響波は、無視できる程度の光熱効果を誘導しながら、全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞応答を同時に監視しながら、光音響刺激を可能にすることができるということである。さらに、ＴＦＯＥ先端コーティング構造、形状及び材料を変更して、さまざまな超音波空間伝播パターン、異なる超音波強度及び周波数を達成できることが考えられる。
［００７６］
本開示の実施形態によれば、電気刺激、超音波刺激、及び光遺伝学的刺激治療は、ＴＦＯＥ１００を介して光音響周波数をデリバリーすることによって神経突起伸長を促進することができる。これは、損傷が発生した場合に神経組織を機能的に修復するための重要なプロセスである。したがって、本開示の光音響プロセスは、神経活動の非遺伝的な時間的及び空間的に正確な刺激をもたらす。本開示の実施形態によれば、ファイバーベースの光音響エミッター１００（ＴＦＯＥ又はＴＦＯＥ）は、インビトロ及びインビボの両方で神経刺激において光音響効果を使用する実現可能性を表わす。図３９のニューロン３９１０は、一次ニューロンがオレゴングリーンで染色されているビトロカルシウム応答を介した結果であることを示している。ＴＦＯＥ１００と同様に、図４０Ａの３８４６を介して測定されるＴＦＯＥ３８００は、光音響刺激がインビボＬＦＰ応答に適用される場合、図４０Ｂの４０２０において同様に示されている。両方について、本開示の光音響プロセスを介して神経刺激を確実かつ繰り返し適用して、神経突起伸長及びその後の神経組織の修復を促進することができる。
［００７７］
特に、ＴＦＯＥ１００は、細胞の変調及び再生の目的で、パルス光エネルギーを超音波パルスに変換できることが想定される。この光音響材料は、拡張マトリックス内の光吸収体で構成することができ、フィルムや３Ｄ構造などのさまざまな設計で使用できることが考えられる。生成された超音波は、ＴＦＯＥ材料の近くに配置されたさまざまなタイプのニューロンなどの細胞を刺激したり、材料が集束超音波を生成するように設計されている場合は組織内のニューロンを刺激したりできる。
［００７８］
本開示の実施形態によれば、ヒドロゲルの土台は、ナノ複合アプローチを介して光音響機能と統合され、ニューロンの再生を可能にする。ヒドロゲルは、ニューロン培養に使用される場合、シルクフィブロインによって神経成長をサポートし、制御可能な生分解速度、調整可能な薬物負荷能力、光学的透明性、及び調整可能な機械的特性も提供する。さらに、カーボンナノチューブは、効率的な光音響剤として機能することができる。カーボンナノチューブを神経刺激に使用すると、高い光から音への変換効率が得られる。さらに、広帯域の光吸収により、将来の用途でレーザーシステムを柔軟に選択できるようになる。カーボンナノチューブは毒性が最小限であり、生体光音響イメージングの用途における確認に役立つ。
［００７９］
本開示の実施形態によれば、ＰＥＧ官能化は、繊維ベースの光音響エミッター１００を構成するＣＮＴ／シルクフィブロインフィルムの全水性製造方法７００を可能にする。シルクフィブロイン７１０は、図７に示すように、型に応じて、シルク溶液７３０（２ｗｔ／ｖ％）と官能化ＣＮＴ溶液７４０（２０～１００μｇ／ｍｌ）を混合することによって水溶液７２０に抽出され、続いて、生成物を７５０℃でキャスティング及び乾燥させて、それぞれＣＮＴ／シルクフィルム７６０又はＣＮＴ／シルクロールを製造した。ＰＥＧ官能基化により、ＣＮＴ水分散性が向上し、毒性が軽減された。表面機能化の結果は、図８のゼータ電位８００でうまく確認できる。
［００８０］
本開示の別の態様によれば、広帯域音響波は、ＣＮＴ／シルクフィブロインフィルムによって生成され得る。例えば、図９は、パルスレーザー９１０を介してマルチモード光ファイバー９１４を介してＣＮＴ／シルクフィルムにデリバリーされる、パルス幅３ｎｓの１０３０ｎｍレーザー９１０を示しており、照射面積は約０．０５ｍｍ2である。音響波９１２は、１０ＭＨｚのトランスデューサーを使用して特性評価され、オシロスコープ９２０によって記録された。その結果、音響パルス幅１μｓ、広帯域中心周波数１．２ＭＨｚ、圧力０．２６ＭＰａの光音響波９１２は、図１０Ａのグラフ線１０１０に示すように、１４．７μＪのパルスエネルギーで生成された。図１０Ｂのグラフ線１０２０は、それぞれ時間及び周波数の関数として示されている。光音響刺激には適切な圧力が必要であり、埋め込まれたＣＮＴの濃度とレーザー出力を操作することで制御できることに留意されたい。これを測定するために、以下が計算される。
［数２］
式中、
［数３］
であり、ｌは固有長さ、Ａは光吸収係数、Ｆはレーザーフルエンス、βは体積熱膨張係数、νは音速、Ｃpは比熱容量である。光吸収材料として、図１１のグラフ線１１１０（ＣＮＴ濃度μｇ／ｍＬの関数としてパルスエネルギーを７５μＪに固定）及び図１２のグラフ線１２１０（パルスエネルギーμＪの関数としてＣＮＴ濃度を２０μｇ／ｍＬに固定）に見られるように、埋め込まれたＣＮＴの濃度が高いほど、吸収係数が高いため、より強い音響波が発生する。
［００８１］
本開示の実施形態によれば、生体適合性及び無視できるほどの熱影響は、神経組織の光音響刺激を介して確認され得る。図１３Ａは、製造されたＣＮＴ／シルクロール又はフィルムをガラス対照群と比較したときの、ニューロン／面積の関数としてのインビトロ形態を確認するグラフ１３１０である。図１３Ｂは、製造されたＣＮＴ／シルクロール又はフィルムをガラス対照群と比較したときの、全長／面積の関数としてインビトロ形態を確認するグラフ１３２０である。図１３Ｃは、コントロール、ＣＮＴ／シルク、及びシルクフィルム＋ＣＮＴグループの細胞生存率をそれぞれ確認するグラフ１３３０である。
［００８２］
図１４は、生後１０週目のマウスのインビボ組織学における神経組織の光音響刺激による生体適合性及び無視できる熱影響をＨ＆Ｅ染色で確認する画像１４００を表わす。４倍と４０倍の倍率レベルでそれぞれ５０μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬに曝露した場合、結果は３日目と３０日目の間隔で記録された。さらに、図１５は、１５００における生体適合性及び無視できるほどの熱影響を確認するパルス列を示す概略図を表わす。繰り返し率は１．７ｋＨｚ、持続時間は３ｍｓ／５パルス、レーザーパルスエネルギーは５３μＪに設定される。図１６は、経時的な温度の関数として、グラフ線１６１０におけるＣＮＴ／シルクの性能とグラフ線１６１２における単離されたシルクの性能を示すグラフであり、ＣＮＴ／シルクの組み合わせの改善された光音響能力をさらに裏付ける。
［００８３］
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＣＮＴ／シルクフィルムによって生成された光音響波は、神経活動を確実かつ繰り返し刺激する。そうするために、図１７～２０に示すように、５ｍｓ（８パルス）で１４．７μＪ（２９．４ｍＪ／ｃｍ２）のレーザーパルスエネルギーを、４日目にトランスフェクトされた一次皮質ニューロンＧＣａＭＰ６ｆに適用することができる。図１７は、光（ＣＮＴ／シルク光＋）にさらされたときのＣＮＴ／シルクフィルム１６１０の性能の１００μｍの画像であり、光照射により活性化領域１７１０が決定される（破線１７１２はレーザー照射領域を示す）。図１８は、光（シルク光＋）にさらされたときのシルクフィルム１６１２の性能の１００μｍの画像であり、光照射が活性化領域１８１４を決定する（点線はレーザー照射領域１８１６を示す）。これをさらに説明するために、図１９及び２０は、ＣＮＴ／シルクの性能について、光にさらされた場合をグラフ線１９１０、光にさらされていない場合（ＣＮＴ／シルク光－）をグラフ線１９１２、シルクフィルムが経時的なΔＦ／Ｆ０の関数として光にさらされた場合をグラフ線１９１４で示すグラフである。これにより、光音響刺激により確実かつ繰り返し神経活性化を誘導できることが確認でき、また、神経機能が損傷していないことも確認できる。
［００８４］
本開示の別の態様によれば、光音響刺激は、神経突起伸長を促進することができる。例示的な実施形態は、図２１～２６に示すように、ラットの後根神経節（ＤＲＧ）外植片を介して観察することができる。図２１は、１．７ｋＨｚ及び５ｍｓのパラメーターでラット後根神経節外植片に経時的に適用される光音響刺激の概略図２１００を含み、パルス列は２分ごとに１時間適用される。図２２は、それぞれ、ＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するＣＮＴ／シルク光＋の従来の画像及び挿入画像を含む。図２３には、ＣＮＴ／シルク光の従来の画像と挿入画像が含まれており、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有する。図２４は光照射を受けたときの、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するガラス光制御グループの従来の画像及び挿入画像を含む。図２５は、光照射を受けていないときの、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するガラス光制御グループの従来の画像及び挿入画像を含む。
［００８５］
例示的な例を続けると、図２６は、面積の関数としての図２２～２５のグラフである。適用すると、光音響刺激ＤＲＧ（１８．１９±１．３７ｍｍ２）は、ガラスコントロールグループ（１０．４８±５．０６７ｍｍ２）と比較して、カバー面積が１．７４倍増加した。さらに、光音響刺激は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現を高めることができる。例示的な実施形態として、光音響刺激の２４時間後、それぞれ図２７及び２８に示すように、２つの神経栄養因子、ＢＤＮＦ及びＮＧＦをＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって測定した。その結果、光音響刺激ＤＲＧのＢＤＮＦ濃度（８６．５２±１７．０７ｐｇ／ｍｌ）は、ガラス対照群（４４．２０±２２．３１ｐｇ／ｍｌ）と比較して１．９６倍の増加を示した。ＮＧＦの発現量に有意差は認められなかった。このようにして、光音響刺激によって誘発される活動電位とそれに続くカルシウム流入は、ＢＤＮＦ経路に影響を与え、神経突起の伸長を促進する。
［００８６］
本開示によれば、実証された高い小型化レベルを達成することによって、調整可能な光音響エミッターを低侵襲性の医療用途に展開することができる。例えば、前述のファイバーベースの光音響デバイス１００は、焦点病変に近接した注射針又はカテーテルに挿入することができ、これにより、従来の集束超音波によって引き起こされる精度及び振幅の低下の問題を克服することができる。さらに、ＴＦＯＥ１００の先端の形状により、凹面構造を介して周波数波を集束させることができることが想定されている。図２９は、時空間符号化及び復号化を可能にする多機能ニューラルインターフェース２９００が対象を治療するために使用される例示的な例を表わす。この方法は、図３０の図にさらに示されており、コンピュータ３０１０は、２９００を介して脳３０１４に光音響刺激３０１２を提供し、その後、電気記録フィードバック３０１６を受信する。あるいは、図３１Ａ～３１Ｂは、光媒介低侵襲性ＰＮＳ刺激用の埋め込み型カフ３１００が、それぞれ２００μｍ及び１００μｍで対象を治療するために使用される例示的な実施形態を表わす。それにより、ＭＥＣＨエラストニクス３１１０は、神経線維３１１２に光音響刺激をもたらす。さらに、本開示の方法及びデバイスは、超音波パラメーターの修正を通じて、各焦点標的において安定で可逆的なソノポレーションを生成できることが想定され、これにより、生体医療用超音波用途、特に薬物デリバリーや遺伝子導入の場合、既存の技術では実現できない正確な制御が可能になる。図３２は、官能化ステップ３２１０、キャスト及びアニーリングステップ３２２０、及び得られるＣＮＴ／シルク３２３０製品の概要を提供する。図３３は、光音響刺激による興奮したニューロン３３１０の前後の画像を提供する。さらに、ＴＦＯＥ１００は電磁干渉の影響を受けないため、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性があることに留意されたい。
［００８７］
本開示では、約２０μｍの空間閉じ込めで音響波を生成し、単一ニューロン及び細胞内精度での光音響神経変調を可能にするＴＦＯＥが提示される。ＴＦＯＥ１００によって生成された近接場音響波は、光音響刺激と全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞反応の同時モニタリングを可能にし、これは、従来の超音波刺激では困難であると報告されている。ＴＦＯＥ１００をエクスビボ脳スライス電気生理学と組み合わせることにより、本開示は、興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンに対する音響刺激に対する細胞型特異的応答をもたらす。
［００８８］
本開示の実施形態によれば、光音響効果は、生物医学的イメージングに広く使用されており、さらに最近では、神経調節のために研究されている２６。以前に報告された光音響刺激デバイスと比較して、ＴＦＯＥ１００は、新しいデバイス設計と革新的な製造方法を適応させることで新しい機能を提供する。ＴＦＯＥ１００の高効率光音響変換層は、熱膨張性ＰＤＭＳマトリックスに埋め込まれた溶解度が向上したカーボンナノチューブでできており、光から音への変換効率が大幅に向上する。さらに、パンチスルーコーティング法により、非常に小さなテーパー状のファイバー先端を優れた制御性と信頼性で均一にコーティングできる。
［００８９］
ＴＦＯＥ１００の重要な利点は、その前例のない空間分解能であることに留意されたい。経頭蓋超音波神経調節は、げっ歯類、非ヒト霊長類、及びヒトで実証されている。ただし、波の回折限界により、集束超音波神経変調では数ミリメートルの空間精度が得られ１９、これにより、小動物の部位特異的調節や単一ニューロンの刺激が禁止され、細胞型特異的応答を研究する能力が欠けている。この制限を克服するために、ＴＦＯＥ１００は、音響波長と比較して１０００分の１小さく、約２０μｍの空間分解能で１ＭＨｚで局所音場を生成する。本開示は、局所音場を利用して、単一細胞及び細胞内精度での神経刺激を実証し、神経細胞体、樹状突起及び軸索を特異的に標的とすることによる細胞内構造のＴＦＯＥ刺激に対する示差的応答を明らかにする。
［００９０］
パルスレーザーの制御性を利用することにより、本開示は、単一細胞レベルでの光音響刺激の累積効果を特定し、超音波刺激が有効になるまで有限の持続時間にわたって統合され得ることを示す。ネットワークのない状態で単一ニューロンの活動を評価する機能を備えたＴＦＯＥ１００の結果は、個々のニューロンの固有の信号解釈としての刺激蓄積効果をさらに確認する。
［００９１］
さらに重要なことに、本開示では、成功したＴＦＯＥ刺激が、１マイクロ秒の音響パルスを生成する３ナノ秒の単一レーザーパルスで達成されたことが意図される。これまでに、１０の音響サイクルと全体の持続時間２２．７マイクロ秒のシングルトーンバースト超音波は、ニューロン変調のための最も短い音響刺激として報告されている。したがって、本開示は、現在の音響刺激技術の時間分解能の大幅な改善を表わす。
［００９２］
さらに、本開示では、ＴＦＯＥ１００により、音響刺激と全細胞パッチクランプ記録との統合が可能になることが意図される。ＴＦＯＥ刺激による脳スライス内の単一ニューロンの電気生理学的記録は、ＴＦＯＥ刺激に対する興奮性錐体ニューロンと抑制性介在ニューロンの異なる反応を明らかにした。異なる応答は、固有の閾値の違い、又は異なるイオンチャネルの分布の変動に起因する可能性がある。さらに、抑制性ニューロンは、興奮性ニューロンと比較して、活動電位発生の閾値の上昇を示した。これは、抑制性ニューロンの閾値が錐体細胞よりも低い電気刺激を使用した発見とは対照的である。この不一致は、音響刺激と電気刺激のメカニズムの違いに起因すると考えられている。したがって、例えば、イオンチャネルを薬理学的又は遺伝的に変更することによる音響刺激中のイオンチャネルの関与に関するさらなる研究は、機械的神経調節の電気生理学的メカニズムに新しい洞察を提供する。
［００９３］
本開示のデバイスの方法によって提供される遺伝子フリーの単一細胞刺激技術は、ニューロン刺激のメカニズム、及び個々のニューロンがネットワーク内でどのように連携してニューラル計算を実行するかを理解するための新しいツールを提供する。ＴＦＯＥ１００は金属コンポーネントを一切使用していないため、電磁干渉の影響を受けず、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性がある。ＭＲＩは、ヒトの患者の行動と疾患の理解に向けた将来の研究に期待されている。
［００９４］
前述の応用に加えて、神経調節は、脳を理解し、疾患を治療するための貴重なプラットフォームであることに留意されたい。脳や病気を解読するには、行動している被験者の脳活動を正確に操作することが重要である。最適には、変調と読み取りの両方が非侵襲的である。解決策として、超音波神経変調（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｎｅｕｒｏ－ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ、ＵＳＮＭ）は、低周波超音波が非侵襲的に脳活動を調節できるため、新しい非侵襲的神経変調技術である。ＵＳＮＭは、ＴＭＳ及びｔＤＣＳ（～ｃｍ）と比較して、より高い空間分解能（＜５ｍｍ）を持つと考えられている。しかし、ガイダンスが不足していると、正確な超音波神経調節が妨げられる。正確なＵＳＮＭには、ｍｍ未満の解像度でのリアルタイムガイダンスと脳回路の評価が必要である。このようなガイダンスを提供するために、本質的にＵＳＮＭと互換性のある超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ、ＵＳ）画像処理を行うことが理想的であると考えられている。
［００９５］
しかし、超音波は神経活動の感知と体積画像の提供には限界がある。例えば、血流を監視する経頭蓋ドップラー超音波（ｔＤＵＳ）は、認知科学の研究での使用に限定されている。ＵＳイメージングでは、体積モニタリングを実現するのが困難な断層画像（Ｂモード）のみが提供される。
［００９６］
したがって、研究や診療所での超音波神経調節には、標準化された体積測定のガイダンスが必要である。前述のことを念頭に置いて、ｆＭＲＩはＵＳＮＭを指導し評価するための最も適した候補である。これは、機能的磁気共鳴イメージング（ｆＭＲＩ）によって実現できる。ｆＭＲＩは、解像度が約２００μｍの非侵襲的体積機能イメージングである。したがって、ｆＭＲＩは、非侵襲的な神経調節のためのＵＳＮＭ（ｍｍレベル分解能）を導くための最良の候補である。
［００９７］
ただし、既存のＭＲＩ互換ＵＳＮＭツールは、研究者にとって制限されているか、アクセスできない。したがって、従来のＵＳＮＭを再設計するには、フェライトや金属コンポーネントをすべて取り除くなど、高度なエンジニアリングが必要である（ほとんどのＵＳトランスデューサーは、磁場を妨げるニッケル、フェライト、金などの材料を使用しているため）。さらに、これらの材料は干渉を最小限にするための電子部品のシールドを複雑にする。現時点では、新しいＭＲＩ対応ＵＳＮＭは限られている。これまでのところ、２０１６年にＦＤＡによってＩｎｓｉｇｈｔｅｃ（イスラエル、ハイファ、１９９９年設立）に対して承認されたシステムは１つだけである。現在、数千のＭＲＩシステムが使用されているが、世界中に設置されているシステムはわずか２１台である。さらに、コンパクトでポータブルなＵＳＮＭツールを作成することは困難である。ＤＢＳ（埋め込まれたパルス発生器から脳内の電極に電荷をデリバリーするために鉛繊維を利用することを含む）と同様に、ＵＳＮＭは症状の継続的な抑制を達成するために慢性的に適用する必要がある。したがって、コンパクトでポータブルな設計のＵＳＮツールが必要である。しかし、既存のＵＳＮツールは剛性が高く、大きなアンプが必要である。
［００９８］
したがって、非侵襲的でＭＲＩ互換性があり、ウェアラブルで広くアクセス可能な非侵襲性神経調節ツールを提供するという満たされていないニーズがある。本開示の実施形態によれば、ファイバーベースの光音響変換器（Ｆｉｂｅｒ－ｂａｓｅｄ Ｏｐｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ、ＦＯＣ）による光音響脳変調は、ＴＦＯＥ１００と同様の刺激をもたらす。例示的な例として、図３８Ａは、パルスレーザー３８１０がＦＯＣ３８００を介して神経突起組織３８５０に刺激をデリバリーするときの、ファイバーベースの光音響変換器（ＦＯＣ）による光音響脳変調の概略図を表わす。図３８Ｂは、ＦＯＣが光音響刺激を生成し、ＦＯＣ３８００を介して光音響信号３８１２を生成する際のＦＯＣの概略図を表わす。そうするために、パルスレーザー３８１０は、２００μｍのファイバー３８１４を介してデリバリーされ、それによって、ＴＦＯＥ１００と同様に、ＺｎＯ／エポキシ混合物拡散層３８１６及びグラファイト／エポキシ混合物吸収／膨張層３８１８と係合して、信号３８１２を生成する。これを説明するために、図３９Ａ～Ｃは、初代ニューロンをオレゴングリーンで染色した、培養初代ニューロンにおいてカルシウム過渡現象を誘導するＦＯＣ３８００の画像及びグラフ表示をもたらす。さらに、図４０Ａ～Ｂは、切断ツール３８４６及びＦＯＣ３８００を含む、マウスの脳においてインビボで神経活性化を誘導するＦＯＣ３８００の画像及びグラフィック描写をもたらす。ただし、ＦＯＣ３８００は侵襲的であるため、外科的特性があるため、常に最適であるとは限らない。
［００９９］
本開示によれば、ＡＭＲＩ互換のソフト光音響パッド（ＳＯＡＰ）を使用する非侵襲性神経変調システムは、この問題を解決する。図４１は、治療としてＡＭＲＩ互換ソフト光音響パッド（ＳＯＡＰ）を使用する非侵襲性神経変調システムの例示的な概要を提供する。ＳＯＡＰ４１００は、水４１４４、ＰＤＭＳ整合層４１４０、及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合層４１４２を利用して、神経突起組織に集束超音波治療を施す。図４２は、ＳＯＡＰ４１００がこの集束超音波４１２４を治療位置に提供する方法の例示的な概略図を提供し、同様にレーザーパルス４１１０及び光ファイバー４１１４によって可能になる。集束超音波４１２４は、ＳＯＡＰ４１００内の水の量を変更することによってさらに調整できる。図４３は、異なる超音波４１２４及び４１２５の波長をそれぞれ比較することによって、ＳＯＡＰ４１００がどのように適応焦点調整を提供できるかを示す概略図を表わす。
［０１００］
本明細書の例示的な実施形態によれば、この処理は、図４４Ａ～図４４Ｉに適用される。図４４Ａ～Ｃは、光音響放射における静的工学的位相プロファイルを表す湾曲光音響フィルムによる集束超音波の発生に関する例示的な実施形態を示す画像を提供する（スケールバー：５ｍｍ。ＵＳ：超音波（緑）、ＯＡ：光音響（赤））。図４４Ｄ～Ｆは、ラットの頭蓋骨が存在しない場合を示す生成された超音波画像を提供し、図４４Ｇ～Ｉは、ラットの頭蓋骨が存在する場合を示す画像を提供する。
［０１０１］
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰ４１００（例えば、焦点で４ＭＰａ（骨なし）、＜０．６５ＭＨｚの超音波放射を伴う）の設計及び製造が意図される。さらに、経頭蓋ＵＳ送信には０．６５ＭＨｚ未満の超音波が必要であると考えられている。焦点での１ＭＰａは、損傷を与えることなくヒトの脳の反応を誘導するのに十分であることが示されている。さらに、ヒトの頭蓋骨による圧力レベルの４倍の減衰が予想される。図４５は、ＳＯＡＰ４１００システムのセットアップダイナミックの概略図を提供する。レーザーパルス４１１２は、それぞれＦＧ１及びＦＧ２を介して、光ファイバー４１１４を介してＳＯＡＰ４１００治療領域上の空気４１２６に前記パルス４１１２をもたらす。ＳＯＡＰは、調整可能な水４１４４、ＰＤＭＳ整合層４１４０、及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２からなる。
［０１０２］
例示的な実施形態を続けると、成形によるＳＯＡＰ４１００内に挿入することができるＳＯＡＰパッド４１２２の製造が、ＳＯＡＰパッド４１２２の製造プロセスの概略図を提供する図４７を介して指示される。３０％ＣＮＦの溶液を半径２５ｍｍの金型に注入する。溶液を金型内で焼成して形成し、ＰＤＭＳを添加して発光ＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２を形成する。得られた生成物４１４２には、追加のＰＤＭＳが注入され、ＰＤＭＳ整合層４１４０と共に剥離され、ＯＤにカットされ、ＰＤＭＳ整合層４１４０及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２を含むＳＯＡＰパッド４１２２を形成する。ＳＯＡＰ４１２２は、図４６に示すように、さまざまなターゲットに合わせてさらにスケーリング及び調整でき、これは、想定されるヒトとマウスの被写体の直径と焦点距離パラメーターの概要を表形式で提供している（ヒト：直径３０ｍｍ、焦点距離２５ｍｍ、マウス：直径５ｍｍ、焦点距離３ｍｍ）。ＳＯＡＰ４１００はソフトポリマーベースであることが想定されている。
［０１０３］
本明細書の実施形態によれば、光音響刺激の所望の強度は、型の直径及び焦点距離に応じて変化するはずである。図４８は、異なる厚さの超音波波形に関するシミュレーションデータのグラフ表示を提供する。図４９は、対応する周波数スペクトルに関連するシミュレーションデータのグラフ表示を提供する。図５０は、ヒトの頭蓋骨の厚さが６ｍｍであり、横方向のＦＷＨＭが４．６ｍｍである内部焦点に関するシミュレーションデータの画像を提供する。
［０１０４］
これにより、マウスの脳スライス上でエクスビトロでＳＯＡＰ４１００を利用することができる。例示的な実施形態によれば、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１４～１６週齢）を標本として利用することができ、定位固定マウスの脳マップに応じて、厚さ０．５ｍｍの１２枚の連続する冠状画像スライスに焦点を合わせ、最初のスライスはブレグマの２ｍｍ吻側に配置される。図５１は、ＭＲＩチャンバ４１３６内でレーザーパルス４１１２、光ファイバー４１１４、及びＭＲＩユニット４１３０をそれぞれ介してエクスビボで神経変調を受けている拘束されたマウス被験者４１２８の図を表わす。パラメーターは、時間分解能１秒のグラディエントエコーエコープラナーイメージング（ＧＥ－ＥＰＩ）シーケンス（ＴＲ／ＴＥ＝１，０００／１２ｍｓ、フリップアングル６０°、マトリックス８０×３５、１平均）を使用したＢＯＬＤ－ｆＭＲＩイメージングが想定されている。さらに、使用する各マウスで１ｋＨｚのレーザー繰り返し速度で２００ｍｓＳＯＡＰ変調が実行されることが想定されている。
［０１０５］
さらに、ＳＯＡＰ４１００は、自由に動くマウス被験者の神経調節によってインビボに非侵襲的に適用できる。図５２は、非侵襲的なインビボ神経調節を受けている自由に動くマウス被験者４１２９の図を表わす。ＳＯＡＰ４１００は、自由に動くマウスの実験に着用できるほど軽量でコンパクトであると考えられている。ＳＯＡＰ４１００は、レーザーパルス４１１２、光ファイバー４１１４、及びＳＯＡＰ４１００を介して、マウスの左半球の一次運動野及び二次運動野を標的とすることが想定されている。ＳＯＡＰ４１００がオンの場合、コントロールグループと比較した場合、動きのパターンが変化すると予想され（例えば、ＳＯＡＰ４１００がオンの場合の時計回りの動き）、カメラ４１３４で監視できる。
［０１０６］
図５３は、ＳＯＡＰ４１００デバイスを要約した概略図を表わす。ＳＯＡＰ４１００は、ＭＲＩと互換性のある光動力及びポリマーベースの超音波エミッターであり、初めての非侵襲性光音響インビボ脳変調である。さらに、ＳＯＡＰ４１００は、従来の光音響エミッタ（約数十ＭＨｚ）とは異なる低周波超音波の生成を可能にする。ＳＯＡＰ４１００は、調整可能な水量と成形により、それぞれ集束超音波発生における調整可能な機能と適用性を備えている。このようにして、ＳＯＡＰ４１００は、ＭＲＩ互換の集束超音波を使用して、リアルタイムのＭＲＩガイドによるＢＢＢ開口を可能にする。さらに、ＳＯＡＰ４１００は柔軟で、空気圧ポンプなどのアクチュエータを使用して音響焦点を調整するように設計できる。
［０１０７］
本開示の別の態様によれば、神経回路を解読し、神経疾患を治療するための強力なツールとしての神経調節の使用がさらに詳細に説明される。経頭蓋集束超音波（Ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ ｆｏｃｕｓｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ、ｔＦＵＳ）は、サブＭＨｚの周波数によりミリメートルスケールの空間分解能を提供する。ただし、小動物の脳のサブ領域をターゲットにする場合は、ミリメートル未満の精度が必要である。本開示は、ろうそくのすすナノ粒子をポリジメチルシロキサン球面に埋め込むことによって製造された軟質光音響パッド（ＳＯＡＰ）によって生成される光学駆動集束超音波（ＯＦＵＳ）を含む。ＳＯＡＰは１５ＭＨｚで横方向分解能６６μｍの超音波焦点を生成できるが、これはｔＦＵＳよりも２桁小さい。本開示は、ＯＦＵＳが、マイクロ秒未満の単一サイクル及び０．０６Ｊ／ｃｍ２で、神経刺激に首尾よく使用されたｔＦＵＳと比較して２桁少ない超音波エネルギーでインビトロで神経刺激を達成することを実証する。さらに、本開示は、インビボでのマウス運動皮質におけるミリメートル未満の経頭蓋刺激を実証する。ＯＦＵＳは、ミリメートル未満の精度を非侵襲的に提供することで、インビボでミリメートル未満の精度で非侵襲的な神経調節を行う光学駆動集束超音波を利用して、神経科学の研究と神経疾患の治療に新しい道を開く。
［０１０８］
本明細書の例示的な実施形態によれば、脳機能がどのように行動を制御し、その機能不全が疾患を引き起こすかを理解するには、神経活動を高精度で調節するモダリティが必要である。小動物では、ミリメートル未満の精度の神経調節ツールを使用して、少数のニューロン集団を調節することによって脳のサブ領域をマッピングできる。電気刺激や光遺伝学などの侵襲的方法は、ミリメートル未満のスケールで空間分解能を提供できる。電気刺激ツールは、すでに神経調節研究と疾患治療におけるゴールドスタンダードとなっている。例えば、脳深部刺激は、埋め込まれた電極によっていくつかの病気の効果的な治療を実現する。パーキンソン病、うつ病、てんかんの臨床治療用として承認されている。しかし、現在の広がりにより、ターゲティングの正確な制御が制限されている。光遺伝学は、光を使用してトランスフェクトされたニューロンをトリガーすることにより、標的細胞タイプに比類のない細胞内空間分解能と特異性を提供し、神経科学の研究を進歩させた。マウスの経頭蓋光遺伝学はさらに手術を回避し、５～６ｍｍの貫通深さで横方向に約０．８から１ｍｍの脳領域を刺激することに成功する。ただし、経頭蓋光遺伝学の光透過率は７ｍｍで約０．０２％である。従来の光遺伝学と経頭蓋光遺伝学はどちらも、ヒトの脳での使用がまだ承認されていないウイルスのトランスフェクションに依存している。非侵襲的な方法は、手術のリスクを回避しながら効果的な神経調節を提供する。経頭蓋直流刺激（ｔＤＣＳ）と経頭蓋磁気刺激（ＴＭＳ）は非侵襲的であるが、使用される電磁波の波長が長いため、得られる空間分解能はセンチメートルレベルである。新しい経頭蓋集束超音波（ｔＦＵＳ）は、マウス、ラット、ウサギ、サル、さらにはヒトなどのさまざまなモデルで高精度の非侵襲的神経調節法として実証されている。パルス超音波処理と連続超音波処理の両方が採用されているが、パルス超音波処理の方が神経反応を引き出すための刺激閾値が低いため、より一般的である。組織損傷の可能性を最小限に抑えるために、１００Ｗ／ｃｍ２以内の低強度が使用されている。高い経頭蓋効率を達成するために、空間分解能が数ミリメートルに制限される約１ＭＨｚ以下の低い超音波周波数のｔＦＵＳが推奨される。ヒトの場合、この空間分解能により、視床の個々の核に対応する刺激量を達成できる。小動物の脳のサブ領域を数百μｍのスケールでターゲットにするには、ミリメートル未満の精度を備えた非侵襲性の神経調節ツールが必要である。
［０１０９］
光音響効果は、超音波を生成する別の方法であることに留意されたい。光音響材料は短い光パルスを吸収し、それを一時的な温度上昇と熱膨張に変換し、その結果、超音波パルスが生成される。最近の研究は、高空間分解能の神経刺激のためのファイバーベースの光音響エミッター（ＦＯＥ）を使用してこれを実証した。これらのファイバーベースの光音響エミッターでは、ＴＦＯＥ１００によって前述したように、光音響材料を光ファイバーの先端にコーティングすることができ、コーティングされたファイバーは高度に局所的な超音波の点源として機能し、サブミリメートルから数十μｍまでの解像度を提供し、細胞内構造を選択的に活性化することができる。ただし、局所的な神経調節に近接場超音波を利用するため、ファイバーベースの光音響エミッターは神経組織に外科的に埋め込む必要があり、経頭蓋的に適用することはできない。
［０１１０］
本開示の例示的な実施形態によれば、ミリメートル未満の精度で非侵襲的な神経調節のための光学駆動集束超音波（ＯＦＵＳ）５４００が提示される。以前に提示されたＳＯＡＰ４１００に加えて、フィルムは、非侵襲的な変調のための集束超音波を生成するように湾曲することができる。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）とカーボンベースの吸収体をベースにした湾曲したＳＯＡＰ５４１０を製造することができ、より厳密な空間集束と焦点圧力の最大化が可能になる。したがって、曲率の直径は、理論上の限界（ＮＡ＝１）に近い開口数（ＮＡ＝０．９５）に達するように調整できる。光音響効果によって光子を音響波に効率的に変換するために、ＳＯＡＰ５４００には、熱収縮膜（ＨＳＭ）、ポリジメチルシロキサン混合カーボンナノチューブ（ＣＮＴ－ＰＤＭＳ）、ＰＤＭＳ混合カーボンナノ粒子（ＣＮＰ－ＰＤＭＳ）、ＰＤＭＳ積層ろうそくのすす（ＣＳ－ＰＤＭＳ）など、４つの異なる光音響材料に基づいて設計された曲率を含めることができ、製作してテストすることも可能である。したがって、それらの光音響変換効率は、製造されたこれらのＯＦＵＳの焦点の圧力を測定することによって比較することができる。ＣＳ－ＰＤＭＳ ＯＦＵＳ５４００を使用すると、本開示は、０．６２ｍＪ／ｃｍ２のレーザー入力で超音波焦点で約４８ＭＰａをもたらす。さらに、経頭蓋能力を備えた約６６μｍの空間分解能を持つＣＳ－ＰＤＭＳ ＯＦＵＳがさらに実証され、ｔＦＵＳによって提供される数ミリメートルの分解能から２桁の向上を達成する。カルシウムイメージングにより、本開示は、インビトロでの培養ニューロンにおいて、ＳＯＡＰ５４１０による直接的かつ経頭蓋単一パルス刺激を確実かつ安全に達成する。ＳＯＡＰ５４１０の総超音波エネルギー入力は、同様のレベルのニューロン応答を引き起こす従来の超音波トランスデューサーでデリバリーされるエネルギーよりも２桁少ない。免疫蛍光イメージングを使用して、本開示は、マウスの脳におけるサブミリメートルの刺激量を視覚化することを含む。さらに、本開示は、電気生理学的記録を使用して、インビボでＳＯＡＰ５４１０を用いてマウスの運動皮質を非侵襲的に刺激することによって機能的結果を検証することを含む。
［０１１１］
本開示は、ＳＯＡＰ５４１０の製造及び光音響効率の最適化をさらに詳細に表わす。ミリメートル以下の精度で集束超音波場を生成するために、生成される音場を予測し、ＳＯＡＰ５４１０の幾何学的設計を最適化するための数値シミュレーションが示されている。図５４Ａは、ＳＯＡＰ５４１０の概略図を示す。ナノ秒レーザー５４１２が、ＳＯＡＰ５４１０の底部から送出される。光音響効果は、湾曲したＳＯＡＰ５４１０の表面で超音波５４１４を生成し、湾曲上の異なる角度から放射された波５４１４は、同位相でその幾何学的中心５４１６に到達する。幾何学的中心５４１６は、ろうそくのすす５４１８を含み、ＰＤＭＳ層５４１９上に配置される。焦点距離２ｍｍは、超音波が頭蓋骨を貫通し、マウスの脳の皮質層に到達して刺激できるように設計されている。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）のｋ－ｗａｖｅツールボックスを使用して数値シミュレーションを実行して、生成される音場を計算できる。ＳＯＡＰ５４１０で生成されたＯＦＵＳ５４００は、適用シナリオを模倣するために、エアバッキングで水中に伝播する。したがって、炭素ベースの吸収体の報告されたデータに従って、中心周波数１５ＭＨｚと帯域幅２００％を設定できる。これにより、焦点距離と調整された半径と曲率直径が固定され、ミリメートル以下の精度が得られる。したがって、曲率直径と半径の比は、開口数（ＮＡ）に比例する。横方向の解像度は、横方向プロファイルの半値全幅として定義される。横方向解像度とＮＡの関係を図５４Ｂにプロットする。ＮＡが高いほど、横方向の解像度はより正確になる。図５４Ｂにおいて、オレンジ色の領域５４２０は、従来の超音波トランスデューサーにおけるＮＡの範囲を表わす。従来の単素子集束超音波トランスデューサーの製造プロセスでは、単結晶圧電材料に亀裂が生じるため、高いＮＡを達成することが困難であった。しかし、光音響材料では、同じ超音波周波数で従来のトランスデューサーが提供できる最良の横方向分解能の半分を提供するため、理論的限界に近い高いＮＡが実現可能である。
［０１１２］
１５ＭＨｚで横方向の分解能を限界まで高めるには、理論上の限界に近い０．９５のＳＯＡＰの高いＮＡを選択できる。これにより、ＳＯＡＰ５４１０の半径は６．３５ｍｍに最適化され、曲率の直径は１２．２ｍｍに設定される。この幾何学的形状は、図５４Ｃ（これは、設計されたジオメトリを持つｋ波シミュレーションでＳＯＡＰ５４１０によって生成された音場の画像５４３０である）に詳述されているように、予想通り、曲率の中心にＯＦＵＳ５４００をもたらす。挿入図は音響焦点で拡大したもので、スケールバーは２００μｍである。生成されたＯＦＵＳは、－６ｄＢで７８μｍの横方向分解能、２０９μｍの軸方向分解能を備えている。この空間分解能は、小動物のサブミリメートル精度の神経刺激には十分である。
［０１１３］
例示的な実施形態を続けると、本開示は、そのような高いＮＡがＯＦＵＳ５４００に高い横方向解像度を提供するだけでなく、焦点における高い焦点ゲインも提供することを表わす。横分解能の概念を音響分解能の光音響顕微鏡に適用することにより、ＯＦＵＳ５４００の横分解能は次の式で計算できる。
［数４］
ここで、νは周囲音速、ｆは中心周波数である。この式により、ＯＦＵＳの理論的な横方向分解能Ｒ＿Ｌ＝７５μｍとなり、これはシミュレーション結果と一致する。さらに、高ＮＡ球面により、低いＦ値と高い焦点ゲインＧが得られる。これは、次の式に従って、焦点の圧力と球面上の圧力の比によって定義される。
［数５］
この式において、ｆ，ｃ0，ｒ，及びｆNは、音響周波数、媒質内の音速、曲率半径、及びＦナンバー（ＳＯＡＰ５４１０の直径に対する曲率半径の比）を表す。水の減衰係数２．２×１０-3ｄＢ／（ｃｍ×ＭＨｚ2）を考えると、ＳＯＡＰ５４１０の有効焦点ゲインＧeff≒２８０を推定できる。この焦点ゲインは、ｆN＝１～４［１、３７～４１］の従来の超音波トランスデューサーの焦点ゲインと比較して５～９２倍高くなる。ＮＡを限界まで高めることにより、横方向分解能の精度を１５ＭＨｚで最大化することができ、従来の集束超音波トランスデューサーと比較して焦点の圧力を桁違いに改善することができる。
［０１１４］
本明細書の例示的な実施形態によれば、光音響変換効率を最適化するために、ＨＳＭ５４４２、ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４、ＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４４６、及びＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を含む、記載された幾何学的設計に従ってＳＯＡＰを製造するための４つの材料の調製は、詳細は図５４Ｄに示されている。左から右、上から下に、熱収縮膜５４４２、カーボンナノチューブ－ＰＤＭＳ５４４４、カーボンナノ粒子－ＰＤＭＳ５４４６、及びろうそくのすす－ＰＤＭＳ５４４８を示す。スケールバー：５ｍｍ。ＨＳＭ５４４２の場合、弾性黒色ポリオレフィン自体が光吸収材と膨張材として同時に機能する。残りの３つの設計であるＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４、ＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４４６、及びＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８では、炭素ベースの材料が光吸収材料としてＰＤＭＳに埋め込まれており、拡張材料として機能する。これらは曲率面で混合物を形成し、光音響変換を最大化する。ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を製造する方法も本開示によって提供される。簡単に説明すると、金属球をろうそくのすすで１０～１５秒間コーティングし、ＰＤＭＳに浸す。次に、ＰＤＭＳを１１０℃で１５分間硬化することにより、このろうそくのすすの層をＰＤＭＳに転写する。金属ボールを除去すると、ＳＯＡＰのＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８が得られる。他のすべてのＳＯＡＰの作成方法については、後で説明する。
［０１１５］
転写プロセスでＣＳとＰＤＭＳがよく混合されたマトリックスが生成されるかどうかを調査するには、ＳＯＡＰのＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を厚さ約２００μｍの薄層にスライスし、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して形態を検査する。厚さ２．７μｍのＣＳとＰＤＭＳからなる均一に混合された層が観察され、図５４Ｅの純粋なＰＤＭＳ層５４５２から分離されており、赤い破線がＣＳとＰＤＭＳの混合領域と純粋なＰＤＭＳ領域を分けている。スケールバー：１μｍ。この厚さは、ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８の最適な光音響変換のための理論上の厚さ２．１５μｍに非常に近い。ＳＥＭ画像から、ＣＳナノ粒子の直径は約５５ｎｍであることがわかる。さらに、ＣＳ層５４５２の堆積速度は約２００μｍ／ｓであり、これも文書化された速度と一致している。形態に加えて、ＣＳ－ＰＤＭＳ複合材料の構造の化学組成は、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）や光熱イメージングを使用してさらに研究できる。ＰＤＭＳにおけるＣ－Ｈ結合のフェムト秒ＳＲＳは、２つのビームが時間的に重なったとき（ｔ～０秒）、特定の位相（ここではＸチャネルとして割り当て）でのみ発生し、一方、ろうそくのすすのポンププローブ信号（Ｙチャネル）は、ほぼすべてのフェーズで発生し、減衰が非常に長くなる。したがって、１つの純粋なＣＳ５４５４サンプルとＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８サンプルを準備し、２つの材料の空間分布を化学的に区別することができる。結合画像５４５０は、ＣＳ及びＰＤＭＳの均一マトリクスが図５４Ｆによって作成されたことを示しており、赤：ＰＤＭＳ、シアン：ＣＳ、スケールバー：２μｍである。このような均一な混合物により、熱光吸収性ＣＳのＰＤＭＳへの迅速な移動が可能になり、これが効率的な光音響変換の基礎となる。
［０１１６］
本明細書の例示的な実施形態によれば、４つの製造されたＳＯＡＰの光音響効率を特徴付けるために、８ｎｓパルス幅を有する１０６４ｎｍパルスレーザーを各設計に供給してＯＦＵＳ信号を生成することができる。図５４Ｇに詳述するように、０．６２ｍＪ／ｃｍ２のレーザー入力を用いて各ＯＦＵＳから生成された光音響信号の波形及び圧力を針ハイドロフォンによって記録した。ＨＳＭグラフ線５４６２は最小の振幅を提供し、ＣＮＴ－ＰＤＭＳグラフ線５４６４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳグラフ線５４６６と比較して５倍小さい。ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４６４とＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４６６からの信号は同じレベルであったが、ＣＳ－ＰＤＭＳグラフ線５４６８はそれらより６倍大きい約４８ＭＰａを生成した。これは以前の取り組みと一致している。ＦＦＴ変換によって波形を分析した後、ＯＦＵＳ信号の周波数スペクトルが得られ、図５４Ｈに詳細が示されている。ＨＳＭグラフ線５４７２の中心周波数は約３ＭＨｚ、ＣＮＴ－ＰＤＭＳグラフ線５４７４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳグラフ線５４７６の中心周波数は約５ＭＨｚであり、一方、ＣＳ－ＰＤＭＳグラフの線５４７８は、最高の中心周波数約１５ＭＨｚと、５ＭＨｚ及び３５ＭＨｚで定義された－６ｄＢ幅を持っている。これらの特徴に基づいて、いくつかの実施形態では、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰはさらなる実験の対象となるのに理想的である可能性がある。これは、他のＳＯＡＰと比較して光音響変換効率が最も高いためだけでなく、最も広い帯域幅により、最も厳密な焦点と最短のサイクル期間が提供され、時空間制御が向上するためでもある。このようにして、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰは、実証可能な高ＮＡ、高焦点ゲイン、及び神経刺激用の焦点におけるボード帯域幅を備えて製造できる。
［０１１７］
本開示の別の態様によれば、ＯＦＵＳは、高い空間分解能及び経頭蓋効率を実証する。ＯＦＵＳが非侵襲的用途で頭蓋骨を貫通した後も高解像度を維持できることを実証するために、マウスの頭蓋骨の一部を貫通する前後でＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰの空間解像度を特徴付けることができる。図５５Ａは、針ハイドロフォンを備えたＳＯＡＰによって生成される超音波を特徴付けるための実験設定の概略図である。図５５Ａでは、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５５１２は、レーザーパルス５５１６で照射された水槽５５１４内に配置される。針ハイドロフォン５５１８は、ＳＯＡＰ５５１２の上部から超音波５５２０の振幅及びプロファイルを取得するために使用される。経頭蓋能力テストでは、マウスの頭蓋骨をＯＦＵＳのサイズ（厚さ～０．１５ｍｍ）に注意深くトリミングし、ハイドロフォン５５１８とＯＦＵＳの間に置く。図５５Ｂは、マウスの頭蓋骨を使用しない場合と使用する場合のＳＯＡＰ５５１２によって生成された正規化された音響波形のグラフである。ＯＦＵＳの経頭蓋効率は、図５５Ｂに示すように、経頭蓋超音波信号の振幅を元の信号の振幅と比較することによって計算することができる。これにより、経頭蓋信号が元の信号に正規化され、鮮明な表示が得られる。グラフ線５５２４におけるマウス頭蓋上のＯＦＵＳの経頭蓋効率は６９％であり、これは５ＭＨｚの従来の超音波トランスデューサーのグラフ線５５２６における３８％と比較して著しく高い。これは、ＯＦＵＳの帯域幅が広いためである。高周波成分は吸収及び反射されるが、低周波成分は依然として頭蓋骨を貫通する可能性がある。マウスの頭蓋骨の有無にかかわらず焦点サイズを特徴付けるために、図５５Ｃ及び５５Ｄで詳述するように、焦点を掃引して横方向及び軸方向のプロファイルを取得することができる。図５５Ｃは、それぞれグラフ線５５３６及び５５３４におけるマウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの横方向解像度のグラフである。図５５Ｄは、それぞれグラフ線５５４６及び５５４４におけるマウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの軸方向分解能のグラフである。ハイドロフォン５５１８はＸＹＺ移動ステージに取り付けられ、１２．７μｍのステップで移動してプロファイルを取得する。すべてのプロファイルは、比較のために元のプロファイルに正規化された。したがって、図５５Ｃ及び５５Ｄのデータは、マウス頭蓋骨の貫通後のプロファイルに明らかな変化を示していない。横方向及び軸方向の解像度は、それぞれの方向の半値全幅（ＦＷＨＭ）に従って定義される。ＯＦＵＳの横方向と軸方向の解像度は、それぞれ６６μｍと２８４μｍから８３μｍと２８７μｍに変化した。ＯＦＵＳの元の解像度はシミュレーションデータに近い。これらの分解能は、超音波神経変調で通常使用される低周波超音波の分解能（０．５ＭＨｚトランスデューサーの場合それぞれ約５ｍｍと約４０ｍｍ）と比較して２桁正確であることに留意されたい。
［０１１８］
例示的な例を続けると、ＯＦＵＳの焦点領域の位置を調べるために、超音波焦点の伝播を光音響断層撮影システムによって視覚化することができる。レーザーパルスはＳＯＡＰ５５１２の底部から送出される。ＳＯＡＰ５５１２、マウスの頭蓋骨５５５０の位置、及び光音響信号は、１２８素子の超音波トランスデューサーアレイによって上部から記録され得る。合成された画像からは、焦点の位置に大きな変化は観察されなかった。図５５Ｅ～５５Ｆは、頭蓋骨５５５０がない場合（５５Ｅ）及び頭蓋骨５５５０がある場合（５５Ｆ）の、ＳＯＡＰ５５１２により生成された超音波伝播の画像である。白い破線はＳＯＡＰ５５１２を示す。赤い破線はマウスの頭蓋骨を示し、スケールバーは２ｍｍである。図５５Ｅ～５５Ｆでは、超音波トランスデューサーアレイの遅延を調整することによって、ＯＦＵＳの伝播プロセスを表面から焦点領域まで再構成することができる。比較のために、画像を元の伝播信号に合わせて拡大縮小した。これらの伝播結果は、緊密な焦点を生成する光音響信号の干渉プロセスを示すだけでなく、このプロセスがマウスの頭蓋骨の存在によって大きく影響されず、緊密な経頭蓋焦点を維持することも示している。
［０１１９］
本開示の別の態様によれば、ＳＯＡＰは、一次皮質ニューロンの直接的かつ経頭蓋刺激を可能にする。ＳＯＡＰの高い光音響効率と緊密な経頭蓋焦点の実証により、ＳＯＡＰが培養ニューロンの反応を誘発できるかどうかも評価できる。例示的な例として、ＧＣａＭＰ６ｆを発現するラットからの初代皮質ニューロンをインビトロ研究に使用することができる。図５６Ａは、直接インビトロ刺激実験デバイスの概略図である。カルシウム信号は、図５６Ａに示すように、倒立広視野顕微鏡及びＣＭＯＳカメラ５６１８からなる蛍光画像化システム５６１０によって記録することができる。実験の前に、入力レーザー５６１４の光路をイメージングシステム５６１０と位置合わせする必要がある。次に、ＳＯＡＰ５６１２は、カスタマイズされたホルダーによってＸＹＺ移動ステージに取り付けられ、入力レーザー５６１４の光路と位置が合うように慎重に調整される。ＳＯＡＰは、培養ニューロン５６１６の約２ｍｍ上に配置できる。ＸＹ方向の焦点を見つけるために、９．９μｍの蛍光ビーズをインジケーターとして使用できる。レーザー５６１４がオンの場合、音響放射力によるビーズの動きによって超音波焦点の位置を視覚化できる。ビーズの動きに基づいて、直径の焦点は約１００μｍにあることが特定され、これはテストされた横方向の解像度と一致している。神経刺激の場合、パルス幅８ｎｓの１０６４ｎｍの単一パルスを送信でき、これにより光音響信号の単一サイクルが生成される。これに続いて、３７個のニューロンからのカルシウムのトレースが記録され、分析された（Ｎ＝７皿）。図５６Ｂは、５６２２及び５６２４でそれぞれ刺激の前後で３．５ｍＪ／ｃｍ２の入力レーザーエネルギーで観察されたカルシウム過渡状態の代表的な画像を示す。一番右のパネルは、５６２６での最大ΔＦ／Ｆを示している。ニューロンの活性化は視野の中心でのみ観察され、残りの部分は反応を示さなかった。これは、サブミリメートルの空間分解能を有するＳＯＡＰの局所刺激能力を実証した。３７個のニューロンの中には、一過性反応と長期反応という２種類の反応が観察される。図５６Ｃは、過渡的な動態の平均化されたカルシウムトレースのグラフである。図５６Ｃでは、これらの２つの応答は５秒の減衰時定数で分離されている。過渡応答は、τ＝４．２秒の減衰時定数を示す。反応は、レーザー開始直後の焦点でグラフ線５６３０によって観察され、最大ΔＦ／Ｆは３１％±８％（３つの培養からＮ＝６、データは平均±ＳＤ）であり、単一サイクル刺激が成功したことを示している。この１サイクルは０．２６μｓ続く。シングルサイクル刺激のデューティサイクルは、１秒間のサイクル期間として定義される。ＯＦＵＳは２．６×１０＾（－４）％という超低デューティサイクルを実現する。延長された応答の時定数はτ＝７．８秒である。これらのニューロンについては、図５６Ｄにおいてレーザー開始直後に６２％±１２％の最大ΔＦ／Ｆが観察される（４つの培養からのＮ＝３１）。図５６Ｄは、ＯＦＵＳ刺激の長期にわたる動態の平均化されたカルシウムトレースのグラフである。ここで、黄色の縦線はＯＦＵＳ刺激を示し、平均トレースは実線で、平均の標準誤差はグラフ線５６４０の影付きで示されている。これらの活性化は焦点で観察されるだけでなく、ネットワークを通じて伝播される。さまざまなダイナミクスの現象を理解するために、各応答の閾値を調べることができる。入力レーザーエネルギーは低く開始され、ニューロンの応答が記録されるまで増加する。図５６Ｅは、一時的刺激及び長期的刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。したがって、図５６Ｅは、５６５０における一時的及び長期の活性化を引き起こす平均化された閾値を示す。過渡応答の閾値は３．８±０．５ｍＪ／ｃｍ２であり、長時間応答（５．７±１．８ｍＪ／ｃｍ２）の閾値よりも大幅に低くなる（２サンプルｔ検定、７つの培養からのＮ＝３７、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ニューロンのこのような能力は機械的刺激の大きさを区別し、より長い時定数を伴うより高い振幅の刺激に対する応答はいくつかの報告とよく一致する。
［０１２０］
例示的な例を続けると、ＳＯＡＰによる神経刺激の安全性を実証するために、ニューロンを繰り返し刺激できるかどうかも示される。このようにして、単一サイクル刺激を２分間隔で３回、同じグループのニューロンに与えることができる。レーザーエネルギーは３．５ｍＪ／ｃｍ2であった。図５６Ｆは、５０μｍのスケールバーでの各刺激の最大ΔＦ／Ｆの画像を示しており、それぞれ画像５６６２、５６６４、又は５６６６で観察される形態の目に見える変形又は損傷はない。図５６Ｇは、対応するカルシウムトレースを示すグラフである。同様の振幅の最大ΔＦ／Ｆを伴うトレースがグラフ線５６７０で記録され、繰り返しの刺激後にニューロンの機能的損傷が観察されないことが実証された。ニューロンの生存能力は、６．５ｍＪ／ｃｍ2及び８．４ｍＪ／ｃｍ2で繰り返し刺激した後にさらに実証された。これら２つのエネルギーレベルは、安全性実証のための余分なマージンを残すために、閾値より７０％高く選択された。したがって、ニューロンの５つのグループが各エネルギーレベルで研究された。各グループについて、５秒の間隔で１０個のパルスがデリバリーされた。各パルスには、１０Ｈｚの３サイクルが含まれていた。細胞生存率を計算するには、３０分間のインキュベーション後に焦点の２００×２００μｍ2の領域内の生細胞と死細胞をカウントする。対照として光のグループは実施しなかった。その結果、刺激群と対照群との間で細胞生存率に有意差は観察されなかった。これらのデータを総合すると、ＯＦＵＳがニューロンの形態や機能に損傷を与えることなく、繰り返しかつ確実にニューロンを刺激できることがわかる。
［０１２１］
注目すべき点は、ＳＯＡＰで同様の振幅の神経反応を引き起こすのに必要な総エネルギーが、従来の超音波と比較して数桁少ないことである。神経刺激は、インビトロでのＳＯＡＰ実験とまったく同じ実験設定で、０．５ＭＨｚの従来の集束超音波トランスデューサーを使用して実行される。このプロセスは、超音波強度を低くし、持続波（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｗａｖｅ、ＣＷ）の超音波を短時間照射することから始まった。次に、最大ΔＦ／Ｆ＞１０％の神経反応が記録されるまで、強度を持続時間とともに段階的に増加させることができる。例示的な例として、実験設定において、５００ｍｓの継続時間で３．０２×１０4Ｗ／ｃｍ2の超音波強度が最大１８％のカルシウム反応を引き起こすことが実証された。従来のトランスデューサーと比較して、ＳＯＡＰはまったく同じ状況で６桁少ないエネルギーで、同様のレベルのニューロン応答を引き起こす。図５７は、同様の振幅のニューロン応答を引き起こすための実験条件及び総エネルギーを含む表である。図５７の表５７００に示すように、約１５％のカルシウム応答を誘発する従来のトランスデューサーを用いた以前の研究と比較しても、ＳＯＡＰは２桁少ないエネルギーをデリバリーした。これは、光音響効果の恩恵を受ける独自のシングルサイクル刺激モードによるＳＯＡＰの高い刺激効率を示している。
［０１２２］
本開示の別の態様によれば、経頭蓋刺激能力を試験するために、マウスの頭蓋骨の一部を貫通することによって、ＯＦＵＳによる神経刺激をさらに研究することができる。図５８Ａは、経頭蓋インビトロ刺激実験デバイス５８１０の概略図である。例示的な例として、マウスの頭蓋骨の一部５８１２がＳＯＡＰ５８１４の曲率に埋め込まれた。ＳＯＡＰ５８１４はレーザーパルス５８１１によって上から照射され、ＧＣａＭＰ６ｆニューロン５８１６の蛍光イメージングはカメラ５８１８によって細胞培養皿の底から記録された。超音波焦点５８１３は、前述のように、移動ステージと蛍光ビーズによって位置合わせされた。したがって、図５８Ｂは、ＯＦＵＳによる経頭蓋刺激の前後のカルシウム信号の代表的な画像及びビデオ、及びそれぞれ５８２２及び５８２４における対応する最大ΔＦ／Ｆ画像を示す。一番右のパネルは、５８２６での最大ΔＦ／Ｆを示しており、全体で５０μｍのスケールバーが使用されている。視野の中央にあるニューロンのみが活性化され、高精度の刺激に対して経頭蓋焦点がまだしっかりと固定されていることが確認された。ＯＦＵＳによる単一サイクル刺激により、２７％±５％の最大ΔＦ／Ｆを有する成功した刺激が、図５８Ｃのグラフ線５８３０によって記録され（７培養からのＮ＝１８）、これは、経頭蓋ＯＦＵＳ刺激の平均カルシウム応答トレースのグラフである。ここで、黄色の縦線はＯＦＵＳ刺激を示し、平均トレースは実線で、平均値の標準誤差は影付きで示されている。直接刺激と経頭蓋刺激の閾値は図５８Ｄで比較され、これは単一パルスによる直接刺激と経頭蓋刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。直接刺激の平均閾値は５．４±１．５ｍＪ／ｃｍ２であったが、経頭蓋刺激の閾値は７．７±１．１ｍＪ／ｃｍ２であった（２サンプルｔ検定、１１培養からのＮ＝４６、＊＊＊ｐ＜０．００１）。マウス頭蓋骨の貫通の減衰によるこのレーザーエネルギーの増加は、ＯＦＵＳの経頭蓋効率の６９％という以前の結果と一致していた。まとめると、これらの結果は、ＯＦＵＳが皮質ニューロンを直接及び経頭蓋的に刺激する能力を示している。
［０１２３］
本開示の別の態様によれば、ＯＦＵＳはインビボで高精度の神経刺激を仲介する。培養ニューロンの直接的かつ経頭蓋的な刺激に成功したことにより、本開示は、ＯＦＵＳが生きている動物のニューロンを活性化できるかどうかも含む。例示的な例として、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをインビボでの刺激に使用し、刺激の効果を免疫蛍光法及び電気生理学記録によって評価した。マウスをイソフルランで深く麻酔し、毛を剃って頭皮を露出させた。図５９Ａは、インビボでのＯＦＵＳ刺激の実験設定の概略図である。ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５９１０は、カスタマイズされた３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられ、ＸＹＺ移動ステージに取り付けられた。入力レーザー５９１２は上部からデリバリーされ、生成された超音波の焦点は定位座標（内側－外側：１．５、前－後：０．５）に基づいて運動皮質と注意深く位置合わせされた。したがって、図５９Ｂは、刺激領域５９２２及び対照領域５９２４内のｃ－Ｆｏｓ及びＤＡＰＩ染色の画像のセットである。参考として、赤：ｃ－Ｆｏｓ、青：ＤＡＰＩ、オレンジ色の輪郭：ＯＦＵＳ刺激領域、緑の輪郭：対側領域の対照群。スケールバー：中央及び下のパネル、５０μｍ。まず、刺激を受けた神経細胞のｃ－Ｆｏｓタンパク質を標識することで刺激領域を可視化する。強力なｃ－ｆｏｓ発現を誘導するために、１０Ｈｚで２０パルスのパルス列に対して１．０ｍＪ／ｃｍ2（ピークツーピーク圧力３９ＭＰａに相当）のレーザーエネルギーでＯＦＵＳ刺激を適用した。これは、３３％のデューティサイクルで３０分間続いた。ｃ－Ｆｏｓの発現を最大化するためにマウスを１時間休ませた。次にマウスの脳を抽出し、１０％ホルマリンで２４時間固定した。厚さ１５０μｍの脳スライスをｃ－ＦｏｓとＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。ＯＦＵＳ刺激領域５９２２で観察されたｃ－Ｆｏｓ陽性細胞は、対側領域で対照群５９２４よりも多かった。次に、ＯＦＵＳ群５９２２及び対照群５９２４におけるｃ－Ｆｏｓ陽性細胞の割合を計算した。図５９Ｃは、ｃ－Ｆｏｓ陽性ニューロンのパーセンテージについての統計分析を伴うグラフ５９３０である。パーセンテージは、対照と比較して、ＯＦＵＳグループで有意に増加した（２サンプルｔ検定、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１）。重要なのは、ｃ－Ｆｏｓ信号が直径約２００μｍの領域に限定されており、従来の圧電トランスデューサーベースの経頭蓋超音波刺激（１～５ｍｍ）と比較して優れた空間分解能を示していることである。さらに、ｃ－Ｆｏｓの発現は標的部位に限定されていた。この領域の大きさはＯＦＵＳの焦点サイズに近かった。これは、ｃ－Ｆｏｓの発現がＯＦＵＳの焦点によって直接誘導されたことを示している。間接的な刺激による、標的領域の外側では有意なｃ－Ｆｏｓ発現は観察されなかった。これらの結果は、ＯＦＵＳが高い空間分解能で非侵襲的にニューロンの反応を直接誘発する能力を裏付けている。
［０１２４］
例示的な実施例を続けると、ＯＦＵＳ刺激による機能的結果のさらなる評価が、筋電図検査（ＥＭＧ）法を用いて行われた。ＳＯＡＰ５９１０の焦点はマウスの脳の一次運動野に合わせられ、筋肉のけいれんを引き起こした。筋肉活動を記録するために、図５９Ａに詳述するように、ＥＭＧ電極５９１４を大腿二頭筋と平行に後肢に挿入し、接地電極を尾に挿入した。その結果、１．０ｍＪ／ｃｍ2で２秒の持続時間のレーザーパルス列がＳＯＡＰ５９１０にデリバリーされ、同時に図５９Ｄに示されるように対側後肢から強いＥＭＧ応答（０．４５８±０．０３ｍＶ）が記録された。これは、２秒のＯＦＵＳ刺激５９４２及び光制御なしグループ５９４４の代表的なＥＭＧ記録である（オレンジ色のボックス：レーザーパルス列）。これらのＥＭＧ信号には、レーザーの開始とＥＭＧ応答の間に通常約６１±６ｍｓの遅延があることに留意されたい。バンドパスフィルターと全波整流器で処理した後、ＥＭＧ信号のエンベロープが図５９Ｅにプロットされた。これは、バンドパスフィルター、全波整流器、及びＯＦＵＳ刺激５９４２及び非光の対照群５９４４も測定したエンベロープ後の代表的なＥＭＧ信号である。超音波の聴覚効果によって引き起こされるＥＭＧ反応の可能性を排除するための対照として、定位座標に基づいて体性感覚皮質を刺激した。有意な反応は観察されなかった。この結果は、ＥＭＧ反応が超音波の聴覚効果ではなく、ＯＦＵＳ刺激によって直接誘発されることを示唆している。
［０１２５］
本開示の別の態様によれば、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によるＯＦＵＳ刺激の安全性を評価することができる。例示的な例として、ＥＭＧ記録後、マウスを屠殺し、脳を抽出して固定した。厚さ５μｍの脳スライスを１５０μｍごとに取得し、標準的なＨ＆Ｅ染色を実行した。次に、すべての脳スライスをスライススキャナーで検査し、標的領域と対側領域の対照群とを比較した。図５９Ｆは、ＯＦＵＳ群５９６２及び対照群５９６４の安全性評価のためのインビボ刺激後の組織学的結果を詳述する一組の画像である。そこでは、これらの群間で細胞の形態の有意な変化は観察されなかった。これは、ＯＦＵＳ刺激がマウスの脳に目に見える損傷を誘発しないことを示している。
［０１２６］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＳＯＡＰによって生成された超音波場は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標） Ｒ２０１９ｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、マサチューセッツ州）上のオープンソースのｋ－Ｗａｖｅツールボックスによって２Ｄでシミュレートされた。シミュレーションでは吸収は考慮されなかった。ＳＯＡＰは伝播媒体として水中に超音波を届けた。バッキング材料を空気と設定した。密度と音速はそれに応じて定義された。
［０１２７］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＨＳＭ－ＳＯＡＰ５４４２を製造して、曲率を形成するために、熱収縮チューブ（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ、６３６３Ｋ２１４）に直径１２．７ｍｍのスチールビーズ（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ、９５２９Ｋ２２）を充填し、ヒートガンで加熱して完全に収縮させた。その後、チューブをスチールビーズの大円から２ｍｍ離れたところで切断し、ＨＳＭ－ＳＯＡＰを取得した。
［０１２８］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５４４６を製造するには、５重量％多層カーボンナノチューブ（ＶＷＲ、ＭＦＣＤ０６２０２０２９）及びＣＮＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、６３３１００－２５Ｇ）は、ＰＤＭＳベース及び硬化剤マトリックス（重量比１０：１、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４）とそれぞれ混合した。この混合物を、直径１２．７ｍｍ、焦点距離２ｍｍで設計された３Ｄプリントされた型に注ぎ、真空中で３０分間脱気した。完全に硬化したＣＮＴ－ＰＤＭＳ及びＣＮＰ－ＰＤＭＳサンプルを得るために、混合物をオーブンで６０℃まで２．５時間加熱してから、型から取り出した。
［０１２９］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を製造するために、直径１２．７ｍｍのスチールビーズをパラフィンワックスのろうそくの炎の中心に１０～１５秒間置き、火炎合成されたろうそくのすすのナノ粒子で完全にコーティングした。次いで、コーティングされたビーズを、脱気したＰＤＭＳベース及び硬化剤マトリックス（重量比１０：１）に浸漬し、ＰＤＭＳマトリックスの表面がビーズの大円面よりも２ｍｍ低く残るように調整した。ヒートプレート上で１１０℃で１５分間加熱した後、硬化サンプルが得られた。
［０１３０］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、超音波の生成及び特性評価に、１０６４ｎｍで８ｎｓのパルスを有するＱスイッチＮｄ：ＹＡＧレーザー（Ｑｕａｎｔｅｌ Ｌａｓｅｒ、ＣＦＲ ＩＣＥ４５０）が含まれ、光音響信号を生成するためにＳＯＡＰにデリバリーされた。レーザーはファンクションジェネレーター（３３２２０Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ）によって繰り返し周波数１０Ｈｚで変調された。超音波圧力とプロファイルの測定には、４０μｍの針状ハイドロフォン（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｃｏｕｓｔｉｃ、ＭＨ００４０、５～４０ＭＨｚの範囲に最適化）、水中プリアンプ、及びＤＣカプラーで構成されるシステムが使用された。次に、信号を超音波パルサー受信機（Ｏｌｙｍｐｕｓ、モデル５０７３ＰＲ）で増幅し、４回平均した後デジタルオシロスコープ（Ｒｉｇｏｌ、ＤＳ４０２４）で収集した。針ハイドロフォンの先端は生成された焦点よりも小さいため、取得されたデータＰpeakは焦点内の圧力の一部のみを反映している。超音波焦点上の実際の圧力を推定するために、２５．４μｍステップを実行して、焦点領域のＦＷＨＭにわたる圧力をマッピングした。データを平均して空間平均圧力Ｐaveragedを取得し、係数Ｃを次の方程式Ｃ＝Ｐaveraged／Ｐpeakで取得した。圧力がハイドロフォンの動的上限に達した後、現在の圧力Ｐ0を記録し、信号の飽和とデバイスの損傷を避けるためにハイドロフォンの焦点を外した。記録された圧力はＰ0-outである。次に、レーザーエネルギーを増加させ、圧力Ｐx-outを記録した。現在のエネルギー入力によって生成される焦点Ｐxの圧力は、空間圧力分布が一定であるため、次の方程式Ｐx＝（Ｐ(x-out)／Ｐ(0-out)）×Ｐ0によって推定できる。最終的に推定される空間平均圧力は、Ｐxに係数Ｃを乗算することによって取得される。
［０１３１］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、ＳＥＭイメージング（Ｚｅｉｓｓ、Ｓｕｐｒａ５５ＶＰ）の前に、ＳＯＡＰの薄い断面スライスがＡｕ／Ｐｄで１０秒間スパッタリングされ、アルミニウムスタブ上に取り付けられた。ＳＯＡＰのＳＥＭ画像は、加速電圧として３ｋＶ、開口サイズ２０μｍで得られる。
［０１３２］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＳＲＳ及び光熱イメージングでは、８０ＭＨｚフェムト秒パルスレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐｈｙｓｉｃｓ、ＩｎＳｉｇｈｔＸ３）が使用され、マルチモーダルイメージングシステムに調整可能なビーム（６８０ｎｍ～１３００ｎｍ）と同期ビーム（１０４５ｎｍに固定）が提供される。ＰＤＭＳとろうそくのすすを画像化するために、固定波長ビームとともに調整可能なビームをポンプビームとして８０１ｎｍに設定した。Ｃ－Ｈ結合のフェムト秒誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡用のストークスと、ろうそくのすすのポンププローブ顕微鏡用のプローブビームを同時に使用するためである。ストークス／プローブビームが音響光学変調器（Ｉｓｏｍｅｔ社、１２０５ｃ）によって変調された後、２つのビームがダイクロイックミラーによって結合され、実験室で作成されたレーザー走査型顕微鏡に向けられた。２つのビーム間の時間的遅延は、電動遅延ステージによって制御された。６０倍の水対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＵＰｌａｎＡｐｏ６０ＸＷ、ＮＡ＝１．２）は、共線ビームをサンプル上に集束させた。サンプル上の各ビームのパワーは２ｍＷである。２つのビームはオイルコンデンサー（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ａｐｌａｎａｔ Ａｃｈｒｏｍａｔ１．４、ＮＡ＝１．４）によって前方向に集められ、次にショートパスフィルターによってフィルターされた。フィルタリング後、ポンプビームのみが実験室で製作された共振増幅器を備えたフォトダイオードによって検出された。位相感応型ロックイン増幅器（Ｚｕｒｉｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＭＦＬＩ）は、変調伝達に従って、誘導ラマン損失信号及びポンププローブ信号の検出されたポンプビームを復調した。したがって、ｘ－ｙ－ｔ画像で構図を測定することができる。
［０１３３］
本開示によって提供される例示的な例によれば、光音響トモグラフィーシステムは、カスタマイズされた１２８素子のトランスデューサーアレイ（Ｌ２２－１４ｖ、Ｖｅｒａｓｏｎｉｃｓ社、帯域幅５０％）、及び１２８チャンネルの超音波データ収集システム（Ｖａｎｔａｇｅ１２８、Ｖｅｒａｓｏｎｉｃｓ社）からなる。ＰＡＴシステムは、ファンクションジェネレーターと遅延ジェネレーター（ＤＧ５３５、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってＱｕａｎｔｅｌと同期される。ファンクションジェネレーターはＱｕａｎｔｅｌをトリガーし、遅延ジェネレーターは１０Ｈｚの繰り返しレートのパルスモードでトリガーした。遅延発生器は、光音響信号が生成された後、異なる時間遅延で超音波信号を受信するために、別の調整可能な遅延をＶａｎｔａｇｅ１２８に追加した。遅延を調整することで、光音響信号の伝播過程を可視化できる。
［０１３４］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、胚ニューロンの培養には、５０μｇ／ｍｌのポリ－Ｄ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングされた３５ｍｍガラス底の皿を、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター内で一晩培養し、ニューロンを播種する前に、滅菌水で３回洗浄した。一次皮質ニューロンは、性別を問わずＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（Ｅ１８）に由来し、パパインで消化された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、５％熱不活化ウマ血清（ＨＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、２ｍＭグルタミンダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む培地は、解離した細胞を洗浄及び粉砕するために使用された。細胞を細胞培養皿（直径１００ｍｍ）で湿潤インキュベーター内３７℃で３０分間培養し、線維芽細胞とグリア細胞を除去した。ニューロンを含む上清を収集し、１０％ＦＢＳ＋５％ＨＳ＋２ｍＭグルタミンＤＭＥＭ培地を含むポリ－Ｄ－リジンでコーティングした皿に播種した。１６時間後、培地を２％Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１％Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、及び２ｍＭグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に交換した。グリアの増殖を防ぎ、ＧＣａＭＰ６ｆを発現させるため、５μＭの５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び最終濃度１μｌ／ｍｌのＡＡＶ９．Ｓｙｎ．Ｆｌｅｘ．ＧＣａＭＰ６ｆ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０ウイルス（Ａｄｄｇｅｎｅ、マサチューセッツ州、米国）をそれぞれ、５日目に培地に添加した。培地の５０％を３～４日ごとに新しい培地と交換し、１０～１３日後にニューロンを刺激に使用した。
［０１３５］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、インビトロでのＯＦＵＳ刺激は、デバイスの位置を微調整するために、３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられたＳＯＡＰを移動ステージまで移動させることを必要とした。Ｑｕａｎｔｅｌレーザーは、光音響信号生成のために自由空間のＳＯＡＰにデリバリーされた。１０倍対物レンズ（Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ、０．３ＮＡ、１６ｍｍＷＤ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を備えた倒立顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｕ、Ｎｉｋｏｎ）が、４７０ｎｍＬＥＤ（Ｍ４７０Ｌ２、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）で照明され、緑色蛍光タンパク質用のフィルターセットで濾過され（ＭＤＦ－ＧＦＰ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）、ＣＭＯＳカメラ（Ｚｙｌａ５．５、Ａｎｄｏｒ）で撮影され、蛍光イメージングに使用された。刺激前に、超音波の焦点を９．９μｍ緑色蛍光ビーズ（Ｇ１０００、Ｄｕｋｅ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｒｐ）で視覚化し、視野の中心に調整した。次に、ニューロン培養皿のＸ方向とＹ方向の同じ位置、ニューロンのＺ方向２ｍｍ上にＳＯＡＰを浸した。カメラはレーザーと同期した。カメラが２０Ｈｚで２０秒間記録している間、５秒目にレーザーが照射された。実験後、イメージングシーケンスの蛍光強度をＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉ）で分析した。
［０１３６］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、細胞生存率の研究のために、各エネルギーレベルで各皿においてニューロンの５つのグループがランダムに選択された。一方、ニューロンの皿には、選択されたエネルギーレベルで合計３０パルスのＯＦＵＳがデリバリーされた。連続する３サイクルごとに、５秒間隔で１０Ｈｚでデリバリーされた。生細胞と死細胞は、焦点の２００×２００μｍ2の領域内で計算された。すべてのニューロンはＧＣａＭＰ６ｆで標識された。死細胞を１μＬ １００μｇ／Ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｐ１３０４ＭＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）溶液で１５分間染色した。細胞を３０分間インキュベートした後、分析のために蛍光顕微鏡で画像化した。
［０１３７］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、インビボでのＯＦＵＳ刺激には、最初に酸素中５％イソフルランで麻酔をかけた成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１４～１６週齢）が関与し、その後、１．５～２％イソフルランで標準定位フレームに固定された。麻酔の深さを決定するために尾部のピンチが使用された。体温を維持するために、加熱パッドをマウスの下に置いた。標的となった脳の毛が除去された。３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられたＳＯＡＰは、マウスの標的運動野に位置合わせされた。Ｑｕａｎｔｅｌレーザーは、１０Ｈｚの繰り返し率で自由空間のＳＯＡＰにデリバリーされた。ｃ－ｆｏｓ発現の場合、パルス列は３３％デューティサイクル（２秒レーザーオン、４秒レーザーオフ）で３０分間デリバリーされた。ＥＭＧ記録では、２秒のパルス列がデリバリーされた。
［０１３８］
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＥＭＧの記録及び処理には、ＳＯＡＰを一次運動野と位置合わせすることが含まれる。筋肉活動を記録するために、針電極を後肢大腿二頭筋の皮下に挿入し、接地電極をフットパッドに挿入した。対照群は、刺激部位と同側の体幹部で記録された。ＥＭＧ信号はＭｕｌｔｉ－Ｃｌａｍｐ７００Ｂアンプ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録し、１～５０００Ｈｚでフィルター処理し、Ａｘｏｎ ＤｉｇｉＤａｔａ１，５５０デジタイザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）でデジタル化し、ノイズエリミネーター（Ｄ－４００、Ｄｉｇｉｔｉｍｅｒ）でフィルター処理した。ＥＭＧ信号は０．５～５００Ｈｚのバンドパスフィルターと全波整流でフィルター処理された。次に、処理された信号のエンベロープがプロットされた。
［０１３９］
本開示によって提供される例示的な例によれば、刺激セッション後に免疫蛍光染色を行い、ｃ－ｆｏｓ発現を最大化するためにマウスを１時間休ませ、次に、これを屠殺し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１倍、ＰＨ７．４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）溶液及び１０％ホルマリンを経心的に灌流した。固定後、脳を摘出し、１０％ホルマリン溶液中で２４時間固定した。固定したマウスの脳を１倍ＰＢＳ溶液に浸漬した。脳を、振動組織スライサー（ＯＳＴ－４５００、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、厚さ１５０μｍの冠状切片にスライスした。脳スライスをブラシで１０％ホルマリン溶液に静かに移し、さらに２４時間固定し、その後５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）－ＰＢＳ溶液で室温で３０分間ブロックした。スライスを０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１６１０４０７、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）－ＰＢＳ溶液で１０分間透過処理し、濃度２μｇ／ｍＬの抗ｃ－ＦｏｓＲａｂｂｉｔ抗体（４３８４Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４℃で一晩インキュベートした。一次培養後、スライスを、濃度１μｇ／ｍＬの二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び濃度５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに暗所、室温で２時間インキュベートした。ステップ間で、スライスを０．２％Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０、東京化成工業）－ＰＢＳ溶液で５分間４回洗浄した。蛍光画像は、ＦＶ３０００共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて取得した。共焦点画像は、ＤＡＰＩの場合は４０５ｎｍ、ｃ－Ｆｏｓの場合は４８８ｎｍの励起波長で取得された。
［０１４０］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、刺激セッション後に組織学的染色が関与し、マウスは直ちに屠殺され、前述のように灌流され、固定された。脳をパラフィンに包埋し、１５０μｍステップで５μｍの厚さにスライスして冠状切片を得た。スライシングと標準的なＨ＆Ｅ染色は、Ｍａｓｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂｒｉｇｈａｍ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｅで実施された。組織像は、ＶＳ１２０自動スライドスキャナー（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で取得した。
［０１４１］
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、温度プロファイルを記録するために熱電対（ＤＩ－２４５、ＤａｔａＱ）が使用された。熱電対の先端は、それぞれＳＯＡＰの焦点、表面に配置された。記録中、エネルギー６．２ｍＪ／ｃｍ２のレーザーを１０Ｈｚで１０秒間オンにした。表面に光がないグループもベースラインとして記録された。
［０１４２］
本開示によって提供される例示的な例によれば、統計分析に関して、音響波形、カルシウムトレース、及び電気生理学的トレースが、Ｏｒｉｇｉｎ２０２０を使用してプロットされた。周波数スペクトルのＦＦＴ変換はＭＡＴＬＡＢ（登録商標） Ｒ２０１９ｂを使用して実行された。データは平均値±平均値の標準誤差で表示される。カルシウム画像はＩｍａｇｅＪで処理される。すべての比較データは２サンプルのｔ検定で分析される。ｐ値は次のように定義された：ｎ．ｓ．、有意ではない（ｐ＞０．０５）；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
［０１４３］
ＯＦＵＳの生物学的安全性は、神経調節を成功させるために非常に重要であることに留意されたい。これらの例示的な実施例では、生体安全性は、インビトロでの繰り返し刺激後の細胞生存率及び損傷が結論付けられなかったインビボの組織学的画像化によって評価された。さらに、キャビテーションと熱蓄積は、超音波曝露による潜在的な２つの主要な生体影響である。安全性を評価するために、機械的指標を計算し、ＯＦＵＳの温度上昇をテストした。インビボ実験のレーザー入力では、マウスの脳に伝達される推定ピークツーピーク圧力３９ＭＰａは、組織損傷が以前に報告されなかったレベルを下回っている。ＯＦＵＳのピーク負圧は１８ＭＰａと測定され、これは軟組織内に気泡雲が発生する閾値（２５～３０ＭＰａ）を下回っている。脳組織の音響減衰係数０．９１ｄＢ／（ｃｍ×ＭＨｚ）［５３］を使用してＭＩを推定し、ＯＦＵＳ刺激のＭＩ＝３．３と計算された。比較すると、ＭＩ＝３．９でパルス幅１．４μｓの短パルス超音波照射では、脳組織にまれにキャビテーション関連の損傷が生じることが報告されている。したがって、例示的な実施形態の０．２６μｓというより短いパルス持続時間及びより低いＭＩは、組織キャビテーションの損傷閾値を十分に下回るはずである。熱的安全性を確保するために、温度プロファイルは熱センサーで記録された。６．２ｍＪ／ｃｍ2のレーザーエネルギーが適用されたが、これは、本開示のこの態様に関する例示的な実施例に従って使用される最高エネルギー閾値と一致した。ＯＦＵＳは１０秒間デリバリーされ、ＯＦＵＳの焦点、ＳＯＡＰの表面、及びＳＯＡＰの表面に光が当たらない対照群でテストされた。１０秒の加熱後、表面で最大０．４Ｋの温度上昇が観察された。したがって、この研究では、最長持続時間が２秒の場合、ＯＦＵＳの焦点では０．１Ｋを超える顕著な温度上昇は引き起こされない。さらに、考えられる最高の温度上昇は、ニューロンの活動を調節するのに必要な閾値（ΔＴ≧５Ｋ）［５５］をはるかに下回っており、細胞に損傷を与えることはない。したがって、ＯＦＵＳは生物学的証拠と物理的証拠の両方によって組織に対して安全であることが証明されている。
［０１４４］
本開示のこの態様の例示的な実施例によれば、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰが開発され、ＯＦＵＳが生成され、空間分解能及び経頭蓋能力を特徴付け、インビトロ及びインビボでのミリメートル未満の経頭蓋神経刺激が検証された。光音響効果による大きなＮＡにより、ピエゾベースの低周波超音波の到達範囲を超える６６μｍでの厳密な焦点が可能になった。広帯域放射により、ＯＦＵＳの６９％の経頭蓋効率がマウスの頭蓋骨の一部に浸透することが可能になった。インビトロでのＧＣａＭＰ６ｆ標識ラット皮質ニューロンの直接刺激及び経頭蓋刺激を蛍光イメージングで記録した。神経反応を引き起こすためのＯＦＵＳの総超音波エネルギー入力は、従来の超音波よりも２～６桁低く、高い刺激効率を実現する。ＯＦＵＳによるインビボでの生きたマウスの運動皮質における非侵襲的刺激の成功は、免疫蛍光法とＥＭＧ記録によって実証された。ＯＦＵＳ刺激の安全性は、生物学的には細胞生存率と組織学によって、また物理的にはＭＩと温度上昇によってインビトロとインビボの両方で評価された。
［０１４５］
ＯＦＵＳ刺激に関する重要な観察は、刺激が聴覚交絡効果などの間接効果ではなく音響波の直接効果によって引き起こされたことであることに留意されたい。インビトロでの実験では、培養ニューロンは聴覚回路なしでＯＦＵＳ刺激に反応していた。インビボでの研究では、ｃ－Ｆｏｓ陽性ニューロンは、直接刺激に対応する刺激部位に位置していた。さらに、ＥＭＧ記録において体性感覚皮質を刺激された対照群では反応が記録されず、蝸牛への骨伝導がプロセスに関与していないことを示した。このような観察は、報告されている超音波による直接刺激と一致する。
［０１４６］
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰは、単一の固定超音波場を提供するデバイスである。複雑な脳機能は単一の部位によって制御されるわけではないが、複数の部位を刺激することで調節や治療の可能性が高まる。パターン化された神経調節を実現でき、例えば、治療のための運動制御の選択性をさらに高めることができる。製造プロセスの柔軟性の強さにより、ＯＦＵＳデバイスはマルチサイト神経調節のための大規模なアレイにスケールアップできる。従来のＰＺＴベースの超音波大規模アレイでは、電磁干渉を最小限に抑えるために各要素に接続された大規模なケーブルが銅で製造されており、これがウェアラブル臨床デバイスの適用をさらに妨げている。それに対して、軽量のＯＦＵＳデバイスは、長時間の治療における快適性を向上させる。金属部品を一切使用しないこのようなデバイスは、リアルタイム磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）ガイダンス及び機能的ＭＲＩモニタリングとの互換性をさらに向上させる。これらは、臨床応用におけるリアルタイムの複数部位刺激と治療評価の閉ループに役立つ。
［０１４７］
特に、ＯＦＵＳは入力光のエネルギーを向上させるだけで高い超音波強度を提供できる。これは、従来の高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）の代わりにＯＦＵＳを超音波治療に適用する機会を提供する。例えば、ヒストトリプシーは、キャビテーションベースの治療のために、低周波（＜３ＭＨｚ）、短パルス（＜１０サイクル）の高強度超音波（＞２０ＭＰａ）を組織にデリバリーする。しかし、ＨＩＦＵは特定の強度に達するために高電圧を必要とし、その一方で狭い帯域幅（＜３０％）、長いリングダウン時間（＞５サイクル）、及び絶縁破壊のリスクをもたらす［７０］。ＳＯＡＰによって生成されたＯＦＵＳは、高周波数、高強度、正確なシングルサイクル制御、及び２００％の広帯域幅で実証されている。このニッチは、時空間制御が改善され、周囲組織への損傷と熱蓄積が最小限に抑えられる、超音波手術におけるＯＦＵＳ応用の将来の方向性をハイライトしている。
［０１４８］
本開示の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰによって生成されたＯＦＵＳは、小動物及び脳サブ領域における神経学的研究に向けて非侵襲的にサブミリメートルの精度を利用する。製造における柔軟性、高い時空間分解能と強度、及び電磁適合性の向上により、超音波手術、薬物デリバリー、疼痛管理などの臨床応用がさらに可能になる。したがって、この研究は、ＯＦＵＳが神経科学研究及び臨床治療における貴重なプラットフォーム技術として利用される可能性が非常に高いことをハイライトしている。
［０１４９］
当業者であれば、上記の説明を読むと、本開示の多くの変更及び修正が自明あるが、例示として図示し説明した特定の実施形態は、決して限定的なものとみなされるものではないことを理解されたい。さらに、特定の実施形態を参照して主題を説明したが、当業者であれば、本開示の精神及び範囲内での変形を想到できる。前述の例は単に説明を目的として提供されたものであり、本開示を限定するものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。
［０１５０］
本発明の概念は、その例示的な実施形態を参照して特に図示及び説明されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変更を加えることができることが当業者には理解される。本発明の概念は、以下の特許請求の範囲によって定義される。
本出願は、２０２１年３月９日に提出された仮出願番号６３／１５８，５６６及び２０２１年４月２０日に出願された仮出願番号６３／１７７，０２９の利益を主張し、その出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約番号ＮＳ１０９７９４に基づく政府支援により行われた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
本開示は、光音響刺激に関し、特に、生物療法のための光音響刺激を操作及び投与するためのデバイス及び方法に関する。
集束超音波は、低侵襲治療及びメカニズムの研究において大きな注目を集めている。高効率の生体変調には１ＭＨｚ未満の周波数が適している。しかし、典型的なサブＭＨｚ超音波技術は、空間閉じ込めが数ミリメートルと不十分で、デバイス直径が約２５ｍｍと大きいため、回折限界が生じ、さらなる応用が著しく妨げられる。低周波フレックス張力共振器、トンピルツトランスデューサー、厚み型共振器など、小型の低周波トランスデューサーを製造する努力がなされてきた。
しかし、ミリメートルスケールの横方向寸法を持つこれらのトランスデューサーの製造は困難であり、高価であると考えられている。デバイスサイズが大きいことに加えて、トランスデューサーベースの集束超音波技術は、数百ｋＨｚの超音波に対してミリメートルスケールでの回折限界焦点体積が大きいという問題がある。
一態様によれば、テーパー状ファイバー光音響エミッターが提供される。エミッターには、レーザーパルスを放射するように構成されたナノ秒レーザーと光ファイバーが含まれる。光ファイバーには、光を超音波に変換するように構成されたコーティングが施された先端が含まれる。先端コーティングは、拡散層と熱膨張層、又は単一の熱膨張層を含むことができる。拡散層には、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子が含まれる。熱膨張層には、レーザーパルスを変換して超音波を発生するように構成されたグラファイトとポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、又はカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びＰＤＭＳが含まれる。超音波の周波数は、拡散層の厚さと膨張層のＣＮＴ濃度で調整される。
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成されている。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であってもよい。
別の態様によれば、テーパー状ファイバー光音響エミッタ（ＴＦＯＥ）を動作させる方法は、ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射するステップと、先端を有する光ファイバーでレーザーパルスをガイドするステップとを含む。先端は、エポキシと酸化亜鉛を含む拡散層と熱膨張層、又はカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）とポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む単一の熱膨張層でコーティングされる。この方法はさらに、拡散層を使用して、局所的な加熱を制限しながらレーザーパルスを拡散すること；熱膨張層を用いて拡散光を変換して超音波を生成すること；及び超音波の周波数を、拡散層の厚さと膨張層のＣＮＴ濃度で調整する。
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得る。
別の態様によれば、光音響材料を介して細胞を刺激する方法が提供される。この方法は、超音波を発生するように構成された光吸収体及び拡張マトリックスを有する光音響材料を提供すること；光音響材料をフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成すること、ここで、フィブロインヒドロゲルは、超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される；及びフィブロインが超音波に応答して神経成長を刺激するように、光音響フィルムにレーザーパルスを放射することによって超音波を発生させることを含む。
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
いくつかの例示的な実施形態では、方法は、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を変更することを含む、超音波の周波数を生成することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、フィブロインヒドロゲルはシルクを含み得る。
別の態様によれば、細胞を刺激するためにテーパー状ファイバー光音響エミッタ（ＴＦＯＥ）を動作させる方法が提供される。この方法は、ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射すること、及び先端を有する光ファイバーでレーザーパルスをガイドすることを含む。次に、この方法は、ＣＮＴをフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成するステップを含み、フィブロインヒドロゲルは超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される。
いくつかの例示的な実施形態では、超音波は、レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む。無指向性音響波は、先端から１００μｍ未満の距離内に局在する。無指向性音響波は単一のニューロンを活性化するように構成される。さらに、無指向性音響波により、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞反応の同時モニタリングが可能になる。
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を変更することを含む、拡散光を変換して超音波を発生することをさらに含む。超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数になるように調整される。さらに、コーティングは、ポリジメチルシロキサン中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、エポキシ及び酸化亜鉛を含む拡散層でコーティングされた先端をさらに備える。拡散層は、局所的な加熱を制限しながらレーザーパルスを拡散する。
いくつかの例示的な実施形態では、デバイスは、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む熱膨張層でコーティングされた先端をさらに含む。熱膨張層は拡散光を変換して超音波を発生し、フィブロインが超音波に応答して細胞内の神経成長を刺激する。いくつかの例示的な実施形態では、フィブロインヒドロゲルにはシルクが含まれる。
別の態様によれば、光音響効果を介した高精度細胞的変調のためのデバイスが提供される。いくつかの例示的な実施形態では、このデバイスは、テーパー状のファイバー光音響エミッターを含む。このデバイスには、レーザーパルスを放射するように構成できるナノ秒レーザーと、先端を備えた光ファイバーが含まれる。光ファイバーは、レーザーパルスをガイドするように構成でき、熱膨張層を含むコーティングを有することができる。熱膨張層は、レーザーパルスを変換して超音波を生成するように構成されたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含み得る。ＣＮＴをフィブロインヒドロゲルに埋め込むと、光音響フィルムを形成できる。フィブロインヒドロゲルはさらに、超音波に応答して神経成長を刺激するように構成することができる。超音波の周波数は、膨張層のＣＮＴ濃度の厚さに応じて調整できる。
いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスは、拡散層を含む先端部をさらに含む。拡散層は、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子を含むことができる。超音波の周波数は拡散層の厚さで調整できる。
いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスの光音響フィルムは平坦であり得る。いくつかの例示的な実施形態によれば、デバイスの光音響フィルムは湾曲していてもよい。いくつかの例示的な実施形態によれば、湾曲した光音響フィルムは、非侵襲的変調のための集束超音波を生成する。
本開示は、本開示の実施形態の非限定的な例として、言及された複数の図面を参照しながら、以下の詳細な説明でさらに説明される。いくつかの図面を通して、同様の参照番号は同様の部分を表す。
本開示のデバイス及び方法によれば、サブＭＨｚの周波数範囲を標的とする制御可能な周波数スペクトルを有する光音響エミッターが提供される。
新しい技術として、経頭蓋集束超音波は、マウス、ウサギの運動反応、及びヒトの感覚／運動反応をうまく誘発することが実証されている。しかし、超音波の空間分解能では高精度の刺激は可能ではない。本開示は、２０μｍという前例のない空間分解能を有するニューロンの光音響刺激のためのＴＦＯＥを提示し、単一ニューロン又は軸索及び樹状突起などの細胞内構造の選択的活性化を可能にする。３ナノ秒の単一レーザーパルスからＴＦＯＥによって変換された１マイクロ秒の単一音響パルスが、これまで成功したニューロン活性化のための最短の音響刺激として示されている。ＴＦＯＥによって生成される高度に局所的な超音波により、光音響刺激と単一ニューロンでの非常に安定したパッチクランプ記録を統合することが可能になった。従来の超音波刺激では困難であった、音響刺激に対する単一ニューロンの電気的応答の直接測定が初めて実証された。ＴＦＯＥをエクスビボ脳スライス電気生理学と組み合わせることで、本開示は、音響刺激に対する興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンの細胞型特異的応答を明らかにする。これらの結果は、ＴＦＯＥが非遺伝的単一細胞及び細胞内変調技術であることを示しており、神経刺激のメカニズムに新たな洞察をもたらす可能性がある。
高い空間分解能での神経調節は、少数の集団又は単一のニューロンの発動によって動物の行動や脳の状態が特異的に変化する可能性があるため、神経科学の分野における基礎知識を進歩させる上で非常に重要である。臨床的には、正確な神経刺激は、網膜刺激や選択的背側根茎切除術などの処置の基礎を築き、ここでは、小さな集団又は単一のニューロン及び軸索線維の選択的な活性化が望まれる。歴史的に、電気刺激は神経調節にとって最も重要な技術であった。脳深部刺激は、臨床的に最も処方されている神経調節法として、パーキンソン病、うつ病、てんかんなどの神経疾患及び精神疾患の治療に使用されている。ただし、電気刺激の空間分解能は電流の広がりによって制限され、電流は数ミリメートルにわたって標的領域の外側に分布する可能性がある。高い空間精度と細胞特異性を提供する光遺伝学は、げっ歯類の集団神経活動を調節する強力な方法であることが示されている。しかし、ウイルス感染が必要なため、ヒトに適用するのは困難である。非遺伝的刺激としては、水の光吸収に基づく光熱神経刺激が報告されており、基礎科学や並進用途の関心が高まっている。赤外光熱神経刺激（ＩＮＳ）では、波長１．５～２μｍの近赤外光がファイバーを通じて送られ、サブミリメートルの精度で水の温度上昇に変換される。この場合、関連する加熱により組織損傷の重大な懸念が生じる。急速に成長しているモダリティである集束超音波は、浸透深さが深く非侵襲性であるため、無数の脳神経調節用途に利用されている。しかし、超音波は音響波回折によって焦点が制限されるため、空間分解能が数ミリメートルレベルに限られており、特定の脳領域の研究が妨げられる。さらに、超音波場はギガオームシールを容易に破壊するため、超音波刺激を全細胞パッチクランプ電気生理学（神経膜とイオンチャネルの生物物理学的機構の高忠実度分析のゴールドスタンダード技術）と統合することは困難である。
本開示のファイバーベースの光音響コンバーターは、光音響効果を利用し、パルス光を吸収して超音波を生成し、ミリメートル未満の空間分解能でインビトロ及びインビボで神経刺激を達成する。小型化されたテーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）は、約２０μｍの空間閉じ込めで＞５７ｋＰａの圧力を生成することができ、超音波刺激に対して前例のない高い空間分解能を提供する。空間分解能と光音響変換効率の両方におけるＴＦＯＥの大幅な進歩は、以下の革新的な設計に基づいて達成される。第一に、以前の研究のように直径２００μｍの市販のマルチモードファイバを使用する代わりに、本開示は、開発された制御されたテーパリング対策を提供し、ファイバーを２０μｍ程度の小さい先端直径まで再現可能にテーパー付けする。第二に、２０μｍの小さなファイバー先端上に約１０μｍの均一で制御可能なコーティング厚さを実現する新しい蒸着方法が開発された。第三に、コンバーターとしてエポキシ中のグラファイト粉末を使用する代わりに、本開示の方法及びデバイスは、溶解度が改善されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マトリックスに埋め込まれたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を適用する。これにより、変換効率が１桁向上し、テーパー状のファイバー先端からの高効率な光音響信号の生成が可能になり、２０μｍの薄いコーティングからの光漏れが防止される。
本開示の実施形態によれば、ＴＦＯＥを使用することにより、ニューロン刺激の空間的及び時間的解像度が向上する。具体的には、単一細胞の刺激と、軸索及び樹状突起の細胞内刺激が実証されている。持続時間１マイクロ秒の単一音響パルスによりニューロン刺激が達成され、これは音響刺激の持続時間が最も短いことが判明した。重要なのは、ＴＦＯＥによって生成された近接場音響波により、従来の超音波の課題として報告されていた全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞反応を同時に監視しながら、光音響刺激が可能になったことである。本開示は、興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンに対する音響刺激に対する細胞型特異的応答を明らかにする。この開示は、神経系の非遺伝的高精度刺激のためのプラットフォーム技術として、また音響神経刺激のメカニズムの研究及びＭＲＩと互換性のある臨床応用のためのツールとしてのＴＦＯＥの刺激的な可能性を示している。
紹介したように、パルス励起光が対象物質に吸収され、一時的な加熱、物質の圧縮と膨張、その後の圧力変化を引き起こす光音響刺激は、超音波を発生させる新規な方法である。特に、光拡散層と熱膨張層という２つの異なる機能層でファイバー先端を設計及びコーティングすることにより、十分な超音波強度の供給と、セル変調に必要なピーク周波数と帯域幅の制御が可能になる。拡散層と吸収／熱膨張層の両方の周波数制御能力を統合することによって、本開示は、サブＭＨｚ範囲内の周波数及び１ＭＨｚを超える周波数の微調整を達成する。
このように、ＴＦＯＥは調整可能な周波数（例えば、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚ）でサブミリメートルの高さの特別な精度の超音波を送信し、ソノポレーション効果によって膜不透過性の小分子を生細胞にデリバリーする。１ＭＨｚを超える周波数と比較して、サブＭＨｚの周波数下で実行されるＳｙｔｏｘのより高いデリバリー効率により、本開示は、サブＭＨｚの周波数とサブミリメートルの精度との間でうまく妥協して、広範な生物医学用途（領域特異的な薬物デリバリー、遺伝子トランスフェクション、局所的なニューロン刺激など）を提供する。
図１Ａには、パルスレーザー１１０及び光音響信号１１２を含む光音響効果の概略図が示されている。ファイバー１１４、拡散層１１６、及び吸収／膨張層１１８を有するＦＯＥ１００ａ（２層コーティングを有するＦＯＥ）の設計及び構造も、この例示的な実施形態に示されている。参考として、図１Ｂは、ファイバーベースのエミッターと、レーザー伝送用の光ファイバー（２０Ｇ、ＩＤ０．６ｍｍ、ＯＤ０．９１ｍｍ）を使用する注射針（１３０）との間の寸法比較を提供する。ＦＯＥ１００ａ、１００ｂ、１００ｃなどは、図１Ａ、１Ｂ、１ＣなどのＦＯＥ１００を指すことに留意されたい。さらに、図１Ｃは、内側拡散層１１６及び外側吸収／膨張層１１８を視覚化するために画像の透明度が調整されたときの、製造されたＦＯＥ１００の側面図を示し、ファイバー遠位端の輪郭を描く白い破線が示されている。拡散層１１６は、層内の熱的に誘起される歪みの違いによる膨張層の局所的な加熱とその後の損傷を防ぐために導入された。図１Ｇは、パルスレーザー１１０による単一ニューロン刺激を可能にするＦＯＥ１００の追加の概略図１７０を示す。
本開示の別の態様によれば、テーパー状ＦＯＥ（ＴＦＯＥ）１００が例示的な実施形態として導入される。図１Ｄでは、単一セル変調に向けて、１層のコーティングのみを有するＴＦＯＥ１００が示されている。ＴＦＯＥ１００は、小型化された低周波超音波源として２０μｍの先端直径を備えている。本開示は、２０μｍの小さなファイバー先端に伴う課題を克服するために、いくつかの革新的な措置を講じた。光ファイバーのテーパー付けを再現可能に制御するために、マルチモードファイバ１１４は、熱テーパー付け技術によって２２５μｍの全直径から２０μｍまで徐々に引張られた。光エネルギーを最大効率で音響波に変換するために、本開示は吸収／熱膨張層１１８（光吸収の強い多層カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を熱膨張係数の高いＰＤＭＳに埋め込んで構成される）を最適化することができる。テーパー状ファイバーの光音響変換効率を高め、光漏れを最小限に抑えるために、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を導入してヒドロキシル基を持つＩＰＡコーティングされたＣＮＴを形成することにより、光音響ＣＮＴ／ＰＤＭＳコーティングを１５％という高いＣＮＴ濃度で調製できる。高濃度のＣＮＴとＩＰＡによって引き起こされるＰＤＭＳの粘度低下を克服し、テーパー端の２０μｍの断面で均一で制御されたコーティング厚さを達成するには、パンチスルー法を導入できる。コーティングの厚さは、ＩＰＡを蒸発させてマトリックスの粘度を変えることで制御できる。テーパー状ファイバー光音響エミッターは、再び図１Ｄに示されるように、厚さ９．５μｍ及び全体直径１９．８μｍのＣＮＴ／ＰＤＭＳコーティングを有し、単一細胞ターゲティングの必要性を満たしていることが顕微鏡画像によってさらに確認され得る。
本開示の実施形態によれば、次に、１０３０ｎｍナノ秒パルスレーザーがＴＦＯＥ１００にデリバリーされて、光音響信号１１２を生成することができる。図１Ｅは、グラフ線１５０によって与えられる音響波形の平均トレースを示す。近接場の超音波圧力は、針ハイドロフォンによって測定されて５６．７ｋＰａであった。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）後の音響波形の無線周波数スペクトルは、図１Ｆのグラフ線１６０で与えられるように、１．０ＭＨｚにピーク周波数を有する０～１０ＭＨｚの広帯域音響周波数を示す。これは、経頭蓋インビボ神経調節及び他の生物医学的応用で最も頻繁に使用される範囲内にある。あるいは、ＴＦＯＥ１００の適用下でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に分散された蛍光ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズ（直径９μｍ）の動きを使用して、音場の分布を視覚化することもできる。５０ミリ秒のレーザーバースト持続時間、１．７ｋＨｚの繰り返し率で７．８ｍＷのレーザー出力の下で、ＴＦＯＥ１００先端（１μｍ未満）に近い２つのビーズは５μｍの変位を示した。一方、ＴＦＯＥ先端から約２０μｍ離れた他のビーズはＴＦＯＥ処理時に静止したままであり、ＴＦＯＥによって生成された音場が２０μｍの距離内に局在していることを示している。
本開示の実施形態によれば、音響生成中に水中でＴＦＯＥによって生成される熱プロファイルを特徴付けるために、ファイバー先端の温度は、ＴＦＯＥ１００先端表面に直接接触する小型超高速熱センサー（ＤＩ－２４５、ＤａｔａＱ、オハイオ州、米国）によって測定された。図１Ｈでは、ニューロン刺激を成功させるために２つの例示的な試験条件を使用することができる：第１．グラフ線１８０での５０ミリ秒のレーザーパルス列、７．８ｍＷのレーザー出力、及び１．７ｋＨｚの繰り返し率；第２．グラフ線１９０での１ミリ秒のレーザーパルス列、１１．４ｍＷのレーザー出力、及び１．７ｋＨｚの繰り返し率である。このように、第１条件では先端表面温度は０．０９３±０．００４℃しか上昇せず、第２条件では上昇は検出されなかった。この温度上昇は、熱誘発ニューロン変調の閾値（ΔＴ≧５℃）をはるかに下回る。まとめると、これらの結果は、製造された先端直径２０μｍのＴＦＯＥ１００が点超音波源として機能し、先端から約２０μｍに高度に局所化された超音波場を生成することを示している。この前例のない空間的閉じ込めにより、熱損傷や望ましくない機械的破壊を最小限に抑えながら、単一ニューロンレベルでの高精度の刺激が可能になると考えられる。
本開示の別の態様によれば、ＴＦＯＥ１００のこの拡散層１１６は、ポリマー（エポキシ）と直径１００ｎｍの酸化亜鉛（ＺｎＯ）ナノ粒子の混合物を含み、これは、近赤外領域での高い光透過性と高い屈折率により、高エネルギーレーザーパルスをコーシー分布に拡散する。ＺｎＯナノ粒子の直径（つまり１００ｎｍ）は、使用されるレーザー波長（１０３０ｎｍ）よりもはるかに小さいため、全方向へのローリー散乱が可能になる。次に、光エネルギーを音響波に変換するために、吸収／熱膨張層１１８を第２のコーティングとして引き続き追加することができる。これは、吸収体として光吸収係数の高いナノ粒子（多層カーボンナノチューブ、ＭＷＣＮＴ）と、光音響変換効率を最大化するための膨張と圧縮を目的とした熱膨張係数の高いポリマー（ＰＤＭＳ）で構成されている。
本開示によれば、ＴＦＯＥ１００のファイバー遠位端にあるこれらの特別に設計されたナノポリマー複合層１１６及び１１８は、パルスレーザー励起時に、光音響効果を通じてＴＦＯＥ１００のファイバー先端から音響波を効果的に生成し、トランスデューサーを介して検出される。さらに、光音響理論によれば、調整可能な音圧を実現するには、圧力は入射レーザーフルエンスに比例する。したがって、レーザーフルエンスが変化したときのＴＦＯＥの振幅と周波数スペクトルも特徴付けられ、さまざまな用途に対する圧力の柔軟性が示される。
ＴＦＯＥ１００の超音波周波数の制御性を実現するために、１１６及び１１８を含む２層コーティングを、典型的なトランスデューサーの構造を模倣するように設計できることに留意されたい。トランスデューサー（図示せず）は３つの層で構成される：活性層と背面コネクタの間の特定の音響インピーダンスを整合させるためのバッキング層；活性層（電圧を印加すると超音波を発生する圧電材料）：及び媒体と活性層の間の特定の音響インピーダンスを整合させるための整合層（ＰＤＭＳの比音響インピーダンス（１．１～１．５Ｐａ・ｓ／ｍ３）は水（１．４８Ｐａ・ｓ／ｍ３）に近いため、ＴＦＯＥ１００では３番目の整合層を省略できる）。トランスデューサーでは、周波数は２つの要素によって決まる。まず、周波数と帯域幅はバッキング層の減衰効果によって制御される。第二に、周波数は活性層の厚さに反比例する。このようにして、ＴＦＯＥ１００における第１の層１１６の音響減衰及び第２の層１１８の光吸収厚さを変更することによって、周波数を正確に制御することができる。
本開示の実施形態によれば、超音波周波数は、拡散層１１６の修正を介して制御することができる。例えば、周波数の制御には、トランスデューサーのバッキング層に対応するＦＯＥ１００の拡散層１１６の修正が含まれる可能性がある。拡散層１１６内のエポキシ（比音響インピーダンス：２．５～３．５Ｐａ・ｓ／ｍ3）は、ファイバー１１４（シリカ、比音響インピーダンス：１３．１Ｐａ・ｓ／ｍ3）と活性層１１８（ＰＤＭＳ、比音響インピーダンス：１．１～１．５Ｐａ・ｓ／ｍ3）との間の比音響インピーダンスに適合するバッキング層マトリックスとして機能する。典型的な変換器におけるバッキング層の減衰効果は生成される周波数に影響を及ぼし、バッキング層として機能する拡散層１１６の厚さの変化がＴＦＯＥ１００の出力周波数を制御することが期待できる。例示的な例を続けると、ＺｎＯ／エポキシ拡散層１１６の厚さを有する製造されたＦＯＥ１００は、それぞれ３６、４２、５３、６２、７９、１００μｍからなり、厚さが１０９±２４μｍであるＣＮＴ／ＰＤＭＳの吸収／熱膨張層１１８を備えることができる。熱膨張層１１８の厚さの変化は、それらがすべて光の侵入深さを超えているため、超音波周波数を変化させないことに留意されたい。
図２Ａ～２Ｄは、拡散層１１６を修正することによる超音波周波数の制御に関するグラフを提供する。図２Ａでは、３６～１００μｍの拡散層１１６（ＺｎＯ／エポキシ）及び１０９±２４μｍの吸収／熱膨張層１１８（ＣＮＴ／ＰＤＭＳ）で製造されたＦＯＥ１００からの時間領域の超音波信号は、それぞれ時間、厚さ、及び振幅の関数として、グラフ線２１０（１００μｍ）、２１１（７９μｍ）、２１２（６２μｍ）、２１３（５３μｍ）、２１４（４２μｍ）、及び２１５（３６μｍ）で示される。図２Ｂは、超音波の０～１．０ＭＨｚ内の周波数領域を示す。ピーク周波数は、拡散層１１６の厚さを３６μｍから１００μｍまで変化させることによって０．３８４から０．０８３ＭＨｚの範囲で制御されることがグラフ２２０に示されており、拡散層１１６の厚さを増加させる間に周波数が大幅に減少することを示唆している。
続いて図２Ｃを参照すると、拡散層１１６の厚さによるグラフ２３０のピーク超音波周波数のグラフが示されており、ピーク超音波周波数は拡散層の厚さの変化によって調整可能である。線２１０（１００μｍ）、２１１（７９μｍ）、２１２（６２μｍ）、２１３（５３μｍ）、２１４（４２μｍ）、及び２１５（３６μｍ）での０～１０ＭＨｚの周波数範囲を調べると、周波数の分布はサブＭＨｚ領域でクラスタリングを示した。さらに、周波数と拡散層１１６の厚さとの線形関係は、図２Ｄのグラフ２４０においてｙ＝０．５１０８６－０．００４３１ｘの関数でＲ２が０．９３９９２であることを示している。拡散層１１６を変化させることによる周波数の制御は、光音響スペクトルのピーク周波数が拡散層１１６の質量によって変調され得るという事実によってさらに合理化され得る。光音響効果は、一般化されたフックの法則とニュートンの第２法則から推定される運動方程式の導関数である熱膨張方程式によって説明できる。光音響変換プロセス中、ＴＦＯＥ１００先端は調和振動子とみなすことができ、振動運動は熱膨張効果によって与えられる初期力から生じる。フックの法則では、振動の振幅は一定のままで、その周波数は振幅とは無関係であるが、振動子の質量と剛性によって決まる。この点に関して、エポキシ／ＺｎＯ拡散層１１６を修正することによって、０．０８３～０．３８４ＭＨｚの周波数範囲が達成される。
さらに、一般的なトランスデューサーの場合、帯域幅は、スペクトル強度が最大値（ｆupper－Ｆlower）の５０％に減衰する周波数の差と中心周波数ｆcentralの間の比によって定義される。
０．０８３～０．３８４ＭＨｚの中心周波数を有するＦＯＥ１００の帯域幅は式１から得られ、平均帯域幅は６７．８±６．８％であった。これらの結果は、ＦＯＥ１００によって生成される超音波帯域幅が、対応する周波数の市販のトランスデューサーによって生成される帯域幅（例えば、５ＭＨｚ、Ｖ３２６、Ｏｌｙｍｐｕｓの場合は６７．０９％；１０ＭＨｚ、ＸＭＳ３１０、Ｏｌｙｍｐｕｓの場合は５６．００％）に匹敵することを示している。特に、市販のトランスデューサーでは、バッキング層の厚さを変更して中心周波数を変化させても帯域幅が大きく変化しないことが判明しており、これは、わずかな周波数依存性を示すＦＯＥ１００の帯域幅と一致している。
本開示の実施形態によれば、超音波周波数は、膨張層内のＣＮＴ濃度を変更することによって調整又は制御することもできる。周波数を操作するための本開示の例示的な実施形態は、活性層（すなわち、吸収／熱膨張層１１８）の有効厚さを変更することを含む。光音響生成理論によれば、光音響の波形は光音響源の光吸収プロファイル、τ＋１／ｃα（τはレーザーのパルス幅、αは吸収体の光吸収係数）にも依存する。吸収体の有効厚さは、光の侵入深さによって決まる。このように、光音響信号波形は実効的な吸収体の厚さによって結果的に変化し、吸収体の厚さは光の侵入深さよりも小さいため、周波数は吸収体の厚さによって決定される。吸収体の厚さが光の侵入深さよりも大きい場合、周波数は一定のままであり、余分な厚さは音響の減衰のみを引き起こす。
図３Ａ～３Ｂは、周波数に対する膨張層の物理的厚さの影響の特徴を示す。本開示のこの態様によれば、２つのグループのＴＦＯＥ１００が、それぞれ３６μｍ及び１００μｍのＺｎＯ／エポキシ拡散層１１６を用いて製造された。図３Ａは、１００μｍ（グラフ線３１１）、１２０μｍ（グラフ線３１２）、１４０μｍ（グラフ線３１３）、及び１６０μｍ（グラフ線３１４）の膨張層のグラフ３１０である。図３Ｂは、１００μｍ（グラフ線３１１）、１２０μｍ（グラフ線３１２）、１５０μｍ（グラフ線３１５）、及び２１０μｍ（グラフ線３１６）の膨張層のグラフ３２０である。各グループについて、ＴＦＯＥからの超音波の時間領域を示す図３の色の凡例で示されるように、１００μｍから２１０μｍまで変化するＣＮＴ／ＰＤＭＳ膨張層を用いて４つのＴＦＯＥを作製した。波形は時間に対して同様の関数のままであったが、膨張層の厚さが増加するにつれて振幅は低下した。結果として、吸収体層１１８の厚さが光の侵入深さを超える場合、周波数は試験範囲内の膨張層の追加の物理的厚さの変化に敏感ではないが、一方、振幅の変化は、熱膨張層の余分な厚さによる音響減衰に起因する可能性がある。
追加の物理的厚さ（光の侵入深さを超えた）は周波数の制御因子ではないが、有効吸収体の厚さを変えることによって周波数を変えることができると考えられることに留意されたい。これは、吸収剤濃度を変更することで膨張層の空間吸収プロファイルを変更することで実現できる。有効厚さは主に物理的厚さではなく光吸収プロファイルによって決定されるため、このようにして、物理的厚さ及び幾何学的構造の変動の影響が最小限に抑えられ、ＴＦＯＥ１００製造の堅牢性が向上する。
超音波周波数を微調整するために吸収剤の濃度をどのように変更できるかを検証するために、拡散層１１６を使用せずに、ＦＯＥ１００をＣＮＴ／ＰＤＭＳ膨張層のみでコーティングした。異なる濃度のＣＮＴ（２．５％、５．０％、７．５％、１０．０重量％）を混合物に使用した。コーティング全体の厚さは同じ範囲に保たれた。図４Ａは、有効吸収／膨張層１１８の厚さの関数としての光音響信号周波数の図を提供する。グラフ４１０のグラフ線４１１、４１２、４１３、及び４１４は、それぞれ２．５、５．０、７．５、及び１０．０％の濃度における吸収／膨張層１１８の厚さを示す。図４Ｂは、ＣＮＴ／ＰＤＭＳ濃度の関数としてプロットされたピーク周波数を示し、４Ｂの各データ点は各濃度の２つの同一のＦＯＥの平均値であり、エラーバーは標準偏差である。したがって、本開示は、ＣＮＴ濃度に依存する周波数変化により、光音響の制御可能なピーク周波数が、グラフ４２０を介して吸収／膨張層１１８の光吸収プロファイルを変更することによっても達成できることを可能にすることを提示する。
本開示によって本明細書に記載される例示的な実施形態によれば、振幅及び周波数スペクトルに関して音響波の角度分布をさらに特徴付けることができる。そうするために、ＦＯＥ１００は、拡散層１１６（ＺｎＯ／エポキシ、厚さ４０μｍ）及び膨張層１１８（ＣＮＴ／ＰＤＭＳ、厚さ１２０μｍ）から構成され得る。ＦＯＥ１００からの音響放射は、１２７ｍＪ／ｃｍ２の一定の光入力でオシロスコープの出力電圧を測定することによって決定することができる。ファイバー軸に対するトランスデューサー検出器の角度は、制御可能な３６０°回転ステージ（米国ニュージャージー州のＴｈｏｒｌａｂｓ社など）によって±１°の精度で変更できる。光音響信号は、図５Ａのグラフ５１０に示すように、それぞれ０°、±２５°、±５０°、及び±７５°の角度で取得することができる。このように、図５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ５２０及び５３０で測定された音響振幅を示す。図５Ｃのピークツーピーク光音響振幅は、それぞれ５．２（０°で）から１．６（±７５°で）に減少することが分かる。これは、角度が大きくなるほど音響振幅が小さくなり、正面方向の振幅が最大になることを示している。ＰＡの振幅異方性は、光強度の異方性から生じると予想される。具体的には、ＺｎＯ／エポキシ（１５重量％）の一層による光強度の角度分布を事前に測定し、制御可能な３６０°回転ステージに取り付けられたフォトダイオードを使用して光強度の角度分布を測定した。５０°での光強度は、０°での光強度の約４１％であった。図５Ｃでは、５０°での音響振幅は０°での振幅の３７％であった（１．９Ｖ対５．２Ｖ）。これにより、音響振幅分布は光強度分布データと一致する。図５Ｄは、５４０で、角度を０度から±７５度まで変化させたとき、ピーク周波数が比較的一定（０．７～０．８ＭＨｚ）であり得ることを示している。これは、拡散層１１６の効果にもかかわらず、レーザーパルスエネルギーの大部分がレーザーの順方向に沿ってデリバリーされ、横方向に伝播する光がほとんどなく、横方向の光音響誘発振動が無視できるためである。拡散層１１６による分散、球状コーティングの曲率半径、ＰＤＭＳと水との間の密度及び音速の不一致を含む他の要因も、振幅異方性に寄与する可能性がある。
本開示の別の態様によれば、ＦＯＥ１００媒介分子デリバリーは周波数依存性であり、０．２ｍｍ2の空間閉じ込めを示す。例示的な実施形態によれば、様々な周波数のＦＯＥ１００によって媒介されるソノポレーション中の細胞膜不透過性蛍光分子の細胞取り込みは、サブＭＨｚ超音波の優れた性能を実証することができるとともに、ＦＯＥの空間的閉じ込めを解明することができる。ソノポレーションプロセスを視覚化するために、損傷した原形質膜を通ってのみ細胞に浸透し、核酸に結合すると蛍光増強を示す高親和性インターカレート核酸染色ＳＹＴＯＸグリーンを選択できる。したがって、２００ミリ秒の持続時間の超音波バーストは、図６Ａの概略図６１０に見られるように、１．７ｋＨｚのパルス繰り返し率で３９ｍＪ／ｃｍ２のパルスレーザーを使用して生成することができ、これはバースト当たり約３４０の音響パルスに相当する。光音響治療は、合計１０分間、バースト繰り返し率０．５Ｈｚで実行できる。ＦＯＥは、培地中の細胞の上約１００μｍに配置できる。
まず、熱誘起細胞膜透過性を除外するために、ＦＯＥ処理中のファイバー先端の温度上昇は、ファイバー先端に接触して配置された小型超高速熱プローブ（直径１００μｍ）を使用して測定できる。図６Ｂのグラフ線６２０に示すように、温度上昇は合計１０分間で０．６℃であることが分かると想定される。このような小さな温度上昇では、熱による膜の脱分極は無視できる。したがって、Ｓｙｔｏｘの取り込み結果は、ＴＦＯＥからの光音響波によって誘発された機械的破壊に起因すると考えられる。
Ｓｙｔｏｘ取り込み効率の超音波周波数依存性を研究するには、ピーク周波数８．０、５．１、１．４、及び０．３ＭＨｚのＴＦＯＥを利用できる（８．０ＭＨｚ：１５％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；５．１ＭＨｚ：１０％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；１．４ＭＨｚ：５％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ；０．３ＭＨｚ：１５％ＺｎＯ／エポキシ＋１０％ＣＮＴ／ＰＤＭＳ）。様々な周波数を有する超音波が、図６Ｃの時間領域６３０に示されている。同一のエネルギー入力を確保するには、レーザーフルエンスを一定に保つ必要がある。したがって、８．０ＭＨｚ信号は最大振幅（２．６５０Ｖ）を示す一方、０．３ＭＨｚ信号は最小振幅（０．０８７Ｖ）を示すはずであるが、これはトランスデューサー感度の不均一性に部分的に起因する可能性がある。図６Ｅは、ＴＦＯＥ処理前の６５２（０分、上のパネル）及びＴＦＯＥ処理後の６５４（２６分、下のパネル）の細胞培養物の蛍光画像を示す。細胞をＴＦＯＥで処理すると、蛍光シグナルの上昇によって示されるように、Ｓｙｔｏｘの細胞取り込みが大幅に増加する。具体的には、０．３ＭＨｚの超音波は、音響強度が最も低いにもかかわらず、ＴＦＯＥ処理後に最も高い蛍光増加を示し、１．４ＭＨｚ及び５．１ＭＨｚと比較して最も高いソノポレーション効率を示した。比較すると、８．０ＭＨｚの超音波で治療したグループでは、Ｓｙｔｏｘの取り込みはごくわずかであった。全体として、ソノポレーション効率は周波数依存性を示した。周波数が低いほど、細胞取り込み効率は高くなる。この結論はさらに統計的に証明することができる。図６Ｄでは、様々な周波数で処理された３０個の個々の細胞からの平均蛍光強度が時間の関数としてグラフ６４０にプロットされている。TFOEで生成されたグラフ線５．１（６４２）、１．４（６４３）、及び０．３（６４４）ＭＨｚ超音波はすべて、治療後の時間の関数としてＳｙｔｏｘ蛍光の増加を示し、Ｓｙｔｏｘの取り込みを促進する能力を確認している。図６Ｄは、処理後約２５分における蛍光のプラトーも示しており、膜の細孔が再封鎖されていることを示した。この動態は、集束超音波が数十分の時間スケールでＳｙｔｏｘの取り込みを促進したという以前に報告された研究と一致している。具体的には、０．３ＭＨｚグループの曲線は最も高い傾きを示し、これは、０．３ＭＨｚのグラフ線６４４が他のグループよりもはるかに速くＳｙｔｏｘの取り込みを促進したことを意味する。最終的な読み取り値は、０．３ＭＨｚのグラフ線６４４がＴＦＯＥ処理後に０．９２という最高のΔＦ／Ｆを示していることも示しており、これは、１．４ＭＨｚのグラフ線６４３（ΔＦ／Ｆ＝０．７４）及び５．１ＭＨｚのグラフ線６４２（ΔＦ／Ｆ＝０．３５）と比較して最も高いソノポレーション効率を示している。したがって、取り込まれるＳｙｔｏｘの総量は周波数に依存する。周波数が低いほど、一定期間内に損傷した細胞膜をより多くの分子が通過する。さらに、８．０ＭＨｚグループのグラフ線６４１は、顕著な蛍光の増加を示さないが、わずかな蛍光の減少を示す。Ｓｙｔｏｘの光漂白による潜在的な影響を考慮すると、蛍光の全体的な低下の理由は、Ｓｙｔｏｘの取り込みによって誘発される蛍光の増加が光漂白効果と比較して弱すぎるためである可能性がある。入射レーザー出力をさらに８．０ＭＨｚの超音波治療に増加すると、最終的には細胞への熱及び／又は光損傷を犠牲にして、０．３ＭＨｚグループと同等のソノポレーション及びデリバリーが得られる可能性があると考えられる。まとめると、ＴＦＯＥ誘発ソノポレーションは、低周波の方が高周波よりも高い効率を実行する周波数依存性を示す。
ソノポレーション効率を定量化するには、ΔＦ／Ｆ≧５０％で細胞をＳｙｔｏｘ陽性細胞として計数し、照射領域内のＳｙｔｏｘ陽性細胞の割合を計算する。このパーセンテージは、ＦＯＥソノポレーション効率の尺度として使用される。同じレーザーエネルギーと継続時間の下で周波数５．１、１．４、及び０．３ＭＨｚのＴＦＯＥの場合、２６分の蛍光イメージングから得られた効率は０％、７２．７％、及び８３．３％であることが確認でき、これは、低周波の方が高周波の超音波よりもソノポレーション効率が大幅に高いことを示唆している。低周波超音波の効率が高いことは、超音波が二層膜の運動を誘発するという膜内キャビテーション理論によって説明でき、組織内に空気空隙があらかじめ存在する必要はない。最大面積ひずみは周波数の平方根に反比例するため、低周波超音波の方がキャビテーション閾値が低くなり、ソノポレーションの効率が向上する。マイクロバブルの助けを借りて超音波によって誘導されるＳｙｔｏｘの取り込みの働きにおいて、取り込まれたＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の最大割合は、それぞれ４００、５００、及び６００ｋＰａで１５ミリ秒（パルス幅１００μ秒で１５０サイクル）の超音波処理後に２０％未満であった（ΔＦ／Ｆの閾値は不明）。本開示において、ＴＦＯＥは、１．１ｍｓの有効超音波処理持続時間（３４０パルス、３．３μｓ未満のパルス持続時間）で約４０ｋＰａの圧力を提供し、低周波数に対して７２．７％及び８３．３％のソノポレーション効率を可能にする。したがって、ＴＦＯＥによって生成される低周波局所光音響波は、テストセルが異なるにもかかわらず、同等の性能を示す。
ＴＦＯＥが、ソノポレーションの閉じ込めによって特定の分子を細胞に局所的にデリバリーすることにより、局所的な細胞調節を可能にする独自の戦略を提供することを検証するために、典型的なホールセルディッシュモジュレーションと比較して、細胞培養物の蛍光増加を１０倍の視野で調査した。局所的なデリバリーは、図６Ｆ及び６Ｇで見ることができる。図６Ｆは、１０倍の対物レンズで撮影されたＴＦＯＥ処置群６６０及び対照群６６５の蛍光画像を提供する。白い破線の円は、観察された顕著な蛍光強度変化の領域を示す。これは、細胞上１００μｍの距離にあるＴＦＯＥの位置の直下にある。ＴＦＯＥ処理後、面積０．２ｍｍ２の処理領域６６２は、３２％の顕著な蛍光増加を示し、横方向に０．２ｍｍ２の空間的閉じ込めを示している。位置特定をさらに検証するために、従来のトランスデューサーアレイはサブＭＨｚ範囲で回折限界があるため、２光子イメージングを使用した組織内のＦＯＥ誘発細胞変調により、３次元視覚化を介して空間閉じ込めが明らかになる。次に、２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム染色（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を使用してＴＦＯＥの生物学的安全性をテストするために、ＦＯＥ処理後の細胞生存率は９９．５５±０．０３％であり、ＴＦＯＥ処理の優れた生体適合性を示している。図６Ｇは、ＴＦＯＥ処置群６６０と対照群６６５との間の蛍光強度変化の比較のグラフ６７０であり、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。まとめると、細胞内に小分子をデリバリーするための新しい超音波源として使用されたＴＦＯＥは周波数依存性を示し、サブＭＨｚ超音波の重要性を示した。局所的な蛍光変化は、ＴＦＯＥが０．２ｍｍ2の空間的に閉じ込められていることを示しており、ニューロン刺激や遺伝子タンパク質研究のための局所的な遺伝子トランスフェクションなど、高い空間精度での細胞調節が期待される。
本明細書で提供される例示的な実施形態によれば、優れた光学的及び機械的特性を有するナノ粒子ポリマーマトリックスから構成されるファイバーベースの光音響エミッター１００が設計及び製造される。拡散層１１６及び膨張層１１８を含む２層コーティング設計は、生成される超音波の振幅及び周波数の正確な制御性を提供する。高振幅とサブＭＨｚ範囲の調整可能な周波数による局所的な音響波の生成が実現される。いくつかの実施形態では、光音響信号プロファイルを振幅及び周波数スペクトルで特徴付けることによって、ＣＮＴ／ＰＤＭＳのマトリックスが高振幅を達成するための好ましい候補であることが実証される。音響周波数を制御するための２つの効果的な戦略を実証できる。第１に、周波数は、音響インピーダンスの不整合を介して減衰材料として機能する拡散層１１６の厚さによって変えることができる。第２に、音響周波数は、活性吸収体／膨張層１１８を通る光の浸透の深さによっても制御され、これは吸収剤の濃度を変えることで間接的に制御できる。小分子を細胞膜にデリバリーするために０．３ＭＨｚから８．０ＭＨｚまでの範囲のさまざまな周波数のＴＦＯＥを使用することにより、サブＭＨｚ超音波は高周波と比較して優れた効率を示す。０．２ｍｍ２の側方空間制限は、ソノポレーション有効面積によっても確認できる。このように、小型化されたＴＦＯＥ１００を使用して、ミリメートル未満の閉じ込めを備えたサブＭＨｚ周波数の音響が生成され、他の典型的な超音波源の制限を克服した。このようなＴＦＯＥ１００デバイスの設計は、細胞膜ソノポレーションを含むがこれらに限定されない、幅広い細胞的用途に有望であると想定され、また、高い有効性と最小限の安全性の問題を備えた、局所的な薬物デリバリー、ニューロン刺激、及び遺伝子トランスフェクションのための新しいツールを提供する。
証明された高い小型化レベルを達成することにより、調整可能な光音響エミッターは低侵襲医療用途に有望であり、ここで、本開示を介して本明細書に提示されるファイバーベースの光音響デバイスは、例えば、焦点病変に近接した注射針又はカテーテルに挿入することができ、したがって、従来の集束超音波によって誘発される精度及び振幅の低下の問題を克服することができる。さらなる実施形態により性能を改善できることが想定される。例えば、最適な光音響信号生成のために高次モードを使用してレーザービームをファイバーに結合できる。第二に、ＴＦＯＥ先端の形状は、凹面構造を介して波を集中させる機会を提供する。第三に、従来のトランスデューサーアレイはサブＭＨｚ範囲で回折限界があるため、サブミリメートルの位置特定をさらに検証することは困難である。二光子イメージングを使用した組織内のＴＦＯＥ誘発細胞変調は、３次元視覚化を介して空間閉じ込めを明らかにする。より広い文脈では、この技術は、超音波パラメーターの変更を通じて各焦点標的で安定かつ可逆的なソノポレーションを生成する可能性を提供し、生物医学的超音波適用の正確な制御を可能にし、これは、既存の技術、特に薬物デリバリーや遺伝子導入ではできなかったことである。さらに、このＴＦＯＥ１００は電磁干渉の影響を受けないため、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性がある。これらの柔軟性は、その前例のない小型化及び容易な反復のしやすさとともに、本開示の方法及びデバイスを革新的な技術にする。
本開示の別の態様によれば、ＴＦＯＥ１００の２層製造は２つのステップから構成される。まず、拡散層１１６については、架橋プロセスによってエポキシ又はＰＤＭＳマトリックスを調製することができる。エポキシは、ポリエポキシド溶液（例えば、Ｄｅｖｃｏｎ社、アルバータ州、カナダ）と多官能性硬化剤を体積比１：１で混合することによって製造された。ＰＤＭＳの場合、シリコーンエラストマー（例えば、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国）を容器に直接慎重に分配して空気の閉じ込めを最小限に抑え、その後、重量比１０：１で硬化剤と混合する。続いて、ディフューザーとして機能するＺｎＯナノ粒子（例えば、～１００ｎｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州、米国）を、別途指定される１５重量％の濃度でマトリックスに添加することができる。コア直径が２００μｍで、先端が研磨されたマルチモード光ファイバー（例：ＦＴ２００ＥＭＴ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社、ニュージャージー州、米国）を混合溶液の表面から約１００μｍ下に慎重に浸し、マイクロマニピュレーターを使用して素早く引き上げた。本開示によれば、室温で垂直に置くことにより、ポリマーが架橋し、マトリックスがコーティングを形成した。エポキシで作られた拡散層１１６は、その後、エポキシの吸収／熱膨張層１１８でコーティングできることが想定される。
このようにして、特定の音響インピーダンスの不整合を最小限に抑えることができ、光音響変換効率を最大化することができる。グラファイト粉末（例えば、Ｄｉｃｋ Ｂｌｉｃｋ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ社、イリノイ州、米国）を、３０重量％の濃度でマトリックスと混合することができる。ＭＷＣＮＴ（例えば、外径＜８ｎｍ、内径２～５ｎｍ、長さ０．５～２μｍ、ＶＷＲ社、ニューヨーク州、米国）は、密度が低い（１．６５ｇ／ｃｍ２）ため、溶解度の上限に近い０～１０重量％の濃度で使用できる。同様に、ＰＤＭＳマトリックスで作られたＴＦＯＥを製造できる。サブＭＨｚ周波数を生成するＴＦＯＥの例示的な実施形態では、構造をＺｎＯ／エポキシ（拡散層１１６）及びＣＮＴ／ＰＤＭＳ（吸収／熱膨張層１１８）として変更することができ、ここでは、エポキシとＰＤＭＳが特定の音響インピーダンスの不整合を実現した。このようにして、セル変調に必要な周波数を満たしながら、圧力を妥協することができる。ファイバー先端付近にサーマルレジストインクでマークを付け、塗布前後の顕微鏡写真上でマークを位置合わせすることで、塗布後の膜厚を測定できる。特に、光漏れは、水及びトランスデューサプローブ内のパルスレーザー誘発衝撃波により、検出トランスデューサー上で音響応答を生成し、潜在的に検出器の損傷を引き起こす可能性がある。パワーメーターを使用して光透過率を測定し、光漏れを評価できる。したがって、上述した本開示の設計及び製造は、ＴＦＯＥ１００の光漏れを排除することができる。
本開示の実施形態によれば、優れた光学的及び機械的特性を有するナノ粒子ポリマーマトリックスから構成されるファイバーベースの光音響エミッターの設計及び製造が開示される。拡散層１１６及び膨張層１１８を含む２層コーティング設計は、生成される超音波の振幅及び周波数の正確な制御性を提供すると考えられる。高振幅とサブＭＨｚ範囲の調整可能な周波数による局所的な音響波の生成が達成された。光音響信号プロファイルを振幅と周波数スペクトルで特徴付けることにより、ＣＮＴ／ＰＤＭＳのマトリックスが高振幅を達成するための好ましい候補として実証できる。
本開示によれば、音響周波数を調整する（すなわち、制御する）ための２つの効果的な戦略が提供される。第１に、周波数は、音響インピーダンスの不整合によって減衰材料として機能する拡散層１１６の厚さによって変えることができる。第２に、音響周波数は、吸収／膨張層１１８を通る光の浸透の深さによっても制御することができ、これは吸収体濃度を変えることによって間接的に制御されている。小分子を細胞膜にデリバリーするために０．３ＭＨｚから８．０ＭＨｚの範囲の様々な周波数のＴＦＯＥ１００を使用することにより、サブＭＨｚの超音波は高周波と比較して優れた効率を示した。０．２ｍｍ2の側方空間制限は、ソノポレーション有効面積によっても確認できる。これにより、小型化されたＴＦＯＥを使用して、ミリメートル未満の閉じ込めを備えたサブＭＨｚ周波数の音響を生成でき、他の一般的な超音波発生源の制限を克服できる。このＴＦＯＥデバイス設計は、細胞膜ソノポレーションなどの幅広い細胞的用途やその他の例示的な用途に有望であり、また、高い有効性と最小限の安全性の問題を備えた、局所的な薬物デリバリー、ニューロン刺激、及び遺伝子トランスフェクションのための新しいツールも提供する。
本明細書の実施形態によれば、本開示のデバイス及び方法によって、単一細胞精度での一次ニューロンのＴＦＯＥ刺激を生成することができる。培養中の単一ニューロンを調節する際に、ＴＦＯＥ１００が十分な空間精度を提供するかどうかをテストするために、例示的な例には、ＧＣａＭＰ６ｆを発現する初代ラット皮質ニューロンを調製し、倒立広視野蛍光顕微鏡を使用してカルシウムイメージングを実行することが含まれる。図３４Ａ及び３４Ｂは、それぞれ５０ミリ秒及び１ミリ秒のレーザー持続時間でＴＦＯＥによって刺激されたまばらな集団における蛍光画像及びカルシウムトレースである（刺激後のピーク強度の蛍光画像は「アフター」として示されている。青い矢印：レーザーの開始）。マイクロマニピュレーターによって制御されるＴＦＯＥ１００は、標的ニューロン３４１４から約５μｍ離れたところに配置できる。１０３０ｎｍ及び１．７ｋＨｚ繰り返し周波数の３ナノ秒パルスレーザーを使用すると、８５パルスに相当する平均出力７．８ｍＷで持続時間５０ミリ秒のレーザーパルスを照射できる。これにより、図３４Ａに示すように、標的ニューロンに対するレーザー照射直後にカルシウム過渡現象を観察することができる一方、先端から約５０μｍ～７０μｍ離れた他のニューロン３４１６は影響を受けず、これはＴＦＯＥ刺激の高い空間分解能を示している。最大ΔＦ／Ｆが１３５％±８３％（３つの培養からＮ＝６、データは平均±ＳＤ）のカルシウム過渡現象は、おそらくＴＦＯＥ刺激によって誘発された複数の活動電位の発動によって標的ニューロンの活性化が成功したことを示している。時間分解能をさらに向上させるために、１１．４ｍＷの出力で１ミリ秒（２パルス）のレーザーパルス列をＴＦＯＥ１００に供給できる。図３４Ｂに示すように、単一ニューロン３４１４の活性化の成功は、１０６％±６１％の最大ΔＦ／Ｆで観察することもできる（３培養からのＮ＝８細胞、データは平均±ＳＤ）。
本開示によれば、ＴＦＯＥ１００は、それにより、光ファイバー上の光拡散層１１６及び膨張層１１８から構成される、ミリメートル未満の閉じ込めを有する小型超音波点音源として機能することができる。音響減衰と光吸収性能を変更することで、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲で制御可能な周波数が実現され、周波数依存の効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導できる。回折限界を突破することで、サブＭＨｚの周波数とサブミリメートルの精度の間の妥協の問題を解決することで、ＴＦＯＥ１００が領域特異的な薬物デリバリー、遺伝子トランスフェクション、及び神経刺激を提供できることが想定されている。さらに、３μＭのテトロドトキシン（ＴＴＸ）を含む１ミリ秒のＴＦＯＥ１００の対照群は活性化を示さないことが考えられ、実験群で観察され得るカルシウムの増加がＮａ＋チャネル依存性活動電位に起因することが確認された。本明細書の実施形態によれば、コーティングのないテーパー状ファイバーを使用した１．０秒のパルス列及び１１．４ｍＷ出力のレーザーのみの群は活性化を示さないため、ニューロン活動に対するレーザーの影響を除外することができる。
本開示の実施形態によれば、ＴＦＯＥ１００は、神経活性化を確実かつ繰り返し誘発することができる。図３４Ｃは、ＴＦＯＥ１００刺激を３回繰り返したときの同じニューロン３４１４の蛍光強度を示す。各刺激には１ミリ秒のレーザー持続時間が、各記録期間の間に１分の間隔で利用されることが想定されている。同じニューロン３４１４の各刺激で活性化が成功する。これにより、ＴＦＯＥ１００刺激後のニューロン３４１４の生存率が確認できる。連続刺激ごとに最大ΔＦ／Ｆの減少が観察されたが、これはカルシウムの枯渇又はスパイク周波数の適応に起因すると考えられる。さらに、図３４Ｄでは、ＴＦＯＥ１００によって選択的に標的とされる３つのニューロンを使用するＴＦＯＥ１００刺激の空間精度を実証することができる。これらの３つのニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６は、２５±２μｍの端から端までの間隔を有する。ＴＦＯＥ１００は、３つの標的ニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６のそれぞれから約５μｍ離れて連続的に配置することができる。最大蛍光強度変化（ΔＦ／Ｆ）は、図３４Ｄに示すように、各ニューロン３４１４、３４１５、及び３４１６について、それぞれ赤、黄、緑で色ラベルを付けることができる。重要なことに、蛍光の増加は、他の２つのニューロンが同時に活性化されることなく、選択的に標的とされたニューロンでのみ観察され、ＴＦＯＥ刺激が２５μｍ未満の空間分解能を提供することを示している。これらの結果は、ＴＦＯＥ１００が単一ニューロンを確実かつ再現性よく刺激できることを総合的に裏付けている。
本明細書の実施形態によれば、ニューロンに対する単一の光音響パルスの刺激効果も操作することができる。このようにして、同じナノ秒パルスレーザーを使用して、単一のレーザーパルスをＴＦＯＥに送信できる。異なるレーザーパルスエネルギーによるＧＣａＭＰ６ｆ発現一次皮質ニューロンのＴＦＯＥ刺激は、単一パルス条件下で実行できる。図３５Ａ～３５Ｃは、例えば５０μｍでのＴＦＯＥ刺激のパルスエネルギー依存性の画像である。それにより、図３５Ａ～Ｃは、単一パルスによるＴＦＯＥ１００刺激の前（図３５Ａ）及び後（３５Ｂ）のＧＣａＭＰ６ｆ発現ニューロン３４１４の蛍光画像を提供し、最大ΔＦ／Ｆ（３５Ｃ）も視覚化する。図３５Ｄは、単一パルス刺激を受けた標的ニューロン３４１４のカルシウムトレース３５４０のグラフである（青線：代表的な光音響波形を示すズームインによる光音響刺激の開始）。パルスエネルギーが６μＪ／パルスに達するまで、カルシウム過渡現象は観察されない。光音響波の幅は約１マイクロ秒であると想定される。この機能により、自然な神経コーディングを模倣するために必要な前例のない時間精度で神経回路の音響制御が可能になる可能性がある。図３５Ｅは、パルス数（Ｎ＝５～７）の関数としてのニューロン３４１４刺激の成功に対するパルスエネルギー閾値のグラフ３５５０である。
本開示はさらに、ニューロン刺激を成功させるために所与のパルス数に対して必要なレーザーエネルギーを考慮する。これまでの超音波研究では、さまざまな強度と持続時間の連続波超音波とパルス超音波がニューロン刺激に適用されてきた。時間平均されたＵＳ強度と応答振幅又は成功率との間の関係は、負又は正であることが判明した。これらの研究を考慮して、本開示は、複数の強度及び持続期間にわたる音響刺激に応答したニューロンの挙動の統計的調査を追求する。引き続きこの用途において、まず、刺激が成功するためのパルスエネルギーの閾値は、２０％を超える最大蛍光強度変化（ＭａｘΔＦ／Ｆ）を誘発するのに十分なレーザーパルスエネルギーとして定義される。２０％ＧＣａＭＰ６ｆの最大ΔＦ／Ｆは、活動電位１以上に対応すると特定できるためである。パルス数を１、２、４と増加させると、閾値エネルギーはそれぞれ６．３μＪ、４．９μＪから３．９μＪまで単調減少を示すことが想定され、パルス数がそれぞれ６と８に増加しても、それは３．９μＪと３．６μＪで比較的一定のままである。これらの結果は次のことを示している：第一に、レーザーパルス数が１～４の範囲で増加するときのエネルギー閾値の減少は、小さなパルスエネルギー条件下では、パルス数の増加とともに閾値以下の脱分極が蓄積することを示している。第二に、４パルスから８パルスへの閾値エネルギーの平坦化傾向は、約４μＪ／パルスにエネルギー閾値が存在することを意味しており、それ以下ではパルス列をさらに延長しても活動電位はほとんど誘発されない。
培養初代ニューロンの刺激が成功すると、本開示はさらに、ＴＦＯＥ１００が細胞内構造を標的にできるかどうかを検討する。この目的を達成するために、まず、ＴＦＯＥ１００を、細胞体が存在せずに軸索と樹状突起が密集している標的領域の上に注意深く配置する。持続時間１ミリ秒、レーザー出力１１．４ｍＷ、繰り返し率１．７ｋＨｚの１０３０ｎｍレーザーパルス列をＴＦＯＥ１００に供給できることが想定されている。図３６Ａ～Ｄに示すように、標的領域での蛍光強度の増加は、レーザー開始後に明確に観察でき、標的神経突起のＴＦＯＥ刺激が成功したことを示す。図３６Ａ及び３６Ｂはそれぞれ、ニューロンネットワーク（色付きの矢印：標的領域３６１０（紫）、ニューロン１（シアン、３６１２）、ニューロン２、３（赤、それぞれ３６１３、３６１４）に沿って伝播するカルシウム波によるＴＦＯＥ１００誘発神経突起活性化の前後の画像である。図３６Ｃは、レーザー開始４秒後のカルシウムシグナルのΔＦ／Ｆの画像である（スケールバー：５０μｍ）。図３６Ｄは、３６Ａでラベル付けされた、標的領域（紫、３６１０）、ニューロン１（シアン、３６１２）、並びにニューロン２及び３（赤、それぞれ３６１３及び３６１４）のカルシウムトレースのグラフである（挿入図：レーザー開始直後のカルシウム信号の拡大図、黒い矢印：レーザー開始）。視野全体のイメージングを通じて、３つの異なるカルシウムの動態を捉えることができる。まず、ＴＦＯＥ刺激後に、神経ネットワーク内の標的領域から始まるカルシウム波のゆっくりとした伝播が観察される。カルシウム波の伝播速度は７５．２μｍ／ｓと計算できると想定され、これは、シナプス活動又は代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）の活性及び逆伝播活動電位によって誘導される樹状カルシウム波の伝播速度と一致しており、その速度は約７０μｍ／ｓ４２であった。第２に、図３６Ｃに示すように、視野内の４つの部位は、カルシウム波が広がる前に蛍光シグナルの上昇を示す。標的領域の神経突起（図３６Ａ～Ｃの紫の３６１０）及び標的領域の神経突起に直接接続する軸索を有する特定のニューロン１（図３６Ａ～Ｃのシアンの３６１２とラベル付けされる）は、レーザー開始直後に速いカルシウム過渡現象を示した（図３６Ｄ）。これは、活動電位の逆伝播に似ている。無髄軸索が活動電位スパイクを５００μｍ／ミリ秒の速度でシナプスに伝導することを考慮すると、約１００μｍの距離にわたる神経突起からニューロン１（図３６Ａ～Ｃのシアン）への伝播には０．２ミリ秒しか必要としない。したがって、ニューロン１（図３６Ｄのシアンの３６１２）と標的領域（図３６Ｄの紫の３６１０）のカルシウム過渡開始の差は、サンプリング間隔５０ミリ秒のカメラでは検出できなくなる。第三に、近くにあるが標的領域に接続する軸索を持たないニューロン２及び３（図３６Ａ～Ｃにおいてそれぞれ赤の３６１３及び３６１４とラベル付けされている）は、同様の時間的動態で約０．２秒の活性化遅延を示した（図３６Ｄ、挿入図）。このシグナル伝達は、カルシウム波よりも速い伝播速度を示したため、シナプス伝達を通じて引き起こされる活動電位に起因すると考えられる。
細胞内構造、特に軸索と樹状突起に対するＴＦＯＥ誘発刺激のこの能力を利用して、軸索と樹状突起が光音響刺激に対して異なる応答プロファイルを持つかどうかを解明できる。図３６Ｅでは、多極ニューロン内の３つの神経突起がＴＦＯＥ１００によって選択的に標的とされた。神経突起の１つ（図３６Ｅ及びＦの赤色３６２２）に対する標的化ＴＦＯＥ刺激１００は、遅滞なく細胞体において強力なカルシウム活性化を誘導した（図３６Ｆ及びＪ）。したがって、そのような伝播する活性化は軸索における活動電位の逆伝播に似ているため、この神経突起３６２２は軸索として識別される。明らかに、他の２つの神経突起（図３６Ｅ、Ｇ、及びＨの黄色３６２３及び緑色３６２４）の標的化ＴＦＯＥ１００刺激は、体細胞でいかなる活性化も誘導しなかった（図３６Ｇ～Ｊ）。したがって、それらは樹状突起として識別できる。図３６Ｆ～Ｈは、異なる領域の刺激時のカルシウム信号の最大ΔＦを示す。ニューロンの樹状突起は、上流のニューロンからのシナプス入力を統合することが知られており、これには急速に連続して到着する刺激の合計が含まれ、別々の枝からの入力の集約が伴う。このケースの場合、単一の樹状突起の前方伝播では、細胞体で活動電位を誘発するには不十分であることが判明する可能性がある。単一細胞レベルでの音響刺激に対する軸索と樹状突起の反応の違いは、複数のニューロンにわたって再現可能であることが示されている。図３６Ｉは、３６Ｅにおいて赤の３６２２、黄色の３６２３、及び緑の３６２４の矢印でそれぞれラベル付けされている、標的神経突起において測定されたカルシウムトレースのグラフである。図３６Ｊは、異なる神経突起の刺激時に体細胞で測定されたカルシウムトレースのグラフである（３６Ｉ～Ｊの青い矢印：レーザー開始）。まとめると、これらのデータは、ＴＦＯＥ１００の細胞内ターゲティング機能によって可能になる、光音響刺激に対する軸索と樹状突起の異なる応答ダイナミクスを初めて明らかにする。
本開示によれば、単一ニューロンＴＦＯＥ１００刺激の重要な利点は、細胞内パッチクランプ記録との適合性である。刺激に対するカルシウム反応の時間分解能は限られているが、細胞内パッチクランプ記録を使用した直接記録は、閾値以下及び閾値以上のニューロン活動を研究するための黄金標準となる。従来の超音波はガラスと膜の間のパッチの付着を容易に破壊するため、従来の超音波刺激中の細胞内パッチクランプ記録は困難であった。本開示の光音響刺激方法及びデバイスは、機械的破壊が最小限に抑えられた局所的な光音響場という利点を有する。したがって、パッチを適用して記録することができ、神経システムの機械的変調に関する洞察を得る新しいテストシステムを提供する。
このように、本開示は、ＴＦＯＥ１００刺激を単一ニューロン上で記録するパッチクランプ３７１２と統合する。例示的な例として、これは、光音響単一ニューロン刺激に対する直接的な電気応答を検出するために、マウスの皮質スライス上で実行され得る。図３７Ａ～Ｂは、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン３７１５及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロン３７１４を標的とする、マウス脳スライス内のＴＦＯＥ１００と一体化されたパッチクランプ３７１０の２光子画像を提供する（パッチピペット３７１８は、細胞内電極溶液中のシアン緑色蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を使用して図３７Ｂで視覚化されている）。図３７Ａに示すように、特定の細胞型の視覚化を助けるために、ＧＡＤ２介在ニューロンにおいてｔｄＴｏｍａｔｏを発現するマウスからの脳スライスが提示される。したがって、ＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性抑制性介在ニューロン３７１４及びＧＡＤ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ陰性錐体ニューロン３７１５を選択的に標的にすることができる。ＴＦＯＥ１００は、パッチピペット３７１８と統合して、脱分極を誘導し、標的ニューロンにおける活動電位の生成を引き起こすことができる。
また、図３７Ｃ～Ｆに示されるように、ニューロン膜電圧は、ＴＦＯＥ１００刺激時に前例のない安定性で正確に測定することができる。本開示の実施形態によれば、電流クランプ３７１２モード下の興奮性錐体細胞３７１４について、５μｍでのＴＦＯＥ刺激の直後に一連の活動電位を観察することができる（図３７Ｃに示すように）。図３７Ｃ及びＤは、約５μｍ（図３７Ｃのグラフ線３７３０）及び約１０μｍ（図３７Ｄのグラフ線３７４０）の距離でのＴＦＯＥ刺激（５ミリ秒）時の興奮性錐体細胞における膜電圧応答のグラフである。この結果は、図３４Ａ～Ｂ及び３５Ｄに示されるように、蛍光変化におけるΔＦ／Ｆが１００％を超える以前のカルシウムイメージングと一致している。ＴＦＯＥがニューロン３７１４及び３７１５から５～１０μｍ離れたところに移動すると（図３７Ｃ及びＤ）、活動電位が閾値以下の脱分極に道を譲ると考えられ、これは組織内の音場の閉じ込めが高いことを示している。
次に、本開示は、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性介在ニューロンを標的とすることを含む。図３７Ｅ及びＦは、膜電圧－７５ｍＶ（図３７Ｅのグラフ線３７５０及び３７５２）及び－４０ｍＶ（図３７Ｆのグラフ線３７６０及び３７６２）における、約５μｍでのＴＦＯＥ刺激時の抑制性介在ニューロンにおける電圧応答のグラフである（レーザー：１１．４ｍＷ、１．７ｋＨｚ、持続時間５ミリ秒）。ＴＦＯＥは、－７５ｍＶに保たれた抑制性介在ニューロンにおいて閾値下脱分極を誘導し、刺激後の経時的な電気応答は２つの成分を示した（図３７Ｅの３７５０）。図３７Ｅの最初の鋭いピーク３７５０は、音響波による膜の完全性の直接の中断によるものである可能性があり、次の広いピーク３７５２は、内向きチャネル電流による可能性が高く、イオンチャネルの関与の可能性を示している。－４０ｍＶ近くまで正の電流を注入することによって膜が脱分極されると、ＴＦＯＥ刺激時に３つの活動電位の短い列３７６２が観察された（図３７Ｆ）。音響刺激に対する興奮性錐体ニューロンと抑制性介在ニューロンの異なる応答は、これら２つの細胞型に固有の活動電位閾値や、音響放射力に対して異なる応答ダイナミクスを持つ機械感受性イオンチャネルの分布など、複数の要因によって寄与されている可能性がある。これにより、ＴＦＯＥ１００は、パッチクランプ３７１２記録と互換性のある前例のない安定した超音波源を提供し、音響誘発ニューロン刺激のメカニズムを明らかにすることが期待される。
テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）は、ナノ秒レーザー、先端が加工された光ファイバー、光音響コーティング、及び光熱効果を最小限に抑えて排除するための一連の動作パラメーターで構成されている。レーザーパルスによって励起されると、コーティングされた先端は光音響効果によってファイバー先端で局所的に全方向性音響波を生成できると考えられている。生成された音響波は、ＴＦＯＥ先端から１００μｍ未満の距離内に高度に局在しており、単一ニューロンの精度でニューロンを活性化するために利用できる。さらに、ファイバー先端は、単一ニューロンからサブミリメートル解像度までの幅広い解像度を提供するように設計でき、パッチクランプを介した単一ニューロン活性化の電気生理学的記録と連携して動作できる。
注目すべきことに、ＴＦＯＥ１００は、１００μｍ未満の精度で神経調節をデリバリーする能力において新規である。本開示のファイバー光音響発生器は、他のファイバー光音響発生器よりも発生する熱がはるかに少なく、効果的な超音波を生成できることが想定される。さらに、ＴＦＯＥは、ファイバー先端から１００μｍ未満の距離内に限定された局所的な超音波場を生成する。これは、他のファイバーベースの光音響デバイスよりも緊密である。音響強度が距離にわたって急速に減衰することを可能にする全方向音響伝播機能と併せて、ＴＦＯＥは高い空間精度でより効果的かつ効率的に神経活性化を生成できる。
本開示によれば、ＴＦＯＥはコンパクトな１０３０ｎｍ、３ナノ秒レーザーと、直径２００μｍ、先端テーパー付きの０．２２ＮＡマルチモーダルファイバーと、テーパー状ファイバー先端の層コーティング（コーティングされた先端全体の直径は、厚さ１０～１００μｍの範囲になる）から構成される。光音響プロセスを通じて、パルスレーザーエネルギーはＴＦＯＥ先端で生成される音響波に変換され、その後、その音響波が先端付近のニューロンを興奮させる。ＴＦＯＥコーティングは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中に５％から１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料であり得ることが想定される。
本開示では、その高い光吸収効率及び熱伝導効率により、ＴＦＯＥを構成するカーボンナノチューブがレーザーを完全に吸収し、熱に変換できることが意図される。その後、熱は周囲のＰＤＭＳに伝達され、全方向に伝播する光音響波が生成される。このように、ＴＦＯＥは光音響効果を利用して、約２０μｍの空間閉じ込めで音響波を生成し、超音波源に対して前例のない高い空間分解能を提供する。
さらに、本開示のＴＦＯＥは、繊維工学、材料の変更、及び新規な堆積方法によって達成される、空間分解能及び光音響変換効率の両方の改善をもたらす。本開示によれば、ＴＦＯＥによって生成される光音響波は、個々の培養ニューロンを直接活性化し、細胞内カルシウム過渡状態を生成することができる。これにより、ＴＦＯＥはファイバー先端の周囲半径２５μｍ以内のニューロンを活性化し、従来のピエゾベースの低周波トランスデューサーや以前のＴＦＯＥデバイスを上回る単一ニューロン分解能を実現する。
このようにして、ＴＦＯＥは単一細胞や軸索や樹状突起などの細胞内構造に音響刺激を与えることができる。時間的には、１マイクロ秒の持続時間の単一の音響パルスは、望ましいニューロン刺激、又は成功した神経調節のための既知の最短持続時間の音響刺激を達成することができる。重要なのは、ＴＦＯＥによって生成される近接場音響波は、無視できる程度の光熱効果を誘導しながら、全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞応答を同時に監視しながら、光音響刺激を可能にすることができるということである。さらに、ＴＦＯＥ先端コーティング構造、形状及び材料を変更して、さまざまな超音波空間伝播パターン、異なる超音波強度及び周波数を達成できることが考えられる。
本開示の実施形態によれば、電気刺激、超音波刺激、及び光遺伝学的刺激治療は、ＴＦＯＥ１００を介して光音響周波数をデリバリーすることによって神経突起伸長を促進することができる。これは、損傷が発生した場合に神経組織を機能的に修復するための重要なプロセスである。したがって、本開示の光音響プロセスは、神経活動の非遺伝的な時間的及び空間的に正確な刺激をもたらす。本開示の実施形態によれば、ファイバーベースの光音響エミッター１００（ＴＦＯＥ又はＴＦＯＥ）は、インビトロ及びインビボの両方で神経刺激において光音響効果を使用する実現可能性を表わす。図３９のニューロン３９１０は、一次ニューロンがオレゴングリーンで染色されているビトロカルシウム応答を介した結果であることを示している。ＴＦＯＥ１００と同様に、図４０Ａの３８４６を介して測定されるＴＦＯＥ３８００は、光音響刺激がインビボＬＦＰ応答に適用される場合、図４０Ｂの４０２０において同様に示されている。両方について、本開示の光音響プロセスを介して神経刺激を確実かつ繰り返し適用して、神経突起伸長及びその後の神経組織の修復を促進することができる。
特に、ＴＦＯＥ１００は、細胞の変調及び再生の目的で、パルス光エネルギーを超音波パルスに変換できることが想定される。この光音響材料は、拡張マトリックス内の光吸収体で構成することができ、フィルムや３Ｄ構造などのさまざまな設計で使用できることが考えられる。生成された超音波は、ＴＦＯＥ材料の近くに配置されたさまざまなタイプのニューロンなどの細胞を刺激したり、材料が集束超音波を生成するように設計されている場合は組織内のニューロンを刺激したりできる。
本開示の実施形態によれば、ヒドロゲルの土台は、ナノ複合アプローチを介して光音響機能と統合され、ニューロンの再生を可能にする。ヒドロゲルは、ニューロン培養に使用される場合、シルクフィブロインによって神経成長をサポートし、制御可能な生分解速度、調整可能な薬物負荷能力、光学的透明性、及び調整可能な機械的特性も提供する。さらに、カーボンナノチューブは、効率的な光音響剤として機能することができる。カーボンナノチューブを神経刺激に使用すると、高い光から音への変換効率が得られる。さらに、広帯域の光吸収により、将来の用途でレーザーシステムを柔軟に選択できるようになる。カーボンナノチューブは毒性が最小限であり、生体光音響イメージングの用途における確認に役立つ。
本開示の実施形態によれば、ＰＥＧ官能化は、繊維ベースの光音響エミッター１００を構成するＣＮＴ／シルクフィブロインフィルムの全水性製造方法７００を可能にする。シルクフィブロイン７１０は、図７に示すように、型に応じて、シルク溶液７３０（２ｗｔ／ｖ％）と官能化ＣＮＴ溶液７４０（２０～１００μｇ／ｍｌ）を混合することによって水溶液７２０に抽出され、続いて、生成物を７５０℃でキャスティング及び乾燥させて、それぞれＣＮＴ／シルクフィルム７６０又はＣＮＴ／シルクロールを製造した。ＰＥＧ官能基化により、ＣＮＴ水分散性が向上し、毒性が軽減された。表面機能化の結果は、図８のゼータ電位８００でうまく確認できる。
本開示の別の態様によれば、広帯域音響波は、ＣＮＴ／シルクフィブロインフィルムによって生成され得る。例えば、図９は、パルスレーザー９１０を介してマルチモード光ファイバー９１４を介してＣＮＴ／シルクフィルムにデリバリーされる、パルス幅３ｎｓの１０３０ｎｍレーザー９１０を示しており、照射面積は約０．０５ｍｍ2である。音響波９１２は、１０ＭＨｚのトランスデューサーを使用して特性評価され、オシロスコープ９２０によって記録された。その結果、音響パルス幅１μｓ、広帯域中心周波数１．２ＭＨｚ、圧力０．２６ＭＰａの光音響波９１２は、図１０Ａのグラフ線１０１０に示すように、１４．７μＪのパルスエネルギーで生成された。図１０Ｂのグラフ線１０２０は、それぞれ時間及び周波数の関数として示されている。光音響刺激には適切な圧力が必要であり、埋め込まれたＣＮＴの濃度とレーザー出力を操作することで制御できることに留意されたい。これを測定するために、以下が計算される。
式中、
であり、ｌは固有長さ、Ａは光吸収係数、Ｆはレーザーフルエンス、βは体積熱膨張係数、νは音速、Ｃpは比熱容量である。光吸収材料として、図１１のグラフ線１１１０（ＣＮＴ濃度μｇ／ｍＬの関数としてパルスエネルギーを７５μＪに固定）及び図１２のグラフ線１２１０（パルスエネルギーμＪの関数としてＣＮＴ濃度を２０μｇ／ｍＬに固定）に見られるように、埋め込まれたＣＮＴの濃度が高いほど、吸収係数が高いため、より強い音響波が発生する。
本開示の実施形態によれば、生体適合性及び無視できるほどの熱影響は、神経組織の光音響刺激を介して確認され得る。図１３Ａは、製造されたＣＮＴ／シルクロール又はフィルムをガラス対照群と比較したときの、ニューロン／面積の関数としてのインビトロ形態を確認するグラフ１３１０である。図１３Ｂは、製造されたＣＮＴ／シルクロール又はフィルムをガラス対照群と比較したときの、全長／面積の関数としてインビトロ形態を確認するグラフ１３２０である。図１３Ｃは、コントロール、ＣＮＴ／シルク、及びシルクフィルム＋ＣＮＴグループの細胞生存率をそれぞれ確認するグラフ１３３０である。
図１４は、生後１０週目のマウスのインビボ組織学における神経組織の光音響刺激による生体適合性及び無視できる熱影響をＨ＆Ｅ染色で確認する画像１４００を表わす。４倍と４０倍の倍率レベルでそれぞれ５０μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬに曝露した場合、結果は３日目と３０日目の間隔で記録された。さらに、図１５は、１５００における生体適合性及び無視できるほどの熱影響を確認するパルス列を示す概略図を表わす。繰り返し率は１．７ｋＨｚ、持続時間は３ｍｓ／５パルス、レーザーパルスエネルギーは５３μＪに設定される。図１６は、経時的な温度の関数として、グラフ線１６１０におけるＣＮＴ／シルクの性能とグラフ線１６１２における単離されたシルクの性能を示すグラフであり、ＣＮＴ／シルクの組み合わせの改善された光音響能力をさらに裏付ける。
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＣＮＴ／シルクフィルムによって生成された光音響波は、神経活動を確実かつ繰り返し刺激する。そうするために、図１７～２０に示すように、５ｍｓ（８パルス）で１４．７μＪ（２９．４ｍＪ／ｃｍ２）のレーザーパルスエネルギーを、４日目にトランスフェクトされた一次皮質ニューロンＧＣａＭＰ６ｆに適用することができる。図１７は、光（ＣＮＴ／シルク光＋）にさらされたときのＣＮＴ／シルクフィルム１６１０の性能の１００μｍの画像であり、光照射により活性化領域１７１０が決定される（破線１７１２はレーザー照射領域を示す）。図１８は、光（シルク光＋）にさらされたときのシルクフィルム１６１２の性能の１００μｍの画像であり、光照射が活性化領域１８１４を決定する（点線はレーザー照射領域１８１６を示す）。これをさらに説明するために、図１９及び２０は、ＣＮＴ／シルクの性能について、光にさらされた場合をグラフ線１９１０、光にさらされていない場合（ＣＮＴ／シルク光－）をグラフ線１９１２、シルクフィルムが経時的なΔＦ／Ｆ０の関数として光にさらされた場合をグラフ線１９１４で示すグラフである。これにより、光音響刺激により確実かつ繰り返し神経活性化を誘導できることが確認でき、また、神経機能が損傷していないことも確認できる。
本開示の別の態様によれば、光音響刺激は、神経突起伸長を促進することができる。例示的な実施形態は、図２１～２６に示すように、ラットの後根神経節（ＤＲＧ）外植片を介して観察することができる。図２１は、１．７ｋＨｚ及び５ｍｓのパラメーターでラット後根神経節外植片に経時的に適用される光音響刺激の概略図２１００を含み、パルス列は２分ごとに１時間適用される。図２２は、それぞれ、ＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するＣＮＴ／シルク光＋の従来の画像及び挿入画像を含む。図２３には、ＣＮＴ／シルク光の従来の画像と挿入画像が含まれており、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有する。図２４は光照射を受けたときの、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するガラス光制御グループの従来の画像及び挿入画像を含む。図２５は、光照射を受けていないときの、それぞれＮＦ、ＤＡＰＩ、及び統合された視点を有するガラス光制御グループの従来の画像及び挿入画像を含む。
例示的な例を続けると、図２６は、面積の関数としての図２２～２５のグラフである。適用すると、光音響刺激ＤＲＧ（１８．１９±１．３７ｍｍ２）は、ガラスコントロールグループ（１０．４８±５．０６７ｍｍ２）と比較して、カバー面積が１．７４倍増加した。さらに、光音響刺激は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現を高めることができる。例示的な実施形態として、光音響刺激の２４時間後、それぞれ図２７及び２８に示すように、２つの神経栄養因子、ＢＤＮＦ及びＮＧＦをＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって測定した。その結果、光音響刺激ＤＲＧのＢＤＮＦ濃度（８６．５２±１７．０７ｐｇ／ｍｌ）は、ガラス対照群（４４．２０±２２．３１ｐｇ／ｍｌ）と比較して１．９６倍の増加を示した。ＮＧＦの発現量に有意差は認められなかった。このようにして、光音響刺激によって誘発される活動電位とそれに続くカルシウム流入は、ＢＤＮＦ経路に影響を与え、神経突起の伸長を促進する。
本開示によれば、実証された高い小型化レベルを達成することによって、調整可能な光音響エミッターを低侵襲性の医療用途に展開することができる。例えば、前述のファイバーベースの光音響デバイス１００は、焦点病変に近接した注射針又はカテーテルに挿入することができ、これにより、従来の集束超音波によって引き起こされる精度及び振幅の低下の問題を克服することができる。さらに、ＴＦＯＥ１００の先端の形状により、凹面構造を介して周波数波を集束させることができることが想定されている。図２９は、時空間符号化及び復号化を可能にする多機能ニューラルインターフェース２９００が対象を治療するために使用される例示的な例を表わす。この方法は、図３０の図にさらに示されており、コンピュータ３０１０は、２９００を介して脳３０１４に光音響刺激３０１２を提供し、その後、電気記録フィードバック３０１６を受信する。あるいは、図３１Ａ～３１Ｂは、光媒介低侵襲性ＰＮＳ刺激用の埋め込み型カフ３１００が、それぞれ２００μｍ及び１００μｍで対象を治療するために使用される例示的な実施形態を表わす。それにより、ＭＥＣＨエラストニクス３１１０は、神経線維３１１２に光音響刺激をもたらす。さらに、本開示の方法及びデバイスは、超音波パラメーターの修正を通じて、各焦点標的において安定で可逆的なソノポレーションを生成できることが想定され、これにより、生体医療用超音波用途、特に薬物デリバリーや遺伝子導入の場合、既存の技術では実現できない正確な制御が可能になる。図３２は、官能化ステップ３２１０、キャスト及びアニーリングステップ３２２０、及び得られるＣＮＴ／シルク３２３０製品の概要を提供する。図３３は、光音響刺激による興奮したニューロン３３１０の前後の画像を提供する。さらに、ＴＦＯＥ１００は電磁干渉の影響を受けないため、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性があることに留意されたい。
本開示では、約２０μｍの空間閉じ込めで音響波を生成し、単一ニューロン及び細胞内精度での光音響神経変調を可能にするＴＦＯＥが提示される。ＴＦＯＥ１００によって生成された近接場音響波は、光音響刺激と全細胞パッチクランプ記録を使用して細胞反応の同時モニタリングを可能にし、これは、従来の超音波刺激では困難であると報告されている。ＴＦＯＥ１００をエクスビボ脳スライス電気生理学と組み合わせることにより、本開示は、興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンに対する音響刺激に対する細胞型特異的応答をもたらす。
本開示の実施形態によれば、光音響効果は、生物医学的イメージングに広く使用されており、さらに最近では、神経調節のために研究されている２６。以前に報告された光音響刺激デバイスと比較して、ＴＦＯＥ１００は、新しいデバイス設計と革新的な製造方法を適応させることで新しい機能を提供する。ＴＦＯＥ１００の高効率光音響変換層は、熱膨張性ＰＤＭＳマトリックスに埋め込まれた溶解度が向上したカーボンナノチューブでできており、光から音への変換効率が大幅に向上する。さらに、パンチスルーコーティング法により、非常に小さなテーパー状のファイバー先端を優れた制御性と信頼性で均一にコーティングできる。
ＴＦＯＥ１００の重要な利点は、その前例のない空間分解能であることに留意されたい。経頭蓋超音波神経調節は、げっ歯類、非ヒト霊長類、及びヒトで実証されている。ただし、波の回折限界により、集束超音波神経変調では数ミリメートルの空間精度が得られ１９、これにより、小動物の部位特異的調節や単一ニューロンの刺激が禁止され、細胞型特異的応答を研究する能力が欠けている。この制限を克服するために、ＴＦＯＥ１００は、音響波長と比較して１０００分の１小さく、約２０μｍの空間分解能で１ＭＨｚで局所音場を生成する。本開示は、局所音場を利用して、単一細胞及び細胞内精度での神経刺激を実証し、神経細胞体、樹状突起及び軸索を特異的に標的とすることによる細胞内構造のＴＦＯＥ刺激に対する示差的応答を明らかにする。
パルスレーザーの制御性を利用することにより、本開示は、単一細胞レベルでの光音響刺激の累積効果を特定し、超音波刺激が有効になるまで有限の持続時間にわたって統合され得ることを示す。ネットワークのない状態で単一ニューロンの活動を評価する機能を備えたＴＦＯＥ１００の結果は、個々のニューロンの固有の信号解釈としての刺激蓄積効果をさらに確認する。
さらに重要なことに、本開示では、成功したＴＦＯＥ刺激が、１マイクロ秒の音響パルスを生成する３ナノ秒の単一レーザーパルスで達成されたことが意図される。これまでに、１０の音響サイクルと全体の持続時間２２．７マイクロ秒のシングルトーンバースト超音波は、ニューロン変調のための最も短い音響刺激として報告されている。したがって、本開示は、現在の音響刺激技術の時間分解能の大幅な改善を表わす。
さらに、本開示では、ＴＦＯＥ１００により、音響刺激と全細胞パッチクランプ記録との統合が可能になることが意図される。ＴＦＯＥ刺激による脳スライス内の単一ニューロンの電気生理学的記録は、ＴＦＯＥ刺激に対する興奮性錐体ニューロンと抑制性介在ニューロンの異なる反応を明らかにした。異なる応答は、固有の閾値の違い、又は異なるイオンチャネルの分布の変動に起因する可能性がある。さらに、抑制性ニューロンは、興奮性ニューロンと比較して、活動電位発生の閾値の上昇を示した。これは、抑制性ニューロンの閾値が錐体細胞よりも低い電気刺激を使用した発見とは対照的である。この不一致は、音響刺激と電気刺激のメカニズムの違いに起因すると考えられている。したがって、例えば、イオンチャネルを薬理学的又は遺伝的に変更することによる音響刺激中のイオンチャネルの関与に関するさらなる研究は、機械的神経調節の電気生理学的メカニズムに新しい洞察を提供する。
本開示のデバイスの方法によって提供される遺伝子フリーの単一細胞刺激技術は、ニューロン刺激のメカニズム、及び個々のニューロンがネットワーク内でどのように連携してニューラル計算を実行するかを理解するための新しいツールを提供する。ＴＦＯＥ１００は金属コンポーネントを一切使用していないため、電磁干渉の影響を受けず、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と互換性がある。ＭＲＩは、ヒトの患者の行動と疾患の理解に向けた将来の研究に期待されている。
前述の応用に加えて、神経調節は、脳を理解し、疾患を治療するための貴重なプラットフォームであることに留意されたい。脳や病気を解読するには、行動している被験者の脳活動を正確に操作することが重要である。最適には、変調と読み取りの両方が非侵襲的である。解決策として、超音波神経変調（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｎｅｕｒｏ－ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ、ＵＳＮＭ）は、低周波超音波が非侵襲的に脳活動を調節できるため、新しい非侵襲的神経変調技術である。ＵＳＮＭは、ＴＭＳ及びｔＤＣＳ（～ｃｍ）と比較して、より高い空間分解能（＜５ｍｍ）を持つと考えられている。しかし、ガイダンスが不足していると、正確な超音波神経調節が妨げられる。正確なＵＳＮＭには、ｍｍ未満の解像度でのリアルタイムガイダンスと脳回路の評価が必要である。このようなガイダンスを提供するために、本質的にＵＳＮＭと互換性のある超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ、ＵＳ）画像処理を行うことが理想的であると考えられている。
しかし、超音波は神経活動の感知と体積画像の提供には限界がある。例えば、血流を監視する経頭蓋ドップラー超音波（ｔＤＵＳ）は、認知科学の研究での使用に限定されている。ＵＳイメージングでは、体積モニタリングを実現するのが困難な断層画像（Ｂモード）のみが提供される。
したがって、研究や診療所での超音波神経調節には、標準化された体積測定のガイダンスが必要である。前述のことを念頭に置いて、ｆＭＲＩはＵＳＮＭを指導し評価するための最も適した候補である。これは、機能的磁気共鳴イメージング（ｆＭＲＩ）によって実現できる。ｆＭＲＩは、解像度が約２００μｍの非侵襲的体積機能イメージングである。したがって、ｆＭＲＩは、非侵襲的な神経調節のためのＵＳＮＭ（ｍｍレベル分解能）を導くための最良の候補である。
ただし、既存のＭＲＩ互換ＵＳＮＭツールは、研究者にとって制限されているか、アクセスできない。したがって、従来のＵＳＮＭを再設計するには、フェライトや金属コンポーネントをすべて取り除くなど、高度なエンジニアリングが必要である（ほとんどのＵＳトランスデューサーは、磁場を妨げるニッケル、フェライト、金などの材料を使用しているため）。さらに、これらの材料は干渉を最小限にするための電子部品のシールドを複雑にする。現時点では、新しいＭＲＩ対応ＵＳＮＭは限られている。これまでのところ、２０１６年にＦＤＡによってＩｎｓｉｇｈｔｅｃ（イスラエル、ハイファ、１９９９年設立）に対して承認されたシステムは１つだけである。現在、数千のＭＲＩシステムが使用されているが、世界中に設置されているシステムはわずか２１台である。さらに、コンパクトでポータブルなＵＳＮＭツールを作成することは困難である。ＤＢＳ（埋め込まれたパルス発生器から脳内の電極に電荷をデリバリーするために鉛繊維を利用することを含む）と同様に、ＵＳＮＭは症状の継続的な抑制を達成するために慢性的に適用する必要がある。したがって、コンパクトでポータブルな設計のＵＳＮツールが必要である。しかし、既存のＵＳＮツールは剛性が高く、大きなアンプが必要である。
したがって、非侵襲的でＭＲＩ互換性があり、ウェアラブルで広くアクセス可能な非侵襲性神経調節ツールを提供するという満たされていないニーズがある。本開示の実施形態によれば、ファイバーベースの光音響変換器（Ｆｉｂｅｒ－ｂａｓｅｄ Ｏｐｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ、ＦＯＣ）による光音響脳変調は、ＴＦＯＥ１００と同様の刺激をもたらす。例示的な例として、図３８Ａは、パルスレーザー３８１０がＦＯＣ３８００を介して神経突起組織３８５０に刺激をデリバリーするときの、ファイバーベースの光音響変換器（ＦＯＣ）による光音響脳変調の概略図を表わす。図３８Ｂは、ＦＯＣが光音響刺激を生成し、ＦＯＣ３８００を介して光音響信号３８１２を生成する際のＦＯＣの概略図を表わす。そうするために、パルスレーザー３８１０は、２００μｍのファイバー３８１４を介してデリバリーされ、それによって、ＴＦＯＥ１００と同様に、ＺｎＯ／エポキシ混合物拡散層３８１６及びグラファイト／エポキシ混合物吸収／膨張層３８１８と係合して、信号３８１２を生成する。これを説明するために、図３９Ａ～Ｃは、初代ニューロンをオレゴングリーンで染色した、培養初代ニューロンにおいてカルシウム過渡現象を誘導するＦＯＣ３８００の画像及びグラフ表示をもたらす。さらに、図４０Ａ～Ｂは、切断ツール３８４６及びＦＯＣ３８００を含む、マウスの脳においてインビボで神経活性化を誘導するＦＯＣ３８００の画像及びグラフィック描写をもたらす。ただし、ＦＯＣ３８００は侵襲的であるため、外科的特性があるため、常に最適であるとは限らない。
本開示によれば、ＡＭＲＩ互換のソフト光音響パッド（ＳＯＡＰ）を使用する非侵襲性神経変調システムは、この問題を解決する。図４１は、治療としてＡＭＲＩ互換ソフト光音響パッド（ＳＯＡＰ）を使用する非侵襲性神経変調システムの例示的な概要を提供する。ＳＯＡＰ４１００は、水４１４４、ＰＤＭＳ整合層４１４０、及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合層４１４２を利用して、神経突起組織に集束超音波治療を施す。図４２は、ＳＯＡＰ４１００がこの集束超音波４１２４を治療位置に提供する方法の例示的な概略図を提供し、同様にレーザーパルス４１１０及び光ファイバー４１１４によって可能になる。集束超音波４１２４は、ＳＯＡＰ４１００内の水の量を変更することによってさらに調整できる。図４３は、異なる超音波４１２４及び４１２５の波長をそれぞれ比較することによって、ＳＯＡＰ４１００がどのように適応焦点調整を提供できるかを示す概略図を表わす。
本明細書の例示的な実施形態によれば、この処理は、図４４Ａ～図４４Ｉに適用される。図４４Ａ～Ｃは、光音響放射における静的工学的位相プロファイルを表す湾曲光音響フィルムによる集束超音波の発生に関する例示的な実施形態を示す画像を提供する（スケールバー：５ｍｍ。ＵＳ：超音波（緑）、ＯＡ：光音響（赤））。図４４Ｄ～Ｆは、ラットの頭蓋骨が存在しない場合を示す生成された超音波画像を提供し、図４４Ｇ～Ｉは、ラットの頭蓋骨が存在する場合を示す画像を提供する。
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰ４１００（例えば、焦点で４ＭＰａ（骨なし）、＜０．６５ＭＨｚの超音波放射を伴う）の設計及び製造が意図される。さらに、経頭蓋ＵＳ送信には０．６５ＭＨｚ未満の超音波が必要であると考えられている。焦点での１ＭＰａは、損傷を与えることなくヒトの脳の反応を誘導するのに十分であることが示されている。さらに、ヒトの頭蓋骨による圧力レベルの４倍の減衰が予想される。図４５は、ＳＯＡＰ４１００システムのセットアップダイナミックの概略図を提供する。レーザーパルス４１１２は、それぞれＦＧ１及びＦＧ２を介して、光ファイバー４１１４を介してＳＯＡＰ４１００治療領域上の空気４１２６に前記パルス４１１２をもたらす。ＳＯＡＰは、調整可能な水４１４４、ＰＤＭＳ整合層４１４０、及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２からなる。
例示的な実施形態を続けると、成形によるＳＯＡＰ４１００内に挿入することができるＳＯＡＰパッド４１２２の製造が、ＳＯＡＰパッド４１２２の製造プロセスの概略図を提供する図４７を介して指示される。３０％ＣＮＦの溶液を半径２５ｍｍの金型に注入する。溶液を金型内で焼成して形成し、ＰＤＭＳを添加して発光ＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２を形成する。得られた生成物４１４２には、追加のＰＤＭＳが注入され、ＰＤＭＳ整合層４１４０と共に剥離され、ＯＤにカットされ、ＰＤＭＳ整合層４１４０及びＰＤＭＳ＋ＣＮＦ混合物層４１４２を含むＳＯＡＰパッド４１２２を形成する。ＳＯＡＰ４１２２は、図４６に示すように、さまざまなターゲットに合わせてさらにスケーリング及び調整でき、これは、想定されるヒトとマウスの被写体の直径と焦点距離パラメーターの概要を表形式で提供している（ヒト：直径３０ｍｍ、焦点距離２５ｍｍ、マウス：直径５ｍｍ、焦点距離３ｍｍ）。ＳＯＡＰ４１００はソフトポリマーベースであることが想定されている。
本明細書の実施形態によれば、光音響刺激の所望の強度は、型の直径及び焦点距離に応じて変化するはずである。図４８は、異なる厚さの超音波波形に関するシミュレーションデータのグラフ表示を提供する。図４９は、対応する周波数スペクトルに関連するシミュレーションデータのグラフ表示を提供する。図５０は、ヒトの頭蓋骨の厚さが６ｍｍであり、横方向のＦＷＨＭが４．６ｍｍである内部焦点に関するシミュレーションデータの画像を提供する。
これにより、マウスの脳スライス上でエクスビトロでＳＯＡＰ４１００を利用することができる。例示的な実施形態によれば、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１４～１６週齢）を標本として利用することができ、定位固定マウスの脳マップに応じて、厚さ０．５ｍｍの１２枚の連続する冠状画像スライスに焦点を合わせ、最初のスライスはブレグマの２ｍｍ吻側に配置される。図５１は、ＭＲＩチャンバ４１３６内でレーザーパルス４１１２、光ファイバー４１１４、及びＭＲＩユニット４１３０をそれぞれ介してエクスビボで神経変調を受けている拘束されたマウス被験者４１２８の図を表わす。パラメーターは、時間分解能１秒のグラディエントエコーエコープラナーイメージング（ＧＥ－ＥＰＩ）シーケンス（ＴＲ／ＴＥ＝１，０００／１２ｍｓ、フリップアングル６０°、マトリックス８０×３５、１平均）を使用したＢＯＬＤ－ｆＭＲＩイメージングが想定されている。さらに、使用する各マウスで１ｋＨｚのレーザー繰り返し速度で２００ｍｓＳＯＡＰ変調が実行されることが想定されている。
さらに、ＳＯＡＰ４１００は、自由に動くマウス被験者の神経調節によってインビボに非侵襲的に適用できる。図５２は、非侵襲的なインビボ神経調節を受けている自由に動くマウス被験者４１２９の図を表わす。ＳＯＡＰ４１００は、自由に動くマウスの実験に着用できるほど軽量でコンパクトであると考えられている。ＳＯＡＰ４１００は、レーザーパルス４１１２、光ファイバー４１１４、及びＳＯＡＰ４１００を介して、マウスの左半球の一次運動野及び二次運動野を標的とすることが想定されている。ＳＯＡＰ４１００がオンの場合、コントロールグループと比較した場合、動きのパターンが変化すると予想され（例えば、ＳＯＡＰ４１００がオンの場合の時計回りの動き）、カメラ４１３４で監視できる。
図５３は、ＳＯＡＰ４１００デバイスを要約した概略図を表わす。ＳＯＡＰ４１００は、ＭＲＩと互換性のある光動力及びポリマーベースの超音波エミッターであり、初めての非侵襲性光音響インビボ脳変調である。さらに、ＳＯＡＰ４１００は、従来の光音響エミッタ（約数十ＭＨｚ）とは異なる低周波超音波の生成を可能にする。ＳＯＡＰ４１００は、調整可能な水量と成形により、それぞれ集束超音波発生における調整可能な機能と適用性を備えている。このようにして、ＳＯＡＰ４１００は、ＭＲＩ互換の集束超音波を使用して、リアルタイムのＭＲＩガイドによるＢＢＢ開口を可能にする。さらに、ＳＯＡＰ４１００は柔軟で、空気圧ポンプなどのアクチュエータを使用して音響焦点を調整するように設計できる。
本開示の別の態様によれば、神経回路を解読し、神経疾患を治療するための強力なツールとしての神経調節の使用がさらに詳細に説明される。経頭蓋集束超音波（Ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ ｆｏｃｕｓｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ、ｔＦＵＳ）は、サブＭＨｚの周波数によりミリメートルスケールの空間分解能を提供する。ただし、小動物の脳のサブ領域をターゲットにする場合は、ミリメートル未満の精度が必要である。本開示は、ろうそくのすすナノ粒子をポリジメチルシロキサン球面に埋め込むことによって製造された軟質光音響パッド（ＳＯＡＰ）によって生成される光学駆動集束超音波（ＯＦＵＳ）を含む。ＳＯＡＰは１５ＭＨｚで横方向分解能６６μｍの超音波焦点を生成できるが、これはｔＦＵＳよりも２桁小さい。本開示は、ＯＦＵＳが、マイクロ秒未満の単一サイクル及び０．０６Ｊ／ｃｍ２で、神経刺激に首尾よく使用されたｔＦＵＳと比較して２桁少ない超音波エネルギーでインビトロで神経刺激を達成することを実証する。さらに、本開示は、インビボでのマウス運動皮質におけるミリメートル未満の経頭蓋刺激を実証する。ＯＦＵＳは、ミリメートル未満の精度を非侵襲的に提供することで、インビボでミリメートル未満の精度で非侵襲的な神経調節を行う光学駆動集束超音波を利用して、神経科学の研究と神経疾患の治療に新しい道を開く。
本明細書の例示的な実施形態によれば、脳機能がどのように行動を制御し、その機能不全が疾患を引き起こすかを理解するには、神経活動を高精度で調節するモダリティが必要である。小動物では、ミリメートル未満の精度の神経調節ツールを使用して、少数のニューロン集団を調節することによって脳のサブ領域をマッピングできる。電気刺激や光遺伝学などの侵襲的方法は、ミリメートル未満のスケールで空間分解能を提供できる。電気刺激ツールは、すでに神経調節研究と疾患治療におけるゴールドスタンダードとなっている。例えば、脳深部刺激は、埋め込まれた電極によっていくつかの病気の効果的な治療を実現する。パーキンソン病、うつ病、てんかんの臨床治療用として承認されている。しかし、現在の広がりにより、ターゲティングの正確な制御が制限されている。光遺伝学は、光を使用してトランスフェクトされたニューロンをトリガーすることにより、標的細胞タイプに比類のない細胞内空間分解能と特異性を提供し、神経科学の研究を進歩させた。マウスの経頭蓋光遺伝学はさらに手術を回避し、５～６ｍｍの貫通深さで横方向に約０．８から１ｍｍの脳領域を刺激することに成功する。ただし、経頭蓋光遺伝学の光透過率は７ｍｍで約０．０２％である。従来の光遺伝学と経頭蓋光遺伝学はどちらも、ヒトの脳での使用がまだ承認されていないウイルスのトランスフェクションに依存している。非侵襲的な方法は、手術のリスクを回避しながら効果的な神経調節を提供する。経頭蓋直流刺激（ｔＤＣＳ）と経頭蓋磁気刺激（ＴＭＳ）は非侵襲的であるが、使用される電磁波の波長が長いため、得られる空間分解能はセンチメートルレベルである。新しい経頭蓋集束超音波（ｔＦＵＳ）は、マウス、ラット、ウサギ、サル、さらにはヒトなどのさまざまなモデルで高精度の非侵襲的神経調節法として実証されている。パルス超音波処理と連続超音波処理の両方が採用されているが、パルス超音波処理の方が神経反応を引き出すための刺激閾値が低いため、より一般的である。組織損傷の可能性を最小限に抑えるために、１００Ｗ／ｃｍ２以内の低強度が使用されている。高い経頭蓋効率を達成するために、空間分解能が数ミリメートルに制限される約１ＭＨｚ以下の低い超音波周波数のｔＦＵＳが推奨される。ヒトの場合、この空間分解能により、視床の個々の核に対応する刺激量を達成できる。小動物の脳のサブ領域を数百μｍのスケールでターゲットにするには、ミリメートル未満の精度を備えた非侵襲性の神経調節ツールが必要である。
光音響効果は、超音波を生成する別の方法であることに留意されたい。光音響材料は短い光パルスを吸収し、それを一時的な温度上昇と熱膨張に変換し、その結果、超音波パルスが生成される。最近の研究は、高空間分解能の神経刺激のためのファイバーベースの光音響エミッター（ＦＯＥ）を使用してこれを実証した。これらのファイバーベースの光音響エミッターでは、ＴＦＯＥ１００によって前述したように、光音響材料を光ファイバーの先端にコーティングすることができ、コーティングされたファイバーは高度に局所的な超音波の点源として機能し、サブミリメートルから数十μｍまでの解像度を提供し、細胞内構造を選択的に活性化することができる。ただし、局所的な神経調節に近接場超音波を利用するため、ファイバーベースの光音響エミッターは神経組織に外科的に埋め込む必要があり、経頭蓋的に適用することはできない。
本開示の例示的な実施形態によれば、ミリメートル未満の精度で非侵襲的な神経調節のための光学駆動集束超音波（ＯＦＵＳ）５４００が提示される。以前に提示されたＳＯＡＰ４１００に加えて、フィルムは、非侵襲的な変調のための集束超音波を生成するように湾曲することができる。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）とカーボンベースの吸収体をベースにした湾曲したＳＯＡＰ５４１０を製造することができ、より厳密な空間集束と焦点圧力の最大化が可能になる。したがって、曲率の直径は、理論上の限界（ＮＡ＝１）に近い開口数（ＮＡ＝０．９５）に達するように調整できる。光音響効果によって光子を音響波に効率的に変換するために、ＳＯＡＰ５４００には、熱収縮膜（ＨＳＭ）、ポリジメチルシロキサン混合カーボンナノチューブ（ＣＮＴ－ＰＤＭＳ）、ＰＤＭＳ混合カーボンナノ粒子（ＣＮＰ－ＰＤＭＳ）、ＰＤＭＳ積層ろうそくのすす（ＣＳ－ＰＤＭＳ）など、４つの異なる光音響材料に基づいて設計された曲率を含めることができ、製作してテストすることも可能である。したがって、それらの光音響変換効率は、製造されたこれらのＯＦＵＳの焦点の圧力を測定することによって比較することができる。ＣＳ－ＰＤＭＳ ＯＦＵＳ５４００を使用すると、本開示は、０．６２ｍＪ／ｃｍ２のレーザー入力で超音波焦点で約４８ＭＰａをもたらす。さらに、経頭蓋能力を備えた約６６μｍの空間分解能を持つＣＳ－ＰＤＭＳ ＯＦＵＳがさらに実証され、ｔＦＵＳによって提供される数ミリメートルの分解能から２桁の向上を達成する。カルシウムイメージングにより、本開示は、インビトロでの培養ニューロンにおいて、ＳＯＡＰ５４１０による直接的かつ経頭蓋単一パルス刺激を確実かつ安全に達成する。ＳＯＡＰ５４１０の総超音波エネルギー入力は、同様のレベルのニューロン応答を引き起こす従来の超音波トランスデューサーでデリバリーされるエネルギーよりも２桁少ない。免疫蛍光イメージングを使用して、本開示は、マウスの脳におけるサブミリメートルの刺激量を視覚化することを含む。さらに、本開示は、電気生理学的記録を使用して、インビボでＳＯＡＰ５４１０を用いてマウスの運動皮質を非侵襲的に刺激することによって機能的結果を検証することを含む。
本開示は、ＳＯＡＰ５４１０の製造及び光音響効率の最適化をさらに詳細に表わす。ミリメートル以下の精度で集束超音波場を生成するために、生成される音場を予測し、ＳＯＡＰ５４１０の幾何学的設計を最適化するための数値シミュレーションが示されている。図５４Ａは、ＳＯＡＰ５４１０の概略図を示す。ナノ秒レーザー５４１２が、ＳＯＡＰ５４１０の底部から送出される。光音響効果は、湾曲したＳＯＡＰ５４１０の表面で超音波５４１４を生成し、湾曲上の異なる角度から放射された波５４１４は、同位相でその幾何学的中心５４１６に到達する。幾何学的中心５４１６は、ろうそくのすす５４１８を含み、ＰＤＭＳ層５４１９上に配置される。焦点距離２ｍｍは、超音波が頭蓋骨を貫通し、マウスの脳の皮質層に到達して刺激できるように設計されている。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）のｋ－ｗａｖｅツールボックスを使用して数値シミュレーションを実行して、生成される音場を計算できる。ＳＯＡＰ５４１０で生成されたＯＦＵＳ５４００は、適用シナリオを模倣するために、エアバッキングで水中に伝播する。したがって、炭素ベースの吸収体の報告されたデータに従って、中心周波数１５ＭＨｚと帯域幅２００％を設定できる。これにより、焦点距離と調整された半径と曲率直径が固定され、ミリメートル以下の精度が得られる。したがって、曲率直径と半径の比は、開口数（ＮＡ）に比例する。横方向の解像度は、横方向プロファイルの半値全幅として定義される。横方向解像度とＮＡの関係を図５４Ｂにプロットする。ＮＡが高いほど、横方向の解像度はより正確になる。図５４Ｂにおいて、オレンジ色の領域５４２０は、従来の超音波トランスデューサーにおけるＮＡの範囲を表わす。従来の単素子集束超音波トランスデューサーの製造プロセスでは、単結晶圧電材料に亀裂が生じるため、高いＮＡを達成することが困難であった。しかし、光音響材料では、同じ超音波周波数で従来のトランスデューサーが提供できる最良の横方向分解能の半分を提供するため、理論的限界に近い高いＮＡが実現可能である。
１５ＭＨｚで横方向の分解能を限界まで高めるには、理論上の限界に近い０．９５のＳＯＡＰの高いＮＡを選択できる。これにより、ＳＯＡＰ５４１０の半径は６．３５ｍｍに最適化され、曲率の直径は１２．２ｍｍに設定される。この幾何学的形状は、図５４Ｃ（これは、設計されたジオメトリを持つｋ波シミュレーションでＳＯＡＰ５４１０によって生成された音場の画像５４３０である）に詳述されているように、予想通り、曲率の中心にＯＦＵＳ５４００をもたらす。挿入図は音響焦点で拡大したもので、スケールバーは２００μｍである。生成されたＯＦＵＳは、－６ｄＢで７８μｍの横方向分解能、２０９μｍの軸方向分解能を備えている。この空間分解能は、小動物のサブミリメートル精度の神経刺激には十分である。
例示的な実施形態を続けると、本開示は、そのような高いＮＡがＯＦＵＳ５４００に高い横方向解像度を提供するだけでなく、焦点における高い焦点ゲインも提供することを表わす。横分解能の概念を音響分解能の光音響顕微鏡に適用することにより、ＯＦＵＳ５４００の横分解能は次の式で計算できる。
ここで、νは周囲音速、ｆは中心周波数である。この式により、ＯＦＵＳの理論的な横方向分解能Ｒ＿Ｌ＝７５μｍとなり、これはシミュレーション結果と一致する。さらに、高ＮＡ球面により、低いＦ値と高い焦点ゲインＧが得られる。これは、次の式に従って、焦点の圧力と球面上の圧力の比によって定義される。
この式において、ｆ，ｃ0，ｒ，及びｆNは、音響周波数、媒質内の音速、曲率半径、及びＦナンバー（ＳＯＡＰ５４１０の直径に対する曲率半径の比）を表す。水の減衰係数２．２×１０-3ｄＢ／（ｃｍ×ＭＨｚ2）を考えると、ＳＯＡＰ５４１０の有効焦点ゲインＧeff≒２８０を推定できる。この焦点ゲインは、ｆN＝１～４［１、３７～４１］の従来の超音波トランスデューサーの焦点ゲインと比較して５～９２倍高くなる。ＮＡを限界まで高めることにより、横方向分解能の精度を１５ＭＨｚで最大化することができ、従来の集束超音波トランスデューサーと比較して焦点の圧力を桁違いに改善することができる。
本明細書の例示的な実施形態によれば、光音響変換効率を最適化するために、ＨＳＭ５４４２、ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４、ＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４４６、及びＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を含む、記載された幾何学的設計に従ってＳＯＡＰを製造するための４つの材料の調製は、詳細は図５４Ｄに示されている。左から右、上から下に、熱収縮膜５４４２、カーボンナノチューブ－ＰＤＭＳ５４４４、カーボンナノ粒子－ＰＤＭＳ５４４６、及びろうそくのすす－ＰＤＭＳ５４４８を示す。スケールバー：５ｍｍ。ＨＳＭ５４４２の場合、弾性黒色ポリオレフィン自体が光吸収材と膨張材として同時に機能する。残りの３つの設計であるＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４、ＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４４６、及びＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８では、炭素ベースの材料が光吸収材料としてＰＤＭＳに埋め込まれており、拡張材料として機能する。これらは曲率面で混合物を形成し、光音響変換を最大化する。ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を製造する方法も本開示によって提供される。簡単に説明すると、金属球をろうそくのすすで１０～１５秒間コーティングし、ＰＤＭＳに浸す。次に、ＰＤＭＳを１１０℃で１５分間硬化することにより、このろうそくのすすの層をＰＤＭＳに転写する。金属ボールを除去すると、ＳＯＡＰのＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８が得られる。他のすべてのＳＯＡＰの作成方法については、後で説明する。
転写プロセスでＣＳとＰＤＭＳがよく混合されたマトリックスが生成されるかどうかを調査するには、ＳＯＡＰのＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を厚さ約２００μｍの薄層にスライスし、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して形態を検査する。厚さ２．７μｍのＣＳとＰＤＭＳからなる均一に混合された層が観察され、図５４Ｅの純粋なＰＤＭＳ層５４５２から分離されており、赤い破線がＣＳとＰＤＭＳの混合領域と純粋なＰＤＭＳ領域を分けている。スケールバー：１μｍ。この厚さは、ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８の最適な光音響変換のための理論上の厚さ２．１５μｍに非常に近い。ＳＥＭ画像から、ＣＳナノ粒子の直径は約５５ｎｍであることがわかる。さらに、ＣＳ層５４５２の堆積速度は約２００μｍ／ｓであり、これも文書化された速度と一致している。形態に加えて、ＣＳ－ＰＤＭＳ複合材料の構造の化学組成は、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）や光熱イメージングを使用してさらに研究できる。ＰＤＭＳにおけるＣ－Ｈ結合のフェムト秒ＳＲＳは、２つのビームが時間的に重なったとき（ｔ～０秒）、特定の位相（ここではＸチャネルとして割り当て）でのみ発生し、一方、ろうそくのすすのポンププローブ信号（Ｙチャネル）は、ほぼすべてのフェーズで発生し、減衰が非常に長くなる。したがって、１つの純粋なＣＳ５４５４サンプルとＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８サンプルを準備し、２つの材料の空間分布を化学的に区別することができる。結合画像５４５０は、ＣＳ及びＰＤＭＳの均一マトリクスが図５４Ｆによって作成されたことを示しており、赤：ＰＤＭＳ、シアン：ＣＳ、スケールバー：２μｍである。このような均一な混合物により、熱光吸収性ＣＳのＰＤＭＳへの迅速な移動が可能になり、これが効率的な光音響変換の基礎となる。
本明細書の例示的な実施形態によれば、４つの製造されたＳＯＡＰの光音響効率を特徴付けるために、８ｎｓパルス幅を有する１０６４ｎｍパルスレーザーを各設計に供給してＯＦＵＳ信号を生成することができる。図５４Ｇに詳述するように、０．６２ｍＪ／ｃｍ２のレーザー入力を用いて各ＯＦＵＳから生成された光音響信号の波形及び圧力を針ハイドロフォンによって記録した。ＨＳＭグラフ線５４６２は最小の振幅を提供し、ＣＮＴ－ＰＤＭＳグラフ線５４６４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳグラフ線５４６６と比較して５倍小さい。ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４６４とＣＮＰ－ＰＤＭＳ５４６６からの信号は同じレベルであったが、ＣＳ－ＰＤＭＳグラフ線５４６８はそれらより６倍大きい約４８ＭＰａを生成した。これは以前の取り組みと一致している。ＦＦＴ変換によって波形を分析した後、ＯＦＵＳ信号の周波数スペクトルが得られ、図５４Ｈに詳細が示されている。ＨＳＭグラフ線５４７２の中心周波数は約３ＭＨｚ、ＣＮＴ－ＰＤＭＳグラフ線５４７４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳグラフ線５４７６の中心周波数は約５ＭＨｚであり、一方、ＣＳ－ＰＤＭＳグラフの線５４７８は、最高の中心周波数約１５ＭＨｚと、５ＭＨｚ及び３５ＭＨｚで定義された－６ｄＢ幅を持っている。これらの特徴に基づいて、いくつかの実施形態では、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰはさらなる実験の対象となるのに理想的である可能性がある。これは、他のＳＯＡＰと比較して光音響変換効率が最も高いためだけでなく、最も広い帯域幅により、最も厳密な焦点と最短のサイクル期間が提供され、時空間制御が向上するためでもある。このようにして、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰは、実証可能な高ＮＡ、高焦点ゲイン、及び神経刺激用の焦点におけるボード帯域幅を備えて製造できる。
本開示の別の態様によれば、ＯＦＵＳは、高い空間分解能及び経頭蓋効率を実証する。ＯＦＵＳが非侵襲的用途で頭蓋骨を貫通した後も高解像度を維持できることを実証するために、マウスの頭蓋骨の一部を貫通する前後でＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰの空間解像度を特徴付けることができる。図５５Ａは、針ハイドロフォンを備えたＳＯＡＰによって生成される超音波を特徴付けるための実験設定の概略図である。図５５Ａでは、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５５１２は、レーザーパルス５５１６で照射された水槽５５１４内に配置される。針ハイドロフォン５５１８は、ＳＯＡＰ５５１２の上部から超音波５５２０の振幅及びプロファイルを取得するために使用される。経頭蓋能力テストでは、マウスの頭蓋骨をＯＦＵＳのサイズ（厚さ～０．１５ｍｍ）に注意深くトリミングし、ハイドロフォン５５１８とＯＦＵＳの間に置く。図５５Ｂは、マウスの頭蓋骨を使用しない場合と使用する場合のＳＯＡＰ５５１２によって生成された正規化された音響波形のグラフである。ＯＦＵＳの経頭蓋効率は、図５５Ｂに示すように、経頭蓋超音波信号の振幅を元の信号の振幅と比較することによって計算することができる。これにより、経頭蓋信号が元の信号に正規化され、鮮明な表示が得られる。グラフ線５５２４におけるマウス頭蓋上のＯＦＵＳの経頭蓋効率は６９％であり、これは５ＭＨｚの従来の超音波トランスデューサーのグラフ線５５２６における３８％と比較して著しく高い。これは、ＯＦＵＳの帯域幅が広いためである。高周波成分は吸収及び反射されるが、低周波成分は依然として頭蓋骨を貫通する可能性がある。マウスの頭蓋骨の有無にかかわらず焦点サイズを特徴付けるために、図５５Ｃ及び５５Ｄで詳述するように、焦点を掃引して横方向及び軸方向のプロファイルを取得することができる。図５５Ｃは、それぞれグラフ線５５３６及び５５３４におけるマウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの横方向解像度のグラフである。図５５Ｄは、それぞれグラフ線５５４６及び５５４４におけるマウス頭蓋骨なし及びマウス頭蓋骨ありのＯＦＵＳの軸方向分解能のグラフである。ハイドロフォン５５１８はＸＹＺ移動ステージに取り付けられ、１２．７μｍのステップで移動してプロファイルを取得する。すべてのプロファイルは、比較のために元のプロファイルに正規化された。したがって、図５５Ｃ及び５５Ｄのデータは、マウス頭蓋骨の貫通後のプロファイルに明らかな変化を示していない。横方向及び軸方向の解像度は、それぞれの方向の半値全幅（ＦＷＨＭ）に従って定義される。ＯＦＵＳの横方向と軸方向の解像度は、それぞれ６６μｍと２８４μｍから８３μｍと２８７μｍに変化した。ＯＦＵＳの元の解像度はシミュレーションデータに近い。これらの分解能は、超音波神経変調で通常使用される低周波超音波の分解能（０．５ＭＨｚトランスデューサーの場合それぞれ約５ｍｍと約４０ｍｍ）と比較して２桁正確であることに留意されたい。
例示的な例を続けると、ＯＦＵＳの焦点領域の位置を調べるために、超音波焦点の伝播を光音響断層撮影システムによって視覚化することができる。レーザーパルスはＳＯＡＰ５５１２の底部から送出される。ＳＯＡＰ５５１２、マウスの頭蓋骨５５５０の位置、及び光音響信号は、１２８素子の超音波トランスデューサーアレイによって上部から記録され得る。合成された画像からは、焦点の位置に大きな変化は観察されなかった。図５５Ｅ～５５Ｆは、頭蓋骨５５５０がない場合（５５Ｅ）及び頭蓋骨５５５０がある場合（５５Ｆ）の、ＳＯＡＰ５５１２により生成された超音波伝播の画像である。白い破線はＳＯＡＰ５５１２を示す。赤い破線はマウスの頭蓋骨を示し、スケールバーは２ｍｍである。図５５Ｅ～５５Ｆでは、超音波トランスデューサーアレイの遅延を調整することによって、ＯＦＵＳの伝播プロセスを表面から焦点領域まで再構成することができる。比較のために、画像を元の伝播信号に合わせて拡大縮小した。これらの伝播結果は、緊密な焦点を生成する光音響信号の干渉プロセスを示すだけでなく、このプロセスがマウスの頭蓋骨の存在によって大きく影響されず、緊密な経頭蓋焦点を維持することも示している。
本開示の別の態様によれば、ＳＯＡＰは、一次皮質ニューロンの直接的かつ経頭蓋刺激を可能にする。ＳＯＡＰの高い光音響効率と緊密な経頭蓋焦点の実証により、ＳＯＡＰが培養ニューロンの反応を誘発できるかどうかも評価できる。例示的な例として、ＧＣａＭＰ６ｆを発現するラットからの初代皮質ニューロンをインビトロ研究に使用することができる。図５６Ａは、直接インビトロ刺激実験デバイスの概略図である。カルシウム信号は、図５６Ａに示すように、倒立広視野顕微鏡及びＣＭＯＳカメラ５６１８からなる蛍光画像化システム５６１０によって記録することができる。実験の前に、入力レーザー５６１４の光路をイメージングシステム５６１０と位置合わせする必要がある。次に、ＳＯＡＰ５６１２は、カスタマイズされたホルダーによってＸＹＺ移動ステージに取り付けられ、入力レーザー５６１４の光路と位置が合うように慎重に調整される。ＳＯＡＰは、培養ニューロン５６１６の約２ｍｍ上に配置できる。ＸＹ方向の焦点を見つけるために、９．９μｍの蛍光ビーズをインジケーターとして使用できる。レーザー５６１４がオンの場合、音響放射力によるビーズの動きによって超音波焦点の位置を視覚化できる。ビーズの動きに基づいて、直径の焦点は約１００μｍにあることが特定され、これはテストされた横方向の解像度と一致している。神経刺激の場合、パルス幅８ｎｓの１０６４ｎｍの単一パルスを送信でき、これにより光音響信号の単一サイクルが生成される。これに続いて、３７個のニューロンからのカルシウムのトレースが記録され、分析された（Ｎ＝７皿）。図５６Ｂは、５６２２及び５６２４でそれぞれ刺激の前後で３．５ｍＪ／ｃｍ２の入力レーザーエネルギーで観察されたカルシウム過渡状態の代表的な画像を示す。一番右のパネルは、５６２６での最大ΔＦ／Ｆを示している。ニューロンの活性化は視野の中心でのみ観察され、残りの部分は反応を示さなかった。これは、サブミリメートルの空間分解能を有するＳＯＡＰの局所刺激能力を実証した。３７個のニューロンの中には、一過性反応と長期反応という２種類の反応が観察される。図５６Ｃは、過渡的な動態の平均化されたカルシウムトレースのグラフである。図５６Ｃでは、これらの２つの応答は５秒の減衰時定数で分離されている。過渡応答は、τ＝４．２秒の減衰時定数を示す。反応は、レーザー開始直後の焦点でグラフ線５６３０によって観察され、最大ΔＦ／Ｆは３１％±８％（３つの培養からＮ＝６、データは平均±ＳＤ）であり、単一サイクル刺激が成功したことを示している。この１サイクルは０．２６μｓ続く。シングルサイクル刺激のデューティサイクルは、１秒間のサイクル期間として定義される。ＯＦＵＳは２．６×１０＾（－４）％という超低デューティサイクルを実現する。延長された応答の時定数はτ＝７．８秒である。これらのニューロンについては、図５６Ｄにおいてレーザー開始直後に６２％±１２％の最大ΔＦ／Ｆが観察される（４つの培養からのＮ＝３１）。図５６Ｄは、ＯＦＵＳ刺激の長期にわたる動態の平均化されたカルシウムトレースのグラフである。ここで、黄色の縦線はＯＦＵＳ刺激を示し、平均トレースは実線で、平均の標準誤差はグラフ線５６４０の影付きで示されている。これらの活性化は焦点で観察されるだけでなく、ネットワークを通じて伝播される。さまざまなダイナミクスの現象を理解するために、各応答の閾値を調べることができる。入力レーザーエネルギーは低く開始され、ニューロンの応答が記録されるまで増加する。図５６Ｅは、一時的刺激及び長期的刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。したがって、図５６Ｅは、５６５０における一時的及び長期の活性化を引き起こす平均化された閾値を示す。過渡応答の閾値は３．８±０．５ｍＪ／ｃｍ２であり、長時間応答（５．７±１．８ｍＪ／ｃｍ２）の閾値よりも大幅に低くなる（２サンプルｔ検定、７つの培養からのＮ＝３７、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ニューロンのこのような能力は機械的刺激の大きさを区別し、より長い時定数を伴うより高い振幅の刺激に対する応答はいくつかの報告とよく一致する。
例示的な例を続けると、ＳＯＡＰによる神経刺激の安全性を実証するために、ニューロンを繰り返し刺激できるかどうかも示される。このようにして、単一サイクル刺激を２分間隔で３回、同じグループのニューロンに与えることができる。レーザーエネルギーは３．５ｍＪ／ｃｍ2であった。図５６Ｆは、５０μｍのスケールバーでの各刺激の最大ΔＦ／Ｆの画像を示しており、それぞれ画像５６６２、５６６４、又は５６６６で観察される形態の目に見える変形又は損傷はない。図５６Ｇは、対応するカルシウムトレースを示すグラフである。同様の振幅の最大ΔＦ／Ｆを伴うトレースがグラフ線５６７０で記録され、繰り返しの刺激後にニューロンの機能的損傷が観察されないことが実証された。ニューロンの生存能力は、６．５ｍＪ／ｃｍ2及び８．４ｍＪ／ｃｍ2で繰り返し刺激した後にさらに実証された。これら２つのエネルギーレベルは、安全性実証のための余分なマージンを残すために、閾値より７０％高く選択された。したがって、ニューロンの５つのグループが各エネルギーレベルで研究された。各グループについて、５秒の間隔で１０個のパルスがデリバリーされた。各パルスには、１０Ｈｚの３サイクルが含まれていた。細胞生存率を計算するには、３０分間のインキュベーション後に焦点の２００×２００μｍ2の領域内の生細胞と死細胞をカウントする。対照として光のグループは実施しなかった。その結果、刺激群と対照群との間で細胞生存率に有意差は観察されなかった。これらのデータを総合すると、ＯＦＵＳがニューロンの形態や機能に損傷を与えることなく、繰り返しかつ確実にニューロンを刺激できることがわかる。
注目すべき点は、ＳＯＡＰで同様の振幅の神経反応を引き起こすのに必要な総エネルギーが、従来の超音波と比較して数桁少ないことである。神経刺激は、インビトロでのＳＯＡＰ実験とまったく同じ実験設定で、０．５ＭＨｚの従来の集束超音波トランスデューサーを使用して実行される。このプロセスは、超音波強度を低くし、持続波（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｗａｖｅ、ＣＷ）の超音波を短時間照射することから始まった。次に、最大ΔＦ／Ｆ＞１０％の神経反応が記録されるまで、強度を持続時間とともに段階的に増加させることができる。例示的な例として、実験設定において、５００ｍｓの継続時間で３．０２×１０4Ｗ／ｃｍ2の超音波強度が最大１８％のカルシウム反応を引き起こすことが実証された。従来のトランスデューサーと比較して、ＳＯＡＰはまったく同じ状況で６桁少ないエネルギーで、同様のレベルのニューロン応答を引き起こす。図５７は、同様の振幅のニューロン応答を引き起こすための実験条件及び総エネルギーを含む表である。図５７の表５７００に示すように、約１５％のカルシウム応答を誘発する従来のトランスデューサーを用いた以前の研究と比較しても、ＳＯＡＰは２桁少ないエネルギーをデリバリーした。これは、光音響効果の恩恵を受ける独自のシングルサイクル刺激モードによるＳＯＡＰの高い刺激効率を示している。
本開示の別の態様によれば、経頭蓋刺激能力を試験するために、マウスの頭蓋骨の一部を貫通することによって、ＯＦＵＳによる神経刺激をさらに研究することができる。図５８Ａは、経頭蓋インビトロ刺激実験デバイス５８１０の概略図である。例示的な例として、マウスの頭蓋骨の一部５８１２がＳＯＡＰ５８１４の曲率に埋め込まれた。ＳＯＡＰ５８１４はレーザーパルス５８１１によって上から照射され、ＧＣａＭＰ６ｆニューロン５８１６の蛍光イメージングはカメラ５８１８によって細胞培養皿の底から記録された。超音波焦点５８１３は、前述のように、移動ステージと蛍光ビーズによって位置合わせされた。したがって、図５８Ｂは、ＯＦＵＳによる経頭蓋刺激の前後のカルシウム信号の代表的な画像及びビデオ、及びそれぞれ５８２２及び５８２４における対応する最大ΔＦ／Ｆ画像を示す。一番右のパネルは、５８２６での最大ΔＦ／Ｆを示しており、全体で５０μｍのスケールバーが使用されている。視野の中央にあるニューロンのみが活性化され、高精度の刺激に対して経頭蓋焦点がまだしっかりと固定されていることが確認された。ＯＦＵＳによる単一サイクル刺激により、２７％±５％の最大ΔＦ／Ｆを有する成功した刺激が、図５８Ｃのグラフ線５８３０によって記録され（７培養からのＮ＝１８）、これは、経頭蓋ＯＦＵＳ刺激の平均カルシウム応答トレースのグラフである。ここで、黄色の縦線はＯＦＵＳ刺激を示し、平均トレースは実線で、平均値の標準誤差は影付きで示されている。直接刺激と経頭蓋刺激の閾値は図５８Ｄで比較され、これは単一パルスによる直接刺激と経頭蓋刺激の閾値エネルギーの統計を詳細に示すグラフである。直接刺激の平均閾値は５．４±１．５ｍＪ／ｃｍ２であったが、経頭蓋刺激の閾値は７．７±１．１ｍＪ／ｃｍ２であった（２サンプルｔ検定、１１培養からのＮ＝４６、＊＊＊ｐ＜０．００１）。マウス頭蓋骨の貫通の減衰によるこのレーザーエネルギーの増加は、ＯＦＵＳの経頭蓋効率の６９％という以前の結果と一致していた。まとめると、これらの結果は、ＯＦＵＳが皮質ニューロンを直接及び経頭蓋的に刺激する能力を示している。
本開示の別の態様によれば、ＯＦＵＳはインビボで高精度の神経刺激を仲介する。培養ニューロンの直接的かつ経頭蓋的な刺激に成功したことにより、本開示は、ＯＦＵＳが生きている動物のニューロンを活性化できるかどうかも含む。例示的な例として、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをインビボでの刺激に使用し、刺激の効果を免疫蛍光法及び電気生理学記録によって評価した。マウスをイソフルランで深く麻酔し、毛を剃って頭皮を露出させた。図５９Ａは、インビボでのＯＦＵＳ刺激の実験設定の概略図である。ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５９１０は、カスタマイズされた３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられ、ＸＹＺ移動ステージに取り付けられた。入力レーザー５９１２は上部からデリバリーされ、生成された超音波の焦点は定位座標（内側－外側：１．５、前－後：０．５）に基づいて運動皮質と注意深く位置合わせされた。したがって、図５９Ｂは、刺激領域５９２２及び対照領域５９２４内のｃ－Ｆｏｓ及びＤＡＰＩ染色の画像のセットである。参考として、赤：ｃ－Ｆｏｓ、青：ＤＡＰＩ、オレンジ色の輪郭：ＯＦＵＳ刺激領域、緑の輪郭：対側領域の対照群。スケールバー：中央及び下のパネル、５０μｍ。まず、刺激を受けた神経細胞のｃ－Ｆｏｓタンパク質を標識することで刺激領域を可視化する。強力なｃ－ｆｏｓ発現を誘導するために、１０Ｈｚで２０パルスのパルス列に対して１．０ｍＪ／ｃｍ2（ピークツーピーク圧力３９ＭＰａに相当）のレーザーエネルギーでＯＦＵＳ刺激を適用した。これは、３３％のデューティサイクルで３０分間続いた。ｃ－Ｆｏｓの発現を最大化するためにマウスを１時間休ませた。次にマウスの脳を抽出し、１０％ホルマリンで２４時間固定した。厚さ１５０μｍの脳スライスをｃ－ＦｏｓとＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。ＯＦＵＳ刺激領域５９２２で観察されたｃ－Ｆｏｓ陽性細胞は、対側領域で対照群５９２４よりも多かった。次に、ＯＦＵＳ群５９２２及び対照群５９２４におけるｃ－Ｆｏｓ陽性細胞の割合を計算した。図５９Ｃは、ｃ－Ｆｏｓ陽性ニューロンのパーセンテージについての統計分析を伴うグラフ５９３０である。パーセンテージは、対照と比較して、ＯＦＵＳグループで有意に増加した（２サンプルｔ検定、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１）。重要なのは、ｃ－Ｆｏｓ信号が直径約２００μｍの領域に限定されており、従来の圧電トランスデューサーベースの経頭蓋超音波刺激（１～５ｍｍ）と比較して優れた空間分解能を示していることである。さらに、ｃ－Ｆｏｓの発現は標的部位に限定されていた。この領域の大きさはＯＦＵＳの焦点サイズに近かった。これは、ｃ－Ｆｏｓの発現がＯＦＵＳの焦点によって直接誘導されたことを示している。間接的な刺激による、標的領域の外側では有意なｃ－Ｆｏｓ発現は観察されなかった。これらの結果は、ＯＦＵＳが高い空間分解能で非侵襲的にニューロンの反応を直接誘発する能力を裏付けている。
例示的な実施例を続けると、ＯＦＵＳ刺激による機能的結果のさらなる評価が、筋電図検査（ＥＭＧ）法を用いて行われた。ＳＯＡＰ５９１０の焦点はマウスの脳の一次運動野に合わせられ、筋肉のけいれんを引き起こした。筋肉活動を記録するために、図５９Ａに詳述するように、ＥＭＧ電極５９１４を大腿二頭筋と平行に後肢に挿入し、接地電極を尾に挿入した。その結果、１．０ｍＪ／ｃｍ2で２秒の持続時間のレーザーパルス列がＳＯＡＰ５９１０にデリバリーされ、同時に図５９Ｄに示されるように対側後肢から強いＥＭＧ応答（０．４５８±０．０３ｍＶ）が記録された。これは、２秒のＯＦＵＳ刺激５９４２及び光制御なしグループ５９４４の代表的なＥＭＧ記録である（オレンジ色のボックス：レーザーパルス列）。これらのＥＭＧ信号には、レーザーの開始とＥＭＧ応答の間に通常約６１±６ｍｓの遅延があることに留意されたい。バンドパスフィルターと全波整流器で処理した後、ＥＭＧ信号のエンベロープが図５９Ｅにプロットされた。これは、バンドパスフィルター、全波整流器、及びＯＦＵＳ刺激５９４２及び非光の対照群５９４４も測定したエンベロープ後の代表的なＥＭＧ信号である。超音波の聴覚効果によって引き起こされるＥＭＧ反応の可能性を排除するための対照として、定位座標に基づいて体性感覚皮質を刺激した。有意な反応は観察されなかった。この結果は、ＥＭＧ反応が超音波の聴覚効果ではなく、ＯＦＵＳ刺激によって直接誘発されることを示唆している。
本開示の別の態様によれば、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によるＯＦＵＳ刺激の安全性を評価することができる。例示的な例として、ＥＭＧ記録後、マウスを屠殺し、脳を抽出して固定した。厚さ５μｍの脳スライスを１５０μｍごとに取得し、標準的なＨ＆Ｅ染色を実行した。次に、すべての脳スライスをスライススキャナーで検査し、標的領域と対側領域の対照群とを比較した。図５９Ｆは、ＯＦＵＳ群５９６２及び対照群５９６４の安全性評価のためのインビボ刺激後の組織学的結果を詳述する一組の画像である。そこでは、これらの群間で細胞の形態の有意な変化は観察されなかった。これは、ＯＦＵＳ刺激がマウスの脳に目に見える損傷を誘発しないことを示している。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＳＯＡＰによって生成された超音波場は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標） Ｒ２０１９ｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、マサチューセッツ州）上のオープンソースのｋ－Ｗａｖｅツールボックスによって２Ｄでシミュレートされた。シミュレーションでは吸収は考慮されなかった。ＳＯＡＰは伝播媒体として水中に超音波を届けた。バッキング材料を空気と設定した。密度と音速はそれに応じて定義された。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＨＳＭ－ＳＯＡＰ５４４２を製造して、曲率を形成するために、熱収縮チューブ（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ、６３６３Ｋ２１４）に直径１２．７ｍｍのスチールビーズ（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ、９５２９Ｋ２２）を充填し、ヒートガンで加熱して完全に収縮させた。その後、チューブをスチールビーズの大円から２ｍｍ離れたところで切断し、ＨＳＭ－ＳＯＡＰを取得した。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＣＮＴ－ＰＤＭＳ５４４４及びＣＮＰ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰ５４４６を製造するには、５重量％多層カーボンナノチューブ（ＶＷＲ、ＭＦＣＤ０６２０２０２９）及びＣＮＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、６３３１００－２５Ｇ）は、ＰＤＭＳベース及び硬化剤マトリックス（重量比１０：１、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４）とそれぞれ混合した。この混合物を、直径１２．７ｍｍ、焦点距離２ｍｍで設計された３Ｄプリントされた型に注ぎ、真空中で３０分間脱気した。完全に硬化したＣＮＴ－ＰＤＭＳ及びＣＮＰ－ＰＤＭＳサンプルを得るために、混合物をオーブンで６０℃まで２．５時間加熱してから、型から取り出した。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＣＳ－ＰＤＭＳ５４４８を製造するために、直径１２．７ｍｍのスチールビーズをパラフィンワックスのろうそくの炎の中心に１０～１５秒間置き、火炎合成されたろうそくのすすのナノ粒子で完全にコーティングした。次いで、コーティングされたビーズを、脱気したＰＤＭＳベース及び硬化剤マトリックス（重量比１０：１）に浸漬し、ＰＤＭＳマトリックスの表面がビーズの大円面よりも２ｍｍ低く残るように調整した。ヒートプレート上で１１０℃で１５分間加熱した後、硬化サンプルが得られた。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、超音波の生成及び特性評価に、１０６４ｎｍで８ｎｓのパルスを有するＱスイッチＮｄ：ＹＡＧレーザー（Ｑｕａｎｔｅｌ Ｌａｓｅｒ、ＣＦＲ ＩＣＥ４５０）が含まれ、光音響信号を生成するためにＳＯＡＰにデリバリーされた。レーザーはファンクションジェネレーター（３３２２０Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ）によって繰り返し周波数１０Ｈｚで変調された。超音波圧力とプロファイルの測定には、４０μｍの針状ハイドロフォン（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｃｏｕｓｔｉｃ、ＭＨ００４０、５～４０ＭＨｚの範囲に最適化）、水中プリアンプ、及びＤＣカプラーで構成されるシステムが使用された。次に、信号を超音波パルサー受信機（Ｏｌｙｍｐｕｓ、モデル５０７３ＰＲ）で増幅し、４回平均した後デジタルオシロスコープ（Ｒｉｇｏｌ、ＤＳ４０２４）で収集した。針ハイドロフォンの先端は生成された焦点よりも小さいため、取得されたデータＰpeakは焦点内の圧力の一部のみを反映している。超音波焦点上の実際の圧力を推定するために、２５．４μｍステップを実行して、焦点領域のＦＷＨＭにわたる圧力をマッピングした。データを平均して空間平均圧力Ｐaveragedを取得し、係数Ｃを次の方程式Ｃ＝Ｐaveraged／Ｐpeakで取得した。圧力がハイドロフォンの動的上限に達した後、現在の圧力Ｐ0を記録し、信号の飽和とデバイスの損傷を避けるためにハイドロフォンの焦点を外した。記録された圧力はＰ0-outである。次に、レーザーエネルギーを増加させ、圧力Ｐx-outを記録した。現在のエネルギー入力によって生成される焦点Ｐxの圧力は、空間圧力分布が一定であるため、次の方程式Ｐx＝（Ｐ(x-out)／Ｐ(0-out)）×Ｐ0によって推定できる。最終的に推定される空間平均圧力は、Ｐxに係数Ｃを乗算することによって取得される。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、ＳＥＭイメージング（Ｚｅｉｓｓ、Ｓｕｐｒａ５５ＶＰ）の前に、ＳＯＡＰの薄い断面スライスがＡｕ／Ｐｄで１０秒間スパッタリングされ、アルミニウムスタブ上に取り付けられた。ＳＯＡＰのＳＥＭ画像は、加速電圧として３ｋＶ、開口サイズ２０μｍで得られる。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＳＲＳ及び光熱イメージングでは、８０ＭＨｚフェムト秒パルスレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐｈｙｓｉｃｓ、ＩｎＳｉｇｈｔＸ３）が使用され、マルチモーダルイメージングシステムに調整可能なビーム（６８０ｎｍ～１３００ｎｍ）と同期ビーム（１０４５ｎｍに固定）が提供される。ＰＤＭＳとろうそくのすすを画像化するために、固定波長ビームとともに調整可能なビームをポンプビームとして８０１ｎｍに設定した。Ｃ－Ｈ結合のフェムト秒誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡用のストークスと、ろうそくのすすのポンププローブ顕微鏡用のプローブビームを同時に使用するためである。ストークス／プローブビームが音響光学変調器（Ｉｓｏｍｅｔ社、１２０５ｃ）によって変調された後、２つのビームがダイクロイックミラーによって結合され、実験室で作成されたレーザー走査型顕微鏡に向けられた。２つのビーム間の時間的遅延は、電動遅延ステージによって制御された。６０倍の水対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＵＰｌａｎＡｐｏ６０ＸＷ、ＮＡ＝１．２）は、共線ビームをサンプル上に集束させた。サンプル上の各ビームのパワーは２ｍＷである。２つのビームはオイルコンデンサー（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ａｐｌａｎａｔ Ａｃｈｒｏｍａｔ１．４、ＮＡ＝１．４）によって前方向に集められ、次にショートパスフィルターによってフィルターされた。フィルタリング後、ポンプビームのみが実験室で製作された共振増幅器を備えたフォトダイオードによって検出された。位相感応型ロックイン増幅器（Ｚｕｒｉｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＭＦＬＩ）は、変調伝達に従って、誘導ラマン損失信号及びポンププローブ信号の検出されたポンプビームを復調した。したがって、ｘ－ｙ－ｔ画像で構図を測定することができる。
本開示によって提供される例示的な例によれば、光音響トモグラフィーシステムは、カスタマイズされた１２８素子のトランスデューサーアレイ（Ｌ２２－１４ｖ、Ｖｅｒａｓｏｎｉｃｓ社、帯域幅５０％）、及び１２８チャンネルの超音波データ収集システム（Ｖａｎｔａｇｅ１２８、Ｖｅｒａｓｏｎｉｃｓ社）からなる。ＰＡＴシステムは、ファンクションジェネレーターと遅延ジェネレーター（ＤＧ５３５、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってＱｕａｎｔｅｌと同期される。ファンクションジェネレーターはＱｕａｎｔｅｌをトリガーし、遅延ジェネレーターは１０Ｈｚの繰り返しレートのパルスモードでトリガーした。遅延発生器は、光音響信号が生成された後、異なる時間遅延で超音波信号を受信するために、別の調整可能な遅延をＶａｎｔａｇｅ１２８に追加した。遅延を調整することで、光音響信号の伝播過程を可視化できる。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、胚ニューロンの培養には、５０μｇ／ｍｌのポリ－Ｄ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングされた３５ｍｍガラス底の皿を、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター内で一晩培養し、ニューロンを播種する前に、滅菌水で３回洗浄した。一次皮質ニューロンは、性別を問わずＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（Ｅ１８）に由来し、パパインで消化された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、５％熱不活化ウマ血清（ＨＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、２ｍＭグルタミンダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む培地は、解離した細胞を洗浄及び粉砕するために使用された。細胞を細胞培養皿（直径１００ｍｍ）で湿潤インキュベーター内３７℃で３０分間培養し、線維芽細胞とグリア細胞を除去した。ニューロンを含む上清を収集し、１０％ＦＢＳ＋５％ＨＳ＋２ｍＭグルタミンＤＭＥＭ培地を含むポリ－Ｄ－リジンでコーティングした皿に播種した。１６時間後、培地を２％Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１％Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、及び２ｍＭグルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に交換した。グリアの増殖を防ぎ、ＧＣａＭＰ６ｆを発現させるため、５μＭの５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び最終濃度１μｌ／ｍｌのＡＡＶ９．Ｓｙｎ．Ｆｌｅｘ．ＧＣａＭＰ６ｆ．ＷＰＲＥ．ＳＶ４０ウイルス（Ａｄｄｇｅｎｅ、マサチューセッツ州、米国）をそれぞれ、５日目に培地に添加した。培地の５０％を３～４日ごとに新しい培地と交換し、１０～１３日後にニューロンを刺激に使用した。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、インビトロでのＯＦＵＳ刺激は、デバイスの位置を微調整するために、３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられたＳＯＡＰを移動ステージまで移動させることを必要とした。Ｑｕａｎｔｅｌレーザーは、光音響信号生成のために自由空間のＳＯＡＰにデリバリーされた。１０倍対物レンズ（Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ、０．３ＮＡ、１６ｍｍＷＤ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を備えた倒立顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｕ、Ｎｉｋｏｎ）が、４７０ｎｍＬＥＤ（Ｍ４７０Ｌ２、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）で照明され、緑色蛍光タンパク質用のフィルターセットで濾過され（ＭＤＦ－ＧＦＰ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）、ＣＭＯＳカメラ（Ｚｙｌａ５．５、Ａｎｄｏｒ）で撮影され、蛍光イメージングに使用された。刺激前に、超音波の焦点を９．９μｍ緑色蛍光ビーズ（Ｇ１０００、Ｄｕｋｅ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｒｐ）で視覚化し、視野の中心に調整した。次に、ニューロン培養皿のＸ方向とＹ方向の同じ位置、ニューロンのＺ方向２ｍｍ上にＳＯＡＰを浸した。カメラはレーザーと同期した。カメラが２０Ｈｚで２０秒間記録している間、５秒目にレーザーが照射された。実験後、イメージングシーケンスの蛍光強度をＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉ）で分析した。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、細胞生存率の研究のために、各エネルギーレベルで各皿においてニューロンの５つのグループがランダムに選択された。一方、ニューロンの皿には、選択されたエネルギーレベルで合計３０パルスのＯＦＵＳがデリバリーされた。連続する３サイクルごとに、５秒間隔で１０Ｈｚでデリバリーされた。生細胞と死細胞は、焦点の２００×２００μｍ2の領域内で計算された。すべてのニューロンはＧＣａＭＰ６ｆで標識された。死細胞を１μＬ １００μｇ／Ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｐ１３０４ＭＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）溶液で１５分間染色した。細胞を３０分間インキュベートした後、分析のために蛍光顕微鏡で画像化した。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、インビボでのＯＦＵＳ刺激には、最初に酸素中５％イソフルランで麻酔をかけた成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１４～１６週齢）が関与し、その後、１．５～２％イソフルランで標準定位フレームに固定された。麻酔の深さを決定するために尾部のピンチが使用された。体温を維持するために、加熱パッドをマウスの下に置いた。標的となった脳の毛が除去された。３Ｄプリントされたホルダーに取り付けられたＳＯＡＰは、マウスの標的運動野に位置合わせされた。Ｑｕａｎｔｅｌレーザーは、１０Ｈｚの繰り返し率で自由空間のＳＯＡＰにデリバリーされた。ｃ－ｆｏｓ発現の場合、パルス列は３３％デューティサイクル（２秒レーザーオン、４秒レーザーオフ）で３０分間デリバリーされた。ＥＭＧ記録では、２秒のパルス列がデリバリーされた。
本開示によって提供される例示的な例によれば、ＥＭＧの記録及び処理には、ＳＯＡＰを一次運動野と位置合わせすることが含まれる。筋肉活動を記録するために、針電極を後肢大腿二頭筋の皮下に挿入し、接地電極をフットパッドに挿入した。対照群は、刺激部位と同側の体幹部で記録された。ＥＭＧ信号はＭｕｌｔｉ－Ｃｌａｍｐ７００Ｂアンプ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録し、１～５０００Ｈｚでフィルター処理し、Ａｘｏｎ ＤｉｇｉＤａｔａ１，５５０デジタイザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）でデジタル化し、ノイズエリミネーター（Ｄ－４００、Ｄｉｇｉｔｉｍｅｒ）でフィルター処理した。ＥＭＧ信号は０．５～５００Ｈｚのバンドパスフィルターと全波整流でフィルター処理された。次に、処理された信号のエンベロープがプロットされた。
本開示によって提供される例示的な例によれば、刺激セッション後に免疫蛍光染色を行い、ｃ－ｆｏｓ発現を最大化するためにマウスを１時間休ませ、次に、これを屠殺し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１倍、ＰＨ７．４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）溶液及び１０％ホルマリンを経心的に灌流した。固定後、脳を摘出し、１０％ホルマリン溶液中で２４時間固定した。固定したマウスの脳を１倍ＰＢＳ溶液に浸漬した。脳を、振動組織スライサー（ＯＳＴ－４５００、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、厚さ１５０μｍの冠状切片にスライスした。脳スライスをブラシで１０％ホルマリン溶液に静かに移し、さらに２４時間固定し、その後５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）－ＰＢＳ溶液で室温で３０分間ブロックした。スライスを０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１６１０４０７、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）－ＰＢＳ溶液で１０分間透過処理し、濃度２μｇ／ｍＬの抗ｃ－ＦｏｓＲａｂｂｉｔ抗体（４３８４Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４℃で一晩インキュベートした。一次培養後、スライスを、濃度１μｇ／ｍＬの二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び濃度５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに暗所、室温で２時間インキュベートした。ステップ間で、スライスを０．２％Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０、東京化成工業）－ＰＢＳ溶液で５分間４回洗浄した。蛍光画像は、ＦＶ３０００共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて取得した。共焦点画像は、ＤＡＰＩの場合は４０５ｎｍ、ｃ－Ｆｏｓの場合は４８８ｎｍの励起波長で取得された。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、刺激セッション後に組織学的染色が関与し、マウスは直ちに屠殺され、前述のように灌流され、固定された。脳をパラフィンに包埋し、１５０μｍステップで５μｍの厚さにスライスして冠状切片を得た。スライシングと標準的なＨ＆Ｅ染色は、Ｍａｓｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂｒｉｇｈａｍ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｅで実施された。組織像は、ＶＳ１２０自動スライドスキャナー（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で取得した。
本開示によって提供される例示的な実施例によれば、温度プロファイルを記録するために熱電対（ＤＩ－２４５、ＤａｔａＱ）が使用された。熱電対の先端は、それぞれＳＯＡＰの焦点、表面に配置された。記録中、エネルギー６．２ｍＪ／ｃｍ２のレーザーを１０Ｈｚで１０秒間オンにした。表面に光がないグループもベースラインとして記録された。
本開示によって提供される例示的な例によれば、統計分析に関して、音響波形、カルシウムトレース、及び電気生理学的トレースが、Ｏｒｉｇｉｎ２０２０を使用してプロットされた。周波数スペクトルのＦＦＴ変換はＭＡＴＬＡＢ（登録商標） Ｒ２０１９ｂを使用して実行された。データは平均値±平均値の標準誤差で表示される。カルシウム画像はＩｍａｇｅＪで処理される。すべての比較データは２サンプルのｔ検定で分析される。ｐ値は次のように定義された：ｎ．ｓ．、有意ではない（ｐ＞０．０５）；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
ＯＦＵＳの生物学的安全性は、神経調節を成功させるために非常に重要であることに留意されたい。これらの例示的な実施例では、生体安全性は、インビトロでの繰り返し刺激後の細胞生存率及び損傷が結論付けられなかったインビボの組織学的画像化によって評価された。さらに、キャビテーションと熱蓄積は、超音波曝露による潜在的な２つの主要な生体影響である。安全性を評価するために、機械的指標を計算し、ＯＦＵＳの温度上昇をテストした。インビボ実験のレーザー入力では、マウスの脳に伝達される推定ピークツーピーク圧力３９ＭＰａは、組織損傷が以前に報告されなかったレベルを下回っている。ＯＦＵＳのピーク負圧は１８ＭＰａと測定され、これは軟組織内に気泡雲が発生する閾値（２５～３０ＭＰａ）を下回っている。脳組織の音響減衰係数０．９１ｄＢ／（ｃｍ×ＭＨｚ）［５３］を使用してＭＩを推定し、ＯＦＵＳ刺激のＭＩ＝３．３と計算された。比較すると、ＭＩ＝３．９でパルス幅１．４μｓの短パルス超音波照射では、脳組織にまれにキャビテーション関連の損傷が生じることが報告されている。したがって、例示的な実施形態の０．２６μｓというより短いパルス持続時間及びより低いＭＩは、組織キャビテーションの損傷閾値を十分に下回るはずである。熱的安全性を確保するために、温度プロファイルは熱センサーで記録された。６．２ｍＪ／ｃｍ2のレーザーエネルギーが適用されたが、これは、本開示のこの態様に関する例示的な実施例に従って使用される最高エネルギー閾値と一致した。ＯＦＵＳは１０秒間デリバリーされ、ＯＦＵＳの焦点、ＳＯＡＰの表面、及びＳＯＡＰの表面に光が当たらない対照群でテストされた。１０秒の加熱後、表面で最大０．４Ｋの温度上昇が観察された。したがって、この研究では、最長持続時間が２秒の場合、ＯＦＵＳの焦点では０．１Ｋを超える顕著な温度上昇は引き起こされない。さらに、考えられる最高の温度上昇は、ニューロンの活動を調節するのに必要な閾値（ΔＴ≧５Ｋ）［５５］をはるかに下回っており、細胞に損傷を与えることはない。したがって、ＯＦＵＳは生物学的証拠と物理的証拠の両方によって組織に対して安全であることが証明されている。
本開示のこの態様の例示的な実施例によれば、ＣＳ－ＰＤＭＳ ＳＯＡＰが開発され、ＯＦＵＳが生成され、空間分解能及び経頭蓋能力を特徴付け、インビトロ及びインビボでのミリメートル未満の経頭蓋神経刺激が検証された。光音響効果による大きなＮＡにより、ピエゾベースの低周波超音波の到達範囲を超える６６μｍでの厳密な焦点が可能になった。広帯域放射により、ＯＦＵＳの６９％の経頭蓋効率がマウスの頭蓋骨の一部に浸透することが可能になった。インビトロでのＧＣａＭＰ６ｆ標識ラット皮質ニューロンの直接刺激及び経頭蓋刺激を蛍光イメージングで記録した。神経反応を引き起こすためのＯＦＵＳの総超音波エネルギー入力は、従来の超音波よりも２～６桁低く、高い刺激効率を実現する。ＯＦＵＳによるインビボでの生きたマウスの運動皮質における非侵襲的刺激の成功は、免疫蛍光法とＥＭＧ記録によって実証された。ＯＦＵＳ刺激の安全性は、生物学的には細胞生存率と組織学によって、また物理的にはＭＩと温度上昇によってインビトロとインビボの両方で評価された。
ＯＦＵＳ刺激に関する重要な観察は、刺激が聴覚交絡効果などの間接効果ではなく音響波の直接効果によって引き起こされたことであることに留意されたい。インビトロでの実験では、培養ニューロンは聴覚回路なしでＯＦＵＳ刺激に反応していた。インビボでの研究では、ｃ－Ｆｏｓ陽性ニューロンは、直接刺激に対応する刺激部位に位置していた。さらに、ＥＭＧ記録において体性感覚皮質を刺激された対照群では反応が記録されず、蝸牛への骨伝導がプロセスに関与していないことを示した。このような観察は、報告されている超音波による直接刺激と一致する。
本明細書の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰは、単一の固定超音波場を提供するデバイスである。複雑な脳機能は単一の部位によって制御されるわけではないが、複数の部位を刺激することで調節や治療の可能性が高まる。パターン化された神経調節を実現でき、例えば、治療のための運動制御の選択性をさらに高めることができる。製造プロセスの柔軟性の強さにより、ＯＦＵＳデバイスはマルチサイト神経調節のための大規模なアレイにスケールアップできる。従来のＰＺＴベースの超音波大規模アレイでは、電磁干渉を最小限に抑えるために各要素に接続された大規模なケーブルが銅で製造されており、これがウェアラブル臨床デバイスの適用をさらに妨げている。それに対して、軽量のＯＦＵＳデバイスは、長時間の治療における快適性を向上させる。金属部品を一切使用しないこのようなデバイスは、リアルタイム磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）ガイダンス及び機能的ＭＲＩモニタリングとの互換性をさらに向上させる。これらは、臨床応用におけるリアルタイムの複数部位刺激と治療評価の閉ループに役立つ。
特に、ＯＦＵＳは入力光のエネルギーを向上させるだけで高い超音波強度を提供できる。これは、従来の高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）の代わりにＯＦＵＳを超音波治療に適用する機会を提供する。例えば、ヒストトリプシーは、キャビテーションベースの治療のために、低周波（＜３ＭＨｚ）、短パルス（＜１０サイクル）の高強度超音波（＞２０ＭＰａ）を組織にデリバリーする。しかし、ＨＩＦＵは特定の強度に達するために高電圧を必要とし、その一方で狭い帯域幅（＜３０％）、長いリングダウン時間（＞５サイクル）、及び絶縁破壊のリスクをもたらす［７０］。ＳＯＡＰによって生成されたＯＦＵＳは、高周波数、高強度、正確なシングルサイクル制御、及び２００％の広帯域幅で実証されている。このニッチは、時空間制御が改善され、周囲組織への損傷と熱蓄積が最小限に抑えられる、超音波手術におけるＯＦＵＳ応用の将来の方向性をハイライトしている。
本開示の例示的な実施形態によれば、ＳＯＡＰによって生成されたＯＦＵＳは、小動物及び脳サブ領域における神経学的研究に向けて非侵襲的にサブミリメートルの精度を利用する。製造における柔軟性、高い時空間分解能と強度、及び電磁適合性の向上により、超音波手術、薬物デリバリー、疼痛管理などの臨床応用がさらに可能になる。したがって、この研究は、ＯＦＵＳが神経科学研究及び臨床治療における貴重なプラットフォーム技術として利用される可能性が非常に高いことをハイライトしている。
当業者であれば、上記の説明を読むと、本開示の多くの変更及び修正が自明あるが、例示として図示し説明した特定の実施形態は、決して限定的なものとみなされるものではないことを理解されたい。さらに、特定の実施形態を参照して主題を説明したが、当業者であれば、本開示の精神及び範囲内での変形を想到できる。前述の例は単に説明を目的として提供されたものであり、本開示を限定するものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。
本発明の概念は、その例示的な実施形態を参照して特に図示及び説明されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変更を加えることができることが当業者には理解される。本発明の概念は、以下の特許請求の範囲によって定義される。
Claims (44)
- テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）であって、
レーザーパルスを放射するように構成されたナノ秒レーザー；及び
レーザーパルスをガイドするように構成された光ファイバーであって、拡散層と熱膨張層を含むコーティングを有する先端を備えた光ファイバー
を含み；
前記拡散層は、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子を含み、
前記熱膨張層は、レーザーパルスを変換して超音波を生成するように構成されたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含み、
前記超音波の周波数は、前記拡散層の厚さ及び前記膨張層のＣＮＴ濃度で調整される、テーパー状ファイバー光音響エミッター。 - 前記超音波は、前記レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって前記先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む、請求項１に記載のデバイス。
- 前記無指向性音響波は、前記先端から１００μｍ未満の距離内に局在する、請求項２に記載のデバイス。
- 前記無指向性音響波は、単一のニューロンを活性化するように構成されている、請求項３に記載のデバイス。
- 前記無指向性音響波が、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞応答の同時モニタリングを可能にする、請求項４に記載のデバイス。
- 影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む、請求項１記載のデバイス。
- 前記超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲の制御可能な周波数を提供するように調整される、請求項６に記載のデバイス。
- 前記コーティングが、ポリジメチルシロキサン中に５％～１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料である、請求項７に記載のデバイス。
- テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）の動作方法であって、
ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射し、先端を備えた光ファイバーでレーザーパルスをガイドすること、ここで、前記先端は、エポキシ及び酸化亜鉛を含む拡散層と、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む熱膨張層でコーティングされる；
拡散層を使用して、局所的な加熱を制限しながらレーザーパルスを拡散すること；
熱膨張層を用いて拡散光を変換して超音波を生成すること；及び
超音波の周波数を、前記拡散層の厚さ及び膨張層のＣＮＴ濃度で調整すること
を含む、方法。 - 前記超音波は、前記レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって前記先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む、請求項９に記載の方法。
- 前記無指向性音響波は、前記先端から１００μｍ未満の距離内に局在する、請求項１０に記載の方法。
- 前記無指向性音響波は、単一のニューロンを活性化するように構成されている、請求項１１に記載の方法。
- 前記無指向性音響波が、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞応答の同時モニタリングを可能にする、請求項１２に記載の方法。
- 影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
- 前記超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲の制御可能な周波数を提供するように調整される、請求項１４に記載の方法。
- 前記コーティングが、ポリジメチルシロキサン中に５％～１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料である、請求項９に記載の方法。
- 光音響材料を介して細胞を刺激する方法であって、
超音波を発生するように構成された光吸収体及び拡張マトリックスを有する光音響材料を提供すること；
前記光音響材料をフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成すること、ここで、前記フィブロインヒドロゲルは、超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される；及び
前記フィブロインが前記超音波に応答して神経成長を刺激するように、前記光音響フィルムにレーザーパルスを放射することによって超音波を発生させること
を含む、方法。 - 前記超音波は、前記レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって前記先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記無指向性音響波は、前記先端から１００μｍ未満の距離内に局在する、請求項１８に記載の方法。
- 前記無指向性音響波は、単一のニューロンを活性化するように構成されている、請求項１９に記載の方法。
- 前記無指向性音響波が、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞応答の同時モニタリングを可能にする、請求項２０に記載の方法。
- 超音波の周波数を生成することが、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を修正することを含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲の制御可能な周波数を提供するように調整される、請求項２２に記載の方法。
- 前記フィブロインヒドロゲルがシルクを含む、請求項１７に記載の方法。
- テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）を動作させて細胞を刺激する方法であって、
ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射し、先端を有する光ファイバーでレーザーパルスをガイドすること；及び
ＣＮＴをフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成すること
を含み、
前記フィブロインヒドロゲルが超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される、方法。 - 前記超音波は、前記レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって前記先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む、請求項２５に記載の方法。
- 前記無指向性音響波は、前記先端から１００μｍ未満の距離内に局在する、請求項２６に記載の方法。
- 前記無指向性音響波は、単一のニューロンを活性化するように構成される、請求項２７に記載の方法。
- 前記無指向性音響波が、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞応答の同時モニタリングを可能にする、請求項２８に記載の方法。
- 前記拡散光を変換して超音波を発生させることが、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を修正することを含む、請求項２５に記載の方法。
- 前記超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲の制御可能な周波数を提供するように調整される、請求項３０に記載の方法。
- 前記コーティングが、ポリジメチルシロキサン中に５％～１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料である、請求項３１に記載の方法。
- 前記先端が、エポキシ及び酸化亜鉛を含む拡散層でコーティングされる、請求項２５に記載の方法。
- 前記拡散層は、局所的な加熱を制限しながら前記レーザーパルスを拡散する、請求項３３に記載の方法。
- 前記先端が、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む熱膨張層でコーティングされる、請求項２５に記載の方法。
- 前記熱膨張層が前記拡散光を変換して超音波を発生させ、前記フィブロインが前記超音波に応答して細胞内の神経成長を刺激する、請求項３５に記載の方法。
- 前記フィブロインヒドロゲルがシルクを含む、請求項２５に記載の方法。
- テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）であって、
レーザーパルスを放射するように構成されたナノ秒レーザー；及び
レーザーパルスをガイドするように構成された光ファイバーであって、熱膨張層を含むコーティングを有する先端を備えた光ファイバー
を含み；
前記熱膨張層は、レーザーパルスを変換して超音波を生成するように構成されたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含み、フィブロインヒドロゲルにＣＮＴを埋め込むと、光音響フィルムが形成され、前記フィブロインヒドロゲルは超音波に応答して神経成長を刺激するように構成され、
前記超音波の周波数は、前記膨張層のＣＮＴ濃度で調整される、テーパー状ファイバー光音響エミッター。 - 前記先端がさらに拡散層を含む、請求項３８に記載のデバイス。
- 前記拡散層は、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子を含む、請求項３９に記載のデバイス。
- 前記超音波の周波数は、前記拡散層の厚さで調整される、請求項４０に記載のデバイス。
- 前記光音響フィルムは平坦である、請求項３８に記載のデバイス。
- 前記光音響フィルムが湾曲している、請求項３８に記載のデバイス。
- 湾曲した前記光音響フィルムは、非侵襲的変調のための集束超音波を生成する、請求項４３に記載のデバイス。
［書類名］ 特許請求の範囲
［請求項１］
テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）であって、
レーザーパルスを放射するように構成されたナノ秒レーザー；及び
レーザーパルスをガイドするように構成された光ファイバーであって、拡散層と熱膨張層を含むコーティングを有する先端を備えた光ファイバー
を含み；
前記拡散層は、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子を含み、
前記熱膨張層は、レーザーパルスを変換して超音波を生成するように構成されたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含み、
前記超音波の周波数は、前記拡散層の厚さ及び前記膨張層のＣＮＴ濃度で調整される、テーパー状ファイバー光音響エミッター。
［請求項２］
前記超音波は、前記レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって前記先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む、請求項１に記載のデバイス。
［請求項３］
前記無指向性音響波は、前記先端から１００μｍ未満の距離内に局在する、請求項２に記載のデバイス。
［請求項４］
前記無指向性音響波は、単一のニューロンを活性化するように構成されている、請求項３に記載のデバイス。
［請求項５］
前記無指向性音響波が、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞応答の同時モニタリングを可能にする、請求項４に記載のデバイス。
［請求項６］
影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む、請求項１記載のデバイス。
［請求項７］
前記超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲の制御可能な周波数を提供するように調整される、請求項６に記載のデバイス。
［請求項８］
前記コーティングが、ポリジメチルシロキサン中に５％～１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料である、請求項７に記載のデバイス。
［請求項９］
テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）の動作方法であって、
ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射し、先端を備えた光ファイバーでレーザーパルスをガイドすること、ここで、前記先端は、エポキシ及び酸化亜鉛を含む拡散層と、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む熱膨張層でコーティングされる；
拡散層を使用して、局所的な加熱を制限しながらレーザーパルスを拡散すること；
熱膨張層を用いて拡散光を変換して超音波を生成すること；及び
超音波の周波数を、前記拡散層の厚さ及び膨張層のＣＮＴ濃度で調整すること
を含む、方法。
［請求項１０］
前記超音波は、前記レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって前記先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む、請求項９に記載の方法。
［請求項１１］
前記無指向性音響波は、前記先端から１００μｍ未満の距離内に局在する、請求項１０に記載の方法。
［請求項１２］
前記無指向性音響波は、単一のニューロンを活性化するように構成されている、請求項１１に記載の方法。
［請求項１３］
前記無指向性音響波が、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞応答の同時モニタリングを可能にする、請求項１２に記載の方法。
［請求項１４］
影響を受けた細胞において細胞膜ソノポレーションを誘導するために周波数を調整することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
［請求項１５］
前記超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲の制御可能な周波数を提供するように調整される、請求項１４に記載の方法。
［請求項１６］
前記コーティングが、ポリジメチルシロキサン中に５％～１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料である、請求項９に記載の方法。
［請求項１７］
光音響材料を介して細胞を刺激する方法であって、
超音波を発生するように構成された光吸収体及び拡張マトリックスを有する光音響材料を提供すること；
前記光音響材料をフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成すること、ここで、前記フィブロインヒドロゲルは、超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される；及び
前記フィブロインが前記超音波に応答して神経成長を刺激するように、前記光音響フィルムにレーザーパルスを放射することによって超音波を発生させること
を含む、方法。
［請求項１８］
前記超音波は、前記レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって前記先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む、請求項１７に記載の方法。
［請求項１９］
前記無指向性音響波は、前記先端から１００μｍ未満の距離内に局在する、請求項１８に記載の方法。
［請求項２０］
前記無指向性音響波は、単一のニューロンを活性化するように構成されている、請求項１９に記載の方法。
［請求項２１］
前記無指向性音響波が、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞応答の同時モニタリングを可能にする、請求項２０に記載の方法。
［請求項２２］
超音波の周波数を生成することが、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を修正することを含む、請求項１７に記載の方法。
［請求項２３］
前記超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲の制御可能な周波数を提供するように調整される、請求項２２に記載の方法。
［請求項２４］
前記フィブロインヒドロゲルがシルクを含む、請求項１７に記載の方法。
［請求項２５］
テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）を動作させて細胞を刺激する方法であって、
ナノ秒レーザーでレーザーパルスを放射し、先端を有する光ファイバーでレーザーパルスをガイドすること；及び
ＣＮＴをフィブロインヒドロゲルに埋め込んで光音響フィルムを形成すること
を含み、
前記フィブロインヒドロゲルが超音波に応答して神経成長を刺激するように構成される、方法。
［請求項２６］
前記超音波は、前記レーザーパルスによって励起されたときに光音響効果によって前記先端で局所的に生成される無指向性音響波を含む、請求項２５に記載の方法。
［請求項２７］
前記無指向性音響波は、前記先端から１００μｍ未満の距離内に局在する、請求項２６に記載の方法。
［請求項２８］
前記無指向性音響波は、単一のニューロンを活性化するように構成される、請求項２７に記載の方法。
［請求項２９］
前記無指向性音響波が、光音響刺激と、全細胞パッチクランプ記録を使用した細胞応答の同時モニタリングを可能にする、請求項２８に記載の方法。
［請求項３０］
前記拡散光を変換して超音波を発生させることが、周波数依存効率で細胞膜ソノポレーションをさらに誘導するために、音響減衰及び光吸収性能を修正することを含む、請求項２５に記載の方法。
［請求項３１］
前記超音波の周波数は、０．０８３ＭＨｚ～５．５００ＭＨｚの範囲の制御可能な周波数を提供するように調整される、請求項３０に記載の方法。
［請求項３２］
前記コーティングが、ポリジメチルシロキサン中に５％～１５％（ｗ／ｗ）の多層カーボンナノチューブを混合した単層ナノ複合材料である、請求項３１に記載の方法。
［請求項３３］
前記先端が、エポキシ及び酸化亜鉛を含む拡散層でコーティングされる、請求項２５に記載の方法。
［請求項３４］
前記拡散層は、局所的な加熱を制限しながら前記レーザーパルスを拡散する、請求項３３に記載の方法。
［請求項３４］
前記先端が、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む熱膨張層でコーティングされる、請求項２５に記載の方法。
［請求項３５］
前記熱膨張層が前記拡散光を変換して超音波を発生させ、前記フィブロインが前記超音波に応答して細胞内の神経成長を刺激する、請求項３４に記載の方法。
［請求項３５］
前記フィブロインヒドロゲルがシルクを含む、請求項２５に記載の方法。
［請求項３６］
テーパー状ファイバー光音響エミッター（ＴＦＯＥ）であって、
レーザーパルスを放射するように構成されたナノ秒レーザー；及び
レーザーパルスをガイドするように構成された光ファイバーであって、熱膨張層を含むコーティングを有する先端を備えた光ファイバー
を含み；
前記熱膨張層は、レーザーパルスを変換して超音波を生成するように構成されたカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含み、フィブロインヒドロゲルにＣＮＴを埋め込むと、光音響フィルムが形成され、前記フィブロインヒドロゲルは超音波に応答して神経成長を刺激するように構成され、
前記超音波の周波数は、前記膨張層のＣＮＴ濃度で調整される、テーパー状ファイバー光音響エミッター。
［請求項３７］
前記先端がさらに拡散層を含む、請求項３６に記載のデバイス。
［請求項３８］
前記拡散層は、局所的な加熱を制限しながら光を拡散するように構成されたエポキシ及び酸化亜鉛のナノ粒子を含む、請求項３７に記載のデバイス。
［請求項３９］
前記超音波の周波数は、前記拡散層の厚さで調整される、請求項３８に記載のデバイス。
［請求項４０］
前記光音響フィルムは平坦である、請求項３７に記載のデバイス。
［請求項４１］
前記光音響フィルムが湾曲している、請求項３７に記載のデバイス。
［請求項４２］
湾曲した前記光音響フィルムは、非侵襲的変調のための集束超音波を生成する、請求項４１に記載のデバイス。
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