JP2024504136A - 「新規な二環式ペプチド」 - Google Patents

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Abstract

分子足場に共有結合しているポリペプチドであって、２つ以上のペプチドループが足場への付着点の間に内在するように共有結合しているポリペプチドが開示される。より詳細には、本発明は、ＰＤ－Ｌ１のペプチド模倣体を提供する。分子足場に共有結合しているポリペプチドの多量体結合複合体であって、２つ以上のペプチドループがＰＤ－Ｌ１の模倣体である足場への付着点の間に内在するように共有結合しているポリペプチドの多量体結合複合体も開示される。ＰＤＬ１核局在化によって媒介される疾患又は障害を処置する際に当該ペプチドを使用する方法も開示される。

Description

関連出願
本出願は、２０２１年１月１９日に出願された「Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題するオーストラリア仮出願第２０２１９００１１４号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、概して、分子足場に共有結合しているポリペプチドであって、２つ以上のペプチドループが足場への付着点の間に内在するように共有結合しているポリペプチドに関する。特に、本発明は、ＰＤ－Ｌ１のペプチド模倣体について述べている。本発明はまた、分子足場に共有結合しているポリペプチドの多量体結合複合体であって、２つ以上のペプチドループがＰＤ－Ｌ１の模倣体である足場への付着点の間に内在するように共有結合しているポリペプチドの多量体結合複合体に関する。本発明はまた、１つ以上のエフェクター及び／又は官能基にコンジュゲートされた前述のペプチド及び複合体を含む薬物コンジュゲート、前述のペプチドリガンド、複合体及び薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、並びにＰＤ－Ｌ１核局在化によって媒介される疾患又は障害の予防、抑制又は処置における前述のペプチドリガンド及び薬物コンジュゲートの使用を含む。
本明細書における任意の先行する刊行物（若しくはそれに由来する情報）、又は既知の任意の事項への言及は、その先行する刊行物（若しくはそれに由来する情報）又は既知の事項が、本明細書が関連する努力の分野における共通の一般知識の一部を形成することの承認又は容認又は任意の形態の示唆として解釈されず、またそのように解釈されるべきではない。
プログラム細胞死タンパク質－１（ＰＤ－１）は、Ｔ細胞活性化を調節し、免疫応答を低下させるその能力を通して、免疫系の調節において重要な役割を果たす。ＰＤ－１は、活性化Ｔ細胞（免疫抑制性ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞を含む）、Ｂ細胞、骨髄樹状細胞（ＭＤＣ）、単球、胸腺細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される（Ｇｉａｎｃｈｅｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．，１２：１０９１－１１００）。
ＰＤ－１シグナル伝達経路は、正常な個体における中枢寛容性及び末梢寛容性の維持に寄与し、それによって正常な宿主組織の破壊を回避する。胸腺において、ＰＤ－１とそのリガンドとの相互作用はポジティブセレクションを抑制し、それによってＣＤ４－ＣＤ８－二重陰性細胞のＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞への形質転換を阻害する（Ｋｅｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５：７３２９－７３７９）。付随的な免疫媒介性組織損傷を回避するためにネガティブセレクションを逃れる自己反応性及び炎症性エフェクターＴ細胞の阻害は、ＰＤ－１シグナル伝達経路に依存する（Ｋｅｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０３：８８３－８９５）。
ＰＤ－１は、２つのリガンド：プログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１；Ｂ７－Ｈ１；ＣＤ２７４）及びプログラム細胞死リガンド－２（ＰＤ－Ｌ２；Ｂ７－ＤＣ；ＣＤ２７３）によって結合されている。ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、上皮細胞及び内皮細胞を含む様々な細胞型で発現される（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１８（２４）：６５８０－６５８７；Ｈｅｒｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，２１：１－８）。ＰＤ－Ｌ１発現はまた、多くのタイプの腫瘍細胞及び局所腫瘍環境における他の細胞において上方制御される（Ｈｅｒｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，上記参照）。ＰＤ－Ｌ２は、単球、マクロファージ及び樹状細胞などの抗原提示細胞上で主に発現されるが、微小環境刺激に応じて、多種多様な他の免疫細胞及び非免疫細胞上でも発現が誘導され得る（Ｈｅｒｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，上記参照Ｋｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８１：６７３８－６７４６；Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：２４０５－２４１０；Ｍｅｓｓａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４８：２２１４－２２１９；Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４９：１－３）。
ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、悪性細胞及び局所腫瘍環境における他の細胞によって過剰発現される。ＰＤ－１は、多くの異なる腫瘍型からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の大部分で高度に発現され、局所エフェクター免疫応答を抑制する。ＰＤ－１のＴＩＬ発現は、エフェクター機能障害（サイトカイン産生及び腫瘍細胞に対する細胞毒性効力）並びに／又は多数の腫瘍型における転帰不良と関連している（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１３（６）：１７５７－１７６１；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２８：８８７－８９６）。ＰＤ－Ｌ１発現は、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌、乳房癌、尿路上皮癌、胃及び膵臓癌を含む多くの腫瘍型において転帰不良と強く相関することが見出されている（Ｋｅｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：６７７－７０４；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２８：８８７－８９６）。ＰＤ－Ｌ２は、腫瘍のサブセットにおいて上方制御されることが示されており、転帰不良にも関連付けられている。
興味深いことに、核ＰＤ－Ｌ１発現は、前立腺癌、結腸直腸癌及び乳癌を含むいくつかの腫瘍型における短い生存期間及び化学療法抵抗性に関連することが示されている（Ｓａｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，６：２８９１０；Ｇｈｅｂｅｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２：Ｒ４８）。
したがって、ＰＤ－１シグナル伝達経路のメンバーは、癌の処置のための重要な治療標的であり、この経路、特にＰＤ－１シグナル伝達経路のメンバーの核局在化を標的とする新しい治療剤が望まれる。
環状ペプチドは、高い親和性及び特異性でタンパク質標的に結合することができ、したがって、治療薬の開発にとって魅力的な分子クラスである。実際、いくつかの環状ペプチドは、臨床において既にうまく使用されており、例えば、抗菌ペプチドバンコマイシン、免疫抑制薬シクロスポリン又は抗癌薬オクトレオチド（Ｄｒｉｇｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２００８），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ７（７），６０８－２４）が挙げられる。良好な結合特性は、ペプチドと標的との間に形成される比較的大きな相互作用表面、並びに環状構造の立体構造柔軟性の低下から生じる。典型的には、大環状分子は、数百平方オングストロームの表面に結合し、例えば、環状ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０，１０６６－７１）、インテグリンα－Ｖβ３に結合するＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐモチーフを有する環状ペプチド（３５５Å２）（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６（５５６５），１５１－５）又はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ウパイン－１（６０３Å２；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １６０（１），１－１０）が挙げられる。
それらの環状配置に起因して、ペプチド大環状分子は、直鎖状ペプチドよりも柔軟性が低く、標的に結合する際のエントロピーの損失がより小さくなり、より高い結合親和性がもたらされる。柔軟性の低下はまた、標的特異的立体構造の固定をもたらし、直鎖状ペプチドと比較して結合特異性を増加させる。この効果は、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ－８）の強力かつ選択的な阻害剤によって例示されており、この阻害剤は、その環が開いたときに他のＭＭＰに対する選択性を失った（Ｃｈｅｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８），Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４１（１１），１７４９－５１）。大環状化を通して達成される好ましい結合特性は、１つより多くのペプチド環を有する多環式ペプチドにおいてより一層顕著であり、例えば、バンコマイシン、ナイシン及びアクチノマイシンが挙げられる。
様々な研究チームが、以前に、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に繋ぎ止めた（Ｋｅｍｐ ａｎｄ ＭｃＮａｍａｒａ（１９８５），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。Ｍｅｌｏｅｎ及び共同研究者らは、タンパク質表面の構造模倣のための合成足場上への複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のために、トリス（ブロモメチル）ベンゼン及び関連分子を使用した（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，上記参照）．候補薬物化合物の生成のための方法であって、前述の化合物が、システイン含有ポリペプチドを、例えば１，１’，１’’－（１，３，５－トリアジナン－１，３，５－トリイル）トリプロパ－２－エン－１－オン（ＴＡＴＡ）（Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ５３（６）１６０２－１６０６）のような分子足場に結合させることによって生成される、方法。
関心対象の標的に対する二環式ペプチドの大きなライブラリーを生成及びスクリーニングするために、ファージディスプレイベースのコンビナトリアルアプローチが開発されている（Ｈｅｉｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ５（７），５０２－７及び国際公開第０９／０９８４５０号）。簡潔には、３つのシステイン残基及び６つのランダムアミノ酸の２つの領域（Ｃｙｓ－（Ｘａａ）６－Ｃｙｓ－（Ｘａａ）６－Ｃｙｓ）を含有する直鎖状ペプチドのコンビナトリアルライブラリーをファージ上に提示し、システイン側鎖を小分子足場に共有結合させることによって環化した。
本発明は、式Ｉによるアミノ酸配列を含む二環式ＰＤ－Ｌ１ペプチド模倣体が、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減するのに特に有効であるという発見に部分的に基づいている。したがって、本発明者らは、式Ｉによるアミノ酸配列を含むＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を使用して、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害することができると考えた。ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＰＤ－Ｌ１とインポーチンα（ＩＭＰα）との複合体を防止又は阻害することによって核局在化を阻害することが理解される。
一態様では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体であって、少なくとも２つのループ配列によって分離された少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチドと、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子足場であって、少なくとも２つのポリペプチドループが分子足場上に形成されるように共有結合を形成する分子足場とを含む、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又はその修飾誘導体、又はその薬学的に許容され得る塩を提供し、該ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、
Ｘ１Ｃ１ＬＸ２Ｘ３ＩＦＣ２Ｘ４ＬＲＫＧＸ５Ｃ３Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＫＸ１０ （式Ｉ）
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３は、それぞれ第１、第２、及び第３のシステイン残基を表し、
Ｘ１は、不存在又はアラニンであり、
Ｘ２は、任意の小アミノ酸（任意選択で、トレオニン、グリシン、セリン、又はアラニン）から選択され、
Ｘ３は、任意のアミノ酸から選択され、
Ｘ４は、任意のアミノ酸から選択され、
Ｘ５は、任意のアミノ酸から選択され、
Ｘ６は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、ロイシン、プロリン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
Ｘ７は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、プロリン、ロイシン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
Ｘ８は、任意のアミノ酸から選択され、
Ｘ９は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、ロイシン、プロリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びノルロイシン）から選択され、及び
Ｘ１０は、任意のアミノ酸から選択される。
典型的には、Ｘ２は、トレオニン及びアラニンから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、Ｘ２はトレオニンである。
典型的には、Ｘ３は、フェニルアラニン及びアラニンから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、Ｘ３はフェニルアラニンである。
典型的には、Ｘ４は、アルギニン及びアラニンから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、Ｘ４はアルギニンである。
典型的には、Ｘ５は、アルギニン及びアラニンから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、Ｘ５はアルギニンである。
典型的には、Ｘ６は、メチオニン、アラニン、ロイシン及びプロリンから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、Ｘ６はメチオニンである。
典型的には、Ｘ７は、メチオニン、アラニン、及びプロリンから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、Ｘ７はメチオニンである。いくつかの代替実施形態において、Ｘ７はアラニンである。
典型的には、Ｘ８は、アスパラギン酸、アラニン、グリシン及びバリンから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、Ｘ８はアスパラギン酸である。
典型的には、Ｘ９は、バリン、アラニン、グリシン、メチオニンから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、Ｘ９はバリンである。
典型的には、Ｘ１０は、リシン、アラニン、アスパラギン、及びメチオニンから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、Ｘ１０はリシンである。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のアミノ酸配列は、ＡＣＬＴＦＩＦＣＲＬＲＫＧＲＣＭＭＤＶＫＫ［配列番号１］を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＩＭＰαに結合し、ＩＭＰαとＰＤ－Ｌ１との複合体化を防止する。典型的には、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＩＭＰαによる他の細胞タンパク質（例えば、ＰＤ－Ｌ２）の核輸送を阻害又は防止しない。したがって、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＰＤ－Ｌ１の核輸送を特異的に防止するが、他のタンパク質の核輸送を阻害しない。
好適には、分子足場は、（ヘテロ）芳香族又は（ヘテロ）脂環式部分を含む。好適には、足場は、トリス置換（ヘテロ）芳香族又は（ヘテロ）脂環式部分、例えば、トリスメチレン置換（ヘテロ）芳香族又は（ヘテロ）脂環式部分を含む。（ヘテロ）芳香族又は（ヘテロ）脂環式部分は、好適には６員環構造であり、好ましくは、足場が３回対称軸を有するようにトリス置換されている。いくつかの好ましい実施形態において、分子足場は、１，３，５－（トリブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）である。他の好ましい実施形態において、分子足場は、１，３，５－トリス－（ブロモアセトアミド）ベンゼン（ＴＢＡＢ）である。
好ましい実施形態において、二環式ペプチドは、Ｎ末端細胞透過性ペプチドを更に含む。好ましくは、細胞透過性ペプチドはＭｙｒである。
いくつかの実施形態において、修飾誘導体は、Ｎ末端及び／又はＣ末端修飾；１つ以上のアミノ酸残基の１つ以上の非天然アミノ酸残基による置換（例えば１つ以上の極性アミノ酸の１つ以上の等配電子又は等電子アミノ酸による置換；１つ以上の疎水性アミノ酸残基の他の非天然の等配電子又は等電子アミノ酸による置換）；スペーサー基の付加；１つ以上の耐酸化性アミノ酸残基の置換；１つ以上のアミノ酸残基のアラニンによる置換、１つ以上のＬアミノ酸残基の１つ以上のＤ－アミノ酸残基による置換；二環式ペプチドリガンド内の１つ以上のアミド結合のＮ－アルキル化；１つ以上のペプチド結合の代替結合による置換；ペプチド骨格長の修飾；１つ以上のアミノ酸残基のα－炭素上の水素の別の化学基による置換、並びにシステイン、リシン、グルタミン酸塩及びチロシンなどのアミノ酸の、適切なアミン、チオール、カルボン酸及びフェノール反応性試薬による合成後双直交修飾から選択される１つ以上の修飾を含む。
いくつかの実施形態において、修飾誘導体は、Ｎ末端アセチル基などのＮ末端修飾を含む。
いくつかの実施形態において、修飾誘導体は、Ｃ末端アミド基などのＣ末端修飾を含む。
いくつかの実施形態において、修飾誘導体は、１つ以上のアミノ酸残基の１つ以上の非天然アミノ酸残基による置換を含む。
いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る塩は、塩酸塩又は酢酸塩から選択される。
いくつかの実施形態において、組成物は、ナノ粒子中にカプセル化されるか又はナノ粒子と複合体化される。典型的には、ナノ粒子は脂質ナノ粒子（例えば、リポソーム又はリポプレックス）である。
好適には、脂質ナノ粒子は、約５０ｎｍ～５００ｎｍの直径を有する。典型的には、ナノ粒子は、直径が約２５０ｎｍ未満（例えば、約１００ｎｍ～２５０ｎｍ）のサイズである。
典型的には、ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び／又は非カチオン性脂質を含む。このタイプのいくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質である。
いくつかの実施形態において、イオン化可能なカチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ）、及びＣ１２－２００からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）脂質を含む。
上記及び本明細書の他の箇所に記載されるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を、１つ以上の賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞におけるＰＤ－Ｌ１の核局在化を低減する方法であって、細胞を、上記及び本明細書の他の箇所に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体と接触させることを含む、方法。
別の態様では、本発明は、対象における癌を処置又は予防する方法であって、癌が少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞を含み、上記及び本明細書の他の箇所に記載されるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を対象に投与することを含む、方法を提供する。
好ましくは、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞は、癌幹細胞、非癌幹細胞腫瘍細胞である。
いくつかの好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞は、癌幹細胞腫瘍細胞である。
いくつかの実施形態において、癌は、乳癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、又は脳癌、又は黒色腫、又は網膜芽細胞腫から選択される。
いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも１つの更なる癌療法を施すことを更に含む。いくつかの実施形態において、更なる癌療法は化学療法剤である。
ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の構造及び配列を表す図である。（Ａ）配列は、２つの候補ペプチドに到達するために行われる配列最適化ステップを示す。（Ｂ）二環式ペプチド候補「ＤＬ－２」のリボン表示。
免疫療法抵抗性及び応答性癌において観察されたＰＤ－Ｌ１ ＰＴＭを示すグラフ及び写真表示である。（Ａ）免疫療法抵抗性及び応答性黒色腫並びにＴＮＢＣにおけるＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ発現の代表的な高解像度免疫蛍光画像。（Ｂ）免疫療法抵抗性及び応答性黒色腫並びにＴＮＢＣについてのＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１又はＰＴＭ２陽性ＣＴＣ集団のパーセンテージ、並びにＰＴＭ１核蛍光強度（ＮＦＩ）又はＰＴＭ２細胞質蛍光強度（ＣＦＩ）。（Ｃ）ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１発現は、免疫療法で処置されたステージＩＶ黒色腫患者における生存と関連する。破線：ＰＤＬ１－ＰＴＭ１陰性；実線：ＰＤＬ１－ＰＴＭ１陽性。
ＰＤ－Ｌ１のアセチル化形態が核ベースのバリアントであることを示す写真表示である。（Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＭＣＦ７乳癌細胞株からの核又は細胞質抽出物の免疫ブロットの例とポンソーレッドローディングコントロール。イムノブロットを、ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１に対する本発明者らのカスタム抗体でプローブした。（Ｂ）ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１（Ａｃ）の核局在化又はＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ２（Ｍｅ３）の細胞質／全細胞染色を実証するハイスループット画像スクリーンの例を示す。右下隅のスケールバーは１０μｍを示す。
癌細胞株におけるＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１の核局在化を確認する写真表示である。ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１（Ａｃ）の核局在化及びサイトケラチンの細胞質局在化を実証する例示的な超解像度画像スクリーン。右下隅のスケールバーは１０μｍを示す。
二重エピジェネティック免疫療法がＴ細胞レパートリーを再教育及び再プログラムすることを示すグラフ表示である。（Ａ）ＣＳＶ、ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１（ＰＤＬ１－Ａｃ）、ＰＤＬ１－ＰＴＭ２（ＰＤＬ１－Ｍｅ３）、又は市販のＰＤ－Ｌ１抗体（ＰＤＬ１－２８－８）に対する抗体で染色された転移性ＴＮＢＣ患者由来の転移性脳病変の画像例。（Ｂ）棒グラフは、ＰＤ－Ｌ１－２８－８、ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１又はＰＴＭ２の蛍光強度を、ＣＳＶ陽性集団のパーセンテージ及びＳＥＭによるこれらのマーカーのいずれかと共に示し、ハイスループット画像スクリーニングデータを示す（１群当たりｎ≧１０００細胞）。
腫瘍内の浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＰＤ－Ｌ１のレベルのグラフ及び写真表示である。ＣＤ８及びＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１（ＰＤ－Ｌ１－Ａｃ）に対する抗体で染色された転移性ＴＮＢＣ患者由来の転移性脳病変の例示的な画像。棒グラフは、ＣＤ８及びＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１（ＰＤ－Ｌ１－Ａｃ）陽性である集団のパーセンテージを示し、ハイスループット画像スクリーニングデータを示す（１群当たりｎ≧１０００細胞）。
癌細胞増殖に対するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の効果を示すグラフ表示である。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｂｒ（ＭＤＡ－ＢＲＭ）又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＴＮＢＣ細胞株の増殖アッセイ及びＤＬ－１又はＤＬ－２による阻害の影響。各アッセイについてＩＣ５０値を示す。
ＰＤ－Ｌ２二環式ペプチド模倣体が有意により高い細胞質ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ２を誘導することを示すグラフ表示である。棒グラフは、ＳＥＭによるＰＤ－Ｌ１－Ａｃ（ＰＴＭ１）の核蛍光強度又はＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３（ＰＴＭ２）の細胞質蛍光強度の蛍光強度を示し、ハイスループット画像スクリーニングデータを示す（１群当たりｎ≧５００細胞）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｂｒをビヒクル対照又は二環式阻害剤ＤＬ－１若しくはＤＬ－２のいずれかで処理し、核内のＰＤ－Ｌ１－Ａｃ（ＰＴＭ１）又は細胞質内のＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３（ＰＴＭ２）の発現を高分解能デジタル病理検査でスコア化した。有意差をビヒクル対照とのペアワイズ比較として計算する。
ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体による処理後の転移負荷の間葉系調節因子を示すグラフ表示である。棒グラフは、ＳＥＭによるＣＳＶ、ＡＢＣＢ５、ＥＧＦＲ若しくはＦＯＸＱ１の細胞質蛍光強度又は核蛍光強度を示し、ハイスループット画像スクリーニングデータを示す（１群当たりｎ≧５００細胞）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｂｒをビヒクル対照又は二環式阻害剤ＤＬ－１若しくはＤＬ－２のいずれかで処理し、発現の変化を高分解能デジタル病理検査で特徴付けた。有意差をビヒクル対照とのペアワイズ比較として計算する。
ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体による処理が上皮マーカーの発現を誘導することを示すグラフ表示を提供する。棒グラフは、ＳＥＭによるＥ－カドヘリンの細胞質蛍光強度を示し、ハイスループット画像スクリーニングデータ（１群当たりｎ≧５００細胞）を示す。（Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又は（Ｂ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｂｒをビヒクル対照又は二環式ペプチド阻害剤ＤＬ－１若しくはＤＬ－２のいずれかで処理し、発現の変化を高分解能デジタル病理検査で特徴付けた。有意差をビヒクル対照とのペアワイズ比較として計算する。
ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が細胞表面ＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３の上方制御を誘導することを示す写真及びグラフ表示である。（Ａ）ビヒクル対照、ＨＤＡＣ２ｉ又は二環式ペプチド阻害剤ＤＬ－２で処理された非透過処理ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のハイスループット画像スクリーン。細胞をＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ２（Ｍｅ３）で染色した。画像の右下隅のスケールバーは１０μｍを示す。（Ｂ）グラフは、ＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３についての平均ＦＩをプロットしている（１群当たりｎ≧１００細胞）。有意差は、クラスカル・ウォリスのノンパラメトリック検定によって計算して示される。
透過処理細胞における核及び細胞質ＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３の発現レベルを示す写真及びグラフ表示を提供する。（Ａ）ビヒクル対照、ＨＤＡＣ２ｉ又は二環式ペプチド阻害剤ＤＬ－２で処理された透過処置ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の例示的なハイスループット画像スクリーン。細胞をＰＤＬ１－ＰＴＭ２（Ｍｅ３）で染色した。画像の右下隅のスケールバーは１０μｍを示す。（Ｂ）グラフは、ＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３についての平均ＮＦＩ（核ＦＩ）又はＣＦＩ（細胞質ＦＩ）をプロットしている（１群当たりｎ≧１００細胞）。有意差は、クラスカル・ウォリスのノンパラメトリック検定によって計算して示される。
本発明の例示的なＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の合成を概説するフローチャートを提供する。
二環式ペプチド阻害剤ＤＬ－２がＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との共局在化を阻害するが、ＩＭＰα１又はＰＤＬ２とＩＭＰα１との共局在化は阻害しないことを示す写真表示を提供する。（Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ＤＬ－２で４～９６時間又は対照ペプチドスクランブルで処理し、透過処理し、マウス抗ＩＭＰａ１、ウサギ抗ＰＤＬ１でプローブし、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートされたロバ抗ウサギ二次抗体又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８にコンジュゲートされたロバ抗マウス二次抗体で可視化した。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ ｎｕｃｂｌｕｅ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。ＰＤＬ１及びＩＭＰａ１デジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析して、平均蛍光強度（平均ＦＩ）を決定した。グラフは、ＩＭＰａ１の平均ＦＩを表す。グラフはまた、自動閾値化及び細胞核に特異的な関心領域（ＲＯＩ）の手動選択を伴うＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してＰＤＬ１／ＩＭＰａ１のＰＣＣを示し、抗体の各対についてピアソン相関係数（ＰＣＣ）を計算した。ＰＣＣ値の範囲は、－１＝共局在化の逆数である。（Ｂ）ＰＤＬ１－Ａｃ及びＩＭＰα１で染色されたＤＵＯＬＩＮＫ細胞の高解像度イメージング。
二環式ペプチドＤＬ－２がＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との複合体を阻害することを示す写真表示を提供する。ＰＤＬ１－Ａｃ ＆ ＩＭＰα１で染色されたＤＵＯＬＩＮＫ細胞のＡＳＩデジタル病理システムによる１００倍対物レンズを使用した高解像度イメージング。
二環式ペプチドＤＬ－２がＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との複合体を阻害するが、直鎖状ＰＤＬ１－Ｌ１ペプチドは阻害しないことを示す写真表示を提供する。ＰＤＬ１－Ａｃ及びＩＭＰα１で染色されたＤＵＯＬＩＮＫ細胞のＡＳＩデジタル病理システムによる１００倍対物レンズを使用した高解像度イメージング。
ＤＬ－２がＰＤＬ１（非修飾）とＩＭＰα１との複合体を阻害するが、直鎖状ＰＤＬ１－Ｌ１ペプチド阻害剤を阻害しないことを示す写真表示を提供する。ＰＤＬ１（非修飾）及びＩＭＰα１で染色されたＤＵＯＬＩＮＫ細胞のＡＳＩデジタル病理システムによる１００倍対物レンズを使用した高解像度イメージング。
ＤＬ－２が免疫療法応答性癌株ＣＴ２６においてＰＤＬ１（非修飾）とＩＭＰα１との複合体を阻害することを示す写真表示を提供する。
ＤＬ－２二環式ペプチドがＮＬＳモチーフに特異的であり、ＰＤＬ１－ＰＴＭ２（ＰＤＬ１－Ｍｅ３）を誘導するが、直鎖状ペプチドは誘導できないことを示すグラフ表示を提供する。棒グラフは、ＳＥＭによるＣＳＶ、ＰＤＬ１－ＰＴＭ２の細胞質レベルを示し、ハイスループット画像スクリーニングデータ（１群当たりＮ≧２０細胞）を示す。
ＤＬ－２がＰＤＬ２とＩＭＰα１との複合体を阻害しないことを示すグラフ表示を提供する。ＰＤＬ２及びＩＭＰα１で染色されたＤＵＯＬＩＮＫ細胞の高解像度イメージング。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＤＬ－２又は対照で処理し、透過処理し、ＤＵＯＬＩＮＫライゲーションアッセイでプローブした。
ＤＬ－２がＰＤＬ２の核発現に影響を及ぼさないことを示すグラフ表示を提供する。ＤＬ－２ペプチドの特異性のハイスループット分析。
ＤＬ－２が他の核タンパク質発現に影響を及ぼさず、ＰＤＬ１に特異的であることを示すグラフ表示を提供する。マーカーＰＫＣθ、ＬＳＤ１、ｐ６５、Ｃ－Ｒｅｌ、ＳＥＴ、ｐＳＴＡＴ３の核強度のグラフ。
ＤＬ－２の効力が２つの異なる二環式足場上で維持されることを示すグラフ表示を提供する。（Ａ）ＣＴ２６、４Ｔ１又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ＤＬ－２又はＤＬ－２－ＴＢＡＢ（２つの異なる足場）二環式阻害剤で７２時間処理した。阻害後、培地を除去し、ＷＳＴ－１細胞増殖試薬と交換した。吸光度を１時間後に４５０ｎｍで記録した。データは、三連で行われた単一の独立した実験を表し、結果は、平均＋／－標準誤差（ＳＥ）としてグラフ化する。（Ｂ）ＰＤＬ１－Ａｃ（ＰＴＭ１）及びＩＭＰα１で染色されたＤＵＯＬＩＮＫ細胞のＡＳＩデジタル病理システムによる１００倍対物レンズを使用した高解像度イメージング。（Ｃ）ＰＤＬ１非修飾及びＩＭＰα１で染色されたＤＵＯＬＩＮＫ細胞のＡＳＩデジタル病理システムによる１００倍対物レンズを使用した高解像度イメージング。
ＤＬ－２及びＤＬ－２－Ｄの生物学的安定性を実証するグラフ表示を提供する。（Ａ）ＤＬ－２及びＤＬ－２－Ｄ安定性をラット血漿モデルにおいて実施した。グラフは、２４時間（１４４０分）まで残存している試験化合物のパーセンテージを示す。（Ｂ）ＤＬ－２、ＤＬ－２－Ｄ、及び直鎖状ペプチド対照をラット血漿中安定モデルで試験した。グラフは、２時間までの試験化合物のパーセンテージを示す。
癌細胞増殖に対するＤＬ－２－Ｄ処置の効果を実証するグラフ表示を示す。３つの癌細胞株（Ａ）ＣＴ２６、（Ｂ）４Ｔ１、及び（Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を分析した。
ＤＬ－２及びＤＬ－２－Ｄがインポーチン：ＰＤＬ１複合体を効果的に阻害することを示すグラフ表示を提供する。
ＤＬ－２－Ｄを含むＤＬ－２二環式ペプチドバリアントが細胞質ＰＤＬ１－ＰＴＭ２の発現を誘導し、ＣＳＶを阻害することを示すグラフ表示を示す。棒グラフは、ハイスループット画像スクリーニングデータ（１群当たりＮ≧２０細胞）からの、ＳＥＭによるＣＳＶ、ＰＤＬ１－Ｍｅ３の細胞質レベルを示す。
環式ＰＤＬ１ペプチド阻害剤が間葉系癌マーカーを阻害できなかったことを示すグラフ表示を提供する。ＰＤＬ１－ＰＴＭ１、ＣＳＶ及びＡＬＤＨ１Ａ１で染色された細胞の、Ｌｅｉｃａ Ｗｉｄｅｆｉｅｌｄシステムによる１００倍対物レンズを使用した高解像度イメージングによる比較。
ＤＬ－２単剤療法が転移性乳癌の４Ｔ１ ＴＮＢＣモデルにおいて原発腫瘍体積を減少させることを示すグラフ表示を提供する。（Ａ）２２日間の処置期間にわたるマウス体重（ｇ）。（Ｂ）接種後２２日目のビヒクル及びＤＬ－２（３０ｍｇ／ｋｇ）処置マウスから採取された肺、肝臓及び脾臓の代表的な画像。（Ｃ）接種後２２日目の最終的な肺、肝臓及び脾臓重量。統計的差異なし、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後検定。（Ｄ）接種後２２日目の個々のマウスの腫瘍体積。＊＊＊ｐ＜０．００１対ビヒクル、２２日目、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後検定。（Ｅ）接種後２２日目のビヒクル及び採取されたＤＬ－２（３０ｍｇ／ｋｇ）処置マウスからの腫瘍の代表的な画像。（Ｆ）接種後２２日目の腫瘍重量。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、対ビヒクル、２２日目、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後検定。
ＤＬ－２及びαＰＤ１併用療法が転移性乳癌の４Ｔ１モデルにおいて原発腫瘍体積を減少させることを示すグラフ表示を提供する。（Ａ）１０日間の処置期間にわたるマウス体重（ｇ）。（Ｂ）接種後１９日目の最終的な肺、肝臓及び脾臓重量。統計的差異なし、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後検定。（Ｃ）αＰＤ１又はアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）と共にビヒクル（生理食塩水）又はＤＬ－２（１０ｍｇ／ｋｇ当量）で処置されたマウスの腫瘍体積（１群当たりｎ＝５）。（Ｄ）接種後１９日目の個々のマウスの腫瘍体積（データもＣに表す）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、対ビヒクル＋アイソタイプ、１９日目、一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後検定。（Ｅ）接種後１９日目の採取された腫瘍の代表的な画像。
ＤＬ－２－Ｄ及びαＰＤ１併用療法が転移性乳癌の４Ｔ１モデルにおいて原発腫瘍量及び肺転移を減少させることを示すグラフ表示を提供する。（Ａ）２０日間の処置期間にわたるマウス体重（ｇ）。（Ｂ）接種後２０日目の最終的な肺、肝臓及び脾臓重量。（Ｃ）αＰＤ１又はアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）と共にビヒクル（生理食塩水）又はＤＬ－２－Ｄ（２０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスの腫瘍体積（１群当たりｎ＝５）。（Ｄ）接種後２０日目の個々のマウスの腫瘍体積（データはＣにも表す）。＊ｐ＜０．０５、ＤＬ－２－Ｄ＋αＰＤ１対ビヒクル＋αＰＤ１及び＊＊ｐ＜０．０１、対ビヒクル＋アイソタイプ、２０日目、マン・ホイットニーの事後検定。（Ｅ）接種後２０日目の採取された腫瘍の代表的な画像。（Ｆ）接種後２０日目のαＰＤ１又はアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）と共にビヒクル（生理食塩水）又はＤＬ－２－Ｄ（２０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスの肺結節数（１群当たりｎ＝５）。肺をブアン溶液中で固定し、表面転移の存在について調べた。＊ｐ＜０．０５、ＤＬ－２－Ｄ＋αＰＤ１対ビヒクル＋アイソタイプ及び＊＊ｐ＜０．０１、対ＤＬ－２－Ｄ＋アイソタイプ、２０日目、マン・ホイットニーの事後検定。
ＤＬ－２とＤＬ－２－Ｄとの間の比較を示すグラフ表示を提供する。（Ａ）上記の図２４及び２５と同様。（Ｂ）固定した細胞をＰＢＳで洗浄し、抗体染色の前に１％ＢＳＡを含有するＰＢＳに再懸濁した。ＣＤ８、ＴＩＭ３及びＰＤ１抗体を標的とする一次抗体を使用した。適切な抗体対照を全てのフローサイトメトリー染色及び取得に使用した。全てのサンプルをＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０ソフトウェアを使用してデータを分析した。
転移性免疫療法抵抗性癌からのＭＩＣの前臨床処置における耐性シグネチャーを阻害するＤＬ－２のグラフ表示を提供する。グラフは、核マイナスバックグラウンドを選択するためにＡＳＩ Ｄｉｇｉｔａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ自動化システムを使用して測定された、ＣＳＶのＣＦＩ値、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１のＮＦＩ、ＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＢＣＢ５のＦＩを表す（ｎ≧４０細胞／サンプル／５患者／群）。マン－ホイットニーのノンパラメトリックｔ検定をペアワイズ比較に使用し、クラスカル・ウォリス検定を用いて＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊ｐ＜０．０５の群を比較した。
ＤＬ－２－Ｎ精製のグラフ表示を提供する。（Ａ）対照製剤（すなわち、中空ナノ粒子）のサイズ分布グラフ。（Ｂ）ＤＬ－２ナノ粒子（ＤＬ－２－ＮＰ）製剤のサイズ分布グラフ。脂質ナノ粒子とＤＬ－２とを３：１の比で１２ｍＬ／分～１８ｍＬ／分の流速で組み合わせることによって、又は中空対照用の脂質ナノ粒子のみと組み合わせることによって、ナノ粒子を形成した。粒子のブラウン運動を測定するために光散乱を使用する光子相関分光法であるＤＬＳを使用して、ナノ粒子サイズの強度を決定した。（Ｃ）ＤＬ－２、ＤＬ－２－ＮＰ、及びＤＬ－２－Ｄ安定性をラット血漿モデルにおいて実施した。グラフは、２４時間（１４４０分）後に残存している試験化合物のパーセンテージを示す。青色プロット：ＤＬ－２；橙色プロット：ＤＬ２－Ｄ；及び灰色プロット：ＤＬ－２－ＮＰ。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞株を使用した細胞増殖に対するＤＬ－２－ＮＰ処置の効果のグラフ表示及び写真表示を提供する。（Ａ）データは、三連で行われた単一の独立した実験を表す。結果を、平均＋／－標準誤差（ＳＥ）としてグラフ化する。濃度は、１＝０．００１ｎｍ～１０＝１０ｎｍの１０個の濃度読み取り値を表す。（Ｂ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１０ｎｍ～０．３ｎｍの範囲の濃度で、ＤＬ－２又はビヒクル対照で２４時間処理した。ＰＤＬ１－ＰＴＭ１（ＰＤＬ１－Ａｃ）、ＣＳＶ、又はＤＬＬ４で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の高解像度イメージング。スケールバーは１０μｍを示す。（Ｂ）グラフは、核（ＮＦＩ）区画、細胞質（ＣＦＩ）区画における平均蛍光強度、又は蛍光染色に対する核の比（Ｆｎ／ｃ）を表し、１より大きい比は核の偏りを意味し、１未満は細胞質の偏りを意味し、０は均等な分布を意味する。有意差は、クラスカル＝ウォリス一元配置ＡＮＯＶＡにより計算した。
ＤＬ－２－ＮＰがＰＤＬ１とＩｍｐ との標的複合体を効果的に阻害することを実証するグラフ表示を提供する。（Ａ，Ｂ）ＰＤＬ１非修飾＆ＩＭＰα１で染色されたＤＵＯＬＩＮＫ細胞のＡＳＩデジタル病理システムによる１００倍対物レンズを使用した高解像度イメージングによる比較。（Ａ）ＰＤＬ１（非修飾）及びＩＭＰα１ ＤＵＯＬＩＮＫデジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析した。（Ｂ）グラフは、核区画又は細胞質区画における平均ＤＯＴ蛍光強度を表し、有意差は一元配置ＡＮＯＶＡ比較により計算した。赤色カットオフは、ＰＤＬ１－（非修飾）とＩＭＰα１との複合体の発現を抑止するためのＤＬ－２－ＮＰのＩＣ５０を表す。（Ｃ，Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ビヒクル対照（中空ナノ粒子）又は１０ｎｍ～０．３ｎｍの濃度のＤＬ－２－ＮＰで処理した。（Ｃ）ＰＤＬ１－ＰＴＭ１及びＩＭＰα１で染色されたＤＵＯＬＩＮＫ細胞のＡＳＩデジタル病理システムによる１００倍対物レンズを使用した高解像度イメージングによる比較。細胞を透過処理し、ＤＵＯＬＩＮＫライゲーションアッセイ及びＰＤＬ１－ＰＴＭ１及びＩＭＰα１ ＤＵＯＬＩＮＫでプローブした。デジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析した。（Ｂ）グラフは、核区画又は細胞質区画における平均ＤＯＴ蛍光強度を表し、有意差は一元配置ＡＮＯＶＡ比較により計算した。赤色カットオフは、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１及びＩＭＰα１の発現を抑止するためのＤＬ－２－ＮＰのＩＣ５０を表す。
１．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を下記で定義する。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。
本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体を対象とする実施形態を含む（及び記載する）。
「アセチル化部位」という用語は、本明細書では、例えばアセチルトランスフェラーゼ、特に、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（その非限定的な例としては、ＧＣＮ５、Ｈａｔｌ、ＡＴＦ－２、Ｔｉｐ６０、ＭＯＺ、ＭＯＲＦ、ＨＢＯ１、ｐ３００、ＣＢＰ、ＳＲＣ－１、ＡＣＴＲ、ＴＩＦ－２、ＳＲＣ－３、ＴＡＦ１、ＴＦＩＩＩＣ及び／又はＣＬＯＣＫ、最も特にｐ３００が挙げられる）によってアセチル化され得る任意のアミノ酸配列を指すために使用される。「アセチル化部位」という用語は、リシン残基などのアセチル化基質、並びにアセチルトランスフェラーゼなどの酵素による基質認識に関与し得る周囲及び／又は近位のアミノ酸残基を含む配列を指す。アセチル化部位は、任意の適切な長さ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２２を超える残基長、好ましくは１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１残基長のアミノ酸配列であり得る。
「薬剤」という用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を誘導する化合物を含む。この用語はまた、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝産物、類似体などを含むがこれらに限定されない、本明細書で具体的に言及される化合物の薬学的に許容され得る、薬理学的に有効な成分を包含する。上記の用語が使用される場合、これは、活性薬剤自体並びに薬学的に許容され得る、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物、類似体などを含むことが理解されるべきである。「薬剤」という用語は、狭く解釈されるべきではなく、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質などの小分子、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体並びにそれらを含む組成物並びにＲＮＡ、ＤＮＡ及び模倣体及びそれらの化学的類似体並びに細胞薬剤に及ぶ。
本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のありとあらゆる可能な組み合せ、並びに選択肢（又は）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、包含する。
「癌幹細胞」（ＣＳＣ）という用語は、広範囲に増殖し、新しい腫瘍を形成し、癌発生を維持する能力を含む、腫瘍開始及び腫瘍維持能力を有する細胞、すなわち、腫瘍の形成及び成長を推進する不定の増殖能を有する細胞を指す。ＣＳＣは、バルク腫瘍細胞とは生物学的に異なり、幹細胞に関連する特徴、具体的には、自己複製し、増殖し、特定の癌サンプル中に見出される全ての細胞型を生じる能力を有する。「癌幹細胞」という用語は、幹細胞（ＳＣ）における遺伝子改変及びＣＳＣになる細胞における遺伝子改変の両方を含む。特定の実施形態において、ＣＳＣは乳房ＣＳＣであり、これは好適にはＣＤ２４＋ＣＤ４４＋であり、その例示的な例としてはＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ２４ｌｏｗが挙げられる。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には制御されない細胞増殖を特徴とする対象における生理学的症状を指すか、又は説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ性悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。かかる癌のより詳細な例としては、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌及び胃腸間質癌を含む胃癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫、及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫）（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、Ｍｅｉｇｓ症候群、脳、並びに頭頸部癌、及び関連する転移が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体による処置に適した癌としては、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、膠芽腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部癌、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫が挙げられる。いくつかの実施形態において、癌は、小細胞肺癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳癌、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、及び肝細胞癌から選択される。更に、いくつかの実施形態において、癌は、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、神経膠芽腫及び乳癌から選択され、それらの癌の転移性形態を含む。特定の実施形態において、癌は、黒色腫又は肺癌であり、好適には転移性黒色腫又は転移性肺癌である。
「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化合物を含む。化学療法剤の例としては、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、ジスルフィラム、没食子酸エピガロカテキン、サリノスポラミドＡ、カルフィルゾミブ、１７－ＡＡＧ（ゲルダナマイシン）、ラジシコール、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨ－Ａ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ／Ｓｕｇｅｎ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、イマチニブメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フィナスネート（finasunate）（ＶＡＴＡＬＡＮＩＢ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オキザリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標、Ｓａｎｏｆｉ）、５－ＦＵ（５－フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）、ロナファミブ（ＳＣＨ ６６３３６）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、アストラゼネカ）、ＡＧ１４７８、アルキル化剤、例えばチオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリシン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、ウレドパ等；エチレンイミン及びメチルメラミン（methylamelamines）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロメラミン（trimethylomelamine）を含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（トポテカン及びイリノテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；副腎皮質ステロイド（プレドニゾン及びプレドニゾロンを含む）；酢酸シプロテロン；５α－レダクターゼ（フィナステリド及びデュタステリドを含む）；ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、バルプロ酸、モセチノスタット、ドラスタチン；アルデスロイキン、タルクデュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロロビン（eleutherobin）；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（novembichin）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンω１Ｉ（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９４ ３３：１８３－１８６）；ダイネマイシン（ダイネマイシンＡを含む）；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ドキソルビシン）、モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えばメトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリシン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎物質、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォミチン（elfomithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダムノール（mopidamnol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オレゴン州ユージーン）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド（例えば、ＴＡＸＯＬ（パクリタキセル；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ニュージャージー州プリンストン）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ不含）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、イリノイ州シャンバーグ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル、ドキセタキセル；Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）；クロランムブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）（ビノレルビン）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；並びに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸及び誘導体が挙げられる。
化学療法剤としてはまた、（ｉ）腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）であって、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）；タモキシフェンクエン酸塩を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（トレミフェンクエン酸塩）を含むもの；（ｉｉ）副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタニー、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）など；（ｉｉｉ）抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；ブセレリン、トリプトレリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ジエチルスチルベストロール、プレマリン、フルオキシメステロン、ａｌｌ ｔｒａｎｓ－レチノイン酸、フェンレチニド、並びにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；（ｉｖ）プロテインキナーゼ阻害剤；（ｖ）脂質キナーゼ阻害剤；（ｖｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ－α、Ｒａｌｆ及びＨ－Ｒａｓなどの異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；（ｖｉｉ）リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）及びＨＥＲ２発現阻害剤；（ｖｉｉｉ）遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）、ｒＩＬ－２；トポイソメラーゼ１阻害剤、例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；並びに（ｉｘ）上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸及び誘導体が挙げられる。
化学療法剤としてはまた、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ）；パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）、２Ｃ４、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ，Ｃｏｒｉｘｉａ）、及び抗体薬物コンジュゲートであるゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）が挙げられる。本発明の化合物と組み合わせた薬剤としての治療可能性を有する更なるヒト化モノクローナル抗体としては、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピヌズマブ、ビバツズマブメルタンシン、カンツズマブメルタンシン、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、シドフシツズマブ、シドツズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノゾビズマブ、ヌマビズマブ、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、ペクセリズマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロベリズマブ、ルプリミズマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、タカツズマブ、テトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、ツコツズマブ、セルモロイキン、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、及びインターロイキン－１２ ｐ４０タンパク質を認識するように遺伝子組換えされたヒト配列の完全長ＩｇＧ１λ抗体である抗インターロイキン－１２（ＡＢＴ－８７４／Ｊ６９５、Ｗｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ及びＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が挙げられる。
化学療法剤としてはまた、「ＥＧＦＲ阻害剤」が挙げられ、これは、ＥＧＦＲに結合するか、さもなければＥＧＦＲと直接相互作用し、そのシグナル伝達活性を防止又は低減する化合物を指し、あるいは「ＥＧＦＲアンタゴニスト」と呼ばれるかかる薬剤の例としては、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子が挙げられる。ＥＧＦＲに結合する抗体の例としては、ＭＡｂ ５７９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ ８５０６）、ＭＡｂ ４５５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ ２２５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０８）、ＭＡｂ ５２８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎｅｔ ａｌ．を参照）及びそれらのバリアント、例えばキメラ化２２５（Ｃ２２５又はセツキシマブ；ＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標））及び再構成ヒト２２５（Ｈ２２５）（国際公開第９６／４０２１０号を参照、Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）；ＩＭＣ－１１Ｆ８、完全ヒトＥＧＦＲ標的化抗体（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ＩＩ型突然変異体ＥＧＦＲに結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載されているようなＥＧＦＲに結合するヒト化抗体及びキメラ抗体；並びにＥＧＦＲに結合するヒト抗体、例えばＡＢＸ－ＥＧＦ又はパニツムマブ（国際公開第９８／５０４３３号、Ａｂｇｅｎｉｘ／Ａｍｇｅｎを参照）；ＥＭＤ ５５９００（Ｓｔｒａｇｌｉｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３２Ａ：６３６－６４０（１９９６））；ＥＭＤ７２００（マツズマブ）：ＥＧＦＲ結合についてＥＧＦ及びＴＧＦ－αの両方と競合する、ＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ抗体（ＥＭＤ／Ｍｅｒｃｋ）；ヒトＥＧＦＲ抗体、ＨｕＭａｘ－ＥＧＦＲ（ＧｅｎＭａｂ）；Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６として知られる完全ヒト抗体．３及びＥ７．６．３及び米国特許第６，２３５，８８３号；ＭＤＸ－４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ Ｉｎｃ）；及びｍＡｂ ８０６又はヒト化ｍＡｂ ８０６（Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２９）：３０３７５－３０３８４（２００４）を参照））が挙げられる。抗ＥＧＦＲ抗体を細胞傷害剤とコンジュゲートさせて、免疫コンジュゲートを生成してもよい（例えば、欧州特許出願公開第６５９４３９（Ａ２）号、Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ ＧｍｂＨを参照）。ＥＧＦＲアンタゴニストとしては、米国特許第５，６１６，５８２号、同第５，４５７，１０５号、同第５，４７５，００１号、同第５，６５４，３０７号、同第５，６７９，６８３号、同第６，０８４，０９５号、同第６，２６５，４１０号、同第６，４５５，５３４号、同第６，５２１，６２０号、同第６，５９６，７２６号、同第６，７１３，４８４号、同第５，７７０，５９９号、同第６，１４０，３３２号、同第５，８６６，５７２号、同第６，３９９，６０２号、同第６，３４４，４５９号、同第６，６０２，８６３号、同第６，３９１，８７４号、同第６，３４４，４５５号、同第５，７６０，０４１号、同第６，００２，００８号、及び同第５，７４７，４９８号、並びに以下のＰＣＴ公開：国際公開第９８／１４４５１号、国際公開第９８／５００３８号、国際公開第９９／０９０１６号、及び国際公開第９９／２４０３７号に記載の化合物などの小分子が挙げられる。特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストとしては、ＯＳＩ－７７４（ＣＰ－３５８７７４、エルロチニブ、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＰＤ １８３８０５（ＣＩ １０３３、２－プロペンアミド、Ｎ－［４－［（３－クロロ－４－フルオロフェニル）アミノ］－７－［３－（４－モルホリニル）プロポキシ］－６－キナゾリニル］－，二塩酸塩、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）；ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））４－（３’－クロロ－４’－フルオロアニリノ）－７－メトキシ－６－（３－モルホリノプロポキシ）キナゾリン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＺＭ １０５１８０（（６－アミノ－４－（３－メチルフェニル－アミノ）－キナゾリン、Ｚｅｎｅｃａ）；ＢＩＢＸ－１３８２（Ｎ８－（３－クロロ－４－フルオロ－フェニル）－Ｎ２－（１－メチル－ピペリシン－４－イル）－ピリミド［５，４－ｄ］ピリミジン－２，８－ジアミン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＰＫＩ－１６６（（Ｒ）－４－［４－［（１－フェニルエチル）アミノ］－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－６－イル］－フェノール）－；（Ｒ）－６－（４－ヒドロキシフェニル）－４－［（１－フェニルエチル）アミノ］－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン）；ＣＬ－３８７７８５（Ｎ－［４－［（３－ブロモフェニル）アミノ］－６－キナゾリニル］－２－ブチンアミド）；ＥＫＢ－５６９（Ｎ－［４－［（３－クロロ－４－フルオロフェニル）アミノ］－３－シアノ－７－エトキシ－６－キノリニル］－４－（－ジメチルアミノ）－２－ブテンアミド）（Ｗｙｅｔｈ）；ＡＧ１４７８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ１５７１（ＳＵ ５２７１；Ｐｆｉｚｅｒ）；デュアルＥＧＦＲ／ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤、例えばラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６又はＮ－［３－クロロ－４－［（３フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］－６［５［［［２メチルスルホニル）エチル］アミノ］メチル］－２－フラニル］－４－キナゾリンアミン）が挙げられる。
化学療法剤としてはまた、前の段落に記載したＥＧＦＲ標的薬を含む「チロシンキナーゼ阻害剤」；Ｔａｋｅｄａから入手可能なＴＡＫ１６５などの小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤；ＣＰ－７２４、７１４、ＥｒｂＢ２受容体チロシンキナーゼの経口選択的阻害剤（Ｐｆｉｚｅｒ及びＯＳＩ）；ＥＧＦＲに優先的に結合するが、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ過剰発現細胞の両方を阻害するＥＫＢ－５６９（Ｗｙｅｔｈから入手可能）などのデュアルＨＥＲ阻害剤；ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６；Ｇｌａｘｏ－ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可能）、経口ＨＥＲ２及びＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤；ＰＫＩ－１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓから入手可能）；ｐａｎ－ＨＥＲ阻害剤、例えばカネルチニブ（ＣＩ－１０３３；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；Ｒａｆ－１シグナル伝達を阻害する、ＩＳＩＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手可能なアンチセンス剤ＩＳＩＳ－５１３２などのＲａｆ－１阻害剤；イマチニブメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｇｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可能）などの非ＨＥＲ標的化ＴＫ阻害剤；スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒから入手可能）などの多標的チロシンキナーゼ阻害剤；ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えばバタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧから入手可能）；ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼＩ阻害剤ＣＩ－１０４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）；キナゾリン、例えばＰＤ １５３０３５，４－（３－クロロアニリノ）キナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ピロロピリミジン、例えばＣＧＰ ５９３２６、ＣＧＰ ６０２６１及びＣＧＰ ６２７０６；ピラゾロピリミジン、４－（フェニルアミノ）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５－ビス（４－フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含有するチルホスチン；ＰＤ－０１８３８０５（Ｗａｒｎｅｒ－Ｌａｍｂｅｒ）；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲコード核酸に結合するもの；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；チルホスチン（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ－７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；ＣＩ－１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）などのｐａｎ－ＨＥＲ阻害剤；Ａｆｆｉｎｉｔａｃ（ＩＳＩＳ ３５２１；Ｉｓｉｓ／Ｌｉｌｌｙ）；イマチニブメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）；ＰＫＩ １６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＧＷ２０１６（Ｇｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＣＩ－１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＫＢ－５６９（Ｗｙｅｔｈ）；セマキシニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＺＤ６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ－７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；ＩＮＣ－１Ｃ１１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））；又は以下の特許公報のいずれかに記載されているもの：米国特許第５，８０４，３９６号；国際公開第１９９９／０９０１６号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）；国際公開第１９９８／４３９６０号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）；国際公開第１９９７／３８９８３号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；国際公開第１９９９／０６３７８号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；国際公開第１９９９／０６３９６号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；国際公開第１９９６／３０３４７号（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ）；国際公開第１９９６／３３９７８号（Ｚｅｎｅｃａ）；国際公開第１９９６／３３９７号（Ｚｅｎｅｃａ）及び国際公開第１９９６／３３９８０号（Ｚｅｎｅｃａ）が挙げられる。
化学療法剤としてはまた、デキサメタゾン、インターフェロン、コルヒチン、メトプリン、シクロスポリン、アムホテリシン、メトロニダゾール、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アミフォスチン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ生菌、ベバクジマブ、ベキサロテン、クラドリビン、クロファラビン、ダルベポエチンアルファ、デニロイキン、デクスラゾキサン、エポエチンアルファ、エルロチニブ、フィルグラスチム、酢酸ヒストレリン、イブリツモマブ、インターフェロンアルファ－２ａ、インターフェロンアルファ－２ｂ、レナリドミド、レバミゾール、メスナ、メトキサレン、ナンドロロン、ネララビン、ノフェツモマブ、オプレルベキン、パリフェルミン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセド二ナトリウム、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、キナクリン、ラスブリカーゼ、サルグラモスチム、テモゾロミド、ＶＭ－２６、６－ＴＧ、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ゾレドロネート、及びゾレドロン酸、並びに薬学的に許容され得るそれらの塩が挙げられる。
化学療法剤としてはまた、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン酢酸エステル、コルチゾン酢酸エステル、ピバリン酸チキソコルトール、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンアルコール、モメタゾン、アムシノニド、ブデゾニド、デソニド、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、ベタメタゾン、ベタメタゾンリン酸エステルナトリウム、デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、フルオコルトロン、１７－酪酸ヒドロコルチゾン、１７－吉草酸ヒドロコルチゾン、アルクロメタゾンプロピオン酸エステル、ベタメタゾン吉草酸エステル、ベタメタゾンジプロピオン酸エステル、プレドニカルベート、１７－クロベタゾン酪酸エステル、１７－クロベタゾールプロピオン酸エステル、カプロン酸フルオコルトロン、吉草酸フルオコルトロン及び酢酸フルプレドニデン；免疫選択的抗炎症性ペプチド（ＩＭｓＡＩＤ）、例えばフェニルアラニン－グルタミン－グリシン（ＦＥＧ）及びそのＤ－異性体型（ｆｅＧ）（ＩＭＵＬＡＮ ＢｉｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＬＬＣ）；抗リウマチ薬、例えばアザチオプリン、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、Ｄ－ペニシラミン、金塩、ヒドロキシクロロキン、レフルノミドミノサイクリン（leflunomideminocycline）、スルファサラジン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）遮断薬、例えばエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、セルトリズマブペゴール（Ｃｉｍｚｉａ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ）、インターロイキン１（ＩＬ－１）遮断薬、例えばアナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）、Ｔ共刺激遮断薬、例えばアバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）遮断薬、例えばトシリズマブ（ＡＣＴＥＭＥＲＡ（登録商標））；インターロイキン１３（ＩＬ－１３）遮断薬、例えばレブリキズマブ；インターフェロンα（ＩＦＮ）α（ＩＦＮ）遮断薬、ロンタリズマブ；β７インテグリン遮断薬、例えばｒｈｕＭＡｂベータ７；ＩｇＥ経路遮断薬、抗Ｍ１プライム；分泌型ホモ三量体ＬＴａ３及び膜結合型ヘテロ三量体ＬＴａ１／β２遮断薬、例えば抗リンホトキシンα（ｌｔＡ）；放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）；様々な治験薬、チオプラチン、ＰＳ－３４１、フェニルブチレート、ＥＴ－１８－ＯＣＨ３、又はファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ－７３９７４９、Ｌ－７４４８３２）；ポリフェノール、例えばケルセチン、レスベラトロール、ピセアタンノール、没食子酸エピガロカテキン、テアフラビン、フラバノール、プロシアニジン、ベツリン酸及びそれらの誘導体；オートファジー阻害剤、例えばクロロキン；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ－ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、９－アミノカンプトテシン）；ポドフィロトキシン；テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））；ビスホスホネート、例えばクロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ－５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、又はリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン；ペリホシン、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、セレコキシブ又はエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ＣＣＩ－７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；Ｂｃｌ－２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピキサントロン；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばロナファルニブ（ＳＣＨ ６６３６，ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））；及び上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸又は誘導体；並びにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略語）；及びＦＯＬＦＯＸ（５－ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を用いた処置レジメンの略語）などの上記のうちの２つ以上の組み合わせが挙げられる。
化学療法剤としてはまた、鎮痛、解熱及び抗炎症効果を有する非ステロイド性抗炎症薬も挙げられる。ＮＳＡＩＤとしては、酵素シクロオキシゲナーゼの非選択的阻害剤が挙げられる。ＮＳＡＩＤの具体例としては、アスピリン、プロピオン酸誘導体、例えばイブプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン及びナプロキセン、酢酸誘導体、例えばインドメタシン、スリンダク、エトドラク、ジクロフェナック、エノール酸誘導体、例えばピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム及びイソキシカム、フェナム酸誘導体、例えばメフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、並びにＣＯＸ－２阻害剤（例えば、セレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、ロフェコキシブ、ロフェコキシブ及びバルデコキシブが挙げられる。ＮＳＡＩＤは、関節リウマチ、変形性関節症、炎症性関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、急性痛風、月経困難症、転移性骨痛、頭痛及び片頭痛、術後疼痛、炎症及び組織損傷に起因する軽度～中程度の疼痛、発熱、回腸及び腎疝痛などの症状の症候的軽減に適応され得る。
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」という語は、記載されたステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群を含むが、任意の他のステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群を除外しないことを意味すると理解される。したがって、「含む（comprising）」などの用語の使用は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素は任意であり、存在してもしなくてもよいことを示す。「からなる（consisting of）」とは、「からなる（consisting of）」という語句の後に続くものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる（consisting of）」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在しなくてもよいことを示す。「から本質的になる（consisting essentially of）」とは、この語句の後に列挙された任意の要素を含み、列挙された要素について本開示で特定された活性又は作用に干渉又は寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる（consisting essentially of）」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
「に対応する（corresponds to）」又は「に対応する（corresponding to）」とは、参照アミノ酸配列に対して実質的な配列類似性又は同一性を示すアミノ酸配列を意味する。一般に、アミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の少なくとも一部に対して少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％又は更に１００％までの配列類似性又は同一性を示す。
「誘導体」とは、当該技術分野で理解されるように、他の化学部分による修飾、例えば、コンジュゲーション若しくは複合体化、又は翻訳後修飾技術によって塩基性分子から誘導された、ポリペプチドなどの分子を意味する。「誘導体」という用語にはまた、その範囲内に、機能的に等価な分子を提供する付加又は欠失を含む親配列に対してなされた改変が含まれる。
本明細書で使用される場合、「投薬単位形態」という用語は、処置される対象の単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的に許容され得るビヒクルと関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。
「有効量」は、特定の障害の測定可能な改善又は予防をもたらすのに必要とされる少なくとも最小量である。本明細書における有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力などの因子に応じて変動し得る。有効量はまた、治療的に有益な効果が、処置の任意の毒性又は有害な効果を上回る量である。予防的使用の場合、有益な結果又は所望の結果には、疾患の生化学的、組織学的及び／又は行動的症状、その合併症並びに疾患の発症中に現れる中間的な病理学的表現型を含む疾患のリスクの排除若しくは低減、重症度の軽減、又は発症の遅延などの結果が含まれる。治療的使用のために、有益な又は所望の結果には、疾患から生じる１つ以上の症候を減少させること、疾患に罹患している者の生活の質を増加させること、疾患を処置するのに必要な他の薬物の用量を減少させること、標的化などによる別の薬物の効果を増強すること、疾患の進行を遅延させること、及び／又は生存を延長することなどの臨床結果が含まれる。癌又は腫瘍の場合、有効量の薬物は、癌細胞の数を減少させる効果；腫瘍サイズを減少させる効果；末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅らせるか、又は望ましくは停止させる）効果；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅らせるか、又は望ましくは停止させる）効果；腫瘍成長をある程度阻害する効果；及び／又は癌若しくは腫瘍に関連する症候の１つ以上をある程度軽減する効果を有し得る。有効量は１回以上の投与で投与することができる。本発明の目的のために、有効量の薬物、化合物、又は医薬組成物は、直接的又は間接的のいずれかで予防的又は治療的処置を達成するのに十分な量である。臨床的な文脈で理解されるように、有効量の薬物、化合物、又は医薬組成物は、別の薬物、化合物、又は医薬組成物と共に達成されてもされなくてもよい。したがって、「有効量」は、１つ以上の治療剤を投与する状況において考慮され得、単一の薬剤は、１つ以上の他の薬剤と共に、所望の結果が達成され得るか、又は達成される場合、有効量で与えられると考慮され得る。
医薬による処置に対する患者の「有効な応答」又は患者の「応答性」及び類似の表現は、癌などの疾患又は障害のリスクがあるか、又はそれに罹患している患者に与えられる臨床的又は治療的利益を指す。一実施形態において、かかる利益には、生存期間の延長（全生存期間及び無増悪生存期間を含む）；客観的応答（完全奏効若しくは部分奏効を含む）をもたらすこと；又は癌の徴候若しくは症候を改善すること、のいずれか１つ以上が含まれる。処置に対して「有効な応答を有しない」患者は、生存期間の延長（全生存期間及び無増悪生存期間を含む）；客観的応答（完全奏効又は部分奏効を含む）をもたらすこと；又は癌の徴候若しくは症候を改善すること、のいずれも有しない患者のことを指す。
本明細書で使用される「排出半減期」という用語は、対象の血漿からのペプチドの排出の最終対数線形速度を指す。当業者は、半減期が、クリアランス及び分布容積の両方の関数として変化する導出パラメーターであることを理解するであろう。排出半減期の文脈において使用される「延長された」、「より長い」、又は「増加した」という用語は、本明細書において互換的に使用され、同等の条件下で決定される場合、参照分子（例えば、直鎖状Ｌ－アミノ酸ペプチド）の半減期と比較して、ペプチド（例えば、二環式ペプチド）の半減期に統計的に有意な増加があることを意味することを意図している。
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、コード配列の場合、発現は、コード配列のｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳を含む。逆に、非コード配列の発現は、非コード配列の転写物への転写のみを含む。「発現」という用語はまた、特定の位置におけるタンパク質又は分子が存在することを指すために本明細書で使用され、したがって、「局在化」と互換的に使用され得る。
遺伝子配列に関する「発現」という用語は、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）を産生するための遺伝子の転写、及び必要に応じて、得られたｍＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳を指す。したがって、文脈から明らかであるように、コード配列の発現は、コード配列の転写及び翻訳から生じる。逆に、非コード配列の発現は、非コード配列の転写から生じる。
「高（high）」という用語は、本明細書で使用される場合、正常よりも大きい、所定の尺度若しくはサブグループ尺度などの標準よりも大きい、又は別のサブグループ尺度よりも相対的に大きい尺度を指す。例えば、ＣＤ４４ｈｉｇｈは、正常なＣＤ４４測定値よりも大きいＣＤ４４の測定値を指す。結果として、「ＣＤ４４ｈｌｆｌｈ」は常に、少なくとも、対象の身体の関連部分又は対象の身体からの関連サンプルにおいて検出可能なＣＤ４４に対応する。正常な尺度は、当業者に利用可能な任意の方法に従って決定され得る。「高」という用語は、所定のカットオフなどの所定の尺度以上である尺度を指すこともある。対象が特定のマーカーについて「高」でない場合、そのマーカーについて「低」である。一般に、対象が「高」であるか「低」であるかを決定するために使用されるカットオフは、その区分が臨床的に関連するように選択されるべきである。
「宿主細胞」という用語は、本発明の任意の組換えベクター又は単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るか、又はレシピエントであった個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶発的な又は意図的な突然変異及び／又は変化に起因して、元の親細胞と必ずしも完全に同一ではない場合がある（形態又は全ＤＮＡ補体において）。宿主細胞は、本発明の組換えベクター又はポリヌクレオチドをインビボ又はインビトロでトランスフェクト又は感染させた細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞である。
「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを生成するための相補的ヌクレオチド配列の対合を示すために使用される。相補的塩基配列は、塩基対合則によって関連付けられる配列である。ＤＮＡでは、ＡはＴと対合し、ＣはＧと対合する。ＲＮＡでは、ＵはＡと対合し、ＣはＧと対合する。これに関して、本明細書で使用される「マッチ」及び「ミスマッチ」という用語は、相補的核酸鎖における対合ヌクレオチドのハイブリダイゼーション能力を指す。マッチしたヌクレオチドは、上記の古典的なＡ－Ｔ及びＧ－Ｃ塩基対のように効率的にハイブリダイズする。ミスマッチは、効率的にハイブリダイズしないヌクレオチドの他の組み合わせである。本発明において、対合の好ましい機構は、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（核酸塩基）間の、ワトソン－クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を含む。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成を介して対合する相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、当業者に公知の様々な環境下で起こり得る。
本明細書で使用される「阻害剤」という用語は、標的分子の少なくとも１つの機能又は生物学的活性を減少又は阻害する薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、そのネイティブな状態で通常付随する成分を実質的に又は本質的に含まない物質をいう。例えば、「単離されたペプチド」は、その天然の細胞環境からの、及び細胞の他の成分との会合からのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のインビトロ単離及び／又は精製を指す。「実質的に含まない」とは、ペプチドの調製物が少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％純粋であることを意味する。好ましい実施形態において、ペプチドの調製物は、（乾燥重量で）約３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％未満の本発明の主題ではない分子（本明細書において「混入分子」とも呼ばれる）を有する。ペプチドが組換え産生される場合、ペプチドはまた、望ましくは、培養培地を実質的に含まず、すなわち、培養培地は、調製物の容量の約２０、１５、１０、５、４、３、２又は１％未満に相当する。本発明は、乾燥重量で少なくとも０．０１、０．１、１．０、及び１０ミリグラムの単離又は精製された調製物を含む。
本明細書で使用される場合、「説明資料」は、本発明の組成物及び方法の有用性を伝えるために使用され得る刊行物、記録、図、又は任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の治療剤又は診断剤を含有する容器に添付されてもよく、又は本発明の治療剤又は診断剤を含有する容器と一緒に出荷されてもよい。
「リポソーム」という用語は、脂質二重層で構成された人工的に調製された小胞を指す。リポソームは、親油性二分子膜の内側に水溶液の一部をカプセル化するそれらの独特の特性に起因して、治療薬の送達のために使用され得る。親油性化合物は脂質二重層に溶解することができ、このようにして、リポソームは親油性化合物と親水性化合物の両方を担持することができる。分子を作用部位に送達するために、脂質二重層は、細胞膜などの他の二重層と融合させて、リポソーム内容物を送達することができる。
「間葉系表現型」という用語は当該技術分野で理解されており、形態学的、分子的及び／又は機能的特徴によって同定することができる。例えば、間葉系細胞は、一般的に、細長い又は紡錘形の外観を有し、間葉系マーカーであるビメンチン、フィブロネクチン及びＮ－カドヘリンを発現し、ゆっくりと分裂するか、又は非分裂性であり、及び／又は上皮細胞と比較して比較的高いレベルの運動性、浸潤性及び／又は足場非依存性成長を有する。
本明細書で使用される場合、「間葉上皮移行」（ＭＥＴ）という用語は、運動性、多極性又は紡錘形の間葉系細胞から上皮と呼ばれる極性化細胞の平面アレイへの移行を含む可逆的な生物学的プロセスである。ＭＥＴは、ＥＭＴの逆プロセスである。ＭＥＴは、正常な発生、癌転移、及び人工多能性幹細胞リプログラミングにおいて生じる。具体的な実施形態において、ＭＥＴは、１つ以上の上皮特性（例えば、上記のような）を回復するための、ＥＭＴを起こした細胞の再プログラミングを指す。例えば、かかる細胞は、典型的には、低下した運動性及び／又は侵襲性を示し、及び／又は急速に分裂し、それによって免疫療法薬及び／又は細胞傷害剤に対する感受性を回復し得る。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマー並びにそのバリアント及び合成類似体を指すために互換的に使用される。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の化学類似体などの合成非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマーに適用される。これらの用語は、修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを除外しない。対象ペプチドの可溶性形態は特に有用である。例えば、非天然アミノ酸又は置換結合を有するポリペプチドを含むアミノ酸の１つ以上の類似体を含むペプチドが、この定義内に含まれる。
「医薬組成物」又は「医薬製剤」という用語は、有効成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、組成物又は製剤が投与される対象に対して許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。かかる製剤は無菌である。「薬学的に許容され得る」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、対象哺乳動物に合理的に投与されて、使用される有効成分の有効用量を提供し得る賦形剤である。
本明細書で使用される場合、「ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞」という用語は、正常細胞よりも検出可能に高いレベルでＰＤ－Ｌ１を発現する脊椎動物細胞、特に哺乳動物又は鳥類（鳥）細胞、とりわけ哺乳動物細胞を指す。細胞は、脊椎動物細胞、例えば霊長類細胞；鳥（鳥類）細胞；家畜動物細胞（例えばヒツジ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、シカ細胞、ロバ細胞、ブタ細胞）；実験動物細胞（例えばウサギ細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞、ハムスター細胞）；コンパニオンアニマル細胞（例えばネコ細胞及びイヌ細胞）；並びに捕獲野生動物（キツネ細胞、シカ細胞及びディンゴ細胞）であり得る。特定の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞はヒト細胞である。具体的な実施形態において、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞は、癌幹細胞又は非癌幹細胞腫瘍細胞；好ましくは癌幹細胞腫瘍細胞である。過剰発現は、正常細胞又は比較細胞（例えば、乳房細胞）と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ超えるものであり得る。
「薬学的に許容され得る担体」とは、生物学的に又は他の点で望ましくないものではない材料で構成された薬学的ビヒクルを意味し、すなわち、この材料は、任意の又は実質的な有害反応を引き起こすことなく、選択された活性薬剤と共に対象に投与され得る。担体は、賦形剤及び他の添加剤、例えば希釈剤、界面活性剤、着色剤、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、トランスフェクション剤などを含み得る。
同様に、本明細書で提供される化合物の「薬理学的に許容され得る」塩、エステル、アミド、プロドラッグ又は誘導体は、生物学的に又は他の点で望ましくないものではない塩、エステル、アミド、プロドラッグ又は誘導体である。
本明細書で使用される場合、「予防する（prevent）」、「予防された（prevented）」又は「予防する（preventing）」は、疾患又は症状を発症する対象の抵抗性を増加させるか、又は言い換えれば、対象が疾患又は症状を発症する可能性を減少させる予防的処置、並びに疾患又は症状が始まった後に、それを完全に減少又は排除するか、又は悪化することを予防するための処置を指す。これらの用語はまた、疾患又は症状に罹りやすい可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患又は症状が発生するのを予防することをその範囲内に含む。
「放射線療法」とは、細胞が正常に機能する能力を制限するように、又は細胞を完全に破壊するように、細胞に十分な損傷を誘導するための指向性ガンマ線又はベータ線の使用を意味する。投与量及び治療期間を決定するための当該技術分野で公知の多くの方法があることが理解されるであろう。典型的な処置は、１回投与として与えられ、典型的な投与量は、１日当たり１０～２００単位（グレイ）の範囲である。
「低減する」、「阻害する」、「抑制する」、「減少させる」という用語及び文法上の同等物は、第２のサンプルに対する第１のサンプル中の物質及び／又は現象のレベルに関して使用される場合、第１のサンプル中の物質及び／又は現象の量が、当該技術分野で認められている任意の統計的分析方法を使用して統計的に有意である任意の量だけ第２のサンプル中よりも少ないことを意味する。一実施形態において、低下は、例えば、患者が疼痛、疲労などの疾患症候の主観的知覚を指す場合に、主観的に決定され得る。別の実施形態において、低下は、例えば、患者からの試料中のＣＳＣ及び／又は非ＣＳＣ腫瘍細胞の数が患者からの以前の試料よりも少ない場合に、客観的に決定され得る。別の実施形態において、第１のサンプル中の物質及び／又は現象の量は、第２のサンプル中の同じ物質及び／又は現象の量よりも少なくとも１０％少ない。別の実施形態において、第１のサンプル中の物質及び／又は現象の量は、第２のサンプル中の同じ物質及び／又は現象の量よりも少なくとも２５％少ない。更に別の実施形態において、第１のサンプル中の物質及び／又は現象の量は、第２のサンプル中の同じ物質及び／又は現象の量よりも少なくとも５０％少ない。更なる実施形態において、第１のサンプル中の物質及び／又は現象の量は、第２のサンプル中の同じ物質及び／又は現象の量より少なくとも７５％低い。更に別の実施形態において、第１のサンプル中の物質及び／又は現象の量は、第２のサンプル中の同じ物質及び／又は現象の量よりも少なくとも９０％低い。あるいは、差分を「ｎ倍」の差分として表現してもよい。
本明細書で使用される場合、「塩」及び「プロドラッグ」という用語は、レシピエントに投与されると、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又はその活性代謝産物若しくは残基を（直接的若しくは間接的に）提供することができる任意の薬学的に許容され得る塩、エステル、水和物又は任意の他の化合物を含む。適切な薬学的に許容され得る塩としては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸及び臭化水素酸などの薬学的に許容され得る無機酸の塩、又は酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、クエン酸、乳酸、粘液酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸及び吉草酸などの薬学的に許容され得る有機酸の塩が挙げられる。塩基塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム及びアルキルアンモニウムなどの薬学的に許容され得るカチオンで形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。また、塩基性窒素含有基は、低級アルキルハライド、例えばメチル、エチル、プロピル及びブチルクロリド、ブロミド並びにヨージド；硫酸ジアルキル、例えば硫酸ジメチル及び硫酸ジエチル；並びにその他などの試薬で四級化されてもよい。しかしながら、薬学的に許容されない塩もまた、これらが薬学的に許容され得る塩の調製において有用であり得るので、本発明の範囲内に含まれることが理解される。塩及びプロドラッグの調製は、当該技術分野で公知の方法によって行うことができる。例えば、金属塩は、本発明の化合物と金属水酸化物との反応によって調製することができる。酸性塩は、適切な酸を本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体と反応させることによって調製することができる。
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、対象から抽出された、未処理の、処理された、希釈された、又は濃縮された任意の生物学的試料を含む。サンプルとしては、全血、血清、赤血球、白血球、血漿、唾液、尿、便（すなわち、糞便）、涙、汗、皮脂、乳頭吸引液、管洗浄液、腫瘍滲出液、滑液、腹水、腹腔液、羊水、脳脊髄液、リンパ液、細針吸引液、羊水、任意の他の体液、細胞溶解物、細胞分泌産物、炎症液、精液及び膣分泌物などの生物学的流体を挙げることができるが、これらに限定されない。サンプルには、組織サンプル及び生検、組織ホモジネートなどが含まれ得る。有利なサンプルとしては、本明細書に教示されるような任意の１つ以上のバイオマーカーを検出可能な量で含むものを挙げることができる。好適には、サンプルは、対象からのサンプルの除去又は単離を可能にする低侵襲的方法によって容易に入手可能である。特定の実施形態において、サンプルは、血液、特に末梢血、又はその画分若しくは抽出物を含有する。典型的には、サンプルは、リンパ球、多形核白血球、好中球、単球、網状赤血球、好塩基球、骨髄球、血球、好酸球、巨核球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、又はかかる細胞の画分（例えば、核酸又はタンパク質画分）を含む、成熟、未成熟又は発生中の白血球などの血液細胞を含む。具体的な実施形態において、サンプルは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む白血球を含む。
本明細書で使用される「足場」又は「分子足場」という用語は、本発明の組成物中のアルキルアミノ結合及びチオエーテル結合（システインが存在する場合）でペプチドに結合している化学部分を指す。本明細書で使用される「足場分子」又は「分子足場分子」という用語は、ペプチド又はペプチドリガンドと反応して、アルキルアミノ結合を有し、特定の実施形態ではチオエーテル結合も有する本発明の誘導体を形成することができる分子を指す。したがって、足場分子は、分子のそれぞれの反応性基（脱離基など）が、足場部分におけるペプチドへのアルキルアミノ及びチオエーテル結合によって置き換えられていることを除いて、足場部分と同じ構造を有する。
本明細書で互換的に使用される「対象」、「患者」、「宿主」又は「個体」という用語は、治療又は予防が望まれる任意の対象、特に脊椎動物対象、更により詳細には哺乳動物対象を指す。本発明の範囲内に含まれる適切な脊椎動物としては、霊長類（例えば、ヒト、サル及び類人猿であり、Ｍａｃａｃａ属（例えば、カニクイザル、例えばＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、及び／又はアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ））及びヒヒ（Ｐａｐｉｏ ｕｒｓｉｎｕｓ）、並びにマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ属からの種）、リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ属からの種）及びタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ属からの種）、並びに類人猿の種、例えばチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ））、齧歯類（例えば，マウスラット，モルモット）、ウサギ目（例えば、ウサギ、野ウサギ）、ウシ科（例えば、ウシ）、ヒツジ科（例えば、ヒツジ）、ヤギ属（例えば、ヤギ）、ブタ科（例えば、ブタ）、ウマ科（例えば、ウマ）、イヌ科（例えば、イヌ）、ネコ科（例えば、ネコ）、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、カナリア、セキセイインコなどのコンパニオン鳥）、海洋哺乳動物（例えば、イルカ、クジラ）、爬虫類（ヘビ、カエル、トカゲなど）、及び魚類を含む亜門脊索動物の任意のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい対象は、増強されたＴ細胞活性化を伴う免疫応答を含む免疫応答を誘発することを必要とするヒトである。しかしながら、前述の用語は、症候が存在することを意味しないことが理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「処置（treatment）」、「処置する（treating）」などの用語は、臨床病理の経過中に処置される個体又は細胞の自然経過を変化させるように設計された臨床的介入を指す。処置の望ましい効果には、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。例えば、Ｔ細胞機能不全障害に関連する１つ以上の症候が緩和又は排除される場合、個体は、正常に「処置」され、これには、癌性細胞の増殖の減少（又は破壊）、病原体感染の減少、疾患から生じる症候の減少、疾患に罹患している個体の生活の質の増加、疾患の処置に必要な他の薬物の用量の減少、及び／又は個体の生存の延長が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、悪性であるか良性であるかにかかわらず、任意の新生物細胞の成長及び増殖、並びに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には制御されない細胞増殖によって部分的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は説明する。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、初期癌及び後期癌を含む、非転移性癌及び転移性癌を指す。「前癌性」という用語は、典型的には癌に先行するか又は癌に発展する状態又は成長を指す。「非転移性」という用語は、良性であるか又は原発部位に留まり、リンパ系若しくは血管系又は原発部位以外の組織に浸透していない癌を指す。一般に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ又はＩＩの癌である任意の癌である。「早期癌」とは、浸潤性若しくは転移性ではない癌、又はステージ０、Ｉ若しくはＩＩの癌として分類される癌を意味する。「後期癌」という用語は、一般に、ステージＩＩＩ又はＩＶの癌を指すが、ステージＩＩの癌又はステージＩＩの癌のサブステージも指すことができる。当業者であれば、ステージＩＩの癌を初期癌又は後期癌のいずれかに分類することは、癌の特定のタイプに依存することを理解するであろう。癌の例示的な例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎癌（腎臓癌）、癌腫、網膜芽細胞腫、黒色腫、脳癌、非小細胞肺癌、頭頸部の扁平上皮癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、中皮腫、直腸癌及び食道癌が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態において、癌は乳癌又は黒色腫である。
本明細書に記載される各実施形態は、特に明記しない限り、あらゆる実施形態に準用される
２．二環式ペプチド
本発明は、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が、間葉系耐性シグネチャー癌細胞の上皮応答性癌細胞への移行を効果的に刺激するという決定の一部に基づいている。この活性は、ＰＤ－Ｌ１の核局在化の阻害又は減少に起因するものであることが確認された。１つ以上の実施形態において、かかる二環式ペプチドは、癌幹細胞及び非癌幹細胞腫瘍細胞の形成、維持、及び／若しくは生存率を阻害若しくは減少させ、並びに／又はＥＭＴを阻害し、並びに／又はＭＥＴ若しくは癌幹細胞腫瘍細胞を誘導する。したがって、本発明者らは、本発明の二環式ペプチドを癌の処置又は予防に使用することができると考えた。
２．１ＰＤ－Ｌ２二環式ペプチド模倣体
したがって、本発明の一態様では、単離又は精製されたＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体であって、少なくとも２つのループ配列によって分離された少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチドと、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子足場であって、少なくとも２つのポリペプチドループが分子足場上に形成されるように共有結合を形成する分子足場とを含む、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又はその修飾誘導体、又はその薬学的に許容され得る塩が提供され、該ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、
Ｚ１Ｘ１Ｃ１ＬＸ２Ｘ３ＩＦＣ２Ｘ４ＬＲＫＧＸ５Ｃ３ＭＸ６ＭＤＸ８ＫＸ９
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３は、それぞれ第１、第２、及び第３のシステイン残基を表し、
Ｘ１は、不存在又はアラニンであり、
Ｘ２は、任意の小アミノ酸（任意選択で、トレオニン、グリシン、セリン、又はアラニン）から選択され、
Ｘ３は、任意のアミノ酸から選択され、
Ｘ４は、任意のアミノ酸から選択され、
Ｘ５は、任意のアミノ酸から選択され、
Ｘ６は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、ロイシン、プロリン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
Ｘ７は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、ロイシン、プロリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びノルロイシン）から選択され、
Ｘ８は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、ロイシン、プロリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びノルロイシン）から選択され、
Ｘ９は、任意のアミノ酸から選択され、及び
Ｚ１は、不存在又は１－テトラデカン酸である。
いくつかの実施形態において、式ＩのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、配列番号１：ＡＣＬＴＦＩＦＣＲＬＲＫＧＲＣＭＭＤＶＫＫ［配列番号１］によって表されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
これに関して、いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、以下の分子構造を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる：
好ましい実施形態において、式ＩのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、以下からなる群から選択される任意の１つ以上の活性を有する：（ｉ）細胞死を増加させること；（ＩＩ）ＭＥＴを増加させること；（ｉｉｉ）ＥＭＴを低減若しくは阻害すること；（ｉｖ）維持を阻害若しくは低減すること；（ｖ）増殖を阻害若しくは低減すること；（ｖｉ）分化を増加させること；（ｖｉｉ）形成を阻害若しくは低減すること；又は（ｖｉｉｉ）ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞の生存率を低下させること。いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞は、癌幹細胞又は非癌幹細胞腫瘍細胞；特に癌幹細胞腫瘍細胞である。
いくつかの実施形態において、式ＩのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列類似性を有する。いくつかの実施形態において、式ＩのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
本発明はまた、配列番号１のバリアントであるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を企図する。かかる「バリアント」ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体には、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のＮ末端及び／又はＣ末端への１つ以上のアミノ酸の欠失若しくは付加、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体における１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失若しくは付加、又はＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体における１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換によって配列番号１から誘導されるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が含まれる。
本発明に包含されるバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、生物学的に活性であり、すなわち、それらはネイティブなＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の所望の生物学的活性を保有し続ける。
配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、アミノ酸置換、欠失、切断及び挿入を含む様々な方法で改変され得る。かかる操作のための方法は、当該技術分野で一般的に知られている。例えば、配列番号１のアミノ酸配列バリアントは、配列番号１のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする核酸の突然変異誘発によって調製され得る。突然変異誘発及びヌクレオチド配列改変のための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ．８２：４８８－４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７－３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ」，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｒ Ｖ．Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）及びそこに引用されている参照文献を参照されたい。目的のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）に見出すことができる。点突然変異又はトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする方法、及び選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法は、当該技術分野で公知である。かかる方法は、配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のコンビナトリアル突然変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。ライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を高める技術である再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、活性バリアントを同定することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｎｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８９： ７８１１－７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６：３２７－３３１）。保存的置換、例えば１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換することは、以下でより詳細に議論されるように望ましい場合がある。
本発明のバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、配列番号１などの親（例えば、参照）アミノ酸配列と比較して、それらの配列に沿った様々な位置に保存的アミノ酸置換を含有し得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、以下に詳細に議論されるように、当該技術分野で定義されている。
酸性：残基は生理学的ｐＨでプロトンが失われるために負電荷を有し、残基はペプチドが生理学的ｐＨで水性媒体中にあるときに、それが含まれるペプチドの立体構造における表面位置を探すように水溶液によって引き寄せられる。酸性側鎖を有するアミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられる。
塩基性：残基は生理学的ｐＨで又はその１若しくは２ｐＨ単位内でプロトンと会合するために正電荷を有し（例えば、ヒスチジン）、残基はペプチドが生理学的ｐＨの水性媒体中にあるときに、それが含まれるペプチドの立体構造における表面位置を探すように水溶液によって引き寄せられる。塩基性側鎖を有するアミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。
荷電：残基は生理学的ｐＨで荷電しており、したがって、酸性又は塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン及びヒスチジンを含む。
疎水性：残基は生理的ｐＨで荷電しておらず、残基はペプチドが生理学的ｐＨで水性媒体中にあるときに、それが含まれるペプチドの立体構造における内部位置を探すように水溶液によってはじかれる。疎水性側鎖を有するアミノ酸としては、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、ノルロイシン、フェニルアラニン及びトリプトファンが挙げられる。
中性／極性：残基は生理学的ｐＨで荷電していないが、残基はペプチドが生理学的ｐＨで水性媒体中にあるときに、それが含まれるペプチドの立体構造における内部位置を探すように水溶液によって十分に反発されない。中性／極性側鎖を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリン及びトレオニンが挙げられる。
この記載はまた、極性基が欠如していても、疎水性を付与するのに側鎖が十分に大きくないので、特定のアミノ酸を「小さい」と特徴付ける。プロリンを除いて、「小（さい）」アミノ酸は、少なくとも１つの極性基が側鎖にある場合は４つ以下の炭素を有し、そうでない場合は３つ以下の炭素を有するものである。小さな側鎖を有するアミノ酸としては、グリシン、セリン、アラニン及びトレオニンが挙げられる。遺伝子コード二次アミノ酸プロリンは、ペプチド鎖の二次立体構造に対するその既知の効果のために特別な場合である。プロリンの構造は、その側鎖がα－アミノ基の窒素並びにα－炭素に結合しているという点で、他の全ての天然に存在するアミノ酸とは異なる。いくつかのアミノ酸類似性マトリックス（例えば、ＰＡＭ１２０マトリックス及びＰＡＭ２５０マトリックスであり、これは、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８），Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ Ｉｎ Ｍ．Ｄａｙｈｏｆｆ，（ｅｄ．），Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．３４５－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ；及びＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６（５０６２）：１４４３－１４４５）によって開示される）は、しかしながら、グリシン、セリン、アラニン及びトレオニンと同じ基にプロリンを含む。したがって、本発明の目的のために、プロリンは「小（さい）」アミノ酸として分類される。
極性又は非極性として分類するために必要な引力又は斥力の程度は任意であり、したがって、本発明によって具体的に企図されるアミノ酸は、一方又は他方として分類されている。具体的に挙げられていないほとんどのアミノ酸は、既知の挙動に基づいて分類することができる。
アミノ酸残基は、更に、環状又は非環状、及び芳香族又は非芳香族、残基の側鎖置換基に関して自明な分類、及び大きい又は小さいものとして下位分類することができる。残基は、追加の極性置換基が存在するという条件で、カルボキシル炭素を含めて合計４つ以下；そうでなければ、３つ以下の炭素原子を含有する場合、小さいと考えられる。小さなアミノ酸残基は、もちろん常に非芳香族である。それらの構造的特性に依存して、アミノ酸残基は２つ以上のクラスに分類され得る。天然に存在するタンパク質アミノ酸について、このスキームによる下位分類を表１に示す。
保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づくグループ分けを含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びノルロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、セリンによるトレオニンの置換、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置換は、得られる本発明のバリアントペプチドの特性に大きな影響を及ぼさないと予想することは合理的である。アミノ酸変化が、核局在化可能なポリペプチド、例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２の核局在化を阻害又は低減するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をもたらすかどうかは、その活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。保存的置換は、例示的及び好ましい置換の見出しの下で表２に示される。本発明の範囲内に含まれるアミノ酸置換は、一般に、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルクを維持する効果において有意差のない置換を選択することによって達成される。置換が導入された後、バリアントは生物学的活性についてスクリーニングされる。
あるいは、保存的置換を行うための類似のアミノ酸は、側鎖の同一性に基づいて３つのカテゴリーにグループ分けすることができる。第１の群には、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン及びヒスチジンが含まれ、これらは全て荷電側鎖を有する。第２の群には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン及びアスパラギンが含まれ、第３の群には、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン及びノルロイシンが含まれ、これはＺｕｂａｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｍ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９３）に記載されている。
したがって、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体中の予測される必須アミノ酸残基は、典型的には、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。あるいは、突然変異は、飽和突然変異誘発などによって、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のコード配列の全部又は一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた突然変異体は、例えば本明細書に記載されているように、親ポリペプチドの活性についてスクリーニングして、その活性を保持する突然変異体を同定することができる。コード配列の突然変異誘発後、コードされたＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を組換え発現させ、その活性を決定され得る。「非必須」アミノ酸残基は、本発明の実施形態のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の参照配列から、その活性の１つ以上を消失又は実質的に変更することなく変更され得る残基である。好適には、改変はこれらの活性の１つを実質的に変化させず、例えば、活性は野生型の活性の少なくとも２０％、４０％、６０％、７０％又は８０％である。対照的に、「必須」アミノ酸残基は、本発明の実施形態ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の野生型配列から変更された場合に、野生型活性の２０％未満が存在するように親分子の活性の消失をもたらす残基である。
したがって、本発明は、配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のバリアントであって、１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって親配列と区別されるバリアントも企図する。一般に、バリアントは、デフォルトパラメーターを使用して本明細書の他の箇所に記載される配列アラインメントプログラムによって決定される場合、例えば、配列番号１に示されるような参照ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性を示す。望ましくは、バリアントは、デフォルトパラメーターを使用して本明細書に記載される配列アラインメントプログラムによって決定される場合、例えば、配列番号１に示されるような親又は参照ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する。本発明のバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の範囲内に含まれる配列番号１のバリアントは、一般に少なくとも１つであるが、５、４、３、２又は１つ未満のアミノ酸残基が親分子と異なり得る。いくつかの実施形態において、本発明のバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、少なくとも１つであるが、５、４、３、２又は１つ未満のアミノ酸残基が配列番号１の対応する配列と異なる。いくつかの実施形態において、本発明のバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のアミノ酸配列は、式ＩのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を含む。特定の実施形態において、本発明のバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減する。
配列比較がアラインメントを必要とする場合、配列は典型的には最大の類似性又は同一性のためにアラインメントされる。欠失若しくは挿入、又はミスマッチから「ループ」アウトされた配列は、一般に相違点と見なされる。この相違は、好適には、非必須残基又は保存的置換における相違又は変化である。
いくつかの実施形態において、配列間の配列類似性又は配列同一性の計算は、以下のように行われる：
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較目的のために配列はアラインメントされる（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非相同配列は無視することができる）。いくつかの実施形態において、比較目的のためにアラインメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも４０％、より通常には少なくとも５０％又は６０％、更により通常には少なくとも７０％、８０％、９０％又は１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置で同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置で同一である。アミノ酸配列比較のために、第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置で同一又は類似のアミノ酸残基（すなわち、保存的置換）によって占められている場合、分子はその位置で類似している。
２つの配列間の配列同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、個々の位置で配列が共有する同一アミノ酸残基の数の関数である。対照的に、２つの配列間のパーセント類似性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、個々の位置で配列が共有する同一及び類似のアミノ酸残基の数の関数である。
配列の比較及び配列間の同一性パーセント又は類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。特定の実施形態において、アミノ酸配列間の同一性又は類似性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｄｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：３８７－３９５）内のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷＱｎｓｃｈ（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４－４５３）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ重み及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重みを使用して決定される。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列間のパーセント同一性又は類似性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（１９８９，Ｃａｂｌｏｓ，４：１１－１７）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用して決定され得る。
本発明はまた、本明細書で定義されるストリンジェンシー条件下で、特に中、高又は超高ストリンジェンシー条件下で、好ましくは高又は超高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体又はその非コード鎖をコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる単離又は精製されたＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を企図する。本発明はまた、本明細書で定義されるストリンジェンシー条件下で、特に中、高又は超高ストリンジェンシー条件下で、好ましくは高又は超高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をコードするポリヌクレオチド配列又はその非コード鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を企図する。
本明細書で使用される場合、「ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件を表し、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー及び超高ストリンジェンシーの条件を包含し得る。
ハイブリダイゼーション反応を行うためのガイダンスは、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、特に第６．３．１節～第６．３．６節に見出すことができる。水性及び非水性の両方の方法を使用することができる。本明細書における低ストリンジェンシー条件への言及は、４２℃でのハイブリダイゼーションのための少なくとも約１％ｖ／ｖ～少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミド及び少なくとも約１Ｍ～少なくとも約２Ｍの塩、並びに４２℃での洗浄のための少なくとも約１Ｍ～少なくとも約２Ｍの塩を含み、包含する。低ストリンジェンシー条件はまた、６５℃でのハイブリダイゼーションのための１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び（ｉ）２ｃ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳ；又は（ＩＩ）室温で洗浄するための０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳを含み得る。低ストリンジェンシー条件の一実施形態は、約４５℃での６ｃＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、続けて少なくとも５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の洗浄を含む（洗浄の温度は、低ストリンジェンシー条件のために５５℃に上昇させることができる）。中ストリンジェンシー条件は、４２℃でのハイブリダイゼーションのための少なくとも約１６％ｖ／ｖ～少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミド及び少なくとも約０．５Ｍ～少なくとも約０．９Ｍの塩、並びに５５℃での洗浄のための少なくとも約０．１Ｍ～少なくとも約０．２Ｍの塩を含み、包含する。中ストリンジェンシー条件はまた、６５℃でのハイブリダイゼーションのための１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、及び（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；又は（ＩＩ）６０～６５℃で洗浄するための０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳを含み得る。中ストリンジェンシー条件の一実施形態は、６×ＳＳＣ中、約４５℃でハイブリダイズし、続けて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃で１回以上洗浄することを含む。高ストリンジェンシー条件は、４２℃でのハイブリダイゼーションのための少なくとも約３１％ｖ／ｖ～少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミド及び約０．０１Ｍ～約０．１５Ｍの塩、並びに５５℃での洗浄のための約０．０１Ｍ～約０．０２Ｍの塩を含み、包含する。高ストリンジェンシー条件はまた、６５℃でのハイブリダイゼーションのための１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、及び（ｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；又は（ＩＩ）６５℃を超える温度で洗浄するための０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳを含み得る。高ストリンジェンシー条件の一実施形態は、６×ＳＳＣ中、約４５℃でハイブリダイズし、続けて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１回以上洗浄することを含む。
本発明のいくつかの態様では、配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体又はその非コード鎖をコードするポリヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる本発明の単離又は精製されたＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が提供される。特定の実施形態において、本発明の単離又は精製されたＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をコードするポリヌクレオチド配列又はその非コード鎖に非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる。超高ストリンジェンシー条件の一実施形態は、６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳをハイブリダイズさせ、続いて６５℃で０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回以上洗浄することを含む。いくつかの実施形態において、本発明のバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のアミノ酸配列は、式Ｉのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、本発明のバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減する。
他のストリンジェンシー条件は、当該技術分野で周知であり、当業者は、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するために種々の因子が操作され得ることを認識するであろう。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度のハイブリダイゼーションを確実にするのに役立ち得る。詳細な例については、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、特に第２．１０．１頁～第２．１０．１６頁及びＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ）、特に第１．１０１節～第１．１０４節を参照。
ストリンジェントな洗浄は典型的には約４２℃～６８℃の温度で実施されるが、当業者は、他の温度がストリンジェントな条件に適している場合があることを理解するであろう。最大ハイブリダイゼーション速度は、典型的には、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドの形成のためのＴｍよりも約２０℃～２５℃低い温度で生じる。Ｔｍが融解温度、又は２つの相補的ポリヌクレオチド配列が解離する温度であることは、当該技術分野において周知である。Ｔｍを推定するための方法は、当該技術分野において周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）の第２．１０．８頁）。一般に、ＤＮＡの完全にマッチした二本鎖のＴｍは、以下の式による近似値として予測することができる：
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－０．６３（％ホルムアミド）－（６００／長さ）
式中、Ｍは、Ｎａ＋の濃度であり、好ましくは０．０１Ｍ～０．４Ｍの範囲であり、％Ｇ＋Ｃは、３０％～７５％Ｇ＋Ｃの範囲内の、全塩基数の百分率としてのグアノシン及びシトシン塩基の合計であり、％ホルムアミドは、体積パーセントホルムアミド濃度であり、長さは、ＤＮＡ二本鎖中の塩基対の数である。二本鎖ＤＮＡのＴｍは、ランダムにミスマッチした塩基対の数が１％増加するごとに約１℃減少する。洗浄は、一般に、高ストリンジェンシーの場合はＴｍ－１５℃で、又は中ストリンジェンシーの場合はＴｍ－３０℃で実施される。
ハイブリダイゼーション手順の一例では、固定化ＤＮＡを含有する膜（例えば、ニトロセルロース膜又はナイロン膜）を、標識プローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（５０％脱イオンホルムアミド、５ｃ ＳＳｃ、５ｃデンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン及び０．１％ＢＳＡ）、０．１％ＳＤＳ及び２００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ）中、４２℃で一晩ハイブリダイズする次いで、膜を２回の連続した中ストリンジェンシー洗浄（すなわち、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４５℃で１５分間、続いて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で１５分間）に供し、続けて２回の連続したより高いストリンジェンシー洗浄（すなわち、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃で１２分間、続けて０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ溶液、６５～６８℃で１２分間）に供する。
本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体はまた、修飾された側鎖を有するアミノ酸を含むＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、ペプチド合成中の非天然アミノ酸残基及び／又はそれらの誘導体の組み込み、並びに架橋剤の使用及び本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体に立体構造の制約を課す他の方法を包含する。側鎖修飾の例としては、無水酢酸によるアシル化などによるアミノ基の修飾；アミノ基と無水コハク酸及びテトラヒドロ無水フタル酸によるアシル化；メチルアセトイミデートによるアミジン化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；ピリドキサール－５－リン酸によるリシンのピリドキシル化、続けて水素化ホウ素ナトリウムによる還元；アルデヒドとの反応による還元的アルキル化、続けて水素化ホウ素ナトリウムによる還元；及び２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化が挙げられる。
カルボキシル基は、Ｏ－アシルイソ尿素形成を介したカルボジイミド活性化と、続けて、例えば対応するアミドへのその後の誘導体化によって修飾することができる。
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３－ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサールなどの試薬による複素環縮合生成物の形成によって修飾することができる。
ペプチド合成中に非天然アミノ酸及び誘導体を組み込む例としては、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－５－フェニルペンタン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン酸、ｔ－ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、Ｌ／ｅ－アセチル－Ｌ－オルニチン、サルコシン、２－チエニルアラニン、Ｌ／ｅ－アセチル－Ｌ－リシン、Ｌ／ｅ－メチル－Ｌ－リシン、Ｌ／ｅ－ジメチル－Ｌ－リシン、Ｌ／ｅ－ホルミル－Ｌ－リシン及び／又はアミノ酸のＤ－異性体の使用が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によって企図される非天然アミノ酸のリストを表３に示す。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。
２．２Ｄ－アミノ酸ペプチド
いくつかの実施形態において、上記及び／又は本明細書の他の箇所に記載されるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の少なくとも１つのアミノ酸はＤ－アミノ酸である。好ましくは、Ｄ－アミノ酸は天然のＬ－アミノ酸に対応する。このタイプの実施形態の利点は、少なくとも１つのＤ－アミノ酸を組み込むペプチドが、一般に、Ｌ－アミノ酸のみから構成されるペプチドよりも高い安定性、より長い生物学的利用能、及び／又はより遅い排出半減期を有することである。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＤＬ１二環式ペプチド模倣体は、Ｄ－アミノ酸残基のみから構成される（立体異性体を有しないグリシンを除く）。他の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のアミノ酸の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％がＤ－アミノ酸である。
いくつかの実施形態において、タンパク質分解性切断部位が公知であるか若しくは予測される残基に対応する残基、及び／又はそうでなければ分解を受けやすい残基が、対応するＤ－アミノ酸アイソフォームで置換されている。例示的な例として、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＰＤ－Ｌ１のＮＬＳモチーフに対応するアミノ酸配列を含んでもよく、野生型ＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列（配列番号７５に記載）の２６１位のロイシン、野生型ＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列（配列番号７５に記載）の２６２位のアルギニン、及び／又は野生型ＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列（配列番号７５に記載）の２６３位のリシンに対応する重要なＮＬＳ残基のいずれか１つが、対応するＤ－アミノ酸で置換されている。
いくつかの実施形態において、式ＩのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、配列番号７５に記載されるネイティブなＰＤ－Ｌ１配列の２６１位に対応する位置にＤ－ロイシンを含む。同じ実施形態のいくつか及びいくつかの代替実施形態において、式ＩのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、配列番号７５に記載されるネイティブなＰＤ－Ｌ１配列の２６２位に対応する位置にＤ－アルギニンを含む。同じ実施形態のいくつか及びいくつかの代替実施形態において、式ＩのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、配列番号７５に記載されるネイティブなＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列の２６３位に対応する位置にＤ－リシンを含む。いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、配列番号７５に記載されるネイティブなＰＤ－Ｌ１配列の２６１位に対応する位置にＤ－ロイシンのうちの２つ、配列番号７５に記載されるネイティブなＰＤ－Ｌ１配列の２６２位に対応する位置にＤ－アルギニンのうちの２つ、及び配列番号７５に記載されるネイティブなＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列の２６３位に対応する位置にＤ－リシンのうちの２つを含む。いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、配列番号７５に記載されるネイティブなＰＤ－Ｌ１配列の２６１位に対応する位置にＤ－ロイシン、配列番号７５に記載されるネイティブなＰＤ－Ｌ１配列の２６２位に対応する位置にＤ－アルギニン、及び配列番号７５に記載されるネイティブなＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列の２６３位に対応する位置にＤ－リシンを含む。
同じ実施形態のいくつか及びいくつかの他の実施形態において、式（Ｉ）のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、レトロ－インベルソ配置のＤ－アミノ酸の鎖を含み得る。このタイプの実施形態において、ペプチド全体がレトロ－インベルソ型であってもよく、又はペプチドの一部がレトロ－インベルソ型であってもよい。例として、式（Ｉ）のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体において、「ＬＲＫ」残基（すなわち、配列番号７５に示されるネイティブなＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列の残基２６１～２６３に対応する）は、Ｄ－アミノ酸であり得、そしてレトロ－インベルソ型であり得る。かかる実施形態において、これらの残基は、形式（すなわち、Ｄ－Ｌｙｓ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｄ－Ｌｅｕ）である。
２．３末端ペプチド修飾
追加のアミノ酸又は他の置換基は、存在する場合、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のＮ末端又はＣ末端に付加され得る。例えば、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか又は両方に追加のアミノ酸が付加されたより長い配列の一部を形成し得る。
本発明の特定の使用及び方法のために、例えば、対象におけるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の排出半減期を増加させるために、高レベルの安定性を有するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が望ましい場合がある。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、安定化部分又は保護部分を含む。安定化部分又は保護部分は、ペプチド上の任意の点でカップリングされ得る。適切な安定化部分又は保護部分としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリカン又はキャッピング部分（アセチル基、ピログルタミン酸又はアミノ基を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、アセチル基及び／又はピログルタミン酸は、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のＮ末端アミノ酸残基にカップリングされる。特定の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のＮ末端はアセトアミドである。好ましい実施形態において、アミノ基は、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のＣ末端アミノ酸残基にカップリングされる。特定の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、Ｃ末端に第一級、第二級又は第三級アミド、ヒドラジド又はヒドロキシアミドを有する。特に、Ｃ末端の第一級アミドである。好ましい実施形態において、ＰＥＧは、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のＮ末端若しくはＣ末端アミノ酸残基に、又はリシン側鎖若しくは他の適切に修飾された側鎖のアミノ基を介して、特にＮ末端アミノ酸残基を介して、例えば残基のアミノ基を介して、又はリシン側鎖のアミノ基を介してカップリングされる。
いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、Ｃ末端に第一級アミド又は遊離カルボキシル基（酸）を有し、Ｎ末端に第一級アミン又はアセトアミドを有する。
２．４膜透過性部分
本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、本質的に膜を透過し得るが、膜透過性は、膜透過性部分とＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体とのコンジュゲーションによって更に増加され得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、膜透過性部分を含む。膜透過性部分は、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の任意の点でカップリングされ得る。
適切な膜透過性部分には、脂質部分、コレステロール並びにタンパク質、例えば細胞透過性ペプチド及びポリカチオン性ペプチド；特に脂質部分が含まれる。
適切な細胞透過性ペプチドには、例えば、米国特許出願公開第２００９／００４７２７２号、米国特許出願公開第２０１５／０２６６９３５号及び米国特許出願公開第２０１３／０１３６７４２に記載されているペプチドが含まれ得る。したがって、適切な膜透過性ペプチドとしては、塩基性ポリ（Ａｒｇ）及びポリ（Ｌｙｓ）ペプチド、並びにＹＧＲＫＫＲＰＱＲＲＲ（ＨＩＶ ＴＡＴ４７～５７；配列番号２２）、ＲＲＷＲＲＷＷＲＲＷＷＲＲＷＲＲ（Ｗ／Ｒ；配列番号２３）、ＣＷＫ１８（ＡｌｋＣＷＫ１８；配列番号２４）、Ｋ１８ＷＣＣＷＫ１８（Ｄｉ－ＣＷＫ１８；配列番号２５）、ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩ Ｌ（トランスポータン；配列番号２６）、ＧＬＦＥＡＬＥＥＬＷＥＡＫ（ＤｉｐＡｌＹｔｉｃ；配列番号２７）、Ｋ１６ＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＡＫ１６ＲＧＤ（Ｋ１６ＲＧＤ；配列番号２８）、Ｋ１６ＧＧＣＭＦＧＣＧＧ（ＰＩ；配列番号２９）、Ｋ１６ＩＣＲＲＡＲＧＤＮＰＤＤＲＣＴ（Ｐ２；配列番号３０）、ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲｂＡＫ（Ｂ）ｂＡ（Ｐ３；配列番号３１）、ＶＡＹＩＳＲＧＧＶＳＴＹＹＳＤＴＶＫＧＲＦＴＲＱＫＹＮ ＫＲＡ（Ｐ３ａ；配列番号３２）、ＩＧＲＩＤＰＡＮＧＫＴＫＹＡＰＫＦＱＤＫＡＴＲＳＮＹＹＧＮＳＰＳ（Ｐ９．３；配列番号３３）、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（Ｐｅｐ－１；配列番号３４）、ＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＴＹ（Ｐｌａｅ；配列番号３５）、Ｋ１６ＧＧＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＧＡ（Ｋｐｌａｅ配列番号３６）、Ｋ１６ＧＧＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＣＡ（ｃＫｐｌａｅ；配列番号３７）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ（ＭＧＰ；配列番号３８）、ＷＥＡＫ（ＬＡＫＡ）２－ＬＡＫＨ（ＬＡＫＡ）２ＬＫＡＣ（ＨＡ２；配列番号３９）、（ＬＡＲＬ）６ＮＨＣＨ３（ＬＡＲＬ４６；配列番号４０）、ＫＬＬＫＬＬＬＫＬＷＬＬＫＬＬＬ（Ｈｅｌ－１１－７；配列番号４１）、（ＫＫＫＫ）２ＧＧＣ（ＫＫ；配列番号４２）、（ＫＷＫＫ）２ＧＣＣ（ＫＷＫ；配列番号４３）、（ＲＷＲＲ）ｚＧＧＣ（ＲＷＲ；配列番号４４）、ＰＫＫＫＲＫＶ（ＳＶ４０ ＮＬＳ７；配列番号４５）、ＰＥＶＫＫＫＲＫＰＥＹＰ（ＮＬＳ１２；配列番号４６）、ＴＰＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰ（ＮＬＳ１２ａ；配列番号４７）、ＧＧＧＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（ＳＶ４０ ＮＬＳ１３；配列番号４８）、ＧＧＧＦＳＴＳＬＲＡＲＫＡ（ＡＶ ＮＬＳ１３；配列番号４９）、ＣＫＫＫＫＫＫＳＥＤＥＹＰＹＶＰＮ（ＡＶ ＲＭＥ ＮＬＳ１７；配列番号５０）、ＣＫＫＫＫＫＫＫＳＥＤＥＹＰＹＶＰＮ ＦＳＴＳＬＲＡＲＫＡ（ＡＶ ＦＰ ＮＬＳ２８；配列番号５１）、ＬＶＲＫＫＲＫＴＥＥＥＳＰＬＫＤＫＤＡＫＫＳＫＱＥ（ＳＶ４０ Ｎ１ ＮＬＳ２４；配列番号５２）、及びＫｇＫｚＫｇＫｇＧＧＫｇ（オリゴマー；配列番号５３）；ＨＳＶ－１外被タンパク質ＶＰ２２；核外輸送シグナル（ＮＥＳ）と融合されたＨＳＶ－１外被タンパク質ＶＰ２２ｒ；大腸菌エンテロトキシンＥｔｘＢの突然変異体Ｂ－サブユニット（Ｈ５７Ｓ）；解毒エクソトクシン（ＥＴＡ）；ＨＩＶ－１ Ｔａｔタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号５４）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒアンテナペディアドメインＡｎｔｐ（アミノ酸４３～５８）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５５）；Ｂｕｆｏｒｉｎ ＩＩ、ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ（配列番号５６）；ｈＣｌｏｃｋ－（アミノ酸３５～４７）（ヒトＣｌｏｃｋタンパク結合ペプチド）、ＫＲＶＳＲＮＫＳＥＫＫＲＲ（配列番号５７）；ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、ＫＩＡＬＫＩＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＩＡ（配列番号５８）；Ｋ－ＦＧＦ、ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＩＡＬＩＡＰ（配列番号５９）；ＶＰＭＬＫＥ（配列番号６０）、ＶＰＭＬＫ（配列番号６１）、ＰＭＬＫＥ（配列番号６２）又はＰＭＬＫ（配列番号６３）を含む群から選択されるペプチドを含むＫｕ７０由来ペプチド；プリオン、マウスＰｒｐｅ（アミノ酸１～２８）、ＭＡＮＬＧＹＷＬＩＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ（配列番号６４）；ｐＶＥＣ、ＬＬＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号６５）；Ｐｅｐ－Ｉ、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６）；ＳｙｎＢＩ、ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ（配列番号６７）；トランスポータン、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＩＡＡＩＡＫＫＩＬ（配列番号６８）；トランスポータン－１０、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号６９）；ＣＡＤＹ、Ａｃ－ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡ－システアミド（配列番号７０）；Ｐｅｐ－７、ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＩＡＣＱＹ（配列番号７１）；ＨＮ－１、ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ（配列番号７２）；ＶＴ５、ＤＰＫＧＤＰＫＧＶＴＶＴＶＴＶＴＶＴＧＫＧＤＰＫＰＤ（配列番号７３）；又はｐＩＳＬ、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（配列番号７４）などのＡｒｇ及びＬｙｓ残基の非天然類似体を含有する塩基性ポリ（Ａｒｇ）及びポリ（Ｌｙｓ）ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態において、膜透過性部分は、脂質部分、例えばＣ１０～Ｃ２０脂肪アシル基、特にステアロイル（オクタデカノイル；Ｃ１８）、パルミトイル（ヘキサデカノイル；Ｃ１６）又はミリストイル（テトラデカノイル；Ｃ１４；最も特にミリストイルである。好ましい実施形態において、膜透過性部分は、Ｎ末端若しくはＣ末端アミノ酸残基に、又はＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のリシン側鎖のアミノ基を介して、又は他の適切に修飾された側鎖、特にＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のＮ末端アミノ酸残基に、又はリシン側鎖のアミノ基を介してカップリングされる。特定の実施形態において、膜透過性部分は、Ｎ末端アミノ酸残基のアミノ基を介してカップリングされる。
いくつかの特定の実施形態において、膜透過性部分は、Ｎ末端アミノ酸残基にカップリングされたミリストイルである。
２．５標的化ペプチド
いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、血液脳関門（「ＢＢＢ」）を通過する、又は特定の細胞型への分子の輸送を増強することができる標的化ペプチドを更に含む。特定の実施形態において、標的化ペプチドは、Ａｎｇｉｏｐｅｐ－１（配列番号１００）；Ａｎｇｉｏｐｅｐ－２（配列番号１０１）；Ａｎｇｉｏｐｅｐ－３（配列番号１０４）；Ａｎｇｉｏｐｅｐ－４ａ（配列番号１０５）；Ａｎｇｉｏｐｅｐ４ｂ（配列番号１０６）；Ａｎｇｉｏｐｅｐ－５（配列番号１０７）；Ａｎｇｉｏｐｅｐ－６（配列番号１０８）；又はＡｎｇｉｏｐｅｐ－７（配列番号１０９）（表４を参照）の配列を有する。標的化ペプチドとコンジュゲートすると、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、特定の細胞型（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、及び筋肉のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ）に効率的に輸送され得るか、又は哺乳動物ＢＢＢを効率的に通過し得る（例えば、Ａｎｇｉｏｐｅｐ－１、－２、－３、－４ａ、－４ｂ、－５、及び－６）。いくつかの代替実施形態において、標的化ペプチドとコンジュゲートすると、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、特定の細胞型（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、及び筋肉のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ）に効率的に輸送され得るが、哺乳動物ＢＢＢ（例えば、Ａｎｇｉｏｐｅｐ－７）を効率的に通過しない。標的化ペプチドは、任意の長さ、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、３５、５０、７０若しくは１００アミノ酸、又はこれらの数の間の任意の範囲であってもよい。特定の実施形態において、ペプチドベクターは、１０～５０アミノ酸長である。
ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体がＢＢＢを通過しなければならない適応症（例えば、脳癌又はＢＢＢによって保護される他の癌）を処置又は予防するために使用される場合、標的化ペプチドは、Ａｎｇｉｏｐｅｐ－２（配列番号１０１）、Ａｎｇｉｏｐｅｐ－１（配列番号１００）、ｃｙｓ－Ａｎｇｉｏｐｅｐ－２（配列番号１１０）、及びＡｎｇｉｏｐｅｐ－２－ｃｙｓ（配列番号１１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得るか、それからなり得るか、又はそれから本質的になり得る。好ましい実施形態において、標的化ペプチドは、Ａｎｇｉｏｐｅｐ－２（配列番号１０１）である。
いくつかの実施形態において、標的化ペプチドは、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の任意の点で、特にＮ末端又はＣ末端アミノ酸残基にカップリングされ得る。代替実施形態において、標的化ペプチドは、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のＣｙｓリンカー領域にコンジュゲートされ得る。
したがって、本発明の別の態様では、式ＩＩによって表される単離又は精製されたＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が提供される：
Ｍ－Ｐ（式ＩＩ）
式中、
Ｍは、膜透過性部分であり、
Ｐは、式Ｉによって表される単離又は精製されたＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体である。
いくつかの実施形態において、Ｍは、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の任意の点；特に、Ｎ末端若しくはＣ末端アミノ酸残基に、又はＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のリシン側鎖のアミノ基を介して、又は他の適切に修飾された側鎖、より具体的にはＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のＮ末端アミノ酸残基に、又はリシン側鎖のアミノ基；最も特に、Ｎ末端アミノ酸残基のアミノ基を介してカップリングされる。
式Ｉによって表されるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の適切な膜透過性部分及び実施形態は、本明細書に記載されるとおりである。
本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、塩又はプロドラッグの形態であり得る。本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の塩は、好ましくは薬学的に許容され得るが、薬学的に許容されない塩も本発明の範囲内に含まれることが理解されるであろう。
本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、結晶形態及び／又は溶媒和物、例えば水和物の形態であり得る。溶媒和は、当該技術分野で公知の方法を使用して行うことができる。
本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用いて、又は化学合成によって調製することができる。
２．６核酸分子
いくつかの実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、組換えＤＮＡ技術を使用して調製される。例えば、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、以下のステップを含む手順によって調製することができる：（ａ）本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をコードし、調節エレメントに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含む構築物を調製するステップ；（ｂ）構築物を宿主細胞に導入するステップ；（ｃ）宿主細胞を培養してポリヌクレオチド配列を発現させ、それによって本発明のコードされたＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を産生するステップ、及び（ｄ）本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を宿主細胞から単離するステップ。本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、標準的なプロトコルを用いて組換えにより調製することができ、例えば、Ｋｌｉｎｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，８（５）：ｅ６３８６５；ｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ）、特に第１６節及び第１７節。Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、特に第１０章及び第１６章；Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、特に第１章、第５章及び第６章；並びに米国特許第５，９７６，５６７号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
したがって、本発明はまた、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をコードする核酸分子を企図する。したがって、本発明の更なる態様では、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をコードするポリヌクレオチド配列、又は本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、例えば、配列番号１の式ＩのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、若しくは本明細書に記載されるバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をコードするポリヌクレオチド配列に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子が提供される。
本発明の単離された核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。核酸分子がＤＮＡ形態である場合、それはゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡであり得る。本発明の核酸分子のＲＮＡ形態は、一般にｍＲＮＡである。
核酸分子は典型的には単離されているが、いくつかの実施形態において、核酸分子は、発現ベクターなどの他の遺伝子分子に組み込まれ得るか、ライゲーションされ得るか、又は他の方法で融合若しくは会合され得る。一般に、発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写及び翻訳調節核酸を含む。したがって、本発明の別の態様では、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、例えば配列番号１の式ＩのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又は本明細書に記載されるバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。
典型的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、並びに核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。ベクターは、任意選択で、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物、原核生物又はその両方におけるカセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクター）、並びに原核生物系及び真核生物系の両方のための選択マーカーを含有する一般的な発現カセットを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、又はその両方における複製及び組み込みに適切であり得る。Ｇｉｌｉｍａｎ及びＳｍｉｔｈ（１９７９），Ｇｅｎｅ，８：８１－９７；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１－７３４；Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ Ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたく、その内容全体は参照により組み込まれる。
真核生物ウイルス、例えば、レトロウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターは、典型的には、真核生物細胞における核酸配列の発現のために使用される。ＳＶ４０ベクターは、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２を含む。ウシパピローマウイルスに由来するベクターとしては、ｐＢＶ－１ ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタイン・バーウイルスに由来するベクターとしては、ｐＨＥＢＯ及びｐ２０５が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及び真核細胞における発現に有効であることが示されているＳＶ－４０初期プロモーター、ＳＶ－４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター又は他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
様々なベクターが使用され得るが、ウイルス発現ベクターは、ウイルスベクターが標的細胞をトランスフェクトし、標的細胞ゲノムに組み込まれる効率が高いため、真核生物細胞を改変するのに有用であることに留意すべきである。このタイプの例示的な発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、並びにＢ、Ｃ、及びＤレトロウイルスなどのレトロウイルス、並びにスピューマウイルス及び改変レンチウイルスを含むがこれらに限定されないウイルスＤＮＡ配列に由来し得る。動物細胞のトランスフェクションに適した発現ベクターは、例えば、Ｗｕ及びＡｔａｉ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｌｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１（２）：２０５－２０８；Ｖｉｇｎａ及びＮａｌｄｉｎｉ（２０００）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．，２（５）：３０８－３１６；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，７（１）：３３－４０；Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６（４）：３６３－３７５；並びにＷＡＬＴＨＥＲ及びＳｔｅｉｎ（２０００）Ｄｒｕｇｓ，６０（２）：２４９－２７１に記載されており、これらの内容全体は参照により組み込まれる。
発現ベクターのポリペプチド又はペプチドをコードする部分は、組換え技術を使用して操作された、天然に存在する配列又はそのバリアントを含み得る。バリアントの一例において、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をコードするポリヌクレオチドのコドン組成は、例えば、国際公開第９９／０２６９４号及び国際公開第００／４２２１５号に記載されているように、コドン使用頻度バイアス、特定の哺乳動物細胞又は組織型における又はコドン翻訳効率を利用する方法を使用して、哺乳動物宿主における本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の発現の増強を可能にするように改変される。簡潔には、これらの後者の方法は、異なるコドンの翻訳効率が異なる細胞又は組織間で変化し、これらの差異を遺伝子のコドン組成と共に利用して特定の細胞又は組織型におけるタンパク質の発現を調節することができるという観察に基づいている。したがって、コドン最適化ポリヌクレオチドの構築のために、親ポリヌクレオチドの少なくとも１つの既存のコドンが、それが置換する既存のコドンよりも標的細胞又は組織において高い翻訳効率を有する同義コドンで置換される。親核酸分子の全ての既存のコドンを、より高い翻訳効率を有する同義コドンで置き換えることが好ましいが、部分的な置き換えであっても発現の増加が達成され得るので、これは必要ではない。好適には、置き換えステップは、親ポリヌクレオチドの既存のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、より好ましくは３５％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれを超えて影響を及ぼす。
発現ベクターは、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が細胞によって発現可能であるように、それが導入される細胞と適合性である。発現ベクターは、使用される発現ベクター及び細胞の特定の選択に依存する任意の適切な手段によって細胞に導入される。かかる導入手段は、当業者に周知である。例えば、導入は、接触（例えば、ウイルスベクターの場合）、エレクトロポレーション、形質転換、形質導入、コンジュゲーション又は三親交配、トランスフェクション、カチオン性脂質による感染膜融合、ＤＮＡコートマイクロプロジェクタイルによる高速衝撃、リン酸カルシウム－ＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、単一細胞への直接マイクロインジェクションなどの使用によって行うことができる。他の方法も利用可能であり、当業者に公知である。あるいは、ベクターは、カチオン性脂質、例えばリポソームによって導入される。かかるリポソームは市販されている（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、メリーランド州ゲイザースバーグによって供給されるＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）など）。
分子足場
本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、分子足場に共有結合したポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。分子足場は、例えば、国際ＰＣＴ特許公開番号第２００９／０９８４５０及びその中で引用されている参考文献、特に国際公開第２００４／０７７０６２号及び同第２００６／０７８１６１号に記載されている。前述の文献に記載されているように、分子足場は、有機小分子などの小分子であってもよい。
いくつかの実施形態において、分子足場は、ヌクレオシド、糖、又はステロイドなどの天然モノマーであってもよく、又はそれに基づいてもよい。例えば、分子足場は、二量体又は三量体などのかかる実体の短いポリマーを含んでもよい。
一実施形態において、分子足場は、既知の毒性、例えば、低毒性の化合物である。適切な化合物の例としては、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、又はテマゼパムなどの既存の薬物が挙げられる。
いくつかの実施形態、分子足場は高分子であってもよい。いくつかの実施形態において、分子足場は、アミノ酸、ヌクレオチド、又は炭水化物で構成された高分子である。
いくつかの実施形態において、分子足場は、ポリペプチドの官能基と反応して共有結合を形成することができる反応基を含む。
分子足場は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキル及びハロゲン化アシルなどの化学基を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、足場は、芳香族分子足場（すなわち、（ヘテロ）アリール基を含む足場）である。これらの芳香族環は、任意選択で、チエニル環、ピリジル環、及びフラニル環などの１つ以上のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＰのうちの１つ以上）を含有することができる。芳香族環は、任意選択で置換されていてよい。アリール環も、任意選択で置換されていてよい。適切な置換基としては、アルキル基（任意選択で置換されていてもよい）、他のアリール基（それ自体置換されていてもよい）、複素環（飽和又は不飽和）、アルコキシ基（アリールオキシ基（例えばフェノキシ基）を含むことを意味する）、ヒドロキシ基、アルデヒド基、ニトロ基、アミン基（例えば、非置換、又はアリール基若しくはアルキル基で一置換若しくは二置換されている）、カルボン酸基、カルボン酸誘導体（例えば、カルボン酸エステル、アミドなど）、ハロゲン原子（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩ）などが挙げられる。
好適には、足場は、トリス置換（ヘテロ）芳香族又は（ヘテロ）脂環式部分、例えば、トリスメチレン置換（ヘテロ）芳香族又は（ヘテロ）脂環式部分を含む。（ヘテロ）芳香族又は（ヘテロ）脂環式部分は、好適には６員環構造であり、好ましくは、足場が３回対称軸を有するようにトリス置換されている。
いくつかの実施形態において、足場は、トリス－メチレン（ヘテロ）アリール部分、例えば、１，３，５－トリスメチレンベンゼン部分である。これらの実施形態において、対応する足場分子は、好適には、メチレン炭素上に脱離基を有する。次いで、メチレン基は、本明細書で定義されるアルキルアミノ結合のＲ１部分を形成する。これらのメチレン置換（ヘテロ）芳香族化合物において、芳香族環の電子が求核置換中に遷移状態を安定化することができる。したがって、例えば、ハロゲン化ベンジルは、（ヘテロ）芳香族基に結合していないハロゲン化アルキルよりも求核置換に対して１００～１０００倍反応性が高い。
このタイプの実施形態において、足場及び足場分子は、一般式を有する：
式中、ＬＧは、足場分子について以下に更に記載されるような脱離基を表すか、又はＬＧ（アルキルアミノ基のＲ１部分を形成する隣接メチレン基を含む）は、本発明のコンジュゲート中のペプチドへのアルキルアミノ結合を表す。
いくつかの実施形態において、上記の基ＬＧは、ハロゲン、例えば限定されないが、臭素原子であってもよく、この場合、足場分子は１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）である。別の適切な分子足場分子は、２，４，６－トリス（ブロモメチル）メシチレンである。これは、１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼンに類似しているが、ベンゼン環に結合した３つのメチル基を更に含む。この足場の場合、追加のメチル基がペプチドとの更なる接触を形成し、したがって追加の構造的制約を加える可能性がある。したがって、１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼンを用いる場合とは異なる多様性範囲が達成される。
求核置換によるペプチドとの反応のための足場を形成するための別の好ましい分子は、１，３，５－トリス（ブロモアセトアミド）ベンゼン（ＴＢＡＢ）である。
いくつかの代替実施形態において、足場は、非芳香族分子足場（例えば、（ヘテロ）脂環式基を含む足場）である。本明細書で使用される場合、「（ヘテロ）脂環式」は、同素環又は複素環式飽和環を指す。環は、非置換であってもよく、又は１つ以上の置換基で置換されていてもよい。置換基は、飽和又は不飽和、芳香族又は非芳香族であり得、適切な置換基の例としては、アルキル及びアリール基上の置換基に関する考察において上で列挙したものが挙げられる。更に、２つ以上の環置換基は、結合して別の環を形成し得、その結果、本明細書で使用される場合、「環」は、縮合環系を含むことを意味する。これらの実施形態において、脂環式足場は、好ましくは１，１’，１’’－（１，３，５－トリアジナン－１，３，５－トリイル）トリプロパ－２－エン－１－オン（ＴＡＴＡ）である。
いくつかの代替実施形態において、分子足場は、コードされたペプチドの４つの官能基と分子足場との反応が２つ以下の生成物異性体を生成するような四面体形状を有し得る。他の幾何学形状も可能である。実際に、ほぼ無限の数の足場形状が可能であり、ペプチドリガンド多様化の可能性がより大きくなる。
本発明の二環式ペプチドを形成するために使用されるペプチドは、システインの末端－ＳＨ基が－ＮＨ２と置き換えられた、足場にチオエーテル結合を形成するために使用されるシステインを含む。
本発明の二環式ペプチドは、注射、吸入、経鼻、眼内、経口又は局所投与のための有益な薬物様分子と見なすことを可能にするいくつかの有利な特性を有する。かかる有利な特性には以下のものが含まれる：
－前臨床薬力学及び薬物動態評価のための典型的な要件である種交差反応性；
－二環式ペプチドリガンドが、理想的には、血漿プロテアーゼ、上皮（「膜固定」）プロテアーゼ、胃及び腸プロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼなどに対する安定性を示すことによる、プロテアーゼ安定性。プロテアーゼ安定性は、二環式ペプチド候補が動物モデルにおいて開発され、ヒトに安心して投与され得るように、異なる種の間で維持されるべきである；
－望ましい溶解度プロファイルであって、これは荷電及び親水性残基対疎水性残基の割合、並びに製剤及び吸収の目的に重要である分子内／分子間Ｈ結合の関数である；
－最適な排出半減期。臨床的適応症及び処置レジメンに依存して、急性疾患管理設定における短時間曝露のための二環式ペプチドを開発すること、又は保持が増強された二環式ペプチドを開発することが必要とされ得る。したがって、より慢性の疾患状態及び癌の管理に最適である。望ましい排出半減期を推進する他の因子は、薬剤の持続的曝露に起因する付随する毒物学に対する最大治療効率のための持続的曝露の要件である。
一実施形態において、分子足場は、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、特に１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼン（「ＴＢＭＢ」）、又はその誘導体を含み得るか、又はそれらからなり得る。
いくつかの特に好ましい実施形態において、分子足場は１，３，５－（トリブロモメチル）ベンゼン）である。
いくつかの他の実施形態において、分子足場は２，４，６－トリス（ブロモメチル）メシチレンである。この分子は、１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼンに類似しているが、ベンゼン環に結合した３つの追加のメチル基を含有する。これは、追加のメチル基がポリペプチドと更なる接触を形成し、したがって追加の構造的制約を加えることができるという利点を有する。
システインのチオール基と反応させるために分子足場上で使用され得る足場反応性基は、ハロゲン化アルキル（又はハロゲノアルカン若しくはハロアルカンとも呼ばれる）である。例としては、ブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢによって例示される足場反応性基）又はヨードアセトアミドが挙げられる。化合物をタンパク質中のシステインに選択的にカップリングするために使用される他の足場反応性基は、マレイミドである。本発明において分子足場として使用され得るマレイミドの例としては、トリス－（２－マレイミドエチル）アミン、トリス－（２－マレイミドエチル）ベンゼン、トリス－（マレイミド）ベンゼンが挙げられる。セレノシステインも、システインと同様の反応性を有し、同じ反応に使用することができる天然アミノ酸である。したがって、システインが言及される場合は常に、文脈が他のことを示唆しない限り、セレノシステインを置換することが典型的に許容され得る。
２．７合成
本発明のペプチドは、標準的な技術によって合成的に製造され得、その後、インビトロで分子足場との反応が行われる。これが行われる場合、標準的な化学が使用され得る。これは、更なる下流実験又は検証のための可溶性物質の迅速な大規模調製を可能にする。かかる方法は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（上記参照）に開示されているような従来の化学を用いて達成することができる。
したがって、本発明はまた、本明細書に示されるように選択されるポリペプチド又はコンジュゲートの製造に関し、ここで、この製造は、以下に説明されるような任意選択の更なるステップを含む。一実施形態において、これらのステップは、化学合成によって作製された最終産物ポリペプチド／コンジュゲートに対して行われる。
任意選択で、コンジュゲート又は複合体を製造する場合、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基が置換され得る。
ペプチドを伸長させて、例えば別のループを組み込み、したがって複数の特異性を導入することもできる。ペプチドを伸長させるために、標準的な固相又は液相化学を使用して、直交的に保護されたリシン（及び類似体）を使用して、そのＮ末端若しくはＣ末端で、又はループ内で単純に化学的に伸長させてもよい。標準的なタンパク質化学を使用して、活性化可能なＮ末端又はＣ末端を導入することができる。あるいは、付加を、フラグメント縮合又はネイティブな化学ライゲーション（例えば、（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６－７７９）によって、又は酵素によって、例えば、ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅを用いて（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９４ Ｄｅｃ ２０；９１（２６）：１２５４４－８又はＨｉｋａｒｉ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌｕｍｅ １８，Ｉｓｓｕｅ ２２，１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８，ｐａｇｅｓ ６０００－６００３に記載されている）行うことができる。
あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を介する更なるコンジュゲーションによって伸長又は修飾され得る。これは、第１及び第２のペプチドが細胞の還元環境内で一度互いに解離することを可能にするという更なる利点を有する。この場合、分子足場（例えば、ＴＢＭＢ）は、３つのシステイン基と反応するように、第１のペプチドの化学合成中に添加され得、次いで、更なるシステインが、第１のペプチドのＮ末端に付加され得、その結果、このシステインは、第２のペプチドの遊離システインとのみ反応した。
同様の技術が、２つの二環式及び二重特異性の大環状分子の合成／カップリングに等しく適用され、潜在的に四重特異性分子を作製する。更に、他の官能基又はエフェクター基の付加は、適切な化学を使用して、Ｎ末端若しくはＣ末端で又は側鎖を介してカップリングして、同じ様式で達成され得る。一実施形態において、カップリングは、いずれかの実体の活性を遮断しないような様式で行われる。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をコードするポリヌクレオチド配列を含む１つ以上の発現構築物、例えば発現ベクターの導入によって細胞内で産生され得る。
本発明は、哺乳動物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞又はヒト胎児腎（ＨＥＫ２９３）細胞）、酵母菌（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｌ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ細胞、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ細胞、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞若しくはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞）、又は細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞）などの宿主細胞内で本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を組換え産生することを企図する。
治療用途のために、本発明はまた、対象の細胞、例えばＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞、例えば脊椎動物細胞、特に哺乳動物又は鳥類細胞、特に哺乳動物細胞内で本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をインビボで産生することも企図する。
いくつかの実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、溶液合成又は固相合成などの標準的なペプチド合成方法を使用して調製される。本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の化学合成は、手動で、又は自動合成装置を使用して行うことができる。例えば、直鎖状ペプチドは、Ｂｏｃ化学又はＦｍｏｃ化学のいずれかを用いた固相ペプチド合成を用いて合成することができ、これは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，８５（１４）：２１４９－２１５４；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ，４０：１８０－１９３ ａｎｄ Ｃａｒｄｏｓｏ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，８８（２）：２９１－３０３に記載され、これらの内容全体は参照により組み込まれる。固体支持体からの脱保護及び切断の後、直鎖状ペプチドを、分取クロマトグラフィーなどの適切な方法を用いて精製する。
３．医薬組成物
本発明によれば、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＰＤ－Ｌ１の核局在化が関与する症状、例えば癌の処置又は予防のための組成物及び方法において有用である。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、医薬組成物の形態であってもよく、この医薬組成物は、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体と薬学的に許容され得る担体又は希釈剤とを含む。
本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、中性又は塩形態として医薬組成物に製剤化されてもよい。
当業者によって理解されるように、薬学的に許容され得る担体又は希釈剤の選択は、投与経路並びに病態及び処置される対象に依存する。特定の担体又は送達系及び投与経路は、当業者によって容易に決定され得る。担体又は送達系及び投与経路は、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の活性が製剤の調製中に枯渇せず、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が無傷で作用部位に到達できることを確実にするように慎重に選択されるべきである。本発明の医薬組成物は、経口、直腸、局所、鼻腔内、眼内、経粘膜、腸管、経腸、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、脳内、膣内、膀胱内、静脈内又は腹腔内投与を含むがこれらに限定されない様々な経路を介して投与され得る。
注射用途に適した医薬形態には、滅菌注射液又は分散液、及び滅菌注射液を調製するための滅菌粉末が含まれる。かかる形態は、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、還元、酸化及び微生物汚染に対して保存され得る。
当業者は、従来のアプローチを使用して、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の適切な製剤を容易に決定することができるであろう。製剤化及び投与のための技術は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（１９８０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，最新版；及びＮｉａｚｉ（２００９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第２版に見出すことができ、これらの内容全体は参照により組み込まれる。
好ましいｐＨ範囲及び適切な賦形剤、例えば、抗酸化剤）の同定は、例えば、Ｋａｔｄａｒｅ及びＣｈａｕｂｅｌ（２００６）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。緩衝液系は、所望の範囲のｐＨ値を提供するために日常的に使用され、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩及びコハク酸塩などのカルボン酸緩衝剤；グリシン；ヒスチジン；リン酸塩；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）；アルギニン；水酸化ナトリウム；グルタミン酸塩；及び炭酸塩緩衝剤を挙げることができるが、これらに限定されない。適切な抗酸化剤としては、フェノール化合物、例えばブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）及びブチル化ヒドロキシアニソール；ビタミンＥ；アスコルビン酸；還元剤、例えばメチオニン又は亜硫酸塩；金属キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；システイン塩酸塩；重亜硫酸ナトリウム；メタ重亜硫酸ナトリウム；亜硫酸ナトリウム；パルミチン酸アスコルビル；レシチン；没食子酸プロピル；及びα－トコフェロールを挙げることができるが、これらに限定されない。
注射のために、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、水溶液、好適には生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス液、リンガー溶液又は生理食塩水緩衝液）中で製剤化され得る。経粘膜投与の場合、浸透されるバリアに適切な浸透剤が製剤に使用される。かかる浸透剤は、当該技術分野で一般に知られている。
本発明の組成物は、許容され得る希釈剤（例えば、生理食塩水及び滅菌水）を含む液体の形態で投与するために処方され得るか、又は許容され得る希釈剤又は担体を含むローション、クリーム又はゲルの形態であり得、所望のテクスチャー、コンシステンシー、粘度及び外観を付与する。許容され得る希釈剤及び担体は当業者によく知られており、エトキシ化及び非エトキシ化界面活性剤、脂肪アルコール、脂肪酸、炭化水素油（パーム油、ヤシ油、及び鉱油など）、カカオバターワックス、シリコーン油、ｐＨバランサー、セルロース誘導体、非イオン性有機及び無機塩基などの乳化剤、保存剤、ワックスエステル、ステロイドアルコール、トリグリセリドエステル、レシチン及びセファリンなどのリン脂質、多価アルコールエステル、脂肪アルコールエステル、親水性ラノリン誘導体、並びに親水性蜜蝋誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
あるいは、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、当該技術分野で周知の薬学的に許容され得る担体を使用して、経口投与に適切な投薬量に容易に製剤化され得、これも本発明の実施のために企図される。かかる担体は、本発明の生物活性剤が、処置される患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などの剤形に製剤化されることを可能にする。これらの担体は、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張食塩水及びパイロジェンフリー水から選択することができる。
非経口投与用の医薬製剤には、水溶性形態の本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の水溶液が含まれる。更に、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。任意選択で、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増加させる適切な安定剤又は薬剤を含有することができる。
滅菌溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を、必要に応じて上記の他の賦形剤と合わせ、続けて濾過などの滅菌を行うことによって調製することができる。概して、分散液は、種々の滅菌された活性化合物を、上述の塩基性分散媒及び必要な賦形剤を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌乾燥粉末は、上記の活性化合物及び他の必要な賦形剤を含む滅菌溶液を真空乾燥又は凍結乾燥することによって調製することができる。
経口使用のための医薬製剤は、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を固体賦形剤と組み合わせ、所望であれば適切な補助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工して錠剤又は糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。適切な賦形剤は、特に、充填剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望であれば、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムが添加され得る。かかる組成物は、薬学の方法のいずれかによって調製され得るが、全ての方法は、上記のような１つ以上の治療剤を、１つ以上の必要な成分を構成する担体と会合させるステップを包含する。一般に、本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方法で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
糖衣錠コアは、適切なコーティングと共に提供される。この目的のために、濃縮糖溶液が使用され得、これは、任意選択で、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含み得る。識別のため、又は粒子用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、染料又は顔料を錠剤又は糖衣錠コーティングに添加してもよい。
経口的に使用することができる医薬品としては、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセル、並びにゼラチン及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤で作られた密封軟カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、並びに任意選択で安定剤と混合した有効成分を含有することができる。軟カプセルにおいて、活性化合物は、適切な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール）に溶解又は懸濁され得る。更に、安定剤を添加してもよい。
本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、放出調節調製物及び製剤、例えば、ポリマーマイクロスフェア製剤、及び油性又はゲルベースの製剤に組み込むことができる。
特定の実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、全身的ではなく局所的な方法で、例えば、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を、好ましくは皮下組織又は大網組織である組織に直接注射することによって、多くの場合、デポー製剤又は徐放性製剤で投与され得る。局所投与又は選択的取り込みの場合、薬剤の有効局所濃度は、血漿濃度に関係しない場合がある。
３．１薬物送達系
更に、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、細胞又は組織に適切に標的化され、細胞又は組織によって選択的に取り込まれる粒子などの標的化薬物送達システムで投与され得る。いくつかの実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、リポソーム、ミセル、デンドリマー、生分解性粒子、人工ＤＮＡナノ構造体、脂質ベースのナノ粒子及び炭素又は金ナノ粒子から選択されるビヒクル中に含有されるか、又は他の方法で会合される。このタイプの例示的な例において、ビヒクルは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ＰＬＡ－ＰＥＧコポリマー及びそれらの組み合わせから選択される。
３．１．１脂質ナノ粒子
いくつかの好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、１つ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質及び／又はイオン化可能な脂質及び／又は中性脂質）と複合体化されるか、カプセル化されるか、部分的にカプセル化されるか、又は会合され、それによってリポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス及び／又はナノリポソームなどの脂質ベースの担体を形成する。ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、脂質ベースの担体の内部空間に完全に又は部分的に位置し得る。治療剤（例えば、ペプチド、核酸、及び小分子）の脂質担体への組み込みはまた、本明細書において「カプセル化」とも称され、治療剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体）は、脂質担体の内部空間内に完全に含まれる。ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を脂質担体に組み込む１つの利点は、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を、酵素若しくは化学物質、又は核酸及び／若しくはペプチドの急速な排出を引き起こす系若しくは受容体を分解する条件を含有する可能性が高い環境から保護することである。更に、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を脂質ベースの担体に組み込むことにより、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の取り込みを促進することができ、したがってペプチドの治療効果を増強することができる。したがって、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体をリポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、及び／又はナノリポソームに組み込むことは、本発明の組成物に（例えば、筋肉内、静脈内、及び／又は皮内投与に）特に好適であり得る。
これに関連して、「複合体化された」又は「会合した」という用語は、共有結合を伴わない、核酸と１つ以上の脂質との、より大きな複合体又は集合体への本質的に安定な組み合わせを指す。
脂質ナノ粒子は、膜又は１つ以上の二重層によって外部媒体から隔離された内部水空間を有する顕微鏡的小胞として適切に特徴付けられる。脂質ナノ粒子の二重層膜は、典型的には、空間的に分離された親水性及び疎水性ドメインを含む合成又は天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成される。リポソームの二重層膜はまた、両親媒性ポリマー及び界面活性剤（例えば、ポリマーソーム、ニオソームなど）によって形成され得る。本発明の文脈において、脂質ナノ粒子は、典型的には、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を標的組織（例えば、腫瘍）に輸送する役割を果たす。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「イオン化可能な脂質」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味を有し、１つ以上の荷電部分を含む脂質を指し得る。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、正に荷電していても負に荷電していてもよい。イオン化可能な脂質は、正に荷電していてもよく、その場合、「カチオン性脂質」と呼ぶことができる。特定の実施形態において、イオン化可能な脂質分子は、アミン基を含んでもよく、イオン化可能なアミノ脂質と呼ぶことができる。本明細書で使用される場合、「荷電部分」は、形式的な電子電荷、例えば、一価（＋１又は－１）、二価（＋２又は－２）、三価（＋３又は－３）などを有する化学部分である。荷電部分は、アニオン性（すなわち、負に荷電している）又はカチオン性（すなわち、正に荷電している）であってもよい。正に荷電した部分の例としては、アミン基（例えば、第一級、第二級、及び第三級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、及びイミダゾリウム基が挙げられる。いくつかの実施形態において、荷電部分はアミン基を含む。負に荷電した基又はその前駆体の例としては、カルボキシレート基、スルホネート基、スルフェート基、ホスホネート基、ホスフェート基、ヒドロキシル基などが挙げられる。荷電部分の電荷は、場合によっては、環境条件によって変動し得、例えば、ｐＨの変化は、部分の電荷を変化させ得、及び／又は部分を荷電又は非荷電にし得る。一般に、分子の電荷密度は、所望に応じて選択することができる。イオン化可能な脂質はまた、国際公開第２０１７／０７５５３１号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１３／０８６３５４号、若しくは同第２０１３／１１６１２６号に開示されている化合物であってもよく、又は米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ～ＣＬＸＸＸＸＩＩ（これらの各々は、この目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）から選択され得る。
「荷電」又は「荷電部分」という用語は、分子上の「部分負電荷」又は「部分正電荷」を指すものではないことを理解されたい。「部分負電荷」及び「部分正電荷」という用語には、当該技術分野におけるその通常の意味が与えられる。「部分負電荷」は、官能基が、電子密度が結合の１つの原子に向かって引き寄せられ、原子上に部分負電荷を生成するように分極されるようになる結合を含む場合に生じ得る。当業者は、一般に、このようにして分極され得る結合を認識するであろう。
いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミノ脂質であり、当該技術分野において「イオン化可能なカチオン性脂質」と呼ばれることもある。一実施形態において、イオン化可能なアミノ脂質は、リンカー構造を介して接続された正に荷電した親水性頭部及び疎水性尾部を有し得る。これらに加えて、イオン化可能な脂質は、環状アミン基を含む脂質であってもよい。
本開示のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子に製剤化され得る。脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン化可能なアミノ脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／又は少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含み得る。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、２０～６０％のモル比のイオン化可能なアミノ脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２０～５０％、２０～４０％、２０～３０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～６０％、４０～５０％、又は５０～６０％のモル比のイオン化可能なアミノ脂質を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、２０％、３０％、４０％、５０、又は６０％のモル比のイオン化可能なアミノ脂質を含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、５～２５％のモル比の非カチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２５％、１５～２０％、又は２０～２５％のモル比の非カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％のモル比の非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、２５～５５％のモル比のステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２５～５０％、２５～４５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～５５％、３０～５０％、３０～４５％、３０～４０％、３０～３５％、３５～５５％、３５～５０％、３５～４５％、３５～４０％、４０～５５％、４０～５０％、４０～４５％、４５～５５％、４５～５０％、又は５０～５５％のモル比のステロールを含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又は５５％のモル比のステロールを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、０．５～１５％のモル比のＰＥＧ修飾脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、０．５～１０％、０．５～５％、１～１５％、１～１０％、１～５％、２～１５％、２～１０％、２～５％、５～１５％、５～１０％、又は１０～１５％のモル比を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、又は１５％のモル比のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、２０～６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。
いくつかの具体的な実施形態において、脂質ナノ粒子は、脂質ＰＯＰＣ、コレステロール、及び／又はＤＳＰＥ－ＰＥＧのうちの１つ以上を含む。より具体的には、脂質ナノ粒子は、ＰＯＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧの各々を含み得る。
３．２投与量
投与の容易さ及び投与量の均一性のために、組成物を単位剤形で製剤化することが有利である。本発明の新規な投薬単位形態の決定は、本明細書において詳細に開示されるように、活性物質の固有の特性、達成されるべき特定の治療効果、及び身体の健康が損なわれている疾患状態を有する生きている対象における疾患の処置のための活性物質の配合技術に固有の限界によって決定され、そしてこれらに直接依存する。
本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、対象に投与される唯一の有効成分であり得るが、当該ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体と同時に他の癌療法を施すことは、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載される式Ｉ、配列番号１、又はバリアントのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、１つ以上の癌療法と同時に投与されてもよく、その非限定的な例としては、放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法、及び免疫療法が挙げられる。本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、癌療法による処置の前に治療的に使用されてもよく、癌療法の後に治療的に使用されてもよく、又は癌療法と一緒に治療的に使用されてもよい。
適切な放射線療法としては、ＤＮＡ損傷を誘発する放射線及び波、例えば、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出及び放射性同位体が挙げられる。典型的には、治療は、局所腫瘍部位を上記の形態の放射線で照射することによって達成され得る。これらの因子の全てが、ＤＮＡに対して、ＤＮＡの前駆体に対して、ＤＮＡの複製及び修復に対して、並びに染色体のアセンブリ及び維持に対して、広範な損傷を引き起こす可能性が高い。
Ｘ線の線量範囲は、３～４週間などの長期間にわたる５０～２００レントゲンの１日線量から、２０００～６０００レントゲンの単回線量までの範囲である。放射性同位元素の線量範囲は多岐にわたり、同位体の半減期、放出される放射線の強度及び種類、並びに新生物細胞による取り込みに依存する。適切な放射線療法としては、コンフォーマル外部照射療法（５０～１００グレイを４～８週間かけて分割照射）、単発又は分割高線量小線源療法、永続的間質性小線源療法、ストロンチウム８９などの全身性放射性同位元素療法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、放射線療法は、放射線増感剤と共に投与され得る。適切な放射線増感剤としては、エファプロキシラル、エタニダゾール、フルオソール、ミソニダゾール、ニモラゾール、テモポルフィン及びチラパザミンを挙げることができるが、これらに限定されない。
３．３組み合わせ
適切な化学療法剤としては、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブチル、ブスルファン及びニトロソ尿素）、代謝拮抗剤（例えば、５－フルオロウラシル及びテガフールのようなフルオロピリシン、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド及びヒドロキシ尿素などの葉酸代謝拮抗剤）、抗癌剤（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン－Ｃ、ダクチノマイシン及びミトラマイシンのようなアントラサイクリン）、抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビンのようなビンカアルカロイド、並びにパクリタキセル及びドセタキセルのようなタキソイド）、並びにトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド及びテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン及びカンプトテシン）；抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン及びイドキシフェン）、エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド及び酢酸シプロテロン）、ＵＨアンタゴニスト又はＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、リュープロレリン及びブセレリン）、プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール及びエキセメスタンとして）並びに５α－レダクターゼの阻害剤（例えば、フィナステリド）；癌細胞浸潤を阻害する薬剤（例えば、マリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤及びウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤）；成長因子機能の阻害剤、例えば、成長因子抗体、成長因子受容体抗体（例えば、抗ｅｒｂｂ２抗体トラスツズマブ［ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）］及び抗ｅｒｂｂ１抗体セツキシマブ［Ｃ２２５］）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤及びセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮増殖因子ファミリーの他の阻害剤（例えば、Ｎ－（３－クロロ－４－フルオロフェニル）－７－メトキシ－６－（３－モルホリノプロポキシ）キナゾリン－４－アミン（ゲフィチニブ、ＡＺＤ１８３９）、Ｎ－（３－エチニルフェニル）－６，７－ビス（２－メトキシエトキシ）キナゾリン－４－アミンエルロチニブ、ＯＳＩ－７７４）及び６－アクリルアミド－Ｎ－（３－クロロ－４－フルオロフェニル）－７－（３－モルホリノプロポキシ）キナゾリン－４－アミン（Ｃｌ １０３３）などの他のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤）、例えば、血小板由来成長因子ファミリーの阻害剤及び例えば、肝細胞成長因子ファミリーの阻害剤；抗血管新生剤、例えば、血管内皮成長因子の効果を阻害するもの（例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ［ＡＶＡＳＴＩＮ（商標）］、国際公開第９７／２２５９６号、同第９７／３００３５号、同第ＷＯ９７／３２８５６号及び同第９８／１３３５４号に開示されているものなどの化合物）並びに他の機構によって作用する化合物（例えば、リノミド、インテグリンａｎｂ３機能の阻害剤及びアンジオスタチン）；サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えばパルボシジブ、アベマシジブ、リボジブ及びアルボジブ；血管損傷剤、例えばコンブレタスタチンＡ４並びに国際公開第９９／０２１６６号、同第ＷＯ００／４０５２９号、同第ＷＯ００／４１６６９号、同第ＷＯ０１／９２２２４号、同第ＷＯ０２／０４４３４号及び同第ＷＯ０２／０８２１３号に開示されている化合物；アンチセンス療法、例えば、抗ｒａｓアンチセンスであるＩＳＩＳ ２５０３などの上記に列挙した標的を対象とするもの；並びに例えば、異常ｐ５３などの異常遺伝子を置換するアプローチ又はシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ又は細菌ニトロレダクターゼ酵素などの異常ＧＤＥＰＴ（遺伝子指向型酵素プロ薬物療法）アプローチ及び多剤耐性遺伝子療法などの化学療法又は放射線療法に対する患者の耐性を高めるアプローチを含む、抗増殖剤／抗腫瘍薬及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
適切な免疫療法アプローチとしては、患者腫瘍細胞の免疫原性を高めるためのエクスビボ及びインビボアプローチ、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４又は顆粒球－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅコロニー刺激因子を含むサイトカインによるトランスフェクション；Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ；サイトカインでトランスフェクトされた樹状細胞などのトランスフェクトされた免疫細胞を使用するアプローチ；サイトカインをトランスフェクトした腫瘍細胞株を用いるアプローチ；及び抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチを挙げることができるが、これらに限定されない。これらのアプローチは、一般に、癌細胞を標的化し、破壊するための免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。免疫エフェクターは、例えば、悪性細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で治療のエフェクターとして機能し得るか、又は他の細胞を動員して実際に細胞死滅を促進し得る。抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲート化され得、そして単に標的化剤として作用し得る。あるいは、エフェクターは、悪性細胞標的と直接又は間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクターは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含むがこれに限定されない、ＰＤ－Ｌ１を標的とする分子であり、その非限定的な例としては、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ－９３５５５９、国際公開第２０１３／１７３２２３号、同第２０１３／０７９１７４号、同第２０１０／０７７６３４号、同第２０１１／０６６３８９号、同第２０１０／０３６９５９号、同第２００７／００５８７４号、同第２００４／００４７７１号、同第２００６／１３３３９６号、同第２０１３／１８１６３４号、同第２０１２／１４５４９３号、及び中国特許公開番号１０１１０４６４０号に記載の抗体、クローンＥＨ１２、及びクローン２９Ｅ．２Ａ３；ＣＡ－１７０；ＣＡ－３２７；ＢＭＳ－２０２（Ｎ－［２－［［［２－メトキシ－６－［（２－メチル［１，１’－ビフェニル］－３－イル）メトキシ］－３－ピリジニル］メチル］アミノ］エチル］－アセトアミド）；ＢＭＳ－８（１－［［３－ブロモ－４－［（２－メチル［１，１’－ビフェニル］－３－イル）メトキシ］フェニル］メチル］－２－ピペリシンカルボン酸）；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ，５４（４０）：１１７６０－１１７６４に記載されるペプチド、特に（Ｄ）ＰＰＡ－１；ＡＵＮＰ－１２；及び国際公開第２０１４／１５１６３４号に記載されているペプチド（その内容全体が参照により組み込まれる）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクターは、抗ＰＤ－１抗体を含むがこれに限定されない、ＰＤ－１を標的とする分子であり、その非限定的な例としては、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、ティスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７）、国際公開第２０１６／１０６１５９号、国際公開第２００９／１１４３３５号、国際公開第２００４／００４７７１号、国際公開第２０１３／１７３２２３号、国際公開第２０１５／１１２９００号、国際公開第２００８／１５６７１２号、国際公開第２０１１／１５９８７７号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１０／０８９４１１号、国際公開第２００６／１３３３９６号、国際公開第２０１２／１４５４９３号、国際公開第２００２／０７８７３１号に記載されている抗体、抗マウスＰＤ－１抗体クローンＪ４３、抗マウス抗体クローンＲＭＰ１－１４、ＡＮＢ０１１（ＴＳＲ－０４２）、ＡＭＰ－５１４（ＭＥＤＩ０６８０）、国際公開第２００６／１２１１６８号、国際公開第２００１／０１４５５７号、国際公開第２０１１／１１０６０４号、国際公開第２０１１／１１０６２１号、国際公開第２００４／０７２２８６号、国際公開第２００４／０５６８７５号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１０／０２９４３４号、及び国際公開第２０１３／０２２０９号に記載されている抗体；ＡＭＰ－２２４；国際公開第２０１１／０８２４００号に記載されている化合物；米国特許第６，８０８，７１０号に記載されている分子及び抗体；国際公開第２０１３／０１９９０６号に記載されている分子及び抗体；国際公開第２００３／０１１９１１号に記載されている分子；及び国際公開第２０１３／１３２３１７号に記載されている化合物（それらの内容全体が参照により組み込まれる）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクターは、抗ＰＤ－Ｌ２抗体を含むがこれに限定されない、ＰＤ－Ｌ２を標的とする分子であり、その非限定的な例としては、国際公開第２０１０／０３６９５９号（その内容全体が参照により組み込まれる）に記載される抗体；及びｒＨｉｇＭ１２Ｂ７が挙げられる。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクターは、ＣＴＬＡ－４抗体、例えばイピリムマブ、トレメリムマブ、国際公開第００／３７５０４号、国際公開第０１／１４４２４号、米国特許出願公開第２００３／００８６９３０号に記載されている抗体；及び国際公開第２００６／０５６４６４号に記載されている化合物を含むがこれらに限定されない、ＣＴＬＡ－４を標的とする分子であり、これらの内容全体が参照により組み込まれる。
他の癌療法の例としては、植物療法、凍結療法、毒素療法又はアポトーシス促進療法が挙げられる。当業者は、このリストが癌及び他の過形成性病変に利用可能な治療様式のタイプを網羅していないことを理解するであろう。
化学療法及び放射線療法は、急速に分裂する細胞を標的とし、及び／又は細胞周期若しくは細胞分裂を破壊することが周知である。これらの処置は、いくつかの形態の癌の処置の一部として提供され、治癒的処置によってそれらの進行を遅らせるか、又は疾患の症候を逆転させることを目的とする。しかしながら、これらの癌処置は、免疫不全状態及びそれに続く病原性感染を引き起こす可能性があり、したがって、本発明はまた、式Ｉ、配列番号１、又は本明細書に記載されるバリアントのＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、癌療法、及び癌療法から生じる免疫不全状態から発症するか又は発症するリスクが高い感染に対して有効な抗感染薬を用いる併用療法に及ぶ。抗感染薬は、好適には、ウイルス、細菌、酵母、真菌、原虫などの微生物を死滅させるか、又はその成長を阻害する化合物を含み得るが、これらに限定されず、したがって、抗生物質、殺アメーバ薬、抗真菌薬、抗原虫薬、抗マラリア薬、抗結核薬及び抗ウイルス薬を含む。抗感染薬はまた、その範囲内に駆虫薬及び殺線虫薬を含む。例示的な抗菌剤としては、キノロン（例えば、アミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、フルメキン、ロメフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、オキソリン酸、ペフロキサシン、ロソキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、スパルフロキサシン、ジナフロキサシン、ガチフロキサシン、モキシフロキサシン；ゲミフロキサシン；及びガレノキサシン）、テトラサイクリン、グリシルサイクリン及びオキサゾリジノン（例えば、クロルテトラシジン、デメドシジン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、チゲシジン；リネゾリド、エペレゾリド）、グリコペプチド、アミノグリコシド（例えば、アミカシン、アルベカドン、ブチロシン、ジベカシン、フォルチマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、メノマイシン、ネチルマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン）、β－ラクタム（例えば、イミペネム、メロペネム、ビアペネム、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォニド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフピミゾール、セフピラミド、セフポドキシム、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフゾナム、セファセトリル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セフィネタゾール、セフォキシチン、セフォテタン、アズレオナムカルモナム、フロモキセフ、モキサラクタム、アムジノシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、ベンジルペニシリン、カルフェシリン、ドキサシリン、ジドキサシリン、メチドリン、メズロシリン、ナシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ピペラシリン、スルベニシリンテモシリン、チカルドリン、セフジトレン、ＳＣ００４、ＫＹ－０２０、セフジニル、セフチブテン、ＦＫ－３１２、Ｓ－１０９０、ＣＰ－０４６７、ＢＫ－２１８、ＦＫ－０３７、ＤＱ－２５５６、ＦＫ－５１８、セフォゾプラン、ＭＥ１２２８、ＫＰ－７３６、ＣＰ－６２３２、Ｒｏ ０９－１２２７、ＯＰＣ－２００００、ＬＹ２０６７６３）、リファマイシン、マクロライド（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、ロキタマイシン、ロサラマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン）、ケトライド（例えば、テリスロマイシン、セスロマイシン）、クーママイシン、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン）及びクロラムフェニコールが挙げられる。
例示的な抗ウイルス薬としては、アバカビル硫酸塩、アシクロビルナトリウム、アマンタジン塩酸塩、アンプレナビル、シドフォビル、デラビルジンメシル酸塩、ジダノシン、エファビレンツ、ファムシクロビル、フォミビルセンナトリウム、ホスカルネットナトリウム、ガンシクロビル、インジナビル硫酸塩、ラミブジン／ジドブジン、ネルフィナビルメシル酸塩、ネビラピン、オセルタミビルリン酸塩、リバビリン、リマンタジン塩酸塩、リトナビル、サキナビル、サキナビルメシル酸塩、スタブジン、バラシドビル塩酸塩、ザルシタビン、ザナミビル、及びジドブジンが挙げられる。
適切な殺アメーバ薬又は抗原虫薬としては、アトバクオン、塩酸クロロキン、リン酸クロロキン、メトロニダゾール、塩酸メトロニダゾール及びイセチオン酸ペンタミジンが挙げられるが、これらに限定されない。駆虫薬は、メベンダゾール、ピランテルパモ酸塩、アルベンダゾール、イベルメクチン及びチアベンダゾールから選択される少なくとも１つであり得る。例示的な抗真菌薬は、アムホテリシンＢ、アムホテリシンＢ硫酸コレステリル複合体、アムホテリシンＢ脂質複合体、アムホテリシンＢリポソーム、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビンマイクロサイズ、グリセオフルビンウルトラマイクロサイズ、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ナイスタチン及びテルビナフィン塩酸塩から選択することができる。適切な抗マラリア薬としては、クロロキン塩酸塩、リン酸クロロキン、ドキシサイクリン、ヒドロキシクロロキン硫酸塩、メフロキン塩酸塩、プリマキンリン酸塩、ピリメタミン、及びスルファドキシンを含むピリメタミンが挙げられるが、これらに限定されない。抗結核薬としては、クロファジミン、サイクロセリン、ダプソン、エタンブトール塩酸塩、イソニアジド、ピラジナミド、リファブチン、リファンピン、リファペンチン、及び硫酸ストレプトマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
前述のように、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、投与単位形態において、適切な薬学的に許容され得る担体と有効量で簡便かつ効果的な投与のために配合され得る。いくつかの実施形態において、単位剤形は、本発明の活性ペプチドを約０．２５ｐｇ～約２０００ｍｇの範囲の量で含み得る。本発明の活性ペプチドは、担体１ｍＬ当たり約０．２５ｐｇ～約２０００ｍｇの量で存在し得る。医薬組成物が１つ以上の追加の有効成分を含む実施形態において、投与量は、当該成分の通常の用量及び投与様式を参照して決定される。
４．方法
本発明者らは、式Ｉに対応するアミノ酸配列を含むＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減することを決定した。ＰＤ－Ｌ１のアセチル化部位のアセチル化が細胞内でのその核局在化を増加させることは以前から知られていた。しかしながら、特に、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１中のアセチル化部位に対応するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を低減又は阻害することを見出した。本発明者らは、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞の形成、増殖、維持、ＥＭＴ、ＭＥＴ又は生存率のうちの少なくとも１つを変化させるための方法において有用であり得、癌などの対象におけるＰＤ－Ｌ１核局在化が関与する状態の処置又は予防に有用であると考えた。
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１のアセチル化がポリペプチドの核局在化を増加させることを決定し、したがって、ＰＤ－Ｌ１のアセチル化の阻害がＰＤ－Ｌ１の核局在化も阻害又は低減することが提案される。更に、アセチル化部位に対応するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、核局在化可能なポリペプチドのアセチル化を競合的に阻害し、したがって、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を減少させることが提案される。
より具体的には、本発明者らは、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が、ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドとインポーチンとの間の相互作用を阻害するか、さもなければ破壊することを同定した。インポーチンは、複合体を細胞核内に輸送するためにＰＤ－Ｌ１に結合する核輸送分子である。本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＰＤ－Ｌ１－インポーチン複合体の特異的阻害剤である。いくつかの特に好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、インポーチンと任意の他のポリペプチドとの間の相互作用を有意に阻害又は破壊しない。いくつかの実施形態において、インポーチンは、インポーチンα（例えば、インポーチンα１）である。
したがって、本発明の別の態様では、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減する方法であって、細胞を、式Ｉに対応するアミノ酸配列（例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列）を含むか、それからなる、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体と接触させることを含む方法が提供される。
ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ネイティブな野生型ＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列のアセチル化部位に対応するアミノ酸を含む。ＰＤ－Ｌ１のアセチル化は、一般に、アセチルトランスフェラーゼ；特に、ＧＣＮ５、Ｈａｔｌ、ＡＴＦ－２、Ｔｉｐ６０、ＭＯＺ、ＭＯＲＦ、ＨＢ０１、ｐ３００、ＣＢＰ、ＳＲＣ－１、ＡＣＴＲ、ＴＩＦ－２、ＳＲＣ－３、ＴＡＦ１、ＴＦＩＩＩＣ及び／又はＣＬＯＣＫを含むが、これらに限定されないヒストンアセチルトランスフェラーゼ；特にｐ３００によって行われる。
特定の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のアミノ酸配列は、リシンアセチル化部位（すなわち、リシン残基がアセチル化されているアセチル化部位）；特にＰＤ－Ｌ１リシンアセチル化部位；最も特に、ＰＤ－Ｌ１の残基２５５～２７１に対応する。
ＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７）を配列番号７５に示す。ＰＤ－Ｌ１の残基２５５～２７１に対応するアミノ酸配列は、潜在的なアセチル化部位を含み、リシン２６３上のε－アミノ基がアセチル化されている。残基２５５～２７１は、以下の配列において下線が引かれている。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、式Ｉによって表される単離又は精製されたＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体；具体的には、配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又は本明細書に記載されるバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体である。
本発明の別の態様では、治療のための、又は治療のための医薬品の製造における、本発明の単離又は精製されたＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、特に本明細書に記載される式Ｉ、配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又はバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の使用が提供される。本発明はまた、治療における使用のための、本発明の単離又は精製されたＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、特に、本明細書に記載される式Ｉ、配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又はバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を提供する。
本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞におけるＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減する方法であって、細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体と接触させることを含む方法を提供する。本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞におけるＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減するための、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の使用を企図する。ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞におけるＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減するための、及びかかる使用のための医薬の製造における、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
本発明の更に別の実施形態において、（ｉ）形成（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）ＥＭＴ；（ｖ）ＭＥＴ；又は（ｖｉ）ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞の生存率のうちの少なくとも１つを変化させる方法であって、該細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の形成調節量、増殖調節量、維持調節量、ＥＭＴ調節量、ＭＥＴ調節量又は生存調節量と接触させることを含む、方法が提供される。本発明はまた、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体であって、（ｉ）形成（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）ＥＭＴ；（ｖ）ＭＥＴ；（ｖｉ）ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞の生存率のうちの１つを変化させるための使用を企図する。本発明はまた、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体であって、（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）ＥＭＴ；（ｖ）ＭＥＴ；又は（ｖｉ）ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞の生存率のうちの少なくとも１つを変化させるのに使用するための、及びかかる使用のための医薬の製造における、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体に及ぶ。
上記の態様のいずれか１つのいくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞は、癌幹細胞又は非癌幹細胞腫瘍細胞、特に癌幹細胞腫瘍細胞である。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）維持；（ｉｖ）ＥＭＴ又は（ｖｉ）ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞の生存率の減少、障害、抑止、阻害又は予防をもたらし、及び／又はＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞の（ｖ）ＭＥＴの増強をもたらす。
ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の適切な実施形態は、本明細書に記載されるとおりである。
本明細書に記載されるアセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、特に式Ｉ、配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又はバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＰＤ－Ｌ１の核局在化の阻害に有用である。したがって、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が対象における癌を処置又は予防するのに有用であると考えた。したがって、別の態様では、少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞を含む対象における癌を処置又は予防するための方法であって、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を対象に投与することを含む方法が提供される。本発明はまた、少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞を含む対象における癌を処置又は予防するための、及びこの目的のための医薬の製造における、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の使用にも及ぶ。対象における癌の処置又は予防において使用するためのアセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体であって、癌が少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞を含む、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体も企図される。
癌は、ＰＤ－Ｌ１の過剰発現を伴う任意の癌であり得る。適切な癌としては、乳癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、腎臓癌若しくは脳腫瘍、又は黒色腫若しくは網膜芽細胞腫；特に、乳癌、肺癌又は黒色腫；最も特に、乳癌又は黒色腫；特に乳癌を挙げることができるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、悪性腫瘍、特に転移性癌の症候を処置、予防及び／又は緩和するのに有用である。好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、転移性癌の症候を処置、予防及び／又は緩和するために使用される。適切なタイプの転移性癌としては、転移性乳癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、腎臓癌若しくは脳腫瘍、又は黒色腫若しくは網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、脳癌は骨肉腫である。好ましい実施形態において、転移性癌は、転移性乳癌、肺癌又は黒色腫；特に転移性乳癌又は黒色腫；最も特に転移性乳癌である。
ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞を含む方法において有用である。特定の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞は、乳房、前立腺、精巣、肺、膀胱、膵臓、結腸、黒色腫、白血病、網膜芽細胞腫、肝臓、卵巣、腎臓又は脳細胞；特に乳房、肺又は黒色腫細胞；最も特に乳房細胞又は黒色腫細胞；より特に乳房細胞から選択される。好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞は、乳房上皮細胞、特に乳管上皮細胞である。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞は、癌幹細胞又は非癌幹細胞腫瘍細胞；特に癌幹細胞腫瘍細胞；最も特に乳癌幹細胞腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、癌幹細胞腫瘍細胞は、ＣＤ２４及びＣＤ４４、特にＣＤ４４高、ＣＤ２４低を発現する。
いくつかの実施形態において、本方法は、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を対象に投与する前に、対象から得られた腫瘍サンプル中のＰＤＬ１遺伝子の過剰発現を検出することを更に含み、腫瘍サンプルは、癌幹細胞腫瘍細胞及び任意選択で非癌幹細胞腫瘍細胞を含む。
本明細書に記載されるアセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、癌と診断された個体、癌を有する疑いがある個体、癌に罹患しやすいことが知られており、癌を発症する可能性が高いと考えられる個体、又は以前に処置された癌の再発を発症すると考えられる個体を処置するのに適している。癌は、ホルモン受容体陰性であり得る。いくつかの実施形態において、癌はホルモン受容体陰性であり、したがって、ホルモン療法又は内分泌療法に抵抗性である。癌が乳癌であるいくつかの実施形態において、乳癌はホルモン受容体陰性である。いくつかの実施形態において、乳癌は、エストロゲン受容体陰性及び／又はプロゲステロン受容体陰性である。
本明細書に記載されるアセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体が有用であり得る、ＰＤ－Ｌ１過剰発現を伴う多数の症状が存在する。したがって、本発明の別の態様では、ＰＤ－Ｌ１の核局在化の阻害又は低減が有効な処置に関連する対象における症状を処置又は予防する方法であって、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を対象に投与することを含む方法が提供される。本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１の核局在化の阻害又は低減が有効な治療に関連する対象における症状を処置又は予防するための、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の使用；ＰＤ－Ｌ１の核局在化の阻害又は低減が有効な治療に関連する対象における状態の処置又は予防に使用するための、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体；及びこの目的のための医薬の製造における、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の使用を提供する。
ＰＤ－Ｌ１過剰発現を伴う症状の非限定的な例としては、癌、感染症、自己免疫障害及び呼吸器障害が挙げられる。
いくつかの実施形態において、感染は病原性感染である。感染は、ウイルス、細菌、酵母、真菌、蠕虫又は原虫感染から選択され得るが、これらに限定されない。本発明によって企図されるウイルス感染としては、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、フィロウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルス、ヒトレトロウイルス、サイトメガロウィルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、エボラウイルス、西ナイルウイルス及び呼吸器合胞体ウイルス；特に、ＨＩＶ、肝炎、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス及び呼吸器合胞体ウイルスによって引き起こされる感染が挙げられるが、これらに限定されない。細菌感染としては、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ａｎａｂａｅｎａ種、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ種、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種、Ｂｏｒｒｅｌｌａ種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃｈｌｒｏｒｂｉｕｍ種、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ種、Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ種、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ種、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、Ｕｓｔｅｒｉａ種、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｏｓｃｌｌｌａｔｏｉｌａ種、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ種、Ｐｒｏｔｅｕｓ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ種、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ種、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ種、Ｖｉｂｒｉｏ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種、Ｎｏｃａｒｄｉａ種及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種；特に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種によって引き起こされる感染が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に包含される原虫感染としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ種、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ種及びＧｉａｒｄｉａ種によって引き起こされるものが挙げられるが、これらに限定されない。蠕虫感染としては、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ種によって引き起こされるものを挙げることができるが、これらに限定されない。本発明によって企図される真菌感染としては、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ種及びＣａｎｄｉｄａ種によって引き起こされるものが挙げられるが、これらに限定されない。
適切な自己免疫障害としては、自己免疫リウマチ障害（例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びループス腎炎などの狼瘡、多発性筋炎－皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群及び乾癬性関節炎など）、自己免疫胃腸及び肝臓障害（例えば、炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎及びセリアック病など）、血管炎（例えば、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）陰性血管炎及びＡＮＣＡ関連血管炎（Ｃｈｕｒｇ－Ｓｔｒａｕｓｓ血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎などを含む）、自己免疫性神経疾患（例えば、多発性硬化症、オプソクローヌスミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、自己免疫性多発神経炎など）、腎障害（例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びベルガー病など）、自己免疫性皮膚疾患（乾癬、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ／ｈｉｖｅｓ）、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡及び皮膚エリテマトーデスなど）、血液障害（血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、自己免疫性溶血性貧血など）、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患（例えば、内耳疾患及び難聴など）、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植、並びに自己免疫性内分泌疾患（例えば、糖尿病関連自己免疫疾患、例えばＩ型糖尿病性、アジソン病及び自己免疫性甲状腺疾患（例えば、バセドウ病及び甲状腺炎など）が挙げられるが、これらに限定されない。
適切な呼吸器疾患としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＲＤ）又は喘息、特にアレルギー性喘息が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本方法は、本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を対象に投与する前に、対象から得られた腫瘍サンプル中のＰＤ－Ｌ１遺伝子の過剰発現を検出することを更に含み、腫瘍サンプルは、癌幹細胞腫瘍細胞及び任意選択で非癌幹細胞腫瘍細胞を含む。
特定の実施形態において、上記の方法のいずれか１つは、追加の癌療法及び／又は抗感染薬、特に追加の癌療法などの、上記のセクション３．３に記載される１つ以上の更なる活性薬剤の投与を含む。
本発明のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、特に、本明細書に記載される式１、配列番号１のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又はバリアントＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、ＰＤ－Ｌ１のアセチル化を阻害又は低減するのに有用である。いくつかの実施形態において、アセチル化は、アセチルトランスフェラーゼ；特に、ヒストンアセチルトランスフェラーゼによって触媒される。いくつかの実施形態において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ＧＣＮ５、Ｈａｔｌ、ＡＴＦ－２、Ｔｉｐ６０、ＭＯＺ、ＭＯＲＦ、ＨＢＯ１、ｐ３００、ＣＢＰ、ＳＲＣ－１、ＡＣＴＲ、ＴＩＦ－２、ＳＲＣ－３、ＴＡＦ１、ＴＦＩＩＩＣ及び／又はＣＬＯＣＫ；特にｐ３００である。
したがって、本発明の更なる態様では、対象におけるアセチルトランスフェラーゼの触媒活性を阻害する方法であって、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を投与することを含む方法が提供され、その実施形態は本明細書に記載されている。本発明はまた、対象におけるアセチルトランスフェラーゼの触媒活性を阻害するための本明細書に記載されるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の使用、及び対象におけるアセチルトランスフェラーゼの触媒活性を阻害する際に使用するための本明細書に記載されるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体に及ぶ。好ましい実施形態において、アセチルトランスフェラーゼはヒストンアセチルトランスフェラーゼであり、その実施形態は上に記載されている。
本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を産生する方法であって、ＰＤ－Ｌ１のアセチル化部位のアセチル化が、細胞におけるその核局在化を増加させる方法であって、該方法は、
ａ）細胞を、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体と接触させること、及びｂ）ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の不存在下での核局在化の正常レベル又は参照レベルに対して、細胞における核局在化可能なポリペプチドの核局在化の低減又は阻害を検出することを含む。
本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を産生する方法であって、ＰＤ－Ｌ１とインポーチン（例えば、インポーチンα）との結合が、細胞におけるその核局在化を増加させる方法であって、該方法は、
ａ）細胞を、ＰＤ－Ｌ１アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体と接触させること、及び
ｂ）ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の不存在下でのインポーチンへのＰＤ－Ｌ１の結合の正常レベル又は参照レベルに対して、細胞におけるインポーチン（例えば、インポーチンα）へのＰＤ－Ｌ１の結合の低減又は阻害を検出することを含む。
別の態様では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を産生する方法であって、ＰＤ－Ｌ１のアセチル化部位のアセチル化が細胞におけるその核局在化を増加させる方法であって、該方法は、
ａ）細胞を、式Ｉに示されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体と接触させること、及び
ｂ）ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の不存在下での核局在化の正常レベル又は参照レベルに対して、細胞における核局在化可能なポリペプチドの核局在化の低減又は阻害を検出することを含む。
本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１の核局在化を阻害又は低減するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を産生する方法であって、ＰＤ－Ｌ１とインポーチン（例えば、インポーチンα）との結合が、細胞におけるその核局在化を増加させる方法であって、該方法は、
ａ）細胞を、式Ｉに従ったアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体と接触させること、及び
ｂ）ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の非存在下でのインポーチンへのＰＤ－Ｌ１の結合の正常レベル又は参照レベルに対して、細胞におけるインポーチン（例えば、インポーチンα）へのＰＤ－Ｌ１の結合の低減又は阻害を検出することを含む。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、少なくとも３つのシステイン残基の付加によってネイティブな野生型ＰＤ－Ｌ１配列（例えば、ネイティブなＰＤ－Ｌ１ ＮＬＳ）と区別される。
ＰＤ－Ｌ１の核局在化の低減又は阻害は、当該技術分野における標準的な技術を使用して決定されてもよく、その非限定的な例としては、免疫蛍光、免疫組織化学染色、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、クロマチンアクセシビリティアッセイ、例えば、ＤＮａｓｅ－ｓｅｑ、ＦＡＩＲＥ－ｓｅｑ及びＡＴＡＣ－ｓｅｑアッセイ、例えば、Ｓａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉ Ｒｅｐ，６：２８９１０；Ｂａｊｅｔｔｏ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，５（３）：２７３－２８１；及びＳｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，１４：９５１に記載されているものが挙げられ、それらの内容全体は参照により組み込まれる。
更に別の態様では、癌細胞（例えば、癌幹細胞）の形成、増殖、生存率又はＥＭＴのうちの少なくとも１つを阻害又は低減するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を産生する方法が提供され、該方法は、
ａ）癌幹細胞を、式Ｉに示されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になるＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体と接触させること、及び
ｂ）ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体の不存在下での細胞の形成、増殖、生存率又はＥＭＴの正常レベル又は参照レベルに対して、癌幹細胞の形成、増殖又はＥＭＴの低減又は阻害を検出することを含む。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、少なくとも３つのシステイン残基の付加によってＰＤ－Ｌ１（例えば、ＰＤ－Ｌ１ ＮＬＳ）と区別される。
ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体のアミノ酸配列は、天然の、設計された、又は合成のアセチル化部位に対応し得る。いくつかの実施形態において、アセチル化部位は、ＰＤ－Ｌ１の部位である。適切なアセチル化部位は、本明細書で先に記載したとおりである。他の実施形態において、アセチル化部位に対応するアミノ酸配列は、ＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列以外である。
設計されたアセチル化部位に対応するアミノ酸配列を有するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、当該技術分野で標準的な医薬品化学技術を使用して同定することができる。
ポリペプチドのアセチル化部位は、Ｈａｋｅ及びＪａｎｚｅｎ（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９８１；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｒｆ Ｒｅｐ，４：５７６５；Ｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９（２）：ｅ８９５７５；及びＷｕｙｕｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１１（５）：ｅ０１５５３７０（それらの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどの計算方法を用いて同定することができるか、又は、例えば、アセチル化リシンなどのアセチル化アミノ酸残基に対する抗体を使用するアセチル化レベルの検出と組み合わせて、例えば、予測される残基の突然変異誘発を使用して実験的に決定され得る。周囲及び／又は近位残基の関与は、当該技術分野で標準的な医薬品化学技術を使用して決定され得る。
当業者は、ＰＤ－Ｌ１などのポリペプチドの核局在化を評価するため、及びポリペプチドの核局在化を阻害又は低減するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を同定するために使用される適切なアッセイを十分に認識しているであろう。本発明による活性薬剤のスクリーニングは、任意の適切な方法によって達成することができる。例えば、この方法は、目的のポリペプチド（例えば、ＰＤ－Ｌ１）をコードする遺伝子に対応するポリヌクレオチドを発現する細胞を、阻害活性を有することが疑われる薬剤と接触させること、及び細胞の核における目的のポリペプチドのレベルの阻害又は減少についてスクリーニングすることを含み得る。
あるいは、目的のポリペプチドの機能的活性の阻害若しくはポリヌクレオチドによってコードされる転写物のレベルの低下、又はポリペプチド若しくは転写物の下流の細胞標的の活性若しくは発現の阻害をスクリーニングすることができ、ここで、その活性は、ＰＤ－Ｌ１の核局在化に関連する。かかる阻害の検出は、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫染色、スロット又はドットブロットアッセイ、シンチレーション近接アッセイ、フルオレセイン若しくはローダミンなどの蛍光物質の抗原結合分子コンジュゲート又は抗原コンジュゲートを使用する蛍光イムノアッセイ、ＲＩＡ、オクタロニー二重免疫拡散分析、アビジン－ビオチン若しくはストレプトアビジン－ビオチン検出系を用いるイムノアッセイ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を含む核酸検出アッセイ、ＷＳＴ－１増殖アッセイなどの細胞増殖アッセイ、及びＰＤ－Ｌ１ハーフウェイＣｈＩＰで処理された細胞の免疫ブロット分析を含むがこれらに限定されない技術を利用して達成され得る。ポリペプチドのアセチル化は、アセチル化ポリペプチドに対する抗体、例えばアセチル化リシン残基に対する抗体を用いて決定され得る。
ＰＤ－Ｌ１が調節又は発現されるポリヌクレオチドは、試験の対象である細胞に天然に存在し得るか、又は試験の目的のために宿主細胞に導入され得ることが理解されるであろう。
アセチラーゼの触媒活性の阻害は、当該技術分野で標準的な技術を使用して決定され得る。例えば、アセチルトランスフェラーゼの阻害は、Ａｂｃａｍからのアセチルトランスフェラーゼ活性アッセイキット（カタログ番号ａｂ２０４５３６）、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のｐ３００蛍光発生アッセイキット（カタログ番号５００９２）、又はＡｂｃａｍ社製のｐ３００阻害剤スクリーニングアッセイキット（蛍光測定）（カタログ番号ａｂｌ９６９９６）；Ａｂｃａｍ社製のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性アッセイキット（カタログ番号ａｂ６５３５２）などの比色アッセイ；又はＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のｐ３００化学発光アッセイキット（カタログ番号５００７７）などの化学発光アッセイを使用して評価することができる。
これらの方法は、合成ライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、化学ライブラリー及び天然ライブラリーを含むタンパク質性薬剤などの推定上の調節薬剤のハイスループットスクリーニングを行うための機構を提供する。
活性分子は、最も強力なインビボ効果を有する分子を同定するために、動物モデルにおいて更に試験され得る。これらの分子は、例えば、化合物を連続修飾、分子モデリング、及び合理的薬物設計において使用される他の慣用的手順に供することによって、医薬品の更なる開発のためのリード分子として役立ち得る。
５．キット
本発明の他の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体及び抗癌スプレーを含む治療キットが提供される。いくつかの実施形態において、治療キットは、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体及び抗癌剤を同時に投与して、癌を有する個体においてＴ細胞機能不全障害を処置するため、又は免疫機能（例えば、免疫エフェクター機能、Ｔ細胞機能などを増強するため、又は癌の進行を処置若しくは遅延させるため、又は個体において感染症を処置するための説明資料を含む添付文書を更に含む。いくつかの実施形態において、抗癌剤は、化学療法剤を含む（例えば、急速に分裂する細胞を標的とし、及び／又は細胞周期若しくは細胞分裂を破壊する薬剤であり、その代表例にはタキサンなどの細胞毒性化合物が含まれる）。
いくつかの実施形態において、ＬＳＤ阻害剤、ＰＤ－１結合アンタゴニスト及び任意選択で、化学療法剤は、同じ容器又は別々の容器中にある。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグ及びシリンジが挙げられる。容器は、ガラス、プラスチック（ポリ塩化ビニル若しくはポリオレフィンなど）、又は金属合金（ステンレス鋼若しくはハステロイなど）などの様々な材料から形成することができる。いくつかの実施形態において、容器は製剤を保持し、容器上の又は容器に付随するラベルは、使用のための指示を示し得る。キットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用のための説明資料を含む添付文書を含む、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、他の薬剤（例えば、化学療法剤、及び抗新生物剤）のうちの１つ以上を更に含む。１つ以上の薬剤のための容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグ及びシリンジが挙げられる。
本発明の他の実施形態において、バイオマーカーの検出及び／又は定量化を可能にする試薬を含む、本明細書に開示されるＴ細胞機能バイオマーカーを含むバイオマーカーの発現を決定するための診断キットが提供される。かかる試薬には、例えば、バイオマーカーの定量を可能にする化合物若しくは材料、又は化合物若しくは材料のセットが含まれる。特定の実施形態において、化合物、材料又は化合物若しくは材料のセットは、ＲＮＡ材料の抽出、対応するＲＮＡのレベルの決定など、対応するｃＤＮＡの合成のためのプライマー、ＤＮＡの増幅のためのプライマー、及び／又は遺伝子によってコードされるＲＮＡ（又は対応するｃＤＮＡ）と特異的にハイブリダイズすることができるプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、近接アッセイプローブ、リガーゼ、抗体などを含むがこれらに限定されない、遺伝子（例えば、Ｔ細胞機能バイオマーカー遺伝子）の発現レベルの決定を可能にする。
キットははまた、任意選択で、標識の検出のための適切な試薬、陽性対照及び陰性対照、洗浄溶液、ブロッティング膜、マイクロタイタープレート、希釈緩衝液などを含み得る。例えば、核酸ベースの検出キットは、（ｉ）Ｔ細胞機能バイオマーカーポリヌクレオチド（陽性対照として使用され得る）、（ｉｉ）Ｔ細胞機能バイオマーカーポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプライマー又はプローブを含み得る。増幅に必要な反応混合物を提供するために、様々なポリメラーゼ（用いられる核酸増幅技術に応じた逆転写酵素、Ｔａｑ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、ＤＮＡリガーゼなど）、デオキシヌクレオチド及び緩衝液を含む核酸を増幅するのに適した酵素も含まれ得る。かかるキットはまた、一般に、適切な手段において、個々の試薬及び酵素並びに各プライマー又はプローブ毎に別個の容器を含む。あるいは、タンパク質ベースの検出キットは、（ｉ）Ｔ細胞機能バイオマーカーポリペプチド（陽性対照として使用され得る）、（ｉｉ）Ｔ細胞機能バイオマーカーポリペプチドに特異的に結合する抗体を含み得る。キットはまた、本明細書に記載されるアッセイの１つを行うための様々なデバイス（例えば、１つ以上）及び試薬（例えば、１つ以上）；及び／又はキットを使用してＴ細胞機能バイオマーカー遺伝子の発現を定量化するための印刷された説明書を特徴とし得る。本明細書に記載される試薬は、任意選択で、検出可能な標識と関連していてもよく、実施例又は以下に記載されるアッセイ、例えば、本明細書に記載されるＲＴ－ＰＣＲ又はＱ ＰＣＲ技術と共に使用するように適合されたマイクロ流体カード、チップ又はチャンバ、マイクロアレイ又はキットの形式で提供することができる。
診断キットの構成要素を包装するのに適した材料としては、水晶、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、紙、封筒などを挙げることができる。更に、本発明のキットは、キットに含まれる異なる成分を同時に、連続して、又は別々に使用するための説明資料を含むことができる。説明資料は、印刷物の形態であってもよいし、電子記憶媒体（磁気ディスク、テープなど）、光学媒体（ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ）など、対象が読み取ることができるように指示を記憶することができる電子支持体の形態であってもよい。代替的又は追加的に、媒体は、説明資料を提供するインターネットアドレスを含むことができる。
本発明を容易に理解し、実際に実施することができるように、以下の非限定的な実施例によって特定の好ましい実施形態を説明する。
実施例１．
ＰＤ－Ｌ１核翻訳後修飾を標的とする二環式阻害剤の開発
本発明者は、アラニンウォークを実施して、ＰＤ－Ｌ１のアセチル化／脱メチル化及び核局在化配列内の重要な残基を同定した。アラニンに変異させた場合、転移開始細胞ＭＩＣの数の有効な阻害を５０％超低下させる一連の残基が同定された（表１を参照）。本発明者はまた、アラニンに変異させた場合、対照と比較してＭＩＣ数の有効な阻害を増加させる２つの残基を同定した。最適化された配列に基づいて、３つの環状ペプチド阻害剤を生成した（ＤＬ－１、ＤＬ－２、及びＤＬ－３）。ＤＬ－１及び２は、これらの構築物の両方がＮＬＳモチーフ及び翻訳後修飾（ＰＴＭ）を受ける重要なＫ２６３残基を保存したため前進したが、ＤＬ－３はコアＮＬＳモチーフを破壊し、したがって生存可能であると見なされなかった。ＤＬ－２構築物は、ＮＬＳモチーフのフロントにリンカー残基Ａｌａ－Ｃｙｓを含有し、これにより、コアの重要な残基が二環式ペプチドの３次元構造においてアクセス可能になる（図２Ｂを参照）。ＤＬ－１は、配列の末端にＣｙｓ－Ｇｌｙリンカー残基を有し、これは、二環式ペプチドの３Ｄ構造を根本的に変化させ、フロントエンドの重要な残基及びＮＬＳがアクセスしにくくする。したがって、本発明者らは、ＤＬ－２は機能するはずであるが、ＤＬ－１は、全体的な３Ｄ構造を破壊する配列のＣ末端におけるリンカー領域及び重要なモチーフ／残基へのアクセス可能性のために、ＤＬ－２ほど有効ではない可能性があると仮定した。
材料及び方法
アラニンウォークのためのフローサイトメトリー
ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）を、一連のアラニンウォークペプチド阻害剤で処理した単一細胞懸濁液に対して行った。Ｃ４４、Ｃ２４、ＳＮＡＩＬ、ＡＢＣＢ５、ＣＳＶ、及びＨｏｅｃｈｓｔ色素を含む、転移性始原細胞（ＭＩＣ）シグネチャーを標的とする抗体のアレイで細胞を染色して、細胞生存率を監視した。使用されるＦＡＣＳゲーティング戦略は、転移性及び攻撃的な癌細胞に関連することが示された、治療抵抗性の表現型であるＭＩＣに基づいて細胞を選別する、転移開始細胞（ＭＩＣ）に対する本発明者らのシグネチャーから採用及び改変される。死細胞（Ｈｏｅｃｈｓｔ陰性細胞）を除外するために、フローサイトメトリーゲーティング戦略を常に分析に含めた。フローサイトメトリーによる取得は、ＢＬＳＲ ＩＩを使用して単一細胞懸濁液に対して行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析を行った。
実施例２．
ＰＤ－Ｌ１ ＮＬＳ ＰＴＭモチーフは、癌処置応答性を示す
本発明者らは次に、免疫療法抵抗性及び応答性転移性癌患者を層別化する新規バイオマーカー発見、新規ＰＤ－Ｌ１アセチル化／メチル化バイオマーカーを使用した。多くの細胞シグナル伝達タンパク質が、最近、核遺伝子調節の役割を有すると記載されている。癌の発生及び進行に関与する多くのタンパク質は、異なる転写結果を指令するＰＴＭによって精巧に調節される。以前のデータは、ＰＴＭが免疫及び化学療法に対する耐性を媒介するために免疫チェックポイントタンパク質の活性も制御することを実証している。潜在的な免疫チェックポイント調節因子を同定するために、本発明者らは、以下を有する複数の免疫チェックポイントタンパク質のインシリコスクリーニングを行った：
（ｉ）推定核局在化配列（ＮＬＳ）；及び
（ｉｉ）エピジェネティックベースのＰＴＭシグネチャー。
ＰＤ－Ｌ１モチーフ分析に基づいて、本発明者らは、高スコアＮＬＳ内のリシン２６３における特定のアセチル化／メチル化モチーフを同定した。これらのモチーフを標的とする抗体を用いた細胞染色研究により、免疫抵抗性癌細胞核が濃縮されているＰＤＬ１－ＰＴＭ１（アセチル化）、及び細胞質／細胞表面において免疫応答性癌細胞が濃縮されるＰＤＬ１－ＰＴＭ２（メチル化）の存在が決定された（図２Ａ）。これらの新規なｎＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭバリアントは、本質的に耐性の攻撃的な「ｃｏｌｄ腫瘍」（ＴＮＢＣ及び前立腺癌など）並びに耐性の「ｈｏｔ腫瘍」（黒色腫及び肺癌など）において排他的に濃縮されており、免疫療法応答に関連していた（図２Ｂ）。最近の研究はまた、腫瘍成長及び増殖の制御におけるＰＤ－Ｌ１の核の役割を支持する。
これらのデータに基づいて、本発明者は、免疫療法に応答する可能性が高い免疫療法患者を同定するための液体生検ｎＰＤ－Ｌ１診断バイオマーカーを開発した（図２）。ＰＤ－Ｌ１においてＰＴＭ１（２６３－リシン－アセチル化）及びＰＴＭ２（２６３－リシン－トリメチル化）を標的とする５つの新規なアフィニティー精製抗体が産生された。注目すべきことに、この領域は、市販のＰＤ－Ｌ１診断抗体（例えば、７３－１０、２８－８、ＳＰ１４２、ＣＡＬ－１０）によって標的化されない。標的配列に対する特異性を広範なＥＬＩＳＡアッセイによって確認したところ、ＰＴＭ１（２６３－リシン－アセチル化）又はＰＴＭ２（２６３－リシン－トリメチル化）を標的とするカスタム抗体は非修飾モチーフを検出しないことが示された。加えて、特異的ＰＴＭに対するペプチド模倣体を用いたインビトロペプチドブロッキングアッセイは、本発明者らの対応する新規なＰＤ－Ｌ１標的化抗体を遮断したが、特異的ＰＴＭに対するペプチド模倣体は市販の抗体結合に影響を及ぼさなかった。本発明者らは、ハイスループットスクリーニング（図３Ａ）及び免疫ブロット分析（図３Ｂ）において、本発明者らの誘導性間葉系モデル（ＭＣＦ７）における本発明者らの抗体の特異性を実証した。これらのデータは、ＰＤ－Ｌ１のアセチル化形態が実際に核が偏ったバリアントであることを実証する。
本発明者らのＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１特異的抗体の核局在化を更に確認するために、本発明者らは、ＡＮＤＯＲスピニングディスク超解像顕微鏡を使用して超解像イメージングを行った。このイメージングデータ（図４）は、ＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び誘導性間葉系ＭＣＦ７モデルの両方におけるＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１の核局在化を明確に示す。
実施例３．
ＴＮＢＣ脳転移病変におけるＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３及びＰＤ－Ｌ１－Ａｃ発現
本発明者らはまた、転移性ＴＮＢＣ患者の脳転移病変における核ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１（ＰＤ－Ｌ１－Ａｃ）及び細胞質ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ２（ＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３）の両方の存在を確認した。これらのデータは、治療が困難であり、免疫療法に抵抗性がある患者のコホートである脳転移性疾患を有するＴＮＢＣ患者の処置におけるＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１又はＰＴＭ２の潜在的な治療標的を示す（図５）。加えて、本発明者らはまた、ＴＮＢＣ患者の脳における腫瘍転移性病変内の浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞がＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１（ＰＤ－Ｌ１－Ａｃ）発現について陽性であることを観察した（図６を参照）。これらの結果は、これらのデータが機能不全ＣＤ８＋Ｔ細胞も示し得ることを示す。
要約
ＰＤ－Ｌ１は、様々な翻訳後修飾形態で存在する。本発明者らは、２つの重要なＰＴＭ：リシン２６３でのトリメチル化及びアセチル化を同定した。
アセチル化（Ａｃ）は、主に核ＰＤ－Ｌ１アイソフォーム上で起こり、細胞質発現はほとんどなく、細胞表面発現はない。患者コホートにおける特性評価：免疫療法に抵抗性がある患者及び進行性疾患に主に関連する。
メチル化（Ｍｅ３）は主に細胞質及び細胞表面アイソフォーム上で起こり、核発現はほとんどない。患者コホートにおける特性評価：免疫療法に応答する患者に主に関連する。したがって、ＰＤ－Ｌ１トリメチル化は、効果的な免疫療法のためにＰＤ－Ｌ１を細胞表面に標的化する新たな機会のための手段を提供する。
本発明者らは、この核軸を競合的に標的化することができる二環式阻害剤を開発した。
更に、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１核局在化モチーフが複数の種にわたって保存されており、ＰＤ－Ｌ１に対してユニークであることを決定した。
実施例４．
二環式ペプチド阻害剤の有効性
本発明者らは次に、ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１の核形態を標的とする二環式阻害剤候補の有効性を調べるために、独自のカスタム新規抗体ツールを利用した。最初に、本発明者らは、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、又はその脳癌クローンＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｂｒの増殖に対するＤＬ－１及びＤＬ－２の影響を調べた。驚くべきことに、両方の二環式ペプチド阻害剤（ＤＬ－１及びＤＬ－２）がＴＮＢＣ癌細胞株の増殖を阻害することができたが、ＤＬ－２はＤＬ－１よりも２～３倍高い効力で阻害することができた（図７）。
次に、二環式阻害剤ＤＬ－１又はＤＬ－２で処置した後に、高分解能デジタル病理検査によって、転移負荷の間葉系調節因子及び抵抗性の幹様シグネチャーを調べた（図９）。
分析により、ＤＬ－２は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｂｒ ＴＮＢＣ細胞株の両方において、全ての間葉系幹様耐性タンパク質マーカーを有意に阻できることが明らかになった。これらのデータは、リード二環式ペプチド候補であるＤＬ－２を用いた核ＰＤ－Ｌ１－Ａｃ（ＰＴＭ１）の標的化に関する明確な有効性を実証している。興味深いことに、本発明者らは、ＤＬ－２及び（より少ない程度でＤＬ－１）での処置もまた、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｂｒ ＴＮＢＣ細胞株の両方において上皮マーカーＥ－カドヘリンの発現を誘導できることを見出した（図１０）。
次に、本発明者は、ＤＬ－２がＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３の細胞表面又は細胞質発現を誘導する能力を調べた。ＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３の細胞表面／細胞質発現の誘導はまた、細胞表面ＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３発現の増加が抗ＰＤ－Ｌ１免疫療法の標的を提供することにより、免疫療法応答性シグネチャーとも関連するという仮説が立てられた。これはまた、上記に提示されたデータと一致する。
本発明者らは、最初に、非透過処理細胞におけるＨＤＡＣ２ｉによるＤＬ－２阻害の効果を調べた。この効果は、ＰＤ－Ｌ１の脱アセチル化を防止し、リシン２６３ ＰＴＭ－ＮＬＳモチーフでのＰＤ－Ｌ１のアセチル化を理論的に増加させる（及びＰＤ－Ｌ１のメチル化を減少させる）であろう。高分解能デジタル病理検査を使用して、本発明者らは、ＤＬ－２による処置が細胞表面ＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３の発現の有意な上方制御を誘導することを見出した（図１１）。透過処理された細胞では、ほぼ同一のパターンが見られ、ＤＬ－２は、透過処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において核ＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３の発現を抑止し、細胞質／細胞表面Ｐ－ＤＬ１－Ｍｅ３を有意に上方制御した（図１２）。
要約
本発明者らは、転移性癌を標的とし、その増殖を阻害することができるだけでなく、ＣＳＶ（細胞表面ビメンチン）、ＥＧＦＲ、ＦＯＸＱ １及びＡＢＣＢ５の発現を含む間葉系マーカーの発現を阻害することができる新規な二環式阻害剤ＤＬ－２を同定した。ＤＬ－２はまた、上皮マーカーＥ－カドヘリンの発現を誘導することができた。このデータセットは、ＤＬ－２阻害が、本発明者らの新規な二環式阻害剤を用いてＰＤ－Ｌ１の核軸を標的化することによって、間葉系耐性シグネチャー癌細胞を上皮応答性癌細胞に再プログラムすることができることを示す。これはまた、ＤＬ－２がＰＤ－Ｌ１（Ｐ－ＤＬ１－ＰＴＭ２／ＰＤ－Ｌ１－Ｍｅ３）の細胞表面発現を誘導するので、処置された細胞が一連の併用免疫療法に適しており、細胞表面ＰＤ－Ｌ１の増加が抗ＰＤ－Ｌ１免疫療法が作用する標的を提供することを示す。これは、本発明者らのＴＮＢＣ脳転移データと組み合わせて、核ＰＤＬ１軸を標的化することが、免疫療法に対する抵抗性を無効にし、脳転移疾患の場合などの重度の転移負荷を有する患者に適用され得ることを示す。
実施例５．
以前の研究は、免疫療法に抵抗性の患者が、核に内在化されたＰＤ－Ｌ１の形態を有することを明らかにしている。これらの患者のための代替処置を提供するために、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１が核に入ることを防止する新規な二環式ペプチド模倣体ＤＬ－２を用いて核ＰＤ－Ｌ１を首尾よくかつ特異的に標的化した。
ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ ｓｅｑ）データを、ＤＬ－２処置あり及びなしのヒト乳癌細胞株ＭＣＦ－７から得た。４つの実験群から合計９つのサンプルを以下のように収集した：
・対照（非刺激対照、Ｃｔｒｌ）（ｎ＝３）；
・刺激した（ＰＭＡ刺激対照）（ｎ＝３）；
・ＤＬ－２（ＤＬ－２で処置し、ＰＭＡで刺激した）（ｎ＝３）；
ＤＬ－２処置群については、ＭＣＦ－７細胞を最初にＤＬ－２に曝露し、次いでその後にＰＭＡで刺激した。
このスクリプトの目的は、以下の間の差次的発現分析及び経路分析を行うことである：
・刺激対対照：どの遺伝子がＰＭＡによる刺激によって影響を受けたかを決定する。
・ＤＬ－２対刺激：どの遺伝子がＤＬ－２ ＰＤ－Ｌ２二環式ペプチド模倣体によって影響を受けたかを決定する。
本発明者らは、ＤＬ－２群と刺激対照群との間で差次的に発現される遺伝子を決定した。
刺激群と対照群との間の差次的発現分析
刺激群及び対照群の差次的発現分析の結果、以下の数の差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）が得られた：
・ＦＤＲ＜０．０１及び絶対ｌｏｇＦＣ＞１の２２１９個の遺伝子；
・ＦＤＲ＜０．０５及び絶対ｌｏｇＦＣ＞１の２２２２個の遺伝子；
・ＦＤＲ＜０．０５及び絶対ｌｏｇＦＣ＞０．５８４９６３の４０７２個の遺伝子（ＦＣ１．５）；
・ＦＤＲ＜０．０５及び絶対ｌｏｇＦＣ＞０．３２１９２８の６３８５個の遺伝子（ＦＣ１．２５）；
・ＦＤＲ＜０．０１の８０９６個の遺伝子（ｌｏｇＦＣフィルターなし）；
・ＦＤＲ＜０．０５の８７７９個の遺伝子（ｌｏｇＦＣフィルターなし）。
結果をＦＤＲ＜０．０５のＤＥＧに限定することによって、本発明者らは更に以下のことを解明した：
・ｌｏｇＦＣ＞０．５８４９６３の２１９１個の遺伝子（刺激されたサンプルにおいて上方制御、ＦＣ１．５）；
・ｌｏｇＦＣ＜－０．５８４９６３の１８８１個の遺伝子（刺激されたサンプルにおいて上方制御された、ＦＣ－１．５）。
ＤＬ－２群と刺激群との間の差次的発現分析
ＤＬ－２及び刺激群の差次的発現分析の結果、以下の数の差次的に発現される遺伝子（ＤＥＧ）が得られた。
・ＦＤＲ＜０．０１及び絶対ｌｏｇＦＣ＞１の４８個の遺伝子；
・ＦＤＲ＜０．０５及び絶対ｌｏｇＦＣ＞１の４９個の遺伝子；
・ＦＤＲ＜０．０５及び絶対ｌｏｇＦＣ＞０．５８４９６３の７７９個の遺伝子（ＦＣ１．５）；
・ＦＤＲ＜０．０５及び絶対ｌｏｇＦＣ＞０．３２１９２８の３４３９個の遺伝子（ＦＣ１．２５）；
・ＦＤＲ＜０．０１の６０９４個の遺伝子（ｌｏｇＦＣフィルターなし）；
・ＦＤＲ＜０．０５の７３０５個の遺伝子（ｌｏｇＦＣフィルターなし）。
更に、結果をＦＤＲ＜０．０５のＤＥＧに限定することによって、本発明者らは以下のことを発見した：
・ｌｏｇＦＣ＞０．５８４９６３の３８５個の遺伝子（ＤＬ－２サンプルにおいて上方制御、ＦＣ１．５）；
・ｌｏｇＦＣ＜－０．５８４９６３の３９４個の遺伝子（ＤＬ－２サンプルにおいて下方制御、ＦＣ－１．５）。
これらの結果を以下の表６及び７に示す。
材料及び方法
ＩＦＡ顕微鏡法
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＴＮＢＣ細胞／ＴＮＢＣ脳癌クローン細胞（核ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１を標的とする二環式阻害剤で処理されていないか又は処理されている）におけるＣＤ８、ＣＳＶ、ＥＧＦＲ、ＡＢＣＢ５、ＦＯＸＱ１、市販のＰＤ－Ｌ１－２８－８、核ＰＤ－Ｌ１、細胞質ＰＤＬ１のシグネチャーを調べる。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｂｒ細胞を、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と共に１５分間インキュベートすることによって透過処理し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで遮断し、ロバ抗ウサギＡＦ ４８８、抗マウスＡＦ ５６８、ロバ抗ヤギ６４７で可視化したＣＳＶ（マウス宿主）、ＣＤ８（マウス宿主）、ＥＧＦＲ（ウサギ宿主）、ＡＢＣＢ５（ヤギ宿主）、ＡＬＤＨ１Ａ（ウサギ宿主）、ＮＯＤＡＬ（ヤギ宿主）、核ＰＤＬ１（ウサギ宿主）、細胞質ＰＤ－Ｌ１（ウサギ宿主）のいずれかでプローブした。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。タンパク質標的を、デジタル病理レーザー走査顕微鏡法によって局在化した。ＡＳＩソフトウェアを実行する１００倍油浸レンズを使用するＡＳＩデジタル病理顕微鏡を使用して、単一の０．５μｍ切片を得た。最終画像は、同じ切片の４つの連続画像を平均することによって得た。自動ＡＳＩソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ、カリフォルニア州カールスバッド）を使用してデジタル画像を分析して、平均核蛍光強度（ＮＦＩ）の自動閾値化及びバックグラウンド補正により自動的に分布及び強度を決定し、目的のタンパク質の発現の特異的標的化を可能にした。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用してデジタル画像も分析して、非透過処理細胞の全細胞蛍光又は細胞表面のみの蛍光を決定した。デジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析して、総核蛍光強度（ＴＮＦＩ）、総細胞質蛍光強度（ＴＣＦＩ）のいずれかを決定した。自動閾値化及び細胞核に特異的な関心領域（ＲＯＩ）の手動選択を伴うＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、抗体の各対についてピアソン相関係数（ＰＣＣ）を計算した。ＰＣＣ値の範囲は、－１＝共局在化の逆数、０＝共局在化なし、＋１＝完全な共局在化である。マン・ホイットニーノンパラメトリック検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、データセット間の有意差を決定した。
ＡＮＤＯＲスピニングディスク超解像顕微法
サンプルを、ＡＮＤＯＲスピニングディスク顕微鏡を用いた超解像のために油浸下で撮像するために、ＩＦＡ顕微鏡法に従って調製した。
Ｏｐａｌ組織顕微鏡法
核ＰＤ－Ｌ１－ＰＴＭ１、ＰＴＭ２、ＰＤ－Ｌ１－２８－８、ＣＳＶ（癌細胞マーカー）のシグネチャーを調べるために、自動染色用ＯＰＡＬ染色キット、自動ｂｏｎｄｒｘプラットフォームを製造業者の指示に従って使用した。次いで、タンパク質を据え付け、ＩＦＡ顕微鏡法に記載されるように局在化した。
細胞培養方法
使用した全ての乳癌細胞株は、ＡＴＣＣから供給された。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＭＤＢ－ＭＢ－２３１－Ｂｒ細胞株を維持し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、及び１％ＰＳＮを補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ＭＣＦ－７細胞を、１．２９ｎｇ／ｍＬホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）又は５ｎｇ／ｍｌ組換えＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で６０時間刺激した。阻害剤研究のために、２×１０５細胞を、６ウェルプレート中の２ｍＬ完全培地に播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞を、核軸ＰＤ－Ｌ１、ＨＤＡＣ２ｉ又はビヒクル対照を標的とするＰＤ－Ｌ１二環式ペプチドで処理した。ｑＰＣＲ分析のために、各時点で、接着細胞をトリプシン処理し、洗浄し、細胞ペレットを更なる処理まで－８０℃で保存した。顕微鏡研究のために、４×１０４細胞をカバースリップ上に播種し、上記のように阻害剤で処理した。各時点で、カバースリップを洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定し、加工するまで４℃で保存した。ｑＰＣＲのために、細胞を１ｍＬのトリ試薬（Ｓｉｇｍａ）中で溶解させ、顕一方で、微鏡研究のために、細胞を３．７％ホルムアルデヒド中で固定し、トリプシン処理及び細胞剥離によって収集した。
ＷＳＴ－１法
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４×１０３細胞／ウェルで９６ウェル平底組織培養プレートに最終体積１００μｌで播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間接着させた。次いで、細胞を、最終濃度２００、１００、５０、２５、１２．５又は６．２５μＭの阻害剤で７２時間処理した。阻害後、培地を除去し、１：１０最終希釈の１００μＬ／ウェルのＷＳＴ－１細胞増殖試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１１６４４８０７００１）と交換した。吸光度を、マイクロプレート分光光度計（３０秒の混合時間）を使用して、１、２、３、及び４時間のインキュベーション期間に４５０ｎｍで記録した。データは、三連で行われた単一の独立した実験を表し、結果は、平均＋／－標準誤差（ＳＥ）としてグラフ化する。
ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー調製：ＴｒｕＳＥＱ鎖ｍＲＮＡ（ポリＡ捕捉）
ＲＮＡ－ｓｅｑデータを生成し、ｆａｓｔｑデータをＱＩＭＲ Ｂｅｒｇｈｏｆｅｒサーバにダウンロードし、次いでＳｃｏｔｔ ＷｏｏｄによってＨＳＭにアーカイブした。配列リードを、Ｃｕｔａｄａｐｔ（バージョン１．９；Ｍａｒｔｉｎ（２０１１））を用いてアダプター配列をトリミングし、ＳＴＡＲ（バージョン２．５．２ａ；Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３））を用いてアラインメントし、Ｅｎｓｅｍｂｌ（リリース７０）遺伝子モデルの遺伝子、転写物、及びエキソンの特徴を有するＧＲＣｈ３７アセンブリにした。品質管理測定基準は、ＲＮＡ－ＳｅＱＣ（バージョン１．１．８；ＤｅＬｕｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１２））を用いて計算し、発現はＲＳＥＭ（バージョン１．２．３０；Ｌｉ及びＤｅｗｅｙ（２０１１））を用いて評価した。
品質管理
ＲＮＡ－ｓｅｑサンプルの品質管理は、品質及び再現性のある分析結果を保証するための重要なステップである。この目的のためにＲＮＡ－ＳｅＱＣを実行した。
データ正規化
正規化の目的は、系統的な技術的効果に基づいてサンプル間の差を除去して、これらの技術的バイアスが結果に対して最小の影響を有することを保証することである。配列決定された最初のＲＮＡ量の差は、配列決定されたリードの数に影響を及ぼすので、ライブラリーサイズは、補正するのに重要である。ＲＮＡ配列組成における差異は、ＲＮＡが他のサンプルと比較して１つのサンプルにおいて過剰提示される場合に生じる。これらのサンプルにおいて、他のＲＮＡはアンダーサンプリングされ、これは、差次的に発現される遺伝子を予測する場合、偽陽性率がより高くなる。
正規化方法
本発明者らの分析において、本発明者らは、各サンプルの遺伝子数をマッピングされた百万個のリードで割ることによってライブラリーサイズを補正した。この手順は、１００万分の１カウント（ＣＰＭ）として知られる一般的な手法である。本発明者らは更に、Ｍ値のトリム平均（ＴＭＭ）と呼ばれる、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＯｓｈｌａｃｋ（２０１０ａ）によって提案された方法を使用して、ＲＮＡ組成の差異を補正した。本発明者らは、ｅｄｇｅＲパッケージ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、ＭｃＣａｒｔｈｙ及びＳｍｙｔｈ（２０１０ｂ））からの関数ｃａｌｃＮｏｒｍＦａｃｔｏｒｓ（）を使用してＴＭＭ因子を得て、これらを使用してＲＮＡ組成の差異を補正した。
主成分分析
主成分分析（ＰＣＡ）は、元の、しばしば相関する変数（ここではリードカウント）を主成分（ＰＣ）と呼ばれる独立した（相関しない）変数のセットに分解する次元削減方法である。第１のＰＣは、可能な限り多くの変動を占め、第２のＰＣは、第１のＰＣから独立しており、データの２番目に大きな変動を占める。残りのＰＣについても同様である。関数ｐｒｃｏｍｐ（）からのＰＣＡ実装を使用した。ＰＣＡ分析を実施して、データにおける分散の主な原因を特定する。理想的には、実験的グループ分けによってクラスタ化されたサンプルを見たい。タンパク質コード遺伝子の抽出は、その後の分析のために１７３２９個を残す。＞２個のサンプルにおいて＞５個のＣＰＭを有する遺伝子のみを保持した後、本発明者らは、分析のために１０７３３個の遺伝子を残した。
差次的発現分析
差次的発現を、ＲパッケージｅｄｇｅＲ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、ＭｃＣａｒｔｈｙ及びＳｍｙｔｈ（２０１０ｂ））を使用して行った。ｅｄｇｅＲは内部で正規化（ライブラリーサイズ及びＲＮＡ組成）を行うので、ＤＥ分析のための入力は、フィルタリングされたが正規化されていないリードカウントであることに留意されたい。ｇｌｍＱＬＦｉｔ（）関数を使用して、各遺伝子についてのリードカウントに準尤度負の二項一般化対数線形モデルを当てはめた。ｇｌｍＱＬＦＴｅｓｔ（）関数を使用して、本発明者らは、所与のコントラストについて遺伝子毎の経験的ベイズ準尤度Ｆ検定を行った。ｅｄｇｅＲユーザーガイドに従って、「準尤度法は、分散推定における不確実性を説明することによってより厳密なエラーレート制御を与えるので、バルクＲＮＡ－ｓｅｑデータの差次的発現解析［対尤度比検定］に非常に推奨される」。
実施例５．
ＰＤＬ１及びインポーチン作用機序
上に提示されたデータは、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１が免疫療法抵抗性癌の核に主に位置するのに対して、ＰＤＬ１－ＰＴＭ２は免疫療法に応答性の癌の細胞質に局在することを明確に実証している。ＰＤＬ１－ＰＴＭ１（すなわちアセチル化）及びＰＤＬ１－ＰＴＭ２（すなわちメチル化）の作用機序を更に確認するために、本発明者らは、構造モデリングを実施して、ＰＤ１及びインポーチン核機構との相互作用に対するこれらのＰＴＭの可能性を確立した。３Ａは、癌の進行又は免疫療法に対する応答のいずれかにおけるＰＤＬ１ ＰＴＭ形態の作用機序を示す。この構造分析は、ＰＤＬ１のメチル化（ＰＤＬ１－ＰＴＭ２）が、免疫療法と同様に作用するＰＤ１とＰＤＬ１との間の相互作用を妨げることを示す。構造分析はまた、リシン２６３位におけるこのＮＬＳモチーフのメチル化がインポーチン経路との相互作用を阻害するのに対して、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１は進行性又は免疫療法抵抗性癌の核において濃縮されることを明らかにした。
本発明者は、インポーチン経路への干渉を介してＰＤＬ１の核移行を阻害するためにＤＬ－２を設計した。ＰＤＬ１－ＰＴＭ１とインポーチン－α（ＩＭＰα）との共局在化（ＰＣＣ）を監視することによる、ＴＮＢＣヒト癌細胞株におけるＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との相互作用に干渉するＤＬ－２の能力。ＤＬ－２は、アッセイ終了時に最大９６時間まで、ＰＣＣ又はＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との共局在化の程度を有意に損なうことができた（図１４Ａ）。ＩＭＰα１の核発現に対するＤＬ－２の有意な効果は観察されなかった（図１４Ａ参照）。これは、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との相互作用に特異的であったことを示している。
これらのデータが、ＤＬ－２がＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との共局在化を首尾よく阻害することを示すことを考慮して、本発明者らは、密接に相互作用するタンパク質を検出するＤＵＯＬＩＮＫ分析を用いて、この複合体の阻害を確認した。驚くべきことに、ＤＬ－２は、ＰＤＬ１とＩＭＰα１との複合体を用量依存的に排除することができ、この複合体及びその後の核ＰＤＬ１－ＰＴＭ１に有意に影響を及ぼす（図１４Ｂ）。
したがって、本発明者らは次に、ネイティブな直鎖状アイソフォームに対する二環式ペプチド構造の重要性を確立しようとした。驚くべきことに、ＤＬ－２は、ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株ＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との複合体を無効にすることができた（転移性、免疫療法抵抗性）。ＤＬ－２とのインキュベーションは、複合体に有意に影響を及ぼし、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との相互作用を減少させる（図１５）。逆に、直鎖状ペプチドアイソフォーム（「ＰＤＬ１－Ｌ１」、配列については表１０を参照）は、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との複合体を有意に防止することができなかった。
本発明者らは次に、ヒトＣＴ２６細胞株（免疫療法応答性細胞）においてＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との複合体に干渉するＤＬ－２二環式ペプチドの能力を評価した（図１６）。ＤＬ－２二環式ペプチドは、ＣＴ２６免疫療法応答性細胞株においてＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との複合体を首尾よく無効にすることができ、この複合体に有意に影響を及ぼし、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との相互作用を減少させる。
これらのデータが、ＤＬ－２がＰＤＬ１－ＰＴＭ１／ＩＭＰα１を首尾よく阻害することを強く証明していることを考慮して、本発明者は次に、非修飾ＰＤＬ１とＩＭＰα１との間の相互作用を阻害するＤＬ－２の能力を調査した。ＤＬ－２は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においてＰＤＬ１（非修飾）とＩＭＰα１との複合体を無効にすることができ、この複合体に有意に影響を及ぼし、ＰＤＬ１－ＡｃとＩＭＰα１との相互作用を減少させる（図１７）。この場合も、直鎖状ＰＤＬ１ペプチドアイソフォーム阻害剤は、この複合体を有意に阻害することができなかった。
本発明者らは次に、図１７と同様に、ヒトＣＴ２６細胞株（免疫療法応答性細胞）において二環式ペプチドＤＬ－２がＰＤＬ１（非修飾）とＩＭＰａ１との複合体に干渉する能力を評価した。ＤＬ－２は、ＣＴ２６細胞においてＰＤＬ１（非修飾）とＩＭＰα１との複合体を無効にすることができ、この複合体に有意に影響を及ぼし、ＰＤＬ１とＩＭＰα１との相互作用を減少させる（図１８）。
これらの結果は、ＤＬ－２が、ＰＤＬ１とインポーチン経路との間の相互作用を遮断することによって、ＰＤＬ１の核移行を首尾よく阻害できることを実証している。これらのデータに基づいて、本発明者は、ＰＤＬ１、ＰＤＬ１－ＰＴＭ２の細胞質に偏ったＰＴＭに対するＰＤＬ１の核軸の遮断の効果を調査した。細胞質画分におけるＰＤＬ１－ＰＴＭ２の濃縮は、免疫療法に応答する癌に類似しており、上記の本発明者らの構造分析は、この形態がインポーチン経路において、及びそのリガンドＰＤ１により効率が低下していることを裏付けている（図１９）。ＤＬ－２は、間葉系マーカーのＣＳＶを阻害すること、ＰＤＬ１－ＰＴＭ２（ＰＤＬ１－Ｍｅ３）の細胞質発現の増加を誘導することの両方が可能であった。直鎖状ＰＤＬ１ペプチドは、はるかに低い有意性でＣＳＶの発現を減少させることができ、ＰＤＬ１－ＰＴＭ２のいかなる発明の増加も誘導することができなかった。
次いで、本発明者は、ＰＤＬ１を標的とするためのＤＬ－２の特異性を評価することを検討した。したがって、ＤＬ－２がＰＤＬ２とインポーチン経路との相互作用に干渉することができるかどうかを調査した。驚くべきことに、ＤＬ－２はＰＤＬ２に対して有意な効果を有しなかった：ＩＭＰα１は任意の濃度で複合体化し、その標的ＰＤＬ１／ＰＤＬ１－ＰＴＭ１に対するＤＬ－２の特異性及びＩＭＰα１との相互作用を実証する（図２０）。
図２０からのデータに基づいて、本発明者は、核ＰＤＬ２の発現に対するＤＬ－２の効果を調べることによって、ＤＬ－２の特異性を更に確認しようとした。ＤＬ－２は、ＰＤＬ２の核発現に全く影響を及ぼさなかった（図２１）。
ＤＬ－２の特異性を更に調査するために、本発明者らは、一連の核関連タンパク質に対するＤＬ－２の効果を調査した。分析した核タンパク質のいずれに対しても、ＤＬ－２によるオフターゲット効果は観察されなかった（図２１）。これは、ＤＬ－２がＰＤＬ１／ＰＤＬ１－ＰＴＭ１及びＩＭＰα１とのその相互作用のみに特異的であり、オフターゲット効果は実証されなかったことを実証する明確な証拠を提供する。
材料及び方法
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の決定
全てのデータ削減及び統合は、ｉＭｏｓｆｌｍ９３を使用し、Ａｉｍｌｅｓｓ９４でのマージ及びスケーリングにより行った。ＰｈａｓｅｒＭＲ９５における分子置換、検索モデル９０を用いて構造を構築し、Ｃｏｏｔ９６における手動構築及びＰｈｅｎｉｘ９７，９８における精密化の反復サイクルを用いて最終構造を生成した。Ｃａｍｉｌｌａ２部マトリックスを密度のために使用した。このモデリングで使用したタンパク質を以下に列挙する。
インポーチン－α経路スクリーニングアッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ＤＬ－２で４～９６時間又は対照ペプチドスクランブルで処理し、透過処理し、マウス抗ＩＭＰα１、ウサギ抗ＰＤＬ１でプローブし、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートされたロバ抗ウサギ二次抗体又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８にコンジュゲートされたロバ抗マウス二次抗体で可視化した。カバースリップを、Ｐｒｏｌｏｎｇ ｎｕｃｌｅｕｓ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。ＰＤＬ１及びＩＭＰα１デジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析して、平均蛍光強度（平均ＦＩ）を決定した。グラフは、ＩＭＰα１の平均ＦＩを表す。グラフはまた、自動閾値化及び細胞核に特異的な関心領域（ＲＯＩ）の手動選択を伴うＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してＰＤＬ１／ＩＭＰα１のＰＣＣを示し、抗体の各対についてピアソン相関係数（ＰＣＣ）を計算した。ＰＣＣ値の範囲は、－１＝共局在化の逆数である。
ＤＵＯＬＩＮＫ近接アッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＤＬ－２で処理した。濃度は１０μＭ～０．００９７５μＭの範囲である。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＤＬ－２又は対照で処理し、透過処理し、ＤＵＯＬＩＮＫライゲーションアッセイでプローブした。カバースリップを、Ｐｒｏｌｏｎｇ ｎｕｃｌｅｕｓ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。ＰＤＬ１－Ａｃ及びＩＭＰα１ ＤＵＯＬＩＮＫデジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析し、グラフは、核又は細胞質区画における平均ＤＯＴ蛍光強度を表し、有意差は、クラスカル・ウォリス一元配置分散分析により計算した。ＩＣ５０は赤色の点線で示され、０．０３９μＭのＤＬ－２に対応する。
非修飾ＰＤＬ１及びＩＭＰα１を特徴付けるために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞又はＣＴ２６細胞を、ビヒクル対照、ＤＬ－２－バッチ１、ＤＬ－２－バッチ２又は直鎖状ＰＤＬ１で処理した。細胞を透過処理し、ＤＵＯＬＩＮＫライゲーションアッセイでプローブした。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ ｎｕｃｂｌｕｅ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。ＰＤＬ１（非修飾）及びＩＭＰα１ ＤＵＯＬＩＮＫデジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析し、グラフは、核又は細胞質区画における平均ＤＯＴ蛍光強度を表し、有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ比較により計算した。
ＰＤＬ１－ＰＴＭ１－ＩＭＰα１結合アッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、ビヒクル対照、ＤＬ－２－バッチ１、ＤＬ－２－バッチ２、又は直鎖状ＰＤＬ１ペプチドで処理した。細胞を透過処理し、ＤＵＯＬＩＮＫライゲーションアッセイでプローブした。カバースリップを、Ｐｒｏｌｏｎｇ ｎｕｃｌｅｕｓ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。ＰＤＬ１Ａｃ及びＩＭＰα１ ＤＵＯＬＩＮＫデジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析し、グラフは、核又は細胞質区画における平均ＤＯＴ蛍光強度を表し、有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ比較により計算した。
高分解能デジタル病理検査－ＣＳＶ発現
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を透過処理し、ビヒクル対照又はＤＬ－２（現在のストック）若しくは直鎖状ＰＤＬ１（ＰＤＬ１－Ｌ１）のいずれかで処理した。ＣＳＶ又はＰＤＬ１－Ｍｅ３の発現の変化を、高分解能デジタル病理検査で特徴付けた。有意差は、ビヒクル対照に対する一元配置ＡＮＯＶＡクラスカル・ウォリス検定比較として計算する。ＣＦＩ＝細胞質蛍光強度。
結合特異性アッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＤＬ－２で処理した。濃度は１０μＭ～０．００９７５μＭの範囲である。カバースリップを、Ｐｒｏｌｏｎｇ ｎｕｃｌｅｕｓ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。ＰＤＬ２及びＩＭＰα１ ＤＵＯＬＩＮＫデジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析し、グラフは、核又は細胞質区画における平均ＤＯＴ蛍光強度を表し、有意差は、クラスカル・ウォリスノン一元配置分散分析により計算した。
免疫蛍光顕微鏡法
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１脳癌細胞株における蛍光強度を介して、ＰＤＬ２の発現に全く影響がないことを実証する。細胞を固定し、免疫蛍光顕微鏡検査を行った。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用してデジタル画像を分析して、核マイナスバックグラウンドを選択するためにＩｍａｇｅＪを使用して測定された細胞における平均核蛍光強度（ＴＮＦＩ）を決定した（ｎ＝＞５００細胞／サンプル）。
核関連タンパク質の決定
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１０μＭの濃度のＤＬ－２により処理した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＤＬ－２又は対照で処理し、透過処理した後、ＰＫＣθ、ＬＳＤ１、ｐ６５、Ｃ－Ｒｅｌ、ＳＥＴ、ｐＳＴＡＴ３に特異的な抗体でプローブした。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ ｎｕｃｂｌｕｅ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。デジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析し、グラフは、核又は細胞質区画における平均蛍光強度を表し、有意差はマン・ホイットニーのペアワイズ比較により計算した。
実施例６．
ＤＬ－２は、代替の二環式足場を使用して効力を維持する。
ＤＬ－２ペプチドがその標的に影響を及ぼすための二環式構造の重要性を考慮して、本発明者は、代替の分子足場がその活性に対して有するであろう任意の効果を調査しようとした。したがって、ＤＬ－２と同等のポリペプチド配列をＴＢＡＢ分子足場上に作製し、その活性を評価した。驚くべきことに、図２３で観察されるように、ＤＬ－２－ＴＢＭＢ及びＤＬ－２－ＴＢＡＢの両方が、免疫療法に対して応答性又は抵抗性のヒト転移性癌細胞株の増殖を効果的に阻害することができた（図２３Ａ）。更に、両方の分子足場は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＣＴ２６細胞株の両方において、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との複合体（図２３Ｂ）並びにＰＤＬ１非修飾とＩＭＰα１との複合体（図２３Ｃ）を阻害することができた。これは、この複合体に対する有意な影響を示し、ＰＤＬ１非修飾とＩＭＰα１との相互作用の実質的な減少の更なる証拠を提供する。これは、ＰＤＬ１非修飾とＩＭＰα１との複合体に有意に影響を及ぼすことができなかった直鎖状ＰＤＬ１（ＰＤＬ１－Ｌ１）ペプチド阻害剤とは全く対照的である（図２３Ａ及びＢ）。
材料及び方法
（Ａ）ＣＴ２６、４Ｔ１又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を阻害剤で７２時間処理した。阻害後、培地を除去し、ＷＳＴ－１細胞増殖試薬と交換した。吸光度を１時間後に４５０ｎｍで記録した。データは、三連で行われた単一の独立した実験を表す。結果を、平均＋／－標準誤差（ＳＥ）としてグラフ化する。Ｂ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＣＴ２６癌細胞を、ビヒクル対照、ＤＬ－２－バッチ１（元のストック）、ＤＬ－２－バッチ２（現在のストック）、ＤＬ－２－ＴＢＡＢ又は直鎖状ＰＤＬ１で処理した。細胞を透過処理し、ＤＵＯＬＩＮＫライゲーションアッセイでプローブした。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ ｎｕｃｂｌｕｅ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。ＰＤＬ１Ａｃ及びＩＭＰα１ ＤＵＯＬＩＮＫデジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析し、グラフは、核又は細胞質区画における平均ＤＯＴ蛍光強度を表し、有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ比較により計算した。（Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＣＴ２６癌細胞を、ビヒクル対照、ＤＬ－２－バッチ１（元のストック）、ＤＬ－２－バッチ２（現在のストック）、ＤＬ－２－ＴＢＡＢ又は直鎖状ＰＤＬ１で処理した。細胞を透過処理し、ＤＵＯＬＩＮＫライゲーションアッセイでプローブした。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ ｎｕｃｂｌｕｅ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。ＰＤＬ１非修飾及びＩＭＰα１ ＤＵＯＬＩＮＫデジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析し、グラフは、核又は細胞質区画における平均ＤＯＴ蛍光強度を表し、有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ比較により計算した。
実施例７．
ＤＬ－２のＤ－アミノ酸アイソフォームの機能的特徴付け
ＤＬ－２－Ｄは、ＤＬ－２ペプチド阻害剤のＤ－異性体バージョンを表し、二環式ペプチドＤＬ－２の全てのアミノ酸は、Ｄ－異性体形態で構成される（Ｄ－異性体形態を有しないグリシンを除く）（表９に示されるとおり）。簡単に説明すると、鏡によるＬ－アミノ酸の反射は、それらのエナンチオマーあるＤ－アミノ酸であり、これらは、平面偏光を反対方向に回転させる能力を除けば、Ｌ－アミノ酸と同一の化学的及び物理的特性を共有する。Ｌ－アミノ酸は、リボソームにおいて翻訳される天然タンパク質の要素として機能するが、Ｄ－アミノ酸は、細菌のいくつかの翻訳後修飾及びペプチドグリカン細胞壁において見出される。Ｌ－アミノ酸とは異なり、Ｄ－アミノ酸は、内因性プロテアーゼの基質としてほとんど作用せず、タンパク質分解に対するＤ－ペプチドの耐性をもたらす。
ＤＬ－２の安定性を（結合親和性及び有効性を保持しながら）増加させることができるかどうかを決定するために、ＤＬ－２のＤ－異性体バージョンを設計し、「ＤＬ－２－Ｄ」と名付けた（表９）。
ＤＬ－２と比較したＤＬ－２－Ｄの安定性を調査するために、二環式ペプチドの両方の血漿安定性をラット血漿中で決定した（図２４）。これらの安定性データは、ＤＬ－２－Ｄ二環式ペプチドがＤＬ－２二環式ペプチドよりも有意に安定であることを明確に実証している（図２４Ａ）。予想どおり、両方の二環式ペプチドは、ＰＤＬ１のネイティブな直鎖状ＮＬＳ配列よりも安定であった（図２４Ｂ）。
Ｄ－アミノ酸製剤の向上した安定性を示すこの確認された安定性データに基づいて、次いで、癌細胞増殖を阻害するＤＬ－２－Ｄの能力を分析した（図２５）。ＤＬ－２及びＤＬ－２－Ｄ二環式ペプチドの両方は、３つの異なる癌細胞株の増殖を有意に阻害する。
本発明者は次に、ＤＬ－２－Ｄが、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との複合体、及びＰＤＬ１（非修飾）とＩＭＰα１との複合体を標的とする能力を保持しているかどうかを、ＤＬ－２について既に確立されているような密接に相互作用するタンパク質を検出するＤＵＯＬＩＮＫアッセイを使用して決定することを検討した（図２６）。両方の複合体は、両方の形態（すなわち、Ｄ－異性体及びＬ－異性体）の二環式ペプチドでの処理によって複合体形成を有意に阻害するが、直鎖状プロトタイプＰＤＬ１－Ｌ１では変化がない。
次に、ＤＬ－２－Ｄ及びＤＬ－２足場がＰＤＬ１－ＰＴＭ２を濃縮することを確認するために（ＤＬ－２について上で実証されたように）、ＰＤＬ１の細胞質に偏ったバイアスＰＴＭ、ＰＤＬ１－ＰＴＭ２に対するＰＤＬ１の核軸の遮断の効果を調べた。細胞質画分におけるＰＤＬ１－ＰＴＭ２の濃縮は、免疫療法に応答する癌を示しており、上記の構造的根拠は、この形態がインポーチン経路において、及びそのリガンドＰＤ１により効率が低下していることを裏付けている。二環式ペプチド阻害剤の両方は、間葉系マーカーＣＳＶを阻害し、ＰＤＬ１－ＰＴＭ２の細胞質発現の発現増加を誘導することができた（図２７）。全く対照的に、直鎖状ＰＤＬ１ペプチドは、ＣＳＶの発現を減少させることができたが、ＰＤＬ１－ＰＴＭ２の発現の増加を誘導しなかった。
要約
上記のペプチド候補の各々の効力の簡単な要約を、以下の表１０～１２に提供する。
材料及び方法
ラット血漿安定性アッセイ
安定性アッセイは、ＣＲＯのプロトコル（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）に従って行った。簡単に説明すると、ペプチド安定性アッセイを、ラット血漿モデルを用いて以下のステップで実施した：
－ 約３．６ｍＬのヒト血漿及びラット血漿を室温で解凍し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。沈殿物を除去した。
－ ２０ｍＬの停止溶液（２０ｍＬアセトニトリル＋２０ｍＬギ酸）を調製し、４℃で予冷する。
－ 以下の溶液を調製する：
－ チューブを３７℃でインキュベートする。２４時間までの所望の時点（例えば、０、１５、３０、６０、１２０分など）でそれぞれ２００μＬの血漿サンプルを取り出す。４００μＬの予冷した停止溶液を添加し、３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を慎重に吸引する。
－ 上清サンプルを０．２２μｍのフィルター膜で濾過し、次いで、残存している試験化合物のパーセンテージを決定するためにＬＣ－ＭＳによって分析した。
細胞増殖アッセイ
４Ｔ１、ＣＴ２６又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞株をＤＬ－２又はＤＬ－２－Ｄ二環式阻害剤で７２時間処理した。阻害後、培地を除去し、ＷＳＴ－１細胞増殖試薬と交換した。吸光度を１時間後に４５０ｎｍで記録した。データは、三連で行われた単一の独立した実験を表す。結果を、平均＋／－標準誤差（ＳＥ）としてグラフ化する。
ＰＤＬ１－インポーチン結合アッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＣＴ２６細胞を、ビヒクル対照、ＤＬ－２－バッチ１、ＤＬ－２－バッチ２、ＤＬ－２－ＴＢＡＢ（ＴＢＡＢ足場）、ＤＬ－２－Ｄ（Ｄ－異性体）又は直鎖状ＰＤＬ１で処理した。この図は、ＰＤＬ１（非修飾）及びＩＭＰα１、並びにＰＤＬ１－ＰＴＭ１及びＩＭＰα１で染色されたＤＵＯＬＩＮＫ細胞のＡＳＩデジタル病理システムによる１００倍対物レンズを使用した高解像度イメージングによる比較を示す。細胞を透過処理し、ＤＵＯＬＩＮＫライゲーションアッセイでプローブした。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ ｎｕｃｂｌｕｅ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。ＰＤＬ１非修飾及びＩＭＰα１並びにＰＤＬ１－ＰＴＭ１及びＩＭＰα１ ＤＵＯＬＩＮＫデジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析し、グラフは、核又は細胞質区画における平均ＤＯＴ蛍光強度を表し、有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ比較により計算した。赤色カットオフは、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１とＩＭＰα１との複合体についての最高レベルの発現を表す。
細胞質ＰＤＬ１－ＰＴＭ２及びＣＳＶの検出
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞株を、ビヒクル対照又はＤＬ－２－バッチ１（元のストック）、ＤＬ－２－バッチ２（現在のストック）、ＤＬ－２－ＴＢＡＢ（ＴＢＡＢ足場）、ＤＬ－２－Ｄ（Ｄ－異性体）、若しくは直鎖状ＰＤＬ１のいずれかで処理した。結果の再現性を保証するために、２つのバッチを分析した。サンプルを透過処理し、ＰＤＬ１－ＰＴＭ２及びＣＳＶに対する抗体で標識した。サンプルを、ＡＳＩ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙシステムを用いて可視化した。ＣＳＶ又はＰＬＤ１－Ｍｅ３の発現の変化を、高分解能デジタル病理検査で特徴付けた。有意差は、ビヒクル対照に対する一元配置ＡＮＯＶＡクラスカル・ウォリス検定比較として計算する。ＣＦＩ＝細胞質蛍光強度。
実施例８．
「頭－尾」環状ペプチド阻害剤は、間葉系癌マーカーを阻害しない
ＤＬ－２の二環構造の重要性を確立するために、他の方法論とは対照的に、従来の「頭－尾」環化ＰＤＬ１－Ｐ１ペプチドを生成した。環式ＰＤＬ１ペプチドは、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１の核発現のレベル、又はＣＳＶ若しくはＡＬＤＨ１Ａの発現に影響を及ぼすことができなかった（図２８）。
これらのデータは、ＰＤＬ１の核経路を標的化するための二環式構造を有することの重要性を確認する。
材料及び方法
Ｃ末端アミノ酸をＮ末端アミノ酸に結合するペプチドの「頭－尾」環化（すなわち、環化のための古典的アプローチである）を考慮し、製造業者のプロトコルによって実施した。この環化ペプチドの合成は非常に問題が多く、低収率であった。達成された最大収量はわずか１～２ｍｇであった。
乳癌細胞株４Ｔ１を、ビヒクル対照又は濃度５０μＭの環式ＰＤＬ１ペプチド（環式ＰＤＬ１）で処理した。細胞を透過処理し、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１、ＣＳＶ及びＡＬＤＨ１Ａ１に対する一次抗体でプローブした。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ ｎｕｃｂｌｕｅ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。ＰＤＬ１－ＰＴＭ１、ＣＳＶ及びＡＬＤＨ１Ａ１デジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析した。グラフは、マン・ホイットニー分析に従って計算された有意差を有する核若しくは細胞質区画における平均蛍光強度、又は式Ｆ（ｎ－ｂ）／（ｃ－ｂ）（式中、ｎ＝核染色、ｂ＝バックグラウンド、ｃ＝細胞質）を使用して計算されたＰＤＬ１－ＰＴＭ１の核染色対細胞質染色の比を表す。１以上の比は核の偏りを示し、１未満は細胞質の偏りを示す。
実施例１０．
ＤＬ－２のインビボ研究
ＤＬ－２単剤療法（２０及び３０ｍｇ／ｋｇ）は、８日間の処置期間にわたって転移性乳癌の４Ｔ１モデルにおいて原発腫瘍体積を減少させる。腫瘍重量もまた、８日後に２０及び３０ｍｇ／ｋｇで有意に減少する。ＤＬ－２処置では、体重の変化は観察されない。ＤＬ－２単独療法は肺、肝臓又は脾臓の重量を変化させない。
抗ＰＤ１抗体と組み合わせたＤＬ－２処置は、１０日間の処置期間にわたって４Ｔ１モデルにおける原発腫瘍体積を有意に減少させる。ＤＬ－２及び抗ＰＤ１併用療法では、体重の変化は観察されない。抗ＰＤ１と組み合わせたＤＬ－２は、肺、肝臓又は脾臓重量を変化させない（図３０）。
このデータに基づいて、本発明者は、単剤療法としての又は抗ＰＤ１と組み合わせたＤＬ－２－Ｄ処置が、１０日間の処置期間にわたって４Ｔ１モデルにおける原発腫瘍体積並びに肺転移を有意に減少させるかどうかを分析した。ＤＬ－２－Ｄ及び抗ＰＤ１併用療法又はＤＬ－２－Ｄ単剤療法では、体重の変化は観察されない。単独又は抗ＰＤ１と組み合わせたＤＬ－２－Ｄは、肺、肝臓又は脾臓重量を変化させない（図３１）。
ＤＬ－２対ＤＬ－２－Ｄの併用有効性を評価するために、本発明者は、上記のような同等の投薬レジメンでＤＬ－２及びＤＬ－２－Ｄを比較した。図３２に示されるこれらのデータは、ＤＬ－２－Ｄが単独療法剤として腫瘍体積を有意に阻害することを明確に示す。この知見は、ＤＬ－２－Ｄが改善された安定性及び排出半減期を有し、したがって、更により効果的な処置をもたらし得るという知見を提供する。４Ｔ１ ＴＮＢＣ腫瘍マウスモデル由来の免疫療法抵抗性ＣＤ８＋ＴＩＭ３＋Ｔ細胞に対するＤＬ－２－Ｄ又はＤＬ－２の効果を、ＦＡＣＳによって調べた。驚くべきことに、ＤＬ－２－Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＩＭ３＋免疫療法抵抗性シグネチャーを無効にし、機能的なエフェクターシグネチャーについてそれらを再プログラミングする点でＤＬ－２よりも強力であった。
材料及び方法
インビボマウスモデル
ＡＲＣ，Ｐｅｒｔｈから得られた４Ｔ１ゴールドスタンダード免疫療法耐性マウスモデルマウス及びマウスに、４Ｔ１ ＴＮＢＣ転移性癌細胞を接種した。ＤＬ－２をガラスバイアル中で凍結乾燥させて供給し、針／シリンジを用いて１０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を作製するために塩化ナトリウム注射ＢＰ（０．９％生理食塩水）を使用して再構成し、ＤＬ－２は反転によって混合された。次いで、動物に腹腔内注射によって１０、２０又は３０ｍｇ／ｋｇを毎日注射し、週末にわたって休ませた。マウスの体重及び腫瘍体積を経時的にモニターした。
ＰＤ１免疫療法併用処置
ＡＲＣ，Ｐｅｒｔｈから得られた４Ｔ１ゴールドスタンダード免疫療法耐性マウスモデルマウス及びマウスに、４Ｔ１ ＴＮＢＣ転移性癌細胞を接種した。ＤＬ－２又はＤＬ－２－Ｄをガラスバイアル中で凍結乾燥させて供給し、針／シリンジを用いて１０ｍｇ／ｍＬのストック溶液を作製するために塩化ナトリウム注射ＢＰ（０．９％生理食塩水）を使用して再構成し、ＤＬ－２は反転によって混合された。次いで、動物に腹腔内注射により注射し、マウスを、αＰＤ１又はアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）と共に週末にわたって休薬しながら、２日毎に２０ｍｇ／ｋｇのＤＬ－２の体重及び腫瘍体積について経時的に監視した。
ＤＬ－２－Ｄを反転により混合した。次いで、動物に腹腔内注射により注射し、マウスを、αＰＤ１又はアイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）と共に２日毎に２０ｍｇ／ｋｇの濃度で（ＰＤ１と同一のレジーム）ＤＬ－２－Ｄの体重及び腫瘍体積について経時的に監視した。
実施例１２．
ＭＩＣの間葉系シグネチャーに対するＤＬ－２の効果
間葉系シグネチャーを阻害するＤＬ－２の有効性に基づいて、本発明者は、ステージＩＶ転移性癌患者から単離された転移性開始細胞（ＭＩＣ）における免疫療法抵抗性間葉系シグネチャーの阻害に関するＤＬ－２の有効性を探そうとした。ＭＩＣは、攻撃的な癌を有する患者からの液体生検において見出され、これらの癌細胞（ＭＩＣ）は、ＡＢＣＢ５及びＡＬＤＨＡ１Ａ１並びに新規ＰＤＬ１－ＰＴＭ１などの耐性及び転移性マーカーの発現を含む間葉表現型を発現することができる。ＭＩＣはまた、転移事象の重要なメディエーターであり、免疫療法に抵抗性がある。
本発明者は、上記の実施例において、ＤＬ－２が免疫療法抵抗性転移性シグネチャーを阻害することを実証した。これらの知見により、本発明者らは、ＤＬ－２が患者の液体生検からのＭＩＣにおけるこれらのシグネチャーを潜在的に阻害するであろうという仮説を立てた。調査時に、ＤＬ－２は、ＮＳＣＬＣ、ＴＮＢＣ及び黒色腫患者由来の癌細胞において、免疫療法抵抗性の間葉系マーカーＡＢＣＢ５及びＡＤＬＨＡ１Ａ１、並びにＰＤＬ１－ＰＴＭ１の発現を阻害することが見出された。したがって、ＤＬ－２はまた、これらのＭＩＣを標的化及び阻害することによって転移の播種を阻害する。
材料及び方法
間葉系ＭＩＣを、ＴＮＢＣ、肺癌及び黒色腫患者の液体生検から単離し（免疫療法／治療耐性又は応答性（完全奏功、部分奏功又は進行性疾患）についてＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１でスコア化）、ビヒクル対照又は核ＰＤＬ１阻害剤、ＤＬ－２のいずれかを用いて前臨床スクリーニングした。サンプルを固定し、ＣＳＶ、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１（アセチル化核ＰＤＬ１）、ＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＢＣＢ５を標的とする一次抗体を用いて、これらの細胞の免疫蛍光顕微鏡検査を行った。グラフは、核マイナスバックグラウンドを選択するためにＡＳＩ Ｄｉｇｉｔａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ自動化システムを使用して測定された、ＣＳＶのＣＦＩ値、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１のＮＦＩ、ＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＢＣＢ５のＦＩを表す（ｎ≧４０細胞／サンプル／５患者／群）。
実施例１１．
ナノ粒子カプセル化方法
ＤＬ－２二環式ペプチドの安定性及び有効性を最適化及び増強するために、本発明者らは、Ｎａｎｏｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓナノ粒子送達系を利用した。このアプローチのために、本発明者らは、ＤＬ－２ペプチド阻害剤を脂質ベースのナノ粒子にパッケージングした。簡潔には、脂質混合物を作製し、ペプチドを１０ｍｇ／ｍｌ濃度でＰＢＳ ｐＨ７．４に溶解し、次いで、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｉｇｎｉｔｅを使用して、ナノ沈殿法において様々なペプチド対脂質比及び流速で流した。これに続いて、本発明者らは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ ＤＬＳシステムで強度によるこれらのサイズ分布を特徴付けた。
ナノ粒子及びＤＬ－２二環式ペプチドの精製中に、ＤＬ－２の大部分が首尾よく封入されたことは明らかであった（図３３Ａ、Ｂ）。図３４Ａ～Ｂを参照すると、プロットされたデータにおいて、１００ｎｍ付近のピークがペプチドの寄与を有する脂質ナノ粒子であるのに対して、対照（中空粒子）はサイズがより小さいことが実証される。
精製後、カプセル化二環式ペプチド製剤が非カプセル化ＤＬ－２二環式ペプチドよりも高いインビボ安定性を有するかどうかを理解するために、安定性研究を行った。ＤＬ－２ナノ粒子（ＤＬ－２－ＮＰ）及びＤＬ－２－Ｄは両方とも、裸のＤＬ－２二環式ペプチドよりも有意に安定である（図３４Ｃ）。
材料及び方法
脂質ナノ粒子の調製
ナノ粒子は、当該技術分野における標準的な方法論を用いて作製した。プロセスを簡単に要約するために、ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、コレステロール及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］）を用いて脂質混合物を作製した。ＤＬ－２二環式阻害剤をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４に１０ｍｇ／ｍｌ濃度で可溶化する。次いで、ペプチドを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｉｇｎｉｔｅを使用するナノ沈殿法において、脂質に対して様々な流速比及び流速で流した。これに続いて、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａ ＤＬＳシステムでサイズを評価した。
ラット安定性アッセイ
安定性アッセイは、上記実施例７に記載したのと同じプロトコルを用いて行った。
実施例１２．
ＤＬ－２－ＮＰは癌細胞の増殖を阻害する
ＤＬ－２－ＮＰは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の増殖の阻害において各化合物のＩＣ５０を比較した場合、ＤＬ－２よりも８００倍超強力であった（図３５Ａ）。
ＤＬ－２－ＮＰは、ナノモル範囲でＴＮＢＣ癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の増殖を抑止することができ、これは、脂質カプセル化なしのＤＬ－２よりも有意に低い濃度である。ＤＬ－２－ＮＰは、核ＰＤＬ１－ＰＴＭ及びＤＬＬ４（癌幹細胞（ＣＳＣ）の維持及び増殖に関与し、患者の生存率低下と関連している）を用量依存的に無効にすることができる（図３５Ｂ）。ＤＬ－２－ＮＰはまた、試験した全ての濃度でＣＳＶ（浸潤性癌の間葉系マーカーである細胞表面ビメンチン）を有意に無効にした（図３５Ｂ）。ＤＬ－２－ＮＰによる処理はまた、ＰＤＬ１－ＰＴＭ１の発現を細胞質に用量依存的に偏らせることができた（赤色点線は１のＦｎ／ｃを表す）。
本発明者はまた、ＤＬ－２－ＮＰが、ＰＤＬ１及びＩＭＰα１複合体を無効にする際に裸のＤＬ－２よりも強力であり、ＤＬ－２－ＮＰのＩＣ５０がわずか１ｎＭでであったことを見出した（ＤＬ－２について３９ｎｍと比較して、約３９倍を示す）。
材料及び方法
細胞増殖アッセイ
細胞を阻害剤で４８時間処理した。阻害後、培地を除去し、ＷＳＴ－１細胞増殖試薬と交換した。吸光度を１時間後に４５０ｎｍで記録した。
ＰＤＬ１－ＩＭＰα１結合アッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ビヒクル対照（中空ナノ粒子）、１０ｎｍ～０．３ｎｍの濃度のＤＬ－２－ＮＰで処理した。細胞を透過処理し、ＤＵＯＬＩＮＫライゲーションアッセイでプローブした。カバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ ｎｕｃｂｌｕｅ ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に顕微鏡スライドガラスに取り付けた。ＰＤＬ１（非修飾）＆ＩＭＰα１ ＤＵＯＬＩＮＫデジタル画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して分析し、グラフは、核又は細胞質区画における平均ＤＯＴ蛍光強度を表し、有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ比較により計算した。
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書における任意の参考文献の引用は、かかる参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
本明細書全体を通して、目的は、本発明をいずれか１つの実施形態又は特徴の特定の集合に限定することなく、本発明の好ましい実施形態を説明することであった。したがって、当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態において様々な修正及び変更を行うことができることを理解するであろう。全てのかかる修正及び変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

Claims (71)

  1. ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体であって、少なくとも２つのループ配列によって分離された少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチドと、前記ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子足場であって、少なくとも２つのポリペプチドループが前記分子足場上に形成されるように共有結合を形成する分子足場とを含み、前記ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体は、
    Ｘ１Ｃ１ＬＸ２Ｘ３ＩＦＣ２Ｘ４ＬＲＫＧＸ５Ｃ３Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＫＸ１０
    のアミノ酸配列を含み、
    式中、
    Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３は、それぞれ第１、第２、及び第３のシステイン残基を表し、
    Ｘ１は、不存在又はアラニンであり、
    Ｘ２は、任意の小アミノ酸（任意選択で、トレオニン、グリシン、セリン、又はアラニン）から選択され、
    Ｘ３は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ４は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ５は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ６は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、ロイシン、プロリン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
    Ｘ７は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、プロリン、ロイシン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
    Ｘ８は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ９は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、ロイシン、プロリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びノルロイシン）から選択され、及び
    Ｘ１０は、任意のアミノ酸から選択される、ＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又はその修飾誘導体、又は薬学的に許容され得る塩。
  2. Ｘ２が、トレオニン及びアラニンから選択される、請求項１に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  3. Ｘ２がトレオニンである、請求項１又は請求項２に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  4. Ｘ３が、フェニルアラニン及びアラニンから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  5. Ｘ３がフェニルアラニンである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  6. Ｘ４が、アルギニン及びアラニンから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  7. Ｘ４がアルギニンである、請求項１～６のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  8. Ｘ５が、アルギニン及びアラニンから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  9. Ｘ５がアルギニンである、請求項１～８のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  10. Ｘ６が、メチオニン、アラニン、ロイシン及びプロリンから選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  11. Ｘ６がメチオニンである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  12. Ｘ７が、メチオニン、アラニン、及びプロリンから選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  13. Ｘ７がメチオニンである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  14. Ｘ７がアラニンである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  15. Ｘ８が、アスパラギン酸、アラニン、グリシン及びバリンから選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  16. Ｘ８がアスパラギン酸である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  17. Ｘ９が、バリン、アラニン、グリシン、メチオニンから選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  18. Ｘ９がバリンである、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  19. Ｘ１０が、リシン、アラニン、アスパラギン、及びメチオニンから選択される、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  20. Ｘ１０がリシンである、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  21. 前記ペプチドがインポーチンに結合する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  22. 前記ペプチド模倣体が、ＰＤ－Ｌ１とインポーチンとの間の複合体を防止又は破壊する、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  23. アミノ酸配列：ＡＣＬＴＦＩＦＣＲＬＲＫＧＲＣＭＭＤＶＫＫ［配列番号１］を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  24. 前記分子足場が１，３，５－（トリブロモメチル）ベンゼン）又はＴＢＡＢである、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  25. Ｎ末端細胞透過性ペプチドを更に含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  26. 前記細胞透過性ペプチドがＭｙｒである、請求項２５に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  27. 前記修飾誘導体が、Ｎ末端及び／又はＣ末端修飾；１つ以上のアミノ酸残基の１つ以上の非天然アミノ酸残基による置換（例えば１つ以上の極性アミノ酸の１つ以上の等配電子又は等電子アミノ酸による置換；１つ以上の疎水性アミノ酸残基の他の非天然の等配電子又は等電子アミノ酸による置換）；スペーサー基の付加；１つ以上の耐酸化性アミノ酸残基の置換；１つ以上のアミノ酸残基のアラニンによる置換、１つ以上のＬアミノ酸残基の１つ以上のＤ－アミノ酸残基による置換；二環式ペプチドリガンド内の１つ以上のアミド結合のＮ－アルキル化；１つ以上のペプチド結合の代替結合による置換；ペプチド骨格長の修飾；１つ以上のアミノ酸残基のα－炭素上の水素の別の化学基による置換、並びにシステイン、リシン、グルタミン酸塩及びチロシンなどのアミノ酸の、適切なアミン、チオール、カルボン酸及びフェノール反応性試薬による合成後双直交修飾から選択される１つ以上の修飾を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  28. 前記修飾誘導体が、Ｎ末端修飾、例えばＮ末端アセチル基を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  29. 前記修飾誘導体が、Ｃ末端修飾、例えばＣ末端アミド基を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  30. 前記修飾誘導体が、１つ以上のアミノ酸残基の１つ以上の非天然アミノ酸残基による置換を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  31. 前記修飾誘導体が、１つ以上のＤ－アミノ酸を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  32. 前記アミノ酸が実質的にＤ－アミノ酸である、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  33. 前記ペプチドが、脂質ナノ粒子中に製剤化されている、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  34. 前記薬学的に許容され得る塩が、塩酸塩又は酢酸塩から選択される、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体。
  35. 請求項１～２９のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を、１つ以上の賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
  36. ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞におけるＰＤ－Ｌ１の核局在化を低減する方法であって、前記方法が、前記細胞を、
    Ｘ１Ｃ１ＬＸ２Ｘ３ＩＦＣ２Ｘ４ＬＲＫＧＸ５Ｃ３Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＫＸ１０
    のアミノ酸配列を有するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体
    又はその修飾誘導体、又は薬学的に許容され得る塩と接触させることを含み、
    式中、
    Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３は、それぞれ第１、第２、及び第３のシステイン残基を表し、
    Ｘ１は、不存在又はアラニンであり、
    Ｘ２は、任意の小アミノ酸（任意選択で、トレオニン、グリシン、セリン、又はアラニン）から選択され、
    Ｘ３は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ４は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ５は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ６は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、ロイシン、プロリン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
    Ｘ７は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、プロリン、ロイシン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
    Ｘ８は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ９は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、ロイシン、プロリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びノルロイシン）から選択され、及び
    Ｘ１０は、任意のアミノ酸から選択される、方法。
  37. Ｘ２が、トレオニン及びアラニンから選択される、請求項３６に記載の方法。
  38. Ｘ２がトレオニンである、請求項３６又は３７に記載の方法。
  39. Ｘ３が、フェニルアラニン及びアラニンから選択される、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. Ｘ３がフェニルアラニンである、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. Ｘ４が、アルギニン及びアラニンから選択される、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. Ｘ４がアルギニンである、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. Ｘ５が、アルギニン及びアラニンから選択される、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. Ｘ５がアルギニンである、請求項３６～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. Ｘ６が、メチオニン、アラニン、ロイシン及びプロリンから選択される、請求項３６～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. Ｘ６がメチオニンである、請求項３６～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. Ｘ７が、メチオニン、アラニン、及びプロリンから選択される、請求項３６～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. Ｘ７がメチオニンである、請求項３６～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. Ｘ７がアラニンである、請求項３６～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. Ｘ８が、アスパラギン酸、アラニン、グリシン及びバリンから選択される、請求項３６～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. Ｘ８がアスパラギン酸である、請求項３６～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. Ｘ９が、バリン、アラニン、グリシン、メチオニンから選択される、請求項３６～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. Ｘ９がバリンである、請求項３６～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. Ｘ１０が、リシン、アラニン、アスパラギン、及びメチオニンから選択される、請求項３６～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. Ｘ１０がリシンである、請求項３６～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. アミノ酸配列：ＡＣＬＴＦＩＦＣＲＬＲＫＧＲＣＭＭＤＶＫＫ［配列番号：１］を含む、請求項３６～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記分子足場が１，３，５－（トリブロモメチル）ベンゼン）又はＴＢＡＢである、請求項３６～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記修飾誘導体が１つ以上のＤ－アミノ酸を含む、請求項３６～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記アミノ酸が実質的にＤ－アミノ酸である、請求項３６～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記ペプチドが脂質ナノ粒子中に製剤化されている、請求項３６～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. Ｎ末端細胞透過性ペプチドを更に含む、請求項３６～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記細胞透過性ペプチドがミリスチン酸である、請求項６１に記載の方法。
  63. 対象における癌を処置又は予防する方法であって、前記癌が少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞を含み、請求項１～３５のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体を前記対象に投与することを含む、方法。
  64. 前記ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞が、癌細胞、癌幹細胞、又は非癌幹細胞腫瘍細胞である、請求項３６～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記ＰＤ－Ｌ１過剰発現細胞が癌幹細胞腫瘍細胞である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記癌が、乳癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、又は脳癌、又は黒色腫、又は網膜芽細胞腫から選択される、請求項６３～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 少なくとも１つの更なる癌療法を施すことを更に含む、請求項３６～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記更なる癌療法が化学療法剤である、請求項６７に記載の方法。
  69. 治療における使用のための、アミノ酸配列：
    Ｘ１Ｃ１ＬＸ２Ｘ３ＩＦＣ２Ｘ４ＬＲＫＧＸ５Ｃ３Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＫＸ１０
    を有するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又はその修飾誘導体、又は薬学的に許容され得る塩を含む組成物であって、
    式中、
    Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３は、それぞれ第１、第２、及び第３のシステイン残基を表し、
    Ｘ１は、不存在又はアラニンであり、
    Ｘ２は、任意の小アミノ酸（任意選択で、トレオニン、グリシン、セリン、又はアラニン）から選択され、
    Ｘ３は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ４は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ５は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ６は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、ロイシン、プロリン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
    Ｘ７は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、プロリン、ロイシン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
    Ｘ８は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ９は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、ロイシン、プロリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びノルロイシン）から選択され、及び
    Ｘ１０は、任意のアミノ酸から選択される、組成物。
  70. 癌の処置における使用のための、アミノ酸配列：
    Ｘ１Ｃ１ＬＸ２Ｘ３ＩＦＣ２Ｘ４ＬＲＫＧＸ５Ｃ３Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＫＸ１０
    を有するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又はその修飾誘導体、又はその薬学的に許容され得る塩を含む組成物であって、
    式中、
    Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３は、それぞれ第１、第２、及び第３のシステイン残基を表し、
    Ｘ１は、不存在又はアラニンであり、
    Ｘ２は、任意の小アミノ酸（任意選択で、トレオニン、グリシン、セリン、又はアラニン）から選択され、
    Ｘ３は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ４は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ５は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ６は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、ロイシン、プロリン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
    Ｘ７は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、プロリン、ロイシン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
    Ｘ８は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ９は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、ロイシン、プロリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びノルロイシン）から選択され、及び
    Ｘ１０は、任意のアミノ酸から選択される、組成物。
  71. 癌の処置用の医薬の製造における、アミノ酸配列：
    Ｘ１Ｃ１ＬＸ２Ｘ３ＩＦＣ２Ｘ４ＬＲＫＧＸ５Ｃ３Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＫＸ１０
    を有するＰＤ－Ｌ１二環式ペプチド模倣体、又はその修飾誘導体、又はその薬学的に許容され得る塩を含む組成物の使用であって、
    式中、
    Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３は、それぞれ第１、第２、及び第３のシステイン残基を表し、
    Ｘ１は、不存在又はアラニンであり、
    Ｘ２は、任意の小アミノ酸（任意選択で、トレオニン、グリシン、セリン、又はアラニン）から選択され、
    Ｘ３は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ４は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ５は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ６は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、ロイシン、プロリン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
    Ｘ７は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、プロリン、ロイシン、グリシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びノルロイシン）から選択され、
    Ｘ８は、任意のアミノ酸から選択され、
    Ｘ９は、任意の非極性／中性アミノ酸（例えば、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、ロイシン、プロリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びノルロイシン）から選択され、及び
    Ｘ１０は、任意のアミノ酸から選択される、使用。
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