JP2024507378A - 試料検体の検出のための構造および方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書において、試料中に存在する1つまたは複数の検体分子を検出するための構造および方法が提供される。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の検体分子は、1つまたは複数の超分子構造を使用して検出される。幾つかの実施形態において、超分子構造は、特定の捕捉分子と連結を形成するように構成された特定の捕捉バーコードと連結を形成するように構成される。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、特定の検体分子と相互作用するように構成される。幾つかの実施形態において、超分子構造の場所は、超分子構造に連結された捕捉バーコードおよび/または別のバーコードに従って複数の結合場所を有する基板上にマッピングされる。幾つかの実施形態において、検体分子と超分子構造の間の連結は、シグナルの生成を可能にする。幾つかの実施形態において、生成されたシグナルは、基板上の超分子構造のマッピングされた場所に基づいて試料中の検体分子の同定および定量を可能にする。
【選択図】図1B
【選択図】図1B
Description
相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2021年2月24日出願の米国特許仮出願第63/153,258号の利益を主張するものである。
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2021年2月24日出願の米国特許仮出願第63/153,258号の利益を主張するものである。
背景
個別化医療の現在の状況は、圧倒的にゲノム中心であり、主に個体の内部に存在する遺伝子を定量することに焦点を合わせている。そのようなアプローチは、極めて強力であることが立証されているが、医師に、個体の健康の全体像を提供するものではない。これは、遺伝子が個体の「青写真」であり、病気を発症する可能性を知らせるに過ぎないためである。これらの「青写真」は、個体の健康に何らかの影響を及ぼすように、個体の内部で最初、RNAに転写されて、その後、様々なタンパク質分子、つまり細胞内の実際の「演者」に翻訳される必要がある。
個別化医療の現在の状況は、圧倒的にゲノム中心であり、主に個体の内部に存在する遺伝子を定量することに焦点を合わせている。そのようなアプローチは、極めて強力であることが立証されているが、医師に、個体の健康の全体像を提供するものではない。これは、遺伝子が個体の「青写真」であり、病気を発症する可能性を知らせるに過ぎないためである。これらの「青写真」は、個体の健康に何らかの影響を及ぼすように、個体の内部で最初、RNAに転写されて、その後、様々なタンパク質分子、つまり細胞内の実際の「演者」に翻訳される必要がある。
タンパク質の濃度、タンパク質間の相互作用(タンパク質-タンパク質相互作用またはPPI)、ならびにタンパク質と小分子の間の相互作用は、様々な臓器の健康、恒常性調節機構、およびこれらのシステムと外部環境との相互作用に複雑に結びつく。こうして、タンパク質ならびにPPIに関する定量的情報は、所与の時点で個体の健康の全体像を作成するのに、そして任意の出現しつつある健康問題を予測するのに不可欠である。例えば心筋が受ける(例えば、心臓発作の際)ストレスの量は、末梢血中に存在するトロポニンI/IIおよびミオシン軽鎖の濃度を測定することにより推測することができる。類似のタンパク質バイオマーカーがまた、広く多様な臓器機能不全(例えば、肝疾患および甲状腺障害)、特定のがん(例えば、結腸直腸または前立腺がん)、および感染性疾患(例えば、HIVおよびジカウイルス感染症)に関して同定、検証、および展開されている。これらのタンパク質間の相互作用はまた、新薬開発にとって必須であり、ますます求められつつあるデータセットである。体液の所与の試料中のタンパク質および他の分子を検出および定量する能力は、そのような医療の開発の不可欠な要素である。
概要
本開示は一般に、試料中の検体分子の検出および定量のためのシステム、構造および方法に関する。
本開示は一般に、試料中の検体分子の検出および定量のためのシステム、構造および方法に関する。
幾つかの実施形態において、本明細書において、試料中に存在する検体分子を検出するための方法であって、a)i)複数のコア分子を含むコア構造と、ii)第一の場所でコア構造に連結され、捕捉分子と連結を形成するように構成された捕捉バーコードと、を含む超分子構造を提供すること;b)捕捉バーコードを介して超分子構造を捕捉分子に連結させること;c)超分子構造を試料と接触させ、それにより検体分子が捕捉分子と相互作用してそれに結合し、それにより超分子構造を基底状態から励起状態に移行させること;d)励起状態の超分子構造を介してシグナルを生成させること;およびe)シグナルに基づいて検体分子を検出すること、を含む方法が開示される。
幾つかの実施形態において、本明細書において、試料中に存在する1つまたは複数の検体分子を検出するための方法であって、a)それぞれが、i)複数のコア分子を含むコア構造と、ii)第一の場所でコア構造に連結した捕捉バーコードと、を含む複数の超分子構造を提供すること;b)対応する捕捉バーコードを介して、複数の超分子構造のそれぞれを捕捉分子に連結させること;c)複数の超分子構造を試料と接触させ、それにより複数の超分子構造の1つまたは複数の捕捉分子が、1つまたは複数の検体分子の対応する検体分子と相互作用し、それにより対応する超分子構造を基底状態から励起状態に移行させること;d)励起状態の各超分子構造のシグナルを生成させること;およびe)生成された対応するシグナルに基づいて各検体分子を検出すること、を含む方法が開示される。幾つかの実施形態において、複数の超分子構造を提供することは、1つもしくは複数のウィジェット、1つもしくは複数の固体支持体、1つもしくは複数のポリマーマトリクス、1つもしくは複数の固体基板、1つもしくは複数の分子縮合体、またはそれらの組合わせに付着した超分子構造を提供することを含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の固体基板の各固体基板は、平面基板を含む。幾つかの実施形態において、各平面基板は、複数の結合部位を含み、結合部位のそれぞれが、複数の超分子構造の1つの超分子構造に付着するように構成される。幾つかの実施形態において、各結合部位は、超分子構造に連結された対応する固定分子を介して超分子構造に付着する。幾つかの実施形態において、方法はさらに、複数の結合部位に付着した複数の超分子構造の場所をマッピングすることであって、1)対応する捕捉バーコード、2)超分子構造に連結された固定バーコード、および/または3)超分子構造に連結された別のバーコード、を介してマッピングすることを含む。幾つかの実施形態において、前記マッピングは、複数の超分子構造を提供する前に、および/または複数の分子を試料に接触させる前に、行われる。幾つかの実施形態において、前記マッピングは、対応する結合場所に付着した対応する超分子構造に連結されるように構成された、捕捉分子および対応する検体分子の同定を可能にする。幾つかの実施形態において、複数の超分子構造の2つ以上の超分子構造は、対応する捕捉分子を介して複数の検体分子の同じ検体分子と連結を形成するように構成される。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、方法はさらに、検出された各検体分子を同定することを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、方法はさらに、検出された各検体分子の濃度を定量することを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各捕捉分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー(RNAおよび/またはDNA)、DNA小分子、親和性結合剤、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各アプタマーは、修飾型アプタマーを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各修飾型アプタマーは、特定のタイプの検体分子と特異的に相互作用するように構成される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、方法はさらに、前記検体分子が1分子以上の個数で試料中に存在する場合に、生成されたシグナルに基づいて各検体分子を検出することを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意のシステムでは、システムは、前記検体分子が1分子以上の個数で試料中に存在する場合に、生成されたシグナルに基づいて各検体分子を検出するように構成される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、試料は、複合的な生体試料を含み、方法は、単一分子感度を提供し、それにより複合的な生体試料中の種々の分子濃度のダイナミックレンジおよび定量的捕捉を増加させる。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、1つまたは複数の検体分子は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質,DNA、RNA、有機分子、無機分子、それらの複合体、またはそれらの任意の組合わせを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、シグナルは、蛍光シグナルおよび/または視覚シグナルを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、視覚シグナルは、光シグナル、電気シグナル、またはその両方を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、光シグナルは、マイクロ波シグナル、紫外線、可視光線、近赤外線、光散乱、またはそれらの組合わせを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、シグナルを生成させることは、a)励起状態の対応する超分子構造に連結された各検体分子を前駆体分子と結合させること;ならびにb)検体分子に結合した各前駆体分子をフルオロフォアおよび/または蛍光標識された分子でタグづけし、それにより蛍光シグナルを生成させること、を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、前駆体分子は、ビオチン分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、ビオチン分子は、NHS-ビオチン分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、NHS-ビオチン分子は、アミン反応性NHS-ビオチン分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、蛍光標識された分子は、蛍光標識されたストレプトアビジン、蛍光標識されたアビジン、またはその両方を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、シグナルを生成させることは、励起状態の対応する超分子構造に連結された各検体分子を色素分子でタグづけし、それにより蛍光シグナルを生成させることを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、色素分子は、NHS-色素分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各検体分子を検出することは、生成されたシグナル(複数可)の蛍光読出しを得ること、および各対応する超分子構造を、捕捉分子およびそれに連結されるように構成された検体分子と相関させること、を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各対応する超分子構造を相関させることは、本明細書に記載されたマッピングに基づく。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、検出することは、蛍光顕微鏡を使用して蛍光読出しを得ることを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、シグナルを生成させることは、a)励起状態の対応する超分子構造に連結された各検体分子を前駆体分子と結合させること;およびb)検体分子に結合した各前駆体分子を、光を散乱する分子またはナノ粒子に連結させ、それにより視覚シグナルを生成させること、を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、前駆体分子は、ビオチン分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、ビオチン分子は、NHS-ビオチン分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、NHS-ビオチン分子は、アミン反応性NHS-ビオチン分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、光を散乱する分子またはナノ粒子は、ストレプトアビジン分子、アビジン分子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、ストレプトアビジン分子、アビジン分子、またはその両方は、Qdotまたは金属ナノ粒子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、視覚シグナルは、前駆体分子に連結した大きなストレプトアビジンおよび/またはアビジン分子の視覚化を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各検体分子を検出することは、各前駆体分子と光を散乱する分子またはナノ粒子の間の相互作用を視覚化すること、および各対応する超分子構造を、捕捉分子およびそれに連結されるように構成された検体分子に相関させること、を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各対応する超分子構造を相関させることは、本明細書に記載されたマッピングに基づく。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、検出することは、干渉散乱顕微鏡を使用することを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、シグナルを生成させることは、励起状態の対応する超分子構造に連結した各検体分子を第二の捕捉分子に連結させることを含み、各対応する第二の捕捉分子は、1)蛍光シグナルを生成するように蛍光標識される、または2)対応する検体分子と共に形成された複合体を通したサンドイッチ形成を介して視覚シグナルを生成するために標識されない。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各検体分子を検出することは、生成されたシグナル(複数可)の蛍光読出しを得ること、および各対応する超分子構造を、捕捉分子およびそれに連結されるように構成された検体分子と相関させること、を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各対応する超分子構造を相関させることは、本明細書に記載されたマッピングに基づく。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、検出することは、蛍光顕微鏡を使用して蛍光読出しを得ることを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各検体分子を検出することは、各検体分子と第二の捕捉分子の間の相互作用を視覚化すること、および各対応する超分子構造を、捕捉分子およびそれに連結されるように構成された検体分子に相関させること、を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各対応する超分子構造を相関させることは、本明細書に記載されたマッピングに基づく。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、検出することは、干渉散乱顕微鏡を使用することを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書において、試料中の1つまたは複数の検体分子を検出するためのシステムであって、a)複数の結合場所を含む基板と;b)複数の超分子構造であって、複数の結合場所の各結合場所が複数の超分子構造の1つの超分子構造を受けるように構成され、各超分子構造が、i)複数のコア分子を含むコア構造と、ii)第一の場所でコア構造に連結された捕捉バーコードと、を含む、複数の超分子構造と;c)各捕捉バーコードが複数の捕捉分子の1つの捕捉分子に連結するように構成された複数の捕捉分子と;d)1つまたは複数の検体分子を含む試料であって、試料を基板と接触させると、1つまたは複数の検体分子が複数の捕捉分子の対応する捕捉分子と相互作用し、それにより対応する超分子構造が基底状態から励起状態に移行する、試料と;e)励起状態の超分子構造に基づいてシグナルを生成することが可能なシグナル生成システムと;f)生成されたシグナルに基づいて励起状態の超分子構造に連結された各検体分子を検出するように構成された検出システムと、を含むシステムが開示される。幾つかの実施形態において、シグナルは、蛍光シグナル、視覚シグナル、またはその両方を含む。幾つかの実施形態において、検出システムは、蛍光顕微鏡および/またはiSCATを含む。幾つかの実施形態において、複数の結合場所における複数の超分子構造の場所は、マッピングされるように構成される。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各超分子構造は、ナノ構造である。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各コア構造は、ナノ構造である。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各コア構造の複数のコア分子は、予め定義された形状に配置され、および/または既定の分子量を有する。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、予め定義された形状は、別の超分子構造との交差反応性を限定または防止するように構成される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各コア構造の複数のコア分子は、1つもしくは複数の核酸鎖、1つもしくは複数の分枝状核酸、1つもしくは複数のペプチド、1つもしくは複数の小分子、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各コア構造は独立して、足場デオキシリボ核酸(DNA)オリガミ、足場リボ核酸(RNA)オリガミ、足場ハイブリッドDNA:RNAオリガミ、一本鎖DNAタイル構造、多鎖DNAタイル構造、一本鎖RNAオリガミ、多鎖RNAタイル構造、複数の足場を有する階層的構成のDNAもしくはRNAオリガミ、ペプチド構造、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各検体分子は、化学結合を通して対応する捕捉分子と相互作用する。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各超分子構造に関して、捕捉分子は、捕捉バーコードを通してコア構造に連結され、捕捉バーコードは、第一の捕捉リンカーと、第二の捕捉リンカーと、第一の捕捉リンカーと第二の捕捉リンカーの間に配置された捕捉ブリッジと、を含み、第一の捕捉リンカーは、コア構造上の第一の場所に結合した第一のコアリンカーに結合し、捕捉分子と第二の捕捉リンカーとは、第三の捕捉リンカーとの結合を通して互いに連結される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、捕捉ブリッジは、ポリマーコアを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、捕捉ブリッジのポリマーコアは、特定の配列の核酸(DNAまたはRNA)またはPEGのようなポリマーを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、第一のコアリンカー、第二のコアリンカー、第三のコアリンカー、第一の捕捉リンカー、第二の捕捉リンカー、第三の捕捉リンカーは独立して、反応性分子またはDNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各反応性分子は独立して、アミン、チオール、DBCO、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、NHS-エステル、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、PEGもしくは重合開始剤のような1種もしくは複数のポリマー、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、捕捉バーコードと、1)第一のコアリンカー、および/または2)第三の捕捉リンカーの間の連結は、化学結合を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、化学結合は、共有結合を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、捕捉分子は、化学結合を通して第三の捕捉リンカーに結合される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、捕捉分子は、第三の捕捉リンカーに共有結合される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各超分子構造はさらに、コア構造に連結された固定分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、固定分子は、固定バーコードを介してコア構造に連結され、固定バーコードは、第一の固定リンカーと、第二の固定リンカーと、第一の固定リンカーと第二の固定リンカーの間に配置された固定ブリッジと、を含み、第一の固定リンカーは、コア構造上の第二の場所に結合した第三のコアリンカーに結合され、固定分子は、第二の固定リンカーに連結される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、固定分子は、アミン、チオール、DBCO、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、NHS-エステル、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、PEGのような1種もしくは複数のポリマー、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、固定ブリッジは、ポリマーコアを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、固定ブリッジのポリマーコアは、特定の配列の核酸(DNAまたはRNA)またはPEGのようなポリマーを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、第三のコアリンカー、第一の固定リンカー、第二の固定リンカー、および固定分子は独立して、固定反応性分子またはDNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各固定反応性分子は独立して、アミン、チオール、DBCO、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、NHS-エステル、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、PEGもしくは重合開始剤のような1種もしくは複数のポリマー、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、固定分子は、化学結合を通して第二の固定リンカーに連結される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、固定分子は、第二の固定リンカーに共有結合される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、第一の場所は、コア構造の第一の側に位置し、第二の場所は、コア構造の第二の側に位置する。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、試料中の1つまたは複数の検体分子は、励起状態に移行した1つまたは複数の超分子構造を介して多重化することを通して同時に検出される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、複数の超分子構造の各コア構造は、互いに同一である。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各超分子構造は、既定の形状、サイズ、分子量、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各超分子構造は、複数の捕捉分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、各超分子構造は、既定の化学量論の捕捉分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、複数の超分子構造の少なくとも1つの超分子構造は、他の超分子構造と異なる検体分子を検出するように構成される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、試料は、生物学的粒子または生体分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、試料は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質,DNA、RNA、有機分子、ウイルス粒子、エクソソーム、オルガネラ、またはそれらの任意の複合体を含む水溶液を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法またはシステムでは、試料は、組織生検、血液、血漿、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、細胞外液、培養細胞、培地、廃棄組織、植物性物質、合成タンパク質、細菌および/もしくはウイルス試料もしくは真菌組織、またはそれらの組合わせを含む。
幾つかの実施形態において、超分子構造は、別の超分子構造との交差反応を低減または排除するために、既定の形状、サイズ、分子量、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、超分子構造は、複数の捕捉分子および検出分子を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造は、別の超分子構造との交差反応を低減または排除するために、既定の化学量論の捕捉分子および検出分子を含む。
幾つかの実施形態において、試料は、生物学的粒子または生体分子を含む。幾つかの実施形態において、試料は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質,DNA、RNA、有機分子、ウイルス粒子、エクソソーム、オルガネラ、またはそれらの任意の複合体を含む水性溶液を含む。幾つかの実施形態において、試料は、組織生検、血液、血漿、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、細胞外液、培養細胞、培地、廃棄組織、植物性物質、合成タンパク質、細菌および/もしくはウイルス試料もしくは真菌組織、またはそれらの組合わせを含む。
開示された装置、送達システム、または方法の具体的実施形態を、ここに図面を参照して記載する。この詳細な記載における如何なるものも、任意の特定の成分、特色またはステップが本発明に必須であることを暗示しないと意図される。
詳細な記載
本出願全体を通して、本開示の様々な実施形態が、範囲の形式で提示される場合がある。範囲の形式での記載が単に利便性および簡潔性のためであることが理解されなければならず、本発明の範囲への変更できない限定と解釈されてはならない。したがって範囲の記載は、可能な部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値の全てを具体的に開示していると考えるべきである。例えば1~6などの範囲の記載は、1~3、1~4、1~5、2~4、2~6、3~6などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば1、2、3、4、5および6を具体的に開示していると考えるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず、適用される。
本出願全体を通して、本開示の様々な実施形態が、範囲の形式で提示される場合がある。範囲の形式での記載が単に利便性および簡潔性のためであることが理解されなければならず、本発明の範囲への変更できない限定と解釈されてはならない。したがって範囲の記載は、可能な部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値の全てを具体的に開示していると考えるべきである。例えば1~6などの範囲の記載は、1~3、1~4、1~5、2~4、2~6、3~6などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば1、2、3、4、5および6を具体的に開示していると考えるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず、適用される。
用語「約」および「およそ」は、当業者により決定される特定の値に関する許容できる誤差範囲内を意味し、これは、値が測定または決定される方法、即ち測定システムの限界に一部依存する。例えば「約」は、当該技術分野での実践ごとに、1以上の標準偏差以内を意味し得る。あるいはこの用語は、所与の値の20%まで、10%まで、5%まで、または1%までの範囲を意味し得る。あるいはこの用語は、値の1桁以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味し得る。
本明細書で用いられる用語「検体」および「検体分子」は、互換的に用いられる。
本明細書で用いられる用語「結合する」、「結合した」、および「相互作用」は、互換的に用いられ、一般に高分子間の(例えば、タンパク質と核酸の間の)非共有結合性の相互作用を指す。非共有結合性の相互作用の状態では、高分子は、「会合している」または「相互作用している」または「結合している」と言われる(例えば、分子Xが、分子Yと相互作用するといわれる場合、分子Xが分子Yと非共有結合性の方法で結合することを意味する)。
本明細書で用いられる用語「付着している」、「連結している」、「連結」および「連結する」は、互換的に用いられ、一般に1つの物体を別の物体につなぐことを指す。例えばオリゴマーおよびプライマーが、捕捉部位の表面に付着されてもよい。付着のメカニズムに関して、企図される方法は、ビオチン化プライマーなどのビオチン部分、アンプリコン、およびプローブの、ストレプトアビジンなどへのライゲート、非共有結合、結合のような付着手段を含む。捕捉分子は、例えば超分子構造に直接的に(例えば、共有結合、ビオチン-ストレプトアビジン結合、DNAオリゴヌクレオチドリンカー、またはポリマーリンカーを介して)、または間接的に(例えば、固定鎖との連結を介して、例えばコンジュゲーションにより、または捕捉鎖などのリンカーを通して)付着されてもよい。
単一分子解析アッセイをマイクロ流体チップ上で多重化されたハイスループット/並行方式で実施することは、生体試料のマルチオミック特徴のための多くの商業的に実用化された装置において重要である。多様なそのようなアッセイが、DNAシークエンシングおよび単一分子定量に関する文献に存在する。タンパク質同定および定量のための質量分析法および他の親和性ベースの方法(抗体ベースの測定など)は、ハイコンテントプロテオミクスの分野を古典的に支配してきたが、技術的問題から処理量および交差反応に及ぶ制約を受ける。修飾型アプタマーなどのタンパク質結合親和性結合剤は、ヒトのプロテオームを先例のないレベルまで定量し、高い感度および特異度で改善された診断および治療のためのバイオマーカーの開発を可能にする、高度に多重化された技術を表す。修飾型アプタマーの例としては、SOMAmer(登録商標)が挙げられる。SomaScan(登録商標)アッセイは、悪性腫瘍、心血管機能不全、および炎症状態のような種々の疾患の潜在的バイオマーカーを同定するために用いられてきた。この迅速で拡張性の高い大規模並行多重化技術は、個別化診断および治療の発展を可能にする強力なツールである。
本明細書において、試料中に存在する1つまたは複数の検体分子を検出および定量するためのシステムおよび方法を開示する。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の検体分子は、1つまたは複数の超分子構造と、超分子構造に連結された1つまたは複数の捕捉分子と、を使用して検出され、各捕捉分子は、一意的検体分子と結合するように構成される。幾つかの実施形態において、捕捉分子のそれぞれが、親和性結合剤を含む。幾つかの実施形態において、各親和性結合剤は、アプタマーを含む。幾つかの実施形態において、各アプタマーは、修飾型アプタマーを含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の超分子構造は、互いとの交差反応を最小限にするように特異的に設計される。幾つかの実施形態において、対応する捕捉分子に結合した検体分子は、生成されたシグナルを通して検出されるように構成される。幾つかの実施形態において、シグナルは、蛍光シグナルまたは視覚シグナルを含む。幾つかの実施形態において、シグナルは、標識された検体分子に相関する。幾つかの実施形態において、複数の超分子構造は、アレイ基板上に提供され、超分子構造は、アレイ上の各超分子構造の場所をマッピングするためにバーコードを付与される。幾つかの実施形態において、超分子構造は、特定の捕捉分子との連結を提供する捕捉バーコードを介してバーコードを付与され、および/または超分子構造は、それに付与された他のバーコードを通してバーコードを付与される。幾つかの実施形態において、検体分子は、基板アレイ上の超分子構造のマッピングされた場所を使用して検出および/または定量される。
試料
幾つかの実施形態において、試料は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質,DNA、RNA、有機分子、無機分子、それらの複合体、またはそれらの任意の組合わせを含む水溶液を含む。幾つかの実施形態において、試料中の検体分子は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質,DNA、RNA、有機分子、無機分子、それらの複合体、またはそれらの任意の組合わせを含む。幾つかの実施形態において、検体分子は、インタクトタンパク質、変性タンパク質、部分的もしくは完全に分解されたタンパク質、ペプチド断片、変性核酸、分解核酸断片、それらの複合体、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、試料は、組織、細胞、組織および/もしくは細胞の環境、またはそれらの組合わせから得られる。幾つかの実施形態において、試料は、組織生検、血液、血漿、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、細胞外液、培養細胞、培地、廃棄組織、植物性物質、合成タンパク質、細菌、ウイルス試料、真菌組織、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、試料は、精製された、または精製されていない、細胞、組織、体液(例えば、血液)、環境試料、またはそれらの組合わせなどの一次供給源から単離される。幾つかの実施形態において、細胞は、機械的工程または他の細胞溶解法(例えば、溶解緩衝液)を使用して溶解される。幾つかの実施形態において、試料は、機械的工程(例えば、遠心分離)、ミクロンフィルターによる濾過、クロマトグラフィーカラム、他の濾過方法、またはそれらの組合わせを利用して濾過される。幾つかの実施形態において、試料は、1種もしくは複数の核酸または1種もしくは複数のタンパク質を除去するために、1種または複数の酵素で処置される。幾つかの実施形態において、試料は、インタクトタンパク質、変性タンパク質、部分的もしくは完全に分解されたタンパク質、ペプチド断片、変性核酸または分解核酸断片を含む。幾つかの実施形態において、試料は、1人もしくは複数の個人、1匹もしくは複数の動物、1株もしくは複数の植物、またはそれらの組合わせから収集される。幾つかの実施形態において、試料は、感染性疾患、免疫障害、癌、遺伝子疾患、変性疾患、生活習慣病、傷害、希少疾患、加齢関連疾患、またはそれらの組合わせを含む疾患または障害を有する個々の人、動物および/または植物から回収される。
幾つかの実施形態において、試料は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質,DNA、RNA、有機分子、無機分子、それらの複合体、またはそれらの任意の組合わせを含む水溶液を含む。幾つかの実施形態において、試料中の検体分子は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質,DNA、RNA、有機分子、無機分子、それらの複合体、またはそれらの任意の組合わせを含む。幾つかの実施形態において、検体分子は、インタクトタンパク質、変性タンパク質、部分的もしくは完全に分解されたタンパク質、ペプチド断片、変性核酸、分解核酸断片、それらの複合体、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、試料は、組織、細胞、組織および/もしくは細胞の環境、またはそれらの組合わせから得られる。幾つかの実施形態において、試料は、組織生検、血液、血漿、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、細胞外液、培養細胞、培地、廃棄組織、植物性物質、合成タンパク質、細菌、ウイルス試料、真菌組織、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、試料は、精製された、または精製されていない、細胞、組織、体液(例えば、血液)、環境試料、またはそれらの組合わせなどの一次供給源から単離される。幾つかの実施形態において、細胞は、機械的工程または他の細胞溶解法(例えば、溶解緩衝液)を使用して溶解される。幾つかの実施形態において、試料は、機械的工程(例えば、遠心分離)、ミクロンフィルターによる濾過、クロマトグラフィーカラム、他の濾過方法、またはそれらの組合わせを利用して濾過される。幾つかの実施形態において、試料は、1種もしくは複数の核酸または1種もしくは複数のタンパク質を除去するために、1種または複数の酵素で処置される。幾つかの実施形態において、試料は、インタクトタンパク質、変性タンパク質、部分的もしくは完全に分解されたタンパク質、ペプチド断片、変性核酸または分解核酸断片を含む。幾つかの実施形態において、試料は、1人もしくは複数の個人、1匹もしくは複数の動物、1株もしくは複数の植物、またはそれらの組合わせから収集される。幾つかの実施形態において、試料は、感染性疾患、免疫障害、癌、遺伝子疾患、変性疾患、生活習慣病、傷害、希少疾患、加齢関連疾患、またはそれらの組合わせを含む疾患または障害を有する個々の人、動物および/または植物から回収される。
超分子構造
幾つかの実施形態において、超分子構造は、分子を空間的に組織化することができるプログラム可能な構造である。幾つかの実施形態において、超分子構造は、超分子DNAオリガミ構造である。幾つかの実施形態において、超分子構造は、互いに連結された複数の分子を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造の複数の分子は、互いの少なくとも幾つかと相互作用する。幾つかの実施形態において、超分子構造は、特異的形状を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造は、超分子構造の複数の分子に基づく既定の分子量を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造は、ナノ構造である。幾つかの実施形態において、複数の分子は、結合、化学結合、物理的付着、またはそれらの組合わせを通して互いに連結される。幾つかの実施形態において、超分子構造は、互いに特異的に相互作用する明確に定義された数のより小さい分子から形成された、特異的形状および分子量の大きい分子実体を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造の構造的、化学的、および物理的特性は、明示的に設計される。幾つかの実施形態において、超分子構造は、既定の距離に従って空間的に離れた複数の部分的構成を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造の少なくとも一部は、剛性である。幾つかの実施形態において、超分子構造の少なくとも一部は、半剛性である。幾つかの実施形態において、超分子構造の少なくとも一部は、可撓性である。
幾つかの実施形態において、超分子構造は、分子を空間的に組織化することができるプログラム可能な構造である。幾つかの実施形態において、超分子構造は、超分子DNAオリガミ構造である。幾つかの実施形態において、超分子構造は、互いに連結された複数の分子を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造の複数の分子は、互いの少なくとも幾つかと相互作用する。幾つかの実施形態において、超分子構造は、特異的形状を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造は、超分子構造の複数の分子に基づく既定の分子量を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造は、ナノ構造である。幾つかの実施形態において、複数の分子は、結合、化学結合、物理的付着、またはそれらの組合わせを通して互いに連結される。幾つかの実施形態において、超分子構造は、互いに特異的に相互作用する明確に定義された数のより小さい分子から形成された、特異的形状および分子量の大きい分子実体を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造の構造的、化学的、および物理的特性は、明示的に設計される。幾つかの実施形態において、超分子構造は、既定の距離に従って空間的に離れた複数の部分的構成を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造の少なくとも一部は、剛性である。幾つかの実施形態において、超分子構造の少なくとも一部は、半剛性である。幾つかの実施形態において、超分子構造の少なくとも一部は、可撓性である。
図1Aは、コア構造13と、捕捉バーコード20と、固定分子18と、を含む超分子構造40の例示的実施形態を提供する。幾つかの実施形態において、超分子構造は、超分子DNAオリガミ構造を含み、コア構造は、DNAオリガミ構造を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造は、固定分子を含まない。幾つかの実施形態において、超分子構造は、ポリヌクレオチド構造である。
幾つかの実施形態において、コア構造13は、互いに連結された1つまたは複数のコア分子を含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のコア分子は、互いに連結された2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200または500の一意的分子を含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のコア分子は、約2の一意的分子~約1000の一意的分子を含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のコア分子は、互いに相互作用し、超分子構造の特異的形状を定義する。幾つかの実施形態において、複数のコア分子は、可逆性の非共有結合性の相互作用を通して互いに相互作用する。幾つかの実施形態において、コア構造の特異的形状は、三次元(3D)構成である。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のコア分子は、特定の分子量を提供する。幾つかの実施形態において、コア構造13は、ナノ構造である。幾つかの例において、1つまたは複数のコア分子は、1つもしくは複数の核酸鎖(例えば、DNA、RNA、非天然核酸)、1つもしくは複数の分枝状核酸、1つもしくは複数のペプチド、1つもしくは複数の小分子、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、コア構造は、ポリヌクレオチド構造を含む。幾つかの実施形態において、コア構造の少なくとも一部は、剛性である。幾つかの実施形態において、コア構造の少なくとも一部は、半剛性である。幾つかの実施形態において、コア構造の少なくとも一部は、可撓性である。幾つかの実施形態において、コア構造は、足場デオキシリボ核酸(DNA)オリガミ、足場リボ核酸(RNA)オリガミ、足場ハイブリッドDNA/RNAオリガミ、一本鎖DNAタイル構造、多鎖DNAタイル構造、一本鎖DNAオリガミ、一本鎖RNAオリガミ、一本鎖RNAタイル構造、多鎖RNAタイル構造、複数の足場を有する階層的構成のDNAおよび/もしくはRNAオリガミ、ペプチド構造、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、DNAオリガミは、足場構造である。幾つかの実施形態において、RNAオリガミは、足場構造である。幾つかの実施形態において、ハイブリッドDNA/RNAオリガミは、足場構造である。幾つかの実施形態において、DNAオリガミ、RNAオリガミ、またはハイブリッドDNA/RNAオリガミを含むコア構造は、既定の二次元(2D)または3D形状を含む。
図1Bに示されるように、幾つかの実施形態において、超分子構造はさらに、本明細書に記載されるように、捕捉バーコード20を介して捕捉分子2に連結されるように構成される。幾つかの実施形態において、捕捉分子2および/または固定分子18は、連結されるとコアナノ構造13に関して固定される。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のコア分子の任意の数が、捕捉分子2および/または固定分子18と連結を形成するように構成された1つまたは複数のコアリンカー12、14を含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のコア分子の任意の数が、コア分子2および/または固定分子18と連結を形成するように構成された1つまたは複数のコアリンカー12、14に連結されるように構成される。
幾つかの実施形態において、1つまたは複数のコアリンカー12、14は、化学結合を通して1つもしくは複数の捕捉分子に連結される。幾つかの実施形態において、1つもしくは複数のコアリンカー12、14の少なくとも1つが、コア反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、各コア反応性分子は、独立して、アミン、チオール、DBCO、NHSエステル、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、またはポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)または1種もしくは複数の重合開始剤)を含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のコアリンカーの少なくとも1つが、DNA配列ドメインを含む。
図1Aを参照すると、幾つかの実施形態において、コア構造13は、1)コア構造上の既定の第一の場所で捕捉バーコード20に、場合により2)コア構造上の既定の第二の場所で固定分子18に連結される。幾つかの実施形態において、指定された第一のコアリンカー12は、コア構造上の第一の場所に配置される。幾つかの実施形態において、第一の場所の1つまたは複数のコア分子は、第一のコアリンカー12と連結を形成するように修飾される。幾つかの実施形態において、第一のコアリンカー12は、コア構造13の延長部である。
幾つかの実施形態において、指定された第三のコアリンカー14は、コア構造13上の第二の場所に配置される。幾つかの実施形態において、第二の場所の1つまたは複数のコア分子は、第三のコアリンカー14と連結を形成するように修飾される。幾つかの実施形態において、第三のコアリンカー12は、コア構造13の延長部である。幾つかの実施形態において、第一の場所は、コア構造13の第一の側に配置され、任意選択による第二の場所は、コア構造13の第二の側に配置される。
図1Bを参照すると、幾つかの実施形態において、捕捉分子2は、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー(RNAおよび/またはDNA)、フルオロフォア、ナノボディ、DARPin、触媒、重合開始剤、PEGのようなポリマー、有機分子、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、修飾型アプタマーを含む。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、SOMAmer(登録商標)を含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の捕捉分子は、SOMAmer(登録商標)アプタマーおよび非SOMAmer(登録商標)アプタマーとの組合わせを含む、アプタマーと修飾型アプタマーとの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、修飾型アプタマーは、親和性結合剤として一意的フィンガープリントを提供するために化学的に修飾された核酸ベースのタンパク質結合試薬のクラスを含む。幾つかの実施形態において、修飾型アプタマーアッセイは、混合物中のタンパク質濃度をDNAシグネチャに変換し、その後、これを例えば市販のDNAマイクロアレイプラットフォームを利用することにより、定量することができる。幾つかの実施形態において、修飾型アプタマーは、a)化学修飾された特性を有する特異的形状のタンパク質結合折畳み実体、および2)ハイブリダイゼーションプローブにより認識されるように設計された一意的核酸配列、という二重の性質を含む。幾つかの実施形態において、修飾型アプタマーの二重の性質により、それらは、高度に多重化された(1000プレキシティを超える)タンパク質定量の強力なツールとなる。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、特定の検体分子(例えば、タンパク質)を認識し、それと結合するように構成された一意的形状および化学的特性を含む。幾つかの実施形態において、捕捉分子と検体分子の間の結合は、捕捉分子-検体分子複合体を形成する。
幾つかの実施形態において、固定分子は、反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、固定分子18は、反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、固定分子18は、反応性分子を含むDNA鎖を含む。幾つかの実施形態において、固定分子18は、アミン、チオール、DBCO、NHSエステル、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、またはポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)または1種もしくは複数の重合開始剤)を含む。幾つかの実施形態において、固定分子18は、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー(RNAおよびDNA)、フルオロフォア、ナノボディ、DARPin、触媒、重合開始剤、PEGのようなポリマー、有機分子、またはそれらの組合わせを含む。
幾つかの実施形態において、超分子構造の各成分は、独立して、修飾または調整されてもよい。幾つかの実施形態において、超分子構造の1種または複数の成分を修飾することは、超分子DNAオリガミ構造そのものの2Dおよび3D幾何学的構造を修飾し得る。幾つかの実施形態において、超分子構造の1種または複数の成分を修飾することが、コア構造の2Dおよび3D幾何学的構造を修飾してもよい。幾つかの実施形態において、そのような超分子構造の成分を独立して修飾する能力は、固体表面(例えば、平面表面または微粒子)での1つまたは複数の超分子構造の組織化および3D体積(例えば、ヒドロゲルマトリクス内)の正確な制御を可能にする。
捕捉バーコード
図1A~1Bで示されるように、幾つかの実施形態において、捕捉分子2は、捕捉バーコード20を通してコア構造13に連結される。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20は、捕捉分子2と連結を形成し、捕捉バーコード20は、コア構造13と連結を形成する。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20は、特定の捕捉分子(例えば、アプタマー)と連結を形成するように構成される。幾つかの実施形態において、捕捉バーコードは、化学的連結を通して特定の捕捉分子と連結を形成するように構成される。幾つかの実施形態において、化学的連結は、マレイミド-チオール、DBCO-アジド、アミン-NHSエステルを含む。幾つかの実施形態において、捕捉バーコードは、捕捉分子とハイブリダイズするように構成される。幾つかの実施形態において、捕捉バーコードはさらに、超分子性分子構造のためのバーコードを提供し、例えば複数の超分子構造が、平面基板上の複数の結合場所に配置される場合に、前記超分子構造の場所をマッピングするために用いられ得る。
図1A~1Bで示されるように、幾つかの実施形態において、捕捉分子2は、捕捉バーコード20を通してコア構造13に連結される。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20は、捕捉分子2と連結を形成し、捕捉バーコード20は、コア構造13と連結を形成する。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20は、特定の捕捉分子(例えば、アプタマー)と連結を形成するように構成される。幾つかの実施形態において、捕捉バーコードは、化学的連結を通して特定の捕捉分子と連結を形成するように構成される。幾つかの実施形態において、化学的連結は、マレイミド-チオール、DBCO-アジド、アミン-NHSエステルを含む。幾つかの実施形態において、捕捉バーコードは、捕捉分子とハイブリダイズするように構成される。幾つかの実施形態において、捕捉バーコードはさらに、超分子性分子構造のためのバーコードを提供し、例えば複数の超分子構造が、平面基板上の複数の結合場所に配置される場合に、前記超分子構造の場所をマッピングするために用いられ得る。
幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20は、第一の捕捉リンカー11と、第二の捕捉リンカー6と、捕捉ブリッジ7と、を含む。幾つかの実施形態において、第一の捕捉リンカー11は、反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、第一の捕捉リンカー11は、アミン、チオール、DBCO、NHSエステル、マレイミド、アジド、Acrydite、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、またはポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)または1種もしくは複数の重合開始剤)を含む反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、第一の捕捉リンカー11は、DNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、第二の捕捉リンカー6は、反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、第二の捕捉リンカー6は、アミン、チオール、DBCO、NHSエステル、ビオチン、マレイミド、アジド、Acrydite、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、またはポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)または1種もしくは複数の重合開始剤)を含む反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、第二の捕捉リンカー6は、DNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、捕捉ブリッジ7は、ポリマーを含む。幾つかの実施形態において、捕捉ブリッジ7は、超分子構造の場所をマッピングするために用いられ得る、および/または個々の捕捉分子と連結を形成するように構成される、一意的バーコード配列を含む。幾つかの実施形態において、捕捉ブリッジ7は、特定の配列の核酸(例えば、DNAまたはRNA)を含むポリマーを含む。幾つかの実施形態において、捕捉ブリッジ7は、PEGなどのポリマーを含む。幾つかの実施形態において、第一の捕捉リンカー11は、その第一の末端で捕捉ブリッジ7に付着され、第二の捕捉リンカー6は、その第二の末端で捕捉ブリッジ7に付着される。幾つかの実施形態において、第一の捕捉リンカー11は、化学結合を介して捕捉ブリッジ7に付着される。幾つかの実施形態において、第二の捕捉リンカー6は、化学結合を介して捕捉ブリッジ7に付着される。幾つかの実施形態において、第一の捕捉リンカー11は、物理的付着を介して捕捉ブリッジ7に付着される。幾つかの実施形態において、第二の捕捉リンカー6は、物理的付着を介して捕捉ブリッジ7に付着される。
幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20は、第一の捕捉リンカー11と第一のコアリンカー12との間の連結を通してコア構造13に連結される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される第一のコアリンカー12は、コア構造13上の第一の場所に配置される。幾つかの実施形態において、第一の捕捉リンカー11および第一の捕捉リンカー11は、化学結合を通して互いに連結される。幾つかの実施形態において、第一の捕捉リンカー11および第一のコアリンカー12は、共有結合を通して互いに連結される。幾つかの実施形態において、第一の捕捉リンカー11と第一のコアリンカー12との間の連結は、トリガーに供されると可逆性になる。幾つかの実施形態において、トリガーは、デコンストラクター分子(「捕捉デコンストラクター分子」)との相互作用、またはトリガーシグナルへの暴露を含む。幾つかの実施形態において、捕捉デコンストラクター分子は、核酸(DNAまたはRNA)、ペプチド、有機小分子、またはその組合わせを含む。幾つかの実施形態において、トリガーシグナルは、光シグナルを含む。幾つかの実施形態において、トリガーシグナルは、電気シグナル、マイクロ波シグナル、紫外線、可視光線、または近赤外線を含む。
幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20は、第二の捕捉リンカー6と、捕捉分子2に結合した第三の捕捉リンカー5との間の連結を通して捕捉分子2に連結される。幾つかの実施形態において、第三の捕捉リンカー5は、反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、第三の捕捉リンカー5は、アミン、チオール、DBCO、NHSエステル、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、またはポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)または1種もしくは複数の重合開始剤)を含む反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、第三の捕捉リンカー5は、DNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、捕捉分子2は、化学結合を通して第三の捕捉リンカー5に結合される。幾つかの実施形態において、捕捉分子2は、共有結合を通して第三の捕捉リンカー5に結合される。幾つかの実施形態において、第二の捕捉リンカー6および第三の捕捉リンカー5は、化学結合を通して互いに連結される。幾つかの実施形態において、第二の捕捉リンカー6および第三の捕捉リンカー5は、共有結合を通して互いに連結される。幾つかの実施形態において、第二の捕捉リンカー6と第三の捕捉リンカー5の間の連結は、トリガーに供されると可逆性になる。幾つかの実施形態において、トリガーは、デコンストラクター分子(「捕捉バーコード放出分子」)との相互作用、またはトリガーシグナルへの暴露を含む。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード放出分子は、核酸(DNAまたはRNA)、ペプチド、有機小分子、またはその組合わせを含む。幾つかの実施形態において、トリガーシグナルは、光シグナルを含む。幾つかの実施形態において、トリガーシグナルは、電気シグナル、マイクロ波シグナル、紫外線、可視光線、または近赤外線を含む。
幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20は、核酸ハイブリダイゼーションなどにより、捕捉分子2にハイブリダイズされる。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20は、核酸ハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションを介して捕捉分子2に連結される。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20は、分子5および6の間の共有結合性の連結を介して捕捉分子2に連結され、分子5と6の両方は、互いと特異的に反応する分子対、例えばDBCO-アジド、アミン-NHSエステル、チオール-マレイミドであり得る。
幾つかの実施形態において、トリガーに供されることは、第一の捕捉リンカー11と第一のコアリンカー12の間の連結を破壊し、それにより第一の場所でコアナノ構造13との捕捉分子の連結を破壊する。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20は、コア構造13および捕捉分子2から分離されると、検体分子を検出するためのシグナルを提供するように構成される。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード20から提供されるシグナルは、DNAシグナルである。
固定バーコード
図1に示されるように、幾つかの実施形態において、固定分子18は、固定バーコードを通してコア構造13に連結される。幾つかの実施形態において、固定バーコードは、固定分子18と連結を形成し、固定バーコードは、コア構造13と連結を形成する。幾つかの実施形態において、固定バーコードは、超分子的分子構造のためのバーコードを提供し、例えば複数の超分子構造が、平面基板上の複数の結合場所に配置される場合に、前記超分子構造の場所をマッピングするために用いられ得る。
図1に示されるように、幾つかの実施形態において、固定分子18は、固定バーコードを通してコア構造13に連結される。幾つかの実施形態において、固定バーコードは、固定分子18と連結を形成し、固定バーコードは、コア構造13と連結を形成する。幾つかの実施形態において、固定バーコードは、超分子的分子構造のためのバーコードを提供し、例えば複数の超分子構造が、平面基板上の複数の結合場所に配置される場合に、前記超分子構造の場所をマッピングするために用いられ得る。
幾つかの実施形態において、固定バーコードは、第一の固定リンカー15と、第二の固定リンカー17と、固定ブリッジ16と、を含む。幾つかの実施形態において、第一の固定リンカー15は、反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、第一の固定リンカー15は、アミン、チオール、DBCO、NHSエステル、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、またはポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)または1種もしくは複数の重合開始剤)を含む反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、第一の固定リンカー15は、DNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、第二の固定リンカー17は、反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、第二の固定リンカー17は、アミン、チオール、DBCO、NHSエステル、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、またはポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)または1種もしくは複数の重合開始剤)を含む反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、第二の固定リンカー17は、DNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、固定ブリッジ16は、ポリマーを含む。幾つかの実施形態において、固定ブリッジ16は、特定の配列の核酸(DNAまたはRNA)を含むポリマーを含む。幾つかの実施形態において、固定ブリッジ16は、PEGなどのポリマーを含む。幾つかの実施形態において、第一の固定リンカー15は、その第一の末端で固定ブリッジ16に付着され、第二の固定リンカー17は、その第二の末端で固定ブリッジ16に付着される。幾つかの実施形態において、第一の固定リンカー15は、化学結合を介して固定ブリッジ16に付着される。幾つかの実施形態において、第二の固定リンカー17は、物理的付着を介して固定ブリッジ16に付着される。幾つかの実施形態において、第一の固定リンカー15は、化学結合を介して固定ブリッジ16に付着される。幾つかの実施形態において、第二の固定リンカー17は、物理的付着を介して固定ブリッジ16に付着される。
幾つかの実施形態において、固定バーコードは、第一の固定リンカー15と第三のコアリンカー14の間の連結を通してコア構造13に連結される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される第三のコアリンカー14は、コア構造13上の第三の場所に配置される。幾つかの実施形態において、第一の固定リンカー15および第三のコアリンカー14は、化学結合を通して互いに連結される。幾つかの実施形態において、第一の固定リンカー15および第三のコアリンカー14は、共有結合を通して互いに連結される。幾つかの実施形態において、第一の固定リンカー15と第三のコアリンカー14の間の連結は、トリガーに供されると可逆性になる。幾つかの実施形態において、トリガーは、デコンストラクター分子(「固定デコンストラクター分子」)との相互作用、またはトリガーシグナルへの暴露を含む。幾つかの実施形態において、固定デコンストラクター分子は、核酸(DNAまたはRNA)、ペプチド、有機小分子、またはその組合わせを含む。幾つかの実施形態において、トリガーシグナルは、光シグナルを含む。幾つかの実施形態において、トリガーシグナルは、電気シグナル、マイクロ波シグナル、紫外線、可視光線、または近赤外線を含む。
幾つかの実施形態において、固定バーコードは、第二の固定リンカー17と固定分子18の間の連結を通して固定分子18に連結される。本明細書に記載されるように、幾つかの実施形態において、固定分子は、反応性分子、DNA配列ドメイン、反応性分子を含むDNA配列ドメイン、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、固定分子18は、化学結合を通して第二の固定リンカー17に結合される。幾つかの実施形態において、固定分子18は、共有結合を通して第二の固定リンカー17に結合される。幾つかの実施形態において、第二の固定リンカー17と固定分子18の間の連結は、トリガーに供されると可逆性になる。幾つかの実施形態において、トリガーは、デコンストラクター分子(「固定バーコード放出分子」)との相互作用、またはトリガーシグナルへの暴露を含む。幾つかの実施形態において、固定バーコード放出分子は、核酸(DNAまたはRNA)、ペプチド、有機小分子、またはその組合わせを含む。幾つかの実施形態において、トリガーシグナルは、光シグナルを含む。幾つかの実施形態において、トリガーシグナルは、電気シグナル、マイクロ波シグナル、紫外線、可視光線、または近赤外線を含む。
幾つかの実施形態において、トリガーに供されることは、第一の固定リンカー15と第三のコアリンカー14の間の連結のみを破壊し、それにより第三の場所のコア構造13との固定分子の連結を破壊する。
幾つかの実施形態において、捕捉デコンストラクター分子および捕捉バーコード放出分子は、同じタイプの分子を含む。幾つかの実施形態において、捕捉デコンストラクター分子および捕捉バーコード放出分子は、異なるタイプの分子を含む。幾つかの実施形態において、捕捉デコンストラクター分子、捕捉バーコード放出分子、固定デコンストラクター分子、および固定バーコード放出分子は、同じタイプの分子を含む。幾つかの実施形態において、捕捉デコンストラクター分子、捕捉バーコード放出分子、固定デコンストラクター分子、および固定バーコード放出分子は、異なるタイプの分子を含む。幾つかの実施形態において、捕捉デコンストラクター分子、捕捉バーコード放出分子、固定デコンストラクター分子、および固定バーコード放出分子の任意の組合わせは、同じタイプの分子を含む。
幾つかの実施形態において、コア構造は、足場DNAオリガミを含み、その中で「足場」鎖と呼ばれる環状ssDNA分子が、ssDNA「足場」鎖の特定の小区分と相互作用する「ステープル」鎖と呼ばれる2つ以上の短鎖ssDNAと相互作用することにより、予め定義された2Dまたは3D形状に折り畳まれる。
超分子DNAオリガミ構造の幾つかの実施形態において、コア構造は、DNAオリガミを含む。幾つかの実施形態において、コア構造13は、DNA配列ドメインを含む第一のコアリンカー12を含む。幾つかの実施形態において、第一のコアリンカー12は、捕捉バーコード鎖20上の第一の捕捉リンカー11と相補的である。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード鎖20は、前記捕捉バーコード鎖のどちらかの末端に第一の捕捉リンカー11および第二の捕捉リンカーを含むDNA鎖を含む。幾つかの実施形態において、第一の捕捉リンカー11は、DNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、第二の捕捉リンカー6は、DNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード鎖20はさらに、第一の捕捉リンカー11と第二の捕捉リンカー6の間に一意的バーコード配列7を含む。幾つかの実施形態において、一意的捕捉バーコード配列7は、特定の配列の核酸(DNAまたはRNA)を含む。幾つかの実施形態において、一意的捕捉バーコード配列7は、PEGなどのポリマーを含む。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード鎖20は、トーホールド(「TH」)と呼ばれる短いドメインを含む。幾つかの実施形態において、捕捉バーコード配列7は、トーホールド(「TH」)を含む。
幾つかの実施形態において、第二の捕捉リンカー6は、第三の捕捉リンカー5と相補的である。幾つかの実施形態において、第三の捕捉リンカー5は、DNA配列ドメインである。幾つかの実施形態において、捕捉分子2は、第三の捕捉リンカー5に結合される。幾つかの実施形態において、捕捉分子2は、第三の捕捉リンカー5に共有結合される。幾つかの実施形態において、捕捉分子2は、捕捉バーコード鎖20に直接結合される。幾つかの実施形態において、捕捉分子2は、捕捉バーコード配列7に直接結合される。
幾つかの実施形態において、コア構造は、DNA配列ドメインを含む第二のコアリンカー14を含む。幾つかの実施形態において、第二のコアリンカー14は、別のバーコード鎖22上の第一の固定リンカー15に相補的である。幾つかの実施形態において、固定バーコード鎖22は、固定バーコード区分22のどちらかの末端に第一の固定リンカー15および第二の固定リンカー17を含むDNA鎖を含む。幾つかの実施形態において、第一の固定リンカー15は、DNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、第二の固定リンカー17は、DNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、固定バーコード鎖22はさらに、第一の固定リンカー15と第二の固定リンカー17の間に一意的固定バーコード配列16を含む。幾つかの実施形態において、固定バーコード鎖22は、トーホールド(「TH」)と呼ばれる短いドメインを含む。幾つかの実施形態において、固定バーコード配列16は、トーホールド(「TH」)を含む。幾つかの実施形態において、一意的検出器バーコード配列16は、特定の配列の核酸(DNAまたはRNA)を含む。幾つかの実施形態において、一意的検出器バーコード配列16は、PEGなどのポリマーを含む。
幾つかの実施形態において、第二の固定リンカー17は、固定分子18と相補的である。幾つかの実施形態において、固定分子18は、DNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、固定分子18は、末端修飾に連結される。幾つかの実施形態において、末端修飾は、反応性分子を含む。幾つかの実施形態において、末端修飾は、アミン、チオール、DBCO、NHSエステル、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、またはポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)または1種もしくは複数の重合開始剤)を含む反応性分子を含む。
検体分子を検出するための方法
本明細書に記載されるように、幾つかの実施形態において、1つまたは複数の超分子構造は、試料中の1つまたは複数の検体分子の検出を可能にする。幾つかの実施形態において、超分子構造はそれぞれ、超分子DNAオリガミ構造を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造は、所与の検体分子との連結を介して(前記超分子構造に連結された対応する捕捉分子を介して)基底状態から励起状態に移行する。幾つかの実施形態において、励起状態の超分子構造は、試料中の前記所与の検体分子の存在に関する情報をシグナルに変換するように構成される。幾つかの実施形態において、シグナルは、蛍光標識ベースのシグナル、標識不含のシグナル、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、シグナルを使用する試料中の所与の検体分子の同定および/または定量は、超分子DNAオリガミ構造上に位置する捕捉バーコードに対応し、複数の超分子構造の場所は、各捕捉バーコードに従ってマッピングされる。幾つかの実施形態において、各捕捉バーコードは、特定の捕捉分子との連結を可能にするように構成される。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、修飾型アプタマーを含む。
本明細書に記載されるように、幾つかの実施形態において、1つまたは複数の超分子構造は、試料中の1つまたは複数の検体分子の検出を可能にする。幾つかの実施形態において、超分子構造はそれぞれ、超分子DNAオリガミ構造を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造は、所与の検体分子との連結を介して(前記超分子構造に連結された対応する捕捉分子を介して)基底状態から励起状態に移行する。幾つかの実施形態において、励起状態の超分子構造は、試料中の前記所与の検体分子の存在に関する情報をシグナルに変換するように構成される。幾つかの実施形態において、シグナルは、蛍光標識ベースのシグナル、標識不含のシグナル、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、シグナルを使用する試料中の所与の検体分子の同定および/または定量は、超分子DNAオリガミ構造上に位置する捕捉バーコードに対応し、複数の超分子構造の場所は、各捕捉バーコードに従ってマッピングされる。幾つかの実施形態において、各捕捉バーコードは、特定の捕捉分子との連結を可能にするように構成される。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、修飾型アプタマーを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される1つの検体分子または複数の検体分子の存在を検出することは、対応する超分子構造に連結された1つまたは複数の検体分子に対応する複数の蛍光標識および/または標識不含の事象からのシグナルの光学的および/または電子的読出しを含む。幾つかの実施形態において、対応する超分子構造に連結された1つまたは複数の検体分子は、固体支持体(複数可)または平面固定基板(複数可)の上に固定され、対応する超分子構造および捕捉分子は予め定義された方式で固定される。本明細書で用いられる用語「捕捉分子」および「認識分子」は、互換的に用いられる。
幾つかの実施形態において、複数の検体分子は、多重化を通して試料中で同時に検出され、複数の超分子構造は、検体分子同定のために複数のシグナル(例えば、光学または電気的)を検出することを可能にする。幾つかの実施形態において、試料中の検体を検出するための本明細書に記載された方法は、複数の超分子構造(例えば、超分子DNAオリガミ構造)を使用することによりハイスループットで高度の多重化能を提供する。幾つかの実施形態において、ハイスループットで高度の多重化能は、検体分子の検出および定量のための高い正確度を提供する。幾つかの実施形態において、試料中の検体を検出するための本明細書に記載された方法は、タンパク質分子を含むバイオポリマーを迅速に、ならびに高い感度および再現性で特徴づけるおよび/または同定するように構成される。幾つかの実施形態において、複数の超分子DNAオリガミ構造は、交差反応に関連する誤差を制限するように構成される。幾つかの実施形態において、そのような交差反応に関連する誤差は、別の超分子DNAオリガミ構造の捕捉分子と相互作用する超分子DNAオリガミ構造の捕捉分子を含む(例えば、分子間相互作用)。幾つかの実施形態において、複数の超分子DNAオリガミ構造の各コア構造は、互いに同一である。幾つかの実施形態において、各超分子DNAオリガミ構造の構造的、化学的、および物理的特性は、明確に設計される。幾つかの実施形態において、同一のコア構造は、超分子DNAオリガミ構造の間の交差反応を制限するために、既定の形状、サイズ、分子量、捕捉分子の既定の数、対応する捕捉分子間の所定の距離(本明細書に記載される)、またはそれらの組合わせを有する。幾つかの実施形態において、それぞれのコア構造の分子量は、同一であり、複数のコア分子の純度に応じて正確である。幾つかの実施形態において、各コア構造は、少なくとも1つの捕捉分子を有する。
幾つかの実施形態において、複数の超分子DNAオリガミ構造はそれぞれ、互いに異なる検体分子と連結を形成するように構成される(対応する捕捉分子を介して)。幾つかの実施形態において、状態の変化(非励起から励起へ)は、主として捕捉分子(超分子構造に連結された)と特定の検体分子の間の連結により駆動される。幾つかの実施形態において、複数の超分子構造は、ある特定の部分的構成が同一であるため、構造的類似性を共有し得るが、試料からの検体分子と超分子構造の間の連結は、対応する捕捉分子により定義される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される超分子構造上の各捕捉バーコードは、同じ特定の捕捉分子と連結を形成するように構成される。幾つかの実施形態において、所与の超分子DNAオリガミ構造上の各捕捉分子は、試料中の特定の検体分子と特異的に相互作用して、特定の検体分子との相互作用により超分子構造の状態変化をもたらすことができる。幾つかの実施形態において、各超分子構造は、それぞれの捕捉分子に対応する一意的DNAバーコード(例えば、捕捉バーコード)を含む。幾つかの実施形態において、所与の超分子DNAオリガミ構造上の捕捉分子は、試料中の検体分子の1つのタイプのみと相互作用するように設計される。幾つかの実施形態において、所与の超分子DNAオリガミ構造上の捕捉分子は、試料中の検体分子の1つより多くのタイプと相互作用するように設計される。
幾つかの実施形態において、各超分子DNAオリガミ構造は、典型的な複合的な生体試料中の広範囲の分子濃度を定量的に捕捉するために必要な最も可能性の高いダイナミックレンジを確保するために単一分子感度となるように構成される。幾つかの実施形態において、単一分子感度は、本明細書に記載されるように、対応する捕捉分子(所与の超分子構造に連結された)と単一検体分子の間の相互作用を通して基底状態から励起状態に移行するように構成された所与の超分子DNAオリガミ構造を含む。幾つかの実施形態において、複数の超分子DNAオリガミ構造は、非特異的相互作用、ならびに任意のユーザー誘発性誤差を低減するために必要とされる試料の取扱いを限定または排除する。
幾つかの実施形態において、複数の超分子構造は、溶液中で提供される。幾つかの実施形態において、複数の超分子構造は、1つまたは複数の基板に付着される。幾つかの実施形態において、複数の超分子構造は、1つまたは複数のウィジェットに付着される。幾つかの実施形態において、複数の超分子構造は、1つまたは複数の固体基板、1つもしくは複数のポリマーマトリクス、1つもしくは複数の分子縮合体、またはそれらの組合わせに付着される。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のポリマーマトリクスは、1つまたは複数のヒドロゲル粒子を含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のポリマーマトリクスは、1つまたは複数のヒドロゲルビーズを含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の固体基板は、1つまたは複数の平面基板を含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の固体基板は、1つまたは複数のマイクロビーズを含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の固体基板は、1つまたは複数の微粒子を含む。
幾つかの実施形態において、試料および超分子DNAオリガミ構造は、既定の環境条件のインキュベータ内でインキュベートされる。幾つかの実施形態において、試料は、超分子DNAオリガミ構造と共に約30秒~約24時間の期間、インキュベートされる。幾つかの実施形態において、試料は、超分子DNAオリガミ構造と共に約30秒~約1分、約1分~約5分、約5分~約30分、約30分~約1時間、約1時間~約5時間、約5時間~約12時間、約12時間~約24時間、約24時間~約48時間の期間、インキュベートされる。
幾つかの実施形態において、検体分子を検出するための方法は、検体分子と相互作用した対応する捕捉分子から捕捉バーコードを切断することを含む。幾つかの実施形態において、捕捉バーコードは、核酸(DNA/RNA)鎖置換、光学的切断、化学的切断、またはそれらの組合わせを通して対応する捕捉分子から切断される。
幾つかの実施形態において、切断された捕捉バーコードは、超分子DNAオリガミ構造を含む溶液から単離される。幾つかの実施形態において、切断された捕捉バーコードは、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿を通して溶液から単離される。幾つかの実施形態において、切断された捕捉バーコードは、それぞれの捕捉分子に結合したそれぞれの検体分子に相関するシグナルを提供する。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される捕捉バーコードは、DNA鎖を含む。幾つかの実施形態において、捕捉バーコードは、検体分子に相関するDNAシグナルを提供する。幾つかの実施形態において、単離された捕捉バーコードは、試料中の対応する検体分子を同定および/または定量するために分析される。幾つかの実施形態において、単離された捕捉バーコードの分析は、遺伝子型決定、qPCR、シークエンシング、またはそれらの組合わせを含む。
幾つかの実施形態において、DNAハイブリダイゼーションまたは他の付着技術(本明細書に記載される)を通してDNAオリガミの配置に基づくアレイ上に捕捉分子(例えば、修飾型アプタマー)を整列させることは、タンパク質結合事象の定量のためのDNAマイクロアレイ技術および修飾型アプタマーに埋め込まれた生じたDNAのシグネチャの使用に対する代替的プラットフォームを提供する。幾つかの実施形態において、溶液ベースのアッセイはその後、ビーズプルダウンおよびUV光切断戦略の使用に対する代替法としてチップベースのアッセイに転換され得る。
表面アッセイを使用する検体分子の検出
図2は、試料中の検体の単一分子計数(即ち、単一分子解像度で試料中の検体分子を検出すること)のために、本明細書に記載されるように、超分子構造を使用する表面ベースのアッセイを使用して試料中の検体分子を検出する方法の例示を提供する。幾つかの実施形態において、超分子構造は、DNAオリガミコアを含むコア構造13を含む。幾つかの実施形態において、(a)基板上の全ての特徴に関する参照座標として役立つ位置合わせマーカー402;(b)個々のコア構造(例えば、DNAオリガミ)が固定され得るマイクロパターン化された結合部位の定義されたセット406;および/または(c)基板400の表面と超分子構造(例えば、捕捉分子、コア構造分子)の間の相互作用を最小限にする、または防止するバックグランド不動態化404を含む平面基板400が提供される。幾つかの実施形態において、位置合わせマーカー402は、基板400上の他の特徴に関する参照特徴として用いられる表面上で定義される幾何学的形状を含む。幾つかの実施形態において、位置合わせマーカー402は、コア構造または超分子構造(例えば、DNAオリガミ)の他の分子と相互作用しないポリマーまたは自己集積化単層でコーティングされる。幾つかの実施形態において、バックグランド不動態化404は、基板の表面と試料の検体分子の間の相互作用を最小限にする、または防止する。幾つかの実施形態において、基板400上の結合部位406に対する優先的な超分子構造結合(例えば、優先的なDNAオリガミ結合)にとって必要なバックグランド不動態化に加えて、基板400は、捕捉分子(例えば、アプタマー)、検体分子(例えば、タンパク質検体)、および標識実体(例えば、NHS-ビオチンおよびストレプトアビジン)と、超分子構造(例えば、DNAオリガミ)分子および/またはそれに連結された分子との特異的相互作用を促進するために、様々なブロッキング試薬で化学的に処理され得る。幾つかの実施形態において、平面基板400は、結合部位406において差次的な化学を含む。幾つかの実施形態において、平面基板400は、当該技術分野で公知のリソグラフィー工程を通して作製される。幾つかの実施形態において、平面基板は、FET、リング共振器、フォトニック結晶または微小電極のような光学装置または電気装置を含み、これらは結合部位406の形成の前に基板に配置され得る。幾つかの実施形態において、結合部位406は、平面基板400上でマイクロパターン化される。幾つかの実施形態において、表面上の結合部位406は、周期的パターンである。幾つかの実施形態において、表面上の結合部位は、非周期的パターン(例えば、ランダム)である。幾つかの実施形態において、任意の2つの結合部位間で、最小距離が指定される。幾つかの実施形態において、任意の2つの結合部位間の最小距離は、少なくとも約200nmである。幾つかの実施形態において、任意の2つの結合部位間の最小距離は、少なくとも約40nm~約5000nmである。幾つかの実施形態において、結合部位の幾何学形状は、円形、正方形、三角形、または他の2Dもしくは3D多角形の形状を含む。幾つかの実施形態において、不動態化に用いられる化学基は、トリメチルシリル(TMS)のような電荷中性の分子、PEGのような無電荷ポリマー、双性イオン性ポリマー、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、結合部位を定義するために用いられる化学基は、シラノール基、カルボキシル基、チオール、他の基、またはそれらの組合わせを含む。
図2は、試料中の検体の単一分子計数(即ち、単一分子解像度で試料中の検体分子を検出すること)のために、本明細書に記載されるように、超分子構造を使用する表面ベースのアッセイを使用して試料中の検体分子を検出する方法の例示を提供する。幾つかの実施形態において、超分子構造は、DNAオリガミコアを含むコア構造13を含む。幾つかの実施形態において、(a)基板上の全ての特徴に関する参照座標として役立つ位置合わせマーカー402;(b)個々のコア構造(例えば、DNAオリガミ)が固定され得るマイクロパターン化された結合部位の定義されたセット406;および/または(c)基板400の表面と超分子構造(例えば、捕捉分子、コア構造分子)の間の相互作用を最小限にする、または防止するバックグランド不動態化404を含む平面基板400が提供される。幾つかの実施形態において、位置合わせマーカー402は、基板400上の他の特徴に関する参照特徴として用いられる表面上で定義される幾何学的形状を含む。幾つかの実施形態において、位置合わせマーカー402は、コア構造または超分子構造(例えば、DNAオリガミ)の他の分子と相互作用しないポリマーまたは自己集積化単層でコーティングされる。幾つかの実施形態において、バックグランド不動態化404は、基板の表面と試料の検体分子の間の相互作用を最小限にする、または防止する。幾つかの実施形態において、基板400上の結合部位406に対する優先的な超分子構造結合(例えば、優先的なDNAオリガミ結合)にとって必要なバックグランド不動態化に加えて、基板400は、捕捉分子(例えば、アプタマー)、検体分子(例えば、タンパク質検体)、および標識実体(例えば、NHS-ビオチンおよびストレプトアビジン)と、超分子構造(例えば、DNAオリガミ)分子および/またはそれに連結された分子との特異的相互作用を促進するために、様々なブロッキング試薬で化学的に処理され得る。幾つかの実施形態において、平面基板400は、結合部位406において差次的な化学を含む。幾つかの実施形態において、平面基板400は、当該技術分野で公知のリソグラフィー工程を通して作製される。幾つかの実施形態において、平面基板は、FET、リング共振器、フォトニック結晶または微小電極のような光学装置または電気装置を含み、これらは結合部位406の形成の前に基板に配置され得る。幾つかの実施形態において、結合部位406は、平面基板400上でマイクロパターン化される。幾つかの実施形態において、表面上の結合部位406は、周期的パターンである。幾つかの実施形態において、表面上の結合部位は、非周期的パターン(例えば、ランダム)である。幾つかの実施形態において、任意の2つの結合部位間で、最小距離が指定される。幾つかの実施形態において、任意の2つの結合部位間の最小距離は、少なくとも約200nmである。幾つかの実施形態において、任意の2つの結合部位間の最小距離は、少なくとも約40nm~約5000nmである。幾つかの実施形態において、結合部位の幾何学形状は、円形、正方形、三角形、または他の2Dもしくは3D多角形の形状を含む。幾つかの実施形態において、不動態化に用いられる化学基は、トリメチルシリル(TMS)のような電荷中性の分子、PEGのような無電荷ポリマー、双性イオン性ポリマー、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、結合部位を定義するために用いられる化学基は、シラノール基、カルボキシル基、チオール、他の基、またはそれらの組合わせを含む。
幾つかの実施形態において、単一の超分子構造40が、それぞれの結合部位406(ステップ1)に付着される。したがって幾つかの実施形態において、複数の超分子構造40が、それぞれ基板400上の対応する結合部位406に付着される。参照番号416は、個々に、および構築して平面基板上に配置された超分子構造の成分の描写を提供する。幾つかの実施形態において、超分子構造は、本明細書の図1A~Bに記載された成分および配置を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造40は、DNAオリガミ(例えば、M13mp18足場およびステープル)を含むコア構造を含み、超分子構造は、DNAオリガミの配置技術を使用して結合部位406のそれぞれに付着される(ステップ1)。幾つかの実施形態において、超分子構造40は、それぞれの結合部位406に付着される前にアセンブルされる。幾つかの実施形態において、DNAオリガミは、DNAオリガミ配置技術を使用して結合部位への結合を容易にするために、一意的形状および寸法を含む。幾つかの実施形態において、DNAオリガミ配置は、表面(例えば、マイクロパターン化された表面)上で個々のDNAオリガミ(例えば、コア構造)を組織化するために指向性自己アセンブリ技術を含む。幾つかの実施形態において、DNAオリガミ配置の代わりに、超分子構造40の反応性基は、結合部位406上で予め組織化されているDNAオリガミに結合される。幾つかの実施形態において、反応基は、本明細書(例えば、図1)に記載された固定分子を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造40を対応する結合部位406に結合させるためのこれらの方法はいずれも、DNAオリガミ配置技術を使用してマイクロパターン化された結合部位で1つまたは複数の分子を組織化する能力に依存する。幾つかの実施形態において、平面基板は、清潔な環境でこのステップ後に有意な期間、貯蔵され得る。
幾つかの実施形態において、超分子構造40は、結合部位406内で高い効率の単一分子結合により、前記結合部位上に配置される。
参照番号416を参照すると、幾つかの実施形態において、超分子構造は、単一、または複数の捕捉バーコードを含む。幾つかの実施形態において、所与の超分子構造上の捕捉バーコードの全てが、同じタイプの捕捉分子と連結を形成するように構成され、それにより所与の超分子構造上の捕捉バーコードの全てが、同じタイプの検体分子との連結を形成するように構成される(特定のタイプの捕捉分子を介して)。幾つかの実施形態において、超分子構造は、1つまたは複数の捕捉バーコードを含み、さらに1つまたは複数の追加のバーコード鎖を含む。幾つかの実施形態において、超分子構造は、1つまたは複数の固定バーコードを含む。幾つかの実施形態において、基板上の超分子構造は、捕捉バーコード、固定バーコード、および/または超分子構造に連結された他のバーコードを介してマッピングされ、基板400(例えば、マイクロパターン化された表面)上の各特定の検体結合位置の場所のカタログを作成する。したがって、基板400上の、特定の捕捉分子、つまり特定の検体分子の結合場所(複数可)のマップが、一意的捕捉バーコードおよび/または超分子構造40に連結された別のバーコード(例えば、固定バーコード、追加のバーコード)を介して作成される。幾つかの実施形態において、色素ベースのハイブリダイゼーションアッセイまたはバーコード領域のシークエンシングを使用して、基板400上の一意的捕捉分子結合場所406に対応する空間的場所のマップを作製する。幾つかの実施形態において、捕捉分子結合場所の前記マッピングは、基板400の製造場所で、またはアッセイを実施する前に行われる。幾つかの実施形態において、各基板は、情報をマッピングするために調べられ得る一意的IDを有し得る。あるいはマッピングは、捕捉分子が基板400上に固定された後に実施され得る。幾つかの実施形態において、超分子構造40はそれぞれ、本明細書に記載される特定の捕捉分子に関する単一または複数の捕捉部位を含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の超分子構造40は、特定の捕捉分子に関する捕捉部位を含む。
幾つかの実施形態において、捕捉分子2(本明細書に記載されるように)を、平面基板400と接触させる(ステップ2)。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されるように、捕捉分子2は、修飾型アプタマーを含むアプタマー、または他の親和性結合剤を含む。幾つかの実施形態において、修飾型アプタマーは、SOMAmer(登録商標)を含む。幾つかの実施形態において、捕捉分子2を、フローセルを利用して平面基板に接触させる。幾つかの実施形態において、捕捉分子を、基板40の上に流れさせる、つまり超分子構造40の上に流れさせる溶液中に提供される。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、基板(40)上にハイブリダイズされ、幾つかの例では、それは捕捉分子をDNAマイクロアレイパターンと接触させる場合の工程と類似である。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、本明細書の図1A~Bに記載される連結を通して、超分子構造に連結される。図2に示されるように、異なる捕捉分子は、S1、S2・・・Snとして識別される。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、平面基板400上で、結合部位416に付着した超分子DNAオリガミ構造40と共にインキュベートされる。幾つかの実施形態において、インキュベーション期間は、約30秒~約24時間である。幾つかの実施形態において、インキュベーション期間は、約30秒~約1分、約1分~約5分、約5分~約30分、約30分~約1時間、約1時間~約5時間、約5時間~約12時間、約12時間~約24時間、約24時間~約48時間である。
幾つかの実施形態において、捕捉分子が、複数の超分子DNAオリガミ構造上の対応する捕捉分子と相互作用することで、捕捉分子が、捕捉バーコードにより捕捉される。幾つかの実施形態において、捕捉分子が、対応する捕捉分子と連結を形成することで、捕捉分子が、捕捉バーコードにより捕捉される(参照番号418を参照)。したがって幾つかの実施形態において、捕捉分子は、超分子構造との連結を介して(対応する捕捉バーコードを介して)基板400上に固定される。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、ハイブリダイゼーションを介して捕捉バーコードにより捕捉される。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、本明細書の図1A~Bに記載されるように、第三の捕捉リンカーを介して捕捉バーコードにより捕捉される。幾つかの実施形態において、各捕捉バーコードは、特定の捕捉分子(例えば、アプタマー、親和性結合剤など)と相互作用するように構成される。
幾つかの実施形態において、標識不含の質量分析の方法である干渉散乱顕微鏡測定(iSCAT)を使用して、捕捉バーコードと、対応する捕捉分子の間の相互作用(例えば、結合工程)を、標識不含の形式で視覚化する。幾つかの実施形態において、標識不含の質量分析の方法である干渉散乱顕微鏡測定(iSCAT)を使用して、捕捉バーコードと対応する捕捉分子の間の連結を、標識不含の形式で視覚化する。
続いて図2を参照すると、幾つかの実施形態において、検体分子44を含む試料(本明細書に記載される)を、平面基板400と接触させる(ステップ3)。幾つかの実施形態において、試料を、フローセルを利用して平面基板400と接触させる。幾つかの実施形態において、試料を、捕捉された捕捉分子2を含む基板400の上に流れさせる。幾つかの実施形態において、検体分子44は、タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、タンパク質は、1つまたは複数のタイプのタンパク質を含む。図2に示されるように、異なる検体分子が、P1、P2・・・Pnとして識別される。幾つかの実施形態において、試料は、平面基板400上で、超分子構造40(対応する結合部位416と付着された)および対応する捕捉分子2と共にインキュベートされる。幾つかの実施形態において、インキュベーション期間は、約30秒~約24時間である。幾つかの実施形態において、インキュベーション期間は、約30秒~約1分、約1分~約5分、約5分~約30分、約30分~約1時間、約1時間~約5時間、約5時間~約12時間、約12時間~約24時間、約24時間~約48時間である。
幾つかの実施形態において、試料中の検体分子44は、平面表面400上の超分子DNAオリガミ構造40上に位置する対応する捕捉分子2と相互作用する。本明細書に記載されるように、幾つかの実施形態において、検体分子44は、タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、特定の検体分子44の単一コピーが、捕捉バーコード20により捕捉された対応する捕捉分子2と結合する(参照番号420を参照)。本明細書に記載されるように、各捕捉分子2は、特定の検体分子44と結合するように構成される。幾つかの実施形態において、所与の捕捉分子2(例えば、修飾型アプタマー)の一意的形状および化学的特性は、対応する検体分子44(例えば、タンパク質)を認識してそれと結合し、基板400上の所与の結合部位416で捕捉分子-検体分子複合体を形成する(Sn-Pn複合体に関連する参照番号420を参照)。したがって幾つかの実施形態において、検体分子は、捕捉分子との相互作用を介して基板400上に固定される。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、特定の検体分子と相互作用し、それに結合する。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、特定の検体分子のみと相互作用して、それに結合する。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、特定の検体分子と直接相互作用する。
幾つかの実施形態において、超分子構造40が、本明細書に記載されるように、検体分子44に連結された(対応する捕捉分子2を介する)後、超分子構造をその後、1つまたは複数の他の同定分子と接触させ、試料中の検体分子に連結した超分子構造を同定して、それにより試料中に見出される前記検体分子を同定する。幾つかの実施形態において、検体分子は、本明細書に記載されるように、超分子構造のマッピングされた場所を介して同定される。幾つかの実施形態において、検体分子はさらに、基板400の結合部位416全体で同定された検体分子の量に基づいて試料中で定量される。
幾つかの実施形態において、1つまたは複数の同定分子は、ビオチン分子46を含む。幾つかの実施形態において、基板400を、ビオチン分子と接触され、それにより1つまたは複数の検体分子44が、ビオチン化に供される(ステップ4)。参照番号422を参照されたい。幾つかの実施形態において、ビオチン化に供されることは、検体分子44がビオチン分子46と相互作用することに対応する。幾つかの実施形態において、検体分子は、ビオチン分子と連結を形成する。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のビオチン分子を含む溶液を、基板400の上に流れさせる。幾つかの実施形態において、検体分子44は、アミンビオチン化、スルフヒドリルビオチン化、カルボキシルビオチン化、糖タンパク質ビオチン化、オリゴヌクレオチドビオチン化、非特異的ビオチン化、またはそれらの組合わせに供される。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のビオチン分子は、NHS-ビオチン分子または任意の他のタイプのビオチン分子を含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のビオチン分子は、アミン反応性NHS-ビオチン分子を含む。幾つかの実施形態において、1つまたは複数のアミン反応性ビオチン分子は、永続的アミド結合を形成することによりアミンを標識する。
幾つかの実施形態において、検体分子44が、ビオチン化に供された(例えば、ステップ4)後に、検体分子44が、その後、蛍光標識される(ステップ5)。幾つかの実施形態において、基板400を、1つまたは複数の蛍光標識された分子48と接触させる。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の蛍光標識された分子48を含む溶液を、基板400の上に流れさせる。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の蛍光標識された分子は、蛍光標識されたストレプトアビジン分子、蛍光標識されたアビジン分子、または検体分子(例えば、タンパク質)をビオチンで標識するために公知である他のタイプの化学を含む。幾つかの実施形態において、蛍光標識された分子は、検体分子と相互作用したビオチン分子と相互作用する(参照番号424を参照)。
幾つかの実施形態において、ビオチン分子に結合した検体分子を蛍光標識することは、蛍光シグナルを提供する。幾つかの実施形態において、蛍光標識した分子により生成された蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡、または蛍光シグナルを検出するために当該技術分野で公知の任意の他の装置を使用して読み出される(図2に示されたステップ6)。幾つかの実施形態において、基板400上の特定の結合場所406から検出された蛍光シグナルは、超分子構造40および対応する捕捉分子のマッピング場所に基づいて(本明細書に記載される)、特定の検体分子(例えば、タンパク質)の捕捉を同定する。幾つかの実施形態において、捕捉された検体分子は、基板400上の対応する結合場所406で検出された蛍光シグナルの累積カウントに基づいて定量される。例えば、基板400上の場所X1Y1、X3Y3、およびX20Y20が、それらの場所で超分子構造40(例えば、超分子DNAオリガミ構造)の分子上の一意的捕捉バーコードを通してマッピングされるように、捕捉分子S1に対応する場合、ストレプトアビジン標識ステップ後のこれらの3つの場所からの蛍光シグナルは、検体分子P1(例えば、タンパク質P1)に関してカウント3をもたらす。
先に記載された蛍光標識ステップに加えて、またはその代わりに、幾つかの実施形態において、捕捉された検体分子をビオチン化に供した後(即ち、ステップ4の後)、基板400を、光を散乱する1つまたは複数の分子またはナノ粒子と接触させ、検体分子44の標識不含の画像化を可能にする。幾つかの実施形態において、光を散乱する1つまたは複数の分子またはナノ粒子を含む溶液を、基板400の上に流れさせる。幾つかの実施形態において、光を散乱する1つまたは複数の分子またはナノ粒子は、ストレプトアビジン分子、アビジン分子、またはビオチン分子と相互作用することが公知である他のタイプの化学を含む。幾つかの実施形態において、光を散乱する1つまたは複数の分子またはナノ粒子は、ストレプトアビジンをコーティングしたナノ粒子、ストレプトアビジンのクラスター、アビジンをコーティングしたナノ粒子、ビオチン分子と相互作用する他の分子およびナノ粒子、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、光を散乱する分子またはナノ粒子を、Qdotおよび/または金属ナノ粒子で標識し、検体分子の標識不含の画像化を可能にする。幾つかの実施形態において、干渉散乱顕微鏡測定(iSCAT)または当該技術分野で知られる他のタイプの装置を使用して、基板400上に固定された対応する検体分子44(即ち、超分子構造に連結された対応する捕捉分子との相互作用を介して固定された検体分子)の場所で、光を散乱する分子またはナノ粒子とビオチン分子(例えば、ビオチン-ストレプトアビジン複合体)の間の結合を介して形成された複合体を視覚化し、視覚シグナルを生成する。幾つかの実施形態において、視覚シグナルは、光シグナル、電気シグナル、またはその両方を含む。幾つかの実施形態において、光シグナルは、マイクロ波シグナル、紫外線、可視光線、近赤外線、光散乱、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、基板上の特定の場所からのそのような複合体の視覚的検出は、超分子構造および対応する捕捉分子のマッピングされた場所に基づいて特定の検体分子(例えば、タンパク質)の捕捉を同定し(本明細書に記載されるように)、それにより検体分子44を同定する(ステップ6)。幾つかの実施形態において、捕捉された検体分子は、基板400上の対応する結合場所406で視覚的に検出されたビオチン複合体の累積カウントに基づいて定量される(ステップ6)。例えば、基板400上の場所X1Y1、X3Y3、およびX20Y20が、それらの場所で超分子構造40(例えば、超分子DNAオリガミ構造)の分子上の一意的捕捉バーコードを通してマッピングされる捕捉分子S1に対応する場合、これらの3つの場所からのビオチン複合体の視覚的検出は、検体分子P1(例えば、タンパク質P1)に関してカウント3をもたらす。
幾つかの実施形態において、基板400をビオチン分子と接触させる代わりに、ステップ3の後に、基板400を、捕捉分子の第二のセットを含む溶液と接触させる。幾つかの実施形態において、捕捉分子の第二のセットは、蛍光標識される、非標識である、またはその両方の混合物を含む。幾つかの実施形態において、捕捉分子の第二のセットは、特定の検体分子と相互作用するように構成される(捕捉分子について本明細書に記載されるように)。幾つかの実施形態において、捕捉分子の第二のセットは、基板400上に固定された対応する検体分子と相互作用し、それにより別の検体分子-捕捉分子複合体の形成を可能にする(即ち、それにより2つの捕捉分子間に位置する検体分子と「サンドイッチ」構成を形成する)。そのため幾つかの実施形態において、対応する捕捉バーコードを有する単一分子のパターン化表面(基板400)は、同じ検体分子を認識するように化学合成された2つの捕捉分子(例えば、修飾型アプタマー)によるサンドイッチアッセイとして用いられ得る。幾つかの実施形態において、捕捉分子の第二のセットを、基板400とインキュベートさせる(本明細書に記載される)。幾つかの実施形態において、捕捉分子の第二のセットからの蛍光標識された捕捉分子は、捕捉分子と相互作用する対応する検体分子を蛍光標識し、蛍光シグナルを生成する。幾つかの実施形態において、蛍光読出し(ステップ6)を行って、本明細書に記載されるように、基板上で検出された検体分子を同定および定量する。幾つかの実施形態において、基板400上の対応する検体分子と相互作用する捕捉分子の第二のセットからの非標識の捕捉分子が、視覚シグナルを生成し、基板400を、iSCATまたは当該技術分野で公知の類似の装置を使用して光学的にインターロゲートして、本明細書に記載されるように、前記視覚シグナルに基づいて基板上で検出された検体分子を同定および定量する(ステップ6)。本明細書に記載されるように、幾つかの実施形態において、視覚シグナルは、光シグナル、電気シグナル、またはその両方を含む。幾つかの実施形態において、光シグナルは、マイクロ波シグナル、紫外線、可視光線、近赤外線、光散乱、またはそれらの組合わせを含む。
幾つかの実施形態において、基板をビオチン分子と接触させる別の代替的ステップにおいて、ステップ3の後、基板400を、1つまたは複数のNHS-色素分子または当該技術分野で公知の他の色素分子(NHS標識量子ドットなど)を含む溶液と接触させる。幾つかの実施形態において、NHS-色素分子(または他のタイプの色素分子)は、検体分子44と相互作用し、それにより対応する蛍光シグナルを生成するように構成され、それにより基板400上に固定された検体分子の蛍光読出し(ステップ6)を可能にする(本明細書に記載されるように)。幾つかの実施形態において、NHS-色素分子(または他のタイプの色素分子)と検体44の間の相互作用は、特異的相互作用である。幾つかの実施形態において、蛍光読出しを行って、本明細書に記載されるように、基板400上で検出された検体分子を同定および定量する。
幾つかの実施形態において、シグナル伝達要素、例えば本明細書に記載される蛍光および/または視覚の導入により、個々の検体分子の捕捉事象(即ち、対応する捕捉バーコード、捕捉分子、検体分子の間の連結、および続くビオチン化または本明細書に記載された他のシグナル生成事象)が、それぞれの検体分子44(基板400上の)の場所に存在するシグナル伝達要素をもたらす、基板400の表面が得られる。本明細書に記載されるように、幾つかの実施形態において、シグナル伝達要素は、光学活性であり、顕微鏡または平面基板400内の集積化光センサーを使用して測定され得る。幾つかの実施形態において、シグナル伝達要素は、電気的に活性であり、集積化電気センサーを使用して測定されてもよい。幾つかの実施形態において、シグナル伝達要素は、磁気的に活性であり、集積化磁気センサーを使用して測定されてもよい。幾つかの実施形態において、各シグナル伝達要素は、蛍光分子または微生物、蛍光ポリマー、高電荷ナノ粒子、またはポリマーを含む。幾つかの実施形態において、各シグナル事象(対応する結合場所406で)は、同じタイプの検体分子(同じタイプの検体分子の単一コピー)の捕捉に関連し、対応する捕捉分子により決定される。したがって幾つかの実施形態において、基板400上の所与の捕捉バーコード20のマッピングされた場所406に基づき、シグナル伝達要素が存在するそのような結合場所406の数をカウントすることが、前記所与の捕捉バーコードに対応する試料中の検体分子の定量を与える。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載された任意のステップ(例えば、図2に示されたステップ1~6)の間に、基板400を洗浄して、基板400に接触した溶液から結合していないおよび/または付着していない内容物を除去する。
幾つかの実施形態において、アレイ(即ち、基板400上の複数の結合場所406)上のDNAオリガミ分子(超分子DNAオリガミ構造)の高密度配置は、超分子構造(例えば、オリガミ分子)に結合した一意的捕捉分子2の数のみにより複雑性が制限されて、検体分子44(例えば、タンパク質)の定量のための大規模な並行アッセイを可能にする。
幾つかの実施形態において、図2に記載される検体を検出するための方法は、単一のタイプの検体分子の検出を可能にする。幾つかの実施形態において、図2に記載される検体を検出するための方法は、複数のタイプの検体分子の検出(多重化された検体分子検出)を可能にする。幾つかの実施形態において、各超分子構造(例えば、超分子DNAオリガミ構造)は、バーコードを付与され、関連するそれぞれの捕捉分子を一意的に同定し、それにより捕捉されたそれぞれの検体分子の同定を可能にする。幾つかの実施形態において、各超分子DNAオリガミ構造は、それぞれの捕捉バーコードおよび/または固定分子を使用してバーコードを付与される。
幾つかの実施形態において、DNAオリガミナノ構造であり得る超分子構造(例えば、超分子DNAオリガミ構造)を有する単一分子のパターン化表面は、捕捉分子-検出分子複合体を使用して表面に既に固定された検体分子(例えば、タンパク質)を認識する新しい捕捉分子(例えば、アプタマー)を発見するために、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(「SELEX」)プラットフォームの大規模多重化ハイスループットとして使用され得る。幾つかの実施形態において、捕捉分子-検出分子複合体は、その全体が本明細書に組み込まれる、2020年9月15日出願の米国特許仮出願第63/078,837号(「837号出願」)に記載されるように、捕捉分子および検出分子を含む超分子構造の使用に対応する。幾つかの実施形態において、‘837号出願に記載された捕捉分子は、特定の検体分子と相互作用するように構成された、本明細書に記載される特定の捕捉分子(例えば、アプタマー)を指す。幾つかの実施形態において、‘837号出願に記載された検出分子は、特定の検体分子と相互作用するように構成された、本明細書に記載される特定の捕捉分子(例えば、アプタマー)を指す。幾つかの実施形態において、‘837号出願に記載された捕捉分子および検出分子は、特定の検体分子と相互作用するように構成された、本明細書に記載される特定の捕捉分子(例えば、アプタマー)の同じタイプを指す。幾つかの実施形態において、この捕捉分子-検出分子複合体は、不可逆的に結合される必要があり得て、検体-捕捉分子複合体も同様に、不可逆的に結合される必要があり得る。幾つかの実施形態において、捕捉バーコードは、分離されるように構成され、1つまたは複数の分離された捕捉バーコードを、遺伝子型決定、qPCR、シークエンシング、またはそれらの組合わせを利用して分析する。幾つかの実施形態において、試料中の複数の検体分子は、励起状態に移行した1つまたは複数の超分子DNAオリガミ構造を介した多重化を通して同時に検出される。幾つかの実施形態において、SELEXプラットフォームは、数十~数千の親和性結合剤のサイクリング(洗浄と、同時のフロースルー)を必要とし得る。
検体分子を検出するための方法の例示的実施形態
幾つかの実施形態において、本明細書において、試料中に存在する検体分子を検出するための方法であって、i)単一または複数の分子を含むコア構造と、ii)特定の検体認識分子の結合をマッピングする目的でバーコードを含む第一の場所でコア構造に連結された捕捉分子と、iii)特定の検体認識分子の結合をマッピングする目的のバーコード、および/またはDNAオリガミ構造を表面に共有結合もしくは非共有結合で結合させるためのバーコードを含み得る第二の場所のコア構造に連結された固定分子と、iv)フルオロフォア標識または非標識光学検出技術を通して超分子DNAオリガミ構造により提供されたシグナルに基づいて検体分子を検出することと、を含む、表面の所定の場所でアレイ形式で配置された、超分子DNAオリガミ構造を提供すること、を含む方法が提供される。
幾つかの実施形態において、本明細書において、試料中に存在する検体分子を検出するための方法であって、i)単一または複数の分子を含むコア構造と、ii)特定の検体認識分子の結合をマッピングする目的でバーコードを含む第一の場所でコア構造に連結された捕捉分子と、iii)特定の検体認識分子の結合をマッピングする目的のバーコード、および/またはDNAオリガミ構造を表面に共有結合もしくは非共有結合で結合させるためのバーコードを含み得る第二の場所のコア構造に連結された固定分子と、iv)フルオロフォア標識または非標識光学検出技術を通して超分子DNAオリガミ構造により提供されたシグナルに基づいて検体分子を検出することと、を含む、表面の所定の場所でアレイ形式で配置された、超分子DNAオリガミ構造を提供すること、を含む方法が提供される。
幾つかの実施形態において、本明細書において、試料中に存在する1つまたは複数の検体分子を検出するための方法であって、a)それぞれが、i)一意的認識要素を結合させるための単一または複数の分子を含むコア構造と、ii)所定の場所でコア構造に連結された捕捉分子と、iii)フルオロフォア標識または非標識光学検出技術を通して超分子DNAオリガミ構造により提供されたシグナルに基づいて検体分子を検出することと、を含む、複数の超分子DNAオリガミ構造を提供すること;b)核酸ハイブリダイゼーションまたは他の化学的連結を通して前記構造上の単一または複数の場所での捕捉のために、認識要素、即ち、SOMAmerまたは他の親和性結合実体を超分子DNAオリガミ構造と接触させること;c)表面の所定の場所に配置された複数の超分子DMAオリガミ構造を使用して、蛍光ベースのハイブリダイゼーションアッセイを通して各一意的認識要素の位置をマッピングすること、または試料をシークエンシングすること;d)試料を、表面の所定の場所の超分子DMAオリガミ構造に結合した認識要素と接触させること:e)読出し可能なシグナルを、i.表面上の予めマッピングされた場所で認識要素により固定された試料から捕捉された検体をビオチン化するステップ、ii.ビオチン化された場所を蛍光ストレプトアビジン部分で標識するステップ、の様々なステップを通して光学形式で生成すること;f)マッピング場所を、表面上の特定の検体結合場所からのシグナルと共に登録することを通して検体濃度を定量すること、を含む方法が提供される。
幾つかの実施形態において、本明細書において、試料中に存在する検体分子を検出するための方法であって、表面上の所定の場所にアレイ形式で配置され、i)単一または複数の分子を含むコア構造と、ii)第一の場所でコア構造に連結された捕捉分子であって、捕捉分子とコア構造の間の連結が、超分子構造上に捕捉分子の相互作用をマッピングするように構成された捕捉バーコードを含む、捕捉分子と、iii)特定の捕捉分子と捕捉バーコードの間の相互作用をマッピングする目的のバーコード、および/またはDNAオリガミ構造を表面に共有結合もしくは非共有結合で結合させるためのバーコードを含み得る第二の場所のコア構造に連結された固定分子とを含む超分子構造を提供すること、iv)捕捉分子が検体分子と相互作用するように、試料を超分子構造と接触させることと、v)捕捉分子と検体分子の間の相互作用に基づいてシグナルを生成させることと、vi)フルオロフォア標識または非標識光学検出技術を通して超分子DNAオリガミ構造により提供されたシグナルに基づいて検体分子を検出することと、を含む方法が提供される。幾つかの実施形態において、超分子構造は、超分子DNAオリガミ構造を含む。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、修飾型アプタマーを含むアプタマーを含む。幾つかの実施形態において、検体分子は、タンパク質を含む。
幾つかの実施形態において、本明細書において、試料中に存在する1つまたは複数の検体分子を検出するための方法であって、a)それぞれが、i)単一または複数の分子を含むコア構造と、ii)所定の場所でコア構造に連結されていて、特定の捕捉分子と連結を形成するように構成された捕捉分子と、を含む、複数の超分子構造を提供すること;b)核酸ハイブリダイゼーションまたは他の化学的連結を通して所与の超分子構造上の単一または複数の場所で、超分子構造を、1つまたは複数の捕捉分子(例えば、アプタマー、SOMAmerを含む修飾型アプタマー)または他の親和性結合実体と接触させること;c)表面上の所定の場所に配置された複数の超分子DMAオリガミ構造によって、蛍光ベースのハイブリダイゼーションアッセイを通して各一意的捕捉分子の位置をマッピングすること、または試料をシークエンシングすること;e)試料を、表面上の所定の場所の超分子構造に連結された捕捉分子と接触させること;e)フルオロフォア標識または非標識光学検出技術を通してシグナルを生成させること;f)マッピング場所を、表面の特定の検体結合場所からのシグナルと共に登録することを通して検体分子濃度を同定および定量すること、を含む方法が提供される。幾つかの実施形態において、検体分子の検出は、シグナルを、i.表面上の予めマッピングされた場所で認識要素により固定された試料から捕捉された検体をビオチン化するステップ、ii.ビオチン化された場所を蛍光、ストレプトアビジン部分で標識するステップの様々なステップを通して光学形式で検出することを含む。幾つかの実施形態において、超分子構造は、超分子DNAオリガミ構造を含む。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、修飾型アプタマーを含むアプタマーを含む。幾つかの実施形態において、検体分子は、タンパク質を含む。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法はさらに、試料中の検体分子の濃度を定量することを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法はさらに、検出された検体分子を同定することを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法はさらに、検体分子が、単一分子またはそれより多くの分子数で試料中に存在する場合にシグナルに基づいて検体分子を検出することを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、試料は、複合生体試料を含み、方法は、単一分子感度を提供し、それによりダイナミックレンジを増加させて、複合生体試料中の種々の分子濃度の定量的捕捉を可能にする。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、検体分子は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、それらの複合体、またはそれらの任意の組合わせを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各超分子DNAオリガミ構造は、2Dまたは3Dナノ構造である。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各コア構造は、ナノ構造である。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各ナノ構造のための複数のコア分子が、予め定義された形状で配置され、および/または既定の分子量を有する。幾つかの実施形態において、予め定義された形状は、別の超分子DNAオリガミ構造との交差反応を制限または防止するように構成される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各コア構造のための複数の分子は、1つもしくは複数の核酸鎖、1つもしくは複数の分枝状核酸、1つもしくは複数のペプチド、1つもしくは複数の小分子、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各コア構造は独立して、足場デオキシリボ核酸(DNA)オリガミ、足場リボ核酸(RNA)オリガミ、足場ハイブリッドDNA:RNAオリガミ、一本鎖DNAタイル構造、多鎖DNAタイル構造、一本鎖RNAオリガミ、多鎖RNAタイル構造、複数の足場を有する階層的構成のDNAもしくはRNAオリガミ、ペプチド構造、またはそれらの組合わせを含む。
幾つかの実施形態において、トリガー/読出しシグナルは、光シグナル、電気シグナル、またはその両方を含む。幾つかの実施形態において、トリガー光シグナルは、マイクロ波シグナル、紫外線、可視光線、近赤外線、光散乱、またはそれらの組合わせを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、反応性検体分子は、1)化学結合を通してそれぞれの超分子DNAオリガミ構造の捕捉分子に結合する。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各超分子DNAオリガミ構造のための捕捉分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー(RNAおよび/またはDNA)、フルオロフォア、DARPin、触媒、重合開始剤、PEGのようなポリマー、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、アプタマーは、修飾型アプタマーを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各超分子DNAオリガミ構造に関して、a)捕捉分子は捕捉バーコードを通してコア構造に連結され、捕捉バーコードは、第一の捕捉リンカーと、第二の捕捉リンカーと、第一の捕捉リンカーと第二の捕捉リンカーの間に配置された捕捉ブリッジと、を含み、第一の捕捉リンカーは、コア構造上の第一の場所に結合した第一のコアリンカーに結合され、捕捉分子および第二の捕捉リンカーは、第三の捕捉リンカーとの結合を通して共に連結される。幾つかの実施形態において、捕捉ブリッジのポリマーコアは独立して、特定の配列の核酸(DNAまたはRNA)またはPEGのようなポリマーを含む。幾つかの実施形態において、第一のコアリンカー、第二のコアリンカー、第一の捕捉リンカー、第二の捕捉リンカー、第三の捕捉リンカーは独立して、反応性分子またはDNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、各反応性分子は独立して、アミン、チオール、DBCO、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、NHS-エステル、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、PEGもしくは重合開始剤のような1種もしくは複数のポリマー、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、捕捉バーコードと、1)第一のコアリンカー、および/または2)第三の捕捉リンカーの間の連結は、化学結合を含む。幾つかの実施形態において、化学結合は、共有結合を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、捕捉分子は、化学結合を通して第三の捕捉リンカーに結合される。幾つかの実施形態において、捕捉分子は、第三の捕捉リンカーに共有結合される。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各超分子DNAオリガミ構造はさらに、コア構造に連結された固定分子を含む。幾つかの実施形態において、固定分子は、固定バーコードを介してコア構造に連結され、固定バーコードは、第一の固定リンカーと、第二の固定リンカーと、第一の固定リンカーと第二の固定リンカーとの間に配置された固定ブリッジと、を含み、第一の固定リンカーは、コア構造上の第二の場所に結合した第三のコアリンカーに結合され、固定分子は、第二の固定リンカーに連結される。幾つかの実施形態において、固定分子は、アミン、チオール、DBCO、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、NHS-エステル、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、PEGもしくは重合開始剤のような1種もしくは複数のポリマー、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、固定ブリッジは、ポリマーコアを含む。幾つかの実施形態において、固定ブリッジのポリマーコアは、特定の配列の核酸(DNAまたはRNA)またはPEGのようなポリマーを含む。幾つかの実施形態において、第二のコアリンカー、第一の固定リンカー、第二の固定リンカー、および固定分子は独立して、固定反応性分子またはDNA配列ドメインを含む。幾つかの実施形態において、各固定反応性分子は独立して、アミン、チオール、DBCO、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、NHS-エステル、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、PEGもしくは重合開始剤のような1種もしくは複数のポリマー、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、固定分子は、化学結合を通して第二の固定リンカーに連結される。幾つかの実施形態において、固定分子は、第二の固定リンカーに共有結合される。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、シグナルは、励起状態に移行した超分子DNAオリガミ構造に対応する捕捉バーコードを含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法はさらに、励起状態に移行した少なくとも1つの超分子DNAオリガミ構造に関して対応する捕捉分子から各捕捉バーコードを分離することを含むため、対応するシグナルは、それぞれの捕捉分子に結合した検体分子の検出のために核酸ベースの配列であり得るそれぞれの捕捉バーコードを含む。幾つかの実施形態において、少なくとも1つの分離された捕捉バーコードは、遺伝子型決定、qPCR、シークエンシング、またはそれらの組合わせを使用して分析される。幾つかの実施形態において、試料中の複数の検体分子は、励起状態に移行した1つまたは複数の超分子DNAオリガミ構造を介して多重化することを通して同時に検出される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、各超分子DNAオリガミ構造に関する捕捉分子は、1つまたは複数の特定のタイプの検体分子に結合するように構成される。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された複数のDNAオリガミ構造を使用することを含む任意の方法では、複数の超分子DNAオリガミ構造の各コア構造は、互いに同一である。幾つかの実施形態において、各超分子DNAオリガミ構造は、複数の超分子DNAオリガミ構造の間の交差反応を低減または制限するために、既定の形状、サイズ、分子量、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、各超分子DNAオリガミ構造は、複数の捕捉分子を含む。幾つかの実施形態において、各超分子DNAオリガミ構造は、複数の超分子DNAオリガミ構造の間の交差反応を低減または制限するために、既定の化学量論の捕捉分子を含む。
幾つかの実施形態において、複数の超分子DNAオリガミ構造は、1つもしくは複数の固体支持体、1つもしくは複数の固体基板、またはそれらの組合わせに付着される。幾つかの実施形態において、1つまたは複数の固体基板の各固体基板は、平面基板を含む。幾つかの実施形態において、複数の超分子DNAオリガミ構造は、平面基板上に配置され、平面基板は、複数の結合部位を含み、各結合部位は、対応する超分子DNAオリガミ構造に連結するように構成される。幾つかの実施形態において、複数の超分子DNAオリガミ構造は、同じ検体分子を検出するように構成される。幾つかの実施形態において、平面基板を使用することを含む任意の方法ではさらに、励起状態に移行した少なくとも1つの超分子DNAオリガミ構造の捕捉された検体分子に連結するように構成された複数のシグナル伝達要素を提供することを含む(本明細書に記載される)。幾つかの実施形態において、各シグナル伝達要素は、蛍光分子または微生物、蛍光ポリマー、高電荷ナノ粒子、またはポリマーを含む。幾つかの実施形態において、複数の超分子DNAオリガミ構造の少なくとも1つの超分子DNAオリガミ構造は、他の超分子DNAオリガミ構造とは異なる検体分子を検出するように構成される。幾つかの実施形態において、平面基板を使用することを含む任意の方法ではさらに、平面基板上の各超分子DNAオリガミ構造の場所を同定するために、各超分子DNAオリガミ構造にバーコードを付与することを含む。幾つかの実施形態において、平面基板を使用することを含む任意の方法では、励起状態に移行した少なくとも1つ超分子DNAオリガミ構造の捕捉された検体分子に連結するように構成された複数のシグナル伝達要素を提供することを含む。幾つかの実施形態において、各シグナル伝達要素は、蛍光分子またはマイクロビーズ、蛍光ポリマー、高荷電ナノ粒子またはポリマーを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、試料は、生物学的粒子または生体分子を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、試料は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質,DNA、RNA、有機分子、ウイルス粒子、エクソソーム、オルガネラ、またはそれらの任意の複合体を含む水溶液を含む。幾つかの実施形態において、本明細書で開示された任意の方法では、試料は、組織生検、血液、血漿、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、細胞外液、培養細胞、培地、廃棄組織、植物性物質、合成タンパク質、細菌および/もしくはウイルス試料または真菌組織、あるいはそれらの組合わせを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書において、複数の超分子DNAオリガミ構造を含む、試料中の1つまたは複数の検体分子を検出するための基板であって、各超分子DNAオリガミ構造が、a)複数のコア分子を含むコア構造と、b)第一の場所で超分子コアに連結された捕捉分子と、を含み、検体分子の認識により、相互作用が、それぞれの超分子DNAオリガミ構造を誘発して励起状態へと移行させ、それぞれの検体分子を検出するためのシグナルを提供する、基板が提供される。
幾つかの実施形態において、本明細書において、複数の超分子構造を含む、試料中の1つまたは複数の検体分子を検出するための基板であって、各超分子構造が、a)複数のコア分子を含むコア構造と、b)第一の場所で超分子コアに連結された捕捉分子と、を含み、捕捉分子が、特定の検体分子と相互作用するように構成されて、相互作用が、それぞれの超分子構造を誘発して励起状態に移行させ、それぞれの検体分子を検出するためのシグナルの生成を可能にする基板が提供される。幾つかの実施形態において、超分子構造は、超分子DNAオリガミ構造を含む。
幾つかの実施形態において、それぞれの検体分子は、1)化学結合を通して捕捉分子に結合される。幾つかの実施形態において、それぞれの超分子DNAオリガミ構造に関する捕捉分子は独立して、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー(RNAおよびDNA)、フルオロフォア、DARPin、触媒、重合開始剤、PEGのようなポリマー、またはそれらの組合わせを含む。
幾つかの実施形態において、それぞれの検体分子と捕捉分子の間の相互作用は、捕捉分子と連結を形成するそれぞれの検体分子を含む。幾つかの実施形態において、連結は、化学結合を含む。幾つかの実施形態において、各超分子DNAオリガミ構造のための捕捉分子は独立して、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー(RNAおよび/またはDNA)、フルオロフォア、DARPin、触媒、重合開始剤、PEGのようなポリマー、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、アプタマーは、修飾型アプタマーを含む。
幾つかの実施形態において、試料は、生物学的粒子または生体分子を含む。幾つかの実施形態において、試料は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質,DNA、RNA、有機分子、ウイルス粒子、エクソソーム、オルガネラ、またはそれらの任意の複合体を含む水性溶液を含む。幾つかの実施形態において、試料は、組織生検、血液、血漿、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、細胞外液、培養細胞、培地、廃棄組織、植物性物質、合成タンパク質、細菌および/もしくはウイルス試料または真菌組織、あるいはそれらの組合わせを含む。
幾つかの実施形態において、試料は、複合的な生体試料を含み、方法は、単一分子感度を提供し、それによりダイナミックレンジを増加させて、複合的な生体試料中の種々の分子濃度の定量的捕捉を可能にする。幾つかの実施形態において、検体分子は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質、DNA、RNA、有機分子、無機分子、それらの複合体、またはそれらの任意の組合わせを含む。幾つかの実施形態において、超分子DNAオリガミ構造は、ナノ構造である。幾つかの実施形態において、コア構造は、ナノ構造である。幾つかの実施形態において、コア構造のための複数のコア分子が、予め定義された形状に配置され、および/または既定の分子量を有する。幾つかの実施形態において、予め定義された形状は、別の超分子DNAオリガミ構造との交差反応を制限または防止するように構成される。幾つかの実施形態において、各コア構造のための複数のコア分子は、1つもしくは複数の核酸鎖、1つもしくは複数の分枝状核酸、1つもしくは複数のペプチド、1つもしくは複数の小分子、またはそれらの組合わせを含む。幾つかの実施形態において、コア構造は独立して、足場デオキシリボ核酸(DNA)オリガミ、足場リボ核酸(RNA)オリガミ、足場ハイブリッドDNA:RNAオリガミ、一本鎖DNAタイル構造、多鎖DNAタイル構造、一本鎖RNAオリガミ、多鎖RNAタイル構造、複数の足場を有する階層的構成のDNAもしくはRNAオリガミ、ペプチド構造、またはそれらの組合わせを含む。
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に図示および記載されているが、そのような実施形態が例示として提供されているにすぎないことが、当業者に自明であろう。今後、数多くの変形、変更、および置換が、本発明を逸脱することなく当業者に想起されるであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態の様々な代替法が、本発明を実践する際に利用され得ることが、理解されなければならない。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造、ならびにそれらに包含される均等物を定義すると意図される。
Claims (92)
- 試料中に存在する検体分子を検出するための方法であって、前記方法が、
(a)
i)複数のコア分子を含むコア構造と、
ii)第一の場所で前記コア構造に連結され、捕捉分子と連結を形成するように構成された捕捉バーコードと、
を含む、超分子構造を提供すること;
(b)前記捕捉バーコードを介して前記超分子構造を前記捕捉分子に連結させること;
(c)前記超分子構造を前記試料と接触させ、それにより前記検体分子が前記捕捉分子と相互作用してそれに結合され、それにより前記超分子構造を基底状態から励起状態に移行させること;
(d)前記励起状態の前記超分子構造を介してシグナルを生成させること;および
(e)前記シグナルに基づいて前記検体分子を検出すること、
を含む、方法。 - 試料中に存在する1つまたは複数の検体分子を検出するための方法であって、
(a)それぞれが、
i.複数のコア分子を含むコア構造と、
ii.第一の場所で前記コア構造に連結した捕捉バーコードと、
を含む、複数の超分子構造を提供すること;
(b)対応する捕捉バーコードを介して、前記複数の超分子構造のそれぞれを捕捉分子に連結させること;
(c)前記複数の超分子構造を前記試料と接触させ、それにより前記複数の超分子構造の1つまたは複数の捕捉分子が、前記1つまたは複数の検体分子の対応する検体分子と相互作用し、それにより対応する超分子構造を基底状態から励起状態に移行させること;
(d)励起状態の各超分子構造のシグナルを生成させること;および
(e)生成された対応するシグナルに基づいて各検体分子を検出すること、
を含む、方法。 - 検出された各検体分子を同定することをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 検出された各検体分子の濃度を定量することをさらに含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 各捕捉分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、アプタマー(RNAおよび/またはDNA)、DNA小分子、親和性結合剤、またはそれらの組合わせを含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 各アプタマーが、修飾型アプタマーを含む、請求項5に記載の方法。
- 各修飾型アプタマーが、特定のタイプの検体分子と特異的に相互作用するように構成される、請求項6に記載の方法。
- さらに、前記検体分子が1分子以上の個数で前記試料中に存在する場合に生成する前記シグナルに基づいて各検体分子を検出することを含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が、複合生体試料を含み、前記方法が、単一分子感度を提供し、それにより前記複合生体試料中の種々の分子濃度のダイナミックレンジおよび定量的捕捉を増加させる、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の検体分子が、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質、DNA、RNA、有機分子、無機分子、それらの複合体、またはそれらの任意の組合わせを含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の超分子構造を提供することが、1つもしくは複数のウィジェット、1つもしくは複数の固体支持体、1つもしくは複数のポリマーマトリクス、1つもしくは複数の固体基板、1つもしくは複数の分子縮合体、またはそれらの組合わせに付着された前記超分子構造を提供することを含む、請求項2~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の固体基板の各固体基板が、平面基板を含む、請求項11に記載の方法。
- 各平面基板が、複数の結合部位を含み、前記結合部位のそれぞれが、前記複数の超分子構造の1つの超分子構造に付着するように構成される、請求項12に記載の方法。
- 各結合部位が、前記超分子構造に連結された対応する固定分子を介して超分子構造に付着する、請求項13に記載の方法。
- 前記複数の結合部位に付着された前記複数の超分子構造の場所をマッピングすることをさらに含み、前記マッピングが、1)前記対応する捕捉バーコード、2)前記超分子構造に連結された固定バーコード、および/または3)前記超分子構造に連結された別のバーコード、を介する、請求項12に記載の方法。
- 前記マッピングが、請求項2のステップ(a)の前に、および/または請求項2のステップ(c)の前に行われる、請求項15に記載の方法。
- 前記マッピングが、対応する結合場所に付着された対応する超分子構造に連結されるように構成された前記捕捉分子および対応する検体分子の同定を可能にする、請求項15に記載の方法。
- 前記複数の超分子構造の2つ以上の超分子構造が、対応する捕捉分子を介して前記複数の検体分子の同じ検体分子と連結を形成するように構成される、請求項2~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルが、蛍光シグナルおよび/または視覚シグナルを含む、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルを生成させることが、
(a)前記励起状態の対応する超分子構造に連結された各検体分子を前駆体分子と結合させること;ならびに
(b)検体分子に結合した各前駆体分子をフルオロフォアおよび/または蛍光標識された分子でタグづけし、それにより前記蛍光シグナルを生成させること、
を含む、請求項19に記載の方法。 - 前記前駆体分子が、ビオチン分子を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記ビオチン分子が、NHS-ビオチン分子を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記NHS-ビオチン分子が、アミン反応性NHS-ビオチン分子を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記蛍光標識された分子が、蛍光標識されたストレプトアビジン、蛍光標識されたアビジン、またはその両方を含む、請求項20~23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルを生成させることが、前記励起状態の対応する超分子構造に連結された各検体分子を色素分子でタグづけし、それにより前記蛍光シグナルを生成させることを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記色素分子が、NHS-色素分子を含む、請求項25に記載の方法。
- 各検体分子を前記検出することが、前記生成されたシグナル(複数可)の蛍光読出しを得ること、および各対応する超分子構造を、前記捕捉分子およびそれに連結されるように構成された検体分子と相関させることを含む、請求項20~26のいずれか1項に記載の方法。
- 対応する超分子構造を相関させることが、請求項15に記載のマッピングに基づく、請求項27に記載の方法。
- 前記検出することが、蛍光顕微鏡を使用して蛍光読出しを得ることを含む、請求項19~28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルを生成させることが、
(a)前記励起状態の対応する超分子構造に連結された各検体分子を前駆体分子と結合させること;および
(b)検体分子に結合した各前駆体分子を、光を散乱する分子またはナノ粒子に連結させ、それにより前記視覚シグナルを生成させること、
を含む、請求項19に記載の方法。 - 前記前駆体分子が、ビオチン分子を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記ビオチン分子が、NHS-ビオチン分子を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記NHS-ビオチン分子が、アミン反応性NHS-ビオチン分子を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記光を散乱する分子またはナノ粒子が、ストレプトアビジン分子、アビジン分子、またはその両方を含む、請求項30~33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ストレプトアビジン分子、前記アビジン分子、またはその両方が、Qdotまたは金属ナノ粒子を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記視覚シグナルが、前記前駆体分子に連結された大きなストレプトアビジンおよび/またはアビジン分子の視覚化を含む、請求項34または35に記載の方法。
- 各検体分子を前記検出することが、各前駆体分子と、光を散乱する分子またはナノ粒子の間の相互作用を視覚化すること、および各対応する超分子構造を、前記捕捉分子およびそれに連結されるように構成された検体分子に相関させること、を含む、請求項30~36のいずれか1項に記載の方法。
- 各対応する超分子構造の前記相関が、請求項15に記載のマッピングに基づく、請求項37に記載の方法。
- 前記検出することが、干渉散乱顕微鏡を使用することを含む、請求項37または38に記載の方法。
- 前記シグナルを生成させることが、前記励起状態の対応する超分子構造に連結した各検体分子を第二の捕捉分子に連結させることを含み、各対応する第二の捕捉分子が、1)蛍光シグナルを生成するように蛍光標識される、または2)対応する検体分子で形成された複合体を通したサンドイッチ形成を介して視覚的シグナルを発生するために標識されない、請求項19に記載の方法。
- 各検体分子を前記検出することが、前記生成されたシグナル(複数可)の蛍光読出しを得ること、および各対応する超分子構造を、前記捕捉分子およびそれに連結されるように構成された検体分子に相関させることを含む、請求項40に記載の方法。
- 各対応する超分子構造の前記相関が、請求項15に記載のマッピングに基づく、請求項41に記載の方法。
- 前記検出することが、蛍光顕微鏡を使用して蛍光読出しを得ることを含む、請求項40~42のいずれか1項に記載の方法。
- 各検体分子を前記検出することが、各検体分子と第二の捕捉分子の間の相互作用を視覚化すること、および各対応する超分子構造を、前記捕捉分子およびそれに連結されるように構成された検体分子に相関させること、を含む、請求項40に記載の方法。
- 各対応する超分子構造の前記相関が、請求項15に記載のマッピングに基づく、請求項44に記載の方法。
- 前記検出することが、干渉散乱顕微鏡を使用することを含む、請求項44または45に記載の方法。
- 各超分子構造が、ナノ構造である、請求項1~46のいずれか1項に記載の方法。
- 各コア構造が、ナノ構造である、請求項1~47のいずれか1項に記載の方法。
- 各コア構造の前記複数のコア分子が、予め定義された形状に配置され、および/または既定の分子量を有する、請求項1~48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記予め定義された形状が、別の超分子構造との交差反応性を限定または防止するように構成される、請求項49に記載の方法。
- 各コア構造の前記複数のコア分子が、1つもしくは複数の核酸鎖、1つもしくは複数の分枝状核酸、1つもしくは複数のペプチド、1つもしくは複数の小分子、またはそれらの組合わせを含む、請求項1~50のいずれか1項に記載の方法。
- 各コア構造が独立して、足場デオキシリボ核酸(DNA)オリガミ、足場リボ核酸(RNA)オリガミ、足場ハイブリッドDNA:RNAオリガミ、一本鎖DNAタイル構造、多鎖DNAタイル構造、一本鎖RNAオリガミ、多鎖RNAタイル構造、複数の足場を有する階層的構成のDNAもしくはRNAオリガミ、ペプチド構造、またはそれらの組合わせを含む、請求項51に記載の方法。
- 各検体分子が、化学結合を通して対応する捕捉分子と相互作用する、請求項1~52のいずれか1項に記載の方法。
- 各超分子構造のために、前記捕捉分子が、捕捉バーコードを通して前記コア構造に連結され、前記捕捉バーコードが、第一の捕捉リンカーと、第二の捕捉リンカーと、前記第一の捕捉リンカーと前記第二の捕捉リンカーとの間に配置された捕捉ブリッジと、を含み、前記第一の捕捉リンカーが、前記コア構造上の前記第一の場所に結合した第一のコアリンカーに結合され、前記捕捉分子と前記第二の捕捉リンカーとが、第三の捕捉リンカーへの結合を通して互いに連結される、請求項1~53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記捕捉ブリッジが、ポリマーコアを含む、請求項54に記載の方法。
- 前記捕捉ブリッジの前記ポリマーコアが、特定の配列の核酸(DNAまたはRNA)またはPEGのようなポリマーを含む、請求項54または55に記載の方法。
- 前記第一のコアリンカー、第二のコアリンカー、第三のコアリンカー、第一の捕捉リンカー、第二の捕捉リンカー、第三の捕捉リンカーが独立して、反応性分子またはDNA配列ドメインを含む、請求項54~56のいずれか1項に記載の方法。
- 各反応性分子が独立して、アミン、チオール、DBCO、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、NHS-エステル、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、PEGもしくは重合開始剤のような1種もしくは複数のポリマー、またはそれらの組合わせを含む、請求項57に記載の方法。
- 前記捕捉バーコードと、1)前記第一のコアリンカー、および/または2)前記第三の捕捉リンカーの間の連結が、化学結合を含む、請求項54~58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化学結合が、共有結合を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記捕捉分子が、化学結合を通して前記第三の捕捉リンカーに結合される、請求項54~60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記捕捉分子が、前記第三の捕捉リンカーに共有結合される、請求項61に記載の方法。
- 各超分子構造がさらに、前記コア構造に連結された固定分子を含む、請求項54~62のいずれか1項に記載の方法。
- 前記固定分子が、固定バーコードを介して前記コア構造に連結され、前記固定バーコードが、第一の固定リンカーと、第二の固定リンカーと、前記第一の固定リンカーと前記第二の固定リンカーとの間に配置された固定ブリッジと、を含み、前記第一の固定リンカーが、前記コア構造上の第二の場所に結合した第三のコアリンカーに結合され、前記固定分子が、前記第二の固定リンカーに連結される、請求項63に記載の方法。
- 前記固定分子が、アミン、チオール、DBCO、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、NHS-エステル、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、PEGもしくは重合開始剤のような1種もしくは複数のポリマー、またはそれらの組合わせを含む、請求項64に記載の方法。
- 前記固定ブリッジが、ポリマーコアを含む、請求項64または65に記載の方法。
- 前記固定ブリッジの前記ポリマーコアが、特定の配列の核酸(DNAまたはRNA)またはPEGのようなポリマーを含む、請求項64~66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第三のコアリンカー、第一の固定リンカー、第二の固定リンカー、および固定分子が独立して、固定反応性分子またはDNA配列ドメインを含む、請求項64~67のいずれか1項に記載の方法。
- 各固定反応性分子が独立して、アミン、チオール、DBCO、マレイミド、ビオチン、アジド、Acrydite、NHS-エステル、特定の配列の一本鎖核酸(DNAまたはRNA)、PEGもしくは重合開始剤のような1種もしくは複数のポリマー、またはそれらの組合わせを含む、請求項68に記載の方法。
- 前記固定分子が、化学結合を通して前記第二の固定リンカーに連結される、請求項64~69のいずれか1項に記載の方法。
- 前記固定分子が、前記第二の固定リンカーに共有結合される、請求項70に記載の方法。
- 前記第一の場所が、前記コア構造の第一の側に位置し、前記第二の場所が、前記コア構造の第二の側に位置する、請求項64~71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料中の前記1つまたは複数の検体分子が、励起状態に移行した1つまたは複数の超分子構造を介して多重化することを通して同時に検出される、請求項2~72のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の超分子構造の各コア構造が、互いに同一である、請求項2~73のいずれか1項に記載の方法。
- 各超分子構造が、既定の形状、サイズ、分子量、またはそれらの組合わせを含む、請求項2~74のいずれか1項に記載の方法。
- 各超分子構造が、複数の捕捉分子を含む、請求項2~75のいずれか1項に記載の方法。
- 各超分子構造が、既定の化学量論の前記捕捉分子を含む、請求項2~76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の超分子構造の少なくとも1つの超分子構造が、他の超分子構造と異なる検体分子を検出するように構成される、請求項1~77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が、生物学的粒子または生体分子を含む、請求項1~78のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、脂質、DNA、RNA、有機分子、ウイルス粒子、エクソソーム、オルガネラ、またはそれらの任意の複合体を含む水溶液を含む、請求項1~79のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が、組織生検、血液、血漿、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、細胞外液、培養細胞、培地、廃棄組織、植物性物質、合成タンパク質、細菌および/もしくはウイルス試料もしくは真菌組織、またはそれらの組合わせを含む、請求項1~80のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中の1つまたは複数の検体分子を検出するためのシステムであって
(a)複数の結合場所を含む基板と;
(b)複数の超分子構造であって、前記複数の結合場所の各結合場所が前記複数の超分子構造の1つの超分子構造を受けるように構成され、各超分子構造が、
i.複数のコア分子を含むコア構造と、
ii.第一の場所で前記コア構造に連結された捕捉バーコードと、
を含む、複数の超分子構造と;
(c)複数の捕捉分子であって、各捕捉バーコードが前記複数の捕捉分子の1つの捕捉分子に連結するように構成された、複数の捕捉分子と;
(d)前記1つまたは複数の検体分子を含む前記試料であって、前記試料を前記基板と接触させると、前記1つまたは複数の検体分子が前記複数の捕捉分子の対応する捕捉分子と相互作用し、それにより対応する超分子構造が基底状態から励起状態に移行する、前記試料と;
(e)励起状態の超分子構造に基づいてシグナルを生成することが可能なシグナル生成システムと;
(f)前記生成されたシグナルに基づいて励起状態の超分子構造に連結された各検体分子を検出するように構成された検出システムと、
を含む、システム。 - 前記シグナルが、蛍光シグナル、視覚シグナル、またはその両方を含む、請求項82に記載のシステム。
- 前記検出システムが、蛍光顕微鏡および/またはiSCATを含む、請求項82または83に記載のシステム。
- 前記複数の結合場所の前記複数の超分子構造の場所が、マッピングされるように構成される、請求項82~84のいずれか1項に記載のシステム。
- 請求項5~7のいずれか1項に記載の捕捉分子をさらに含む、請求項82~85のいずれか1項に記載のシステム。
- 請求項10に記載の検体分子をさらに含む、請求項82~86のいずれか1項に記載のシステム。
- 請求項47~78のいずれか1項に記載の超分子構造をさらに含む、請求項82~87のいずれか1項に記載のシステム。
- 請求項79~81のいずれか1項に記載の試料をさらに含む、請求項82~88のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記システムが、前記検体分子が1分子以上の個数で試料中に存在する場合に、生成する前記シグナルに基づいて各検体分子を検出するように構成される、請求項82~89のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記試料が、複合生体試料を含み、前記方法が、単一分子感度を提供し、それにより前記複合生体試料中の種々の分子濃度のダイナミックレンジおよび定量的捕捉を増加させる、請求項82~90のいずれか1項に記載のシステム。
- 各検体分子が、化学結合を通して前記対応する捕捉分子と相互作用する、請求項82~91のいずれか1項に記載の方法。
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