JP2024502791A - 細胞膜を摂動させるための並列化された狭窄部を有する高スループットマイクロ流体チップ - Google Patents

細胞膜を摂動させるための並列化された狭窄部を有する高スループットマイクロ流体チップ Download PDF

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Abstract

細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップは、細胞懸濁液がマイクロ流体チップ内の第１の流体流れ領域から第２の流体流れ領域に１またはそれを超える複数の狭窄部を通って流れることを可能にするように構成された複数の狭窄部であって、複数の狭窄部の各々の断面幅が、細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが摂動された細胞膜を通過することができるように、細胞の膜が狭窄部を通過するときに摂動され、複数の狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい、複数の狭窄部を含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２９日に出願された米国仮出願第６３／１３１，４３０号の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
分野
本開示は、細胞へのペイロードの送達に関し、より具体的には、細胞膜を乱してペイロードが摂動された膜を通過することを可能にし得るマイクロ流体狭窄チャネルに関する。
背景
細胞への様々な材料の制御された送達は、細胞療法の発展中の医療分野において重要である。例えば、様々な研究および治療用途は、細胞膜を通して細胞内へのペプチド、核酸、タンパク質、小分子およびナノ材料の送達を含み得る。国際公開第２０１３０５９３４３号、国際公開第２０１５０２３９８２号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５８４８９号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６０６８９号、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／１３１１３号で論じられているように、狭窄マイクロ流体チャネルを使用して、化合物および他のペイロードを細胞に送達することができる。ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／６６２９５に開示されているように、卓上実験室および／または臨床システムは、細胞懸濁液中の細胞の膜に摂動を引き起こすために、狭窄チャネルまたは狭窄部細孔を有するマイクロ流体チップの１またはそれを超える狭窄部を通して細胞懸濁液を強制的に流動させるように構成され得る。
国際公開第２０１３０５９３４３号 国際公開第２０１５０２３９８２号
発明の要旨
上記で説明したように、細胞内ペイロード送達のためのシステムは、細胞懸濁液が狭窄部カートリッジを通って流れるときに細胞懸濁液中の細胞の膜に摂動を引き起こすために、１またはそれを超える狭窄チャネルまたは狭窄部細孔を通して細胞を強制するように構成されたシステムを含む。しかしながら、細胞内ペイロード送達のための公知のシステムは、狭窄部の目詰まりを起こしやすく、スループット速度が不十分であり、製造するのに十分に単純かつ効率的ではない。
したがって、高いスループット速度および低い目詰まり速度を有する改善されたマイクロ流体細胞狭窄チップの必要性を含む、細胞内ペイロード送達のための改善されたシステム、方法、および技術が必要とされている。改善された幾何学的構成、改善されたスループット、目詰まりまたは他の故障に対する改善された耐性、および／または改善された製造の容易さおよび効率を有するマイクロ流体細胞狭窄チップが必要とされている。本明細書に開示されるシステム、方法、および技術は、幾何学的構成、スループット、目詰まりまたは他の故障に対する耐性、製造の容易さおよび効率、ならびにマイクロ流体細胞狭窄チップおよび／またはシステムの容量、使用方法、および／または製造方法を改善するための１またはそれを超えるこれらの必要性に対処することができる。
本明細書では、細胞懸濁液中の細胞にペイロードを送達するためのシステムにおける使用のための高スループットマイクロ流体チップが開示される。チップは、細胞懸濁液が加圧下で押し出され得る複数の並列化された狭窄部（例えば、狭窄チャネル）を含む。細胞懸濁液の細胞は、マイクロ流体チップの細胞変形狭窄部を通過するために変形し、それらの膜が摂動される可能性がある。本明細書で説明されるように、チップのスループットおよび目詰まり特性は、本明細書に開示されるチップのいくつかの特性のために改善され得る。
第１に、本明細書に開示されるチップは、第１の流体流れ領域を第２の流体流れ領域から分割する多数の並列化された狭窄部を含むことができる。例えば、本明細書に開示されているようなチップは、数百または数千の並列化されたマイクロ流体狭窄部を有し得る。第１の流体流れ領域内の細胞懸濁液が加圧されると、狭窄部のいずれか１つを通って第２の流体流れ領域に流動され得て、狭窄部の数が少ないチップよりもスループットを増加させることができる。
第２に、本明細書に開示されるチップは、断面周囲長に対する断面積の商が以前の既知の設計よりも高い１またはそれを超える狭窄部を有し得る。いくつかの実施形態では、この商の増加は、深く狭い矩形の狭窄部（例えば、スリット形状の狭窄部）を基板（例えば、シリコン基板）にエッチングすることによって達成され得る。狭窄部は、狭窄側壁を互いに並列な十分な角度閾値内に維持しながら、十分に深くエッチングすることによって形成され得る。さらに、狭窄部は、側壁を互いに距離の所定の包絡線（例えば、公差）内に維持しながら十分に深くエッチングすることによって形成され得、その結果、狭窄部を通って押し出された細胞は、細胞が狭窄部を通過する位置（例えば、エッチング深さ）にかかわらず側壁によって変形され得る。このようにして、各深く狭い矩形の狭窄部は、同じサイズの細胞に対して構成された幅を有するが基板内に深くエッチングされていない狭窄部と比較して、より大きい断面狭窄部面積に起因して、個々のスループットが増加し得る。さらに、狭窄部の目詰まりは狭窄部の縁部および角部によって引き起こされる傾向があるため、同じサイズの細胞に対して構成された幅を有するが、基板内に深くエッチングされていない狭窄部と比較して、深く狭い矩形のくびれは、減少した速度で目詰まりする可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、断面狭窄部周囲長を最小にしながら狭窄部面積を増加させることにより、狭窄部目詰まりの可能性および／または程度を最小にしながら、狭窄部ごとのスループットを増加させ得る。
第３に、本明細書に開示されるチップは、細胞懸濁液が複数の狭窄部に接近し、複数の狭窄部を通って流れる際に、十分に均一な流速および流れパターンを確保するように構成された幾何学的形状を有し得る。いくつかの実施形態では、複数の狭窄部は、並列化された複数の狭窄部の上流側の第１の流れ領域と、並列化された複数の狭窄部の下流側の第２の流れ領域との間にバリアまたは壁を形成するラインに配置されてもよい。複数の狭窄部によって形成されたバリアは、チップの入口ポートから十分な距離に配置されてもよく、バリアの長さは、当該距離に対して十分に短くてもよく、複数の狭窄部を通る流速および流れパターンは、高スループットおよび低目詰まりを維持するために十分に均一である。
第４に、本明細書に開示される狭窄部は、狭窄部内および狭窄部の周囲の十分に均一な流れパターンを確保し、狭窄部を通る十分に高い流速およびスループット流量を確保するように構成された幾何学的形状を有し得る。いくつかの実施形態では、狭窄部は、流体が狭窄部の最も狭い点に接近するときに流体が流れるアプローチ領域を有する。アプローチ領域は、狭窄部の最も狭い点に向かって所定の角度で先細になるテーパ状側壁等の１またはそれを超えるのテーパ状壁によって画定することができる。所定の角度は、狭窄部の最も狭い点の幅ならびにチップおよび細胞懸濁液の他の特性と併せて、均一な流れパターンならびに十分な流速およびスループットを確保するように設定され得る。
一部の実施形態では、細胞にペイロードを送達させるための第１のマイクロ流体チップが提供され、第１のチップは、細胞懸濁液の流れを受け取り、細胞懸濁液をマイクロ流体チップ内の第１の流体流れ領域に送るように構成された流体入口と、細胞懸濁液がマイクロ流体チップ内の第１の流体流れ領域から第２の流体流れ領域に１またはそれを超える複数の狭窄部を通って流れることを可能にするために第１の流体流れ領域に流体接続された複数の狭窄部であって、複数の狭窄部の各々の断面幅が、細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが摂動された細胞膜を通過することができるように、細胞の膜が狭窄部を通過するときに摂動され、複数の狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい、複数の狭窄部とを含む。
一部の実施形態では、ペイロードを細胞に送達させる第１の方法が提供され、第１の方法は、マイクロ流体チップの第１の流体流れ領域への細胞懸濁液の流れを受け取ることであって、細胞懸濁液が複数の細胞を含む、細胞懸濁液の流れを受け取ることと、細胞懸濁液を第１の流体流れ領域からマイクロ流体チップの複数の狭窄部を通って流動させることとを含み、複数の狭窄部の各々の断面幅が、細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが変形された細胞膜を通過することができるように、細胞の膜が狭窄部を通過するときに変形され、複数の狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい。
一部の実施形態では、細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップを製造する第２の方法が提供され、第２の方法は、細胞懸濁液が入口ポートから第１の流体流れ領域を通って流れることを可能にするように構成された第１の流体流れ領域を形成するように基板にエッチングすることと、細胞懸濁液が第１の流体流れ領域から狭窄部を通って流れることを可能にするように構成された複数の狭窄部を形成するために基板にエッチングすることとを含み、複数の狭窄部の各々の断面幅が、細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが変形された細胞膜を通過することができるように、細胞の膜が狭窄部を通過するときに変形され、複数の狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい。
一部の実施形態では、細胞にペイロードを送達させるための第２のマイクロ流体チップが提供され、第２のチップは、細胞懸濁液の流れを受け取り、細胞懸濁液をマイクロ流体チップ内の第１の流体流れ領域に送るように構成された流体入口と、細胞懸濁液がマイクロ流体チップ内の第１の流体流れ領域から第２の流体流れ領域に１またはそれを超える第１の複数の狭窄部を通って流れることを可能にするために第１の流体流れ領域に流体接続された第１の複数の狭窄部と、細胞懸濁液がマイクロ流体チップ内の第２の流体流れ領域から第３の流体流れ領域に１またはそれを超える第２の複数の狭窄部を通って流れることを可能にするために第２の流体流れ領域に流体接続された第２の複数の狭窄部であって、第１の複数の狭窄部および第２の複数の狭窄部の狭窄部の各々の断面幅が、細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが摂動された細胞膜を通過することができるように、細胞の膜が狭窄部を通過するときに摂動され、第１の複数の狭窄部および第２の複数の狭窄部の狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい、第２の複数の狭窄部と、を含む。
いくつかの実施形態では、実施形態のいずれかに関して上述した１またはそれを超える特徴、特性、または要素のいずれかは、上述したまたは本明細書の他の箇所に記載された他の実施形態のいずれかに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、本開示の他の箇所で説明した１またはそれを超える特徴、特性、または要素いずれかは、１またはそれを超える上述の実施形態のいずれかに組み込まれ得る。
図１Ａ～図１Ｃは、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップの様々な図を示す。図１Ａは、いくつかの実施形態による、チップの俯瞰図およびチップの狭窄部の拡大ハイライトを示す。図１Ｂは、いくつかの実施形態による、チップの狭窄部およびガイドチャネルの俯瞰図を示す。図１Ｃは、いくつかの実施形態による、チップの狭窄部の断面図を示す。
図２Ａ～図２Ｂは、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップの製造工程を示す。図２Ａは、いくつかの実施形態による、エッチング工程後の狭窄部を示す。図２Ｂは、いくつかの実施形態による、堆積工程後の狭窄部を示す。
図３Ａ～図３Ｃは、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップを通る細胞懸濁液のフローパターンを示すフローラインの異なる倍率での様々な図であり、チップは傾斜したアプローチ領域を有さない。
図４は、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップを通る細胞懸濁液のフローパターンを示すフローラインを示し、チップは傾斜したアプローチ領域を有する。
図５Ａ～図５Ｃは、ペイロードを細胞に送達するためのチップの異なる実施形態を通る様々な細胞懸濁液のフローパターンを示すフローラインを示し、実施形態は、異なるそれぞれの角度によって画定されるアプローチ領域を有する（または、図５Ｃの場合、実施形態は、狭窄部に隣接する傾斜したアプローチ領域を有さない）。
図６Ａ～図６Ｃは、ペイロードを細胞に送達するためのチップの異なる実施形態を通る様々な細胞懸濁液の流速を示し、実施形態は、異なるそれぞれの角度によって画定されるアプローチ領域を有する（または、図５Ｉの場合、実施形態は、狭窄部に隣接する傾斜したアプローチ領域を有さない）。 図６Ａ～図６Ｃは、ペイロードを細胞に送達するためのチップの異なる実施形態を通る様々な細胞懸濁液の流速を示し、実施形態は、異なるそれぞれの角度によって画定されるアプローチ領域を有する（または、図５Ｉの場合、実施形態は、狭窄部に隣接する傾斜したアプローチ領域を有さない）。 図６Ａ～図６Ｃは、ペイロードを細胞に送達するためのチップの異なる実施形態を通る様々な細胞懸濁液の流速を示し、実施形態は、異なるそれぞれの角度によって画定されるアプローチ領域を有する（または、図５Ｉの場合、実施形態は、狭窄部に隣接する傾斜したアプローチ領域を有さない）。
図７は、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップを示し、チップは並列化された狭窄部の複数のセットを有し、セットは互いに直列である。
図８は、いくつかの実施形態による、細胞にペイロードを送達させる方法を示す。
図９は、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップを保持するカートリッジを示す。
図１０Ａ～図１０Ｃは、ペイロードを細胞に送達するための様々なチップを示し、チップは様々な幾何学的形状を有する流体流れ領域を有する。
図１１は、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップの実験的送達プロファイルデータを示す。
図１２は、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップの実験的送達プロファイルデータを示す。
図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。 図１３Ａ～図１３Ｏは、いくつかの実施形態による、並列化された狭窄部のセットを有する試験チップからのチップ概略図情報および実験データを示し、セットは互いに直列である。
発明の詳細な説明
細胞懸濁液中の細胞にペイロードを送達するためのシステムにおける使用のための高スループットマイクロ流体チップが以下に開示される。チップは、細胞懸濁液が加圧下で押し出され得る複数の並列化された狭窄部（例えば、狭窄チャネル）を含む。細胞懸濁液の細胞は、マイクロ流体チップの細胞変形狭窄部を通過するために変形し、それらの膜が摂動される可能性がある。本明細書で説明されるように、チップのスループットおよび目詰まり特性は、本明細書に開示されるチップのいくつかの特性のために改善され得る。
以下、図１Ａ～図１Ｃの説明は、細胞内ペイロード送達のための並列化された狭窄部を有するマイクロ流体チップの例示的な実施形態を説明する。次に、図２Ａ～図２Ｂの説明は、細胞内ペイロード送達のためのマイクロ流体チップ内の狭窄部の製造を説明する。次に、図３Ａ～図３Ｃ、図４、図５Ａ～図５Ｃ、および図６Ａ～図６Ｃの説明は、細胞内ペイロード送達のためのチップの狭窄部に隣接するアプローチ領域の様々な幾何学的形状を説明する。次に、図７の説明は、並列化された狭窄部の複数のセットを有し、セットが互いに直列であるマイクロ流体チップの例示的な実施形態を説明する。次に、図８の説明は、本明細書に開示されているようなチップの使用方法を説明する。以下に説明するように、図１～図７を参照して説明したチップおよび／またはチップの幾何学的形状は、いくつかの実施形態では、方法８００で使用することができる。次に、図９の説明は、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのカートリッジ保持チップを説明する。次に、図１０Ａ～図１０Ｃの説明は、様々な幾何学的形状を有する流体流れ領域を有するチップを説明する。次いで、図１１、図１２、および図１３Ａ～図１３Ｏの説明は、本明細書に記載のいくつかの例からの実験データに関する。
以下の説明は、例示的なシステム、方法、技術、パラメータ等を記載する。しかしながら、そのような説明は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、代わりに例示的な実施形態の説明として提供されることを認識されたい。
定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、必要に応じて、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。以下に記載する定義が参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合、記載する定義が優先するものとする。
本明細書で使用される場合、単数「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、特に指示されない限り、複数の言及を含む。
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むことが理解される。
「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および／または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載された特徴、整数、工程、動作、要素、および／または構成要素の存在を指定するが、１またはそれを超える他の特徴、整数、工程、動作、要素、構成要素、および／またはそれらのグループの存在または追加を排除するものではないことが更に理解される。
「場合（ｉｆ）」という用語は、文脈に応じて、「とき、場合（ｗｈｅｎ）」または「時（ｕｐｏｎ）」または「判定に応答して（ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」または「検出に応答して（ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」を意味すると解釈され得る。同様に、「判定された場合（ｉｆ ｉｔ ｉｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）」または「［記載された条件または事象］が検出された場合」という語句は、文脈に応じて、「判定時」または「判定に応答して」または「［記載された条件または事象］の検出時」または「［記載された条件または事象］の検出に応答して」を意味すると解釈され得る。
本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における値またはパラメータ「約」への言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（および説明する）。
本明細書の説明では、様々な要素を説明するために第１、第２等の用語を使用しているが、これらの要素はこれらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある要素を別の要素と区別するためにのみ使用される。
本明細書に記載の構造的および機能的特性のいずれについても、これらの特性を決定する方法は当技術分野で公知である。
特許出願および刊行物を含む本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
細胞内ペイロード送達のためのマイクロ流体チップの幾何学的形状
スループットの向上および細胞目詰まりの低減のためのマイクロ流体チップを以下に説明する。
図１Ａ～図１Ｃは、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップ１００の様々な図を示す。図１Ａは、いくつかの実施形態による、チップ１００の俯瞰図およびチップの狭窄部の拡大ハイライトを示す。図１Ｂは、いくつかの実施形態による、チップ１００の狭窄部およびガイドチャネルの俯瞰図を示す。図１Ｃは、いくつかの実施形態による、チップ１００の狭窄部の断面図を示す。
マイクロ流体チップ１００は、流体入口１１０で流体の流れを受け取るように構成される。流体は、細胞懸濁液を含み得る。いくつかの実施形態では、流体は、細胞への送達のためのペイロードを含み得、ペイロードは、細胞への送達のための任意の適切なカーゴを含み得る。
本明細書における説明の目的のために、チップ１００の方向および寸法は、以下の慣例によって参照され得る：ｘ方向またはｘ寸法は、図１Ａにおいて水平に延びる寸法を指し得る（ｘ方向は、流れ入口から流れ出口へのチップ１００を通る流体の全体的な流れの方向である）；ｙ方向またはｙ寸法は、図１Ａにおいて垂直に延びる寸法を指し得る；ｚ方向またはｚ次元は、図１Ａの紙面の内外を通る次元を指し得る。
いくつかの実施形態では、チップ１００は、圧力下で狭窄部を通って押し出される細胞を変形させるために、少なくとも一次元において十分に狭い１またはそれを超える狭窄部（例えば、狭窄チャネル）を通る流体の流れを導くように構成されたマイクロ流体チップであり得る。細胞が圧力下で狭窄部を通過する際の細胞の変形は、（狭窄部（複数可）を通過する前に懸濁液中に懸濁されるか、または後で懸濁液に添加されることによって）細胞懸濁液中に懸濁されたペイロードが、摂動された細胞膜を通過して細胞に入るように、細胞膜の摂動を引き起こし得る。
チップ１００の例では、チップ１００を通って流れる流体（例えば、細胞懸濁液）は、入口ポート１０２を介してチップ１００に流入することができ、入口１０２から第１の流体流れ領域１０４に流入することができる。第１の流体流れ領域１０４から、流体は、複数の並列化された狭窄部１０６を通って第２の流体流れ領域１０８に（例えば、圧力下で強制されることによって）流れることができる。次いで、流体は、第２の流体流れ領域１０８から出口ポート１１０を介してチップ１００から流出することができる。流体入口ポート１０２と流体出口ポート１１０との間の距離は、チップ１００の基板の平面（例えば、内面）に垂直な方向に延在することができる。流体入口ポート１０２と流体出口ポート１１０との間の距離は、５～３０ｍｍ、８～２５ｍｍ、または１０～２０ｍｍであってもよい。いくつかの実施形態では、流体入口ポート１０２と流体出口ポート１１０との間の距離は、４５０ｍｍ、２５０ｍｍ、１００ｍｍ、５０ｍｍ、３０ｍｍ、２５ｍｍ、２０ｍｍ、１５ｍｍ、１０ｍｍ、または８ｍｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、流体入口ポート１０２と流体出口ポート１１０との間の距離は、５ｍｍ、８ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、２０ｍｍ、２５ｍｍ、３０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２５０ｍｍ、または４５０ｍｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００の流体入口ポート１０２と流体出口ポート１１０との間は交換可能であってもよい。
いくつかの実施形態では、第１の流体流れ領域１０４、狭窄部１０６、および第２の流体流れ領域１０８は全て、シリコン基板等の基板内に形成された凹部空間として形成されてもよい。いくつかの実施形態では、基板の上面にエッチングすることによってｚ方向にエッチングを行ってもよい。いくつかの実施形態では、ウェットエッチングまたはドライエッチングが使用され得る。いくつかの実施形態では、深堀反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を使用してもよい。第１の流体流れ領域１０４、狭窄部１０６、および／または第２の流体流れ領域１０８を形成する凹部空間を画定するために基板にエッチングした後、領域１０４および１０８ならびに狭窄部１０６をｚ方向に囲むように最上層を基板層の上に固定されてもよい。
いくつかの実施形態では、入口ポート１０２および／または出口ポート１１０は、最上層の開口部として形成されてもよい。いくつかの実施形態では、入口ポート１０２および／または出口ポート１１０は、ｚ方向の基板層の底部を通る開口部、またはｘ方向および／またはｙ方向の基板の側面を通る開口部等、エッチングされた基板層の開口部として形成されてもよい。
いくつかの実施形態では、チップ１００は、第１の流体流れ領域１０４および／または第２の流体流れ領域１０８を通って延在し得るピラー１２０を含み得る。ピラー１２０は、チップ１００の最上層を保持する、および／またはチップ１００の最上層を結合し得る支持構造として機能し得る。いくつかの実施形態では、ピラー１２０の形状および／または配置は、第１の流体流れ領域１０４と第２の流体流れ領域１０８との間の狭窄部１０６によって形成された境界の全ての部分に対する均一な流れパターンおよび流速の乱れを最小限に抑えるように選択され得る。例えば、ピラー１２０は、ｙ方向の幅を過度に増加させ、ｘ方向の流体流れを遮断することなく、支持および／または結合のためのピラーの十分なｘ－ｙ表面積を提供するように、ｘ方向の長さよりも短いｙ方向の幅を有し得る。
いくつかの実施形態では、基板とは別個に形成されたポールまたはピラー等の１またはそれを超える追加のおよび／または代替の支持機構が使用されてもよく、および／またはチップ１００の前面および／または後面を覆うことができる１またはそれを超えるバッキング等の外部支持機構が使用されてもよい。
図１Ａの拡大円形図は、チップ１００の複数の狭窄部１０６のサブセットの拡大図を示す。図示のように、狭窄部１０６は、第１の流体流れ領域１０４と第２の流体流れ領域１０８との間の境界を集合的に形成するように、互いに並列に配置されてもよい。チップ１００の例では、狭窄部１０６は、互いに並んで直線状に（ｙ方向に延在して）配置されている。いくつかの実施形態では、互いに並列化された流れ配置の狭窄部のセットは、湾曲した形状および／または直線形状の境界を形成することができる。いくつかの実施形態では、境界の形状は、ｘ－ｙ平面内でチップ１００を斜めに横切って延在し、それによってその全長を増加させ得る。いくつかの実施形態では、境界の形状は、ｘ－ｙ平面内でチップ１００を横切って蛇行または階段状の角度で延在し、それによってその全長を増加させ得る。
図１Ｂは、チップ１００の４つの狭窄部１０６を示す、チップ１００の拡大部分の俯瞰図を示す。図１Ａの円形拡大図のように、図１Ｂの狭窄部１０６は、互いに並んで直線状に（ｙ方向に延在して）配置され、左側の第１の流体流れ領域１０４から右側の第２の流体流れ領域１０８までそれぞれの流路を提供する。図１Ｂの図では、チップ１００の様々な領域の形状および程度を示すために、４つの狭窄部の最上部（ｙ方向）および周囲領域に注釈が付けられている。注釈付き領域は、狭窄部１０６、上流側アプローチ領域１１２ａ、下流側アプローチ領域１１２ｂ、上流側ガイドチャネル１１４ａ、および下流側ガイドチャネル１１４ｂを含む。
図１Ｃは、チップ１００の３つの狭窄部１０６を示す、チップ１００の（断面ｚ－ｙ平面を示す）拡大部分断面図を示す。図１Ａおよび図１Ｂのように、は、互いに並んで直線に（ｙ方向に延在して）配置され、第１の流体流れ領域１０４から第２の流体流れ領域１０８へのそれぞれの流路を提供する。図１Ｃに示すように、狭窄部１０６は、ｚ方向に延在する、例えば、基板の上面からｚ方向に基板内に下方に延在する高さ（例えば、エッチング深さ）を有し得る。いくつかの実施形態では、狭窄部１０６の高さは、対応する上流側アプローチ領域１１２ａ、対応する下流側アプローチ領域１１２ｂ、対応する上流側ガイドチャネル１１４ａ、および／または対応する下流側ガイドチャネル１１４ｂのうちの１またはそれを超える高さと同じであってもよい。
いくつかの実施形態では、スループットを増加させ、目詰まりを減少させ、送達後のペイロード送達の有効性および細胞生存率を維持するために、図１Ｂおよび／または図１Ｃに示す構成要素の１またはそれを超えるいずれかの寸法が選択され得る。
いくつかの実施形態では、狭窄部１０６は、１．４μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、または１０μｍより大きいまたはそれと等しい（図１Ｂに示すｙ方向の）断面狭窄部幅を有し得る。いくつかの実施形態では、（図１Ｂに示すｙ方向の）断面狭窄部幅は、１．４μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、または１０μｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、断面狭窄部幅は、±０．３μｍ、±０．２μｍ、±０．１μｍ、または±０．０５μｍの公差を有し得る。いくつかの実施形態では、断面狭窄部幅は、狭窄部を通過することによって摂動される細胞の直径（例えば、懸濁液中の直径）に従って設定および／または選択され得る。例えば、本明細書に列挙される範囲は、懸濁状態にある間に直径約１．４μｍ～約１０μｍの細胞を処理するように構成され得る。本明細書の開示に照らして、当業者は、異なる断面狭窄部幅（およびそれに対応するチップの他の寸法）が、他の直径の細胞が処理される使用事例において使用され得ることを理解するであろう。例えば、単球の処理は、１０μｍを超える断面狭窄部幅で達成され得る。更に大きな細胞の処理は、最大約０．１ｍｍの断面狭窄部幅で達成され得る。
いくつかの実施形態では、狭窄部１０６は、２．５μｍ、５μｍ、７．５μｍ、１０μｍ、１２．５μｍ、１５μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、５００μｍ、１ｍｍ、５ｍｍ、１ｃｍ、または２ｃｍより大きいまたはそれと等しい（図１Ｂに示すｘ方向の）狭窄部長さを有し得る。いくつかの実施形態では、（図１Ｂに示すｘ方向の）狭窄部長さは、２．５μｍ、５μｍ、７．５μｍ、１０μｍ、１２．５μｍ、１５μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、５００μｍ、１ｍｍ、５ｍｍ、１ｃｍ、または２ｃｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、狭窄部長さは、±２μｍ、±１．５μｍ、±１μｍ、または±０．５μｍの公差を有し得る。
いくつかの実施形態では、狭窄部１０６は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、または１２０μｍより大きいまたはそれと等しい（図１Ｃに示すｚ方向の）狭窄部高さを有し得る。いくつかの実施形態では、狭窄部高さは、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、または１２０μｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、狭窄部高さは、±３μｍ、±２μｍ、±１．５μｍ、±１μｍ、または±０．５μｍの公差を有し得る。
いくつかの実施形態では、狭窄部１０６は、側壁ドラフトを有してもよく、側壁とは、図１Ｃに示すようにｚ方向に垂直に延在し、狭窄部幅を画定する壁のうちの１つを指す。いくつかの実施形態では、側壁ドラフトは、０．０１°、０．０２°、０．０３°、０．０４°、０．０５°、または０．０６°より大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、側壁ドラフトは、０．０１°、０．０２°、０．０３°、０．０４°、０．０５°、または０．０６°より小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、側壁ドラフトは、±０．０２°、±０．０１°、または±０．００５°の公差を有し得る。いくつかの実施形態では、側壁ドラフトは、１°、２°、５°、または１０°より大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、側壁ドラフトは、１°、２°、５°、または１０°より小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。所与のドラフト角度に対して、より高い（より深い）狭窄部は、より短い（より浅い）狭窄部よりも大きく断面狭窄部幅が変化し得ることから、側壁ドラフトの許容範囲は、ｚ次元狭窄高さに依存し得る（狭窄部幅の変動が大きすぎる場合、流体の流れは、狭窄部のより狭い部分を通るのではなく、狭窄部のより広い部分を通って流れ、チャネルのより狭い部分を通らず、細胞膜を摂動することなく流体が狭窄部を通って流れることを可能にする）。したがって、より短い（より浅い）ｚ次元狭窄部高さを有するチップは、より高い（より深い）ｚ次元狭窄部高さを有するチップよりも高い側壁ドラフト角度を有することができる可能性がある。
いくつかの実施形態では、狭窄部１０６は、側壁粗さを有し得る。いくつかの実施形態では、側壁粗さは、０．３μｍ、０．２μｍ、０．１５μｍ、０．１０μｍ、０．０５μｍ、０．０１μｍ、または０．００１μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、側壁粗さは、０．３μｍ、０．２μｍ、０．１５μｍ、０．１０μｍ、または０．０５μｍ、０．０１μｍ、または０．００１μｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。
いくつかの実施形態では、アプローチ領域１１２ａまたは１１２ｂは、狭い端部および広い端部を含むことができ、狭い端部は対応する狭窄部１０６の近位にあり、広い端部は対応するガイドチャネル１１４ａまたは１１４ｂの近位にある。アプローチ領域は、狭い端部の開口部と広い端部の開口部との間で傾斜する直線壁を含む側壁を有することができ、ｘ方向の直線から０°より大きく９０°未満の角度を画定する。アプローチ領域の側壁が互いになす角度は、０°より大きく１８０°未満であってもよい。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の側壁は、狭い端部と広い端部との間に１またはそれを超える湾曲部分（例えば、ｚ方向の上方から見たときに蛇行形状を画定する）および／または角（例えば、ｚ方向の上方から見たときにステップ様の形状を画定する）を含み得る。
いくつかの実施形態では、狭い端部における（図１Ｂに示すｙ方向の）断面アプローチ領域幅は、１．４μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、または１０μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、狭い端部における（図１Ｂに示すｙ方向の）断面アプローチ領域幅は、１．４μｍ、１．６μｍ、１．８μｍ、２．０μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、または１０μｍアプローチ領域より小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、狭い端部における断面アプローチ領域幅は、±０．３μｍ、±０．２μｍ、±０．１μｍ、または±０．０５μｍの公差を有し得る。
いくつかの実施形態では、広い端部における（図１Ｂに示すｙ方向の）断面アプローチ領域幅は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、広い端部における（図１Ｂに示すｙ方向の）断面アプローチ領域幅は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、広い端部における断面アプローチ領域幅は、±０．３μｍ、±０．２μｍ、±０．１μｍ、または±０．０５μｍの公差を有し得る。
いくつかの実施形態では、アプローチ領域の（図１Ｂに示すｘ方向の）長さは、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の（図１Ｂに示すｘ方向の）長さは、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、狭窄部長さは、±２μｍ、±１．５μｍ、±１μｍ、または±０．５μｍの公差を有し得る。
いくつかの実施形態では、アプローチ領域の（図１Ｃに示すｚ方向の）高さは、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、または１２０μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の（図１Ｃに示すｚ方向の）高さは、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、または１２０μｍアプローチ領域より小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、アプローチ領域高さは、±３μｍ、±２μｍ、±１．５μｍ、±１μｍ、または±０．５μｍの公差を有し得る。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の高さは、基板のｚ方向の高さよりも低い任意の適切な高さであってもよい。
いくつかの実施形態では、アプローチ領域１１２ａまたは１１２ｂは、側壁ドラフトを有してもよく、側壁とは、ｚ方向に垂直に延在し、アプローチ領域幅を画定する壁のうちの１つを指す。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の側壁ドラフトは、０．０１°、０．０２°、０．０３°、０．０４°、０．０５°、または０．０６°より大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の側壁ドラフトは、０．０１°、０．０２°、０．０３°、０．０４°、０．０５°、または０．０６°より小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の側壁ドラフトは、±０．０２°、±０．０１°、または±０．００５°の公差を有し得る。いくつかの実施形態では、側壁ドラフトは、１°、２°、５°、または１０°より大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、側壁ドラフトは、１°、２°、５°、または１０°より小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。側壁ドラフトの許容範囲は、狭窄部側壁ドラフトおよび狭窄部高さに関して上述したのと同様に、ｚ次元アプローチ領域高さに依存し得る。
いくつかの実施形態では、アプローチ領域１１２ａまたは１１２ｂは、側壁粗さを有し得る。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の側壁粗さは、０．３μｍ、０．２μｍ、０．１５μｍ、０．１０μｍ、または０．０５μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の側壁粗さは、０．３μｍ、０．２μｍ、０．１５μｍ、０．１０μｍ、または０．０５μｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。
いくつかの実施形態では、アプローチ領域は、アプローチ領域の広い端部からアプローチ領域の狭い端部まで延在する側壁を有し得る。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の対向する側壁は、１６０°、１４０°、１２０°、１００°、８０°、６０°、４０°、または２０°より大きいまたはそれと等しい角度を互いに形成し得る。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の対向する側壁は、１６０°、１４０°、１２０°、１００°、８０°、６０°、４０°、または２０°より小さいまたはそれと等しい角度を互いに形成し得る。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の側壁は、隣接する狭窄部の側壁と８０°、７０°、６０°、５０°、４０°、３０°、２０°、または１０°より小さいまたはそれと等しい角度を形成し得る。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の側壁は、隣接する狭窄部の側壁と８０°、７０°、６０°、５０°、４０°、３０°、２０°、または１０°より大きいまたはそれと等しい角度を形成し得る。
いくつかの実施形態では、ガイドチャネル１１４ａまたは１１４ｂは、対応するアプローチ領域（１１２ａまたは１１２ｂ）に近接する端部と、対応するアプローチ領域から遠位の反対側の端部との間に延在してもよい。
いくつかの実施形態では、（図１Ｂに示すｙ方向の）断面ガイドチャネル幅は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、（図１Ｂに示すｙ方向の）断面ガイドチャネル幅は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、断面ガイドチャネル幅は、±０．３μｍ、±０．２μｍ、±０．１μｍ、または±０．０５μｍの公差を有し得る。
いくつかの実施形態では、（図１Ｂに示すｘ方向の）ガイドチャネル長は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、（図１Ｂに示すｘ方向の）ガイドチャネル長は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、ガイドチャネル長は、±２μｍ、±１．５μｍ、±１μｍ、または±０．５μｍの公差を有し得る。
いくつかの実施形態では、ガイドチャネルの（図１Ｃに示すｚ方向の）高さは、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、または１２０μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、ガイドチャネルの（図１Ｃに示すｚ方向の）高さは、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、または１２０μｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、ガイドチャネルの高さは、±３μｍ、±２μｍ、±１．５μｍ、±１μｍ、または±０．５μｍの公差を有し得る。いくつかの実施形態では、ガイドチャネルの高さは、基板のｚ方向の高さよりも低い任意の適切な高さであってもよい。
いくつかの実施形態では、ガイドチャネル１１４ａまたは１１４ｂは、側壁ドラフトを有してもよく、側壁とは、ｚ方向に垂直に延在し、ガイドチャネル幅を画定する壁のうちの１つを指す。いくつかの実施形態では、ガイドチャネルの側壁ドラフトは、０．０１°、０．０２°、０．０３°、０．０４°、０．０５°、または０．０６°より大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、アプローチ領域の側壁ドラフトは、０．０１°、０．０２°、０．０３°、０．０４°、０．０５°、または０．０６°より小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、ガイドチャネルの側壁ドラフトは、±０．０２°、±０．０１°、または±０．００５°の公差を有し得る。
いくつかの実施形態では、ガイドチャネル１１４ａまたは１１４ｂは、側壁粗さを有し得る。いくつかの実施形態では、ガイドチャネルの側壁粗さは、０．３μｍ、０．２μｍ、０．１５μｍ、０．１０μｍ、または０．０５μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、ガイドチャネルの側壁粗さは、０．３μｍ、０．２μｍ、０．１５μｍ、０．１０μｍ、または０．０５μｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい
いくつかの実施形態では、隣接する並列化狭窄部（および／または対応するアプローチ領域またはガイドチャネル）は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより小さいまたはそれと等しいピッチ１１６だけｙ方向に互いにオフセットされてもよい。いくつかの実施形態では、隣接する並列化狭窄部（および／または対応するアプローチ領域またはガイドチャネル）は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより大きいまたはそれと等しいピッチ１１６だけｙ方向に互いにオフセットされてもよい。
いくつかの実施形態では、隣接する並列化された狭窄部は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより小さいまたはそれと等しい狭窄部側壁厚さ１１８によってｙ方向に互いに分離されてもよい。いくつかの実施形態では、隣接する並列化された狭窄部は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍ、または５００μｍより大きいまたはそれと等しい狭窄部側壁厚さ１１８によってｙ方向に互いに分離されてもよい。
いくつかの実施形態では、隣接する並列化されたガイドチャネルは、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、または２５０μｍより小さいまたはそれと等しいガイドチャネル側壁厚さ１２２によってｙ方向に互いに分離されてもよい。いくつかの実施形態では、隣接する並列化されたガイドチャネルは、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、または２５０μｍより大きいまたはそれと等しいガイドチャネル側壁厚さ１２２によってｙ方向に互いに分離されてもよい。
いくつかの実施形態では、第１の流れ領域１０４、狭窄部１０６、および／または第２の流れ領域１０８が形成される基板は、３００μｍ、４００μｍ、６００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、または５ｍｍより小さいまたはそれと等しい（ｚ方向の）厚さを有し得る。いくつかの実施形態では、第１の流れ領域１０４、狭窄部１０６、および／または第２の流れ領域１０８が形成される基板は、３００μｍ、４００μｍ、６００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、または５ｍｍより大きいまたはそれと等しい（ｚ方向の）厚さを有し得る。約４００μｍより大きいまたはそれと等しい基板厚さは、基板破壊のリスクを低減するのに役立ち得る。
いくつかの実施形態では、チップ１００の最上層（例えば、基板層がエッチングされた後に基板層の上に配置される層）は、３００μｍ、４００μｍ、６００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、または５ｍｍより小さいまたはそれと等しい（ｚ方向の）厚さを有し得る。いくつかの実施形態では、チップ１００の最上層（例えば、基板層がエッチングされた後に基板層の上に配置される層）は、３００μｍ、４００μｍ、６００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、または５ｍｍより大きいまたはそれと等しい（ｚ方向の）厚さを有し得る。
いくつかの実施形態では、入口ポート１０２および／または出口ポート１１０は、２００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、１ｍｍ、または５ｍｍより小さいまたはそれと等しい直径を有する開口部として形成されてもよい。いくつかの実施形態では、入口ポート１０２およびまたは出口ポート１１は、２００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、１ｍｍ、または５ｍｍより大きいまたはそれと等しい直径を有する開口部として形成されてもよい。いくつかの実施形態では、開口部は円形であってもよい。いくつかの実施形態では、開口部は、ｙ方向、ｘ方向、または上記の直径のいずれかより小さいまたはそれと等しいｘ－ｙ平面内の別の方向の寸法を有する任意の形状を有し得る。いくつかの実施形態では、開口部は、ｙ方向、ｘ方向、または上記の直径のいずれかより大きいまたはそれと等しいｘ－ｙ平面内の別の方向の寸法を有する任意の形状を有し得る。
いくつかの実施形態では、第１の流体領域１０４の全部または一部および／または第２の流体領域１０８の全部または一部は、ｚ方向の高さ（例えば、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、または１２０μｍより大きいまたはそれと等しいチップ１００の基板へのエッチング深さを有し得る。いくつかの実施形態では、第１の流体領域１０４の全部または一部および／または第２の流体領域１０８の全部または一部の（ｚ方向の）高さは、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、または１２０μｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、第１の流体領域１０４の高さおよび／または第２の流体領域１０８の高さは、±３μｍ、±２μｍ、±１．５μｍ、±１μｍ、または±０．５μｍの公差を有し得る。
いくつかの実施形態では、１またはそれを超える狭窄部１０６のいずれかは、断面狭窄部周囲長に対する断面狭窄部面積の商よって特徴付けられてもよい。いくつかの実施形態では、断面狭窄部周囲長に対する狭窄部面積の商は、０．５μｍ、０．７５μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、１．１μｍ、１．２５μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、または５μｍより大きくてもよく、またはそれと等しくてもよい。いくつかの実施形態では、断面狭窄部周囲長に対する狭窄部面積の商は、０．５μｍ、０．７５μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、１．１μｍ、１．２５μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、または５μｍより小さくてもよく、またはそれと等しくてもよい いくつかの実施形態では、この商がより高い狭窄部は、この商がより低い狭窄部よりも目詰まりしにくい可能性がある。いくつかの実施形態では、所与の狭窄部幅（これは、狭窄部を通過させることによって摂動される細胞（複数可）の細胞直径（例えば、懸濁液中の細胞の直径）によって決定され得る）について、この商がより高い狭窄部は、この商がより低い狭窄部よりも目詰まりしにくい可能性がある。いくつかの実施形態では、この商の増加は、本明細書に記載されるように、深く狭い矩形の狭窄部（例えば、スリット形状の）を基板（例えば、シリコン基板）にエッチングすることによって達成され得る。狭窄部は、本明細書に記載されるように、狭窄部側壁を互いに並列な十分な角度閾値内に維持しながら、狭窄部側壁材料を十分に深くエッチングおよび／または堆積させることによって形成することができる。さらに、狭窄部は、側壁を互いに距離の所定の包絡線（例えば、公差）内に維持しながら十分に深くエッチングすることによっておよび／または狭窄側部壁材料を堆積させることによって形成され得、その結果、狭窄部を通って押し出された細胞は、細胞が狭窄部を通過する位置（例えば、エッチング深さ）にかかわらず側壁によって変形され得る。このようにして、各々の深く狭い矩形の狭窄部は、同じ直径の細胞を摂動させるように構成されるが基板内に深くエッチングされていない幅を有する狭窄部と比較して、より大きい断面狭窄部面積に起因して、個々のスループットが増加し得る。さらに、狭窄部の目詰まりは狭窄部の縁および角によって引き起こされる可能性があるため、同じ直径の細胞を摂動させるように構成されるが、基板に深くエッチングされていない幅を有するくびれと比較して、深く狭い矩形の狭窄部は、減少した速度で目詰まりする可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、断面狭窄部周囲長を最小にしながら狭窄部面積を増加させることにより、狭窄部目詰まりの可能性および／または程度を最小にしながら、狭窄部ごとのスループットを増加させ得る。
いくつかの実施形態では、第１の流体流れ領域１０４によって囲まれたピラー１２０は、第１の流体流れ領域１０４自体のｘ－ｙ平面内の面積の５～１０％であるｘ－ｙ平面内の集合的な総表面積を有し得る。いくつかの実施形態では、第１の流体流れ領域１０４によって囲まれたピラー１２０は、第１の流体流れ領域１０４自体のｘ－ｙ平面内の面積の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または５０％より小さいまたはそれと等しいｘ－ｙ平面内の集合的な総表面積を有し得る。いくつかの実施形態では、第１の流体流れ領域１０４によって囲まれたピラー１２０は、第１の流体流れ領域１０４自体のｘ－ｙ平面内の面積の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または５０％より大きいまたはそれと等しいｘ－ｙ平面内の集合的な総表面積を有し得る。
いくつかの実施形態では、第２の流体流れ領域１０８によって囲まれたピラー１２０は、第２の流体流れ領域１０８自体のｘ－ｙ平面内の面積の５～１０％であるｘ－ｙ平面内の集合的な総表面積を有し得る。いくつかの実施形態では、第２の流体流れ領域１０８によって囲まれたピラー１２０は、第２の流体流れ領域１０８自体のｘ－ｙ平面内の面積の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または５０％より小さいまたはそれと等しいｘ－ｙ平面内の集合的な総表面積を有し得る。いくつかの実施形態では、第１の流体流れ領域１０８によって囲まれたピラー１２０は、第１の流体流れ領域１０８自体のｘ－ｙ平面内の面積の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または５０％より大きいまたはそれと等しいｘ－ｙ平面内の集合的な総表面積を有し得る。
いくつかの実施形態では、チップ１００は、２ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２５０ｍｍ、４５０ｍｍ、または５００ｍｍより大きいまたはそれと等しいｘ方向のチップ長さを有し得る。いくつかの実施形態では、チップ１００は、２ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２５０ｍｍ、４５０ｍｍ、または５００ｍｍより小さいまたはそれと等しいｘ方向のチップ長さを有し得る。
いくつかの実施形態では、チップ１００は、２ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２５０ｍｍ、４５０ｍｍ、または５００ｍｍより大きいまたはそれと等しいｙ方向のチップ幅を有し得る。いくつかの実施形態では、チップ１００は、２ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２５０ｍｍ、４５０ｍｍ、または５００ｍｍより小さいまたはそれと等しいｙ方向のチップ幅を有し得る。
いくつかの実施形態では、チップ１００は、３００μｍ、４００μｍ、６００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、または５ｍｍより小さいまたはそれと等しいｚ方向の全チップ高さ（例えば、厚さ）を有し得る。いくつかの実施形態では、チップ１００は、３００μｍ、４００μｍ、６００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、または５ｍｍより大きいまたはそれと等しいｚ方向の全チップ高さ（例えば、厚さ）を有し得る。いくつかの実施形態では、全チップ高さは、４００μｍ～３ｍｍであってもよい。
いくつかの実施形態では、第１の流体流れ領域１０４および第２の流体流れ領域１０８を形成するエッチングされた領域は、流れ領域がエッチングされるマイクロ流体チップおよび／または基板の表面積の７５％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％より小さいまたはそれと等しい合わせた表面積（例えば、ｘ－ｙ平面において）を有し得る。いくつかの実施形態では、エッチングされた領域は、マイクロ流体チップおよび／または流れ領域がエッチングされる基板の表面積の７５％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％より大きいまたはそれと等しい合わせた表面積を有し得る。
いくつかの実施形態では、チップ１００は、３００μｍ、４００μｍ、６００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、または３ｍｍより小さいまたはそれと等しいｚ方向の基板厚さを有する狭窄部がエッチングされた基板（例えば、シリコン基板）を有し得る。いくつかの実施形態では、チップ１００は、３００μｍ、４００μｍ、６００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、または３ｍｍより大きいまたはそれと等しいｚ方向の基板厚さを有する狭窄部がエッチングされた基板（例えば、シリコン基板）を有し得る。
いくつかの実施形態では、並列化された狭窄部のセットは、１００１～１５００個の狭窄部、１５０１～２０００個の狭窄部、２００１～２５００個の狭窄部、２５０１～５０００個の狭窄部、または５００１～１００００個の狭窄部を含み得る。いくつかの実施形態では、チップ１００内の並列化狭窄部１０６のセットは、１、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、２，５００、または５，０００より大きいまたはそれと等しい並列化狭窄部を含み得る。いくつかの実施形態では、チップ１００内の並列化狭窄部１０６のセットは、１、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、２，５００、または５，０００より少ないまたはそれと等しい並列化狭窄部を含み得る。本明細書に開示されるように、比較的多数の並列化された狭窄部を有するチップは、細胞懸濁液の高い体積流量、高い細胞スループット、および目詰まりの減少を可能にし得る。
いくつかの実施形態では、チップ１００は、金属、プラスチック、ポリマー、および／またはガラスで作られた１またはそれを超える構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、チップ１００の基板はシリコンを含み得る。いくつかの実施形態では、チップ１００の最上層（例えば、基板層の上に接着または固定された層）は、ガラスおよび／または石英を含み得る。
図１Ｂに示す例では、狭窄部１０６は、図１Ｂに示す俯角から見て、長方形の断面形状を有する。したがって、図１Ｂに示す狭窄部１０６は、（ｘ方向の）長さに沿った、全ての点で均一な（図１Ｂに示すｙ方向の）断面狭窄部幅を有する。いくつかの追加または代替の実施形態では、狭窄部（狭窄部１０６等）は、図１Ｂに示す俯角から見て、台形、湾曲、階段状、または他の不規則な断面形状を有し得る。
例えば、いくつかの実施形態では、狭窄部は、（図１Ｂに示すｙ方向の）均一な断面狭窄部幅を有するのではなく、狭窄部の長さ（ｘ方向）に沿ってｙ方向のその断面幅が（直線的にまたは他の方法で）増加または減少するようにテーパ形状を有し得る。いくつかの実施形態では、テーパ状狭窄部の断面幅は、狭窄部全体の長さに沿って（本明細書に示される断面狭窄部幅のいずれかから）約１％、２％、３％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、または５００％増加または減少し得る。
いくつかの実施形態では、狭窄部は、（図１Ｂに示すｙ方向の）均一な断面狭窄部幅を有するのではなく、多段階狭窄部幅を有してもよく、狭窄部は、狭窄部の（図１Ｂに示すｘ方向の）複数の段が１またはそれを超える他の段のとは異なる断面幅を有する階段状の形状を有する。例えば、いくつかの実施形態では、狭窄部は、第１の段が第２の段よりも狭い、または第２の段が第１の段よりも狭い２つの段を有し得る。狭窄部の段の断面幅は、狭窄部の流れの方向に単調に増加してもよく、狭窄部の流れの方向に単調に減少してもよく、または狭窄部の流れの方向に増加および減少の両方であってもよい（例えば、３つまたはそれを超える狭窄部の段を有する狭窄部の場合）。段は、１つの狭窄部壁または両方の狭窄部壁に形成された（ｙ方向の）ステップによって互いに区別され得る。狭窄部内の段間のステップは、直角のステップとして形成されてもよく、および／またはステップ間のテーパ状の移行領域によって形成されてもよい。
いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える狭窄部の段は、本明細書に開示される断面狭窄部幅のいずれかに等しい断面狭窄部幅を有し得る。いくつかの実施形態では、隣接する狭窄部の段は、互いに約１％、２％、３％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、または５００％異なる断面狭窄部幅を有し得る。
いくつかの実施形態では、任意の１またはそれを超える狭窄部の段は、本明細書に開示される狭窄部長さのいずれかに等しい狭窄部長さを有し得る。あるいは、狭窄部全体を形成する狭窄部の段のセットは、合計して本明細書に開示される狭窄部長さのいずれかに等しい長さを有し得る。
隣接する狭窄部段がテーパ状の狭窄部移行領域によって分離されているいくつかの実施形態では、テーパ状の狭窄部移行領域の長さは、本明細書に開示される狭窄部長さのいずれかの約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、２５％、５０％、または１００％に等しくてもよい。
いくつかの実施形態では、不均一な（例えば、先細りしている）断面幅の狭窄部および／または異なる断面幅の多段を有する狭窄部は、チップが、狭窄部を通過する細胞が狭窄部壁からの圧力を受ける時間を延長することを可能にし、それによって、細胞壁の細孔が開いている時間を延長し、ペイロード送達効率および有効性を増加させ得る。いくつかの実施形態では、最初のより狭い部分とその後のより広い部分とを有する狭窄部は、細孔が最初の部分に迅速かつ効果的に形成され、細胞がより広い部分を通過するときに細孔が開いたままにされることを可能にし得る。より狭い狭窄部に続いてより広い狭窄部を使用することにより、狭窄部全体がより狭い狭窄部幅を有する実施と比較して、細胞生存率を増加させながら効果的なペイロード送達を達成し得る。
図２Ａ～図２Ｂは、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップの製造工程を示す。具体的には、図２Ａは、いくつかの実施形態による、エッチング工程後のチップの狭窄部、例えばチップ１００の狭窄部１０６の部分断面図を示す。図２Ｂは、いくつかの実施形態による、エッチング工程の後に実施される堆積工程後のチップの狭窄部の部分断面図を示す。
図２Ａに示すように、チップ内に狭窄部を形成するためのエッチング工程は、基板から材料を除去してその中にチャネルを形成するために、チップの基板にエッチングダウン（例えば、ｚ方向の下方）することを含み得る。いくつかの実施形態では、エッチング工程は、ドライエッチングおよび／またはウェットエッチングを含み得る。いくつかの実施形態では、エッチング工程は深堀反応性イオンエッチングを含み得る。
いくつかの実施形態では、エッチングされたチャネルは、製造プロセスの終わり（例えば、堆積後）における狭窄部の目標寸法よりも大きい１またはそれを超える寸法（例えば、ｚ方向の高さおよび／またはｙ方向の幅）を有すし得る。
図２Ｂに示すように、エッチング工程に続いて、材料の層がエッチングされた基板上に堆積される堆積工程が実施され得る。いくつかの実施形態では、堆積材料は、ＳｉＯ、プラスチック、ガラス、ケイ素由来材料、プラスチック由来材料、ガラス由来材料、金属（例えば、金、銀、ステンレス鋼、および／またはアルミニウム）、および／または金属由来材料を含み得る。いくつかの実施形態では、この材料層の堆積は、エッチングされたチャネルを、チャネルの垂直（ｚ方向）の側壁に堆積された材料によって狭めることができ、この堆積プロセスによってチャネルを狭めて、所望の狭窄部寸法を有する狭窄部を形成してもよい。
いくつかの実施形態では、堆積層は、１０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、５００ｎｍ、１μｍ、または２μｍより大きいまたはそれと等しい厚さを有し得る。いくつかの実施形態では、堆積層は、１０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、５００ｎｍ、１μｍ、または２μｍより小さいまたはそれと等しい厚さを有し得る。
いくつかの実施形態では、堆積工程後の狭窄部は、図１Ａ～図１Ｃを参照して説明した狭窄部１０６の寸法のいずれかと同じ１またはそれを超える寸法を有し得る。
本明細書に開示されるマイクロ流体チップの流れ特性
本明細書に記載のマイクロ流体チップを通って流れる流体の様々な流体流れ特性を、流体流れ特性に影響を及ぼし得る様々なチップ特性と共に以下に説明する。具体的には、圧力、剪断応力、剪断速度、細胞流量、細胞体積流量、細胞目詰まり速度、および細胞スループットが以下に提供される。
上記で説明したように、本明細書で提供されるマイクロ流体チップは、細胞懸濁液の細胞が上流側の流体流れ領域から狭窄部を通って下流側の流体流れ領域に強制されることを確実にするために圧力下で動作するように設計されており、その結果、細胞の細胞膜は狭窄部を通過することによって摂動される。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、１～２００ＰＳＩ、１０～１５０ＰＳＩ、または２５～１００ＰＳＩで動作するように構成され得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、または２００ＰＳＩより小さいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成され得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、または２００ＰＳＩより大きいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成され得る。
いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、０．５ｍ／ｓ、１ｍ／ｓ、５ｍ／ｓ、１０ｍ／ｓ、１５ｍ／ｓ、２０ｍ／ｓ、２５ｍ／ｓ、３０ｍ／ｓ、４０ｍ／ｓまたは５０ｍ／ｓより大きいまたはそれと等しいチップの狭窄部を通る流体流れ速度を提供し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、０．５ｍ／ｓ、１ｍ／ｓ、５ｍ／ｓ、１０ｍ／ｓ、１５ｍ／ｓ、２０ｍ／ｓ、２５ｍ／ｓ、３０ｍ／ｓ、４０ｍ／ｓまたは５０ｍ／ｓより小さいまたはそれと等しいチップの狭窄部を通る流体流れ速度を提供し得る。
上記で説明したように、本明細書で提供されるマイクロ流体チップは、高スループットを有するように具体的に設計されている。特定の狭窄部の幾何学的形状のために、狭窄部を通過することができる（そして狭窄部によって摂動され得る）細胞数は、所与の時間単位で既知のマイクロ流体チップよりも多い。
いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、０．５μＬ／分、１μＬ／分、１０μＬ／分、１００μＬ／分、５００μＬ／分、１ｍＬ／分、または５ｍＬ／分より大きいまたはそれと等しいチップの単一狭窄部を通る体積流量を提供し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、０．５μＬ／分、１μＬ／分、１０μＬ／分、１００μＬ／分、５００μＬ／分、１ｍＬ／分、または５ｍＬ／分より小さいまたはそれと等しいチップの単一狭窄部を通る体積流量を提供し得る。
いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、０．５ｍＬ／分、１ｍＬ／分、１０ｍＬ／分、１００ｍＬ／分、５００ｍＬ／分、１Ｌ／分、または５Ｌ／分より大きいまたはそれと等しい全体的な体積流量（全ての並列化された狭窄部１０６にわたって合わせた）を提供し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、０．５ｍＬ／分、１ｍＬ／分、１０ｍＬ／分、１００ｍＬ／分、５００ｍＬ／分、１Ｌ／分、または５Ｌ／分より小さいまたはそれと等しい全体的な体積流量（全ての並列化された狭窄部１０６にわたって合わせた）を提供し得る。
いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、５ｍＬ／分、１０ｍＬ／分、１５ｍＬ／分、２０ｍＬ／分、３０ｍＬ／分、または５０ｍＬ／分より小さいまたはそれと等しいチップの狭窄部を通る細胞スループット速度を提供し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、５ｍＬ／分、１０ｍＬ／分、１５ｍＬ／分、２０ｍＬ／分、３０ｍＬ／分、または５０ｍＬ／分より大きいまたはそれと等しいチップの狭窄部を通る細胞スループット速度を提供し得る。
いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、５ｍＬ／分、１０ｍＬ／分、ｍＬ／分、５０ｍＬ／分、１００ｍＬ／分、２００ｍＬ／分、または５００ｍＬ／分より小さいまたはそれと等しい全体的な細胞スループット速度を提供し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップ１００は、５ｍＬ／分、１０ｍＬ／分、ｍＬ／分、５０ｍＬ／分、１００ｍＬ／分、２００ｍＬ／分、または５００ｍＬ／分より大きいまたはそれと等しい全体的な細胞スループット速度を提供し得る。
本明細書に記載のマイクロ流体チップは、流体流れ領域および／または狭窄部における細胞の目詰まりを最小限に抑えるように設計されている。本明細書で提供される実施形態によるマイクロ流体チップを詰まらせるのに必要な細胞の数は、狭窄部の断面積、粒子／細胞直径、および粒子／細胞流量に依存する。この関係は、以下のように定義することができる：
、Ａ＝断面積、Ｄ＝粒子径、Ｖ＝粒子流量
以下、図３Ａ～図３Ｃ、図４、図５Ａ～図５Ｃ、および図６Ａ～図６Ｃは、異なる角度の側壁を有するアプローチ領域を有する実施形態等、異なる流れ特性を有し得るチップの様々な実施形態を示す。
図３Ａ～図３Ｃは、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するための例示的なマイクロ流体チップ３００を通る細胞懸濁液のフローパターンを示すフローラインの異なる倍率での様々な図を示し、チップは傾斜したアプローチ領域を有していない。
図３Ａは、入口ポート３０２、第１の流れ領域３０４と、狭窄部３０６、第２の流れ領域３０８、および出口ポート３１０を含むチップ３００を示す。チップ３００の構成要素は、図１Ａ～図１Ｃに関して上述したチップ１００の対応する（例えば、同様の番号が付けられている）構成要素と共通の任意の１またはそれを超える特性を共有し得る。図３Ｂは、狭窄部３０６のいくつかを含むチップ３００の拡大部分図を示す。図３Ｃは、狭窄部３０６のうちの２つを含むチップ３００の更なる拡大部分図を示す。
図３Ａ～図３Ｃに示すように、チップ３００は、狭窄部３０６に隣接するテーパ状または傾斜したアプローチ領域を有さない。むしろ、狭窄部３０６の側壁は、第１の流れ領域３０４および第２の流れ領域３０８の端部壁と直角である。
チップ３００では、流体（例えば、細胞懸濁液）は、入口ポート３０２から出口ポート３１０にｘ軸寸法（図３Ａ～図３Ｃの紙面の対角線上）で流れることができる。第１の流れ領域３０４、第２の流れ領域３０８および狭窄部３０６全体にわたる湾曲した黒い線は、チップ３００全体を流れる流体（例えば、細胞懸濁液）の流れパターンを示す。パターンの渦流は流れの中断を示し、細胞懸濁液の細胞は流れが中断された点で凝集し得る。流れパターンの平坦な点は、流れの間に細胞が凝集し得る領域を示す。線が分岐する流れパターン内の点は、細胞が凝集し得る領域を示す。
図４は、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するための例示的なマイクロ流体チップ４００を通る細胞懸濁液のフローパターンを示すフローラインを示し、チップは傾斜したアプローチ領域を有する。
図４は、入口ポート４０２、第１の流れ領域４０４、狭窄部４０６、第２の流れ領域４０８、および出口ポート４１０を含むチップ４００を示す。チップ４００の構成要素は、図１Ａ～図１Ｃに関して上述したチップ１００の対応する（例えば、同様の番号が付けられている）構成要素および／または図３Ａ～図３Ｃに関して上述したチップ３００と共通の任意の１またはそれを超える特性を共有し得る。
チップ４００は、狭窄部４０６がそれぞれの狭窄部に隣接するテーパ状アプローチ領域を有し得るという点でチップ３００とは異なり得る。図示される例では、チップ４００は、側壁が２０°の角度で狭窄部４０６に向かって収束し、２０°の角度で狭窄部４０６から分岐するアプローチ領域を有する（角度は、対向するアプローチ領域側壁が互いに作る角度によって画定される）。
チップ４００では、流体（例えば、細胞懸濁液）は、入口ポート４０２から出口ポート４１０にｘ軸寸法（図４の紙面の斜め上）で流れることができる。第１の流れ領域４０４、第２の流れ領域４０８および狭窄部４０６全体にわたる湾曲した黒い線は、チップ４００全体を流れる流体（例えば、細胞懸濁液）の流れパターンを示す。
図３Ａ～図３Ｃで使用されたものと同じ流れパターンを表すための規則が図４で使用され、パターン内の渦流は流れの中断を示し、流れパターン内の平坦な点は流れの間に細胞が凝集し得る領域を示し、線が分岐する流れパターン内の点は細胞が凝集し得る領域を示す。したがって、図４の流れパターンは、図３Ａ～図３Ｃの流れパターンよりも滑らかであり、より均一であり、無秩序ではなく、テーパ状の側壁を有するアプローチ領域は、マイクロ流体チップ内の流れを改善することができ、細胞の凝集および／またはチップの目詰まりを回避するのに役立つことができ、チップのスループットを改善することができ、チップの使用可能寿命を改善することができることを示すことに留意されたい。
図５Ａ～図５Ｃは、ペイロードを細胞に送達するためのチップの異なる実施形態を通る様々な細胞懸濁液のフローパターンを示すフローラインを示し、実施形態は、異なるそれぞれの角度によって画定されるアプローチ領域を有する（または、図５Ｉの場合、実施形態は、狭窄部に隣接する傾斜したアプローチ領域を有さない）。
図５Ａ～図５Ｃに示す実施形態は、図１Ａ～図１Ｃ、図３Ａ～図３Ｃ、および／または図４を参照して上述したチップ（およびその構成要素）と共通のいくつかまたは全ての特性を共有し得るチップの部分拡大図を示す。図５Ａ～図５Ｃに示す実施形態では、流体（例えば、細胞懸濁液）は、図示される狭窄部を通って紙面上の左から右にｘ軸方向に流れることができる。
図５Ａ～図５Ｂのチップ実施形態は、異なるそれぞれの角度によって画定されたアプローチ領域を有し、図５Ｃの場合、実施形態は、狭窄部に隣接する傾斜したアプローチ領域を有さない。図５Ａの実施形態は、それぞれの反対側の側壁と２０°の角度を形成する側壁を有するアプローチ領域を有する。図５Ｂは、４０°の角度の実施形態を示す。図５Ｃは、図３Ａ～図３Ｃに示すものと同様のテーパ状または傾斜したアプローチ領域を含まない（これは「１８０°角度の実施形態」と呼ばれることがある）。
図５Ａ～図５Ｃの様々な実施形態における流体流れパターンは、流体流れ領域、アプローチ領域、および狭窄部に示される矢印によって示される。図示されているように、流体流れパターンは、より緩やかに傾斜したアプローチ領域を有する実施形態では、一般に、より滑らかで、より均一であり、より無秩序なく、より緩やかに傾斜する側壁を有するアプローチ領域は、マイクロ流体チップ内の流れを改善することができ、細胞の凝集および／またはチップの目詰まりを回避するのに役立つことができ、チップのスループットを改善することができ、チップの使用可能寿命を改善することができることを示す。
図６Ａ～図６Ｃは、図５Ａ～図５Ｃに示すものと同様のチップの実施形態を通る様々な細胞懸濁液の流速を示す。図６Ａ～図６Ｃでは、図６Ａのカラーキーに示すように、勾配にまたがる１０個の陰影は、（ａ）０ｍ／ｓ～２．３２７ｍ／ｓの下端部から（ｂ）２０．９３９ｍ／ｓ～２３．２６５ｍ／ｓの上端までの流速を表す。勾配によって示されるように、流速は狭窄部内および狭窄部の周囲でより高い。いくつかの実施形態では、流体が減速および／または停滞するゾーンが（サイズおよび／または量において）最小化および／または排除されるようにチップの幾何学的形状を構成することが望ましい場合がある。図６Ａ～図６Ｂのチップ実施形態は、異なるそれぞれの角度によって画定されたアプローチ領域を有し、図６Ｃの場合、実施形態は、狭窄部に隣接する傾斜したアプローチ領域を有さない。図６Ａの実施形態は、それぞれの反対側の側壁と４０°の角度を形成する側壁を有するアプローチ領域を有する。図６Ｂは、６０°の角度の実施形態を示す。図６Ｃは、図３Ａ～図３Ｃに示すものと同様のテーパ状または傾斜したアプローチ領域を含まない（これは「１８０°角度の実施形態」と呼ばれることがある）。
いくつかの実施形態では、チップ１００は、細胞懸濁液が複数の狭窄部に接近し、複数の狭窄部を通って流れる際に、十分に均一な流速および流れパターンを確保するように構成され得る。いくつかの実施形態では、並列化された狭窄部１０６のセットに対する入口ポート１０２の配置は、均一な流速および流れパターンを確保するのに役立ち得る。チップ１００は、入口ポート１０２が、並列化された狭窄部１０６のセットによって形成されたバリア（例えば、直線または曲線）から、バリアの横方向（例えば、ｙ方向）範囲に対して十分に遠く（例えば、ｘ方向に）離間するように構成されてもよい。
いくつかの実施形態では、複数の狭窄部は、並列化された複数の狭窄部の上流側の第１の流れ領域と、並列化された複数の狭窄部の下流側の第２の流れ領域との間にバリアまたは壁を形成するラインに配置されてもよい。複数の狭窄部によって形成されたバリアは、チップの入口ポートから十分な距離に配置されてもよく、バリアの長さは、当該距離に対して十分に短くてもよく、複数の狭窄部を通る流速および流れパターンは、高スループットおよび低目詰まりを維持するために十分に均一である。
いくつかの実施形態では、入口ポート１０２は、１ｍｍ、２．５ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ１５ｍｍ、２０ｍｍ、または３０ｍｍより大きいまたはそれと等しい最小間隔距離（例えば、入口ポート１０２と並列化された狭窄部のセット上の任意の点との間の最短直線の長さ）だけ一組の並列化狭窄部から離間されていてもよい。いくつかの実施形態では、入口ポート１０２は、１ｍｍ、２．５ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ１５ｍｍ、２０ｍｍ、または３０ｍｍより小さいまたはそれと等しい最小間隔距離だけ並列化された狭窄部のセットから離間されてもよい。
いくつかの実施形態では、入口ポート１０２から境界上の最も近い点までの距離と境界の長さとの比は、０．０００１、０．００５、０．００１、０．０１、０．５、０．１、１、１０、５０、１００、または２５０より大きいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、入口ポート１０２から境界上の最も近い点までの距離と境界の長さとの比は、０．０００１、０．００５、０．００１、０．０１、０．５、０．１、１、１０、５０、１００、または２５０より小さいまたはそれと等しい。
いくつかの実施形態では、入口ポート１０６からの境界上の最も遠い点までの距離と、入口ポート１０６からの境界の最も近い点までの距離との比は、５、２．５、２．２５、２、１．７５、１．５、１．２５、１．１、１．０５、１．０１、または１．００１より小さいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、入口ポート１０６からの境界上の最も遠い点までの距離と、入口ポート１０６からの境界の最も近い点までの距離との比は、５、２．５、２．２５、２、１．７５、１．５、１．２５、１．１、１．０５、１．０１、または１．００１より大きいまたはそれと等しい。いくつかの実施形態では、入口ポート１０６からの境界上の最も遠い点までの距離と、入口ポート１０６からの境界の最も近い点までの距離との比は１に等しい。
いくつかの実施形態では、上記の比を特徴とするチップは、優れた流れの均一性、スループット、および目詰まり耐性性を示すことができる。
並列化された狭窄部の複数のセットを有するチップの実施形態
図７は、いくつかの実施形態による、ペイロードを細胞に送達するためのチップを示し、チップは並列化された狭窄部の複数のセットを有し、セットは互いに直列である。図７は、図１Ａ～図１Ｃを参照して上述したチップ１００と共通の１またはそれを超える特性を共有することができ、チップ７００は、入口ポート７０２から出口ポート７１０への流体（例えば、細胞懸濁液）の流れを、ポート間に流体経路を形成する複数の細胞変形狭窄部を通って先導するように構成され得ることを含む。
しかしながら、チップ１００は、第１の流体流れ領域１０４と第２の流体流れ領域１０８との間に流体流路を形成する互いに並列に設けられた狭窄部７０６の単一のセットを含むが、チップ７００は、流体的に並列化された狭窄部の複数のセットを含んでもよい。図７に示すように、チップ７００は、第１のセットの狭窄部７０６ａ、第２のセットの狭窄部７０６ｂ、第３セットの狭窄部７０６ｃ、第４セットの狭窄部７０６ｄ、および第５セットの狭窄部７０６ｅを含み得る。個々のセット７０６ａ～７０６ｅの各々の中の狭窄部は、チップ１００内の並列化された狭窄部１０６のセットのように、互いに並列に配置されてもよく、上流側の流体流れ領域から下流側の流体流れ領域への流体的に並列化された流路を提供する。しかしながら、並列化された狭窄部７０６ａ～７０６ｂのセット自体は、第１のセット（例えば、７０６ａ）によって提供される流体流路が第２の流路（例えば、７０６ｂ）によって提供される流体流路の上流側にあるように、互いに直列に提供されてもよい。チップ７００では、入口ポート７０２から出口ポート７１０に流れる流体は、第１の流体流れ領域７３０、第２の流体流れ領域７３２、第３の流体流れ領域７３４、第４の流体流れ領域７３６、第５の流体流れ領域７３８、および最後に第６の流体流れ領域７４０を横切ることができ、これらは互いに直列に配置されてもよく、図示のように狭窄部７０６のセットによって分離されてもよい。
いくつかの実施形態では、狭窄部の隣接するセット（例えば、７０６ａおよび７０６ｂ）は、２５μｍ、５０μｍ、１００μｍ、５００μｍ、１ｍｍ、１ｃｍ、または５ｃｍより小さいまたはそれと等しい分だけ流れ方向に互いに（例えば、図７のｘ方向に）オフセットされ得る。いくつかの実施形態では、狭窄部の隣接するセット（例えば、７０６ａおよび７０６ｂ）は、２５μｍ、５０μｍ、１００μｍ、５００μｍ、１ｍｍ、１ｃｍ、または５ｃｍより大きいまたはそれと等しい分だけ流れ方向に互いに（例えば、図７のｘ方向に）オフセットされ得る。
図７の例は、５つの別個の並列化された狭窄部のセットを有するチップ７００を示すが、チップには、任意の適切な数の並列化された狭窄部のセットを設けてもよい。例えば、チップは、直列に設けられた２、３、４、５もしくはそれを超える、１０もしくはそれを超える、または２０もしくはそれを超えるの並列化された狭窄部のセットを有し得る。
本明細書に記載のマイクロ流体チップを使用して細胞にペイロードを送達する方法
図８は、いくつかの実施形態による、細胞にペイロードを送達させる方法を示す。図８の方法は、図１Ａ～図１Ｃのチップ１００または図７のチップ７００等の（これらに限定されない）本明細書に記載の並列化された狭窄部を有する１またはそれを超えるチップを使用して実施され得る。図８は、チップ１００を例示的に参照して以下に説明される。
工程８０２において、マイクロ流体チップ（例えば、図１のマイクロ流体チップ１０２）は、第１の流体流れ領域への流体の流れを受け取る。細胞懸濁液等の流体は、複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体はまた、流体中の１またはそれを超える細胞に送達されるペイロードを含むことができる。具体的には、マイクロ流体チップは、第１の流体流れ領域を並列化された狭窄部のセットの下流側の第２の流体流れ領域に流体接続する並列化された狭窄部の当該セットの上流側にある第１の流体流れ領域内の流体の流れを受け取る。
工程８０４において、マイクロ流体チップ（例えば、図１のマイクロ流体チップ１０２）は、マイクロ流体チップ内の並列化された狭窄部のセットを介して細胞を流動させることによって、流体から細胞の細胞膜を摂動させる。本明細書に記載されるように、狭窄部のセットは、チップの基板内にチャネルをエッチングすることによって形成され得、狭窄部に向かっておよび狭窄部を通って細胞懸濁液を先導するように構成され得る。
工程８０６において、摂動された細胞へのペイロードの送達が行われる。ペイロード送達は、細胞懸濁液が狭窄部を通過し、それによって引き起こされる細胞膜の摂動の後、並列化された狭窄部のセットの下流側の第２の流体流れ領域で行われ得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、摂動後に、第２の流体流れ領域において、および／またはチップ１００とは別個の流体容器もしくはリザーバ内で、細胞懸濁液に導入される。ペイロードの送達後、細胞膜は治癒し得る。
いくつかの実施形態では、例えば方法８００に従って、本明細書に記載のマイクロ流体チップの１またはそれを超える狭窄部を通して処理された細胞は、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％または９９％より大きいまたはそれと等しい狭窄部（複数可）を通過した後の生存率を示し得る。
いくつかの実施形態では、例えば方法８００に従って、本明細書に記載のマイクロ流体チップの１またはそれを超える狭窄部を通して処理された細胞は、３０％、５０％、７０％、９０％、９５％または９９％より大きいまたはそれと等しいペイロード送達割合を示し得る。
カートリッジ内に配置されたチップ
図９は、２つのチップ９０２ａおよび９０２ｂを内部に保持するカートリッジ９００を示す。カートリッジ９００は、内部にチップを保持し、内部に保持されたチップとの間で流体の流れを導くことができる。図９の断面図によって示されるように、Ｏリング９０４は、チップを押圧し、チップの入口または出口ポートを取り囲み、チップを定位置に保持し、入口／出口ポートの周りにシールを形成し、漏れなくチップに出入りする流体の流れを容易にし得る。
流体流れ領域の幾何学的形状
図１０Ａ～図１０Ｃは、様々な流体流れ領域の幾何学的形状を有するチップを示す。具体的には、図１Ａ～図１Ｃに示すチップ１００は、（ｘ－ｙ平面の俯瞰図において）不規則な五角形として成形された流体流れ領域を有するが、図１０Ａ～図１０Ｃのカートリッジは、他の形状の流体流れ領域を有してもよい。
図１０Ａに示すカートリッジ１０００ａは、矩形の形状の流体流れ領域を有する。図１０Ｂに示すカートリッジ１０００ｂは、三角形の形状の流体流れ領域を有する。図１０Ｃに示すカートリッジ１０００ｃは、共に正方形を形成する矩形の形状の流体流れ領域を有する。
実施例１
並列する第１のセットの２つのチップの狭窄部の幅が４μｍであり、並列する第２のセットの２つのチップの狭窄部の幅が４．５μｍである、異なるチップの性能を比較した。各チップは、並列に配置された７５個の狭窄部を含んでいた。全てのチップについて、狭窄部長さは１０μｍであった。全てのチップについて、５０ＰＳＩの圧力および２～８℃の温度を使用した。全てのチップについて、血液製剤Ｈｅｍａｃａｒｅ ＬＰを７．２０×１０７細胞／ｍＬの濃度で使用した。全てのチップについて、ＲＰＭＩの送達媒体および０．０１ｍｇの送達材料であるＭＬ ３ｋＤａデキストランＡＦ６８０を使用した。
チップの性能を以下の表１に示す。
実施例２
並列に配置された７５個の狭窄部を有し、各狭窄部は４μｍの幅および６６μｍのエッチング深さを有するチップの性能を試験した。チップに、４０ＰＳＩ、５０ＰＳＩ、および６０ＰＳＩの圧力下でマイクロ流体スクイーズを行ったこれらの３つのランまたは「スクイーズ」を、３つの対照スクイーズ対照１（６０ＰＳＩで試験した、長さ３０μｍ、幅４μｍ、深さ２０μｍの狭窄部を有するチップ）、対照２（マイクロ流体スクイーズを行わない、細胞懸濁液へのデキストランの添加）、対照３：（デキストランを添加せず、マイクロ流体スクイーズを行わない）に対してプロットして、図１１に示すように、生Ｂ細胞の割合、デキストラン送達の割合、および相対平均蛍光強度を示す。
図１１の右側のグラフは、異なる条件下での細胞によるデキストランの取り込みの蛍光分析を示すヒストグラムである。上位３つのヒストグラムは、異なる圧力：４０ＰＳＩ、５０ＰＳＩ、および６０ＰＳＩの下でのスクイーズを表す。「ＳＴＤ」は、６０ＰＳＩで試験した長さ３０μｍ、幅４μｍ、および深さ２０μｍの狭窄部を有するチップでのスクイーズ条件を表す。「ＳＱＺｅｎｄｏ」は、細胞をスクイーズせずにデキストランと接触させるだけによるデキストランの送達を表し、エンドサイトーシスによる細胞へのデキストランの取り込みを示す。「接触なし」は、デキストランを含まず、スクイーズを行わなかった細胞の蛍光を表す。
並列に配置された７５個の狭窄部を有し、各狭窄部は４μｍの幅および９７μｍのエッチング深さを有するチップの性能を試験した。チップに、１５ＰＳＩ、３０ＰＳＩ、４５ＰＳＩ、および６０ＰＳＩの圧力下でマイクロ流体スクイーズを行った。これらの４つスクイーズを、３つの対照スクイーズ対照１（６０ＰＳＩで試験した、長さ３０μｍ、幅４μｍ、深さ２０μｍの狭窄部を有するチップ）、対照２（マイクロ流体スクイーズを行わない、細胞懸濁液へのデキストランの添加）、対照３：（デキストランを添加せず、マイクロ流体スクイーズを行わない）に対してプロットして、図１２に示すように、生Ｂ細胞の割合、デキストラン送達の割合、および相対平均蛍光強度を示す。
図１２の右側のグラフは、異なる条件下での細胞によるデキストランの取り込みの蛍光分析を示すヒストグラムである。上位４つのヒストグラムは、異なる圧力下：１５ＰＳＩ、３０ＰＳＩ、４５ＰＳＩ、および６０ＰＳＩでのスクイーズを表す。「ＳＴＤ」は、６０ＰＳＩで試験した長さ３０μｍ、幅４μｍ、および深さ２０μｍの狭窄部を有するチップでのスクイーズ条件を表す。「ＳＱＺｅｎｄｏ」は、細胞をスクイーズせずにデキストランと接触させるだけによるデキストランの送達を表し、エンドサイトーシスによる細胞へのデキストランの取り込みを示す。「接触なし」は、デキストランを含まず、スクイーズを行わなかった細胞の蛍光を表す。
実施例３
幅４．５μｍ、長さ１０μｍ、エッチング深さ８０μｍの狭窄部が９５０個並列に配置されたチップを作製した。チップの全体サイズは、縦３０ｍｍ、横２０ｍｍ、高さ（厚さ）１２２５μｍであった。チップは、出口流体ポートから２４ｍｍ離間した入口流体ポートを含み、各ポートは２．００ｍｍの直径を有する。チップは、高さ（厚さ）６００μｍのシリコン基板と、厚さ６００μｍのガラス最上層とを含んでいた。
チップを製造するための目標狭窄部寸法は、狭窄部幅が４．５０±０．２０μｍ、狭窄部長さが１０±１μｍ、狭窄高さ（深さ）が８０±２μｍであった。
チップを作製するための仕様は、以下の表２に示す通りであった：
狭窄部幅を、狭窄部の頂部で測定された、チップ上の全ての狭窄部の１０％の平均狭窄部幅として測定した。
狭窄部幅の変動を、ウエハにわたる選択チップのＳＥＭ断面に基づいて測定された、所与の狭窄部内で測定した。
チップ製造プロセスは、それによって製造されたチップの８０％が表２に記載の仕様内にあると予想されるように構成された。
実施例４
６つのチップタイプについて性能を試験し、６つのチップタイプの各々は、セットが直列である並列に配置された狭窄部の複数のセットを有する。６つのチップタイプは、図１３Ａに概略的に示されている。
チップレイアウト５ｆは、５組の並列化された狭窄部を有し、これらのセットは互いに直列であり、第１の間隔距離だけ互いに離間している。
チップレイアウト５ｃは、５組の並列化された狭窄部を有し、これらのセットは互いに直列であり、第１の間隔距離よりも小さい第２の間隔距離だけ互いに離間している。
チップレイアウト１０は、１０組の並列化された狭窄部を有し、これらのセットは互いに直列であり、第２の間隔距離だけ互いに離間している。
チップタイプ１は、上流側アプローチ領域が２０°の角度で傾斜し、下流側アプローチ領域が４５°の角度で傾斜した「５ｆ」チップレイアウトを有する。
チップタイプ２は、上流側アプローチ領域が２０°の角度で傾斜し、下流側アプローチ領域が４５°の角度で傾斜した「５ｃ」チップレイアウトを有する。
チップタイプ３は、上流側アプローチ領域が２０°の角度で傾斜し、下流側アプローチ領域が４５°の角度で傾斜した「１０」チップレイアウトを有する。
チップタイプ４は、上流側アプローチ領域が２０°の角度で傾斜し、下流側アプローチ領域が６０°の角度で傾斜した「５ｆ」チップレイアウトを有する。
チップタイプ５は、上流側アプローチ領域が２０°の角度で傾斜し、下流側アプローチ領域が６０°の角度で傾斜した「５ｃ」チップレイアウトを有する。
チップタイプ６は、上流側アプローチ領域が２０°の角度で傾斜し、下流側アプローチ領域が６０°の角度で傾斜した「１０」チップレイアウトを有する。
６つのチップタイプの各々について、狭窄部の長さは１０μｍ、幅は３μｍ、高さ（エッチング深さ）は７０μｍであった。
６種類のチップの各々について、８８個のチップを試験した。６つのチップタイプを、異なる圧力を使用して、および／または異なるドナーからの血液を使用して試験した。さらに、チップを、例えば、チップを「前方」および「後方」の両方に走らせることによって、様々な方向で試験した。結果を、走行中に実際に上流側にあったアプローチ領域の角度に従って図１３Ｂ～１３Ｈに示す。すなわち、チップタイプ１の「４５°」とラベル付けされたランでは、４５°のアプローチ領域が上流側になり、２０°のアプローチ領域が下流側になるようにチップを反転させた。結果を以下に示す。
図１３Ｂは、様々な向きで、３人の異なるドナー（Ａ、Ｂ、およびＣ）からの血液を使用する、様々な圧力（３０、４５、６０、７５、９０、および１０５ＰＳＩ）でのチップタイプ１の試験の生存割合および送達割合の結果を示す。
図１３Ｃは、様々な向きで、３人の異なるドナー（Ａ、Ｂ、およびＣ）からの血液を使用する、様々な圧力（３０、４５、６０、７５、９０、および１０５ＰＳＩ）でのチップタイプ１の試験の細胞における活性ＧＦＰの検出を示す。
図１３Ｄは、様々な圧力（３０、４５、６０、７５、９０、および１０５ＰＳＩ）および様々な向きでのチップタイプ１の試験の有効性結果を示す。
図１３Ｅ～１３Ｈは、チップタイプ１の試験のＦＡＣＳプロットを示す。細胞におけるＧＦＰ蛍光を、細胞におけるデキストラン蛍光に対してプロットする。
図１３Ｉは、様々な向きで、３人の異なるドナー（Ａ、Ｂ、およびＣ）からの血液を使用する、様々な圧力（４５、６０、７５、９０、および１０５ＰＳＩ）でのチップタイプ３の試験の生存割合および送達割合の結果を示す。
図１３Ｊは、様々な向きで、３人の異なるドナー（Ａ、Ｂ、およびＣ）からの血液を使用する、様々な圧力（４５、６０、７５、９０、および１０５ＰＳＩ）でのチップタイプ３の試験の発現割合の結果を示す。
図１３Ｋは、様々な圧力（４５、６０、７５、９０、および１０５ＰＳＩ）および様々な向きでのチップタイプ３の試験の有効性結果を示す。
図１３Ｌ～１３Ｏは、チップタイプ３の試験のＦＡＣＳプロットを示す。細胞におけるＧＦＰ蛍光を、細胞におけるデキストラン蛍光に対してプロットする。
実施形態
以下は、特定の実施形態の列挙されたリストである。いくつかの実施形態では、実施形態の依存関係が実施形態を組み合わせることができることを明示的に示さない場合であっても、いずれか１またはそれを超える以下の実施形態のいずれか１またはそれを超える特徴のいずれか１またはそれを超える他の実施形態と組み合わせることができる。
１． 細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップであって、前記チップが、
細胞懸濁液の流れを受け取り、前記細胞懸濁液を前記マイクロ流体チップ内の第１の流体流れ領域に送るように構成された流体入口と、
前記細胞懸濁液が前記マイクロ流体チップ内の前記第１の流体流れ領域から第２の流体流れ領域に１またはそれを超える複数の狭窄部を通って流れることを可能にするために前記第１の流体流れ領域に流体接続された複数の狭窄部であって、
前記複数の狭窄部の各々の断面幅が、前記細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが前記摂動された細胞膜を通過することができるように、前記細胞の膜が前記狭窄部を通過するときに摂動され、
前記複数の狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい、複数の狭窄部と、
前記細胞懸濁液が前記第２の流体流れ領域から前記マイクロ流体チップの外に流れることを可能にするように構成された流体出口と、を含む、マイクロ流体チップ。
２． 前記複数の狭窄部の各々の断面幅が、１．８μｍ、１．９μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、または１０μｍの１またはそれを超えるものより小さいまたはそれと等しい、実施形態１に記載のマイクロ流体チップ。
３． 前記複数の狭窄部の各々の断面高さが２０μｍより大きいまたはそれと等しい、実施形態１～２のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
４． 前記複数の狭窄部の各々が、前記マイクロ流体チップの基板にエッチングすることによって形成され、前記複数の狭窄部の各々の前記断面高さが、前記エッチングのエッチング深さによって画定される、実施形態３に記載のマイクロ流体チップ。
５． 前記基板がシリコンを含む、実施形態４に記載のマイクロ流体チップ。
６． 前記エッチングが深堀反応性イオンエッチングを含む、実施形態４～５のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
７． 前記複数の狭窄部が、１０００個を超える狭窄部を含む、実施形態１～６のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
８． 前記複数の狭窄部が、前記第１の流体流れ領域と前記第２の流体流れ領域との間に境界を形成するように互いに並列に配置される、実施形態１～７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
９． 前記境界の長さに対する前記入口ポートから前記境界上の最も近い点までの距離の比が０．５より大きいまたはそれと等しい、実施形態８に記載のマイクロ流体チップ。
１０． 前記入口ポートからの前記境界上の最も遠い点までの距離と前記入口ポートからの前記境界の最も近い点までの距離との比が１．５より小さいまたはそれと等しい、実施形態８～９のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
１１． 前記境界が直線状に延在する部分を含む、実施形態８～１０のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
１２． 前記境界の長さが４ｍｍより大きいまたはそれと等しい、実施形態８～１１のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
１３． 前記マイクロ流体チップが、全ての狭窄部にわたって１ｍＬ／分より大きいまたはそれと等しい全体スループット速度で動作するように構成される、実施形態１～１２のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
１４． 前記マイクロ流体チップが、１０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成される、実施形態１～１３のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
１５． 前記複数の狭窄部の各々が、前記狭窄部に向かって先細になるテーパ壁を含む各々のアプローチ領域に隣接して配置される、実施形態１～１４のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
１６． 前記テーパ壁が、前記狭窄部の側壁から１０度より大きいまたはそれと等しい、かつ８０度より小さいまたはそれと等しい角度で前記狭窄部に向かって先細になっている、実施形態１５に記載のマイクロ流体チップ。
１７． 前記マイクロ流体チップが、前記複数の狭窄部の平均狭窄部あたり体積流量が１μＬ／分より大きいまたはそれと等しいように構成される、実施形態１～１６のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
１８． 前記第１の流体流れ領域と交差し、前記第１の流体流れ領域の第１の内面の平面を前記第１の流体流れ領域の第２の内面の平面に接続する１またはそれを超えるピラーを含む、実施形態１～１７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
１９． 前記第１の流体流れ領域および前記第２の流体流れ領域を形成するエッチングされた全面積の比が、前記マイクロ流体チップの表面積の５０％より小さいまたはそれと等しい、実施形態１～１８のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
２０． ペイロードを細胞に送達させる方法であって、前記方法が、
マイクロ流体チップの第１の流体流れ領域への細胞懸濁液の流れを受け取ることであって、前記細胞懸濁液が複数の細胞を含む、細胞懸濁液の流れを受け取ることと、
前記細胞懸濁液を前記第１の流体流れ領域から前記マイクロ流体チップの複数の狭窄部を通って流動させることとを含み、
前記複数の狭窄部の各々の断面幅が、前記細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが前記変形された細胞膜を通過することができるように、前記細胞の膜が前記狭窄部を通過するときに変形され、
前記複数の狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい、方法。
２１． 前記細胞懸濁液が前記ペイロードを含む、実施形態２０に記載の方法。
２２． 前記細胞膜の摂動後に前記ペイロードを前記細胞懸濁液と接触させることを含む、実施形態２０～２１のいずれかに記載の方法。
２３． 前記ペイロードを前記細胞懸濁液と接触させた後に前記ペイロードが送達される細胞の割合が３０％より大きいまたはそれと等しい、実施形態２２に記載の方法。
２４． 前記細胞懸濁液が前記マイクロ流体チップの前記複数の狭窄部を通過した後の前記細胞懸濁液中の生細胞の割合が３０％より大きいまたはそれと等しい、実施形態２０～２３のいずれかに記載の方法。
２５． 前記複数の狭窄部の各々の断面幅が、１．８μｍ、１．９μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、または１０μｍのうちの１またはそれを超えるものより小さいまたはそれと等しい、実施形態２０～２４のいずれかに記載の方法。
２６． 前記複数の狭窄部の各々の断面高さが、２０μｍより大きいまたはそれと等しい、実施形態２０～２５のいずれかに記載の方法。
２７． 前記複数の狭窄部が、１０００個を超える狭窄部を含む、実施形態２０～２６のいずれかに記載の方法。
２８． 前記マイクロ流体チップが、全ての狭窄部にわたって１ｍＬ／分より大きいまたはそれと等しい全体スループット速度で動作するように構成される、実施形態２０～２７のいずれかに記載の方法。
２９． 前記細胞懸濁液を前記第１の流体流れ領域から前記複数の狭窄部を通って流動させることが、１０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で前記流体流れを強制することを含む、実施形態２０～２８のいずれかに記載の方法。
３０． 前記細胞懸濁液を前記第１の流体流れ領域から前記複数の狭窄部を通って流動させることが、前記細胞懸濁液を１μＬ／分より大きいまたはそれと等しい前記複数の狭窄部の平均狭窄部あたり体積流量で流動させることを含む、実施形態２０～２９のいずれかに記載の方法。
３１． 細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップを製造する方法であって、前記方法が、
細胞懸濁液が入口ポートから第１の流体流れ領域を通って流れることを可能にするように構成された第１の流体流れ領域を形成するように基板にエッチングすることと、
前記細胞懸濁液が前記第１の流体流れ領域から前記狭窄部を通って流れることを可能にするように構成された複数の狭窄部を形成するために前記基板にエッチングすることとを含み、
前記複数の狭窄部の各々の断面幅が、前記細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが前記変形された細胞膜を通過することができるように、前記細胞の膜が前記狭窄部を通過するときに変形され、
前記複数の狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい、方法。
３２． 前記エッチングされた基板にカバー層を固定して、前記第１の流体流れ領域および前記複数の狭窄部を囲むことを含む、実施形態３１に記載の方法。
３３． 前記複数の狭窄部を形成するための前記基板へのエッチングが深堀反応性イオンエッチングを含む、実施形態３１～３２のいずれかに記載の方法。
３４． 前記複数の狭窄部を形成するために前記基板にエッチングすることが、５０μｍより大きいまたはそれと等しい深さまでエッチングする工程を含む、実施形態３１～３３のいずれかに記載の方法。
３５． 前記基板へのエッチング後に前記基板上に材料の層を堆積させることを含み、前記層を堆積させることにより、前記複数の狭窄部の幅を減少させる、実施形態３１～３４のいずれかに記載の方法。
３６． 細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップであって、前記チップが、
細胞懸濁液の流れを受け取り、前記細胞懸濁液を前記マイクロ流体チップ内の第１の流体流れ領域に送るように構成された流体入口と、
前記細胞懸濁液が前記マイクロ流体チップ内の前記第１の流体流れ領域から第２の流体流れ領域に１またはそれを超える第１の複数の狭窄部を通って流れることを可能にするために前記第１の流体流れ領域に流体接続された第１の複数の狭窄部と、
前記細胞懸濁液が前記マイクロ流体チップ内の前記第２の流体流れ領域から第３の流体流れ領域に１またはそれを超える第２の複数の狭窄部を通って流れることを可能にするために前記第２の流体流れ領域に流体接続された第２の複数の狭窄部であって、
前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の前記狭窄部の各々の断面幅が、前記細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが前記摂動された細胞膜を通過することができるように、前記細胞の膜が前記狭窄部を通過するときに摂動され、
前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の前記狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい、第２の複数の狭窄部と、を含む、マイクロ流体チップ。
３７． 前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の各々の断面幅が、１．８μｍ、１．９μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、または１０μｍのうちの１またはそれを超えるものより小さいまたはそれと等しい、実施形態３６に記載のマイクロ流体チップ。
３８． 前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の各々の断面高さが２０μｍより大きいまたはそれと等しい、実施形態３６～３７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
３９． 前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の各々が、前記マイクロ流体チップの基板にエッチングすることによって形成され、前記複数の狭窄部の各々の前記断面高さが、前記エッチングのエッチング深さによって画定される、実施形態３８に記載のマイクロ流体チップ。
４０． 前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の各々が１０００個を超える狭窄部を含む、実施形態３６～３９のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
４１． 前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部が、２５μｍより大きいまたはそれと等しい最も近い間隔距離だけ互いに離間している、実施形態３６～４０のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
４２． 前記マイクロ流体チップが、全ての狭窄部にわたって１ｍＬ／分より大きいまたはそれと等しい全体スループット速度で動作するように構成される、実施形態３６～４１のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
４３． １０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成される、実施形態３６～４２のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
４４． 前記マイクロ流体チップが、前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の平均狭窄部あたり体積流量が１μＬ／分より大きいまたはそれと等しいように構成される、実施形態３６～４３のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。

Claims (44)

  1. 細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップであって、前記チップが、
    細胞懸濁液の流れを受け取り、前記細胞懸濁液を前記マイクロ流体チップ内の第１の流体流れ領域に送るように構成された流体入口と、
    前記細胞懸濁液が前記マイクロ流体チップ内の前記第１の流体流れ領域から第２の流体流れ領域に１またはそれを超える複数の狭窄部を通って流れることを可能にするために前記第１の流体流れ領域に流体接続された複数の狭窄部であって、
    前記複数の狭窄部の各々の断面幅が、前記細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが前記摂動された細胞膜を通過することができるように、前記細胞の膜が前記狭窄部を通過するときに摂動され、
    前記複数の狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい、複数の狭窄部と、
    前記細胞懸濁液が前記第２の流体流れ領域から前記マイクロ流体チップの外に流れることを可能にするように構成された流体出口と、を含む、マイクロ流体チップ。
  2. 前記複数の狭窄部の各々の断面幅が、１．８μｍ、１．９μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、または１０μｍの１またはそれを超えるものより小さいまたはそれと等しい、請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
  3. 前記複数の狭窄部の各々の断面高さが２０μｍより大きいまたはそれと等しい、請求項１～２のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  4. 前記複数の狭窄部の各々が、前記マイクロ流体チップの基板にエッチングすることによって形成され、前記複数の狭窄部の各々の前記断面高さが、前記エッチングのエッチング深さによって画定される、請求項３に記載のマイクロ流体チップ。
  5. 前記基板がシリコンを含む、請求項４に記載のマイクロ流体チップ。
  6. 前記エッチングが深堀反応性イオンエッチングを含む、請求項４～５のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  7. 前記複数の狭窄部が、１０００個を超える狭窄部を含む、請求項１～６のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  8. 前記複数の狭窄部が、前記第１の流体流れ領域と前記第２の流体流れ領域との間に境界を形成するように互いに並列に配置される、請求項１～７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  9. 前記境界の長さに対する前記入口ポートから前記境界上の最も近い点までの距離の比が０．５より大きいまたはそれと等しい、請求項８に記載のマイクロ流体チップ。
  10. 前記入口ポートからの前記境界上の最も遠い点までの距離と前記入口ポートからの前記境界の最も近い点までの距離との比が１．５より小さいまたはそれと等しい、請求項８～９のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  11. 前記境界が直線状に延在する部分を含む、請求項８～１０のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  12. 前記境界の長さが４ｍｍより大きいまたはそれと等しい、請求項８～１１のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  13. 前記マイクロ流体チップが、全ての狭窄部にわたって１ｍＬ／分より大きいまたはそれと等しい全体スループット速度で動作するように構成される、請求項１～１２のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  14. 前記マイクロ流体チップが、１０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成される、請求項１～１３のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  15. 前記複数の狭窄部の各々が、前記狭窄部に向かって先細になるテーパ壁を含む各々のアプローチ領域に隣接して配置される、請求項１～１４のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  16. 前記テーパ壁が、前記狭窄部の側壁から１０度より大きいまたはそれと等しい、かつ８０度より小さいまたはそれと等しい角度で前記狭窄部に向かって先細になっている、請求項１５に記載のマイクロ流体チップ。
  17. 前記マイクロ流体チップが、前記複数の狭窄部の平均狭窄部あたり体積流量が１μＬ／分より大きいまたはそれと等しいように構成される、請求項１～１６のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  18. 前記第１の流体流れ領域と交差し、前記第１の流体流れ領域の第１の内面の平面を前記第１の流体流れ領域の第２の内面の平面に接続する１またはそれを超えるピラーを含む、請求項１～１７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  19. 前記第１の流体流れ領域および前記第２の流体流れ領域を形成するエッチングされた全面積の比が、前記マイクロ流体チップの表面積の５０％より小さいまたはそれと等しい、請求項１～１８のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  20. ペイロードを細胞に送達させる方法であって、前記方法が、
    マイクロ流体チップの第１の流体流れ領域への細胞懸濁液の流れを受け取ることであって、前記細胞懸濁液が複数の細胞を含む、細胞懸濁液の流れを受け取ることと、
    前記細胞懸濁液を前記第１の流体流れ領域から前記マイクロ流体チップの複数の狭窄部を通って流動させることとを含み、
    前記複数の狭窄部の各々の断面幅が、前記細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが前記変形された細胞膜を通過することができるように、前記細胞の膜が前記狭窄部を通過するときに変形され、
    前記複数の狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい、方法。
  21. 前記細胞懸濁液が前記ペイロードを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記細胞膜の摂動後に前記ペイロードを前記細胞懸濁液と接触させることを含む、請求項２０～２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記ペイロードを前記細胞懸濁液と接触させた後に前記ペイロードが送達される細胞の割合が３０％より大きいまたはそれと等しい、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記細胞懸濁液が前記マイクロ流体チップの前記複数の狭窄部を通過した後の前記細胞懸濁液中の生細胞の割合が３０％より大きいまたはそれと等しい、請求項２０～２３のいずれかに記載の方法。
  25. 前記複数の狭窄部の各々の断面幅が、１．８μｍ、１．９μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、または１０μｍのうちの１またはそれを超えるものより小さいまたはそれと等しい、請求項２０～２４のいずれかに記載の方法。
  26. 前記複数の狭窄部の各々の断面高さが、２０μｍより大きいまたはそれと等しい、請求項２０～２５のいずれかに記載の方法。
  27. 前記複数の狭窄部が、１０００個を超える狭窄部を含む、請求項２０～２６のいずれかに記載の方法。
  28. 前記マイクロ流体チップが、全ての狭窄部にわたって１ｍＬ／分より大きいまたはそれと等しい全体スループット速度で動作するように構成される、請求項２０～２７のいずれかに記載の方法。
  29. 前記細胞懸濁液を前記第１の流体流れ領域から前記複数の狭窄部を通って流動させることが、１０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で前記流体流れを強制することを含む、請求項２０～２８のいずれかに記載の方法。
  30. 前記細胞懸濁液を前記第１の流体流れ領域から前記複数の狭窄部を通って流動させることが、前記細胞懸濁液を１μＬ／分より大きいまたはそれと等しい前記複数の狭窄部の平均狭窄部あたり体積流量で流動させることを含む、請求項２０～２９のいずれかに記載の方法。
  31. 細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップを製造する方法であって、前記方法が、
    細胞懸濁液が入口ポートから第１の流体流れ領域を通って流れることを可能にするように構成された第１の流体流れ領域を形成するように基板にエッチングすることと、
    前記細胞懸濁液が前記第１の流体流れ領域から前記狭窄部を通って流れることを可能にするように構成された複数の狭窄部を形成するために前記基板にエッチングすることとを含み、
    前記複数の狭窄部の各々の断面幅が、前記細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが前記変形された細胞膜を通過することができるように、前記細胞の膜が前記狭窄部を通過するときに変形され、
    前記複数の狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい、方法。
  32. 前記エッチングされた基板にカバー層を固定して、前記第１の流体流れ領域および前記複数の狭窄部を囲むことを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記複数の狭窄部を形成するための前記基板へのエッチングが深堀反応性イオンエッチングを含む、請求項３１～３２のいずれかに記載の方法。
  34. 前記複数の狭窄部を形成するために前記基板にエッチングすることが、５０μｍより大きいまたはそれと等しい深さまでエッチングする工程を含む、請求項３１～３３のいずれかに記載の方法。
  35. 前記基板へのエッチング後に前記基板上に材料の層を堆積させることを含み、前記層を堆積させることにより、前記複数の狭窄部の幅を減少させる、請求項３１～３４のいずれかに記載の方法。
  36. 細胞にペイロードを送達させるためのマイクロ流体チップであって、前記チップが、
    細胞懸濁液の流れを受け取り、前記細胞懸濁液を前記マイクロ流体チップ内の第１の流体流れ領域に送るように構成された流体入口と、
    前記細胞懸濁液が前記マイクロ流体チップ内の前記第１の流体流れ領域から第２の流体流れ領域に１またはそれを超える第１の複数の狭窄部を通って流れることを可能にするために前記第１の流体流れ領域に流体接続された第１の複数の狭窄部と、
    前記細胞懸濁液が前記マイクロ流体チップ内の前記第２の流体流れ領域から第３の流体流れ領域に１またはそれを超える第２の複数の狭窄部を通って流れることを可能にするために前記第２の流体流れ領域に流体接続された第２の複数の狭窄部であって、
    前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の前記狭窄部の各々の断面幅が、前記細胞懸濁液中の細胞の直径よりも小さく、それにより、ペイロードが前記摂動された細胞膜を通過することができるように、前記細胞の膜が前記狭窄部を通過するときに摂動され、
    前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の前記狭窄部の各々の断面周囲長に対する断面積の商が、０．５μｍより大きいまたはそれと等しい、第２の複数の狭窄部と、を含む、マイクロ流体チップ。
  37. 前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の各々の断面幅が、１．８μｍ、１．９μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、または１０μｍのうちの１またはそれを超えるものより小さいまたはそれと等しい、請求項３６に記載のマイクロ流体チップ。
  38. 前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の各々の断面高さが２０μｍより大きいまたはそれと等しい、請求項３６～３７のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  39. 前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の各々が、前記マイクロ流体チップの基板にエッチングすることによって形成され、前記複数の狭窄部の各々の前記断面高さが、前記エッチングのエッチング深さによって画定される、請求項３８に記載のマイクロ流体チップ。
  40. 前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の各々が１０００個を超える狭窄部を含む、請求項３６～３９のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  41. 前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部が、２５μｍより大きいまたはそれと等しい最も近い間隔距離だけ互いに離間している、請求項３６～４０のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  42. 前記マイクロ流体チップが、全ての狭窄部にわたって１ｍＬ／分より大きいまたはそれと等しい全体スループット速度で動作するように構成される、請求項３６～４１のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  43. １０ｐｓｉより大きいまたはそれと等しい圧力で動作するように構成される、請求項３６～４２のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
  44. 前記マイクロ流体チップが、前記第１の複数の狭窄部および前記第２の複数の狭窄部の平均狭窄部あたり体積流量が１μＬ／分より大きいまたはそれと等しいように構成される、請求項３６～４３のいずれかに記載のマイクロ流体チップ。
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