JP2024511880A

JP2024511880A - オリゴデンドロサイト前駆細胞を作製するための方法および組成物

Info

Publication number: JP2024511880A
Application number: JP2023560985A
Authority: JP
Inventors: ヌーシンアミニ
Original assignee: トレイルヘッドバイオシステムズインコーポレイテッド
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2024-03-15
Also published as: WO2022211893A9; US20220315891A1; CA3215398A1; AU2022247250A1; US20240158744A1; EP4314256A1; BR112023019790A2; WO2022211893A1; US20240158743A1; IL305671A; CN117321191A; KR20230161494A

Abstract

ヒト多能性幹細胞からプレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）およびオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を作製するための方法が、わずか3日でプレOPCとOPCの生成を可能にする化学的に規定された培養培地を用いることで、提供される。培養培地、単離された細胞集団、およびキットも提供される。

Description

関連出願
本出願は、2021年3月30日に出願された米国仮出願第63/168,065号の優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。

政府の使用許諾権利
本発明は、U.S. ARMY ACC-AGP-RTPによって授与された助成金番号W911NF-17-3-0003の下に政府の支援を受けて行われたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。

発明の背景
オリゴデンドロサイト（OL）は、軸索周囲のミエリン鞘を合成するグリア細胞の一種である。そのため、それらは中枢神経系（CNS）における神経伝導にとって極めて重要である。オリゴデンドロサイトの生物学をより深く理解することは、多発性硬化症や大脳白質萎縮症のような脱髄疾患だけでなく、疾患の過程で後に脱髄を伴うことがある筋萎縮性側索硬化症（ALS）といった、神経変性疾患の治療法の開発において非常に重要になると考えられる。さらに、脳への放射線療法はオリゴデンドロサイトの枯渇という副作用を伴っており、認知機能の低下および/または運動協調性（motor coordination）の障害につながる可能性がある。

成熟したヒトオリゴデンドロサイトはヒト対象者から容易に単離できないので、該細胞の研究を可能にするためにヒトオリゴデンドロサイト細胞株が開発されてきた。しかし、不死化細胞株は天然の細胞の生物学を完全には模倣していない可能性があり、治療上の使用には適していない。したがって、幹細胞などから、ヒトオリゴデンドロサイトをインビトロで作製する能力が非常に望まれている。ヒト多能性幹細胞からオリゴデンドロサイトを分化させるための様々なプロトコルが報告されている。ところが、これらのプロトコルは、オリゴデンドロサイトの収量の点から、依然として効率が悪く、ばらつきがあり、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）陽性のオリゴデンドロサイトを生じさせるためには、非常に長い分化期間を必要とする。

初期のプロトコルでは、4段階のプロセスが用いられた（Hu et al. (2009) Nature Protocols 4:1614-1622（非特許文献1）；Wang et al. (2013) Cell Stem Cell 12:252-264（非特許文献2）も参照のこと）。このプロトコルでは、最初にヒト胚性幹細胞（hESC）を2週間かけて神経上皮細胞に分化誘導して、神経管様ロゼットを形成させ、続いてレチノイン酸（RA）とソニック・ヘッジホッグ（sonic hedgehog：SHH）で10日間処理して、OLIG2を発現する前駆細胞へと誘導した。線維芽細胞増殖因子（FGF2）でさらに10日間処理すると、OLIG2およびNKX2.2を発現するプレOPC（pre-OPC）への変換が起こった。最後に、プレOPCをFGF2の非存在下でさらに8～9週間培養して、血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRα）、SOX10、NG2などのマーカーを発現するOPCへと分化させた。したがって、このプロトコルを用いると、OLIG2を発現する前駆細胞を生じさせるには約24日、OLIG2およびNKX2.2を発現するプレOPCを生じさせるには約34日を要し、成熟したOLを得るには約100日を必要とした。このプロトコルの変形がDouvarasら（Stem Cell Reports (2014) 3:250-259（非特許文献3））によって報告されたが、それでもプレOPCを得るには約20日、OPCを得るには約50日を要し、外部から加えられた増殖因子PDGF、IGF-1およびHGFを用いる培養を含んでいた。

その後、代替プロトコルが報告されたが、これらのプロトコルは、依然として約1週間にわたる神経誘導・パターン形成段階（神経化（neuralization）とも呼ばれる）を利用し、続いて、プロトコルに応じてFGF2、PDGF、IGF-1および/またはHGFなどの、外部から加えられた増殖因子を含む培地を用いて、プレOPCおよびOPCマーカーを発現する細胞を誘導するものであった（例えば、Piao et al. (2015) Cell Stem Cell 16:198-210（非特許文献4）; Douvaras & Fossati (2015) Nature Protocols 10:1143-1154（非特許文献5）; Livesey et al. (2016) Stem Cells 34:1040-1053（非特許文献6）; およびYamashita et al. (2017) PLOS One 12: e0171947（非特許文献7）を参照されたい）。

最近では、最初にhESCを神経誘導して神経前駆細胞（NPC）を作製し、続いてNPCにSOX10転写因子を過剰発現させ（ウイルス形質導入による）、bFGFの存在下で増殖させることで、わずか約20日でMBP陽性オリゴデンドロサイトを作製するプロトコルが報告されている（Garcia-Leon et al. (2018) Stem Cell Reports 10:655-672（非特許文献8））。さらに、神経幹細胞（神経化によって生成）のSHH経路転写因子GLI1を小分子阻害剤GANT61によって一過性かつ部分的に阻害すると、より移動性が高く、ミエリン産生オリゴデンドロサイトに向けて早期に分化できるOPCが生成されることが見出された（Namchaiw et al. (2019) Stem Cell Res & Therapy 10:272（非特許文献9））。

したがって、ある程度の進歩は見られたものの、ヒト多能性幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞を作製するための、効率的でロバストな方法および組成物の必要性が依然として存在している。

Hu et al. (2009) Nature Protocols 4:1614-1622 Wang et al. (2013) Cell Stem Cell 12:252-264 Stem Cell Reports (2014) 3:250-259 Piao et al. (2015) Cell Stem Cell 16:198-210 Douvaras & Fossati (2015) Nature Protocols 10:1143-1154 Livesey et al. (2016) Stem Cells 34:1040-1053 Yamashita et al. (2017) PLOS One 12: e0171947 Garcia-Leon et al. (2018) Stem Cell Reports 10:655-672 Namchaiw et al. (2019) Stem Cell Res & Therapy 10:272

本開示は、OLIG2およびNKX2.2陽性のプレOPCとOPCをわずか3日間の培養で作製することを可能にする化学的に規定された培養培地を用いて、多能性幹細胞からヒトプレOPCおよびOPCを作製する方法を提供する。この培養培地は、血清や他の外部から加えられた増殖因子を欠き、かつ多能性幹細胞における特定のシグナル伝達経路の活性に作用するまたは拮抗する小分子薬剤を含み、結果的に、OPC系統に沿った分化が促進されて、細胞の成熟化とOPC関連バイオマーカーの発現につながるようになる。本開示の方法は、先行技術プロトコルの神経誘導段階を回避して、多能性幹細胞をプレOPCとOPCに直接分化させることを可能にし、それによってプレOPCとOPCの作製に必要な時間を大幅に短縮するという利点を有する。さらに、この培養培地中で小分子薬剤を用いることで、培養成分類の正確な制御が可能である。

したがって、一局面において、本開示は、ヒトプレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を作製する方法に関し、この方法は、以下の工程を含む：
OLIG2を発現するプレOPCまたはOPCが作製されるように、ヒト多能性幹細胞を、外部から加えられた増殖因子を欠きかつレチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニストおよびmTOR経路アゴニストを含む培養培地中で培養する工程。

一態様では、OLIG2を発現するプレOPCまたはOPCは、該培養培地中でヒト多能性幹細胞の培養を開始してから72時間以内に作製される。一態様では、プレOPCまたはOPCはNKX2-2も発現する。

別の態様では、該培養培地はWNT経路アンタゴニストをさらに含む。別の態様では、該培養培地はSHH経路アゴニストをさらに含む。別の態様では、該培養培地はBMP経路アンタゴニストをさらに含む。別の態様では、該培養培地はPKC経路アンタゴニストをさらに含む。様々な態様では、プレOPCまたはOPCはまた、OTX2および/またはFEZF2を発現する。

したがって、別の局面において、本開示は、ヒトプレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を作製する方法に関し、この方法は、以下の工程を含む：
OLIG2を発現するプレOPCまたはOPCが作製されるように、ヒト多能性幹細胞を、外部から加えられた増殖因子を欠きかつレチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニスト、mTOR経路アゴニスト、WNT経路アンタゴニスト、SHH経路アゴニスト、BMP経路アンタゴニストおよびPKC経路アンタゴニストを含む培養培地中で培養する工程。他の態様では、プレOPCまたはOPCはまた、NKX2-2、OTX2および/またはFEZF2を発現する。

適切なアゴニストおよびアンタゴニスト薬剤の非限定的な例、ならびにそれらの濃度については、本明細書でさらに詳しく説明する。

一態様では、ヒト多能性幹細胞は人工多能性幹細胞（iPSC）である。別の態様では、ヒト多能性幹細胞は胚性幹細胞である。

一態様では、ヒト多能性幹細胞は、培養の間中、ビトロネクチンでコーティングされたプレートに付着されている。

別の態様では、本開示は、プレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を得るための培養培地に関し、この培養培地は、レチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニストおよびmTOR経路アゴニストを含み、かつ外部から加えられた増殖因子を欠く。一態様では、該培養培地はWNT経路アンタゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はSHH経路アゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はBMP経路アンタゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はPKC経路アンタゴニストをさらに含む。

別の局面において、本開示は、プレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）の単離された細胞培養物に関し、この培養物は、レチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニストおよびmTOR経路アゴニストを含み、かつ外部から加えられた増殖因子を欠く培養培地中で培養された、OLIG2を発現するプレOPCまたはOPCを含む。一態様では、該培養培地はWNT経路アンタゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はSHH経路アゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はBMP経路アンタゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はPKC経路アンタゴニストをさらに含む。他の態様では、プレOPCまたはOPCはまた、NKX2-2、OTX2および/またはFEZF2を発現する。細胞培養物の一態様では、プレOPCまたはOPCは、ビトロネクチンでコーティングされたプレートに付着されている。

別の局面において、本開示は、例えば本開示の方法によって作製された、プレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）に関する。一態様では、本開示は、非天然のプレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を含む組成物を提供し、ここで、プレOPCまたはOPCは、OLIG2、NKX2-2、OTX2およびFEZF2を発現しており、NESTINの発現を欠いている。

さらに別の局面において、本開示は、少なくとも1×10⁶個の、OLIG2を発現するプレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を含む、プレOPCまたはOPCの単離された細胞集団に関し、この細胞集団はNESTINを発現する神経幹細胞を欠いている。他の態様では、プレOPCまたはOPCはまた、NKX2-2、OTX2および/またはFEZF2を発現する。単離された細胞集団の一態様では、プレOPCまたはOPCは、プレOPCまたはOPCによって発現された少なくとも1つの細胞表面マーカーに結合する少なくとも1つの抗体と結合されている。

さらに別の局面において、本開示は、プレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を単離する方法に関し、この方法は、以下の工程を含む：
本開示の方法によって作製された、OLIG2を発現するプレOPCまたはOPCを、OLIG2を発現するプレOPCまたはOPCによって発現された細胞表面マーカーに結合する少なくとも1つの結合剤と接触させる工程；および
該結合剤に結合する細胞を単離し、それによってOPCを単離する工程。

一態様では、前記結合剤は抗体である。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図1は、NKX2-2の発現が最大となるように最適化された8因子実験のHD-DoEモデルからの結果を示す。モデルの上段は、NKX2-2に向けて最適化された場合の、予め選択された53個の遺伝子の発現レベルの予測を示す。モデルの下段は、このモデルで試験されたエフェクターと、NKX2-2の最大発現に対するそれらの寄与（contribution）とを示す。値の欄は、モデルを模倣するために必要とされる各エフェクターの濃度を示す。図2は、PDGFRAの発現が最大となるように最適化された8因子実験のHD-DoEモデルからの結果を示す。上段と下段は、図1について説明した通りである。この条件では、PDGFRAの高発現のための重要な入力（input）として、30.05の因子寄与を有するエフェクターPD0325901が強調される。図3は、試験した8種のエフェクターの濃度に対するNKX2-2、OLIG1、OLIG2およびPDGFRA遺伝子の発現レベルの動的プロファイルを示す。PDGFRAの発現に対するTTNPB、MHY1485およびPD0325901のプラスの影響と、それらの因子寄与は、各エフェクターのプロットの傾きで示される。点線のボックスでは、PDGFRAと比較して、NKX2-2およびOLIG2に対するPD0325901の反対の影響が強調される。図4は、OTX2の発現が最大となるように最適化された13因子実験のHD-DoEモデルからの結果を示す。このモデルでは、OTX2の発現に対するポジティブエフェクターとして、MK2206、PD0325901、CHIR99021、LDN193189、Go6983およびPD173074が導入された。図5は、FEZF2の発現が最大となるように最適化された13因子実験のHD-DoEモデルからの結果を示す。このモデルでは、細胞のパターン形成に対するLDN193189、MK2206およびPD0325901のプラスの効果が確認され、SC79、XAV939およびパルモルファミン-500nMを含む3つの他の因子が導入された。図6は、このモデルで試験した13種の因子の濃度に対するOTX2およびFEZF2の発現レベルの動的プロファイルを示す。XAV939とパルモルファミン-500nMは、FEZF2の発現に顕著なプラスの影響を及ぼし、OTX2の発現には顕著なマイナスの影響を及ぼさない。図7A～Dは、8因子モデリング実験における除外プロセスの動的プロファイル解析と、NKX2-2、OLIG2およびPDGFRAの発現に対するその影響を示す。図7Aの説明を参照のこと。図7Aの説明を参照のこと。図7Aの説明を参照のこと。図8A～Dは、13因子モデリング実験における除外プロセスの動的プロファイル解析と、FEZF2およびOTX2の発現に対するその影響を示す。図8Aの説明を参照のこと。図8Aの説明を参照のこと。図8Aの説明を参照のこと。図9は、最適化されたOPC分化培地中で培養した細胞の3日後の画像の写真を示す。オリゴデンドロサイトと神経のバイオマーカーを用いて細胞を染色した。細胞は、OPC特異的バイオマーカーOLIG2と共に、OTX2およびNKX2-2を含む前部神経外胚葉（anterior neuroectoderm）バイオマーカーを発現している。NESTINおよびPDGFRa（それぞれ神経細胞および後期OPCのバイオマーカーである）は存在していない。KI67の発現は前駆細胞の増殖状態を示している。図10A～Bは、最適化されたOPC分化培地で培養した細胞の3日後のRNA-seqデータを示す。幹細胞遺伝子NANOGおよびPOU5F1の発現レベルは低下したが、脳領域およびオリゴデンドロサイト系統の初期発生に関与する遺伝子は上昇した。

発明の詳細な説明
本明細書には、小分子をベースとしたアプローチを用いて、化学的に規定された培養条件下でヒト多能性幹細胞からプレOPCおよびOPCを作製することを可能にする方法論ならびに組成物が記載される。本開示の方法は、出発多能性幹細胞が、多くの先行技術プロトコルによって採用されている神経誘導（neural induction）を経由しない、という利点を有する。これにより、プレOPCとOPCをわずか3日で作製することが可能となり、この日数は、プレOPCの作製に平均10日を要する現行のプロトコルと比べて、はるかに短くなっている。

実施例1に記載されるように、高次元実験計画（High-Dimensional Design of Experiments：HD-DoE）アプローチを使用して、複数のプロセス入力（例えば、小分子アゴニストまたはアンタゴニスト）を、遺伝子発現などの出力応答に関して同時に試験した。これらの実験により、プレOPCまたはOPCを極めて短時間で作製するのに十分な、特定のシグナル伝達経路のアゴニストおよび/またはアンタゴニストを含む、化学的に規定された培養培地を特定することができた。最適化された培養培地は、実施例2に記載されるように、個々のアゴニストまたはアンタゴニスト薬剤を除外したときの影響を調べる、因子重要度分析（factor criticality analysis）によってさらに検証された。この分化プロトコルによって作製された細胞の表現型は、実施例3に記載されるように、免疫組織化学でさらに確認された。

本発明の様々な局面について、以下のサブセクションでさらに詳しく説明する。

I. 細胞
本開示の培養で用いられる出発細胞は、ヒト多能性幹細胞である。本明細書で使用する用語「ヒト多能性幹細胞」（hPSCと略記）とは、様々な異なる細胞タイプに分化する能力があるヒト幹細胞を指す。本明細書で使用する用語「多能性」とは、異なる条件下で、3つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）に特徴的な細胞タイプに分化する能力がある細胞を指す。多能性細胞は、主として、例えばヌードマウスと奇形腫（テラトーマ）形成アッセイを用いて、3つ全ての胚葉に分化する能力によって特徴づけられる。多能性は胚性幹（ES）細胞マーカーの発現によって証明することもできるが、多能性についての好ましい試験は3つの胚葉のそれぞれの細胞に分化する能力を実証することである。

ヒト多能性幹細胞には、例えば、人工多能性幹細胞（iPSC）と、ES細胞株などのヒト胚性幹細胞とが含まれる。人工多能性幹細胞（iPSC）の非限定的な例としては、19-11-1、19-9-7または6-9-9細胞が挙げられる（例えば、Yu, J. et al. (2009) Science 324:797-801に記載される）。ヒト胚性幹細胞株の非限定的な例としては、ES03細胞（WiCell Research Institute）およびH9細胞（Thomson, J.A. et al. (1998) Science 282:1145-1147）が挙げられる。ヒト多能性幹細胞（PSC）は、細胞をPSCであると識別するために使用できる細胞マーカーを発現している。多能性幹細胞マーカーの非限定的な例には、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-54、SSEA1、SSEA3、SSEA4、CD9、CD24、OCT3、OCT4、NANOGおよび/またはSOX2が含まれる。本開示のプレOPCおよび/またはOPCを作製する方法は、出発多能性幹細胞集団を分化（成熟）させるために使用されるので、様々な態様では、本開示の方法によって作製されたプレOPCおよび/またはOPC細胞集団は、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-54、SSEA1、SSEA3、SSEA4、CD9、CD24、OCT3、OCT4、NANOGおよび/またはSOX2からなる群より選択される1つまたは複数の幹細胞マーカーの発現を欠いている。

多能性幹細胞は、本明細書に記載されるような、細胞分化を誘導する培養条件にさらされる。本明細書で使用する用語「分化」とは、細胞がより原始的な段階から、より成熟した（すなわち、より原始的でない）細胞へと発達することを指し、成熟した細胞は通常、特定の細胞系統に深く関わる表現型の特徴を示す。ヒトPSCから神経誘導（神経化）によって誘導され得る初期前駆細胞は、神経前駆細胞（NPC）である。本明細書で使用する「神経前駆細胞」または「NPC」とは、VI型中間径フィラメントタンパク質のネスチン（Nestin）を発現する幹細胞由来の前駆細胞を指す。本開示のプレOPCおよび/またはOPCを作製する方法は、神経誘導の使用を回避するためNPCを発生させないので、様々な態様では、本開示の方法によって作製された細胞集団はネスチン陽性細胞を欠いている。

一態様では、本開示の方法によって作製された細胞は、プレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）である。本明細書で使用する「プレオリゴデンドロサイト前駆細胞」または「プレOPC」とは、細胞マーカーOLIG2およびNKX2.2を発現する幹細胞由来の前駆細胞を指す。プレOPCは、OTX2（前部神経外胚葉バイオマーカー）、FEZF2（前部外胚葉バイオマーカー)、および/またはOLIG1を含むがこれらに限定されない、追加のマーカーを発現してもよい。

一態様では、本開示の方法によって作製された細胞は、プレOPCよりも分化した（より成熟した）細胞であるオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）である。本明細書で使用する「オリゴデンドロサイト前駆細胞」または「OPC」とは、細胞マーカーOLIG2およびNKX2.2だけでなく、PDGFRaも発現する幹細胞由来の前駆細胞を指す。OPCは追加のマーカーを発現してもよく、その非限定的な例としては、SOX10（神経堤マーカー）、OTX2（前部神経外胚葉バイオマーカー）、FEZF2（前部外胚葉バイオマーカー）、および/またはOLIG1が挙げられる。

本開示の方法によって作製されたプレOPCおよびOPCは、成熟オリゴデンドロサイト（OL）を作製するために、インビトロでさらに培養することができる。成熟OLのマーカーには、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）およびO4が含まれるが、これらに限定されない。

II. 培養培地の成分
プレOPCまたはOPCを作製するための本開示の方法は、ヒト多能性幹細胞を、外部から加えられた増殖因子を欠きかつ細胞シグナル伝達経路の特定のアゴニストおよび/またはアンタゴニストを含む培養培地中で培養する工程を含む。

実施例1に記載されるように、レチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニストおよびmTOR経路アゴニストを含む培養培地は、OLIG2およびNKX2.2を発現するプレOPCをわずか3日で作製するのに十分であった。追加の薬剤を含めることは、OPC分化のマーカーとしてのPDGFRaなどの、他のマーカーの発現を最適化した。他の態様では、該培養培地は、WNT経路アンタゴニスト、SHH経路アゴニスト、BMP経路アンタゴニストおよびPKC経路アンタゴニストからなる群より選択される少なくとも1つの追加の薬剤をさらに含む。一態様では、該培養培地はWNT経路アンタゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はSHH経路アゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はBMP経路アンタゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はPKC経路アンタゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はWNT経路アンタゴニストとSHH経路アゴニストをさらに含み、この場合、分化した細胞は、OLIG2とNKX2.2に加えて、OTX2およびFEZF2を発現する。

一態様では、培養培地は、レチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニスト、mTOR経路アゴニスト、WNT経路アンタゴニスト、SHH経路アゴニスト、BMP経路アンタゴニストおよびPKC経路アンタゴニストを含む。一態様では、分化した細胞は、少なくともOLIG2、NKX2.2およびPDGFRaを発現するOPCである（さらに、OTX2、FEZF2および/またはOLIG1などの、追加のマーカーを発現してもよい）。

本明細書で使用する場合、細胞シグナル伝達経路の「アゴニスト」とは、細胞シグナル伝達経路を刺激する（アップレギュレートする）薬剤を指すことが意図される。細胞シグナル伝達経路の刺激は、例えばシグナル伝達経路に関与する細胞表面受容体を活性化するアゴニストの使用によって、細胞外で開始され得る（例えば、そのアゴニストは受容体リガンドであってよい）。さらに、またはその代わりに、細胞シグナル伝達の刺激は、例えばシグナル伝達経路の構成因子（複数可）と細胞内で相互作用する小分子アゴニストの使用によって、細胞内で開始され得る。

本明細書で使用する場合、細胞シグナル伝達経路の「アンタゴニスト」とは、細胞シグナル伝達経路を阻害する（ダウンレギュレートする）薬剤を指すことが意図される。細胞シグナル伝達経路の阻害は、例えばシグナル伝達経路に関与する細胞表面受容体をブロックするアンタゴニストの使用によって、細胞外で開始され得る。さらに、またはその代わりに、細胞シグナル伝達の阻害は、例えばシグナル伝達経路の構成因子（複数可）と細胞内で相互作用する小分子アンタゴニストの使用によって、細胞内で開始され得る。

レチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニスト、mTOR経路アゴニスト、WNT経路アンタゴニスト、SHH経路アゴニスト、BMP経路アンタゴニストおよびPKC経路アンタゴニストは当技術分野で知られており、市販されている。それらは、培養培地中で、所望の結果、例えば注目のマーカーを発現するプレOPCおよび/またはOPCの生成、を達成するのに有効な濃度で使用される。適切なアゴニストおよびアンタゴニスト薬剤の非限定的な例、ならびに有効な濃度範囲については、以下でさらに説明する。

RA経路のアゴニストには、全トランス型レチノイン酸と9-シスレチノイン酸の両方によって活性化されるレチノイン酸受容体（RAR）を刺激できる薬剤、分子、化合物、または物質が含まれる。3つのRAR、すなわちRARα、RARβおよびRARγが存在し、それぞれRARA、RARB、RARG遺伝子によってコードされている。レチノイン酸経路を活性化できる種々のレチノイン酸アナログが合成されている。このような化合物の非限定的な例としては、TTNPB（RARα、βおよびγのアゴニスト）、AM 580（RARαアゴニスト）、CD 1530（強力かつ選択的なRARγアゴニスト）、CD 2314（選択的RARβアゴニスト）、Ch 55（強力なRARアゴニスト）、BMS 753（RARα選択的アゴニスト）、タザロテン（受容体選択的レチノイド；RARβおよびγに結合）、イソトレチノイン（レチノイン酸受容体の内因性アゴニスト；神経分化の誘導剤）、およびAC 261066（RARβ2アゴニスト）が挙げられる。いくつかの態様では、RAシグナル伝達経路アゴニストは、i）レチノイド化合物、ii）レチノイドX受容体（RXR）アゴニスト、およびiii）25レチノイン酸受容体（RAR）アゴニストからなる群より選択される。特定の態様では、RA経路アゴニストは、レチノイン酸、Sr11237、アダパレン、EC23、9-シスレチノイン酸、13-シスレチノイン酸、4-オキソレチノイン酸、および全トランス型レチノイン酸（ATRA）からなる群より選択される。

したがって、一態様では、RA経路アゴニストは、TTNPB、AM 580、CD 1530、CD 2314、Ch 55、BMS 753、タザロテン、イソトレチノイン、AC 261066、レチノイン酸（RA）、Sr11237、アダパレン、EC23、9-シスレチノイン酸、13-シスレチノイン酸、4-オキソレチノイン酸、および全トランス型レチノイン酸（ATRA）、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様では、RA経路アゴニストは、培養培地中に5～500mM、または10～100nM、または25～75nMの範囲内の濃度で存在する。一態様では、RA経路アゴニストはTTNPBである。一態様では、RA経路アゴニストはTTNPBであって、培養培地中に5～500nM、または10～100nM、または25～75nMの範囲内の濃度で存在する。一態様では、RA経路アゴニストはTTNPBであって、培養培地中に50nMの濃度で存在する。

Akt経路のアゴニストには、Akt1（PKBまたはRacPKとも称される）、Akt2（PKBβまたはRacPK-βとも称される）およびAkt3（PKBγまたはthyoma viral proto-oncogene 3とも称される）を含む、セリン/スレオニンキナーゼAktファミリーメンバーの1つまたは複数のシグナル伝達経路を刺激する（活性化する）ことができる薬剤、分子、化合物、または物質が含まれる。一態様では、Akt経路アゴニストは汎（pan）Akt活性化剤である。一態様では、汎Akt活性化剤はSC79である。一態様では、Akt経路アゴニストは、培養培地中に0.1～10μMの範囲内の濃度で存在する。一態様では、Akt経路アゴニストはSC79である。一態様では、Akt経路アゴニストはSC79であって、培養培地中に0.1～10μM、または0.5～5μM、または0.5～2.5μM、または0.5～1.5μMの濃度で存在する。一態様では、Akt経路アゴニストはSC79であって、培養培地中に1μMの濃度で存在する。

mTOR（mammalian target of rapamycin：哺乳類ラパマイシン標的）経路のアゴニストには、mTOR（mTORC1およびmTORC2複合体のコア成分であるPI3K関連キナーゼファミリーのメンバー）を介したシグナル伝達を刺激する（活性化する）ことができる薬剤、分子、化合物、または物質が含まれる。一態様では、mTOR経路アゴニストは、MHY1485、3BDO、サリドロシド、L-ロイシン、NV-5138、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様では、mTOR経路アゴニストは、培養培地中に0.1～10μM、または0.5～5μM、または0.5～2.5μM、または0.5～1.5μMの範囲内の濃度で存在する。一態様では、mTOR経路アゴニストはMHY1485である。一態様では、mTOR経路アゴニストはMHY1485であって、培養培地中に0.1～10μM、または0.5～5μM、または0.5～2.5μM、または0.5～1.5μMの濃度で存在する。一態様では、mTOR経路アゴニストはMHY1485であって、培養培地中に1μMの濃度で存在する。

WNT経路のアンタゴニストには、古典的（canonical）Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を阻害する（ダウンレギュレートする）ことができる薬剤、分子、化合物、または物質が含まれる；Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路は、生物学的には、Wntタンパク質リガンドがFrizzledファミリー受容体に結合することによって活性化される。一態様では、WNT経路アンタゴニストは、XAV939、ICG001、カプマチニブ、endo-IWR-1、IWP-2、IWP-4、MSAB、CCT251545、KY02111、NCB-0846、FH535、LF3、WIKI4、トリプトニド、KYA1797K、JW55、JW67、JW74、カルジオノーゲン1（Cardionogen 1）、NLS-StAx-h、TAK715、PNU 74654、iCRT3、WIF-1、DKK1、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様では、WNT経路アンタゴニストは、培養培地中に10～500nM、50～250nMまたは50～150nMの範囲内の濃度で存在する。一態様では、WNT経路アンタゴニストはXAV939である。一態様では、WNT経路アンタゴニストはXAV939であって、培養培地中に10～500nM、50～250nMまたは50～150nMの濃度で存在する。一態様では、WNT経路アンタゴニストはXAV939であって、培養培地中に100nMの濃度で存在する。

SHH（sonic hedgehog：ソニック・ヘッジホッグ）経路のアゴニストには、SHH経路を介したシグナル伝達を刺激する（活性化する）ことができる薬剤、分子、化合物、または物質が含まれる；SHH経路は、生物学的には、SHHのPatched-1（PTCH1）受容体への結合と、Smoothened（SMO）膜貫通タンパク質を介した伝達を含む。一態様では、SHH経路アゴニストは、パルモルファミン、GSA 10、SAG、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様では、SHH経路アゴニストは、培養培地中に100～1000nM、または250～750nM、または400～600nMの範囲内の濃度で存在する。一態様では、SHH経路アンタゴニストはパルモルファミンである。一態様では、SHH経路アンタゴニストはパルモルファミンであって、培養培地中に100～1000nM、または250～750nM、または400～600nMの濃度で存在する。一態様では、SHH経路アンタゴニストはパルモルファミンであって、培養培地中に500nMの濃度で存在する。

BMP（骨形成タンパク質）経路のアンタゴニストには、BMPシグナル伝達経路を阻害する（ダウンレギュレートする）ことができる薬剤、分子、化合物、または物質が含まれる；BMPシグナル伝達経路は、生物学的には、BMPのBMP受容体への結合によって活性化され、このBMP受容体は、アクチビン受容体様キナーゼ（ALK）（例えば、ALK2およびALK3を含むがこれらに限定されない、I型BMP受容体）である。一態様では、BMP経路アンタゴニストは、LDN193189、DMH1、DMH2、ドルソモルフィン、K02288、LDN214117、LDN212854、フォリスタチン、ML347、ノギン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様では、BMP経路アンタゴニストは、培養培地中に100～1000nM、150～750nM、100～500nM、または150～350nMの範囲内の濃度で存在する。一態様では、BMP経路アンタゴニストはLDN193189である。一態様では、BMP経路アンタゴニストはLDN193189であって、培養培地中に100～1000nM、150～750nM、100～500nM、または150～350nMの濃度で存在する。一態様では、BMP経路アンタゴニストはLDN193189であって、培養培地中に250nMの濃度で存在する。

PKC（プロテインキナーゼC）経路のアンタゴニストには、PKCシグナル伝達経路を阻害する（ダウンレギュレートする）ことができる薬剤、分子、化合物、または物質が含まれる；PKCシグナル伝達経路は、生物学的には、PKCファミリーのメンバーによって媒介される。セリン/スレオニンキナーゼのPKCファミリーには、アイソフォームα、β1、β2およびγを含む、「古典的」PKCサブカテゴリーを含めて、15のアイソザイムが含まれる。一態様では、PKC経路アンタゴニストは、PKCα、PKCβ1、PKCβ2およびPKCγから選択される少なくとも1つ（他の態様では、少なくとも2つまたは3つ）のPKC酵素の活性を阻害する。一態様では、PKC経路アンタゴニストは、Go 6983、ソトラスタウリン、エンザスタウリン、スタウロスポリン、LY31615、Go 6976、GF 109203X、Ro 31-8220メシラート、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一態様では、PKC経路アンタゴニストは、培養培地中に10～500nM、50～300nM、50～150nMまたは75～150nMの範囲内の濃度で存在する。一態様では、PKC経路アンタゴニストはGo 6983である。一態様では、PKC経路アンタゴニストはGo 6983であって、培養培地中に10～500nM、50～300nM、50～150nMまたは75～150nMの濃度で存在する。一態様では、PKC経路アンタゴニストはGo 6983であって、培養培地中に110nMの濃度で存在する。

III. 培養条件
上記サブセクションIIに記載した、化学的に規定され最適化された培養培地と組み合わせて、本開示のプレOPCおよびOPCを作製する方法は、細胞培養に関して当技術分野で確立された標準的な培養条件を利用する。例えば、5％O₂および5％CO₂の条件下に37℃で細胞を培養することができる。細胞は標準的な培養容器またはプレート、例えば96ウェルプレートで培養し得る。特定の態様では、出発多能性幹細胞は、好ましくはビトロネクチンなどの細胞外マトリックス材料でコーティングされた、プレートに接着される。一態様では、幹細胞はビトロネクチンコート済み培養表面（例えば、ビトロネクチンコート済み96ウェルプレート）上で培養される。

多能性幹細胞は、分化に先立って、市販の培地で培養することができる。例えば、幹細胞を、分化プロトコルの開始前に、Essential 8 Flex培地（Thermo Fisher＃A2858501）で少なくとも1日間培養し得る。非限定的な例示的態様では、幹細胞をビトロネクチン（Thermo Fisher＃A14700）コート済み96ウェルプレートに150,000細胞/cm2の密度で継代培養し、分化に先立ってEssential 8 Flex培地で1日間培養する。

分化プロトコルを開始するには、幹細胞が培養されている培地を、基礎分化培地に交換するが、基礎分化培地は、サブセクションIIで上述したようなシグナル伝達経路のアゴニストおよび/またはアンタゴニストが補充されたものである。基礎分化培地は、例えば、細胞の生存と増殖を維持するのに必要な追加の標準培地成分を補充した市販の基本培地を含み得るが、血清（基礎分化培地は無血清培地である）または他の外部から加えられた増殖因子、例えばFGF2、PDGF、IGF、HGFなどを欠いている。非限定的な例示的態様では、基礎分化培地は、1×IMDM（Thermo Fisher＃12440046）、1×F12（Thermo Fisher＃11765047）、1mg/mlのポリ(ビニルアルコール)（Sigma＃p8136）、1％の化学的組成が明確な脂質濃縮液（Thermo Fisher＃11905031）、450μMの1-チオグリセロール（Sigma＃M6145）、0.7μg/mlのインスリン（Sigma＃11376497001）、および15μg/mlのトランスフェリン（Sigma＃10652202001）を含有する。

培養培地は通常、定期的に新鮮な培地に交換される。例えば、一態様では、培地を24時間ごとに交換する。

プレOPCおよび/またはOPCを作製するには、幹細胞を、最適化された培養培地中で、細胞の分化とプレOPCまたはOPC関連マーカーの発現にとって十分な時間にわたり培養する。実施例に記載されるように、最適化された培養培地中で幹細胞をわずか72時間（3日間）培養することで、プレOPCおよびOPCへと分化させるのに十分であることが判明した。したがって、一態様では、細胞は少なくとも72時間培養される。他の態様では、細胞を少なくとも60、64、68、72、76、80、84、88、92または96時間培養する。他の態様では、細胞を少なくとも2.5、3、3.5、4、4.5または5日間培養する。

IV. 用途
プレOPCおよびOPCを作製するための本開示の方法および組成物は、これらの細胞集団を様々な用途に効率的かつロバストに利用することを可能にする。例えば、これらの方法および組成物は、オリゴデンドロサイト関連の疾患および障害の理解を助けるために、オリゴデンドロサイトの発生と生物学の研究に用いることができる。例えば、本開示の方法を用いて作製されたプレOPCおよび/またはOPCは、その細胞上に発現された表面マーカーに結合する薬剤を用いて、当技術分野で確立された方法に従ってさらに精製することができる。したがって、一態様では、本開示は、プレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を単離する方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む：
本開示の方法によって作製された、OLIG2を発現するプレOPCまたはOPCを、プレOPCまたはOPCによって発現された細胞表面マーカーに結合する少なくとも1つの結合剤と接触させる工程；および
該結合剤に結合する細胞を単離し、それによってプレOPCまたはOPCを単離する工程。

一態様では、該結合剤は抗体であり、例えば、細胞表面マーカーに結合するモノクローナル抗体（mAb）である。適切なOPC細胞表面マーカーの非限定的な例には、PDGFRa、O4およびA2B5が含まれる。該抗体に結合している細胞は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）および磁気活性化セルソーティング（MACS）を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の方法によって単離され得る。

オリゴデンドロサイト系統の前駆細胞はまた、オリゴデンドロサイト関連の疾患または障害がある対象に該細胞を送達することによって、様々な疾患および障害の治療に使用することも企図される。オリゴデンドロサイト関連の疾患および障害の例には、多発性硬化症（MS）、進行性多巣性白質脳症、脳室周囲白質軟化症、ある種の大脳白質萎縮症、および筋萎縮性側索硬化症（ALS）が含まれるが、これらに限定されない。

V. 組成物
他の局面において、本開示は、培養培地および細胞培養物、ならびに単離された前駆細胞および細胞集団を含めて、プレOPCおよびOPCの作製方法に関連する組成物を提供する。

一局面において、本開示は、外部から加えられた増殖因子を欠き、かつレチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニストおよびmTOR経路アゴニストを含む、プレOPCまたはOPCを得るための培養培地を提供する。一態様では、該培養培地はWNT経路アンタゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はSHH経路アゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はWNT経路アンタゴニストとSHH経路アゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はBMP経路アンタゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はPKC経路アンタゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はBMP経路アンタゴニストとPKC経路アンタゴニストをさらに含む。一態様では、該培養培地はレチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニスト、mTOR経路アゴニスト、WNT経路アンタゴニスト、SHH経路アゴニスト、BMP経路アンタゴニスト、およびPKC経路アンタゴニストを含む。

一局面において、本開示は、プレOPCまたはOPCの単離された細胞培養物を提供し、この培養物は、以下を含む：レチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニストおよびmTOR経路アゴニストを含みかつ外部から加えられた増殖因子を欠く培養培地中で培養された、OLIG2を発現するプレOPCまたはOPC。様々な態様では、該培養培地はまた、WNT経路アンタゴニスト、SHH経路アゴニスト、BMP経路アンタゴニストおよび/またはPKC経路アンタゴニストを含み得る。一態様では、プレOPCまたはOPCはNKX2.2も発現する。他の態様では、プレOPCまたはOPCはまた、OTX2およびFEZF2を発現する。一態様では、プレOPCまたはOPCは、ビトロネクチンコート済みプレートに付着されている。

別の局面において、本開示は、本開示の分化方法によって作製されたプレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を提供する。一態様では、本開示は、非天然のプレOPCまたはOPCを含む組成物を提供し、ここで、プレOPCまたはOPCは、OLIG2、NKX2-2、OTX2およびFEZF2を発現しており、かつNESTINの発現を欠いている。別の態様では、本開示は、少なくとも1×10⁶個のOLIG2およびNKX2.2を発現するプレOPCまたはOPCを含む、プレOPCまたはOPCの単離された細胞集団を提供し、ここで、該細胞集団はNESTINを発現する神経幹細胞を欠いている。他の態様では、該細胞集団は、少なくとも5×10⁶個、1×10⁷個、5×10⁷個、1×10⁸個、5×10⁸個または1×10⁹個のOLIG2およびNKX2.2を発現するプレOPCまたはOPCを含む。単離された細胞集団の一態様では、プレOPCまたはOPCは、プレOPCまたはOPCによって発現された少なくとも1つの細胞表面マーカーに結合する少なくとも1つの抗体と結合している。適切なOPC細胞表面マーカーの非限定的な例には、PDGFRa、O4およびA2B5が含まれる。

本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、実施例はさらなる限定として解釈されるべきではない。図面ならびに本出願を通じて引用された全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。

実施例1：幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を作製するための培養プロトコルの開発
この実施例では、オリゴデンドロサイト前駆細胞を作製するための培養培地のレシピが開発された；この培地レシピは、ヒト多能性幹細胞を、培養3日後に、NKX2-2およびOLIG2を発現するオリゴデンドロサイト前駆細胞へと分化させるように誘導することができる。これらの細胞は、成熟オリゴデンドロサイトへとさらに分化させることが可能である。

この実施例では、Bukys et al. (2020) Iscience 23:101346に以前に記載されたような、高次元実験計画（HD-DoE）法を利用する。この方法は、複数のプロセス入力を同時に試験するためにコンピュータ化された設計ジオメトリ（design geometry）を採用し、ディープなエフェクター/応答空間の数学的モデリングを提供する。この方法により、細胞分化などの複雑なプロセスを制御する、組み合わせ可能なシグナル伝達入力を見つけることが可能である。これにより、複数の妥当性のある重要なプロセスパラメータの試験が可能になるが、それは、このようなパラメータが遺伝子発現などの出力応答に影響を与えるためである。遺伝子発現は、例えばヒト細胞の、表現型の顕著な特徴を提供するので、この方法を適用することで、どのシグナル伝達経路が細胞の運命を制御しているかを特定し、理解することができる。この実施例では、多能性幹細胞の状態から直接、オリゴデンドロサイト前駆細胞が発現する遺伝子を誘導する条件を見つけることを目的として、HD-DOE法が適用された。

具体的には、オリゴデンドロサイトを作製する新規な方法を開発するために、複数のシグナル伝達経路のアゴニストとアンタゴニスト（本明細書ではエフェクターと呼ばれる）が、3日間の処理後に2セットの予め選択された53個の遺伝子の発現に及ぼす影響を試験された。これらのエフェクターは、幹細胞を特定の運命に段階的に分化させる際によく用いられる小分子である。エフェクターの選択は、前部外胚葉での神経誘導および幹細胞からオリゴデンドロサイトへの分化に関する最新の文献に基づいていた。

HD-DoE ＃1
エフェクターを試験するために、少なくとも8つの因子を用いる実験を計画設計した；この実験では、ある範囲の濃度のエフェクターの48以上の異なる組み合わせに対する細胞の応答を評価することができる。このモデルを解析するために、本発明者らは、NKX2-2、OLIG2、OLIG1、PDGFRAなど、前部神経外胚葉およびオリゴデンドロサイトの初期発生中に発現される遺伝子の発現に焦点を当てた。各エフェクターが遺伝子発現レベルに与える影響は、モデリング中に各エフェクターについて計算される因子寄与（factor contribution）と呼ばれるパラメータによって定義される。

図1にまとめた結果に示されるように、1つのモデルは、NKX2-2の発現が12480.6と最大になるように最適化された場合、NKX2-2およびOLIG2遺伝子のアップレギュレーションに関して有望な結果を明確に示した。このモデルでは8つの因子を試験した：PD0325901、MK2206、TTNPB、SC79、MHY1485、ZM336372、AGN193109、およびAZD3147。

試験した8つの因子のうち、3つの因子、すなわちTTNPB（レチノイン酸経路のアゴニスト）、SC79（Aktシグナル伝達経路のアゴニスト）、およびMHY1485（mTORシグナル伝達経路のアゴニスト）は、標的遺伝子の発現に対して顕著なプラスの影響を及ぼした；TTNPBは31.3の因子寄与で最も大きな影響を与え、MHY1485は13.8、SC79は1.47の因子寄与であった。これらの因子は、NKX2-2およびOLIG2の発現を大幅に上昇させることができた。OLIG1およびPDGFRAは、オリゴデンドロサイトの分化期間中の遺伝子発現パターンに適合する平均的な発現レベル（それぞれ129.9および346.45）を有していた。

図2にまとめた結果に示されるように、このモデルでのPDGFRAの正規化された発現は、832.9にまで達することができ、全モデルの中で最も高い発現レベルであった；それゆえ、このモデルもPDGFRAの発現が最大となるように最適化された。この設定は、TTNPB（レチノイン酸経路のアゴニスト）およびMHY1485（mTORシグナル伝達経路のアゴニスト）も、それぞれ49.01および13.4の因子寄与で、PGFRAのアップレギュレーションにプラスの影響を及ぼすことを示した。また、PD0325901がこの遺伝子に対して30.6の因子寄与で顕著なプラスの影響を及ぼし得ることも観察された。ZM336372の因子寄与が低かった（＜1）ため、この因子は培地レシピに含めなかった。この条件では、OLIG1の平均的な発現レベルは228.36であり、NKX2-2の最適化条件と同様であった。この条件での1つの違いは、OLIG2遺伝子が前の条件での1049.4から241.9にダウンレギュレートされたことである。

図3にまとめた結果に示されるように、NKX2-2、OLIG2またはPDGFRAの発現レベルに対してプラスの寄与を有するエフェクターのうち、2つの因子はNKX2-2およびOLIG2の発現レベルにマイナスの影響を与えていた。したがって、これら2つの因子、PD0325901とZM336372を、オリゴデンドロサイト分化の培地レシピの候補リストから除外した。

したがって、この最初のHD-DoEスクリーニングでは、外部から加えられた増殖因子を欠き、かつレチノイン酸経路のアゴニスト、Aktシグナル伝達経路のアゴニストおよびmTORシグナル伝達経路のアゴニストを含む培養培地が、3日間（72時間）の培養後に、多能性幹細胞から、OLIG2を発現するOPCを生成させるのに十分であるとして特定された。

HD-DoE ＃2
多能性からのオリゴデンドロサイト分化の条件をさらに高めるために、本発明者らは、追加のHD-DoE実験を行った。本発明者らは追加の遺伝子制御モデルを入手し、これを分化プロトコルの準備のために使用した。これの基礎は、前部神経外胚葉への細胞分化の開始に焦点を当てた13因子のHD-DoE実験であった。このモデルでは、FEZF2とOTX2の発現に重点が置かれた。

図4にまとめた結果に示されるように、このモデルは、OTX2の発現が12755.9と最高になるように最適化された。OTX2のこの高発現モデルによると、MK2206、PD0325901、CHIR99021、LDN193189、Go6983、PD173074およびBLU9931を含む7つのエフェクターはプラスの寄与を有し、MK2206の因子寄与が22.2と最も高く、PD173074とBLU9931の因子寄与が1.7と最も低かった。

図5にまとめた結果に示されるように、このモデルは、FEZF2の発現が4466と最高になるように最適化された。FEZF2の発現レベルが最大となるようにモデルが最適化された場合、因子寄与が19.5のLDN193189、因子寄与が14.6のPD0325901、および因子寄与が12.3のMK2206を含む3つのエフェクターは前の条件と共通しており、パルモルファミン-500nM、XAV939およびSC79を含む3つの新しいエフェクターが導入された。

図6にまとめた結果に示されるように、このレシピを微調整し、かつOTX2とFEZF2の両方を高発現させるための最適な因子の組み合わせを見つけるために、動的プロファイリング解析を行った。この解析によると、XAV939（WNTシグナル伝達経路の阻害剤）とパルモルファミン（SHHシグナル伝達経路のアゴニストであり、脳の領域の発生過程で細胞を腹側化することが知られている）は、FEZF2の発現に顕著なプラスの影響を及ぼし、OTX2の発現レベルにはマイナスの影響を及ぼさなかった。したがって、これら2つの因子を最適化された培地レシピに加えた。

OPC関連表面マーカーの発現を促進する因子を含めることに加え、そのようなマーカーの発現を阻害する特定の因子を、最適化された培地レシピから除外した。WNTシグナル伝達経路のアゴニストであるCHIR99021は除外された。MK2206とPD0325901も除外されたが、8因子モデルによると、それらはオリゴデンドロサイト遺伝子の発現にマイナスの影響を及ぼしたためである。PD173074とBLU9931もまた、因子寄与が1.7と低かったため除外された。

まとめ
両モデルを考慮して、ヒト人工多能性幹細胞の、OTX2、FEZF2、NKX2-2およびOLIG2の発現上昇につながるオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）のアイデンティティ（identity）を持つ細胞への分化を最大化する培養条件には、以下のエフェクター入力が含まれていた：TTNPB（RA経路アゴニスト）、SC79（Akt経路アゴニスト）、MHY1485（mTOR経路アゴニスト）、パルモルファミン（SHH経路アゴニスト）、XAV939（WNT経路アンタゴニスト）、LDN193189（BMP経路アンタゴニスト）およびGo6983（PKC経路アンタゴニスト）。

実施例2： OPCを誘導する培養条件の因子重要度分析
実施例1に記載の最適化された培養培地中の各成分の因子重要度（factor criticality）を評価するために、個々のエフェクターを除外して、他のエフェクターを存在させた条件下で、結果のインシリコ（in-silico）予測解析を行った。そのために、本発明者らは、各因子の非存在下での注目の遺伝子の発現レベルを比較しながら、セットポイントでの動的プロファイル解析を使用した。注目の遺伝子の発現は、望ましい結果に到達できるかどうかを明らかにするので、この因子重要度分析は各入力エフェクターの重要性の程度を明らかにした。

図7A～Dは、エフェクターであるTTNPB（RA経路アゴニスト）、SC79（Akt経路アゴニスト）およびMHY1485（mTOR経路アゴニスト）の因子重要度分析の結果をまとめたものである。図7Aは、NKX2-2の発現が最大となるようにモデルが最適化された場合の、TTNPB、MHY1485およびSC79の存在下での注目のOPC遺伝子の発現レベルを示す。図7Bに示されるように、TTNPBを除去すると、NKX2-2、OLIG2およびPDGFRAの予測発現レベルは、NKX2-2が12000超から4500に、OLIG2が1000から400に、PDGFRAが350から100未満に大幅に低下した。この結果は、RA経路アゴニストが除去されると、全ての望ましいマーカーの発現に著しい悪影響があることを意味している。図7Cに示されるように、MHY1485を除去すると、この場合も発現レベルが低下したが、前の条件ほど急激ではなかった。図7Dに示されるように、SC79を除去した場合には、プロットのわずかなシフトのみが観察され、このことは、OPCマーカーの誘導を最大にするために、この因子がTTNPBおよびMHY1485ほど重要ではないことを示唆している。

図8A～Dは、エフェクターであるパルモルファミン（SHH経路アゴニスト）、XAV939（WNT経路アンタゴニスト）、LDN193189（BMP経路アンタゴニスト）およびGo6983（PKC経路アンタゴニスト）の因子重要度分析の結果をまとめたものである。脳の前部領域へのオリゴデンドロサイト集団の望ましいパターン形成を達成するために、これらの追加の因子入力が、FEZF2およびOTX2などに、クエリ（query）された。FEZF2の発現が最大となるようにモデルが最適化された場合に、LDN193189、XAV、パルモルファミンまたはGo6983のいずれかの非存在下でFEZF2およびOTX2の発現レベルを調べた。最も顕著な変化はLDN193189の非存在下で観察され、FEZF2の発現がほぼ50％（4500から2500に）低下した。OTX2の発現も9000から7000に低下し、これは4つ全ての除外プロセスにおいて最低であった。XAV939とパルモルファミンを除去すると、FEZF2の発現レベルはそれぞれ3000および3500に低下したが、OTX2の発現はいずれの場合もほんのわずかに高かった。Go6983を除去した場合には、注目の遺伝子の発現レベルに有意な変化が観察されなかったことから、Go6983はFEZF2とOTX2の制御に関連して任意であることが示唆された。

実施例3：幹細胞由来OPCの免疫細胞化学的検証
実施例1に記載の最適化された培養培地をさらに検証するために、最適化された培地で細胞を3日間培養し、免疫細胞化学を用いて前部神経外胚葉とオリゴデンドロサイト前駆細胞のバイオマーカーの発現を評価した。バイオマーカーには、OTX2と、NKX2-2、OLIG2、PDGFなどのオリゴデンドロサイト前駆細胞バイオマーカーが含まれていた。神経幹細胞とオリゴデンドロサイト前駆細胞とを区別するために、初期の神経細胞マーカーであるネスチンを使用した。誘導後の細胞の増殖を確認するために、Ki67も使用した。代表的な免疫組織化学の結果を図9に示す。これらの免疫細胞化学の画像から、ほとんどの細胞がOTX2を発現していることが確認された。しかし、神経細胞のバイオマーカーであるネスチンの痕跡は検出されず、分化したOPC集団は神経幹細胞を欠いていることが確認された。OLIG2とNKX2-2の発現もまた、90％超の細胞で観察され、それによって細胞のオリゴデンドロサイト系統が確認された。どの細胞もPDGFRを発現しなかったが、これは、この遺伝子がオリゴデンドロサイトの分化の後期段階で発現されるため予想されたことである。

実施例4：幹細胞由来プレOPCのRNA-seq検証
実施例1および2に詳述した分化培地で培養した細胞の遺伝子プロファイルを得るために、RNAシーケンシングを使用した。hiPSCを該培地中で3日間培養し、得られた細胞からのRNAを標準的なRNA-seq解析によって配列決定した。図10Aの結果は、0日目と3日目の3回の反復実験における、脳の様々な領域、初期オリゴデンドロサイトアイデンティティ（NKX2-2、OLIG2、PDGFRa）、および幹細胞状態（NANOG、POU5F1）を代表する選択された遺伝子の正規化発現レベルを示している。その結果から、プレOPC細胞では幹細胞遺伝子のレベルが低下した一方で、オリゴデンドロサイト遺伝子のレベルは上昇したことが実証され、これによって分化培地を用いたhiPSCのオリゴデンドロサイト系統への分化が検証された。図10Bの結果は、選択された遺伝子の差次的発現と倍率変化を示しており、HOXA1が最高レベル（15）で、OLIG2、NKX2-2およびPDGFRaは5であった。このデータは、細胞をオリゴデンドロサイトアイデンティティに向けて誘導する際の第1段階の培地として開発されたレシピの能力を実証している。

均等物
当業者は、本明細書に記載された本発明の具体的な態様の多くの均等物を認識したり、日常的な実験だけを用いて確認したりすることができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。

Claims

以下の工程を含む、ヒトプレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を作製する方法：
OLIG2を発現するプレOPCまたはOPCが生成されるように、ヒト多能性幹細胞を、外部から加えられた増殖因子を欠きかつレチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニストおよびmTOR経路アゴニストを含む培養培地中で培養する工程。
ヒト多能性幹細胞が人工多能性幹細胞（iPSC）である、請求項1に記載の方法。
ヒト多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項1に記載の方法。
OLIG2を発現するプレOPCまたはOPCが、前記培養培地中でヒト多能性幹細胞の培養を開始してから72時間以内に生成される、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
プレOPCまたはOPCがNKX2-2も発現する、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
ヒト多能性幹細胞が、培養の間中、ビトロネクチンでコーティングされたプレートに付着されている、請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
RA経路アゴニストが、TTNPB、AM 580、CD 1530、CD 2314、Ch 55、BMS 753、タザロテン、イソトレチノイン、AC 261066、レチノイン酸（RA）、Sr11237、アダパレン、EC23、9-シスレチノイン酸、13-シスレチノイン酸、4-オキソレチノイン酸、全トランス型レチノイン酸（ATRA）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
RA経路アゴニストが、前記培養培地中に10～100nMの範囲内の濃度で存在する、請求項7に記載の方法。
RA経路アゴニストがTTNPBであり、前記培養培地中に50nMの濃度で存在する、請求項8に記載の方法。
Akt経路アゴニストがSC79である、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
SC79が、前記培養培地中に0.1～10μMの範囲内の濃度で存在する、請求項10に記載の方法。
SC79が、前記培養培地中に1μMの濃度で存在する、請求項10に記載の方法。
mTOR経路アゴニストが、MHY1485、3BDO、サリドロシド、L-ロイシン、NV-5138、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
mTOR経路アゴニストが、前記培養培地中に0.1～10μMの範囲内の濃度で存在する、請求項13に記載の方法。
mTOR経路アゴニストがMHY1485であり、前記培養培地中に1μMの濃度で存在する、請求項14に記載の方法。
前記培養培地が、WNT経路アンタゴニストおよびSHH経路アゴニストをさらに含む、請求項1～15のいずれか一項に記載の方法。
WNT経路アンタゴニストが、XAV939、ICG001、カプマチニブ、endo-IWR-1、IWP-2、IWP-4、MSAB、CCT251545、KY02111、NCB-0846、FH535、LF3、WIKI4、トリプトニド、KYA1797K、JW55、JW67、JW74、カルジオノーゲン1（Cardionogen 1）、NLS-StAx-h、TAK715、PNU 74654、iCRT3、WIF-1、DKK1、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
WNT経路アンタゴニストが、前記培養培地中に50～150nMの範囲内の濃度で存在する、請求項17に記載の方法。
WNT経路アンタゴニストがXAV939であり、前記培養培地中に100nMの濃度で存在する、請求項18に記載の方法。
SHH経路アゴニストが、パルモルファミン、GSA 10、SAG、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
SHH経路アゴニストが、前記培養培地中に250～750nMの範囲内の濃度で存在する、請求項20に記載の方法。
SHH経路アンタゴニストがパルモルファミンであり、前記培養培地中に500nMの濃度で存在する、請求項21記載の方法。
前記培養培地がBMP経路アンタゴニストをさらに含む、請求項1～22のいずれか一項に記載の方法。
BMP経路アンタゴニストが、LDN193189、DMH1、DMH2、ドルソモルフィン、K02288、LDN214117、LDN212854、フォリスタチン、ML347、ノギン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項23に記載の方法。
BMP経路アンタゴニストが、前記培養培地中に100～500nMの範囲内の濃度で存在する、請求項24に記載の方法。
BMP経路アンタゴニストがLDN193189であり、前記培養培地中に250nMの濃度で存在する、請求項25に記載の方法。
前記培養培地がPKC経路アンタゴニストをさらに含む、請求項1～26のいずれか一項に記載の方法。
PKC経路アンタゴニストが、Go 6983、ソトラスタウリン、エンザスタウリン、スタウロスポリン、LY31615、Go 6976、GF 109203X、Ro 31-8220メシラート、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
PKC経路アンタゴニストが、前記培養培地中に50～150nMの範囲内の濃度で存在する、請求項28に記載の方法。
PKC経路アンタゴニストがGo6983であり、前記培養培地中に110nMの濃度で存在する、請求項29に記載の方法。
以下の工程を含む、ヒトプレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を作製する方法：
OLIG2を発現するプレOPCまたはOPCが生成されるように、ヒト多能性幹細胞を、外部から加えられた増殖因子を欠きかつレチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニスト、mTOR経路アゴニスト、WNT経路アンタゴニスト、SHH経路アゴニスト、BMP経路アンタゴニスト、およびPKC経路アンタゴニストを含む培養培地中で培養する工程。
レチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニストおよびmTOR経路アゴニストを含み、かつ外部から加えられた増殖因子を欠く、プレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を得るための培養培地。
WNT経路アンタゴニストおよびSHH経路アゴニストをさらに含む、請求項32に記載の培養培地。
BMP経路アンタゴニストおよびPKC経路アンタゴニストをさらに含む、請求項33に記載の培養培地。
プレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）の単離された細胞培養物であって、レチノイン酸（RA）経路アゴニスト、Akt経路アゴニストおよびmTOR経路アゴニストを含みかつ外部から加えられた増殖因子を欠く培養培地中で培養された、OLIG2を発現するプレOPCまたはOPCを含む、該単離された細胞培養物。
前記培養培地がWNT経路アンタゴニストおよびSHH経路アゴニストをさらに含み、プレOPCまたはOPCがOTX2およびFEZF2も発現する、請求項35に記載の単離された細胞培養物。
前記培養培地がBMP経路アンタゴニストおよびPKC経路アンタゴニストをさらに含む、請求項35または36に記載の単離された細胞培養物。
プレOPCまたはOPCが、ビトロネクチンでコーティングされたプレートに付着されている、請求項35～37のいずれか一項に記載の単離された細胞培養物。
請求項1～32のいずれか一項に記載の方法により作製された、プレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）。
非天然のプレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を含む組成物であって、プレOPCまたはOPCがOLIG2、NKX2-2、OTX2およびFEZF2を発現しており、かつNESTINの発現を欠いている、該組成物。
少なくとも1×10⁶個の、OLIG2を発現するプレオリゴデンドロサイト前駆細胞（プレOPC）またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）を含む、プレOPCまたはOPCの単離された細胞集団であって、NESTINを発現する神経幹細胞を欠いている、該単離された細胞集団。
プレOPCまたはOPCがNKX2-2、OTX2およびFEZF2も発現する、請求項41に記載の単離された細胞集団。
プレOPCまたはOPCが、プレOPCまたはOPCによって発現される少なくとも1つのマーカーに結合する少なくとも1つの抗体と結合されている、請求項41または42に記載の単離された細胞集団。