JP2024515037A - 改変Ｆｃ受容体による移植細胞保護 - Google Patents

改変Ｆｃ受容体による移植細胞保護 Download PDF

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Abstract

本発明は、トランケート型又は改変型のＦｃ受容体タンパク質（例えば、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ）を発現して抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を回避する細胞を初めて提供する。細胞は、低免疫多能性細胞（ＨＩＰ）又はＡＢＯ式血液型Ｏ型Ｒｈ因子陰性ＨＩＰ細胞（ＨＩＰＯ－）を含めた、トランケート型又は改変型のＦｃ受容体を発現する多能性細胞であってもよい。本発明は、多能性細胞から誘導された細胞並びに初代細胞を包含する。細胞はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、膵島細胞、膵β細胞、甲状腺細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、又は網膜色素内皮細胞を含め、分化細胞であってもよい。

Description

Ｉ．関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０２１年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１６８，２２５号明細書、及び２０２２年２月１日に出願された同第６３／３０５，５８７号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、再生又は腫瘍学細胞療法に関する。一部の実施形態において、この再生細胞療法は、細胞又は細胞系を、それを必要としている患者に移植することを含む。一部の実施形態において、細胞系は、細胞内シグナル伝達ドメインが除去されるようにトランケートされている細胞表面Ｆｃ受容体を発現する多能性細胞を含む。他の実施形態において、細胞表面Ｆｃ受容体は、トランケート型ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４タンパク質（それぞれ、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ）である。他の実施形態において、これは低免疫原性であるか、Ｏ型の血液型を有するか、又はＲｈ因子陰性である。他の実施形態において、再生又は腫瘍学細胞療法産物は、同種異系レシピエントにおいて生存の延長を示す。一部の実施形態において、この再生細胞療法は、傷害された臓器及び組織の治療において使用され、この免疫腫瘍学細胞産物は、癌を治療するために使用される。一部の実施形態において、本発明の再生細胞療法は、疾患の治療又は損傷組織の回復に使用される膵島細胞、甲状腺細胞、肝細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、心筋細胞、又は網膜色素内皮細胞を利用する。他の実施形態において、本発明の免疫腫瘍学細胞産物は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はその他の、自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）のような免疫細胞を利用する。
再生細胞療法は、損傷臓器及び組織を再生するための重要で有望な治療である。移植用臓器の利用可能性は低く、それに伴って待機時間も長いため、容易に利用可能な細胞系を患者中に移植することによる組織の再生の可能性は当然魅力的である。再生細胞療法は、動物モデル（例えば、心筋梗塞後）における移植後の損傷組織の回復についての有望な初期結果を示している。しかしながら、移植レシピエントの免疫系が同種材料を拒絶する傾向は治療薬の潜在的な有効性を大幅に低減させ、そのような治療周囲の考えられる好ましい効果を縮小させる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、治療が困難な癌患者の治療において目覚ましい進歩を遂げているものの、固形腫瘍を持つ大勢の人の利益となるような戦略を開発しなければならない。この種の治療法が種々の癌に対する広く受け入れられた標準治療となるには、その前に幾つかの障害を乗り越える必要がある。そうした障害の中でも特に、注入された細胞の持続性が不十分である点は、癌療法の成功に決定的に重要な課題である。注入されたＣＡＲ Ｔ細胞の不十分な持続性は、癌患者の長期にわたる臨床的寛解維持と逆の相関関係があることはよく認識されており、ＣＡＲ Ｔ細胞の限られた持続性は、工学操作されたＴ細胞産物の免疫原性に結び付けられている（Ｋｏｒｄｅ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｐａｎ－ＫＩＲ２Ｄ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｗｉｔｈ ＩＰＨ２１０１ ｉｎ ｓｍｏｌｄｅｒｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９９，ｅ８１－８３（２０１４）、Ｓｃｈｍｉｄｔｓ，Ａ．＆ Ｍａｕｓ，Ｍ．Ｖ．Ｍａｋｉｎｇ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａ Ｓｏｌｉｄ Ｏｐｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９，２５９３（２０１８））。自家ＣＡＲ Ｔ療法の一部の例では、特異的免疫反応がＣＡＲそれ自体に向かうことが同定されており、そのためこの細胞療法薬は、その作用を完全に実現する前に排出される（Ｈｅｇｅ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ，ｔｕｍｏｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）－Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ＴＡＧ－７２ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ５，２２（２０１７）、Ｌａｍｅｒｓ，Ｃ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｉｔｈ ＣＡＩＸ ＣＡＲ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２１，９０４－９１２（２０１３））。新生物形質転換を起こしたＢ系統の細胞ではＣＤ１９発現が維持され、したがって、ＣＤ１９は、Ｂ細胞白血病の診断において、及びＣＡＲ Ｔ細胞療法の標的として有用である。現代の白血病療法には、細胞傷害性のプレコンディショニングと、続く抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与が含まれ、このＣＡＲ Ｔ細胞は、白血病集団及び良性集団を含めたあらゆるＢ細胞を標的とするものである。したがって、Ｂ細胞白血病の治療を受ける患者の宿主対移植片免疫反応は概して鈍り、長く続く抗体産生抑制を示す。ひいてはＣＡＲ Ｔ細胞は、白血病患者を治療するとき、より良好に免疫拒絶から保護される。固形臓器癌の患者では、ＣＡＲ Ｔ産物に対する免疫反応が亢進し（Ｈｅｇｅ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ，ｔｕｍｏｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）－Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ＴＡＧ－７２ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ５，２２（２０１７））、この療法の有効性は最小限となる。持続性が不十分であると、注入された細胞のエフェクター機能が妨げられ、長期にわたる治療の成功が阻まれる。
自己誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、理論的には、患者特異的細胞ベース臓器修復方針のための無制限の細胞源を構成する。しかしながら、これらの生成は技術的及び製造的困難を課し、あらゆる急性治療モダリティを概念的に妨げる長期のプロセスである。同種ｉＰＳＣベース療法又は胚性幹細胞ベース療法は製造の観点からより容易であり、十分にスクリーニングされ、標準化された高品質の細胞産物の生成を可能とする。しかしながら、これらの同種起源のため、そのような細胞産物は拒絶を受ける。細胞の抗原性が低減又は排除されるため、普遍的に許容可能な細胞産物を産生することができる。多能性幹細胞は３つの胚葉の任意の細胞タイプに分化させることができるため、幹細胞療法の潜在的適用は多岐にわたる。分化は、エクスビボ又はインビボで移植部位の臓器環境中で分化及び成熟を継続する前駆細胞を移植することにより実施することができる。エクスビボ分化は、研究者又は臨床医が手順を厳密にモニタリングすることを可能とし、適切な細胞の集団が移植前に生成されることを確保する。
しかしながら、ほとんどの場合、未分化多能性幹細胞は、奇形腫を形成するその傾向に起因して臨床移植療法において避けられる。むしろ、このような治療法は、分化細胞（例えば、心不全を罹患する患者の心筋中に移植される幹細胞由来心筋細胞）を使用する傾向がある。このような多能性細胞又は組織の臨床適用は、その移植後の細胞の成長及び生存を制御する「安全性特徴」から利益を得る。
本技術分野は、疾患又は欠損細胞を再生し、又は置き換えるために使用される細胞を産生し得る幹細胞を追求する。多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、それが急速に増殖し、多くの考えられる細胞タイプに分化するため、使用することができる。ＰＳＣのファミリーとしては、異なる技術を介して生成され、区別される免疫原性特徴を有するいくつかのメンバーが挙げられる。ＰＳＣに由来する工学操作細胞又は組織との患者適合性は、免疫拒絶のリスク及び免疫抑制の要求を決定する。
胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、レシピエントとミスマッチする組織適合性抗原を示す。この免疫学的バリアは、ＥＳＣのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型バンクにより解決することができない。それというのも、ＨＬＡ一致ＰＳＣグラフトもマイナー抗原として機能する非ＨＬＡ分子におけるミスマッチのため拒絶を受けるためである。これは、同種誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）にも当てはまる。
低免疫原性多能性（ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）（ＨＩＰ）細胞及び細胞産物は、例としてＴ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージが挙げられる免疫系の細胞構成成分からそれらを保護するための遺伝子ノックアウト又は導入遺伝子を有する。これらは、ＡＢＯ血液型のＯ型及びＲｈ陰性（ＨＩＰＯ－）でもあり得る。
免疫拒絶は、細胞療法薬を成功させる上での主な障害を呈し、現在、細胞拒絶を回避する万能な同種異系の既製品細胞の開発に多大な労力が注ぎ込まれている（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５８６，６０６－６１１（２０２０）；Ｗａｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ５，４２９－４４０（２０２１）；Ｄｅｕｓｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１８，（２０２１））。しかしながら、かかる遺伝子編集された低免疫細胞は、非ＨＬＡエピトープ、細胞型特異的自己抗原、並びに工学操作された細胞及びウイルス産物における異種構築物（Ｋｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．Ａｒｃｈ Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ １２４，９２１－９２３（２０００））又は合成構築物（Ｃｈｏｅ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １３（２０２１））に対して向けられる抗体による殺傷の影響を依然として受け易い。かかる細胞は、形質導入過程から生じる（Ｌａｍｅｒｓ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１７，７２－８２（２０１１）；Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １６，１２４５－１２５６（２０１０））。細胞傷害性抗体は、前から存在していることも、又は治療によって誘導されることもあり（Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １８，３７９－３９３（２０２１））、細胞療法薬の持続性及び有効性を脅かす。
抗体が関与する最も関連する２つの殺傷機序は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、Ｂ細胞又は顆粒球による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体カスケードの活性化を介する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。それらの殺傷機序の全ては、標的細胞に結合し、エフェクター免疫細胞又は補体を活性化させる抗体を利用する（図１）。ＩｇＧ抗体は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方の強力な媒介であり得る。ＩｇＧ抗体は、特異的エピトープに結合する２つの可変Ｆａｂ領域を有する。結晶性Ｆｃ領域は突出し、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、顆粒球、又は補体の結合のために機能する。
ＩｇＧのＦｃ部分を認識する受容体は、４つの異なるクラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲＩＶに分けられる。ＦｃγＲＩは抗体定常領域についての高い親和性及び制限されたアイソタイプ特異性を示す一方、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩはＩｇＧのＦｃ領域についての低い親和性を有するが、より広いアイソタイプ結合パターンを有し、ＦｃγＲＩＶは中間的な親和性及び制限されたサブクラス特異性を有する近年同定された受容体である。生理学的には、ＦｃγＲＩは初期免疫応答の間に機能する一方、ＦｃγＲＩＩ及びＲＩＩＩは後期免疫応答の間に多価抗原を包囲する凝集体としてＩｇＧを認識する。
抗体がそのＦａｂ領域を介して未保護細胞に結合する場合、ＦＣは、ＮＫ細胞（多くはそのＣＤ１６受容体を介する）、マクロファージ（多くはＣＤ６４、ＣＤ１６、又はＣＤ３２を介する）、Ｂ細胞（多くはＣＤ３２を介する）、又は顆粒球（多くはＣＤ３２、ＣＤ１６、又はＣＤ６４を介する）により結合され得、ＡＤＣＣを媒介し得る。補体もＦｃに結合し、そのカスケードを活性化させ、ＣＤＣ殺傷のための膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成し得る。
本発明は、細胞内シグナル伝達機能又は細胞内シグナル伝達ドメインが除去されるようにトランケートされている、又は改変されている細胞表面Ｆｃ受容体を発現する細胞を提供する。この細胞は、それを必要としている患者に移植され得る。一部の実施形態において、本発明の再生又は腫瘍学細胞療法は、癌、疾患の治療又は損傷組織の回復に使用される膵島細胞、甲状腺細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、肝細胞、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、心筋細胞、又は網膜色素内皮細胞を利用する。
本発明は、局所抗体のＦｃ部分を封鎖し、ひいてはＡＤＣＣ及びＣＤＣを阻害するトランケート型ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４（図２）を発現する細胞を提供する（図１及び図３を比較されたい）。本細胞は、初代細胞、分化細胞、低免疫多能性細胞（ＨＩＰ）を含めた多能性細胞、ＡＢＯ式血液型Ｏ型Ｒｈ因子陰性ＨＩＰ細胞（ＨＩＰＯ－） 人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、Ｏ－であるｉＰＳＣ、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、又はＯ－であるＥＳＣであってよく、これらのいずれも、トランケート型ＣＤ６４発現をさらに含む。初代細胞は、組織から直接単離される。
他の実施形態において、本細胞は、疾患の治療又は損傷組織の回復に使用される膵島細胞、甲状腺細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、肝細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、心筋細胞、又は網膜色素内皮細胞であり得る。
ＣＤ６４はマクロファージ及び単球にのみ構成的に見出され、通常、組織細胞には発現しない。これは通称Ｆｃガンマ受容体１（ＦｃγＲＩ）として知られ、ＩｇＧ Ｆｃ領域に高親和性で結合する。標的細胞上でＣＤ６４が過剰発現すると、ＩｇＧ Ｆｃが封鎖され、それが標的細胞に結合する。ＣＤ６４を介した細胞活性化の細胞内経路を有しない細胞では、かかる細胞に何ら機能的効果が及ばないことになり得る。ＣＤ６４の細胞質テールが細胞内活性化経路を誘導することを可能にする全ての細胞について、Ｆｃ結合は細胞に影響を与えることになり、その生理を乱す可能性がある。これは、ＣＤ６４などのＦｃ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインをトランケートし、又は改変することによって回避し得る。細胞内ドメインのないＦｃ受容体は細胞活性化を引き起こさないことになり、しかしＩｇＧ Ｆｃを封鎖することはなおも可能である。これは、ＣＤ６４、ＣＤ３２、及びＣＤ１６について当てはまる。遊離Ｆａｂ領域が近傍の標的細胞に結合したとしても、Ｆｃが占有しているため、いかなるＡＤＣＣ又はＣＤＣも阻止される。
このように、本発明は改変細胞を提供し、ここでこの改変細胞は、トランケーション又は改変を含むＦｃ受容体タンパク質を発現し、ここでこのＦｃ受容体タンパク質発現に起因して、改変細胞は抗体依存性細胞性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の影響を受けにくくなり、ここでこのトランケーション又は改変により、細胞内シグナル伝達が減少し、又はなくなる。本発明の一部の態様において、Ｆｃ受容体タンパク質は、トランケート型ＣＤ１６（ＣＤ１６ｔ）、トランケート型ＣＤ３２（ＣＤ３２ｔ）、及びトランケート型ＣＤ６４（ＣＤ６４ｔ）からなる群から選択される。他の態様において、細胞は、初代細胞、分化細胞、又は多能性細胞である。
本発明の一部の態様において、Ｆｃ受容体タンパク質は、配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ６４ｔタンパク質、配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ１６ｔタンパク質、及び配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ３２ｔタンパク質からなる群から選択される。好ましい態様において、ＣＤ６４ｔタンパク質は、配列番号１６の配列を有する。
本発明の一部の態様において、改変細胞は、ヒト低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞、ヒト低免疫原性多能性ＡＢＯ血液型Ｏアカゲザル因子陰性（ＨＩＰＯ－）細胞、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又はヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）に由来する。
他の態様において、改変細胞は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ、スイギュウ、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、及びモルモットからなる群から選択される種からのものである。
本発明は、改変細胞の死滅を生じさせるトリガーによって活性化される自殺遺伝子をさらに含む本明細書に開示されるとおりの改変細胞を提供する。一部の態様において、自殺遺伝子は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ－ｔｋ）であり、トリガーはガンシクロビルである。好ましい態様において、ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子は、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする。別の好ましい態様において、ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子は、配列番号４の配列を含むタンパク質をコードする。別の態様において、自殺遺伝子は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子（ＥＣ－ＣＤ）であり、トリガーは５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である。好ましい態様において、ＥＣ－ＣＤ遺伝子は、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする。別の好ましい態様において、ＥＣ－ＣＤ遺伝子は、配列番号５の配列を含むタンパク質をコードする。別の態様において、自殺遺伝子は誘導性カスパーゼタンパク質をコードし、トリガーは化学的二量体化誘導物質（ＣＩＤ）である。好ましい態様（ｓｐｅｃｔ）において、自殺遺伝子は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を含む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする。別の好ましい（ｐｒｅｆｆｅｒｅｄ）態様において、自殺遺伝子は、配列番号６の配列を含む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする。別の態様において、ＣＩＤはＡＰ１９０３である。
本発明は、本明細書に開示されるとおりの改変細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、膵島細胞、膵β細胞、甲状腺細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択されることを提供する。一部の態様において、細胞は、ＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－ＮＫ細胞である。
本発明は、本明細書に開示されるとおりの細胞を対象へと移植することを含む方法を提供し、ここで対象は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ、スイギュウ、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモットである。この方法の一部の態様において、改変細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、膵島細胞、心筋細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される。
本発明は、疾患を治療する方法であって、本明細書に開示される細胞、又はそれから誘導された細胞を対象に投与することを含む方法を提供する。この方法の一部の態様において、細胞又は誘導体細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、膵島細胞、膵β細胞、甲状腺細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される。他の態様において、疾患は、Ｉ型糖尿病、心疾患、神経学的疾患、内分泌疾患、癌、眼疾患、及び血管疾患からなる群から選択される。
本発明は、本明細書に開示されるとおりの改変細胞の作成方法であって、親の非改変バージョンの細胞においてＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔタンパク質を発現させることを含む方法を提供する。一部の態様において、改変細胞は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ、スイギュウ、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、又はモルモット起源を有する。他の態様において、改変細胞は、ＨＩＰ細胞、ＨＩＰＯ－細胞、ｉＰＳＣ細胞（ｃｅｌ）、又はＥＳＣ細胞から誘導される。
この方法の一部の態様において、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現は、親バージョンの改変細胞へとヒトＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ遺伝子の少なくとも１つのコピーをプロモーターの制御下に導入することによって生じる。好ましい態様において、プロモーターは構成的プロモーターである。
本発明は、本明細書に開示されるとおりの改変細胞又はそれから誘導された細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含む、疾患の治療用の医薬組成物を提供する。一部の態様において、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、膵島細胞、膵β細胞、甲状腺細胞、別の内分泌細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される。他の態様（ａｓｐｅｅｃｔｓ）において、疾患は、Ｉ型糖尿病、心疾患、神経学的疾患、内分泌疾患、癌、眼疾患、及び血管疾患からなる群から選択される。
本発明は、本明細書に記載されるとおりの細胞又は本明細書に記載されるとおりの改変細胞から誘導されたものを含む、疾患の治療用の医薬品を提供する。一部の態様において、細胞又は誘導体細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、膵島細胞、膵β細胞、甲状腺細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される。他の態様において、疾患は、Ｉ型糖尿病、心疾患、神経学的疾患、内分泌疾患、癌、眼疾患、及び血管疾患からなる群から選択される。
本発明は、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔタンパク質を含む、改変細胞を提供し、ここでこのタンパク質発現に起因して、改変細胞は抗体依存性細胞性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の影響を受けにくくなる。一部の態様において、改変細胞は、遺伝子工学操作によって生じるＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔタンパク質レベルの亢進を含む。他の態様において、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、膵島細胞、膵β細胞、甲状腺細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される。
本発明は、本明細書に開示されるとおりの改変細胞を提供し、ここで前記細胞は、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路を媒介しない細胞質ドメインを含むＦｃ受容体キメラを含み、ここで前記細胞質ドメインは、前記Ｆｃ受容体キメラの細胞外ドメインへとそのＦｃによって結合した抗体のエンドサイトーシスを促進する。一部の態様において、細胞質ドメインは、トランスフェリン受容体のものである。他の態様において、トランスフェリン受容体は、ＴｆＲ１又はＴｆＲ２である。好ましい態様において、Ｆｃ受容体キメラは、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４細胞表面ドメインと、ＴｆＲ１又はＴｆＲ２細胞質ドメインとを含む。
本発明は、本明細書に開示されるとおりの改変細胞を提供し、ここでこの細胞は、組換えＳＩＲＰａエンゲージャータンパク質を発現する。他の態様において、ＳＩＲＰａエンゲージャータンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、抗体Ｆａｂドメイン、又は単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含む。他の態様において、ＳＩＲＰａエンゲージャータンパク質は、その解離定数（Ｋｄ）によって測られる親和性でＳＩＲＰａに結合し、ここでＫｄは、約１０－７～１０－１３Ｍである。
一部の態様において、本明細書に開示されるとおりの改変細胞は、Ｂ２Ｍ－／－表現型、ＣＩＩＴＡ－／－表現型、ＣＤ６４ｔ、及びＳＩＲＰα－エンゲージャー分子を含む。他の態様において、ＳＩＲＰａ－エンゲージャータンパク質は、ＣＤ４７である。他の態様において、細胞は、工学操作されたＮＫ細胞である。
ＡＤＣＣ及びＣＤＣの概略図である。ＩｇＧ型の抗体が標的膵島細胞の表面に抗原を見付けると、それがＮＫ細胞又は補体を活性化させて、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって標的細胞を殺傷させる。 標的細胞の生理を変えることなく抗体を封鎖する工学操作されたＦｃ受容体を利用する本発明のある態様の概略図である。トランケート型又は改変型ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４コード配列（ＣＤＳ）は、機能性の細胞内シグナル伝達ドメインを欠いている。Ｕｎｉｐｒｏｔに従うタンパク質ドメインを図示する。トランケーション又は改変のための細胞質ドメインが指示される。 標的細胞にいかなるシグナル伝達も誘導することなく遊離ＩｇＧ Ｆｃを捕捉するトランケート型ＣＤ６４（ＣＤ６４ｔ）を図示する。 図４Ａは、完全長ＣＤ６４を発現する野生型（ｗｔ）ヒトｉＥＣを図示する。図４Ｂは、このようなｉＥＣがアレムツズマブＦｃを濃度依存的に捕捉することを図示する。 ＣＤ６４ｔを発現する野生型（ｗｔ）ヒトｉＥＣも同様にアレムツズマブＦｃを濃度依存的に捕捉した。図５Ａは、ｗｔ ｉＥＣのＣＤ６４ｔ発現を図示する。図５Ｂは、アレムツズマブＦｃを濃度依存的に捕捉するｉＥＣを図示する。 ヒトＨＩＰ ｉＥＣのＣＤ６４発現に関するフローサイトメトリーヒストグラムを図示する（図６Ａ）。遊離ＩｇＧ１ Ｆｃの結合について、ＨＩＰ ｉＥＣ上に特異的結合部位のない抗ＣＤ５２抗体であるアレムツズマブを使用して評価した。試験した全濃度範囲でＩｇＧ１ Ｆｃ結合はなかった（図６Ｂ）。 ＣＤ６４トランス遺伝子を発現するように形質導入したヒトＨＩＰ ｉＥＣのＣＤ６４発現に関するフローサイトメトリーヒストグラムを図示する（ＨＩＰ ｉＥＣＣＤ６４、図７Ａ）。遊離ＩｇＧ１ Ｆｃの結合について、ＨＩＰ ｉＥＣＣＤ６４上に特異的結合部位のない抗ＣＤ５２抗体であるアレムツズマブを使用して評価した。ＩｇＧ１の濃度依存的結合があった（図７Ｂ）。Ｆａｂ結合エピトープがないため、これはＦｃ及びＣＤ６４を介した結合のはずである。 ＣＤ６４ｔトランス遺伝子を発現するように形質導入したヒトＨＩＰ ｉＥＣのＣＤ６４ｔ発現に関するフローサイトメトリーヒストグラムを図示する（ＨＩＰ ｉＥＣＣＤ６４ｔ、図８Ａ）。ＩｇＧ１の濃度依存的結合があった（図８Ｂ）。Ｆａｂ結合エピトープがないため、これはＦｃ及びＣＤ６４ｔを介した結合のはずである。 ヒト抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１抗体アレムツズマブの標的エピトープであるＣＤ５２を発現するように形質導入したＨＩＰ ｉＥＣを図示する。インピーダンスＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおいて種々のアレムツズマブ濃度でＨＩＰ ｉＥＣＣＤ５２をチャレンジし、これらは濃度依存的様式で殺傷された（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 インピーダンスＣＤＣアッセイにおいて種々のアレムツズマブ濃度でチャレンジしたＨＩＰ ｉＥＣＣＤ５２を図示する。ＨＩＰ ｉＥＣＣＤ５２は濃度依存的様式で殺傷された（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 ヒト抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１抗体アレムツズマブの標的エピトープであるＣＤ５２並びにＣＤ６４ｔを発現するように形質導入したＨＩＰ ｉＥＣを図示する。インピーダンスＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおいて種々のアレムツズマブ濃度でＨＩＰ ｉＥＣＣＤ５２，ＣＤ６４ｔをチャレンジし、これらは殺傷に対して完全な抵抗性を示した（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 インピーダンスＣＤＣアッセイにおいて種々のアレムツズマブ濃度でチャレンジしたＨＩＰ ｉＥＣＣＤ５２，ＣＤ６４ｔを図示する。ＨＩＰ ｉＥＣＣＤ５２，ＣＤ６４ｔは殺傷に対して完全な抵抗性を示した（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 ヒト甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ（Ａ）及びｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔ（Ｂ）の甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）及びＣＤ６４ｔ発現に関する代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを図示する。 ヒト甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ（図１４Ａ）及びｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔ（図１４Ｂ）への遊離ＩｇＧ１ Ｆｃ（アレムツズマブ、これは甲状腺ｅｐｉＣ上にＦａｂ結合部位を有しない）の結合に関する代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを図示する。ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔのみがＩｇＧ１と結合可能であった。 Ｅｌｉｓａアッセイで測定したｅｐｉＣＴＰＯ（図１５Ａ）及びｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔ（図１５Ｂ）によるサイロキシン産生を図示する。１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１抗体の存在下又は非存在下でサイロキシン産生に差はなかった（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）をインビトロで発現するヒト甲状腺上皮細胞（ｅｐｉＣ）は、漸増濃度の抗ＴＰＯ抗体でＮＫ細胞ＡＤＣＣによる抗体媒介性拒絶反応（ＡＭＲ）を起こした（上の列）。加えてＣＤ６４ｔを発現するヒト甲状腺ｅｐｉＣは、全ての抗体濃度でＡＤＣＣから保護された（下の列）。 種々の濃度の抗ＴＰＯ ＩｇＧ１抗体でのインピーダンスＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおけるヒト甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯを図示する。甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯは濃度依存的に殺傷された（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 種々の濃度の抗ＴＰＯ ＩｇＧ１抗体でのインピーダンスＣＤＣアッセイにおけるヒト甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯを図示する。甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯは濃度依存的に殺傷された（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 種々の濃度の抗ＴＰＯ ＩｇＧ１抗体でのインピーダンスＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおけるヒト甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔを図示する。甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔは殺傷から完全に保護された（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 種々の濃度の抗ＴＰＯ ＩｇＧ１抗体でのインピーダンスＣＤＣアッセイにおけるヒト甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯを図示する。甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔは殺傷から完全に保護された（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 インピーダンスＣＤＣアッセイにおいてヒト甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ及びｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔを橋本病患者１（図２１Ａ）、２（図２１Ｂ）、及び３（図２１Ｃ）からの血清と共にインキュベートした。これらの患者は、正常値上限（０．０３Ｕ／ｍｌ）の２１倍（図２１Ａ）、２６．３倍（図２１Ｂ）、及び２９．６倍（図２１Ｃ）の抗ＴＰＯ抗体力価を有した。甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯは、これらのアッセイで即座に殺傷されたが、ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔは生存し続け、全く影響を受けないままであった（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 図２２Ａは、インビボ抗体殺傷アッセイの実験セットアップを図示する。合計５×１０４個のヒト甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ又はｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔを免疫不全ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）に１０６個のヒトＮＫ細胞と共に皮下注射した。両群とも、抗ＴＰＯの皮下用量１ｍｇを３回、０、１、及び２日目に受けた。甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ（図２２Ｂ）及びｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔ（図２２Ｃ）のＢＬＩシグナルを追うと、甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ移植片がすぐに消えた一方、ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔは全て生存し続けたことが示された（全ての動物を一匹ずつプロットし、各群の代表的な１匹の動物のＢＬＩ画像を示している）。 ヒトβ細胞（図２３Ａ）又はＣＤ６４ｔ発現β細胞ＣＤ６４ｔ（図２３Ｂ）のＣＤ６４ｔ発現に関する代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを図示する。β細胞ＣＤ６４ｔは強力なＣＤ６４ｔ発現を示した。 β細胞（図２４Ａ）及びβ細胞ＣＤ６４ｔ（図２４Ｂ）への遊離ＩｇＧ１ Ｆｃ（アレムツズマブ）の結合に関するフローサイトメトリーヒストグラムを図示する。β細胞ＣＤ６４ｔのみが、濃度依存的な顕著なＩｇＧ１ Ｆｃ結合を示した。 ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒトβ細胞（図２５Ａ）及びβ細胞ＣＤ６４ｔ（図２５Ｂ）によるグルコース感知及びインスリン産生を図示する。このアッセイは低（２ｍＭ）及び高（２０ｍＭ）グルコース条件下で実施した。β細胞及びβ細胞ＣＤ６４ｔの両方が、高グルコース条件で有意に多いインスリンを産生した。グルコース感知及びインスリン産生は、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１抗体の有無の影響を受けなかった（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 ヒト膵島細胞（ＨＬＡ－Ａ２陽性）は、抗ＨＬＡ－Ａ２ ＩｇＧ抗体及びＮＫエフェクター細胞でチャレンジしたとき、インビトロ抗体媒介性殺傷を受けた（上の列）。ＣＤ６４ｔを発現するように形質導入した膵島細胞は、全ての抗体濃度で抗ＨＬＡ－Ａ２抗体媒介性殺傷から保護された（下の列）。 インピーダンスＣＤＣアッセイにおいて種々の濃度の抗ＨＬＡ－Ａ２ ＩｇＧ１抗体でチャレンジしたヒトβ細胞を図示する。ＨＬＡ－Ａ２発現β細胞は濃度依存的に殺傷された（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 インピーダンスＣＤＣアッセイにおいて種々の濃度の抗ＨＬＡ－Ａ２ ＩｇＧ１抗体でチャレンジしたヒトβ細胞ＣＤ６４を図示する。ＨＬＡ－Ａ２発現β細胞ＣＤ６４ｔは、ＣＤＣ殺傷に対して完全な抵抗性を示した（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 図２９Ａは、インビボβ細胞生存実験の実験セットアップを図示する。合計５×１０４個のヒトβ細胞又はβ細胞ＣＤ６４ｔをＮＳＧマウスに１０６個のヒトＮＫ細胞と共に皮下注射した。両群とも、皮下１ｍｇ用量の抗ＨＬＡ－Ａ２ ＩｇＧ１を３回、０、１、及び２日目に受けた。β細胞（図２９Ｂ）及びβ細胞ＣＤ６４ｔ（図２９Ｃ）のＢＬＩシグナルを追った。β細胞移植片は、僅か２日のうちに全てが拒絶された。β細胞ＣＤ６４ｔ移植片は、いずれも影響を受けないままであり、この研究期間中生存し続けた。対照として、５×１０４個のヒトβ細胞をＮＫ細胞なし及び抗体なしでＮＳＧマウスに皮下注射した（図２９Ｄ）。抗ＨＬＡ－Ａ２及びＮＫ細胞でチャレンジしたβ細胞ＣＤ６４ｔ移植片の生存動態は、抗体及びＮＫ細胞のないβ細胞移植片と区別がつかなかった。これは、β細胞ＣＤ６４ｔ移植片がインビボで抗体媒介性殺傷から完全に保護されたことを示している。全ての動物を一匹ずつプロットし、各群の代表的な１匹の動物のＢＬＩ画像を示している。 ヒトＣＡＲ－Ｔ（Ａ）及びＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔ（Ｂ）の抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ及びＣＤ６４ｔ発現に関する代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを図示する。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ抗体は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを特異的に認識する（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 ＣＡＲ－Ｔ細胞（図３１Ａ）及びＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔ細胞（図３１Ｂ）への遊離ＩｇＧ１ Ｆｃ（抗ＴＰＯ ＩｇＧ１）の結合に関する代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを図示する。ＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔのみがＩｇＧ１に濃度依存的に結合可能であった（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔによるＣＤ１９＋ＮＡＬＭ標的細胞殺傷の動態を図示する。殺傷速度は、細胞指数が１から０．５に落ちるまでにかかる時間として表す。異なるＴ細胞対ＮＡＬＭ比を図示する（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 １μｇ／ｍｌの抗ＣＤ５２の存在下及び非存在下でのＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔによるＣＤ１９＋ＮＡＬＭ標的細胞殺傷の動態を図示する。殺傷速度は、細胞指数が１から０．５に落ちるまでにかかる時間として表す。異なるＣＡＲ－Ｔ細胞対ＮＡＬＭ比を図示する（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 ＨＬＡ（抗ＨＬＡ－Ａ２）、非ＨＬＡ（抗ＣＤ５２、抗ＣＤ３）、Ｒｈ式血液型Ｄ抗原（抗Ｒｈ（Ｄ））に対する、及びＣＡＲ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）に対する１μｇ／ｍｌの抗体でのインピーダンスＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおけるヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を図示する（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。全ての抗体で、ＣＡＲ－Ｔ細胞の極めて急速な殺傷があった。 ＨＬＡ（抗ＨＬＡ－Ａ２）、非ＨＬＡ（抗ＣＤ５２、抗ＣＤ３）、Ｒｈ式血液型Ｄ抗原（抗Ｒｈ（Ｄ））に対する、及びＣＡＲ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）に対する１μｇ／ｍｌの抗体でのインピーダンスＣＤＣアッセイにおけるヒトＣＡＲ－Ｔ細胞を図示する（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。ここでもやはり、全ての抗体で、ＣＡＲ－Ｔ細胞の極めて急速な殺傷があった。 ＨＬＡ（抗ＨＬＡ－Ａ２）、非ＨＬＡ（抗ＣＤ５２、抗ＣＤ３）、Ｒｈ式血液型Ｄ抗原（抗Ｒｈ（Ｄ））に対する、及びＣＡＲ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）に対する１μｇ／ｍｌの抗体でのインピーダンスＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおけるヒトＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔ細胞を図示する（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。ＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔ細胞はＡＤＣＣ殺傷に対して完全な抵抗性を示した。 ＨＬＡ（抗ＨＬＡ－Ａ２）、非ＨＬＡ（抗ＣＤ５２、抗ＣＤ３）、Ｒｈ式血液型Ｄ抗原（抗Ｒｈ（Ｄ））に対する、及びＣＡＲ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）に対する１μｇ／ｍｌの抗体でのインピーダンスＣＤＣアッセイにおけるヒトＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔ細胞を図示する（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。ＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔ細胞はＣＤＣ殺傷に対して完全な抵抗性を示した。 ヒトＮＫ細胞（図３８Ａ）及びＮＫＣＤ６４ｔ細胞（図３８Ｂ）のＣＤ６４ｔ発現に関する代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを図示する。ＮＫＣＤ６４ｔ細胞のみがＣＤ６４ｔを発現する。 ＮＫ細胞（図３９Ａ）及びＮＫＣＤ６４ｔ細胞（図３９Ｂ）への遊離ＩｇＧ１ Ｆｃ（抗ＴＰＯ ＩｇＧ１）の結合に関する代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを図示する。ＮＫＣＤ６４ｔ細胞のみがＩｇＧ１に濃度依存的に結合可能であった。 インピーダンスＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおいて種々の濃度の抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１抗体（アレムツズマブ）でチャレンジしたヒトＮＫ細胞を図示する。ＣＤ５２発現ＮＫ細胞は濃度依存的に殺傷された（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 インピーダンスＣＤＣアッセイにおいて種々の濃度の抗ＣＤ５２抗体でチャレンジしたヒトＮＫ細胞を図示する。ＣＤ５２発現ＮＫ細胞は濃度依存的に殺傷された（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 インピーダンスＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイにおいて種々の濃度の抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１抗体（アレムツズマブ）でチャレンジしたヒトＮＫＣＤ６４ｔ細胞を図示する。ＣＤ５２発現ＮＫＣＤ６４ｔ細胞はＡＤＣＣ殺傷から完全に保護された（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。 インピーダンスＣＤＣアッセイにおいて種々の濃度の抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１抗体（アレムツズマブ）でチャレンジしたヒトＮＫＣＤ６４ｔ細胞を図示する。ＣＤ５２発現ＮＫＣＤ６４ｔ細胞はＣＤＣ殺傷から完全に保護された（平均値±ＳＤ、各群及び各時点につき３回の独立したレプリケート）。
Ａ．序論
本発明は、トランケート型ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４発現を含むことにより抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を回避する一方で細胞内シグナル伝達をなくした細胞を初めて提供する。細胞は、初代細胞であっても、又は低免疫多能性細胞（ＨＩＰ）又はＡＢＯ式血液型Ｏ型Ｒｈ因子陰性ＨＩＰ細胞（ＨＩＰＯ－）を含めた、ＣＤ６４発現の亢進をさらに含む多能性細胞であってもよい。細胞はまた、疾患の治療又は損傷組織の回復に使用される膵島細胞、甲状腺細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、心筋細胞、又は網膜色素内皮細胞であってもよい。
固形臓器移植後の抗体媒介性拒絶反応（ＡＭＲ）は、１９９７年に初めて他と異なる臨床病理学的実体として発見された。細胞拒絶反応の概念が広く受け入れられるようになってから何十年も経って、腎臓、心臓、肺、肝臓、及び膵臓移植についての標準化された命名法及び診断基準が開発された。ＡＭＲの顕著な特徴は、移植片の損傷と併せた移植片特異抗体の存在である。
抗体がそのＦａｂ領域を介して細胞上のＨＬＡ又は非ＨＬＡ抗原に結合すると、ＦｃがＮＫ細胞による結合（ほとんどがそのＣＤ１６受容体を介する）を受け、それが抗体媒介性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は移植セッティングではＡＭＲを媒介する。補体もまたＦｃに結合してそのカスケードを活性化し、ＣＤＣ殺傷のための膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成し得る（図１）。
抗体が向かうことのできる抗原は３層ある。第一の、移植セッティングにおいて最も関連性の高い層は、Ｔ細胞活性化に決定的に重要な最も多型性の高い組織適合性複合体であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）である。その移植片に対する抗体を有する患者は、臓器系全般で移植片の生存率が劣っていることが一貫して示された。
第二の層は、ヒトＨＬＡ遺伝子内にコードされる細胞表面グリコールタンパク質であるＭＨＣクラスＩ関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）など、高度に多型性の非ＨＬＡ抗原である。これはβ２－ミクログロブリンと会合せず、ペプチドも提示しない。抗ＭＩＣＡ抗体は、固形臓器移植における移植片生着不全の加速と関連付けられている。膵島細胞上のＭＩＣＡ多型性及び発現量は、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に関連している。
第三の層、固形臓器移植後に生成される細胞型特異的表面抗原に対する抗体は、ＡＭＲを媒介する。
移植レシピエントにおいては、有効な全身免疫抑制の使用にもかかわらず、これらのＡＭＲ反応が起こる。一部の自己免疫疾患では、自己抗体が標的細胞の破壊を引き起こし、又は亢進させ、疾患の一部として持続する。自己免疫性甲状腺炎又は１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）の患者では、それぞれ抗甲状腺上皮細胞抗体又は抗β細胞抗体の保有率が高く、そうした抗体は長年持続し得る。
免疫適格患者における長期にわたる良性再生手法を用いた細胞移植片を有する患者は、最終的には、細胞源及び治療下の疾患に応じた何らかの形態の抗体媒介性の免疫攻撃に見舞われ得る。甲状腺細胞及び膵島細胞は３層全ての抗原を発現し、あらゆる形態のＡＭＲに対して最も脆弱である。このため、これらの細胞型は、本明細書に開示される抗体回避技術の良い例となる。他の細胞型も関係があるとされ、同種異系ヒト胚性幹細胞由来の心筋前駆体及び間葉系間質細胞誘導体が挙げられる。
本発明は、膵島細胞及び甲状腺細胞などの移植された細胞をＡＭＲから有効に保護する遺伝子編集戦略を提供する。本発明は、ＨＬＡ特異的、非ＨＬＡ特異的、及び細胞型特異的抗原に対する抗体からの保護を確立する。一部の実施形態において本発明は、細胞拒絶反応を静める追加の低免疫編集体と組み合わされる。
本発明は、ＨＩＰの概念を基礎とした、非免疫原性成分を利用する抗体抵抗性を提供する。微生物ＩｇＧ分解酵素の全身的な使用は、高度に感作された患者においてその腎移植前に全ＩｇＧ及びＨＬＡ抗体を枯渇させるための使用が成功している（Ｊｏｒｄａｎ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７，４４２－４５３（２０１７））。最近になって、このエンドペプチダーゼは、標的細胞に結合したＩｇＧを切断することが示された（Ｐｅｒａｒｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０２１））。しかしながら、健常集団では、これらの細菌酵素に対する抗体が元から存在し、広く保有されている（Ａｋｅｓｓｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １８９，７９７－８０４（２００４））。これはレンサ球菌感染時にスパイクし（Ｌｅｉ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ７，１２９８－１３０５（２００１）；Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２３，４８５２－４８５９（２００５））、自ら望ましくない免疫原性を加える可能性がある。ヒトＣＤ６４及びそのトランケートされた形態ＣＤ６４ｔは非免疫原性であり、ＩｇＧに対して高親和性を有し（Ｂｒｕｈｎｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１３，３７１６－３７２５（２００９））、幾つかのトランスレーショナルな関連性のある細胞型での抗体による殺傷に対して極めて有効である。
本発明は、この技術を、再生細胞療法薬、特に、移植された細胞を破壊し得る抗体が存在するような基礎的自己免疫性成分を伴う疾患に対する再生細胞療法薬に適用する。自己免疫が回避されなければ、再生細胞療法薬は天然の細胞と同様に破壊されることになり得る（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ４４５，３５－４１（２０１７））。
本発明は、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）及びＣＤ６４（ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔ）を発現する工学操作された上皮細胞（ｅｐＣ）が、臨床的に関連性のある抗ＴＰＯ殺傷から保護されたことを示す。Ｉ型糖尿病患者の臨床試験における現在の幹細胞由来の膵島細胞は、現在のところ胚性幹細胞から作製されている（Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｓｌｅｔ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ６４，１０３０－１０３６（２０２１））。これは全ＨＬＡ不適合者に移植される。しかしながら、宿主免疫系から膵島細胞を保護するためにカプセル化戦略が用いられているにもかかわらず、マイクロカプセル化した移植細胞に対する抗体が観察されている（Ｄｅｓａｉ，Ｔ．＆ Ｓｈｅａ，Ｌ．Ｄ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １６，３３８－３５０（２０１７）；Ｄｕｖｉｖｉｅｒ－Ｋａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ４，１９９１－２０００（２００４））。抗ＨＬＡ ＡＤＣＣ及びＣＤＣからヒトβ細胞を保護するには、その上でＣＤ６４ｔを強制的に過剰発現させることで十分であった。
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の成功のほとんどはＢ細胞新生物で実現しており、ここでは患者はリンパ球傷害性薬物で治療され、ＣＡＲ－Ｔ細胞は抗体産生源を直接標的化する（Ｂｒｕｄｎｏ，Ｊ．Ｎ．＆ Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １５，３１－４６（２０１８））。しかしながら、抗体誘導がなおも定期的に観察されている（Ｔｉｌｌ，Ｂ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１２，２２６１－２２７１（２００８））。ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する抗体反応は、再注入時のＣＡＲ－Ｔ細胞の増大を妨げ（Ｐｅｒａｒｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｅｖａｓｉｎｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｏｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０２１））、持続性を阻むことが示されている。ＣＡＲ－Ｔ細胞にＣＤ６４ｔが発現すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、その特異的殺傷能力への影響なしに抗ＣＡＲ－Ｔ細胞抗体に対して抵抗性となる。初期免疫クリアランスはむしろ非Ｂ細胞癌に多く見られるため、ＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔは、これらの適用疾患に一層効率的であり得る。Ｆｃ封鎖機構は、幾つかの細胞型で抗体からの保護を確実に構築し、同種異系再生及び免疫腫瘍学細胞療法薬についての免疫回避の概念をさらに進歩させる。（国際公開第２０２１０７６４２７号パンフレット（全体として参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）
ＣＤ６４は、遊離血清ＩｇＧを捕捉する能力のある高親和性ヒトＩｇＧ受容体ＦｃγＲＩである。ＡＭＲに対する抵抗性を実現するため、ＣＤ６４のＦｃ結合能を利用した。しかしながら、望ましくない細胞内シグナル伝達からの工学操作された細胞の変化を避けるため、本発明は、細胞内シグナル伝達を誘導する能力のないトランケート形態のＣＤ６４（ＣＤ６４ｔ）を細胞上に提供する。ＣＤ６４コード配列（ＣＤＳ）において細胞内テールを切り捨てた後、それをレンチウイルスにクローニングして多能性細胞で発現させた。このＣＤ６４ｔは、下流シグナル伝達を誘導することなく遊離ＩｇＧ Ｆｃを捕捉する（図３）。
本技術についての１つの具体的な適応は、自己免疫性疾患の細胞治療である。自己エピトープに対する抗体は、１型糖尿病におけるベータ細胞死滅及び自己免疫性甲状腺炎における甲状腺細胞死滅を引き起こす。抗体は、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合し得る。さらに、ＨＬＡ非依存性抗体が記載されている。再生療法に使用される細胞が同じエピトープを有する場合、それはそれらの抗体によっても結合され、殺傷される。本発明のＣＤ６４封鎖は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを妨げる。
本発明の一部の実施形態において、低免疫原性多能性（ＨｙｐｏＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ：「ＨＩＰ」）細胞は、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔを発現するように改変される（ＨＩＰ／ＣＤ１６ｔ、ＨＩＰ／ＣＤ３２ｔ、又はＨＩＰ／ＣＤ６４ｔ細胞）。ＨＩＰ細胞は、本明細書に概説されるいくつかの遺伝子操作に起因して宿主免疫応答を回避する。細胞は、免疫応答をトリガーする主要免疫抗原を欠き、食作用及びＮＫ細胞殺傷を回避するように工学操作される。一部の実施形態において、ＨＩＰ細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）中のＢ２Ｍ遺伝子の両方のアレルの活性を排除すること；ｉＰＳＣ中のＣＩＩＴＡ遺伝子の両方のアレルの活性を排除すること；及びｉＰＳＣ中のＣＤ４７の発現を増加させることにより作製される。ＨＩＰ細胞は、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８１３２７８３号パンフレットに詳述される。他の実施形態において、ＨＩＰ細胞は、ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０６２００８号明細書（全体として参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるとおりのＳＩＲＰαエンゲージャー分子を発現する。
本発明の他の実施形態において、低免疫原性多能性血液型Ｏ型Ｒｈ－（ＨｙｐｏＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ Ｏ Ｒｈ－：「ＨＩＰＯ－」）細胞は、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔを発現するように改変される（ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ細胞、ＨＩＰＯ－／ＣＤ３２ｔ、又はＨＩＰＯ－／ＣＤ６４ｔ細胞）。ＨＩＰＯ－細胞は、本明細書に概説されるいくつかの遺伝子又は酵素的操作に起因して宿主免疫応答を回避する。細胞は、免疫応答をトリガーする主な血液型及び免疫抗原を欠き、拒絶、食作用、又は殺傷を回避するように工学操作される。これは、規定の組織及び臓器を生成するための「既製」細胞産物の誘導を可能とする。ヒト同種ＨＩＰＯ－細胞及びその由来物をヒト患者において使用することができる利益は、有意な利益、例として、同種移植において一般に見られる長期補助免疫抑制療法及び薬物使用を回避する能力を提供する。これらは、細胞療法をそれぞれの患者のための個々の治療の要求なしで使用することができるため有意な経費節減も提供する。ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６、ＨＩＰＯ－／ＣＤ３２、又はＨＩＰＯ－／ＣＤ６４細胞は、普遍的に許容可能な由来物の生成のための普遍的な細胞資源として機能し得る。ＨＩＰＯ－細胞は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／８４６，３９９号明細書及び同第６２．８５５，４９９号明細書に詳述される。
Ｂ．定義
「多能性細胞」という用語は、自己複製及び増殖し得る一方、未分化状態を維持し得、適切な条件下で特殊化細胞タイプに分化するように誘導され得る細胞を指す。本明細書において使用される「多能性細胞」という用語は、胚性幹細胞及び他のタイプの幹細胞、例として、胎児、羊膜、又は体細胞幹細胞を包含する。例示的なヒト幹細胞系としては、Ｈ９ヒト胚性幹細胞系が挙げられる。追加の例示的な幹細胞系としては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ及びｔｈｅ Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＨＵＥＳ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを介して入手可能とされるものが挙げられる（参照により全体として本明細書に組み込まれるＣｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ．ａｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１３．（２００４）に記載）。
本明細書において使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉：内胚葉（例えば、胃関連、胃腸管、肺など）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖組織など）又は外胚葉（例えば、表皮組織及び神経系組織）のいずれかに分化する潜在性を有する。本明細書において使用される「多能性幹細胞」という用語は、非多能性細胞に由来する多能性幹細胞のタイプの「誘導多能性幹細胞」、又は「ｉＰＳＣ」も包含する。親細胞の例としては、種々の手段により多能性未分化表現型を誘導するように再プログラム化された体細胞が挙げられる。このような「ｉＰＳ」又は「ｉＰＳＣ」細胞は、ある調節遺伝子の発現を誘導することにより、又はあるタンパク質の外因性適用により作出することができる。ｉＰＳ細胞の誘導方法は当技術分野において公知であり、以下にさらに記載される（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７（１１）：２６６７－７４（２００９）；Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７）：７９５（２００８）；Ｗｏｌｔｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５８（７２３９）：７６６－７７０（２００９）；及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：３８１－３８４（２００９）参照；それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成は、以下に概説される。本明細書において使用される場合、「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト誘導多能性幹細胞であり、「ｍｉＰＳＣ」は、マウス誘導多能性幹細胞である。
「多能性幹細胞特徴」は、多能性幹細胞を他の細胞から区別する細胞の特徴を指す。適切な条件下で、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の全てからの細胞系列と関連する特徴をまとめて実証する細胞タイプへの分化を受け得る子孫を生じさせる能力は、多能性幹細胞特徴である。分子マーカーのある組み合わせの発現又は非発現も多能性幹細胞特徴である。例えば、ヒト多能性幹細胞は、以下の非限定的なリストからのマーカーの少なくともいくつか、一部の実施形態において、その全てを発現する：ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９／６Ｅ、ＡＬＰ、Ｓｏｘ２、Ｅ－カドヘリン、ＵＴＦ－１、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、及びＮａｎｏｇ。多能性幹細胞と関連する細胞形態も多能性幹細胞特徴である。本明細書に記載のとおり、細胞は内胚葉性前駆細胞及び／又は肝細胞に再プログラム化される多能性を受けることを必要としない。
本明細書において使用される場合、「複能性」又は「複能性細胞」は、限定数の他の特定の細胞タイプを生じさせ得る細胞タイプを指す。例えば、誘導複能性細胞は、内胚葉性細胞を形成し得る。さらに、複能性血液幹細胞は、それ自体、いくつかのタイプの血液細胞、例として、リンパ球、単球、好中球などに分化し得る。
本明細書において使用される場合、「少能性」という用語は、数種の異なる細胞タイプにのみ分化する成体幹細胞の能力を指す。例えば、リンパ系又は骨髄系幹細胞は、それぞれリンパ系又は骨髄系列のいずれかの細胞を形成し得る。
本明細書において使用される場合、「単能性」という用語は、単一の細胞タイプを形成する細胞の能力を意味する。例えば、精原幹細胞は、精細胞のみを形成し得る。
本明細書において使用される場合、「全能性」は、生物全体を形成する細胞の能力を意味する。例えば、哺乳類において、接合体及び第１の卵割状態の割球のみが全能性である。
本明細書において使用される場合、「非多能性細胞」は、多能性細胞でない哺乳類細胞を指す。このような細胞の例としては、分化細胞及び前駆細胞が挙げられる。分化細胞の例としては、限定されるものではないが、骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪組織及び末梢血から選択される組織からの細胞が挙げられる。例示的な細胞タイプとしては、限定されるものではないが、線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、ニューロン、骨芽細胞、破骨細胞、及びＴ細胞が挙げられる。誘導複能性細胞、内胚葉性前駆細胞、及び肝細胞の生成に用いられる出発細胞は、非多能性細胞であり得る。
分化細胞としては、限定されるものではないが、複能性細胞、少能性細胞、単能性細胞、前駆細胞、及び最終分化細胞が挙げられる。特定の実施形態において、低能性の細胞は、高能性の細胞に対して「分化している」とみなされる。
「体細胞」は、生物の身体を形成する細胞である。体細胞としては、生物中の臓器、皮膚、血液、骨及び結合組織を構成する細胞が挙げられるが、生殖細胞は除く。
細胞は、例えば、ヒト又は非ヒト哺乳類からのものであり得る。例示的な非ヒト哺乳類としては、限定されるものではないが、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、及び非ヒト霊長類が挙げられる。一部の実施形態において、細胞は、成体ヒト又は非ヒト哺乳類からのものである。一部の実施形態において、細胞は、新生児ヒト、成体ヒト、又は非ヒト哺乳類からのものである。
本明細書において使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、任意の動物、例えば、飼育動物、動物園の動物、又はヒトを指す。「対象」又は「患者」は、哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、鳥類、家畜、又はヒトであり得る。「対象」及び「患者」の具体例としては、限定されるものではないが、肝臓、心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、神経組織、血液、骨、骨髄などに関連する疾患又は障害を有する個体（特にヒト）が挙げられる。
哺乳類細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳類からのものであり得る。例示的な非ヒト哺乳類としては、限定されるものではないが、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、及び非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク、及び類人猿）が挙げられる。
本明細書における「低免疫原性多能性」細胞又は「ＨＩＰ」細胞は、その多能特徴を保持し、同種宿主中に移植した場合、依然として低減した免疫学的拒絶応答を生じさせる多能性細胞を意味する。好ましい実施形態において、ＨＩＰ細胞は、免疫応答を生じさせない。したがって、「低免疫原性」は、本明細書に概説される免疫工学操作前の親（すなわち、「ｗｔ」）細胞の免疫応答と比較して有意に低減した又は排除された免疫応答を指す。多くの場合、ＨＩＰ細胞は免疫学的にサイレントであり、依然として多能性の能力を保持する。ＨＩＰ特徴についてのアッセイは以下に概説される。
「ＨＩＰ／ＣＤ１６ｔ」、「ＨＩＰ／ＣＤ３２ｔ」、又は「ＨＩＰ／ＣＤ６４ｔ」細胞とは、本明細書では、細胞表面上にそれぞれトランケート型ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４タンパク質を有するＨＩＰ細胞を意味する。このトランケーションにより、細胞内シグナル伝達ドメインが除去される。代替的実施形態では、シグナル伝達ドメインはトランケートされるのでなく、むしろ、シグナル伝達機能がなくなるように改変される。かかる改変は、アミノ酸置換又は内部欠失であり得る。
本明細書における「低免疫原性多能性細胞Ｏ－」「低免疫原性多能性ＯＲｈ－」細胞又は「ＨＩＰＯ－」細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ及びアカゲザル因子Ｒｈ－でもあるＨＩＰＯ細胞を意味する。ＨＩＰＯ－細胞は、Ｏ－になるように酵素的に改変され、又はＯ－になるように遺伝子工学操作されたＯ－細胞から生成することができる。
「ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ」、「ＨＩＰＯ－／ＣＤ３２ｔ」、又は「ＨＩＰＯ－／ＣＤ６４ｔ」細胞とは、本明細書では、細胞表面上にそれぞれトランケート型ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４タンパク質を有するＨＩＰＯ－細胞を意味する。このトランケーションにより、細胞内シグナル伝達ドメインが除去される。代替的実施形態では、シグナル伝達ドメインはトランケートされるのでなく、むしろ、シグナル伝達機能がなくなるように突然変異を受ける。
「ＨＬＡ」又は「ヒト白血球抗原」複合体は、ヒトにおける主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。ＨＬＡ複合体を構成するこれらの細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の調節を担う。ヒトにおいて、２つのＭＨＣ、クラスＩ及びクラスＩＩ、「ＨＬＡ－Ｉ」及び「ＨＬＡ－ＩＩ」が存在する。ＨＬＡ－Ｉとしては、３つのタンパク質、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃが挙げられ、それらは細胞の内部からのペプチドを提示し、ＨＬＡ－Ｉ複合体により提示される抗原がキラーＴ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞としても公知）を誘引する。ＨＬＡ－Ｉタンパク質は、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と関連する。ＨＬＡ－ＩＩとしては、５つのタンパク質、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲが挙げられ、それらは細胞の外側からＴリンパ球に抗原を提示する。これは、ＣＤ４＋細胞（Ｔヘルパー細胞としても公知）を刺激する。「ＭＨＣ」又は「ＨＬＡ」のいずれかの使用は、遺伝子がヒト（ＨＬＡ）からのものかマウス（ＭＨＣ）からのものかに依存するため、限定的であることを意味しないことを理解すべきである。したがって、これが哺乳類細胞に関連する場合、それらの用語は本明細書において互換的に使用することができる。
本明細書における「遺伝子ノックアウト」は、特定の遺伝子をそれが残留する宿主細胞中で不活性にし、目的タンパク質の不産生又は不活性形態のいずれかをもたらすプロセスを意味する。当業者により認識されるとおり、且つ以下にさらに記載されるとおり、これは、多数の異なる手法、例として、遺伝子からの核酸配列の除去、又は配列の他の配列での中断、リーディングフレームの変更、又は核酸の調節構成成分の変更で達成することができる。例えば、目的遺伝子のコード領域の全て又は一部を除去し、又は「ナンセンス」配列で置き換えることができ、調節配列、例えば、プロモーターの全て又は一部を除去し、又は置き換えることができ、翻訳開始配列を除去し、又は置き換えることができる、などである。
本明細書における「遺伝子ノックイン」は、遺伝子機能を宿主細胞に付加するプロセスを意味する。これは、コードされるタンパク質の増加したレベルを引き起こす。当業者により認識されるとおり、これはいくつかの手法、例として、宿主細胞への遺伝子の１つ以上の追加のコピーの付加又はタンパク質の発現を増加させる内在性遺伝子の調節構成成分の変更で達成することができる。これは、プロモーターを改変し、異なるプロモーターを付加し、エンハンサーを付加し、又は他の遺伝子発現配列を改変することにより達成することができる。
「β－２ミクログロブリン」又は「β２Ｍ」又は「Ｂ２Ｍ」タンパク質は、以下に示されるアミノ酸及び核酸配列を有するヒトβ２Ｍタンパク質を指し；このヒト遺伝子はアクセッション番号ＮＣ＿００００１５．１０：４４７１１４８７～４４７１８１５９を有する。
「ＣＤ４７タンパク質」タンパク質は、以下に示されるアミノ酸及び核酸配列を有するヒトＣＤ４７タンパク質を指し；このヒト遺伝子はアクセッション番号ＮＣ＿００００１６．１０：１０８６６２０８～１０９４１５６２を有する。ＣＤ４７は、ＳＩＲＰαのリガンド（「ＳＩＲＰαエンゲージャー」分子）である。ＣＤ４７は、「自己のマーカー」であるタンパク質であり、広範な腫瘍型で過剰発現し得る。これは、癌免疫療法に対する新規の強力なマクロファージ免疫チェックポイントとして浮上しつつある。腫瘍細胞におけるＣＤ４７は、マクロファージ食作用を阻害する「ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ－ｍｅ（私を食べないで）」シグナルを送る。
「ＣＩＩＴＡタンパク質」タンパク質は、以下に示されるアミノ酸及び核酸配列を有するヒトＣＩＩＴＡタンパク質を指し；このヒト遺伝子はアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．１２：１０８０４３０９４～１０８０９４２００を有する。
細胞の文脈における「野生型」は、天然で見出される細胞を意味する。しかしながら、多能性幹細胞の文脈において、本明細書において使用される場合、これは、多能性をもたらす核酸変化を含有し得るが、低免疫原性を達成するための本発明の遺伝子編集手順を受けなかったｉＰＳＣも意味する。
本明細書における「同系」は、宿主生物及び細胞移植物の遺伝子類似性又は同一性を指し、免疫学的適合性が存在し；例えば免疫応答が生成されない。
本明細書における「同種」は、宿主生物及び細胞移植物の遺伝子非類似性を指し、免疫応答が生成される。
本明細書における「Ｂ２Ｍ－／－」は、二倍体細胞が両染色体中で不活性化されたＢ２Ｍ遺伝子を有したことを意味する。本明細書に記載のとおり、これは種々の手法で行うことができる。
本明細書における「ＣＩＩＴＡ－／－」は、二倍体細胞が両染色体中で不活性化されたＣＩＩＴＡ遺伝子を有したことを意味する。本明細書に記載のとおり、これは種々の手法で行うことができる。
本明細書における「ＣＤ４７ ｔｇ」（「導入遺伝子」を表す）又は「ＣＤ４７＋」）は、一部の例ではＣＤ４７遺伝子の少なくとも１つの追加のコピーを有することにより、宿主細胞がＣＤ４７を発現することを意味する。
「Ｏｃｔポリペプチド」は、転写因子のオクタマーファミリーの天然に生じるメンバー、又は最も近縁な天然に生じるファミリーメンバーと比較して類似（少なくとも５０％、８０％、又は９０％の活性以内）の転写因子活性を維持するそれらのバリアント、又は天然に生じるファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドのいずれかを指し、転写活性化ドメインをさらに含み得る。例示的なＯｃｔポリペプチドとしては、Ｏｃｔ－１、Ｏｃｔ－２、Ｏｃｔ－３／４、Ｏｃｔ－６、Ｏｃｔ－７、Ｏｃｔ－８、Ｏｃｔ－９、及びＯｃｔ－１１が挙げられる。Ｏｃｔ３／４（本明細書において「Ｏｃｔ４」と称される）は、ＰＯＵドメイン、Ｐｉｔ－１、Ｏｃｔ－１、Ｏｃｔ－２及びｕｒｉｃ－８６間で保存される１５０アミノ酸配列を含有する（参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｒｙａｎ，Ａ．Ｋ．＆ Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１１：１２０７－１２２５（１９９７）を参照）。一部の実施形態において、バリアントは、天然に生じるＯｃｔポリペプチドファミリーメンバー、例えば上記で列挙されるもの又は例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ－００２６９２．２（ヒトＯｃｔ４）若しくはＮＰ－０３８６６１．１（マウスＯｃｔ４）に列挙されるものと比較してそれらの配列全体にわたり、少なくとも８５％、９０％又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｏｃｔポリペプチド（例えば、Ｏｃｔ３／４又はＯｃｔ ４）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物からのものであり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｏｃｔポリペプチドは、非多能性細胞において複能性の誘導を助け得る多能性因子であり得る。
「Ｋｌｆポリペプチド」は、クルッペル様因子（Ｋｌｆ）のファミリーの天然に生じるメンバー、ショウジョウバエ胚パターン調節因子クルッペルのものと類似のアミノ酸配列を含有するジンクフィンガータンパク質、又は最も近縁な天然に生じるファミリーメンバーと比較して類似（少なくとも５０％、８０％、又は９０％の活性以内）の転写因子活性を維持する天然に生じるメンバーのバリアント、又は天然に生じるファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドのいずれかを指し、転写活性化ドメインをさらに含み得る（参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｄａｎｇ，Ｄ．Ｔ．，Ｐｅｖｓｎｅｒ，Ｊ．＆ Ｙａｎｇ，Ｖ．Ｗ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３２：１１０３－１１２１（２０００）参照）。例示的なＫｌｆファミリーメンバーとしては、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ３、Ｋｌｆ－４、Ｋｌｆ５、Ｋｌｆ６、Ｋｌｆ７、Ｋｌｆ８、Ｋｌｆ９、Ｋｌｆ１０、Ｋｌｆ１１、Ｋｌｆ１２、Ｋｌｆ１３、Ｋｌｆ１４、Ｋｌｆ１５、Ｋｌｆ１６、及びＫｌｆ１７が挙げられる。Ｋｌｆ２及びＫｌｆ－４は、マウスにおいてｉＰＳ細胞を生成し得る因子であることが見出され、関連遺伝子Ｋｌｆ１及びＫｌｆ５も同様であったが効率は低かった（参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｎａｋａｇａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：１０１－１０６（２００７）参照）。一部の実施形態において、バリアントは、天然に生じるＫｌｆポリペプチドファミリーメンバー、例えば上記で列挙されるもの又は例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＸ１６０８８（マウスＫｌｆ４）若しくはＣＡＸ１４９６２（ヒトＫｌｆ４）で列挙されるものと比較してそれらの全配列にわたり少なくとも８５％、９０％、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｋｌｆポリペプチド（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４及びＫｌｆ５）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物からのものであり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｋｌｆポリペプチドは、多能性因子であり得る。Ｋｌｆ４遺伝子又はポリペプチドの発現は、出発細胞又は出発細胞の集団において複能性の誘導を助け得る。
「Ｍｙｃポリペプチド」は、Ｍｙｃファミリーの天然に生じるメンバーのいずれかを指す（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＡｄｈｉｋａｒｙ，Ｓ．＆ Ｅｉｌｅｒｓ，Ｍ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：６３５－６４５（２００５）参照）。これは、最も近縁な天然に生じるファミリーメンバーと比較して類似（すなわち、少なくとも５０％、８０％、又は９０％の活性以内）の転写因子活性を維持するバリアントも含む。これは、天然に生じるファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをさらに含み、転写活性化ドメインをさらに含み得る。例示的なＭｙｃポリペプチドとしては、例えば、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ及びＬ－Ｍｙｃが挙げられる。一部の実施形態において、バリアントは、天然に生じるＭｙｃポリペプチドファミリーメンバー、例えば上記で列挙されるもの又は例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ２５０１５（ヒトＭｙｃ）に列挙されるものと比較してそれらの全配列にわたり少なくとも８５％、９０％、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｍｙｃポリペプチド（例えばｃ－Ｍｙｃ）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物からのものであり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｍｙｃポリペプチドは多能性因子であり得る。
「Ｓｏｘポリペプチド」は、ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス（Ｓｏｘ）転写因子の天然に生じるメンバーのいずれかを指し、最も近縁な天然に生じるファミリーメンバーと比較して類似（すなわち、少なくとも５０％、８０％、又は９０％の活性以内）の転写因子活性を維持する高移動度群（ＨＭＧ）ドメイン、又はそれらのバリアントの存在を特徴とする。これは、天然に生じるファミリーメンバーの少なくともＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドも含み、転写活性化ドメインをさらに含み得る（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＤａｎｇ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３２：１１０３－１１２１（２０００）参照）。例示的なＳｏｘポリペプチドとしては、例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ－２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ８、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１０、Ｓｏｘ１１、Ｓｏｘ１２、Ｓｏｘ１３、Ｓｏｘ１４、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、Ｓｏｘ－２１、及びＳｏｘ３０が挙げられる。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と類似の効率でｉＰＳ細胞を生じさせることが示されており、遺伝子Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５及びＳｏｘ１８もｉＰＳ細胞を生成することが示されているがＳｏｘ２よりもいくらか効率が低い（参照により全体として本明細書に組み込まれるＮａｋａｇａｗａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：１０１－１０６（２００７）参照）。一部の実施形態において、バリアントは、天然に生じるＳｏｘポリペプチドファミリーメンバー、例えば上記に列挙されるもの又は例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ８３４３５（ヒトＳｏｘ２）に列挙されるものと比較してそれらの全配列にわたり少なくとも８５％、９０％、又は９５％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｓｏｘポリペプチド（例えばＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５又はＳｏｘ１８）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物からのものであり得る。一般に、操作される細胞の種と同じ種のタンパク質が使用される。Ｓｏｘポリペプチドは多能性因子であり得る。本明細書に考察されるとおり、ＳＯＸ２タンパク質がｉＰＳＣの生成において特に使用される。
本明細書における「分化低免疫原性多能性細胞」又は「分化ＨＩＰ細胞」又は「ｄＨＩＰ細胞」は、（例えばＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのノックアウト並びにＣＤ４７のノックインにより）低免疫原性を有するように工学操作されており、次いで対象中への最終的な移植のための細胞タイプに分化されるｉＰＳ細胞を意味する。したがって、例えば、ＨＩＰ細胞は、肝細胞（「ｄＨＩＰ肝細胞」）、ベータ様膵臓細胞又は膵島オルガノイド（「ｄＨＩＰベータ細胞」）、内皮細胞（「ｄＨＩＰ内皮細胞」）などに分化させることができる。同様の定義は、「分化ＨＩＰ／ＣＤ６４ｔ」及び分化したＨＩＰＯ－／ＣＤ６４ｔ細胞に当てはまる。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈におけるパーセント「同一性」という用語は、以下に記載の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ又は当業者が利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用し、又は目視検査により測定して比較し、一致が最大となるようにアラインした場合、規定の割合の同じヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域にわたり、例えば、機能ドメインにわたり存在し得、或いは、比較すべき２つの配列の全長にわたり存在し得る。配列比較について、典型的には１つの配列が試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は目視検査（一般にＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、以下参照）により実施することができる。
パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、それはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に利用可能である。
「阻害剤」、「活性化因子」、及び「モジュレーター」は、生物学的関連分子の機能又は発現に影響を及ぼす。「モジュレーター」という用語には、阻害剤及び活性化因子の両方が含まれる。これらは、標的分子の発現又は活性についてのインビトロ及びインビボアッセイを使用して同定することができる。
「阻害剤」は、例えば、発現を阻害し、又は標的分子若しくはタンパク質に結合する作用物質である。これらは、部分的若しくは全体的に刺激を遮断し得、又はプロテアーゼ阻害剤活性を有し得る。これらは、記載される標的タンパク質の活性の不活性化、脱感作、又は下方調節を含め、活性化を低減させ、減少させ、防止し、又は遅延させ得る。モジュレーターは、標的分子又はタンパク質のアンタゴニストであり得る。
「活性化因子」は、例えば、標的分子又はタンパク質の機能又は発現を誘導し、又は活性化させる作用物質である。これらは、標的分子に結合し、標的分子活性を刺激し、増加させ、開放し、活性化させ、又は促進し得る。活性化因子は、標的分子又はタンパク質のアゴニストであり得る。
「相同体」は、参照分子とヌクレオチド配列、ペプチド配列、機能、又は構造レベルにおいて類似する生物活性分子である。相同体としては、参照配列とあるパーセント同一性を共有する配列誘導体を挙げることができる。したがって、一実施形態において、相同又は誘導体配列は、少なくとも７０パーセントの配列同一性を共有する。具体的な実施形態において、相同又は誘導体配列は、少なくとも８０又は８５パーセントの配列同一性を共有する。具体的な実施形態において、相同又は誘導体配列は、少なくとも９０パーセントの配列同一性を共有する。具体的な実施形態において、相同又は誘導体配列は、少なくとも９５パーセントの配列同一性を共有する。より具体的な実施形態において、相同又は誘導体配列は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を共有する。相同又は誘導体核酸配列は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で参照核酸配列に結合し続けるそれらの能力によっても定義することができる。参照分子に対して構造又は機能的類似性を有する相同体は、参照分子の化学誘導体であり得る。構造及び機能的相同体並びに誘導体を検出し、生成し、スクリーニングする方法は当技術分野において公知である。
「ハイブリダイゼーション」は一般に、相補鎖がそれらの融解温度未満の環境中に存在する場合に再アニールする変性ＤＮＡの能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用することができる相対温度は高くなる。結果として、より高い相対温度は反応条件をより高ストリンジェンシーとする傾向がある一方、より低い温度は反応条件をより低ストリンジェンシーとする傾向があるということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの追加の詳細及び説明については、参照により全体として本明細書に組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）参照。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定可能であり、一般にプローブの長さ、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、適切なアニーリングのために、プローブが長いほど高い温度が要求される一方、プローブが短いほど必要な温度は低くなる。
「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書において定義される場合、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／Ｐｈ６．５の５０Ｍｍのリン酸ナトリウム緩衝液と、７５０Ｍｍの塩化ナトリウム、７５Ｍｍのクエン酸ナトリウムと用いるもの；又は（３）４２℃において５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０Ｍｍのリン酸ナトリウム（Ｐｈ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｌ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストランを用いる溶液中での一晩のハイブリダイゼーションと、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中での４２℃における１０分間の洗浄とそれに続く５５℃におけるＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣからなる１０分間の高ストリンジェンシー洗浄により特定することができる。
本明細書全体を通じて与えられる全ての最大の数値限定には、全てのより低い数値限定が本明細書に明示されているかのように、全てのより低い数値限定が含まれるものとする。本明細書に全体を通じて与えられる全ての最小の数値限定には、全てのより高い数値限定が本明細書に明示されているかのように、全てのより高い数値限定が含まれる。本明細書全体を通じて与えられる全ての数値範囲には、全てのより狭い数値範囲が全て本明細書に明示されているかのように、そのようなより広い数値範囲内に収まる全てのより狭い数値範囲が含まれる。
本明細書において使用される場合、「改変」という用語は、親分子からの改変分子を物理的に区別する変更を指す。一実施形態において、本明細書に記載の方法に従って調製されるＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ４７、ＨＳＶｔｋ、ＥＣ－ＣＤ、又はｉＣａｓｐ９バリアントポリペプチド中のアミノ酸変化は、本明細書に記載の方法に従って改変されていない対応する親遺伝子又は細胞、例えば、野生型タンパク質、天然に生じる突然変異体タンパク質又はそのようなバリアントポリペプチドの改変を含まない別の工学操作されたタンパク質とそれを区別する。別の実施形態において、バリアントポリペプチドは、未改変ポリペプチドからバリアントポリペプチドの機能を区別する１つ以上の改変を含む。例えば、バリアントポリペプチド中のアミノ酸変化は、その受容体結合プロファイルに影響を及ぼす。他の実施形態において、バリアントポリペプチドは、置換、欠失、若しくは挿入の改変、又はそれらの組み合わせを含む。別の実施形態において、バリアントポリペプチドは、未改変ポリペプチドの親和性と比較して受容体についてのその親和性を増加させる１つ以上の改変を含む。
一実施形態において、バリアントポリペプチドは、対応する天然又は親配列と比べて１つ以上の置換、挿入、又は欠失を含む。ある実施形態において、バリアントポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１～４０、４１～５０、又は５１個以上の改変を含む。
本明細書における「エピソームベクター」は、細胞の細胞質中に存在し得、自律的に複製し得る遺伝子ベクターを意味し；例えば、これは宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれない。多数のエピソームベクターが当技術分野において公知であり、以下に記載される。
遺伝子の文脈における「ノックアウト」は、ノックアウトを保有する宿主細胞が遺伝子の機能タンパク質産物を産生しないことを意味する。本明細書に概説されるとおり、ノックアウトは、種々の手法で、コード配列の全て又は一部を除去すること、機能タンパク質が産生されないように（トランケート又はナンセンス配列のいずれか）フレームシフト突然変異を導入すること、遺伝子が転写されないように調節構成成分（例えば、プロモーター）を除去又は変更すること、ｍＲＮＡへの結合を介して翻訳を妨害することなどから生じ得る。一般に、ノックアウトは、細胞の子孫も永久的にノックアウトを担持するようにゲノムＤＮＡレベルにおいてもたらされる。
遺伝子の文脈における「ノックイン」は、ノックインを保有する宿主細胞が細胞中で活性なより機能的なタンパク質を有することを意味する。本明細書に概説されるとおり、ノックインは、種々の方法で、通常はタンパク質をコードする導入遺伝子（ｔｇ）の少なくとも１つのコピーの細胞中への導入により行うことができるが、これは、調節構成成分を置き換えることによっても、例えば、構成的プロモーターを内在性遺伝子に付加することにより行うこともできる。一般に、ノックイン技術は、宿主細胞中への導入遺伝子の追加コピーの組込みをもたらす。
ＶＩ．本発明の細胞
本発明は、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔを発現する多能性細胞を作成するための組成物及び方法論を提供する。本発明の一部の態様において、細胞は、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）、Ｏ－人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣＯ－）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、Ｏ－胚性幹細胞（ＥＳＣＯ－）、低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞、低免疫原性多能性Ｏ－（ＨＩＰＯ－）細胞、又はこれらから誘導されるか若しくは分化した細胞から誘導されることになる。他の態様において、細胞は、遺伝子編集された初代細胞を含め、初代細胞である。本発明の細胞はまた、疾患の治療又は損傷組織の回復に使用される膵島細胞、甲状腺細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、心筋細胞、又は網膜色素内皮細胞であってもよい。
Ａ．遺伝子変更のための方法
本発明は、細胞内又は無細胞条件下で核酸配列を改変してＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現を有する両細胞を生成する方法を含む。例示的な技術としては、相同組換え、ノックイン、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ））／Ｃａｓ９、及び他の部位特異的ヌクレアーゼ技術が挙げられる。これらの技術により、所望の遺伝子座部位における二本鎖ＤＮＡ分解が可能になる。これらの制御された二本鎖分解は、特異的遺伝子座部位における相同組み換えを促進する。このプロセスは、核酸分子、例えば、染色体の特異的配列の標的化に焦点を当て、その配列を認識し、それに結合し、核酸分子中の二本鎖分解を誘導するエンドヌクレアーゼを用いる。二本鎖分解は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え（ＨＲ）のいずれかにより修復される。
当業者により認識されるとおり、多数の異なる技術を使用して本発明の多能性細胞を工学操作することができ、本明細書に概説されるとおり低免疫原性になるようにｉＰＳＣを工学操作する。
一般に、これらの技法は、個別に、又は組み合わせで使用することができる。例えば、これらの技法はＦｃ受容体発現細胞の作成に使用することができ、この受容体はトランケート型であり、細胞質シグナル伝達ドメインの一部又は全てが除去されているものである。或いは、このドメインは、欠失、置換、又はナンセンス突然変異によって改変されてもよい。
Ｆｃ結合時、ＣＤ６４の細胞質テールが、ｓｒｃ関連チロシンキナーゼファミリー（Ｆｙｎ及びＬｙｎなど）及びＳｙｋファミリーキナーゼと相互作用する。これらは、関連するＦｃＲガンマ鎖（その自己遺伝子ＦＣＥＲ１Ｇによってコードされる）にある免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）と称される細胞質アミノ酸モチーフをリン酸化する。これは免疫細胞の活性化を媒介する。
このように、本発明は、ＦｃＲガンマ鎖ＩＴＡＭの活性化を防ぎ、ひいては下流シグナル伝達を防ぐため、ｓｒｃ関連チロシンキナーゼファミリー及びＳｙｋファミリーキナーゼと相互作用する細胞質テールを改変することを提供する。
ＣＤ６４細胞質テールは、配列番号７からの以下の６０アミノ酸である：
ＲＫＥＬＫＲＫＫＫＷＤＬＥＩＳＬＤＳＧＨＥＫＫＶＩＳＳＬＱＥＤＲＨＬＥＥＥＬＫＣＱＥＱＫＥＥＱＬＱＥＧＶＨＲＫＥＰＱＧＡＴ
一部の実施形態において、Ｆｃ受容体の細胞質ドメインは、生理機能の異なる別の細胞質ドメイン（ｃｙｔｏｐｌａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎ）に交換される。例えば、トランスフェリン受容体（例えばＴｆＲ１又はＴｆＲ２）の細胞質ドメインは、連続的なエンドサイトーシスを促進するため、高い受容体代謝回転につながる。したがって、特定の実施形態において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃ受容体細胞外ドメインとトランスフェリン受容体細胞質ドメインとの間のキメラである。これは、細胞表面上のＦｃ受容体ドメインに当初結合していたＩｇＧ抗体のエンドサイトーシス及び崩壊を促進することになる。このように、好ましい実施形態において、本発明の細胞は、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４細胞表面ドメインとＴｆＲ１又はＴｆＲ２細胞質ドメインとを含むキメラを発現する。
その上、これらの技法は、ＨＩＰ細胞の作成に用いられてもよい。ＣＲＩＳＰＲを用いて、工学操作された細胞中の活性なＢ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡタンパク質の発現を、ＣＤ４７又は他のＳＩＲＰα－エンゲージャータンパク質の発現をノックインするウイルス技法（例えばレンチウイルス）で低減してもよい。また、当業者は理解するであろうとおり、一実施形態は、ＣＲＩＳＰＲステップを順次利用してＢ２Ｍをノックアウトし、続いてＣＲＩＳＰＲステップを利用してＣＩＩＴＡをノックアウトして、最終的なレンチウイルスのステップでＣＤ４７又は他のＳＩＲＰα－エンゲージャータンパク質の発現をノックインするが、これらの遺伝子は、異なる順番で異なる技術を用いて操作することができる。
下記でより詳細に考察されるとおり、一般に再プログラム化遺伝子の一過的発現を行って多能性幹細胞を生成／誘導する。
ａ．ＣＲＩＳＰＲ技術
一実施形態において、当技術分野において公知のとおり、クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート）／Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ」）技術を使用して細胞を操作する。ＣＲＩＳＰＲを使用して出発ｉＰＳＣを生成し、又はｉＰＳＣからＨＩＰ細胞を生成することができる。ＣＲＩＳＰＲをベースとする多数の技術が存在する、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＤｏｕｄｎａ ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５８０９６参照。ＣＲＩＳＰＲ技術及びキットは市販されている。
ｂ．ＴＡＬＥＮ技術
一部の実施形態において、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）法を使用して本発明のＨＩＰ細胞を作製する。ＴＡＬＥＮは、事実上任意の所望のＤＮＡ配列に結合し、それを切断するように工学操作することができるヌクレアーゼと組み合わせられた制限酵素である。ＴＡＬＥＮキットは市販されている。
ｃ．ジンクフィンガー技術
一実施形態において、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して細胞を操作する。Ｚｎフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂ドメインに融合させることにより生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは特異的な所望のＤＮＡ配列を標的化するように工学操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内でユニーク配列を標的化することが可能になる。内在性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、ＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮと同様に、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを正確に変更することができる。
ｄ．ウイルスベースの技術
本発明のＨＩＰ細胞を生成するために（並びにｉＰＣＳの最初の生成のため）使用することができる広範なウイルス技術、例として、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びセンダイウイルスベクターの使用が存在する。ｉＰＳＣの生成において使用されるエピソームベクターが以下に記載される。
ｅ．干渉ＲＮＡを使用する遺伝子の下方調節
他の実施形態において、ＨＬＡ分子において使用されるタンパク質をコードする遺伝子をＲＮＡｉ技術により下方調節する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、多くの場合、特異的ｍＲＮＡ分子の分解を引き起こすことにより、ＲＮＡ分子が遺伝子発現を阻害するプロセスである。２つのタイプのＲＮＡ分子（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））がＲＮＡ干渉の中心である。これらは、標的ｍＲＮＡ分子に結合し、その活性を増加又は減少させる。ＲＮＡｉは、寄生性の核酸、例えば、ウイルス及びトランスポゾンからのものに対する細胞防御を助ける。ＲＮＡｉは発生にも影響を与える。
ｓｄＲＮＡ分子は、１９～２１塩基のガイド（アンチセンス）鎖を含む非対称ｓｉＲＮＡのクラスである。これらは、５’リン酸、２’Ｏｍｅ又は２’Ｆ修飾ピリミジン、及び３’位における６つのホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｏａｔｅ）を含有する。これらは、３’コンジュゲートステロール部分、３’位における２つのホスポチオエート（ｐｈｏｓｐｏｔｉｏａｔｅ）、及び２’Ｏｍｅ修飾ピリミジンを含有するセンス鎖も含有する。両方の鎖は、長さ３を超えない未修飾プリンの連続ストレッチとともに２’Ｏｍｅプリンを含有する。ｓｄＲＮＡは、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，７９６，４４３号明細書に開示される。
これらの技術の全てについて、周知の組換え技術を使用して本明細書に概説されるとおり組換え核酸を生成する。ある実施形態において、組換え核酸（所望のポリペプチド、例えば、ＣＤ４７、又は破壊配列のいずれかをコードする）は、発現構築物中で１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に結合させることができる。調節ヌクレオチド配列は、一般に宿主細胞及び治療すべき対象に適切である。種々の宿主細胞について、多くのタイプの適切な発現ベクター及び好適な調節配列が当技術分野において公知である。典型的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、限定されるものではないが、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又は活性化因子配列を挙げることができる。当技術分野において公知の構成的又は誘導性プロモーターも企図される。プロモーターは、天然に生じるプロモーター、又は２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、エピソーム、例えば、プラスミド上で細胞中に存在し得、又は発現構築物は染色体中に挿入することができる。具体的な実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択マーカー遺伝子を含む。ある実施形態は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に結合しているバリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書における使用のための調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメントが挙げられる。ある実施形態において、発現ベクターは、形質転換すべき宿主細胞の選択、発現が望まれる特定のバリアントポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御するための能力、又はベクターによりコードされる任意の他のタンパク質、例えば、抗生物質マーカーの発現のために設計される。
好適な哺乳類プロモーターの例としては、例えば、以下の遺伝子からのプロモーター：ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（国際公開第９７／１５６６４号パンフレット）、サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のロングターミナルリピート領域、マウス乳癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルスロングターミナルリピート領域、及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターが挙げられる。他の異種哺乳類プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン又は熱ショックプロモーターである。
追加の実施形態において、哺乳類宿主細胞での使用のためのプロモーターは、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（英国特許第２，２１１，５０４号明細書、１９８９年７月５日公開）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得ることができる。さらなる実施形態において、異種哺乳類プロモーターが使用される。例としては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、及び熱ショックプロモーターが挙げられる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、簡便に、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として得られる。Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３－１２０（１９７８）。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、簡便に、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２）。前述の参考文献は参照により全体として組み込まれる。
Ｂ．多能性細胞の生成
本発明は、多能性細胞から非免疫原性多能性細胞を産生する方法を提供する。したがって、第１のステップは、多能性幹細胞を提供することである。
マウス及びヒト多能性幹細胞（一般にｉＰＳＣと称され；マウス細胞についてはｍｉＰＳＣ又はヒト細胞についてはｈｉＰＳＣ）の生成は、一般に当技術分野において公知である。当業者により認識されるとおり、ｉＰＣＳの生成のための種々の異なる方法が存在する。４つの転写因子、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４のウイルス導入を使用して、マウス胚又は成体線維芽細胞から最初の誘導が行われた；全体として、具体的には文献に概説される技術について参照により本明細書に組み込まれるＴａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６（２００６）参照。それ以降、多数の方法が開発された；両方とも全体として、特にｈｉＰＳＣを生成する方法について、参照により本明細書に明確に組み込まれる、概説についてはＳｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ７（１）：１１６－１２５（２０１５）、及びＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ａｎｄ Ｖｅｒｍｕｒｉ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１３参照（例えば後者の参考文献の第３章参照）。
一般に、ｉＰＳＣは、通常はエピソームベクターを使用して導入される、宿主細胞中での１つ以上の「再プログラム化因子」の一過的発現により生成される。これらの条件下で、少量の細胞がｉＰＳＣになるように誘導される（選択マーカーが使用されないため一般にこのステップの効率は低い）。細胞が「再プログラム化」され、多能性になると、それらはエピソームベクターを損失し、内在性遺伝子を使用して因子を産生する。このエピソームベクターの損失は、「無痕跡（ｚｅｒｏ ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）」細胞と呼ばれる細胞をもたらす。（特に宿主細胞のゲノム中の）遺伝子改変が少ないほど良いため、これは望ましい。したがって、得られるｈｉＰＳＣは永久的な遺伝子改変を有さないことが好ましい。
また当業者により認識されるとおり、使用することができ、又は使用される再プログラム化因子の数は変動し得る。一般に、より少ない再プログラム化因子が使用される場合、多能性状態への細胞の形質転換の効率が低下し、「多能性」も低下し、例えば、より少ない再プログラム化因子は、十分に多能性ではないが、より少ない細胞タイプにのみ分化可能であり得る細胞をもたらし得る。
一部の実施形態において、単一の再プログラム化因子、ＯＣＴ４が使用される。他の実施形態において、２つの再プログラム化因子、ＯＣＴ４及びＫＬＦ４が使用される。他の実施形態において、３つの再プログラム化因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４及びＳＯＸ２が使用される。他の実施形態において、４つの再プログラム化因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ－Ｍｙｃが使用される。他の実施形態において、ＳＯＫＭＮＬＴ；ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及びＳＶ４０Ｌ Ｔ抗原から選択される５、６又は７つの再プログラム化因子を使用することができる。
一般に、当技術分野において公知のもの及び市販のものなどのエピソームベクター上でこれらの再プログラム化因子遺伝子が提供される。例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎは、ｈｉＰＳＣの無痕跡生成のためのセンダイウイルス再プログラム化キットを販売している、カタログ番号Ａ３４５４６参照。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒは、ＥＢＮＡベース系も販売している、カタログ番号Ａ１４７０３参照。
さらに、利用可能な多数の市販のｈｉＰＳＣ系が存在する；例えば、無痕跡でウイルス組込みのないヒトｉＰＳＣ細胞系であるＧｉｂｃｏ（登録商標）エピソームｈｉＰＳＣ系、Ｋ１８９４５参照（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１、前掲参照）。
一般に、当技術分野において公知のとおり、ｉＰＳＣは、本明細書に記載のとおり再プログラム化因子を一過的に発現させることにより、非多能性細胞、例えば、ＣＤ３４＋臍帯血細胞、線維芽細胞などから作製される。
例えば、良好なｉＰＳＣはまた、再プログラム化効率が低減するものの、Ｃ－Ｍｙｃを省略してＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４のみを使用して生成された。
一般に、ｉＰＳＣは、例としてＫＬＦ４、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＥＳＲＲＢ、ＴＢＸ３、ｃ－Ｍｙｃ及びＴＣＬ１が挙げられるある因子の発現を特徴とする。本発明の目的のためのこれらの因子の新たな又は増加した発現は、内在性遺伝子座の誘導若しくはモジュレーションを介するものであり、又は導入遺伝子からの発現からのものであり得る。
例えば、マウスｉＰＳＣは、全体として、具体的にはｍｉＰＳＣの生成のための方法及び試薬について参照により本明細書に組み込まれるＤｉｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５，Ｊａｎ．２８；５：８０８１（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０８０８１）の方法を使用して生成することができる。例えば、全体として、具体的には本明細書に概説される方法について参照により本明細書に組み込まれるＢｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１１ ６（４）：１８２９３も参照。
一部の例において、細胞の多能性は、本明細書及び実施例に概説されるとおり、例えば、再プログラム化因子をアッセイすることにより、又は分化反応を実施することにより、本明細書に概説されるとおり測定され、又は確認される。
Ｃ．低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞の生成
多能性細胞からのＨＩＰ細胞の生成は３つという少ない遺伝子変化により行われ、細胞活性の最小の破壊をもたらすが、免疫サイレンシングを細胞に付与する。
本明細書に考察されるとおり、一実施形態は、ＭＨＣ Ｉ及びＩＩ（細胞がヒトである場合、ＨＬＡ Ｉ及びＩＩ）のタンパク質活性の低減又は排除を利用する。これは、それらの構成成分をコードする遺伝子を変更することにより行うことができる。一実施形態において、遺伝子のコード領域又は調節配列は、ＣＲＩＳＰＲを使用して破壊される。別の実施形態において、干渉ＲＮＡ技術を使用して、遺伝子翻訳を低減させる。第３の変化は、マクロファージ食作用に対する感受性を調節する遺伝子、例えば、ＣＤ４７又はＳＩＲＰα－エンゲージャーの変化であり、これは一般にウイルス技術を使用する遺伝子の「ノックイン」である。
ＣＲＩＳＰＲを遺伝子改変に使用する一部の例において、細胞系の高効率編集を可能にするＣａｓ９構築物を含有するｈｉＰＳＣ細胞を使用することができる；例えば、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＨｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ Ｃａｓ９ ｉＰＳＣ細胞株、Ａ３３１２４参照。
１．ＨＬＡ－Ｉ低減
本発明のＨＩＰ細胞は、ＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合、ＨＬＡ Ｉ）の低減を含む。
当業者により認識されるとおり、機能の低減は、多数の手法、例として、遺伝子からの核酸配列の除去、配列の他の配列での中断、又は核酸の調節構成成分の変更で達成することができる。例えば、目的遺伝子のコード領域の全て又は一部を除去することができ、又は「ナンセンス」配列で置き換えることができ、フレームシフト突然変異を作製することができ、調節配列、例えば、プロモーターの全て又は一部を除去し、又は置き換えることができ、翻訳開始配列を除去し、又は置き換えることができる、などである。
当業者により認識されるとおり、多能性細胞におけるＭＨＣ Ｉ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合、ＨＬＡ Ｉ）の良好な低減は、当技術分野において公知の技術を使用して、及び以下に記載のとおり；例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識抗体を使用するＦＡＣＳ技術；例えば、ヒト主要組織適合性ＨＬＡクラスＩ抗原のアルファ鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体を使用して測定することができる。
ａ．Ｂ２Ｍ変更
一実施形態において、ＨＬＡ－Ｉ活性の低減は、多能性幹細胞におけるβ－２ミクログロブリン遺伝子の発現を破壊することにより行われ、そのヒト配列は本明細書に開示される。この変更は一般に本明細書において遺伝子「ノックアウト」と称され、本発明のＨＩＰ細胞において、これは宿主細胞において両アレル上で行われる。一般に、両方の破壊を行うための技術は同じである。
特に有用な実施形態は、遺伝子を破壊するためにＣＲＩＳＰＲ技術を使用する。一部の例において、機能タンパク質が産生されないようにＣＲＩＳＰＲ技術を使用して遺伝子のコード領域中に小さい欠失／挿入を導入し、多くの場合、トランケートされた非機能タンパク質が作製されるように終止コドンの生成をもたらすフレームシフト突然変異がもたらされる。
したがって、有用な技術は、マウス中のＢ２Ｍ遺伝子又はヒト中のＢ２Ｍ遺伝子のコード配列を標的化するように設計されたＣＲＩＳＰＲ配列を使用することである。遺伝子編集後、形質移入されたｉＰＳＣ培養物を単一細胞に解離させる。単一細胞をフルサイズのコロニーに拡張し、ＣＲＩＳＰＲ開裂部位からの異常配列の存在をスクリーニングすることによりＣＲＩＳＰＲ編集を試験する。両アレルが欠失するクローンをピックする。このようなクローンはＰＣＲにより実証されるとおりＢ２Ｍを発現せず、ＦＡＣＳ分析により実証されるとおりＨＬＡ－Ｉを発現しなかった（例えば、実施例１及び６参照）。
Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されたか否かを試験するためのアッセイは公知であり、本明細書に記載される。一実施形態において、アッセイは、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体でプローブする細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態において、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ－ＰＣＲ）が不活性化変更の存在を裏付ける。
さらに、ＨＬＡ Ｉ複合体が細胞表面上で発現されないことを確認するために細胞を試験することができる。これは、上記考察のとおり１つ以上のＨＬＡ細胞表面構成成分に対する抗体を使用してＦＡＣＳ分析によりアッセイすることができる。
注目すべきことに、両アレルにおいてＢ２Ｍ遺伝子のサイレンシングを試行した場合、他のものでは不良な結果であった。例えば、Ｇｏｒｎａｌｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｂｔ．３８６０）参照。
２．ＨＬＡ－ＩＩ低減
ＨＬＡ Ｉの低減に加え、本発明のＨＩＰ細胞は、ＭＨＣ ＩＩ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合、ＨＬＡ ＩＩ）も欠く。
当業者により認識されるとおり、機能の低減は、多数の手法、例として、遺伝子からの核酸配列の除去、遺伝子への核酸配列の付加、リーディングフレームの破壊、配列の他の配列での中断又は核酸の調節構成成分の変更で達成することができる。一実施形態において、目的遺伝子のコード領域の全て又は一部を除去することができ、又は「ナンセンス」配列で置き換えることができる。別の実施形態において、調節配列、例えば、プロモーターを除去し、又は置き換えることができ、翻訳開始配列を除去し、又は置き換えることができる、などである。
多能性細胞又はその由来物におけるＭＨＣ ＩＩ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合、ＨＬＡ ＩＩ）の良好な低減は、当技術分野において公知の技術、例えば、タンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技術、ｒｔ－ＰＣＲ技術などを使用して測定することができる。
ａ．ＣＩＩＴＡ変更
一実施形態において、ＨＬＡ－ＩＩ活性の低減は、多能性幹細胞におけるＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を破壊することにより行われ、そのヒト配列は本明細書に示される。この変更は一般に本明細書において遺伝子「ノックアウト」と称される。本発明のＨＩＰ細胞において、これは宿主細胞において両アレル上で行われる。
ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されたか否かを試験するためのアッセイは公知であり、本明細書に記載される。一実施形態において、アッセイは、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体でプローブする細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態において、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ－ＰＣＲ）が不活性化変更の存在を裏付ける。
さらに、ＨＬＡ ＩＩ複合体が細胞表面上で発現されないことを確認するために、細胞を試験することができる。ここでも、アッセイは当技術分野で公知のとおり行われる。例示的な分析としては、一般に、以下に概説されるヒトＨＬＡクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ及びほとんどのＤＱ抗原に結合する市販抗体を使用するウエスタンブロット又はＦＡＣＳ分析が挙げられる。
特に有用な実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用してＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊する。全てのＭＨＣ ＩＩ分子について必須の転写因子である、マウス中のＣｉｉｔａ遺伝子又はヒト中のＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列を標的化するようにＣＲＩＳＰＲを設計した。遺伝子編集後、形質移入されたｉＰＳＣ培養物を単一細胞に解離させた。これらをフルサイズのコロニーに拡張し、ＣＲＩＳＰＲ開裂部位からの異常配列の存在をスクリーニングすることにより良好なＣＲＩＳＰＲ編集を試験した。欠失のあるクローンは、ＰＣＲにより決定されたとおりＣＩＩＴＡを発現せず、ＦＡＣＳ分析により決定されたとおりＭＨＣ ＩＩ／ＨＬＡ－ＩＩを発現しなかった。
３．食作用低減
一般に、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡノックアウトを使用すると、ＨＬＡ Ｉ及びＩＩ（又はＭＨＣ Ｉ及びＩＩ）の低減に加え、本発明のＨＩＰ細胞は、低減したマクロファージ食作用及びＮＫ細胞殺傷に対する感受性を有する。得られたＨＩＰ細胞は、１つ以上のＣＤ４７導入遺伝子に起因して免疫マクロファージ及び自然経路を「回避する」。
ａ．ＣＤ４７増加
一部の実施形態において、低減したマクロファージ食作用及びＮＫ細胞殺傷感受性は、ＨＩＰ細胞表面上でのＣＤ４７の増加から生じる。これは、「ノックイン」又はトランスジェニック技術を使用して当業者により認識されるとおりいくつかの手法で行われる。一部の例において、ＣＤ４７発現の増加は、１つ以上のＣＤ４７導入遺伝子から生じる。
したがって、一部の実施形態において、ＣＤ４７遺伝子の１つ以上のコピーをＨＩＰ細胞に誘導性又は構成的プロモーターの制御下で付加し、後者が好ましい。一部の実施形態において、レンチウイルス構築物を本明細書に記載のとおり、又は当技術分野において公知のとおり用いる。ＣＤ４７遺伝子は、当技術分野において公知のとおり好適なプロモーターの制御下で宿主細胞のゲノム中に組込み得る。
Ｂ２Ｍ－／－ ＣＩＩＴＡ－／－ ｉＰＳＣからＨＩＰ細胞系を生成した。ブラストサイジンマーカーを使用してＣＤ４７を発現するレンチウイルスベクターを含有する細胞を選択した。ＣＤ４７遺伝子配列を合成し、ブラストサイジン耐性を有するプラスミドレンチウイルスｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中にＤＮＡをクローニングした。
一部の実施形態において、内在性ＣＤ４７遺伝子の調節配列を変更することにより、例えば、内在性プロモーターを構成的プロモーターに、又は異なる誘導性プロモーターに交換することにより、ＣＤ４７遺伝子の発現を増加させることができる。これは一般に公知の技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲを使用して行うことができる。
変更させたら、公知の技術、例えば、実施例に記載のもの、例えば、抗ＣＤ４７抗体を使用するウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ又はＦＡＣＳアッセイを使用して、十分なＣＤ４７発現の存在をアッセイすることができる。一般に、この文脈における「十分」は、ＮＫ細胞殺傷をサイレンシングするＨＩＰ細胞表面上でのＣＤ４７の発現の増加を意味する。細胞のＭＨＣ Ｉが除去されると、細胞上の天然発現レベルが低すぎてＮＫ細胞溶解からそれらを保護することができない。
ＳＩＲＰαの会合は、工学操作された分子又は代わりの分子によって達成されてもよい。本発明の一部の態様において、エンゲージャー分子はタンパク質である。他の態様（ａｐｓｅｃｔｓ）において、タンパク質は融合タンパク質である。他の態様において、融合タンパク質は、ＣＤ４７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。本発明の他の態様において、ＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインを含む。本発明の他の態様において、エンゲージャー分子は、ＳＩＲＰαに結合する抗体Ｆａｂ又は単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含む。他の態様において、Ｆａｂ又はｓｃＦＶは、その解離定数（Ｋｄ）によって測られる親和性でＳＩＲＰαに結合し、ここでＫｄは、約１０－７～１０－１３Ｍである。ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０６２００８号明細書（全体として参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
本発明の一部の態様において、エンゲージャー分子は、ＳＩＲＰαに結合する１つ以上の抗体相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＤＲ）を含む。
４．自殺遺伝子
一部の実施形態において、本発明は、「自殺遺伝子」又は「自殺スイッチ」を含む低免疫原性多能性細胞を提供する。これらは、不所望に成長及び分裂する場合に低免疫原性多能性細胞の死滅を引き起こし得る「安全スイッチ」として機能するように取り込まれる。「自殺遺伝子」消失アプローチとしては、規定の化合物により活性化された場合のみ細胞殺傷をもたらすタンパク質をコードする遺伝子移入ベクター中の自殺遺伝子が挙げられる。自殺遺伝子は、無毒性化合物を高毒性代謝産物に選択的に変換する酵素をコードし得る。この結果は、酵素を発現する細胞の特異的排除である。一部の実施形態において、自殺遺伝子はヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であり、トリガーはガンシクロビルである。他の実施形態において、自殺遺伝子は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）遺伝子であり、トリガーは５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である（両方とも参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｂａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２－１９４３（２０１２）、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．８：７３－８（１９９８））。
他の実施形態において、自殺遺伝子は誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパーゼタンパク質は、アポトーシスを誘導し得るカスパーゼタンパク質の少なくとも一部を含む。一実施形態において、カスパーゼタンパク質の一部は配列番号６に例示される。好ましい実施形態において、誘導性カスパーゼタンパク質はｉＣａｓｐ９である。これは、ヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子に一連のアミノ酸を介して連結しているＦ３６Ｖ突然変異を有する、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質、ＦＫＢＰ１２の配列を含む。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、小分子二量体化剤ＡＰ１９０３に高い親和性で結合する。したがって本発明におけるｉＣａｓｐ９の自殺機能は二量体誘導化合物（ＣＩＤ）の投与によりトリガーされる。一部の実施形態において、ＣＩＤは小分子薬物ＡＰ１９０３である。二量体化は、アポトーシスの急速な誘導を引き起こす（それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１１４６８６２号パンフレット；Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６５；１８（２０１１）；Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３－９２４（２００７）参照）。
５．ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現
本発明の細胞は、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現から生じるＡＤＣＣ及びＣＤＣに対する低減した感受性を有する。得られた細胞は、増加した発現に起因して抗体を封鎖する。一実施形態において、細胞は、１つ以上のＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ導入遺伝子を含む。
一部の実施形態において、低減したＡＤＣＣ又はＣＤＣ感受性は、細胞表面上のＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔから生じる。これは、当業者により認識されるとおりいくつかの手法で、「ノックイン」又はトランスジェニック技術を使用して行われる。一部の例において、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現は、１つ以上の導入遺伝子から生じる。
したがって、一部の実施形態において、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ遺伝子の１つ以上のコピーを細胞に誘導性又は構成的プロモーターの制御下で付加し、後者が好ましい。一部の実施形態において、一部の実施形態において、レンチウイルス構築物を本明細書に記載のとおり、又は当技術分野において公知のとおり用いる。遺伝子は、当技術分野において公知のとおり好適なプロモーターの制御下で宿主細胞のゲノム中に組込み得る。
ブラストサイジンマーカーを使用してＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔを発現するレンチウイルスベクターを含有する細胞を選択する。遺伝子配列を合成し、例えば、ブラストサイジン耐性を有するプラスミドレンチウイルスｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中にＤＮＡをクローニングすることができる。
一部の実施形態において、遺伝子の発現は、本明細書に記載されるとおりのトランケーション又は突然変異と組み合わせて内因性ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４遺伝子の調節配列を変化させることにより増加させることができる。これは、例えば、内因性プロモーターを構成的プロモーター又は別の誘導性プロモーターに交換することにより達成されてもよい。これは概して、ＣＲＩＳＰＲなど、公知の技法を用いて行うことができる。
変更させたら、公知の技術、例えば、実施例に記載のもの、例えば、抗ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４抗体を使用するウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ又はＦＡＣＳアッセイを使用して、十分な発現の存在をアッセイすることができる。一般に、この文脈における「十分」は、抗体を封鎖し、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを阻害する細胞表面上での発現の増加を意味する。
６．ＨＩＰ表現型のアッセイ及び多能性の保持
ＨＩＰ細胞を生成したら、一般に本明細書に及び実施例に記載のとおり、これらをそれらの低免疫原性及び／又は多能性の保持についてアッセイすることができる。
例えば、低免疫原性は、多数の技術を使用してアッセイする。１つの例示的な技術としては、同種宿主中への移植及び宿主免疫系を回避するＨＩＰ細胞成長（例えば、奇形腫）についてのモニタリングが挙げられる。ルシフェラーゼを発現させるようにＨＩＰ由来物を形質導入し、次いで生体発光イメージングを使用して追跡することができる。同様に、ＨＩＰ細胞に対する宿主動物のＴ細胞及び／又はＢ細胞応答を試験してＨＩＰ細胞が宿主動物において免疫反応を引き起こさないことを確認する。Ｔ細胞機能は、Ｅｌｉｓｐｏｔ、Ｅｌｉｓａ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、又はマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）により評価する。Ｂ細胞応答又は抗体応答は、ＦＡＣＳ又はｌｕｍｉｎｅｘを使用して評価する。さらに、又は代替的に、細胞を、自然免疫応答、例えば、ＮＫ細胞殺傷を回避するそれらの能力についてアッセイすることができる。ＮＫ細胞溶解活性は、インビトロ又はインビボで当技術分野において公知の技術を使用してアッセイする。
同様に、多能性の保持は、多数の手法で試験する。一実施形態において、一般に本明細書に記載のとおり多能性は、ある多能性特異的因子の発現によりアッセイする。さらに、又は代替的に、ＨＩＰ細胞を多能性の指標として１つ以上の細胞タイプに分化させる。
Ｄ．ＨＩＰＯ－ ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現細胞の生成
本発明の一部の態様において、上記のとおり生成されたＨＩＰ細胞は、そのプロセスがＯ血液型を有する多能性細胞を用いて開始するため既にＨＩＰＯ－細胞である。
本発明の他の態様は、Ａ及びＢ抗原の酵素的変換を含む。好ましい態様において、酵素を使用してＢ抗原をＯに変換する。より好ましい態様において、酵素は、α－ガラクトシダーゼである。この酵素は、Ｂ抗原の末端ガラクトース残基を排除する。本発明の他の態様は、Ａ抗原のＯへの酵素的変換を含む。好ましい態様において、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼを使用してＡ抗原をＯに変換する。酵素的変換は、例えば、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれるＯｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｉｎｉｑｕｅ ｅｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅ １１：３３－３９（２００４）；米国特許第４，４２７，７７７号明細書、同第５，６０６，０４２号明細書、同第５，６３３，１３０号明細書、同第５，７３１，４２６号明細書、同第６，１８４，０１７号明細書、同第４，６０９，６２７号明細書、及び同第５，６０６，０４２号明細書；並びに国際公開第９９２３２１０号パンフレットに考察される。
本発明の他の実施形態は、ＡＢＯ遺伝子エキソン７をノックアウトし、又はＳＬＣ１４Ａ１（ＪＫ）遺伝子をサイレンシングすることにより細胞を遺伝子工学操作することを含む。本発明の他の実施形態は、Ｒｈ血液型式（ＲＨ）のＣ及びＥ抗原、ケル式（ＫＥＬ）のＫ、ダフィー式（ＦＹ）のＦｙａ及びＦｙ３、キッド式（ＪＫ）のＪｋｂ、又はＭＮＳ血液型式のＵ及びＳをノックアウトすることを含む。当技術分野において公知の又は本明細書に記載の任意のノックアウト法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ｔａｌｅｎ、又は相同組換えを用いることができる。
Ｅ．本発明の好ましい実施形態
本発明のＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔを発現するＨＩＰ、ＨＩＰＯ－、ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣ、又はＥＳＣＯ－細胞、又はそれらの由来物を使用し、例えば、１型糖尿病、心疾患、神経疾患、癌、盲目、血管疾患、及び再生薬物療法に応答する他のものを治療することができる。特に、本発明は、任意の細胞タイプへの分化のための細胞の使用を企図する。したがって、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔを発現し、多能性を示すが、同種宿主、例えば、ヒト患者中に多能性細胞又はその分化産物のいずれかとして移植された場合、宿主ＡＤＣＣ応答もＣＤＣ応答ももたらさない細胞が本明細書に提供される。加えて、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４細胞内シグナル伝達機能は、トランケーション又は突然変異によって減少し、又はなくなる。
一態様において、本発明の細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現と共にコードする核酸を含む。ＣＡＲは、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むことができる。
一部の実施形態において、細胞外ＣＡＲドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＳ１、ＣＤ１７１、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６、ＲＯＲ１、及びＷＴ１からなる群から選択される抗原に結合する。ある実施形態において、細胞外ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、及びＢＴＬＡを含む。ある実施形態において、ＣＡＲ細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、及びＢＴＬＡを含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ゼータシグナリング細胞内ドメインを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢシグナリング細胞内ドメイン、及びＣＤ３ゼータシグナリング細胞内ドメインを含む。
本発明の別の態様において、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔを発現する単離されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれか１つのインビトロ分化によって作製される。一部の実施形態において、細胞は、細胞傷害性低免疫ＣＡＲ－Ｔ細胞である。
種々の実施形態において、インビトロ分化は、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の成長因子又はサイトカインを含む培養培地中でＣＡＲ構築物を担持する細胞を培養することを含む。一部の実施形態において、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ以上をさらに含む。
特定の実施形態において、インビトロ分化により産生された本発明の単離ＣＡＲ－Ｔ細胞は、癌の治療として使用する。
本発明の別の態様は、治療有効量の本明細書に記載の単離ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかを含む組成物を投与することにより、癌を有する患者を治療する方法を提供する。一部の実施形態において、組成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。
一部の実施形態において、投与ステップは、静脈内投与、皮下投与、リンパ節内投与、腫瘍内投与、髄腔内投与、胸腔内投与、及び腹腔内投与を含む。ある例において、投与は、ボーラス又は連続灌流による投与をさらに含む。
一部の実施形態において、癌は、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫からなる群から選択される血液癌である。種々の実施形態において、癌は、固形腫瘍癌又は液体腫瘍癌である。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の単離ＣＡＲ－Ｔ／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞のいずれか１つを作製する方法を提供する。方法は、本発明の細胞のいずれか１つのインビトロ分化を含み、インビトロ分化は、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の成長因子又はサイトカインを含む培養培地中でそれらを培養することを含む。一部の実施形態において、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ以上をさらに含む。
一部の実施形態において、インビトロ分化は、フィーダー細胞上でＨＩＰＯ－細胞を培養することを含む。他の実施形態において、インビトロ分化は、模擬微小重力中で培養することを含む。ある例において、模擬微小重力中での培養は、少なくとも７２時間の培養である。
一部の態様において、本明細書には、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔを発現する細胞から分化した、単離され、工学操作された低免疫心臓細胞（低免疫原性心臓細胞）が提供される。
一部の態様において、心臓病態又は疾患を罹患する患者を治療する方法が本明細書に提供される。方法は、治療有効量の、本明細書に記載の本発明の細胞に由来する単離工学操作低免疫性心臓細胞のいずれか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態において、組成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。
一部の実施形態において、投与は、患者の心臓組織中への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、又は点滴を含む。
一部の実施形態において、心臓病態又は疾患は、小児心筋症、加齢性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、他の心筋症、心筋炎、心筋虚血性再灌流障害、心室機能不全、心不全、鬱血性心不全、冠動脈疾患、末期心疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、動脈炎、又は心血管疾患からなる群から選択される。
一部の態様において、本明細書には、ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞の集団からインビトロ分化によって低免疫心臓細胞の集団を作製する方法が提供され、ここでは内因性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内因性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性がなくなり、ＨＩＰＯ－細胞におけるＣＤ４７又は別のＳＩＲＰα－エンゲージャータンパク質の発現が増加している。方法は、（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む培養培地中でＨＩＰＯ－細胞の集団を培養すること；（ｂ）ＷＮＴアンタゴニストを含む培養培地中でＨＩＰＯ－細胞の集団を培養して心臓前駆細胞の集団を産生すること；及び（ｃ）インスリンを含む培養培地中で心臓前駆細胞の集団を培養して低免疫性心臓細胞の集団を産生することを含む。
一部の実施形態において、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体又はそのバリアントである。一部の例において、ＧＳＫ阻害剤は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態において、ＷＮＴアンタゴニストは、ＩＷＲ１、その誘導体又はそのバリアントである。一部の例において、ＷＮＴアンタゴニストは、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
一部の態様において、ＨＩＰＯ－細胞から分化した単離工学操作ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４過剰発現内皮細胞が本明細書に提供される。他の態様において、本発明の単離工学操作内皮細胞は、毛細血管内皮細胞、血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、脳内皮細胞、及び腎臓内皮細胞からなる群から選択される。
一部の態様において、血管病態又は疾患を罹患する患者を治療する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態において、方法は、治療有効量の本発明の単離工学操作内皮細胞の集団を含む組成物を投与することを含む。
方法は、治療有効量の本明細書に記載の単離工学操作ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４過剰発現内皮細胞のいずれか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態において、一部の実施形態において、組成物は、治療的に有効な担体又は賦形剤をさらに含む。一部の実施形態において、投与は、患者の心臓組織中への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、又は点滴を含む。
一部の実施形態において、血管病態又は疾患は、血管損傷、心血管疾患、血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、鬱血性心不全、高血圧、虚血性組織損傷、肢虚血、脳卒中、神経障害、及び脳血管疾患からなる群から選択される。
一部の態様において、インビトロ分化によりＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現細胞の集団から低免疫性内皮細胞の集団を産生する方法であって、ＨＩＰＯ－細胞において、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除されており、ＣＤ４７発現が増加している方法が本明細書に提供される。方法は、（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む第１の培養培地中でＨＩＰＯ－細胞の集団を培養すること；（ｂ）ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む第２の培養培地中でＨＩＰＯ－細胞の集団を培養して内皮前駆細胞の集団を産生すること；並びに（ｃ）ＲＯＣＫ阻害剤及びＡＬＫ阻害剤を含む第３の培養培地中で内皮前駆細胞の集団を培養して低免疫性内皮細胞の集団を産生することを含む。
一部の実施形態において、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、又はそのバリアントである。一部の例において、ＧＳＫ阻害剤は約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体、又はそのバリアントである。一部の例において、ＲＯＣＫ阻害剤は約１μＭ～約２０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態において、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はそのバリアントである。一部の例において、ＡＬＫ阻害剤は約０．５μＭ～約１０μＭの濃度範囲である。
一部の実施形態において、第１の培養培地は２μＭ～約１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１を含む。一部の実施形態において、第２の培養培地は、５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを含む。他の実施形態において、第２の培養培地はＹ－２７６３２及びＳＢ－４３１５４２をさらに含む。種々の実施形態において、第３の培養培地は１０μＭ Ｙ－２７６３２及び１μＭ ＳＢ－４３１５４２を含む。ある実施形態において、第３の培地はＶＥＧＦ及びｂＦＧＦをさらに含む。特定の例において、第１の培養培地及び／又は第２の培地はインスリンを欠く。
一部の態様において、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現細胞から分化した単離工学操作低免疫性ドーパミン作動性ニューロン（ＤＮ）が本明細書に提供される。一部の実施形態において、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除されており、ＣＤ４７又は別のＳＩＲＰα－エンゲージャー発現が増加しており、ニューロンは血液型Ｏ及びＲｈ－である。
一部の実施形態において、単離ドーパミン作動性ニューロンは、神経幹細胞、神経前駆細胞、未熟ドーパミン作動性ニューロン、及び成熟ドーパミン作動性ニューロンからなる群から選択される。
一部の態様において、神経変性疾患又は病態を罹患する患者を治療する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態において、方法は、治療有効量の単離低免疫性ドーパミン作動性ニューロンのいずれか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態において、組成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。一部の実施形態において、単離低免疫性ドーパミン作動性ニューロンの集団は生体分解性足場上に存在する。投与は移植又は注射を含み得る。一部の実施形態において、神経変性疾患又は病態は、パーキンソン病、ハンチントン病、及び多発性硬化症からなる群から選択される。
一部の態様において、インビトロ分化によりＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現ドーパミン作動性ニューロンの集団を産生する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態において、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除されており、ＣＤ４７又は別のＳＩＲＰα－エンゲージャー発現が増加しており、血液群はＯ及びＲｈ－である。一部の実施形態において、方法は、（ａ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ８、ＷＮＴ１、レチノイン酸、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される１つ以上の因子を含む第１の培養培地中で細胞の集団を培養して未熟ドーパミン作動性ニューロンの集団を産生すること；並びに（ｂ）第１の培養培地と異なる第２の培養培地中で未熟ドーパミン作動性ニューロンの集団を培養してドーパミン作動性ニューロンの集団を産生することを含む。
一部の実施形態において、ＧＳＫβ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、又はそのバリアントである。一部の例において、ＧＳＫβ阻害剤は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態において、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はそのバリアントである。一部の例において、ＡＬＫ阻害剤は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態において、第１の培養培地及び／又は第２の培養培地は動物血清を欠く。
一部の実施形態において、方法は、非ドーパミン作動性ニューロンから低免疫性ドーパミン作動性ニューロンの集団を単離することも含む。一部の実施形態において、方法は、低免疫性ドーパミン作動性ニューロンの単離集団を冷凍保存することをさらに含む。
一部の態様において、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現細胞から分化した単離工学操作低免疫性膵島細胞が本明細書に提供される。一部の実施形態において、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除されており、ＣＤ４７又は別のＳＩＲＰα－エンゲージャー発現が増加しており、血液型はＯ及びＲｈ－である。
一部の実施形態において、単離低免疫性膵島細胞は、膵島前駆細胞、未熟膵島細胞、及び成熟膵島細胞からなる群から選択される。
一部の態様において、糖尿病を罹患する患者を治療する方法が本明細書に提供される。方法は、治療有効量の本明細書に記載の単離ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現膵島細胞のいずれか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態において、組成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。一部の実施形態において、単離低免疫性膵島細胞の集団は生体分解性足場上に存在する。一部の例において、投与は移植又は注射を含む。
一部の態様において、インビトロ分化によりＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現細胞の集団から低免疫性膵島細胞の集団を産生する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態において、ＨＩＰＯ－細胞において内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除されており、ＣＤ４７又は別のＳＩＲＰα－エンゲージャー発現が増加しており、血液型はＯ及びＲｈ－である。方法は、（ａ）インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、及び血管内皮胞成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦβ）スーパーファミリー、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ２）、骨形成タンパク質－７（ＢＭＰ７）、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ１型受容体阻害剤、及びレチノイン酸からなる群から選択される１つ以上の因子を含む第１の培養培地中でＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現細胞の集団を培養して未熟膵島細胞の集団を産生すること；並びに（ｂ）第１の培養培地と異なる第２の培養培地中で未熟膵島細胞の集団を培養して低免疫性膵島細胞の集団を産生することを含む。
一部の実施形態において、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、又はそのバリアントである。一部の例において、ＧＳＫ阻害剤は約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態において、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はそのバリアントである。一部の例において、ＡＬＫ阻害剤は約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態において、第１の培養培地及び／又は第２の培養培地は動物血清を欠く。
一部の実施形態において、方法は、非膵島細胞からＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現膵島細胞の集団を単離することも含む。一部の実施形態において、方法は、低免疫性膵島細胞の単離集団を冷凍保存することをさらに含む。
一部の態様において、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現細胞から分化した単離工学操作低免疫性網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であって、内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除されており、ＣＤ４７又は別のＳＩＲＰα－エンゲージャー発現が増加しており、血液型はＯ及びＲｈ－である細胞が本明細書に提供される。
一部の実施形態において、単離低免疫性ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ前駆細胞、未熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞、及び機能的ＲＰＥ細胞からなる群から選択される。
一部の態様において、眼科病態を罹患する患者を治療する方法が本明細書に提供される。方法は、治療有効量の本明細書に記載の単離ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現ＲＰＥ細胞の集団のいずれか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態において、組成物は、治療的に有効な担体をさらに含む。一部の実施形態において、単離低免疫性ＲＰＥ細胞の集団は生体分解性足場上に存在する。一部の実施形態において、投与は、患者の網膜への移植又は注射を含む。一部の実施形態において、眼科病態は、滲出型黄斑変性、萎縮型黄斑変性、若年性黄斑変性、レーバー先天性黒内障、網膜色素変性症、及び網膜剥離からなる群から選択される。
一部の態様において、インビトロ分化により細胞の集団からＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の集団を産生する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態において、ＨＩＰＯ－細胞において内在性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内在性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が排除されており、ＣＤ４７又は別のＳＩＲＰα－エンゲージャー発現が増加している。方法は、（ａ）アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４／７、ＤＫＫ１、ＩＧＦ１、ノギン、ＢＭＰ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＶＥＧＦＲ阻害剤からなる群から選択される因子のいずれか１つを含む第１の培養培地中でＨＩＰＯ－細胞の集団を培養してＲＰＥ前駆細胞の集団を産生すること；並びに（ｂ）第１の培養培地と異なる第２の培養培地中でＲＰＥ前駆細胞の集団を培養して低免疫性ＲＰＥ細胞の集団を産生することを含む。
一部の実施形態において、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はそのバリアントである。一部の例において、ＡＬＫ阻害剤は約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。一部の実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体、又はそのバリアントである。一部の例において、ＲＯＣＫ阻害剤は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
一部の実施形態において、第１の培養培地及び／又は第２の培養培地は動物血清を欠く。
一部の実施形態において、方法は、非ＲＰＥ細胞から低免疫性ＲＰＥ細胞の集団を単離することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、低免疫性ＲＰＥ細胞の単離集団を冷凍保存することをさらに含む。
一態様において、ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現によりＡＤＣＣ又はＣＤＣに抵抗する。一部の実施形態において、これらは低免疫性多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。これらは、ａ）それぞれのアレルにおけるＢ２Ｍ遺伝子の破壊（例えばＢ２Ｍ－／－）、ｂ）それぞれのアレルにおけるＣＩＩＴＡ遺伝子の破壊（例えばＣＩＩＴＡ－／－）、及びｃ）ＣＤ４７遺伝子の過剰発現（ＣＤ４７＋、例えばＣＤ４７遺伝子の１つ以上の追加のコピーの導入又はゲノム遺伝子の活性化を介して）により低免疫原性とされる。これは、ｈｉＰＳＣ集団をＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇとする。好ましい実施形態において、細胞は非免疫原性である。別の実施形態において、ＨＩＰ細胞は、上記のとおり非免疫原性Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７ｔｇとされるが、要求によりインビボで細胞を殺傷するために誘導される誘導性自殺遺伝子を含めることによりさらに改変される。他の態様において、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４過剰発現ＨＩＰＯ細胞は、ＡＢＯ遺伝子エキソン７をノックアウトし、又はＳＬＣ１４Ａ１（ＪＫ）遺伝子をサイレンシングすることによりＨＩＰ細胞が血液型Ｏにされ、Ｒｈ血液型式（ＲＨ）のＣ及びＥ抗原、ケル式（ＫＥＬ）のＫ、ダフィー式（ＦＹ）のＦｙａ及びＦｙ３、キッド式（ＪＫ）のＪｋｂ、又はＭＮＳ血液型式のＵ及びＳをノックアウトすることより細胞がＲｈ－にされる場合に作出される。
Ｆ．ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞の維持
生成されたら、ｉＰＳＣの維持について公知のとおりＨＩＰＯ－ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞を未分化状態で維持することができる。例えば、分化を妨げ、多能性を維持する培養培地を使用してＭａｔｒｉｇｅｌ上でＨＩＰ細胞を培養する。
Ｇ．ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞の分化
本発明は、対象中への後続の移植のために異なる細胞タイプに分化されるＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞を提供する。当業者により認識されるとおり、分化の方法は、公知の技術を使用して所望の細胞タイプに依存する。懸濁液中で細胞を分化させ、次いでゲルマトリックス形態、例えば、ｍａｔｒｉｇｅｌ、ゼラチン、又はフィブリン／トロンビン形態中に入れて細胞生存を促進する。分化は、当技術分野において公知のとおり、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによりアッセイする。
一部の実施形態において、ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞を肝細胞に分化させて肝細胞機能の損失又は肝臓の肝硬変に対処する。ＨＩＰＯ－細胞を肝細胞に分化させるために使用することができる多数の技術が存在する；例えば、全てが全体として、具体的には分化のための方法及び試薬について参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｐｅｔｔｉｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｐｒｅ３２８８８、Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６９８：３０５－３１４（２０１１）、Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１：２９７－３０５（２０１０）及びＡｓｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ（：４９３－５０４（２０１３）参照。一般に肝細胞関連及び／又は特異的マーカー、例として、限定されるものではないが、アルブミン、アルファフェトプロテイン、及びフィブリノーゲンの存在を評価することにより、当技術分野において公知のとおり分化をアッセイする。アンモニアの代謝、ＬＤＬ貯蔵及び取り込み、ＩＣＧ取り込み及び放出並びにグリコーゲン貯蔵など、分化を機能的に測定することもできる。
一部の実施形態において、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対処するための移植用にＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞をベータ様細胞又は膵島オルガノイドに分化させる。細胞系はＴ１ＤＭに対処するための有望な手法である、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＥｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｒｇａｓｔｒｏ．２０１７．９３参照。さらにＰａｇｌｉｕｃａ ｅｔ ａｌ．は、ｈｉＰＳＣからの良好なβ細胞の分化について報告する（全体として、特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生について概説される方法及び試薬について参照により本明細書に組み込まれるｄｏｉ／１０．１０６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０４０参照）。さらに、Ｖｅｇａｓ ｅｔ ａｌ．は、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の産生と、その後の宿主による免疫拒絶を回避するための封入を示す；（全体として、特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生について概説される方法及び試薬について参照により本明細書に組み込まれるｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０３０）。
一般に、β細胞関連又は特異的マーカー、例として、限定されるものではないが、インスリンの存在を評価することにより、当技術分野で公知のとおり分化をアッセイする。グルコース代謝の測定など、分化を機能的に測定することもできる、一般に全体として、具体的には概説されるバイオマーカーについて参照により本明細書に組み込まれるＭｕｒａｒｏ ｅｔ ａｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０１６．０９．００２参照。
ｄＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔベータ細胞を生成したら、それらを門脈／肝臓、網、胃腸粘膜、骨髄、筋肉、又は皮下嚢中に移植することができる（本明細書に考察されるとおり細胞懸濁液として、又はゲルマトリックス内のいずれかで）。
一部の実施形態において、ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞を網膜色素上皮（ＲＰＥ）に分化させて視力を脅かす眼の疾患に対処する。全体として、特に分化技術及び試薬について概説される方法及び試薬について参照により本明細書に組み込まれるＫａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４：２：２０５－１８に概説される技術を使用して、ヒト多能性幹細胞がＲＰＥ細胞に分化されており；ＲＰＥ細胞のシート生成のための技術及び患者中への移植について全体として同様に組み込まれるＭａｎｄａｉ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１６０８３６８も参照。
当技術分野において公知のとおり、一般に、ＲＰＥ関連及び／若しくは特異的マーカーの存在を評価することにより、又は機能的に測定することにより分化をアッセイすることができる。例えば、全体として、具体的には結果セクションの第１段落に概説されるマーカーについて参照により本明細書に同様に組み込まれるＫａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１３．１２．００７も参照。
一部の実施形態において、ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞を心筋細胞に分化させて心血管疾患に対処する。心筋細胞へのｈｉＰＳＣの分化についての技術は当技術分野において公知であり、実施例に考察される。当技術分野において公知のとおり、一般に心筋細胞関連若しくは特異的マーカーの存在を評価することにより、又は機能的に測定することにより分化をアッセイすることができる；例えば、全体として、具体的には幹細胞、例として、心筋細胞を分化させる方法について参照により本明細書に組み込まれるＬｏｈ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０６．００１参照。
一部の実施形態において、ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞を内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）に分化させて新たな血管を形成させて末梢動脈性疾患に対処する。内皮細胞を分化させるための技術は公知である。例えば、全体として、具体的にはヒト多能性幹細胞からの内皮細胞の生成のため、並びにさらに移植技術のための方法及び試薬について参照により組み込まれるＰｒａｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４８参照。当技術分野において公知のとおり、一般に内皮細胞関連若しくは特異的マーカーの存在を評価することにより、又は機能的に測定することにより分化をアッセイすることができる。
一部の実施形態において、ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞を、甲状腺前駆細胞及び甲状腺ホルモンを分泌し得る甲状腺濾胞オルガノイドに分化させて自己免疫性甲状腺炎に対処する。甲状腺細胞を分化させるための技術は当技術分野において公知である。例えば、全体として、具体的にはヒト多能性幹細胞からの甲状腺細胞の生成のための方法及び試薬について、並びにさらに移植技術について参照により本明細書に明示的に組み込まれるＫｕｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０９．００４参照。当技術分野において公知のとおり、一般に甲状腺細胞関連若しくは特異的マーカーの存在を評価することにより、又は機能的に測定することにより分化をアッセイすることができる。
Ｈ．分化ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ細胞の移植
当業者により認識されるとおり、分化ＨＩＰＯ－／ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ由来物は、細胞タイプ及びそれらの細胞の最終使用の両方に依存する当技術分野において公知の技術を使用して移植する。一般に、本発明の細胞は、静脈内又は患者の特定位置における注射により移植する。特定の位置に移植する場合、細胞をゲルマトリックス中で懸濁させてそれらを保持しつつ分散を妨げることができる。
本明細書に記載の発明をより十分に理解することができるようにするため、以下の実施例が記載される。これらの実施例が説明目的にすぎず、決して本発明の限定として解釈すべきでないことが理解される。
ＨＩＰ及びＨＩＰＯ－細胞は、国際公開第２０１８／１３２７８３号パンフレット、ＰＣＴ／ＵＳ１９／４２１２３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ１９／４２１１７号明細書、及び米国仮特許出願第６２／６９８，９７３号明細書、同第６２／６９８，９７８号明細書、同第６２／６９８，９８１号明細書、同第６２／６９８，９８４号明細書、同第６２／８４６，３９９号明細書、及び同第６２／８５５，４９９号明細書に開示されるとおり作成される。多能性細胞にＣＤ６４が過剰発現したときのＮＫ細胞及びＡＤＣＣ殺傷からの保護については、ＰＣＴ／ＵＳ２０／５５１２０号明細書に開示される。前述の各々は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１：ＣＤ６４ｔ発現はＦｃドメインによって抗体を封鎖する
図３は、標的細胞にいかなるシグナル伝達も誘導することなく遊離ＩｇＧ Ｆｃを捕捉するＣＤ６４ｔを示す概略図である。ヒト野生型（ｗｔ）ｉＰＳＣ由来の内皮細胞（ｉＥＣ）を、ＣＤ６４又はＣＤ６４ｔを発現するように形質導入した。１０万個のｉＥＣをゼラチンコートした６ウェルプレートに播き、３７℃で５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。翌日、培地を交換し、改良型ＥＦ１ａプロモーター（特注製品、ＧｅｎＴａｒｇｅｔ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の下にあるトランケート型ＣＤ６４のトランス遺伝子を担持する２０μｌのレンチウイルス粒子（１×１０８ＩＦＵ／ｍｌ）又は完全長ＣＤ６４を担持する２００μｌのレンチウイルス粒子（１×１０７ＩＦＵ／ｍｌ）を１．５ｍｌの培地に加えた。３６時間後、１ｍｌの細胞培地を加えた。さらに２４時間後、全培地交換を実施した。２日後、ＣＤ６４又はＣＤ６４ｔ発現をフローサイトメトリーにより測定した（図４Ａ及び図５Ａ）。ＣＤ６４又はＣＤ６４ｔのフローサイトメトリー分析は、ＰＥタグ付加マウス抗ヒトＣＤ６４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、カタログ番号５５８５９２）を使用して実施した。抗体Ｆｃ結合能をヒト化ＩｇＧ１抗ＣＤ５２抗体アレムツズマブ（Ｉｃｈｏｒｂｉｏ、Ｗａｎｔａｇｅ ＯＸ１２ ９ＦＦ、ＵＫ）を使用して測定した。この抗体はｉＰＳＣ上のエピトープを認識せず、ＣＤ６４又はＣＤ６４ｔの存在下においてのみ結合する（それぞれ、図４Ａ及び図５Ａ）。Ｆｃ結合をＱＤｏｔ ６５５タグ付加ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（カタログ番号Ｑ－１１２２１ＭＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して定量化した。フローサイトメトリーは、ＣＤ６４及びＣＤ６４ｔの両方について抗体濃度の上昇に伴うアレムツズマブＦｃ結合の増加を示した（それぞれ、図４Ｂ及び図５Ｂ）。
実施例２：ＣＤ６４ｔを発現するＨＩＰ ｉＥＣはＡＤＣＣ及びＣＤＣから保護される
ＨＩＰ ｉＥＣはＣＤ６４を発現しない（図６Ａ）。これはまた、いかなるＣＤ５２も発現しないため、これは抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１（アレムツズマブ）をそのＦａｂ又はそのＦｃを介して結合しない（図６Ｂ）。ＨＩＰ ｉＥＣを、ＣＤ６４を発現するように形質導入した（図７Ａ）。かかるＨＩＰ ｉＥＣＣＤ６４は、ＩｇＧ１をそのＦｃを介して濃度依存的に結合可能であった（図７Ｂ）。
細胞内シグナル伝達を回避するため、ＨＩＰ ｉＥＣを、トランケート型ＣＤ６４（ＣＤ６４ｔ）を細胞内で発現するように形質導入した（図８Ａ）。かかるＨＩＰ ｉＥＣＣＤ６４ｔは、ＩｇＧ１をそのＦｃを介して濃度依存的に結合可能であった（図８Ｂ）。
次に、高度に細胞傷害性のＩｇＧ１抗体アレムツズマブの標的であるＣＤ５２をさらに発現するようにＨＩＰ ｉＥＣ及びＨＩＰ ｉＥＣＣＤ６４ｔを形質導入した。ヒト初代ＮＫ細胞をＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（７００３６、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）から購入し、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％高ＦＣＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で培養した後、アッセイを実施した。ＣＤＣアッセイでは、標的細胞を新鮮なＡＢＯ適合ヒト血清と共にインキュベートした。
ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＳＰプラットフォーム及びＭＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．）でリアルタイム殺傷アッセイを実施した。コラーゲン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でコートした特別な９６ウェルＥ－プレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。合計４×１０４個のヒトｉＥＣ、ｅｐｉＣ、β細胞、又はＣＡＲ－Ｔ細胞を１００μｌ培地に播いた。細胞指数が０．７に達した後、ＡＤＣＣアッセイに４×１０４個のヒトＮＫ細胞を加えるか、又はＣＤＣアッセイに５０μｌ血液型適合ヒト血清を加えた。患者血清試料は、使用前にＤＴＴで処理して、血液型ＩｇＭ抗体を除去した。
Ｎａｌｍ６殺傷アッセイについては、４×１０４個のＮａｌｍ６細胞を播き、４×１０４個のＣＡＲ－Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。以下の抗体を使用し、指示されるとおりの５０μｌ培地中又は血清中にＮＫ細胞と混合した後に加えた：ヒト化抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１（アレムツズマブ、ｉｃｈｏｒｂｉｏ、カタログ番号ＩＣＨ４００２）、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２ ＩｇＧ１（クローン３ＰＦ１２、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、カタログ番号ＡＢ００９４７－１０．０）、ヒト化抗Ｒｈ（Ｄ）ＩｇＧ１（クローンＦ５、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号ＦＡＭＡＢ－００８９ＷＪ）、ヒト化抗ＴＰＯ ＩｇＧ１（クローンＢ８、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号ＦＡＭＡＢ－００１４ＪＦ）、ヒト化抗ＣＤ３ ＩｇＧ１（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、特注製品）、ヒト化抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３）ＩｇＧ１（クローン１３６．２０．１、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号ＨＰＡＢ－０４４０－ＹＪ－ｍ／ｈ）。０．０００１μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度を使用した。陰性対照として、細胞を培地中２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理した（データは示さず）。データは標準化し、ＲＴＣＡソフトウェア（ＡＣＥＡ）で分析した。
ＡＤＣＣ及びＣＤＣ殺傷アッセイでは、ＨＩＰ ｉＥＣＣＤ５２は、それぞれＮＫ細胞（図９）又は補体（図１０）によって濃度依存的に殺傷された。ＨＩＰ ｉＥＣＣＤ５２，ＣＤ６４ｔは、ＡＤＣＣ（図１１）及びＣＤＣ（図１２）の両方から完全に保護されたことが見出された。
実施例３：工学操作されたヒト甲状腺上皮細胞は抗体媒介性自己免疫性殺傷を回避する
橋本甲状腺炎は、細胞傷害性自己抗体が甲状腺組織の破壊につながる原型的な疾患である。患者の９０％に抗ＴＰＯ抗体、主にＩｇＧ１サブクラスの同抗体が高濃度で存在する（Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｂ．＆ ＭｃＬａｃｈｌａｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｔｈｙｒｏｉｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０８，１２５３－１２５９（２００１）；Ｄｏｕｌｌａｙ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ９，２３７－２４４（１９９１））。こうした抗体は、ＡＤＣＣ（Ｂｏｇｎｅｒ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ５９，７３４－７３８（１９８４）；Ｓｔａｔｈａｔｏｓ，Ｎ．＆ Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｇ．Ｈ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｔｈｙｒｏｉｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２４，７０－７５（２０１２）；Ｓｔａｓｓｉ，Ｇ．＆ Ｄｅ Ｍａｒｉａ，Ｒ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｔｈｙｒｏｉｄ ｄｉｓｅａｓｅ：ｎｅｗ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２，１９５－２０４（２００２））及びＣＤＣ（Ｒｅｂｕｆｆａｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ９３，９２９－９３４（２００８）；Ｃｈｉｏｖａｔｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ７７，１７００－１７０５（１９９３））の両方を媒介する。これにより甲状腺の機能が低下する（Ｐｅａｒｃｅ，Ｅ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８，２６４６－２６５５（２００３））。本発明は、甲状腺機能低下症患者への移植時に自然免疫反応を存続させて、及び臓器機能を取り戻すための、ＴＰＯ抗体に抵抗性の甲状腺上皮細胞（ｅｐｉＣ）を提供する。
不死化ヒト甲状腺上皮細胞（ｅｐｉＣ、Ｉｎｓｃｒｅｅｎｅｘ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号ＩＮＳ－ＣＩ－１０１７）及び初代ヒト膵島細胞（Ｔａｋａｒａ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、カタログ番号Ｙ１０１０６）を使用した。これらのｅｐｉＣはインビトロで甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対して生理反応を示さなかったため、その甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）レベルは生理学的発現レベルをはるかに下回った。したがって、レンチウイルス形質導入手法を用いてそのＴＰＯ発現を人為的に増加させた。１０万個のヒト甲状腺ｅｐｉＣをゼラチンコートした６ウェルプレートに播き、３７℃で５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。翌日、培地を交換し、ヒトＴＰＯ改良型ＥＦ１ａプロモーター（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ）のトランス遺伝子を担持する２００μｌのレンチウイルス粒子（１×１０７ＩＦＵ／ｍｌ）を１．５ｍｌの培地に加えた。３６時間後、１ｍｌの細胞培地を加えた。
これらのｅｐｉＣＴＰＯは良好なＴＰＯ発現を示したが、ＣＤ６４は発現しなかった（図１３Ａ）。次に、ｅｐｉＣＴＰＯをＣＤ６４ｔもまた発現するように形質導入して、ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔを作成した（図１３Ｂ）。甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯは、高濃度であっても、いかなるヒトＩｇＧ１とも結合しなかったが（図１４Ａ）、ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔは、遊離ヒトＩｇＧ１ Ｆｃの結合に有効であった（図１４Ｂ）。
サイロキシン産生をＥＬＩＳＡにより測定した。９６ウェルプレートをゼラチンでコートし、１ウェル当たり３×１０４個のヒト甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ又はｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔを１００μｌ ｈ７Ｈ培地に播種し、３７℃で５％ＣＯ２にて２４時間インキュベートした。翌日、ｈ７Ｈ培地を交換し、１ｍＵ／ｍＬ未変性ウシ甲状腺刺激ホルモンタンパク質（ＴＳＨ、カタログ番号ＴＳＨ－１３１５Ｂ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）を補足した。各ｅｐｉＣ群につき３ウェルには、１μｇ／ｍＬ抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１（アレムツズマブ、クローンＣａｍｐａｔｈ－１Ｈ、Ｂｉｏｒａｄ）もまた補足した。７２時間後、上清を回収し、サイロキシン（Ｔ４）競合ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＥＩＡＴ４Ｃ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従い使用してサイロキシンレベルを評価した。結果は、アレムツズマブのある群とない群との間の光学濃度（ＯＤ）の変化として提示する。甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ及びｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔは両方とも、ＩｇＧ１抗体の存在とは無関係にサイロキシンを産生した（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。
インビトロインピーダンスアッセイのため、ＣＤ６４ｔ発現のある及びないｅｐｉＣ（ＴＰＯ）をＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅプラットフォームに播いた（図１６）。これらをプラスチック皿に付着させ、多層方式で成長させた。したがって、ＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ機が計算する細胞指数は、単層を形成するものであっても内皮細胞から公知の定常状態レベルに達しなかった。それらの細胞が多層状の集塊で成長するにつれ、細胞指数は増加し続けた。このアッセイでは、ウサギ抗ＴＰＯ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、カタログ番号ａｂ２０３０５７）を漸増濃度で使用して抗体媒介性殺傷を誘導した。４０，０００個のヒトＮＫ細胞をエフェクター細胞として加えた。ウサギＩｇ ＦｃはヒトＣＤ１６に結合しないため、ｅｐｉＣ（ＴＰＯ）は濃度依存的に殺傷された。しかしながら、工学操作したｅｐｉＣ（ＴＰＯ，ＣＤ６４ｔ）は、このアッセイに使用した全ての抗体濃度で抗体媒介性殺傷を有効に回避した。
ウサギＩｇＧ ＦｃはヒトＣＤ６４及びＣＤ６４ｔに結合するが、本発明者らは次に、ヒト化抗ＴＰＯ ＩｇＧ１抗体を使用した。このヒトＩｇＧ１抗体は、ＮＫ細胞ＡＤＣＣアッセイ（図１７）及びＣＤＣアッセイ（図１８）において甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯの殺傷に有効であった。しかしながら、甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔはＡＤＣＣ（図１９）及びＣＤＣ（図２０）から完全に保護された。
橋本甲状腺炎及び正常値上限（０．０３Ｕ／ｍｌ）の２１倍、２６．３倍、及び２９．６倍の抗ＴＰＯ抗体力価を有する３例の患者からの血清試料は、ＣＤＣアッセイで甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯをすぐに殺傷した（図２１Ａ～図２１Ｃ）。甲状腺ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔは、患者血清中で殺傷から完全に保護され、ひいては臨床的に関連性のある自己免疫性条件に耐えた。
ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、００５５５７）マウス６～１２週齢をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）から購入した。この例で使用した動物の数は、各図に提示する。０、１、及び２日目、ＮＳＧレシピエントに、５×１０４個のｅｐｉＣＴＰＯ又はｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔ、１００万個のヒトＮＫ細胞、及び１ｍｇ用量の抗ＴＰＯを皮下注射した（図２２Ａ）。ｅｐｉＣＴＰＯ移植片は全てがすぐに消え（図２２Ｂ）、一方、ｅｐｉＣＴＰＯ，ＣＤ６４ｔ移植片は全てが生き残った（図２２Ｃ）。
実施例４：工学操作したヒトβ細胞はＨＬＡ抗体媒介性殺傷を回避する
１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）は、もう一つの自己免疫疾患であり、これはＴ細胞媒介性であって、抗体反応が付随する。本発明者らは、ＣＤ６４ｔ発現によってそれをＨＬＡ抗体殺傷に対して抵抗性にすることができるかどうかを試験することを目指した。ヒトｉＰＳＣ由来の膵β細胞をＴａＫａＲａ（ＣｈｉＰＳＣ２２、カタログ番号Ｙ１０１０６）から購入し、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ｈｉＰＳ β細胞培地キット（ＴａＫａＲａ、カタログ番号Ｙ１０１０８）で培養した。１２ウェルプレートに製造者のプロトコルどおりに細胞を播いた。一部の細胞にＣＤ６４ｔレンチウイルス粒子（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ）を形質導入した。ヒトｉＰＳＣ由来の膵島細胞（β細胞）はＣＤ６４を発現しない（図２３Ａ）。次に、ヒトｉＰＳＣ由来のβ細胞を、ＣＤ６４ｔを発現するように形質導入した（図２３Ｂ）。β細胞はＩｇＧ１と結合できないが（図２４Ａ）、β細胞ＣＤ６４ｔは、遊離ＩｇＧ Ｆｃを捕捉して結合することが可能であった（図２４Ｂ）。
インスリン産生をＥＬＩＳＡにより測定した。２４ウェルプレートをゼラチンでコートし、１ウェル当たり５×１０４個のｉＰＳＣ由来のβ細胞及びβ細胞ＣＤ６４ｔ細胞（カタログ番号Ｙ１０１０８、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を５００μｌ Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ｈｉＰＳ β細胞培地に播種し、３７℃で５％ＣＯ２にて２４時間インキュベートした。翌日、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ｈｉＰＳ β細胞培地をグルコース不含のＲＰＭＩ １６４０（カタログ番号１１８７９－０２０、Ｇｉｂｃｏ）に２時間交換した。２時間後、２ｍＭグルコース（カタログ番号Ｇ７５２８、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補足したグルコース不含のＲＰＭＩに培地を交換した。各β細胞群につき３ウェルには、１μｇ／ｍＬ抗ＣＤ５２ ＩｇＧ１（アレムツズマブ、クローンＣａｍｐａｔｈ－１Ｈ、カタログ番号ＭＣＡ６１０１、Ｂｉｏｒａｄ）もまた補足した。２０分後、上清を回収し、２０ｍＭグルコースを補足したグルコース不含のＲＰＭＩに培地を交換した。この場合もやはり、各群３ウェルに１μｇ／ｍＬアレムツズマブを加えた。２０分後、上清を回収し、ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＫＡＱ１２５１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従い使用してヒトインスリンのレベルを決定した。結果は、アレムツズマブのある群とない群との間の光学濃度（ＯＤ）の変化として提示する。β細胞（図２５Ａ）及びβ細胞ＣＤ６４ｔ（図２５Ｂ）は両方とも、インタクトなグルコース感知及びインスリン産生を示した。これらのデータは、インスリンＥＬＩＳＡにおける光学濃度（ＯＤ）測定値を示す。低グルコース培地（２ｍＭ）では、β細胞及びβ細胞ＣＤ６４ｔは両方とも、高グルコース培地（２０ｍＭ）と比較して低いインスリン産生を示す。インスリン産生は、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）抗体の存在下でも変わらなかった。
次に、ＣＤ６４ｔ発現のある及びない膵島細胞（膵β細胞）をＸＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅプラットフォームに播いた（図２６）。これらはプラスチック皿に付着したが、また集塊状にも成長し、時間とともに細胞指数は増加し続けた。集塊状の成長パターンにもかかわらず、このアッセイは標的細胞殺傷の検出感度がなおも極めて高かった。膵島細胞はＨＬＡ Ａ２型を示した。したがって本発明者らは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを有するヒト化抗ヒトＨＬＡ－Ａ２（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、カタログ番号Ａｂ００９４７－１０．０）を使用して抗体媒介性殺傷を誘導した。ヒトＮＫ細胞（４０，０００個）をエフェクター細胞として使用した。膵島細胞は、抗ＨＬＡ－Ａ２濃度の増加に対応して増加した速さでもって殺傷された。対照的に、膵島β細胞（ＣＤ６４ｔ）細胞は抗ＨＬＡ－Ａ２抗体媒介性殺傷から保護された。
β細胞を発現するＨＬＡ－Ａ２は、ＣＤＣアッセイにおいて、抗ＨＬＡ－Ａ２ ＩｇＧ１抗体濃度の増加に伴い徐々に速く殺傷された（図２７）。しかしながら、β細胞ＣＤ６４ｔは、ＣＤＣアッセイでＨＬＡ抗体媒介性殺傷に対して完全な抵抗性を示した（図２８）。
次に本発明者らは、ＮＳＧマウスに５×１０４個のヒトβ細胞又はβ細胞ＣＤ６４ｔを１００万個のヒトＮＫ細胞と共に皮下注射した（図２９Ａ）。１ｍｇ用量の抗ＨＬＡ－Ａ２を３回、０、１、及び２日目に皮下注射した。注射した細胞は全て、Ｌｕｃ＋であった。画像化のため、Ｄ－ルシフェリンホタルカリウム塩（３７５ｍｇ／ｋｇ；Ｂｉｏｓｙｎｔｈ ＡＧ、Ｓｔａａｄ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ）に溶解させて、麻酔下のマウスに２５０μｌを腹腔内注射した。動物をＡＭＩ ＨＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）で画像化した。関心領域（ＲＯＩ）の生物発光を毎秒毎平方センチメートル毎ステラジアン当たりの最大光子数（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）の単位で定量化した。ＲＯＩからの最大シグナルをＡｕｒａ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。全てのβ細胞移植片が２日以内に消え（図２９Ｂ）、一方、β細胞ＣＤ６４ｔ移植片は抗体媒介性殺傷に耐え（図２９Ｃ）、抗体チャレンジのないβ細胞の生存に匹敵した（図２９Ｄ）。
実施例５：工学操作したヒトＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＨＬＡ、非ＨＬＡ、及びＣＡＲに向けられる抗体殺傷を回避する
臨床的ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は抗体反応を誘発し、これは、固形腫瘍を有する患者ではなおさら顕著である。したがってＣＡＲ－Ｔ細胞に抗体保護を工学操作した。ヒトＴ細胞を、追加的なＣＤ６４ｔ発現を伴う又は伴わないＣＤ１９ ｓｃＦｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζコンストラクトを発現するように形質導入した。ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζコンストラクト（ＰｒｏＭａｂ、カタログ番号ＰＭ－ＣＡＲ１００２－Ｖ）のトランス遺伝子を担持するレンチウイルス粒子を使用して、ヒトＰＢＭＣからヒト抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を作成した。ＰＢＭＣをＩＬ－２で一晩刺激し、９６ウェルＵ字底プレートにおいて、プロタミン硫酸塩及び１μｇ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が入った各ウェルにつき１０５細胞の密度で播種した。ウェルにレンチウイルスを２０のＭＯＩで加えた。一部のウェルについては、ＣＤ６４ｔレンチウイルス粒子（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ）を２０のＭＯＩでさらに形質導入した。スピンフェクションを２５℃において１８００ｒｐｍで３０分間行った。この後、加湿した５％ＣＯ２インキュベーターに細胞を一晩戻した。２日後に培地を交換し、細胞をＴ細胞培地（ＯｐＴｍｉｚｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１ｍｌ当たり１０６個の密度で播種した。Ｔ細胞の増大には、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。ＢＤ Ａｒｉａ ＦｕｓｉｏｎでＣＡＲ＋及びＣＡＲ＋／Ｃ６４ｔ＋集団に関して細胞を選別し、さらなるアッセイに使用した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ受容体（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）の顕著な発現を示したが、ＣＤ６４ｔを発現しなかった（図３０Ａ）。次にＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＤ６４ｔを発現するように形質導入し、かかるＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔは、ＣＡＲをなおも発現し、加えてＣＤ６４ｔを発現した（図３０Ｂ）。
ＣＡＲ－Ｔ細胞はいかなる遊離ＩｇＧ１とも結合しなかったが（抗ＴＰＯ抗体を使用、図３１Ａ）、ＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔは、遊離ＩｇＧ１ Ｆｃを捕捉して結合することが可能であった（図３１Ｂ）。
ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔ、及び普通のＴ細胞の殺傷有効性をＣＤ１９陽性ＮＡＬＭ標的細胞に対して評価した（図３２）。対照のＴ細胞は殺傷を示さなかったが、ＣＡＲ－Ｔ及びＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔは両方とも、広範囲のエフェクター細胞対標的細胞比にわたって等しく有効なキラーであった。さらには、ＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔの腫瘍殺傷能力は、Ｆｃ結合抗体の存在による影響を受けなかった（図３３）。
ＨＬＡエピトープ（ＨＬＡ－Ａ２）、非ＨＬＡエピトープ（ＣＤ５２、ＣＤ３）、血液型抗原（Ｒｈ（Ｄ））、及びＣＡＲ受容体（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）に対する細胞傷害性抗体によるＡＤＣＣ（図３４）及びＣＤＣアッセイ（図３５）を実施し、全てのアッセイでＣＡＲ－Ｔ細胞は殺傷された。しかしながら、ＣＡＲ－ＴＣＤ６４ｔは、ＡＤＣＣ（図３６）及びＣＤＣアッセイ（図３７）の両方において５つの抗体全てによる抗体媒介性殺傷を回避することが可能であった。ＣＤ６４ｔ発現はヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性に影響を及ぼさず、しかしその特異性とは無関係にそれを抗体に対して抵抗性にする。
実施例６：工学操作したヒトＮＫ細胞はＡＤＣＣ及びＣＤＣ殺傷を回避する
抗体保護をＮＫ細胞に工学操作できることを示すため、ヒトＮＫ細胞を、ＣＤ６４ｔを発現するように形質導入した。末梢ヒトＮＫ細胞はＣＤ６４ｔを発現しない（図３８Ａ）。ＮＫＣＤ６４ｔは高いＣＤ６４ｔ発現を示した（図３８Ｂ）。
ＮＫ細胞はいかなる遊離ＩｇＧ１とも結合しなかったが（抗ＴＰＯ抗体を使用、図３９Ａ）、ＮＫＣＤ６４ｔ細胞は、遊離ＩｇＧ１ Ｆｃを捕捉して結合することが可能であった（図３９Ｂ）。
抗ＣＤ５２抗体アレムツズマブによるＡＤＣＣ（図４０）及びＣＤＣアッセイ（図４１）を実施し、ＮＫ細胞はすぐに殺傷された。しかしながら、ＮＫＣＤ６４ｔ細胞は、ＡＤＣＣ（図４２）及びＣＤＣアッセイ（図４３）の両方で抗体媒介性殺傷を回避することが可能であった。ＣＤ６４ｔ発現により、ＮＫ細胞は抗体媒介性殺傷に対して抵抗性となる。
ＶＩＩＩ．例示的配列：
配列番号１－ヒトβ－２－ミクログロブリン
ＭＳＲＳＶＡＬＡＶＬＡＬＬＳＬＳＧＬＥＡＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮＦＬＮＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶＫＷＤＲＤＩ
配列番号２－ヒトＣＩＩＴＡタンパク質、１６０アミノ酸Ｎ末端
Figure 2024515037000002
 配列番号３－ヒトＣＤ４７
Figure 2024515037000003
 配列番号４－単純ヘルペスウイルスチミジン（Ｔｈｉｍｉｄｉｎｅ）キナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）
Figure 2024515037000004
 配列番号５－大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）
Figure 2024515037000005
 配列番号６－トランケート型ヒトカスパーゼ９
Figure 2024515037000006
 配列番号７－ヒトＣＤ６４
ＮＭ＿０００５６６
Figure 2024515037000007
 配列番号８－ヒトＣＤ５２
ＮＭ＿００１８０３
ＭＫＲＦＬＦＬＬＬＴＩＳＬＬＶＭＶＱＩＱＴＧＬＳＧＱＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳＡＳＳＳＭＳＧＧＩＦＬＦＦＶＡＮＡＩＩＨＬＦＣＦＳ
配列番号９－ヒトＣＤ１６ ＦＣＧＲ３Ａ
ＮＰ＿０００５６０．６
Figure 2024515037000008
 配列番号１０－ヒトＣＤ１６ ＦＣＧＲ３Ｂ
ＮＰ＿００１２３１６８２．２
Figure 2024515037000009
 配列番号１１－ヒトＣＤ３２ ＦＣＧＲ２Ａ
＞ＮＰ＿００１１２９６９１．１
Figure 2024515037000010
 配列番号１２－ヒトＣＤ３２ ＦＣＧＲ２Ｂ
＞ＮＰ＿００３９９２．３
Figure 2024515037000011
 配列番号１３－ヒトＣＤ３２ ＦＣＧＲ２Ｃ
＞ＮＰ＿９６３８５７．３
Figure 2024515037000012
 配列番号１４－トランケート型ヒトＣＤ１６
Figure 2024515037000013
 配列番号１５－トランケート型ヒトＣＤ３２
Figure 2024515037000014
 配列番号１６－トランケート型ヒトＣＤ６４
Figure 2024515037000015
 配列番号１７－ＴｆＲ１細胞質ドメイン（１～６７位）
ＭＭＤＱＡＲＳＡＦＳＮＬＦＧＧＥＰＬＳＹＴＲＦＳＬＡＲＱＶＤＧＤＮＳＨＶＥＭＫＬＡＶＤＥＥＥＮＡＤＮＮＴＫＡＮＶＴＫＰＫＲＣＳＧＳＩＣ
配列番号１８－ＴｆＲ１膜貫通ドメイン（６８～８８位）
ＹＧＴＩＡＶＩＶＦＦＬＩＧＦＭＩＧＹＬＧＹ
配列番号１９－ＴｆＲ１細胞外ドメイン（８９～７６０位）
Figure 2024515037000016
 配列番号２０－ＴｆＲ２細胞質ドメイン（１～８３位）
ＭＥＲＬＷＧＬＦＱＲＡＱＱＬＳＰＲＳＳＱＴＶＹＱＲＶＥＧＰＲＫＧＨＬＥＥＥＥＥＤＧＥＥＧＡＥＴＬＡＨＦＣＰＭＥＬＲＧＰＥＰＬＧＳＲＰＲＱＰＮＬＩＰＷＡＡＡＧＲＲＡＡＰ
配列番号２１－ＴｆＲ２膜貫通ドメイン（８４～１０４位）
ＹＬＶＬＴＡＬＬＩＦＴＧＡＦＬＬＧＹＶＡＦ
配列番号２２－ＴｆＲ２細胞外ドメイン（１０５～８０１位）
Figure 2024515037000017
本明細書に開示又は参照される全ての刊行物及び特許文書は、参照により全体として組み込まれる。上記の記載は、説明及び記載の目的のためにのみ提示されている。この記載は、本発明を開示される正確な形態に限定するものではない。本発明の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲により定められるものとする。

Claims (55)

  1. 改変細胞であって、前記改変細胞が、トランケーション又は改変を含むＦｃ受容体タンパク質を発現し、前記Ｆｃ受容体タンパク質発現に起因して、前記改変細胞は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の影響を受けにくくなり、前記トランケーション又は改変により、前記Ｆｃ受容体細胞内シグナル伝達が減少し、又はなくなる、改変細胞。
  2. 前記Ｆｃ受容体タンパク質が、トランケート型ＣＤ１６（ＣＤ１６ｔ）、トランケート型ＣＤ３２（ＣＤ３２ｔ）、及びトランケート型ＣＤ６４（ＣＤ６４ｔ）からなる群から選択される、請求項１に記載の改変細胞。
  3. 前記細胞が多能性細胞である、請求項１又は２に記載の改変細胞。
  4. 前記Ｆｃ受容体タンパク質が、配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ６４ｔタンパク質、配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ１６ｔタンパク質、及び配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ３２ｔタンパク質からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変細胞。
  5. 前記ＣＤ６４ｔタンパク質は、配列番号１６の配列を有する、請求項４に記載の改変細胞。
  6. ヒト低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞に由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変細胞。
  7. ヒト低免疫原性多能性ＡＢＯ血液型Ｏアカゲザル因子陰性（ＨＩＰＯ－）細胞に由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変細胞。
  8. ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、請求項１～７のいずれか一項に記載の改変細胞。
  9. ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）に由来する、請求項１～７のいずれか一項に記載の改変細胞。
  10. ヒト、サル、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ、スイギュウ、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、及びモルモットからなる群から選択される種からのものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の改変細胞。
  11. 前記改変細胞の死滅を引き起こすトリガーにより活性化される自殺遺伝子をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の改変細胞。
  12. 前記自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ－ｔｋ）であり、前記トリガーは、ガンシクロビルである、請求項１１に記載の改変細胞。
  13. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子は、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１２に記載の改変細胞。
  14. 前記ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子は、配列番号４の配列を含むタンパク質をコードする、請求項１３に記載の改変細胞。
  15. 前記自殺遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子（ＥＣ－ＣＤ）であり、前記トリガーは、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である、請求項１１に記載の改変細胞。
  16. 前記ＥＣ－ＣＤ遺伝子は、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項１５に記載の改変細胞。
  17. 前記ＥＣ－ＣＤ遺伝子は、配列番号５の配列を含むタンパク質をコードする、請求項１６に記載の改変細胞。
  18. 前記自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼタンパク質をコードし、前記トリガーは、二量体誘導化合物（ＣＩＤ）である、請求項１１に記載の改変細胞。
  19. 前記自殺遺伝子は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を含む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする、請求項１８に記載の改変細胞。
  20. 前記自殺遺伝子は、配列番号６の配列を含む誘導性カスパーゼタンパク質をコードする、請求項１９に記載の改変細胞。
  21. 前記ＣＩＤは、ＡＰ１９０３である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の改変細胞。
  22. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、膵島細胞、膵β細胞、甲状腺細胞、内分泌細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される、請求項１～２又は４～２１のいずれか一項に記載の改変細胞。
  23. 前記ＣＡＲ細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項２２に記載の改変細胞。
  24. 前記ＣＡＲ細胞が、ＣＡＲ－ＮＫ細胞である、請求項２２に記載の改変細胞。
  25. 請求項１～２、４～２４、又は４４～４９のいずれか一項に記載の細胞を対象に移植することを含む、方法であって、前記対象が、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ、スイギュウ、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモットである、方法。
  26. 前記改変細胞から誘導される前記細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、膵島細胞、心筋細胞、肝細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 疾患を治療する方法であって、請求項１～２４又は４４～４９のいずれか一項に記載の改変細胞から誘導される細胞を対象に投与することを含む、方法。
  28. 前記誘導体細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、膵島細胞、膵β細胞、甲状腺細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記疾患が、Ｉ型糖尿病、心疾患、神経学的疾患、内分泌疾患、癌、眼疾患、及び血管疾患からなる群から選択される、請求項２７又は２８に記載の方法。
  30. 請求項１～２４又は４４～４９のいずれか一項に記載の改変細胞の作成方法であって、親の非改変バージョンの前記細胞において前記ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔタンパク質を発現させることを含む、方法。
  31. 前記改変細胞は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ、スイギュウ、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、又はモルモット起源を有する、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記改変細胞は、ＨＩＰ細胞に由来する、請求項３０又は３１に記載の方法。
  33. 前記改変細胞は、ＨＩＰＯ－細胞に由来する、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記改変細胞は、ｉＰＳＣに由来する、請求項３０又は３１に記載の方法。
  35. 前記改変細胞は、ＥＳＣに由来する、請求項３０又は３１に記載の方法。
  36. 前記ＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ発現は、プロモーターの制御下でヒトＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔ遺伝子の少なくとも１つのコピーを前記改変細胞の前記親型中に導入することから生じる、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記プロモーターは、構成的プロモーターである、請求項３６に記載の方法。
  38. 請求項１～２、４～２４、又は４４～４９のいずれか一項に記載の改変細胞に由来する細胞及び薬学的に許容可能な担体を含む、疾患を治療するための医薬組成物。
  39. 前記細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、膵島細胞、膵β細胞、甲状腺細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される、請求項３８に記載の医薬組成物。
  40. 前記疾患が、Ｉ型糖尿病、心疾患、神経学的疾患、内分泌疾患、癌、眼疾患、及び血管疾患からなる群から選択される、請求項３８又は３９に記載の医薬組成物。
  41. 請求項１～２、４～２４、又は４４～４９のいずれか一項に記載の改変細胞に由来する細胞を含む、疾患を治療するための医薬品。
  42. 前記誘導体細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、膵島細胞、膵β細胞、甲状腺細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される、請求項４２に記載の医薬品。
  43. 前記疾患が、Ｉ型糖尿病、心疾患、神経学的疾患、内分泌疾患、癌、眼疾患、及び血管疾患からなる群から選択される、請求項４１又は４２に記載の医薬品。
  44. 遺伝子工学操作によって生じるＣＤ１６ｔ、ＣＤ３２ｔ、又はＣＤ６４ｔタンパク質レベルの亢進を含む、改変細胞であって、前記タンパク質発現に起因して、前記改変細胞は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の影響を受けにくくなる、改変細胞。
  45. 前記細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＩＬＣ、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経膠細胞、膵島細胞、膵β細胞、甲状腺細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞、及び網膜色素内皮細胞からなる群から選択される、請求項４４に記載の改変細胞。
  46. 前記細胞が、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路を媒介しない細胞質ドメインを含むＦｃ受容体キメラを含み、前記細胞質ドメインが、前記Ｆｃ受容体キメラの細胞外ドメインへとそのＦｃによって結合した抗体のエンドサイトーシスを促進する、請求項１～２、４～２１、又は４４～４５のいずれか一項に記載の改変細胞。
  47. 前記細胞質ドメインが、トランスフェリン受容体のものである、請求項４６に記載の改変細胞。
  48. 前記トランスフェリン受容体が、ＴｆＲ１又はＴｆＲ２である、請求項４７に記載の改変細胞。
  49. 前記Ｆｃ受容体キメラが、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４細胞表面ドメインと、ＴｆＲ１又はＴｆＲ２細胞質ドメインとを含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の改変細胞。
  50. 前記細胞が、組換えＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質を発現する、請求項１～２４又は４４～４９のいずれか一項に記載の改変細胞。
  51. 前記ＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質が、免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、抗体Ｆａｂドメイン、又は単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含む、請求項５０に記載の改変細胞。
  52. 前記ＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質が、その解離定数（Ｋｄ）によって測られる親和性でＳＩＲＰαに結合し、前記Ｋｄが約１０－７～１０－１３Ｍである、請求項５１に記載の改変細胞。
  53. Ｂ２Ｍ－／－表現型、ＣＩＩＴＡ－／－表現型、ＣＤ６４ｔ、及びＳＩＲＰα－エンゲージャー分子を含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の改変細胞。
  54. 前記ＳＩＲＰａ－エンゲージャータンパク質が、ＣＤ４７である、請求項５３に記載の改変細胞。
  55. 工学操作されたＮＫ細胞である、請求項５３又は５４に記載の改変細胞。
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