JP2024508910A - がん療法におけるフェロトーシスを標的とするためのジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ｄｈｏｄｈ）阻害剤の使用 - Google Patents

がん療法におけるフェロトーシスを標的とするためのジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ｄｈｏｄｈ）阻害剤の使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、がんを治療するための方法であって、その治療を必要とする対象に、治療有効量のジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤を投与することを含み、がんは、対照試料と比較して、変化したグルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）発現を有する、方法を提供する。本開示はまた、対象のＧＰＸ４発現が対照試料と比較して低い場合にはジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤により、または対象のＧＰＸ４発現が対照試料と比較して高い場合にはＤＨＯＤＨ阻害剤及びフェロトーシス誘導剤により、対象を治療する方法を提供する。【選択図】図１－１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月３日に出願された米国仮出願第６３／１５６，１７９号の優先権の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＣＡ１８１１９６に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
参照による配列表の組み込み
本願と共に出願され、電子的に提出された配列表の内容（名称：４４４３＿００１ＰＣ０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５、サイズ：４，８１２バイト、及び作成日：２０２２年２月２４日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
フェロトーシスは、過剰な脂質過酸化によって誘導される非アポトーシス細胞死の一形態である（Ｄｉｘｏｎ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４９，１０６０－１０７２（２０１２）、Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７１，２７３－２８５（２０１７））。細胞は、フェロトーシスを抑制するために少なくとも２つの防御機構を進化させている。第１に、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を利用して、脂質ヒドロペルオキシドを解毒し、フェロトーシスを阻害する（Ｊｉａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０，５７－６２（２０１５）、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０，１１８１－１１９２（２０１８））。ほとんどのがん細胞は、ＧＳＨ生合成のためのシステインを得るために、溶質キャリアファミリー７メンバー１１（ＳＬＣ７Ａ１１）によって媒介されるシスチン輸送に依存する（Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５６，３１７－３３１（２０１４））。ＳＬＣ７Ａ１１－ＧＰＸ４シグナル伝達軸は、フェロトーシスに対する主要な細胞防御システムを表し、対応するフェロトーシス誘導剤によるＧＰＸ４またはＳＬＣ７Ａ１１の不活性化は、多くのがん細胞においてフェロトーシスを誘導する（Ｄｉｘｏｎ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４９，１０６０－１０７２（２０１２）Ｊｉａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０，５７－６２（２０１５）、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０，１１８１－１１９２（２０１８））。第２に、フェロトーシス抑制タンパク質１（ＦＳＰ１。ＡＩＦＭ２とも呼ばれる）は、フェロトーシスを抑制するためにＧＰＸ４と並行して作用する別のフェロトーシス阻害剤として機能する。機械的に、ＦＳＰ１は、主に形質膜上に局在するオキシドレダクターゼとして機能し、ユビキノン（ＣｏＱ）をユビキノール（ＣｏＱＨ２）に還元し、次に、脂質ヒドロペルオキシドを解毒する親油性ラジカル捕捉酸化防止剤（ＲＴＡ）として機能する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ Ａｎｇｅｌｉ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６，１１８０－１１９１（２０１４）、Ｂｅｒｓｕｋｅｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７５，６８８－６９２（２０１９））。他の細胞下区画にフェロトーシスに対する追加の細胞防御機構が存在するか否かは不明である。
フェロトーシスは、最近、重要な腫瘍抑制機構として出現している（Ｄｉｘｏｎ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４９，１０６０－１０７２（２０１２）、Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７１，２７３－２８５（２０１７）、Ｄｏｌｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７５，６９３－６９８（２０１９）、Ｋｏｐｐｕｌａ，Ｐ．，Ｚｈｕａｎｇ，Ｌ．＆Ｇａｎ，Ｂ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ（２０２０））。しかしながら、がん療法におけるフェロトーシスを標的とする能力は、フェロトーシス機構の不完全な理解によって妨げられる。さらに、腫瘍抑制におけるフェロトーシスの役割の新たな理解にもかかわらず、フェロトーシス及び／または合理的な薬物併用戦略の治療的標的化のための特定の状況を特定するための重要な必要性が存在する。
本明細書に記載される場合、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）は、とりわけ、ＧＰＸ４及びＦＳＰ１から独立して、ミトコンドリア内で作動するフェロトーシス防御機構である。ＤＨＯＤＨの阻害は、フェロトーシスの治療的標的化及び合理的な併用薬物の設計のための手段を提供する。本明細書に記載されるように、ＧＰＸ４ｌｏｗ固形腫瘍のアレイは、ＤＨＯＤＨ阻害剤によって効果的に標的化されて、腫瘍負荷を軽減することができ、また、限定されないが、スルファサラジンを含むフェロトーシス誘導剤とのＤＨＯＤＨ阻害剤の組み合わせを使用して、ＧＰＸ４ｈｉｇｈ固形腫瘍を治療することができる。
本開示は、がんを治療するための方法であって、その治療を必要とする対象に、治療有効量のジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤を投与することを含み、がんは、対照試料と比較して、変化したグルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）発現を有する、方法を提供する。
本明細書に記載の方法の態様では、変化したＧＰＸ４発現は、対照試料と比較して、ＧＰＸ４の低い発現レベルである。いくつかの態様では、がんは、腫瘍である。いくつかの態様では、腫瘍は、癌腫である。いくつかの態様では、がんは、再発性、難治性、または少なくとも１つの抗がん剤の投与を含む少なくとも１つの事前の療法後に難治性である。いくつかの態様では、がんは、線維肉腫、肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、腎細胞癌、乳房腺癌、結腸直腸腺癌、子宮頸管内膜腺癌、またはＴ急性リンパ芽球性白血病から選択される。
いくつかの態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤は、Ａｇ－６３６、ＡＳＬＡＮ００３、ＢＡＹ２４０２２３４、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、ＩＭＵ－８３８、ＰＰ－００１、ＰＴＣ２９９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、ＤＨＯＤＨ阻害物質は、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本明細書に記載の方法の態様では、変化したＧＰＸ４発現は、対照試料と比較して、ＧＰＸ４の高い発現レベルである。いくつかの態様では、がんは、腫瘍である。いくつかの態様では、腫瘍は、癌腫である。いくつかの態様では、がんは、再発性、難治性、または少なくとも１つの抗がん剤の投与を含む少なくとも１つの事前の療法後に難治性である。いくつかの態様では、がんは、線維肉腫、肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、腎細胞癌、乳房腺癌、結腸直腸腺癌、子宮頸管内膜腺癌、またはＴ急性リンパ芽球性白血病から選択される。
本明細書に記載の方法の態様では、方法は、治療有効量のフェロトーシス誘導剤を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、フェロトーシス誘導剤は、クラスＩフェロトーシス誘導剤、クラスＩＩフェロトーシス誘導剤、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様では、フェロトーシス誘導剤は、スルファサラジン、ロシグリタゾン、マレイン酸ロシグリタゾン、バルドキソロンメチル、リナグリプチン、クルクミン、ジレウトン、ピオグリタゾンＨＣｌ、ノルディヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）、トログリタゾン、セタナキシブ、メシル酸デフェロキサミン、トシル酸ソラフェニブ、シスプラチン、ロサデュスタット、ラパチニブ、シンバスタチン、デフェラシロックス、ソラフェニブ、エラスチン、イミダゾールケトンエラスチン、ＲＳＬ３、（１Ｓ，３Ｒ）－ＲＳＬ３、ＭＬ２１０、ＭＬ１６２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、フェロトーシス誘導剤は、スルファサラジン、トシル酸ソラフェニブ、エラスチン、イミダゾールケトンエラシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、対象は、ヒトである。
本開示はまた、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤により対象を治療する方法であって、対象が、がんに罹患しており、本方法は、（ａ）がん試料中のグルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）の発現レベルを決定することと、（ｂ）ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対ＧＰＸ４発現レベルと比較して低い場合、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤を対象に投与することか、または（ｃ）ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対ＧＰＸ４発現レベルと比較して高い場合、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤及び治療有効量のフェロトーシス誘導剤を対象に投与することと、を含む、方法を提供する。
本開示はまた、がんに罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量のジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤を対象に投与することを含み、投与前に、対象が、対照試料中の相対グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）発現レベルと比較してＧＰＸ４の変化した発現レベルを示すことが同定されている、方法を提供する。
いくつかの態様では、対象がＧＰＸ４の低い発現レベルを示すと同定されている場合、治療は、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、対象がＧＰＸ４の高い発現レベルを示すと同定されている場合、治療は、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤及び治療有効量のフェロトーシス誘導剤を対象に投与することを含む。
いくつかの態様では、対象を、ＧＰＸ４の変化した発現レベルを示すものとして同定することは、対象からがん試料を得ることと、試料をＧＰＸ４発現レベルについて分析することとを含む。
本開示はまた、がんに罹患している対象を、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤による治療に好適であるとして同定する方法であって、対照試料中の相対グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）発現レベルと比較して、対象がＧＰＸ４の変化した発現レベルを有するか否かを決定することを含み、（ａ）ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対ＧＰＸ４発現レベルと比較して低い場合、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤を対象に投与することができるか、または、（ｂ）ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対ＧＰＸ４発現レベルと比較して高い場合、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤及び治療有効量のフェロトーシス誘導剤を対象に投与することができる、方法を提供する。
いくつかの態様では、対象がＧＰＸ４の変化した発現レベルを有するか否かを決定することは、対象からがん試料を得ることと、試料をＧＰＸ４発現レベルについて分析することとを含む。
いくつかの態様では、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤は、Ａｇ－６３６、ＡＳＬＡＮ００３、ＢＡＹ２４０２２３４、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、ＩＭＵ－８３８、ＰＰ－００１、ＰＴＣ２９９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤は、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、フェロトーシス誘導剤は、クラスＩフェロトーシス誘導剤、クラスＩＩフェロトーシス誘導剤、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様では、フェロトーシス誘導剤は、スルファサラジン、ロシグリタゾン、マレイン酸ロシグリタゾン、バルドキソロンメチル、リナグリプチン、クルクミン、ジレウトン、ピオグリタゾンＨＣｌ、ノルディヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）、トログリタゾン、セタナキシブ、メシル酸デフェロキサミン、トシル酸ソラフェニブ、シスプラチン、ロサデュスタット、ラパチニブ、シンバスタチン、デフェラシロックス、ソラフェニブ、エラスチン、イミダゾールケトンエラスチン、ＲＳＬ３、（１Ｓ，３Ｒ）－ＲＳＬ３、ＭＬ２１０、ＭＬ１６２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、フェロトーシス誘導剤は、スルファサラジン、トシル酸ソラフェニブ、エラスチン、イミダゾールケトンエラシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、対象は、ヒトである。
本明細書に記載の方法の態様では、がん試料は、腫瘍組織、腫瘍内組織、血液試料、骨髄、またはそれらの組み合わせを含む。
本明細書に記載の方法の態様では、ＧＰＸ４発現レベルは、配列決定またはＲＮＡもしくはタンパク質発現レベルを測定する任意の技術を使用して決定される。いくつかの態様では、ＧＰＸ４発現レベルは、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ディープシーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、ＥｄｇｅＳｅｑ、ＰＣＲ、ナノストリング（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）、マイクロアレイ発現プロファイリング、免疫組織化学的方法、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン解析、ＨＰＬＣ、プロテオミクスアッセイ、またはそれらの組み合わせによって決定される。
本明細書に記載の方法の態様では、本明細書に記載の方法は、ａ．化学療法を投与すること、ｂ．手術を行うこと、ｃ．放射線療法を投与すること、ｄ．免疫療法を投与すること、ｅ．標的療法を投与すること、またはｆ．それらの任意の組み合わせをさらに含む。
いくつかの態様では、治療有効量のジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤、または治療有効量のジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤及び治療有効量のフェロトーシス誘導剤の両方、を投与することは、がん負荷を低減する。
ＤＨＯＤＨ不活性化がＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍細胞においてフェロトーシスを促進することを示す。Ａ及びＢは、ビヒクルで処理したＨＴ－１０８０細胞のメタボロミクスプロファイルと、ＲＳＬ３（１０μＭ）（Ａ）またはＭＬ１６２（１０μＭ）（Ｂ）で２時間処理した細胞のメタボロミクスプロファイルとを比較した火山プロットである。ｎ＝３の独立した実験である。Ｃ及びＤは、ＨＴ－１０８０細胞における、２時間のＲＳＬ３（１０μＭ）またはＭＬ１６２（１０μＭ）処理によって誘導される、Ｃ－Ａｓｐ（Ｃ）及びウリジン（Ｄ）の倍率変化を示す棒グラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｅは、デノボでのピリミジン生合成経路の簡略化された概略図である。Ｆ及びＧは、ビヒクル、Ｃ－Ａｓｐ（１００μＭ）、ＤＨＯ（１００μＭ）、ＯＡ（１００μＭ）、またはウリジン（５０μＭ）で４８時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理したＮＣＩ－Ｈ２２６（Ｆ）またはＨＴ－１０８０細胞（Ｇ）における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ａｓｐ：アスパラギン酸塩、Ｃ－Ｐ：カルバモイルリン酸塩、Ｐ：リン酸塩、Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＦＭＮ：フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＯＡ：オロト酸塩、ＰＲＰＰ：ホスホリボシルピロリン酸塩、ＰＰｉ：無機ピロリン酸塩、ＯＭＰ：オロチジン５’－モノリン酸塩、ＣＯ２：二酸化炭素、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＺＶＦ：Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－ｖａｌ－ａｌａ－ａｓｐ（ｏ－ｍｅ）フルオロメチルケトン。 ＤＨＯＤＨ不活性化がＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍細胞においてフェロトーシスを促進することを示す。Ｆ及びＧは、ビヒクル、Ｃ－Ａｓｐ（１００μＭ）、ＤＨＯ（１００μＭ）、ＯＡ（１００μＭ）、またはウリジン（５０μＭ）で４８時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理したＮＣＩ－Ｈ２２６（Ｆ）またはＨＴ－１０８０細胞（Ｇ）における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｈ及びＩは、Ｌｉｐ－１（１０μＭ）またはＺＶＦ（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＢＱＲで４時間処理したＮＣＩ－Ｈ２２６（Ｈ）またはＨＴ－１０８０細胞（Ｉ）における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ａｓｐ：アスパラギン酸塩、Ｃ－Ｐ：カルバモイルリン酸塩、Ｐ：リン酸塩、Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＦＭＮ：フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＯＡ：オロト酸塩、ＰＲＰＰ：ホスホリボシルピロリン酸塩、ＰＰｉ：無機ピロリン酸塩、ＯＭＰ：オロチジン５’－モノリン酸塩、ＣＯ２：二酸化炭素、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＺＶＦ：Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－ｖａｌ－ａｌａ－ａｓｐ（ｏ－ｍｅ）フルオロメチルケトン。 ＤＨＯＤＨ不活性化がＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍細胞においてフェロトーシスを促進することを示す。Ｊ及びＫは、Ｌｉｐ－１（１０μＭ）またはＺＶＦ（１０μＭ）で２４時間前処理した後の、ＮＣＩ－Ｈ２２６（５００μＭ）（Ｊ）またはＨＴ－１０８０（５ｍＭ）（Ｋ）細胞におけるＢＱＲによる４時間処理時の脂質過酸化の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｌは、異なる用量のＲＳＬ３及びＢＱＲ（５００μＭ）で４時間共処理したＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｍは、ＲＳＬ３（１μＭ）及び／またはＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したＨＴ－１０８０細胞における脂質過酸化の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ａｓｐ：アスパラギン酸塩、Ｃ－Ｐ：カルバモイルリン酸塩、Ｐ：リン酸塩、Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＦＭＮ：フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＯＡ：オロト酸塩、ＰＲＰＰ：ホスホリボシルピロリン酸塩、ＰＰｉ：無機ピロリン酸塩、ＯＭＰ：オロチジン５’－モノリン酸塩、ＣＯ２：二酸化炭素、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＺＶＦ：Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－ｖａｌ－ａｌａ－ａｓｐ（ｏ－ｍｅ）フルオロメチルケトン。 ＧＰＸ４の異なる発現を有する異なるがん細胞における、フェロトーシスの誘導に対するＤＨＯＤＨ阻害剤の効果を示す。Ａ及びＢは、ビヒクル、ＺＶＦ（１０μＭ）、及び／またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ＢＱＲ（ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞の場合は５００μＭ、ＨＴ－１０８０細胞の場合は５ｍＭ）で処理した、ＮＣＩ－Ｈ２２６（Ａ）またはＨＴ－１０８０（Ｂ）細胞における細胞生存率及びＰＴＧＳ２のｍＲＮＡレベルの測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＺＶＦ：Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－ｖａｌ－ａｌａ－ａｓｐ（ｏ－ｍｅ）フルオロメチルケトン、Ｌｉｐ－１：リプロックスキスタチン－１、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＧＳＨ：グルタチオン。 ＧＰＸ４の異なる発現を有する異なるがん細胞における、フェロトーシスの誘導に対するＤＨＯＤＨ阻害剤の効果を示す。Ｃは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で処理し、ＬＦＭ（１００μＭ）またはＴＦ（５００μＭ）で４時間共処理した、ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｄは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＭＬ１６２で処理し、ＢＱＲ（５００μＭ）、ＬＦＭ（１００μＭ）、またはＴＦ（５００μＭ）で４時間共処理した、ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＺＶＦ：Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－ｖａｌ－ａｌａ－ａｓｐ（ｏ－ｍｅ）フルオロメチルケトン、Ｌｉｐ－１：リプロックスキスタチン－１、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＧＳＨ：グルタチオン。 ＧＰＸ４の異なる発現を有する異なるがん細胞における、フェロトーシスの誘導に対するＤＨＯＤＨ阻害剤の効果を示す。Ｅは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ＲＳＬ３（１μＭ）及び／またはＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときの、ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率及びＰＴＧＳ２ ｍＲＮＡレベルの測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｆは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＳＡＳで処理し、ＢＱＲ（５００μＭ）、ＬＦＭ（１００μＭ）、またはＴＦ（５００μＭ）で４時間共処理した、ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＺＶＦ：Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－ｖａｌ－ａｌａ－ａｓｐ（ｏ－ｍｅ）フルオロメチルケトン、Ｌｉｐ－１：リプロックスキスタチン－１、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＧＳＨ：グルタチオン。 ＧＰＸ４の異なる発現を有する異なるがん細胞における、フェロトーシスの誘導に対するＤＨＯＤＨ阻害剤の効果を示す。Ｇは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のエラスチンで処理し、ＢＱＲ（５００μＭ）、ＬＦＭ（１００μＭ）、またはＴＦ（５００μＭ）で４時間共処理した、ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＺＶＦ：Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－ｖａｌ－ａｌａ－ａｓｐ（ｏ－ｍｅ）フルオロメチルケトン、Ｌｉｐ－１：リプロックスキスタチン－１、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＧＳＨ：グルタチオン。 ＧＰＸ４の異なる発現を有する異なるがん細胞における、フェロトーシスの誘導に対するＤＨＯＤＨ阻害剤の効果を示す。Ｈは、ＳＬＣ７Ａ１１、ＧＰＸ４、またはＡＣＳＬ４のｍＲＮＡレベル、ならびにそれらのタンパク質レベルを、ＢＱＲ（５００μＭ）、ＬＦＭ（１００μＭ）、またはＴＦ（５００μＭ）で４時間処理したＨＴ－１０８０細胞において測定した結果を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｉは、ＢＱＲ（５００μＭ）、ＬＦＭ（１００μＭ）、またはＴＦ（５００μＭ）で４時間処理したときのＨＴ－１０８０細胞におけるＧＳＨレベルの測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＺＶＦ：Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－ｖａｌ－ａｌａ－ａｓｐ（ｏ－ｍｅ）フルオロメチルケトン、Ｌｉｐ－１：リプロックスキスタチン－１、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＧＳＨ：グルタチオン。 ＧＰＸ４の薬理学的阻害が、デノボピリミジン生合成経路における中間レベルに影響を及ぼすことを示す。Ａ及びＢは、２時間、ビヒクルで処理したＡ－４９８（Ａ）またはＲＣＣ４（Ｂ）細胞のメタボロミクスプロファイルと、ＲＳＬ３（１０μＭ）またはＭＬ１６２（１０μＭ）で処理した同じ細胞のメタボロミクスプロファイルとを比較した火山プロットである。ｎ＝３個の独立した反復である。Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド。 ＧＰＸ４の薬理学的阻害が、デノボピリミジン生合成経路における中間レベルに影響を及ぼすことを示す。Ｃ及びＤは、Ａ－４９８（Ｃ）またはＲＣＣ４（Ｄ）細胞における、ビヒクル処理と比較した、２時間のＲＳＬ３（１０μＭ）またはＭＬ１６２（１０μＭ）処理によって誘導されるＣ－Ａｓｐ及びウリジンの倍率変化を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド。 ＧＰＸ４の薬理学的阻害が、デノボピリミジン生合成経路における中間レベルに影響を及ぼすことを示す。Ｅは、ＲＳＬ３（１０μＭ）及び／またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２時間処理したときのＨＴ－１０８０細胞における１５Ｎ－ＵＭＰレベルのアミド－１５Ｎ－グルタミン標識分析を示すグラフを示す。Ｆは、ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞において、ビヒクル、ＤＨＯ（１００μＭ）またはＯＡ（１００μＭ）でそれぞれ４８時間処理したときの細胞内ＤＨＯまたはＯＡレベルの倍率変化を示すグラフである。Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド。 ＧＰＸ４の薬理学的阻害が、デノボピリミジン生合成経路における中間レベルに影響を及ぼすことを示す。Ｇは、ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞においてビヒクルまたはＣ－Ａｓｐ（１００μＭ）で４８時間処理したときの細胞内Ｃ－Ａｓｐレベルの倍率変化を示すグラフである。Ｈは、ビヒクル、ＯＡ（１００μＭ）で２４時間、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で４８時間前処理した後、ＲＳＬ３（１０μＭ）で２時間処理した、ＨＴ－１０８０細胞におけるＤＨＯ活性測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｉは、ウェスタンブロッティングによって決定される、異なる細胞株におけるＧＰＸ４タンパク質、ＤＨＯＤＨ、及びＦＳＰ１レベル対ビンキュリンの画像である。Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド。 ＧＰＸ４の薬理学的阻害が、デノボピリミジン生合成経路における中間レベルに影響を及ぼすことを示す。Ｊは、ビヒクル、Ｃ－Ａｓｐ（１００μＭ）、ＤＨＯ（１００μＭ）、ＯＡ（１００μＭ）、またはウリジン（５０μＭ）で４８時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、ＴＫ－１０、ＵＭＲＣ２、Ａ４９８、またはＲＣＣ４細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド。 ＧＰＸ４の薬理学的阻害が、デノボピリミジン生合成経路における中間レベルに影響を及ぼすことを示す。Ｋは、ビヒクル、ＤＨＯ（１００μＭ）またはＯＡ（１００μＭ）で４８時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、ＳＷ６２０、Ｕ－８７ＭＧ、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ１４３７、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド。 ＧＰＸ４の薬理学的阻害が、デノボピリミジン生合成経路における中間レベルに影響を及ぼすことを示す。Ｌは、ウェスタンブロッティングによって決定される、異なるがん細胞株におけるＧＰＸ４、ＤＨＯＤＨ、及びＦＳＰ１タンパク質レベルの画像である。Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド。 ＧＰＸ４の薬理学的阻害が、デノボピリミジン生合成経路における中間レベルに影響を及ぼすことを示す。Ｍは、異なる用量のＢＱＲ、ＬＦＭ、またはＴＦで４時間処理したＧＰＸ４ｈｉｇｈ（ＨＴ－１０８０、Ａ－４９８、ＲＣＣ４、７８６－Ｏ及び７６９－Ｐ）及びＧＰＸ４ｌｏｗ（ＨＣＴ－８、ＵＭＲＣ６、ＴＫ－１０、ＵＭＲＣ２及びＮＣＩ－Ｈ２２６）細胞における、細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド。 フェロトーシスの調節におけるＤＨＯＤＨとＧＰＸ４との間の遺伝的相互作用を示す。Ａは、がん細胞におけるＧＰＸ４阻害剤（ＲＳＬ３、ＭＬ１６２、及びＭＬ２１０）に対する耐性と高いＤＨＯＤＨ発現が相関することを示すグラフである。プロットされたデータをＣＴＲＰデータベースから採取した。プロットされた値はピアソンの相関係数である。Ｂは、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理したＣａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｃは、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときのＣａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｄは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞における脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。ＣＴＲＰ：Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐｏｒｔａｌ、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 フェロトーシスの調節におけるＤＨＯＤＨとＧＰＸ４との間の遺伝的相互作用を示す。Ｅは、ビヒクル、ウリジン（５０μＭ）、及びウリジン（５０μＭ）＋Ｌｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間処理したときのＣａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｆは、異なる用量のＢＱＲで４時間処理したＳｈｃｔｒｌ及びＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｇは、ＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときのＳｈｃｔｒｌ及びＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞における脂質過酸化の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｈは、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞における脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＣＴＲＰ：Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐｏｒｔａｌ、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 フェロトーシスの調節におけるＤＨＯＤＨとＧＰＸ４との間の遺伝的相互作用を示す。Ｉは、ビヒクル、ウリジン（５０μＭ）、及びウリジン（５０μＭ）＋Ｌｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間処理したときの、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＣＴＲＰ：Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐｏｒｔａｌ、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 ＤＨＯＤＨ欠失が、ＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞をフェロトーシスに感作させることを示す。Ａは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞株におけるＤＨＯＤＨタンパク質レベルの画像である。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｂは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞におけるＤＨＯ活性の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃは、ビヒクルまたはウリジン（５０μＭ）で２４時間処理したときのＣａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｄは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞におけるＰＴＧＳ２ ｍＲＮＡの測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＧＳＨ：グルタチオン。 ＤＨＯＤＨ欠失が、ＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞をフェロトーシスに感作させることを示す。Ｅは、示されるＣａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＧＰＸ４ｈｉｇｈ細胞株における脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｆは、異なる用量のＭＬ１６２で４時間処理したＣａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地で培養した。ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＧＳＨ：グルタチオン。 ＤＨＯＤＨ欠失が、ＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞をフェロトーシスに感作させることを示す。Ｇは、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときのＣａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率及びＰＴＧＳ２ ｍＲＮＡレベルの測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｈは、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞におけるＤＨＯＤＨ及びＡＣＳＬ４タンパク質レベルのウェスタンブロット解析である。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｉは、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＧＳＨ：グルタチオン。 ＤＨＯＤＨ欠失が、ＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞をフェロトーシスに感作させることを示す。Ｊは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞におけるＳＬＣ７Ａ１１、ＧＰＸ４、またはＡＣＳＬ４のｍＲＮＡレベル、ならびにそれらのタンパク質レベル（ウェスタンブロット解析による）の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＧＳＨ：グルタチオン。 ＤＨＯＤＨ欠失が、ＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞をフェロトーシスに感作させることを示す。Ｋは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞におけるＧＳＨレベルの測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｌは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＧＰＸ４ｌｏｗ細胞株におけるＤＨＯＤＨタンパク質レベルを示す画像である。細胞を、ウリジン（５０μＭ）及びＬｉｐ－１（１０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｍは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞におけるＤＨＯ活性の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）及びＬｉｐ－１（１０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｎは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞の細胞増殖の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｏは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞におけるＰＴＧＳ２のｍＲＮＡレベルの測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＧＳＨ：グルタチオン。 ＤＨＯＤＨ欠失が、ＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞をフェロトーシスに感作させることを示す。Ｐは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＧＰＸ４ｌｏｗ細胞の脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＧＳＨ：グルタチオン。 ＤＨＯＤＨ欠失がＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞においてフェロトーシスを誘導することを示す。Ａは、Ｓｈｃｔｒｌ及びＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞におけるＧＰＸ４及びＤＨＯＤＨタンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。Ｂは、Ｓｈｃｔｒｌ及びＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞の細胞増殖の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃは、異なる用量のＬＦＭまたはＴＦで４時間処理したＳｈｃｔｒｌ及びＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞の細胞生存率の測定値を示すグラフである。ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＭＴＳ：ミトコンドリア標的配列、ＤＨＯＤドメイン：ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼドメイン、Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア。 ＤＨＯＤＨ欠失がＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞においてフェロトーシスを誘導することを示す。Ｄは、ＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときの、Ｓｈｃｔｒｌ及びＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率及びＰＴＧＳ２ ｍＲＮＡレベルの測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｅは示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞におけるＧＰＸ４及びＤＨＯＤＨタンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｆは、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞におけるＰＴＧＳ２ ｍＲＮＡレベルの測定を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＭＴＳ：ミトコンドリア標的配列、ＤＨＯＤドメイン：ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼドメイン、Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア。 ＤＨＯＤＨ欠失がＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞においてフェロトーシスを誘導することを示す。Ｇは、ＳｈｃｔｒｌまたはＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞におけるＤＨＯＤＨｋｏの細胞増殖の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｈは、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞におけるＤＨＯＤＨ及びＦＳＰ１タンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｉは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、示される遺伝子型を有するＣａｓ９ｃｔｒｌまたはＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｊは、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞におけるＤＨＯＤＨ及びＦＳＰ１タンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＭＴＳ：ミトコンドリア標的配列、ＤＨＯＤドメイン：ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼドメイン、Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア。 ＤＨＯＤＨ欠失がＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞においてフェロトーシスを誘導することを示す。Ｋは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、示される遺伝子型を有するＣａｓ９ｃｔｒｌまたはＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｌは、ビヒクルまたはＢＱＲ（５００μＭ）、及び４時間にわたって異なる用量のＲＳＬ３で処理したＣａｓ９ｃｔｒｌまたはＦＳＰ１ｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｍは、示されるようなＤＨＯＤＨ及びその変異体の簡略化された概略図である。ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＭＴＳ：ミトコンドリア標的配列、ＤＨＯＤドメイン：ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼドメイン、Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア。 ＤＨＯＤＨ欠失がＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞においてフェロトーシスを誘導することを示す。Ｎは、示されるＤＨＯＤＨ構築物を発現するＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞由来の細胞質及びミトコンドリア画分におけるＤＨＯＤＨタンパク質レベルのウェスタンブロッティング分析を示す画像である。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｏは、示されるＤＨＯＤＨ構築物を発現するＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞におけるＤＨＯ活性の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｐは、異なる用量のＭＬ１６２で４時間処理した、示されるＤＨＯＤＨ構築物を発現するＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＭＴＳ：ミトコンドリア標的配列、ＤＨＯＤドメイン：ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼドメイン、Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア。 ＤＨＯＤＨ欠失がＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞においてフェロトーシスを誘導することを示す。Ｑは、４時間のＲＳＬ３（１μＭ）での処理時に示されるＤＨＯＤＨ構築物を発現するＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率及びＰＴＧＳ２ ｍＲＮＡレベルの測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＭＴＳ：ミトコンドリア標的配列、ＤＨＯＤドメイン：ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼドメイン、Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア。 ＤＨＯＤＨがミトコンドリアにおける脂質過酸化を抑制することを示す。Ａは、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、示されるＤＨＯＤＨ構築物を発現するＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｂは、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときに示されるＤＨＯＤＨ構築物を発現するＤＨＯＤＨ ｋｏＨＴ－１０８０細胞における脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃは、４時間、異なる用量のＢＱＲで処理した、示されるＧＰＸ４構築物を発現するＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｄは、ＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときに示されるＧＰＸ４構築物を発現するＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞における脂質過酸化の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ：２－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イルアミノ）－２－オキソエチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、Ｍｉｔｏ－Ｃ１１：蛍光ミトコンドリア標的脂質過酸化プローブ。 ＤＨＯＤＨがミトコンドリアにおける脂質過酸化を抑制することを示す。Ｅは、異なる用量のＢＱＲで４時間処理した、示されるＧＰＸ４構築物を発現するＮＣＩ－Ｈ２２６細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｆは、ＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときに示されるＧＰＸ４構築物を発現するＮＣＩ－Ｈ２２６細胞における脂質過酸化の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｇ及びＨは、ビヒクル、ＴＥＭＰＯ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ（Ｇ）またはＤＨＯＤＨｋｏ（Ｈ）ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ：２－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イルアミノ）－２－オキソエチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、Ｍｉｔｏ－Ｃ１１：蛍光ミトコンドリア標的脂質過酸化プローブ。 ＤＨＯＤＨがミトコンドリアにおける脂質過酸化を抑制することを示す。Ｉ及びＪは、ビヒクル、ＴＥＭＰＯ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後の、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときの、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ（Ｉ）またはＤＨＯＤＨｋｏ（Ｊ）ＨＴ－１０８０細胞におけるミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｋは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌまたはＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞をＲＳＬ３（１μＭ）で２時間処理し、次いでｍｉｔｏ－ＢＯＤＩＰＹで染色したことを示す画像である。酸化型ｍｉｔｏ－ＢＯＤＩＰＹ（緑色）は、ミトコンドリアの脂質過酸化を示す。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ：２－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イルアミノ）－２－オキソエチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、Ｍｉｔｏ－Ｃ１１：蛍光ミトコンドリア標的脂質過酸化プローブ。 ＤＨＯＤＨがミトコンドリアＧＰＸ４と協働して、様々な細胞株におけるフェロトーシスを抑制することを示す。Ａは、がん細胞株のパネルにおける細胞質及びミトコンドリア画分におけるＧＰＸ４レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。Ｂは、細胞質及びミトコンドリアのＧＰＸ４構築物の簡略化された概略図である。Ｃは、示されるＧＰＸ４構築物を発現するＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞由来の細胞質及びミトコンドリア画分におけるＧＰＸ４タンパク質レベルのウェスタンブロッティング分析を示す画像である。Ｄは、４時間、異なる用量のＬＦＭまたはＴＦで処理した、示されるＧＰＸ４構築物を発現するＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＭＴＳ：ミトコンドリア標的配列、ＧＳＨペルオキシダーゼ：グルタチオンペルオキシダーゼ、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール。 ＤＨＯＤＨがミトコンドリアＧＰＸ４と協働して、様々な細胞株におけるフェロトーシスを抑制することを示す。Ｅは、ＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときに示されるＧＰＸ４構築物を発現するＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率及びＰＴＧＳ２ ｍＲＮＡレベルの測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｆは、様々な細胞株において示されるＧＰＸ４構築物を発現するＧＰＸ４ｓｈ細胞におけるＧＰＸ４タンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＭＴＳ：ミトコンドリア標的配列、ＧＳＨペルオキシダーゼ：グルタチオンペルオキシダーゼ、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール。 ＤＨＯＤＨがミトコンドリアＧＰＸ４と協働して、様々な細胞株におけるフェロトーシスを抑制することを示す。Ｇは、４時間、異なる用量のＢＱＲで処理した、示されるＧＰＸ４構築物を発現する様々なＧＰＸ４ｓｈ細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＭＴＳ：ミトコンドリア標的配列、ＧＳＨペルオキシダーゼ：グルタチオンペルオキシダーゼ、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール。 ＤＨＯＤＨがミトコンドリアＧＰＸ４と協働して、様々な細胞株におけるフェロトーシスを抑制することを示す。Ｇは、４時間、異なる用量のＢＱＲで処理した、示されるＧＰＸ４構築物を発現する様々なＧＰＸ４ｓｈ細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＭＴＳ：ミトコンドリア標的配列、ＧＳＨペルオキシダーゼ：グルタチオンペルオキシダーゼ、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール。 ＤＨＯＤＨ及びＧＰＸ４の不活性化が、ミトコンドリア脂質過酸化を促進することを示す。Ａは、示されるＧＰＸ４構築物を発現するＮＣＩ－Ｈ２２６細胞由来の細胞質及びミトコンドリア画分におけるＧＰＸ４タンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。Ｂは、示されるＧＰＸ４構築物を発現するＮＣＩ－Ｈ２２６細胞の細胞増殖の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃは、異なる用量のＬＦＭまたはＴＦで４時間処理した、示されるＧＰＸ４構築物を発現するＮＣＩ－Ｈ２２６細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｄは、ＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときに示されるＧＰＸ４構築物を発現するＮＣＩ－Ｈ２２６細胞における細胞生存率及びＰＴＧＳ２ ｍＲＮＡレベルの測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ：２－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イルアミノ）－２－オキソエチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 ＤＨＯＤＨ及びＧＰＸ４の不活性化が、ミトコンドリア脂質過酸化を促進することを示す。Ｅは、ビヒクル、ＴＥＭＰＯ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＭＬ１６２で４時間処理した、Ｃａｓ９ｃｔｒｌまたはＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｆは、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときの、Ｃａｓ９ｃｔｒｌまたはＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞におけるミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｇは、ＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときの、ＳｈｃｔｒｌまたはＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞におけるミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ：２－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イルアミノ）－２－オキソエチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 ＤＨＯＤＨ及びＧＰＸ４の不活性化が、ミトコンドリア脂質過酸化を促進することを示す。Ｈは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ＲＳＬ３（１μＭ）及び／またはＢＱＲ（５００μＭ）、ＬＦＭ（１００μＭ）、またはＴＦ（５００μＭ）で４時間処理したときの、ＨＴ－１０８０細胞のミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ：２－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イルアミノ）－２－オキソエチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 ＤＨＯＤＨ及びＧＰＸ４の不活性化が、ミトコンドリア脂質過酸化を促進することを示す。Ｉは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ＭＬ１６２（１μＭ）及び／またはＢＱＲ（５００μＭ）、ＬＦＭ（１００μＭ）、またはＴＦ（５００μＭ）で４時間処理したときの、ＨＴ－１０８０細胞のミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ：２－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イルアミノ）－２－オキソエチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 ＤＨＯＤＨ及びＧＰＸ４の不活性化が、ミトコンドリア脂質過酸化を促進することを示す。Ｊは、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときに示されるＤＨＯＤＨ構築物を発現するＤＨＯＤＨｋｏＨＴ－１０８０細胞のミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｋ及びＬは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときの、示される遺伝子型を有するＣａｓ９ｃｔｒｌまたはＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞におけるミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ：２－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イルアミノ）－２－オキソエチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 ＤＨＯＤＨ及びＧＰＸ４の不活性化が、ミトコンドリア脂質過酸化を促進することを示す。Ｋ及びＬは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときの、示される遺伝子型を有するＣａｓ９ｃｔｒｌまたはＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞におけるミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｍは、ＲＳＬ３（１μＭ）及び／またはＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときの、Ｃａｓ９ｃｔｒｌまたはＦＳＰ１ｋｏ ＨＴ－１０８０細胞におけるミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｎは、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞の細胞質（ｃｙｔｏ）及びミトコンドリア（ｍｉｔｏ）画分におけるＤＨＯＤＨ及びＦＳＰ１タンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ：２－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イルアミノ）－２－オキソエチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 ＤＨＯＤＨ及びＧＰＸ４の不活性化が、ミトコンドリア脂質過酸化を促進することを示す。Ｏは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、示される遺伝子型を有するＣａｓ９ｃｔｒｌまたはＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ：２－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イルアミノ）－２－オキソエチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 Ｐは、ＤＨＯＤＨ及びＧＰＸ４の不活性化が、ミトコンドリア脂質過酸化を促進することを示す。ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときの、示される遺伝子型を有するＣａｓ９ｃｔｒｌまたはＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞におけるミトコンドリア脂質過酸化測定を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｑは、ＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときに示されるＧＰＸ４構築物を発現するＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０細胞のミトコンドリア脂質過酸化測定を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｒは、ＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときに示されるＧＰＸ４構築物を発現するＮＣＩ－Ｈ２２６細胞のミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃｙｔｏ：細胞質、Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、ＢＱＲ：ブレキナール、ＴＥＭＰＯ：２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ：２－（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イルアミノ）－２－オキソエチル）トリフェニルホスホニウムクロリド、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 ＤＨＯＤＨがＣｏＱをＣｏＱＨ２に還元することによってフェロトーシスを抑制する可能性が高いことを示す。Ａは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＦＩＮ５６で処理し、ビヒクルまたはＢＱＲ（５００μＭ）で４時間共処理した、ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｂは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ビヒクル、ＦＩＮ５６（５０μＭ）、及び／またはＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときの、ＨＴ－１０８０細胞におけるミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｃ及びＤは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、示される遺伝子型を有するＣａｓ９ｃｔｒｌ（Ｃ）またはＤＨＯＤＨｋｏ（Ｄ）ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、４－ＣＢＡ：４－カルボキシベンズアルデヒド、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＦＭＮ：フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＣｏＱ：コエンザイムＱ、ＣｏＱＨ２：還元型コエンザイムＱ、ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート。 ＤＨＯＤＨがＣｏＱをＣｏＱＨ２に還元することによってフェロトーシスを抑制する可能性が高いことを示す。Ｅ及びＦは、ビヒクル、４－ＣＢＡ（５ｍＭ）、または４－ＣＢＡ（５ｍＭ）＋Ｌｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ（Ｅ）またはＤＨＯＤＨｋｏ（Ｆ）ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｇ及びＨは、ＢＱＲ（１ｍＭ）で２時間治療したＨＴ－１０８０（Ｇ）またはＮＣＩ－Ｈ２２６（Ｈ）細胞におけるＣｏＱ／ＣｏＱＨ２比の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｉ及びＪは、ビヒクル、ＭｉｔｏＱ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＱＨ２（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ（Ｉ）またはＤＨＯＤＨｋｏ（Ｊ）ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、４－ＣＢＡ：４－カルボキシベンズアルデヒド、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＦＭＮ：フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＣｏＱ：コエンザイムＱ、ＣｏＱＨ２：還元型コエンザイムＱ、ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート。 ＤＨＯＤＨがＣｏＱをＣｏＱＨ２に還元することによってフェロトーシスを抑制する可能性が高いことを示す。Ｉ及びＪは、ビヒクル、ＭｉｔｏＱ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＱＨ２（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ（Ｉ）またはＤＨＯＤＨｋｏ（Ｊ）ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｋ及びＬは、ビヒクル、ＭｉｔｏＱ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＱＨ２（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときの、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ（Ｋ）またはＤＨＯＤＨｋｏ（Ｌ）ＨＴ－１０８０細胞のミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、４－ＣＢＡ：４－カルボキシベンズアルデヒド、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＦＭＮ：フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＣｏＱ：コエンザイムＱ、ＣｏＱＨ２：還元型コエンザイムＱ、ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート。 ＤＨＯＤＨがＣｏＱをＣｏＱＨ２に還元することによってフェロトーシスを抑制する可能性が高いことを示す。Ｍは、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｎは、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときの、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞のミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、４－ＣＢＡ：４－カルボキシベンズアルデヒド、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＦＭＮ：フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＣｏＱ：コエンザイムＱ、ＣｏＱＨ２：還元型コエンザイムＱ、ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート。 フェロトーシスのＤＨＯＤＨ調節が、ミトコンドリアにおけるＣｏＱをＣｏＱＨ２に還元する機能に関連していることを示す。Ａは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＦＩＮ５６で処理し、ＬＦＭ（１００μＭ）またはＴＦ（５００μＭ）で４時間共処理した、ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｂは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ビヒクル、ＦＩＮ５６（５０μＭ）及び／またはＢＱＲ（５００μＭ）で４時間処理したときの、ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率及びＰＴＧＳ２ ｍＲＮＡレベルの測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、４－ＣＢＡ：４－カルボキシベンズアルデヒド、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＦＭＮ：酸化型フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＣｏＱＨ２：還元型コエンザイムＱ、ＣｏＱ：酸化型コエンザイムＱ、ＯＣＲ：酸素消費速度、ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 フェロトーシスのＤＨＯＤＨ調節が、ミトコンドリアにおけるＣｏＱをＣｏＱＨ２に還元する機能に関連していることを示す。Ｃは、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞におけるＣＯＱ２及びＤＨＯＤＨタンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｄは、Ｃａｓ９ｃｔｒｌまたはＣＯＱ２ｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における総ＣｏＱ測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｅは、ビヒクルまたは４－ＣＢＡ（５ｍＭ）で２４時間処理したＨＴ－１０８０細胞における総ＣｏＱ測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｆは、ビヒクルまたはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＭＬ１６２で４時間処理した、示される遺伝子型を有するＣａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、４－ＣＢＡ：４－カルボキシベンズアルデヒド、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＦＭＮ：酸化型フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＣｏＱＨ２：還元型コエンザイムＱ、ＣｏＱ：酸化型コエンザイムＱ、ＯＣＲ：酸素消費速度、ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 フェロトーシスのＤＨＯＤＨ調節が、ミトコンドリアにおけるＣｏＱをＣｏＱＨ２に還元する機能に関連していることを示す。Ｇは、ビヒクル、４－ＣＢＡ（５ｍＭ）及びＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＭＬ１６２で４時間処理した、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｈは、ビヒクル、４－ＣＢＡ（５ｍＭ）、または４－ＣＢＡ（５ｍＭ）＋Ｌｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ＲＳＬ３（１μＭ）で処理した、Ｃａｓ９ｃｔｒｌまたはＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞におけるミトコンドリア脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、４－ＣＢＡ：４－カルボキシベンズアルデヒド、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＦＭＮ：酸化型フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＣｏＱＨ２：還元型コエンザイムＱ、ＣｏＱ：酸化型コエンザイムＱ、ＯＣＲ：酸素消費速度、ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 フェロトーシスのＤＨＯＤＨ調節が、ミトコンドリアにおけるＣｏＱをＣｏＱＨ２に還元する機能に関連していることを示す。Ｉは、ＤＨＯＤＨが、ＤＨＯのＯＡへの酸化を、ミトコンドリア内膜におけるＣｏＱからＣｏＱＨ２への還元にどのように結合するかを示す概略図である。Ｊは、ビヒクル、ＭｉｔｏＱ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＱＨ２（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＭＬ１６２で４時間処理した、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。Ｋは、ビヒクル、ＭｉｔｏＱ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＱＨ２（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ＲＳＬ３（１μＭ）で４時間処理したときの、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞の脂質過酸化の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。ＢＱＲ：ブレキナール、ＬＦＭ：レフルノミド、ＴＦ：テリフルノミド、４－ＣＢＡ：４－カルボキシベンズアルデヒド、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＦＭＮ：酸化型フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＣｏＱＨ２：還元型コエンザイムＱ、ＣｏＱ：酸化型コエンザイムＱ、ＯＣＲ：酸素消費速度、ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１。 様々な細胞株におけるＲＳＬ３及びＢＱＲ誘発性フェロトーシスに対するＭｉｔｏＱ及びＭｉｔｏＱＨ２の効果を示す。Ａは、示される細胞株におけるＧＰＸ４、ＤＨＯＤＨ及びＦＳＰ１タンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪは、ビヒクル、ＭｉｔｏＱ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＱＨ２（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ビヒクル（上パネル）またはＢＱＲ（５００μＭ）（下パネル）で異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、２９３Ｔ（Ｂ）、Ｈｅｌａ（Ｃ）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｄ）、ＳＷ６２０（Ｅ）、Ｕ－８７ＭＧ（Ｆ）、Ａ５４９（Ｇ）、ＮＣＩ－Ｈ１４３７（Ｈ）、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６（Ｉ）、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｊ）細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＯＣＲ：酸素消費速度。 様々な細胞株におけるＲＳＬ３及びＢＱＲ誘発性フェロトーシスに対するＭｉｔｏＱ及びＭｉｔｏＱＨ２の効果を示す。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪは、ビヒクル、ＭｉｔｏＱ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＱＨ２（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ビヒクル（上パネル）またはＢＱＲ（５００μＭ）（下パネル）で異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、２９３Ｔ（Ｂ）、Ｈｅｌａ（Ｃ）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｄ）、ＳＷ６２０（Ｅ）、Ｕ－８７ＭＧ（Ｆ）、Ａ５４９（Ｇ）、ＮＣＩ－Ｈ１４３７（Ｈ）、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６（Ｉ）、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｊ）細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＯＣＲ：酸素消費速度。 様々な細胞株におけるＲＳＬ３及びＢＱＲ誘発性フェロトーシスに対するＭｉｔｏＱ及びＭｉｔｏＱＨ２の効果を示す。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪは、ビヒクル、ＭｉｔｏＱ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＱＨ２（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ビヒクル（上パネル）またはＢＱＲ（５００μＭ）（下パネル）で異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、２９３Ｔ（Ｂ）、Ｈｅｌａ（Ｃ）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｄ）、ＳＷ６２０（Ｅ）、Ｕ－８７ＭＧ（Ｆ）、Ａ５４９（Ｇ）、ＮＣＩ－Ｈ１４３７（Ｈ）、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６（Ｉ）、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｊ）細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＯＣＲ：酸素消費速度。 様々な細胞株におけるＲＳＬ３及びＢＱＲ誘発性フェロトーシスに対するＭｉｔｏＱ及びＭｉｔｏＱＨ２の効果を示す。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪは、ビヒクル、ＭｉｔｏＱ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＱＨ２（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ビヒクル（上パネル）またはＢＱＲ（５００μＭ）（下パネル）で異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、２９３Ｔ（Ｂ）、Ｈｅｌａ（Ｃ）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｄ）、ＳＷ６２０（Ｅ）、Ｕ－８７ＭＧ（Ｆ）、Ａ５４９（Ｇ）、ＮＣＩ－Ｈ１４３７（Ｈ）、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６（Ｉ）、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｊ）細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＯＣＲ：酸素消費速度。 様々な細胞株におけるＲＳＬ３及びＢＱＲ誘発性フェロトーシスに対するＭｉｔｏＱ及びＭｉｔｏＱＨ２の効果を示す。Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪは、ビヒクル、ＭｉｔｏＱ（１０μＭ）、ＭｉｔｏＱＨ２（１０μＭ）、またはＬｉｐ－１（１０μＭ）で２４時間前処理した後、ビヒクル（上パネル）またはＢＱＲ（５００μＭ）（下パネル）で異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、２９３Ｔ（Ｂ）、Ｈｅｌａ（Ｃ）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｄ）、ＳＷ６２０（Ｅ）、Ｕ－８７ＭＧ（Ｆ）、Ａ５４９（Ｇ）、ＮＣＩ－Ｈ１４３７（Ｈ）、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６（Ｉ）、及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｊ）細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｋは、ミキソチアゾール（１０μＭ）で２時間処理したＨＴ－１０８０細胞におけるＣｏＱ／ＣｏＱＨ２比の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｌは、ビヒクルまたはミキソチアゾール（１μＭ）で２４時間前処理した後、異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、Ｃａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＨＴ－１０８０細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＯＣＲ：酸素消費速度。 様々な細胞株におけるＲＳＬ３及びＢＱＲ誘発性フェロトーシスに対するＭｉｔｏＱ及びＭｉｔｏＱＨ２の効果を示す。Ｍは、ミキソチアゾール（１０μＭ）で２時間処理したＡ５４９細胞におけるＣｏＱ／ＣｏＱＨ２比の測定値を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝３回の独立した反復である。Ｎは、ビヒクルまたはミキソチアゾール（１μＭ）で２４時間前処理した後、ＢＱＲ（５００μＭ）ありまたはなしで異なる用量のＲＳＬ３で４時間処理した、Ａ５４９細胞における細胞生存率の測定値を示すグラフである。Ｏは、示される遺伝子型を有するＨＴ－１０８０細胞におけるＤＨＯＤＨ及びｃｉＡＯＸタンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。細胞を、ウリジン（５０μＭ）を補充した培地中で増殖させた。ＭｉｔｏＱ：［１０－（４，５－ジメトキシ－２－メチル－３，６－ジオキソ－１，４－シクロヘキサジエン－１－イル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、ＭｉｔｏＱＨ２：［１０－（２，５－ジヒドロキシ－３，４－ジメトキシ－６－メチルフェニル）デシル］トリフェニル－ホスホニウム、モノメタンスルホネート、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、ＯＣＲ：酸素消費速度。 ＤＨＯＤＨ阻害剤処理が、インビボでフェロトーシスを誘導することによってＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍増殖を抑制することを示す。Ａ及びＢは、異なる時点（日）で示される処理を用いたＳｈｃｔｒｌ（Ａ）及びＧＰＸ４ｓｈ（Ｂ）ＨＴ－１０８０異種移植片腫瘍の体積を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝８個の独立した腫瘍である。Ｃ及びＤは、Ｓｈｃｔｒｌ（図１３Ｃ）及びＧＰＸ４ｓｈ（図１３Ｄ）ＨＴ－１０８０異種移植片腫瘍の４－ＨＮＥ染色の免疫化学スコアリングを示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝５個の独立した腫瘍である。Ｅは、異なる時点（日）で示された処理を用いたＮＣＩ－Ｈ２２６細胞異種移植片腫瘍の体積を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝８個の独立した腫瘍である。Ｆは、異なるＰＤＸモデルにおけるＧＰＸ４タンパク質レベルのウェスタンブロット解析を示す画像である。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、４－ＨＮＥ：４－ヒドロキシノネナール、ＰＤＸ：患者由来異種移植片、ＳＡＳ：スルファサラジン。 ＤＨＯＤＨ阻害剤処理が、インビボでフェロトーシスを誘導することによってＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍増殖を抑制することを示す。Ｇ、Ｈ、及びＩは、異なる時点（日）で示された処理を行ったＴＣ６３２（Ｇ）、ＴＣ６２９（Ｈ）、またはＴＣ４９４（Ｉ）ＰＤＸ腫瘍の体積を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝６個の独立した腫瘍である。Ｊは、異なる時点（日）で示された処理を用いたＨＴ－１０８０細胞異種移植片腫瘍の体積を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝８個の独立した腫瘍である。Ｋは、ＨＴ－１０８０異種移植片腫瘍の４－ＨＮＥ染色の免疫化学スコアリングを示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝５個の独立した腫瘍である。Ｌは、異なる時点（日）で示された処理を用いたＴＣ６３２ ＰＤＸ腫瘍の体積を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝６個の独立した腫瘍である。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、４－ＨＮＥ：４－ヒドロキシノネナール、ＰＤＸ：患者由来異種移植片、ＳＡＳ：スルファサラジン。 ＤＨＯＤＨ阻害剤がＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍増殖を選択的に抑制することを示す。Ａは、示される処理を用いたＳｈｃｔｒｌ及びＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０異種移植片腫瘍の重量測定を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝８個の独立した腫瘍である。Ｂ、Ｃ、及びＤは、示される処理を用いたＳｈｃｔｒｌ及びＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０異種移植片腫瘍からの代表的な免疫化学画像であり（Ｂ）、切断カスパーゼ３（Ｃ）及びｋｉ６７（Ｄ）染色の染色スコアをさらに示す。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝５個の独立した腫瘍である。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン及びエオシン、４－ＨＮＥ：４－ヒドロキシノネナール、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＰＤＸ：患者由来異種移植片。 ＤＨＯＤＨ阻害剤がＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍増殖を選択的に抑制することを示す。Ｂ、Ｃ、及びＤは、示される処理を用いたＳｈｃｔｒｌ及びＧＰＸ４ｓｈ ＨＴ－１０８０異種移植片腫瘍からの代表的な免疫化学画像であり（Ｂ）、切断カスパーゼ３（Ｃ）及びｋｉ６７（Ｄ）染色の染色スコアをさらに示す。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝５個の独立した腫瘍である。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン及びエオシン、４－ＨＮＥ：４－ヒドロキシノネナール、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＰＤＸ：患者由来異種移植片。 ＤＨＯＤＨ阻害剤がＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍増殖を選択的に抑制することを示す。Ｅは、示される処理を用いたＮＣＩ－Ｈ２２６異種移植片腫瘍の重量測定を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝８個の独立した腫瘍である。Ｆは、示される処理を用いたＴＣ６３２、ＴＣ６２９、またはＴＣ４９４ＰＤＸの腫瘍の重量測定を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝６個の独立した腫瘍である。Ｇは、異なる時点（日）で示される処理を用いたＣａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＮＣＩ－Ｈ２２６異種移植片腫瘍の体積を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝８個の独立した腫瘍である。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン及びエオシン、４－ＨＮＥ：４－ヒドロキシノネナール、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＰＤＸ：患者由来異種移植片。 ＤＨＯＤＨ阻害剤がＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍増殖を選択的に抑制することを示す。Ｈは、示される処理を用いたＣａｓ９ｃｔｒｌ及びＤＨＯＤＨｋｏ ＮＣＩ－Ｈ２２６異種移植片腫瘍の重量測定を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝８個の独立した腫瘍である。Ｉは、示される処理を用いたＨＴ－１０８０異種移植片腫瘍の重量測定を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝８回の独立した反復である。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン及びエオシン、４－ＨＮＥ：４－ヒドロキシノネナール、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＰＤＸ：患者由来異種移植片。 ＤＨＯＤＨ阻害剤がＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍増殖を選択的に抑制することを示す。Ｊ、Ｋ、及びＬは、示される処理を用いたＨＴ－１０８０異種移植片腫瘍の代表的な免疫化学画像であり（Ｊ）、切断カスパーゼ３（Ｋ）及びｋｉ６７（Ｌ）染色の染色スコアをさらに示す。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝５個の独立した腫瘍である。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン及びエオシン、４－ＨＮＥ：４－ヒドロキシノネナール、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＰＤＸ：患者由来異種移植片。 ＤＨＯＤＨ阻害剤がＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍増殖を選択的に抑制することを示す。Ｍは、異なる時点（日）で示された処理を用いたＴＣ６２９ ＰＤＸ腫瘍の体積を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝６個の独立した腫瘍である。Ｎは、示される処理を用いたＴＣ６３２及びＴＣ６２９ＰＤＸ腫瘍の重量測定を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝６個の独立した腫瘍である。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン及びエオシン、４－ＨＮＥ：４－ヒドロキシノネナール、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＰＤＸ：患者由来異種移植片。 ＤＨＯＤＨ阻害剤がＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍増殖を選択的に抑制することを示す。Ｏは、異なる時点（日数）で示される異なる処理を行った全ての細胞株異種移植片またはＰＤＸのマウス体重測定を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝８（ヌードマウス）またはｎ＝６（ＮＳＧマウス）の独立したマウスである。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン及びエオシン、４－ＨＮＥ：４－ヒドロキシノネナール、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＰＤＸ：患者由来異種移植片。 ＤＨＯＤＨ阻害剤がＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍増殖を選択的に抑制することを示す。Ｏは、異なる時点（日数）で示される異なる処理を行った全ての細胞株異種移植片またはＰＤＸのマウス体重測定を示すグラフである。エラーバーは平均±ｓｄであり、ｎ＝８（ヌードマウス）またはｎ＝６（ＮＳＧマウス）の独立したマウスである。ＢＱＲ：ブレキナール、Ｌｉｐ－１：リプロキスタチン－１、Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン及びエオシン、４－ＨＮＥ：４－ヒドロキシノネナール、ＳＡＳ：スルファサラジン、ＰＤＸ：患者由来異種移植片。 異なる細胞下区画におけるフェロトーシス抑制を示す図である。ＰＬＯＯＨ：リン脂質ヒドロペルオキシド、ＰＬＯＯ・：リン脂質ヒドロペルオキシルラジカル、ＧＳＨ：還元型グルタチオン、ＧＳＳＨ：酸化型グルタチオン、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸塩）、ＮＡＤ（Ｐ）＋：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸塩）、ＣｏＱ：酸化型コエンザイムＱ、ＣｏＱＨ２：還元型コエンザイムＱ、ＦＭＮＨ２：還元型フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮ：酸化型フラビンモノヌクレオチド、Ａｓｐ：アスパラギン酸塩、Ｃ－Ｐ：カルバモイルリン酸塩、Ｐ：リン酸塩、Ｃ－Ａｓｐ：Ｎ－カルバモイル－Ｌ－アスパラギン酸塩、ＤＨＯ：ジヒドロオロト酸塩、ＯＡ：オロト酸塩、ＰＲＰＰ：ホスホリボシルピロリン酸塩、ＰＰｉ：無機ピロリン酸塩、ＯＭＰ：オロチジン５’－モノリン酸塩、ＣＯ２：二酸化炭素、ＵＭＰ：ウリジン５’－モノリン酸塩。
Ｉ．定義
本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。本出願で使用される場合、本明細書に別段の定めがある場合を除き、以下の各用語は、以下に記載される意味を有するものとする。追加の定義は、本出願全体を通して記載されている。
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、ならびに「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。特定の態様では、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「単一」を意味する。他の態様において、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「２つ以上」または「複数」を含む。
さらに、本明細書で使用する場合、「及び／または」は、他方を伴うまたは伴わない２つの指定された特徴または構成成分をそれぞれ具体的に開示するものとして解釈するものとする。したがって、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などのフレーズで使用される「及び／または」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含することが意図される。Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が関係する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で使用される「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値または組成物に対する許容誤差範囲内にある値または組成物を指し、それは、その値または組成物がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に一部依存する。例えば、約は、列挙された数±１０％（例えば、「約１０」は、９～１１を意味する）を含むことができる。
本明細書で使用される「投与する」という用語は、当業者に知られている様々な方法及び送達システムのいずれかを使用して、治療剤（例えば、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤）を含む組成物を対象に物理的に導入することを指す。投与経路には、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄または他の非経口投与経路、例えば、注射または注入による投与経路が含まれる。
「抗がん剤」またはそれらの組み合わせという用語は、対象においてがん退縮を促進する。いくつかの態様では、治療有効量の治療剤は、がんを除去する点までがんの退縮を促進する。
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導する、向上させる、抑制する、または別様に改変することを含む方法による、疾患に罹患しているか、または疾患の罹患リスクもしくは再発リスクがある対象の治療を意味する。
本明細書で使用される「試料」または「生体試料」という用語は、対象から単離された生体材料を指す。試料は、例えば、核酸を配列決定することによって、遺伝子発現を決定するのに適した任意の生物学的材料を含有することができる。
試料は、任意の好適な生体組織、例えば、がん組織であってもよい。一態様では、試料は、腫瘍組織生検、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織または新鮮凍結腫瘍組織などである。別の態様では、腫瘍内試料が使用される。別の態様では、生体液は、腫瘍組織生検に存在することができるが、生体試料は、生体液自体ではない。
本明細書で使用される「がん」という用語は、体内の異常細胞の無制御増殖を特徴とする様々な疾患の広範な群を指す。調節されていない細胞分裂及び成長は、隣接する組織に浸潤する悪性腫瘍の形成をもたらし、また、リンパ系または血流を介して身体の遠隔部分に転移する可能性がある。「腫瘍」という用語は、固形がんを指す。「癌腫」という用語は、上皮由来のがんを指す。
本明細書で使用される「対照試料」という用語は、がんを有しないと考えられる「正常な」または「健康な」個体（複数可）から得られた生体試料（例えば、血液、尿、腫瘍）、またはがんを有すると考えられる個体（複数可）から得られた「正常な」または「健康な」（例えば、非がん性）生体試料を指す。対照は、当該技術分野で周知である方法を使用して選択され得る。あるレベルが対照集団について十分に確立されると、試験生体試料からのアレイ結果を、既知のレベルと直接比較することができる。
「グルタチオンペルオキシダーゼ４」または「ＧＰＸ４」という用語は、本明細書で使用される場合、ＧＰＸ４遺伝子をコードする酵素を指す。ＧＰＸ４は、細胞を膜脂質過酸化から保護するリン脂質ヒドロペルオキシダーゼである。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語には、任意のヒト動物または非ヒト動物が含まれる。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用される。「非ヒト動物」という用語は、限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、バイソン、ラマ、シカ、エルク、及び他の大型動物等の脊椎動物、ならびに子牛及び子羊を含むそれらの若者、ならびにマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル等の霊長類、及び他の実験動物を含む。動物内では、哺乳動物が好ましく、最も好ましくは、家畜ペット、競走馬、及びヒトの消費のために直接的に（例えば、肉）または間接的に（例えば、乳）食品を生産するために使用される動物などの貴重かつ貴重な動物であるが、実験動物もまた含まれる。特定の態様では、対象は、ヒトである。したがって、本開示は、臨床、獣医学、及び研究用途に適用可能である。
本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、疾患または状態、及び／またはそれに関連する症状を排除、軽減、または改善することを指す。除外されてはいないものの、疾患または状態を処置することは、その疾患、状態、またはそれらに関連する症状が完全に排除されることは必要としない。本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、「予防的治療」を含み得、これは、疾患もしくは状態を再発症していないが、疾患もしくは状態を再発症すること、または疾患もしくは状態の再発を有していないが、そのリスクがあるか、またはそれに罹患しやすい対象における、疾患もしくは状態の再発の可能性、または以前に制御された疾患もしくは状態の再発の可能性を低下させることを指す。「治療する」という用語及び同義語は、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤を、そのような治療を必要とする個体に投与することを企図する。
本明細書で使用される「治療有効量」または「有効用量」という用語は、本開示の方法によって投与されるとき、目的の状態または疾患の治療のための活性成分（複数可）を、その治療を必要とする個体に有効に送達するのに十分な活性成分（複数可）の量を指す。がんまたは他の増殖障害の場合、治療有効量の薬剤は、望ましくない細胞増殖を減らす（すなわち、ある程度遅延させる、好ましくは停止させる）、がん細胞数を減らす、腫瘍のサイズを縮小する、末梢器官へのがん細胞の浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅延させる、好ましくは停止させる）、腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅延させる、好ましくは停止させる）、腫瘍成長をある程度阻害する、標的細胞内のタンパク質メチル化を調節する、及び／またはがんに関連する症状の１つ以上をある程度緩和することができる。投与される化合物または組成物は、既存のがん細胞の成長を防止する、及び／またはそれを殺傷する程度に、細胞増殖抑制性及び／または細胞傷害性であり得る。
加えて、本明細書に開示される治療に関して「有効」及び「有効性」という用語は、薬理学的有効性及び生理学的安全性の両方を含む。薬理学的有効性は、患者のがん退縮を促進する薬物の能力を指す。生理学的安全性は、薬物の投与から生じる細胞、臓器及び／または生物レベルでの毒性のレベル、または他の有害な生理学的影響（有害な影響）を指す。
疾患退縮、例えば、がん退縮を促進する治療薬の能力は、当業者に既知の様々な方法を使用して、例えば、臨床試験中のヒト対象、ヒトにおける効能を予測する動物モデル系、またはインビトロアッセイにおける薬剤の活性をアッセイすることによって評価することができる。
本明細書に記載されるように、特に明記されない限り、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、列挙される範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むと理解されるべきである。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が関係する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を提供する。
態様が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語で本明細書に記載されている場合はいつでも、それ以外は類似である「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で記載されている態様も提供されることを理解されたい。
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められた形態で示される。本明細書に提供される見出しは、本開示の様々な態様の限定ではなく、本明細書全体を参照することによって有することができる。したがって、定義された用語は、その全体が明細書を参照することによってより完全に定義される。
本明細書で使用される略語は、本開示を通して定義される。本開示の様々な態様については、以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。
ＩＩ．治療方法
本開示の一態様は、がんを治療するための方法に関し、方法は、その治療を必要とする対象に、治療有効量のジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤を投与することを含み、がんは、対照試料と比較して、変化したグルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）発現を有する。
いくつかの態様では、改変されたＧＰＸ４発現は、対照試料と比較してＧＰＸ４の低い発現レベルである。ＧＰＸ４を指すために使用される「発現レベル」（例えば、改変されたＧＰＸ４発現レベル、低いＧＰＸ４発現レベル、低いＧＰＸ４発現、高ＧＰＸ４発現レベル、または高ＧＰＸ４発現）には、ＧＰＸ４ ＲＮＡ、ＧＰＸ４タンパク質、またはその両方の発現レベルが含まれる。ＧＰＸ４ ＲＮＡを指すとき、発現レベルは、一般に、対象もしくはそこからの試料または対照試料中に存在する目的の核酸配列を表すＲＮＡ分子の検出された量、例えば、目的の核酸配列を含むＤＮＡ分子（例えば、対象のゲノムまたは対象のがんからのもの）から発現されたＲＮＡ分子の量を指す。ＧＰＸ４タンパク質を指す場合、発現レベルは、一般に、対象もしくはそこからの試料、または対照試料中に存在する目的のタンパク質を表すタンパク質分子の検出量、例えば、目的のリボ核酸配列を含むＲＮＡ分子（例えば、対象のトランスクリプトームまたは対象のがんからの）から発現されるタンパク質分子の量を指す。
いくつかの態様では、がんは、腫瘍である。さらなる態様では、腫瘍は、がんである。
いくつかの態様では、腫瘍は、固形腫瘍である。「固形腫瘍」には、肉腫、黒色腫、癌腫、または他の固形腫瘍癌が含まれるがこれらに限定されない。
「肉腫」という用語は、胚性結合組織のような物質からなり、かつ、一般に、線維状または均質な物質に埋め込まれた密接に充填された細胞から構成される腫瘍を指す。肉腫には、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫（ｍｅｌａｎｏｓａｒｃｏｍａ）、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー肉腫、脂肪性肉腫、脂肪肉腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル芽細胞肉腫、ブドウ状肉腫、緑色肉腫、絨毛腫、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、ジェンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血球肉腫（ｌｅｕｋｏｓａｒｃｏｍａ）、悪性間葉肉腫、傍骨性肉腫、網状赤血球肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢包性肉腫、滑膜肉腫、または毛細血管拡張性肉腫が含まれるがこれらに限定されない。
「黒色腫」という用語は、皮膚及び他の器官のメラノサイト系から生じる腫瘍を指す。黒色腫には、例えば、末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング・パッセイ黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、転移性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、または表在拡大型黒色腫が含まれる。
「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤する傾向があり転移を引き起こす上皮細胞から構成される悪性の新たな成長物を指す。例示的ながんとしては、例えば、腺房癌、小葉癌、腺嚢胞癌、腺様嚢胞癌、腺腫様癌、副腎皮質の癌、肺胞癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌、基底細胞癌、基底扁平上皮癌、基底扁平上皮癌、気管支肺胞癌、気管支肺胞癌、気管支原性癌、大脳癌、胆管細胞癌、絨毛癌、コロイド癌、コメド癌、子宮体癌、篩状癌、よろい状癌、皮膚癌、円柱癌、円柱細胞癌、管癌、デュラム癌、胚性癌、脳様癌、類上皮癌、アデノイド上皮癌、外植生癌、潰瘍外癌、線維性癌、ゼラチン様癌、ゼラチン状癌、巨大細胞癌、巨大細胞癌、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母細胞癌、ヘマトイド癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、ヒアリン癌、類上皮小体癌、小児胚性癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ癌、Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙｃｅｌｌ癌、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫様癌、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌、軟性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘表皮癌、粘膜癌、粘液性癌（ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌、鼻咽頭癌、麦粒腫、骨化癌、骨様癌、乳頭癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、プリックル細胞癌、プルテース癌、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫、シュナイデル癌、スキルス癌、スクロチ癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌、球状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿状癌、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、糸状癌、毛細血管拡張癌、毛細血管拡張症癌、移行細胞癌、結節性癌、結節性癌、疣状癌、または絨毛癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｖｉｆｌｏｓｕｍ）が挙げられる。
本明細書に開示される方法に従って治療することができる追加のがんとしては、例えば、白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵臓インシュラノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前悪性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、甲状腺乳頭癌、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、食道癌、泌尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、前立腺癌、ミュラー癌、卵巣癌、腹膜癌、卵管癌、または子宮漿液性乳頭癌が挙げられる。
いくつかの態様では、がんは、再発性、難治性、または少なくとも１つの抗がん剤の投与を含む少なくとも１つの事前の療法後に難治性である。「再発」という用語は、療法後にがんの寛解を有した対象ががん細胞の復帰を有する状況を指す。本明細書で使用される場合、「難治性」または「耐性」という用語は、対象が、強力な治療後であっても、体内に残存がん細胞を有する状況を指す。いくつかの態様において、がんは、転移性である。
いくつかの態様では、がんとしては、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌、小児癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭・下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔・副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔・中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟部組織肉腫、基底細胞・扁平上皮皮膚癌、黒色腫、小腸癌、胃癌、精巣癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、がん治療による二次がんを挙げることができるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、がんは、線維肉腫、肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、腎細胞癌、乳房腺癌、結腸直腸腺癌、子宮頸管内膜腺癌、またはＴ急性リンパ芽球性白血病から選択される。
「がん」または「がん組織」は、様々な段階における腫瘍を含み得る。ある特定の態様では、がんまたは腫瘍は、ステージ０、例えば、がんまたは腫瘍が、発達における極めて早期であり、転移していないようなものである。いくつかの態様では、がんまたは腫瘍は、ステージＩ、例えば、がんまたは腫瘍が、サイズが比較的小さく、近くの組織に広がっておらず、転移していないようなものである。他の態様では、がんまたは腫瘍は、ステージＩＩまたはステージＩＩＩ、例えば、がんまたは腫瘍が、ステージ０またはステージＩよりも大きく、近くの組織に成長しているが、潜在的にリンパ節を除き転移していないようなものである。他の態様では、がんまたは腫瘍は、ステージＩＶ、例えば、がんまたは腫瘍が転移しているようなものである。ステージＩＶはまた、進行または転移がんと称され得る。
ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤は、自己免疫疾患、免疫及び炎症性疾患、破壊的な骨障害、悪性腫瘍性疾患、血管新生関連障害、ウイルス性疾患、及び感染症の治療または予防のために開示されている。例えば、ＷＯ２０１００８３９７５、ＷＯ２０１１１３８６６５、ＷＯ２００１３７０８１、ＷＯ２００９１３３３７９、ＷＯ２００９０２１６９６、ＷＯ２０００８２６９１、ＷＯ２００９０２９４７３、ＷＯ２００９１５３０４３、ＵＳ２００９２０９５５７、ＵＳ２００９０６２３１８、ＵＳ２００９０８２３７４、ＷＯ２００８０９７１８０、Ｗ０２ＱＱ８Ｑ７７６３９、ＵＳ２００８０２７０７９、ＵＳ２００７２９９Ｕ４、ＵＳ２００７０２７１９３、ＵＳ２００７２２４６７２、ＷＯ２００７１４９２１１、ＪＰ２００７０１５９５２、ＷＯ２００６０４４７４１、ＷＯ２００６００１９６１、ＷＯ２００６０５１９３７、ＷＯ２００６０３８６０６、ＷＯ２００６０２２４４２、ＵＳ２００６１９９８５６、ＷＯ２００５０７５４１０、米国特許第１０，０１６，４０２号、米国特許第７，０７４，８３１号、ＷＯ２００４０５６７９７、米国特許第７，２４７，７３６号、ＷＯ２００４０５６７４７、ＷＯ２００４０５６７４６、ＪＰ２００４０９９５８６、ＷＯ２００３０９７５７４、ＷＯ２００３０３０９０５、ＷＯ２００３００６４２５、ＷＯ２００３００６４２４、ＵＳ２００３２０３９５１、ＷＯ２００２０８０８９７、米国特許第７，１７６，２４１号、米国特許第７，４２３，０５７号、ＷＯ２００１０２４７８５、米国特許第６，８４１，５６１号、ＷＯ９９４５９２６、ＷＯ９９３８８４６、ＷＯ９９４１２３９、ＥＰ７６７１６７及び米国特許第５，９７６，８４８号を参照されたく、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＤＨＯＤＨ阻害剤に関するさらなるレビュー及び文献については、Ｂｉｏ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０（６），２０１０，ｐａｇｅｓ１９８１－１９８４、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，５２，２６８３－２６９３、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，５１（１２），３６４９－３６５３を参照のこと。
例えば、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤としては、限定されないが、レフルノミド、テリフルノミド、ブレキナール、ジクロロアリルロゾン、マリチムス、レドキサール、Ａｇ－６３６、ＡＳＬＡＮ００３、ＢＡＹ２４０２２３４、ＩＭＵ－８３８、ＰＰ－００１、及びＰＴＣ２９９が挙げられる。
いくつかの態様では、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤は、Ａｇ－６３６、ＡＳＬＡＮ００３、ＢＡＹ２４０２２３４、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、ＩＭＵ－８３８、ＰＰ－００１、ＰＴＣ２９９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらなる態様では、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤は、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、改変されたＧＰＸ４発現は、対照試料と比較してＧＰＸ４の高い発現レベルである。
いくつかの態様では、本方法は、治療有効量のフェロトーシス誘導剤を投与することをさらに含む。
フェロトーシス誘導剤（ＦＩＮ）は、悪性腫瘍性疾患、神経系疾患、及び血液疾患の治療または予防のために開示されている。例えば、参照によりそれぞれの全内容が本明細書に組み込まれるＵＳ２０２００１３８８２９、ＷＯ２０１９２００３４３、ＷＯ２０１８２１８０８７、及びＷＯ２０２０２３６６２０を参照されたい。
フェロトーシス誘導剤（ＦＩＮ）は、４つのクラス、すなわち、（ｉ）系Ｘｃ－を阻害し、システイン取り込みを防止すること、（ｉｉ）ＧＰＸ４を阻害すること、（ｉｉｉ）ＧＰＸ４を分解し、ＳＱＳに結合し、酸化防止剤ＣｏＱ１０を枯渇させること、（ｉｖ）鉄及びリピドームを直接、及び非活性のＧＰＸ４を直接酸化すること、に分けられる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｓｅａｓｅ，１１，８８（２０２０）を参照されたい。クラスＩには、例えば、エラスチン、ソラフェニブ、スルファサラジンが含まれ、クラスＩＩには、例えば、ＲＳＬ３、（１Ｓ，３Ｒ）－ＲＳＬ３、ＭＬ２１０、ＭＬ１６２、ＤＰＩ７、及びＤＰＩ１０が含まれ、クラスＩＩＩには、例えば、ＦＩＮ５６が含まれ、クレーム４には、例えば、ＦＩＮＯ２が含まれる。
いくつかの態様では、フェロトーシス誘導剤は、クラスＩフェロトーシス誘導剤、クラスＩＩフェロトーシス誘導剤、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの態様では、フェロトーシス誘導剤は、スルファサラジン、ロシグリタゾン、マレイン酸ロシグリタゾン、バルドキソロンメチル、リナグリプチン、クルクミン、ジレウトン、ピオグリタゾンＨＣｌ、ノルディヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）、トログリタゾン、セタナキシブ、メシル酸デフェロキサミン、トシル酸ソラフェニブ、シスプラチン、ロサデュスタット、ラパチニブ、シンバスタチン、デフェラシロックス、ソラフェニブ、エラスチン、イミダゾールケトンエラスチン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらなる態様では、フェロトーシス誘導剤は、スルファサラジンＲＳＬ３、（１Ｓ，３Ｒ）－ＲＳＬ３、ＭＬ２１０、ＭＬ１６２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、フェロトーシス誘導剤は、クラス（ｉｉｉ）フェロトーシス誘導剤ではない。いくつかの態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤は、クラス（ｉ）フェロトーシス誘導剤と組み合わせて投与される。いくつかの態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤は、クラス（ｉｉ）フェロトーシス誘導剤と組み合わせて投与される。いくつかの態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤は、クラス（ｉｖ）フェロトーシス誘導剤と組み合わせて投与される。
いくつかの態様では、対象は、ヒトである。
本開示の別の態様は、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤により対象を治療する方法であって、対象が、がんに罹患しており、本方法は、（ａ）がん試料中のグルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）の発現レベルを決定することと、（ｂ）ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対ＧＰＸ４発現レベルと比較して低い場合、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤を対象に投与することか、または（ｃ）ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対ＧＰＸ４発現レベルと比較して高い場合、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤及び治療有効量のフェロトーシス誘導剤を対象に投与することと、を含む、方法に関する。
本開示の別の態様は、がんに罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量のジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤を対象に投与することを含み、投与前に、対象が、対照試料中の相対グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）発現レベルと比較してＧＰＸ４の変化した発現レベルを示すことが同定されている、方法に関する。
いくつかの態様では、対象がＧＰＸ４の低発現レベルを示すと同定されている場合、治療は、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤を対象に投与することを含む。
いくつかの態様では、対象がＧＰＸ４の高い発現レベルを示すと同定されている場合、治療は、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤及び治療有効量のフェロトーシス誘導剤を対象に投与することを含む。
いくつかの態様では、対象を、ＧＰＸ４の変化した発現レベルを示すものとして同定することは、対象からがん試料を得ることと、試料をＧＰＸ４発現レベルについて分析することとを含む。
本開示の別の態様は、がんに罹患している対象をジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤による治療に好適であるとして同定する方法であって、対照試料中の相対グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）発現レベルと比較して、対象がＧＰＸ４の変化した発現レベルを有するか否かを決定することを含み、（ａ）ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対ＧＰＸ４発現レベルと比較して低い場合、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤を対象に投与することができるか、または、（ｂ）ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対ＧＰＸ４発現レベルと比較して高い場合、治療有効量のＤＨＯＤＨ阻害剤及び治療有効量のフェロトーシス誘導剤を対象に投与することができる、方法に関する。
いくつかの態様では、対象がＧＰＸ４の変化した発現レベルを有するか否かを決定することは、対象からがん試料を得ることと、試料をＧＰＸ４発現レベルについて分析することとを含む。
本明細書に記載されるＧＰＸ４発現のレベルは、当該技術分野の任意の方法を使用して決定することができる。例えば、発現レベルは、核酸（例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）または遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を検出することによって決定され得る。したがって、いくつかの態様では、発現レベルは、転写されたＲＮＡレベル及び／または発現されたタンパク質レベルである。いくつかの態様では、ＲＮＡレベルは、配列決定方法、例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用して決定される。いくつかの態様では、ＮＧＳは、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、ＥｄｇｅＳｅｑ、ＰＣＲ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ、もしくはこれらの組み合わせ、またはＲＮＡを測定する任意の技術である。いくつかの態様では、ＲＮＡ測定方法は、ヌクレアーゼ保護を含む。いくつかの態様では、ＲＮＡレベルは蛍光を使用して決定される。いくつかの態様では、ＲＮＡレベルは、Ａｇｉｌｅｎｔによって販売されるようなＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイまたはマイクロアレイを使用して決定される。
いくつかの態様では、試料のＧＰＸ４発現レベルの分析には、ＰＣＲ（例えば、リアルタイムＰＣＲ）、シーケンシング（例えば、ディープシーケンシングまたは次世代シーケンシング、例えば、ＲＮＡ－Ｓｅｑ）、マイクロアレイ発現プロファイリング、免疫組織化学的方法、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン解析、ＨＰＬＣ、プロテオミクスアッセイ、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤は、Ａｇ－６３６、ＡＳＬＡＮ００３、ＢＡＹ２４０２２３４、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、ＩＭＵ－８３８、ＰＰ－００１、ＰＴＣ２９９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらなる態様では、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤は、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、フェロトーシス誘導剤は、スルファサラジン、ロシグリタゾン、マレイン酸ロシグリタゾン、バルドキソロンメチル、リナグリプチン、クルクミン、ジレウトン、ピオグリタゾンＨＣｌ、ノルディヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）、トログリタゾン、セタナキシブ、メシル酸デフェロキサミン、トシル酸ソラフェニブ、シスプラチン、ロサデュスタット、ラパチニブ、シンバスタチン、デフェラシロックス、ソラフェニブ、エラスチン、イミダゾールケトンエラスチン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらなる態様では、フェロトーシス誘導剤は、スルファサラジンＲＳＬ３、（１Ｓ，３Ｒ）－ＲＳＬ３、ＭＬ２１０、ＭＬ１６２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、フェロトーシス誘導剤は、クラス（ｉｉｉ）フェロトーシス誘導剤ではない。いくつかの態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤は、クラス（ｉ）フェロトーシス誘導剤と組み合わせて投与される。いくつかの態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤は、クラス（ｉｉ）フェロトーシス誘導剤と組み合わせて投与される。いくつかの態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤は、クラス（ｉｖ）フェロトーシス誘導剤と組み合わせて投与される。
いくつかの態様では、対象は、ヒトである。
いくつかの態様では、がん試料は、腫瘍組織、腫瘍内組織、血液試料、骨髄、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様では、ＧＰＸ４発現レベルは、例えば、本明細書に開示されるように、配列決定またはＲＮＡもしくはタンパク質発現レベルを測定する任意の技術を使用して決定される。
本明細書に開示される方法はまた、ＧＰＸ４発現レベルの決定に少なくとも部分的に基づいて、予防及び／または治療を処方、開始、及び／または変更するなどの追加のステップを含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法は、（ａ）化学療法を投与すること、（ｂ）手術を行うこと、（ｃ）放射線療法を投与すること、または（ｄ）それらの任意の組み合わせをさらに含む。
他の態様では、本明細書に開示される方法は、がん療法のための標準的なケアと組み合わせることができる。いくつかの態様では、標準的なケアとしては、化学療法、放射線療法、免疫療法の投与、標的療法の投与、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、本明細書に開示される方法は、がん負荷を軽減する。
いくつかの態様では、がん負荷は、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤の投与前のがん負荷と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または約５０％減少する。
いくつかの態様では、対象は、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤の初回投与後、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約７ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約９ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、少なくとも約１１ヶ月、少なくとも約１年、少なくとも約１８ヶ月、少なくとも約２年、少なくとも約３年、少なくとも約４年、または少なくとも約５年の無増悪生存を示す。
いくつかの態様では、対象は、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤の初回投与から約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１年、約１８ヶ月、約２年、約３年、約４年、または約５年後に安定した疾患を示す。「安定した疾患」という用語は、がんの存在についての診断を指すが、がんは、例えば、イメージングデータ及び／または最良の臨床的判断によって決定されるように、治療されており、安定した状態、すなわち、進行性ではない状態に留まる。「進行性疾患」という用語は、画像化データ及び／または最良の臨床的判断によって決定されるように、がんの高活性状態、すなわち、治療されておらず、安定していない、または治療されて、療法に応答していない、または治療されて、活性疾患が残っている状態の存在についての診断を指す。
「安定した疾患」は、治療開始時（すなわち、治療前）の初期腫瘍体積と比較して、治療過程中の（一時的な）腫瘍縮小／腫瘍体積の減少を包含することができる。この関連において、「腫瘍縮小」は、治療開始時（すなわち、治療前）の初期体積と比較して、治療時の腫瘍の体積の減少を指すことができる。例えば、１００％未満（例えば、治療開始時の初期体積の約９９％～約６６％）の腫瘍体積は、「安定した疾患」を表すことができる。
「安定した疾患」は、あるいは、治療開始時（すなわち、治療前）の初期腫瘍体積と比較して、治療過程中の（一時的な）腫瘍増殖／腫瘍体積の増加を包含することができる。この関連において、「腫瘍成長」は、治療の開始時（すなわち、治療の前）の初期体積と比較して、治療阻害剤時の腫瘍の体積の増加を指すことができる。例えば、１００％を超える（例えば、初期体積の約１０１％～約１３５％、好ましくは治療開始時の初期体積の約１０１％～約１１０％）腫瘍体積は、「安定した疾患」を表すことができる。
「安定した疾患」という用語は、以下の態様を含むことができる。例えば、腫瘍体積は、例えば、処置後に縮小しない（すなわち、腫瘍増殖が停止する）か、または例えば、処置の開始時に縮小するが、腫瘍が消失するまで縮小し続けない（すなわち、腫瘍増殖が最初に回復するが、腫瘍が例えば、初期体積の６５％未満になる前に、腫瘍が再び増殖する）かのいずれかである。
いくつかの態様では、対象は、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤の初回投与から約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１年、約１８ヶ月、約２年、約３年、約４年、または約５年後に部分奏効を示す。
いくつかの態様では、対象は、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤の初回投与から約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１年、約１８ヶ月、約２年、約３年、約４年、または約５年後に完全奏効を示す。
本明細書で使用される場合、「奏効」という用語は、例えば、がんが転移したときの「腫瘍縮小」または腫瘍数の減少を指すことができる。「奏効」という用語は、患者または腫瘍の「完全奏効」または「部分奏効」にも反映され得る。本明細書で使用される「完全奏効」という用語は、本明細書に開示される特定の療法に応答して、がんの全ての徴候の消失を指すことができる。「完全奏効」という用語及び「完全寛解」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。例えば、「完全奏効」は、腫瘍が消失するまで、腫瘍の継続的な縮小に反映することができる（添付の実施例に示すように）。治療の開始時（すなわち、それ以前）の初期腫瘍体積（１００％）と比較して、例えば、０％の腫瘍体積は、「完全奏効」を表すことができる。
本明細書に開示されるＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤による処置は、「部分応答」（または部分寛解、例えば、処置に応答して、腫瘍のサイズの減少、または体内のがんの程度の減少）をもたらし得る。「部分奏効」は、治療開始時（すなわち、治療前）の初期腫瘍体積と比較して、治療過程中の（一時的な）腫瘍縮小／腫瘍体積の減少を包含することができる。
いくつかの態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤を投与することは、治療を受けていない対象の無増悪生存確率と比較して、無増悪生存確率を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、または少なくとも約１５０％改善する。
いくつかの態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤を投与することは、治療を受けない対象の全生存確率と比較して、全生存確率を少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、少なくとも約３００％、少なくとも約３２５％、少なくとも約３５０％、または少なくとも約３７５％改善する。
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、試料（例えば、がん試料または生体試料）は、例えば、ヘルスケア提供者（例えば、医師）またはヘルスケア利益提供者によって要求され、同じまたは異なるヘルスケア提供者（例えば、看護師、病院）または臨床検査室によって取得及び／または処理され、処理後、結果は、元のヘルスケア提供者またはさらに別のヘルスケア提供者、ヘルスケア利益提供者または患者に転送され得る。同様に、本明細書に開示されるＧＰＸ４の発現レベルの定量化、例えば、対照試料の発現レベルと対象の発現レベルとの比較、ＧＰＸ４の不在または存在の評価、特定の閾値に関するＧＰＸ４発現レベルの決定、処置決定、またはそれらの組み合わせは、１つ以上のヘルスケア提供者、ヘルスケア利益提供者、及び／または臨床検査室によって行うことができる。
本明細書で使用される場合、「ヘルスケア提供者」という用語は、生体の対象、例えば、ヒト患者と直接やりとりを行い、それに投与する個人または機関を指す。ヘルスケア提供者の非限定的な例としては、医師、看護師、技術者、セラピスト、薬剤師、カウンセラー、代替医療の開業医、医療施設、医師のオフィス、病院、救急治療室、診療所、緊急治療センター、代替医療の診療所／施設、及び一般的及び／または専門的な治療、評価、維持、療法、投薬、及び／または患者の健康状態の全てまたは一部に関連するアドバイス（限定されないが、一般的な医療、専門的な医療、外科、及び／または任意の他のタイプの治療、評価、維持、療法、投薬、及び／またはアドバイスを含む）を提供する任意の他の団体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「臨床検査室」という用語は、生体対象、例えば、ヒトに由来する材料の検査または処理のための施設を指す。処理の非限定的な例としては、例えば、生体対象、例えば、ヒトの疾患または障害の診断、予防、または治療、または健康の評価のために情報を提供する目的で、人体に由来する材料の生物学的、生化学的、血清学的、化学的、免疫学的、血液学的、生物物理学的、細胞学的、病理学的、遺伝的、または他の検査が挙げられる。これらの検査はまた、試料を収集するか、またはそれ以外の方法で取得するための手順、生体対象、例えば、ヒトの体内における様々な物質、または生体対象、例えば、ヒトの体内から得られた試料中の様々な物質を調製、決定、測定、またはそうでなければその存在または非存在を説明する手順を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「ヘルスケア給付提供者」という用語は、１つ以上のヘルスケア給付、給付プラン、健康保険、及び／またはヘルスケア費用アカウントプログラムを提供する、提示する、提供する、全体的または部分的に支払う、または患者にアクセスを与えることに関連する、個々の当事者、組織、またはグループを包含する。
いくつかの態様では、ヘルスケア提供者は、がんを治療するために、本明細書に開示されるＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤を投与すること、または別のヘルスケア提供者にその投与を行うよう指示することができる。ヘルスケア提供者は、試料を取得する、試料を処理する、試料を提出する、試料を受け取る、試料を移送する、試料を分析または測定する、試料を定量化する、試料を分析／測定／定量化した後に得られた結果を提供する、試料を分析／測定／定量化した後に得られた結果を受け取る、１つ以上の試料を分析／測定／定量化した後に得られた結果を比較／スコアリングする、１つ以上の試料から比較／スコアを提供する、１つ以上の試料から比較／スコアを取得する、療法を投与する、療法の投与を開始する、療法の投与を中止する、療法の投与を継続する、一時的に中断する、投与される治療薬の量を増加させる、投与される治療薬の量を減少させる、治療薬の量の投与を継続する、治療薬の投与頻度を増加させる、治療薬の投与頻度を減少させる、治療薬に対する同じ投与頻度を維持する、薬剤または治療薬を少なくとも別の薬剤または治療薬に置き換える、薬剤または治療薬を少なくとも別の薬剤または追加の治療薬と組み合わせる、という作業を実行すること、またはそれを行うようヘルスケア提供者または患者に指示することができる。
いくつかの態様では、ヘルスケア利益提供者は、例えば、試料の収集、試料の処理、試料の提出、試料の受領、試料の移送、試料の分析または測定、試料の定量化、試料の分析／測定／定量化後に得られた結果の提供、試料の分析／測定／定量化後に得られた結果の移送、１つ以上の試料の分析／測定／定量化後に得られた結果の比較／スコアリング、比較／１つ以上の試料からのスコアの移送、療法または治療剤の投与、療法または治療剤の投与の開始、療法または治療剤の投与の中止、療法または治療剤の投与の継続、療法または治療剤の投与の一時的な中断、投与される治療剤の量の増加、投与される治療剤の量の減少、ある量の治療剤の投与の継続、治療剤の投与頻度の増加、治療剤の投与頻度の減少、治療剤の同じ投与頻度の維持、療法または治療剤を少なくとも別の療法または治療剤で置き換えること、または療法もしくは治療剤を少なくとも別の療法または追加の治療剤と組み合わせること、を認可または拒絶することができる。
加えて、ヘルスケア利益は、例えば、療法の処方を認可または拒絶すること、療法の補償を認可または拒絶すること、療法費用の払い戻しを認可または拒絶すること、療法の適格性を決定または拒絶することなどを提供することができる。
いくつかの態様では、臨床検査室は、例えば、試料を収集または取得し、試料を処理し、試料を提出し、試料を受け取り、試料を移送し、試料を分析または測定し、試料を定量化し、試料を分析／測定／定量化した後に得られた結果を提供し、試料を分析／測定／定量化した後に得られた結果を受け取り、１つ以上の試料を分析／測定／定量化した後に得られた結果を比較／スコアリングし、１つ以上の試料から比較／スコアを提供し、１つ以上の試料から比較／スコアを取得し、または他の関連する活動を行うことができる。
ＩＩＩ．医薬組成物
ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤は、任意の他の成分が存在しない生の化学物質の形態で対象に投与することができる。ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤は、好適な薬学的に許容される担体と組み合わせた化合物を含有する医薬組成物の一部として、対象に投与することもできる。かかる担体は、薬学的に許容される賦形剤及び補助剤から選択され得る。「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容されるビヒクル」という用語は、標準的な医薬担体、溶媒、界面活性剤、またはビヒクルのいずれかを包含する。適切な薬学的に許容されるビヒクルとしては、水性ビヒクル及び非水性ビヒクルが挙げられる。標準的な医薬担体及びそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９ｔｈ ｅｄ．１９９５に記載されている。
本開示の範囲内の医薬組成物は、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤が１つ以上の薬学的に許容される担体と組み合わせられている全ての組成物を含む。ある特定の態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤は、その意図される治療目的を達成するのに有効な量で組成物中に存在する。個々の必要性は変化し得るが、各化合物の有効量の最適範囲の決定は当業者の範囲内である。典型的には、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤は、個別にまたは組み合わせて、特定の障害を治療するために、哺乳動物、例えば、ヒトに、１日当たり、哺乳動物の体重１ｋｇ当たり約０．００２５～約１５００ｍｇの用量、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の等量で投与することができる。哺乳動物に投与されるＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤の有用な用量は、個別にまたは組み合わせて、哺乳動物の体重１ｋｇ当たり約０．００２５～約５０ｍｇ、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の等量である。筋肉内注射の場合、用量は、典型的には、経口用量の約半分である。
単位用量は、約０．０１ｍｇ～約１ｇのＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤を、個別にまたは組み合わせて、例えば、約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約２５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約１００ｍｇ、０．０１ｍｇ～約５０ｍｇ、例えば、約０．１ｍｇ～約１０ｍｇの化合物を含み得る。単位用量は、１日１回以上、例えば、それぞれが約０．０１ｍｇ～約１ｇの化合物、または等量のその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含有する１つ以上の錠剤またはカプセルとして投与することができる。
ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤を含む医薬組成物は、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤の有益な効果を経験し得る任意の対象、例えば、その治療を必要とするがん患者に投与することができる。そのような対象の中で最も重要なのは、哺乳動物、例えば、ヒト及びコンパニオン動物であるが、本開示は、そのように限定されることを意図していない。１つのいくつかの態様では、対象は、ヒトである。
いくつかの態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤は、フェロトーシス誘導剤と同時に投与することができる。他の態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤は、フェロトーシス誘導剤とは異なる時間に投与することができる。追加の態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤及びフェロトーシス誘導剤は、連続的に投与することができる。一態様では、ＤＨＯＤＨ阻害剤は、フェロトーシス誘導剤の後に投与することができる。別の態様では、フェロトーシス誘導剤は、ＤＨＯＤＨ阻害剤の後に投与することができる。
本開示の薬学的組成物は、その意図される目的を達成する任意の手段によって投与され得る。例えば、投与は、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、鼻腔内、経粘膜、直腸、膣内、もしくは頬側経路によるもの、または吸入によるものとすることができる。投与される投与量及び投与経路は、特定の対象の状況に応じて、レシピエントの年齢、性別、健康状態及び体重、治療される状態または障害、もしあれば同時治療の種類、治療の頻度、及び所望の効果の性質などの要因を考慮に入れて変化するであろう。
いくつかの態様では、本開示の医薬組成物は、経口的に投与することができる。いくつかの態様では、本開示の医薬組成物は、経口投与することができ、錠剤、糖衣錠、カプセル、または経口液体製剤に製剤化される。いくつかの態様では、経口製剤は、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤を含む押出された多数の粒子を含む。
あるいは、本開示の医薬組成物は、直腸投与することができ、坐薬に製剤化される。
代替的に、本開示の医薬組成物は、注射によって投与することができる。
あるいは、本開示の医薬組成物は、経皮的に投与することができる。
あるいは、本開示の医薬組成物は、吸入によって、または鼻腔内または経粘膜投与によって投与することができる。
代替的に、本開示の医薬組成物は、膣内経路によって投与することができる。
本開示の医薬組成物は、個別にまたは組み合わせて、約０．０１～９９重量％、例えば、約０．２５～７５重量％のＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤、例えば、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、または約７５重量％のＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤を個別にまたは組み合わせて含むことができる。
本開示の薬学的組成物は、それ自体が本開示を考慮して既知となる方法で、例えば、従来の混合、造粒、糖衣錠作製、溶解、押出、または凍結乾燥工程によって製造される。ゆえに、経口使用のための医薬組成物は、活性化合物を固形賦形剤と組み合わせることによって得ることができ、任意に、所望される場合、または必要に応じて、好適な補助剤を添加した後、結果として得られる混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して錠剤または糖衣コアを得る。
好適な賦形剤としては、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール）、セルロース調製物、リン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム）、ならびにデンプンペースト（例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、またはジャガイモデンプンを使用）、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドン等の結合剤が挙げられる。所望される場合、上述のデンプン、及びカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウム等の１つ以上の崩壊剤が添加され得る。
補助剤は、典型的には、流量調節剤及び滑沢剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸またはそれらの塩（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム）、及びポリエチレングリコールである。糖衣コアには、胃液に耐える好適なコーティングが提供される。この目的のために、任意に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る、濃縮された糖類溶液を使用することができる。胃液に耐えるコーティングを生成するために、フタル酸アセチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチル－フタル酸セルロース等の好適なセルロース調製物の溶液が使用され得る。染料または色素を、識別のため、または活性化合物用量の組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。
経口的に使用され得る他の薬学的調製物の例には、ゼラチンで作製された押込嵌めカプセル、またはゼラチン及びグリセロールまたはソルビトール等の可塑剤で作られた軟性、密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、顆粒の形態の化合物を含み得、これは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、及び任意選択的に安定剤、または押出された多粒子の形態で混合することができる。軟性カプセルにおいて、活性化合物は、好ましくは脂肪油または液体パラフィン等の好適な液体中に溶解または懸濁される。加えて、安定剤を添加することができる。
直腸投与のための可能な薬学的調製物には、例えば、１つ以上の活性化合物と坐剤基剤との組み合わせからなる坐薬が含まれる。好適な坐剤基剤には、特に天然及び合成トリグリセリド、ならびに炭化水素パラフィンが含まれる。例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、または炭化水素パラフィン等の、活性化合物と塩基材料との組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用することも可能である。
非経口投与に適した製剤には、例えば、水溶性塩、アルカリ溶液、または酸性溶液等の水溶性形態の活性化合物の水性溶液が含まれる。あるいは、活性化合物の懸濁液を、油性懸濁液として調製することができる。懸濁液などの好適な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油）、合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル）、トリグリセリド、またはポリエチレングリコール－４００（ＰＥＧ－４００）などのポリエチレングリコールが含まれ得る。水性懸濁液は、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる１つ以上の物質を含有し得る。懸濁液は、任意に安定剤を含有し得る。
ＩＶ．キット
いくつかの態様では、本開示は、ＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤（またはＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤を含む組成物）を、本開示の方法を実施するためのそれらの使用を容易にするように包装したキットを提供する。いくつかの態様では、キットは、密封されたボトルまたは容器などの容器に包装されたＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤（またはＤＨＯＤＨ阻害剤及び／またはフェロトーシス誘導剤を含む組成物）を含み、ラベルが容器に貼付されているか、または本開示の方法を実践するための化合物または組成物の使用を説明するキットに含まれている。いくつかの態様では、化合物または組成物は、単位剤形で包装される。このキットは、さらに、意図される投与経路に従ってこの組成物を投与するために適したデバイスを備えることができる。
かかるキットは、本明細書に記載の方法に従って、及び当該技術分野で知られているように、ＧＰＸ４の発現レベル、例えば、ＧＰＸ４ ＲＮＡ、ＧＰＸ４タンパク質、またはその両方を決定するのに使用するための様々な試薬（例えば、濃縮形態）を含むことができる。例えば、かかる試薬は、１つ以上のオリゴヌクレオチド（例えば、ＧＰＸ４に対応するｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド）または抗体（例えば、ＧＰＸ４のタンパク質発現産物を検出することができる抗体）を含むことができる。１つ以上のオリゴヌクレオチドまたは抗体、例えば、捕捉抗体は、固体支持体に既に付着して提供することができる。１つ以上のオリゴヌクレオチドまたは抗体を、検出可能な標識に予め共役させて提供することができる。キットはまた、本明細書に提供される方法の実施をサポートするために、試薬、緩衝剤、及び／または器具を提供することができる。キットはまた、対象のＧＰＸ４発現レベルを決定するための、本明細書に開示される方法またはそれらの実用的な適用を説明するパンフレットまたは説明書を含むことができる。したがって、本開示のキットは、本開示の方法に従って対象のＧＰＸ４発現レベルを決定し、本開示の方法に従って対象を治療し、本開示の方法に従って決定及び治療するためのキットを含む。
以下の実施例は、本開示の様々な態様を実証するために設けるものである。以下の実施例に開示される技術は、本開示の実施において十分に機能するために発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることを当業者は理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示され、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得る特定の例において多くの変更を行うことができることを理解すべきである。
実施例１：ミトコンドリア脂質過酸化及びフェロトーシスのＤＨＯＤＨ調節は、ＧＰＸ４ｌｏｗがんにおける標的化可能な脆弱性を誘発する
方法及び材料
細胞培養試験
ＵＭＲＣ２、ＵＭＲＣ６、及びＲＣＣ４細胞株は、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎから提供を受けた。ＴＫ－１０細胞株は、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＧｏｒｄｏｎ Ｍｉｌｌｓ博士から入手した。他の全てのがん細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。全ての細胞株は、マイコプラズマ汚染がなかった（ベンダーによる試験より）。この試験で使用した細胞株は、ベンダーによって実施された短いタンデムリピートプロファイリングに基づいて、一般的に誤認される細胞株の国際細胞株認証委員会データベースには見出されていないものである。細胞を、１０％（体積／体積；ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で、３７℃で、２０％Ｏ２及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気で培養した。全ての細胞株を１０ｃｍプレートで培養し、次いで、細胞死及び脂質過酸化測定のために１２ウェルプレートで培養した。細胞生存率アッセイの際は、細胞を９６ウェルプレートにて培養した。細胞を、ＲＳＬ３（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ＭＬ１６２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、エラスチン（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＦＩＮ５６（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、またはスルファサラジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むフェロトーシス誘導剤；ブレキナール（Ｔｏｃｒｉｓ）、レフルノミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはテリフルノミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＤＨＯＤＨ阻害剤、細胞死阻害剤リプロキスタチン－１（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）またはＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＥＭＰＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＭｉｔｏＴＥＭＰＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＭｉｔｏＱ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、またはＭｉｔｏＱＨ２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含む酸化防止剤；及びミキソチアゾール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むミトコンドリア複合体ＩＩＩ阻害剤で処理した。
プラスミド構築物
ＧＰＸ４ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を、Ｏｒｉｇｅｎｅ（ＴＲ３１６５６８）から購入した。ＧＰＸ４発現プラスミドは、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ Ｈｅａｌｔｈ ＳｃｉｅｎｃｅｓのＡｉｋｓｅｎｇ Ｏｏｉ博士から得た。ＤＨＯＤＨ及びＦＳＰ１ ｃＤＮＡは、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手し、ｃｉＡＯＸ ｃＤＮＡは、Ａｄｄｇｅｎｅ（＃１１１６６１）から購入し、その後、レンチウイルスベクターｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏにクローニングした。全ての構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子ノックアウト
ヒト細胞株におけるＤＨＯＤＨ、ＡＣＳＬ４及びＣＯＱ２のノックアウトは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及びドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９発現系を使用して、本発明者らの最近の刊行物（Ｌｅｅ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２２，２２５－２３４（２０２０））に記載のように実施した。ｓｇＲＮＡをレンチウイルスレンチガイドベクターにクローニングした。本試験で使用したｓｇＲＮＡの配列を表１に列挙する。ＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅクローンを、ｐｓＰＡＸ２パッケージングプラスミド及びｐＭＤ２．Ｇ発現プラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞を０．８μｇ／ｍｌポリブレンによりレンチウイルスに３日間感染させ、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、ブラスチジン（２μｇ／ｍｌ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）またはハイグロマイシンＢ（２μｇ／ｍｌ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で選抜し、次いで単一細胞を９６ウェルプレートに分類した。単一細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中、３７℃で、２０％Ｏ２及び５％ＣＯ２を含むインキュベーター中で３～４週間維持し、各コロニーをウェスタンブロットによって検証して、標的遺伝子欠失を確認した。ＤＯＸ誘導性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子欠失を有する細胞株を作製するために、細胞をレンチウイルスに感染させ、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、ブラスチジン（２μｇ／ｍｌ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）またはハイグロマイシンＢ（２μｇ／ｍｌ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で２日間選択し、次いで単一の細胞を９６ウェルプレートに選別した。細胞株を確立した後、１μｇ／ｍｌのＤＯＸ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を培地に添加して、選択後４８時間の標的遺伝子欠失を誘導し、次いで、細胞をＤＯＸを含まない培地中で培養して、その後の解析を行った。
Figure 2024508910000002
過剰発現細胞株の生成
標的遺伝子の安定した過剰発現を有する細胞株を、以前に記載されているように作製した（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｋｏｐｐｕｌａ，Ｐ．＆Ｇａｎ，Ｂ，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ １８，７７３－７８３（２０１９）、Ｃｈａｕｈａｎ，Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ ３３，２９５７－２９７０（２０１９））。簡単に言えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、０．８μｇ／ｍｌのポリブレンを使用して、ｐｓＰＡＸ．２及びｐＭＤ２．Ｇ第三世代レンチウイルスパッケージングシステムにより、ｐＬＶＸ－空のベクターまたは標的遺伝子構築物のいずれかでトランスフェクトした。７２時間後、培地中のレンチウイルス粒子を採取し、濾過した後、標的細胞株を感染させた。感染後４８時間で、ピューロマイシンを添加して、形質導入に成功した安定した細胞株を得た。
メタボローム解析
メタボローム解析は、既に記載されているように実施した（Ｌｉｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２，４７６－４８６（２０２０）を参照されたい）。細胞を、抽出時に約７０～８０％のコンフルエンスを確実にするのに十分な密度で３５ｍｍの培養プレートに播種した。ピリミジン合成の代謝トレーサー分析のために、ＨＴ－１０８０細胞をＲＳＬ３及び／またはＬｉｐ－１で２時間処理し、次いで、アミド－１５Ｎ－グルタミンを含有する無薬物培地に移した（この時点を０時間として定義する）。代謝物を、後続の解析のために示される時点で抽出した。培養培地を急速に吸引し、次いで０．６ｍＬの８０％メタノール：２０％水の混合物をドライアイス温度で添加して代謝物を抽出した。プレートをドライアイス上で１５分間インキュベートした後、細胞材料を氷上で掻き取り、予め冷却したエッペンドルフチューブに入れた。細胞破砕物を、４℃、１３，０００ＲＣＦで５分間遠心分離することによってペレット化し、上清を新鮮なチューブに移し、解析までドライアイス上で保存した。解析の直前に、５００μＬの抽出物を窒素ガス流下で乾燥させ、次いで１００μＬの水中に再懸濁した。
完全なプラットフォームは、Ｘｃａｌｉｂｕｒ ３．０．６３ソフトウェアパッケージによって制御されるＡｃｃｅｌａ １２５０ ＨＰＬＣシステム、Ａｃｃｅｌａ Ｏｐｅｎ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、ＭａｙＬａｂ Ｍｉｓｔｒａｓｗｉｔｃｈカラムオーブン、及びＥｘａｃｔｉｖｅ ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計で構成される。クロマトグラフィーを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰカラム（１００×２ｍｍ、２．５μｍ粒径）を用いて行った。溶媒Ａは、水中の１０ｍＭのトリブチルアミン及び１５ｍｍの酢酸であり、溶媒Ｂは、メタノールである。勾配は以下のとおりである：０分、０％Ｂ；２．５分、０％Ｂ；５分、２０％Ｂ；７．５分、２０％Ｂ；１３分、５５％Ｂ；１５．５分、９５％Ｂ；１８．５分、９５％Ｂ；１９分、０％Ｂ；２５分、０％Ｂ。注入体積は１０μＬであった。カラム温度を４０℃に設定し、流量を２００μＬ／分とした。Ｅｘａｃｔｉｖｅは、エレクトロスプレーイオン化インターフェースを備えた負イオン化モードで動作させた。機器のパラメータは、シースガス流量３０（任意の単位）、補助ガス流量１０（任意の単位）、スイープガス流量３（任意の単位）、スプレー電圧３ｋＶ、キャピラリー温度３２５℃、キャピラリー電圧－２５Ｖ、チューブレンズ電圧－５０Ｖである。スキャン範囲は、最大注入時間２５０ｍｓ、１Ｈｚで解像度１００，０００、及びＡＧＣ（自動ゲイン制御）ターゲット１Ｅ６で、８０～１０００ｍ／ｚに設定した。ＭＡＶＥＮ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｓｕｉｔｅ５７を使用して、ピーク面積（上部）として決定されたシグナル強度をデータとして分析した。代謝標識実験については、ＩｓｏＣｏｒｒｅｃｔｏＲ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８，１７９１０（２０１８））を用いて窒素－１５の天然の含有量に対してデータを補正した。
細胞生存率アッセイ
既に記載されているように（Ｋｏｐｐｕｌａ，Ｐ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｓｈｉ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｗ．＆Ｇａｎ，Ｂ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９２，１４２４０－１４２４９（２０１７）、Ｌｉｕ，Ｘ．＆Ｇａｎ，Ｂ，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ １５，３４７１－３４８１（２０１６））、細胞計数キット－８（ＣＣＫ－８，Ｄｏｊｉｎｄｏ）を使用して、生存細胞を測定した。簡潔に述べると、細胞をウェル当たり２×１０４の密度で９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞をＧＰＸ４またはＤＨＯＤＨ阻害剤で４時間処理した。その後、１０μｌのＣＣＫ－８試薬（１ウェル当たり１００μｌの培地）に３７℃で１時間、インキュベーター内で５％のＣＯ２で細胞を曝露した。４５０ｎｍの波長での吸光度を、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して決定した。
脂質過酸化の測定
細胞を１２ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。翌日、細胞を示された時間の間化合物で処理し、トリプシン処理によって回収し、５μＭのＣ１１－ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。細胞を、水浴中で３７℃で３０分間インキュベートした。脂質過酸化を、ＦＬ１検出器上の４８８ｎｍレーザーによりフローサイトメーターＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ を使用して評価した。ウェル当たり少なくとも１０，０００個の単一細胞を解析した。
細胞死アッセイ
細胞死を、フローサイトメーターを使用したヨウ化プロピジウム（Ｒｏｃｈｅ）染色によって以前記載されているように測定した（Ｄａｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４，３１９２－３１９７（２０１７）、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８０，２２４３－２２５６（２０２０））。ヨウ化プロピジウム染色のために、細胞を５０％コンフルエンスの密度で１２ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を異なる試薬で処理した。細胞死を測定するために、（浮遊死細胞を含む）細胞を採取し、５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメーターＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦＬ２検出器を使用して、ヨウ化プロピジウム陽性死細胞集団のパーセンテージを解析した。１ウェル当たり少なくとも１０，０００個の単一細胞を分析し、全ての実験を少なくとも３回実施した。
ＤＨＯＤＨ活性測定
ＤＨＯＤＨ活性は、既に記載されるように（Ｆａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ ３３，ｅ０００２１（２０１３））、還元２，６－ジクロロフェノール－インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の６００ｎｍの吸光度の減少をモニターすることによって、３７℃で分光測光法で決定した。簡潔に述べると、５０μＭのＤＣＰＩＰ、２μｇのロテノン、２μｇのアンチマイシンＡ、５ｍＭのＮａＮ３、及び０．１ｍｇの全細胞溶解物を補充した１ｍＬの標準反応緩衝液中の２０ｍＭのＤＨＯで反応を開始させた。データを、タンパク質のｎｍｏｌ ｍｉｎ－１μｇ－１として表した。
グルタチオン測定
以前に記載されたように、グルタチオンレベルの測定を行い（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０，１１８１－１１９２（２０１８））、その際、１ウェル当たり１×１０５個の細胞を６ウェルディッシュに播種した。細胞を薬物で４時間処理した。細胞をスクレイピングによって回収し、プロトコルに従ってグルタチオンアッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用してグルタチオンの測定のために調製した。ＧＳＨ及びＧＳＳＧ濃度は、標準曲線を使用して計算し、全タンパク質レベルに正規化した。
ＣｏＱ及びＣｏＱＨ２解析
Ｎａｇａｓｅらによって開発された方法の変法を使用して、ユビキノン（ＣｏＱ）及びユビキノール（ＣｏＱＨ２）を培養細胞から抽出し（Ｎａｇａｓｅ，Ｍ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｍｉｔｓｕｉ，Ｊ．＆Ｔｓｕｊｉ，Ｓ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｕｔｒ ６３，２０５－２１０（２０１８））、脳脊髄液中のＣｏＱ及びＣｏＱＨ２を解析した。簡潔には、細胞を最初に３５ｍｍプレート上で約７０％のコンフルエンスまで増殖させた。次いで、細胞を、１ｍＬの無血清室温培養培地中で速やかに１回洗浄して、細胞への代謝摂動を最小限に抑えて、血清由来のＣｏＱ及びＣｏＱＨ２を除去した。１００μＭのｔｅｒｔ－ブチル－ヒドロキノンを含有する６００μＬの調製直後の氷冷イソプロパノールをプレートに添加し、次いで氷上の冷却したプレート上に置いた。細胞を細胞リフターで擦り、細胞懸濁液を氷上のエッペンドルフチューブに移した。短時間のボルテックス後、チューブを４℃で５分間１３，０００ＲＣＦで遠心分離することによって清澄化し、上清を新鮮なチューブに移した。これらの抽出物を、ＬＣ－ＭＳによる分析まで、暗所でドライアイス上で保存した。これらの条件におけるＣｏＱ及びＣｏＱＨ２の相対レベルは、少なくとも４８時間安定していた。
ＣｏＱ及びＣｏＱＨ２レベルを、以前に記載されたリピドミクス法に由来する分析方法を使用して、ＬＣ－ＭＳによって決定した（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２０１９））。抽出物を、４℃に維持されたオートサンプラー中のアンバーガラス試料バイアルに移した。Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３カラム（２．１×１００ｍｍ、１．８μｍ粒径）を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣシステム上で分離を実施した。移動相Ａは、アセトニトリル：１０ｍＭ酢酸アンモニウム及び０．１％酢酸を伴う水（６０：４０、ｖ／ｖ）からなり、移動相Ｂは、イソプロパノール：アセトニトリル：１０ｍＭ酢酸アンモニウム及び０．１％酢酸を伴う水（８５：１０：５、ｖ／ｖ／ｖ）からなるものとした。勾配は０分、４０％Ｂ；１．５分、４０％Ｂ；１２分、１００％Ｂ；１５分、１００％Ｂ；１６分、４０％Ｂ；１７分、４０％Ｂとした。注入体積は１０μＬとした。カラム温度を５５℃に設定し、流量を４００μＬ／分とした。
試料を、加熱されたエレクトロスプレーイオン源を用いた陽イオン化モードで、Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計によって分析した。機器のパラメータは、シースガス流量３０（任意の単位）、補助ガス流量１０（任意の単位）、スイープガス流量３（任意の単位）、スプレー電圧４ｋＶ、キャピラリー温度１２０℃、ヒーター温度５００℃、キャピラリー電圧６５Ｖ、チューブレンズ電圧１００Ｖである。スキャン範囲は、最大注入時間１００ｍｓ、１Ｈｚで解像度１００，０００、及びＡＧＣ（自動ゲイン制御）ターゲット１Ｅ６で、２００～１０００ｍ／ｚに設定した。ＭＡＶＥＮ ｓｏｆｔｗａｒｅ ５７を使用して、ピーク面積（上部）として決定されたシグナル強度をデータとして分析した。ＣｏＱ及びＣｏＱＨ２の両方を、それらのアンモニウム付加物（［Ｍ＋ＮＨ４］＋）として検出した。
定量的逆転写ＰＣＲ
ｑＲＴ－ＰＣＲを、以前に記載されたように行った（Ｌｉｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，４３１－４４２（２０１６）、Ｌｅｅ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７，１９１３４－１９１４６（２０１６））。簡潔に述べると、ＴＲＩｚｏｌ試薬（１５５９６０２６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（１８０６４０１４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＥＲ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（１１７６２５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行い、製造元のプロトコルに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＭＸ３０００Ｐ ｑＰＣＲシステム上で３個の試料でランした。各遺伝子の閾値サイクル（Ｃｔ）値を、β－アクチンの閾値サイクル（Ｃｔ）値に正規化し、２－ΔΔＣｔ法を定量分析に用いた。プライマー配列を表１に列挙する。
免疫ブロット法
タンパク質発現を解析するためのウェスタンブロットを、以前に記載されたように行った（Ｌｉｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３３，３１８３－３１９４（２０１４）、Ｌｉｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４，１６８２－１６９３（２０１４））。簡潔に述べると、細胞ペレット及び組織をＩＰ溶解バッファー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して溶解し、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用してビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってタンパク質濃度を決定した。２５μｇのタンパク質を、ＤＨＯＤＨ（１：１，０００、１４８７７－１－ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、ＧＰＸ４（１：１，０００、ＭＡＢ５４５７、Ｒ＆Ｄシステム）、ビンキュリン（１：３，０００、Ｖ４５０５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＳＬＣ７Ａ１１（１：１，０００、１２６９１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＡＣＳＬ４（１：１，０００、ｓｃ－２７１８００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＣＯＱ２（１：１，０００、ｓｃ－５１７１０７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＦＳＰ１（１：１，０００、ｓｃ－３７７１２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びＦＬＡＧ（１：１０，０００、６６００８－３－Ｉｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）に対する抗体を使用して、免疫ブロット解析に使用した。
組織学及び免疫組織化学
新鮮な腫瘍組織を１０％中性緩衝ホルマリンで一晩固定し、ＰＢＳで一度洗浄し、４℃で７０％エタノールで保存した。組織を脱水し、標準的なプロトコルに従って、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）によってパラフィンに包埋させた。包埋された組織を、Ｈ＆Ｅまたは免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のために５μｍの厚さの切片とした。ＩＨＣ分析は、以前に記載されているように実施した（Ｇａｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １８，４７２－４８４（２０１０）、Ｇａｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７５，１２１－１３３（２００６））。簡潔に述べると、ｋｉ－６７（１：５００、９０２７ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、切断カスパーゼ３（１：５００、９６６１ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、または４－ＨＮＥ（１：４００、ａｂ４６５４５、Ａｂｃａｍ）を含む一次抗体を、４℃で一晩インキュベートした。染色を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣキット及びＤＡＢペルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して行った。画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４３顕微鏡を使用して、×２００倍で腎皮質からランダムに採取した（腫瘍当たり５つの画像）。
細胞株由来異種移植片モデル
全ての異種移植実験は、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認されたプロトコルに従って実施した。この試験は、動物研究に関する全ての関連する倫理規定に準拠している。雌の４～６週齢の無胸腺ヌードマウス（Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから購入し、ＭＤ ＡｎｄｅｒｓｏｎのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ＳｕｒｇｅｒｙのＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容した。がん細胞株を懸濁し、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でカウントし、５×１０６個のＨＴ－１０８０または１×１０７個のＮＣＩ－Ｈ２２６細胞をマウスに皮下注射した。腫瘍が５０～１００ｍｍ３に達したとき、マウスを異なる治療群にランダムに割り当てた。ブレキナールまたはスルファサラジンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、ＰＢＳ中で希釈した。ブレキナールを３日ごとに３０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに腹腔内注射した。スルファサラジンを１００ｍｇ／ｋｇ用量で毎日腹腔内注射した。ＰＢＳ中で希釈したリプロキスタチン－１を１０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日腹腔内注射した。対応する図に示されるように、ブレキナール、スルファサラジン、またはリプロキスタチン－１の毎日の注射を、エンドポイントまで継続した。腫瘍体積は、エンドポイントまで３日ごとに測定し、体積＝長さ×幅２×１／２の式に従って計算した。
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデル
ＰＤＸは、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認されたプロトコルに従って生成された。患者からインフォームドコンセントを取得し、この研究は、ヒト参加者を含む研究に関する全ての関連する倫理規定に準拠している。全てのＮＯＤ ｓｃｉｄ γ（ＮＳＧ）マウスを、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから購入し、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ＳｕｒｇｅｒｙのＡｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容した。この試験で使用したＰＤＸモデルは、もともとＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの肺癌ＰＤＸプラットフォームから得られたものである。ＰＤＸ実験を、以前に記載されたように実施した（Ｌｉｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２，４７６－４８６（２０２０））。簡潔に述べると、冷却したＤＭＥＭ培地中のＰＤＸ腫瘍を体積１～２ｍｍ３の断片にミンチした。次に、各ＰＤＸ腫瘍断片をＮＳＧマウスの背側脇腹に皮下接種した。腫瘍の体積が５０～１００ｍｍ３に達したとき、細胞株由来の異種移植片モデルに記載されているように、マウスをブレキナール、スルファサラジン、及び／またはリプロキスタチン－１の治療のために異なる治療群にランダムに割り当てた。腫瘍体積は、エンドポイントまで３日ごとに測定し、体積＝長さ×幅２×１／２の式に従って計算した。
統計分析及び再現性
細胞培養実験の結果を少なくとも３つの独立した反復から収集した。各群の少なくとも６個の腫瘍からの体積または重量をプロットした。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計的有意性（Ｐ値）は、不対スチューデントｔ検定またはＬｏｇランク検定を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０またはＳＰＳＳ ２５．０によって計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意ではない。
結果
メタボロミクス解析は、ＤＨＯＤＨとフェロトーシス調節とを関連付ける
全般的なメタボローム解析は、複数のがん細胞株におけるＧＰＸ４阻害剤ＲＳＬ３またはＭＬ１６２による短期（２時間）の処理が、ピリミジン生合成の最終生成物であるウリジンの同時蓄積を伴う、ピリミジン生合成の中間体であるＣ－Ａｓｐの著しい枯渇をもたらしたことを明らかにした（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、及び図３Ｄ）。デノボ生合成経路の第１のステップでピリミジン環に組み込まれるアミド窒素で標識されたグルタミンを使用した代謝トレーサー試験は、ＲＳＬ３処理が１５Ｎ－ＵＭＰレベルを有意に増加させ、この効果がフェロトーシス阻害剤であるリプロキスタチン－１によって完全にレスキューされたことを明らかにした（図３Ｅ）。理論に縛られることを望まないが、このメタボローム変化は、急性のＧＰＸ４不活性化に応答してフェロトーシスに対する細胞防御システムを回復させる試みを反映する可能性があるため、ＧＰＸ４阻害によって誘導されるフェロトーシスに対するピリミジン生合成中間体の補充の潜在的な効果を試験した（図１Ｅ）。これらの解析は、ＤＨＯが細胞をＧＰＸ４阻害から保護し、ＯＡは細胞をＧＰＸ４阻害に感作したことを明らかにした。驚くべきことに、ウリジン補給は、ＧＰＸ４阻害剤に対する細胞感受性に影響を及ぼさなかった（図１Ｆ）。ＤＨＯまたはＯＡ補給がその細胞内レベルを劇的に増加させたことを見ることができる（図３Ｆ）。Ｃ－Ａｓｐ補充は、その細胞内レベルを適度に増加させ（図３Ｇ）、したがって、ＲＳＬ３に対するフェロトーシス感受性に影響を及ぼさなかった（図１Ｆ）ため、Ｃ－Ａｓｐは細胞に対して大部分が不透過性であると考えられる。ＤＨＯＤＨ反応の基質及び生成物（図１Ｅ）が、フェロトーシス感受性に反対の効果を及ぼしたことは、ピリミジンヌクレオチドの生成におけるその役割とは独立した方法で、フェロトーシスを調節するＤＨＯＤＨの潜在的な役割を示唆するものであった。これと一致して、ＲＳＬ３誘発性フェロトーシスストレスがＤＨＯＤＨ活性を有意に増加させることが観察された（図３Ｈ）。
ＤＨＯ（またはＯＡ）の補充は、一般に、ＧＰＸ４ｌｏｗ細胞株（ＮＣＩ－Ｈ２２６等）において、ＧＰＸ４ｈｉｇｈ細胞株（ＨＴ－１０８０等）よりもはるかに顕著な保護（または感作）効果を発揮したことが分かる（図１Ｆ、図１Ｇ、図３Ｉ、図３Ｊ、及び図３Ｋ）。ＧＰＸ４ｈｉｇｈ及びＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞株のパネルの解析は、ＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞が一般的にＤＨＯＤＨ阻害剤に対してより感受性であることを明らかにした（図３Ｌ及び図３Ｍ）。アポトーシス阻害剤Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫではなく、リプロキスタチン－１が、ＧＰＸ４ｌｏｗ ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞におけるＤＨＯＤＨ阻害誘発性細胞死を大幅にレスキューした（図１Ｈ及び図２Ａ）が、ＤＨＯＤＨ阻害剤で処理したＧＰＸ４ｈｉｇｈ ＨＴ－１０８０細胞ではその反対の現象が観察された（図１Ｉ及び図２Ｂ）。ＤＨＯＤＨ阻害は、ＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞ではなく、ＧＰＸ４ｌｏｗにおいて、強力な脂質過酸化及びフェロトーシスマーカー遺伝子ＰＴＧＳ２の発現を誘導した（図１Ｊ、図１Ｋ、図２Ａ、及び図２Ｂ）。これらのデータにより、ＤＨＯＤＨ阻害が主にＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞においてフェロトーシスを誘導すること、及びフェロトーシス誘導がＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞よりもＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞のＤＨＯＤＨ阻害に対するより顕著な脆弱性を説明する可能性が高いことが示唆される。ＤＨＯＤＨ阻害は、ＧＰＸ４ｈｉｇｈ ＨＴ－１０８０細胞においてフェロトーシスを誘導しなかったが（図１Ｉ）、そのような細胞を、クラス２ＦＩＮ（ＧＰＸ４活性を阻害するＲＳＬ３及びＭＬ１６２）（図１Ｌ、図１Ｍ、図２Ｃ、図２Ｄ、及び図２Ｅ）またはクラス１ ＦＩＮ（ＳＬＣ７Ａ１１媒介のシスチン輸送を遮断するスルファサラジン及びエラスチン、がん細胞は、主にＳＬＣ７Ａ１１に依存して、ＧＳＨ合成のためのシステインを得る（Ｋｏｐｐｕｌａ，Ｐ．，Ｚｈｕａｎｇ，Ｌ．＆Ｇａｎ，Ｂ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ（２０２０））（図２Ｆ及び図２Ｇ）によって誘導されるフェロトーシスに対して著しく感作した。ＤＨＯＤＨ阻害剤処置は、ＧＰＸ４、ＳＬＣ７Ａ１１、またはＡＣＳＬ４（多くの細胞株においてフェロトーシスに必要な脂質代謝酵素）の発現（Ｄｏｌｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １３，９１－９８（２０１７））、またはＧＳＨレベル（図２Ｈ及び図２Ｉ）に影響を与えなかった。まとめると、これらのデータは、ＤＨＯＤＨ阻害がＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞におけるフェロトーシスを誘導するが、ＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞をフェロトーシスに感作させること、及びフェロトーシスのＤＨＯＤＨ調節が、ＳＬＣ７Ａ１１－ＧＰＸ４シグナル伝達とは独立している（または並行している）可能性が高いことを示唆する。
ＤＨＯＤＨ欠失は、フェロトーシスを促進する
遺伝的アプローチを使用して、フェロトーシス調節におけるＤＨＯＤＨ機能を試験した。Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐｏｒｔａｌの解析（Ｂａｓｕ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４，１１５１－１１６１（２０１３））は、５００を超える薬物の中で、ＧＰＸ４阻害剤がＤＨＯＤＨ発現に対する最も強い耐性相関のいくつかを示すことを明らかにした（図４Ａ）。誘導性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９アプローチ（図５Ａ）によるＧＰＸ４ｈｉｇｈ ＨＴ－１０８０細胞におけるＤＨＯＤＨノックアウト（ＫＯ）は、ＤＨＯＤＨ酵素活性を排除し、実質的な細胞死を誘導し（ただし、明らかなフェロトーシスマーカー遺伝子ＰＴＧＳ２発現または脂質過酸化を誘導することはなかった）、これは、ウリジン補充によって主にレスキューされ得る（図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、及び図５Ｅ）。ＤＨＯＤＨ欠失時の脂質過酸化誘導の欠如は、追加のＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞において確認された（図５Ａ及び図５Ｅ）。（別段記述されない限り、ウリジン補充培地は、ＤＨＯＤＨ ＫＯ細胞を用いた全ての試験において使用した。）ウリジン補充条件下で、ＤＨＯＤＨ欠失は、ＨＴ－１０８０細胞を、ＲＳＬ３またはＭＬ１６２誘発性脂質過酸化及びフェロトーシスに対して著しく感作させ（図４Ｂ、図４Ｃ、図５Ｆ、及び図５Ｇ）、これは、ＡＣＳＬ４欠失によって大部分妨害され得る（図５Ｈ及び図５Ｉ）。ＤＨＯＤＨ欠失は、ＨＴ－１０８０細胞におけるＧＰＸ４、ＳＬＣ７Ａ１１、もしくはＡＣＳＬ４発現レベル、またはＧＳＨレベルに影響を及ぼさなかった（図５Ｊ及び図５Ｋ）。ＨＴ－１０８０細胞とは異なり、ＧＰＸ４ｌｏｗ ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞におけるＤＨＯＤＨ欠失は、ウリジン補充であっても脂質過酸化及びフェロトーシスを強力に誘導し、ウリジン補充は、ＤＨＯＤＨ ＫＯ ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞の長期培養を維持するのに十分ではなかった（図４Ｄ、図４Ｅ、図５Ｌ、図５Ｍ、図５Ｎ、及び図５Ｏ）。追加のＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞（図５Ｌ及び図５Ｐ）におけるＤＨＯＤＨ欠失誘発性脂質過酸化を検証した。したがって、ＤＨＯＤＨの遺伝的アブレーションを伴うデータは、ＤＨＯＤＨ阻害剤を使用してデータをミラーリングした（図１Ｈ、図１Ｉ、図１Ｊ、図１Ｋ、図１Ｌ、及び図１Ｍ）。
上述のデータは、ＤＨＯＤＨとＧＰＸ４との間の遺伝的相互作用のさらなる解析を促した。ＨＴ－１０８０細胞におけるＧＰＸ４部分ノックダウンは、基底細胞の成長または生存率に有意には影響しなかったが、ＤＨＯＤＨ阻害剤誘発性脂質過酸化及びフェロトーシスに対して細胞を著しく感作させた（図４Ｆ、図４Ｇ、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、及び図６Ｄ）。ＨＴ－１０８０細胞におけるＧＰＸ４ノックダウンは、ＤＨＯＤＨレベルを有意に増加させ（図６Ａ）、これは、慢性ＧＰＸ４不活性化に応答してフェロトーシスを抑制しようとする適応細胞応答を表す可能性が高い。ＧＰＸ４ノックダウンＨＴ－１０８０細胞におけるＤＨＯＤＨのさらなる欠失（ＤＨＯＤＨ欠失またはＧＰＸ４ノックダウン単独ではない）は、脂質過酸化及びフェロトーシスを著しく誘導し、これは、フェロトーシス阻害剤であるリプロキスタチン－１による処理によってレスキューされ得る（図４Ｈ、図４Ｉ、図６Ｅ、及び図６Ｆ）が、注目すべきことに、ウリジン補充は、ＤＨＯＤＨ ＫＯ ＨＴ－１０８０細胞における細胞死をレスキューし得るが、ＧＰＸ４ノックダウンを有するそのような細胞においてはレスキューされない（図４Ｉ及び図６Ｇ）。データをまとめると、ＤＨＯＤＨがフェロトーシスを抑制するためにＧＰＸ４と並行して作用し、ＤＨＯＤＨ欠失がＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞（またはＧＰＸ４ノックダウンを伴うＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞）においてフェロトーシスを誘導することが示唆される。
ＤＨＯＤＨとＦＳＰ１との間の遺伝的相互作用を試験した（Ｂｅｒｓｕｋｅｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７５，６８８－６９２（２０１９）、Ｄｏｌｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７５，６９３－６９８（２０１９））。ＦＳＰ１の過剰発現は、ＨＴ－１０８０細胞におけるＲＳＬ３誘発性フェロトーシスを有意に抑制し、逆にその欠失が促進したが、しかしながら、ＦＳＰ１の過剰発現または欠失は、ＤＨＯＤＨ ＫＯ細胞におけるＲＳＬ３誘発性フェロトーシスに影響を及ぼさなかった（図６Ｈ、図６Ｉ、図６Ｊ、及び図６Ｋ）。同様に、ＤＨＯＤＨ阻害剤ブレキナールによる処理は、野生型（ＷＴ）細胞ではＲＳＬ３誘発性フェロトーシスを促進するが、ＦＳＰ１ＫＯ細胞では促進しない（図６Ｌ）。したがって、ＤＨＯＤＨ及びＦＳＰ１は、それぞれ、ミトコンドリア内膜及び形質膜上のこれらの２つのタンパク質の独特の局在と一致して、２つの別々のシステムでフェロトーシスを阻害するように作用する。
ＤＨＯＤＨは、ミトコンドリアにおける脂質過酸化を抑制する
ＤＨＯＤＨは、ミトコンドリア内膜の外面に局在する酵素である（Ｍａｄａｋ，Ｊ．Ｔ．，Ｂａｎｋｈｅａｄ，Ａ．，３ｒｄ，Ｃｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｄ．＆Ｎｅａｍａｔｉ，Ｎ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ １９５，１１１－１３１（２０１９））。ＤＨＯＤＨ ＫＯ ＨＴ－１０８０細胞では、ＤＨＯＤＨ ＷＴの修復が、ＧＰＸ４阻害剤に対するフェロトーシス感受性を修復したが、その触媒不活性変異体（Ｒ１３５Ｃ）またはミトコンドリア局在化に欠陥のある変異体（Δ２－１２）では見られなかったことがわかる（図７Ａ、図７Ｂ、図６Ｍ、図６Ｎ、図６Ｏ、図６Ｐ、及び図６Ｑ）。哺乳動物細胞は、細胞質及びミトコンドリア局在化ＧＰＸ４（ＧＰＸ４ｃｙｔｏ及びＧＰＸ４ｍｉｔｏ）１３を含む、独特の細胞下局在を有するいくつかのＧＰＸ４アイソフォームをコードする。分画分析は、ＧＰＸ４ｈｉｇｈがん細胞が、一般に、ＧＰＸ４ｍｉｔｏとＧＰＸ４ｃｙｔｏとの両方の高い発現を示したことを明らかにした（図８Ａ）。ＧＰＸ４ノックダウンＨＴ－１０８０細胞におけるＧＰＸ４ｃｙｔｏではなく、ＧＰＸ４ｍｉｔｏの修復は、ＤＨＯＤＨ阻害に対する細胞の感受性をレスキューした（図７Ｃ、図７Ｄ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、及び図８Ｅ）。これは、様々な細胞株（図８Ｆ及び図８Ｇ）において生じた。同様に、ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞におけるＧＰＸ４ｃｙｔｏではなく、ＧＰＸ４ｍｉｔｏの過剰発現は、これらの細胞を、ＤＨＯＤＨ阻害剤によって誘導されるＤＨＯＤＨ阻害及び緩和された脂質過酸化に対して耐性を強化した（図７Ｅ、図７Ｆ、図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、及び図９Ｄ）。ＲＴＡ２，２，６，６－テトラメチルピペリジニル－１－オキシ（ＴＥＭＰＯ）は、リプロキスタチン－１と同様に、ＤＨＯＤＨ ＷＴ及びＫＯ ＨＴ－１０８０細胞の両方において、ＧＰＸ４阻害誘発性フェロトーシスをレスキューしたが、対照的に、ミトコンドリア標的化ＴＥＭＰＯ（ｍｉｔｏ－ＴＥＭＰＯ）（Ｔｒｎｋａ，Ｊ．，Ｂｌａｉｋｉｅ，Ｆ．Ｈ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．＆Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．Ｐ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ４４，１４０６－１４１９（２００８））は、ＤＨＯＤＨ ＫＯにおいて実質的な保護を提供したが、そのＷＴ対応体においては提供しなかった（図７Ｇ、図７Ｈ、及び図９Ｅ）。
以前の報告と一致するとおり（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ Ａｎｇｅｌｉ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６，１１８０－１１９１（２０１４））、ｍｉｔｏ－ＢｏＤＩＰＹの染色（ミトコンドリア脂質過酸化を特異的に検出するためのＣ１１－ＢｏＤＩＰＹのミトコンドリア標的バージョン（Ｐｒｉｍｅ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ５３，５４４－５５３（２０１２））は、ＨＴ－１０８０細胞におけるＧＰＸ４阻害時のミトコンドリア脂質過酸化を示さず（図７Ｉ）、注目すべきことに、ＧＰＸ４阻害剤は、ＤＨＯＤＨ ＫＯ ＨＴ－１０８０細胞において強力なミトコンドリア脂質過酸化を誘導し、これはＴＥＭＰＯ、ｍｉｔｏ－ＴＥＭＰＯ、またはリプロキスタチン－１処理によって抑制され得る（図７Ｊ）。ｍｉｔｏ－ＢＯＤＩＰＹ染色の共焦点顕微鏡分析により、ＤＨＯＤＨ ＫＯにおけるＲＳＬ３誘発性ミトコンドリア脂質過酸化が確認されたが、ＷＴ細胞では確認されなかった（図７Ｋ）。同様に、ＧＰＸ４及びＤＨＯＤＨの併用不活性化は、ミトコンドリア脂質過酸化を大規模に誘導し、これは単一の不活性化のいずれでも見られなかった（図９Ｆ、図９Ｇ、図９Ｈ、図９Ｉ、及び図９Ｊ）。ＦＳＰ１の過剰発現または欠失は、ＤＨＯＤＨ ＷＴ細胞またはＫＯ細胞のいずれにおいても、ミトコンドリア脂質過酸化に影響を及ぼさなかった（図９Ｋ、図９Ｌ、及び図９Ｍ）。ミトコンドリア局在化ＦＳＰ１（ＦＳＰ１ｍｉｔｏ、ＦＳＰ１のＮ末端にミトコンドリア標的化配列を付加することによる）の過剰発現は、ＨＴ－１０８０細胞またはＤＨＤＯＨ ＫＯ対応体におけるミトコンドリア脂質過酸化に影響を与えなかったか、またはＲＳＬ３誘発性フェロトーシスにいかなる保護も提供しなかった（図９Ｎ、図９Ｏ、及び図９Ｐ）。これらのデータは、ＦＳＰ１の抗フェロトーシス機能を媒介する際のＦＳＰ１の形質膜局在化の重要な役割を確認している。さらに、ＦＳＰ１をミトコンドリアに単独で標的化することは、ミトコンドリアにおいて、その推定される抗フェロトーシス機能を促進するのに十分ではなく、これは、フェロトーシス調節におけるＦＳＰ１の機能が、細胞質内または形質膜上に局在する追加の調節タンパク質を必要とするため、及び／またはミトコンドリア標的配列の付加が、フェロトーシスの抑制におけるその機能に必要とされるＦＳＰ１のＮ末端ミリストイル化を破壊するためである可能性が高い（Ｂｅｒｓｕｋｅｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７５，６８８－６９２（２０１９）、Ｄｏｌｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７５，６９３－６９８（２０１９））。最後に、ＧＰＸ４ｃｙｔｏではなく、ＧＰＸ４ｍｉｔｏの修復が、ＧＰＸ４ノックダウンＨＴ－１０８０細胞またはＧＰＸ４ｌｏｗ ＮＣＩ－Ｈ２２６細胞におけるＤＨＯＤＨ阻害によって引き起こされるミトコンドリア脂質過酸化を抑制したことを見ることができる（図９Ｑ及び図９Ｒ）。一緒に、このデータは、ＤＨＯＤＨ及びミトコンドリア局在化ＧＰＸ４が、ミトコンドリア脂質過酸化及びフェロトーシスを抑制するために協調的に作用するモデルをサポートする。
ＤＨＯＤＨは、ミトコンドリア内のＣｏＱをＣｏＱＨ２に還元することによってフェロトーシスを抑制する
次に、ＤＨＯＤＨがミトコンドリア脂質過酸化及びフェロトーシスを抑制するメカニズムを検討した。ＤＨＯＤＨ阻害は、ＨＴ－１０８０細胞をクラス１または２のＦＩＮ（図１Ｌ、図１Ｍ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ、及び図２Ｇ）に感作したが、驚くべきことに、ＧＰＸ４タンパク質及びＣｏＱの両方を枯渇させることによって作用するクラス３のＦＩＮ ＦＩＮ５６には感作しなかった（Ｓｈｉｍａｄａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １２，４９７－５０３（２０１６））（図１０Ａ、図１１Ａ、及び図１１Ｂ）ことが見られ、これにより、ＤＨＯＤＨがフェロトーシスをＣｏＱ依存的に調節することが示唆される。ＲＳＬ３とは異なり、ＦＩＮ５６処理は、実質的なミトコンドリア脂質過酸化を誘導し、ＤＨＯＤＨ欠失は、ＦＩＮ５６処理の下でミトコンドリア脂質過酸化をさらに増加させなかった（図１０Ｂ）。ＣｏＱ生合成に関与する主要酵素であるＣＯＱ２の欠失、または４－クロロ安息香酸（４－ＣＢＡ）処置によるＣｏＱ生合成の遮断により、全ＣｏＱレベルが有意に低下し（図１１Ｃ、図１１Ｄ、及び図１１Ｅ）、ＨＴ－１０８０細胞において、ＤＨＯＤＨ ＫＯ対応体（図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ、図１１Ｆ、図１１Ｇ、及び図１１Ｈ）よりもはるかに劇的に、フェロトーシスが促進された。これらのデータは共に、ＤＨＯＤＨが、ＣｏＱ生合成経路と同じシグナル伝達軸において作用して、ミトコンドリア脂質過酸化及びフェロトーシスを抑制することを示す。
ＤＨＯＤＨは、ＤＨＯのＯＡへの酸化を、ミトコンドリア内膜におけるＣｏＱからＣｏＱＨ２への還元に結合させる（Ｍａｄａｋ，Ｊ．Ｔ．，Ｂａｎｋｈｅａｄ，Ａ．，３ｒｄ，Ｃｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｄ．＆Ｎｅａｍａｔｉ，Ｎ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ １９５，１１１－１３１（２０１９））（図１１Ｉ）。ＤＨＯＤＨ阻害がＣｏＱ／ＣｏＱＨ２比を有意に増加させたことを見ることができる（図１０Ｇ及び図１０Ｈ）。ＭｉｔｏＱ及びｍｉｔｏＱＨ２（それぞれ、ＣｏＱ及びＣｏＱＨ２のミトコンドリア標的類似体）の補充は、ＨＴ－１０８０細胞におけるＲＳＬ３またはＭＬ１６２誘発性フェロトーシスに対する限定的な保護を提供し（図１０Ｉ及び図１１Ｊ）（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ Ａｎｇｅｌｉ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６，１１８０－１１９１（２０１４））、対照的に、ｍｉｔｏＱではなく、ｍｉｔｏＱＨ２は、ＤＨＯＤＨ ＫＯ細胞におけるＲＳＬ３またはＭＬ１６２誘導のミトコンドリア脂質過酸化及びフェロトーシスから有意に保護した（図１０Ｊ、図１０Ｋ、図１０Ｌ、図１１Ｊ、及び図１１Ｋ）。これらの結果は、（ｉ）ｍｉｔｏＱＨ２が主に、広範囲のミトコンドリア脂質過酸化を伴う細胞（ＧＰＸ４不活性化を伴うＤＨＯＤＨ ＫＯ細胞など）におけるフェロトーシスを阻害し、（ｉｉ）フェロトーシスを抑制するために、ｍｉｔｏＱをｍｉｔｏＱＨ２に還元するためにＤＨＯＤＨが必要であることを示している。これらの観察は、試験した他の細胞株のほとんどにも見られる（図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、図１２Ｆ、図１２Ｇ、図１２Ｈ、図１２Ｉ、及び図１２Ｊ）。
電子伝達鎖（ＥＴＣ）複合体ＩＩＩは、ＣｏＱＨ２をＣｏＱに戻す。複合体ＩＩＩ阻害剤ミキソチアゾールを用いた処置は、ＣｏＱ／ＣｏＱＨ２比を有意に低下させ、ｍｉｔｏＱＨ２処置と同様に、ＨＴ－１０８０細胞におけるフェロトーシス感受性に影響を及ぼさなかったが、ＤＨＯＤＨ ＫＯ対応体におけるＲＳＬ３誘発性フェロトーシスに対して保護し、ｍｉｔｏＱＨ２よりも中等度の保護効果を有する（図１０Ｊ、図１２Ｋ、図１２Ｌ、図１２Ｍ、及び図１２Ｎ）。これは、ＧＰＸ４の不活性化時に、ＣｏＱＨ２プールの多くがミトコンドリア脂質過酸化物をクエンチすることによって消費され、複合体ＩＩＩに供給するために利用可能なＣｏＱＨ２が少ないためである可能性が高い。最後に、プロトンをポンピングせずにミトコンドリアＣｏＱＨ２をＣｏＱに酸化させるＣｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＡＯＸの過剰発現（Ｈａｋｋａａｒｔ，Ｇ．Ａ．，Ｄａｓｓａ，Ｅ．Ｐ．，Ｊａｃｏｂｓ，Ｈ．Ｔ．＆Ｒｕｓｔｉｎ，Ｐ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ７，３４１－３４５（２００６））は、ＨＴ－１０８０細胞におけるＲＳＬ３誘発性ミトコンドリア脂質過酸化及びフェロトーシスに対して劇的な感作効果を有し、重要なことに、ＤＨＯＤＨ欠失は、ＡＯＸ過剰発現細胞においてさらなるフェロトーシス感作効果をもたらさなかった（図１０Ｍ、図１０Ｎ、及び図１２Ｏ）。理論に拘束されないが、データは、ＤＨＯＤＨが、ミトコンドリア内のＣｏＱをＣｏＱＨ２に還元することによってフェロトーシスを阻害するモデルをサポートする。
ＤＨＯＤＨ阻害剤は、インビボでフェロトーシスを誘導することによってＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍増殖を抑制する
理論に拘束されないが、データが、ＧＰＸ４ｌｏｗがん細胞がＤＨＯＤＨ阻害誘発性フェロトーシスに特に感受性であることを示唆したため、インビボでＧＰＸ４ｌｏｗ腫瘍を処理することにおけるＤＨＯＤＨ阻害剤の治療可能性を調査した。強力かつ特異的なＤＨＯＤＨ阻害剤であるブレキナール（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０，４６４４－４６４９（１９９０）、Ｎａｔａｌｅ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ３，６５９－６６０（１９９２）、Ｕｒｂａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３１，１６７－１６９（１９９２）、Ｍａｒｏｕｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３２，６４－６６（１９９３））をこれらの研究に使用した。ブレキナール処理またはＧＰＸ４ノックダウン単独では、ＨＴ－１０８０異種移植片腫瘍の成長に影響を与えなかったが、ＧＰＸ４ノックダウンは、ＨＴ－１０８０異種移植片腫瘍をＤＨＯＤＨ阻害に対して有意に感作させ、リプロキスタチン－１による処理は、ブレキナール処理下でのＧＰＸ４ノックダウン腫瘍の成長を大幅に回復させた（図１３Ａ、図１３Ｂ、及び図１４Ａ）。さらなる解析は、ブレキナール処理が、対照試料及びＧＰＸ４ノックダウン異種移植片試料の両方において切断カスパーゼ－３またはＫｉ６７染色に影響を及ぼさなかったことを明らかにした（図１４Ｂ、図１４Ｃ、及び図１４Ｄ）が、しかしながら、ブレキナール処理は、ＧＰＸ４－ノックダウン腫瘍において、脂質過酸化マーカーである４－ＨＮＥ染色を劇的に増加させ（Ｌｅｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０，１４６－１６２（２０２０））、対照腫瘍においては増加させなかった（図１３Ｃ、図１３Ｄ、及び図１４Ｂ）。同様に、ブレキナールは、ＧＰＸ４ｌｏｗ ＮＣＩ－Ｈ２２６異種移植片またはＧＰＸ４ｌｏｗ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の腫瘍増殖を有意に抑制したが、ＧＰＸ４ｈｉｇｈ ＰＤＸの腫瘍増殖は抑制せず、ＮＣＩ－Ｈ２２６異種移植片またはＧＰＸ４ｌｏｗ ＰＤＸにおける抑制された腫瘍増殖は、リプロキスタチン－１処理によって回復することができる（図１３Ｅ、図１３Ｆ、図１３Ｇ、図１３Ｈ、図１３Ｉ、図１４Ｅ、及び図１４Ｆ）。さらに、ＤＨＯＤＨアブレーションは、ＮＣＩ－Ｈ２２６異種移植片腫瘍の成長を著しく抑制したが、リプロキスタチン－１及びウリジンによる併用処置は、ＤＨＯＤＨ ＫＯ腫瘍の成長をほぼ完全に回復させ（図１４Ｇ及び図１４Ｈ）、いずれの単独処理ではそうではなく、これはインビトロデータ（図４Ｅ）と一致する。
最後に、ブレキナール及びスルファサラジン（ＳＬＣ７Ａ１１を阻害するクラス１のＦＩＮ（Ｇｏｕｔ，Ｐ．Ｗ．，Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ａ．Ｒ．，Ｓｉｍｍｓ，Ｃ．Ｒ．＆Ｂｒｕｃｈｏｖｓｋｙ，Ｎ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １５，１６３３－１６４０（２００１））による併用処理が、相乗作用で脂質過酸化を誘発して、ＨＴ－１０８０異種移植腫瘍の増殖を抑制したこと、またその抑制された腫瘍増殖が、主にリプロキスタチン－１処理によって回復することができること（図１３Ｊ、図１３Ｋ、図１４Ｉ、図１４Ｊ、図１４Ｋ、及び図１４Ｌ）を理解することができる。ＧＰＸ４ｈｉｇｈ ＰＤＸにおいて同様の観察が見られた（図１３Ｌ、図１４Ｍ、及び図１４Ｎ）。これらの全ての動物試験において、薬物治療は動物の体重に有意な影響を及ぼさず（図１４Ｏ）、これは、治療がインビボで良好に耐容されたことを示唆している。
考察
理論に縛られることなく、独特の細胞下局在を有するフェロトーシスに対する、以下の少なくとも３つの細胞保護システムが存在する（図１５）：サイトゾル及びミトコンドリア中のＧＰＸ４、原形質膜上のＦＳＰ１、及びミトコンドリア中のＤＨＯＤＨ。ＧＰＸ４は、フェロトーシスに対する強力な防御機構を構成し、少なくとも部分的には細胞内でのＧＰＸ４の多用途な局在化に関連しているため、ＧＰＸ４は、全てまたはほとんどの細胞膜で産生される脂質過酸化物を解毒する可能性が高い。フェロトーシス防御機構の区画化も重要な役割を果たし、異なる細胞下区画におけるフェロトーシス調節をさらに理解するための幅広い概念的枠組みを提供する。ＤＨＯＤＨ及びミトコンドリアＧＰＸ４はまた、ミトコンドリア脂質過酸化物を解毒するための２つの主要な防御アームを構成し、したがって、一方のアームを無効にすると、細胞が他方により依存するようになり、両方のアームを無効にすると、主にミトコンドリア脂質過酸化によって誘発されるフェロトーシスを引き起こす可能性がある。ＤＨＯＤＨは、以前のＣＲＩＳＰＲスクリーニングでは同定されなかったが（Ｚｏｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０，１６１７（２０１９）、Ｓｏｕｌａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １６，１３５１－１３６０（２０２０））、それは必須遺伝子である。したがって、ウリジンの補給は、基底細胞の増殖を維持し、したがって、ＤＨＯＤＨ ＫＯ細胞におけるフェロトーシス表現型を明らかにするために必要である。
一方、ブレキナールなどのＤＨＯＤＨ阻害剤は、腫瘍学的臨床試験で試験されており、ブレキナールは患者において忍容性が良好であるが、固形腫瘍に対する広範な有効性を欠いていることが示されている（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０，４６４４－４６４９（１９９０）、Ｎａｔａｌｅ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ３，６５９－６６０（１９９２）、Ｕｒｂａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３１，１６７－１６９（１９９２）、Ｍａｒｏｕｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３２，６４－６６（１９９３））、ＤＨＯＤＨ及び／または合理的な薬物併用戦略の治療的標的化のための具体的な前後関係を特定することが何より必要である。本明細書に記載のデータは、ＧＰＸ４ｌｏｗ固形腫瘍のアレイがＤＨＯＤＨ阻害剤によって効果的に標的化されて腫瘍負荷を軽減することができ、ＤＨＯＤＨ阻害剤とスルファサラジンなどのフェロトーシス誘導剤との組み合わせを使用してＧＰＸ４ｈｉｇｈ固形腫瘍を治療することができることを示す。加えて、ＤＨＯＤＨ阻害剤は、放射線療法及び免疫療法等の、フェロトーシスを誘発することができるがん療法における他の標準的なケアと組み合わせることができる（Ｌｅｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０，１４６－１６２（２０２０）、Ｗａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６９，２７０－２７４（２０１９）、Ｌａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ（２０１９）、Ｙｅ，Ｌ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １５，４６９－４８４（２０２０））。
参照文献
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４６．Ｇａｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．ＦｏｘＯｓ ｅｎｆｏｒｃｅ ａ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒａｉｎ ｍＴＯＲＣ１－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｎａｌ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １８，４７２－４８４（２０１０）．
４７．Ｇａｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ＦＩＰ２００ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦａｌｐｈａ ａｎｄ ＴＳＣ－ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７５，１２１－１３３（２００６）．
ここで本発明を完全に説明したが、当業者であれば、本発明の範囲またはその任意の態様に影響を与えることなく、条件、製剤、及び他のパラメータの広範かつ同等の範囲内で同じことを行うことができることを理解するであろう。
本開示の他の態様は、本明細書に開示される本発明の仕様及び実践の考慮から、当業者には明らかであろう。本明細書及び実施例は、例示的なものにすぎないとみなされることが意図され、本発明の真の範囲及び趣旨は、次の特許請求の範囲によって示される。
本明細書に引用される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる。

Claims (36)

  1. がんを治療するための方法であって、前記治療を必要とする対象に、治療有効量のジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤を投与することを含み、前記がんが、対照試料と比較して変化したグルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）発現を有する、前記方法。
  2. 前記変化したＧＰＸ４発現が、対照試料と比較して、ＧＰＸ４の低い発現レベルである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記がんが、腫瘍である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記腫瘍が、癌腫である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記がんが、再発性、難治性、または少なくとも１つの抗がん剤の投与を含む少なくとも１つの事前の療法後に難治性である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記がんが、線維肉腫、肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、腎細胞癌、乳房腺癌、結腸直腸腺癌、子宮頸管内膜腺癌、またはＴ急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記ＤＨＯＤＨ阻害剤が、Ａｇ－６３６、ＡＳＬＡＮ００３、ＢＡＹ２４０２２３４、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、ＩＭＵ－８３８、ＰＰ－００１、ＰＴＣ２９９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記ＤＨＯＤＨ阻害剤が、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記変化したＧＰＸ４発現が、対照試料と比較して、ＧＰＸ４の高い発現レベルである、請求項１に記載の方法。
  10. 前記がんが、腫瘍である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記腫瘍が、癌腫である、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記がんが、再発性、難治性、または少なくとも１つの抗がん剤の投与を含む少なくとも１つの事前の療法後に難治性である、請求項９に記載の方法。
  13. 前記がんが、線維肉腫、肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、腎細胞癌、乳房腺癌、結腸直腸腺癌、子宮頸管内膜腺癌、またはＴ急性リンパ芽球性白血病から選択される、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記方法が、治療有効量のフェロトーシス誘導剤を投与することをさらに含む、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記フェロトーシス誘導剤が、クラスＩフェロトーシス誘導剤、クラスＩＩフェロトーシス誘導剤、またはそれらの組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記フェロトーシス誘導剤が、スルファサラジン、ロシグリタゾン、マレイン酸ロシグリタゾン、バルドキソロンメチル、リナグリプチン、クルクミン、ジレウトン、ピオグリタゾンＨＣｌ、ノルディヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）、トログリタゾン、セタナキシブ、メシル酸デフェロキサミン、トシル酸ソラフェニブ、シスプラチン、ロサデュスタット、ラパチニブ、シンバスタチン、デフェラシロックス、ソラフェニブ、エラスチン、イミダゾールケトンエラスチン、ＲＳＬ３、（１Ｓ，３Ｒ）－ＲＳＬ３、ＭＬ２１０、ＭＬ１６２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 前記フェロトーシス誘導剤が、スルファサラジン、トシル酸ソラフェニブ、エラスチン、イミダゾールケトンエラシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記対象が、ヒトである、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤により対象を治療する方法であって、前記対象が、がんに罹患しており、前記方法が、
    ａ．前記がん試料において、グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）の発現レベルを決定することと、
    ｂ．前記ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対的なＧＰＸ４発現レベルと比較して低い場合、治療有効量の前記ＤＨＯＤＨ阻害剤を前記対象に投与することか、または
    ｃ．前記ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対的なＧＰＸ４発現レベルと比較して高い場合、治療有効量の前記ＤＨＯＤＨ阻害剤及び治療有効量のフェロトーシス誘導剤を前記対象に投与することと、を含む、前記方法。
  20. がんに罹患している対象を治療する方法であって、前記対象に治療有効量のジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤を投与することを含み、前記投与前に、前記対象が、対照試料中の相対グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）発現レベルと比較してＧＰＸ４の変化した発現レベルを示すことが同定されている、前記方法。
  21. 前記対象がＧＰＸ４の低い発現レベルを示すことが同定されている場合、前記治療が、治療有効量の前記ＤＨＯＤＨ阻害剤を前記対象に投与することを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 前記対象がＧＰＸ４の高い発現レベルを示すことが同定されている場合、前記治療が、治療有効量の前記ＤＨＯＤＨ阻害剤及び治療有効量のフェロトーシス誘導剤を前記対象に投与することを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
  23. 前記対象をＧＰＸ４の変化した発現レベルを示すとして同定することが、前記対象からがん試料を取得し、前記試料を前記ＧＰＸ４の発現レベルについて分析することを含む、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. がんに罹患している対象を、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤による治療に好適であるとして同定する方法であって、対照試料中の相対グルタチオンペルオキシダーゼ４（ＧＰＸ４）発現レベルと比較して、前記対象がＧＰＸ４の変化した発現レベルを有するか否かを決定することを含み、
    ａ．前記ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対ＧＰＸ４発現レベルと比較して低い場合、治療有効量の前記ＤＨＯＤＨ阻害剤を前記対象に投与することができるか、または、
    ｂ．前記ＧＰＸ４の発現レベルが対照試料中の相対ＧＰＸ４発現レベルと比較して高い場合、治療有効量の前記ＤＨＯＤＨ阻害剤及び治療有効量のフェロトーシス誘導剤を前記対象に投与することができる、前記方法。
  25. 前記対象がＧＰＸ４の変化した発現レベルを有するか否かを決定することが、前記対象からがん試料を取得し、前記試料を前記ＧＰＸ４の発現レベルについて分析することを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤が、Ａｇ－６３６、ＡＳＬＡＮ００３、ＢＡＹ２４０２２３４、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、ＩＭＵ－８３８、ＰＰ－００１、ＰＴＣ２９９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 前記ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤が、レフルノミド、ブレキナール、テリフルノミド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記フェロトーシス誘導剤が、クラスＩフェロトーシス誘導剤、クラスＩＩフェロトーシス誘導剤、またはそれらの組み合わせである、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記フェロトーシス誘導剤が、スルファサラジン、ロシグリタゾン、マレイン酸ロシグリタゾン、バルドキソロンメチル、リナグリプチン、クルクミン、ジレウトン、ピオグリタゾンＨＣｌ、ノルディヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）、トログリタゾン、セタナキシブ、メシル酸デフェロキサミン、トシル酸ソラフェニブ、シスプラチン、ロサデュスタット、ラパチニブ、シンバスタチン、デフェラシロックス、ソラフェニブ、エラスチン、イミダゾールケトンエラスチン、ＲＳＬ３、（１Ｓ，３Ｒ）－ＲＳＬ３、ＭＬ２１０、ＭＬ１６２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記フェロトーシス誘導剤が、スルファサラジン、トシル酸ソラフェニブ、エラスチン、イミダゾールケトンエラシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記対象が、ヒトである、請求項１９～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記がん試料が、腫瘍組織、腫瘍内組織、血液試料、骨髄、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１９、２３、または２５～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記ＧＰＸ４の発現レベルが、配列決定またはＲＮＡもしくはタンパク質発現レベルを測定する任意の技術を使用して決定される、請求項１９～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記ＧＰＸ４の発現レベルが、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ディープシーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、ＥｄｇｅＳｅｑ、ＰＣＲ、ナノストリング（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）、マイクロアレイ発現プロファイリング、免疫組織化学的方法、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン解析、ＨＰＬＣ、プロテオミクスアッセイ、またはそれらの組み合わせによって決定される、請求項３３に記載の方法。
  35. ａ．化学療法を投与すること、
    ｂ．手術を行うこと、
    ｃ．放射線療法を投与すること、
    ｄ．免疫療法を投与すること、
    ｅ．標的療法を投与すること、または
    ｆ．それらの任意の組み合わせ、をさらに含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記投与が、がん負荷を低減する、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

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