JP2024513181A - グラム陰性細菌に対して活性なアムリン、溶解素、及び溶解素－抗微生物ペプチド（ａｍｐ）コンストラクト - Google Patents

グラム陰性細菌に対して活性なアムリン、溶解素、及び溶解素－抗微生物ペプチド（ａｍｐ）コンストラクト Download PDF

Info

Publication number
JP2024513181A
JP2024513181A JP2023558888A JP2023558888A JP2024513181A JP 2024513181 A JP2024513181 A JP 2024513181A JP 2023558888 A JP2023558888 A JP 2023558888A JP 2023558888 A JP2023558888 A JP 2023558888A JP 2024513181 A JP2024513181 A JP 2024513181A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
lysin
gram
negative bacteria
chp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023558888A
Other languages
English (en)
Inventor
レイモンド シューフ
Original Assignee
コントラフェクト コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by コントラフェクト コーポレイション filed Critical コントラフェクト コーポレイション
Publication of JP2024513181A publication Critical patent/JP2024513181A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/407—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. ketorolac, physostigmine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/427—Thiazoles not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
    • A61K31/542—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/545—Compounds containing 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. cephalosporins, cefaclor, or cephalexine
    • A61K31/546—Compounds containing 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. cephalosporins, cefaclor, or cephalexine containing further heterocyclic rings, e.g. cephalothin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/7036—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin having at least one amino group directly attached to the carbocyclic ring, e.g. streptomycin, gentamycin, amikacin, validamycin, fortimicins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
    • C12N2795/14211—Microviridae
    • C12N2795/14222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
    • C12N2795/14211—Microviridae
    • C12N2795/14233—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/025—Achromobacter
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/32—Mycobacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C12R2001/385—Pseudomonas aeruginosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/42—Salmonella
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/425—Serratia
    • C12R2001/43—Serratia marcescens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法であって、細菌を、有効量のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、又はその活性フラグメント若しくは変異体を含む組成物と、上記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、又はそれを死滅させるのに十分な期間接触させることを含む、方法が本明細書において開示される。また、喀痰中に存在するグラム陰性細菌を阻害する方法、グラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊又は根絶する方法、及びグラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染症を治療する方法も本明細書に開示される。

Description

［関連出願の相互参照］
この出願は、２０２１年１１月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／２８２，２３０号、２０２１年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２７９，８５５号、２０２１年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２４９，６３８号、２０２１年６月３日に出願された米国仮特許出願第６３／１９６，４３６号、及び２０２１年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／１６６，４６３号の利益を主張し、またこの出願日に依拠するものであり、これらの特許出願の各々はその全体が、引用することにより本明細書の一部をなす。
［配列表］
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。２０２２年３月２３日付けで作製された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前は０３４１＿００２９－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、１２６４０９バイトのサイズである。
開示の分野
本開示は、抗微生物剤の分野に関し、より具体的には、グラム陰性細菌及び／又は抗酸菌に感染するファージ由来抗微生物アムリンペプチド及び溶解素ポリペプチドと、グラム陰性細菌及び／又は抗酸菌（特にＭＤＲ及び／又はＸＤＲ）の死滅における、並びに細菌感染及び汚染、特に肺系、特に喀痰に存在するものへの対処におけるこれらのペプチドの使用とに関する。
グラム陰性細菌、特にシュードモナス（Pseudomonas）属の成員及び新興多剤耐性病原体であるアシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）は、深刻な、生命に関わる恐れのある侵襲的感染の重要な原因である。シュードモナス感染は、熱傷創、慢性創傷、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、脆弱な患者に対して多くの脅威を及ぼす移植生体材料上、並びに院内環境表面（hospital surface）及び給水設備内での表面増殖といった大きな問題となる。
シュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）は、患者において定着した後、治療が特に困難な場合がある。そのゲノムは、β－ラクタム抗生物質及びアミノグリコシド抗生物質への耐性を与える多剤排出ポンプ及び酵素を含む多くの耐性遺伝子をコードし、新規の抗微生物治療剤がないことから、このグラム陰性病原体に対する療法は、特に困難なものとなっている。この難点は、細菌を宿主防御及び化学療法から保護することによって感染を引き起こす細菌の能力を高める可能性があるバイオフィルム中で増殖するシュードモナス・エルギノーサの能力によって複雑になる。
医療現場では、シュードモナス・エルギノーサの薬剤耐性株の発生率が増加している。地域病院における医療関連の血流感染（ＢＳＩ）の観察研究では、シュードモナス・エルギノーサが上位４つの多剤耐性（ＭＤＲ）病原体の１つであり、全院内死亡率の１８％に及んでいた。さらに、ＭＤＲシュードモナス・エルギノーサの大流行がよく記載されている。不良な転帰が、コリスチン等の最終手段の薬物による治療を必要とすることが多いシュードモナス・エルギノーサのＭＤＲ株と関連付けられている。さらに、シュードモナス・エルギノーサのＸＤＲ株を含む広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）細菌の出現が増加しており、利用可能な効果的な抗生物質治療剤は、仮にあったとしてもより少なくなる可能性がある。
世界保健機関（ＷＨＯ）及び疾病管理センター（ＣＤＣ）によって重大な脅威として特定された他の薬剤耐性細菌としては、次のグラム陰性細菌：アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、腸内細菌科（大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）及びエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）を含む）、サルモネラ属（Salmonella）種、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）及びシゲラ属（Shigella）種が挙げられる（非特許文献１）。
一般に細胞壁にミコール酸を多く含む抗酸菌は、チール・ニールゼン染色法等の実験室染色中の酸による脱色に対する細菌の耐性を測定することで同定され得る。抗酸菌は、酸ベースの染色の脱色に耐えることができる。グラム陰性細菌と同様に、抗酸菌、例えば、放線菌門は生命を脅かす疾患の原因となる。例えば、マイコバクテリウム属（mycobacterium）は放線菌門の属であり、結核及びらい病を含む深刻な疾患を引き起こすことが知られている病原体を含む。結核菌（Mycobacterium tuberculosis）は通常、肺に感染することによって発症し、例えば、感染した被験体が咳をしたり、くしゃみをしたり、又は話したりすると、空気中に広がる可能性がある。シュードモナス・エルギノーサと同様に、結核菌（M. tuberculosis）も薬剤耐性株の発生率が増しており、結核感染症の治療がますます困難になっている。
さらに、或る特定の抗生物質の有効性の低下は、抗生物質耐性の発現よりもむしろ、肺サーファクタント等の感染環境における因子に起因するグラム陰性感染症及びグラム陽性感染症の両方との闘いで観察される。例えば、ダプトマイシン等の或る特定の抗生物質は、重症の市中感染性肺炎の臨床試験において基準を満たすことができなかった。この欠陥は、具体的には肺環境における、より一般的には肺サーファクタントが存在する気道環境における、ダプトマイシンと、グラム陽性生物に対するこの抗生物質の活性を阻害する肺サーファクタントとの間の相互作用によるものであることが示されている（非特許文献２）。そのため、ダプトマイシンは、肺及びより一般的には気道（特に下気道）感染の治療に対して指示されておらず、当業者は、かかる感染を治療するためにダプトマイシンを含む治療計画を採用しないであろう。肺サーファクタントの存在下でダプトマイシンが感染と闘うことができないことは、例えば、非特許文献３に非常に明確に示されている。最近の研究は、構造的に関連するリポペプチドＡ５４１４５のハイブリッド分子の抗菌活性を試験及び評価することにより、サーファクタントの存在下でダプトマイシン不活性を克服することに焦点を当てている（非特許文献４）。
肺サーファクタントは、肺上皮被覆液の主要成分であって、気道の内表面を覆う複雑な脂質－タンパク質混合物であり、肺胞内の表面張力を低下させる。サーファクタントは、主にジパルミトイルホスファチジルコリン（全ての哺乳類種において約８０％）の他に、相当量のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、並びに少量の少数のリン脂質、中性脂質及びコレステロールで構成されている。親水性タンパク質ＳＰ－Ａ及びＳＰ－Ｄ、並びに疎水性タンパク質ＳＰ－Ｂ及びＳＰ－Ｃの４つのタンパク質成分が存在する（非特許文献５）。ダプトマイシンは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びＰＣ／ＰＧで構成される人工膜小胞に挿入される（非特許文献６、非特許文献７）。
したがって、肺又は他の気道、より一般的には呼吸器の感染の場合に感染部位である器官又は組織に存在する肺サーファクタント等の因子によって、そうでなければ有効な抗生物質が阻害されるという点で、かかる抗生物質の活性を回復させ、更には強める可能性がある治療計画は商業上及び公衆衛生上の利益となるであろう。
上で検討したダプトマイシンに加えて、肺サーファクタントによって阻害されることが知られている他の抗生物質としては、限定されるものではないが、肺炎の一般的な原因であるグラム陰性細菌シュードモナス・エルギノーサによって引き起こされる感染を治療するために使用されるアミノグリコシドであるトブラマイシン（非特許文献８）、及びシュードモナス・エルギノーサを含むグラム陰性細菌に対して広く活性である環状リポペプチドであるコリスチン（ポリミキシン）（非特許文献９）が挙げられる。
さらに、肺の細菌感染症を有する嚢胞性線維症患者等の肺系の細菌感染を有する患者の場合、患者の喀痰は、非嚢胞性線維症患者と比較して変化した組成を有し、嚢胞性線維症患者からの喀痰は、より高い濃度のＤＮＡ、タンパク質、脂質、及び炭水化物を有することが示されている（非特許文献１０）。この喀痰組成の違いは、肺における細菌感染の二次的な結果であると考えられている。したがって、喀痰において活性を有する抗菌剤は、肺疾患、例えば嚢胞性線維症を有する患者等の患者における細菌感染に対する作用物質の活性を予測するために使用され得る。
新規の機構を持つ新たな抗微生物剤の必要性に応えるため、研究者らが様々な薬物及び生物学的製剤を調査している。かかるクラスの抗微生物剤の１つに、溶解素が含まれる。溶解素は細胞壁ペプチドグリカンヒドロラーゼであり、「分子バサミ」として作用して細胞形状の維持及び内部浸透圧への抵抗に関与するペプチドグリカン網を分解する。ペプチドグリカンの分解は浸透圧溶解をもたらす。しかしながら、グラム陽性細菌に存在せず、下にあるペプチドグリカンへのアクセスを制限するグラム陰性細菌の外膜（ＯＭ）の存在のため、或る特定の溶解素は、少なくとも部分的にグラム陰性細菌に対しては有効ではなかった。修飾溶解素（「ａｒｔｉｌｙｓｉｎ」）も開発されている。ポリカチオン性、両親媒性及び疎水性の特性を有する特定のαヘリックスドメインに融合した溶解素を含有するこれらの作用物質は、ＯＭを介して移行することができる。しかしながら、或る特定のａｒｔｉｌｙｓｉｎは、ｉｎ ｖｉｖｏで低い活性を示す。これは、ヒト血清の構成成分、具体的には生理学的塩及び２価カチオンによって引き起こされる場合がある。これらの構成成分はリポ多糖結合部位について競合し、溶解素のαヘリックス転移ドメインを妨害し、それによって血液中での活性を制限して、侵襲的感染を治療するための或る特定の溶解素及びａｒｔｉｌｙｓｉｎの有効性を制限する可能性がある。複数の異なる外膜を透過及び不安定化する抗微生物ペプチドについて、血液中での同様の活性の欠如が報告されている。
溶解素及びａｒｔｉｌｙｓｉｎに加えて、「アムリン（amurins）」を含む他のファージにコードされている宿主溶解システムが同定された（非特許文献１１）。アムリンという用語は、ｓｓＤＮＡファージ及びｓｓＲＮＡファージ（それぞれミクロウイルス科及びレビウイルス科）の両方に由来する、限定された非壁溶解の（nonmuralytic）（「壁破壊」ではない、すなわち、細胞壁のペプチドグリカン加水分解に基づくものではない）溶解活性のセットを説明する。例えば、ファージφＸ１７４（ミクロウイルス科ミクロウイルス属）のタンパク質Ｅアムリンは、ムレイン前駆物質であるリピドＩの形成を触媒する必須膜埋め込み型酵素である細菌トランスロカーゼＭｒａＹを阻害することにより溶解を引き起こす９１アミノ酸の膜タンパク質である（非特許文献１２）。さらに、ファージＱβ（レビウイルス科アロレビウイルス属）のＡ２カプシドタンパク質は、ＭｕｒＡ活性に干渉し、ペプチドグリカン生合成のプロセスを調節不全にすることにより溶解を引き起こす４２０アミノ酸の構造タンパク質（及びアムリン）である（非特許文献１３）。他の非限定的な例としては、ＭｕｒＪの特異的阻害物質であるファージＭのＬｙｓＭアムリン、大腸菌（E. coli）のリピドＩＩフリッパーゼ、及びファージＭＳ２（レビウイルス科レビウイルス属）のタンパク質Ｌアムリン（７５アミノ酸の内在性膜タンパク質であり、宿主シャペロンＤｎａＪの活性を必要とする方法で溶解を引き起こす）（非特許文献１４）が挙げられる。Ｌ様アムリンの推定ドメイン構造が割り当てられており、１０個～１７個の疎水性残基の伸長が直前に付されている内部ロイシルセリンジペプチドを含む。これらのアムリンは、内在性膜タンパク質であり、精製されておらず、溶解素のようには使用されていない。さらに、それらの標的は細胞質にある。それらは、溶菌剤として試験されていない。幾つかのアムリンは、例えばＰＣＴ出願公開である特許文献１に詳しく記載されているが、せいぜい治療薬の開発の基礎となるにすぎず、抗菌治療薬に開発されているものはない。
最近の出版物では、溶解素／ａｒｔｉｌｙｓｉｎ及び他の宿主溶解システム（例えば、アムリン）が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて様々なレベルの有効性でグラム陰性細菌に対して使用することができると記載されているが、侵襲的感染の治療のためにシュードモナス・エルギノーサ、ステノトロホモナス・マルトフィリア（S. maltophilia）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（A. xylosoxidans）、結核菌及び他のグラム陰性細菌及び抗酸菌を含むＭＤＲ及び／又はＸＤＲ細菌を標的とする追加の抗菌化合物、特に、溶解性が高く、血清及び／又は肺サーファクタントの存在下でｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性なままであり、溶血活性を有しない及び／又は耐性傾向が低い抗菌化合物に対する必要性が残されている。
国際公開第２００１／００９３８２号
Tillotson G. 2018. A crucial list of pathogens. Lancet Infect Dis 18:234-236 Silverman, J.A. et al., "Surfactant Inhibition of Daptomycin," JID, 191: 2149-2152 (2005) Koplowicz, Y.B. et al., "Development of daptomycin-susceptible methicillin-resistant Staphylococcus aureus Pneumonia during high-dose daptomycin therapy", Clin Infect Dis. 49(8):1286-7 (2009) Nguyen, K.T. et al., "Genetically engineered lipopeptide antibiotics related to A54145 and daptomycin with improved properties", Antimicrob. Agents Chemother. 2010 Apr; 54(4):1404-1413 Goerke, J., "Pulmonary Surfactant: functions and molecular composition", Biochim. Biophys. Acta. 1998; 1408:79-89 Lakey J.H. et al., "Fluorescence indicates a calcium-dependent interaction between the lipopeptide antibiotic LY146032 and phospholipid membranes," Biochemistry 1988; 27:4639-45 Jung, D. et al., "Structural transitions as determinants of the action of the calcium-dependent antibiotic daptomycin", Chem. Biol. 2004; 11:949-57 van't Veen, A. et al., "Influence of pulmonary surfactant on in vitro bactericidal activities of amoxicillin, ceftazidime, and tobramycin",Antimicrob. Agents Chemother. 39:329-333 (1995) Schwameis, R. et al., "Effect of Pulmonary surfactant on antimicrobial activity in vitro", Antimicrob. Agents Chemother. 57(10):5151-54 (2013) Barth, A.L., The high amino-acid content of sputum from cystic fibrosis patients promotes growth of auxotrophic Pseudomonas aeruginosa, J. Med. Microbiol. 1996, 45:110-119. Chamakura KR et al., 2017. Mutational analysis of the MS2 lysis protein L. Microbiology 163:961-969 Zheng Y et al., 2009. Purification and functional characterization of phiX174 lysis protein E. Biochemistry 48:4999-5006 Gorzelnik KV et al., 2016. Proc Natl Acad Sci U S A 113:11519-11524 Chamakura KR et al., 2017. J Bacteriol 199
本願は、例えば、ミクロウイルス科ゲノム配列に由来し、既知の溶解素／ａｒｔｉｌｙｓｉｎ及びアムリン（クラミジアファージ（Ｃｈｐ）ペプチドとも呼ばれる）を含む他のかかる作用物質とは異なるファージ溶菌剤を使用する新規な方法を開示する。本願は更に、例えば、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株を含む）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidan）、アクロモバクター・ルランディ（Achromobacter ruhlandii）、アクロモバクター・ドレンズ（Achromobacter dolens）、及びＥＳＫＡＰＥ病原体として知られる他の高耐性細菌性病原体（すなわち、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）、アシネトバクター・バウマンニ（A. baumannii）、シュードモナス・エルギノーサ、及びエンテロバクター（Enterobacter）属種）、別の実施の形態において、シュードモナス・エルギノーサ（シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株を含む）、ステノトロホモナス・マルトフィリア、アクロモバクター・キシロソキシダンス、及びＥＳＫＡＰＥ病原体として知られる他の高耐性細菌性病原体（すなわち、エンテロコッカス・フェシウム、スタフィロコッカス・アウレウス、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、及びエンテロバクター属種）、更に別の実施の形態においては、シュードモナス・エルギノーサ及びＥＳＫＡＰＥ病原体として知られる他の高耐性細菌性病原体（すなわち、エンテロコッカス・フェシウム、スタフィロコッカス・アウレウス、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、及びエンテロバクター属種）を含むがこれらに限定されない、グラム陰性細菌、特に多剤耐性及び／又は広範囲薬剤耐性のグラム陰性細菌によって引き起こされる感染症を含む細菌感染を治療するために使用することができる、Ｃｈｐペプチド、溶解素、並びに溶解素及び抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）を含むポリペプチドコンストラクトを使用する方法を開示する。
一態様において、本開示は、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法であって、細菌を、有効量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトを含む組成物であって、上記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、組成物と、上記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖の阻害、その菌数の減少、又はその死滅に十分な期間にわたって接触させることを含む、方法に関する。
少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法の或る特定の態様において、Ｃｈｐペプチドは、配列番号２（本明細書ではＣｈｐ２又はＡＭ１と称する）、配列番号８１（本明細書ではＣｈｐ２－Ｍ１又はＡＭ２と称する）、及び配列番号８９（本明細書ではＣｈｐ１０－Ｍ１又はＡＭ３と称する）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、アクロモバクター・キシロソキシダンス、アクロモバクター・ルランディ、アクロモバクター・ドレンズ、ステノトロホモナス・マルトフィリア及びシュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、ＸＤＲ分離株、及び／又はカルバペネム耐性分離株を含む）からなる群から選択され、別の実施の形態において、ステノトロホモナス・マルトフィリア及びシュードモナス・エルギノーサ、更に別の実施の形態において、アクロモバクター・キシロソキシダンス、アクロモバクター・ルランディ、アクロモバクター・ドレンズ、及びステノトロホモナス・マルトフィリアから選択される。或る特定の態様において、溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、配列番号１４９のアミノ酸配列（本明細書ではＧＮ３７０と称する）を含み、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、大腸菌（Escherichia coli）、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、クライベラ・アスコルバータ（Kluyvera ascorbate）、ラウルテラ・オルニチノリチカ（Raoultella ornithinolytica）、及びサルモネラ・センフテンベルク（Salmonella senftenberg）から選択される。この態様の別の実施の形態において、溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、配列番号１４９のアミノ酸配列（本明細書ではＧＮ３７０と称する）を含み、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、ＸＤＲ分離株、及び／又はカルバペネム耐性分離株を含む）、ステノトロホモナス・マルトフィリア、アクロモバクター・キシロソキシダンス及びアクロモバクター・ルランディ、更に別の実施の形態においては、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、ＸＤＲ分離株、及び／又はカルバペネム耐性分離株を含む）及びステノトロホモナス・マルトフィリアから選択される。
また、本明細書において、喀痰中に存在するグラム陰性細菌を阻害する方法であって、喀痰と、有効量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトを含む組成物であって、上記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、組成物と、上記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖の阻害、その菌数の減少、又はその死滅に十分な期間にわたって接触させることを含む、方法が開示される。
喀痰中に存在するグラム陰性細菌を阻害する方法の或る特定の態様において、Ｃｈｐペプチドは、配列番号２、配列番号８１、及び配列番号８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサ、アクロモバクター・キシロソキシダンス、及びステノトロホモナス・マルトフィリアからなる群から選択される。或る特定の態様において、溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、配列番号１４９のアミノ酸配列を含み、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサ、アクロモバクター・キシロソキシダンス、及びステノトロホモナス・マルトフィリアからなる群から選択される。或る特定の実施の形態において、喀痰は、嚢胞性線維症を有する患者から取得される。
さらに、本明細書において、グラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊又は根絶する方法であって、バイオフィルム内の少なくとも１つの種のグラム陰性細菌を死滅させるのに有効な量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトを、それを必要とする被験体に投与することを含み、上記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、方法が開示される。
グラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊又は根絶する方法の或る特定の態様において、Ｃｈｐペプチドは、配列番号２、配列番号８１、及び配列番号８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・クロアカエ、大腸菌、アクロモバクター・キシロソキシダンス、バークホルデリア・マルチボランス（Bulkholderia multivorans）、及びステノトロホモナス・マルトフィリアから選択され、別の実施の形態において、前述の細菌に加えて、アクロモバクター・キシロソキシダンス及びステノトロホモナス・マルトフィリア（S. maltophilia）からも選択される。或る特定の態様において、シュードモナス・エルギノーサ等の少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株である。グラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊又は根絶する方法の或る特定の態様において、溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、配列番号１４９のアミノ酸配列を含み、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・クロアカエ、及び大腸菌から選択される。
更に別の実施の形態において、グラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染を治療する方法であって、グラム陰性細菌が、バークホルデリア・セノセパシア及び任意に１つ以上の追加の種のグラム陰性細菌を含み、上記方法は、細菌感染と診断された、そのリスクがある、又はその症状を示す被験体に、有効量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトを含有する医薬組成物を投与することを含み、上記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有し、組成物が、バークホルデリア・セノセパシア細菌増殖を阻害すること、バークホルデリア・セノセパシアの菌数を減少させること、及び／又はバークホルデリア・セノセパシアを死滅させることから選択される少なくとも１つの活性を含む、方法が開示される。
グラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染を治療する方法の或る特定の態様において、溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む。
前述の方法及び／使用のいずれかにおいて、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・クロアカエ、大腸菌、アクロモバクター・キシロソキシダンス、アクロモバクター・ルランディ、アクロモバクター・ドレンズ、バークホルデリア・マルチボランス（Bulkholderia multivorans）、バークホルデリア・セノセパシア、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、パンドラエア・アピスタ（Pandoraea apista）、ステノトロホモナス・マルトフィリア、ラルストニア・マンニトリリチカ（Ralstonia mannitolilytica）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、シトロバクター・フロウンディ、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・オキシトカ、クライベラ・アスコルバータ、ラウルテラ・オルニチノリチカ、及びサルモネラ・センフテンベルクからなる群から選択され得る。或る特定の態様において、シュードモナス・エルギノーサ等の少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株である。
本明細書に開示される幾つかの実施の形態において、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサを更に含み、例えば、シュードモナス・エルギノーサのムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む。或る特定の実施の形態において、細菌感染は、局所又は全身の細菌感染である。或る特定の実施の形態において、細菌感染は、嚢胞性線維症を有する被験体、例えば嚢胞性線維症患者の肺に存在する。別の実施の形態において、細菌感染は、嚢胞性線維症（ＣＦ）患者及び／又は肺増悪（ＰＥｘ）及び／又は肺機能の低下及び死亡率に関連する患者におけるものである。更に別の実施の形態において、細菌感染は、非ＣＦ気管支拡張症及び／又は潜在的に急性肺炎である。したがって、有効量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰを、それを必要とする被験体に投与することを含み、上記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又はリジン－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、嚢胞性線維症の治療方法が本明細書において企図される。
幾つかの実施の形態において、前述の方法／使用のいずれかは、グラム陰性細菌感染の治療に適した抗生物質を被験体に投与することを更に含む。或る特定の実施の形態において、グラム陰性細菌感染の治療に適した抗生物質は、セファロスポリン（例えばセファタキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン、セフトビプロール、及びセファゾリン）、テトラサイクリン（例えばミノサイクリン）、チゲサイクリン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、アミノグリコシド（例えばゲンタマイシン、トブラマイシン、及びアミカシン）、カルバペネム（例えばイミペネム、メロペネム、及びドリペネム）、ペニシリン（例えばピペラシリン、アンピシリン及びチカルシリン）、リファンピシン、ポリミキシンＢ、及びコリスチンの１つ以上から選択される。或る特定の実施の形態において、抗生物質は、アミカシン、アジスロマイシン、アズトレオナム、シプロフロキサシン、コリスチン、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、イミペネム、ピペラシリン、リファンピシン及びトブラマイシンの１つ以上から選択される。幾つかの実施の形態において、抗酸菌感染の治療に適した抗生物質は、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、及びピラジナミドの１つ以上から選択される。或る特定の実施の形態において、抗生物質はメロペネムから選択される。
さらに、本明細書において、グラム陰性細菌が抗生物質に対する耐性を発現する能力を抑制する方法であって、グラム陰性細菌に対して、（ａ）抗生物質と、（ｂ）グラム陰性細菌の抗生物質に対する耐性の発現を抑制するのに有効な量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトを投与することを含み、上記Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、方法が開示される。本明細書に開示される方法の或る特定の実施の形態において、溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、ＧＮ３７０（配列番号１４９）のアミノ酸配列を含む。或る特定の実施の形態において、抗生物質は、フルオロキノロン（任意にレボフロキサシン）、カルバペネム（任意にメロペネム）、又はアミノグリコシド（任意にトブラマイシン）である。或る特定の実施の形態において、Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクト（任意にＧＮ３７０）は、グラム陰性細菌に対して、例えばＭＩＣの１／８、ＭＩＣの１／１６、又はＭＩＣの１／３２等のＭＩＣ以下の量で投与される。
前述の方法／使用のいずれかの或る特定の態様において、Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、グラム陰性細菌に対する耐性を発現させる傾向がないか、又はその傾向が低い。前述の方法／使用のいずれかの或る特定の態様において、細菌は多剤耐性又は広範囲薬剤耐性である。
更なる実施の形態において、グラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトを含有する医薬組成物であって、上記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、医薬組成物を投与することを含み、組成物が、グラム陰性細菌の増殖を阻害、減少、及び／又は死滅させることから選択される少なくとも１つの活性を含む、方法が開示される。
或る特定の実施の形態において、感染は、嚢胞性線維症（ＣＦ）患者、及び／又は肺増悪（ＰＥｘ）及び／又は肺機能の低下及び死亡率に関連する患者におけるものであり、或る特定の実施の形態において、感染は、非ＣＦ気管支拡張症及び／又は潜在的に急性肺炎である。本明細書に開示される或る特定の実施の形態によれば、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、マイコバクテリウム種、例えば、マイコバクテリウム・スメグマチス（M. smegmatis）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（M. fortuitum）、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）、マイコバクテリウム・カンサシ（M. kansaii）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（M. scrofulaceum）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（M. intracellulare）及び結核菌（M. tuberculosis）から選択され、或る特定の実施の形態において、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、マイコバクテリウム・アブセサス（M. abscessus）である。
クラミジアファージペプチド（Ｃｈｐ）ファミリーの成員であるＣｈｐ１、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ４、Ｃｈｐ５、Ｃｈｐ６、Ｃｈｐ７、Ｅｃｐ１、Ｅｃｐ２及びＯｓｐ１の構造についてＩ－Ｔａｓｓｅｒによって推定される三次元モデルを示す図である。比較のため、ヒト自然免疫エフェクターペプチドＬＬ－３７を含める。αヘリックス構造は明らかであり、一般に最上部末端はＮ末端である。
定義
本明細書において使用される場合、以下の用語及びその同語源語は、文脈上そうでないことが明示されない限り、下記の意味を有するものとする。
「担体」は、活性化合物と共に投与される溶媒、添加剤、賦形剤、分散媒、可溶化剤、コーティング剤、保存料、等張剤及び吸収遅延剤（absorption delaying agent）、界面活性剤、噴射剤、希釈剤、ビヒクル等を指す。かかる担体は、滅菌液、例えば水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、及び石油、動物、植物又は合成起源のものを含む油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等であり得る。
「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合するあらゆる溶媒、添加剤、賦形剤、分散媒、可溶化剤、コーティング剤、保存料、等張剤及び吸収遅延剤、界面活性剤、噴射剤、希釈剤、ビヒクル等を指す。担体（複数の場合もある）は、薬剤中で通常使用される量で治療対象の被験体に有害でないという意味で「許容可能」でなくてはならない。薬学的に許容可能な担体は、組成物をその意図される目的に不適なものにすることなく組成物の他の成分に適合する。さらに、薬学的に許容可能な担体は、過度の有害な副作用（毒性、刺激及びアレルギー応答等）なしに本明細書に提示される被験体への使用に適している。副作用は、それらのリスクが組成物によってもたらされる利益を上回る場合に「過度」である。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の非限定的な例としては、任意の標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、並びに油／水エマルション及びマイクロエマルション等のエマルションが挙げられる。好適な医薬担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin, 18th Editionに記載されている。薬学的に許容可能な担体は、自然に存在しない担体であってもよい。
「殺菌」又は「殺菌活性」は、細菌の初期菌数において１８時間～２４時間にわたって少なくとも３－ｌｏｇ１０（９９．９％）以上の減少の程度まで細菌の死滅を引き起こすか、又は細菌を死滅させることが可能であるという特性を指す。
「静菌」又は「静菌活性」は、細菌細胞の増殖を阻害し、それにより細菌の初期菌数において１８時間～２４時間にわたって２－ｌｏｇ１０（９９％）以上かつ最大３－ｌｏｇ弱の減少を引き起こすことを含む、細菌増殖を阻害する特性を指す。
「抗菌剤」は、静菌剤及び殺菌剤の両方を指す。
「抗生物質」は、細菌に致死性又は増殖の低減等の負の影響を与える特性を有する化合物を指す。抗生物質は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、抗酸菌及び非抗酸菌のありとあらゆる組合せに負の影響を与えることができる。例としては、抗生物質は、細胞壁ペプチドグリカンの生合成、細胞膜の完全性、又は細菌におけるＤＮＡ若しくはタンパク質の合成に影響を及ぼし得る。グラム陰性細菌に対して活性な抗生物質の非限定的な例としては、セフトリアキソン－セフォタキシム、セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン及びセフトビプロール等のセファロスポリン；シプロフロキサシン及びレボフロキサシン等のフルオロキノロン；ゲンタマイシン、トブラマイシン及びアミカシン等のアミノグリコシド；ピペラシリン、チカルシリン、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、βラクタマーゼ阻害剤と併用する又は併用しない広域スペクトルペニシリン、リファンピシン、ポリミキシンＢ及びコリスチンが挙げられる。抗酸菌に対して活性な抗生物質の非限定的な例としては、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、及びピラジナミドが挙げられる。
「薬剤耐性」は、概して薬物の抗菌活性に耐性を示す細菌を指す。或る特定の方法で使用される場合、薬剤耐性は、特に抗生物質耐性を指し得る。場合によっては、一般に特定の抗生物質の影響を受けやすい細菌は、抗生物質に対する耐性を発現し、それにより薬剤耐性微生物又は株となる可能性がある。「多剤耐性」（「ＭＤＲ」）病原体は、各々が単剤療法として使用される少なくとも２つのクラスの抗微生物薬に対する耐性を発現した病原体である。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）の或る特定の株は、メチシリン及び／又はバンコマイシンを含む幾つかの抗生物質に耐性を示すことが見出されている（Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention）。「広範囲薬剤耐性（extensively drug resistant）」又は「超多剤耐性（extremely drug resistant）」（「ＸＤＲ」）病原体とは、病原体が１つ又は２つのクラスのみに対して感受性のままであるように、２つ以下の抗微生物クラスを除く全ての抗微生物クラスにおける少なくとも１つの作用物質に対して耐性を発現させた病原体である。抗微生物クラス又はカテゴリーは、例えば、Magiorakos, A.P., Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance, Clin. Microbiol. Infect. 2012; 18:268-281に定義される通りであってもよい。或る特定の実施形態において、シュードモナス・エルギノーサに対して使用される作用物質の抗微生物クラスは、本明細書に記載される表Ｂに見出され得る。当業者は、薬物又は抗生物質に対する細菌の感受性又は耐性を決定する日常的な実験技術を用いて、細菌が薬剤耐性であるかを容易に決定することができる。
「有効量」は、適切な頻度又は投与計画で適用又は投与した場合に、細菌増殖若しくは細菌負荷を予防、低減、阻害若しくは解消するか、又は治療される障害（例えば、グラム陰性細菌又は抗酸菌病原体の増殖又は感染）の発症、重症度、期間若しくは進行を予防、低減若しくは改善するか、治療される障害の進展を予防するか、治療される障害の退行を引き起こすか、又は抗生物質若しくは静菌療法等の別の療法の予防効果若しくは治療効果（複数の場合もある）を高める若しくは改善するのに十分な量を指す。
「共投与する」は、順次的な２種類の作用物質、例えばＣｈｐペプチド又は溶解素又は溶解素－ＡＭＰコンストラクト及び抗生物質又は任意の他の抗菌剤の投与、並びに実質的に同時の、例えば単一の混合物／組成物中での、又は別個に与えられるが、それでも実質的に同時に、例えば同日又は２４時間中に異なる時点で被験体に投与される用量でのこれらの作用物質の投与を指す。Ｃｈｐペプチド、溶解素又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトと１つ以上の付加的な抗菌剤とのこのような共投与は、最大数日、数週間又は数ヶ月続く継続的な治療として行うことができる。さらに、用途に応じて、共投与は、継続的又は同延的（coextensive）である必要はない。例えば、用途が局所抗菌剤として、例えば細菌性潰瘍又は感染した糖尿病性潰瘍を治療することであった場合、Ｃｈｐペプチド又は溶解素又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトを初めのみ、追加の抗生物質の２４時間以内に投与することができ、その後、追加の抗生物質の使用をＣｈｐペプチド、溶解素又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトの更なる投与なしに継続してもよい。
「被験体」は、哺乳動物、植物、下等動物、単細胞生物又は細胞培養物を指す。例えば、「被験体」という用語は、細菌感染、例えばグラム陽性細菌、グラム陰性細菌感染又は抗酸菌感染の影響を受けやすい又はそれを患う生物、例えば原核生物及び真核生物を含むことを意図する。被験体の例としては、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット及びトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。或る特定の実施形態において、被験体はヒト、例えばかかる感染が全身性であるか、局所性であるか、又は別の形で特定の器官若しくは組織に集中若しくは限局しているかに関わらず、グラム陰性細菌又は抗酸菌による感染を患う、それを患うリスクがある又はその影響を受けやすいヒトである。
「ポリペプチド」は、本明細書で「ペプチド」という用語と区別なく使用され、アミノ酸残基からなり、概して少なくとも約３０個のアミノ酸残基を有するポリマーを指す。この用語は、単離形態のポリペプチドだけでなく、その活性フラグメント及び修飾された変異体を含むその誘導体も含む。「ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載のＣｈｐペプチド、溶解素及び／又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトを含み、例えば溶解機能を維持する融合タンパク質又は融合ポリペプチドも包含する。文脈に応じて、ポリペプチドは、自然発生ポリペプチド、又は組換え、改変若しくは合成的に作製されたポリペプチドであり得る。特定のＣｈｐペプチド、溶解素又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、例えば酵素的若しくは化学的切断によって天然タンパク質から得るか若しくは取り出しても、又は従来のペプチド合成法（例えば、固相合成）若しくは分子生物学的手法（例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に開示されるもの）を用いて調製しても、又は戦略的に切断若しくはセグメント化して、例えば、同じ若しくは少なくとも１つの一般的な標的細菌に対する溶菌活性を維持する活性フラグメントを得てもよい。
「融合ポリペプチド」は、通例、異なる特性又は機能性を有する２つ以上のドメイン又はセグメントを有する融合発現産物を生じる、２つ以上の核酸セグメントの融合から得られる発現産物を指す。より特定の意味では、「融合ポリペプチド」という用語は、直接、又はアミノ酸若しくはペプチドリンカーを介して共有結合的に連結した２つ以上の異種ポリペプチド又はペプチドを含むポリペプチド又はペプチドも指す場合がある。融合ポリペプチドを形成するポリペプチドは通例、Ｃ末端からＮ末端に連結されるが、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端又はＮ末端からＣ末端に連結されてもよい。「融合ポリペプチド」という用語は、「融合タンパク質」という用語と区別なく使用される場合もある。或る特定の構造「を含むポリペプチド」というオープンエンドの表現は、融合ポリペプチド等の列挙される構造よりも大きい分子を含む。
「異種」は、天然では隣接しないヌクレオチド、ペプチド又はポリペプチドの配列を指す。例えば、本開示の文脈で、「異種」という用語は、融合ペプチド又はポリペプチドが通常は天然に見られない２つ以上のペプチド及び／又はポリペプチドの組合せ又は融合、例えば増強した溶菌活性を有し得る、Ｃｈｐペプチド、溶解素、溶解素－ＡＭＰフラグメント又はその活性フラグメント、並びにカチオン性及び／又はポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、ｓｕｓｈｉペプチド（Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008)）、ディフェンシンペプチド（Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003)）、疎水性ペプチド及び／又は抗微生物ペプチドを記載するために使用することができる。２つ以上のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントがこの定義に含まれる。これらは、溶菌活性を有する融合ポリペプチドの作製に使用することができる。
「活性フラグメント」は、フラグメントが得られた単離ポリペプチドの１つ以上の機能又は生物活性、例えば、１つ以上のグラム陰性細菌又は抗酸菌に対する殺菌活性を保持するポリペプチドの部分を指す。
「両親媒性ペプチド」は、親水性官能基及び疎水性官能基の両方を有するペプチドを指す。或る特定の実施形態において、二次構造により疎水性及び親水性アミノ酸残基が両親媒性ペプチドの反対側（例えば、ペプチドが水等の溶媒中にある場合、内側対外側）に置かれ得る。これらのペプチドは、或る特定の実施形態において、αヘリックス二次構造等のヘリックス二次構造を取ることができる。
「カチオン性ペプチド」は、正に帯電したアミノ酸残基を高い割合で有するペプチドを指す。或る特定の実施形態において、カチオン性ペプチドは、８．０以上のｐＫａ値を有する。本開示の文脈での「カチオン性ペプチド」という用語は、主に正に帯電したアミノ酸残基、例えばリシン（Ｌｙｓ）及び／又はアルギニン（Ａｒｇ）残基で構成される、合成的に作製されたペプチドであるポリカチオン性ペプチドも包含する。正に帯電していないアミノ酸残基は、中性に帯電したアミノ酸残基、負に帯電したアミノ酸残基、及び／又は疎水性アミノ酸残基であり得る。
「疎水性基」は、水分子に対する親和性が低いか又は親和性を有しないが、油分子に対してより高い親和性を有するアミノ酸側鎖等の化学基を指す。疎水性物質は、水又は水相への溶解性が低いか又は溶解性を有しない傾向があり、通例非極性であるが、油相への溶解性がより高い傾向がある。疎水性アミノ酸の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。
「高める（Augmenting）」は、そうでない場合よりも高い抗微生物活性等の作用物質の活性の程度を指す。「高める」は、相加的効果及び相乗（超相加的（superadditive））効果を包含する。
「相乗的」又は「超相加的」は、独立して働く２つの作用物質の効果の総和を超える、組合せでの２つの物質によってもたらされる有益な効果を指す。或る特定の実施形態において、相乗又は超相加的効果は、独立して働く２つの作用物質の効果の総和を有意に、すなわち統計的に有意に超える。一方又は両方の有効成分を閾値下レベル、すなわち活性物質が個別に用いられる場合に効果を生じないか、又は非常に限られた効果しか生じないレベルで用いることができる。効果は、本明細書に記載されるチェッカーボードアッセイ等のアッセイによって測定することができる。
「治療」は、ヒト等の被験体が、直接的又は間接的に、障害を治癒するか、病原体を根絶するか、又は被験体の状態を改善する目的で医療を受ける任意のプロセス、行為、適用、療法等を指す。治療は、発生率の低減、症状の軽減、再発の解消、再発の予防、発生の予防、発生リスクの低減、症状の改善、予後の改善、又はそれらの組合せも指す。「治療」は、被験体における細菌の菌数、増殖速度又は病原性を低減することで、被験体における細菌感染、又は器官、組織若しくは環境の細菌汚染を制御又は低減することを更に包含し得る。このため、発生率を低減する「治療」は、例えば、被験体であるか又は環境であるかを問わず、特定のミリュー（milieu）での少なくとも１つのグラム陰性細菌又は抗酸菌の増殖を阻害するのに効果的となり得る。一方、既に確立された感染の「治療」は、感染又は汚染の原因となるグラム陰性細菌及び／又は抗酸菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させること（根絶することを含む）を指す。
「予防する」は、細菌感染等の障害の発生、再発、拡大、発症又は確立の予防を指す。本開示が感染の完全な予防又は感染の確立の予防に限定されることは意図されない。幾つかの実施形態において、発症を遅らせるか、又は続いて発症した（contracted）疾患の重症度若しくは疾患の発症の可能性を低減することが予防例を構成する。
「発症した疾患」は、発熱、敗血症又は菌血症の検出等の臨床症状又は不顕性（subclinical）症状が現れた疾患、並びにかかる病理と関連する症状が未だ現れていない場合の細菌病原体の増殖（例えば、培養物中での）によって検出され得る疾患を指す。
ペプチド又はポリペプチド又はその活性フラグメントとの関連での「誘導体」という用語は、溶菌活性に実質的に悪影響を与えない又は溶菌活性を損なわない、アミノ酸以外の１つ以上の化学的部分を含有するように修飾されたポリペプチドを包含することを意図する。化学的部分は、例えばアミノ末端のアミノ酸残基、カルボキシ末端のアミノ酸残基又は内部アミノ酸残基を介してペプチドに共有結合的に連結することができる。かかる修飾は、天然であっても又は非天然であってもよい。或る特定の実施形態において、非天然修飾は、反応性部分への保護基若しくはキャップ基（capping group）の付加、抗体及び／又は蛍光標識等の検出可能な標識の付加、グリコシル化の付加若しくは修飾、又はＰＥＧ（ペグ化）等の嵩高基（bulking group）の付加、並びに当業者に既知の他の変化を含み得る。或る特定の実施形態において、非天然修飾は、Ｎ末端アセチル化及びＣ末端アミド化等のキャップ修飾であり得る。ペプチドに付加することができる、例示的な保護基としては、ｔ－Ｂｏｃ及びＦｍｏｃが挙げられるが、これらに限定されない。限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びｍＣｈｅｒｒｙ等の一般に使用される蛍光標識タンパク質は、細胞タンパク質の正常機能に干渉することなく、ペプチドに共有結合的若しくは非共有結合的に結合するか、又はペプチドに融合させることができる小型のタンパク質である。或る特定の実施形態において、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドをポリヌクレオチド配列の上流又は下流に挿入することができる。これにより、細胞機能又はそれが結合したペプチドの機能を妨げない融合タンパク質（例えば、Ｃｈｐペプチド：：ＧＦＰ）が生じる。タンパク質へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコンジュゲーションが、多くの医薬タンパク質の循環半減期を延長する方法として使用されている。このため、ペプチド誘導体との関連で、「誘導体」という用語は、１つ以上のＰＥＧ分子の共有結合によって化学修飾されたペプチドを包含する。ペグ化ペプチドは、生物活性及び治療活性を保持した上で非ペグ化ペプチドと比較して延長された循環半減期を示すことが予想される。
「修飾された変異体」は、溶菌活性を増強するか、又はＣｈｐペプチド、溶解素若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトの溶菌活性に実質的に悪影響を与えたり若しくは破壊したりしない、アミノ酸配列に天然に存在しない修飾が行われたＣｈｐペプチド、溶解素又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトを指す。修飾された変異体に対してなされ得る例示的な修飾としては、Ｃｈｐペプチドのアミノ酸（例えば、正に帯電したアミノ酸）をＬ型からＤ型に修飾すること、アミノ酸残基（複数の場合がある）をＣ末端及び／又はＮ末端に付加して融合ポリペプチドを形成すること、並びにアミノ酸電荷が再配列された電荷アレイ変異体（charge array variants）を形成することが挙げられる。
「パーセントアミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、任意の保存的置換を配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列、例えば特定のＣｈｐペプチド、溶解素又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトのポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者の能力の範囲内の様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ等の公開されているソフトウェア、又は例えばDNASTARにより市販されているソフトウェアを用いて達成することができる。２つ以上のポリペプチド配列は、０％～１００％の間のいずれか、又はその間の任意の整数値で同一であり得る。本開示の文脈で、２つのポリペプチドは、アミノ酸残基の少なくとも８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２．５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％）が同一である場合に「実質的に同一」である。本明細書に記載される「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」という用語は、ペプチドにも当てはまる。このため、「実質的に同一」という用語は、本明細書に記載される単離ポリペプチド及びペプチドの突然変異型、切断型、融合型、又は別の形で配列が修飾された形態、及びその活性フラグメント、並びに参照（野生型又は他の無傷）ポリペプチドと比較して相当の配列同一性（例えば、１つ以上の上記の方法によって測定される、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性）を有するポリペプチドを包含する。
本明細書において使用される場合、２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２．５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％）が同一であるか、又は保存的置換を示す場合に「実質的に相同」である。本開示のポリペプチドの配列は、ポリペプチド、例えば本明細書に記載のＣｈｐペプチド、溶解素又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトのアミノ酸の１つ以上、例えば最大１０％、最大１５％、又は最大２０％が同様の又は保存的アミノ酸置換で置換され、得られるペプチド、例えば本明細書に開示のＣｈｐペプチド、溶解素又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが、参照ポリペプチドの少なくとも１つの活性（例えば、抗菌効果）及び／又は細菌特異性を有する場合に実質的に相同である。
本明細書において使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。
「吸入用組成物」は、日常呼吸又は補助呼吸（例えば、気管気管支内（intratracheobronchial）投与、経肺投与及び／又は経鼻投与による）時の、又はそれと同時の気道への直接送達のために配合されている本開示の医薬組成物を指し、霧化、噴霧化、乾燥粉末及び／又はエアロゾル化配合物が挙げられるが、これらに限定されない。
「バイオフィルム」は、表面に付着し、細菌及び／又は宿主に由来する成分で構成され得る水和したポリマーマトリックス中に凝集した細菌を指す。バイオフィルムは、生物表面又は非生物表面上で細胞が互いに接着した微生物の凝集物である。これらの接着細胞は、限定されるものではないが、細胞外高分子物質（ＥＰＳ）で構成されるマトリックス中に埋め込まれることが多い。バイオフィルムのＥＰＳは、スライム（スライムと記載されたもの全てがバイオフィルムという訳ではない）又はプラークとも称され、一般に細胞外ＤＮＡ、タンパク質及び多糖で構成されるポリマー集塊である。
「バイオフィルムの形成を予防すること」とは、バイオフィルムの出現、再発、伝播、作用発現又は確立の予防を指す。本開示はバイオフィルム確立の完全な予防又は予防に限定することを意図するものではない。幾つかの実施形態において、バイオフィルムの作用発現が遅延されるか、又はバイオフィルムの確立が減少されるか、又は新たなバイオフィルムの形成の機会が減少され、それらがバイオフィルムの予防の例を構成する。さらに、バイオフィルムの予防は、１）効果的に浮遊細菌を死滅させること；２）懸濁液中の「生残」菌細胞、すなわち代謝的に不活性であり、抗生物質に耐性で、バイオフィルム形成と高度に関連がある細菌を死滅させること；及び／又は３）「凝集」、すなわち、細菌がタンパク質若しくは多糖を介して互いに付着する能力を予防することを含む任意のメカニズムに起因し得る。
バイオフィルムを指して「根絶」とは、１）バイオフィルム内の生残菌細胞を含むバイオフィルム内の細菌を効果的に死滅させることと、任意に２）効果的にバイオフィルムマトリックスを破壊及び／又は損傷させることとを含む。
バイオフィルムを指して「破壊」とは、予防と根絶との間に当たるメカニズムを指す。破壊されるバイオフィルムは、例えば、抗生物質がより容易にバイオフィルムを透過して、細菌を死滅させるために、「開口」されるか、そうでない場合は損傷され得る。
或る特定の細菌に対する使用に適した抗生物質との関連での「適した、好適な（Suitable）」は、耐性が後に発現する場合であっても、これらの細菌に対して効果的であることが見出された抗生物質を指す。
「外膜（Outer Membrane）」すなわち「ＯＭ」はグラム陰性細菌の特性を指す。外膜は、リン脂質の内葉と、大部分がリポ多糖（ＬＰＳ）からなる両親媒性の外葉とを有する脂質二重層で構成される。ＬＰＳは、リピドＡと呼ばれるヘキサアシル化グルコサミンベースのリン脂質、多糖コア、及びＯ抗原と呼ばれる伸長した外部多糖鎖の３つの要部を有する。ＯＭは、ｉ）特にカチオンが存在し、リン酸基を中和する場合のＬＰＳ分子の互いに対する強い結合、ｉｉ）殆どが飽和したアシル鎖の密な充填、及びｉｉｉ）リピドＡ部分の疎水性スタッキングを含む３つの主な相互作用によって安定化している非流動性の連続体を示す。生じる構造は、疎水性分子及び親水性分子の両方にとって障壁となる。ＯＭの下では、ペプチドグリカンが加水分解に非常に影響を受けやすい薄層を形成する。厚さ３０ナノメートル（ｎｍ）～１００ｎｍであり、最大４０層からなるグラム陰性細菌のペプチドグリカンとは異なり、グラム陰性細菌のペプチドグリカンは、厚さが僅か２ｎｍ～３ｎｍであり、１層～３層のみからなる。
ポリペプチド
アムリン
本願は、例えば、ミクロウイルス科のゲノム配列に由来し、既知の溶解素／ａｒｔｉｌｙｓｉｎ及びアムリンを含む、他のかかる作用物質とは異なるファージ溶菌剤を用いる方法を開示する。本明細書に開示されるファージ溶菌剤はクラミジアファージ（Ｃｈｐ）ペプチドと称され、「アムリンペプチド」（アムリンとの配列類似性を意味しない機能的定義）とも称される。特定の溶菌性タンパク質のファミリーを構成する、同定された様々なＣｈｐペプチド、並びにそれらのＣｈｐペプチドの天然に存在しない修飾された変異体（配列番号８１～配列番号９１及び配列番号９４～配列番号１０２に対応する）が本明細書に開示される。
本明細書において使用される場合、「Ｃｈｐペプチド」は、天然に存在するＣｈｐペプチド、その天然に存在しない修飾された変異体、及び野生型Ｃｈｐペプチドと比較して少なくとも１つの修飾（例えば、置換）を有する修飾Ｃｈｐペプチドの両方を指す。本明細書に開示されるＣｈｐペプチドの幾つかは、互いに顕著な配列類似性を示すが、配列データベース内の他の既知のペプチドとは異なる。Ｃｈｐペプチドに特有な配列にもかかわらず、それらはいずれも脊椎動物の自然免疫系の幾つかの以前に記載される抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）と同様のαヘリックス構造をとると予測されている（E.F. Haney et al, 2017, In Hansen PR (ed), Antimicrobial Peptides: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1548）が、かかるＡＭＰとの配列類似性は有していない。Ｃｈｐクラスに関する抗菌機能と一致して、幾つかの異なる精製Ｃｈｐペプチドに関して、グラム陰性病原体及び抗酸菌病原体に対する強力な広域スペクトルの殺菌活性が本明細書に開示される。外部に適用されたタンパク質によって容易にアクセスすることができない場合がある細胞壁の生合成装置に細胞質標的を有するミクロウイルス科の先に記載されるアムリンとは異なり、本明細書に開示されるＣｈｐペプチドを、「ない状態から」（すなわち、細胞壁の外側に対して作用することにより）殺菌活性を発揮するために精製された形態で使用することができる。本明細書で同定されるＣｈｐペプチドは、グラム陰性病原体及び抗酸菌病原体に対する広域スペクトル活性、並びに血清及び／又は肺サーファクタントの存在下で持続する能力を有する新規クラスの抗微生物剤となる。例示的なＣｈｐペプチドは、例えば、ＰＣＴ出願公開である国際公開第２０２１／００７１０７号に記載されており、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。本明細書で実証及び説明されるように、野生型Ｃｈｐペプチド、修飾Ｃｈｐペプチド、その誘導体、修飾された変異体又は活性フラグメントを含む本項に記載されるＣｈｐペプチドを、本明細書に記載される医薬組成物及び方法において使用することができる。
幾つかの実施形態において、αヘリックスドメインは、分子の大部分に及ぶ。例えば、図１のＣｈｐ１及びＣｈｐ４を参照されたい。幾つかの実施形態において、αヘリックスドメインは中断され（例えば、図１のＣｈｐ２を参照されたい）、また幾つかの実施形態において、αヘリックスドメインは切断される（例えば、図１のＣｈｐ６及びＯｓｐ１を参照されたい）。本開示のＣｈｐペプチドのαヘリックスドメインは、約３個～３２個のアミノ酸、より典型的には約１０個～２５個のアミノ酸残基で大きさが変化する。
本開示の修飾Ｃｈｐペプチドは、典型的には、参照Ｃｈｐペプチドの１つ以上の機能的活性又は生物学的活性を保持する。幾つかの実施形態において、修飾はＣｈｐペプチドの抗菌活性を改善する。典型的には、修飾Ｃｈｐペプチドは、参照Ｃｈｐペプチドと比較してｉｎ ｖｉｔｒｏでの（例えばバッファー及び／又は培地における）抗菌活性を改善した。他の実施形態において、修飾Ｃｈｐペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでの（例えば、動物感染モデルにおける）抗菌活性を改善した。幾つかの実施形態において、修飾は、ヒト血清の不在下及び／又は存在下でのＣｈｐペプチドの抗菌活性を改善する。幾つかの実施形態において、修飾は、肺サーファクタントの不在下及び／又は存在下でのＣｈｐペプチドの抗菌活性を改善する。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド、又はその変異体若しくはその活性フラグメントは、ヒト血清の不在下若しくは存在下、又はヒト血清の存在に関わらず、シュードモナス・エルギノーサ、及び／又は少なくとも１つの種の抗酸菌（結核菌等）、及び任意に少なくとも１つの他の種のグラム陰性細菌若しくは抗酸菌の増殖を阻害することができるか、又はその菌数を減少させることができるか、又はそれを死滅させることができる。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド、又はその変異体若しくは活性フラグメントは、肺サーファクタントの不在下若しくは存在下、又は肺サーファクタントの存在に関わらず、シュードモナス・エルギノーサ、及び／又は少なくとも１つの種の抗酸菌（結核菌等）、及び任意に少なくとも１つの他の種のグラム陰性細菌若しくは抗酸菌の増殖を阻害することができるか、又はその菌数を減少させることができるか、又はそれを死滅させることができる。
或る特定の実施形態において、修飾Ｃｈｐペプチドは、配列番号１～配列番号４、配列番号６～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６６、配列番号８１～配列番号９１及び配列番号９４～配列番号１０２からなる群から選択される少なくとも１つのＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントのアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９２．５％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、該修飾Ｃｈｐペプチドは、任意にヒト血清及び／又は肺サーファクタントの存在下で、シュードモナス・エルギノーサ等の少なくとも１つの種のグラム陰性細菌、又はマイコバクテリアを含む放線菌等の少なくとも１つの種の抗酸菌及び任意に少なくとも１つの追加の種の本明細書に記載されるグラム陰性細菌又は抗酸菌の増殖を阻害する、その菌数を減少させる、及び／又はそれを死滅させる。
幾つかの実施形態において、本開示のＣｈｐペプチドは、１つの化学修飾された参照Ｃｈｐペプチドの誘導体である。化学修飾は、限定されるものではないが、化学部分を追加すること、新たな結合を作ること、及び化学部分を除去することを含む。化学修飾は、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含むＣｈｐペプチドのどこにでも起こり得る。例えば、或る特定の実施形態において、Ｃｈｐペプチドは、Ｎ末端アセチル化修飾を含む。或る特定の実施形態において、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、Ｃ末端アミド化修飾を含む。かかる修飾は、Ｃｈｐペプチド中の２以上の部位に存在し得る。
さらに、Ｃｈｐポリペプチド又はその活性フラグメントの１つ以上の側鎖基又は末端基は、当業者に既知の保護基によって保護され得る。
幾つかの実施形態において、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、持続時間延長（duration enhancing）部分にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態において、持続時間延長部分はポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）は、持続時間が延長された治療用ポリペプチドを得るために使用されている（Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6:150-165 (1995)、Mehvar, R., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3:125-136 (2000)、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）。ＰＥＧ骨格（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－）ｎ（ここで、ｎは繰り返しモノマーの数である）は、柔軟で両親媒性である。Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメント等の別の化学成分に付着すると、ＰＥＧポリマー鎖は、免疫応答及び他のクリアランス機構からかかるポリペプチドを保護することができる。その結果、ペグ化は、薬物動態を最適化し、バイオアベイラビリティを高め、免疫原性及び投薬の量及び／又は頻度を減少させることによって、有効性及び安全性の向上につなげることができる。
或る特定の実施形態において、Ｃｈｐペプチドは、それらのＬ－アイソフォームに自然に現れる正のアミノ酸（アルギニン、リシン、及びヒスチジン）が、Ｄ－アイソフォームの同じアミノ酸によって置き換えられている修飾された変異体である。サポシンＢに由来する種々の抗微生物タンパク質を用いて、Ｄアイソフォームアミノ酸を含む変異体がより高い抗菌活性を示す可能性があることが示されている。例えば、Manabe et al., Scientific Reports (2017); DOI:10.1038/srep43384を参照されたい。或る特定の実施形態において、Ｃｈｐペプチドは、アミノ酸残基（複数の場合がある）がＣ末端、Ｎ末端、又はＣ末端及びＮ末端の両方に付加されている修飾された変異体である。例えば、或る特定の実施形態において、システインがＣ末端及び／又はＮ末端に付加され得る。或る特定の実施形態において、αヘリックスに安定性を付与すること、及び／又は塩の存在下で活性を促進することが知られている残基を、Ｃ末端及び／又はＮ末端に付加することができる。例えば、Park et al., Helix stability confers salt resistance upon helical antimicrobial peptides, J. Biol. Chem. (2004); 279(14):13896-901を参照されたい。更なる実施形態において、Ｃｈｐペプチドは、電荷アレイ変異体である修飾された変異体であり、アミノ酸は、両親媒性ヘリックス構造を維持するためにそれらの電荷に基づいて再配列されている。更なる実施形態において、アミノ酸残基は、或る特定の実施形態において、対照ペプチドとして作用し得る修飾された変異体を作製するためにスクランブルされ得る。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド及びその活性フラグメントは、グラム陰性細菌の外膜を透過することができる。理論によって制限されるものではないが、外膜の透過後、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、細菌細胞壁の主な構造成分であるペプチドグリカンを分解し、細胞溶解をもたらすことができる。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、グラム陰性細菌のアニオン性外膜への結合を促進して、隣接するペプチドグリカンへの移行を引き起こす、正に帯電した（及び両親媒性の）Ｎ末端及び／又はＣ末端のαヘリックスドメインを含む。
グラム陰性細菌の外膜を透過するＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの能力は、国際公開第２０１７／０４９２３３号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されるような当該技術分野で既知の任意の方法によって評定され得る。例えば、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントを、グラム陰性細菌及び疎水性化合物と共にインキュベートしてもよい。殆どのグラム陰性細菌は、疎水性化合物に耐性が強く、外膜が存在することから、１－Ｎ－フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）、クリスタルバイオレット、又は８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）等の疎水性物質を取り込ませない。ＮＰＮは、無傷のグラム陰性細菌によって大部分が排除されるが、損傷した、又は透過性の外膜を持つ細胞では、ＮＰＮの取り込みが促進される場合がある。ＮＰＮは、疎水性条件下では強く、水性条件下では弱く蛍光を発する。したがって、細菌のエンベロープ内の膜リン脂質とのＮＰＮの相互作用は、その蛍光シグナルを増加させ、損傷した細菌膜の指標及び外膜透過性の尺度（measurement）として使用することができる。
より詳しくは、外壁を透過するＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの能力は、例えば、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントの存在下で、活性を試験するグラム陰性細菌、例えばシュードモナス・エルギノーサ株ＰＡ０１と共に、例えばＮＰＮをインキュベートすることで評定され得る。Ｃｈｐペプチドが存在しない場合（陰性対照）に放出される蛍光と比較して蛍光の誘導が高いことは、外膜透過を示す。加えて、蛍光誘導を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等の確立された透過剤、又はシュードモナス・エルギノーサの治療に最終手段として用いられる抗生物質、すなわち、ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）等の抗生物質の蛍光誘導と比較することで、外膜透過のレベルを評定することができる。
文献全体の複数のプロトコルは、例えば、（１）Mohamed et al., A short D-enantiomeric antimicrobial peptide with potent immunomodulatory and antibiofilm activity against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii, SCIENTIFIC REPORTS 2017; 6953(7):1-13、（２）Lv et al., Antimicrobial Properties and Membrane-Active Mechanism of a Potential α-Helical Antimicrobial Derived from Cathelicidin PMAP-36, PLoS One 2014; 9:e86364、（３）Wang et al., High specific selectivity and Membrane-Active Mechanism of the synthetic centrosymmetric α-helical peptides with Gly-Gly pairs, SCIENTIFIC REPORTS 2015; 15963(5):1-19、及び（４）Shao et al., Symmetrical Modification of Minimized Dermaseptins to Extend the Spectrum of Antimicrobials with Endotoxin Neutralization Potency, INTERNATIONAL J. MOL. SCI. 2019; 1417(20)等のＮＰＮ及びアムリンペプチドを用いる様々な作用研究の方法を詳述する。したがって、文献に基づいて、或る特定の対照ペプチドを使用し、本明細書に開示されるＣｈｐペプチドと比較することができる。例えば、Lv et al. 2014は、急速な（例えば数分以内の）膜破壊及びＮＰＮ取り込みの急速な増加を引き起こすハチ毒ペプチドであるメリチンを開示する。Wang et al. 2015は、膜の破壊及びＮＰＮの取り込みを引き起こすヒトの自然免疫分子であるＬＬ－３７を開示する。さらに、強力な膜破壊活性を有する既知のペプチドであるコリスチン、及びＣｈｐ５等の本明細書に開示されるＣｈｐペプチドの電荷反転変異体は、例えば、本明細書に開示されるＣｈｐペプチドの作用機序の研究を促進するために、対照として使用され得る。
グラム陰性細菌の外膜を破壊するＣｈｐペプチドの能力は、例えば、ＥＣ５０、又は細菌サンプルが１０分で外膜にＮＰＮの最大５０％を取り込んだ濃度を測定することによって評定することができる。ＣｈｐペプチドであるＣｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及びＣｈｐ１０－Ｍ１がグラム陰性細菌（シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・クロアカエ、クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌、及びアシネトバクター・バウマンニを含む）の外膜を透過する能力について試験された場合、コリスチン、ＬＬ３７、及びメリチンと同等の外膜透過性の用量依存的な増加が観察された。したがって、或る特定の実施形態において、グラム陰性細菌を本明細書に開示されるＣｈｐペプチドと接触させると、グラム陰性細菌は、対照ペプチド（コリスチン、ＬＬ－３７、又はメリチン等）に曝露されたグラム陰性細菌のＥＣ５０に匹敵するか又はそれより少ないＥＣ５０を示し得て、本明細書に開示されるＣｈｐペプチドが、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・クロアカエ、クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌、及びアシネトバクター・バウマンニを含むグラム陰性細菌の外膜のＮＰＮ取り込み及び透過率の増加を可能にすることを示す。
本明細書に開示されるＣｈｐペプチドの作用機序は、ＭＤＲ及びＸＤＲ株を含むグラム陰性細菌の内膜の脱分極を測定することによっても評価することができる。内膜は、カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルセリン等のヒドロキシル化リン脂質を含む。これは、生理学的ｐＨで正味の負電荷を生成し、本明細書に開示されるＣｈｐペプチドを含むカチオン性ペプチドの結合を増強すると考えられる。外膜を透過処理すると、細胞膜の電位勾配（Δψ）の散逸を誘発するＣｈｐペプチドの能力を、例えば、未処理対照と比較した時間の関数として、３，３’－ジプロピルチアジカルボシアニン（ｄｉＳＣ３－５）の放出を追跡することにより調べることができる。ｄｉＳＣ３－５は、細菌の内膜内に集中し、細菌の膜電位勾配の影響下にあるケージドカチオン（caged cation）であるフルオロフォアである。高濃度では、ｄｉＳＣ３－５は自己消光し、蛍光の抑制につながる。内膜が劣化するか、又はプロトンを含む陽イオンが漏れると、Δψが散逸し、ｄｉＳＣ３－５が放出され、続いて蛍光が増加する。ＬＬ－３７及びメリチン等の対照ペプチドはΔψを散逸させることが示されており、様々なグラム陰性細菌で本明細書に開示されているＣｈｐペプチドの散逸電位（dissipation potential）を評価するための比較として使用することができる。ＣｈｐペプチドであるＣｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及びＣｈｐ１０－Ｍ１がグラム陰性細菌（シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・クロアカエ、クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌、及びアシネトバクター・バウマンニを含む）の内膜を脱分極する能力について試験された場合、メリチン、ＬＬ３７、ＲＩ－１８、及びＰＭＢＮと同等の又はそれよりも優れた膜脱分極の用量依存的な増加が観察された。理論によって制限されることを望まないが、Ｃｈｐペプチドの内膜への吸着及び結合、並びに脂質二重層への挿入は、膜電位の崩壊に付随する膜透過及び細孔／イオンチャネル形成をもたらすと考えられる。
ＭＤＲ及びＸＤＲ株を含むグラム陰性細菌の外膜及び内膜に対する本明細書に開示されるＣｈｐペプチドによって引き起こされる損傷は、ヨウ化プロピジウム等の不浸透性色素を用いて評定することもできる。ヨウ化プロピジウムがアムリンペプチドによって損傷を受けた細菌膜を通過し、ＤＮＡに挿入され、蛍光シグナルを発する能力を評定するためのプロトコルは、例えば、Mohamed et al. 2017、Wang et al. 2015、Kwon et al., Mechanism of action of antimicrobial peptide P5 truncation against Pseudomonas aeruginosa and Staphyloccus aureus, AMB Express 2019; 9:122、及びNagant et al., Identification of Peptides Derived from the Human Antimicrobial Peptide LL-37 Active against Biofilms Formed by Pseudomonas aeruginosa Using a Library of Truncated Fragments, Antimicrob. Agents Chemo.2012; 56:5698-5708を含む当該技術分野において知られている。ＮＰＮと同様に、ヨウ化プロピジウムのＥＣ５０は、所与の時間後にＣｈｐペプチドと接触したグラム陰性細菌において測定して、未処理、又は例えば、コリスチン、ＬＬ－３７、若しくはメリチン等の対照ペプチドと接触したグラム陰性細菌のＥＣ５０と比較してもよい。ＣｈｐペプチドであるＣｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及びＣｈｐ１０－Ｍ１がグラム陰性細菌（シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・クロアカエ、クレブシエラ・ニューモニエ、大腸菌、及びアシネトバクター・バウマンニを含む）のヨウ化プロピジウムの取り込みを増強する能力について試験された場合、細胞エンベロープ透過性の用量依存的増加はコリスチン、ＬＬ３７、及びメリチンの場合と同等であった。
さらに、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド及び溶解素及び／又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトの両方の作用機序を、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）及び透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）の手法を使用することによって評価することができる。上で検討したように、Ｃｈｐペプチドと接触すると細菌膜が急速に透過化及び脱分極するため、膜の損傷をＳＥＭ及びＴＥＭで視覚化することができる。ＳＥＭ及びＴＥＭの画像は、多くの既知の溶解素と同様に、本明細書に開示されるＣｈｐペプチドが、「膜バブル（membrane bubbles）」の出現、それに続く膜の溶解を特徴とする可能性があることを実証する。Ｃｈｐペプチド（８μｇ／ｍＬ）がシュードモナス・エルギノーサと接触してからおよそ２分後に撮影されたＴＥＭ及びＳＥＭの画像は、細菌膜上に複数のバルジ（bulges）が形成されていること、並びに細孔形成及び細胞膜の分解の出現を示す。Ｃｈｐペプチド（８μｇ／ｍＬ）がシュードモナス・エルギノーサと接触してからおよそ５分後に撮影されたＴＥＭ及びＳＥＭの画像は、細胞膜の分解、電子密度の高い細胞質物質の凝縮、スフェロプラストの形成及び細孔形成と共に、膜バルジ（membrane bulges）の継続的な形成を示す。Ｃｈｐペプチド（８μｇ／ｍＬ）がシュードモナス・エルギノーサと接触してからおよそ２０分後に撮影されたＴＥＭ及びＳＥＭ画像は、細孔形成、及び細胞内内容物がないゴースト菌体の出現の複数の例を示す。ＧＮ３７０溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、細孔の形成及び溶解の前に、より広範で大きな膜ブレブを引き起こし、アモルファス形態の出現（すなわち、棒状形態の喪失）を引き起こしたが、アムリンは、細孔の出現及び溶解の前に、より離散的でより小さな膜不安定化領域をもたらした。まとめると、ＴＥＭ及びＳＥＭの画像は、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド及び溶解素及び／又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトとの接触による膜溶解が、膜のバブリング（membrane bubbling）又はバルジ形成（bulging）、細孔形成、及び細胞溶解を含む３段階のプロセスを通じて起こり、糸状物質の放出をもたらす可能性があることを実証する。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、ヒト血清の存在下及び／又は不在下で溶菌活性を示す。ヒト血清中でＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの活性を評定するのに適した方法は、当該技術分野において既知であり、実施例に記載されている。簡潔に述べると、ＭＩＣ値（すなわち、対照と比較して細菌増殖を少なくとも８０％抑制するのに十分なペプチドの最小濃度）をＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントについて決定することができ、例えば、ヒト血清中で不活性な化合物、例えば、Ｔ４ファージリゾチーム又はａｒｔｉｌｙｓｉｎ ＧＮ１２６と比較することができる。Ｔ４ファージリゾチームは、例えばSigma-Aldrich, Incから市販されている。ＧＮ１２６は、文献に記載されているＡｒｔ－１７５に相当し、ＡＭＰ ＳＭＡＰ－２９をＧＮ溶解素ＫＺ１４４に融合させることによって得られる。Briers et al. 2014, Antimicrob, Agents Chemother. 58:3774-3784を参照されたい。本文献はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、肺サーファクタントの存在下及び／又は不在下で溶菌活性を示す。肺サーファクタント中でＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの活性を評定するのに適した方法は、当該技術分野において既知であり、実施例に記載されている。ヒト血清中での活性を評定する場合と同様に、肺サーファクタント又は適切な代替物（例えば、Ｓｕｒｖａｎｔａ（商標））中でのＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントについてＭＩＣ値を決定し、任意に、ダプトマイシン等の肺サーファクタント及び／又はＳｕｒｖａｎｔａ（商標）中において活性の低下を示す化合物と比較することができる。
より詳しくは、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントのＭＩＣ値は、様々な標準培地及び非標準培地、例えば、ミューラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ）、ヒト血清又はＳｕｒｖａｎｔａ（商標）を添加したＭＨＢ、デンプンを含まないＭＨＢ（ＭＨＢｎｓ）、生理的塩濃度を含む本明細書に記載のＣＡＡ、ヒト血清又はＳｕｒｖａｎｔａ（商標）を添加したＣＡＡ、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、例えば、０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）を添加したＣＡＡ（ＣＡＡＴ）、デンプン又はビーフエキスを添加したＣＡＡＴ、改変ＲＰＭＩ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及びトリプシンソイブロスにおいて、例えば、実験室のシュードモナス・エルギノーサ株ＰＡ０１及びＣＦＳ－１２９２を含む特定の細菌に対して決定され得る。殆どの臨床分離株とは異なり、ＰＡ０１はヒト血液マトリックスの抗菌活性に感受性がないことから、ＰＡ０１の使用により血清濃度が上昇した状態での試験が可能になる。他の細菌を使用して、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントのＭＩＣ値を決定することもでき、例えば、実験室株マイコバクテリウム・スメグマチスＭＣ２１５５；弱毒化結核菌（Ｚｏｐｆ）Ｌｅｈｍａｎｎ及びＮｅｕｍａｎｎ ＡＴＣＣ（商標）株３５８１８、株２５１７７、株３５８１７、及び株３５８１８；並びに非結核性抗酸菌株、例えば、マイコバクテリウム・アビウム株Ｃｈｅｓｔｅｒ（ＡＴＣＣ（商標）７００８９８）、マイコバクテリウム・カンサシ株Ｈａｕｄｕｒｏｙ（ＡＴＣＣ（商標）１２４７８）、マイコバクテリウムス・スクロフラセウム株Ｐｒｉｓｓｉｃｋ及びＭａｓｓｏｎ（ＡＴＣＣ（商標）１９９８１）、マイコバクテリウム・ペレグリナム株Ｋｕｓｕｎｏｋｉ及びＥｚａｋｉ（ＡＴＣＣ（商標）７００６８６）、マイコバクテリウム・マリナム株Ａｒｏｎｓｏｎ（ＡＴＣＣ（商標）９２７）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ株（Ｃｕｔｔｉｎｏ及びＭｃＣａｂｅ）Ｒｕｎｙｏｎ（ＡＴＣＣ（商標）１３９５０）、及びマイコバクテリウム・フォーチュイタム亜種フォーチュイタムｄａ Ｃｏｓｔａ Ｃｒｕｚ（ＡＴＣＣ（商標）６８４１）が挙げられる。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、バイオフィルムを低減することができる。Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントの最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ：Minimal Biofilm Eradicating Concentration）を評定する方法は、修正を加えた微量液体希釈ＭＩＣ法の変法を用いて決定することができる（Ceri et al. 1999. J. Clin Microbial. 37:1771-1776（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）、及びSchuch et al., 2017, Antimicrob. Agents Chemother. 61, pages 1-18（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。この方法では、例えばＡＴＣＣ１７６４７等のシュードモナス・エルギノーサ株の新しいコロニーを培地、例えば、ＴＳＢｇ（０．２％グルコースを添加したトリプシンソイブロス）中に例えば１：１００に希釈したリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に懸濁し、例えば、０．１５ｍｌのアリコートとしてこれをＣａｌｇａｒｙ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｄｅｖｉｃｅ（９６個のポリカーボネートペグを持つ蓋付きの９６ウェルプレート；lnnovotech Inc.）に加え、例えば３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、バイオフィルムを洗浄し、例えば、ＴＳＢｇ中の溶解素の２倍希釈系列を用いて、例えば、３７℃で２４時間処理する。処理後、ウェルを洗浄し、例えば３７℃で風乾し、例えば０．０５％クリスタルバイオレットで１０分間染色した。染色後、バイオフィルムを、例えば３３％酢酸中で脱色し、例えば、抽出されたクリスタルバイオレットのＯＤ６００を決定する。各サンプルのＭＢＥＣは、クリスタルバイオレットの定量により評定されるバイオフィルムのバイオマスの少なくとも９５％を除去するのに必要な最小Ｃｈｐペプチド濃度である。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、ヒト血清、肺サーファクタント、及び／又はヒト喀痰及び嚢胞性線維症患者からのヒト喀痰を含む喀痰の存在下及び／又は不在下での抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を低下させる。ＭＩＣを評定するための任意の既知の方法が使用され得る。幾つかの実施形態において、チェッカーボードアッセイを、抗生物質濃度に対するＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントの影響を決定するために使用する。チェッカーボードアッセイは、微量液体希釈によるＭＩＣ決定のためのＣＬＳＩ法の修正に基づく（Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）、及びCeri et al. 1999. J. Clin. Microbiol. 37:1771-1776（同様にその全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。
チェッカーボードは、最初に、例えば、各ウェルが横軸に沿って２倍に希釈された同じ量の抗生物質を有する９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートの列を準備することによって構築される。別のプレートに、各ウェルが、例えば、縦軸に沿って２倍に希釈された同じ量のＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントを有する比較用の行を準備する。そして、各列が一定量の抗生物質と、Ｃｈｐペプチドの倍加希釈物とを有し、各行が一定量のＣｈｐペプチドと、抗生物質の倍加希釈物とを有するように、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメント及び抗生物質の希釈物を組み合わせる。各ウェルは、このようにＣｈｐペプチドと抗生物質との独自の組合せを持つ。細菌を、例えば、ヒト血清又は肺サーファクタントの有無にかかわらず、ＣＡＡ中１×１０５ＧＦＵ／ｍｌの濃度で薬物の組合せに加える。次いで、単独の及び組み合わせた各薬物のＭＩＣを、例えば周囲空気中、３７℃で１６時間後に記録する。部分阻止濃度の合計（ΣＦＩＣ）を各薬物について計算し、最小ΣＦＩＣ値（ΣＦＩＣｍｉｎ）を用いてＣｈｐペプチド／抗生物質の組合せの効果を決定する。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド又はその活性フラグメントは、赤血球に対して低い毒性を示す。当該技術分野で既知の任意の方法論は、本Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントの溶血活性の可能性を評定するために使用され得る。
本明細書に開示されるＣｈｐペプチドとしては、例えば引用することによりその全体が本明細書の一部をなすＰＣＴ出願公開である国際公開第２０２１／００７１０７号に記載されるものが挙げられ、以下の表１及び表２に記載される。
Figure 2024513181000002
Figure 2024513181000003
Figure 2024513181000004
Figure 2024513181000005
Figure 2024513181000006
Figure 2024513181000007
Figure 2024513181000008
Figure 2024513181000009
Figure 2024513181000010
溶解素、変異型溶解素、その活性フラグメント又は誘導体
本開示は、溶解素、変異型溶解素、その活性フラグメント又は誘導体を含む単離ポリペプチドにも関する。幾つかの実施形態において、溶解素、変異型溶解素、その活性フラグメント又は誘導体を含む単離ポリペプチドを抗微生物ペプチド（「ＡＭＰ」）と組み合わせて、溶解素－ＡＭＰポリペプチドコンストラクト、例えば、配列番号１４９（ＧＮ３７０）の溶解素－ＡＭＰコンストラクトを形成し、ここで、溶解素－ＡＭＰコンストラクトは溶菌活性を有する。本明細書において使用される場合、「溶菌活性」は、任意にヒト血清又は肺サーファクタントの存在下で、溶解素が細菌（例えば、シュードモナス・エルギノーサ）を死滅させる能力、細菌の菌数を減少させる能力又は細菌増殖を阻害する（例えば、グラム陰性細菌の外膜を透過することによる）能力を包含する。溶菌活性はまた、任意にヒト血清又は肺サーファクタントの存在下で、バイオフィルムを除去若しくは減少させる能力及び／又は抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を減少させる能力を包含する。例示的な溶解素及び溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、例えば、国際公開第２０１９／１９１６３３号及び国際公開第２０２０／０４６７４７号に記載されており、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
上で論じたＣｈｐペプチドと同様、グラム陰性細菌の外膜を透過する溶解素の能力は、国際公開第２０１７／０４９２３３号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されるような当該技術分野で既知の任意の方法によって評定され得る。例えば、溶解素を、グラム陰性細菌及び疎水性化合物と共にインキュベートしてもよい。ほとんどのグラム陰性細菌は、外膜が存在することから、疎水性化合物に耐性が強く、そのため１－Ｎ－フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）、クリスタルバイオレット、又は８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）等の疎水性物質を取り込ませない。ＮＰＮは、例えば、疎水性条件下では強く、水性条件下では弱く蛍光を発する。したがって、ＮＰＮ蛍光は、外膜透過性の尺度（measurement）として使用することができる。
より詳しくは、外膜を透過する溶解素の能力は、例えば、溶解素の存在下で、活性を試験するグラム陰性細菌（例えば、シュードモナス・エルギノーサ株ＰＡ０１）と共に、例えばＮＰＮをインキュベートすることで評定され得る。溶解素が存在しない場合（陰性対照）に放出される蛍光と比較して蛍光の誘導が高いことは、外膜透過を示す。加えて、蛍光誘導を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等の確立された透過剤、又はシュードモナス・エルギノーサの治療に最終手段として用いられる抗生物質、すなわち、ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）等の抗生物質の蛍光誘導と比較して、外膜透過性のレベルを評定することができる。
幾つかの実施形態において、溶解素、変異型溶解素、その活性フラグメント又は誘導体を含む本単離ポリペプチドは、ヒト血清の存在下及び／又は不在下で溶菌活性を示す。ヒト血清中で溶解素の活性を評定するのに適した方法は、当該技術分野において既知であり、実施例に記載されている。簡潔に述べると、ＭＩＣ値（すなわち、対照と比較して細菌増殖を少なくとも８０％を抑制するのに十分なペプチドの最小濃度）を溶解素について決定することができ、例えば、親溶解素又はヒト血清中で不活性な化合物、例えば、Ｔ４ファージリゾチーム又はａｒｔｉｌｙｓｉｎ ＧＮ１２６（国際公報第２０２０／０４６７４７号に開示、ｐＩ９．８）と比較することができる。Ｔ４ファージリゾチームは、例えばSigma-Aldrich, Inc.から市販されている。ＧＮ１２６は、文献に記載されているＡｒｔ－１７５に相当し、ＡＭＰ ＳＭＡＰ－２９をＧＮ溶解素ＫＺ１４４に融合させることによって得られる。Briers et al. 2014, Antimicrob, Agents Chemother. 58:3774-3784を参照されたい。本文献はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。溶解素ＧＮ６５（ｐＩ９．９）及びバイオフィルムを分解する酵素であるディスパーシンＢ（ＧＮ８１、ｐＩ６．０）を対照として用いることもできる（どちらも例えば、国際公開第２０２０／０４６７４７号に開示）。
より詳しくは、溶解素のＭＩＣ値は、例えば、ミューラー・ヒントンブロス、ヒト血清を添加したミューラー・ヒントンブロス、生理学的塩濃度を備えた本明細書に記載されるＣＡＡ、及びヒト血清を添加したＣＡＡにおいて、例えばシュードモナス・エルギノーサの実験室株ＰＡ０１に対して決定され得る。ほとんどの臨床分離株とは異なり、ＰＡ０１はヒト血液マトリックスの抗菌活性に感受性がないことから、ＰＡ０１の使用により血清濃度が上昇した状態での試験が可能になる。
幾つかの実施形態において、溶解素、変異型溶解素、その活性フラグメント又は誘導体を含む本単離ポリペプチドは、バイオフィルムを低減することができる。溶解素又はＡＭＰの最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ）を評定する方法は、Ｃｈｐペプチドについて上で論じたように決定され得る。
幾つかの実施形態において、溶解素、変異型溶解素、その活性フラグメント又は誘導体を含む本単離ポリペプチドは、ヒト血清、肺サーファクタント、又は喀痰（ヒト喀痰及び嚢胞性線維症患者由来のヒト喀痰を含む）の存在及び／又は不在下で細菌を阻害するために必要な抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を低下させる。ＭＩＣを評定するための任意の既知の方法が使用され得る。幾つかの実施形態において、上で論じたように、チェッカーボードアッセイは、抗生物質濃度に対する溶解素の効果を決定するために使用される。
幾つかの実施形態において、本溶解素及び溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、アミカシン、イミペネム及びメロペネム等の抗生物質と相乗的に作用し、カルバペネム耐性シュードモナス・エルギノーサ等のＭＤＲ及び／又はＸＤＲ生物を含むグラム陰性細菌の再感作を推進することができる。かかる再感作は、本明細書に記載されるチェッカーボードアッセイにおいて、本溶解素又は溶解素－ＡＭＰポリペプチドコンストラクトを抗生物質と組み合わせることによって判断され得る。カルバペネム耐性シュードモナス・エルギノーサ等の抗生物質耐性細菌を、溶解素又は溶解素－ＡＭＰポリペプチドコンストラクトの組合せに加える。一般的に、抗生物質ＭＩＣ値が、例えば、抗生物質感受性細菌の場合はＭＩＣ値２以下、中間感受性細菌の場合はＭＩＣ値４、及び抗生物質耐性菌、例えばカルバペネム耐性分離株の場合はＭＩＣ値８以上の確立されたブレイクポイントを下回る相乗的な組合せで、再感作が起こる。Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), CLSI. 2019. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 29th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PAを参照されたい。この文献はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
幾つかの実施形態において、溶解素、変異型溶解素、その活性フラグメント又は誘導体を含む本単離ポリペプチドは、赤血球に対して低い毒性を示す。当該技術分野で既知の任意の方法論は、溶解素、変異型溶解素、その活性フラグメント又は誘導体を含む本単離ポリペプチドの溶血活性の可能性を評定するために使用することができ、その方法論にはＰＣＴ出願公開第２０１９／１９１６３３号及びＰＣＴ出願公開第２０２０／０４６７４７号に記載される方法が含まれる。
特に本明細書に記載される溶解素－ＡＭＰコンストラクトとの使用に適した本開示の溶解素の例としては、クレブシエラ（Klebsiella）ファージ０５０７－ＫＮ２－１から得られるＧＮ３１６溶解素（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００８５３１９６３．１）、シュードモナス（Pseudomonas）ファージから得られる溶解素ＰａＰ２＿ｇｐ１７（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿０２４７４５．１）、デルフチア（Delftia）属種から得られるＧＮ３３３（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０１６０６４７９１．１）、バークホルデリア・シュードマルチボランス（Burkholderia pseudomultivorans）から得られるＧＮ４２４（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０６０２５０９９６．１）、シュードモナス・フレキシビリス（Pseudomonas flexibilis）から得られるＧＮ４２５溶解素（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０３９６０５９３５．１）、エシェリヒア（Escherichia）ウイルスＣＢＡ１２０から得られるＧＮ４２８（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００４９５７７８１．１）、ディッケヤ（Dickeya）ファージｐｈｉＤ３から得られるＧＮ４３１（ＮＣＢＩ参照配列：ＡＩＭ５１３４９．１）、エルウィニア（Erwinia）属種Ｌｅａｆ５から得られるＧＮ４８５（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０５６２３３２８２．１）、及びシュードモナスファージＰｈｉＰＡ３（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００９２１７２４２．１）から得られるＧＮ１２３が挙げられる。
上記溶解素をバイオインフォマティクス手法により同定し、例えば、国際公開第２０２０／０４６７４７号に開示される。同定された配列の幾つかは、推定ペプチドグリカン結合タンパク質として注釈付けされていたが、以前にはこれらの配列を有するポリペプチドに決定的に起因すると考えられる機能はなかった。本発明者らは、驚くべきことに、上記の同定された配列が、特に、実施例に記載されるグラム陰性細菌に対して抗菌剤として使用するのに適していることを認識した。
本開示の好適な溶解素の更なる例、特に本溶解素－ＡＭＰコンストラクトと共に使用されるものとして、海洋メタゲノムから得られるＧＮ７（ｐＩ５．６）、ＮＣＢＩアクセッション番号ＥＣＦ７５９８８．１；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０から得られるＧＮ１１（ｐＩ７．３）、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿７４４４１８．１；シュードモナス・プチダ株ＰＡ１４Ｈ７から得られるＧＮ４０（ｐＩ５．１）、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＺ＿ＫＮ６３９１７６．１；シュードモナス・プチダ株ＰＡ１４Ｈ７から得られるＧＮ１２２（ｐＩ５．４）、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＺ＿ＫＮ６３９１７６．１；シュードモナス・プロテゲンス（Pseudomonas protegens）から得られるＧＮ３２８（ｐＩ７．９）、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿０２１２３７．１；アシネトバクター（Acinetobacter）ファージｖＢ＿ＡｂａＰ＿ＣＥＢ１から得られるＧＮ７６、ＮＣＢＩ参照配列ＡＬＣ７６５７５．１、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬＣ７６５７５．１；シュードモナス（Pseudomonas）ファージＰＡＪＵ２から得られるＧＮ４、ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ００２２８４３６１．１；シュードモナスファージＬｕｌｌから得られるＧＮ１４、ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ００６３８２５５５．１；及びミカビブリオ・エルギノサヴォルス（Micavibrio aeruginosavorus）から得られるＧＮ３７、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０１４１０２１０２．１が挙げられる。これらは全て、ＰＣＴ出願公開である国際公開第２０２０／０４６７４７号に開示されており、その全体が引用することで本明細書の一部をなす。ＧＮ４、ＧＮ１４及びＧＮ３７は、国際公開第２０１７／０４９２３３号にも開示されており、その全体が引用することで本明細書の一部をなす。
本開示の好適な溶解素－ＡＭＰコンストラクトとしては、ＧＮ７５（ｐＩ１０．１）及びＧＮ８３（ｐＩ９．４）が挙げられる。ＧＮ７５は、国際公開第２０１９／１１８６３２号に記載の溶解素ＧＮ１３のＮ末端に融合されたＡＭＰ ＯＢＰｇｐＬＹＳ（米国特許第８，８４６，８６５号の配列番号８８）を含む。ＧＮ８３は、国際公開第２０１９／１１８６３２号に記載の溶解素ＧＮ４のＮ末端に融合されたＡＭＰ ＯＢＰｇｐＬＹＳ（米国特許第８，８４６，８６５号の配列番号８８）を含む。米国特許第８，８４６，８６５号及び国際公開第２０１９／１１８６３２号は、それぞれ、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
幾つかの実施形態において、本開示の好適なポリペプチドは、バイオフィルム形成を破壊することができる酵素等のディスパーシンＢ様分子である。好適なディスパーシンＢ様分子としては、ＰＣＴ出願公開である国際公開第２０２０／０４６７４７号に開示のＧＮ８０（ｐＩ４．６）が挙げられる。
幾つかの実施形態において、本単離ポリペプチドは、溶解素変異体、例えば、参照溶解素ポリペプチド、例えば天然起源の溶解素又は親溶解素と比較して１つ以上の挿入、欠失及び／又はアミノ酸置換を含有する溶解素を含み、それ自体が変異型溶解素である。幾つかの実施形態において、変異型溶解素、その活性フラグメント又は誘導体を含む単離ポリペプチド配列は、本明細書に記載される参照溶解素（例えば、ＧＮ２０２）及び／又はその活性フラグメントと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する。
本開示の溶解素変異体は、典型的には、参照溶解素の１つ以上の機能的活性又は生物学的活性を保持する。幾つかの実施形態において、修飾は溶解素の抗菌活性を改善する。典型的には、溶解素変異体は、参照溶解素と比較してｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えばバッファー及び／又は培地における）抗菌活性を改善した。他の実施形態において、溶解素変異体は、ｉｎ ｖｉｖｏでの（例えば、動物感染モデルにおける）抗菌活性を改善した。幾つかの実施形態において、修飾は、ヒト血清の不在下及び／又は存在下での溶解素の抗菌活性を改善する。幾つかの実施形態において、修飾は、肺サーファクタントの存在下での溶解素の抗菌活性を改善する。
幾つかの実施形態において、変異型溶解素は、例えば、単一の点突然変異等の単一のｐＩ増加突然変異を参照溶解素に組み込むことにより、溶解素の全体的な等電点（ｐＩ）（すなわち、分子が正味中性電荷を有するｐＨ）の変化をもたらす修飾を含むように参照溶解素を修飾することによって得られる。
幾つかの実施形態において、本開示の溶解素変異体は、典型的には、α－ヘリックスドメインを保持するように設計されており、その有無は、Ｊｐｒｅｄ４（compio.dundee.ac.uk/jpred）、Ｈｅｌｉｃａｌ Ｗｈｅｅｌ（hael.net/helical.htm）、ＨｅｌｉＱｕｅｓｔ（zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）及びＰＥＰ－ＦＯＬＤ ３（bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3）等の様々なソフトウェアプログラムを使用して容易に判断することができる。
幾つかの実施形態において、α－ヘリックスドメインは、溶解素のＣ末端に位置する。他の実施形態において、α－ヘリックスドメインは、溶解素のＮ末端に位置する。より典型的には、α－ヘリックスドメインは、Ｃ末端に位置する。本開示の溶解素のα－ヘリックスドメインは、約２０個～４０個のアミノ酸、より典型的には約１５個～３３個のアミノ酸残基で大きさが変化する。例えば、Ｎ末端に位置するＧＮ１４ α－ヘリックスドメインは、１５個のアミノ酸（ＰＣＴ出願公開である国際公開第２０２０／０４６７４７号の配列番号１２４の残基６６～８０）を含む。Ｃ末端に位置するＧＮ３７ α－ヘリックスドメインは、１４個のアミノ酸（ＰＣＴ出願公開である国際公開第２０２０／０４６７４７号の配列番号８４の残基１１３～１２６）を含む。同じくＣ末端に位置するＧＮ４ α－ヘリックスドメインは、２５個のアミノ酸（ＰＣＴ出願公開である国際公開第２０２０／０４６７４７号の配列番号７４の残基１１６～１４０）を含む。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示の変異型溶解素、その活性フラグメント又はその誘導体は精製タグ、例えばＰＣＴ出願公開である国際公開第２０１９／１９１６３３号及び国際公開第２０２０／０４６７４７号に開示のものを含むように修飾される。これらはどちらも、引用することにより本明細書の一部をなす。
溶解素変異体は、当該技術分野で既知であり、国際公開第２０１７／０４９２３３号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載される任意の方法によって、例えば、本明細書に記載される１つ以上の生物学的機能を保持する、本溶解素を産生する宿主において部位特異的突然変異誘発を通して又は突然変異を介して、本明細書に記載される溶解素、その活性フラグメント及び誘導体のいずれかを修飾することにより形成され得る。本溶解素変異体は、切断型、キメラ型、シャッフル型又は「天然型」であってもよく、例えば、米国特許第５，６０４，１０９号に記載されているように組合せであってもよく、この文献はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
例えば、当業者は、例えばα－ヘリックスドメイン又はα－ヘリックスドメインの外の領域に対する置換又は置換えを合理的に行い、試験することができる。Ｇｅｎｂａｎｋデータベースと、例えば、本明細書に記載される完全なアミノ酸配列との配列比較を行って、例えば、置換のためのアミノ酸を同定することができる。
突然変異は、アミノ酸配列において、又はポリペプチド、及び溶解素、活性フラグメント若しくは誘導体をコードする核酸配列において、特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンに変化する、アミノ酸が別のアミノ酸に置換される、又は１つ以上のアミノ酸が削除されるように行われ得る。
かかる突然変異は、一般的には可能な限りヌクレオチド変化を少なくすることによって行われる。この種の置換突然変異は、非保存的な方法（例えば、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から別の分類に属するアミノ酸へとコドンを変化させることによる）又は保存的な方法（例えば、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から同じ分類に属するアミノ酸へとコドンを変化させることによる）で、得られるタンパク質中のアミノ酸を変化させることができる。かかる保存的変化は、概して、得られるタンパク質の構造及び機能の変化を少なくする。非保存的な変化は、得られるタンパク質の構造、活性又は機能を変更する可能性がより高い。本開示は、得られるタンパク質の活性又は結合特性を著しく変化させない保存的変化を含む配列を含むように考慮されるべきである。そのため、当業者は、本明細書に提供される溶解素の配列の再検討、また他の溶解素ポリペプチドに利用可能なそれらの知識及び公開情報に基づいて、溶解素ポリペプチド配列においてアミノ酸の変化又は置換を行うことができる。本明細書に提供される溶解素（複数の場合もある）の配列内の１つ以上、１つ又は数個、１つ又は幾つか、１個～５個、１～１０個又は他のその数のアミノ酸を置換えて又は置換して、それらの突然変異体又は変異体を生成するため、アミノ酸の変化を行うことができる。それらのかかる突然変異体又は変異体を、機能について推定するか、又は例えば、シュードモナス・エルギノーサについて本明細書に記載される抗菌活性についての機能若しくは能力、及び／又は本明細書に記載され、特に提供されている溶解素（複数の場合もある）に匹敵する活性を有することについて試験してもよい。そのため、溶解素の配列に対して行われる変化、及び本明細書に記載される突然変異体又は変異体を、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載されるアッセイ及び方法を用いて試験することができる。当業者は、本明細書の溶解素（複数の場合もある）のドメイン構造に基づいて、合理的で保存的又は非保存的な置換を含む、置換若しくは置換えに適した１つ以上の、１つ若しくは幾つかのアミノ酸、及び／又は置換若しくは置換えに適さない１つ以上のアミノ酸を予測することができる。
幾つかの実施形態において、本単離ポリペプチドは、溶解素の活性フラグメント又は誘導体を含む。「活性フラグメント」という用語は、完全長の溶解素の一部を指し、これは、参照溶解素の１つ以上の生物学的活性を保持する。そのため、本明細書において使用される場合、溶解素又は変異型溶解素の活性フラグメントは、ヒト血清の不在下若しくは存在下、又はヒト血清の有無にかかわらず、又は肺サーファクタントの存在下で、例えば、シュードモナス・エルギノーサ及び／又は本明細書に記載される他のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、又はその集団を減少させるか、又はそれを死滅させる。溶解素の好適な活性フラグメントとしては、限定されるものではないが、国際公開第２０１７／０４９２３３号に記載されているものが挙げられ、この文献はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。活性溶解素フラグメントは、典型的にはα－ヘリックスドメインを保持する。
抗微生物ペプチド
幾つかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、溶解素－ＡＭＰコンストラクトを含む。溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、本明細書に記載される溶解素、変異型溶解素、その活性フラグメント又は誘導体を含む単離ポリペプチドと、抗微生物ペプチド又はそのフラグメントとを含む。本明細書において使用される場合、「抗微生物ペプチド」（ＡＭＰ）という用語は、事実上全ての生物において見出すことができる広範囲の短い（一般に３アミノ酸～５０アミノ酸残基の長さの）遺伝子コードペプチドのメンバー、典型的には抗生物質を指し、例えば、本明細書に開示される、又は引用することにより本明細書の一部をなすＰＣＴ出願公開である国際公開第２０２１／００７１０７号に開示されるＣｈｐペプチドのいずれかを含むことができる。該用語は、ヘリックスペプチド、β－シートペプチド及び大部分が不規則ランダムコイル構造を示すペプチドを包含する。ＡＭＰは、本明細書に記載されるような、ディフェンシン、カテリシジン、ｓｕｓｈｉペプチド、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、疎水性ペプチド及び／又はＡＭＰ様ペプチド、例えばアムリンペプチドを含む。ＡＭＰのフラグメント、ＡＭＰ変異体及びＡＭＰの誘導体もこの用語に包含される。
本明細書で用いられる場合、「ＡＭＰ活性」の用語は、例えばヒト血清又は肺サーファクタントの存在下及び／又は不在下で、例えばグラム陰性細菌の外膜を透過することによって、細菌を死滅させるか、細菌の集団を減少させるか、又は細菌増殖を阻害するＡＭＰ又はそのフラグメントの能力を包含する。典型的には、ＡＭＰの移行は、外膜のリポ多糖部分との一次静電相互作用、その後のカチオン変位、膜の崩壊及び一時的開口、場合によってはＡＭＰの内在化によって推進される。
ＡＭＰ活性はまた、ヒト血清又は肺サーファクタントの存在下及び／又は不在下における抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を減少させるＡＭＰ又はそのフラグメントの能力を包含する。グラム陰性細菌の外膜を透過する本ＡＭＰ及びそのフラグメントの能力を評定し、血清又は肺サーファクタントの存在下及び不在下での抗生物質のＭＩＣの減少を判断するのに適した方法は、当該技術分野で既知であり、本溶解素、誘導体及びその活性フラグメントについて上に記載されるそれらの方法を含む。
幾つかの実施形態において、本ＡＭＰは、本明細書に記載されるＡＭＰのいずれかと、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する変異型ＡＭＰであり、その変異型ＡＭＰはＡＭＰ活性を保持する。
幾つかの実施形態において、本ＡＭＰは、α－ヘリックスドメイン等のヘリックスドメインを含む。幾つかの実施形態において、α－ヘリックスドメインは、分子の大部分に及ぶ。例えば、図１のＣｈｐ１及びＣｈｐ４を参照されたい。他の実施形態において、α－ヘリックスドメインは、中断されるか（例えば、Ｃｈｐ２）又は切断される（例えば、Ｃｈｐ６及びＯｓｐ１）。本明細書に記載されるＣｈｐ等の本ＡＭＰのα－ヘリックスドメインは、約３個～３２個のアミノ酸、より典型的には約１０個～２５個のアミノ酸残基で大きさが変化する。一般的には、ヘリックスドメインは活性に必要であり、典型的には溶解素のＣ末端又はＮ末端に融合する際に保持されなければならない。
典型的には、ヘリックスペプチドは、両親媒性の特性を示し、繰り返しパターンで頻繁に現れるかなりの割合（例えば５０％）の疎水性残基を含有する。α－ヘリックス構造の形成に際して、親水性残基は、典型的にはヘリックスの同じ側で終了し、それにより立体構造依存性の両親媒性をもたらす。多くの場合、これらのペプチドは水性環境下で不定形であるが、脂質膜に遭遇した場合にはヘリックス立体構造をとる。このグループに属するペプチドは、典型的には、＋２～＋１１の範囲の全体的な正電荷を示し、通常、膜欠損を起こして電解質、シグナル物質及び他の因子の勾配の損なわせることで、グラム陰性細菌等の微生物を死滅させる。
幾つかの実施形態において、本ＡＭＰは、クラミジアファージ（Ｃｈｐ）ペプチド又はアムリンペプチドと本明細書で称されるファージの溶解物質を含む「ＡＭＰ様」ペプチドである。本開示のアムリンペプチドは、アムリンと区別することができる。当該技術分野で知られているように、ｓｓＤＮＡファージ又はｓｓＲＮＡファージ（それぞれ、ミクロウイルス科（Microviridae）及びレビウイルス科（Leviviridae））から得られるアムリンは、直前に１０個～１７個の疎水性残基が伸びる内部ＬＳジペプチドを含む推定ドメイン構造を有する内在性膜タンパク質である。アムリンの例としては、ムレイン前駆物質リピドＩ（Lipid I）の形成を触媒する必須の膜組み込み型酵素（membrane-embedded enzyme）である細菌トランスロカーゼＭｒａ Ｙを阻害することによって溶解を引き起こす９１アミノ酸の膜タンパク質である、ファージ＜ｐＸ１７４由来のタンパク質Ｅアムリン（ミクロウイルス科、ミクロビンツ（Microvints）属）；ＭｕｒＡ活性を妨げ、ペプチドグリカン生合成のプロセスを調節不全にすることによって溶解を引き起こす４２０アミノ酸の構造タンパク質である、ファージＱ～のＡ２カプシドタンパク質（レビウイルス科、アロレビウイルス（Allolevivirus）属）；宿主シャペロンＤｎａＪの活性を必要とする機構を用いて溶解を引き起こす、７５アミノ酸の膜内在性タンパク質であるファージＭＳ２のタンパク質Ｌアムリン（レビウイルス科、レビスウイルス属）が挙げられる。典型的には、アムリンは精製することができず、抗菌治療薬としての使用には適さない。
アムリンとは対照的に、本開示のアムリンペプチドは、様々な脊椎動物の自然免疫系から得られたＡＭＰと同様の推定α－ヘリックス構造を有する小さなカチオン性ペプチドである（但し、ＡＭＰに似ていないアミノ酸配列を有する）。アムリンペプチドは、主にクラミジアミクロウイルスに見られ、ゴクショウイルス科（Gokushovirinae）サブファミリーの他の関連する成員で見られる頻度はより少ない。様々なミクロウイルス科ファージに由来するアムリンペプチドは、互いに３０％～１００％の同一性を示し、他のペプチドとの相同性を有していない。細胞壁の生合成装置に細胞質標的を有するミクロウイルス科のアムリンとは異なるため、外部に適用されたタンパク質によって容易にアクセスできず、本アムリンペプチドは「ない状態から」殺菌活性を発揮するために精製された形態で使用することができる。
幾つかの実施形態において、本開示のＡＭＰは、合成ペプチドを含む。幾つかの実施形態において、合成ペプチドは、細菌の目に見える増殖を防ぐ抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を減少させるが、それ自体は抗菌活性を示さない。本開示の溶解素－ＡＭＰポリペプチドコンストラクトと共に使用するための特に望ましい合成ペプチドとしては、ＦＩＲＬペプチド模倣体（配列番号１２６）（ＰＣＴ出願公開である国際公開第２０２０／０４６７４７号の配列番号１１４）が挙げられる。理論によって制限されるものではないが、ＦＩＲＬ（配列番号１２６）（ＰＣＴ出願公開である国際公開第２０２０／０４６７４７号の配列番号１１４）は、外膜タンパク質生合成に関与するタンパク質ＢａｍＤの配列に関連しており、抗生物質に対する外膜の透過性を増加させるようである。提案される機構に関する更なる情報は、例えば、Mori et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2012, 67: 2173-2181に見られ、これはその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
構造安定化成分
幾つかの実施形態において、本開示の溶解素－ＡＭＰポリペプチドコンストラクトは、コンストラクトにおいて第１の成分及び／又は第２の成分、例えば溶解素及び／又はＡＭＰの構造の少なくとも一部を、コンジュゲートされていない溶解素及び／又はＡＭＰの場合と実質的に同じに維持する少なくとも１つの構造安定化成分を更に含む。幾つかの実施形態において、安定化構造はリンカーである。典型的には、リンカー等の少なくとも１つの構造安定化成分により溶解素及びＡＭＰが第１のタンパク質部分及び／又は第２のタンパク質部分の三次元構造を実質的に保存することができ、溶解素及び／又はＡＭＰの少なくとも１つの生物学的活性が保持される。
好適なリンカー及び構造安定化成分は、例えば、ＰＣＴ出願公開である国際公開第２０１９／１９１６３３号及び同第２０２０／０４６７４７号に開示され、いずれも引用することにより本明細書の一部をなす。
溶解素－ＡＭＰポリペプチドコンストラクトの例
本明細書に開示される溶解素－ＡＭＰポリペプチドの例としては、例えば、ＰＣＴ出願公開である国際公開第２０１９／１９１６３３号及び同第２０２０／０４６７４７号に開示されるものが挙げられ、いずれも引用することにより本明細書の一部をなす。
例えば、幾つかの実施形態において、溶解素－ＡＭＰポリペプチドコンストラクトは、ＧＮ３７０溶解素（配列番号１４９）を生成するために、ＧＮ２０２溶解素（配列番号１２８）にＮ末端で導入された、ＭＩＤＲ部分（配列番号１２５）と、ＦＩＲＬ部分（配列番号１２６）と、ＮＰＴＨ部分（配列番号１２７）とを含むか、又は溶解素活性を有し、配列番号１４９に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％若しくは例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
下記表３は、本明細書に記載される溶解素及び溶解素－ＡＭＰコンストラクトの具体例を示す。コンストラクトのＡＭＰ部分はＧＮ１６８（配列番号１２９）、ＧＮ１７６（配列番号１３０）、ＧＮ１７８（配列番号１３１）、ＧＮ３７０（配列番号１４９）、ＧＮ３７１（配列番号１５０）及びＧＮ９３（配列番号１５８）では、二重下線で示される。他のコンストラクトではいずれも、二重下線は溶解素に対応する。リンカー等の構造安定化成分はイタリック体の太字で示される。ＧＮ４８６（配列番号１６０）に対する精製タグは下線が付いたイタリック体の太字である。単一の点突然変異は太字である。
Figure 2024513181000011
Figure 2024513181000012
Figure 2024513181000013
幾つかの実施形態において、本開示の溶解素及び／又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトは化学的に修飾される。化学修飾としては、限定されるものではないが、化学部分を付加すること、新たな結合を作製すること、及び化学部分を除去することが挙げられる。化学修飾は、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含む溶解素及び／又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトのどこでも起こり得る。例えば、或る特定の実施形態において、溶解素又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、Ｎ末端アセチル化修飾を含む。或る特定の実施形態において、溶解素又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、Ｃ末端アミド化修飾を含む。かかる修飾は、溶解素及び／又は溶解素－ＡＭＰコンストラクト内の２つ以上の部位に存在し得る。
さらに、溶解素及び／又は溶解素－ＡＭＰポリペプチドコンストラクトの１つ以上の側鎖基又は末端基は、当業者に既知の保護基によって保護され得る。
幾つかの実施形態において、溶解素及び／又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、持続期間延長（duration enhancing）部分にコンジュゲートされる。幾つかの実施形態において、持続時間延長部分はポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）は、持続期間が延長された治療用ポリペプチドを得るために使用されている（Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6:150-165 (1995)、Mehvar, R., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3:125-136 (2000)、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす）。ＰＥＧ骨格（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－）ｎ（ここで、ｎは繰り返しモノマーの数である）は、柔軟で両親媒性である。溶解素及び／又は溶解素－ＡＭＰコンストラクト等の別の化学成分に付着すると、ＰＥＧポリマー鎖は、免疫応答及び他のクリアランス機構からかかるポリペプチドを保護することができる。その結果、ペグ化は、薬物動態を最適化し、バイオアベイラビリティを高め、免疫原性及び投薬の量及び／又は頻度を減少させることによって、有効性及び安全性の向上につなげることができる。
ポリヌクレオチド
溶解素、変異型溶解素、その活性フラグメント又は誘導体
一態様において、本開示は、本明細書に記載されるＣｈｐペプチド、溶解素、溶解素－ＡＭＰコンストラクト、その変異体又は活性フラグメントをコードする核酸分子を含む単離ポリヌクレオチドに関する。幾つかの実施形態において、単離ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。他の実施形態において、単離ポリヌクレオチドはｃＤＮＡ配列である。
幾つかの実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＣｈｐペプチド、溶解素、溶解素－ＡＭＰコンストラクト、又はその変異体若しくは活性フラグメントと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含み、ここで、コードされるポリペプチドは、ヒト血清の不在下若しくは存在下、又はヒト血清の有無にかかわらず、又は肺サーファクタントの存在下で、シュードモナス・エルギノーサ及び任意に本明細書に記載される少なくとも１つの他の種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。
幾つかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ－Ｍ１、Ｃｈｐ１０－Ｍ１、Ｕｎｐ２－Ｍ１、Ｃｈｐ４－Ｍ１、Ｃｈｐ６、及びＣｈｐ６－Ｍ１の少なくとも１つをコードする核酸分子と、ＧＮ３７０若しくはその変異体、又はその活性フラグメント若しくは誘導体から選択される溶解素－ＡＭＰコンストラクトとを含み、単離されたポリヌクレオチドによってコードされる変異体又はその活性フラグメント若しくは誘導体は、ヒト血清の不在下若しくは存在下、又はヒト血清の有無にかかわらず、又は肺サーファクタントの存在下で、シュードモナス・エルギノーサ及び／又は少なくとも１つの他の種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。
幾つかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｃｈｐペプチド（Ｃｈｐペプチドは、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ－Ｍ１、Ｃｈｐ１０－Ｍ１、Ｕｎｐ２－Ｍ１、Ｃｈｐ４－Ｍ１、Ｃｈｐ６、及びＣｈｐ６－Ｍ１の少なくとも１つである）をコードする核酸分子を含むか、又は溶解素活性を有し、かつＣｈｐ２、Ｃｈｐ－Ｍ１、Ｃｈｐ１０－Ｍ１、Ｕｎｐ２－Ｍ１、Ｃｈｐ４－Ｍ１、Ｃｈｐ６、及びＣｈｐ６－Ｍ１に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、若しくは例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
幾つかの実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、溶解素－ＡＭＰコンストラクト（溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、ＧＮ３７０である）をコードする核酸分子を含むか、又は溶解素活性を有し、かつＧＮ３７０に対して少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、若しくは例えば少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
ベクター及び宿主細胞
別の態様において、本開示は、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその変異体若しくは活性フラグメントのいずれかをコードする核酸分子を含む単離ポリヌクレオチド又は本単離ポリヌクレオチドの相補配列を含むベクターに関する。幾つかの実施形態において、ベクターはプラスミド又はコスミドである。他の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、この場合、追加のＤＮＡセグメントをウイルスベクターにライゲートすることができる。幾つかの実施形態において、ベクターは、ベクターが導入された宿主細胞において自律的に複製することができる。幾つかの実施形態において、ベクターは宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに統合され、それによって宿主ゲノムと共に複製され得る。
幾つかの実施形態において、特定のベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」又は「発現ベクター」と称され、ベクターが操作可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。ポリヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列と機能的な関係に置かれる場合、「操作可能に連結」される。例えば、プロモーター又は調節ＤＮＡ配列は、２つの配列が操作可能に連結している場合、又はプロモーター若しくは調節ＤＮＡ配列がコーディングＤＮＡ配列若しくは構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を与えるように位置する場合、ＲＮＡ及び／又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列に「操作可能に連結して」いると言われる。操作可能に連結されたＤＮＡ配列は、典型的には連続的であるが、必ずしもそうであるわけではない。
幾つかの実施形態において、本開示は、配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、及び配列番号８１～配列番号１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードする核酸分子を含むベクターに関する。
幾つかの実施形態において、本開示は、配列番号２、配列番号６、配列番号８１、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９１及び配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣｈｐペプチド、又はその活性フラグメントをコードする核酸分子を含むベクターに関する。
幾つかの実施形態において、本開示は、配列番号１４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントをコードする核酸分子を含むベクターに関する。
一般的には、宿主においてポリペプチドを維持、増殖又は発現するのに適した任意の系又はベクターは、本明細書に開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントの発現に使用され得る。適切なＤＮＡ／ポリヌクレオチド配列は、例えばSambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に記載されるもの等、様々な既知の日常的な手法のいずれかによって発現系へと挿入され得る。さらに、Ｃｈｐペプチド又はその活性フラグメントにタグ、例えば、ｃ－ｍｙｃ、ビオチン、ｐｏｌｙ－Ｈｉｓ等を付加して、簡便な分離方法を提供することもできる。かかる発現系用のキットは市販されている。
広範な宿主／発現ベクターの組合せを、本明細書に開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列の発現に用いることができる。多数の好適なベクターが当業者に既知であり、市販されている。適切なベクターの例は例えば、Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)に提示されている。かかるベクターとしては、特に染色体ベクター、エピソームベクター及びウイルス由来ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体要素、バキュロウイルス、ＳＶ４０等のパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス等のウイルスに由来するベクター、並びにそれらの組合せに由来するベクター、例えばプラスミドとコスミド及びファージミド等のバクテリオファージ遺伝要素とに由来するベクターが挙げられる。
さらに、上記ベクターは、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性化フラグメントの構成的又は誘導性発現をもたらすことができる。好適なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体、並びに既知の細菌プラスミド、例えば大腸菌プラスミドｃｏｌＥｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４、ｐＢＡＤ２４及びｐＢＡＤ－ＴＯＰＯ等のプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばファージＡの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、並びに他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２Ｄプラスミド等の酵母プラスミド又はその誘導体；昆虫又は哺乳動物細胞に有用なベクター等の真核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミド等のプラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。上述のベクターの多くがNew England Biolabs Inc.、Addgene、Takara Bio Inc.、ThermoFisher Scientific Inc.等の供給業者から市販されている。
さらに、ベクターは、様々な調節要素（プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する様々なシスエレメントを含む）を含んでいてもよく、ベクターは、宿主細胞に応じて構築される。広範な発現制御配列（それに操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を制御する配列）のいずれかを、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を発現するために、これらのベクターに用いることができる。有用な制御配列としては、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ又はアデノウイルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージＡの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄ外被タンパク質の制御領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母接合因子のプロモーター、細菌における発現のための大腸菌プロモーター、並びに原核若しくは真核細胞、又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られる他のプロモーター配列、並びにそれらの様々な組合せが挙げられるが、これらに限定されない。通例、Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列は、異種プロモーター又は調節要素に操作可能に連結される。
別の態様において、本開示は、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、本明細書に開示されるいずれかのベクターを含む宿主細胞に関する。広範な宿主細胞が本ポリペプチドの発現に有用である。本ポリペプチドの発現に適した宿主細胞の非限定的な例としては、大腸菌株、シュードモナス株、バシラス（Bacillus）株、ストレプトミセス（Streptomyces）株、酵母等の真菌、並びにＣＨＯ細胞、Ｒｌ．ｌ細胞、Ｂ－Ｗ細胞及びＬ－Ｍ細胞等の動物細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣｌ、ＢＳＣ４０及びＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、並びに組織培養ではヒト細胞及び植物細胞等の既知の真核生物及び原核生物の宿主が挙げられる。発現宿主は、任意の既知の発現宿主細胞であってもよいが、典型的な実施形態において、発現宿主は大腸菌の株の１つである。これらの大腸菌株としては、限定されるものではないが、Ｔｏｐ１０（ThermoFisher Scientific, Inc.）、ＤＨ５ａ（Thermo Fisher Scientific, Inc.）、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Agilent Technologies, Inc.）、ＳＣＳ１１０（Agilent Technologies, Inc.）、ＪＭ１０９（Promega, Inc.）、ＬＭＧ１９４（ATCC）及びＢＬ２１（Thermo Fisher Scientific, Inc.）等の市販の大腸菌株が挙げられる。
大腸菌を宿主系として使用することの利点は幾つかあり、最適な環境条件下で、その倍加時間が約２０分間である急速な増殖動態（Sezonov et al., J. Bacterial. 189 8746-8749 (2007)）、容易に達成される高密度の培養物、外来性ＤＮＡによる容易かつ急速な形質転換等が挙げられる。プラスミド選択及び株選択を含む、大腸菌におけるタンパク質発現に関する詳細は、Rosano, G. and Ceccarelli, E., Front Microbial., 5: 172 (2014)に詳細に論考されている。
本Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントの効率的な発現は、最適発現シグナル（転写及び翻訳の両方のレベルで）、正確なタンパク質フォールディング及び細胞増殖特性等の様々な要因によって決まる。ベクターを構築する方法及び構築した組換えベクターを宿主細胞に形質導入する方法に関して、当該技術分野で既知の従来の方法を利用することができる。全てのベクター、発現制御配列及び宿主が本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を発現するよう同様に良好に機能するわけではないことが理解されるが、当業者は、本開示の範囲から逸脱することなく所望の発現を達成するために過度な実験なしに適当なベクター、発現制御配列及び宿主を選択することが可能である。
本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法によって組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィーをＣｈｐペプチド精製に用いることもできる。
代替的には、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又は活性フラグメントの作製に用いられるベクター系は、無細胞発現系であってもよい。様々な無細胞発現系が市販されており、限定されるものではないが、Promega、LifeTechnologies、Clonetech等から入手可能なものが挙げられる。
上記のように、タンパク質の産生及び精製に関しては、様々な選択肢がある。タンパク質の産生及び精製において検討される好適な方法及び戦略の例は、国際公開第２０１７／０４９２３３号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に提供され、さらにStructural Genomics Consortium et al., Nat. Methods., 5(2):135-146 (2008)に提示される。
医薬組成物
本開示の組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体を含有するカプセル剤、粉末、持続放出製剤、坐剤、タンポン用途エマルション、エアロゾル、スプレー、懸濁液、ロゼンジ、トローチ、キャンディー、注射剤、チューインガム、軟膏、スメア（smears）、時間放出パッチ、液体を吸収したワイプ、及びそれらの組合せの形態をとることができる。
本開示の組成物又はその薬学的に許容可能な形態の投与は局所的であってもよく、すなわち、該医薬組成物は、その作用が望まれる場所に直接（例えば創傷に直接）適用されてもよく、又は全身的であってもよい。同様に、全身投与は、経腸又は経口（すなわち、組成物は消化管を介して与えられ得る）であってもよく、非経口（すなわち、組成物は注射又は吸入等の消化管以外の経路によって与えられ得る）であってもよい。そのため、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメント及びそれらを含む組成物は、経口的に、非経口的に、吸入により、局所的に、経腸的に、経鼻的に、バッカルで、留置されたリザーバーにより、又は任意の他の既知の方法により被験体に投与され得る。本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを、持続放出剤形を用いて投与することもできる。
経口投与の場合、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを、固体又は液体の調製物、例えば錠剤、カプセル剤、粉末、溶液、懸濁液及び分散液に配合することができる。組成物を、例えば、ラクトース、スクロース、コーンスターチ、ゼラチン、ジャガイモデンプン、アルギン酸及び／又はステアリン酸マグネシウム等の賦形剤と配合することができる。
錠剤及び丸剤等の固体組成物を調製するため、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを薬学的賦形剤と混合して固体プレ製剤組成物を形成してもよい。望ましい場合、標準的な手法によって錠剤を糖コーティング又は腸溶性コーティングしてもよい。錠剤又は丸剤を、長期作用の利点を与える剤形を提供するためにコーティングしてもよく、又は他の形で配合させてもよい。例えば、錠剤又は丸剤は、内部製剤（inner dosage）及び外部製剤（outer dosage）の成分を含むことができ、後者は前者を覆うエンベロープの形態である。２つの成分を腸溶層によって分離することができ、胃内での崩壊に抵抗するようにはたらき、内側の成分が十二指腸をそのまま通過するか、又は放出が遅延することを可能にする。かかる腸溶層又はコーティング剤には様々な材料を使用することができ、かかる材料としては、多くのポリマー酸、並びにシェラック、セチルアルコール及び酢酸セルロース等の材料とのポリマー酸の混合物が挙げられる。
本開示の局所組成物は、皮膚科学的に又は耳（otically）に許容可能な担体等の薬学的又は生理学的に許容可能な担体を更に含んでもよい。かかる担体は、皮膚科学的に許容可能な担体の場合、皮膚、爪、粘膜、組織及び／又は毛髪に適合性であり得て、これらの要件を満たす従来使用される任意の皮膚科担体を含むことができる。耳に許容可能な担体の場合、担体は、耳の全ての部分に適合性であり得る。かかる担体は、当業者によって容易に選択され得る。本開示の組成物の局所投与用の担体としては、限定されるものではないが、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン及び／又はポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が挙げられる。皮膚軟膏を配合する際には、本開示の有効成分を、例えば油性炭化水素基剤、無水吸収基剤、油中水型吸収基剤、水中油型水分除去（water-removable）基剤及び／又は水溶性基剤に配合することができる。耳用組成物を配合する際には、本開示の有効成分を、例えばデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、多糖ゲル、Ｇｅｌｒｉｔｅ（商標）等のゲランガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース系ポリマー、及びアクリル酸のポリマー又はコポリマー等のカルボキシ含有ポリマー等の担体、並びに他の高分子粘滑剤を含む、水性高分子懸濁液に配合することができる。本開示による局所組成物は、局所適用に適した任意の形態であり得て、水性、水性アルコール性若しくは油性の溶液、ローション若しくはセラム分散液、水性、無水若しくは油性のゲル、水相に脂肪相を（Ｏ／Ｗ又は水中油型）若しくはその逆に（Ｗ／Ｏ又は油中水型）分散させることで得られるエマルション、マイクロエマルション或いはマイクロカプセル、マイクロ粒子又はイオン性及び／又は非イオン性タイプの脂質ベシクル分散物、クリーム、ローション、ゲル、フォーム（加圧キャニスター、適切なアプリケーター、乳化剤及び不活性噴射剤を用い得る）、エッセンス、乳液、懸濁液及びパッチを含む。本開示の局所組成物はまた、親水性又は親油性のゲル化剤、親水性又は親油性の活性剤、保存剤、酸化防止剤、溶媒、香料、増量剤、日焼け止め剤、消臭剤（odor-absorbers）及び色素等のアジュバントを含んでもよい。更なる態様において、本明細書に開示の局所組成物は、被験体の皮膚又は他の組織に付着可能であるか、別の形で付くことが可能な、本明細書に開示される治療有効量の１つ以上のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを送達することができる経皮パッチ、包帯剤、パッド、ラップ、マトリックス及び包帯等の用具と併用して投与され得る。
一実施形態において、本開示の局所組成物は、局所熱傷を治療するために使用される１つ以上の成分を追加的に含む。かかる成分としては、限定されるものではないが、プロピレングリコールヒドロゲル；グリコール、セルロース誘導体及び水溶性アルミニウム塩の組合せ；消毒薬；抗生物質；並びに副腎皮質ステロイドを挙げることができる。保湿剤（固体又は液体のワックスエステル等）、吸収促進剤（親水性粘土又はデンプン等）、増粘剤及び皮膚保護剤も添加することができる。局所製剤は、マウスウォッシュ等のリンスの形態であってもよい。例えば、国際公開第２００４／００４６５０号を参照されたい。
本開示の組成物を、適切な量のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントと、担体とを含む治療剤の注射により投与することもできる。例えば、Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを、グラム陰性細菌による感染（シュードモナス・エルギノーサによって引き起こされるもの等）、及び／又は、抗酸菌による感染（例えば結核菌及び非結核性抗酸菌を含む放線菌門の種によって引き起こされるもの等）を治療するため、筋肉内、髄腔内、皮膚下（subdermally）、皮下（subcutaneously）又は静脈内に投与することができる。担体は、蒸留水、生理食塩水、アルブミン、血清又はそれらの任意の組合せで構成され得る。さらに、非経口注射剤の医薬組成物は、ｐＨ緩衝液、アジュバント（例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤）、リポソーム製剤、ナノ粒子、分散液、懸濁液又はエマルション、及び使用の直前に滅菌注射液又は分散液に再構成するための滅菌粉末の１つ以上に加えて、本明細書に開示されるＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントの薬学的に許容可能な水性又は非水性の溶液を含むことができる。
非経口注射が選択される投与様式である場合、等張性製剤が用いられ得る。一般的には、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンを挙げることができる。血管収縮剤を製剤に添加することができる。この種の用途に応じた医薬調製物は、滅菌されパイロジェンフリーで提供され得る。
希釈剤は、エタノール、プロピレングリコール、油、又は薬学的に許容可能な乳化剤若しくは界面活性剤等の１つ以上の他の賦形剤を更に含んでもよい。
別の実施形態において、本開示の組成物は吸入可能な組成物である。本開示の吸入可能な組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含むことができる。一実施形態において、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントは、乾燥した吸入可能な粉末として配合され得る。具体的な実施形態において、Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを含む吸入用溶液は、エアロゾル送達用の噴射剤を用いて更に配合され得る。或る特定の実施形態において、溶液は、噴霧化されてもよい。
医薬品と噴射剤との間の表面張力及び界面張力を低下させるため、界面活性剤を本開示の吸入用医薬組成物に添加することができる。医薬品と噴射剤と賦形剤とが懸濁液を形成する場合、界面活性剤は使用されてもよく、又は使用されなくてもよい。医薬品と噴射剤と賦形剤とが溶液を形成する場合、界面活性剤は、例えば、特定の医薬品及び賦形剤の溶解度に応じて、使用されてもよく、又は使用されなくてもよい。界面活性剤は、医薬品と非反応性であり、医薬品と賦形剤と噴射剤との間の表面張力を低くし、及び／又はバルブ潤滑剤として作用する、任意の適切な非毒性の化合物であり得る。
好適な界面活性剤の例としては、限定されるものではないが、オレイン酸；ソルビタントリオレエート；塩化セチルピリジニウム；大豆レシチン；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート；ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル；ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル；ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンエチレンジアミンブロックコポリマー；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート；ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンブロックコポリマー；ひまし油エトキシレート及びそれらの組合せが挙げられる。
適切な噴射剤の例としては、限定されるものではないが、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン及び二酸化炭素が挙げられる。
吸入用組成物に使用される好適な賦形剤の例としては、限定されるものではないが、ラクトース、デンプン、中鎖脂肪酸のプロピレングリコールジエステル；中鎖、短鎖若しくは長鎖、又はそれらの任意の組合せの脂肪酸のトリグリセリドエステル；パーフルオロジメチルシクロブタン；パーフルオロシクロブタン；ポリエチレングリコール；メタノール；ラウログリコール；ジエチレングリコールモノエチルエーテル；中鎖脂肪酸のポリグリコール化グリセリド；アルコール；ユーカリ油；短鎖脂肪酸；及びそれらの組合せが挙げられる。
幾つかの実施形態において、本開示の組成物は、鼻腔適用を含む。鼻腔適用としては、鼻腔用スプレー、鼻腔用ドロップ、鼻腔用軟膏、鼻腔用洗浄液、鼻腔用注射剤、鼻腔用パッキング、気管支スプレー及び吸入剤等の直接用途に対する適用、並びに咽喉ロゼンジ剤及び洗口液若しくは含嗽剤等の間接的用途に対する適用、又は鼻孔若しくは顔に塗布される軟膏の使用によるもの、またこれらの及び同様の適用方法の任意の組合せが挙げられる。
別の実施形態において、本開示の医薬組成物は、１つ以上の抗微生物剤及び／又は１つ以上の従来の抗生物質を含む相補的な作用物質を含む。感染の治療を促進するため又は抗菌作用を高めるため、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを含有する治療剤は、ペプチドの殺菌活性を強化することもできる少なくとも１つの相補的な作用物質を更に含んでもよい。相補的な作用物質としては、グラム陰性細菌の治療に用いられる１種以上の抗生物質又は抗酸菌の治療に用いられる１種以上の抗生物質であり得る。一実施形態において、相補的な作用物質は、シュードモナス・エルギノーサのＭＤＲ及び／又はＸＤＲ株を含むシュードモナス・エルギノーサによって引き起こされる感染症の治療に使用される抗生物質又は抗微生物剤である。一実施形態において、相補的な作用物質は、結核菌によって引き起こされる感染の治療に使用される抗生物質又は抗微生物剤であり、一実施形態において、相補的な作用物質は、非結核性抗酸菌によって引き起こされる感染の治療に使用される抗生物質又は抗微生物剤である。
本開示の医薬組成物は、単位剤形で与えられ得て、当該技術分野で既知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、例えば治療される宿主、感染性細菌へのレシピエントの曝露期間、被験体の大きさ及び体重、並びに特定の投与様式によって異なる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、例えば治療効果を生み出す各化合物の量であり得る。或る特定の実施形態において、１００％のうち、有効成分の総量は約１％～約９９％、例えば約５％～約７０％、又は約１０％～約３０％の範囲であり得る。
投与量及び投与
適用される投与量は、治療されている感染の活動性、治療される被験体の年齢、健康及び総合的な健康状態、特定のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントの活性、存在する場合には、本開示によるＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントと組み合わせる抗生物質の性質及び活性、並びにかかる組合せの併用効果等の多くの要因に依存し得る。或る特定の実施形態において、投与されるＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントの有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ（又は１ｍｃｇ／ｍｌ～５０ｍｃｇ／ｍｌ）の範囲内に含まれ得る。或る特定の実施形態において、投与されるＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントの有効量は、約１μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬの範囲内に含まれ得て、例えば、約１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの範囲内、約１μｇ／ｍＬ、又は約１０μｇ／ｍＬであり得る。或る特定の実施形態において、Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントは、毎日１回～４回を１日～１４日間に及ぶ期間にわたって投与され得る。抗生物質も使用される場合は、任意の相乗作用を考慮して標準的な投与計画又は低量で投与され得る。しかしながら、（Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト若しくはその活性フラグメント、又はそれに伴って投与される任意の抗生物質に関わらず）かかる投与量及び投与計画はいずれも、最適化の対象となる。最適な投与量は、当業者が備えている技能の範囲内であるが、本開示を考慮に入れて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのパイロット有効性実験を行うことにより決定され得る。
本明細書に開示されるＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントは、急速な殺菌性を提供することができ、ＭＩＣ以下の量で使用される場合には静菌効果を提供することができることが企図される。本明細書に開示されるＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントは、様々な抗生物質耐性細菌に対して活性であり、耐性の発現と関連し得ないことが更に企図される。本開示に基づいて、臨床現場では、本Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントは、単独で又は抗生物質（耐性が生じた抗生物質を含む）と共に、薬剤耐性細菌及び多剤耐性細菌、及び超多剤耐性細菌から生じる感染を治療するための強力な代替（又は添加剤）であり得る。グラム陰性細菌に対する既存の耐性機構は、本Ｃｈｐポリペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントの溶菌活性に対する感受性に影響を与えないと考えられる。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントに対する時間曝露は、１ｍｌ当たりの活性ペプチド単位の所望の濃度に影響を及ぼす場合がある。「長時間」又は「緩徐（slow）」放出担体に分類される担体（例えば、或る特定の鼻スプレー又はロゼンジ等）は、１ｍｌ当たりのペプチド単位の濃度は低いが、より長時間にわたって提供し得るのに対し、「短時間」又は「即時」放出担体（例えば、含嗽剤等）は、１ｍｌ当たりのペプチド単位（ｍｃｇ）の濃度は高いが、より短時間で提供し得る。より高い単位／ｍｌ投与量又はより低い単位／ｍｌ投与量が所望され得る状況もある。
本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントでは、治療有効用量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌ、又はブタ）のいずれかで最初に推定され得る。望ましい濃度範囲及び投与経路を達成するために動物モデルを使用することもできる。次いで、得られた情報を、ヒトにおける有効用量、並びに投与経路を決定するために使用することができる。十分なレベルの有効成分を提供するか、又は所望の効果を維持するように、投与量及び投与を更に調整することができる。考慮され得る追加の要因としては、疾患状態の重症度；患者の年齢、体重及び性別；食餌；望ましい治療期間；投与方法；投与の時間及び頻度；薬物の組合せ；反応感受性；治療法に対する忍容性／応答；並びに治療医の判断が挙げられる。
治療計画は、毎日（例えば、毎日１回、２回、３回等）、隔日（１日おきに１回、２回、３回等）、半週毎、毎週、２週間に１回、１ヶ月に１回等の投与を必要とし得る。一実施形態において、治療を、持続点滴として与えることができる。単位用量を複数回で投与することができる。また、臨床症状を監視することによって指示されるというように、間隔が不規則であってもよい。代替的には、単位用量を持続放出製剤として投与することができ、その場合、より低頻度の投与が用いられ得る。投与量及び頻度は、患者によって異なる可能性がある。限局性の（localized）投与、例えば、鼻腔内、吸入、直腸等、又は全身投与、例えば経口、直腸（例えば、浣腸による）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、経尿道等に対してかかるガイドラインを調整することが当業者に理解される。
方法
本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト及びその活性フラグメントを、被験体において、例えば、シュードモナス・エルギノーサ等のグラム陰性細菌による、又は放線菌等の抗酸菌による細菌感染を治療するためｉｎ ｖｉｖｏで、並びに例えば、医療用具の表面等の細菌汚染のレベルを低下させるためｉｎ ｖｉｔｒｏで使用することができる。或る特定の実施形態において、グラム陰性細菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性であるか、又はＭＤＲ病原体である。或る特定の実施形態において、グラム陰性細菌は、複数の抗生物質に耐性であるか、又はＸＤＲ病原体である。
例えば、幾つかの実施形態において、本Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントは、グラム陰性細菌又は抗酸菌によって形成される細菌バイオフィルムの予防、破壊及び／又は根絶に使用され得る。バイオフィルム形成は、微生物細胞が互いに接着し、表面上の細胞外高分子物質（ＥＰＳ）のマトリックス中に埋め込まれる場合に生じる。生体高分子（例えば、多糖、核酸及びタンパク質）及び栄養素が豊富な、かかる保護環境での微生物の増殖は、微生物クロストークを増強し、病原性を増大させる。バイオフィルムは、生物表面及び非生物表面、例えば肺（例えば、嚢胞性線維症患者の肺）の粘液栓、汚染カテーテル、コンタクトレンズ等を含む任意の支持環境で発生し得る（Sharma et al. Biologicals, 42(1):1-7 (2014)（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす））。そのため、一実施形態において、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントは、細菌が細菌性バイオフィルムによって保護される場合に、グラム陰性細菌又は抗酸菌による細菌感染の予防、破壊及び／又は根絶に使用することができる。一実施形態において、Ｃｈｐ２又はその活性フラグメントは、細菌が細菌バイオフィルムによって保護されている場合に、グラム陰性細菌による細菌感染の予防、破壊、及び／又は根絶に使用することができる。一実施形態において、Ｃｈｐ２－Ｍ１又はその活性フラグメントは、細菌が細菌バイオフィルムによって保護されている場合に、グラム陰性細菌による細菌感染の予防、破壊、及び／又は根絶に使用することができる。一実施形態において、Ｃｈｐ１０－Ｍ１又はその活性フラグメントは、細菌が細菌バイオフィルムによって保護されている場合に、グラム陰性細菌による細菌感染の予防、破壊、及び／又は根絶に使用することができる。
或る特定の実施形態において、ＧＮ３７０、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及び／又はＣｈｐ１０－Ｍ１、又はその活性フラグメントは、細菌が細菌バイオフィルムによって保護されている、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）、バークホルデリア・マルチボランス（B. multiovorans）、アクロモバクター・キシロソキシダンス等のアクロモバクター種、及び／又はステノトロホモナス・マルトフィリア等のステノトロホモナス種による細菌感染の予防、破壊、及び／又は根絶に使用することができる。別の実施形態において、ＧＮ３７０、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及び／又はＣｈｐ１０－Ｍ１、又はその活性フラグメントは、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）、ステノトロホモナス・マルトフィリア、アクロモバクター・キシロソキシダンス、アクロモバクター・ルランディ及びアクロモバクター・ドレンズによる細菌感染の予防、破壊、及び／又は根絶に使用することができる。更に別の実施形態において、ＧＮ３７０、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及び／又はＣｈｐ１０－Ｍ１、又はその活性フラグメントは、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）、ステノトロホモナス・マルトフィリア、アクロモバクター・キシロソキシダンスによる細菌感染の予防、破壊、及び／又は根絶に使用することができる。更に別の実施形態において、ＧＮ３７０、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及び／又はＣｈｐ１０－Ｍ１、又はその活性フラグメントは、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）及びステノトロホモナス・マルトフィリアによる細菌感染の予防、破壊、及び／又は根絶に使用することができ、更に別の実施形態において、ＧＮ３７０、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及び／又はＣｈｐ１０－Ｍ１、又はその活性フラグメントは、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）による細菌感染の予防、破壊、及び／又は根絶に使用することができる。或る特定の実施形態において、ＧＮ３７０、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及び／又はＣｈｐ１０－Ｍ１又はその活性フラグメントは、グラム陰性細菌のバイオフィルム、例えばアクロモバクター・キシロソキシダンス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、シュードモナス・エルギノーサ、及び／又はバークホルデリア・マルチボランスの細菌バイオフィルムを根絶することができる。別の実施形態において、ＧＮ３７０、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及び／又はＣｈｐ１０－Ｍ１又はその活性フラグメントは、アクロモバクター・キシロソキシダンス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）等のグラム陰性細菌のバイオフィルムを根絶することができる。更に別の実施形態において、ＧＮ３７０、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及び／又はＣｈｐ１０－Ｍ１又はその活性フラグメントは、ステノトロホモナス・マルトフィリア、及びシュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）等のグラム陰性細菌のバイオフィルムを根絶することができる。更に別の実施形態において、ＧＮ３７０、Ｃｈｐ２、Ｃｈｐ２－Ｍ１、及び／又はＣｈｐ１０－Ｍ１又はその活性フラグメントは、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）等のグラム陰性細菌のバイオフィルムを根絶することができる。一実施形態において、Ｃｈｐ２は、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）、ステノトロホモナス・マルトフィリア、アクロモバクター・キシロソキシダンス、及び／又はバークホルデリア・マルチボランスを含むグラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊、又は根絶することができる。別の実施形態において、Ｃｈｐ２は、ステノトロホモナス・マルトフィリア及び／又はシュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）を含むグラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊、又は根絶することができる。更に別の実施形態において、Ｃｈｐ２は、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）を含むグラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊、又は根絶することができる。一実施形態において、Ｃｈｐ２－Ｍ１は、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）及び／又はステノトロホモナス・マルトフィリアを含むグラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊、又は根絶することができる。一実施形態において、Ｃｈｐ１０－Ｍ１は、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）及び／又はアクロモバクター・キシロソキシダンスを含むグラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊、又は根絶することができる。一実施形態において、ＧＮ３７０は、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）及び／又はステノトロホモナス・マルトフィリアを含むグラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊、又は根絶することができる。更に別の実施形態において、ＧＮ３７０は、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、ＭＤＲ分離株、及び／又はＸＤＲ分離株を含む）を含むグラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊、又は根絶することができる。
一態様において、本開示は、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、本明細書に記載される１つ以上の付加的なグラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染を治療する方法に関する。一態様において、本開示は、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、本明細書に記載される１つ以上の付加的な種の抗酸菌によって引き起こされる細菌感染を治療する方法に関する。一態様において、本開示は、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む、本明細書に記載される１つ以上のＭＤＲ及び／又はＸＤＲグラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染を治療する方法に関する。
「感染」及び「細菌感染」という用語は、ＣＦ患者及び／又は肺機能の低下及び死亡率を伴う患者における（急性）肺増悪を含む嚢胞性線維症（ＣＦ）を有する患者における気道感染症等の気道感染症（ＲＴＩ）；慢性気管支炎（ＡＣＥＢ）の急性増悪等の下気道感染症；急性副鼻腔炎；市中肺炎（ＣＡＰ）；院内肺炎（ＨＡＰ）；人工呼吸器関連肺炎；嚢胞性線維症関連肺炎；院内気道感染症；気管支拡張症及び／又は急性肺炎等の非嚢胞性線維症肺疾患；淋菌性子宮頸管炎及び淋菌性尿道炎等の性感染症；尿路感染症；急性中耳炎；新生児敗血症及びカテーテル関連敗血症を含む敗血症；骨髄炎；結核；及び非結核マイコバクテリア感染症を含むことを意味する。薬剤耐性菌、多剤耐性菌、及び広範囲薬剤耐性菌によって引き起こされる感染症も企図される。
シュードモナス・エルギノーサ、アクロモバクター・キシロソキシダンス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、又は抗酸菌等のグラム陰性細菌によって引き起こされる感染の非限定的な例としては、Ａ）院内感染：１．気道感染、特に、嚢胞性線維症患者の肺増悪及び非嚢胞性線維症患者の気管支拡張症を含む嚢胞性線維症患者及び人工呼吸器を装着している患者における気道感染、２．菌血症及び敗血症、３．創傷感染、特に火傷被害者の創傷感染、４．尿路感染、５．侵襲的器具上での術後感染、６．汚染された薬液の静脈内投与による心内膜炎、７．後天性免疫不全症候群、癌化学療法、ステロイド療法、血液悪性疾患、臓器移植、腎代替療法、及び重度の好中球減少症を伴う他の病態の患者における感染、Ｂ）市中感染：１．結核等の市中気道感染、２．髄膜炎、３．汚染水に起因する毛包炎及び外耳道感染、４．高齢者及び糖尿病患者における悪性外耳炎、５．小児における踵骨の骨髄炎、６．一般に汚染されたコンタクトレンズと関連した眼感染、７．手が頻繁に水に曝される人々における爪感染等の皮膚感染、８．消化管感染、並びに９．筋骨格系感染が挙げられる。
本方法の１つ以上の種のグラム陰性細菌は、本明細書に記載されるグラム陰性細菌の任意の種を含み得る。典型的には、付加的な種のグラム陰性細菌は、アシネトバクター・バウマンニ、アシネトバクター・ヘモリティクス（Acinetobacter haemolyticus）、アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、アクロモバクター属種、例えばアクロモバクター・ドレンズ（Achromobacter dolens）、アクロモバクター・ルランディイ（Achromobacter ruhlandii）、及びアクロモバクター・キシロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidans）、バクテロイデス（Bacteroides）属種（バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、バクテロイデス・ディスタソニス（Bacteroides distasonis）、バクテロイデス・オバトゥス（Bacteroides ovatus）、及びバクテロイデス・ヴルガトゥス（Bacteroides vulgatus）、バルトネラ・クインタナ（Bartonella Quintana）、百日咳菌（Bordetella pertussis）等）、ブルセラ（Brucella）属種（ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）等）、バークホルデリア（Burkholderia）属種（バークホルデリア・アンティナ（Burkholderia anthina）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、バークホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenacepacia）、バークホルデリア・グラディオリ（Burkholderia gladioli）、バークホルデリア・マルティボランス（Burkholderia multivorans）、バークホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）及びバークホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）等）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、プレボテラ・コーポリス（Prevotella corporis）、プレボテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）、プレボテラ・エンドドンタリス（Prevotella endodontalis）、ポルフィロモナス・アサッカロリティカ（Porphyromonas asaccharolytica）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・フィタス（Campylobacter fetus）、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）、クラミジア（Chlamydia）属種（肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）及びクラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）等）、シトロバクター・フロウンディ（Citrobacter freundii）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetii）、エドワジエラ属種（エドワジエラ・タルダ）等）、エイケネラ・コロデンス（Eikenella corrodens）、エンテロバクター属種（エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・フェシウム（Enterobacter faecium）及びエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）等）、大腸菌、野兎病菌（Francisella tularensis）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ヘモフィルス・ドゥクレイ（Haemophilus ducreyi）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、キンゲラ・キンゲ（Kingella kingae）、クレブシエラ（Klebsiella）属種（クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、クレブシエラ・リノスクレロマティス（Klebsiella rhinoscleromatis）及びクレブシエラ・オザエナエ（Klebsiella ozaenae）等）、クライベラ・アスコルバータ（Kluyvera ascorbata）、レジオネラ・ペヌモフィラ（Legionella penumophila）、モラクセラ（Moraxella）属種（モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）等）、モルガネラ（Morganella）属種（モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）等）、淋菌、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、パンドラレア・アピスタ（Pandoraea apista）、シュードモナス・エルギノーサ、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、プロテウス・ペンネリ（Proteus penneri）、プロテウス・ミクソファシエンス（Proteus myxofaciens）、プロビデンシア（Providencia）属種（プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）等）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、ラウルテラ・オルニチノリチカ（Raoultella ornithinolytica）、チフス菌（Salmonella typhi）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、パラチフス菌（Salmonella paratyphi）、セラチア（Serratia）属種（セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）等）、シゲラ属種（シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ボイディ（Shigella boydii）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnei）及び志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）等）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）、ビブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、ペスト菌（Yersinia pestis）、仮性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis）、肺炎クラミジア、クラミジア・トラコマティス、リケッチア・プロワツェキイ（Ricketsia prowazekii）、コクシエラ・バーネッティ、エーリキア・シャフェンシス（Ehrlichia chafeensis）及び／又はバルトネラ・ヘンセラ（Bartonella hensenae）の１つ以上から選択される。
或る特定の実施形態において、本方法の１つ以上の種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株を含む）、ステノトロホモナス・マルトフィリア、アクロモバクター・キシロソキシダンス、アクロモバクター・ルランディ、アクロモバクター・ドレンズ、特定の実施形態において、シュードモナス・エルギノーサ、ステノトロホモナス・マルトフィリア及びアクロモバクター・キシロソキシダンス、更に別の実施形態において、シュードモナス・エルギノーサ及びステノトロホモナス・マルトフィリア、更に別の実施形態において、シュードモナス・エルギノーサ（ムコイド、非ムコイド及び／又は溶血性（α溶血性等）分離株、特にムコイド及びアルファ溶血性分離株を含む）から選択されるいずれかの種のグラム陰性細菌を含み得る。本発明の全ての態様の或る特定の実施形態において、１つ以上の種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサのムコイド及び／又はα溶血性分離株、及び／又はシュードモナス・エルギノーサ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、及び／又はアクロモバクター・キシロソキシダンスのＭＤＲ分離株及び／又はＸＤＲ分離株及び／又はカルバペネム耐性分離株を含み得る。
より典型的には、少なくとも１つの他の種のグラム陰性細菌は、アシネトバクター・バウマンニ、百日咳菌、バークホルデリア・セパシア、バークホルデリア・シュードマレイ、バークホルデリア・マレイ、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリ、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・アエロゲネス、大腸菌、野兎病菌、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ドゥクレイ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ペヌモフィラ、モラクセラ・カタラーリス、モルガネラ・モルガニ、淋菌、髄膜炎菌、パスツレラ・ムルトシダ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、チフス菌、セラチア・マルセセンス、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ソネイ、志賀赤痢菌、ステノトロホモナス・マルトフィリア、コレラ菌、及び／又は肺炎クラミジアの１つ以上から選択される。
更により典型的には、少なくとも１つの他の種のグラム陰性細菌は、ステノトロホモナス属種（例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア）、ネズミチフス菌、チフス菌、シゲラ属種、大腸菌、アシネトバクター・バウマンニ、クレブシエラ・ニューモニエ、淋菌、髄膜炎菌、セラチア属種、プロテウス・ミラビリス、モルガネラ・モルガニ、プロビデンシア属種、エドワジエラ属種、エルシニア属種、インフルエンザ菌、バルトネラ・クインタナ、ブルセラ属種、百日咳菌、バークホルデリア属種、モラクセラ属種、野兎病菌、レジオネラ・ニューモフィラ、コクシエラ・バーネッティ、バクテロイデス属種、エンテロバクター属種及び／又はクラミジア属種の１つ以上から選択される。
更に典型的には、少なくとも１つの他の種のグラム陰性細菌は、クレブシエラ属種、エンテロバクター属種、大腸菌、シトロバクター・フロウンディ、ネズミチフス菌、ペスト菌、ステノトロホモナス・マルトフィリア及び／又は野兎病菌の１つ以上から選択される。
本発明の方法の１つ以上の種の抗酸菌は、本明細書に記載される抗酸菌の任意の種を含み得る。典型的には、付加的な種の抗酸菌は、マイコバクテリア等の放線菌門の１つ以上の種から選択される。
マイコバクテリアは、診断及び治療の目的で３つの主要なグループに分類され得る小さな棒状の桿菌のファミリーである。１つ目は、肺結核を引き起こす可能性のある結核菌複合体であり、結核菌（M. tuberculosis）、マイコバクテリウム・ボビス（M. bovis）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（M. africanum）、マイコバクテリウム・ミクロチ（M. microti）、及びマイコバクテリウム・カネッティ（M. canetti）を含む。２つ目のグループは、ハンセン病又はらい病を引き起こすマイコバクテリウム・レプラエ（M. leprae）及びマイコバクテリウム・レプロマトシス（M. lepromatosis）を含む。３つ目のグループは、非結核性抗酸菌（ＮＴＭ）であり、これは結核に似た肺疾患、リンパ節炎、皮膚疾患、又は播種性疾患を引き起こす可能性のある他の全てのマイコバクテリアを含む。ＮＴＭとしては、限定されるものではないが、マイコバクテリウム・アビウム複合体（ＭＡＣ）、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）、マイコバクテリウム・カンサシ（M. kansasii）、マイコバクテリウム・アブセサス（M. abscessus）、マイコバクテリウム・ケロナエ（M. chelonae）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（M. fortuitum）、マイコバクテリウム・ゲナベンス（M. genavense）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（M. gordonae）、マイコバクテリウム・ヘモフィルム（M. haemophilum）、マイコバクテリウム・イムノゲナム（M. immunogenum）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（M. intracellulare）、マイコバクテリウム・マルモエンセ（M. malmoense）、マイコバクテリウム・マリヌム（M. marinum）、マイコバクテリウム・ムコゲニカム（M. mucogenicum）、マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム（M. nonchromogenicum）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（M. scrofulaceum）、マイコバクテリウム・シミエ（M. simiae）、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・ツルガイ（M. szulgai）、マイコバクテリウム・テラエ（M. terrae）、マイコバクテリウム・テラエ複合体、マイコバクテリウム・ウルセランス（M. ulcerans）、及びマイコバクテリウム・ゼノピ（M. xenopi）が挙げられる。ＭＡＣは、少なくとも２つのマイコバクテリア種、マイコバクテリウム・アビウム及びマイコバクテリウム・イントラセルラーレを含む。これらの２つの種は、従来の物理的又は生化学的試験に基づいて区別することはできないが、２つの種を識別及び区別するために使用できる核酸プローブがある。
或る特定の実施形態において、抗酸菌は、マイコバクテリウム・スメグマチス、結核菌、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・カンサシ、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、マイコバクテリウム・ペレグリナム、マイコバクテリウム・マリナム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、及び／又はマイコバクテリウム・フォーチュイタムの１つ以上から選択され得る。
幾つかの実施形態において、グラム陰性細菌又は抗酸菌による感染は、局所細菌感染、例えば皮膚創傷等の局在化した感染をもたらす。他の実施形態において、細菌感染は全身病原性細菌感染である。一般的な抗酸菌感染としては、結核及び非結核性抗酸菌感染が挙げられる。一般的なグラム陰性病原体及び関連感染を本開示の表Ａに収載する。これらは、本Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト及びその活性フラグメントで治療、緩和又は予防され得る細菌感染の例となることを意味し、限定を意図するものではない。
Figure 2024513181000014
幾つかの実施形態において、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト及びその活性フラグメントは、グラム陰性細菌又は抗酸菌に起因する感染を獲得するリスクがある被験体を治療するために使用される。グラム陰性細菌又は抗酸菌感染を獲得するリスクがある被験体としては、例えば、嚢胞性線維症患者、好中球減少症患者、壊死性腸炎患者、熱傷の犠牲者、創傷感染を有する患者が挙げられ、より一般的には、病院にいる患者、特に外科の患者及びカテーテル、例えば中心静脈カテーテル、ヒックマンデバイス（Hickman device）等の留置型医療用具、又は電気生理学的心臓装置、例えばペースメーカー及び留置型除細動器を使用して治療されている患者が挙げられる。グラム陰性細菌又は抗酸菌に感染するリスクがある他の患者群としては、限定されるものではないが、関節全置換（例えば膝又は股関節の全置換）等の留置型プロテーゼを有する患者が挙げられる。
別の態様において、本開示は、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、有効量の本明細書に記載されるＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを含有する第１の有効量の組成物と、グラム陰性細菌感染の治療に適した第２の有効量の抗生物質との組合せを共投与することを含む、細菌感染を予防又は治療する方法に関する。或る特定の態様において、本開示は、細菌感染と診断された、そのリスクがある又はその症状を示す被験体に、有効量の本明細書に記載されるＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを含有する第１の有効量の組成物と、抗酸菌感染の治療に適した第２の有効量の抗生物質との組合せを共投与することを含む、細菌感染を予防又は治療の方法に関する。
本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクト及びその活性フラグメントを、標準治療の抗生物質又は最終手段としての抗生物質と、個別に、又は当該技術分野における技術範囲内の様々な組合せで共投与することができる。マイコバクテリア感染に対して使用される従来の抗生物質としては、例えば、マクロライド（クラリスロマイシン、アジスロマイシン）、エタンブトール、リファマイシン（リファンピン、リファブチン）、イソニアジド、ピラジナミド、及びアミノグリコシド（ストレプトマイシン、アミカシン）が挙げられる。シュードモナス・エルギノーサに対して用いられる伝統的な抗生物質を表Ｂに記載する。クレブシエラ属種、エンテロバクター属種、大腸菌、シトロバクター・フロウンディ、ネズミチフス菌、ペスト菌及び野兎病菌等の他のグラム陰性細菌に対する抗生物質は、シュードモナス・エルギノーサについて表Ｂに記載されているものと同様である。
Figure 2024513181000015
より具体的な実施形態において、抗生物質は、セフタジジム、セフェピム、セフォペラゾン、セフトビプロール、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、アミノグリコシド、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ピペラシリン、チカルシリン、ペニシリン、リファンピシン、ポリミキシンＢ及びコリスチンの１つ以上から選択される。或る特定の実施形態において、抗生物質は、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、及びピラジナミドから選択される。
本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを抗生物質と組み合わせることで有効な抗菌投与計画を提供する。幾つかの実施形態において、本開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントと、１つ以上の抗生物質との共投与により、Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト若しくはその活性フラグメントのいずれか若しくは抗生物質、又はそれらの両方の用量及び量を減少して、及び／又は殺菌活性及び静菌活性を高め、抗生物質耐性のリスクを低減させ、有害な神経学的若しくは腎臓の副作用のリスク（コリスチン又はポリミキシンＢの使用に関連するもの等）を低減させて、治療頻度を減らし及び／又は治療期間を短くして行うことができる。以前の研究は、総累積コリスチン用量が腎臓損傷に関連していることを示し、Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントとの併用療法を用いる投与量の減少又は治療期間の短縮が腎毒性の発生を低下させる可能性があることを示唆している（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Spapen et al. Ann Intensive Care. 1:14 (2011)）。本明細書において使用される場合、「用量の減少」という用語は、同じ有効成分を用いる単剤療法と比較した、組合せにおける１つの有効成分の用量を指す。幾つかの実施形態において、組み合わせたＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト若しくはその活性フラグメント又は抗生物質の用量は、それぞれの単剤療法と比較して最適以下、更には閾値以下となる場合がある。或る特定の実施形態において、組み合わせたＧＮ３７０若しくはその活性フラグメント又はメロペネムの用量は、シュードモナス・エルギノーサ又はバークホルデリア・セノセパシアの少なくとも１つに起因するグラム陰性細菌感染を治療する際のそれぞれの単独療法と比較して、最適以下、更には閾値以下であり得る。
幾つかの実施形態において、本開示は、被験体に本明細書に開示のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを対象の抗生物質と共に投与することによって、グラム陰性細菌又は抗酸菌に対する１つ以上の抗生物質の抗生物質活性を単独で使用される該抗生物質の活性と比較して高める方法を提供する。組合せは細菌に対して有効であり、抗生物質に対する耐性を克服すること及び／又は抗生物質をより低用量で用いることを可能とし、ポリミキシンＢの腎毒性及び神経毒性作用等の望ましくない副作用を減少させる。
幾つかの実施形態において、本Ｃｈｐペプチド、溶解素及び溶解素－ＡＭＰコンストラクトは、シュードモナス・エルギノーサ等のＭＤＲ及び／又はＸＤＲ生物を含むグラム陰性細菌における抗生物質耐性の抑制を駆動することができる。抗生物質耐性のかかる抑制は、本明細書に記載されるように、連続継代耐性実験によって決定され得る。抗生物質耐性の発現の抑制は、Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクト、例えばＧＮ３７０の存在下で、抗生物質ＭＩＣ値が有意に増加しない場合、又はより少ない程度で増加する場合に生じる。例えば、抗生物質耐性の発現の抑制は、連続継代耐性実験においてグラム陰性細菌を２８日間連続継代した後のＭＩＣ値に２倍以下の増加がある場合、例えば増加がない場合に示され得る。或る特定の実施形態において、ＧＮ３７０は、例えばシュードモナス・エルギノーサ等のグラム陰性病原体における抗生物質耐性の発現を抑制し得る。或る特定の実施形態において、Ｃｈｐペプチド、溶解素及び溶解素－ＡＭＰコンストラクト、例えばＧＮ３７０は、ＭＩＣの１／８、ＭＩＣの１／１６、又はＭＩＣの１／３２等のＭＩＣ以下の量で存在し得る。或る特定の実施形態において、Ｃｈｐペプチド、溶解素及び溶解素－ＡＭＰコンストラクト、例えばＧＮ３７０によって耐性が抑制される抗生物質は、フルオロキノン（例えばレボフロキサシン）、アミノグリコシド（例えばトブラマイシン）、又はカルバペネム（例えばメロペネム）である。
本開示の抗生物質と任意に組み合わせたＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを、限定されるものではないが、例えば、ＥＤＴＡ、ＴＲＩＳ、乳酸、ラクトフェリン、ポリミキシン、クエン酸（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Vaara M. Microbial Rev. 56(3):395-441 (1992)）等の金属キレート剤を含む、グラム陰性細菌の追加の外膜透過化剤と更に組み合わせることができる。
更に別の態様において、本開示は、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌又は抗酸菌の増殖を阻害する、又はその菌数を減少させる、又はそれを死滅させる方法に関し、該方法は、細菌を、有効量の本明細書に記載されるＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを含有する組成物と接触させることを含み、ここで、該Ｃｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントは、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌又は抗酸菌の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる。
幾つかの実施形態において、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌又は抗酸菌の増殖を阻害するか、又はその菌数を減少させるか、又はそれを死滅させることは、細菌と本明細書に記載されるＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又は活性フラグメントとを接触させることを含み、細菌は、例えば病院及び他の健康関連又は公共の建物における医療器具、床、階段、壁及び調理台の表面、並びに手術室、緊急治療室、病室、診療所及び浴室等における機器の表面上に存在する。
本明細書に記載のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト又はその活性フラグメントを用いて保護することができる医療器具の例としては、管類及び他の表面医療器具、例えば尿道カテーテル、粘液吸引カテーテル、吸引カテーテル、臍帯カニューレ（umbilical cannulae）、コンタクトレンズ、子宮内器具、膣内及び腸内器具、気管内チューブ、気管支鏡、歯科補綴物及び歯列矯正器具、外科用器械、歯科用器械、管類、歯科用送水管、布、紙、指示薬ストリップ（例えば、紙の指示薬ストリップ又はプラスチックの指示薬ストリップ）、接着剤（例えば、ヒドロゲル接着剤、ホットメルト接着剤又は溶剤系接着剤）、包帯、組織包帯剤（tissue dressings）又は治療器具、及び密封パッチ（occlusive patches）、並びに医療分野で使用される任意の他の表面器具が挙げられるが、これらに限定されない。器具には、電極、外部人工装具、固定テープ、圧迫包帯、及び様々なタイプのモニターが含まれ得る。医療器具には、挿入又は移植部位近くの皮膚等の挿入又は移植部位に設置することができ、グラム陰性細菌及び／又は抗酸菌によるコロニー形成の影響を受けやすい少なくとも１つの表面を含み得る任意の器具も含まれ得る。
本開示の更なる実施形態において、本明細書に記載のＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、又はその活性フラグメントは、ヒト喀痰等の喀痰中に存在する少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害し得るか、又はその菌数を減少させ得るか、又はそれを死滅させ得る。或る特定の実施形態において、少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、嚢胞性線維症患者の喀痰中に存在する。或る特定の実施形態において、喀痰中に存在する少なくとも１つの種のグラム陰性細菌は、シュードモナス・エルギノーサ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、アクロモバクター・キシロソキシダンス、アクロモバクター・ルランディ、アクロモバクター・ドレンズ、バークホルデリア・セノセパシア、バークホルデリア・グラジオリ、バークホルデリア・マルチボランス、及びパンドラエア・アピスタ（P. apista）の少なくとも１つから選択される。
実施例１：マイコバクテリウム種に対するアムリンペプチド活性
マイコバクテリウム種に対するアムリンペプチドの活性を、Ｈ７９（ＡＤＣ、Ｔ）培地で試験した結核菌（M.tuberculosis）を除いて、ＣＡＡＴ培地で試験した。ＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）値を、７つの異なるマイコバクテリウム種に対して３０個のアムリンペプチドについて決定した。
米国臨床検査標準協議会（ＣＬＳＩ：Clinical and Laboratory Standards Institute）によって規定される標準微量液体希釈参照法（CLSI. 2015. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.）の修正を用いてＭＩＣ値を決定した。修正は、ミューラー・ヒントンブロスのＣＡＡ培地（ＮａＣｌを含む又は含まない）又は２．５％ヒト血清を添加したＣＡＡのいずれかによる置換えに基づくものであった。ＭＩＣは、対照と比較して細菌増殖の少なくとも８０％を抑制するのに十分なペプチドの最小濃度である。
結果を下記表４に示す。
Figure 2024513181000016
Figure 2024513181000017
上記の表４に太字で示されているように、以下の７個のペプチドが最も高い活性を有するものとして同定された：Ｃｈｐ２（ＡＭ１）；Ｃｈｐ２－Ｍ１（ＡＭ２）；Ｃｈｐ１０－Ｍ１（ＡＭ３）；Ｕｎｐ２－Ｍ１（ＡＭ９）；Ｃｈｐ４－Ｍ１（ＡＭ１６）；Ｃｈｐ６（ＡＭ１７）；及びＣｈｐ６－Ｍ１（ＡＭ１８）。次に、これらの７つのペプチド、及び１つの陰性対照（ＡＭ１０）を、更なる分析のために選択した。クラリスロマイシン耐性と予測されたＭＤＲマイコバクテリウム・アブセサス分離株の５つの臨床株（ｅｒｍ（４１））と１つのＡＴＣＣ株に対して、７つのペプチドについてＭＩＣの決定を行った。ＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）値を、ＡＳＴ培地（ＣＡＡＴ）で７日間増殖した後に決定し、明確なエンドポイントを観察した。結果を下記表５に示す。
Figure 2024513181000018
上に示したように、Ｃｈｐ２（ＡＭ１）とＣｈｐ１０－Ｍ１（ＡＭ３）の両方がマイコバクテリウム・アブセサスに対して非常に活性があった。Ｕｎｐ２－Ｍ１（ＡＭ９）、Ｃｈｐ４－Ｍ１（ＡＭ１６）、及びＣｈｐ６（ＡＭ１７）も良好な活性を示した。
次に、ＭＤＲ形態を含む結核菌分離株の８つの臨床株に対する７個のアムリンペプチドについてＭＩＣ決定を行った。試験を７Ｈ９ブロス（ＡＤＣ富化＋Ｔｗｅｅｎ８０ ０．００２％）中で行い、プレートを２０日間インキュベートした。結果を下記表６に示し、ＭＩＣ値をμｇ／ｍＬで示し、各株の抗生物質耐性を括弧内に示す。
Figure 2024513181000019
上に示したように、Ｃｈｐ６－Ｍ１（ＡＭ１８）は、試験した結核菌分離株に対して最も活性が高く、ＭＩＣ範囲は０．５μｇ／ｍＬ～２μｇ／ｍＬであった。さらに、長さが４０アミノ酸であるＡＭ１８は、ＡＭ２のアミノ酸残基５～４４と同一であることに留意されたい。
実施例２：ＧＮ３７０並びにＣｈｐペプチドＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３の抗微生物活性
２７８０４名の成人嚢胞性線維症患者の分析に加えて、９つの最も一般的なグラム陰性病原体が同定され、それらの有病率を下記表７に示す（Salsgiver, E.L. et al., Changing Epidemiology of the Respiratory Bacteriology of Patients with Cystic Fibrosis, Chest 2016, 149(2):390-400）。
Figure 2024513181000020
これらの最も一般的な９つの株に基づいて、ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３を含む直接溶菌剤を、９つの株のそれぞれからの様々な分離株に対して評価した。ＭＩＣ及びＭＢＥＣ（実施例３）を決定し、実施例５で後述するように喀痰阻害試験を実施した。
ＭＩＣを、メロペネム、ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３についての微量液体希釈法を用いて以下に記載されるように決定した。結果を下記表８～表１２に示す。
Figure 2024513181000021
Figure 2024513181000022
Figure 2024513181000023
Figure 2024513181000024
Figure 2024513181000025
上に示したように、ＧＮ３７０は、シュードモナス・エルギノーサ及びステノトロホモナス・マルトフィリアの全ての試験分離株に対して非常に活性であった。ＡＭ１は、シュードモナス・エルギノーサ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、及びアクロモバクター属種の全ての試験分離株に対して非常に活性があった。ＡＭ２及びＡＭ３はシュードモナス・エルギノーサ及びステノトロホモナス・マルトフィリアに対して非常に活性があり、アクロモバクター属種に対しては可変的に活性であった。
実施例３：ＧＮ３７０並びにＣｈｐペプチドＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３の抗バイオフィルム活性
ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３の抗バイオフィルム活性を、シュードモナス・エルギノーサ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、及びアクロモバクター・キシロソキシダンスを含む嚢胞性線維症患者に蔓延している様々なグラム陰性細菌に対して評価した。
ＭＢＥＣ（２時間治療後）を、Jones and Wozniak, PsI Produced by Mucoid Pseudomonas aeruginosa Contributes to the Establishment of Biofilms and Immune Evasion, Am. Soc. Microbiol. 2017, 8(3):e00864-17に記載されるように決定した。メロペネム及びトブラマイシンを対照として含めたところ、どちらも活性が乏しく、ＭＢＥＣ９０値は２５６μｇ／ｍＬ超であった（データは示していない）。
ＧＮ３７０（表１３）、ＡＭ１（表１４）、ＡＭ２（表１５）、及びＡＭ３（表１６）について、結果を下記表１３～表１６に示す。
Figure 2024513181000026
Figure 2024513181000027
Figure 2024513181000028
Figure 2024513181000029
上に示したように、ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２の全てがシュードモナス・エルギノーサ及びステノトロホモナス・マルトフィリアに対して高い活性を示した。ＡＭ１は、シュードモナス・エルギノーサ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、アクロモバクター・キシロソキシダンス、及びバークホルデリア・マルチボランスについて試験した全ての株に対して非常に活性であった。ＡＭ２は主にシュードモナス・エルギノーサとステノトロホモナス・マルトフィリアに対して活性を示し、ＡＭ３は主にシュードモナス・エルギノーサとアクロモバクター・キシロソキシダンスに対して活性を示した。
さらに、ＧＮ３７０の抗バイオフィルム活性を、様々なＭＤＲ分離株及び広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）分離株について決定した。下記表１７に示すように、ＧＮ３７０は、実施例６で以下に報告されるＭＩＣ値と同様に、４μｇ／ｍＬ以下のＭＢＥＣ値を有する分離株に対して活性を実証した。
Figure 2024513181000030
実施例４：ＧＮ３７０と抗生物質との広域スペクトル相乗効果
ＧＮ３７０とメロペネムとの相乗効果を、シュードモナス・エルギノーサの３つの異なる株及びバークホルデリア・セノセパシアの３つの異なる株に対して評価した。結果を下記表１８に示し、ＧＮ３７０がシュードモナス・エルギノーサに対してメロペネムと相乗効果を示すが、バークホルデリア・セノセパシアに対しては相乗効果を発揮しないことを示す。
Figure 2024513181000031
ＧＮ３７０を、シュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター・バウマンニ、大腸菌、エンテロバクター・クロアカエ、及びクレブシエラ・ニューモニエを含む様々な細菌株に対して、最大７つの追加の抗生物質（メロペネムに加えて）と組み合わせて更に試験した。ＧＮ３７０及び対象抗生物質をチェッカーボードアッセイ形式で試験し、ＦＩＣＩ値を決定し、ここで、０．５以下は相乗効果を示し、０．５超～１以下は相加効果を示し、１超は無影響を示す。下記表１９に示す結果は、ＧＮ３７０が複数の異なる作用方法を有する広範囲の抗生物質と相乗効果を発揮することを実証する。
Figure 2024513181000032
実施例５：成人嚢胞性線維症患者の喀痰におけるＣｈｐペプチド及び溶解素－ＡＭＰコンストラクトの活性
５名の嚢胞性線維症患者からの喀痰を集めた。得られた混合物は非常に濃く、濾過による滅菌に適していなかったため、濾過しなかった。喀痰は、ＤＮＡ、炭水化物、及び脂質の複雑な混合物であることが知られている（Salsgiver, 2016）。本明細書で使用される場合、「喀痰」という用語は、ヒト等の動物の気道に存在する粘液を指す。喀痰は、刺激又は細菌感染を含む感染のために濃度が増す可能性があり、場合によっては、咳をしている間に動物によって排出されることがある。或る特定の例において、嚢胞性線維症は、嚢胞性線維症患者の肺に存在する濃厚で粘着性の粘液又は喀痰の存在を特徴とし得る。
ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、ＡＭ３、及びメロペネムの活性を、Zhang et al., Antimicrobial peptide therapeutics for cystic fibrosis, Antimicrobial Agents Chemother. 2005; 49(7):2921-2927に開示されるような時間－殺菌アッセイ形式を用いて喀痰において決定した。活性を、２×１０５ＣＦＵ／ｍＬの濃度で喀痰にスパイクした３つの代表的な生物（シュードモナス・エルギノーサ、アクロモバクター・キシロソキシダンス、及びステノトロホモナス・マルトフィリア）を使用して試験した。次いで、喀痰を試験のために最終濃度１０％に希釈した。
溶菌剤（すなわち、ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、又はＡＭ３のいずれか）を細菌との喀痰混合物に添加した後、培養物を３７℃で２４時間インキュベートし、定量的プレーティングのために１時間、３時間、及び２４時間の時点でアリコートを取り出した。ベースラインＣＦＵ決定のための前処理プレーティング（ｔ＝０）に加えて、未処理の対照が含まれていた。活性はまた、喀痰の存在下で観察された活性と比較するために、喀痰の不在下でも決定された。
シュードモナス・エルギノーサと共にインキュベートした喀痰についての結果を下記表２０及び表２１に示す。
Figure 2024513181000033
Figure 2024513181000034
上記表２０及び表２１で実証されるように、シュードモナス・エルギノーサに対するＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３の抗菌活性は、喀痰の存在下では阻害されない。２４時間時点において、ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３のいずれについても、喀痰の存在又は不在による活性に差は認められなかった。ＧＮ３７０は、３時間で１．５－ｌｏｇ１０の減少と２４時間での完全な死滅を示した（３－ｌｏｇ１０超の減少）。ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３はいずれも、１時間で完全な死滅を示し、２４時間までに死滅を維持した（すなわち、新たな増殖は観察されなかった）。しかしながら、メロペネムは喀痰の存在及び不在の両方で活性が乏しかった。
ステノトロホモナス・マルトフィリアと共にインキュベートした喀痰についての結果を下記表２２及び表２３に示す。シュードモナス・エルギノーサと同様に、ステノトロホモナス・マルトフィリアについても、ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３のいずれも、喀痰の存在下で阻害されなかった。
Figure 2024513181000035
Figure 2024513181000036
ステノトロホモナス・マルトフィリアとのインキュベーション後、ＧＮ３７０は３時間で約２－ｌｏｇ１０の減少を示し、２４時間で完全な死滅を示した。ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３は１時間で完全な死滅を示し、２４時間で死滅を維持した。メロペネムは、喀痰の存在下及び不在下で活性が乏しかった。
最後に、アクロモバクター・キシロソキシダンスと共にインキュベートした喀痰についての結果を下記表２４及び表２５に示す。シュードモナス・エルギノーサ及びステノトロホモナス・マルトフィリアと同様に、アクロモバクター・キシロソキシダンスについても、ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３のいずれも、喀痰の存在下で阻害されなかった。
Figure 2024513181000037
Figure 2024513181000038
アクロモバクター・キシロソキシダンスとのインキュベーション後、ＧＮ３７０は３時間で約２－ｌｏｇ１０の減少を示し、２４時間で完全な死滅を示した（３－ｌｏｇ１０超の減少）。ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３は１時間で完全な死滅を示し、２４時間で死滅を維持した。メロペネムは、喀痰の存在下及び不在下で活性が乏しかった。したがって、上に示したように、試験した全ての溶菌剤は、嚢胞性線維症患者の喀痰の存在下で高レベルの活性を示した。
実施例６：ＣＦ－３７０は広域スペクトルの抗微生物活性を示す
ＭＩＣ値を、カルバペネム耐性エンテロバクター科、アシネトバクター、及びシュードモナスを含む、ＧＮ ＥＳＫＡＰＥ病原体及び大腸菌を含む、ＣＤＣ抗生物質耐性バンクからの分離株を含む、広範囲の細菌種からの臨床分離株及び耐性分離株に対する微量液体希釈によって決定した。結果を下記表２６に示す。
Figure 2024513181000039
示されるように、ＧＮ３７０はアシネトバクター・バウマンニ及び大腸菌について１μｇ／ｍＬ、シュードモナス・エルギノーサについて２μｇ／ｍＬ、クレブシエラ・ニューモニエ及びエンテロバクター・クロアカエについて４μｇ／ｍＬのＭＩＣ９０値を示した。交差耐性は観察されなかった。殺菌活性（時間－殺菌アッセイで３ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｍＬ以上の減少として定義される）、抗生物質との相乗効果、ＭＢＥＣアッセイでの抗バイオフィルム活性、及びシュードモナス・エルギノーサについて先に説明した連続継代耐性実験での耐性の欠如の実証を、他のＧＮ ＥＳＫＡＰＥ病原体と大腸菌に拡張した。なお、表２４に示すように、ＧＮ３７０の活性を、ＡＲ Ｂａｎｋ分離株及びＷｅｉｌｌ－Ｃｏｒｎｅｌｌ分離株の両方に対して、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・クロアカエ、及び大腸菌について試験した。ＧＮ３７０についても同様の抗菌活性が両セットの分離株で観察された。
表２４に上記で提供されたＭＩＣ値に基づいて、ＧＮ３７０は、シュードモナス・エルギノーサ、クレブシエラ・ニューモニエ、エンテロバクター・クロアカエ、アシネトバクター・バウマンニ及び大腸菌を含む様々な細菌種の臨床分離株並びにＭＤＲ分離株及びＸＤＲ分離株に対して広範な活性を実証する。
実施例７－広域スペクトル殺菌活性を示すＧＮ３７０時間－殺菌アッセイ
ＧＮ３７０殺菌活性の動態解析を、時間－殺菌アッセイ形式を用いて行い、各標的生物（シュードモナス・エルギノーサ、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、大腸菌、及びエンテロバクター・クロアカエ）のＣＦＵ減少を、ＧＮ３７０の５倍、２倍、１倍、及び０．２倍のＭＩＣレベルで処理した培養物において、３７℃で２４時間（１時間、３時間、及び２４時間の時点で）測定した。殺菌活性を、２４時間の時点での接種菌液と比較して３－ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｍＬ以上のＣＦＵ減少として定義した。Methods for Determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents; Approved Guideline, NCCLS document M26-A, CLSI 1999 (Wayne, PA)を参照されたい。下記表２７に示すように、ＧＮ３７０は、評価した各病原体について１×ＭＩＣ以上の殺菌活性を示した。
Figure 2024513181000040
ＭＩＣ値及びＭＢＥＣ値を含む本明細書で提供されるデータは、ＧＮ３７０がシュードモナス・エルギノーサ、クレブシエラ・ニューモニエ、エンテロバクター・クロアカエ、アシネトバクター・バウマンニ及び大腸菌を含む様々な細菌種の臨床分離株並びにＭＤＲ分離株及びＸＤＲ分離株に対して広範かつ迅速な活性を実証し、広域スペクトルの抗生物質との相乗効果を実証することを示す。
実施例８－連続継代耐性発現研究
シュードモナス・エルギノーサ株ＣＦＳ １２９２を用いて、ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３、並びにシプロフロキサシン（重複して行った）に対して２倍希釈連続継代研究を２８日の期間にわたって実施した。継代培養のＭＩＣを、０日目～２８日目に毎日決定し、未処理の対照と比較した。
２８日目の時点で、ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３のいずれについてもＭＩＣ値に有意な変化は観察されず、ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、又はＡＭ３のいずれも耐性に対する傾向を全く示さなかったことを実証する。同様の結果が、例えば、引用することにより本明細一部をなすＰＣＴ出願公開である国際公開第２０２１／００７１０７号及び国際公開第２０２０／０４６７４７号に報告されている。対照的に、シプロフロキサシンはＭＩＣの２５６倍の増加を示した（１μｇ／ｍＬから２５６μｇ／ｍＬ）。D'Lima et al.はまた、連続継代中にシプロフロキサシンＭＩＣの増加を見出した。２１日間の連続継代にわたって最大３２倍のシプロフロキサシンＭＩＣの増加を報告する、D'Lima et al., No Decrease in Susceptibility to NVC-422 in Multiple-Passage Studies with Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, and Escherichia coli, ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY 2012, 56(5): 2753-2755を参照されたい。
比較抗生物質としてレボフロキサシンを使用して、ステノトロホモナス・マルトフィリア及びアクロモバクター・キシロソキシダンスを用いて、三連で更なる連続継代研究を実施した。ステノトロホモナス・マルトフィリアについては、２８日目の時点で、ＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３のいずれも、ＭＩＣの増加が観察されなかったことから、耐性の傾向を示さなかった。対照的に、レボフロキサシンの場合、ＭＩＣは０．２５μｇ／ｍＬから６４μｇ／ｍＬに最大２５６倍に増加した。アクロモバクター・キシロソキシダンスの場合、２８日目の時点で、ＡＭ１のＭＩＣの増加は観察されなかったが、レボフロキサシンＭＩＣ値は０．２５μｇ／ｍＬから３２μｇ／ｍＬに１２８倍に増加し、別の例では２μｇ／ｍＬから１２８μｇ／ｍＬに６４倍に増加した。
さらに、ＥＳＫＡＰＥ病原体であるシュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター・バウマンニ、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、及びエンテロバクター・クロアカエを使用して、ＧＮ３７０に対して２８日間にわたって２倍希釈連続継代研究を実施した。シプロフロキサシンに対するシュードモナス・エルギノーサ及びレボフロキサシンに対するアシネトバクター・バウマンニ、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、及びエンテロバクター・クロアカエに対する２倍希釈連続継代研究を２８日間にわたって更に実施した。シュードモナス・エルギノーサ（ＰＡ４５３）、クレブシエラ・ニューモニエ（１＿１＿５ ＨＭ－４４）、アシネトバクター・バウマンニ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－７４７）、エンテロバクター・クロアカエ（ＡＴＣＣ １３０４７）、及び大腸菌（ＡＴＣＣ ２５９２２）を含む各標的生物に対して、各化合物について最大３つの異なる系統を試験した。各生物のＭＩＣ値を下記表３６に示す。
Figure 2024513181000041
継代培養のＭＩＣを、０日目～２８日目に毎日決定し、未処理の対照と比較した。ＧＮ３７０のＭＩＣ値の変化は、シュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター・バウマンニ、及び大腸菌のいずれについても観察されなかった。ＧＮ３７０ ＭＩＣ値の２倍以下のシフトが、クレブシエラ・ニューモニエ及びエンテロバクター・クロアカエで観察された。別の例では、ＧＮ３７０のＭＩＣ値の変化はクレブシエラ・ニューモニエについて観察されなかった。シプロフロキサシン及びレボフロキサシンについては、全ての場合において少なくとも４０倍のＭＩＣ増加が観察され、約１２８倍～５１２倍の平均ＭＩＣ増加の範囲が観察された。具体的には、シュードモナス・エルギノーサに対して、シプロフロキサシンＭＩＣは２つの独立した継代で最大５１２倍に増加した。レボフロキサシンＭＩＣは、３つの独立した継代においてクレブシエラ・ニューモニエについて最大５１２倍、３つの独立した継代においてアシネトバクター・バウマンニについて１２８倍、３つの独立した継代においてエンテロバクター・クロアカエについて２５６倍、３つの独立した継代において大腸菌について１２８倍に増加した。未処理の対照継代は、２８日間にわたってＭＩＣ値の変化を示さなかった。
これらの結果は、シプロフロキサシン及びレボフロキサシンとは対照的に、試験した細菌株のＧＮ３７０、ＡＭ１、ＡＭ２、及びＡＭ３の全てにおいて自然耐性の傾向が低く、ＧＮ３７０におけるＥＳＫＡＰＥ病原体に対する耐性の傾向が低いことを証明する。
実施例９－ウサギ肺感染症モデルにおけるＡＭ１の反復投与研究
ウサギ肺モデルを用いて、ＡＭ１単独及び抗生物質（アミカシン）との組合せの有効性を評定した。はじめに、ウサギに６．８ｌｏｇ ＣＦＵのシュードモナス・エルギノーサＡＲ－７６９を気管内感染させた。感染後６時間で治療を開始した（ｔ＝６）。治療群を下記表２８に示し、全ての投薬量を静脈内投与した。ウサギをアミカシンの最後の用量の約１２時間後に屠殺し、肺における細菌負荷（ＣＦＵ／グラム）を評定した。
Figure 2024513181000042
アミカシン又はＡＭ１単独で治療された動物の肺の平均細菌密度は、ビヒクル対照群と比較して、中程度のＣＦＵ／ｇ減少を示したか、減少を全く示さなかった。アミカシンに加えてＡＭ１で治療された動物の肺組織における平均細菌密度は、アミカシン単独と比較して、２．２ｌｏｇ ＣＦＵから２．６ｌｏｇ ＣＦＵに更に減少した。結果を下記表２９に示す。
Figure 2024513181000043
このデータは、シュードモナス・エルギノーサの肺組織の細菌負荷の減少におけるＡＭ１とアミカシンとの相乗活性を証明する。
実施例１０－ムコイド分離株、α溶血性分離株、ＭＤＲ分離株、及びカルバペネム耐性分離株に対するＧＮ３７０及びＡＭ１活性
ＧＮ３７０及びＡＭ１の活性を、シュードモナス・エルギノーサのムコイド分離株及びα溶血性分離株、ＭＤＲ分離株、及びカルバペネム耐性分離株を含む様々な細菌分離株に対して評価した。ＧＮ３７０及びＡＭ１のＭＩＣ５０値及びＭＩＣ９０値（μｇ／ｍＬ）を、これらの様々な分離株の存在下で、実施例２で上記した方法を用いて決定し、全ての例においてＧＮ３７０及びＡＭ１の両方について良好な活性が実証された。
ＧＮ３７０及びＡＭ１のＭＩＣ値を、ムコイドシュードモナス・エルギノーサ分離株（ｎ＝１１）及びα溶血性シュードモナス・エルギノーサ分離株（ｎ＝１３）の存在下で決定した。結果を下記表３０に示し、ＧＮ３７０及びＡＭ１の両方がムコイド及び溶血性のシュードモナス・エルギノーサ分離株に対して良好な活性を示すことを実証する。
Figure 2024513181000044
ＧＮ３７０及びＡＭ１の活性を、シュードモナス・エルギノーサ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、及びアクロモバクター・キシロソキシダンスの様々なＭＤＲ分離株に対して更に試験し、ＭＤＲは、細菌分離株が３つ以上の抗菌カテゴリーの少なくとも１つの作用物質の影響を受けなかったことを示す。Magiorakos, A. et al., Bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance, MICROBIOLOGY 2011; 18(3):268-281を参照されたい。結果を下記表３１に示す。
Figure 2024513181000045
ＧＮ３７０の活性を、ステノトロホモナス・マルトフィリアの様々なＸＤＲ分離株に対して更に試験し、ＸＤＲは、細菌分離株が２つ以下の抗微生物カテゴリーを除く全ての抗微生物カテゴリーにおいて少なくとも１つの作用物質の影響を受けなかったことを示す。Magiorakos, A. et al., Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance, CLIN MICROBIOL INFECT 2012; 18(3):268-281を参照されたい。ＧＮ３７０ ＭＩＣを微量液体希釈によって決定し、獲得耐性を、Magiorakos 2012に記載されている基準を使用して、合計２７の異なる抗生物質を使用したアンチバイオグラムによって決定した。結果を下記表３２に示す。
Figure 2024513181000046
結果に基づき、ステノトロホモナス・マルトフィリア分離株のＭＩＣ５０は１μｇ／ｍＬ、ＭＩＣ９０は２１μｇ／ｍＬ、範囲は０．０３１２５～２であることが示された。
最後に、ＧＮ３７０及びＡＭ１の活性を、シュードモナス・エルギノーサ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、及びアクロモバクター・キシロソキシダンスの様々なカルバペネム耐性分離株に対して更に試験した。結果を下記表３２に示し、これらのカルバペネム耐性株に対するＧＮ３７０及びＡＭ１の強い活性を示す。
Figure 2024513181000047
実施例１１－ウサギ肺炎モデルにおけるＧＮ３７０
ウサギ肺炎モデルを使用して、シュードモナス・エルギノーサのＸＤＲ株（ＡＲ－７６９）によって引き起こされる感染に対するＧＮ３７０単独及び抗生物質（アミカシン）との併用のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評定した。ＸＤＲではないＰＡ２０とは異なり、シュードモナス・エルギノーサのＡＲ－７６９株はメロペネムに耐性があり（ＭＩＣ＝６４μｇ／ｍＬ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのみアミカシンに感受性である（ＭＩＣ＝８μｇ／ｍＬ）。ＧＮ３７０のＭＩＣは２μｇ／ｍＬである。
はじめに、ニュージーランド白ウサギ（雌性、２．２ｋｇ～２．５ｋｇ）にシュードモナス・エルギノーサＡＲ－７６９（４×１０９ＣＦＵ／動物）の気管内接種により肺炎を誘発した。感染後６時間で、ウサギを無作為化し、表３３に示すような治療を受けさせた。治療を受けていない群の細菌負荷を６時間後に評価し、治療前の標的組織におけるベースラインを確立した。治療を２４時間続け、アミカシン投与後２４時間で平均細菌密度（ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ±ＳＤ）を介して４つの標的組織（各肺、腎臓、及び脾臓）で比較有効性を測定した。
Figure 2024513181000048
３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのＧＮ３７０単独で、又はアミカシンに加えて治療した全ての動物（１００％）は、研究の終わりまで生存したが、ビヒクル処理された動物は８０％が生存した。両方の肺、腎臓組織、及び脾臓組織における細菌密度を下記表３４に示す。
Figure 2024513181000049
４ｍｇ／ｋｇのアミカシン単独による治療は、ビヒクル処理された対照と比較して、肺、腎臓、及び脾臓における細菌密度の１．２ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ～１．７ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇの減少を引き起こした。単回用量のＧＮ３７０を３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇで単独で投与すると、ビヒクル対照群と比較して、肺、腎臓、及び脾臓における細菌密度が１．９ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ～２．５ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ有意に減少した。アミカシン単独又はＧＮ３７０単独で治療された動物からの肺の平均細菌密度は、ビヒクル対照に対して、それぞれ１．３－ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ及び約２．０－ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ減少した（ｐ≦０．０１２２２）。
アミカシンレジメンに３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの単回ＧＮ３７０用量を追加すると、３つの組織全ての細菌密度が、アミカシン単独と比較して１．３ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ～３．２ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ、ビヒクル対照群と比較して２．５ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ～４．５ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｇ更に有意に低下した（ｐ≦０．００５４）。アミカシンに加えて、漸増用量のＧＮ３７０を投与すると、用量反応関係が観察された。
さらに、アミカシンの有無にかかわらず、シュードモナス・エルギノーサ株ＡＲ－７６９に対するＧＮ３７０についてのｉｎ ｖｉｔｒｏチェッカーボードアッセイを、本明細書に記載の方法に従って行った。結果を下記表３５に示す。
Figure 2024513181000050
上記のように、ＧＮ３７０とアミカシンの平均ＦＩＣＩスコアは０．３２３であり、ＧＮ３７０もセフタジジムを除く試験した全ての抗生物質との相乗効果（平均ＦＩＣＩスコア≦０．５）を示した。
これらの研究は、シュードモナス・エルギノーサのＸＤＲ株を標的とする静脈内投与された溶解素のｉｎ ｖｉｔｒｏ相乗効果とｉｎ ｖｉｖｏ有効性を実証する。ＧＮ３７０はアミカシンと相乗効果を発揮し、腎臓及び脾臓における血行性二次感染を特徴とするシュードモナス肺炎モデルにおける有効性を改善した。全体として、これらのデータは、多抗生物質耐性株（ＭＤＲ及びＸＤＲ）、院内感染及び／又は人工呼吸器関連肺炎、並びに嚢胞性線維症関連肺炎によって引き起こされるものを含む、重篤なシュードモナス・エルギノーサ感染に対するＧＮ３７０補助療法の潜在的な役割を支持する。
実施例１２－ＧＮ３７０はシュードモナス・エルギノーサにおいて抗生物質に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ耐性を抑制する
上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ連続（毎日）継代耐性アッセイ形式を、ＧＮ３７０（ＭＩＣ＝１）及び３つの抗生物質：レボフロキサシン（ＭＩＣ＝１）、メロペネム（ＭＩＣ＝０．５）、及びトブラマイシン（ＭＩＣ＝０．００２）のそれぞれに使用した。各条件について、最大３つの異なる系統をシュードモナス・エルギノーサ株ＡＴＣＣ ２７８５３に対して試験した。単剤対照研究では、ＧＮ３７０と抗生物質への曝露は標準的な２倍希釈スキームに従った。ＧＮ３７０と抗生物質の組合せについては、ＧＮ３７０の一定のＭＩＣ以下のレベル（１／８のＭＩＣ、又は０．１２５μｇ／ｍＬ）に加えて、各抗生物質の２倍希釈系列を使用した。レボフロキサシンについては、１／１６のＭＩＣ（０．０６２５μｇ／ｍＬ）及び１／３２のＭＩＣ（０．０３１２５μｇ／ｍＬ）を含む追加のＭＩＣ以下の量を評価した。２８日間にわたって毎日、全ての中間体を分離し、最終的なＭＩＣ決定の前に２回（抗微生物剤の不在下で）継代培養した。
ＧＮ３７０の不在下で単独で評価した場合、２８日後、レボフロキサシンについて１６倍のＭＩＣ増加が観察され、メロペネムについて３２倍のＭＩＣ増加が観察され、トブラマイシンについて３２倍のＭＩＣ増加が観察された。別の例では、ＧＮ３７０の不在下でトブラマイシンについて最大４倍のＭＩＣ増加が観察された。ＧＮ３７０単独ではＭＩＣの増加は観察されなかった。１／８のＭＩＣのＧＮ３７０の存在下では、レボフロキサシン、メロペネム、及びトブラマイシンについてＭＩＣの変化は観察されなかった。別の例では、１／８のＭＩＣのＧＮ３７０の存在下でメロペネムについて２倍のＭＩＣ増加が観察された。１／１６のＭＩＣと１／３２のＭＩＣの両方のＧＮ３７０を使用すると、２８日後にレボフロキサシンについてＭＩＣが２倍に増加した。
これらのデータは、ＧＮ３７０が１／３２のＭＩＣという低い濃度で抗生物質耐性に対する抑制効果を示し、薬剤耐性グラム陰性病原体によって引き起こされる感染の治療のための従来の抗生物質に加えたＧＮ３７０の使用を支持する。抗生物質耐性の発現の抑制は、Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクト、例えばＧＮ３７０の存在下で、抗生物質のＭＩＣ値が有意に増加しない場合、又はより少ない程度で増加する場合に生じる。
抗微生物感受性試験（ＡＳＴ）培地陽イオン調整ミューラー・ヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ）の各メロペネム、レボフロキサシン、及びトブラマイシンについて追加のデータが生成された。２８日間の連続継代にわたって、メロペネム、レボフロキサシン、及びトブラマイシンのそれぞれについて、最大１０２４倍、６４倍、及び３２倍のＭＩＣ増加が観察された。ＤＣＡＡＴ培地でＧＮ３７０を２８日間連続継代しても、ＭＩＣの増加は生じなかった。これらのデータは、以前に報告された結果と一致しているため、連続継代耐性研究が文献で報告されたものと一致するように実施されていることを示す。例えば、Palmer, K. et al., Genetic Basis for Daptomycin Resistance in Enterococci, Antimicrobial Agents Chemother. 2011, 55(7), doi: 10.1128/AAC.00207-11、Drago, L. et al., In vitro selection of resistance in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. by levofloxacin and ciprofloxacin alone and in combination with Beta-lactams and amikacin, J. Microbial Chemother 2005, 56(2):353-359、Zhao, L. et al., Development of in vitro resistance to fluoroquinolones in Pseudomonas aeruginosa, Antimicrobial Resistance Infection Control 2020, 9(124):1-8、及びSchuch, R., Combination therapy with lysin CF-301 and antibiotic is superior to antibiotic alone for treating methicillin-resistant Staphylococcus aureus-induced murine bacteremia, J. Infect Dis. 2014, 209(9):1469-78を参照されたい。

Claims (36)

  1. 少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖を阻害するか、その菌数を減少させるか、又はそれを死滅させる方法であって、前記細菌を、有効量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトを含む組成物であって、前記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、組成物と、前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖の阻害、その菌数の減少、又はその死滅に十分な期間にわたって接触させることを含む、方法。
  2. 前記Ｃｈｐペプチドが、配列番号２、配列番号８１、及び配列番号８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記溶解素－ＡＭＰコンストラクトが、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌が、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・クロアカエ、大腸菌、アクロモバクター・キシロソキシダンス、アクロモバクター・ルランディ、アクロモバクター・ドレンズ、バークホルデリア・マルチボランス、バークホルデリア・セノセパシア、バークホルデリア・セパシア、パンドラエア・アピスタ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、ラルストニア・マンニトリリチカ、セラチア・マルセセンス、シトロバクター・フロウンディ、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・オキシトカ、クライベラ・アスコルバータ、ラウルテラ・オルニチノリチカ、及びサルモネラ・センフテンベルクからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌が、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・クロアカエ及び大腸菌からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌が、シュードモナス・エルギノーサ、アクロモバクター・キシロソキシダンス、アクロモバクター・ルランディ、アクロモバクター・ドレンズ、及びステノトロホモナス・マルトフィリアからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌が、シュードモナス・エルギノーサ及びステノトロホモナス・マルトフィリアからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 喀痰中に存在するグラム陰性細菌を阻害する方法であって、前記喀痰と、有効量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトを含む組成物であって、前記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、組成物と、前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌の増殖の阻害、その菌数の減少、又はその死滅に十分な期間にわたって接触させることを含む、方法。
  9. 前記Ｃｈｐペプチドが、配列番号２、配列番号８１、及び配列番号８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記溶解素－ＡＭＰコンストラクトが、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
  11. 前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌が、シュードモナス・エルギノーサ、アクロモバクター・キシロソキシダンス、及びステノトロホモナス・マルトフィリアからなる群から選択される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. グラム陰性細菌のバイオフィルムを予防、破壊又は根絶する方法であって、
    バイオフィルム内の少なくとも１つの種のグラム陰性細菌を死滅させるのに有効な量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトを、それを必要とする被験体に投与することを含み、前記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、方法。
  13. 前記Ｃｈｐペプチドが、配列番号２、配列番号８１、及び配列番号８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記溶解素－ＡＭＰコンストラクトが、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌が、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・クロアカエ、大腸菌、アクロモバクター・キシロソキシダンス、バークホルデリア・マルチボランス、及びステノトロホモナス・マルトフィリアからなる群から選択される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌が、シュードモナス・エルギノーサを更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載に記載の方法。
  17. 細菌感染が局所又は全身の細菌感染である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. グラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染を治療する方法であって、前記グラム陰性細菌が、バークホルデリア・セノセパシア及び任意に１つ以上の追加の種のグラム陰性細菌を含み、細菌感染と診断された、そのリスクがある、又はその症状を示す被験体に、有効量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトを含有する医薬組成物であって、前記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、医薬組成物を投与することを含み、前記組成物が、バークホルデリア・セノセパシアの細菌増殖を阻害すること、バークホルデリア・セノセパシアの菌数を減少させること、及び／又はバークホルデリア・セノセパシアを死滅させることから選択される少なくとも１つの活性を含む、方法。
  19. グラム陰性細菌感染の治療に適した抗生物質を前記被験体に投与することを更に含む、請求項１８に記載の方法。
  20. グラム陰性細菌感染の治療に適した前記抗生物質が、アジスロマイシン、アズトレオナム、ホスホマイシン、セファロスポリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、アミノグリコシド、カルバペネム、ペニシリン、リファンピシン、ポリミキシンＢ、及びコリスチンの１つ以上から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記抗生物質が、カルバペネム、アズトレオナム、シプロフロキサシン、アミノグリコシド、コリスチン、又はセファロスポリンである、請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. 前記アミノグリコシドが、ゲンタマイシン、トブラマイシン、又はアミカシンである、請求項２０又は２１に記載の方法。
  23. 前記セファロスポリンが、セフタジジム、セフェピム、セファペラゾン、セフトビプロール、又はセファゾリンである、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. 前記溶解素－ＡＭＰコンストラクトが、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌が、シュードモナス・エルギノーサのムコイド及び／又はα溶血性分離株、及び／又はシュードモナス・エルギノーサ、ステノトロホモナス・マルトフィリア、及び／又はアクロモバクター・キシロソキシダンスの多剤耐性（ＭＤＲ）分離株及び／又はカルバペネム耐性分離株から選択される、請求項１～４、６、８～１５及び１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌が、シュードモナス・エルギノーサの広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）分離株から選択される、請求項１～４、６、８～１５及び１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. グラム陰性細菌が抗生物質に対する耐性を発現する能力を抑制する方法であって、前記グラム陰性細菌に、
    ａ．前記抗生物質と、
    ｂ．前記グラム陰性細菌の抗生物質に対する耐性の発現を抑制するのに有効な量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトと、
    を投与することを含み、前記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、方法。
  28. 前記溶解素－ＡＭＰコンストラクトが、配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記抗生物質が、フルオロキノロン、任意にレボフロキサシン、カルバペネム、任意にメロペネム、又はアミノグリコシド、任意にトブラマイシンである、請求項２７又は２８に記載の方法。
  30. 前記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが、前記グラム陰性細菌にＭＩＣ以下の量で投与される、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. グラム陰性細菌によって引き起こされる細菌感染を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の（ｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクト、若しくはその活性フラグメント、又は（ｉｉ）配列番号１～配列番号２６、配列番号５４～配列番号６７、配列番号８１～配列番号１０２、及び配列番号１２９～配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣｈｐペプチド、溶解素、若しくは溶解素－ＡＭＰコンストラクトを含有する医薬組成物であって、前記Ｃｈｐペプチド、溶解素、又は溶解素－ＡＭＰコンストラクトが溶菌活性を有する、医薬組成物を投与することを含み、前記組成物が、前記グラム陰性細菌の増殖を阻害すること、その菌数を減少させること、及び／又はそれを死滅させることから選択される少なくとも１つの活性を含む、方法。
  32. 前記感染が、嚢胞性線維症（ＣＦ）患者、及び／又は肺増悪（ＰＥｘ）及び／又は肺機能の低下及び死亡率に関連する患者におけるものである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記感染が、非ＣＦ気管支拡張症及び／又は潜在的に急性肺炎である、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌が、マイコバクテリウム種、例えば、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・フォーチュイタム、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・カンサシ、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ及び結核菌から選択される、請求項１～３又は３１のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記少なくとも１つの種のグラム陰性細菌が、マイコバクテリウム・アブセサスである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記細菌が、多剤耐性又は広範囲薬剤耐性である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
JP2023558888A 2021-03-26 2022-03-23 グラム陰性細菌に対して活性なアムリン、溶解素、及び溶解素－抗微生物ペプチド（ａｍｐ）コンストラクト Pending JP2024513181A (ja)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163166463P 2021-03-26 2021-03-26
US63/166,463 2021-03-26
US202163196436P 2021-06-03 2021-06-03
US63/196,436 2021-06-03
US202163249638P 2021-09-29 2021-09-29
US63/249,638 2021-09-29
US202163279855P 2021-11-16 2021-11-16
US63/279,855 2021-11-16
US202163282230P 2021-11-23 2021-11-23
US63/282,230 2021-11-23
PCT/US2022/021543 WO2022204280A1 (en) 2021-03-26 2022-03-23 Amurins lysins, and lysin-antimicrobial peptide (amp) constructs active against gram-negative bacteria

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024513181A true JP2024513181A (ja) 2024-03-22

Family

ID=83397840

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023558888A Pending JP2024513181A (ja) 2021-03-26 2022-03-23 グラム陰性細菌に対して活性なアムリン、溶解素、及び溶解素－抗微生物ペプチド（ａｍｐ）コンストラクト

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20240181022A1 (ja)
EP (1) EP4314020A1 (ja)
JP (1) JP2024513181A (ja)
KR (1) KR20230162045A (ja)
AU (1) AU2022242830A1 (ja)
CA (1) CA3213352A1 (ja)
IL (1) IL307148A (ja)
MX (1) MX2023011235A (ja)
WO (1) WO2022204280A1 (ja)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201000352D0 (en) * 2010-01-11 2010-02-24 Isogenica Ltd Antimicrobial peptides
EP2679677A1 (en) * 2012-06-29 2014-01-01 Lysando Aktiengesellschaft Composition for use in Mycobacteria therapy
CA3095484A1 (en) * 2018-03-29 2019-10-03 Contrafect Corporation Lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022242830A1 (en) 2023-11-02
CA3213352A1 (en) 2022-09-29
IL307148A (en) 2023-11-01
AU2022242830A9 (en) 2023-11-16
MX2023011235A (es) 2023-10-13
KR20230162045A (ko) 2023-11-28
EP4314020A1 (en) 2024-02-07
WO2022204280A1 (en) 2022-09-29
US20240181022A1 (en) 2024-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11773140B2 (en) Gram-negative lysin-antimicrobial peptide (AMP) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof in human serum
US20210147498A1 (en) Use of gram-negative lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs in pulmonary surfactant and biofilms
US10988520B2 (en) Lysin-antimicrobial peptide (AMP) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof
US20210324359A1 (en) Use of gram-negative lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs in treating endocarditis
US20210330738A1 (en) Antimicrobial, bacteriophage-derived polypeptides and their use against gram-negative bacteria
US20220401514A1 (en) Antimicrobial, bacteriophage-derived polypeptides and their use against gram-negative and acid-fast bacteria
US20220411473A1 (en) Lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof
US20240181022A1 (en) Amurins lysins, and lysin-antimicrobial peptide (amp) constructs active against gram-negative bacteria
CA3095473A1 (en) Lysin-antimicrobial peptide (amp) polypeptide constructs, lysins, isolated polynucleotides encoding same and uses thereof
CN117377680A (zh) 针对革兰氏阴性细菌有活性的amurin溶素和溶素-抗微生物肽(AMP)构建体