JP2024505134A - 抗体の特徴付けのための手段 - Google Patents

Abstract

本開示は、超希薄溶液中において自己会合特性（粘度および乳白光）に関して標的タンパク質をスクリーニングするための手段（例えば、使用、ナノ粒子、溶液、方法、キット、およびシステム）を提供する。この手段は、最終用途の製剤と比べて桁違いに低い濃度で多数の標的タンパク質をスクリーニングするための手段を提供する。

Description

本開示は、超希薄溶液測定値を使用してタンパク質（例えば、治療用抗体）の自己会合特性を検出するのに有用な手段（例えば、使用、ナノ粒子、溶液、方法、キット、およびシステム）を提供する。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、最も成功した医療治療法の一つであり、多様な疾患を処置するのに使用される。この成功にもかかわらず、ｍＡｂは、製造、安定性、および送達での大きな課題をもたらす開発上での問題点を抱えやすい。具体的には、皮下投与が意図されたｍＡｂの開発は、高濃度製剤の必要性により妨げられる可能性があり、この高濃度製剤は、高粘度、乳白光、相分離、および凝集の形での溶液挙動の不良により限定的になることが多い。病院環境におけるｍＡｂの静脈内投与は日常的であるが、皮下投与は低侵襲性であり、患者のコンプライアンスがより保証され、かつ医療インフラが不十分な環境においても容易に適応可能である。開発可能な治療用ｍＡｂ候補の迅速な選択が常に望まれているが、感染症パンデミックと戦う場合には、この緊急性はさらに深刻となる。開発可能性に問題が生じた場合には、資源集約的な緩和戦略を講じなければならず、このことは、遅延を必ず引き起こし、かつ成功を保証するものではない。従って、発見の初期段階で薬剤のような特性を有するバリアントを同定することをかなり重視しつつ、有利な溶液特性を有するｍＡｂを早期に選択することが、はるかに効率的である。

本明細書で開示されているのは、第１の態様では、正荷電ポリマーの使用であって、表面上に捕捉剤を含むナノ粒子を安定化させるための使用である。

本明細書で開示されているのは、第２の態様では、表面上に、捕捉剤と、正荷電ポリマーとを含むナノ粒子である。

本明細書で開示されているのは、第３の態様では、溶液であって、第２の態様の複数のナノ粒子を含む溶液である。

本明細書で開示されているのは、第４の態様では、キットであって、ナノ粒子と、正荷電ポリマーとを含むキットである。

本明細書で開示されているのは、第５の態様では、標的タンパク質の自己会合傾向を決定する方法であって、
（ｉ）第３の態様で定義された溶液中で標的タンパク質を捕捉する工程、
（ｉｉ）この溶液の色を決定する工程
を含み、
標的タンパク質を含まない、第３の態様で定義されたコントロール溶液と比較したこの溶液の色の変化は、標的タンパク質の自己会合傾向を示す、
方法である。

本明細書で開示されているのは、第６の態様では、自己会合特性に関して希薄濃度で標的タンパク質をスクリーニングする方法であって、捕捉剤と正荷電ポリマーとを表面（例えばナノ粒子（例えば金属ナノ粒子））上に吸着させて、捕捉剤コンジュゲートを形成すること；この捕捉剤コンジュゲートを、溶液（例えば緩衝液）中で標的タンパク質と共にインキュベートして、標的タンパク質コンジュゲートを形成すること；４５０ｎｍ～約７５０ｎｍの範囲の複数の波長で、標的タンパク質コンジュゲートの吸光度を測定すること；および標的タンパク質コンジュゲートによる吸光度が最大となる波長としてプラズモン波長を特定することを含む方法である。

本明細書で開示されているのは、第７の態様では、捕捉剤、正荷電ポリマー、捕捉表面（例えば金属ナノ粒子）、溶液（例えば緩衝液）、標的タンパク質；少なくとも１種の較正タンパク質；および分光光度計の内のそれぞれの１つまたはそれ以上を含むシステムまたはキットである。

本開示の他の態様および実施形態は、下記の詳細な説明および添付の図面を考慮して明らかであるだろう。

モノクローナル抗体の例示的な研究開発プロセスの概略である。抗体発見キャンペーンは、標的生体分子を認識する数千もの候補抗体の特定および検証で始まる。大きなプールは、最適化段階中に数百のオーダーに凝縮され、候補は、親和性成熟およびヒト化を受ける。これらの初期段階中では、入手可能な材料は微量（ｎｇ～μｇ範囲）であり、そのため、粘度、乳白光、および凝集等の開発可能性の品質属性の評価は実行不可能となる。このため、開発可能性属性が低い分子が臨床開発に進むことは珍しいことではなく、実行可能な医薬品の生成に費やされる時間およびリソースの量が大幅に増加する。本明細書で説明されているＣＳ－ＳＩＮＳアプローチ等の超低消費で高スループットのアッセイを使用するリード最適化中の主要な開発可能性属性の評価は、開発の後期段階における製造および製剤化中の合併症のリスクが低下した抗体候補の前進を促進し、タイムラインを早め、関連するリソースの消費も削減することになる。 図２Ａ～２Ｄは、ポリリシンを使用する抗体－金コンジュゲートの安定化の評価を示す。標準的なＡＣ－ＳＩＮＳ実行からの免疫金コンジュゲート（図２Ａ、左側）を、一般的な製剤およびプロセス条件（１０ｍＭの酢酸およびヒスチジン緩衝液、ｐＨ４．０４～６．５）下で安定性に関して評価した。動的光散乱測定により、ｐＨ５．０で始まるコンジュゲートの急速の凝集を観察し、関連条件全体を通してｐＨ６．５まで続いた（図２Ｂ、左側）。凝集したコンジュゲートのプラズモン波長の同時のシフトも観察され、吸光度分光法で測定した（図２Ｃ、左側）。ｐＨ範囲にわたってゼータ電位を測定し、ｐＨが４．０から上昇するにつれて電位の一貫した低下を観察し、ｐＨ５．７５付近でゼロに交差し、その後はマイナスに転じた（図２Ｄ、左側）。製剤空間中における免疫金コンジュゲートの安定性を達成するために、高荷電生体高分子である少量（３質量％）のポリリシンを組み込んだ（図２、中央）。粒径のＤＬＳ測定値（図２Ｂ、中央）およびプラズモン波長の光学測定値（図２Ｃ、中央）の両方を使用して、粒子の安定化をｐＨ６．０まで観察した。コンジュゲートのデータ電位は、アッセイしたｐＨ範囲にわたり正のままであった（図２Ｄ、中央）。しかしながら、ｐＨ６．０付近での電位の絶対値はゼロに近く、これは、不安定なコンジュゲートによる類似の実験での凝集と関連している。高度に安定化された１５％ポリリシン条件により実証されたように（図２Ａ、右側）、ポリリシンが３％～１５％の範囲内で増加するにつれて安定化が増加した。このコンジュゲートは、ＤＬＳサイズ測定値（図２Ｂ、右側）およびプラズモン波長（図２Ｃ、右側）により示されるように、関連するｐＨ範囲にわたり安定であった。高度に安定化された粒子のゼータ電位は、測定範囲にわたりプラスであった（図２Ｄ、右側）。図２Ｅは、ナノ粒子のプラズモン波長を決定するために使用される波長の関数としての吸光度の例示的なグラフである。 図２－１の続き。 図２－２の続き。 図３Ａ～Ｈは、弱いタンパク質間相互作用の評価のための電荷安定化免疫金コンジュゲートの応用を示す。５６種のモノクローナル抗体の多様なパネルを利用して、抗体自己相互作用の特定での電荷安定化免疫金コンジュゲートの有用性を評価した。このパネルは、治療用抗体データベース（ＴＡＢＳ）から抽出された５００種の分子のデータセットとの生物物理的特性の類似により明らかなように、臨床抗体の状況の正確な再現を表した（図３Ａ～３Ｄ）。ポリリシンの様々な濃度（３％対１０％）で実施した実験の結果を比較することにより、較正アプローチ（方法で説明されている）の頑健性が実証された。２つの条件間で優れた相関関係を観察し、このアッセイが試薬調製のばらつきに起因して起こり得るポリリシン濃度の小さい変化からの影響に対する耐性を示すことが実証された（図３Ｅ）。ＣＳ－ＳＩＮＳスコアを、重要な開発可能性特性の直接測定と比較し（全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｊ．Ｓ．他．Ｓｃｉ Ａｄｖ ６、ｅａｂｂ０３７２、ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａｂｂ０３７２（２０２０）を参照されたい）、これは、実験的に、粘度＞３０ｃＰまたは乳白光＞１２ＮＴＵのｍＡｂは、臨床開発中の製造および製剤化における問題を示唆することが立証された。これらのベンチマークを適用すると、ＣＳ－ＳＩＮＳ閾値０．３５を使用すると、良好な挙動（粘度＜３０ｃＰ、および乳白光＜１２ＮＴＵ）、粘度（＞３０ｃＰ）、または乳白光（＞１２ＮＴＵ）、またはｍＡｂパネルの＞８５％での問題のある溶液挙動を示すことが分かった（図３Ｆ～３Ｈ）。 図３－１の続き。 図３－２の続き。 図３－３の続き。 図３－４の続き。 図３－５の続き。 ＣＳ－ＳＩＮＳ較正プロセスの方法論を示す。ＣＳ－ＳＩＮＳ測定値を、２つの試験を使用して較正して評価する。両方の試験に合格したＣＳ－ＳＩＮＳ測定値のみを許容すべきである。 図５Ａ～Ｃは、ＣＳ－ＳＩＮＳ測定値の例示的な較正を示す。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体と金粒子との緩やか混合（図５Ｂ）、または標的ｍＡｂ濃度の５０％の添加（図５Ｃ）に起因して、較正プロセスが合格した（図５Ａ）および不合格した（図５Ｂ～５Ｃ）実験の例。試験番号１に合格するために、抗体－金コンジュゲートは、５３４ｎｍ（ヒトポリクローナル抗体）および５３３ｎｍ（ＮＩＳＴ ｍＡｂ）未満のプラズモン波長を示す。試験番号２に合格するために、コンジュゲートは、理論値（傾きに関して１、切片に関して０、およびＲ^２に関して１）の１０％以内であるｍＡｂの参照パネルに対する較正パネルの線形フィットパラメータを示す。ＣＳ－ＳＩＮＳスコアを、本明細書で説明されているように算出する。 図５－１の続き。 較正されたＣＳ－ＳＩＮＳ結果は、様々なポリリシン濃度を使用して調製されたコンジュゲートに関して強く相関していることを示す。様々な量のポリリシンによる実験からの結果を正規化するために、頑強な較正プロコルを開発した。０．０３（９７％ＩｇＧ）および０．１０（９０％ＩｇＧ）のポリリシン／ＩｇＧの質量分率にてポリリシンにより安定化されたヤギ抗ヒトＦｃ抗体コンジュゲートを使用したｍＡｂのパネルに関するプラズモンシフト測定値（図６Ａ）。図６Ｂは、図４および５で詳述した較正を使用して、図６Ａで報告したプラズモン測定値に関して２つのポリリシン／ＩｇＧ質量分率で測定されたｍＡｂのパネルに関するＣＳ－ＳＩＮＳスコア間の較正のグラフである。 較正されたＣＳ－ＳＩＮＳ結果は、様々なポリリシン濃度を使用して調製されたコンジュゲートに関して強く相関していることを示す。様々な量のポリリシンによる実験からの結果を正規化するために、頑強な較正プロコルを開発した。０．０３（９７％ＩｇＧ）および０．１０（９０％ＩｇＧ）のポリリシン／ＩｇＧの質量分率にてポリリシンにより安定化されたヤギ抗ヒトＦｃ抗体コンジュゲートを使用したｍＡｂのパネルに関するプラズモンシフト測定値（図６Ａ）。図６Ｂは、図４および５で詳述した較正を使用して、図６Ａで報告したプラズモン測定値に関して２つのポリリシン／ＩｇＧ質量分率で測定されたｍＡｂのパネルに関するＣＳ－ＳＩＮＳスコア間の較正のグラフである。 図７Ａ～Ｃは、ＣＳ－ＳＩＮＳ測定値が、ＩｇＧサブクラス特異的挙動において拡散相互作用パラメータと強く相関していることを示す。ＣＳ－ＳＩＮＳスコア（０．０１ｍｇ／ｍＬ）は、ｋＤ測定値（１～１０ｍｇ／ｍＬ）と十分に相関している（図７Ａ、上）。ＣＳ－ＳＩＮＳスコアは、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２抗体のサブセットに関してさらに十分に相関したｋＤ測定値であり（図７Ａ、中央）、ＩｇＧ４抗体のサブセットに関しては相関が低い（図７Ａ、下）。サブクラスとの関連における溶液挙動は、ＣＳ－ＳＩＮＳ測定に関して提案された０．３５閾値が、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２サブクラスグループ化の不良な挙動の分子の全てを効果的に特定することを明らかにする（図７Ｂ）。ＩｇＧ４に関する溶液挙動は、大部分が高い乳白光の傾向があるがＣＳ－ＳＩＮＳアッセイでは常に反応するわけではないことから、予測することがより困難である（図７Ｃ）。 図７－１の続き。 図８Ａ～Ｃは、ヒスチジン製剤（ｐＨ６）中におけるｍＡｂ自己会合を測定するためのポリシン安定化金コンジュゲートの使用の評価のグラフである。金粒子を、最初に、ヤギ抗ヒトＦｃ ＩｇＧおよびポリリシン（≧７０ｋＤａ）（図８Ａ）、ヤギ非特異的ＩｇＧおよびポリリシン（図８Ｂ）、またはポリリシンのみ（図８Ｃ）でコーティングし、次いで、このコンジュゲートを、自己会合が様々なレベルのｍＡｂのパネルと共にインキュベートした。吸着したｍＡｂの量へのプラズモンシフトの依存性を評価するために、コンジュゲート（第１段階のコンジュゲート工程後）を、ヒトポリクローナル抗体のみ（０％ｍＡｂ）、ヒトｍＡｂのみ（１００％ｍＡｂ）、またはこれらの組み合わせで構成された一定濃度のヒト抗体（０．０１ｍｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。報告するプラズモンシフトは、ヒトポリクローナル抗体に関連する。図８Ａおよび８Ｂでは、ポリリシンとＩｇＧとの質量比は０．０３であり、コンジュゲート中に使用したポリリシンおよびＩｇＧの濃度は、それぞれ０．０１２および０．３８８ｍｇ／ｍＬであった。図８Ｃでは、コンジュゲーション中に使用したポリリシンの濃度は、０．４ｍｇ／ｍＬであった。 図８－１の続き。 ヒスチジン製剤（ｐＨ６）中におけるプラズモンシフトのＣＳ－ＳＩＮＳ測定値へのポリリシンサイズの影響を示すグラフである。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体と様々なサイズのポリリシンポリマーとを共吸着させることによりコンジュゲートを調製し、このコンジュゲートを使用して、ヒトｍＡｂのパネルのプラズモンシフトを測定した。図９Ａは、３０～７０ｋＤａのポリリシン（０．０３ポリリシン／ＩｇＧ質量比）および≧７０ｋＤのポリリシン（０．０３ポリリシン／ＩｇＧ質量比）を使用して測定したプラズモンシフト間の相関関係を示す。図９Ｂは、１５～３０ｋＤａのポリリシンポリマー（０．１０ポリリシン／ＩｇＧ質量比）および＃７０ｋＤａのポリリシンポリマー（０．０３ポリリシン／ＩｇＧ質量比）を使用して測定したプラズモンシフト間の相関関係を示す。

本開示は、超希薄溶液中で少量のタンパク質を使用して、タンパク質製剤の問題となる特性（例えば自己会合）を予測する方法を提供する。

自己会合が低レベルである抗体は、高濃度での製造、製剤化、および送達中に、好ましくない溶液挙動を示すリスクが低い。希薄溶液相互作用は、抗体の溶液挙動の予測に有効なアプローチを示すが、発見初期中に多数の抗体に関して適切なスクリーニング方法を採用することは困難である（図１）。従来の技術は、そのような測定を行なうために、比較的濃縮されたタンパク質溶液（＞１ｍｇ／ｍＬ）を必要とする。抗体濃度に関連するこのたった１つの課題により、抗体リード最適化（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｅａｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）中での抗体の自己会合の大規模で体系的な分析が妨げられている（図１）。高濃度溶液挙動（例えば、１５０ｍｇ／ｍＬでの粘度）の予測様式では、はるかに低濃度（１～１０μｇ／ｍＬ）で抗体相互作用をアッセイすることにより、発見初期において、はるかに多い候補のプールからの良好な挙動のｍＡｂの選択が可能となるだろう。

既に使用されているアプローチ（親和性捕捉ナノ粒子分光法、ＡＣ－ＳＩＮＳ）は、抗ヒト捕捉抗体を金ナノ粒子（２０ｎｍ）に吸着させること、およびこのコンジュゲートを使用して目的のヒトｍＡｂを捕捉することを含んだ。近接して複数のｍＡｂを捕捉することにより、コロイド相互作用が増幅され、金ナノ粒子に固有の光学特性の測定可能な変化を介して抗体の自己相互作用が高感度に検出された。しかしながら、ＡＣ－ＳＩＮＳの主な限界は、抗体開発中に一般に利用されるｐＨ４．５～７の範囲および低イオン強度でのプロセス流および製剤化条件に適合しないことであった。捕捉（抗ヒト）抗体でコーティングされた金ナノ粒子は、そのような条件下では不安定であり、容易に凝集する。

本明細書で説明されているのは、正荷電ポリマーを使用して抗体－金コンジュゲート安定化させることによりＡＣ－ＳＩＮＳの限界を克服する、電荷安定化自己相互作用ナノ粒子分光法（ＣＳ－ＳＩＮＳ）と称されるシステムおよび方法の開発である。さらに、ＣＳ－ＳＩＮＳは、４桁高い濃度（１５０ｍｇ／ｍｌ）では問題となる高濃度および乳白光の抗体を予測する超希薄濃度（１０μｇ／ｍＬ）でのｍＡｂの弱い自己相互作用を確実に評価し得た。

本セクションおよび本開示全体で使用されるセクションの見出しは、単に整理を目的とするものであり、限定することは意図されていない。

１．定義
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「し得る（ｃａｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、およびこれらの変形は、本明細書で使用される場合、付加的な行為または構造の可能性を排除しないオープンエンドの暫定的な語句、用語、または単語であることが意図されている。「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、別途文脈が明確に示さない限り、複数の言及を含む。本開示はまた、明記されているか否かにかかわらず、本明細書で提示された実施形態または要素「を含む」、「からなる」、および「から本質的になる」他の実施形態も企図する。

本明細書での数値範囲の列挙では、同程度の精度でその間に介在する各数字が明示的に企図されている。例えば、６～９の範囲では、６および９に加えて数字７および８が企図されており、６．０～７．０の範囲では、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に企図されている。

本明細書で別途定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。例えば、本明細書で説明されている細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される任意の命名法および技術は、当該技術分野で公知であり一般に使用されているものである。用語の意味および範囲は明確であるべきであるが、曖昧さが潜んでいる場合には、本明細書に記載されている定義は、いかなる辞書または外部の定義よりも優先される。さらに、別途文脈により必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。

「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、細菌およびウイルス等の外来物を同定して中和するために免疫系により内在的に使用されるタンパク質を指す。典型的には、抗体は、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むタンパク質である。ＣＤＲは、抗体の「超可変領域」を形成し、この超可変領域は、抗原結合に関与する（さらに下記で論じる）。全抗体は、典型的には、下記の４つのポリペプチドからなる：重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピー、および軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピー。それぞれの重鎖は、１つのＮ末端可変（Ｖ_Ｈ）領域と、３つのＣ末端定常（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３）領域とを含み、それぞれの軽鎖は、１つのＮ末端可変（Ｖ_Ｌ）領域と、１つのＣ末端定常（Ｃ_Ｌ）領域とを含む。抗体の軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）またはラムダ（λ）のいずれかの２つの異なるタイプの内の１つに割り当て得る。典型的な抗体では、それぞれの軽鎖は、ジスルフィド結合により重鎖に連結されており、２本の重鎖は、ジスルフィド結合により互いに連結されている。軽鎖可変領域は、重鎖の可変領域と整列されており、軽鎖定常領域は、重鎖の第１の定常領域と整列されている。重鎖の残余の定常領域は、互いに整列されている。軽鎖および重鎖のそれぞれの対の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は全体構造が同一であり、それぞれの領域は、４つのフレームワーク（ＦＷまたはＦＲ）領域を含む。「フレームワーク領域」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＤＲ間に位置する可変領域内の比較的保存されたアミノ酸配列を指す。それぞれの可変ドメイン中には、４つのフレームワーク領域が存在しており、それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と呼ばれている。フレームワーク領域は、可変領域の構造フレームワークを提供するβシートを形成する（例えば、Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ他（編）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（２００１）を参照されたい）。フレームワーク領域は、３つのＣＤＲで連結されている。上記で論じたように、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として既知である）は、抗原結合に関与する、抗体の「超可変領域」を形成する。ＣＤＲは、フレームワーク領域により形成されているベータ－シート構造を連結し、場合によってはその一部を構成するループを形成する。軽鎖および重鎖の定常領域は、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、定常領域は、可変領域の配向に影響を及ぼし得る。定常領域はまた、エフェクター分子および細胞との相互作用を介して、抗体依存性の補体媒介性溶解または抗体依存性の細胞毒性への関与等の様々なエフェクター機能も示す。

「抗体のフラグメント」、「抗体フラグメント」、および抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、本明細書では、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを指すために互換的に使用される（一般にＨｏｌｌｉｇｅｒ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３（９）：１１２６～１１２９頁（２００５）を参照されたい）。本明細書で説明されている抗体の抗原結合フラグメントはいずれも、本発明の範囲内である。抗体フラグメントは、望ましくは、例えば、１つもしくはそれ以上のＣＤＲ、可変領域（もしくはその一部）、定常領域（もしくはその一部）、またはこれらの組み合わせを含む。抗体フラグメントの例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）Ｖ_Ｌドメイン、Ｖ_Ｈドメイン、Ｃ_Ｌドメイン、およびＣ_Ｈ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）_２フラグメント、（ｉｉｉ）抗体の単一アームのＶ_ＬドメインおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｉｖ）穏やかな還元条件を使用してＦ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド架橋を切断することにより生じるＦａｂ’フラグメント、（ｖ）ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、ならびに（ｖｉ）抗原に特異的に結合する抗体単一可変領域ドメイン（Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌ）ポリペプチドであるドメイン抗体（ｄＡｂ）。

「分光光度計」は、様々な波長で光の吸収および／または透過を測定するあらゆる種類の装置である。分光光度計は、紫外放射線（１８５～４００ｎｍ）、可視放射線（４００～７００ｎｍ）、および赤外放射線（７００～１５０００ｎｍ）に最も一般的に適用されるが、一部の分光光度計は、Ｘ線、紫外、可視、赤外、および／またはマイクロ波の波長を含む電磁スペクトルの広い帯を調べ得る。分光光度計は、光源、分光器、波長選択機、試料ホルダー、および検出器を有する。溶液ベースの試料を処理可能な任意の分光光度計（例えば、キュベットサンプルホルダー、プレーターリーダー、および同類のものを備えたもの）を使用し得る。

「ポリペプチド」、「タンパク質」、または「ペプチド」は、ペプチド結合により連結された２つ以上のアミノ酸の連結配列である。ポリペプチドは、天然、合成、または天然および合成の改変もしくは組み合わせであり得る。ペプチドおよびポリペプチドには、結合タンパク質、受容体、および抗体等のタンパク質が含まれる。タンパク質は、糖、脂質、またはアミノ酸鎖に含まれない他の部分の付加により改変することができる。「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

正荷電ポリマーは、正味の正電荷を有する様々な化合物の内のいずれかであり得る。本発明で有用な正荷電ポリマーとして、正荷電ペプチドおよびタンパク質（両方とも、天然および合成）、ならびにポリアミン、炭水化物、または合成ポリカチオンポリマーが挙げられる。正荷電ポリマーは、直鎖ポリマーまたは分枝ポリマーであり得、かつ主鎖連結に加えて繰り返し単位間に相互連結を有し得る。正荷電ポリマー組成物は、実質的に単分散から実質的に多分散までの任意のレベルの多分散性を有し得る。実質的に単分散の組成物は、実質的に全てが同一の鎖長を有するポリマー分子を含む。実質的に多分散の組成物は、様々な鎖長（従って分子量）のポリマー分子を含む。

正荷電ポリマーの濃度は様々であり得るが、標的タンパク質の非存在下での捕捉剤コンジュゲートの自己凝集を防ぐ濃度を対象とする。捕捉剤コンジュゲートの凝集を、当該技術分野で既知の多くの方法（例えば、本明細書で示されている動的光散乱）により、様々な溶液条件（ｐＨ、コンジュゲート濃度、温度、イオン強度）下で測定し得る。

正荷電ポリマーの濃度は、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約０．１質量％より大きくてもよいし（即ち、０．１％の正荷電ポリマー、および９９．９％の捕捉剤）、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約１質量％より大きくてもよいし、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約３質量％より大きくてもよいし、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約５質量％より大きくてもよいし、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約１０質量％より大きくてもよいし、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約１５質量％より大きくてもよいし、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約２０質量％より大きくてもよいし、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約３０質量％より大きくてもよいし、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約４０質量％より大きくてもよい。いくつかの実施形態では、正荷電ポリマーは、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の３％質量％を超える濃度で添加される。

正荷電ポリマーの濃度は、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約０．１質量％～約５０質量％であり得る。正荷電ポリマーの濃度は、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約０．１質量％～約５０質量％、約１質量％～約５０質量％、約３質量％～約５０質量％、約５質量％～約５０質量％、約１０質量％～約５０質量％、約２０質量％～約５０質量％、約３０質量％～約５０質量％、約０．１質量％～約４０質量％、約１質量％～約４０質量％、約３質量％～約４０質量％、約５質量％～約５０質量％、約１０質量％～約５０質量％、約２０質量％～約５０質量％、約３０質量％～約５０質量％、約０．１質量％～約３０質量％、約１質量％～約３０質量％、約３質量％～約３０質量％、約５質量％～約３０質量％、約１０質量％～約３０質量％、約２０質量％～約３０質量％、約０．１質量％～約２０質量％、約１質量％～約２０質量％、約３質量％～約２０質量％、約５質量％～約２０質量％、約１０質量％～約２０質量％、約０．１質量％～約１５質量％、約１質量％～約１５質量％、約３質量％～約１５質量％、約５質量％～約１５質量％、約１０質量％～約１５質量％、約０．１質量％～約１０質量％、約１質量％～約１０質量％、約３質量％～約１０質量％、約５質量％～約１０％質量、約０．１質量％～約５質量％、約１質量％～約５％質量、約３質量％～約５質量％、約０．１質量％～約３質量％、約１質量％～約３質量％、または約０．１質量％～約１質量％であり得る。いくつかの実施形態では、正荷電ポリマーは、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の３質量％を超える濃度で添加される。いくつかの実施形態では、正荷電ポリマーは、正荷電ポリマーおよび捕捉剤の約３質量％～約１５質量％の濃度で添加される。

正荷電ポリマーは、広範囲の分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、正荷電ポリマーは、約１０ｋＤ超の、約１５ｋＤ超の、約２０ｋＤ超の、約２５ｋＤ超の、約３０ｋＤ超の、約４０ｋＤ超の、約５０ｋＤ超の、約６０ｋＤ超の、約７０ｋＤ超の、約８０ｋＤ超の、約９０ｋＤ超の、約１００ｋＤ超の、約１５０ｋＤ超の、約２００ｋＤ超の、またはより大きい分子量を有し得る。他の実施形態では、正荷電ポリマーは、１０～５００ｋＤａ、１０～２５０ｋＤａ、１０～２００ｋＤａ、１５～７０ｋＤａ、３０～７０ｋＤａ、または１５～３０ｋＤａの分子量を有し得る。しかしながら、捕捉剤コンジュゲートの自己凝集を防ぐ他のサイズも使用し得る。分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／または多角度レーザー光散乱技術等の方法により、当業者によって決定される。

本発明のある特定の実施形態では、正荷電ポリマーは、ポリアミノ酸としても既知である合成ポリペプチドのクラスに入る場合がある。合成ポリペプチドは、正荷電（即ち塩基性）アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）の内の１つのホモポリマーであってもよいし、２種以上の正荷電アミノ酸のヘテロポリマーであってもよい。いくつかの実施形態では、ポリカチオンは、ポリリシン（例えば、ポリ－Ｄ－リシン、ポリ－Ｌ－リシン、およびポリ－ＤＬ－リシン）、ポリアルギニン、ならびにポリヒスチジンであり得、特にポリリシンであり得る。加えて、ポリマーは、１つまたはそれ以上の正荷電非標準アミノ酸（例えば、オルニチン、５－ヒドロキシリシン、および同類のもの）を含み得る。または、ポリペプチドは、ポリ（γ－ベンジル－Ｌ－グルタミン酸）等の他の基で官能化することができる。いずれの組み合わせのアミノ酸も、直鎖、分枝、または架橋鎖に重合される。そのようなポリカチオンポリペプチドは、少なくとも５０個のアミノ酸残基、少なくとも１００個のアミノ酸残基、少なくとも２００個のアミノ酸残基、少なくとも３００個のアミノ酸残基、少なくとも５００個のアミノ酸残基、少なくとも７５０個のアミノ酸、少なくとも１０００個のアミノ酸、少なくとも２０００個のアミノ酸、少なくとも３０００個のアミノ酸、少なくとも４０００個のアミノ酸以上（例えば、約５０～約５００個のアミノ酸残基、約５０～約１０００個のアミノ酸残基、または約１００～約１０００個のアミノ酸残基）を含み得る。合成ポリペプチドを、当業者に既知の方法（例えば、化学合成法または組換え法）により製造し得る。選択的実施形態では、正荷電ポリマーは、約７０ｋＤａ以上のポリリシンである。選択的実施形態では、正荷電ポリマーは、体積に対して３～１５重量％の濃度で添加されたポリリシンである。

いくつかの実施形態では、正荷電ポリマーは、合成ポリカチオンポリマー（例えば、限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、および同類のもの）を含む。

ナノ粒子に関する「安定化」という用語は、特に、ナノ粒子の凝集の防止または少なくとも低減を指す。「凝集」は、懸濁液中での集合体の形成を指しており、コロイド系の機能的不安定化につながるメカニズムを表す。このプロセス中に、液相中に分散した粒子は互いにくっつき、不規則な粒子集合体、フロック、または凝集体を自然に形成する。この現象はまた、凝固または凝結とも称され、そのような懸濁液はまた、不安定とも呼ばれる。

本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、０．００１μｍ～１μｍのスケールのサイズ（例えば直径）を有する小さい粒子を指す。ナノ粒子は、球、棒、鎖、星、花、岩礁、ひげ、繊維、箱、および同類のものの形状であり得る。サイズは、ナノ粒子のある点から別の点までの最大距離（例えば、球の場合には直径）を指す。ナノ粒子は、任意の材料（例えば、金属、半導体材料、磁性材料、および材料の組み合わせ）を含み得る。本開示に関して具体的に想定されているのは、本明細書で言及される場合は常に、金属ナノ粒子である。金属ナノ粒子（例えば、金または銀ナノ粒子）は、表面プラズモン共鳴ベースのアッセイに本質的に適しており、なぜならば、金属球は、入射光からの電場と相互作用し得る、その表面上の自由電子を有しており、その結果、強い吸光度スペクトルが得られるからである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、金表面を有するかまたは金からなる金ナノ粒子を含む。ナノ粒子のサイズは、最大吸光度の強度および波長に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１ｎｍ～１０００ｎｍ（例えば１ｎｍ～２００ｎｍ）の直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、５ｎｍ～５０ｎｍのサイズ（例えば直径）であり、例えば約２０ｎｍである。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、２０ｎｍの金ナノ粒子を含むか、または２０ｎｍの金ナノ粒子である。アッセイ中のナノ粒子の全体量は、シグナル対ノイズ測定に影響を及ぼす場合がある。いくつかの実施形態では、２０ｎｍの金ナノ粒子は、少なくとも粒子７．０×１０^９個／ｍＬの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、２０ｎｍの金ナノ粒子は、粒子７．０×１０^９～１．５×１０^９個／ｍＬ（例えば、粒子１．０×１０^１０～１．５×１０^９個／ｍＬ）の濃度で使用される。

捕捉剤は、標的タンパク質に結合可能な（具体的には、第３の態様で定義される溶液中において「標的タンパク質を捕捉する」）あらゆる薬剤である。そのため、捕捉剤の性質は、標的タンパク質の種類に依存するだろう。例えば、捕捉剤は、天然または合成の標的タンパク質の結合パートナー（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、低分子、または標的タンパク質により特異的に認識される別の結合部分）を含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、抗体、または標的タンパク質に結合可能な、その誘導体もしくはフラグメントを含む。捕捉剤は、ナノ粒子に直接吸着されるか、あるいは、ナノ粒子は、捕捉剤をこのナノ粒子に繋ぎ止めるリンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、タンパク質またはタンパク質リガンドである。具体的な実施形態では、捕捉剤は、抗体、または抗体の抗原結合フラグメントを含むタンパク質である（またはそれを含む）。抗体は、特に、Ｆｃ特異的抗体（即ち、別の抗体のＦｃ部分に結合する抗体）であり得、例えば、ＩｇＧ－Ｆｃ特異的抗体、具体的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４特異的抗体、より具体的には、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４－Ｆｃ特異的抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、抗ヒト抗体である。標的タンパク質は、希薄溶液中において少量のタンパク質を使用して自己会合特性または自己凝集特性を決定したい任意のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、治療用タンパク質を含む。治療用タンパク質は、対象における疾患および障害の処置に有用な精製済タンパク質および合成タンパク質の両方を含む。治療用タンパク質として、抗体ベースの薬剤、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固薬、血液因子、骨形成タンパク質、改変タンパク質足場、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、および血栓溶解薬を挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む。選択的実施形態では、標的タンパク質は、抗体を含み、具体的にはモノクローナル抗体を含み、より具体的にはヒトモノクローナル抗体を含む。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体であり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体である。選択的実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。標的タンパク質は、任意の濃度であり得る。治療用タンパク質の場合には、濃度は、治療用製剤の濃度と比べてはるかに薄い可能性がある。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、１ｍｇ／ｍＬ未満（例えば、５００μｇ／ｍＬ未満、１００μｇ／ｍＬ未満、５０μｇ／ｍＬ未満、または１０μｇ／ｍＬ未満）の濃度である。標的タンパク質は、１～１０００μｇ／ｍＬ、１～１００μｇ／ｍＬ、１～５０μｇ／ｍＬ、１～２０μｇ／ｍＬ、または１～１０μｇ／ｍＬの濃度であり得る。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、１～１０μｇ／ｍＬの濃度であり得る。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ｐＨが３．５～７（例えば４．５～７）、具体的には４～６．５または４～６である溶液（例えば緩衝液）中に存在している。いくつかの実施形態では、溶液（緩衝液）は、低イオン強度を有する。

イオン強度は、溶液中のイオンの濃度の尺度である。「低イオン強度溶液」という用語は、全緩衝剤濃度が約５０ｍＭ未満である緩衝液のような溶液を指しており、高イオン強度緩衝液は、濃度が約１００ｍＭ超である緩衝液である。緩衝剤は、当該技術分野で公知であり、弱酸と弱塩基との塩であり得る。例は、炭酸塩、重炭酸塩、およびリン酸水素塩である。本開示の具体的な実施形態では、緩衝液は、ヒスチジンおよび／もしくは酢酸緩衝液であるか、またはヒスチジンおよび／もしくは酢酸緩衝液と実質的に同一のイオン強度を有する緩衝液である。ヒスチジンおよび／または酢酸緩衝液は、５０ｍＭ未満のヒスチジンおよび／または５０ｍＭ未満の酢酸の濃度を有して得、例えば、２５ｍＭ未満のヒスチジンおよび／または２５ｍＭ未満の酢酸の濃度を有しており、具体的には、約１０ｍＭのヒスチジンおよび／または１０ｍＭの酢酸の濃度を有している。「実質的に同一」は、±５０％、±４０％、±３０％、±２０％、±１０％、または±５％を意味する。

「コンジュゲーション」または「コンジュゲートすること」という用語は、化学的な、物理的な、または生物学的な手段によるナノ粒子への分子の結合を指す。分子へのナノ粒子のコンジュゲーションは、通常、表面上に分子を含むナノ粒子を指す場合に意味される。この用語の具体的な意味は、「吸着」または「吸着すること」であり、物理吸着（ファンデルワールス力）、化学吸着（共有結合）、および静電気引力を含む。選択的実施形態では、この用語の具体的な意味は、物理吸着である。

「自己会合」という用語は、同種のタンパク質（または抗体）間の相互作用、および多量体形成を指す。そのような多量体形成は、希釈等の操作により単量体に戻る場合がある。自己会合の「傾向」は、特に、タンパク質の濃度を、例えば、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌ（本明細書では、「高」または「より高い」濃度と称される）を超えて増加させることによる、自己会合のし易さを指す。自己会合を示すパラメータの例は、拡散相互作用パラメータである。拡散相互作用パラメータは、実験的方法により得られた拡散係数の濃度依存性を使用して算出される自己会合の指標である。この値が、－１２．４ｇ／ｍＬ以上である場合には、分子間の反発力が優性となる。この値がそれ未満である場合には、引力（自己会合）相互作用であると報告されている（Ｓａｉｔｏ他、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、２０１３．第３０巻 １２６３頁）。拡散係数は、溶液中での分子の拡散のし易さの指標であり、動的光散乱法または同様のものにより測定される。より一般的には、タンパク質の自己会合により、高粘度、乳白光、相分離、および／または凝集等の溶液挙動が不良となる場合がある。

「プラズモン波長」という用語は、最大吸光度の波長を指す。

好ましい方法および材料を下記で説明するが、本明細書で説明されているものと類似のまたは同等の方法および材料を、本開示の実施または試験で使用し得る。本明細書で言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照によって組み入れられる。本明細書で開示されている材料、方法、および例は、例示にすぎず、限定することは意図されていない。

２．安定化ナノ粒子の使用
第１の態様では、本開示は、表面上に捕捉剤を含むナノ粒子を安定化させるための正荷電ポリマーの使用に関する。

捕捉剤は、通常は、ナノ粒子にコンジュゲートしている。具体的な実施形態では、このナノ粒子は、溶液に含まれている。従って、この使用は、ナノ粒子（特にその複数）を溶液中で安定化させるため（即ち、ナノ粒子懸濁液を安定化させるため）であり得る。この溶液は、下記の第３の態様で定義されるものであり得る。

この使用は、通常、ナノ粒子に捕捉剤をコンジュゲートさせる前に、同時に、または後に（具体的な一実施形態では、同時に）、このナノ粒子に正荷電ポリマーをコンジュゲートさせることを含む。正荷電ポリマーの（正荷電ポリマーおよび捕捉剤の質量による）濃度は、上記で説明された通りであり得る。いくつかの実施形態では、この使用は、ヒトポリクローナル抗体（例えば、ヒトポリクローナル抗体ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）を捕捉している間に溶液中のナノ粒子のプラズモン波長を５３４ｎｍ以下に決定すること、および／またはＮＩＳＴモノクローナル抗体（参照物質ＲＭ８６７１）ｍＡｂを捕捉している間に溶液中のナノ粒子のプラズモン波長を５３３ｎｍ以下に決定することにより、ナノ粒子の安定化を決定することを含む。

３．ナノ粒子
第２の態様では、本開示は、表面上に捕捉剤と正荷電ポリマーとを含むナノ粒子に関する。

いくつかの実施形態では、このナノ粒子は、金属ナノ粒子であり、特に金ナノ粒子である。

いくつかの実施形態では、捕捉剤および／または正荷電ポリマーは、ナノ粒子にコンジュゲートしている。正荷電ポリマーの量（正荷電ポリマーおよび捕捉剤の質量による）は、上記で説明されている通りであり得る。具体的な実施形態では、ナノ粒子は、安定したナノ粒子であり、即ち、例えば、第１の態様の使用に従って安定化されている。具体的には、ヒトポリクローナル抗体（例えば、ヒトポリクローナル抗体ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）を捕捉する間での溶液中のナノ粒子のプラズモン波長は、５３４ｎｍ以下であり、および／またはＮＩＳＴモノクローナル抗体（参照物質ＲＭ８６７１）ｍＡｂを捕捉している間での溶液中のナノ粒子のプラズモン波長は、５３３ｎｍ以下である。

４．ナノ粒子を含む溶液
第３の態様では、本開示は、第２の態様の複数のナノ粒子を含む溶液に関する。従って、この溶液はまた、ナノ粒子懸濁液とも呼ばれる。

いくつかの実施形態では、この溶液は、緩衝液であり、特に低イオン強度の緩衝液である。この溶液／緩衝液のｐＨは、３．５～７（例えば４．５～７）であり得、具体的には４～６．５または４～６であり得る。複数は、少なくとも２、少なくとも１０、少なくとも１００、または少なくとも１０００を意味する。

本開示が第２の態様のナノ粒子の使用を指す場合は常に、代わりに第３の態様の溶液の使用を指すことも意図されていることを理解しなければならない。

５．ナノ粒子を含むキット
第４の態様では、本開示は、ナノ粒子（特に複数のナノ粒子）と、正荷電ポリマーとを含むキットに関する。

このキットは、緩衝液のような溶液をさらに含み得、特に、低イオン強度溶液／緩衝液を含み得る。この溶液／緩衝液のｐＨは、３．５～７（例えば４．５～７）であり得、具体的には、４～６．５または４～６であり得る。さらなる実施形態では、このキットはまた、（ｉ）捕捉剤（場合により、ナノ粒子にコンジュゲートしている）、および／または（ｉｉ）少なくとも２種（例えば、少なくとも３、４、５、もしくは６種）の較正タンパク質のパネルも含み得る。このキットは、加えて、較正タンパク質のパネルの較正タンパク質のプラズモン波長を提供する使用説明書を含み得る。このプラズモン波長は、較正タンパク質の既知のまたは「過去の」プラズモン波長である。

６．標的タンパク質の自己会合を決定する方法
第５の態様では、本開示は、標的タンパク質の自己会合傾向を決定する方法であって、
（ｉ）第３の態様で定義された溶液中で標的タンパク質を捕捉する工程、
（ｉｉ）この溶液の色を決定する工程
を含み、
標的タンパク質を含まない、第３の態様で定義されたコントロール溶液と比較した溶液の色の変化は、標的タンパク質の自己会合傾向を示す、
方法に関する。

コントロール溶液は、工程（ｉ）の前および標的タンパク質が添加される前の溶液であってもよいし、別個の溶液であってもよい（例えば、工程（ｉ）を除いて同一方法を経たもの）。

標的タンパク質の濃度は、標的タンパク質分析に関して上記で説明した通りであり得る。捕捉する工程は、（例えば、第６の態様に関して下記で説明するように）溶液を混合することおよび／またはインキュベートすることを含み得る。

色の変化は、通常、より高い吸収波長に向かって起こる。いくつかの実施形態では、色を決定することは、光吸収を決定することを含み、コントロール溶液と比較した光吸収の変化は、標的タンパク質の自己会合傾向を示す。具体的な実施形態では、工程（ｉｉ）は、プラズモン波長を決定することを含み、コントロール溶液と比較したプラズモン波長の変化は、標的タンパク質の自己会合傾向を示す。この決定は、プラズモン波長を決定するために、４５０ｎｍ～約７５０ｎｍの範囲の複数の波長で吸光度を測定することを含み得る。最大吸光度に対応する波長（プラズモン波長）は、ナノ粒間の分離距離が短くなるほど、大きな値にシフトする。そのため、標的タンパク質が自己会合すると、ナノ粒子の吸光度スペクトルが変化し、プラズモン波長が長くなる。例えば、ナノ粒子が金ナノ粒子である場合には、赤色への色の変化（例えば、プラズモン波長での赤色シフト）は、標的タンパク質の自己会合傾向を示す。通常、色、光吸収、またはプラズモン波長それぞれの変化の程度は、標的タンパク質の自己会合傾向の強さを示す。しかしながら、いくつかの実施形態では、この変化を、標的タンパク質の捕捉に起因してプラズモン波長が変化するかどうかに基づいて、自己会合ありおよび自己会合なしの２値表示として使用し得る。

この溶液は、通常、第３の態様で定義された溶液である。溶液中のナノ粒子（または溶液）は、選択的実施形態では、５３４ｎｍ以下のヒトポリクローナル抗体（例えば、ヒトポリクローナル抗体ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）を捕捉する間のプラズモン波長、および／または５３３ｎｍ以下のＮＩＳＴモノクローナル抗体（参照物質ＲＭ８６７１）ｍＡｂを捕捉する間のプラズモン波長を有する。この目的のために、この方法は、工程（ｉ）の前に、工程（ｉ）での捕捉のためにナノ粒子（または溶液）を選択する工程を含み得、ヒトポリクローナル抗体（例えば、ヒトポリクローナル抗体ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）を捕捉する間の溶液中のナノ粒子のプラズモン波長は、５３４ｎｍ以下であり、および／またはＮＩＳＴモノクローナル抗体（参照物質ＲＭ８６７１）ｍＡｂを捕捉する間の溶液中のナノ粒子のプラズモン波長は、５３４ｎｍ以下である。

いくつかの実施形態では、この方法は、自己会合する傾向が異なる少なくとも２種（好ましくは、少なくとも３、４、５、または６種）の較正タンパク質（例えば抗体、具体的にはモノクローナル抗体）のパネルを使用して較正する工程を含む。この傾向は、既知である。この較正することは、
（ｉ）このパネルの各較正タンパク質のプラズモン波長を測定する工程、
（ｉｉ）下記式：ＣＳ－ＳＩＮＳスコア＝（ｃＰ－パラメータ１）／（パラメータ２－パラメータ１）（式中、パラメータ１は、パネルの自己会合傾向が最も低い較正タンパク質のプラズモン波長であり、パラメータ２は、パネルの自己会合傾向が最も高い較正タンパク質のプラズモン波長である）に従って、各較正タンパク質（ｃＰ）の過去ＣＳ－ＳＩＮＳスコアを算出する工程、
（ｉｉｉ）下記式：ＣＳ－ＳＩＮＳスコア＝（ｃＰ－パラメータ１）／（パラメータ２－パラメータ１）（式中、パラメータ１は、パネルの自己会合傾向が最も低い較正タンパク質のプラズモン波長であり、パラメータ２は、パネルの自己会合傾向が最も高い較正タンパク質のプラズモン波長である）に従って、各較正タンパク質の新たなＣＳ－ＳＩＮＳスコアを算出すること、および下記の項：（（１－傾き）^２＋（切片）^２））を最小化させることにより、過去のパラメータと新たなパラメータとの間の線形フィットの一致を最大化するようにパラメータをフィットさせること、
（ｉｖ）新規データと過去データとの間の線形フィットに関して、較正が下記基準ａ）～ｃ）を満たすかどうかを決定すること
ａ）線形フィットの傾きが、０．９～１．１である、
ｂ）線形フィットの切片が、－０．１～０．１である、
ｃ）線形フィットのＲ^２が、０．９超である；
ならびに
（ｖ）工程（ｉｖ）の全ての基準が満たされる場合には、工程（ｉｉｉ）で特定されたフィットパラメータを使用して、標的タンパク質のＣＳ－ＳＩＮＳスコアを較正すること
を含み得る。工程（ｉｉ）を、工程（ｉ）の前、後、または同時に実行し得る。具体的な実施形態では、約０．３５以下の標的タンパク質ＣＳ－ＳＩＮＳスコアは、標的タンパク質は自己会合傾向が低い（即ち、高濃度の標的タンパク質（例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以上の標的タンパク質）を含む製剤および組成物に対して有利な自己会合特性を有する）ことを示す。

７．標的タンパク質をスクリーニングする方法
本開示は、自己会合特性（例えば、乳白光、および粘弾性特性）に関して、希薄濃度の標的タンパク質をスクリーニングする方法を提供する。一般に、第５の態様の方法の使用は、自己会合の傾向に関して標的タンパク質をスクリーニングするために提供される。より具体的には、第６の態様では、本開示は、捕捉剤と正荷電ポリマーとをナノ粒子（例えば金属ナノ粒子）上に吸着させて、捕捉剤コンジュゲートを形成すること；この捕捉剤コンジュゲートを、溶液（例えば緩衝液）中で標的タンパク質と共にインキュベートして、標的タンパク質コンジュゲートを形成すること；４５０ｎｍ～約７５０ｎｍの範囲の複数の波長で、この標的タンパク質コンジュゲートの吸光度を測定すること；およびこの標的タンパク質コンジュゲートによる吸光度が最大となる波長としてプラズモン波長を特定することを含み得る方法に関する。

正荷電ポリマーは、捕捉剤と共に表面（例えばナノ粒子）上に共吸着される。

この方法は、溶液（例えば緩衝液）中で捕捉抗体コンジュゲートと標的タンパク質とをインキュベートして、標的タンパク質コンジュゲートを形成することを含み得る。このインキュベーションは、標的タンパク質を捕捉剤に結合させて標的タンパク質コンジュゲートを形成するのに必要な任意の長さの時間であり得る。例えば、このインキュベーションは、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、またはより長い時間であり得る。

インキュベーションに使用される緩衝液は、任意の所望の特性（ｐＨ、イオン強度等）を有し得るが、通常は、標的タンパク質の最終的な下流での使用に望ましい緩衝液条件を模倣する。いくつかの実施形態では、緩衝液条件は、治療において生理学的に許容されるものである。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨ、ひいてはインキュベーションのｐＨは、４．５～７である。緩衝液のｐＨは、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、または約７であり得る。いくつかの実施形態では、緩衝液は、低イオン強度を有する。

この方法は、４５０ｎｍ～約７５０ｎｍの範囲の複数の波長で標的タンパク質コンジュゲートの吸光度を測定すること、および標的タンパク質コンジュゲートによる吸光度が最大となる波長としてプラズモン波長を特定することを含み得る。プラズモン波長（λ_ｐ）、即ち最大吸光度に対応する波長は、ナノ粒子間の分離距離が短くなるほど、大きな値にシフトする。そのため、標的タンパク質が自己会合すると、ナノ粒子の吸光度スペクトルが変化し、このことは、プラズモン波長の特定に反映される。いくつかの実施形態では、この変化を、捕捉剤コンジュゲートに対する標的タンパク質コンジュゲートの吸光度測定時にプラズモン波長が変化するかどうかに基づいて、自己会合ありおよび自己会合なしの２値表示として使用し得る。

抗体－金コンジュゲート間の粒子間距離の変化に対するプラズモン波長の感度を、標的タンパク質の自己会合の程度または度合いの尺度として使用し得る。いくつかの実施形態では、この方法は、電荷安定化自己相互作用ナノ粒子分光法（ＣＳ－ＳＩＮＳ）スコアを算出することをさらに含む。ＳＣ－ＳＩＮＳスコアは、図４（試験番号２）で説明されており、かつ方程式（１）：

（式中、パラメータ１は、低自己会合抗体のプラズモン波長であり、パラメータ２は、高自己会合抗体のプラズモン波長である）
で示されているように、高自己会合コントロールタンパク質コンジュゲートと、低自己会合コントロールタンパク質コンジュゲートとのプラズモン波長の差違に対する、低自己会合コントロールタンパク質コンジュゲートからのプラズモン波長の減算による、標的タンパク質コンジュゲートのプラズモン波長の比である。

いくつかの実施形態では、約０．３５以下のＣＳ－ＳＩＮＳスコアは、標的タンパク質が、高濃度の標的タンパク質（例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以上の標的タンパク質）を含む製剤および組成物に有利な自己会合特性を有することを示す。

いくつかの実施形態では、この方法は、捕捉剤コンジュゲートにより複数の較正タンパク質を捕捉して、複数の較正タンパク質コンジュゲートを形成すること、４５０ｎｍ～約７５０ｎｍの範囲の複数の波長で、複数の較正タンパク質コンジュゲートのそれぞれの吸光度を測定すること、およびプラズモン波長を特定することを含む較正方法をさらに含む。

較正方法は、複数の較正タンパク質コンジュゲートのそれぞれのＣＳ－ＳＩＮＳスコアを算出すること；および線形フィットのために、複数の較正タンパク質コンジュゲートのそれぞれのＣＳ－ＳＩＮＳスコアと、過去の較正タンパク質コンジュゲートのＳＣ－ＳＩＮＳスコアとを比較することをさらに含み得る。例えば、複数の較正タンパク質コンジュゲートのそれぞれのＣＳ－ＳＩＮＳを、下記の項：（（１－傾き）^２＋（切片）^２））を最小化させることにより、新規のデータと過去のＣＳ－ＳＩＮＳスコアとの間の線形フィットの一致を最大化するようにフィットさせる。この較正は、
・ 線形フィットの傾き＝０．９＜ｘ＜１．１；
・ 線形フィットの切片＝－０．１＜ｘ＜０．１；および
・ 線形フィットのＲ^２≧０．９
の場合には、新規のデータと過去のデータとの間の線形フィットの基準を満たしており、そのため適切な較正である。

複数の較正タンパク質は、様々な自己会合特性（例えば、乳白光、および粘弾性特性）を有するタンパク質を含む。較正タンパク質は、標的タンパク質と同種のタンパク質であり得る。例えば、標的タンパク質が抗体である場合には、較正タンパク質は、自己会合特性が異なる様々な抗体から選択される。いくつかの実施形態では、複数の較正タンパク質のそれぞれは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびこれらのフラグメントまたは誘導体からなる群からそれぞれ独立して選択される。

いくつかの実施形態では、較正タンパク質として、低自己会合コントロールタンパク質、および高自己会合コントロールタンパク質が挙げられ、本明細書の他の箇所で説明されているように、これらのコンジュゲートのプラズモン波長を使用してＣＳ－ＳＩＮＳを算出する。

いくつかの実施形態では、複数の較正タンパク質は、ＮＩＳＴ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＲＭ ８６７１、およびヒトポリクローナル抗体ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（全分子）を含む。いくつかの実施形態では、較正により、ＮＩＳＴ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＲＭ ８６７１、およびヒトポリクローナル抗体ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（全分子）のプラズモン波長が特定される。適切な較正は、５３３ｎｍ未満のＮＩＳＴ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＲＭ ８６７１のプラズモン波長、および５３４ｎｍ未満のヒトポリクローナル抗体ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（全分子）のプラズモン波長を含むことになる。

８．標的タンパク質をスクリーニングするためのシステムまたはキット
第７の態様では、本開示は、好ましい自己会合特性（例えば、乳白光、および粘弾性特性）に関して希薄濃度の標的タンパク質をスクリーニングするためのシステムまたはキット（例えば、試薬、コンピュータソフトウェア、機器等）に関する。いくつかの実施形態では、このシステムは、捕捉剤、正荷電ポリマー、表面（例えば金属ナノ粒子）、溶液（例えば緩衝液）、標的タンパク質、少なくとも１種の較正タンパク質、および分光光度計の内の１つもしくはそれ以上またはそれぞれを含む。本明細書の他の箇所で提供される捕捉剤、正荷電ポリマー、表面（例えば金属ナノ粒子）、溶液（例えば緩衝液）、および標的タンパク質に関して上記に記載されている説明は、本開示のシステムにも適用可能である。分光光度計は、様々な光の波長での光の吸収および／または透過を測定するあらゆる機器を含み得る。このシステムまたはキットの個々のメンバー構成要素は、物理的に、一緒に、または別々に梱包される。

このシステムはまた、このシステムの構成要素を使用するための説明書も含み得る。この説明書は、このシステムに関する関連資料または方法論である。この資料として、下記の任意の組み合わせが挙げられる：背景情報、構成要素のリストおよびその入手可能性情報（購入情報等）、システムの使用に関する簡潔なまたは詳細なプロトコール、トラブルシューティング、参考文献、テクニカルサポート、および任意の他の関連文書。説明書は、紙の形態、またはコンピュータ読み取り可能なメモリデバイスで供給されるかもしくはインターネットウェブサイトからダウンロードされる電子形態、または記録された発表のいずれかとして、システムと共に提供されるか、または別個のメンバー構成要素として提供される。

本開示のシステムおよびキットは、本開示の方法に関連して利用されることが理解される。

９．実施例
材料および方法
ＰＢＳ中でのＡＣ－ＳＩＮＳ用の免疫金コンジュゲート調製 ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１０９－００５－００８）を、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＩ－８９８８２）を使用して、２０ｍＭの酢酸（ｐＨ４．３）に２回緩衝液交換した。濃度を、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度と１．２６ｍＬ／ｍｇ×ｃｍの質量減衰係数とを使用して決定した。抗体を、２０ｍＭの酢酸（ｐＨ４．３）で０．４ｍｇ／ｍＬまで希釈した。２０ｎｍの金ナノ粒子（粒子７．０×１０^１１個／ｍＬ；Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．、１５７０５）１ミリリットルを、６分にわたる２１１３０ｒｃｆで、１．５ｍＬの微小遠心管（１６１５－５５００、ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で沈降させた。次に、上清９５０μＬを除去し、ｍｉｌｌｉＱ水９５０μＬに置き換えた。再懸濁させた粒子を、ｍｉｌｌｉＱ水５００μＬの添加でさらに希釈した（最終濃度粒子４．６７×１０^１１個／ｍＬ）。調製した捕捉抗体１００μＬに、金ナノ粒子９００μＬを添加した。この混合物を、一晩室温でインキュベートした。使用前に、免疫金コンジュゲートを、６分にわたり２１１３０ｒｃｆで沈降させた。上清９５０マイクロリットルを取り出して保存し、粒子を残余の上清に再懸濁させた。体積を、５０μＬに注意深く再調整した。

ＣＳ－ＳＩＮＳ用のポリリシン安定化免疫金コンジュゲートの調製 ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１０９－００５－００８）を、上記で説明したように緩衝液交換し、２０ｍＭの酢酸（ｐＨ４．３）で０．８ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。最初に５ｍｇ／ｍＬでｍｉｌｌｉＱ水に溶解させたポリリシン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＣＮ１９４５４４０５）を、２０ｍＭの酢酸（ｐＨ４．３）で、０．８ｍｇ／ｍＬ（０．０３ポリリシン／ＩｇＧ分率）、２．６７ｍｇ／ｍＬ（０．１０ポリリシン／ＩｇＧ分率）、または４．０ｍｇ／ｍＬ（０．１５ポリリシン／ＩｇＧ分率）のいずれかまで希釈した。コンジュゲート１００μＬの調製では、捕捉ＩｇＧ ４８．５μＬを、ポリリシン１．５μＬと混合して保存した。２０ｎｍの金ナノ粒子（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、１５７０５）１２００マイクロリットルを、６分にわたり２１１３０ｒｃｆで沈降させ、その後、上清１１５０μＬを除去した。ナノ粒子を、残余の上清に再懸濁させ、体積を、５０μＬに注意深く調整した。次いで、このナノ粒子を、ＩｇＧ／ポリリシン混合物に添加し、２０回上下にピペッティングすることにより急速に混合した。このコンジュゲートを、一晩室温でインキュベートした。説明した調製は、コンジュゲート１００μＬに関するが、必要に応じて、より大きい体積を調製するために調節可能である。非捕捉抗体を使用した実験では、ヤギ抗ヒトＩｇＧをヤギポリクローナルＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、００５－０００－００３）に交換した。

免疫金コンジュゲートの動的光散乱およびゼータ電位測定 動的光散乱（ＤＬＳ）実験を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳＰ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して実施した。所与の緩衝液中の免疫金コンジュゲートのサイズを評価するために、緩衝液９５０μＬを、コンジュゲート５０μＬに添加し、折り畳まれたキャピラリゼータセル（ＤＴＳ１０７０、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）に直ちに移した。キュベットをＺｅｔａｓｉｚｅｒ機器に移し、１７３°後方散乱測定値によるＤＬＳを使用して、２５℃でサイズを測定した。サイズ測定値は、少なくとも３０回の１０秒測定値の平均であった。試料が単分散（標準的なＡＣ－ＳＩＮＳ実行のために調製された免疫金コンジュゲート）であった場合には、キュムラント分析を使用して算出したｚ平均直径を報告した。試料が多分散（ポリリシン安定化免疫金コンジュゲート）であった場合には、非負最小二乗分析により決定されたサイズ分布の主要ピークを報告した。粒子径測定の直後に、同一機器でレーザードップラー速度計測を使用して、粒子のゼータ電位を測定した。データを収集し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ７．１１ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して分析した。

ヒスチジン中でのＣＳ－ＳＩＮＳアッセイ 目的の抗体を、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＩ８９８８２）を使用して、１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．０）に２回緩衝液交換した。濃度を、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度、および各モノクローナル抗体に関して独自に算出した質量減衰係数［ヒトポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、００９－０００－００３）の場合には、１．４０ｍＬ／ｍｇ×ｃｍを使用した］を使用して決定した。抗体を、ＣＳ－ＳＩＮＳでの使用前に、ヒスチジン（ｐＨ６．０）で１１．１μｇ／ｍＬまで希釈した。透明で底が平らな３８４ウェルポリスチレンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１２５６５５０６）に、アッセイした各ｍＡｂおよびヒトポリクローナル抗体に関して、免疫金コンジュゲート５μＬを３回添加した。次に、この免疫金コンジュゲートに、各抗体４５μＬを添加し、１０回上下にピペッティングすることにより混合した（最終抗体濃度１０μｇ／ｍＬ）。この混合物を覆い、４時間にわたり室温でインキュベートし、その後、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して、１ｎｍ刻み（通常の走査速度、１ウェル当たり８回の読み取り）で、４５０～６５０ｎｍでの吸光度を測定した。観察した最大吸光度付近の４０データ点に二次多項式を当てはめ、一次導関数を０に設定することにより、プラズモン波長を決定した。ＣＳ－ＳＩＮＳスコアを、下記で説明するように算出した。

ＣＳ－ＳＩＮＳアッセイの較正 ＣＳ－ＳＩＮＳ測定値を、下記の方法で較正して評価した。最初に、金抗Ｆｃコンジュゲートの各新規バッチを、２種のコントロール抗体（即ち、ヒトポリクローナル抗体（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、全分子、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅａｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ００９－０００－００３）、およびＮＩＳＴ ｍＡｂ ＲＭ ８６７１（ＮＩＳＴ ｍＡｂ））を使用して評価した（全体が参照によって本明細書に組み入れられるＫａｒａｇｅｏｒｇｏｓ，Ｉ．他、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２０１７、５０、２７～３４頁を参照されたい）。ヒト抗体を吸着させたこれらのコンジュゲートのプラズモン波長が５３４ｎｍ（ヒトポリクローナル抗体）または５３３ｎｍ（ＮＩＳＴ ｍＡｂ）を超えた場合には、実験を終了し、この試験（試験番号１）に合格するまで、このコンジュゲートを再度調製した。次に、試験番号１に合格した金抗Ｆｃコンジュゲートを、低いおよび高い自己会合挙動の両方に及ぶ６種のコントロールｍＡｂ（この試験では、ｍＡｂ Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＫ）のパネルを使用して評価し、これらのプラズモン波長（ＣＳ－ＳＩＮＳスコアの形）を、同一抗体の参照データと比較した。参照データに関して、ＣＳ－ＳＩＮＳスコアを、（所与のｍＡｂのプラズモン波長－最低自己会合ｍＡｂ（例えば、この試験ではｍＡｂ Ａ）のプラズモン波長）／（最高自己会合ｍＡｂ（例えば、この試験ではｍＡｂ Ｋ）のプラズモン波長－最低自己会合ｍＡｂ（例えば、この試験ではｍＡｂ Ａ）のプラズモン波長）として算出した。各新規実験でのｍＡｂのパネルの測定値（即ち、較正測定値）では、ＣＳ－ＳＩＮＳスコアを、（所与のｍＡｂのプラズモン波長－パラメータ１）／（パラメータ２－パラメータ１）として算出した。これら２つのパラメータを、（（１－傾き）^２＋（切片）^２）の合計が最小化するようにフィットさせ、これら傾きおよび切片の項は、較正と参照ＣＳ－ＳＩＮＳスコアとの線形回帰から得られる。この線形フィットの傾き、切片、またはＲ^２値の３つの値の内のいずれかが、理想値（傾きの場合は１、切片の場合は０、およびＲ^２の場合は１）の１０％以内でなかった場合には、実験を終了し、試験番号１に加えてこの試験（試験番号２）に合格するまで、コンジュゲートを再度調製した。測定値が両方の試験に合格した場合には、ＣＳ－ＳＩＮＳ測定を、抗体のフルパネルで実施し、ＣＳ－ＳＩＮＳスコアを、試験番号２でのパラメータフィット（即ち、パラメータ１および２）を使用して算出した。較正抗体は、下記を含む：Ａ、トシリズマブ；Ｃ、セツキシマブ；Ｄ、エボロクマブ；Ｅ、デノスマブ；Ｆ、ペムブロリズマブ；およびＫ、オマリズマブ。

粘度および乳白光の測定 実験ｍＡｂデータセットの粘度および乳白光の値を、Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ他（全体が参照によって本明細書に組み入れられるＳｃｉ Ａｄｖ ６、ｅａｂｂ０３７２、ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａｂｂ０３７２（２０２０））から得た。

電荷安定化により、抗体－金コンジュゲートの凝集が防止される
ＡＣ－ＳＩＮＳを使用する過去の試みで経験した問題の原因を理解するために（図２Ａ、左側）、金－抗体（抗ヒトＩｇＧ）コンジュゲートの凝集を、ｐＨ値の範囲（ｐＨ４．０～６．５；図２Ｂ、左側）にわたり希釈緩衝液（１０ｍＭの酢酸および／またはヒスチジン）中で測定した。５．０～６．５の範囲のｐＨ値では、ＰＢＳ中の安定なコンジュゲートの典型的な値（５３０～５３５ｎｍ）とは著しく異なる約５９０ｎｍと高いプラズモン波長を観察した（図２Ｅ）。動的光散乱により検出されたコンジュゲートの大きな見かけ上の直径から明らかなように、ｐＨ５．０～６．５の範囲で、実質的な粒子凝集を観察した。この結果と一致して、ＰＢＳ中の安定なコンジュゲートの典型的な値（５３０～５３５ｎｍ）とは著しく異なる約５９０ｎｍと高いプラズモン波長を観察した（図２Ｃ、左側）。抗体－金コンジュゲートのゼータ電位を測定することにより、粒子凝集のメカニズムを調べ（図２Ｄ、左側）、ｐＨ４．０での最大値＋１６ｍＶから着実な減少を観察し、ｐＨ５．７付近でゼロと交差し、ｐＨ６．５で最小値－５ｍＶであった。ｐＨ増加を伴うゼータ電位の傾向は、固定された捕捉抗体固有の荷電アミノ酸の滴定とも一致した。これらの発見から、ｐＨ５．６～６付近のコンジュゲートの低い正味の電荷は、ｐＨ５～７範囲での凝集に関連していることが示唆された。

コンジュゲーション調製中に、大きな正荷電ポリマー（ポリリシン、≧７０ｋＤａ）を、捕捉抗体と共吸着させた。たとえ少量のポリリシンの添加（例えば３％、図２Ａ、中央）であっても、４～６の広いｐＨ範囲にわたりコンジュゲートの凝集を妨げるのに十分であった（図２Ｂ、中央）。ポリリシンを１５％まで増加させると（図２Ａ、右側）、ｐＨ６．５までさらに安定化した（図２Ｂ、右側）。ポリリシンで安定化されたコンジュゲートのプラズモン波長は、コンジュゲートの見かけ上のサイズで観察された場合と同様のｐＨ依存的な傾向を示した（図２Ｃ、中央、および図２Ｃ、右側）。この同一ｐＨ範囲わたり、正の値（＋２～＋６ｍＶ）までのコンジュゲートのゼータ電位の同時の増加も観察した（図２Ｄ、中央、および図２Ｄ、右側）。低量のポリリシン（３％）により、ポリリシンの非存在下でのコンジュゲートの凝集と関連するであろうｐＨ６でのゼータ電位（＋２．３ｍＢ）が得られたという事実から、観察された安定化に対するさらなる立体要素が示唆された。

安定化されたコンジュゲートを使用して、ヒスチジン製剤中のＣＳ－ＳＩＮＳによりｍＡｂの自己相互作用を測定した（図８）。ヒスチジン製剤中のｍＡｂコロイド相互作用の光散乱分析に基づいて幅広い自己会合挙動を示す７種のｍＡｂを選択した。ＣＳ－ＳＩＮＳ分析により、小さいが検出可能なｍＡｂ依存性プラズモンシフトが明らかとなった（ＰＢＳ中の従来のＡＣ－ＳＩＮＳを使用した同一の抗体に関して観察された３０ｎｍ超と比較して１ｎｍ未満のプラズモンシフト）。捕捉抗体を、非特異的抗体に置き換え、７種のｍＡｂに関して７つのより小さいプラズモンシフトを観察した。ｍＡｂの添加前にポリリシンのみで調製されたコンジュゲートも、ｍＡｂに依存しない極めて小さいプラズモンシフトを示した。プラズモンシフトへのポリリシンサイズ（公称サイズ３０～７０ｋＤａおよび１５～３０ｋＤａ）の影響を検証し、様々なサイズのポリリシンで調製されたコンジュゲートに関して同様の傾向を観察した（図９）。これらの結果から、ＣＳ－ＳＩＮＳアッセイが、抗体媒介性の固定化を必要としておりかつポリリシンサイズに弱く依存するｍＡｂ特異的コロイド相互作用を検出することが示された。

頑強な較正法は、正確な実験プロトコールに従わない場合に起こり得る結果のばらつきを制御する。ＣＳ－ＳＩＮＳ測定値の較正および評価のための２種の試験を開発した（図４および５）。１）２種の較正抗体（ヒトポリクローナル抗体およびＮＩＳＴ ｍＡｂ）に関する抗Ｆｃ金コンジュゲートは、成功裏の実験に関して図５Ａに示すように、ヒロポリクローナル抗体に関する５３４ｎｍ未満およびＮＩＳＴ ｍＡＢに関する５３３ｎｍ未満のプラズモン波長が得られるはずである。２）６種の較正ｍＡｂのパネルを使用してアッセイを較正し、これらの測定値を、複数の独立したアッセイで得られた参照（過去）測定値と比較した。方法セクションおよび図４で説明したように、較正データと参照データとの間での線形フィットを最大化するように２つのパラメータをフィットさせて、プラズモン波長を較正されたＣＳ－ＳＩＮＳスコアに変換した。傾き、切片、およびＲ２の値が理想値の１０％以内であった場合には、このアッセイは試験番号２に合格しており、抗体の完全パネルを評価した。図５での成功裏の実験の場合には、アッセイは試験番号２に合格しており、抗体のより大きなパネル（較正抗体を含まない）の評価データは、参照データと比較して良好な性能を示した。較正プロトコールを、２５種の市販のｍＡｂのパネルに関して３％または１０％のポリリシンにより得られたＣＳ－ＳＩＮＳ測定値に適用した（図６Ａ）。プラズモン波長シフトとして分析した場合には、２つのポリリシン条件間で測定値に明らかな差違があった。しかしながら、較正プロトコールを適用した場合には、２つのデータセット間に優れた一致が見られた（図６Ｂ）。この較正プロセスの価値を説明すべく、欠陥のあるプロトコールによる実験をどのように容易に特定し得るかを説明するために、さらなる実験を実施した（図５Ｂ～５Ｃ）。

溶液挙動の予測としてのｍＡｂ自己相互作用
ｍＡｂ自己相互作用の測定、およびその結果としての抗体溶液挙動の予測での電荷安定化免疫金コンジュゲートの有用性を評価するために、４３種の市販の製品を含む５６種のｍＡｂの多様なセットを利用した。アミノ酸配列に関連する様々な特性（ｐＩ、電荷、電荷非対称、および疎水性）を、治療用抗体データベース（ＴＡＢＳ）を使用して、データセット内のｍＡｂに関して、より広範な臨床現場から集めた５００種の固有の抗体配列と比較した（図３Ａ～Ｄ）。静電的性質および疎水的性質の配列由来の測定基準の評価に重点が置かれており、これらは両方とも、ｍＡｂ自己相互作用の原動力であることが既に示されている。この分析に基づいて、ｍＡｂセットは、等電点、正味の電荷（ｐＨ６）、およびＦｖ電荷非対称パラメータ（Ｆｖ－ＣＳＰ、ｐＨ６）等のより広い臨床抗体の状況からのｍＡｂの重要な特性を正確に表していることが実証された。さらに、この抗体のパネルはまた、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＥＨＩ）に関して評価した場合の疎水性特性も、臨床段階の抗体の大きいパネルと類似していた。この発見により、ｍＡｂデータセットは、抗体溶液挙動を評価するためのＣＳ－ＳＩＮＳアッセイの一般的な適用性の評価に十分に適していることが示された。

臨床段階のｍＡｂの３０％超、およびおそらく初期の前臨床段階でのより高い割合は、高い溶液粘度および乳白光（これらは、より高い濃度（＞１００ｍｇ／ｍＬ）でのみ現れる）等の不良な溶液挙動を示すことが予想される。高いｍＡｂ溶液粘度は、自動注射器による皮下送達、および限外／透析ろ過精製ユニット操作中に特に問題となる。高い乳白光は、相の分離および凝集の素因を示し得る。近年、拡散相互作用パラメータ（ｋ_Ｄ）による弱いコロイド自己相互作用の測定は、分子記述子の大きなセットと比較して高い粘度または乳白光の傾向を示すｍＡｂの予測で最も有効であることが示された。しかしながら、そのような測定値の材料要件により、小数（約１０個）の候補のみの発見プロセス（図１）の後の候補選択段階でのみ実行可能となる。一方、弱いコロイドコロイド相互作用も測定するＣＳ－ＳＩＮＳアッセイは、数百～数千のバリアントのスクリーニングの候補最適化中の実行に適している（図１）。

ＣＳ－ＳＩＮＳを超希薄溶液（１０μｇ／ｍｌ）で実行して、４桁高い抗体濃度（＞１００ｍｇ／ｍｌ）で現れる問題の挙動を検出し得るかどうかを決定した。粘性（＞３０ｃＰ）の抗体は、低粘度の良好な挙動のｍＡｂと比べてＣＳ－ＳＩＮＳスコアが一貫して高く、極度の乳白光プロファイル（＞２０ＮＴＵ）を有するこのｍＡｂは、ＣＳ－ＳＩＮＳを使用して容易に同定された（図３Ｆ）。閾値０．３５により、ＣＳ－ＳＩＮＳは、＞８５％の精度で、良好な挙動のｍＡｂ（＜３０ｃＰ、＜１２ＮＴＵ）を同定した（図３Ｇ～３Ｈ）。このＣＳ－ＳＩＮＳスコア閾値を設定することにより、１０種全て（１００％）の粘性抗体、および７種の内の３種（４３％）の乳白光抗体の特定が容易となった。加えて、この閾値は、残り３９種の良好な挙動の抗体の内の４種（１０％）のみで誤って特徴付けされた。５６種のｍＡｂの内、３９種の内の３５種は、良好な挙動と正確に特定され、１７種の内の１３種は、不良な溶液特性を有すると特定され、ｋ_Ｄによる分類と同等であった。ＣＳ－ＳＩＮＳアッセイはまた、再現性に関しても頑強であり、詳細な較正およびシステム適合性基準により裏付けられた（図３、４、および５）。

抗体の同様のパネルを使用する過去の研究から、拡散相互作用パラメータ（ｋ_Ｄ）と不良な溶液特性との間の強い関係が明らかとなった。さらに、本明細書で特定されているように、不良な溶液特性（特に、乳白光に関するもの）の予測でのｋ_Ｄの有用性に関するＩｇＧサブクラス特異的挙動。ｋ_Ｄと本明細書で測定されたＣＳ－ＳＩＮＳスコアとの間の関係を調べた（図７）。サブクラスによるｍＡｂの分離を行なわないと、ｋ_ＤとＣＳ－ＳＩＮＳスコアとの間に適度に強い順位相関が観察された（スピアマンのρ －０．８０；図７Ａ、上）。しかしながら、ｍＡｂをＩｇＧ１／ＩｇＧ２対ＩｇＧ４サブクラスに分けると、サブクラス特異的挙動が現れた。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２グループ化の順位相関が顕著に増加し（スピアマンのρ －０．８９；図７Ａ、中央）、ＩｇＧ４サブクラスでは減少した（スピアマンのρ －０．７６；図７Ａ、下）。この分析を不良な溶液挙動の予測まで拡張することにより、０．３５のＣＳ－ＳＩＮＳ閾値を使用することによって、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２サブクラスグループ化における全ての不良な挙動の分子の検出が容易となることが観察された（図７Ｂ）。同一の基準をＩｇＧ４グループ化に適用することにより、低ＣＳ－ＳＩＮＳスコアを有する乳白光分子の全てがこのサブクラスに属していることが明らかとなり（図７Ｃ）、このことから、乳白光挙動につながるＩｇＧ４自己会合の様式がＩｇＧ１／２抗体と比べて独特であり得ることが示唆される。より一般的には、これらの結果から、自己会合の超希薄（１０μｇ／ｍＬ）溶液測定値を使用して、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ２ ｍＡｂに関して、高レベルの粘度および乳白光を有する抗体を特定するＣＳ－ＳＩＮＳの能力が総合的に実証された。このアッセイは、頑強であり、多数（約１００～１０００）のｍＡｂ候補の同時のハイスループットスクリーニングに容易に実行可能である。ＣＳ－ＳＩＮＳアッセイは、早期発見における薬物のような特性を有する開発可能な抗体の特定に向けた大きな進歩を表す。

前述の詳細な説明および添付の実施例は、単なる例示であり、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ定義される本開示の範囲に対する限定と見なされないことが理解される。

本開示の実施形態に対する様々な変更および改変は、当業者に明らかであり、その趣旨および範囲から逸脱することなく行なわれる。

Claims (15)

1. 正荷電ポリマーの使用であって、表面上に捕捉剤を含むナノ粒子を安定化させるための使用。
2. 前記ナノ粒子は、溶液中で安定化される、請求項１に記載の使用。
3. ナノ粒子であって、表面上に、捕捉剤と、正荷電ポリマーとを含むナノ粒子。
4. 前記ナノ粒子は、溶液に含まれている、請求項３に記載のナノ粒子。
5. 溶液であって、請求項３または４のいずれか１項に記載の複数のナノ粒子を含む溶液。
6. キットであって、ナノ粒子と、正荷電ポリマーとを含むキット。
7. 溶液および／または捕捉剤をさらに含む、請求項６に記載のキット。
8. 標的タンパク質の自己会合傾向を決定する方法であって、
   （ｉ）請求項５で定義された溶液中で標的タンパク質を捕捉する工程、
   （ｉｉ）溶液の色を決定する工程
   を含み、
   標的タンパク質を含まない、請求項５で定義されたコントロール溶液と比較した前記溶液の色の変化は、標的タンパク質の自己会合傾向を示す、方法。
9. 自己会合特性に関して希薄濃度で標的タンパク質をスクリーニングする方法であって、
   捕捉剤と正荷電ポリマーとをナノ粒子上に吸着させて、捕捉剤コンジュゲートを形成すること；
   捕捉剤コンジュゲートを、溶液中で標的タンパク質と共にインキュベートして、標的タンパク質コンジュゲートを形成すること；
   ４５０ｎｍ～約７５０ｎｍの範囲の複数の波長で、標的タンパク質コンジュゲートの吸光度を測定すること；および
   標的タンパク質コンジュゲートによる吸光度が最大となる波長としてプラズモン波長を特定すること
   を含む方法。
10. 自己会合特性に関して希薄濃度で標的タンパク質をスクリーニングするためのシステムであって、
    捕捉剤；
    正荷電ポリマー；
    ナノ粒子；
    溶液；
    標的タンパク質；
    少なくとも１種の較正タンパク質；および
    分光光度計
    の内の１つもしくはそれ以上またはそれぞれを含むシステム。
11. ナノ粒子は、金属ナノ粒子であり、好ましくは金ナノ粒子である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用、ナノ粒子、溶液、キット、方法、またはシステム。
12. 正荷電ポリマーは、ポリリシンである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の使用、ナノ粒子、キット、方法、またはシステム。
13. 捕捉剤は、抗体である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の使用、ナノ粒子、キット、方法、またはシステム。
14. 標的タンパク質は、抗体である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法またはシステム。
15. 溶液は、低イオン強度および／または３．５～７のｐＨを有する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の使用、ナノ粒子、溶液、キット、方法、またはシステム。

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