JP2024502028A

JP2024502028A - 配列決定ライブラリー調製のための方法および組成物

Info

Publication number: JP2024502028A
Application number: JP2023539958A
Authority: JP
Inventors: ムンディング，エリザベス; ブランシェット，マルコ
Original assignee: ダブテイルゲノミクスエルエルシー
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2024-01-17
Also published as: EP4271804A1; US20240084291A1; AU2021411520A1; WO2022147129A1; CA3203900A1

Abstract

【解決手段】本明細書では、近接ライゲーションの方法およびそのような方法で使用するための組成物が提供される。単一細胞核酸立体構造の評価、または単一細胞核酸配列もしくはフェージング情報の決定に関する実施形態も本明細書で提供される。立体構造が保存されたまたは立体構造が再構築された核酸試料は、試料から生成されたペアエンドライブラリーの分析時に、ペアエンドがパーティション起源または細胞起源に割り当てられるように、アリコート識別配列セグメントが付加されたアリコートに断片化および分布させることができる。したがって、配列と３次元核酸配置における細胞特異的な変化を判定することができる。【選択図】図３２

Description

相互参照
本出願は、２０２０年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１３２，３０４号、２０２１年２月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１４５，８５９号、２０２１年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２１６，１７０号、２０２１年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２１７，００９号、２０２１年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／２２４，７２２号、および２０２１年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／２８１，４９９号の利点を主張するものであり、上記文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

高品質の連続したゲノム配列を得ることは、特に、限定された供給源材料が配列分析に利用可能である場合、しばしば困難である。生配列データを得ることは、より速く、より低コストで利用可能になってきたが、データを効率的かつ正確に分析して組み立てるための好適な方法は、依然として課題である。

一態様では、核酸処理の方法が提供される。場合によっては、方法は、少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された試料を得る工程と、核酸分子を、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを含む複数のセグメントに切断する工程であって、切断がトランスポザーゼによって達成される、工程と、第１のセグメントおよび第２のセグメントに第１のリコンビナーゼ部位を結合させる工程と、リコンビナーゼの存在下で、第２のリコンビナーゼ部位を含むリンカーに、第１のセグメントおよび第２のセグメントを接触させる工程であって、それによって、第１のセグメント由来の第１の配列と、リンカー由来のリンカー配列と、第２のセグメント由来の第２の配列とを含む結合された核酸を生成する、工程とを含む。いくつかの実施形態では、切断する工程および結合させる工程は、協奏反応で生じる。他の実施形態では、切断する工程および結合させる工程は連続して生じる。

場合によっては、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである。場合によっては、第２のリコンビナーゼ部位は、直接反復配列（ｄｉｒｅｃｔｒｅｐｅａｔｓ）として配向された２つのリコンビナーゼ部位を含む。場合によっては、リコンビナーゼはインテグラーゼである。場合によっては、インテグラーゼは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはそれらの組み合わせである。

場合によっては、方法は、結合された核酸の５’末端を、結合された核酸の３’末端にライゲーションすることによって、結合された核酸を環状化する工程をさらに含む。

特定の場合において、方法は、結合された核酸の少なくとも一部を配列決定する工程をさらに含む。特定の場合において、配列決定する工程は、第１の配列の少なくとも一部および第２の配列の少なくとも一部を配列決定することを含む。特定の場合において、方法は、第１の配列の少なくとも一部および第２の配列の少なくとも一部をゲノムにマッピングする工程をさらに含む。特定の場合において、方法は、配列決定からの情報を使用して三次元ゲノム解析を行う工程をさらに含む。

様々な場合において、安定化された試料はクロスリンクされた試料である。様々な場合において、安定化された試料を得る工程は、試料を得ることと、試料を安定化することとを含む。様々な場合において、安定化された試料を得る工程は、前もって安定化された試料を得ることを含む。様々な場合において、核酸結合タンパク質は、クロマチンまたはその成分を含む。様々な場合において、安定化された試料は、約６２℃にて約０．３％ＳＤＳで細胞を処理することによって調製された核を含む。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位および第２のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰおよびａｔｔＢインテグラーゼ部位を含む。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位は、第２のリコンビナーゼ部位とは異なる。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位である。様々な場合において、第２のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位である。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位はａｔｔＰインテグラーゼ部位であり、第２のリコンビナーゼ部位はａｔｔＢインテグラーゼ部位である。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位はａｔｔＢインテグラーゼ部位であり、第２のリコンビナーゼ部位はａｔｔＰインテグラーゼ部位である。様々な場合において、結合された核酸はヘアピンループを形成しない。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位および第２のリコンビナーゼ部位は、トランスポザーゼモザイク末端を含む。様々な場合において、リンカー配列はバーコード配列を含む。様々な場合において、バーコード配列は、パーティション起源を示す。様々な場合において、バーコード配列は、細胞起源を示す。様々な場合において、バーコード配列は、細胞集団起源を示す。様々な場合において、バーコード配列は、生物起源を示す。様々な場合において、バーコード配列は、種起源を示す。様々な場合において、パーティションは、アレイまたはビーズ上のウェル、液滴、または表面位置である。様々な場合において、方法は４時間以下で完了する。様々な場合において、安定化された試料は、５０，０００個以下の細胞を含む。様々な場合において、安定化された試料は、少なくとも１０，０００個の細胞を含む。様々な場合において、安定化された試料は安定化された核を含む。様々な場合において、安定化された試料は、５０，０００個以下の核を含む。様々な場合において、安定化された試料は、少なくとも１０，０００個の核を含む。様々な場合において、安定化された試料は超音波処理されない。

別の態様では、核酸処理の方法が提供され、方法は、少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された試料を得る工程と、核酸分子を、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを含む複数のセグメントへ切断する工程と、第１のセグメントおよび第２のセグメントに第１のリコンビナーゼ部位を結合させる工程と、リコンビナーゼの存在下で、第２のリコンビナーゼ部位を含むリンカーに、第１のセグメントおよび第２のセグメントを接触させる工程であって、それによって、第１のセグメント由来の第１の配列と、リンカー由来のリンカー配列と、第２のセグメント由来の第２の配列とを含む結合された核酸を生成し、第２のリコンビナーゼ部位は、直接反復配列として配向された２つのリコンビナーゼ部位を含む、工程とを含む。いくつかの実施形態では、切断する工程および結合させる工程は、協奏反応で生じる。他の実施形態では、切断する工程および結合させる工程は連続して生じる。別の態様では、核酸処理の方法が提供され、方法は、少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された試料を得る工程と、核酸分子を、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを含む複数のセグメントへ切断する工程と、第１のセグメントおよび第２のセグメントに第１のリコンビナーゼ部位を結合させる工程と、リコンビナーゼの存在下で、第２のリコンビナーゼ部位を含むリンカーに、第１のセグメントおよび第２のセグメントを接触させる工程であって、それによって、第１のセグメント由来の第１の配列と、リンカー由来のリンカー配列と、第２のセグメント由来の第２の配列とを含む結合された核酸を生成する、工程とを含む。いくつかの実施形態では、第２のリコンビナーゼ部位は、直接反復配列として配向された２つのリコンビナーゼ部位を含む。

場合によっては、切断する工程はトランスポザーゼによって達成される。場合によっては、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼである。場合によっては、リコンビナーゼはインテグラーゼである。場合によっては、インテグラーゼは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはそれらの組み合わせである。

特定の場合において、安定化された試料はクロスリンクされた試料である。特定の場合において、安定化された試料を得る工程は、試料を得ることと、試料を安定化することとを含む。特定の場合において、安定化された試料を得る工程は、前もって安定化された試料を得ることを含む。特定の場合において、核酸結合タンパク質は、クロマチンまたはその成分を含む。特定の場合において、第１のリコンビナーゼ部位および第２のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰおよびａｔｔＢインテグラーゼ部位を含む。特定の場合において、第１のリコンビナーゼ部位は、第２のリコンビナーゼ部位とは異なる。特定の場合において、第１のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位である。特定の場合において、第２のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位である。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位はａｔｔＰインテグラーゼ部位であり、第２のリコンビナーゼ部位はａｔｔＢインテグラーゼ部位である。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位はａｔｔＢインテグラーゼ部位であり、第２のリコンビナーゼ部位はａｔｔＰインテグラーゼ部位である。特定の場合において、結合された核酸はヘアピンループを形成しない。特定の場合において、第１のリコンビナーゼ部位および第２のリコンビナーゼ部位は、トランスポザーゼモザイク末端を含む。特定の場合において、リンカー配列はバーコード配列を含む。

様々な場合において、バーコード配列は、パーティション起源を示す。様々な場合において、バーコード配列は、細胞起源を示す。様々な場合において、バーコード配列は、細胞集団起源を示す。様々な場合において、バーコード配列は、生物起源を示す。様々な場合において、バーコード配列は、種起源を示す。様々な場合において、パーティションは、アレイまたはビーズ上のウェル、液滴、または表面位置である。様々な場合において、方法は４時間以下で完了する。様々な場合において、安定化された試料は、５０，０００個以下の細胞を含む。様々な場合において、安定化された試料は、少なくとも１０，０００個の細胞を含む。様々な場合において、安定化された試料は安定化された核を含む。様々な場合において、安定化された試料は、約６２℃にて約０．３％ＳＤＳで細胞を処理することによって調製された核を含む。様々な場合において、安定化された試料は、５０，０００個以下の核を含む。様々な場合において、安定化された試料は、少なくとも１０，０００個の核を含む。様々な場合において、安定化された試料は超音波処理されない。

他の態様では、（ａ）少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された生体試料を得る工程と、（ｂ）複合体を形成するために核酸分子をデンドリマーと接触させる工程であって、デンドリマーの１つ以上のポリマーが末端の一級アミンを含む、工程と、（ｃ）核酸分子を、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを含む複数のセグメントへ切断する工程と、（ｄ）複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを接合部で結合させる工程と、を含む方法が提供される。場合によっては、デンドリマーはクロスリンカー（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）で修飾される。場合によっては、方法は、（ｂ）の前に、デンドリマーをクロスリンカーに接触させる工程をさらに含む。場合によっては、クロスリンキング剤は挿入剤、抗生物質、または副溝結合剤を含む。場合によっては、クロスリンカーはソラレン、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンを含む。場合によっては、ソラレンはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル－コンジュゲートソラレンを含む。場合によっては、デンドリマーはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを含む。場合によっては、上記方法はさらに、（ｅ）デンドリマーからクロスリンカーを分離する工程をさらに含む。場合によっては、分離する工程は熱アルカリ処理を含む。場合によっては、分離する工程はＵＶ放射への曝露を含む。場合によっては、複数のセグメントの一部は結合してコンカテマーを形成する。場合によっては、コンカテマーは少なくとも３個のセグメントを含む。場合によっては、コンカテマーは少なくとも４個のセグメントを含む。場合によっては、コンカテマーは少なくとも５個のセグメントを含む。場合によっては、コンカテマーは少なくとも６個のセグメントを含む。場合によっては、コンカテマーは少なくとも８個のセグメントを含む。場合によっては、コンカテマーは少なくとも１０個のセグメントを含む。場合によっては、デンドリマーの分子量は、５キロダルトン（ｋＤａ）～１２５ｋＤａである。場合によっては、デンドリマーの分子量は、６ｋＤａ～８ｋＤａである。場合によっては、デンドリマーの分子量は、２５ｋＤａ～３５ｋＤａである。場合によっては、デンドリマーの分子量は、１１０ｋＤａ～１２５ｋＤａである。場合によっては、デンドリマーは３２～５１２個の反応基を含む。場合によっては、デンドリマーは約３２個の反応基を含む。場合によっては、デンドリマーは約１２８個の反応基を含む。場合によっては、デンドリマーは約５１２個の反応基を含む。場合によっては、方法は、（ｂ）の後に、デンドリマー複合体を光活性化する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、（ｆ）複数の選択されたセグメントを得るために、複数のセグメントをサイズ選択に供する工程をさらに含む。場合によっては、切断する工程は、核酸分子をデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）と接触させることを含む。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、小球菌ヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、安定化された生体試料はクロスリンキング剤で処理される。場合によっては、クロスリンキング剤は化学的固定剤である。場合によっては、化学的固定剤は、ホルムアルデヒド、ソラレン、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、紫外線、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、クロスリンキング剤は、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンを含む。場合によっては、クロスリンキング剤は挿入剤、抗生物質、または副溝結合剤を含む。場合によっては、安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料である。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された細胞溶解物を含む。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された無傷細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された無傷の核を含む。様々な場合において、安定化された試料は、約６２℃にて約０．３％ＳＤＳで細胞を処理することによって調製された核を含む。場合によっては、工程（ｃ）は、無傷細胞または無傷の核の溶解の前に実施される。場合によっては、方法は、工程（ｄ）の前に、安定化された生体試料中で細胞および／または核を溶解させる工程をさらに含む。場合によっては、安定化された生体試料は３，０００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１，０００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、結合させる工程は、ビオチンタグ付きヌクレオチドを使用して粘着末端をｆｉｌｌ－ｉｎすること、および平滑末端をライゲーションすることを含む。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも１つの架橋オリゴヌクレオチドに、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを接触させることを含む。場合によっては、架橋オリゴヌクレオチドはバーコード配列を含む。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを、複数の架橋オリゴヌクレオチドに連続して接触させることを含む。場合によっては、結合させる工程は、架橋オリゴヌクレオチドの固有の配列を受け取る安定化された生体試料の試料、細胞、核、染色体、または核酸分子をもたらす。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントをバーコードに接触させることを含む。場合によっては、結合させる工程は、パーティションで行われる。場合によっては、パーティションは、アレイまたはビーズ上のウェル、液滴、または表面位置である。場合によっては、上記方法はさらに、（ｇ）第１のリード対を生成するために接合部の各側で少なくともいくつかの配列を得る工程を含む。場合によっては、上記方法はさらに、（ｈ）第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、（ｉ）ゲノムに対する順序および／または配向を表すコンティグのセットを通る経路を決定する工程とを含む。場合によっては、上記方法はさらに、（ｈ）第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、（ｉ）コンティグのセットから、安定化された生体試料中の構造バリアントの存在またはヘテロ接合性の喪失を決定する工程とを含む。場合によっては、上記方法はさらに、（ｈ）第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、（ｉ）コンティグのセット内のバリアントをフェーズに割り当てる工程とを含む。場合によっては、上記方法はさらに、（ｈ）第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、（ｉ）コンティグのセットから、コンティグのセットにおけるバリアントの存在を決定する工程と、（ｊ）（１）安定化された生体試料についての疾患段階、予後、または処置の経過を同定すること、（２）バリアントの存在に基づいて薬物を選択すること、または、（３）安定化された生体試料についての薬物効力を同定すること、のうちの１つ以上から選択される工程を行う工程とを含む。

別の態様では、（ａ）少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子および少なくとも１つの非コードＲＮＡを含む安定化された生体試料を得る工程と、（ｂ）Ｔｎ５トランスポザーゼ、ならびに、モザイク末端および検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチドに、ＤＮＡ分子を接触させる工程であって、それによってＤＮＡ分子を断片化し、断片化したＤＮＡ分子の末端にオリゴヌクレオチドを結合させる、工程と、（ｃ）断片をＴ４ＲＮＡリガーゼに接触させる工程であって、それによって非コードＲＮＡをオリゴヌクレオチドにライゲーションし、クロスリンクを脱クロスリンクする（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ）、工程と、（ｄ）二本鎖ＤＮＡ断片を作製するために、ライゲーションされたＲＮＡを逆転写酵素で伸長させる工程と、（ｅ）検出可能な標識に結合する薬剤に結合されたエンドヌクレアーゼに二本鎖ＤＮＡ断片を接触させる工程であって、それによって検出可能な標識付近のＤＮＡを消化する、工程と、（ｆ）配列決定アダプターを（ｅ）の生成物に結合させる工程と、を含む分析方法が提供される。場合によっては、非コードＲＮＡは長い非コードＲＮＡである。場合によっては、オリゴヌクレオチドはアデニル化されている。場合によっては、検出可能な標識はビオチンを含む。場合によっては、薬剤はストレプトアビジンを含む。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、小球菌ヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、方法は、（ｆ）の生成物を濃縮する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、二本鎖ＤＮＡ断片の配列を得る工程をさらに含む。場合によっては、方法は、（ｂ）の前に、安定化された生体試料をＲＮａｓｅＨに接触させる工程をさらに含む。場合によっては、安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料である。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された細胞溶解物を含む。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された無傷細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された無傷の核を含む。場合によっては、オリゴヌクレオチドはバーコードをさらに含む。

引用による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が引用によって組み込まれるよう具体的かつ個別に示されるかのように、同じ程度まで引用により本明細書に組み込まれる。

本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明と、添付図面とを引用することによって得られるであろう。
不十分に処理された（図１Ａ）および十分に処理された（図１Ｂ）安定化された組織試料を示す。不十分に処理された（図１Ａ）および十分に処理された（図１Ｂ）安定化された組織試料を示す。定量化および断片サイズ分析を示す。本開示の様々な実施形態にかかる例示的なコンピュータシステムの様々な構成要素を示す。本開示の様々な実施形態に関連して使用することができる例示的なコンピュータシステムのアーキテクチャを示すブロック図である。本開示の様々な実施形態に関連して使用することができる例示的なコンピュータネットワークを示す図である。本開示の様々な実施形態に関連して使用することができる別の例示的なコンピュータシステムのアーキテクチャを示すブロック図である。ＭＮａｓｅ－Ｃと比較したＤＮａｓｅ－Ｃについてのリード対分離分布のグラフを示す。ＭＮａｓｅ－Ｃと比較したＤＮａｓｅ－Ｃについての１番染色体について計算された連鎖距離の累積分布のグラフを示す。ＭＮａｓｅ消化の様々な時間および条件についての高占有率ＣＴＣＦ結合部位の周りの相対的なリードカバレッジのグラフを示す。ＭＮａｓｅ消化の様々な時間および条件についてのＭＮａｓｅ処理された試料の消化パターン、ならびに各試料中のモノヌクレオソーム：ジヌクレオソームの計算された比を示す。ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ（ＵＣＳＣ）ＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒからのＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＤＮＡＥｌｅｍｅｎｔｓ（ＥＮＣＯＤＥ）において報告されたピークと比較したＣｈＩＰ－ｓｅｑおよびＨｉＣｈＩＰの結果を示す。ＨｉＣｈＩＰ試料についてのＣＴＣＦ結合部位周辺の相対的なリードカバレッジを示す。標的タンパク質に関連するリードのパイルアップを示すリードカバレッジのグラフ（図１１に示す）および遺伝子アノテーションのグラフにわたって提示されるリード対の接触マップを示す。図１１と同じＥＮＣＯＤＥピークに対するＭＮａｓｅＨｉＣｈＩＰ結果の比較であるが、同じ日およびその後の日の試料反復についての比較を示す。本開示の様々な実施形態にかかる、各ＤＮＡセグメントを結合するために架橋オリゴヌクレオチドを使用する、改良された近接ライゲーションのための例示的なワークフローを示す。本開示の様々な実施形態にかかる、分割およびプーリング手法を使用する例示的なワークフローを示す。本開示の様々な実施形態にかかる、分割およびプーリング手法を使用する例示的なワークフローを示す。本開示の様々な実施形態にかかる、分割およびプーリング手法から得られるバーコードと架橋との組み合わせの例を示す。例示的なインテグラーゼ活性の工程を示す。図１９Ａでは、ｐｈｉＣ３１プロファージＤＮＡがストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）に組み込まれていることが分かる。例示的なインテグラーゼ活性の工程を示す。図１９Ｂでは、インテグラーゼが、細菌ゲノム中のファージａｔｔＢ部位およびａｔｔＰ配列に結合し、鎖交換を誘発していることが分かる。例示的なインテグラーゼ活性の工程を示す。図１９Ｃでは、組み込みが３塩基短い２つの新しい配列ａｔｔＬおよびａｔｔＲに分解していることが分かる。例示的なインテグラーゼ活性の工程を示す。図１９Ｄでは、環状リンカーが組み込みに必要でないことが分かる。組み込み部位の内部露出された末端への送達の例として、ＤＮａｓｅ消化クロマチンへのアダプターライゲーションによるａｔｔＰ送達を描いている。３３塩基ａｔｔＢセグメントに隣接する配列が、例えば、パーティション識別セグメントを使用して交換され得ることを示す。ａｔｔＢ線状ＤＮＡの組み込みが凝集体内ライゲーションを引き起こすことを示す。ライブラリー調製アプローチを描いている。図２３Ａでは、ａｔｔＢ含有分子に組み込まれたビオチンが見られるが、ａｔｔＰアダプターはホスホチオレート化ヌクレオチドを保有している。ライブラリー調製アプローチを描いている。図２３Ｂでは、ストレプトアビジンプルダウンがビオチン含有分子のみをプルダウンするために使用されることが分かる。ライブラリー調製アプローチを描いている。図２３Ｃでは、ａｔｔＰ特異的増幅が、組み込まれた分子のみを増幅するために使用されることが分かる。ライブラリー調製アプローチを描いている。図２３Ｄでは、代替的にまたは組み合わせて、エキソヌクレアーゼ活性が、組み込まれていない分子および非アダプターライゲーション核酸を除去するために使用されることが分かる。近接ライゲーション事象の単一核タグ付けのための組み込みの使用を描いている。（図の上部から下部へ）断片化（例えば、ＤＮａｓｅを用いるなどの酵素消化による）、末端平滑化（ｅｎｄｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）およびＡテーリング、組換え部位のライゲーション（例えば、Ａテール適合性ａｔｔＢ部位）、リンカーとの組換え（例えば、ａｔｔＰリンカー）、およびクロスリンクの脱クロスリンク（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｒｅｖｅｒｓａｌ）を含む、リコンビナーゼ（例えば、インテグラーゼ）ベースの近接ライゲーションであって、ゲノムの異なる領域に由来する近接ライゲーションされた核酸をもたらすものの例示的な概略図を示している。（図の上部から下部へ）非組換えｇＤＮＡにライゲーションされた例示的なＥＰオーバーハングａｔｔＢ部位、非組換えｇＤＮＡにライゲーションされた例示的なａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位を有する例示的な非組換えビオチンリンカー、ｇＤＮＡ上のａｔｔＢ部位に組換えられたリンカーの１つの末端、およびｇＤＮＡ上のａｔｔＢ部位と組換えられたリンカーの両方の末端を含む、リコンビナーゼベースの近接ライゲーションのための例示的な核酸配列を示す。配列決定アダプター部位（例えば、Ｐ７およびＰ５配列決定Ｙアダプター）を伴うａｔｔＢ部位の例示的な設計および核酸配列を、それ自体（上部）で、および非組換えｇＤＮＡへのライゲーションされた状態（下部）で示している。他のすべての遊離末端とハイブリダイゼーション適合性である一本鎖オーバーハングを有する多くの遊離末端を有する消化された再構成されたクロマチン凝集体を描いている。単一塩基がｆｉｌｌ－ｉｎされた状態の図２８の消化された再構成されたクロマチン凝集体を描いており、各一本鎖オーバーハングを再アニーリングおよび再ライゲーションに不適合にしている。再構成された凝集体の修飾された遊離末端と適合する切断（ｐｕｎｃｔｕａｔｉｏｎ）オリゴヌクレオチドとライゲーションされた図２９の部分的にｆｉｌｌ－ｉｎされた消化された再構成されたクロマチン凝集体を描いている。図３０のライゲーション産物とその後のＤＮＡ結合タンパク質からの放出から生じる切断されたＤＮＡ分子を示す。各ゲノムセグメントは、その既知の配列によって同定可能な切断オリゴヌクレオチドによって描写される。ゲノムセグメントはすべて、その出発再構成クロマチン凝集体における入力分子のいくつかの領域を表す。したがって、このセットのリードはハプロタイプフェージングされ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅｐｈａｓｅｄ）、アセンブリまたはハプロタイプフェーズの再構築に使用することができる。Ｔｎ５を使用して核酸を断片化し、ＡｔｔＢタグを付加し、その後核酸末端のＰｈｉＣ３１結合を行う試料調製方法を描いている。精製されたタグ付き核酸は、増幅に基づくライブラリー調製の前に環状化される。図３２の方法のための例示的なワークフローを描いている。異なる方法を用いて調製されたライブラリーを使用して得られたカバレッジ均一性の比較を描いている。異なる方法を用いて調製されたライブラリー特性の比較を描いている。異なる方法を用いて調製されたライブラリーの所定のゲノム間隔における接触数の比較を描いている。ライブラリー調製におけるプライマーの取り込みの戦略を描いている。異なるライブラリー調製方法を用いて得られたロングレンジ情報の比較を描いている。長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）結合部位を同定する方法を描いている。

１つの態様において、ロングレンジおよび構造ゲノムの情報を含むゲノム配列の決定、細胞における核酸の物理的立体構造の決定に関連する、ならびにいくつかの他の方法よりも改善された結果を有する核酸の極端にロングレンジのリード対を生成するための、組成物、システム、および方法が本明細書において提供される。本明細書の方法は、最適な結果を達成するために、限定されないが、クロスリンクした核酸のトランスポザーゼ断片化、インテグラーゼ組換え、および低入力要件を含む技術を利用することができる。２０２０年６月２５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３９６５６は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

トランスポザーゼ断片化クロマチン
１つの態様において、核酸プロセシングの方法が本明細書で提供される。そのような方法は、少なくとも１つの核酸結合タンパク質と複合体形成した核酸分子を含む安定化された試料を得る工程と、核酸分子を、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを含む複数のセグメントに切断する工程を含むことができ、切断する工程はトランスポザーゼによって達成される。本明細書に記載の方法は、第１のセグメントおよび第２のセグメントに第１のリコンビナーゼ部位を結合させる工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、切断する工程および結合させる工程は、協奏反応で生じる。他の実施形態では、切断する工程および結合させる工程は連続して生じる。さらに、本明細書に記載の方法は、リコンビナーゼの存在下で、第２のリコンビナーゼ部位を含むリンカーに、第１のセグメントおよび第２のセグメントを接触させる工程であって、それによって、第１のセグメント由来の第１の配列と、リンカー由来のリンカー配列と、第２のセグメント由来の第２の配列とを含む結合された核酸を生成する、工程を含むことができる。場合によっては、安定化された試料は超音波処理されない。

本明細書の方法の様々な態様において、安定化された核酸を切断する工程は、トランスポザーゼを使用して行われる。場合によっては、切断する工程は、透過処理された細胞において行われる。場合によっては、切断する工程は、透過処理された核において行われる。場合によっては、トランスポザーゼは、Ｔｎ５、Ｔｎ３、Ｔｎ７、ｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ、またはそれらの組み合わせである。場合によっては、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼである。

本明細書の方法の様々な態様において、リコンビナーゼ部位を含むリンカーは、リコンビナーゼの存在下で切断された核酸に接触させることができ、リコンビナーゼ部位は、直接反復配列として配向された２つのリコンビナーゼ部位を含む。場合によっては、直接反復配列として配向されたリコンビナーゼ部位の存在は、得られる産物が安定したヘアピン構造を形成することを防ぎ得る。場合によっては、結合された核酸は、ヘアピンループを形成しない。場合によっては、得られた産物は、リコンビナーゼ部位が逆反復配列として配向されている産物よりも容易に配列決定される。

本明細書の方法の様々な態様では、切断された核酸の第１のセグメントおよび第２のセグメントを、リコンビナーゼの存在下でインテグラーゼ部位を含むリンカーに接触させる。場合によっては、リコンビナーゼはインテグラーゼである。場合によっては、インテグラーゼは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはそれらの組み合わせである。

様々な態様において、リコンビナーゼ産物が環状化される、核酸を処理する方法が提供される。場合によっては、リコンビナーゼの末端を除去して、ライゲーションの前に第１のセグメントおよび第２のセグメントを露出させる。いくつかの実施形態では、環状化産物は、配列決定ライブラリーを作製するためにＰＣＲを使用して増幅される。この方法の例を図３２および図３３に例示する。

本明細書の方法の様々な態様において、リンカーは、モザイク末端、配列決定アダプター、およびａｔｔＢ配列を含む。代替的に、リンカーはモザイク末端および配列決定アダプターを含み、ａｔｔＢ配列は、組換えの前に、例えば、リガーゼを用いてトランスポザーゼ産物に付加される。

本明細書の方法の特定の態様では、方法は、本明細書で提供される方法などの任意の適切な方法を介して結合された核酸の少なくとも一部を配列決定する工程をさらに含むことができる。場合によっては、配列決定する工程は、第１の配列の少なくとも一部および第２の配列の少なくとも一部を配列決定することを含み得る。特定の場合において、方法は、第１の配列の少なくとも一部および第２の配列の少なくとも一部をゲノムにマッピングする工程をさらに含み得る。様々な場合において、方法は、配列決定からの情報を使用して三次元ゲノム解析を行う工程をさらに含み得る。

本明細書の方法の様々な態様において、安定化された試料は、クロスリンクされた試料であり得る。場合によっては、安定化された試料はクロスリンクされた細胞であり得る。場合によっては、安定化された試料はクロスリンクされた核であり得る。場合によっては、安定化された試料はクロスリンクされたクロマチンであり得る。場合によっては、安定化された試料を得る工程は、試料を得ることと、試料を安定化することを含むことができる。場合によっては、安定化された試料を得る工程は、前もって安定化された試料を得ることを含むことができる。場合によっては、核酸結合タンパク質は、クロマチンまたはその成分を含むことができる。

本明細書の方法の様々な態様において、レコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰおよびａｔｔＢインテグラーゼ部位を含むことができる。場合によっては、第１のリコンビナーゼ部位は、第２のリコンビナーゼ部位とは異なり得る。場合によっては、第１のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位であり得る。場合によっては、第２のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位であり得る。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位はａｔｔＰインテグラーゼ部位であり、第２のリコンビナーゼ部位はａｔｔＢインテグラーゼ部位である。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位はａｔｔＢインテグラーゼ部位であり、第２のリコンビナーゼ部位はａｔｔＰインテグラーゼ部位である。場合によっては、第１のリコンビナーゼ部位および第２のリコンビナーゼ部位は、トランスポザーゼモザイク末端を含むことができる。

本明細書の方法の様々な態様では、リンカーはさらなる配列を含むことができる。場合によっては、リンカー配列はバーコード配列を含むことができる。場合によっては、バーコード配列は、パーティション起源を示すことがある。場合によっては、バーコード配列は、細胞起源を示すことがある。場合によっては、バーコード配列は、細胞集団起源を示すことがある。場合によっては、バーコード配列は、生物起源を示すことがある。場合によっては、バーコード配列は、種起源を示すことがある。場合によっては、リンカーはアダプターを含むことができる。場合によっては、アダプターはＰ５配列を含むことができる。場合によっては、アダプターはＰ７配列を含むことができる。

本明細書の方法の様々な態様において、方法は、１日未満で完了することがある。場合によっては、方法は８時間未満で完了することがある。場合によっては、方法は６時間未満で完了することがある。場合によっては、方法は４時間以下で完了することがある。場合によっては、方法は４～６時間で完了することがある。場合によっては、方法は４～８時間で完了することがある。場合によっては、方法は３～４時間で完了することがある。

本明細書の方法の様々な態様では、方法は、試料材料の非常に低い入力を必要とし得る。場合によっては、安定化された試料は、５０，０００個以下の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は、４０，０００個以下の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は、３０，０００個以下の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は、２０，０００個以下の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は少なくとも１０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は少なくとも２０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は少なくとも３０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は少なくとも４０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約３０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約４０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約４０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約３０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約２０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約４０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約３０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約３０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約３０，０００個の細胞～約４０，０００個の細胞を含むことができる。

本明細書の方法の様々な態様では、安定化された試料は核を含むことがある。場合によっては、安定化された試料は、５０，０００個以下の核を含むことがある。場合によっては、試料は、４０，０００個以下の核を含むことがある。場合によっては、試料は、３０，０００個以下の核を含むことがある。場合によっては、試料は、２０，０００個以下の核を含むことがある。場合によっては、試料は少なくとも１０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は少なくとも２０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は少なくとも３０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は少なくとも４０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約３０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約４０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約４０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約３０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約２０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約４０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約３０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約３０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約３０，０００個の核～約４０，０００個の核を含むことがある。

直接反復配列として配向されたリコンビナーゼ部位
別の態様では、少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された試料を得る工程を含む核酸処理の方法が提供される。次に、方法は、核酸分子を、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを含む複数のセグメントに切断する工程と、第１のリコンビナーゼ部位を第１のセグメントおよび第２のセグメントに結合させる工程とを含むことができる。それから、方法は、リコンビナーゼの存在下で、第２のリコンビナーゼ部位を含むリンカーに、第１のセグメントおよび第２のセグメントを接触させる工程であって、それによって、第１のセグメント由来の第１の配列と、リンカー由来のリンカー配列と、第２のセグメント由来の第２の配列とを含む結合された核酸を生成し、第２のリコンビナーゼ部位は、直接反復配列として配向された２つのリコンビナーゼ部位を含む、工程を含む。場合によっては、安定化された試料は超音波処理されないことがある。

本明細書の方法の様々な態様において、安定化された核酸を切断する工程は、トランスポザーゼを使用して行われることがある。場合によっては、切断する工程は、透過処理された細胞において行われることがある。場合によっては、切断する工程は、透過処理された核において行われることがある。場合によっては、トランスポザーゼは、Ｔｎ５、Ｔｎ３、Ｔｎ７、ｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ、またはそれらの組み合わせであり得る。場合によっては、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼであり得る。

本明細書の方法の様々な態様において、リコンビナーゼ部位を含むリンカーは、リコンビナーゼの存在下で切断された核酸に接触させてもよく、リコンビナーゼ部位は、直接反復配列として配向された２つのリコンビナーゼ部位を含む。場合によっては、直接反復配列として配向されたリコンビナーゼ部位の存在は、得られる産物が安定したヘアピン構造を形成することを防ぎ得る。場合によっては、結合された核酸は、ヘアピンループを形成しない。場合によっては、得られた産物は、リコンビナーゼ部位が逆反復配列として配向されている産物よりも容易に配列決定され得る。

本明細書の方法の様々な態様では、切断された核酸の第１のセグメントおよび第２のセグメントを、リコンビナーゼの存在下でインテグラーゼ部位を含むリンカーに接触させてもよい。場合によっては、リコンビナーゼはインテグラーゼであり得る。場合によっては、インテグラーゼは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはそれらの組み合わせであり得る。

本明細書の方法の様々な態様では、方法は、本明細書で提供される方法などの任意の適切な方法を介して結合された核酸の少なくとも一部を配列決定する工程をさらに含むことができる。場合によっては、配列決定する工程は、第１の配列の少なくとも一部および第２の配列の少なくとも一部を配列決定することを含むことができる。場合によっては、方法は、第１の配列の少なくとも一部および第２の配列の少なくとも一部をゲノムにマッピングする工程をさらに含む。場合によっては、方法は、配列決定からの情報を使用して三次元ゲノム解析を行う工程をさらに含む。

本明細書の方法の様々な態様において、安定化された試料は、クロスリンクされた試料であり得る。場合によっては、安定化された試料はクロスリンクされた細胞であり得る。場合によっては、安定化された試料はクロスリンクされた核であり得る。場合によっては、安定化された試料はクロスリンクされたクロマチンであり得る。場合によっては、安定化された試料を得る工程は、試料を得ることと、試料を安定化することを含む。場合によっては、安定化された試料を得る工程は、前もって安定化された試料を得ることを含む。場合によっては、核酸結合タンパク質は、クロマチンまたはその成分を含む。

本明細書の方法の様々な態様において、レコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰおよびａｔｔＢインテグラーゼ部位を含むことができる。場合によっては、第１のリコンビナーゼ部位は、第２のリコンビナーゼ部位とは異なり得る。場合によっては、第１のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位であり得る。場合によっては、第２のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位であり得る。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位はａｔｔＰインテグラーゼ部位であり、第２のリコンビナーゼ部位はａｔｔＢインテグラーゼ部位である。様々な場合において、第１のリコンビナーゼ部位はａｔｔＢインテグラーゼ部位であり、第２のリコンビナーゼ部位はａｔｔＰインテグラーゼ部位である。場合によっては、第１のリコンビナーゼ部位および第２のリコンビナーゼ部位は、トランスポザーゼモザイク末端を含み得る。

本明細書の方法の様々な態様では、リンカーはさらなる配列を含み得る。場合によっては、リンカー配列はバーコード配列を含み得る。場合によっては、バーコード配列は、パーティション起源を示すことがある。場合によっては、バーコード配列は、細胞起源を示すことがある。場合によっては、バーコード配列は、細胞集団起源を示すことがある。場合によっては、バーコード配列は、生物起源を示すことがある。場合によっては、バーコード配列は、種起源を示すことがある。場合によっては、リンカーはアダプターを含むことができる。場合によっては、アダプターはＰ５配列を含むことができる。場合によっては、アダプターはＰ７配列を含むことができる。

本明細書の方法の様々な態様において、方法は、１日未満で完了することがある。場合によっては、方法は８時間未満で完了することがある。場合によっては、方法は６時間未満で完了することがある。場合によっては、方法は４時間以下で完了することがある。場合によっては、方法は４～６時間で完了することがある。場合によっては、方法は４～８時間で完了することができる。場合によっては、方法は３～４時間で完了することができる。

本明細書の方法の様々な態様では、方法は、試料材料の非常に低い入力を必要とすることができる。場合によっては、安定化された試料は、５０，０００個以下の細胞を含むことがある。場合によっては、試料は、４０，０００個以下の細胞を含むことがある。場合によっては、試料は、３０，０００個以下の細胞を含むことがある。場合によっては、試料は、２０，０００個以下の細胞を含むことがある。場合によっては、試料は少なくとも１０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は少なくとも２０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は少なくとも３０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は少なくとも約４０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約３０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約４０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約４０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約３０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約２０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約４０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約３０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約３０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、試料は約３０，０００個の細胞～約４０，０００個の細胞を含むことができる。

本明細書の方法の様々な態様では、安定化された試料は核を含むことがある。場合によっては、安定化された試料は、５０，０００個以下の核を含むことがある。場合によっては、試料は、４０，０００個以下の核を含むことがある。場合によっては、試料は、３０，０００個以下の核を含むことがある。場合によっては、試料は、２０，０００個以下の核を含むことがある。場合によっては、試料は少なくとも１０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は少なくとも２０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は少なくとも３０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は少なくとも４０，０００個の核を含むことがある。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことができる。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことができる。場合によっては、試料は約３０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことができる。場合によっては、試料は約４０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことができる。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約４０，０００個の核を含むことができる。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約３０，０００個の核を含むことができる。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約２０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことができる。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約４０，０００個の核を含むことができる。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約３０，０００個の核を含むことができる。場合によっては、試料は約３０，０００個の核～約５０，０００個の核を含むことができる。場合によっては、試料は約３０，０００個の核～約４０，０００個の核を含むことができる。

コンカテマーを作製するための近接ライゲーション
本明細書では、近接ライゲーションを使用してコンカテマー形成を可能にする組成物、システム、および方法が提供される。例えば、核酸結合タンパク質と複合体化された核酸分子を有する安定化された生体試料などの生体試料を、デンドリマーと接触させて複合体を形成することができる。別の例では、生体試料は、デンドリマーと接触させることによって安定化させて複合体を形成することができる。次に、核酸分子を、複数のセグメント、例えば、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントに切断することができる。その後、複数のセグメントを複数の接合部に結合させることができ、例えば、第１のセグメントおよび第２のセグメントを接合部に結合させることができる。

本明細書の方法の特定の態様では、生体試料、例えば、核酸結合タンパク質およびデンドリマーと複合体化された核酸分子を有する安定化された生体試料。場合によっては、デンドリマーはソラレンとコンジュゲートされる。場合によっては、デンドリマーはアジド－Ｐｅｇ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとコンジュゲートされる。場合によっては、アジド－Ｐｅｇ４－ＮＨＳエステルのＮＨＳエステルは、デンドリマー上の一級アミンと反応して、反応性アジド基を有するデンドリマーを生じさせる。場合によっては、カルボキシル化ビーズ（例えば、磁気ビーズ）は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／スルホ－ＮＨＣ化学を用いて、ジベンゾシクロオクチン－アミン（ＤＢＣＯ）－Ｐｅｇ４－アミンビルディングブロックとコンジュゲートすることによって調製される。これらの調製されたビーズは、例えば、近接ライゲーションの前に磁気分離法によってデンドリマーを単離するために使用することができる。

場合によっては、デンドリマーは化合物で修飾されるか、または化合物と接触させる。例えば、場合によっては、デンドリマーはソラレンで修飾される。場合によっては、ソラレンはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル－コンジュゲートソラレンを含む。場合によっては、デンドリマーはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを含む。場合によっては、デンドリマーは、クロスリンキング剤、例えば、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンで修飾される。場合によっては、デンドリマーは、挿入剤、抗生物質、または副溝結合剤で修飾される。

本明細書の方法は、デンドリマーから化合物を分離する工程を含むことができる。例えば、ソラレンなどの化合物は、熱を使用してデンドリマーから分離することができる。場合によっては、ソラレンなどの化合物は、アルカリ条件または高ｐＨを使用して、デンドリマーから分離される。代替的に、ソラレンなどの化合物は、熱およびアルカリ条件を使用して、デンドリマーから分離される。化合物（例えば、ソラレン）はさらに、ＵＶ放射を使用してデンドリマーから分離され得る。

任意の適切なデンドリマーを、本明細書の方法において使用することができる。デンドリマーの分子量は、約５キロダルトン（ｋＤａ）～約１２５ｋＤａであり得る。場合によっては、デンドリマーの分子量は、６ｋＤａ～８ｋＤａである。場合によっては、デンドリマーの分子量は、２５ｋＤａ～３５ｋＤａである。場合によっては、デンドリマーの分子量は、１１０ｋＤａ～１２５ｋＤａである。場合によっては、デンドリマーは３２～５１２個の反応基を含む。場合によっては、デンドリマーは約３２個の反応基を含む。場合によっては、デンドリマーは約１２８個の反応基を含む。場合によっては、デンドリマーは約５１２個の反応基を含む。場合によっては、デンドリマーはＧｅｎ３デンドリマーである。場合によっては、デンドリマーはＧｅｎ５デンドリマーである。場合によっては、デンドリマーはＧｅｎ７デンドリマーである。

本明細書の方法は、セグメントの少なくとも一部をコンカテマーに結合させることができる。例えば、コンカテマーを形成するために、少なくとも２個のセグメント、少なくとも３個のセグメント、少なくとも４個のセグメント、少なくとも５個のセグメント、少なくとも６個のセグメント、少なくとも７個のセグメント、少なくとも８個のセグメント、少なくとも９個のセグメント、少なくとも１０個のセグメント、またはそれ以上を結合させることができる。場合によっては、オリゴヌクレオチドは、各セグメント間に結合される。場合によっては、オリゴヌクレオチドは架橋オリゴヌクレオチドである。場合によっては、オリゴヌクレオチドはアダプターオリゴヌクレオチドである。場合によっては、オリゴヌクレオチドは切断オリゴヌクレオチドである。場合によっては、架橋オリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、および／または切断オリゴヌクレオチドは、バーコード配列を含む。場合によっては、架橋オリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、および／または切断オリゴヌクレオチドは、ジベンゾ－シクロオクチン（ＤＢＣＯ）部分で修飾される。場合によっては、ＤＢＣＯ部分は、銅フリークリックケミストリー（ｃｏｐｐｅｒｆｒｅｅｃｌｉｃｋｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を促進する。場合によっては、複数のオリゴヌクレオチドは、各セグメント間に連続して結合される。結合は、オリゴヌクレオチド（例えば、架橋オリゴヌクレオチド）の固有の配列を受け取る安定化された生体試料の試料、細胞、核、染色体、または核酸分子をもたらすことができる。

場合によっては、デンドリマーを安定化された生体試料と接触させて複合体を形成した後、例えば、約３６０ｎｍの波長を有するＵＶ放射線に複合体を曝露することによって複合体を光活性化し、それによってクロスリンクした複合体を生成する。場合によっては、クロスリンキングは、核酸上に付加物を残すことなく脱クロスリンク可能（ｒｅｖｅｒｓａｂｌｅ）である。

本明細書の方法は、複数の選択されたセグメントを得るために、複数のセグメントをサイズ選択に供する工程をさらに含むことができる。本明細書のサイズ選択は、セグメントサイズの任意の適切な範囲を含むことができる。。

本明細書に提供される方法における切断は、任意の適切な方法を使用して、例えば、ヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を使用することによって行うことができる。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、小球菌ヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む。

本明細書の方法の安定化された生体試料は、安定化剤またはクロスリンキング試薬を用いて処理されることによって安定化させることができる。場合によっては、クロスリンキング剤は、化学的固定剤、例えば、ホルムアルデヒド、ソラレン、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、紫外線、またはそれらの組み合わせである。場合によっては、クロスリンキング剤は、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンを含む。場合によっては、クロスリンキング剤は挿入剤、抗生物質、または副溝結合剤を含む。安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料であり得る。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された無傷細胞または安定化された無傷の核を含む。場合によっては、方法は、安定化された生体試料中の細胞および／または核を溶解する工程を含む。本明細書の方法の切断する工程は、無傷細胞または無傷の核の溶解の前に行うことができる。

本明細書の方法は、少数の細胞を含む、安定化された生体試料上で行うことができる。例えば、場合によっては、安定化された生体試料は３，０００，０００個未満の細胞を含む。安定化された生体試料は、約１，０００，０００個未満の細胞、約５００，０００個未満の細胞、約４００，０００個未満の細胞、約３００，０００個未満の細胞、約２００，０００個未満の細胞、約１００，０００個未満の細胞、またはそれ未満を含むことができる。

本明細書の方法の態様では、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくともいくつかの配列を得る工程をさらに含むことができる。加えて、本方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、ゲノムに対する順序および／または配向を表すコンティグのセットを通る経路を決定する工程とをさらに含むことができる。代替的に、または組み合わせて、本方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、安定化された生体試料中の構造バリアントの存在またはヘテロ接合性の喪失を決定する工程とを含むことができる。代替的に、または組み合わせて、本方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットにおけるバリアントをフェーズに割り当てる工程とを含む。代替的に、または組み合わせて、本方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、コンティグのセットにおけるバリアントの存在を決定する工程と、安定化された生体試料についての疾患段階、予後、または処置の経過を同定すること、バリアントの存在に基づいて薬物を選択すること、または、安定化された生体試料についての薬物効力を同定することの１つ以上から選択される工程を行う工程とをさらに含むことができる。

本明細書の方法の態様では、近接ライゲーションは、コンカテマーの各セグメント間に結合したＤＢＣＯ修飾架橋オリゴヌクレオチドを用いるなどの、銅フリークリックケミストリーを含む、クリックケミストリーを用いて行うことができる。その後、コンカテマーを、例えば、デンドリマーを介して結合することができる。ライゲーションした分子を濃縮するために、架橋オリゴヌクレオチドの特徴を標的とすることができる。ある例では、ＤＢＣＯ含有オリゴヌクレオチドを、ビーズなどのストレプトアビジン基質で単離することができるアジド－ビオチン部分と反応させることができる。他の例では、ＤＢＣＯ含有オリゴヌクレオチドを、ジスルフィド結合を含むアジド修飾ＮＨＳ－Ｓ－Ｓ－ｄＰＥＧ４－ビオチンと反応させることができ、アジド－ＰＥＧ３アミンを使用して、アジドをＮＨＳ－Ｓ－Ｓ－ｄＰＥＧ４－ビオチンに添加することができ、ライブラリー調製のために核酸を単離するために、このジスルフィド結合は、ＤＴＴと加熱を使用して、例えば、約１０分間７０℃で加熱することによって、還元することができる。

本明細書の方法の態様では、核酸断片が接触しているデンドリマーは、核酸断片の近接ライゲーションの前に、試料中の残りの核酸から分離または単離させることができる。この工程は、近接ライゲーションによって形成されたコンカテマーが、同じデンドリマーと接触した断片を確実に含むようにすることができる。このことは、所定のコンカテマーのすべてのセグメントが、元の安定化された試料中で互いに近接していたことを意味することができる。したがって、どの核酸領域がどの他の領域に近接していたかについての単なる対情報ではなく、そのようなアプローチは、はるかに複雑な近接情報、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の核酸領域がすべて互いに近接していたという情報をもたらすことができる。

場合によっては、核酸断片が接触しているデンドリマーを、残りの核酸から分離または単離させることで、近接ライゲーションの代わりに、これらの断片のバーコード化またはタグ付けを可能にすることができる。所定のデンドリマーと関連付けられる断片は、例えば、液滴またはウェル中でバーコード化またはタグ付けすることができる。配列決定後、配列は、それらのバーコードに基づいて関連付けることができ、近接情報は、上記と同じコンカテマー中に存在することではなく、バーコードに基づいて導き出することができる。この近接情報は、本明細書で論じるように使用することができる。一例では、デンドリマーは、試料中の核酸に複合体化されることで、それらを安定化させ、その後、核酸を断片化し、次いで、デンドリマーをそれらの複合体化された核酸断片と共に単離して、液滴中に封入し、液滴中の核酸は、液滴特異的なバーコードまたは標識で標識され、次いで、核酸を配列決定し、バーコードまたは標識情報を使用して、試料中で互いに近接していた断片を関連付ける。

長い非コードＲＮＡ分析
長い非コードＲＮＡ結合部位を分析する方法が本明細書で提供される。場合によっては、そのような方法は、少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子、および少なくとも１つの非コードＲＮＡを含む安定化された生体試料を得る工程を含む。次に、方法は、Ｔｎ５トランスポザーゼ、ならびに、モザイク末端および検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチドに、ＤＮＡ分子を接触させる工程であって、それによってＤＮＡ分子を断片化し、断片化したＤＮＡ分子の末端にオリゴヌクレオチドを結合させる、工程を含むことができる。断片をＴ４ＲＮＡリガーゼに接触させ、それによって非コードＲＮＡをオリゴヌクレオチドにライゲーションし、クロスリンクを脱クロスリンクすることができる。その後、ライゲーションしたＲＮＡを逆転写酵素で伸長させることで、二本鎖ＤＮＡ断片を作製することができる。次いで、二本鎖ＤＮＡ断片を、検出可能な標識に結合する薬剤に結合されたエンドヌクレアーゼと接触させ、それによって検出可能な標識付近のＤＮＡを消化することができる。その後、配列決定ライブラリーを作製するために、配列決定アダプターを結合させることができる。場合によっては、非コードＲＮＡへのライゲーションを促進するために、オリゴヌクレオチドは、一方の末端でアデニル化される。場合によっては、オリゴヌクレオチドはバーコードをさらに含む。場合によっては、安定化された生体試料を、トランスポザーゼ処理の前に、ＲＮａｓｅＨと接触させる。

本明細書の方法の態様において、場合によっては、非コードＲＮＡは長い非コードＲＮＡである。場合によっては、非コードＲＮＡはエンハンサーである。場合によっては、非コードＲＮＡはｍｉＲＮＡである。場合によっては、非コードＲＮＡはＹＲＮＡである。場合によっては、非コードＲＮＡはＲＮａｓｅＰである。場合によっては、非コードＲＮＡはｐｉＲＮＡである。場合によっては、非コードＲＮＡはＸｉｓｔである。

本明細書の方法の態様において、場合によっては、検出可能な標識は、クリックケミストリー反応が可能な修飾されたヌクレオチドを含む。場合によっては、検出可能な標識はビオチンを含む。場合によっては、薬剤は抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、またはストレプトアビジンを含む。場合によっては、非コードＲＮＡに結合されたＤＮＡは、さらなる分析の前に濃縮される。

本明細書の方法の態様では、エンドヌクレアーゼは、分析の前に外来性の試料ＤＮＡを切断するために使用される。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、小球菌ヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む。

本明細書の方法の態様では、配列は、非コードＲＮＡを含有している二本鎖ＤＮＡ断片で得られる。本明細書に記載される方法をさらに含む任意の適切な配列決定方法を使用することができる。

様々な適切な安定化された生体試料は、本明細書の方法で使用するために企図される。本明細書で詳細に別記された安定化された生体試料は、クロスリンキング剤、例えば、固定剤、またはＵＶ光を用いてクロスリンクされている。例えば、場合によっては、安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料である。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された細胞溶解物を含む。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された無傷細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された無傷の核を含む。

核酸立体構造の評価
第２の細胞または細胞集団の物理的な立体構造と区別可能な細胞、例えば、単一細胞または細胞集団における核酸の物理的な立体構造の決定に関連する組成物、システム、および方法が本明細書に開示される。本明細書の開示の実施を通して、三次元核酸相対位置を示す核酸分子を生成し、任意選択で、タグ（例えば、核酸バーコード）を提供することで、複数の分子に共通の細胞または起源集団を識別することができる。

本明細書で開示される方法の実施を通して、核酸は、細胞におけるその三次元配置のすべてまたは少なくともいくつかを保存するように得ることができる。このような核酸の露出した核酸ループを切断して、互いにランダムに再結合した内部セグメント末端を露出させ、物理的に近接した露出した末端が互いに結合する（近接結合）可能性がより高くなるようにすることができる。したがって、どの露出された末端が互いに対して結合するようになるかを決定することによって、天然の細胞配置における末端隣接核酸の物理的な近接に関する有用なデータを得ることが可能である。

関連するアプローチは、例えば、２０１６年９月６日にＤｅｋｋｅｒらに公開されたＵＳ９４３４９８５Ｂ２で開示されており、この文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。

本明細書に開示される方法の実施を通して、ペアエンドのライブラリー成分は、集団の個々の細胞間の立体構造の差異が細胞の集団について容易に識別されるように、または細胞の第１の集団と細胞の第２の集団との間の立体構造の差異が、たとえそれらが同時に分析される場合でも、容易に識別されるように、細胞起源を示す配列情報とともにさらにタグ付けされ得るか、それ以外の方法で提供され得る。タグは、例えば、核酸バーコードを含むことができる。場合によっては、タグは、ゲノム中で隣接していない２つの核酸セグメント間の接合部を含むことができる。核酸分子は、完全または部分的に配列決定される場合に、しばしば各ゲノム末端をそのゲノム遺伝子座にマッピングするのに十分な少なくともいくつかのゲノム配列が得られ、さらに、正確なまたは可能性の高い起源の細胞または細胞集団を同定するのに十分なタグ付け配列または連鎖配列を得られるように、作製することができる。したがって、互いに物理的に近接しているゲノムの２つの領域の有用な配列情報を得ると同時に、この物理的な立体構造が生じる細胞または細胞集団の有用な情報も得て、それを、その細胞または細胞集団において同時に生じる他の物理的な立体構造情報の文脈で評価することができるようになる。

細胞中のゲノム核酸または他の核酸を安定化させることができ、真核生物細胞については、本明細書に組み込まれるかまたはそうでなければ公知である方法などの公知の方法に従って、核を任意選択で単離させる。例えば、図１Ａおよび図１Ｂでは、処理された安定化された組織試料が例示されている。図１Ａは、不十分に処理された組織試料を例示している。図１Ｂは、十分に処理された安定化された組織試料を例示している。

本明細書の開示と一致する核酸は、任意の数の細胞核酸、例えば、原核生物の初代ゲノムもしくはプラスミド核酸、真核生物の核、ミトコンドリアもしくはプラスチド核酸、または、場合によっては、試料中の細胞質核酸、例えば、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは外因性核酸、例えば、試料のウイルスもしくは他の病原体もしくは他の外因性核酸を含む。

安定化された核酸は、場合によっては、少なくともいくつかの核酸が個々のパーティションに分布するように分布され得る。例示的なパーティションとしては、ウェル、エマルジョン中の液滴、または本明細書の他の箇所に記載されるような差次的に配列決定されたリンカー分子の別個のパッチを含む表面位置（例えば、アレイスポット、ビーズなど）が挙げられる。追加のパーティションも企図され、本明細書に開示される方法、組成物、およびシステムと一貫している。

安定化された核酸は、特定の細胞についての核酸配置情報を得るために、後の再結合のために内部切断部を露出するように断片化することができる。多くの断片化アプローチが公知であり、本明細書の開示と一致している。核酸は、制限エンドヌクレアーゼ、プログラム可能なエンドヌクレアーゼ、例えば、ガイドＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、非特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）、タグメンテーション（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、せん断、超音波処理、加熱、または他の機構の１つまたは複数の集団を使用して断片化することができる。場合によっては、ＤＮａｓｅは非配列特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの両方に対して活性である。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡに特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡよりも優先される。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡに特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡよりも優先される。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩである。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩＩである。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩおよびＤＮａｓｅＩＩの１つ以上から選択される。場合によっては、ＤＮａｓｅは小球菌ヌクレアーゼである。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、および小球菌ヌクレアーゼのうちの１つ以上から選択される。他の適切なヌクレアーゼも本開示の範囲内である。

特に、２０１４年８月７日にＧｒｅｅｎらに公開されたＷ０２０１４１２１０９１Ａ１（後に２０１５年１２月１７日にＵＳ２０１５０３６３５５０Ａ１として公開され、２０１８年１０月２日にＵＳ１００８９４３７Ｂ２として公開される）の開示は、全体として本明細書に組み込まれる。同様に、２０１６年２月４日にＦｉｅｌｄｓらに公開されたＷ０２０１６０１９３６０Ａ１（後に２０１７年１１月２３日にＵＳ２０１７０３３５３６９Ａ１として公開された）の開示は、全体として本明細書に組み込まれる。同様に、２０１７年８月３１日にＧｒｅｅｎらに公開されたＷＯ２０１７１４７２７９Ａ１の開示は、全体として本明細書に組み込まれる。

核酸は、結合の前または後に表面に結合することができる。例示的な表面としては、限定されないが、ビーズ、アレイ、およびウェルが挙げられる。場合によっては、表面は、ＳＰＲＩビーズなどの固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）表面である。結合前に核酸を表面に結合させることにより、下流工程の性能を改善することができ、例えば、染色体間ライゲーションまたは結合を減少させ、染色体内ライゲーションまたは結合を増加させることができる。

核酸は、結合の前または後に免疫沈降させてもよい。そのような方法は、クロマチンを断片化する工程、および、断片を、アセチル化ヒストン、特にＨ３を特異的に認識してそれに結合する抗体と接触させる工程を含むことができる。このような抗体の例としては、限定されないが、ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ，ＮＹから入手可能な抗アセチル化ヒストンＨ３が挙げられる。免疫沈降物からのポリヌクレオチドは、その後、免疫沈降物から収集することができる。限定されないが、アプタマー、オリゴヌクレオチド、または他の核酸プローブ、および核酸誘導型ヌクレアーゼ（例えば、触媒的に不活性または「死んだ」ヌクレアーゼを含む、Ｃａｓ９などのＣａｓファミリー酵素）を含む標的特異的な化合物を用いて、同様の標的化濃縮方法を採用することもできる。

連鎖核酸、例えば、バーコード、パーティション特異的配列、またはパーティション同定配列を有する連鎖核酸は、左ゲノムセグメント、しばしばパーティション特異的配列またはパーティション同定配列（例えば、核酸バーコード）を有する連鎖領域、および右ゲノムセグメントを有する核酸セグメントを生成するように、露出した内部末端に結合させることができ、左ゲノムセグメントおよび右ゲノムセグメントは、供給源細胞において物理的に近接したゲノムセグメントにマッピングされる。

露出した核酸末端を結合させる前に、末端を処理することができる。そのような加工は、末端平滑化（ｅｎｄｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）または平滑末端化（ｂｌｕｎｔｅｎｄｉｎｇ）を含むことができる。平滑末端を露出させた核酸末端は、例えば、他の平滑末端露出核酸末端に直接、またはアダプターもしくはリンカーにライゲーションすることができる。そのような加工は、例えば、テーリング（例えば、Ａテーリングまたはアデニル化）によってオーバーハングを生成することを含むことができる。一例では、オーバーハングは１ヌクレオチドのサイズである。一例では、オーバーハングは単一のＡヌクレオチドである。尾状の露出した核酸末端は、例えば、他の尾状の露出した核酸末端に直接、またはアダプターもしくはリンカーにライゲーションすることができる。場合によっては、平滑末端化またはテーリングは、ビオチン化核酸などの親和性タグ付け核酸を組み込むことができる。親和性タグは、例えば、下流の捕捉または濃縮工程において使用することができる。他の場合において、平滑末端化またはテーリングは、親和性タグ付け核酸を組み込むことなく（例えば、ビオチン化核酸なしで）実施することができる。その後、親和性タグは、必要に応じて、例えば、アダプターまたはリンカー（例えば、架橋）に付加することができる。一例では、露出した核酸を末端で平滑化し、オーバーハングを生成し、露出した末端を、架橋オリゴを介して結合させる。

結合は、ライゲーションなどを介して直接的であり得る。

結合は、リンカーまたは架橋を介して、例えば、１つの露出した核酸末端を別の核酸末端に結合する１つ以上のリンカーまたは架橋核酸のライゲーションによるものであり得る。

結合は、キャッピング核酸アダプターセグメント、例えば、インテグラーゼまたはトランスポザーゼの取り込みなどのリコンビナーゼの取り込みと一致するものの使用を介するものであり得る。リコンビナーゼ部位を有するアダプターは、露出した核酸末端に付加することができ、次いで、これらの末端は、例えば、組換えによって結合させることができる。

一例としてｐｈｉＣ３１インテグラーゼバーコード送達を挙げると、細胞同定リンカーまたは細胞特異的リンカー（例えば、核酸バーコード）などのリンカーを、以下のように酵素的に添加することができる。

内部核酸末端の露出の後に、インテグラーゼ部位を、露出した核酸末端、例えば、内部末端または露出した線状染色体末端、例えば、テロメアが除去されているものに、ライゲーションすることができる。例示的な組み込み部位は、ａｔｔＰｐｈｉＣ３１インテグラーゼ組み込み部位、またはａｔｔＰ組み込み部位を含む核酸であるが、他の組み込み部位は本明細書の開示と一致している。ライゲーションは、核酸断片の集団をもたらし、その少なくともいくつかは個々に、ａｔｔＰセグメントを含むセグメントなどの、組み込み部位によって各末端で境界付けられた細胞核酸セグメントを含む。様々な実施形態では、断片化および組み込み部位の結合の一方もしくは両方が、パーティショニングの前に起こるか、または断片化および組み込み部位の結合の一方もしくは両方が、パーティショニングの後に起こる。

図１９Ａ～図１９Ｄは、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼベースの結合アプローチの例示的な概略図を示す。図１９Ａでは、インテグラーゼを介したストレプトマイセスへのｐｈｉＣ３１組み込みの概略図が見られる。ａｔｔＰ（破線によって示される）およびａｔｔＢ（実線によって示される）部位を含む核酸が示されているが、様々な実施形態では、ａｔｔＢおよびａｔｔＰ以外の部位、ならびにインテグラーゼ以外の酵素活性も企図されており、本明細書の開示と一致する。図１９Ｂでは、インテグラーゼおよび関連タンパク質（丸で示されている）が、細菌ゲノム中のファージａｔｔＢ部位およびａｔｔＰ配列に結合し、鎖交換を誘発することが分かる。図１９Ｃでは、組み込み事象の結果が見られる。組み込みは、ａｔｔＢおよびａｔｔＰを欠くが、ａｔｔＢおよびａｔｔＰの部分のキメラ断片であるａｔｔＬおよびａｔｔＲを有する線状核酸に分解される。ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位は３ｂｐ短く、ａｔｔＢおよびａｔｔＰと比較して配列が異なる。図１９Ｄでは、環状の組み込みまたはリンカーゲノムが必要とされないことが分かる。ａｔｔＢ部位を含有する線状ＤＮＡの組み込みにより、ａｔｔＰ含有ＤＮＡの切断が引き起こされる。

図２０は、本明細書で企図される安定化された核酸の露出した内部末端へのインテグラーゼ部位の送達を描いている。例えば、ａｔｔＰは、アダプターライゲーションによって、ＤＮａｓｅ消化クロマチン（円筒形によって示される）の露出した内部末端に送達され得る。核酸は、ヌクレオソームなどの結合部分との接触を保存するように、場合によっては、フェージング情報または三次元の物理的位置を保存するように、安定化させることができる。

図２１は、ａｔｔＢ部位などのインテグラーゼ部位を使用するリンカー構築物の生成を示す。例えば、最小３３ヌクレオチドａｔｔＢ部位が組み込みに十分である。フランキング配列は、バーコードまたは特定の供給源（例えば、細胞、液滴、または他のパーティション、生物）由来の核酸を指定する他の配列などの最適な配列を使用して置き換えることができる。図２２は、ａｔｔＢ線状ＤＮＡの組み込みによる凝集体内ライゲーションを示す。その結果として、相同（ｉｎｐｈａｓｅ）するか、または、物理的に近接している核酸セグメントの露出した内部末端を有する線状分子が単一のライブラリー成分に結合している。ライブラリー成分は、無傷の組み込み部位（この場合、ａｔｔＰ）によって結合されるが、内部組み込み部位は、ａｔｔＰ関連プライマーがライブラリー断片を増幅し得るように、破壊され、ａｔｔＲおよびａｔｔＬ境界に置き換えられている。内部末端隣接配列を得て、それをゲノムまたはコンティグセットにマッピングすることによって、コンティグまたはゲノムセグメントを共通のフェーズまたは細胞内の共通の三次元位置に割り当てることができる。

図２５は、組換えベースの近接ライゲーションプロトコルの別の例を示す。クロスリンクしたクロマチンを含むゲノムＤＮＡは、例えば、ＤＮａｓｅで消化される。露出した末端を平滑化し、例えば、単一のＡ塩基オーバーハングでＡ－テーリングを行う。ａｔｔＢ部位などのリコンビナーゼ部位を含むＡテール適合性アダプターを、露出した末端にライゲーションする。ａｔｔＰ部位などの対応するリコンビナーゼ部位を有するリンカーを試料に接触させ、リコンビナーゼ酵素（例えば、ｐｈｉＣ３１）を用いて組換えを実施することで近接ライゲーションを達成する。リンカーは、下流のプルダウンまたは他の精製もしくはプロセシングを可能にするために、ビオチン（ｂ）などの親和性剤を任意選択で含む。クロスリンキングを脱クロスリンクさせ、例えば、約４０ｂｐのａｔｔＢ部位、その後の約１５０ｂｐのゲノムＤＮＡ領域１、その後ａｔｔＲ部位および親和性剤を含む約９０ｂｐのリンカー配列、その後約１５０ｂｐのゲノムＤＮＡ領域２、続いて約４０ｂｐのａｔｔＢ部位を含む、近接ライゲーションした核酸を回収する。

図２６は例示的なアダプターおよびリンカー配列を用いる、図２５に示されるものと同様のプロトコルを示す。最上部には、ＥＰオーバーハングａｔｔＢアダプター、ａｔｔＢ部位ＧＣＣＣＴＴＧＧＧＣを含む配列ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣｔｔＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＴＣ、および逆ａｔｔＢ部位ＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣを含む補体配列ＣＧＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣａａＧＧＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣを有する、非組換えｇＤＮＡが示されている。上から２番目には、ａｔｔＢアダプター、配列ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣｔｔＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＧＴＣＣＣＣおよび補体配列ＧＧＧＧＡＣＧＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣａａＧＧＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣを有する、非組換えｇＤＮＡが示されている。上から３番目には、ａｔｔＰ部位を含む配列ｇｇａｇＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＧＧＴＡＡＣＣＴｔｔＧＡＧＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＧＧＧＧａｃｃａｔｇｇａｇａ／ｉＢｉｏｄＴ／ｃａＣＣＣＣＡＡＣＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣａａＡＧＧＴＴＡＣＣＣＣＡＧＴＴＧＧＧＧＣＡＣＴＡＣ、配列ＡＣＣＴＴＴＧＡＧＴおよびリンカー配列ＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣを有する、ａｔｔＰ部位およびビオチンを含む非組換えリンカーが示されている。上から４番目には、配列ｇｇａｇＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＧＧＴＡＡＣＣＴｔｔＧＡＧＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＧＧＧＧａｃｃａｔｇｇａｇａ／ｉＢｉｏｄＴ／ｃａＣＣＣＣＡＡＣＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣａａＧＧＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣを有する、ａｔｔＢ／ｇＤＮＡと組換えられたリンカーの一端が示されている。最下部には、配列ＧＣＣＣＴＴＧＡＧＴを有するａｔｔＲ部位および配列ＡＣＴＣＡＡＧＧＧＣを有する逆ａｔｔＲ部位を含む、配列ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣｔｔＧＡＧＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＧＧＧＧａｃｃａｔｇｇａｇａ／ｉＢｉｏｄＴ／ｃａＣＣＣＣＡＡＣＴＧＡＧＡＧＡＡＣＴＣａａＧＧＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣを有する、ａｔｔＢ／ｇＤＮＡと組換えられたリンカーの両方の末端が示されている。

図２３Ａは、ライブラリー生成を促進するための例示的なリンカー分子およびアダプター分子修飾を示す。リンカー分子には親和性タグ（この場合では、円で示されているビオチン）が付与される一方で、アダプターにはエキソヌクレアーゼ耐性修飾（この場合では、星によって示されているホスホロチオエート化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｉｏｎ）（ＰＳ））が与えられる。親和性タグは、リンカー分子が末端隣接分子に組み込まれるかどうかに関係なく、リンカー分子の単離を促進する。リンカー上のエキソヌクレアーゼ耐性修飾は、リンカーが付加されなかった核酸分子の、末端隣接核酸試料分子と統合されなかったリンカー分子への選択的な分解を促進する。図２３Ｂは、タグ付け分子が内部末端に付加されたライゲーション部位に組み込まれるかどうかに関係なく、タグ付け分子の親和性精製（この場合では、半円弧によって示されるストレプトアビジン）を示す。図２３Ｃは、ａｔｔＰ部位などのインテグラーゼ部位を保存する親和性単離分子を選択的に増幅するために（この場合、そのような部位をプライマーで標的化することによって）、ａｔｔＰ指向性増幅を使用することができることを示している。親和性タグおよびａｔｔＰ部位の存在は、組み込み事象が成功した分子を示す。図２３Ｄは、エキソヌクレアーゼ耐性修飾（この場合、ホスホチオール化（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ））を欠く親和性タグ付け分子を除去するためにエキソヌクレアーゼ（扇形または「Ｐａｃ－Ｍａｎ」によって示される）が使用される代替物を示している。親和性タグおよびエキソヌクレアーゼ耐性部位の存在は、組み込み事象が成功した分子を示す。

代替的に、トランスポザーゼ、例えば、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、またはｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼをバーコード送達に使用することができる。内部核酸末端の露出の後に、モザイク末端を、露出した核酸末端、例えば、内部末端、または露出した線状染色体末端、例えば、テロメアが除去されたものに、ライゲーションすることができる。例示的なモザイク末端は、Ｔｎ５モザイク末端、またはＴｎ５モザイク末端を含む核酸であるが、他のモザイク末端は本明細書の開示と一致する。ライゲーションにより核酸断片の集団が生じ、その少なくともいくつかは、Ｔｎ５モザイク末端などのモザイク末端によって各末端で境界付けられた細胞核酸セグメントを個々に含んでいる。

リコンビナーゼアダプター分子は、配列決定アダプター部位、例えば、Ｐ５およびＰ７部位も含むことができる。図２７（上）は、ａｔｔＢアダプター配列ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣｔｔＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＧ、Ｐ７配列ＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ、およびＰ５配列ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣを有する、配列決定Ｙアダプターを有する例示的なａｔｔＢアダプターを示している。図２７（下）は、配列決定アダプターを有するリコンビナーゼアダプターを有する非組換えｇＤＮＡの概略図を示す。配列決定アダプターは、組換え後にゲノムＤＮＡと共に残るａｔｔＢ部位の部分に結合され、さらなる増幅またはアダプターライゲーションなしで組換え後の配列決定を可能にする。限定されないが、図２７に示されるものを含む配列決定アダプターを含むリコンビナーゼアダプターを使用することで、増幅または別個のアダプター組み込み工程を必要とすることなく、近接ライゲーション産物の直接的な配列決定が可能となる。これにより、得られる配列情報における増幅バイアスなどのバイアスを低減することができる。

様々な実施形態では、断片化およびモザイク末端の結合の一方もしくは両方が、パーティショニングの前に起こるか、または断片化およびモザイク末端の結合の一方もしくは両方が、パーティショニングの後に起こる。図２４は、インテグラーゼ媒介凝集体内ライゲーションを使用する、単細胞ＨｉＣ（または他の近接ライゲーション技術）のための例示的なシステムを描いている。単細胞核は、インテグラーゼと組み合わせてパーティションの第１のセットに封入される。パーティションは、この場合、エマルジョン中の液滴である。核が鎖切断に供されることで、内部露出末端が生成され、局所的な三次元情報が保存される。アダプターを、露出した内部末端にライゲーションする。アダプターは任意選択でエキソヌクレアーゼ耐性末端を含む。この実施形態では、アダプターは、パーティション識別情報を伝達しない。パーティションの第２のセットでは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）などのパーティション識別配列を有するリンカーが封入され、任意選択で増幅および切断指向性直線化に供される。パーティションの第１および第２のセットは、約１：１の比率で、または２つの細胞からの核酸が単一の結果として生じるパーティションに組み合わされる可能性が低いような条件下で合体する。

インテグラーゼ部位またはモザイク末端などのリコンビナーゼ部位は、場合によっては、内部核酸末端上にライゲーションされる未修飾の一本鎖断片または二本鎖断片上で担持され得る。代替的に、その後の配列決定ライブラリーのクリーンアップを容易にするために、ａｔｔＰ配列またはモザイク末端、例えば、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、またはｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼモザイク末端などの組み込み部位を有するいくつかの一本鎖または二本鎖断片は、エキソヌクレアーゼまたは他の核酸分解活性を妨害する修飾などの少なくとも１つの修飾を含むことができる。例としては、組み込み部位を有する二本鎖断片が各末端に付加された断片のエキソヌクレアーゼ分解を排除するためのチオ硫酸修飾が挙げられる。

しばしば、組み込み部位またはモザイク末端などのリコンビナーゼ部位は、そのような組み込み部位またはモザイク末端の配列、例えば、ａｔｔＰ配列もしくはＴｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、またはｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼモザイク末端が、隣接する核酸の細胞源を指定するためには使用されないという点で、非特異的である。代替的に、しばしば核酸パーティショニングの後に、パーティションに、組み込み部位またはモザイク末端に隣接する別個の、特異的な配列または細胞識別配列（例えば、核酸バーコード）を有するアダプターを提供するか、または別個の組み込み部位またはモザイク末端を提供することができ、したがって、第１のパーティションの核酸は、第１の同定セグメントを有する組み込みセグメントまたはモザイク末端を受け取り、第２のパーティションの核酸セグメントは、第２の同定セグメントを有する組み込みセグメントを受け取るようになる。

次いで、インテグラーゼａｔｔＰセグメントを含む境界などのリコンビナーゼ境界を有する断片を、共通の溶液中で、ａｔｔＢｐｈｉＣ３１組み込み部位などの組み込み部位に接触させることができる。例えば、組み込み酵素はｐｈｉ３１インテグラーゼを含むことができ、組み込み境界はａｔｔＰセグメントを含むことができ、組み込み部位はａｔｔＢ組み込み部位を含むことができる。代替的に、断片は、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７などのモザイク末端境界、またはｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼモザイク末端境界を有する。

ａｔｔＢ組み込み部位、またはＴｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、またはｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼモザイク末端などのリコンビナーゼ部位が、セグメントまたは細胞源（例えば、核酸バーコード）に特異的なものなどの、パーティションまたは細胞を同定する配列を有する連鎖セグメントに隣接する場合、その配列は、特定のまたは共通の細胞源またはパーティションから生じるものとして隣接細胞核酸を同定し、したがって、共通の細胞識別セグメントまたはパーティション識別セグメントによって結合された共通の細胞からの複数の露出した末端は、配列決定の前にまたは配列決定と同時に、第２のパーティションの断片とともにバルク化される場合であっても、共通の細胞から生じるものとして容易に同定することができるようになる。

細胞識別配列がリコンビナーゼ部位境界断片を介して送達される場合、組み込みまたは転位は好ましくは、パーティショニングの後に行われる。少なくともいくつかのパーティションの核酸内容物は、それによって、そのリンカーの細胞識別配列によって識別することができ、したがって、複数の細胞源に由来する核酸が配列決定のためにバルク化された後であっても、内部末端対と、大部分または完全に配列決定されたゲノムを最大限含むコンティグセットにおいてそれらがマッピングされる近傍に割り当てられる近接情報とを、試料の少なくとも１つの他の細胞と区別される共通の細胞に対して割り当てることができ、そうすることで、予測される核酸三次元立体構造の差異を確立することができるようになる。

組換え部位境界断片は、任意選択で細胞またはパーティション指定配列（例えば、核酸バーコード）を含むリンカー領域によって結合された左境界断片および右境界断片（例えば、ａｔｔＢ部位またはＴｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、またはｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼモザイク末端）を様々に含む。リンカー領域は任意選択で、その後の単離を促進するための部分をさらに含む。多くの親和性タグまたは修飾塩基は、本明細書の開示に一致している。例示的な部分は、インテグラーゼまたはトランスポザーゼ処理後のリンカーの物理的または化学的な単離を促進する。アビジンまたはストレプトアビジンベースの単離を促進し得る１つまたは複数のビオチンタグなどの、任意の数の親和性タグが本明細書の開示と一致する。代替的に、インテグラーゼまたはトランスポザーゼ活性を妨害することなく単離を促進する任意の抗原、受容体、またはリガンドが、本明細書のいくつかの実施形態に適している。

上述のように、いくつかのライブラリー生成アプローチは、取り込まれていない試薬を選択的に除去する工程などのクリーンアップ工程を含む。例えば、エキソヌクレアーゼ処理は、結合していないリンカー分子、いかなる組み込み部位も結合していないゲノム断片、または結合していないリンカー分子およびいかなる組み込み部位も結合していないゲノム断片の両方を選択的に除去するためにしばしば使用される。チオ硫酸骨格などのエキソヌクレアーゼ耐性修飾を有する組み込み部位断片にライゲーションされたゲノム断片は、その末端からエキソヌクレアーゼ分解に耐性があり、チオ硫酸骨格などのエキソヌクレアーゼ耐性修飾を有する組み込み部位断片によって両方の末端で結合された核酸分子は、両方の末端で分解に耐性があり、エキソヌクレアーゼ処理を生き残ることができる。

代替的にまたは組み合わせて、いくつかのリンカー分子は、組換え部位、例えば、ａｔｔＰ組み込み部位、またはＴｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、またはｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼモザイク末端の反対側に逆親和性タグを含み、逆親和性タグは、組換え反応の成功に従って除去される。そのような場合、望ましくない試薬は、逆親和性タグの結合パートナーと接触させることによって除去することができる。

インテグラーゼ活性は、組み込み事象の一部として、ａｔｔＢ部位およびａｔｔＰ部位などの両方の組み込み部位を部分的に破壊する。したがって、ａｔｔＰ組み込み部位などのライゲーションされたアダプター部位にアニーリングするプライマーを、単独で、またはリンカーベースの単離と組み合わせて、設計することによって、細胞またはアリコート識別情報および内部末端隣接情報が増幅され、場合によっては、配列決定または他の下流分析を容易にするように、少なくとも１つのリンカーにまたがるクローンアンプリコンを生成することができる。

ライブラリーの生成および任意選択でライブラリーのクリーンアップの後に、核酸を完全にまたは部分的に配列決定して、細胞識別または細胞特異的三次元核酸位置評価に十分な情報を得ることができる。上述のように、配列決定は好ましくは、ライブラリー成分の各ゲノム末端をそのゲノム遺伝子座にマッピングするのに十分な少なくともいくつかのゲノム配列を取得し、さらに、正確なまたは可能性のある起始細胞を同定するのに十分な連鎖配列を取得するように行われる。したがって、互いに物理的に近接しているゲノムの２つの領域の有用な配列情報を得ると同時に、この物理的な立体構造が生じる細胞の有用な情報も得て、それを、その細胞において同時に生じる他の物理的な立体構造情報の文脈で評価することができるようになる。多くの場合、この情報は完全長配列決定ではなくペアエンド配列決定によって得られるが、両方のアプローチおよび他のアプローチは本明細書の開示と一致している。

第２の細胞上の物理的な立体構造と識別可能な単細胞などの細胞における核酸の物理的立体構造の決定に関する組成物および方法は、本明細書の開示と一致する多くのシステム上で実施することができる。いくつかのシステムは、エマルジョンの第１の液滴中、またはウェル中、例えば、ウェルプレート上での固定細胞核酸材料の分配を含む。これらの液滴は、本明細書に記載されるように任意選択でエキソヌクレアーゼ耐性となるように任意に修飾されたインテグラーゼ部位またはモザイク末端などのリコンビナーゼ部位、ならびにインテグラーゼまたはトランスポザーゼ酵素およびリガーゼ酵素を含む。別個に、リンカー核酸分子は、エマルジョンの第１の液滴への送達のために構成され得る。リンカー核酸は任意選択で、第２のエマルジョンまたは第２のウェルの液滴に分配され、任意選択で、例えば、ローリングサークル増幅を使用して増幅され、所定のリンカー分子／エマルジョン液滴の複数のコピーを生成するように処理されることができる。

次いで、第２のエマルジョン液滴および第１のエマルジョン液滴は、インテグラーゼまたはトランスポザーゼ適合性リンカーを用いてインテグラーゼまたはトランスポザーゼライゲーション核酸断片を組み立てるために対で合体され得、しばしば、液滴あたり均一な標識を示す。しかしながら、核酸試料あたり２つ以上の識別子を有する液滴は、とりわけ、データ分析が液滴中の複数の種類のタグの存在を示す場合、依然として有意義なデータをもたらすことが可能であり得る。

対合体の代替物として、場合によっては、インテグラーゼまたはトランスポザーゼ適合性リンカーは、全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１１月２３日に公開されたＵＳ２０１７０３３５３６９Ａ１に記載されるものなど、液滴からストリームへの合体を介して第１のエマルジョン液滴と接触する試薬ストリーム中の固体粒子のコロニーとして送達することができる。リンカー核酸は、固体粒子上またはゲル中で、任意選択で増幅することができる。第１のエマルジョン液滴は、ストリームに合体させることができ、第２のエマルジョン液滴は、ストリームをセグメント化または分割することによって回収することができ、１：１、１：１超、または１：１未満などの所望の割合の核酸クラスター対リンカー粒子が得られるようになる。

代替的に、いくつかのシステムおよび方法は、固定された細胞核酸材料をチップまたはプレートのウェルに分配すること、その後、未増幅のまたは上記のように増幅されたリンカー核酸をパーティションに送達することを含む。

代替的に、場合によっては、リンカー核酸の送達は、分割から時間的に分離されない。むしろ、リンカー核酸または酵素活性または酵素活性に必要な因子は、リンカーを介するなどしてリンカーの核酸試料露出末端への共有結合をもたらす酵素活性を一時的に活性化するように、熱、電磁活性化、または他の投与などの特定の処置まで隔離される。

多くの組み込み酵素は、本明細書の開示と一致する。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによって市販されているものなどのＰｈｉＣ３１インテグラーゼは、方法の実施、システムの操作、および本明細書の組成物における使用について多くの利点を示す。このインテグラーゼのいくつかの利点は以下の通りである。これは、小さな組み込み部位（ａｔｔＢ／ａｔｔＰ）を使用する。酵素自体は小さな単一ポリペプチドである。組み込みは、組み込み事象を切除するための別個の酵素を使用することなく不可逆的である。活性は高く、酵素は容易に操作されて活性を変化させる。それにもかかわらず、多くの組み込みシステムが本明細書の開示と一致しているように、その使用は他の酵素の除外に必要ではない。本開示の態様はＰｈｉＣ３１インテグラーゼに関して記載され得るが、任意の適合性のある酵素の使用が企図される。

多くのトランスポザーゼ酵素は、本明細書の開示と一致する。Ｌｕｃｉｇｅｎによって市販されているものなどのＴｎ５トランスポザーゼは、本方法の実施、システムの操作、および本明細書の組成物における使用について多くの利点を示す。このトランスポザーゼのいくつかの利点は以下の通りである。Ｔｎ５は１９ｂｐのモザイク末端認識配列を使用し、挿入はほとんど偏りがなく安定しており、Ｔｎ５はインビボ転位のために細胞に送達され得、またはインビトロ反応のために単離核酸に送達され得る。それにもかかわらず、Ｔｎ３、Ｔｎ７、またはｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼなどの多くのトランスポザーゼ系は本明細書の開示と一致するため、その使用は他の酵素の除外に必要ではない。本開示の態様は、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、またはｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙトランスポザーゼに関して記載され得るが、任意の適合性のある酵素の使用が企図される。

ライブラリー成分から得られる配列情報は、Ｈｉ－Ｃ、Ｃｈｉｃａｇｏ（登録商標）インビトロ近接ライゲーション、または他の三次元立体構造解析の文脈におけるものなどの多くのアプローチによって評価される。重要なことに、ゲノムまたは特定のコンティグの特定の領域への末端隣接配列マッピングの頻度を細胞特異的に評価することができるように、細胞特異的リード対の頻度を得ることができる。すなわち、可能性のある三次元立体構造の細胞特異的な発生を評価することができる。場合によっては、３次元立体構造における細胞特異的な距離と相関するシグナルの細胞特異的な強度を評価することもでき、その結果、核酸の特定の領域が、１つの細胞において、それらが同等であるが「弱い」またはより遠くに近接している第２の細胞に対して比較的近接しており、第３の細胞にある間、近接を示すシグナルがないと結論付けることができる。すなわち、三次元立体構造の定性的評価および定量的評価の両方は、本明細書の開示と一致する。場合によっては、第２の領域に対する１つの領域の近接は、第２のクラスターのクラスター成分との対をなすペアエンドリードにおいて同時に生じる第１のクラスターのクラスター成分の数を数えることによって、とりわけ、固有のパーティションタグなどの共通のパーティション識別配列を共有するライブラリー成分において、少なくとも部分的に評価される。

構成情報は、複数のライブラリー成分における同一の末端隣接配列の複数回の発生を通して作製される必要はない。むしろ、場合によっては、第２の末端隣接配列マッピング部位付近に（共通の「クラスター」に）マッピングされる末端隣接配列は、クラスターの両方のメンバーが、ゲノムなどの核酸参照の第２の領域上の第２のクラスターの非同一領域にマッピングされる場合に、三次元立体構造評価を強化することができる。

場合によっては、本明細書に開示される方法は、ポリヌクレオチドまたはその配列セグメントを標識および／または会合させ、そのデータを様々な用途に利用するために使用される。場合によっては、本開示は、約１０，０００未満、約２０，０００未満、約５０，０００未満、約１００，０００未満、約２００，０００未満、約５００，０００未満、約１００万未満、約２００万未満、約５００万未満、約１０００万未満、約２０００万未満、約３０００万未満、約４０００万未満、約５０００万未満、約６０００万未満、約７０００万未満、約８０００万未満、約９０００万未満、約１億未満、約２億未満、約３億未満、約４億未満、約５億未満、約６億未満、約７億未満、約８億未満、約９億未満、または約１０億未満のリード対を有する、高度に連続したかつ正確なヒトゲノムアセンブリを生成する方法を提供する。場合によっては、本開示は、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の精度で、ヒトゲノム中のヘテロ接合性バリアントの約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上をフェージングするか、それらに物理的連鎖情報を割り当てる方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、メタゲノム、例えば、ヒトの腸で見られるものの調査を可能にする。したがって、所定の生態学的環境に生息するいくつかまたはすべての生物の部分的または完全なゲノム配列を調査することができる。例としては、すべての腸内微生物、皮膚の特定の領域で見られる微生物、および毒性廃棄物部位に生存する微生物のランダムな配列決定が挙げられる。これらの環境における微生物集団の組成は、本明細書に記載される組成物および方法、ならびにそれらのそれぞれのゲノムによってコードされる相互に関連する生化学の態様を使用して、決定することができる。本明細書に記載の方法は、複雑な生物学的環境、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、５０００、１００００またはそれ以上を超える生物および／または生物のバリアントを含む生物学的環境からのメタゲノム研究を可能にすることができる。

したがって、本明細書に開示される方法は、無傷のヒトゲノムＤＮＡ試料に適用され得るが、逆転写ＲＮＡ試料、循環遊離ＤＮＡ試料、癌組織試料、犯罪現場試料、古細菌試料、非ヒトゲノム試料などの広範で多様な核酸試料、または１を超える生物、例えば、実験室条件下で容易に培養されない生物からの遺伝情報を含む環境試料などの環境試料にも適用され得る。

癌ゲノム配列決定に必要とされる高い精度は、本明細書に記載される方法およびシステムを使用して達成することができる。不正確な参照ゲノムは、癌ゲノムを配列決定する際に塩基呼び出しを困難なものにしかねない。不均一な試料および小さな出発物質、例えば、生検により得られた試料がさらなる困難をもたらす。さらに、大規模な構造的なバリアントおよび／またはヘテロ接合性の損失の検出はしばしば、癌ゲノム配列決定の他、体細胞バリアントと塩基呼び出しのエラーとを区別する能力にも、必要不可欠である。

本明細書に記載されるシステムおよび方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、またはそれ以上の様々なゲノムを含む複合試料から正確な長い配列を生成し得る。通常の、良性の、および／または腫瘍由来の混合試料は任意選択で、通常の対照を必要とすることなく、解析されてもよい。いくつかの実施形態において、１００ｎｇまたは数百ほどのゲノム当量の小さな出発試料は、正確な長い配列を生成するために利用される。本明細書に記載されるシステムおよび方法は、大規模な構造バリアントおよび再編成の検出が可能となる場合があり、フェージングされたバリアントコールは、約１ｋｂｐ、約２ｋｂｐ、約５ｋｂｐ、約１０ｋｂｐ、約２０ｋｂｐ、約５０ｋｂｐ、約１００ｋｂｐ、約２００ｋｂｐ、約５００ｋｂｐ、約１Ｍｂｐ、約２Ｍｂｐ、約５Ｍｂｐ、約１０Ｍｂｐ、約２０Ｍｂｐ、約５０Ｍｂｐ、または約１００Ｍｂｐ、またはそれ以上のヌクレオチドにまたがる長い配列にわたって得られ得る。例えば、フェージングされたバリアントコールは、約１Ｍｂｐまたは約２Ｍｂｐにまたがる長い配列にわたって得られる得る。

特定の態様において、本明細書に開示される方法は、単一のＤＮＡ分子に由来する複数のコンティグを組み立てるために使用される。場合によっては、方法は、複数のナノ粒子にクロスリンクされる単一のＤＮＡ分子から複数のリード対を生成する工程と、リード対を使用してコンティグを組み立てる工程とを含む。特定の場合において、単一のＤＮＡ分子は、細胞の外側でクロスリンクされる。場合によっては、リード対の少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％は、単一のＤＮＡ分子上の１ｋＢ、２ｋＢ、３ｋＢ、４ｋＢ、５ｋＢ、６ｋＢ、７ｋＢ、８ｋＢ、９ｋＢ、１０ｋＢ、１５ｋＢ、２０ｋＢ、３０ｋＢ、４０ｋＢ、５０ｋＢ、６０ｋＢ、７０ｋＢ、８０ｋＢ、９０ｋＢ、１００ｋＢ、１５０ｋＢ、２００ｋＢ、２５０ｋＢ、３００ｋＢ、４００ｋＢ、５００ｋＢ、６００ｋＢ、７００ｋＢ、８００ｋＢ、９００ｋＢ、または１ＭＢよりも大きい距離に及ぶ。特定の場合において、リード対の少なくとも０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％は、単一のＤＮＡ分子上の５ｋＢ、６ｋＢ、７ｋＢ、８ｋＢ、９ｋＢ、１０ｋＢ、１５ｋＢ、２０ｋＢ、３０ｋＢ、４０ｋＢ、５０ｋＢ、６０ｋＢ、７０ｋＢ、８０ｋＢ、９０ｋＢ、１００ｋＢ、１５０ｋＢ、または２００ｋＢより大きい距離に及ぶ。さらなる場合において、リード対の少なくとも０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、または５％は、単一のＤＮＡ分子上で２０ｋＢ、３０ｋＢ、４０ｋＢ、５０ｋＢ、６０ｋＢ、７０ｋＢ、８０ｋＢ、９０ｋＢ、または１００ｋＢを超える距離に及ぶ。特定の場合において、リード対の少なくとも１％または５％は、単一のＤＮＡ分子上で５０ｋＢまたは１００ｋＢよりも大きい距離に及ぶ。場合によっては、リード対は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、または６０日以内に生成される。特定の場合において、リード対は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８日以内に生成される。さらなる場合において、リード対は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日以内に生成される。特定の場合において、リード対は、７または１４日以内に生成される。

本明細書に記載される方法およびシステムを使用して決定されるハプロタイプは、コンピュータリソース、例えば、クラウドシステムなどのネットワーク上のコンピュータリソースに割り当てられてもよい。短いバリアントコールは、必要であれば、コンピュータリソースに保管される関連情報を使用して修正することができる。構造バリアントは、短いバリアントコールからの組み合わされた情報、およびコンピュータリソースに保管された情報に基づいて検出することができる。ゲノムの問題となる部分、例えば、セグメント重複、構造多型（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｖａｒｉａｔｉｏｎ）の傾向がある領域、高度に可変的でありかつ医学的に関連するＭＨＣ領域、セントロメアおよびテロメアの領域、ならびに、反復領域、低い配列精度、高いバリアント率、ＡＬＵ反復、セグメント重複を持つものを含む他の異質染色質領域、または当該技術分野での他の関連する問題となる部分を、精度の向上ために再度組み立てることができる。

試料の種類は、局所的に、またはクラウドなどのネットワーク接続されたコンピュータリソースにおいて、配列情報に割り当てることができる。情報のソースが分かっている場合、例えば、情報のソースが癌または正常な組織由来である場合、このソースは試料の種類の一部として試料に割り当てることができる。他の試料の種類の例は通常、限定されないが、組織の種類、試料収集方法、感染の存在、感染の種類、処理方法、試料のサイズなどを含む。癌ゲノムとの比較における通常のゲノムのなどの、完全または部分的な比較ゲノム配列が利用可能である場合、試料データと比較ゲノム配列との差を判定することができ、任意選択で出力することができる。

本開示の方法は、選択的なゲノムの関心領域の他に、選択的な関心領域と相互作用し得るゲノム領域の遺伝子情報の分析に使用され得る。本明細書に開示されるような増幅方法は、限定されないが、米国特許第６，４４９，５６２号、第６，２８７，７６６号、第７，３６１，４６８号、第７，４１４，１１７号、第６，２２５，１０９号、および第６，１１０，７０９号でみられるものなど、遺伝子分析のためのデバイス、キット、および方法に使用することができる。場合によっては、本開示の増幅方法は、多型の存在の有無を判定するためのＤＮＡハイブリダイゼーション研究のために標的核酸を増幅するために使用することができる。多型または対立遺伝子は、遺伝病などの疾患または疾病に関連付けることができる。いくつかの他の場合において、多型は、疾患または疾病に対する感受性に関連付けることができ、例えば、多型は、中毒、退行性および加齢性の疾病、癌などに関連付けられる。他の場合において、多型は、冠状動脈の健康の増大といった有用な特色、ＨＩＶもしくはマラリアなどの疾患に対する抵抗性、または骨粗鬆症、アルツハイマー病、もしくは痴呆などの成人病に対する抵抗性に関連付けることができる。

本開示の組成物および方法は、診断、予後、治療、患者の層別化、薬物の開発、処置の選択、およびスクリーニングの目的のために使用することができる。本開示は、本開示の方法を使用して多くの様々な標的分子が単一の生体分子試料から一度に分析することができるという利点を提供する。これにより、例えば、様々な診断試験を１つの試料上で行うことが可能となる。

本明細書において提供される方法は、これらの反復領域によってもたらされる実質的な障壁を克服することによってゲノムの分野を大幅に進歩させることができ、それによってゲノム分析の多くの領域における重要な進歩を可能にすることができる。以前の技術を用いてｄｅｎｏｖｏアセンブリを実施するためには、多くの小さな足場に断片化されたアセンブリを準備するか、または、大きな挿入ライブラリーを生成するための、もしくはより連続したアセンブリを生成するための他のアプローチを使用するために、かなりの時間および資源を必要とするかのいずれかでなければならない。そのようなアプローチは、非常に深いシーケンシングカバレッジの獲得、ＢＡＣまたはホスミドライブラリーの構築、光学マッピング、または、おそらく、これらおよび他の技術のいくつかの組み合わせを含み得る。資源および時間の厳しい要件のせいで、そのようなアプローチが大部分の小規模研究室に浸透せず、非モデル生物の研究が妨げられている。本明細書に記載される方法は、非常にロングレンジのリードセットを生成することができるため、デノボアセンブリは、単一の配列決定の実行で達成され得る。これにより、組立コストが桁違いに削減され、必要とされる時間が数ヶ月または数年から数週間にまで短縮される。場合によっては、本明細書に開示される方法は、１４日未満、１３日未満、１２日未満、１１日未満、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、２日未満、１日未満、または前述の指定された期間のいずれか２つの間の範囲内で、複数のリードセットを生成することを可能にする。場合によっては、方法は、約１０日～１４日で複数のリードセットを生成することを可能にする。生物の大部分のニッチについてさえゲノムを構築することは日常的となり、系統発生分析は比較の欠如に悩まされることなく、Ｇｅｎｏｍｅ１０ｋなどのプロジェクトを実現することができる。

本明細書に記載される方法は、以前に提供されたコンティグ情報、以前に生成されたコンティグ情報、またはデノボ合成されたコンティグ情報を、染色体またはより短い連続する核酸分子などの物理的な連鎖群に割り当てることを可能にする。同様に、本明細書に開示される方法は、前記コンティグが物理的な核酸分子に沿って直線的な順序で互いに対して配置されることを可能にする。同様に、本明細書に開示される方法は、前記コンティグが物理的な核酸分子に沿って直線的な順序で互いに対して配向されることを可能にする。

同様に、本明細書に開示される方法は、医療目的のための構造解析およびフェージング解析における進歩を提供することができる。癌、同じ種類の癌を持つ個体、または同じ腫瘍の中でさえ、驚くべき異種性が存在する。結果として生じる効果から原因となるものを引き出すことは、試料あたりの低いコストで非常に高い精度およびスループットを必要とする。オーダーメード医療の領域では、ゲノムケアの絶対的基準のうち１つは、大小の構造再編成および新規な突然変異を含む、徹底的に特徴付けられかつフェージングされたすべてのバリアントを有する、配列決定されたゲノムである。以前の技術でこれを達成するためには、現在ではあまりに高価でありかつ慣例的な医療処置を要求する、デノボアセンブリに必要なものと同様の労力を必要とする。場合によっては、本明細書に開示される方法は、低コストで完全で正確なゲノムを迅速に産生し、それによって、ヒト疾患の研究および処置において多くの高度に求められる能力をもたらす。

さらに、本明細書に開示される方法をフェージングに適用することは、統計的アプローチの利便性を、家族分析の精度と組み合わせることができ、いずれかの方法を単独で使用するものよりも大きな節約－費用、労力、および試料－をもたらす。以前の技術では禁止的である非常に望ましいフェージング分析である新規バリアントフェージング解析は、本明細書に開示される方法を使用して容易に実施することができる。このことは、ヒトの変種の大部分が稀であるため（５％未満のマイナー対立遺伝子頻度）、特に重要である。フェージング情報は、非連鎖遺伝子型と比較して、高度に結合したハプロタイプのネットワーク（単一染色体に割り当てられたバリアントの集合）から有意な利点を得る集団遺伝子研究にとって貴重である。ハプロタイプ情報は、集団のサイズ、移動、および亜集団間の交換の歴史的変化のより高解像度の研究を可能にし得、特定のバリアントを特定の親および祖父母に遡って追跡することを可能にする。これは、ひいては、疾患に関連するバリアントの遺伝的伝達、および単一の個体においてまとめられた場合のバリアント間の相互作用を明らかにする。さらなる場合において、本開示の方法は、極端にロングレンジのリードセット（ＸＬＲＳ）または極端にロングレンジのリード対（ＸＬＲＰ）ライブラリーの調製、配列決定、および分析を可能にする。

本開示のいくつかの実施形態では、対象由来の組織またはＤＮＡ試料が提供され、本方法は、組み立てられたゲノム、コールされたバリアント（大きな構造バリアントを含む）とのアラインメント、フェージングされたバリアントコール、または任意の追加の解析に戻る。他の実施形態において、本明細書に開示される方法は、個体のためのＸＬＲＰライブラリーを直接提供する。

様々な実施形態では、本明細書に開示される方法は、大きい距離によって分離される極端にロングレンジのリード対を生成する。この距離の上限は、大きなサイズのＤＮＡ試料を集める能力により改善され得る。場合によっては、リード対は、最大５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００ｋｂｐ、またはそれ以上のゲノム距離におよぶ。場合によっては、リード対は、最大５００ｋｂｐのゲノム距離におよぶ。他の場合には、リード対は、最大２０００ｋｂｐのゲノム距離におよぶ。本明細書に開示される方法は、分子生物学の標準技術に基づいて組み込みかつ構築することができ、さらに効率、特異性、およびゲノムカバレッジの増大に十分に適している。場合によっては、リード対は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、６０、または９０日未満で生成される。場合によっては、リード対は約１４日未満で生成される。さらなる場合には、リード対は約１０日未満で生成される。場合によっては、本開示の方法は、複数のコンティグの正確な順序付けおよび／または配向における少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％の精度で、リード対の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％超を提供する。場合によっては、方法は、複数のコンティグの正確な順序付けおよび／または配向において約９０～１００％の精度を提供する。

他の実施形態において、本明細書に開示される方法は、現在利用される配列決定技術と共に使用される。場合によっては、この方法は、十分に試験されおよび／または広く配備された配列決定機器と組み合わせて使用される。さらなる実施形態において、本明細書に開示される方法は、現在利用される配列決定技術に由来する技術と手法と共に使用される。

本明細書に開示される方法は、多種多様な生物のためのデノボゲノムアセンブリを劇的に単純化することができる。以前の技術を使用して、そのようなアセンブリは、現在、経済的なメイトペアライブラリーの短い挿入物によって制限されている。フォスミドでアクセス可能な最大４０～５０ｋｂｐのゲノム距離でリード対を生成することが可能であり得るが、これらは高価であり、扱いにくく、ヒトでは３００ｋｂｐ～５Ｍｂｐのサイズの範囲であるセントロメア内のものを含む最も長い反復ストレッチに及ぶには短すぎる。場合によっては、本明細書に開示される方法は、長い距離（例えば、メガベース以上）に及ぶことが可能なリード対を提供し、それによって、これらの足場完全性の課題を克服する。したがって、染色体レベルのアセンブリの産生は、本明細書に開示される方法を利用することによって日常的であり得る。同様に、ロングレンジフェージング情報の獲得は、集団のゲノム研究、系統発生研究、および疾患研究にさらなる膨大な力を提供することができる。特定の場合において、本明細書に開示される方法は、多数の個体についての正確なフェージングを可能にし、したがって、集団および深い時間レベルでゲノムをプローブする我々の能力の幅および深さを拡張する。

個別化医療の分野では、本明細書に開示される方法から生成されるＸＬＲＳリードセットは、正確で、低コストで、フェージングされた、迅速に産生される個人ゲノムへの有意義な進歩を表している。以前の方法は、長距離でバリアントをフェージングする能力が不十分であり、それによって、化合物ヘテロ接合遺伝子型の表現型の影響の特徴付けを妨げる。さらに、ゲノム疾患に実質的な関心対象の構造バリアントは、それらを研究するために使用されるリードおよびリード挿入物と比較してサイズが大きいため、以前の技術を用いて正確に同定および特徴付けすることが困難である。数十キロベース～メガベース以上にわたるリードセットは、この困難さを軽減するのに役立つことができ、それによって、構造多型の高度に並列かつ個別化された分析を可能にする。

基本的な進化研究および生物医学研究は、ハイスループット配列決定における技術的進歩によって推進され得る。現在、大量のＤＮＡ配列データを生成することは比較的安価である。しかしながら、以前の技術を用いて高品質で高度に連続したゲノム配列を作製することは、理論上および実際には困難である。さらに、ヒトを含む多くの生物は二倍体であり、各個体はゲノムの２つの半数体コピーを有する。ヘテロ接合性の部位（例えば、母親によって与えられる対立遺伝子が父親によって与えられる対立遺伝子と異なる場合）では、どの対立遺伝子のセットがどの親から来たかを知ることは困難である（ハプロタイプフェージングとして知られる）。この情報は、疾患および形質の関連研究などのいくつかの進化的研究および生物医学的研究を実施するために極めて重要であり得る。

本開示は、所定のゲノム内のクロマチン複合体などの複合体に結合した単一の物理的核酸分子からの配列リードに対応する、短い、中程度の、および長い結合のハイスループット発見のために、タグ付き配列リードとＤＮＡ調製のための技術を組み合わせるゲノムアセンブリのための方法を提供する。本開示はさらに、ゲノムアセンブリを補助するために、ハプロタイプフェージングのために、および／またはメタゲノム研究のために、これらの結合を使用する方法を提供する。本明細書に提示される方法は、対象のゲノムのアセンブリを決定するために使用することができるが、特定の場合において、本明細書に提示される方法は、染色体などの対象のゲノムの部分のアセンブリ、または様々な長さの対象のクロマチンのアセンブリを決定するために使用されることも理解されたい。特定の場合において、本明細書に提示される方法は、非染色体核酸分子のアセンブリを決定または指示するために使用されることも理解されたい。実際に、非反復コンティグを分離する反復領域の存在によって配列決定が複雑である任意の核酸は、本明細書に開示される方法を使用して促進され得る。

さらなる場合において、本明細書に開示される方法は、少量の材料を用いた遺伝子型アセンブリ、ハプロタイプフェージング、およびメタゲノミクスについての正確かつ予測的な結果を可能にする。場合によっては、約１００ピコグラム（ｐｇ）未満、約２００ｐｇ未満、約３００ｐｇ未満、約４００ｐｇ未満、約５００ｐｇ未満、約６００ｐｇ未満、約７００ｐｇ未満、約８００ｐｇ未満、約９００ｐｇ未満、約１．０ナノグラム（ｎｇ）未満、約２．０ｎｇ未満、約３．０ｎｇ未満、約４．０ｎｇ未満、約５．０ｎｇ未満、約６．０ｎｇ未満、約７．０ｎｇ未満、約８．０ｎｇ未満、約９．０ｎｇ未満、約１０ｎｇ未満、約１５ｎｇ未満、約２０ｎｇ未満、約３０ｎｇ未満、約４０ｎｇ未満、約５０ｎｇ未満、約６０ｎｇ未満、約７０ｎｇ未満、約８０ｎｇ未満、約９０ｎｇ未満、約１００ｎｇ未満、約２００ｎｇ未満、約３００ｎｇ未満、約４００ｎｇ未満、約５００ｎｇ未満、約６００ｎｇ未満、約７００ｎｇ未満、約８００ｎｇ未満、約９００ｎｇ未満、約１．０マイクログラム（μｇ）未満、約１．２μｇ未満、約１．４μｇ未満、約１．６μｇ未満、約１．８μｇ未満、約２．０μｇ未満、約２．５μｇ未満、約３．０μｇ未満、約３．５μｇ未満、約４．０μｇ未満、約４．５μｇ未満、約５．０μｇ未満、約６．０μｇ未満、約７．０μｇ未満、約８．０μｇ未満、約９．０μｇ未満、約１０μｇ未満、約１５μｇ未満、約２０μｇ未満、約３０μｇ未満、約４０μｇ未満、約５０μｇ未満、約６０μｇ未満、約７０μｇ未満、約８０μｇ未満、約９０μｇ未満、約１００μｇ未満、約１５０μｇ未満、約２００μｇ未満、約３００μｇ未満、約４００μｇ未満、約５００μｇ未満、約６００μｇ未満、約７００μｇ未満、約８００μｇ未満、約９００μｇ未満、または約１０００μｇ未満のＤＮＡが、本明細書に開示される方法とともに使用される。場合によっては、本明細書に開示される方法で使用されるＤＮＡは、約１０，０００，０００未満、約５，０００，０００未満、約４，０００，０００未満、約３，０００，０００未満、約２，０００，０００未満、約１，０００，０００未満、約５００，０００未満、約２００，０００未満、約１００，０００未満、約５０，０００未満、約２０，０００未満、約１０，０００未満、約５，０００未満、約２，０００未満、約１，０００未満、約５００未満、約２００未満、約１００未満、約５０未満、約２０未満、または約１０未満の細胞から抽出される。

二倍体ゲノムでは、染色体対上の相同位置にマッピングするのではなく、どの対立遺伝子バリアントが同じ染色体上で物理的に連合されているかを知ることがしばしば重要である。対立遺伝子または他の配列を二倍体染色体対の特定の物理的染色体にマッピングすることは、ハプロタイプフェージングとして公知である。ハイスループット配列データからのショートリードは、とりわけ、最も頻繁にあることだが、対立遺伝子バリアントが最長の単一リードよりも長い距離だけ離れている場合に、どの対立遺伝子バリアントが結合されているかを直接観察することを可能にすることはほとんどない。ハプロタイプフェージングのコンピュータによる推論は、長距離では信頼できない可能性がある。本明細書に開示される方法は、リード対上の対立遺伝子バリアントを使用して、どの対立遺伝子バリアントが物理的に結合されるかを決定することを可能にする。

様々な場合において、本開示の方法および組成物は、複数の対立遺伝子バリアントに関して、二倍体または多倍体のゲノムのハプロタイプフェージングを可能にする。したがって、本明細書に記載される方法は、標識された配列セグメントからのバリアント情報および／またはそれを使用するアセンブルされたコンティグに基づいて、結合された対立遺伝子バリアントの決定を提供する。対立遺伝子バリアントの例としては、限定されないが、１０００ゲノム、ＵＫ１０Ｋ、ＨａｐＭａｐ、およびヒト間の遺伝的変異を発見するための他のプロジェクトから知られているものが挙げられる。場合によっては、例えば、シャルコー・マリー・トゥース神経障害（ＬｕｐｓｋｉＪＲ，ＲｅｉｄＪＧ，Ｇｏｎｚａｇａ－ＪａｕｒｅｇｕｉＣ，ｅｔａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６２：１１８１－９１，２０１０）を引き起こすＳＨ３ＴＣ２の両方のコピーにおける非連鎖の不活性化突然変異、および高コレステロール血症９（ＲｉｏｓＪ，ＳｔｅｉｎＥ，ＳｈｅｎｄｕｒｅＪ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４３１３－１８，２０１０）を引き起こすＡＢＣＧ５の両方のコピーにおける非連鎖の不活性化突然変異の発見によって実証されるように、ハプロタイプフェージングデータを有することによって、特定の遺伝子への疾患の関連がより容易に明らかにされる。

ヒトは、１，０００において平均１部位でヘテロ接合性である。場合によっては、ハイスループット配列決定法を使用するデータの単一レーンは、少なくとも約１５０，０００，０００のリードを生成する。さらなる場合において、個々のリードは、約１００塩基対長である。本発明者らは、入力ＤＮＡ断片が平均１５０ｋｂｐのサイズであると仮定し、断片当たり１００のペアエンドリードを得る場合、セット当たり、すなわち１００のリード対当たり３０のヘテロ接合性部位を観察すると予想する。セット内にヘテロ接合部位を含むすべてのリード対は、同じセット内の他のすべてのリード対に対して相同性である（すなわち、分子的に結合される）。この特性は、場合によっては、リードの単数の対とは対照的に、セット内のフェージングのより大きな力を可能にする。ヒトゲノム中の約３０億塩基、および１０００中の１つがヘテロ接合性である場合、平均ヒトゲノム中に約３００万のヘテロ接合性部位が存在する。ヘテロ接合性部位を含む約４５，０００，０００個のリード対では、ハイスループット配列決定法の単一レーンを使用してフェージングされる各ヘテロ接合性部位の平均カバレッジは、典型的なハイスループット配列決定機を使用して、約（１５倍（１５Ｘ））である。したがって、二倍体ヒトゲノムは、本明細書に開示される方法を使用して調製される試料由来の配列バリアントに関連するハイスループット配列データの１つのレーンと、確実かつ完全にフェージングすることができる。場合によっては、データのレーンは、ＤＮＡ配列リードデータのセットである。さらなる場合において、データのレーンは、ハイスループット配列決定機の１回のランからのＤＮＡ配列リードデータのセットである。

ヒトゲノムは染色体の２つの相同セットからなるため、個体の真の遺伝子構成を理解することは、遺伝物質の母体および父体のコピーまたはハプロタイプの描写を必要とする。個体においてハプロタイプを得ることは、いくつかの方法で有用である。例えば、ハプロタイプは、臓器移植におけるドナー－宿主適合の結果の予測において臨床的に有用である。ハプロタイプは、疾患関連性を検出するためにますます使用されている。複合ヘテロ接合性を示す遺伝子において、ハプロタイプは、２つの有害なバリアントが同じ対立遺伝子（すなわち、遺伝学用語を使用するなら、「シス」）上に位置するか、または２つの異なる対立遺伝子（「トランス」）上に位置するかに関する情報を提供し、これらのバリアントの遺伝が有害であるかどうかの予測に大きく影響し、個体が機能的対立遺伝子および２つの有害なバリアント位置を有する単一の非機能的対立遺伝子を有するかどうか、または、その個体がそれぞれ異なる欠陥を有する２つの非機能的対立遺伝子を有するかどうかについて、結論に影響を与える。個体群由来のハプロタイプは、疫学者および人体学者の両方の関心対象である集団構造に関する、かつ、人類の進化の歴史に有益な情報を提供している。加えて、遺伝子発現における広範な対立遺伝子の不均衡が報告されており、対立遺伝子フェーズ間の遺伝的または後成的な差異が発現の定量的差異に寄与する可能性があることを示唆している。ハプロタイプ構造の理解は、対立遺伝子不均衡に寄与するバリアントの機構を描写するであろう。

特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ロングレンジの結合およびフェージングのために必要なゲノムの遠位領域間の会合を固定および捕捉するためのインビトロ技術を含む。場合によっては、方法は、非常にゲノム的に遠位のリード対を送達するために、１つ以上のリードセットを構築および配列決定する工程を含む。さらなる場合において、各リードセットは、共通のバーコードによって標識された２つ以上のリードを含み、これは、共通のポリヌクレオチドからの２つ以上の配列セグメントを表し得る。場合によっては、相互作用は主として単一のポリヌクレオチド内のランダムな会合から生じる。場合によっては、ポリヌクレオチドにおいて互いに近接する配列セグメントがより頻繁にかつより高い確率で相互作用するが、分子の遠位部分間の相互作用はより低頻度であるため、配列セグメント間のゲノム距離が推測される。したがって、２つの遺伝子座を結合する対の数と入力ＤＮＡ上でのそれらの近接性との間には系統的な関係がある。

いくつかの態様では、本開示は、極めて高いフェージング精度を達成するためのデータを生成する方法および組成物を提供する。以前の方法と比較して、本明細書に記載される方法は、より高い割合のバリアントをフェージングすることができる。場合によっては、高レベルの精度を維持しながらフェージングが達成される。さらなる場合において、このフェージング情報は、例えば、約２００ｋｂｐ、約３００ｋｂｐ、約４００ｋｂｐ、約５００ｋｂｐ、約６００ｋｂｐ、約７００ｋｂｐ、約８００ｋｂｐ、約９００ｋｂｐ、約１Ｍｂｐ、約２Ｍｂｐ、約３Ｍｂｐ、約４Ｍｂｐ、約５Ｍｂｐ、または約１０Ｍｂｐを超えて、あるいは、最大で染色体の全長を含んで、約１０Ｍｂｐを超えるロングレンジに拡張される。いくつかの実施形態では、ヒト試料のヘテロ接合性ＳＮＰの９０％超が、約２．５億未満のリードを使用して、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑデータの１レーンのみを使用することによって、９９％を超える精度でフェージングされる。他の場合において、ヒト試料についてのヘテロ接合性ＳＮＰの約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％超が、約２．５億未満または約５億未満のリードを使用して、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑデータの１または２レーンのみを使用することによって、約７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％を超える精度で、フェージングされる。場合によっては、ヒト試料についてのヘテロ接合性ＳＮＰの９５％または９９％超が、約２．５億または約５億未満のリードを用いて、約９５％または９９％を超える精度でフェージングされる。さらなる場合において、追加のバリアントは、リード長を約２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、８００ｂｐ、１０００ｂｐ、１５００ｂｐ、２ｋｂｐ、３ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、２０ｋｂｐ、５０ｋｂｐ、または１００ｋｂｐに増加させることによって捕捉される。

本開示の組成物および方法は、遺伝子発現分析に使用され得る。本明細書に記載される方法は、ヌクレオチド配列を区別する。標的ヌクレオチド配列間の差は、例えば、単一の核酸塩基の差、核酸欠失、核酸挿入、または再編成であり得る。１より多くの塩基を含むそのような配列の差も検出され得る。本開示のプロセスは、感染症、遺伝子疾患、および癌を検出することができる。さらに、上記プロセスは環境モニタリング、法医学、および食品科学においても有用である。核酸に対して実施され得る遺伝子分析の例としては、例えば、ＳＮＰ検出、ＳＴＲ検出、ＲＮＡ発現分析、プロモーターメチル化、遺伝子発現、ウイルス検出、ウイルスのサブタイプ分類、および薬物耐性が挙げられる。

本方法は、罹患した細胞型が試料に存在するかどうか、疾患の段階、患者の予後、特定の処置に応答する患者の能力、または患者にとって最良の処置を判定するために、患者から得られたまたは患者に由来する有生分子試料の分析に適用され得る。本方法は、特定の疾患のためのバイオマーカーを同定するためにも適用され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は疾病の診断に使用される。本明細書で使用されるように、「診断する」もしくは疾病の「診断」という用語は、疾病を予測もしくは診断すること、疾病の素因を判定すること、疾病の処置をモニタリングすること、疾患の治療反応、もしくは疾病の予後、疾病の進行、または疾病の特定の処置に対する反応を診断することを含む。例えば、血液試料は、試料中の疾患または悪性細胞型のマーカーの存在および／または量を判定するために、本明細書に記載される方法のうちいずれかに従ってアッセイすることができ、それによって、疾患または癌を診断またはステージ分類することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物は、疾病の診断および予後のために使用される。

多数の免疫学的、増殖性、および悪性の疾患と障害は、本明細書に記載される方法に特に適している。免疫疾患および障害は、アレルギー性疾患および障害、免疫機能の障害、ならびに自己免疫疾患および疾病を含む。アレルギー性疾患および障害は、限定されないが、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、および食物アレルギーを含む。免疫不全症は、限定されないが、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、好酸球増加症候群、慢性肉芽腫症、白血球接着不全症ＩおよびＩＩ、高ＩｇＥ症候群、チェディアック・東、好中球増加症、好中球減少症、無形成症、無ガンマグロブリン血症、高ＩｇＭ症候群、ディジョージ／軟口蓋帆・心臓・顔症候群、およびインターフェロン・ガンマ－ＴＨ１経路欠損症を含む。自己免疫性および免疫調節異常の障害は、限定されないが、関節リウマチ、糖尿病、全身性エリトマトーデス、グレーブス病、グレーブス眠症、クローン病、多発性硬化症、乾癬、全身性硬化症、甲状腺腫およびリンパ腫性甲状腺腫（橋本甲状腺炎、リンパ節様甲状腺腫）、円形脱毛症、自己免疫性心筋炎、硬化性苔癬、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、萎縮性胃炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、および炎症性腸疾患、同種異系移植片拒絶反応、ならびに感染性細菌または環境抗原に対するアレルギー反応による組織破壊を含む。

本開示の方法により評価され得る増殖性疾患および障害は、限定されないが、新生児の血管腫症、二次性進行型多発性硬化症、慢性進行性骨髄変性疾患、神経線維腫症、神経節神経腫症、ケロイド形成、骨のパジェット病、（例えば、乳房または子宮の）線維嚢胞症、サルコイドーシス、ペロニーおよびデュピュイトランの繊維症、硬変、アテローム性動脈硬化、および血管再狭窄を含む。

本開示の方法により評価され得る悪性疾患および障害は、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方を含む。

血液悪性腫瘍は特に、血液由来の細胞の変化を含むため、試料が血液試料である時に本開示の方法に適している。そのような悪性腫瘍は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非Ｂ細胞リンパ腫、および他のリンパ腫、急性または慢性の白血病、多血球血症、血小板血症、多発性骨髄腫、骨髄異形成障害、骨髄増殖性障害、骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｅｓ）、異型免疫リンパ球増殖、および形質細胞障害を含む。

本開示の方法により評価され得る形質細胞疾患は、多発性骨髄腫、アミロイドーシス、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む。

固形腫瘍の例としては、限定されないが、結腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱腫瘍、黒色腫、肝臓癌、骨肉腫、および他の骨癌、睾丸および卵巣の癌腫、頭頸部腫瘍、および子宮頸部の新生物が挙げられる。

遺伝子疾患も本開示のプロセスにより検出することができる。これは、染色体および遺伝子の異常、または遺伝子疾患に関する出生前または出生後のスクリーニングにより実行され得る。検出可能な遺伝子疾患の例は、２１ヒドロキシラーゼ欠損、嚢胞性繊維症、脆弱Ｘ症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ダウン症候群または他のトリソミー、心疾患、単一の遺伝子疾患、ＨＬＡ分類、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、テイ・ザックス病、サラセミア、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リピドーシス、肥満欠損症（ｏｂｅｓｉｔｙｄｅｆｅｃｔ）、血友病、先天性代謝異常症、および糖尿病を含む。

本明細書に記載される方法は、試料中の細菌またはウイルスそれぞれのマーカーの存在および／または量を判定することにより、病原体感染、例えば、細胞内細菌およびウイルスによる感染を診断するために使用され得る。

多種多様な感染症が本開示のプロセスにより検出することができる。感染症は、細菌、ウイルス、寄生生物、および真菌の感染因子により引き起こされ得る。薬物に対する様々な感染因子の抵抗性も、本開示を使用して判定され得る。

本開示により検出され得る細菌感染因子は、エシェリキア－コリ、サルモネラ、シゲラ、クレブシエラ、シュードモナス、リステリア－モノサイトゲネス、マイコバクテリウム－ツベルクローシス、マイコバクテリウム－アビウム－イントラセルラーレ、エルシニア、フランシセラ、パスツレラ、ブルセラ、クロストリジウム、ボルデテラ－ペルツッシス、バクテロイデス、スタフィロコッカス－アウレウス、ストレプトコッカス－ニューモニエ、Ｂ溶血性連鎖球菌（Ｂ－Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｓｔｒｅｐ．）、コリネバクテリア、レジオネラ、ミコプラズマ、ウレアプラスマ、クラミジア、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス、ヘモフィルスインフルエンザ、エンテロコッカス－フェカーリス、プロテウス・ブルガリス、プロテウス・ミラビリス、ヘリコバクターピロリ、トレポネーマ・パラジウム、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・リカレンチス、リケッチア病原体、ノカルディア、および放線菌（Ａｃｉｔｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）を含む。

本開示により検出され得る真菌感染因子は、クリプトコッカス－ネオフォルマンス、ブラストミセス－デルマティティディス、ヒストプラスマ－カプスラーツム、コクシジオイデス－イミチス、パラコクシジオイデス－ブラジリエンシス、カンジダ－アルビカンス、アスペルギルス－フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｕｔｕｓ）、藻菌類（リゾープス）、スポロトリックス－シェンキー、クロモミコーシス、およびマズラミコーシスを含む。

本開示により検出されるウイルス感染因子は、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ性細胞栄養性ウイルス（ｈｕｍａｎＴ－ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｔｒｏｐｈｉｃｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）、エプスタイン－バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トーガウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、風疹ウイルス、およびレオウイルスを含む。

本開示により検出され得る寄生生物因子は、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵型マラリア原虫、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｖｅｒｖａｖｏｌｖｕｌｕｓ）、リーシュマニア、トリパノゾーマ種、住血吸虫種、エントアメーバ－ヒストリティカ、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｕｍ）、ジアルジア種、トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｉｍｏｎａｓ）種、大腸バランチジウム（ＢａｌａｔｉｄｉｕｍＣｏｌｉ）、バンクロフト糸状虫、トキソプラズマ種、蟯虫、回虫、鞭虫、メジナ虫（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓｍｅｄｉｎｅｓｉｓ）、吸虫、広節裂頭条虫、テニア種、ニューモシスチス－カリニ、およびアメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒａｍｅｒｉｃａｎｉｓ）を含む。

本開示は、感染因子による薬物抵抗性の検出にも有用である。例えば、バイコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム、メチシリン耐性スタフィロコッカス－アウレウス、ペニシリン耐性ストレプトコッカス－ニューモニエ、多剤耐性マイコバクテリウム－ツベルクローシス、および耐ＡＺＴ性ヒト免疫不全ウイルスはすべて、本開示で同定され得る。

したがって、本開示の組成物および方法を使用して検出された標的分子は、患者のマーカー（癌マーカーなど）、または細菌もしくはウイルスマーカーなどの異物による感染のマーカーのいずれかであり得る。

本開示の組成物および方法は、標的分子を同定および／または定量化するために使用され得、標的分子の存在量は、生物学的状態または疾患条件、例えば、疾患状態の結果としてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる血液マーカーを示す。

いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物は、サイトカイン発現のために使用することができる。本明細書に記載される方法の低感受性は、例えば、癌などの疾患の状態、診断、または予後のバイオマーカーとしてのサイトカインの早期発見、および亜臨床的な状態の同定に有用である。

標的ポリヌクレオチドが由来する様々な試料は、同じ個体の複数の試料、異なる個体の試料、あるいはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、試料は、１人の個体の複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、試料は、２人以上の個体の複数のポリヌクレオチドを含む。個体は、標的ポリヌクレオチドが由来し得る任意の生物またはその一部であり、その非限定的な例としては、植物、動物、真菌、原生生物、モネラ界、ウイルス、ミトコンドリア、および葉緑体が挙げられる。試料ポリヌクレオチドは、細胞試料、組織試料、または、例えば、培養細胞株、生検、血液試料、もしくは細胞を含有している流体試料を含む、それらに由来する臓器試料など、対象から単離することができるものである。対象は、限定されないが、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物を含む動物であってもよく、通常はヒトなどの哺乳動物である。試料は化学合成などにより人工的に得られることもできる。いくつかの実施形態において、試料はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、試料はゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、試料は、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、バクテリア人工染色体、酵母人工染色体、オリゴヌクレオチドタグ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、試料は、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写、およびそれらの組み合わせを含む、プライマーとＤＮＡポリメラーゼとの適切な組み合わせを使用したプライマー伸長反応により生成されたＤＮＡを含む。プライマー伸長反応のための鋳型がＲＮＡである場合、逆転写の産物は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と呼ばれる。プライマー伸長反応に有用なプライマーは、１つ以上の標的に特異的な配列、ランダム配列、部分的なランダム配列、およびそれらの組み合わせを含み得る。プライマー伸長反応に適した反応条件は当該技術分野で知られている。一般に、試料のポリヌクレオチドは、試料中に存在する任意のポリヌクレオチドを含み、これは標的ポリヌクレオチドを含むこともあれば、含まないこともある。

いくつかの実施形態において、核酸鋳型分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、タンパク質、脂質、および非鋳型核酸などの、様々な他の成分を含有する生体試料から単離される。核酸鋳型分子は任意の細胞材料から得られ、動物、植物、細菌、真菌類、または他の細胞生物から得られ得る。本開示での使用のための生体試料は、ウイルスの粒子または調製物を含む。核酸鋳型分子は、生物から直接、または、生物から得た生体試料、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、便、および組織から得ることができる。任意の組織または体液の標本が、本開示で使用される核酸の供給源として使用されてもよい。核酸鋳型分子は、初代細胞培養物または細胞株などの培養細胞からも単離され得る。鋳型核酸が得られる細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染され得る。試料は、生体標本、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルスＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡから抽出された総体的なＲＮＡでもあり得る。試料は、細胞構造がない起源から単離されたＤＮＡ、例えば、冷凍装置から増幅／単離されたＤＮＡでもあり得る。

核酸の抽出と精製のための方法は公知である。例えば、核酸は、フェノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、あるいはＴＲＩｚｏｌおよびＴｒｉＲｅａｇｅｎｔを含む同様の製剤での有機抽出により精製され得る。抽出技術の他の限定されない例は、（１）自動核酸抽出器、例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なＭｏｄｅｌ３４１ＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｏｒの使用を伴うまたは伴わない、例えば、フェノール／クロロホルムの有機試薬（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９９３）を使用する、有機抽出とその後のエタノール沈殿、（２）固定相吸着法（米国特許第５，２３４，８０９号、Ｗａｌｓｈｅｔａｌ．，１９９１）、および（３）典型的に「塩析」方法と呼ばれる沈澱法などの、塩で誘導された核酸沈澱法（Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，（１９８８））を含む。核酸の単離および／または精製の別の例は、核酸が特異的または非特異的に結合することができる磁性粒子の使用と、その後の、磁石を使用したビーズの単離と、核酸の洗浄と、ビーズからの核酸の溶出を含む（例えば、米国特許第５，７０５，６２８号を参照）。いくつかの実施形態において、上記の単離方法は、試料から不要なタンパク質を取り除くのに役立つ酵素消化工程、例えば、プロテイナーゼＫまたは他の同様のプロテアーゼによる消化によって始められてもよい。例えば、米国特許第７，００１，７２４号を参照。必要に応じて、ＲＮａｓｅ阻害剤を溶解緩衝液に添加することができる。特定の細胞または試料型について、前記プロトコルにタンパク質変性／消化の工程を加えることが望ましい場合もある。精製方法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を単離することを目的とし得る。抽出手順の間またはその後に、ＤＮＡとＲＮＡの両方が一緒に単離されると、さらなる工程を利用して、一方または両方を他とは別々に精製することができる。例えば、サイズ、配列、または他の物理的もしくは化学的な特性による精製により、抽出した核酸の細画分を生成することもできる。最初の核酸単離工程に加えて、過剰なまたは不要な試薬、反応物、または生成物を除去するなどのために、本開示の方法における工程の後に、核酸の精製を実施することができる。

核酸の鋳型分子は、２００３年１０月９日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２００２／０１９０６６３号Ａ１に記載の通り得ることができる。通常、核酸は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０－２８１（１９８２）に記載されるものなどの様々な技術によって生体試料から抽出することができる。場合によっては、核酸は、最初に生体試料から抽出され、次いでインビトロでクロスリンクされ得る。場合によっては、天然の会合タンパク質（例えば、ヒストン）を、核酸からさらに除去することができる。

他の実施形態では、本開示は、例えば、組織、細胞培養物、体液、動物組織、植物、細菌、真菌、ウイルスなどから単離されたＤＮＡを含む任意の高分子量二本鎖ＤＮＡに容易に適用することができる。

サイズ選択を含むＨｉ－Ｃ方法

少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された生体試料を得る工程と、核酸分子を複数のセグメントに切断するために、安定化された生体試料をＤＮａｓｅと接触させる工程と、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程と、複数の選択されたセグメントを得るために、複数のセグメントをサイズ選択に供する工程と、を含む方法が本明細書で提供される。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１４５～約６００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約２５００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約６００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約６００～約２５００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは、約１００ｂｐ～約６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１４００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２４００ｂｐ、または約１００ｂｐ～約２５００ｂｐである。

本明細書に提供されるサイズ選択工程を含む方法の別の態様では、方法は、サイズ選択工程の前に、複数のセグメントから配列決定ライブラリーを調製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、サイズ選択ライブラリーを得るために、配列決定ライブラリーをサイズ選択に供する工程をさらに含む。場合によっては、サイズ選択されたライブラリーは、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐのサイズである。場合によっては、サイズ選択ライブラリーは、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐのサイズ、例えば、約１００ｂｐ～約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐおよび約２０００ｂｐ、約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約３５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２５００ｂｐ、または約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐである。

本明細書に提供されるサイズ選択工程を含む方法において利用されるサイズ選択は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、サイズ選択ビーズ、ゲル濾過カラム、他の適切な方法、またはそれらの組み合わせを用いて行うことができる。

別の態様では、本明細書で提供されるサイズ選択工程を含む方法は、ＱＣ値を得るために複数の選択されたセグメントを分析する工程をさらに含むことができる。場合によっては、ＱＣ値は、クロマチン消化効率（ＣＤＥ）およびクロマチン消化指数（ＧＤＩ）から選択される。ＣＤＥは、所望の長さを有するセグメントの割合として計算される。例えば、場合によっては、ＣＤＥは、サイズ選択前の１００～２５００ｂｐのサイズのセグメントの割合として計算される。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも６５％であるときに、さらなる分析のために選択される。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である場合に、さらなる分析のために選択される。ＣＤＩは、サイズ選択前の、モノヌクレオソームサイズのセグメントの数対ジヌクレオソームサイズのセグメントの数の比として計算される。例えば、ＣＤＩは、６００～２５００ｂｐのサイズを有する断片対１００～６００ｂｐのサイズを有する断片の比の対数として計算され得る。場合によっては、試料は、ＣＤＩ値が－１．５より大きくかつ１未満である場合に、さらなる分析のために選択される。場合によっては、ＣＤＩ値が約－２より大きく約１．５未満、約－１．９より大きく約１．５未満、約－１．８より大きく約１．５未満、約－１．７より大きく約１．５未満、約－１．６より大きく約１．５未満、約－１．５より大きく約１．５未満、約－１．４より大きく約１．５未満、約－１．３より大きく約１．５未満、約－１．２より大きく約１．５未満、約－１．１より大きく約１．５未満、約－２より大きく約１．５未満、約－１より大きく約１．５未満、約－０．９より大きく約１．５未満、約－０．８より大きく約１．５未満、約－０．７より大きく約１．５未満、約－０．６より大きく約１．５未満、約－０．５より大きく約１．５未満、約－２より大きく約１．４未満、約－２より大きく約１．３未満、約－２より大きく約１．２未満、約－２より大きく約１．１未満、約－２より大きく約１未満、約－２より大きく約０．９未満、約－２より大きく約０．８未満、約－２より大きく約０．７未満、約－２より大きく約０．６未満、または約－２より大きく約０．５未満である場合に、試料はさらなる分析のために選択される。

別の態様において、本明細書におけるサイズ選択工程を含む方法において使用される安定化された生体試料は、安定化剤で処理された生体材料を含む。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された細胞溶解物を含む。代替的に、安定化された生体試料は安定化された無傷細胞を含む。代替的に、安定化された生体試料は安定化された無傷の核を含む。場合によっては、安定化された無傷細胞または無傷の核試料をＤＮａｓｅに接触させる工程は、無傷細胞または無傷の核の溶解の前に行われる。場合によっては、細胞および／または核は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる前に溶解される。

別の態様において、本明細書におけるサイズ選択工程を含む方法は、少数の細胞または少量の核酸を含有する少量の試料において行われる。例えば、場合によっては、安定化された生体試料は３，０００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２，０００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１，０００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は５００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は４００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は３００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は５０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は４０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は３０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は約１０，０００個の細胞を含むことができる。場合によっては、安定化された生体試料は１０μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は９μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は８μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は７μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は６μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は５μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は４μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は３μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は２μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は１μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は０．５μｇ未満のＤＮＡを含む。

別の態様では、本明細書のサイズ選択工程を含む方法は、個々の細胞または単一の細胞に対して行うことができる。例えば、本明細書の方法は、個々のパーティションに分配された細胞に対して行うことができる。例示的なパーティションとしては、限定されないが、ウェル、エマルジョン中の液滴、または本明細書の他の箇所に記載されるような差次的に配列決定されたリンカー分子の別個のパッチを含む表面位置（例えば、アレイスポット、ビーズなど）が挙げられる。追加のパーティションも企図され、本明細書に開示される方法、組成物、およびシステムと一貫している。

さらなる態様では、本明細書のサイズ選択工程を含む方法で使用される安定化された生体試料は、ＤＮＡの断片を作製するためにＤＮａｓｅなどのヌクレアーゼで処理される。場合によっては、ＤＮａｓｅは非配列特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの両方に対して活性である。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡに特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡを優先的に切断する。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡに特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡを優先的に切断する。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩである。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩＩである。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩおよびＤＮａｓｅＩＩの１つ以上から選択される。場合によっては、ＤＮａｓｅは小球菌ヌクレアーゼである。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、および小球菌ヌクレアーゼのうちの１つ以上から選択される。場合によっては、ＤＮａｓｅは、免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合または融合され得る。免疫グロブリン結合タンパク質は、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬであり得る。いくつかの実施形態において、ＤＮａｓｅは、２つ以上の免疫グロブリン結合タンパク質および／またはその断片を含む融合タンパク質に結合され得る。他の適切なヌクレアーゼも本開示の範囲内である。

さらなる態様において、サイズ選択工程を含む方法において使用するための本明細書に提供される安定化された生体試料は、１つ以上のクロスリンキング剤で処理される。場合によっては、クロスリンキング剤は化学的固定剤である。場合によっては、化学的固定剤は、約２．３～２．７オングストローム（Å）のスペーサーアーム長を有するホルムアルデヒドを含んでいる。場合によっては、化学的固定剤は、長いスペーサーアーム長を有するクロスリンキング剤を含み、例えば、クロスリンキング剤は、少なくとも約３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１３Å、１４Å、１５Å、１６Å、１７Å、１８Å、１９Å、または２０Åのスペーサー長を有することができる。化学的固定剤は、約１６．１Åの長さを有するスペーサーアームを有するエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）を含むことができる。化学的固定剤は、約７．７Åの長さのスペーサーアームを有するジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）を含むことができる。場合によっては、化学的固定剤は、ホルムアルデヒドおよびＥＧＳ、ホルムアルデヒドおよびＤＳＧ、またはホルムアルデヒド、ＥＧＳ、および、ＤＳＧを含む。複数の化学的固定剤が使用される場合によっては、各化学的固定剤は連続して使用され、他の場合には、複数の化学的固定剤のいくつかまたはすべてが、同時に試料に適用される。長いスペーサーアームを有するクロスリンカーの使用は、大きな（例えば、＞１ｋｂ）リード対分離距離を有するリード対の割合を増加させることができる。例えば、図７は、得られたライブラリー（消化されたＤＮａｓｅおよびＭＮａｓｅの両方）をホルムアルデヒド単独でクロスリンクしたものと、ホルムアルデヒドとＤＳＧまたはＥＧＳでクロスリンクしたものとの比較を示す。ＤＳＧは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＤＳＧは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＤＳＧは、いくつかの用途においてジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）と比較して、クロスリンキング効率を高めることができる。ＥＧＳは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＥＧＳは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＥＧＳクロスリンクは、例えば、ｐＨ８．５で３～６時間ヒドロキシルアミンで処理することによって脱クロスリンクすることができる。例えば、ラクトースデヒドロゲナーゼは、ＥＧＳとの可逆的クロスリンク後にその活性の６０％を保持した。場合によっては、化学的固定剤はソラレンを含む。場合によっては、クロスリンキング剤は、紫外線、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンである。場合によっては、クロスリンキング剤は挿入剤、抗生物質、または副溝結合剤を含む。場合によっては、安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料である。

さらなる態様では、本明細書で提供されるサイズ選択工程を含む方法は、複数の選択されたセグメントを抗体に接触させる工程を含む。

さらなる態様では、本明細書で提供されるサイズ選択工程を含む方法は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程を含む。場合によっては、結合させる工程は、ビオチンタグ付きヌクレオチドを使用して粘着末端をｆｉｌｌ－ｉｎすること、および平滑末端をライゲーションすることを含む。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを架橋オリゴヌクレオチドに接触させることを含む。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントをバーコードに接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長～約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、約１５～約１８ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、バーコードを含み得る。いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、複数のバーコードを含むことができる。いくつかの実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドは、互いに結合された複数の架橋オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合され（ｃｏｕｐｌｅｄまたはｌｉｎｋｅｄ）得る。場合によっては、結合された架橋オリゴヌクレオチドは、抗体が結合される試料核酸中の位置に送達され得る。

分割およびプーリングアプローチを用いて、固有のバーコードを有する架橋オリゴヌクレオチドを生成することができる。試料の集団は、複数の群に分割することができ、架橋オリゴヌクレオチドは、架橋オリゴヌクレオチドバーコードが群間で異なるが、群内では同じであるように試料に結合させることができ、試料の群を再度プールすることができ、このプロセスを複数回繰り返すことができる。このプロセスを反復すると、最終的には、集団中の各試料が固有の一連の架橋オリゴヌクレオチドバーコードを有することになり、単一試料（例えば、単細胞、単核、単染色体）の分析が可能になる。１つの例示的な例では、ビーズの固体支持体に結合したクロスリンクした消化核の試料を８本のチューブに分け、各々が、ライゲーションされる二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）アダプターを含む第１のアダプター群（第１の反復）の８つの固有のメンバーのうちの１つを含有する。８つのアダプターの各々は、核中のクロスリンクしたクロマチン凝集体の核酸末端へのライゲーションのための同じ５’オーバーハング配列を有することができるが、そうでなければ固有のｄｓＤＮＡ配列を有する。第１のアダプター群をライゲーションした後、核をプールして戻し、洗浄してライゲーション反応成分を除去することができる。分配、ライゲーション、およびプールのスキームは、さらに２回繰り返すことができる（２回の反復）。各アダプター群からのメンバーのライゲーション後に、クロスリンクしたクロマチン凝集体を複数のバーコードに連続して結合させることができる。場合によっては、複数のアダプター群の複数のメンバーの連続ライゲーション（反復）は、バーコードの組み合わせをもたらす。利用可能なバーコードの組み合わせの数は、反復当たりの群の数、および使用されるバーコードオリゴヌクレオチドの総数に依存する。例えば、それぞれ８つのメンバーを含む３つの反復は、８３の可能な組み合わせを有することができる。場合によっては、バーコードの組み合わせは固有である。場合によっては、バーコードの組み合わせは冗長である。バーコードの組み合わせの総数は、固有のバーコードを受け取る群の数を増加または減少させることによって、および／または、反復の数を増加または減少させることによって調整することができる。１を超えるアダプター群が使用される場合、反復アダプター結合のために、分配、結合、およびプールのスキームを使用することができる。場合によっては、分配、結合、およびプールのスキームは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０回さらに繰り返され得る。場合によっては、最後のアダプター群のメンバーは、例えば、ＰＣＲ増幅による配列決定ライブラリー調製中に、アダプターに結合したＤＮＡのその後の濃縮のための配列を含む。

さらなる態様において、本明細書におけるサイズ選択工程を含む方法は、せん断工程を含まない（例えば、核酸はせん断されない）。

本明細書におけるサイズ選択工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくともいくつかの配列を得る工程を含む。例えば、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくとも約５０ｂｐ、少なくとも約１００ｂｐ、少なくとも約１５０ｂｐ、少なくとも約２００ｂｐ、少なくとも約２５０ｂｐ、または少なくとも約３００ｂｐの配列を得る工程を含み得る。

本明細書におけるサイズ選択工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングすることと、ゲノムに対する順序および／または配向を表すコンティグのセットを通る経路を決定することとを含む。

本明細書におけるサイズ選択工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、安定化された生体試料中の構造バリアントの存在またはヘテロ接合性の喪失を決定する工程とを含む。

本明細書におけるサイズ選択工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセット中のバリアントをフェーズに割り当てる工程とを含む。

本明細書におけるサイズ選択工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、コンティグのセットにおけるバリアントの存在を決定する工程と、（１）安定化された生体試料についての疾患段階、予後、または処置の経過を同定すること、（２）バリアントの存在に基づいて薬物を選択すること、または、（３）安定化された生体試料についての薬物効力を同定することの１つ以上から選択される工程を実施する工程とを含む。

ＱＣ計算を含むＨｉ－Ｃ方法
さらに、少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された生体試料を得る工程と、核酸分子を複数のセグメントに切断するために、安定化された生体試料をＤＮａｓｅと接触させる工程と、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程と、ＱＣ値を決定するために複数のセグメントを分析する工程と、を含む方法が本明細書で提供される。場合によっては、ＱＣ値は、クロマチン消化効率（ＣＤＥ）およびクロマチン消化指数（ＧＤＩ）から選択される。ＣＤＥは、所望の長さを有するセグメントの割合として計算される。例えば、場合によっては、ＣＤＥは、サイズ選択前の１００～２５００ｂｐのサイズのセグメントの割合として計算される。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも６５％であるときに、さらなる分析のために選択される。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である場合に、さらなる分析のために選択される。ＣＤＩは、サイズ選択前の、モノヌクレオソームサイズのセグメントの数対ジヌクレオソームサイズのセグメントの数の比として計算される。例えば、ＣＤＩは、６００～２５００ｂｐのサイズを有する断片対１００～６００ｂｐのサイズを有する断片の比の対数として計算され得る。場合によっては、試料は、ＣＤＩ値が－１．５より大きくかつ１未満である場合に、さらなる分析のために選択される。場合によっては、ＣＤＩ値が約－２より大きく約１．５未満、約－１．９より大きく約１．５未満、約－１．８より大きく約１．５未満、約－１．７より大きく約１．５未満、約－１．６より大きく約１．５未満、約－１．５より大きく約１．５未満、約－１．４より大きく約１．５未満、約－１．３より大きく約１．５未満、約－１．２より大きく約１．５未満、約－１．１より大きく約１．５未満、約－２より大きく約１．５未満、約－１より大きく約１．５未満、約－０．９より大きく約１．５未満、約－０．８より大きく約１．５未満、約－０．７より大きく約１．５未満、約－０．６より大きく約１．５未満、約－０．５より大きく約１．５未満、約－２より大きく約１．４未満、約－２より大きく約１．３未満、約－２より大きく約１．２未満、約－２より大きく約１．１未満、約－２より大きく約１未満、約－２より大きく約０．９未満、約－２より大きく約０．８未満、約－２より大きく約０．７未満、約－２より大きく約０．６未満、または約－２より大きく約０．５未満である場合に、試料はさらなる分析のために選択される。

他の態様では、本明細書のＱＣ決定工程を含む方法は、複数の選択されたセグメントを得るために、複数のセグメントをサイズ選択に供する工程を含み得る。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１４５～約６００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約２５００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約６００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約６００～約２５００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは、約１００ｂｐ～約６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１４００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２４００ｂｐ、または約１００ｂｐ～約２５００ｂｐである。

本明細書に提供されるＱＣ決定工程を含む方法の別の態様では、方法は、サイズ選択工程の前に、複数のセグメントから配列決定ライブラリーを調製する工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、方法は、サイズ選択ライブラリーを得るために、配列決定ライブラリーをサイズ選択に供する工程をさらに含む。場合によっては、サイズ選択されたライブラリーは、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐのサイズである。場合によっては、サイズ選択ライブラリーは、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐのサイズ、例えば、約１００ｂｐ～約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐおよび約２０００ｂｐ、約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約３５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２５００ｂｐ、または約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐである。

本明細書のＱＣ決定工程を含む方法において利用されるサイズ選択は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、サイズ選択ビーズ、ゲル濾過カラム、またはそれらの組み合わせを用いて行うことができる。他の適切なサイズ選択の方法も本開示の範囲内である。

別の態様において、本明細書のＱＣ決定工程を含む方法において使用される安定化された生体試料は、安定化剤で処理されている生体材料を含む。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された細胞溶解物を含む。代替的に、安定化された生体試料は安定化された無傷細胞を含む。代替的に、安定化された生体試料は安定化された無傷の核を含む。場合によっては、安定化された無傷細胞または無傷の核試料をＤＮａｓｅに接触させる工程は、無傷細胞または無傷の核の溶解の前に行われる。場合によっては、細胞および／または核は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる前に溶解される。

別の態様において、本明細書のＱＣ決定工程を含む方法は、少数の細胞または少量の核酸を含有する少量の試料において行われる。場合によっては、安定化された生体試料は３，０００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２，０００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１，０００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は５００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は４００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は３００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は５０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は４０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は３０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は約１０，０００個の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１０μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は９μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は８μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は７μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は６μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は５μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は４μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は３μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は２μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は１μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は０．５μｇ未満のＤＮＡを含む。

別の態様では、本明細書のＱＣ決定工程を含む方法は、個々の細胞または単一の細胞に対して行うことができる。例えば、本明細書の方法は、個々のパーティションに分配された細胞に対して行うことができる。例示的なパーティションとしては、限定されないが、ウェル、エマルジョン中の液滴、または本明細書の他の箇所に記載されるような差次的に配列決定されたリンカー分子の別個のパッチを含む表面位置（例えば、アレイスポット、ビーズなど）が挙げられる。追加のパーティションも企図され、本明細書に開示される方法、組成物、およびシステムと一貫している。

さらなる態様では、本明細書のＱＣ決定工程を含む方法で使用される安定化された生体試料は、ＤＮＡの断片を作製するためにＤＮａｓｅなどのヌクレアーゼで処理される。場合によっては、ＤＮａｓｅは非配列特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの両方に対して活性である。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡに特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡを優先的に切断する。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡに特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡを優先的に切断する。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩである。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩＩである。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩおよびＤＮａｓｅＩＩの１つ以上から選択される。場合によっては、ＤＮａｓｅは小球菌ヌクレアーゼである。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、および小球菌ヌクレアーゼのうちの１つ以上から選択される。場合によっては、ＤＮａｓｅは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合または融合され得る。他の適切なヌクレアーゼも本開示の範囲内である。

さらなる態様では、本明細書のＱＣ決定工程を含む方法で使用される安定化された生体試料は、クロスリンキング剤で処理される。場合によっては、クロスリンキング剤は化学的固定剤である。場合によっては、化学的固定剤は、約２．３～２．７オングストローム（Å）のスペーサーアーム長を有するホルムアルデヒドを含んでいる。場合によっては、化学的固定剤は、長いスペーサーアーム長を有するクロスリンキング剤を含み、例えば、クロスリンキング剤は、少なくとも約３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１３Å、１４Å、１５Å、１６Å、１７Å、１８Å、１９Å、または２０Åのスペーサー長を有することができる。化学的固定剤は、約１６．１Åの長さを有するスペーサーアームを有するエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）を含むことができる。化学的固定剤は、約７．７Åの長さのスペーサーアームを有するジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）を含むことができる。場合によっては、化学的固定剤は、ホルムアルデヒドおよびＥＧＳ、ホルムアルデヒドおよびＤＳＧ、またはホルムアルデヒド、ＥＧＳ、および、ＤＳＧを含む。複数の化学的固定剤が使用される場合によっては、各化学的固定剤は連続して使用される。他の場合には、複数の化学的固定剤のいくつかまたはすべてが、同時に試料に適用される。長いスペーサーアームを有するクロスリンカーの使用は、大きな（例えば、＞１ｋｂ）リード対分離距離を有するリード対の割合を増加させることができる。例えば、図７は、得られたライブラリー（消化されたＤＮａｓｅおよびＭＮａｓｅの両方）をホルムアルデヒド単独でクロスリンクしたものと、ホルムアルデヒドとＤＳＧまたはＥＧＳでクロスリンクしたものとの比較を示す。ＤＳＧは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＤＳＧは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＤＳＧは、いくつかの用途においてジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）と比較して、クロスリンキング効率を高めることができる。ＥＧＳは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＥＧＳは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＥＧＳクロスリンクは、例えば、ｐＨ８．５で３～６時間ヒドロキシルアミンで処理することによって脱クロスリンクすることができる。例えば、ラクトースデヒドロゲナーゼは、ＥＧＳとの可逆的クロスリンキング後にその活性の６０％を保持した。場合によっては、化学的固定剤はソラレンを含む。場合によっては、クロスリンキング剤は、紫外線、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンである。場合によっては、クロスリンキング剤は挿入剤、抗生物質、または副溝結合剤を含む。場合によっては、安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料である。

さらなる態様では、本明細書で提供されるＱＣ決定工程を含む方法は、複数の選択されたセグメントを抗体に接触させる工程を含む。

さらなる態様では、本明細書で提供されるＱＣ決定工程を含む方法は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程を含む。場合によっては、結合させる工程は、ビオチンタグ付きヌクレオチドを使用して粘着末端をｆｉｌｌ－ｉｎすること、および平滑末端をライゲーションすることを含む。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを架橋オリゴヌクレオチドに接触させることを含む。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントをバーコードに接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長～約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、約１５～約１８ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、バーコードを含み得る。いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、複数のバーコードを含むことができる。いくつかの実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドは、互いに結合された複数の架橋オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合され（ｃｏｕｐｌｅｄまたはｌｉｎｋｅｄ）得る。場合によっては、結合された架橋オリゴヌクレオチドは、抗体が結合される試料核酸中の位置に送達され得る。

さらなる態様では、本明細書のＱＣ決定工程を含む方法は、せん断工程を含まない。

本明細書のＱＣ決定工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくともいくつかの配列を得る工程を含む。例えば、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくとも約５０ｂｐ、少なくとも約１００ｂｐ、少なくとも約１５０ｂｐ、少なくとも約２００ｂｐ、少なくとも約２５０ｂｐ、または少なくとも約３００ｂｐの配列を得る工程を含み得る。

本明細書のＱＣ決定工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、ゲノムに対する順序および／または配向を表すコンティグのセットを通る経路を決定する工程とを含む。

本明細書のＱＣ決定工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、安定化された生体試料中の構造バリアントの存在またはヘテロ接合性の喪失を決定する工程とを含み得る。

本明細書のＱＣ決定工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセット中のバリアントをフェーズに割り当てる工程とを含む。

本明細書のＱＣ決定工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、コンティグのセットにおけるバリアントの存在を決定する工程と、（１）安定化された生体試料についての疾患段階、予後、または処置の経過を同定すること、（２）バリアントの存在に基づいて薬物を選択すること、または、（３）安定化された生体試料についての薬物効力を同定することの１つ以上から選択される工程を実施する工程とを含む。

全細胞または全核消化を含むＨｉ－Ｃ方法
少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された生体試料を得る工程と、核酸分子を複数のセグメントに切断するために、安定化された生体試料をＤＮａｓｅと接触させる工程と、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程であって、安定化された生体試料は無傷細胞および／または無傷の核を含む、工程とを含む方法が本明細書でさらに提供される。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された無傷細胞を含む。代替的に、または、組み合わせで、安定化された生体試料は安定化された無傷の核を含む。場合によっては、安定化された無傷細胞または無傷の核試料をＤＮａｓｅに接触させる工程は、無傷細胞または無傷の核の溶解の前に行われる。場合によっては、細胞および／または核は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる前に溶解される。

他の態様では、本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法は、複数の選択されたセグメントを得るために、複数のセグメントをサイズ選択に供する工程を含むことができる。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１４５～約６００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約２５００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約６００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約６００～約２５００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは、約１００ｂｐ～約６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１４００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２４００ｂｐ、または約１００ｂｐ～約２５００ｂｐである。

本明細書で提供される全細胞または全核の消化を含む方法の別の態様では、方法は、サイズ選択工程の前に、複数のセグメントから配列決定ライブラリーを調製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、サイズ選択ライブラリーを得るために、配列決定ライブラリーをサイズ選択に供する工程をさらに含む。場合によっては、サイズ選択されたライブラリーは、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐのサイズである。場合によっては、サイズ選択ライブラリーは、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐのサイズ、例えば、約１００ｂｐ～約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐおよび約２０００ｂｐ、約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約３５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２５００ｂｐ、または約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐである。

本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法において利用されるサイズ選択は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、サイズ選択ビーズ、ゲル濾過カラム、またはそれらの組み合わせを用いて行うことができる。

別の態様では、本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法は、ＱＣ値を得るために複数の選択されたセグメントをさらに分析する工程を含み得る。場合によっては、ＱＣ値は、クロマチン消化効率（ＣＤＥ）およびクロマチン消化指数（ＧＤＩ）から選択される。ＣＤＥは、所望の長さを有するセグメントの割合として計算される。例えば、場合によっては、ＣＤＥは、サイズ選択前の１００～２５００ｂｐのサイズのセグメントの割合として計算される。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも６５％であるときに、さらなる分析のために選択される。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である場合に、さらなる分析のために選択される。ＣＤＩは、サイズ選択前の、モノヌクレオソームサイズのセグメントの数対ジヌクレオソームサイズのセグメントの数の比として計算される。例えば、ＣＤＩは、６００～２５００ｂｐのサイズを有する断片対１００～６００ｂｐのサイズを有する断片の比の対数として計算され得る。場合によっては、試料は、ＣＤＩ値が－１．５より大きくかつ１未満である場合に、さらなる分析のために選択される。場合によっては、ＣＤＩ値が約－２より大きく約１．５未満、約－１．９より大きく約１．５未満、約－１．８より大きく約１．５未満、約－１．７より大きく約１．５未満、約－１．６より大きく約１．５未満、約－１．５より大きく約１．５未満、約－１．４より大きく約１．５未満、約－１．３より大きく約１．５未満、約－１．２より大きく約１．５未満、約－１．１より大きく約１．５未満、約－２より大きく約１．５未満、約－１より大きく約１．５未満、約－０．９より大きく約１．５未満、約－０．８より大きく約１．５未満、約－０．７より大きく約１．５未満、約－０．６より大きく約１．５未満、約－０．５より大きく約１．５未満、約－２より大きく約１．４未満、約－２より大きく約１．３未満、約－２より大きく約１．２未満、約－２より大きく約１．１未満、約－２より大きく約１未満、約－２より大きく約０．９未満、約－２より大きく約０．８未満、約－２より大きく約０．７未満、約－２より大きく約０．６未満、または約－２より大きく約０．５未満である場合に、試料はさらなる分析のために選択される。

別の態様において、本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法は、少数の細胞または少量の核酸を含有する少量の試料において行われる。場合によっては、安定化された生体試料は３，０００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２，０００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１，０００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は５００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は４００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は３００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は５０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は４０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は３０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は約１０，０００個の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１０μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は９μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は８μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は７μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は６μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は５μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は４μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は３μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は２μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は１μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は０．５μｇ未満のＤＮＡを含む。

他の態様では、本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法は、個々のまたは単一の細胞上で実施され得る。例えば、本明細書の方法は、個々のパーティションに分配された細胞に対して行うことができる。例示的なパーティションとしては、限定されないが、ウェル、エマルジョン中の液滴、または本明細書の他の箇所に記載されるような差次的に配列決定されたリンカー分子の別個のパッチを含む表面位置（例えば、アレイスポット、ビーズなど）が挙げられる。追加のパーティションも企図され、本明細書に開示される方法、組成物、およびシステムと一貫している。

さらなる態様では、本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法で使用される安定化された生体試料は、ＤＮＡの断片を作製するためにＤＮａｓｅなどのヌクレアーゼで処理される。場合によっては、ＤＮａｓｅは非配列特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの両方に対して活性である。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡに特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡを優先的に切断する。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡに特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡを優先的に切断する。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩである。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩＩである。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩおよびＤＮａｓｅＩＩの１つ以上から選択される。場合によっては、ＤＮａｓｅは小球菌ヌクレアーゼである。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、および小球菌ヌクレアーゼのうちの１つ以上から選択される。場合によっては、ＤＮａｓｅは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合または融合され得る。他の適切なヌクレアーゼも本開示の範囲内である。

さらなる態様では、本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法で使用される安定化された生体試料は、クロスリンキング剤で処理される。場合によっては、クロスリンキング剤は化学的固定剤である。場合によっては、化学的固定剤は、約２．３～２．７オングストローム（Å）のスペーサーアーム長を有するホルムアルデヒドを含んでいる。場合によっては、化学的固定剤は、長いスペーサーアーム長を有するクロスリンキング剤を含み、例えば、クロスリンキング剤は、少なくとも約３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１３Å、１４Å、１５Å、１６Å、１７Å、１８Å、１９Å、または２０Åのスペーサー長を有することができる。化学的固定剤は、約１６．１Åの長さを有するスペーサーアームを有するエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）を含むことができる。化学的固定剤は、約７．７Åの長さのスペーサーアームを有するジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）を含むことができる。場合によっては、化学的固定剤は、ホルムアルデヒドおよびＥＧＳ、ホルムアルデヒドおよびＤＳＧ、またはホルムアルデヒド、ＥＧＳ、および、ＤＳＧを含む。複数の化学的固定剤が使用される場合によっては、各化学的固定剤は連続して使用される。他の場合には、複数の化学的固定剤のいくつかまたはすべてが、同時に試料に適用される。長いスペーサーアームを有するクロスリンカーの使用は、大きな（例えば、＞１ｋｂ）リード対分離距離を有するリード対の割合を増加させることができる。例えば、図７は、得られたライブラリー（消化されたＤＮａｓｅおよびＭＮａｓｅの両方）をホルムアルデヒド単独でクロスリンクしたものと、ホルムアルデヒドとＤＳＧまたはＥＧＳでクロスリンクしたものとの比較を示す。ＤＳＧは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＤＳＧは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＤＳＧは、いくつかの用途においてジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）と比較して、クロスリンキング効率を高めることができる。ＥＧＳは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＥＧＳは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＥＧＳクロスリンクは、例えば、ｐＨ８．５で３～６時間ヒドロキシルアミンで処理することによって脱クロスリンクすることができる。例えば、ラクトースデヒドロゲナーゼは、ＥＧＳとの可逆的クロスリンキング後にその活性の６０％を保持した。場合によっては、化学的固定剤はソラレンを含む。場合によっては、クロスリンキング剤は、紫外線、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンである。場合によっては、クロスリンキング剤は挿入剤、抗生物質、または副溝結合剤を含む。場合によっては、安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料である。

さらなる態様では、本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法は、複数の選択されたセグメントを抗体に接触させる工程を含む。

さらなる態様では、本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程を含む。場合によっては、結合させる工程は、ビオチンタグ付きヌクレオチドを使用して粘着末端をｆｉｌｌ－ｉｎすること、および平滑末端をライゲーションすることを含む。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを架橋オリゴヌクレオチドに接触させることを含む。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントをバーコードに接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長～約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、約１５～約１８ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、バーコードを含むことができる。いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、複数のバーコードを含むことができる。いくつかの実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドは、互いに結合された複数の架橋オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合され（ｃｏｕｐｌｅｄまたはｌｉｎｋｅｄ）得る。場合によっては、結合された架橋オリゴヌクレオチドは、抗体が結合される試料核酸中の位置に送達され得る。

さらなる態様では、本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法は、せん断工程を含まない。

本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくともいくつかの配列を得る工程を含む。例えば、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくとも約５０ｂｐ、少なくとも約１００ｂｐ、少なくとも約１５０ｂｐ、少なくとも約２００ｂｐ、少なくとも約２５０ｂｐ、または少なくとも約３００ｂｐの配列を得る工程を含み得る。

本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、ゲノムに対する順序および／または配向を表すコンティグのセットを通る経路を決定する工程とを含む。

本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、安定化された生体試料中の構造バリアントの存在またはヘテロ接合性の喪失を決定する工程とを含む。

本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセット中のバリアントをフェーズに割り当てる工程とを含む。

本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、コンティグのセットにおけるバリアントの存在を決定する工程と、（１）安定化された生体試料についての疾患段階、予後、または処置の経過を同定すること、（２）バリアントの存在に基づいて薬物を選択すること、または、（３）安定化された生体試料についての薬物効力を同定することの１つ以上から選択される工程を実施する工程とを含む。

低核酸入力要件を有するＨｉ－Ｃ方法
少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された生体試料を得る工程と、核酸分子を複数のセグメントに切断するために、安定化された生体試料をＤＮａｓｅと接触させる工程と、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程であって、安定化された生体試料は３，０００，０００個未満の細胞または１０μｇ未満のＤＮＡを含む方法が本明細書でさらに提供される。場合によっては、安定化された生体試料は３，０００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２，０００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１，０００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は５００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は４００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は３００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２００，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１００，０００未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は５０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は４０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は３０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は約１０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は少なくとも１０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は少なくとも２０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は少なくとも３０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は少なくとも４０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約３０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約４０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約４０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約３０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約１０，０００個の細胞～約２０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約４０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約２０，０００個の細胞～約３０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約３０，０００個の細胞～約５０，０００個の細胞を含む。場合によっては、試料は約３０，０００個の細胞～約４０，０００個の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１０μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は９μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は８μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は７μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は６μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は５μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は４μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は３μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は２μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は１μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は０．５μｇ未満のＤＮＡを含む。

本明細書の方法の様々な態様では、安定化された試料は核を含むことがある。場合によっては、安定化された試料は、５０，０００個以下の核を含む。場合によっては、試料は、４０，０００個以下の核を含む。場合によっては、試料は、３０，０００個以下の核を含む。場合によっては、試料は、２０，０００個以下の核を含む。場合によっては、試料は少なくとも１０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は少なくとも２０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は少なくとも３０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は少なくとも４０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約５０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約５０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約３０，０００個の核～約５０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約４０，０００個の核～約５０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約４０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約３０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約１０，０００個の核～約２０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約５０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約４０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約２０，０００個の核～約３０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約３０，０００個の核～約５０，０００個の核を含む。場合によっては、試料は約３０，０００個の核～約４０，０００個の核を含む。

他の態様では、本明細書の低核酸入力要件を有する方法は、個々のまたは単一の細胞上で実施され得る。例えば、本明細書の方法は、個々のパーティションに分配された細胞に対して行うことができる。例示的なパーティションとしては、限定されないが、ウェル、エマルジョン中の液滴、または本明細書の他の箇所に記載されるような差次的に配列決定されたリンカー分子の別個のパッチを含む表面位置（例えば、アレイスポット、ビーズなど）が挙げられる。追加のパーティションも企図され、本明細書に開示される方法、組成物、およびシステムと一貫している。

他の態様では、本明細書の低核酸入力要件を有する方法は、複数の選択されたセグメントを得るために、複数のセグメントをサイズ選択に供する工程を含み得る。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１４５～約６００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約２５００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約６００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約６００～約２５００ｂｐである。場合によっては、複数の選択されたセグメントは、約１００ｂｐ～約６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１４００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２４００ｂｐ、または約１００ｂｐ～約２５００ｂｐである。

本明細書に提供される低核酸入力要件を有する方法の別の態様では、方法は、サイズ選択工程の前に、複数のセグメントから配列決定ライブラリーを調製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、サイズ選択ライブラリーを得るために、配列決定ライブラリーをサイズ選択に供する工程をさらに含む。場合によっては、サイズ選択されたライブラリーは、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐのサイズである。場合によっては、サイズ選択ライブラリーは、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐのサイズ、例えば、約１００ｂｐ～約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐおよび約２０００ｂｐ、約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約３５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２５００ｂｐ、または約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐである。

本明細書の低核酸入力要件を有する方法において利用されるサイズ選択は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、サイズ選択ビーズ、ゲル濾過カラム、またはそれらの組み合わせを用いて行うことができる。

別の態様では、本明細書の低核酸入力要件を有する方法は、ＱＣ値を得るために複数の選択されたセグメントを分析する工程をさらに含み得る。場合によっては、ＱＣ値は、クロマチン消化効率（ＣＤＥ）およびクロマチン消化指数（ＧＤＩ）から選択される。ＣＤＥは、所望の長さを有するセグメントの割合として計算される。例えば、場合によっては、ＣＤＥは、サイズ選択前の１００～２５００ｂｐのサイズのセグメントの割合として計算される。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも６５％であるときに、さらなる分析のために選択される。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である場合に、さらなる分析のために選択される。ＣＤＩは、サイズ選択前の、モノヌクレオソームサイズのセグメントの数対ジヌクレオソームサイズのセグメントの数の比として計算される。例えば、ＣＤＩは、６００～２５００ｂｐのサイズを有する断片対１００～６００ｂｐのサイズを有する断片の比の対数として計算され得る。場合によっては、試料は、ＣＤＩ値が－１．５より大きくかつ１未満である場合に、さらなる分析のために選択される。場合によっては、ＣＤＩ値が約－２より大きく約１．５未満、約－１．９より大きく約１．５未満、約－１．８より大きく約１．５未満、約－１．７より大きく約１．５未満、約－１．６より大きく約１．５未満、約－１．５より大きく約１．５未満、約－１．４より大きく約１．５未満、約－１．３より大きく約１．５未満、約－１．２より大きく約１．５未満、約－１．１より大きく約１．５未満、約－２より大きく約１．５未満、約－１より大きく約１．５未満、約－０．９より大きく約１．５未満、約－０．８より大きく約１．５未満、約－０．７より大きく約１．５未満、約－０．６より大きく約１．５未満、約－０．５より大きく約１．５未満、約－２より大きく約１．４未満、約－２より大きく約１．３未満、約－２より大きく約１．２未満、約－２より大きく約１．１未満、約－２より大きく約１未満、約－２より大きく約０．９未満、約－２より大きく約０．８未満、約－２より大きく約０．７未満、約－２より大きく約０．６未満、または約－２より大きく約０．５未満である場合に、試料はさらなる分析のために選択される。

別の態様において、本明細書における低核酸入力要件を有する方法において使用される安定化された生体試料は、安定化剤で処理された生体材料を含む。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された細胞溶解物を含む。代替的に、安定化された生体試料は安定化された無傷細胞を含む。代替的に、安定化された生体試料は安定化された無傷の核を含む。場合によっては、安定化された無傷細胞または無傷の核試料をＤＮａｓｅに接触させる工程は、無傷細胞または無傷の核の溶解の前に行われる。場合によっては、細胞および／または核は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる前に溶解される。

さらなる態様では、本明細書の低核酸入力要件を有する方法で使用される安定化された生体試料は、ＤＮＡの断片を作製するためにＤＮａｓｅなどのヌクレアーゼで処理される。場合によっては、ＤＮａｓｅは非配列特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの両方に対して活性である。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡに特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡを優先的に切断する。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡに特異的である。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡを優先的に切断する。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩである。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩＩである。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩおよびＤＮａｓｅＩＩの１つ以上から選択される。場合によっては、ＤＮａｓｅは小球菌ヌクレアーゼである。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、および小球菌ヌクレアーゼのうちの１つ以上から選択される。場合によっては、ＤＮａｓｅは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合または融合され得る。他の適切なヌクレアーゼも本開示の範囲内である。

さらなる態様では、本明細書の低核酸入力要件を有する方法で使用される安定化された生体試料は、クロスリンキング剤で処理される。場合によっては、クロスリンキング剤は化学的固定剤である。場合によっては、化学的固定剤は、約２．３～２．７オングストローム（Å）のスペーサーアーム長を有するホルムアルデヒドを含んでいる。場合によっては、化学的固定剤は、長いスペーサーアーム長を有するクロスリンキング剤を含み、例えば、クロスリンキング剤は、少なくとも約３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１３Å、１４Å、１５Å、１６Å、１７Å、１８Å、１９Å、または２０Åのスペーサー長を有することができる。化学的固定剤は、約１６．１Åの長さを有するスペーサーアームを有するエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）を含むことができる。化学的固定剤は、約７．７Åの長さのスペーサーアームを有するジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）を含むことができる。場合によっては、化学的固定剤は、ホルムアルデヒドおよびＥＧＳ、ホルムアルデヒドおよびＤＳＧ、またはホルムアルデヒド、ＥＧＳ、および、ＤＳＧを含む。複数の化学的固定剤が使用される場合によっては、各化学的固定剤は連続して使用される。他の場合には、複数の化学的固定剤のいくつかまたはすべてが、同時に試料に適用される。長いスペーサーアームを有するクロスリンカーの使用は、大きな（例えば、＞１ｋｂ）リード対分離距離を有するリード対の割合を増加させることができる。例えば、図７は、得られたライブラリー（消化されたＤＮａｓｅおよびＭＮａｓｅの両方）をホルムアルデヒド単独でクロスリンクしたものと、ホルムアルデヒドとＤＳＧまたはＥＧＳでクロスリンクしたものとの比較を示す。ＤＳＧは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＤＳＧは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＤＳＧは、いくつかの用途においてジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）と比較して、クロスリンキング効率を高めることができる。ＥＧＳは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＥＧＳは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＥＧＳクロスリンクは、例えば、ｐＨ８．５で３～６時間ヒドロキシルアミンで処理することによって脱クロスリンクすることができる。例えば、ラクトースデヒドロゲナーゼは、ＥＧＳとの可逆的クロスリンキング後にその活性の６０％を保持した。場合によっては、化学的固定剤はソラレンを含む。場合によっては、クロスリンキング剤は、紫外線、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンである。場合によっては、クロスリンキング剤は挿入剤、抗生物質、または副溝結合剤を含む。場合によっては、安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料である。

さらなる態様では、本明細書で提供される方法は、複数の選択されたセグメントを抗体に接触させる工程を含む。

さらなる態様では、本明細書で提供される低核酸入力要件を有する方法は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程を含む。場合によっては、結合させる工程は、ビオチンタグ付きヌクレオチドを使用して粘着末端をｆｉｌｌ－ｉｎすること、および平滑末端をライゲーションすることを含む。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを架橋オリゴヌクレオチドに接触させることを含む。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントをバーコードに接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長～約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、約１５～約１８ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、バーコードを含み得る。いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、複数のバーコードを含むことができる。いくつかの実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドは、互いに結合された複数の架橋オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合され（ｃｏｕｐｌｅｄまたはｌｉｎｋｅｄ）得る。場合によっては、結合された架橋オリゴヌクレオチドは、抗体が結合される試料核酸中の位置に送達され得る。

さらなる態様では、本明細書の低核酸入力要件を有する方法は、せん断工程を含まない。

本明細書の低核酸入力要件を有する方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくともいくつかの配列を得る工程を含む。例えば、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくとも約５０ｂｐ、少なくとも約１００ｂｐ、少なくとも約１５０ｂｐ、少なくとも約２００ｂｐ、少なくとも約２５０ｂｐ、または少なくとも約３００ｂｐの配列を得る工程を含み得る。

本明細書の低核酸入力要件を有する方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、ゲノムに対する順序および／または配向を表すコンティグのセットを通る経路を決定する工程とを含む。

本明細書の低核酸入力要件を有する方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、安定化された生体試料中の構造バリアントの存在またはヘテロ接合性の喪失を決定する工程とを含む。

本明細書の低核酸入力要件を有する方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセット中のバリアントをフェーズに割り当てる工程とを含む。

本明細書の低核酸入力要件を有する方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、コンティグのセットにおけるバリアントの存在を決定する工程と、（１）安定化された生体試料についての疾患段階、予後、または処置の経過を同定すること、（２）バリアントの存在に基づいて薬物を選択すること、または、（３）安定化された生体試料についての薬物効力を同定することの１つ以上から選択される工程を実施する工程とを含む。

小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）を使用するＨｉ－Ｃ方法
少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された生体試料を得る工程と、核酸分子を複数のセグメントに切断するために、安定化された生体試料を小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）と接触させる工程と、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程とを含み得る方法がさらに本明細書で提供される。本明細書の方法におけるＭＮａｓｅの使用は、例えば、ＭＮａｓｅがＤＮＡ結合タンパク質に結合していないすべての塩基対を切断することができるため、ＤＮＡ結合タンパク質が最大で一塩基対解像度によってクロマチンに結合している場所に関する特定の情報を提供することができる。さらに、ＭＮａｓｅ消化の使用により、三次元クロマチン構造情報を解読するための接触マップおよびトポロジー的に関連するドメインの作成が可能となり得る。場合によっては、ＭＮａｓｅは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合または融合され得る。

例えば、ＭＮａｓｅＨｉ－Ｃ方法は、約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、５０００ｂｐ、６０００ｂｐ、７０００ｂｐ、８０００ｂｐ、９０００ｂｐ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、または１００ｋｂ以下の解像度でタンパク質結合またはゲノムの接触相互作用の位置を提供することができる。場合によっては、タンパク質結合部位、タンパク質フットプリント、接触相互作用、または他の特徴は、１０００ｂｐ以内、９００ｂｐ以内、８００ｂｐ以内、７００ｂｐ以内、６００ｂｐ以内、５００ｂｐ以内、４００ｂｐ以内、３００ｂｐ以内、２００ｂｐ以内、１９０ｂｐ以内、１８０ｂｐ以内、１７０ｂｐ以内、１６０ｂｐ以内、１５０ｂｐ以内、１４０ｂｐ以内、１３０ｂｐ以内、１２０ｂｐ以内、１１０ｂｐ以内、１００ｂｐ以内、９０ｂｐ以内、８０ｂｐ以内、７０ｂｐ以内、６０ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、４０ｂｐ以内、３０ｂｐ以内、２０ｂｐ以内、１０ｂｐ以内、９ｂｐ以内、８ｂｐ以内、７ｂｐ以内、６ｂｐ以内、５ｂｐ以内、４ｂｐ以内、３ｂｐ以内、２ｂｐ以内、または１ｂｐ以内にマッピングすることができる。

特定の態様では、ＭＮａｓｅ消化工程を含む方法は、複数の選択されたセグメントを得るために、複数のセグメントをサイズ選択に供する工程を含み得る。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１４５～約６００ｂｐであり得る。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約２５００ｂｐであり得る。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約６００ｂｐであり得る。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約６００～約２５００ｂｐであり得る。場合によっては、複数の選択されたセグメントは、約１００ｂｐ～約６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１４００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２４００ｂｐ、または約１００ｂｐ～約２５００ｂｐであり得る。

本明細書に提供されるＭＮａｓｅ消化工程を含む方法の別の態様では、方法は、複数のセグメントから配列決定ライブラリーを調製する工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、サイズ選択ライブラリーを得るために、配列決定ライブラリーをサイズ選択に供する工程をさらに含み得る。場合によっては、サイズ選択されたライブラリーは、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐのサイズであり得る。場合によっては、サイズ選択ライブラリーは、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐのサイズ、例えば、約１００ｂｐ～約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約３５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２５００ｂｐ、または約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐであり得る。

別の態様では、本明細書で提供されるＭＮａｓｅ消化工程を含む方法は、ＱＣ値を得るために複数のセグメントを分析する工程をさらに含むことができる。場合によっては、ＱＣ値は、クロマチン消化効率（ＣＤＥ）およびクロマチン消化指数（ＧＤＩ）から選択され得る。ＣＤＥは、所望の長さを有するセグメントの割合として計算することができる。例えば、場合によっては、ＣＤＥは、サイズ選択前の１００ｂｐ～２５００ｂｐのサイズのセグメントの割合として計算することができる。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも６５％であるときに、さらなる分析のために選択される。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である場合に、さらなる分析のために選択され得る。

ＣＤＩは、サイズ選択前の、モノヌクレオソームサイズのセグメントの数対ジヌクレオソームサイズのセグメントの数の比として計算することができる。例えば、ＣＤＩは、６００～２５００ｂｐのサイズを有する断片対１００～６００ｂｐのサイズを有する断片の比の対数として計算され得る。場合によっては、試料は、ＣＤＩ値が－１．５より大きくかつ１未満である場合に、さらなる分析のために選択され得る。場合によっては、ＣＤＩ値が約－２より大きく約１．５未満、約－１．９より大きく約１．５未満、約－１．８より大きく約１．５未満、約－１．７より大きく約１．５未満、約－１．６より大きく約１．５未満、約－１．５より大きく約１．５未満、約－１．４より大きく約１．５未満、約－１．３より大きく約１．５未満、約－１．２より大きく約１．５未満、約－１．１より大きく約１．５未満、約－２より大きく約１．５未満、約－１より大きく約１．５未満、約－０．９より大きく約１．５未満、約－０．８より大きく約１．５未満、約－０．７より大きく約１．５未満、約－０．６より大きく約１．５未満、約－０．５より大きく約１．５未満、約－２より大きく約１．４未満、約－２より大きく約１．３未満、約－２より大きく約１．２未満、約－２より大きく約１．１未満、約－２より大きく約１未満、約－２より大きく約０．９未満、約－２より大きく約０．８未満、約－２より大きく約０．７未満、約－２より大きく約０．６未満、または約－２より大きく約０．５未満である場合に、試料はさらなる分析のために選択され得る。

別の態様において、本明細書で提供されるＭＮａｓｅ消化工程を含む方法において使用される安定化された生体試料は、安定化剤で処理された生体材料を含む。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された細胞溶解物を含み得る。代替的に、安定化された生体試料は安定化された無傷細胞を含み得る。代替的に、安定化された生体試料は安定化された無傷の核を含み得る。場合によっては、安定化された無傷細胞または無傷の核試料をＭＮａｓｅに接触させる工程は、無傷細胞または無傷の核の溶解の前に行われ得る。場合によっては、細胞および／または核は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる前に溶解され得る。

別の態様において、本明細書のＭＮａｓｅ消化工程を含む方法は、少数の細胞または少量の核酸を含有する少量の試料において行われ得る。例えば、場合によっては、安定化された生体試料は３，０００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は２，０００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は１，０００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は５００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は４００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は３００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は２００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は１００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は５０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は４０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は３０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は約１０，０００個の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１０μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は９μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は８μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は７μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は６μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は５μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は４μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は３μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は２μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は１μｇ未満のＤＮＡを含む。場合によっては、安定化された生体試料は０．５μｇ未満のＤＮＡを含む。

別の態様では、本明細書のＭＮａｓｅ消化工程を含む方法は、個々の細胞または単一の細胞に対して行ってもよい。例えば、本明細書の方法は、個々のパーティションに分配された細胞に対して行うことができる。例示的なパーティションとしては、限定されないが、ウェル、エマルジョン中の液滴、または本明細書の他の箇所に記載されるような差次的に配列決定されたリンカー分子の別個のパッチを含む表面位置（例えば、アレイスポット、ビーズなど）が挙げられる。追加のパーティションも企図され、本明細書に開示される方法、組成物、およびシステムと一貫している。

さらなる態様では、本明細書のＭＮａｓｅ消化工程を含む方法で使用される安定化された生体試料は、ＤＮＡの断片を作製するためにＤＮａｓｅなどの追加のヌクレアーゼでさらに処理され得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは非配列特異的であり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの両方に対して活性であり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡに特異的であり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡを優先的に切断し得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡに特異的であり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡを優先的に切断し得る。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩであり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩＩであり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩおよびＤＮａｓｅＩＩの１つ以上から選択され得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合または融合され得る。他の適切なヌクレアーゼも本開示の範囲内である。

さらなる態様において、ＭＮａｓｅ消化工程を含む方法において使用するための本明細書に提供される安定化された生体試料は、クロスリンキング剤で処理することができる。場合によっては、クロスリンキング剤は化学的固定剤であり得る。場合によっては、化学的固定剤は、約２．３～２．７オングストローム（Å）のスペーサーアーム長を有するホルムアルデヒドを含んでいる。場合によっては、化学的固定剤は、長いスペーサーアーム長を有するクロスリンキング剤を含み、例えば、クロスリンキング剤は、少なくとも約３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１３Å、１４Å、１５Å、１６Å、１７Å、１８Å、１９Å、または２０Åのスペーサー長を有することができる。化学的固定剤は、約１６．１Åの長さを有するスペーサーアームを有するエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）を含むことができる。化学的固定剤は、約７．７Åの長さのスペーサーアームを有するジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）を含むことができる。場合によっては、化学的固定剤は、ホルムアルデヒドおよびＥＧＳ、ホルムアルデヒドおよびＤＳＧ、またはホルムアルデヒド、ＥＧＳ、および、ＤＳＧを含む。複数の化学的固定剤が使用される場合によっては、各化学的固定剤は連続して使用される。他の場合には、複数の化学的固定剤のいくつかまたはすべてが、同時に試料に適用される。長いスペーサーアームを有するクロスリンカーの使用は、大きな（例えば、＞１ｋｂ）リード対分離距離を有するリード対の割合を増加させることができる。例えば、図７は、得られたライブラリー（消化されたＤＮａｓｅおよびＭＮａｓｅの両方）をホルムアルデヒド単独でクロスリンクしたものと、ホルムアルデヒドとＤＳＧまたはＥＧＳでクロスリンクしたものとの比較を示す。ＤＳＧは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＤＳＧは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＤＳＧは、いくつかの用途においてジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）と比較して、クロスリンキング効率を高めることができる。ＥＧＳは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＥＧＳは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＥＧＳクロスリンクは、例えば、ｐＨ８．５で３～６時間ヒドロキシルアミンで処理することによって脱クロスリンクすることができる。例えば、ラクトースデヒドロゲナーゼは、ＥＧＳとの可逆的クロスリンキング後にその活性の６０％を保持した。場合によっては、化学的固定剤はソラレンを含み得る。場合によっては、クロスリンキング剤は、紫外線、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンであり得る。場合によっては、クロスリンキング剤は挿入剤、抗生物質、または副溝結合剤を含む。場合によっては、安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料であり得る。

さらなる態様では、本明細書で提供されるＭＮａｓｅ消化工程を含む方法は、複数の選択されたセグメントを抗体に接触させる工程を含み得る。場合によっては、オリゴヌクレオチドアダプターにテザリングされた免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片は、複数の選択されたセグメントに結合した抗体にテザリングされ得る。

さらなる態様では、本明細書で提供されるＭＮａｓｅ消化工程を含む方法は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程を含む。場合によっては、結合させる工程は、ビオチンタグ付きヌクレオチドを使用して粘着末端をｆｉｌｌ－ｉｎすること、および平滑末端をライゲーションすることを含み得る。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを架橋オリゴヌクレオチドに接触させることを含み得る。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントをバーコードに接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長～約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、約１５～約１８ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、バーコードを含み得る。

本明細書のＭＮａｓｅ消化工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくともいくつかの配列を得る工程を含むことができる。例えば、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくとも約５０ｂｐ、少なくとも約１００ｂｐ、少なくとも約１５０ｂｐ、少なくとも約２００ｂｐ、少なくとも約２５０ｂｐ、または少なくとも約３００ｂｐの配列を得る工程を含み得る。

本明細書におけるＭＮａｓｅ消化工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングすることと、ゲノムに対する順序および／または配向を表すコンティグのセットを通る経路を決定することとを含むことができる。

本明細書のＭＮａｓｅ消化工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、安定化された生体試料中の構造バリアントの存在またはヘテロ接合性の喪失を決定する工程とを含むことができる。

本明細書におけるＭＮａｓｅ消化工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセット中のバリアントをフェーズに割り当てる工程とを含む。

本明細書のＭＮａｓｅ消化工程を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、コンティグのセットにおけるバリアントの存在を決定する工程と、（１）安定化された生体試料についての疾患段階、予後、または処置の経過を同定すること、（２）バリアントの存在に基づいて薬物を選択すること、または、（３）安定化された生体試料についての薬物効力を同定することの１つ以上から選択される工程を実施する工程とを含むことができる。

ＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法
ＨｉＣｈＩＰは、ＨｉＣの方法をクロマチン免疫沈降の方法と組み合わせるアプローチであり、関心対象の１つ以上のタンパク質を含む相互作用の標的分析を可能にする。近接ライゲーションされた核酸を調製することができ、標的領域をさらなる分析のために免疫沈降させることができる。関連するアプローチであるＨｉＣｈＩＲＰは、ＲＮＡ精製（ＣｈＩＲＰ）濃縮によるクロマチン単離をＨｉＣ法と組み合わせて使用し、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の足場機能などのＲＮＡの調査を可能にする。メチル－ＨｉＣは、メチル化分析をＨｉＣ法と組み合わせ、染色体立体配座およびＤＮＡメチローム情報の同時捕捉を可能にする。メチル－ＨｉＣは、核内で空間的に近接している遠位ゲノムセグメント間の同調的なＤＮＡメチル化状態を明らかにし、混合集団におけるクロマチン構造およびＤＮＡメチロームの両方の異質性を描写し、複雑な組織における細胞型特異的クロマチン構成およびエピゲノムの同時の特徴付けを可能にすることができる。これらの方法および他の方法は、限定されないが、サイズ選択工程、表面結合工程（例えば、ＳＰＲＩビーズなどのビーズへの結合）、近接ライゲーションを行うための架橋オリゴヌクレオチドの使用、近接ライゲーションを行うための組換えの使用などを含む本開示の技法の使用によって改善することができる。

さらなる態様では、例えば、核酸結合タンパク質に結合した核酸の免疫沈降によって、またはメチル化核酸の免疫沈降によって、少なくとも１つの核酸結合タンパク質と複合体化された核酸分子を含む安定化された生体試料を得る工程と、核酸分子を複数のセグメントに切断するために、安定化された生体試料をＤＮａｓｅと接触させる工程と、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程と、複数の選択されたセグメントを得るために、複数のセグメントをサイズ選択に供する工程と、を含むことができる、ＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法が本明細書で提供される。代替的に、または、組み合わせで、本明細書の方法は、例えば、核酸結合タンパク質に結合した核酸の免疫沈降によって、またはメチル化核酸の免疫沈降によって、少なくとも１つの核酸結合タンパク質と複合体化された核酸分子を含む安定化された生体試料を得る工程と、核酸分子を複数のセグメントに切断するために、安定化された生体試料を小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）と接触させる工程と、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程とを含むことができる。

本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法のいくつかの態様では、安定化された生体試料は無傷細胞および／または無傷の核を含むことができる。場合によっては、安定化された生体試料は安定化された無傷細胞を含むことができる。代替的に、または、組み合わせで、安定化された生体試料は安定化された無傷の核を含むことができる。場合によっては、安定化された無傷細胞または無傷の核試料をＤＮａｓｅに接触させる工程は、無傷細胞または無傷の核の溶解の前に行われ得る。場合によっては、細胞および／または核は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる前に溶解され得る。

他の態様では、本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣの改善された方法を含む方法は、複数の選択されたセグメントを得るために、複数のセグメントをサイズ選択に供する工程を含むことができる。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１４５～約６００ｂｐであり得る。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約２５００ｂｐであり得る。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約１００～約６００ｂｐであり得る。場合によっては、複数の選択されたセグメントは約６００～約２５００ｂｐであり得る。場合によっては、複数の選択されたセグメントは、約１００ｂｐ～約６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１４００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１７００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１８００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１９００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２３００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２４００ｂｐ、または約１００ｂｐ～約２５００ｂｐであり得る。

本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣの改善された方法を含む方法の別の態様では、方法は、サイズ選択工程の前に、複数のセグメントから配列決定ライブラリーを調製する工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、サイズ選択ライブラリーを得るために、配列決定ライブラリーをサイズ選択に供する工程をさらに含み得る。場合によっては、サイズ選択されたライブラリーは、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐのサイズであり得る。場合によっては、サイズ選択ライブラリーは、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐのサイズ、例えば、約１００ｂｐ～約３５０ｂｐ、約３５０ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２０００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約３５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約２５００ｂｐ、または約２０００ｂｐ～約２５００ｂｐであり得る。

本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法において利用されるサイズ選択は、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、サイズ選択ビーズ、ゲル濾過カラム、それらの組み合わせ、または任意の他の適切な方法を用いて行うことができる。

別の態様において、本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法は、ＱＣ値を得るために複数の選択されたセグメントをさらに分析する工程を含み得る。場合によっては、ＱＣ値は、クロマチン消化効率（ＣＤＥ）およびクロマチン消化指数（ＧＤＩ）から選択され得る。ＣＤＥは、所望の長さを有するセグメントの割合として計算することができる。例えば、場合によっては、ＣＤＥは、サイズ選択前の１００～２５００ｂｐのサイズのセグメントの割合として計算することができる。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも６５％であるときに、さらなる分析のために選択される。場合によっては、試料は、ＣＤＥ値が少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である場合に、さらなる分析のために選択され得る。

他の態様では、本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法は、少数の細胞または少量の核酸を含有する少量の試料において行うことができる。場合によっては、安定化された生体試料は３，０００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は２，０００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は１，０００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は５００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は４００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は３００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は２００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は１００，０００個未満の細胞を含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は５０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は４０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は３０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は２０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１０，０００個未満の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は約１０，０００個の細胞を含む。場合によっては、安定化された生体試料は１０μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は９μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は８μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は７μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は６μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は５μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は４μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は３μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は２μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は１μｇ未満のＤＮＡを含み得る。場合によっては、安定化された生体試料は０．５μｇ未満のＤＮＡを含み得る。

他の態様では、本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法は、個々の細胞または単一の細胞に対して行ってもよい。例えば、本明細書の方法は、個々のパーティションに分配された細胞に対して行うことができる。例示的なパーティションとしては、限定されないが、ウェル、エマルジョン中の液滴、または本明細書の他の箇所に記載されるような差次的に配列決定されたリンカー分子の別個のパッチを含む表面位置（例えば、アレイスポット、ビーズなど）が挙げられる。追加のパーティションも企図され、本明細書に開示される方法、組成物、およびシステムと一貫している。

さらなる態様では、本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法は、ＤＮＡの断片を作製するためにＤＮａｓｅなどのヌクレアーゼで処理することができる。場合によっては、ＤＮａｓｅは非配列特異的であり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの両方に対して活性であり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡに特異的であり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡを優先的に切断し得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡに特異的であり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは一本鎖ＤＮＡを優先的に切断し得る。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩであり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅＩＩであり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩおよびＤＮａｓｅＩＩの１つ以上から選択され得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは小球菌ヌクレアーゼであり得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、および小球菌ヌクレアーゼのうちの１つ以上から選択され得る。場合によっては、ＤＮａｓｅは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合または融合され得る。他の適切なヌクレアーゼも本開示の範囲内である。

さらなる態様では、本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法は、クロスリンキング剤で処理され得る。場合によっては、クロスリンキング剤は化学的固定剤であり得る。場合によっては、化学的固定剤は、約２．３～２．７オングストローム（Å）のスペーサーアーム長を有するホルムアルデヒドを含んでいる。場合によっては、化学的固定剤は、長いスペーサーアーム長を有するクロスリンキング剤を含み、例えば、クロスリンキング剤は、少なくとも約３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１３Å、１４Å、１５Å、１６Å、１７Å、１８Å、１９Å、または２０Åのスペーサー長を有することができる。化学的固定剤は、約１６．１Åの長さを有するスペーサーアームを有するエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）を含むことができる。化学的固定剤は、約７．７Åの長さのスペーサーアームを有するジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）を含むことができる。場合によっては、化学的固定剤は、ホルムアルデヒドおよびＥＧＳ、ホルムアルデヒドおよびＤＳＧ、またはホルムアルデヒド、ＥＧＳ、および、ＤＳＧを含む。複数の化学的固定剤が使用される場合によっては、各化学的固定剤は連続して使用される。他の場合には、複数の化学的固定剤のいくつかまたはすべてが、同時に試料に適用される。長いスペーサーアームを有するクロスリンカーの使用は、大きな（例えば、＞１ｋｂ）リード対分離距離を有するリード対の割合を増加させることができる。例えば、図７は、得られたライブラリー（消化されたＤＮａｓｅおよびＭＮａｓｅの両方）をホルムアルデヒド単独でクロスリンクしたものと、ホルムアルデヒドとＤＳＧまたはＥＧＳでクロスリンクしたものとの比較を示す。ＤＳＧは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＤＳＧは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＤＳＧは、いくつかの用途においてジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）と比較して、クロスリンキング効率を高めることができる。ＥＧＳは、両方の末端にＮＨＳエステル反応基を有し、アミノ基（例えば、一級アミン）に対して反応性であり得る。ＥＧＳは膜透過性であり、細胞内クロスリンキングを可能にする。ＥＧＳクロスリンクは、例えば、ｐＨ８．５で３～６時間ヒドロキシルアミンで処理することによって脱クロスリンクすることができる。例えば、ラクトースデヒドロゲナーゼは、ＥＧＳとの可逆的クロスリンキング後にその活性の６０％を保持した。場合によっては、化学的固定剤はソラレンを含み得る。場合によっては、クロスリンキング剤は、紫外線、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンであり得る。場合によっては、クロスリンキング剤は挿入剤、抗生物質、または副溝結合剤を含む。場合によっては、安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料であり得る。

さらなる態様では、本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程を含み得る。場合によっては、結合させる工程は、ビオチンタグ付きヌクレオチドを使用して粘着末端をｆｉｌｌ－ｉｎすること、および平滑末端をライゲーションすることを含むことができる。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを架橋オリゴヌクレオチドに接触させることを含むことができる。場合によっては、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントをバーコードに接触させることを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長～約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、約１５～約１８ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書の架橋オリゴヌクレオチドは、バーコードを含み得る。

さらなる態様では、本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法は、せん断工程を含まない。

本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくともいくつかの配列を得る工程を含み得る。例えば、方法は、第１のリード対を生成するために、接合部の各側で少なくとも約５０ｂｐ、少なくとも約１００ｂｐ、少なくとも約１５０ｂｐ、少なくとも約２００ｂｐ、少なくとも約２５０ｂｐ、または少なくとも約３００ｂｐの配列を得る工程を含み得る。

本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、ゲノムに対する順序および／または配向を表すコンティグのセットを通る経路を決定する工程とを含み得る。

本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、安定化された生体試料中の構造バリアントの存在またはヘテロ接合性の喪失を決定する工程とを含み得る。

本明細書の全細胞または全核の消化を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセット中のバリアントをフェーズに割り当てる工程とを含み得る。

本明細書のＨｉＣｈＩＰ、ＨｉＣｈＩＲＰ、およびメチルＨｉＣのための改善された方法を含む方法のさらなる態様では、方法は、第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、コンティグのセットから、コンティグのセットにおけるバリアントの存在を決定する工程と、（１）安定化された生体試料についての疾患段階、予後、または処置の経過を同定すること、（２）バリアントの存在に基づいて薬物を選択すること、または、（３）安定化された生体試料についての薬物効力を同定することの１つ以上から選択される工程を実施する工程とを含み得る。

ロングレンジのリード対の生成
本開示は、極めてロングレンジのリード対を生成し、そのデータを前述の追跡のすべての進歩のために利用するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、約３億リード対のみを有する高度に連続した正確なヒトゲノムアセンブリを生成する方法を提供する。他の実施形態では、本開示は、９９％以上の精度でヒトゲノム中のヘテロ接合性バリアントの９０％以上をフェージングする方法を提供する。さらに、本開示によって生成されるリード対の範囲は、はるかに大きいゲノム距離に及ぶように拡張することができる。アセンブリは、極めてロングレンジのリード対ライブラリーに加えて、標準的なショットガンライブラリーから作製される。さらに他の実施形態において、本開示は、配列決定データのこれらのセットの両方を利用することができるソフトウェアを提供する。フェージングされたバリアントは、単一のロングレンジのリード対ライブラリーを用いて生成され、そこからのリードは、参照ゲノムにマッピングされ、その後、個体の２つの親染色体のうちの１つにバリアントを割り当てるために使用される。最後に、本開示は、例外的に長いロングリードを生成するように、公知の技術を使用してさらに大きなＤＮＡ断片を抽出することをもたらす。

これらの反復がアセンブリおよびアラインメントのプロセスを妨げるメカニズムはかなり簡単であり、最終的には曖昧さの結果である。大きな反復領域の場合、問題はスパンの１つであり得る。リードまたはリード対が反復領域に及ぶほど十分に長くない場合、反復要素に隣接する領域を信頼できる形で結合することができない場合がある。小さな反復要素の場合、問題は主に配置であり得る。ある領域がゲノムにおいて共通する２つの反復要素と隣接している場合、その正確な配置を決定することは、不可能ではないにしても、隣接する要素がそれらのクラスの他のすべてに類似しているため、困難になる。両方の場合において、同定、したがって、特定の反復配列の配置を困難になるのは、反復配列中に区別する情報が欠如しているからである。必要とされているのは、反復領域によって囲まれたまたは分離された固有のセグメント間の結合を実験的に確立する能力である。

本開示の方法は、これらの反復領域によってもたらされる実質的な障壁を克服することによってゲノムの分野を進歩させ、それによってゲノム分析の多くの領域における重要な進歩を可能にすることができる。以前の技術を用いてｄｅｎｏｖｏアセンブリを実施するためには、多くの小さな足場に断片化されたアセンブリを準備するか、または、大きな挿入ライブラリーを生成するための、もしくはより連続したアセンブリを生成するための他のアプローチを使用するために、かなりの時間および資源を必要とするかのいずれかでなければならない。そのようなアプローチは、非常に深いシーケンシングカバレッジの獲得、ＢＡＣまたはホスミドライブラリーの構築、光学マッピング、または、これらおよび／もしくは他の技術のいくつかの組み合わせを含み得る。資源および時間の厳しい要件のせいで、そのようなアプローチが大部分の小規模研究室に浸透せず、非モデル生物の研究が妨げられている。本明細書に記載される方法は、非常にロングレンジのリード対を生成することができるため、デノボアセンブリは、単一の配列決定の実行で達成することができる。これにより、組立コストが桁違いに削減され、必要とされる時間が数ヶ月または数年から数週間にまで短縮されることになる。場合によっては、本明細書に開示される方法は、１４日未満、１３日未満、１２日未満、１１日未満、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、または前述の指定された期間のいずれか２つの間の範囲内で、複数のリード対を生成することを可能にする。例えば、方法は、約１０日～１４日で複数のリード対を生成することを可能にすることができる。生物の大部分のニッチについてさえゲノムを構築することは日常的となり、系統発生分析は比較の欠如に悩まされることなく、Ｇｅｎｏｍｅ１０ｋなどのプロジェクトを実現することができる。

同様に、医療目的のための構造分析およびフェージング分析にも課題が残っている。癌、同じ種類の癌を持つ個体、または同じ腫瘍の中でさえ、驚くべき異種性が存在する。結果として生じる効果から原因となるものを引き出すことは、試料あたりの低いコストで非常に高い精度およびスループットを必要とする。オーダーメード医療の領域では、ゲノムケアの絶対的基準のうち１つは、大小の構造再編成および新規な突然変異を含む、徹底的に特徴付けられかつフェージングされたすべてのバリアントを持つ、配列決定されたゲノムである。以前の技術でこれを達成するためには、現在ではあまりに高価でありかつ慣例的な医療処置を要求する、デノボアセンブリに必要なものと同様の労力を必要とする。開示された方法は、低コストで完全で正確なゲノムを迅速に産生することができ、それによって、ヒト疾患の研究および処置において多くの高度に求められる能力をもたらすことができる。

本明細書に開示される方法をフェージングに適用することは、統計的アプローチの利便性を、家族分析の精度と組み合わせることができ、いずれかの方法を単独で使用するよりも大きな節約－費用、労力、および試料－をもたらす。以前の技術では禁止的である非常に望ましいフェージング分析である新規バリアントフェージング解析は、本明細書に開示される方法を使用して容易に実施することができる。このことは、ヒトの変種の大部分が稀であるため（５％未満のマイナー対立遺伝子頻度）、特に重要である。フェージング情報は、非連鎖遺伝子型と比較して、高度に結合したハプロタイプのネットワーク（単一染色体に割り当てられたバリアントの集合）から有意な利点を得る集団遺伝子研究にとって貴重である。ハプロタイプ情報は、集団のサイズ、移動、および亜集団間の交換の歴史的変化のより高解像度の研究を可能にし得、特定のバリアントを特定の親および祖父母に遡って追跡することを可能にする。これは、ひいては、疾患に関連するバリアントの遺伝的伝達、および単一の個体においてまとめられた場合のバリアント間の相互作用を明らかにする。本開示の方法は最終的には、極めてロングレンジのリード対（ＸＬＲＰ）ライブラリーの調製、配列決定、および分析を可能にすることができる。

本開示のいくつかの実施形態では、対象由来の組織またはＤＮＡ試料が提供され得、本方法は、組み立てられたゲノム、コールされたバリアント（大きな構造バリアントを含む）とのアラインメント、フェージングされたバリアントコール、または任意の追加の解析を返すことができる。他の実施形態において、本明細書に開示される方法は、個体のためのＸＬＲＰライブラリーを直接提供することができる。

極めてロングレンジのリード対
本開示の様々な実施形態において、本明細書に開示される方法は、長い距離分離された極めてロングレンジのリード対を生成することができる。この距離の上限は、大きなサイズのＤＮＡ試料を集める能力により改善され得る。場合によっては、リード対は、最大で５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００ｋｂｐ、またはそれ以上のゲノム距離におよぶ。いくつかの例において、リード対は、最大５００ｋｂｐのゲノム距離におよぶことができる。他の例において、リード対は、最大２０００ｋｂｐのゲノム距離におよぶことができる。本明細書に開示される方法は、分子生物学の標準技術に基づいて組み込みかつ構築することができ、さらに効率、特異性、およびゲノムカバレッジの増大に十分に適している。場合によっては、リード対は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、６０、または９０日未満で生成することができる。いくつかの例では、リード対は約１４日未満で生成することができる。さらなる例では、リード対は約１０日未満で生成することができる。場合によっては、本開示の方法は、複数のコンティグの正確な順序付けおよび／または配向において、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％の精度で、リード対の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％超を提供することができる。例えば、方法は、複数のコンティグの正確な順序付けおよび／または配向において約９０～１００％の精度を提供することができる。

他の実施形態において、本明細書に開示される方法は、現在利用される配列決定技術と共に使用することができる。例えば、この方法は、十分に試験されおよび／または広く配備された配列決定機器と組み合わせて使用することができる。さらなる実施形態において、本明細書に開示される方法は、現在利用される配列決定技術に由来する技術と手法と共に使用することができる。

本開示の方法は、多種多様な生物のためのデノボゲノムアセンブリを劇的に単純化することができる。以前の技術を使用して、そのようなアセンブリは、現在、経済的なメイトペアライブラリーの短い挿入物によって制限されている。フォスミドでアクセス可能な最大４０～５０ｋｂｐのゲノム距離でリード対を生成することが可能であり得るが、これらは高価であり、扱いにくく、－ヒトでは－３００ｋｂｐ～５Ｍｂｐのサイズの範囲であり得るセントロメア内のものを含む最も長い反復ストレッチに及ぶには短すぎる。場合によっては、本明細書に開示される方法は、長い距離（例えば、メガベース以上）に及ぶことが可能なリード対を提供し、それによって、これらの足場完全性の課題を克服することができる。したがって、染色体レベルのアセンブリの産生は、本開示の方法を利用することによって日常的になり得る。アセンブリのためのより労力を要する手段－現在、研究研究室では信じられない量の時間および金銭がかかっており、広範なゲノムカタログを妨げている－は不要になり可能性があり、より有意義な分析のために資源が解放される。同様に、ロングレンジフェージング情報の獲得は、集団のゲノム研究、系統発生研究、および疾患研究にさらなる膨大な力を提供することができる。本明細書に開示される方法は、多数の個体についての正確なフェージングを可能にし、したがって、集団および深い時間レベルでゲノムをプローブする我々の能力の幅および深さを拡張する。

個別化医療の分野では、本明細書に開示される方法から生成されるＸＬＲＰリード対は、正確で、低コストで、フェージングされた、迅速に産生される個人ゲノムへの有意義な進歩を表している。現在の方法は、長距離でバリアントをフェージングする能力が不十分であり、それによって、化合物ヘテロ接合遺伝子型の表現型の影響の特徴付けを妨げる。さらに、ゲノム疾患に実質的な関心対象の構造バリアントは、それらを研究するために使用されるリードおよびリード対挿入物と比較してサイズが大きいため、現在の技術を用いて正確に同定および特徴付けすることが困難である。数十キロベース～メガベース以上にわたるリード対は、この困難さを軽減するのに役立つことができ、それによって、構造多型の高度に並列かつ個別化された分析を可能にする。

基本的な進化研究および生物医学研究は、ハイスループット配列決定における技術的進歩によって推進されている。全ゲノム配列決定およびアセンブリは、大きなゲノム配列決定センターの出所となるように使用されるが、市販のシーケンサーは、現在、ほとんどの研究大学がこれらの機械の１つまたは複数を有するほど安価である。現在、大量のＤＮＡ配列データを生成することは比較的安価である。しかしながら、現在の技術を用いて高品質で高度に連続したゲノム配列を産生することは、理論上および実際には依然として困難である。さらに、ヒトを含む、分析を目指すであろうほとんどの生物は二倍体であるため、各個体はゲノムの２つの半数体コピーを有する。ヘテロ接合性の部位（例えば、母親によって与えられる対立遺伝子が父親によって与えられる対立遺伝子と異なる場合）では、どの対立遺伝子のセットがどの親から来たかを知ることは困難である（ハプロタイプフェージングとして知られる）。この情報は、疾患および形質の関連研究などのいくつかの進化的研究および生物医学的研究を実施するために使用することができる。

様々な実施形態では、本開示は、ＤＮＡ調製のための技術と、所定のゲノム内の短い、中程度の、および長い結合のハイスループット発見のためのペアエンド配列決定とを組み合わせる、ゲノムアセンブリのための方法を提供する。本開示はさらに、ゲノムアセンブリを補助するために、ハプロタイプフェージングのために、および／またはメタゲノム研究のために、これらの結合を使用する方法を提供する。本明細書に提示される方法は、対象のゲノムのアセンブリを決定するために使用することができるが、本明細書に提示される方法は、染色体などの対象のゲノムの部分のアセンブリ、または様々な長さの対象のクロマチンのアセンブリを決定するために使用することができることも理解されたい。

いくつかの実施形態において、本開示は、対象から得られた標的ＤＮＡの配列決定断片から複数のコンティグを生成する工程を含む、本明細書に開示される１つ以上の方法を提供する。標的ＤＮＡの長いストレッチは、１つ以上のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、小球菌ヌクレアーゼなど）でＤＮＡを切断することによって断片化することができる。複数の配列決定リードを得るために、得られた断片を、ハイスループット配列決定方法を用いて配列決定することができる。本開示の方法とともに使用され得るハイスループット配列決定方法の例としては、限定されないが、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによって開発された４５４パイロシークエンシング方法、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって開発された「クラスター」配列決定方法、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって開発されたＳＯＬｉＤａｎｄＩｏｎｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ配列決定方法、ならびにＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅｎｏｍｉｃｓによって開発されたＤＮＡナノボール配列決定法が挙げられる。次いで、異なる配列決定リードの重複末端をアセンブルしてコンティグを形成することができる。代替的に、断片化された標的ＤＮＡをベクターにクローニングすることができる。次いで、細胞または生物にＤＮＡベクターをトランスフェクトしてライブラリーを形成する。トランスフェクトした細胞または生物を複製した後、ベクターを単離し、配列決定して、複数の配列決定リードを生成する。その後、異なる配列決定リードの重複末端をアセンブルしてコンティグを形成することができる。

特にハイスループット配列決定技術によるゲノムアセンブリは、問題となり得る。多くの場合、アセンブリは、数千個または数万個の短いコンティグからなる。これらのコンティグの順序および配向は一般に不明であり、ゲノムアセンブリの有用性を制限している。これらの足場を順序付け、配向するための技術が存在するが、それらは概して、高価で、多くの人手を要し、しばしば、非常にロングレンジの相互作用を発見することに失敗する。

コンティグを生成するために使用される標的ＤＮＡを含む試料は、体液（例えば、血液、尿、血清、リンパ液、唾液、口腔スワブ、肛門および膣の分泌物、汗、および精液など）を採取する、組織を採取すること、または細胞／生物を収集することを含む、任意の数の手段によって対象から得ることができる。得られた試料は、単一のタイプの細胞／生物から構成されてもよく、または複数のタイプの細胞／生物から構成されてもよい。ＤＮＡは、対象の試料から抽出および調製することができる。例えば、試料は、公知の溶解緩衝液、超音波処理技術、エレクトロポレーションなどを使用して、ポリヌクレオチドを含む細胞を溶解するように処理され得る。アルコール抽出、セシウム勾配、および／またはカラムクロマトグラフィーを使用することによって、標的ＤＮＡをさらに精製して、タンパク質などの汚染物質を除去することができる。

本開示の他の実施形態では、非常に高分子量のＤＮＡを抽出する方法が提供される。場合によっては、ＸＬＲＰライブラリーからのデータは、入力ＤＮＡの断片サイズを増加させることによって改善され得る。いくつかの例では、細胞からのＤＮＡのメガベースサイズの断片の抽出は、ゲノム中のメガベースによって分離されたリード対を生成することができる。場合によっては、生成されたリード対は、約１０ｋＢ、約５０ｋＢ、約１００ｋＢ、約２００ｋＢ、約５００ｋＢ、約１Ｍｂ、約２Ｍｂ、約５Ｍｂ、約１０Ｍｂ、または約１００Ｍｂを超えるスパンにわたる配列情報を提供することができる。いくつかの例において、リード対は、約５００ｋＢを超えるスパンにわたる配列情報を提供することができる。さらなる例において、リード対は、約２Ｍｂを超えるスパンにわたる配列情報を提供することができる。場合によっては、非常に高分子量のＤＮＡは、非常に穏やかな細胞溶解（Ｔｅａｇｕｅ，Ｂ．ｅｔａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０７（２４），１０８４８－５３）およびアガロースプラグ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄ．Ｃ．，＆Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．（１９８４）Ｃｅｌｌ，３７（１），６７－７５）によって抽出することができる。他の場合では、長さが最大メガベースのＤＮＡ分子を精製することができる市販の機械を使用して、非常に高分子量のＤＮＡを抽出することができる。

染色体の物理的レイアウトのプロービング
様々な実施形態では、本開示は、生細胞内の染色体の物理的なレイアウトをプローブする工程を含む、本明細書に開示される１つ以上の方法を提供する。配列決定を通じて染色体の物理的なレイアウトを調査する技術の例は、染色体立体配座キャプチャ（「３Ｃ」）、環状染色体立体配座キャプチャ（「４Ｃ」）、カーボンコピー染色体キャプチャ（「５Ｃ」）、およびＨｉ－Ｃベースの方法などの技術の「Ｃ」ファミリー、ならびに、ＣｈＩＰ－ループ、ＣｈＩＰ－ＰＥＴ、およびＨｉＣｈＩＰなどのＣｈＩＰベースの方法を含む。これらの技術は、核の中の空間的関係を固めるために生細胞のクロマチンの固定化を利用する。生成物のその後のプロセシングおよび配列決定により、研究者は、ゲノム領域間での近接の関連性のマトリクスを回復することが可能になる。さらなる分析により、これらの関連性を使用して、染色体が生きている核に物理的に配置されるときの染色体の三次元幾何学的マップを生成することができる。このような技術は、生細胞における染色体の離散的な空間的組織化を説明し、染色体遺伝子座間の機能的相互作用の正確な見解を提供する。これらの機能的研究に支障をきたした１つの問題は、非特異的相互作用の存在、染色体の近接性以上のものに起因しないデータに存在する関連性であった。本開示では、これらの非特異的な染色体内相互作用は、アセンブリのための貴重な情報を提供するために、本明細書に提示される方法によって捕捉される。

いくつかの実施形態において、染色体内相互作用は染色体の結合性と関連づけられる。場合によっては、染色体内データがゲノムアセンブリを補助することができる。場合によっては、クロマチンはインビトロで再構成される。このことは有利であり得る。なぜなら、クロマチン、具体的には、クロマチンの主要タンパク質成分であるヒストンが、配列決定を通じてクロマチンの立体配座および構造を検出するための技術の最も一般的な「Ｃ」ファミリー：３Ｃ、４Ｃ、５Ｃ、およびＨｉ－Ｃの下での固定化に重要であるからである。クロマチンは、配列に関して非常に非特異的であり、通常はゲノムにわたって均一にアセンブルする。場合によっては、クロマチンを使用しない種のゲノムは、再構成されたクロマチン上でアセンブルすることができ、それによって、本開示のホライゾンを生命のすべてのドメインに拡張する。

クロマチン立体構造捕捉技術を要約する。手短に言えば、物理的に近接しているゲノム領域間にクロスリンクが形成される。クロマチン内のＤＮＡ分子、例えば、ゲノムＤＮＡへのタンパク質（ヒストンなど）のクロスリンキングは、本明細書の他の箇所でさらに詳細に記載されるか、またはそうでなければ公知である適切な方法に従って達成することができる。場合によっては、２つ以上のヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチド配列に結合したタンパク質を介してクロスリンクされ得る。１つのアプローチは、クロマチンを紫外線照射に曝露することである（Ｇｉｌｍｏｕｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：４２７５－４２７９，１９８４）。ポリヌクレオチドセグメントのクロスリンキングは、化学的または物理的（例えば、光学的）なクロスリンキングなどの他のアプローチを利用しても実施され得る。適切な化学的クロスリンキング剤としては、限定されないが、ホルムアルデヒドおよびソラレン（Ｓｏｌｏｍｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：６４７０－６４７４，１９８５；Ｓｏｌｏｍｏｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ５３：９３７－９４７，１９８８）が挙げられる。例えば、クロスリンキングは、ＤＮＡ分子およびクロマチンタンパク質を含む混合物に２％ホルムアルデヒドを添加することによって行うことができる。ＤＮＡをクロスリンクするために使用することができる薬剤の他の例としては、限定されないが、ＵＶ光、マイトマイシンＣ、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、１，３－ブタジエンジエポキシド、シスジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）、およびシクロホスファミドが挙げられる。適切には、クロスリンキング剤は、比較的短い距離（例えば、約２Å）をクロスリンクするクロスリンキングを形成し、それによって、脱クロスリンクされ得る密接な相互作用を選択する。

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ分子は、クロスリンキングの前または後に免疫沈降され得る。場合によっては、ＤＮＡ分子は断片化することができる。断片は、アセチル化ヒストン、例えば、Ｈ３を特異的に認識し、それに結合する抗体などの結合パートナーと接触させることができる。このような抗体の例としては、限定されないが、ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ，ＮＹから入手可能な抗アセチル化ヒストンＨ３が挙げられる。免疫沈降物からのポリヌクレオチドは、その後、免疫沈降物から収集され得る。クロマチンを断片化する前に、アセチル化ヒストンを隣接するポリヌクレオチド配列にクロスリンクすることができる。その後、混合物を処理して、混合物中のポリヌクレオチドを分画する。本明細書における分画技術は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素の使用を含む。本明細書の方法に適切なＤＮａｓｅには、限定されないが、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、および小球菌ヌクレアーゼが挙げられる。得られた断片はサイズが異なり得る。得られた断片はさらに、５’末端または３’末端に一本鎖オーバーハンドを含み得る。

いくつかの実施形態では、約１４５ｂｐ～約６００ｂｐの断片を得ることができる。代替的に、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約６００ｂｐ、または約６００～約２５００の断片を得ることができる。試料は、クロスリンクされた結合配列セグメントの配列決定のために調製することができる。場合によっては、ポリヌクレオチドの単一の短いストレッチは、例えば、分子内でクロスリンクされた２つの配列セグメントをライゲーションすることによって作製され得る。配列情報は、本明細書の他の箇所でさらに詳細に記載される任意の適切な配列決定技術、またはハイスループット配列決定法などの他の適切な方法を使用して、試料から得ることができる。例えば、ライゲーション産物を、断片の各末端から配列情報を得るペアエンド配列決定に供することができる。配列セグメントの対は、ポリヌクレオチドに沿って２つの配列セグメントを分離する直線距離にわたるハプロタイピング情報を関連付けて、得られた配列情報において表すことができる。

Ｈｉ－Ｃによって生成されたデータの１つの特徴は、ほとんどのリード対が、ゲノムに戻してマッピングされる場合、直鎖状に近接していることが分かることである。すなわち、ほとんどのリード対は、ゲノム中で互いに近接していることが分かる。得られたデータセットにおいて、染色体内接触の確率は、染色体が別個の区域を占有する場合に予想されるように、平均して染色体間接触の確率よりもはるかに高い。さらに、相互作用の確率は直線距離と共に急速に減衰するが、同じ染色体上で＞２００Ｍｂだけ離れた遺伝子座でさえ、異なる染色体上の遺伝子座よりも相互作用する可能性が高い。ロングレンジの染色体内、および特に染色体間の接触の検出において、ショートレンジおよびミドルレンジの染色体内接触のこの「バックグラウンド」は、Ｈｉ－Ｃ分析を使用して取り除くべきバックグラウンドノイズである。

特に、真核生物におけるＨｉ－Ｃ実験は、種特異的および細胞型特異的なクロマチン相互作用に加えて、２つのカノニカル相互作用パターンを示している。１つのパターンである距離依存性減衰（ｄｉｓｔａｎｃｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｅｃａｙ）（ＤＤＤ）は、ゲノム距離に応じた相互作用頻度の減衰の一般的な傾向である。第２のパターンであるシス－トランス比（ＣＴＲ）は、数十メガベースの配列によって隔てられている場合でさえも、異なる染色体上の遺伝子座と比較して、有意に高い、同じ染色体上に位置する遺伝子座間の相互作用頻度である。これらのパターンは、近位の遺伝子座がランダムに相互作用するより高い確率を有する一般的なポリマー動力学、ならびに染色体領域の形成、ほとんど混合せずに核内で別個の体積を占有する傾向がある間期染色体の現象などの特定の核組織化特徴を反映し得る。これらの２つのパターンの正確な詳細は、種、細胞型、および細胞条件の間で異なり得るが、それらは遍在し、顕著である。これらのパターンは非常に強く、一貫性があるため、実験の質を評価するために使用され、通常、詳細な相互作用を明らかにするためにデータから正規化される。しかしながら、本明細書に開示される方法では、ゲノムアセンブリは、ゲノムの三次元構造を利用することができる。カノニカルＨｉ－Ｃ相互作用パターンを、特異的なループ相互作用、すなわち、それらの遍在性、強度、および一貫性の分析のための障害にする特徴は、コンティグのゲノム位置を推定するための強力なツールとして使用することができる。

特定の実施において、染色体内リード対間の物理的距離の調査は、ゲノムアセンブリに関するデータのいくつかの有用な特徴を示す。第１に、より短い距離の相互作用は、より長い距離の相互作用よりも一般的である。すなわち、リード対の各リードは、遠く離れた領域よりも実際のゲノムにおいて近い領域と結合する可能性が高い。第２に、中間距離およびロングレンジの相互作用の長いテールがある。すなわち、リード対は、キロベース（ｋＢ）またはさらにはメガベース（Ｍｂ）の距離で染色体内配置に関する情報を保持する。例えば、リード対は、約１０ｋＢ、約５０ｋＢ、約１００ｋＢ、約２００ｋＢ、約５００ｋＢ、約１Ｍｂ、約２Ｍｂ、約５Ｍｂ、約１０Ｍｂ、または約１００Ｍｂを超えるスパンにわたる配列情報を提供することができる。データのこれらの特徴は単に、同じ染色体上の近くにあるゲノムの領域が物理的により近接している可能性が高いことを示し、これは、それらがＤＮＡ骨格を介して互いに化学的に結合されるため、予想される結果である。Ｈｉ－Ｃによって生成されたものなどのゲノムワイドクロマチン相互作用データセットは、染色体全体に沿った配列のグループ化および線形組織化に関するロングレンジ情報を提供すると推測された。

Ｈｉ－Ｃの実験方法は簡単で比較的低コストであるが、ゲノムアセンブリおよびハプロタイピングのための現在のプロトコルは、特に特定のヒト患者試料からの３～５００万個の細胞、つまり、得ることが実現可能でないかもしれないかなり大量の材料を必要とする。対照的に、本明細書に開示される方法は、有意に少ない細胞由来の材料を用いて、遺伝子型アセンブリ、ハプロタイプフェージング、およびメタゲノミクスについての正確かつ予測的な結果を可能にする方法を含む。例えば、約０．１μｇ、約０．２μｇ、約０．３μｇ、約０．４μｇ、約０．５μｇ、約０．６μｇ、約０．７μｇ、約０．８μｇ、約０．９μｇ、約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．５μｇ、約３．０μｇ、約３．５μｇ、約４．０μｇ、約４．５μｇ、約５．０μｇ、約６．０μｇ、約７．０μｇ、約８．０μｇ、約９．０μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約１５０μｇ、約２００μｇ、約３００μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約７００μｇ、約８００μｇ、約９００μｇ、約１０００μｇ、約１２００μｇ、約１４００μｇ、約１６００μｇ、約１８００μｇ、約２０００μｇ、約２２００μｇ、約２４００μｇ、約２６００μｇ、約２８００μｇ、約３０００μｇ、約３２００μｇ、約３４００μｇ、約３６００μｇ、約３８００μｇ、約４０００μｇ、約４２００μｇ、約４４００μｇ、約４６００μｇ、約４８００μｇ、約５０００μｇ、約５２００μｇ、約５４００μｇ、約５６００μｇ、約５８００μｇ、約６０００μｇ、約６２００μｇ、約６４００μｇ、約６６００μｇ、約６８００μｇ、約７０００μｇ、約７２００μｇ、約７４００μｇ、約７６００μｇ、約７８００μｇ、約８０００μｇ、約８２００μｇ、約８４００μｇ、約８６００μｇ、約８８００μｇ、約９０００μｇ、約９２００μｇ、約９４００μｇ、約９６００μｇ、約９８００μｇ、または約１０，０００μｇ未満のＤＮＡが、本明細書に開示される方法と共に使用することができる。いくつかの例において、本明細書に開示される方法の中で使用されるＤＮＡは、約３，０００，０００、約２，５００，０００、約２，０００，０００、約１，５００，０００、約１，０００，０００、約５００，０００、約１００，０００、約５０，０００、約１０，０００、約５，０００、約１，０００、約５００、または約１００未満の細胞から抽出することができる。

普遍的に、Ｈｉ－Ｃベースの技術などの染色体の物理的なレイアウトをプローブするための手順は、培養細胞または初代組織から単離されたクロマチンなどの、細胞／生物内に形成されるクロマチンを利用する。本開示は、細胞／生物から単離されたクロマチンだけでなく、再構成クロマチンを用いたそのような技術の使用を提供する。再構成クロマチンは、様々な特徴にわたって細胞／生物内に形成されたクロマチンとは区別される。第１に、多くの試料について、ネイキッドＤＮＡ試料の収集は、体液を集めること、頬または直腸の領域を拭き取ること、上皮試料を得ることなど、様々な非侵襲的な方法から侵襲的な方法までを使用することによって、達成することができる。第２に、クロマチンの再構成は、ゲノムアセンブリおよびハプロタイプフェージングのためのアーチファクトを生成する染色体間のおよび他のロングレンジの相互作用の形成を実質的に妨げる。場合によっては、試料は、約２０、１５、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１％未満、またはそれ以下の、本開示の方法および組成物にかかる染色体間または分子間のクロスリンキングを有してもよい。いくつかの例において、試料は、約５％未満の染色体間または分子間のクロスリンキングを有してもよい。いくつかの例において、試料は、約３％未満の染色体間または分子間のクロスリンキングを有してもよい。さらなる例において、試料は、約１％未満の染色体間または分子間のクロスリンキングを有してもよい。第３に、クロスリンキングが可能な部位の頻度、したがって、ポリヌクレオチド内の分子内クロスリンキングの頻度は、調整することができる。例えば、ＤＮＡ対ヒストンの比は変動する場合があり、そうすることでヌクレオソーム密度を望ましい値に調整することができる。場合によっては、ヌクレオソーム密度は、生理的レベルより下に減らされる。したがって、クロスリンクの分布は、よりロングレンジの相互作用を支持するように変更させることができる。いくつかの実施形態において、クロスリンク密度が変動するサブ試料は、ショートレンジおよびロングレンジの両方の会合をカバーするように調製され得る。例えば、クロスリンキング条件は、クロスリンクの少なくとも約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％が、試料ＤＮＡ分子上で少なくとも約５０ｋｂ、約６０ｋｂ、約７０ｋｂ、約８０ｋｂ、約９０ｋｂ、約１００ｋｂ、約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ、約１３０ｋｂ、約１４０ｋｂ、約１５０ｋｂ、約１６０ｋｂ、約１８０ｋｂ、約２００ｋｂ、約２５０ｋｂ、約３００ｋｂ、約３５０ｋｂ、約４００ｋｂ、約４５０ｋｂ、または約５００ｋｂ離れているＤＮＡセグメント間に生じるように、調整することができる。

接触マッピングおよびトポロジー
本開示の方法によって生成されたリード対を使用して、ゲノムならびにその中の染色体および核酸分子の三次元構造を分析することができる。本明細書で論じられるように、リード対中の各リードは、ゲノム中の異なる領域にマッピングされ得る。所定のリード対について、それらがマッピングするゲノム中の２つの異なる領域は、一緒にライゲーションすることができるように、互いに空間的に近接していると推測することができる。リード対における両方のリードの座標に従って試料からのリード対をプロットすることによって、試料についての接触マップを作成することができる。例示的な接触マップは図１３に見ることができ、接触マップ上の各点は、そのリード対のマッピングされた位置に従ってプロットされたリード対を表している。

試料全体にわたる接触の分析は、染色体およびゲノムの構造の分析を可能にすることができる。ゲノムの、ＡおよびＢコンパートメント、活性および不活性のコンパートメント、染色体コンパートメント、ユークロマチンおよびヘテロクロマチン、ＴＡＤサブタイプを含むトポロジー関連ドメイン（ＴＡＤ）、ならびに他の構造への組織化は、キロベースまたはメガベーススケールと同程度の規模で分析することができる。接触マップの分析は、再編成、転座、コピー数多型、逆位、欠失、および挿入などの構造的バリアントなどのゲノム特徴の検出を可能にすることができる。

本開示の方法は、約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、５０００ｂｐ、６０００ｂｐ、７０００ｂｐ、８０００ｂｐ、９０００ｂｐ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、または１００ｋｂ以下の解像度でタンパク質結合、構造的変化、またはゲノムの接触相互作用の位置を提供することができる。場合によっては、タンパク質結合部位、タンパク質フットプリント、接触相互作用、または他の特徴は、１０００ｂｐ以内、９００ｂｐ以内、８００ｂｐ以内、７００ｂｐ以内、６００ｂｐ以内、５００ｂｐ以内、４００ｂｐ以内、３００ｂｐ以内、２００ｂｐ以内、１９０ｂｐ以内、１８０ｂｐ以内、１７０ｂｐ以内、１６０ｂｐ以内、１５０ｂｐ以内、１４０ｂｐ以内、１３０ｂｐ以内、１２０ｂｐ以内、１１０ｂｐ以内、１００ｂｐ以内、９０ｂｐ以内、８０ｂｐ以内、７０ｂｐ以内、６０ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、４０ｂｐ以内、３０ｂｐ以内、２０ｂｐ以内、１０ｂｐ以内、９ｂｐ以内、８ｂｐ以内、７ｂｐ以内、６ｂｐ以内、５ｂｐ以内、４ｂｐ以内、３ｂｐ以内、２ｂｐ以内、または１ｂｐ以内にマッピングすることができる。一例において、本開示の方法は、ゲノム上で互いに１０，０００ｂｐ、５，０００ｂｐ、２，０００ｂｐ、または１，０００ｂｐ以内にある部位（例えば、ＣＴＣＦ部位などのタンパク質結合部位）の解像度を可能にすることができる。場合によっては、改善された解像度またはマッピングは、保護されていない核酸（例えば、結合タンパク質のフットプリント内にない核酸）を分解するＭＮａｓｅまたは他のエンドヌクレアーゼの使用によって達成され得、それによって、保護された領域（例えば、タンパク質フットプリント）の縁で生じる近接ライゲーション事象をもたらす。

コンティグマッピング
様々な実施形態において、本開示は、複数のリード対の複数のコンティグへのマッピングを可能にする様々な方法を提供する。リードをコンティグ配列にマッピングするためのいくつかの公的に入手可能なコンピュータプログラムがある。これらのリードマッピングプログラムデータはさらに、特定のリードマッピングがゲノム内でどのように固有であるかを記述するデータを提供する。固有にマッピングされるリードの集団から、コンティグ内で高い信頼度で、各リード対におけるリード間の距離の分布を推測することができる。リードが異なるコンティグに信頼できる形でマッピングされるリード対について、このマッピングデータは、問題の２つのコンティグ間の結合を意味する。これは、上述の分析から学習された距離の分布に比例する２つのコンティグ間の距離を意味する。したがって、そのリードが異なるコンティグにマッピングされる各リード対は、正しいアセンブリにおけるこれらの２つのコンティグ間の結合を意味する。すべてのそのようなマッピングされたリード対から推論される結合は、各コンティグが行および列の両方によって表される隣接行列に要約することができる。コンティグを結合するリード対は、対応する行および列において非ゼロ値としてマークされ、リード対におけるリードがマッピングされたコンティグを示す。リード対のほとんどはコンティグ内にマッピングされ、そこからリード対間の距離の分布を学習することができ、そこから異なるコンティグにマッピングされるリード対を使用してコンティグの隣接行列を構築することができる。

様々な実施形態において、本開示は、リード対データからのリードマッピングデータを使用してコンティグの隣接行列を構築する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、隣接行列は、ロングレンジの相互作用に対するショートレンジの相互作用の傾向を組み込むリード対に対する重み付けスキームを使用する。短い距離に及ぶリード対は概して、長い距離に及ぶリード対よりも一般的である。特定の距離の確率を記述する関数は、この分布を学習するために単一のコンティグにマッピングされるリード対データを使用して適合させることができる。したがって、異なるコンティグにマッピングするリード対の１つの重要な特徴は、それらがマッピングするコンティグ上の位置である。両方ともコンティグの一方の末端付近にマッピングするリード対の場合、これらのコンティグ間の推測される距離は短くなり得、したがって、結合したリード間の距離は小さい。リード対間のより短い距離は長い距離よりも一般的であるので、この構成は、これらの２つのコンティグが、コンティグの端から遠くにマッピングするリードよりも隣接しているというより強力な証拠を提供する。したがって、隣接行列における結合は、コンティグの端までのリードの距離によってさらに重み付けされる。さらなる実施形態では、隣接行列をさらに再スケールして、ゲノムの無差別領域を表すいくつかのコンティグ上の多数の接触点の重みを下げることができる。ゲノムのこれらの領域は、それらに対して高い割合のリードマッピングを有することによって同定可能であり、先験的に、アセンブリを誤認する可能性のある偽のリードマッピングを含む可能性が高い。またさらなる実施形態において、このスケーリングは、転写抑制因子ＣＴＣＦ、内分泌受容体、コヒーシン、または共有結合的に修飾されたヒストンなどの、クロマチンの足場相互作用を調節する１つ以上の薬剤についての１つ以上の保存された結合部位を探索することによって指向され得る。

いくつかの実施形態では、本開示は、ゲノムに対する順序および／または配向を表すコンティグを通る経路を決定するために、隣接行列を分析する工程を含む、本明細書に開示される１つ以上の方法を提供する。他の実施形態では、コンティグを通る経路は、各コンティグを正確に１回通過するように選択することができる。さらなる実施形態では、コンティグを通る経路は、隣接行列を通る経路が通過したエッジの重みの合計を最大化するように選択される。このようにして、正しいアセンブリのために最も可能性の高いコンティグ結合が提案される。またさらなる実施形態では、コンティグを通る経路は、各コンティグを正確に１回通過し、隣接行列のエッジの重み付けが最大化されるように選択することができる。

ハプロタイプフェージング
二倍体ゲノムでは、どの対立遺伝子バリアントが同じ染色体上に結合されているかを知ることがしばしば重要である。これはハプロタイプフェージングとして知られている。ハイスループット配列データからのショートリードは、どの対立遺伝子バリアントが結合されているかを直接観察することを可能にすることはめったにない。ハプロタイプフェージングのコンピュータによる推論は、本開示は、リード対上の対立遺伝子バリアントを使用して、どの対立遺伝子バリアントが結合されているかを決定することを可能にする１つ以上の方法を提供する。場合によっては、本開示の方法によるフェージングは、補完なしで行われる。

様々な実施形態において、本開示の方法および組成物は、複数の対立遺伝子バリアントに関して、二倍体または多倍体のゲノムのハプロタイプフェージングを可能にする。したがって、本明細書に記載される方法は、リード対からのバリアント情報および／またはそれを使用するアセンブルされたコンティグに基づいて、結合された対立遺伝子バリアントの決定を提供することができる。対立遺伝子バリアントの例としては、限定されないが、１０００ゲノム、ＵＫ１０Ｋ、ＨａｐＭａｐ、およびヒト間の遺伝的変異を発見するための他のプロジェクトから知られているものが挙げられる。場合によっては、例えば、シャルコー・マリー・トゥース神経障害（ＬｕｐｓｋｉＪＲ，ＲｅｉｄＪＧ，Ｇｏｎｚａｇａ－ＪａｕｒｅｇｕｉＣ，ｅｔａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６２：１１８１－９１，２０１０）を引き起こすＳＨ３ＴＣ２の両方のコピーにおける非連鎖の不活性化突然変異、および高コレステロール血症９（ＲｉｏｓＪ，ＳｔｅｉｎＥ，ＳｈｅｎｄｕｒｅＪ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４３１３－１８，２０１０）を引き起こすＡＢＣＧ５の両方のコピーにおける非連鎖の不活性化突然変異の発見によって実証されるように、ハプロタイプフェージングデータを有することによって、特定の遺伝子への疾患の関連がより容易に明らかにされ得る。

ヒトは、１，０００において平均１部位でヘテロ接合性である。場合によっては、ハイスループット配列決定法を使用するデータの単一レーンは、少なくとも約１５０，０００，０００個のリード対を生成することができる。リード対は約１００塩基対長であり得る。これらのパラメーターから、ヒト試料からの全リードの１０分の１が、ヘテロ接合部位をカバーすると推定される。したがって、ヒト試料由来の全リード対の平均１００分の１は、ヘテロ接合部位の対をカバーすると推定される。したがって、約１，５００，０００リード対（１５０，０００，０００の百分の１）は、単一レーンを使用してフェージングデータを提供する。ヒトゲノム中の約３０億塩基、および１０００中の１つがヘテロ接合性である場合、平均ヒトゲノム中に約３００万のヘテロ接合性部位が存在する。ヘテロ接合性部位の対を表す約１，５００，０００個のリード対では、ハイスループット配列法の単一レーンを使用してフェージングされる各ヘテロ接合性部位の平均カバレッジは、典型的なハイスループット配列決定機を使用して、約（１倍（１Ｘ））である。したがって、二倍体ヒトゲノムは、本明細書に開示される方法を使用して調製される試料由来の配列バリアントに関連するハイスループット配列データの１つのレーンと、確実かつ完全にフェージングすることができる。いくつかの例では、データのレーンは、ＤＮＡ配列リードデータのセットであり得る。さらなる例において、データのレーンは、ハイスループット配列決定機の１回のランからのＤＮＡ配列リードデータのセットであり得る。

ヒトゲノムは染色体の２つの相同セットからなるため、個体の真の遺伝子構成を理解することは、遺伝物質の母体および父体のコピーまたはハプロタイプの描写を必要とする。個体においてハプロタイプを得ることは、いくつかの方法で有用である。第１に、ハプロタイプは、臓器移植におけるドナー－宿主適合の結果の予測において臨床的に有用であり、疾患関連性を検出するための手段としてますます使用されている。第２に、複合ヘテロ接合性を示す遺伝子において、ハプロタイプは、２つの有害なバリアントが同じ対立遺伝子上に位置するかどうかに関する情報を提供し、これらのバリアントの遺伝が有害であるかどうかの予測に大きく影響する。第３に、個体群からのハプロタイプは、人種の集団構造および進化歴に関する情報を提供した。最後に、最近記載された遺伝子発現における広範な対立遺伝子不均衡は、対立遺伝子間の遺伝的または後成的な差異が発現の定量的差異に寄与し得ることを示唆している。ハプロタイプ構造の理解は、対立遺伝子不均衡に寄与するバリアントの機構を描写するであろう。

特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ロングレンジの結合およびフェージングのために必要なゲノムの遠位領域間の会合を固定および捕捉するためのインビトロ技術を含む。場合によっては、方法は、非常にゲノム的に遠位のリード対を送達するために、ＸＬＲＰライブラリーを構築および配列決定する工程を含む。場合によっては、相互作用は主として単一のＤＮＡ断片内のランダムな会合から生じる。いくつかの例では、ＤＮＡ分子において互いに近接する配列セグメントがより頻繁にかつより高い確率で相互作用するが、分子の遠位部分間の相互作用はより低頻度であるため、配列セグメント間のゲノム距離を推測することができる。したがって、２つの遺伝子座を結合する対の数と入力ＤＮＡ上でのそれらの近接性との間には系統的な関係がある。本開示は、抽出において最大のＤＮＡ断片に及ぶことができるリード対を生成することができる。このライブラリーのための入力ＤＮＡは、１５０ｋｂｐの最大長を有し、これは、配列決定データから観察される最も長い意味のあるリード対である。これは、より大きな入力ＤＮＡ断片が提供される場合、本方法がなおよりゲノム的に遠位の遺伝子座を結合することができることを示唆している。本方法によって生成されたデータのタイプを取り扱うように特に適合された改良型のアセンブリソフトウェアツールを適用することによって、完全なゲノムアセンブリが可能であり得る。

極めて高いフェージング精度は、本開示の方法および組成物を使用して生成されたデータによって達成することができる。以前の方法と比較して、本明細書に記載される方法は、より高い割合のバリアントをフェージングすることができる。フェージングは、高いレベルの精度を維持しながら達成することができる。本明細書の技術は、約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９９％を超える精度でのフェージングを可能にすることができる。本明細書の技術は、約５００×配列決定深さ、４５０×配列決定深さ、４００×配列決定深さ、３５０×配列決定深さ、３００×配列決定深さ、２５０×配列決定深さ、２００×配列決定深さ、１５０×配列決定深さ、１００×配列決定深さ、または５０×配列決定深さ未満の正確なフェージングを可能にすることができる。このフェージング情報は、より長い距離、例えば、約２００ｋｂｐ、約３００ｋｂｐ、約４００ｋｂｐ、約５００ｋｂｐ、約６００ｋｂｐ、約７００ｋｂｐ、約８００ｋｂｐ、約９００ｋｂｐ、約ＩＭｂｐ、約２Ｍｂｐ、約３Ｍｂｐ、約４Ｍｂｐ、約５Ｍｂｐ、または約１０Ｍｂｐ超に拡張することができる。いくつかの実施形態において、ヒト試料についてのヘテロ接合性ＳＮＰの９０％超は、約２．５億未満のリードまたはリード対を使用して、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑデータの１レーンのみを使用することによって、９９％を超える精度でフェージングすることができる。他の場合において、ヒト試料についてのヘテロ接合性ＳＮＰの約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％超が、約２．５億未満または約５億未満のリードまたはリード対を使用して、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑデータの１または２レーンのみを使用することによって、約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９９％を超える精度でフェージングすることができる。例えば、ヒト試料についてのヘテロ接合性ＳＮＰの９５％または９９％超は、約２．５億未満または約５億未満のリードを使用して、約９５％または９９％を超える精度でフェージングすることができる。さらなる場合において、リード長を約２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、８００ｂｐ、１０００ｂｐ、１５００ｂｐ、２ｋｂｐ、３ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、２０ｋｂｐ、５０ｋｂｐ、または１００ｋｂｐに増加させることによって、さらなるバリアントを捕捉することができる。

本開示の他の実施形態では、ＸＬＲＰライブラリーからのデータを使用して、ロングレンジのリード対のフェージング能力を確認することができる。これらの結果の精度は、以前に利用可能な最良の技術と同等であるが、有意に長い距離までさらに拡大する。特定の配列決定方法のための現在の試料調製プロトコルは、フェージングのための標的部位のリード長、例えば、１５０ｂｐ内に位置するバリアントを認識する。一例では、アセンブリのベンチマーク試料であるＮＡ１２８７８について構築されたＸＬＲＰライブラリーから、存在する１，７０３，９０９のヘテロ接合性ＳＮＰの４４％を、９９％を超える精度でフェージングした。場合によっては、この割合は、酵素の賢明な選択または消化条件を用いて、ほぼすべての可変部位に拡大することができる。

ハプロタイプフェージングは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）領域（例えば、クラスＩＨＬＡ－Ａ、Ｂ、およびＣ、クラスＩＩＨＬＡ－ＤＲＢ１／３／４／５、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１）のフェージングを含むことができる。ゲノムのＨＬＡ領域は密集した多型であり、標準的な配列決定アプローチでは配列決定またはフェージングすることが困難であり得る。本開示の技法は、ゲノムのＨＬＡ領域の改善された配列決定およびフェージング精度を提供することができる。本開示の技法を用いて、ゲノムのＨＬＡ領域は、より大きな領域（例えば、染色体アーム、染色体、全ゲノム）またはそれ自体（例えば、ハイブリッド捕捉などの標的濃縮による）のフェージングの一部として正確にフェージングすることができる。一例では、ＨＬＡ領域自体を、約３００倍（ｘ）の配列決定深さで正確にフェージングした。これらの技法は、ロングレンジＰＣＲなどのＨＬＡ分析のための従来のアプローチに勝る利点を提供することができる。例えば、ロングレンジＰＣＲは、複雑なプロトコルおよび多くの別個の反応を含むことができる。本明細書でさらに論じられるように、例えば、試料識別バーコードを架橋オリゴヌクレオチドまたは他の場所に含め、バーコードに基づいて配列情報を逆多重化することによって、配列決定分析のために試料を多重化することができる。例えば、複数の試料を近接ライゲーションに供し、試料同定バーコード（例えば、架橋オリゴヌクレオチド中）でバーコード化し、ＨＬＡ領域を標的化し（例えば、ハイブリッド捕捉によって）、多重配列決定を行い、複数の試料についてのＨＬＡ領域のフェージングを可能にする。場合によっては、ＨＬＡ領域のフェージングは、補完なしで行われる。

ハプロタイプフェージングは、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）領域のフェージングを含むことができる。ゲノムのＫＩＲ領域は、トランスポゾン媒介性組換えのために高度に相同かつ構造的に動的であり、標準的な配列決定アプローチを用いて配列決定またはフェージングすることは困難であり得る。本開示の技法は、ゲノムのＫＩＲ領域の改善された配列決定およびフェージング精度を提供することができる。本開示の技法を用いて、ゲノムのＫＩＲ領域は、より大きな領域（例えば、染色体アーム、染色体、全ゲノム）またはそれ自体（例えば、ハイブリッド捕捉などの標的濃縮による）のフェージングの一部として正確にフェージングすることができる。これらの技法は、ロングレンジＰＣＲなどのＨＬＡ分析のための従来のアプローチに勝る利点を提供することができる。例えば、ロングレンジＰＣＲは、複雑なプロトコルおよび多くの別個の反応を含むことができる。本明細書でさらに論じられるように、例えば、試料識別バーコードを架橋オリゴヌクレオチドまたは他の場所に含め、バーコードに基づいて配列情報を逆多重化することによって、配列決定分析のために試料を多重化することができる。例えば、複数の試料を近接ライゲーションに供し、試料同定バーコード（例えば、架橋オリゴヌクレオチド中）でバーコード化し、ＫＩＲ領域を標的化し（例えば、ハイブリッド捕捉によって）、多重配列決定を行い、複数の試料についてのＫＩＲ領域のフェージングを可能にする。少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、またはそれ以上の遺伝子および／または偽遺伝子をフェージングすることができる。場合によっては、ＫＩＲ領域のフェージングは、補完なしで行われる。

メタゲノミクス分析
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、メタゲノム、例えば、ヒトの腸で見られるものの調査を可能にする。したがって、所定の生態学的環境に生息するいくつかまたはすべての生物の部分的または完全なゲノム配列を調査することができる。例としては、すべての腸内微生物、皮膚の特定の領域で見られる微生物、および毒性廃棄物部位に生存する微生物のランダムな配列決定が挙げられる。これらの環境における微生物集団の組成は、本明細書に記載される組成物および方法、ならびにそれらのそれぞれのゲノムによってコードされる相互に関連する生化学の態様を使用して、決定することができる。本明細書に記載される方法は、複雑な生物学的環境、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、５０００、１００００またはそれ以上を超える生物および／または生物のバリアントを含む生物学的環境からのメタゲノム研究を可能にすることができる。

癌ゲノム配列決定に必要とされる高い精度は、本明細書に記載される方法およびシステムを使用して達成することができる。不正確な参照ゲノムは、癌ゲノムを配列決定する際に塩基呼び出しを困難なものにしかねない。不均一な試料および小さな出発物質、例えば、生検により得られた試料はさらなる困難をもたらす。さらに、大規模な構造的なバリアントおよび／またはヘテロ接合性の損失の検出はしばしば、癌ゲノム配列決定の他、体細胞バリアントと塩基呼び出しのエラーとを区別する能力にも、必要不可欠である。

改善された配列決定精度
本明細書に記載されるシステムおよび方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、またはそれ以上の様々なゲノムを含む複雑な試料から正確な長い配列を生成し得る。通常の、良性の、および／または腫瘍由来の混合試料は任意選択で、通常の対照を必要とすることなく、解析されてもよい。いくつかの実施形態において、１００ｎｇまたは数百ほどのゲノム当量の小さな出発試料は、正確な長い配列を生成するために利用される。本明細書に記載されるシステムおよび方法は、大規模な構造バリアントおよび再編成の検出が可能となる場合があり、フェージングされたバリアントコールは、約１ｋｂｐ、約２ｋｂｐ、約５ｋｂｐ、約１０ｋｂｐ、約２０ｋｂｐ、約５０ｋｂｐ、約１００ｋｂｐ、約２００ｋｂｐ、約５００ｋｂｐ、約１Ｍｂｐ、約２Ｍｂｐ、約５Ｍｂｐ、約１０Ｍｂｐ、約２０Ｍｂｐ、約５０Ｍｂｐ、または約１００Ｍｂｐ、またはそれ以上のヌクレオチドにまたがる長い配列にわたって得られ得る。例えば、フェージングされたバリアントコールは、約１Ｍｂｐまたは約２Ｍｂｐにまたがる長い配列にわたって得られる得る。

本明細書に記載される方法およびシステムを使用して決定されるハプロタイプは、コンピュータリソース、例えば、クラウドシステムなどのネットワーク上のコンピュータリソースに割り当てられてもよい。短いバリアントコールは、必要であれば、コンピュータリソースに保管される関連情報を使用して修正することができる。構造バリアントは、短いバリアントコールからの組み合わされた情報、およびコンピュータリソースに保管された情報に基づいて検出することができる。ゲノムの問題となる部分、例えば、セグメント重複、構造多型（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｖａｒｉａｔｉｏｎ）の傾向がある領域、高度に可変的でありかつ医学的に関連するＭＨＣ領域、セントロメアおよびテロメアの領域、ならびに、限定されないが、反復領域、低い配列精度、高いバリアント率、ＡＬＵ反復、セグメント重複を持つものを含む他の異質染色質領域、または当該技術分野での他の関連する問題となる部分を、精度の向上ために再度組み立てることができる。

臨床用途
本開示の方法は、選択的なゲノムの関心領域の他に、選択的な関心領域と相互作用し得るゲノム領域の遺伝子情報の分析に使用され得る。本明細書に開示されるような増幅方法は、限定されないが、米国特許第６，４４９，５６２号、第６，２８７，７６６号、第７，３６１，４６８号、第７，４１４，１１７号、第６，２２５，１０９号、および第６，１１０，７０９号でみられるものなど、遺伝子分析のためのデバイス、キット、および方法に使用することができる。場合によっては、本開示の増幅方法は、多型の存在の有無を判定するためのＤＮＡハイブリダイゼーション研究のために標的核酸を増幅するために使用することができる。多型または対立遺伝子は、遺伝病などの疾患または疾病に関連付けることができる。他の場合において、多型は、疾患または疾病に対する感受性に関連付けることができ、例えば、多型は、中毒、退行性および年齢に関連する疾病、癌などに関連付けられる。他の場合において、多型は、冠状動脈の健康の増大といった有用な特色、ＨＩＶもしくはマラリアなどの疾患に対する抵抗性、または骨粗鬆症、アルツハイマー病、もしくは痴呆などの成人病に対する抵抗性に関連付けることができる。

本開示の組成物および方法はゲノミクスにおいて使用され得る。本明細書に記載される方法は、この用途に非常に望ましい答えを迅速に示すことができる。本明細書に記載される方法および組成物は、診断または予後のためにかつ健康と疾患の指標として使用され得るバイオマーカーを見つけ出すプロセスで使用され得る。本明細書に記載される方法および組成物は、薬物をスクリーニングするために、例えば、薬物の開発、処置の選択、処置の有効性の判定、および／または医薬開発のための標的の識別のために、使用され得る。薬物に関するスクリーニングアッセイ時に遺伝子発現を試験する能力は、タンパク質が身体において最終的な遺伝子産物であるため、非常に重要である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法および組成物は、実行されている特定のスクリーニングに関する最も多くの情報を提供するタンパク質および遺伝子発現の両方を同時に測定する。

本開示の組成物および方法は、遺伝子発現分析に使用され得る。本明細書に記載される方法は、ヌクレオチド配列を区別する。標的ヌクレオチド配列間の差は、例えば、単一の核酸塩基の差、核酸欠失、核酸挿入、または再編成であり得る。１を超える塩基を含むそのような配列の差も検出することができる。本開示のプロセスは、感染症、遺伝子疾患、および癌を検出することができる。さらに、上記プロセスは環境モニタリング、法医学、および食品科学においても有用である。核酸に対して実施され得る遺伝子分析の例としては、例えば、ＳＮＰ検出、ＳＴＲ検出、ＲＮＡ発現分析、プロモーターメチル化、遺伝子発現、ウイルス検出、ウイルスのサブタイプ分類、および薬物耐性が挙げられる。

本方法は、罹患した細胞型が試料に存在するかどうか、疾患の段階、患者の予後、特定の処置に応答する患者の能力、または患者にとって最良の処置を判定するために、患者から得られたまたは患者に由来する生体分子試料の分析に適用され得る。本方法は、特定の疾患のためのバイオマーカーを同定するためにも適用され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は疾病の診断に使用される。本明細書で使用されるように、「診断する」または疾病の「診断」という用語は、疾病を予測もしくは診断すること、疾病の素因を判定すること、疾病の処置をモニタリングすること、疾患の治療反応、もしくは疾病の予後、疾病の進行、または疾病の特定の処置に対する反応を診断することを含む。例えば、血液試料は、試料中の疾患または悪性細胞型のマーカーの存在および／または量を判定するために、本明細書に記載される方法のうちいずれかに従ってアッセイすることができ、それによって、疾患または癌を診断またはステージ分類することができる。

多数の免疫学的、増殖性、および悪性の疾患と障害が、本明細書に記載される方法に特に適している。免疫疾患および障害は、アレルギー性疾患および障害、免疫機能の障害、ならびに自己免疫疾患および疾病を含む。アレルギー性疾患および障害は、限定されないが、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、および食物アレルギーを含む。免疫不全症は、限定されないが、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、好酸球増加症候群、慢性肉芽腫症、白血球接着不全症ＩおよびＩＩ、高ＩｇＥ症候群、チェディアック・東、好中球増加症、好中球減少症、無形成症、無ガンマグロブリン血症、高ＩｇＭ症候群、ディジョージ／軟口蓋帆・心臓・顔症候群、およびインターフェロン・ガンマ－ＴＨ１経路欠損症を含む。自己免疫性および免疫調節異常の障害は、限定されないが、関節リウマチ、糖尿病、全身性エリトマトーデス、グレーブス病、グレーブス眠症、クローン病、多発性硬化症、乾癬、全身性硬化症、甲状腺腫およびリンパ腫性甲状腺腫（橋本甲状腺炎、リンパ節様甲状腺腫）、円形脱毛症、自己免疫性心筋炎、硬化性苔癬、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、萎縮性胃炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、および炎症性腸疾患、同種異系移植片拒絶反応、ならびに感染性細菌または環境抗原に対するアレルギー反応による組織破壊を含む。

本開示の方法は、限定されないが、遺伝子融合、構造バリアント、再編成、およびトポロジーの変化、例えば、ＴＡＤ境界の欠失または変化、ＴＡＤサブタイプの変化、コンパートメントの変化、クロマチン型の変化、および修飾状態の変化、例えば、メチル化状態（例えば、ＣｐＧメチル化、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、または他のヒストンメチル化）を含む遺伝的疾患に関連する遺伝的特徴またはゲノム特徴を検出するために使用され得る。

本開示により検出され得る細菌感染因子は、エシェリキア－コリ、サルモネラ、シゲラ、クレブシエラ、シュードモナス、リステリア－モノサイトゲネス、マイコバクテリウム－ツベルクローシス、マイコバクテリウム－アビウムイントラセルラーレ、エルシニア、フランシセラ、パスツレラ、ブルセラ、クロストリジウム、ボルデテラ－ペルツッシス、バクテロイデス、スタフィロコッカス－アウレウス、ストレプトコッカス－ニューモニエ、Ｂ溶血性連鎖球菌（Ｂ－Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｓｔｒｅｐ．）、コリネバクテリア、レジオネラ、ミコプラズマ、ウレアプラスマ、クラミジア、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス、ヘモフィルスインフルエンザ、エンテロコッカス－フェカーリス、プロテウス・ブルガリス、プロテウス・ミラビリス、ヘリコバクターピロリ、トレポネーマ・パラジウム、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・リカレンチス、リケッチア病原体、ノカルディア、および放線菌（Ａｃｉｔｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）を含む。

本開示により検出され得るウイルス感染因子は、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞リンパ性細胞栄養性ウイルス（ｈｕｍａｎＴ－ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｔｒｏｐｈｉｃｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）、エプスタイン－バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トーガウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、風疹ウイルス、およびレオウイルスを含む。

本開示の方法は、限定されないが、遺伝子融合、構造バリアント、再編成、およびトポロジーの変化、例えば、ＴＡＤ境界の欠失または変化、ＴＡＤサブタイプの変化、コンパートメントの変化、クロマチン型の変化、および修飾状態の変化、例えば、メチル化状態（例えば、ＣｐＧメチル化、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、または他のヒストンメチル化）を含む癌に関連する遺伝的特徴またはゲノム特徴を検出するために使用され得る。

試料
標的ポリヌクレオチドが由来する様々な試料は、同じ個体の複数の試料、異なる個体の試料、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、試料は、１人の個体の複数のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、試料は、２人以上の個体の複数のポリヌクレオチドを含む。個体は、標的ポリヌクレオチドが由来し得る任意の生物またはその一部であり、その非限定的な例としては、植物、動物、真菌、原生生物、モネラ界、ウイルス、ミトコンドリア、および葉緑体が挙げられる。試料ポリヌクレオチドは、細胞試料、組織試料、または、例えば、培養細胞株、生検、血液試料、もしくは細胞を含有している流体試料を含む、それらに由来する臓器試料など、対象から単離することができるものである。対象は、限定されないが、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物を含む動物であってもよく、通常はヒトなどの哺乳動物である。試料は化学合成などにより人工的に得られることもできる。いくつかの実施形態において、試料はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、試料はゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、試料は、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、バクテリア人工染色体、酵母人工染色体、オリゴヌクレオチドタグ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、試料は、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写、およびそれらの組み合わせを含む、プライマーとＤＮＡポリメラーゼとの適切な組み合わせを使用したプライマー伸長反応により生成されたＤＮＡを含む。プライマー伸長反応のための鋳型がＲＮＡである場合、逆転写の産物は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と呼ばれる。プライマー伸長反応に有用なプライマーは、１つ以上の標的に特異的な配列、ランダム配列、部分的なランダム配列、およびそれらの組み合わせを含み得る。プライマー伸長反応に適した反応条件は当該技術分野で知られている。一般に、試料のポリヌクレオチドは、試料中に存在する任意のポリヌクレオチドを含み、これは標的ポリヌクレオチドを含むこともあれば、含まないこともある。

核酸の抽出と精製のための方法は公知である。例えば、核酸は、フェノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、またはＴＲＩｚｏｌおよびＴｒｉＲｅａｇｅｎｔを含む同様の製剤での有機抽出により精製され得る。抽出技術の他の非限定的な例は、（１）自動核酸抽出器、例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なＭｏｄｅｌ３４１ＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｏｒの使用を伴うまたは伴わない、例えば、フェノール／クロロホルムの有機試薬（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９９３）を使用する、有機抽出とその後のエタノール沈殿、（２）固定相吸着法（米国特許第５，２３４，８０９号、Ｗａｌｓｈｅｔａｌ．，１９９１）、および（３）典型的に「塩析」方法と呼ばれる沈澱法などの、塩で誘導された核酸沈澱法（Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，（１９８８））を含む。核酸の単離および／または精製の別の例は、核酸が特異的または非特異的に結合することができる磁性粒子の使用と、その後の、磁石を使用したビーズの単離と、核酸の洗浄と、ビーズからの核酸の溶出を含む（例えば、米国特許第５，７０５，６２８号を参照）。いくつかの実施形態では、上記の単離方法の前に、試料から望ましくないタンパク質を除去するのを助けるための酵素消化工程、例えば、プロテイナーゼＫまたは他の同様のプロテアーゼによる消化を行ってもよい（例えば、米国特許第７，００１，７２４号を参照されたい）。必要に応じて、ＲＮａｓｅ阻害剤を溶解緩衝液に添加することができる。特定の細胞または試料型について、前記プロトコルにタンパク質変性／消化の工程を加えることが望ましい場合もある。精製方法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を単離することを目的とし得る。抽出手順の間またはその後に、ＤＮＡとＲＮＡの両方が一緒に単離されると、さらなる工程を利用して、一方または両方を他とは別々に精製することができる。例えば、サイズ、配列、または他の物理的もしくは化学的な特性による精製により、抽出した核酸の細画分を生成することもできる。最初の核酸単離工程に加えて、過剰なまたは不要な試薬、反応物、または生成物を除去するなどのために、本開示の方法における工程の後に、核酸の精製を実施することができる。

核酸の鋳型分子は、２００３年１０月９日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２００２／０１９０６６３号Ａ１に記載される通りに得ることができる。通常、核酸は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０－２８１（１９８２）に記載されるものなどの様々な技術によって生体試料から抽出することができる。場合によっては、核酸は、最初に生体試料から抽出され、次いでインビトロでクロスリンクされ得る。場合によっては、天然の会合タンパク質（例えば、ヒストン）を、核酸からさらに除去することができる。

いくつかの実施形態では、複数の独立した試料の各々は、少なくとも約１ｎｇ、２ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、３０ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、７５ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、２００ｎｇ、２５０ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、１．５μｇ、２μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、５００μｇ、または１０００μｇ、またはそれ以上の核酸材料を独立して含むことができる。いくつかの実施形態では、複数の独立した試料の各々は、約１ｎｇ、２ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、３０ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、７５ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、２００ｎｇ、２５０ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、１．５μｇ、２μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、５００μｇ、または１０００μｇ未満、またはそれ以上の核酸を独立して含むことができる。

いくつかの実施形態では、末端修復は、ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能なものなどの市販のキットを使用して、平滑末端５’リン酸化核酸末端を生成するために行われる。

アダプター
アダプターオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに結合することができる配列（少なくともその一部が公知である）を有する任意のオリゴヌクレオチドを含む。アダプターオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログ、非カノニカルヌクレオチド、標識ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。アダプターオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、または部分二本鎖であり得る。一般に、部分二本鎖アダプターは、１つ以上の一本鎖領域および１つ以上の二本鎖領域を含む。二本鎖アダプターは、互いにハイブリダイズした２つの別個のオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチド二本鎖」とも呼ばれる）を含むことができ、ハイブリダイゼーションは、１つ以上の平滑末端、１つ以上の３’オーバーハング、１つ以上の５’オーバーハング、ミスマッチおよび／または不対合のヌクレオチドから生じる１つ以上のバルジ、またはこれらの任意の組み合わせを残し得る。いくつかの実施形態では、一本鎖アダプターは、互いにハイブリダイズすることができる２つ以上の配列を含む。このような２つのハイブリダイズ可能な配列が一本鎖アダプターに含まれる場合、ハイブリダイゼーションによりヘアピン構造（ヘアピンアダプター）が得られる。アダプターの２つのハイブリダイズした領域がハイブリダイズされていない領域によって互いに隔てられている場合、「バブル」構造が生じる。バブル構造を含むアダプターは、内部ハイブリダイゼーションを含む単一のアダプターオリゴヌクレオチドからなり得るか、または互いにハイブリダイズされた２つ以上のアダプターオリゴヌクレオチドを含み得る。アダプターにおける２つのハイブリダイズ可能な配列の間などの内部配列ハイブリダイゼーションは、一本鎖アダプターオリゴヌクレオチドにおいて二本鎖構造を生じ得る。ヘアピンアダプターおよび二本鎖アダプターなどの異なる種類のアダプター、または異なる配列のアダプターを組み合わせて使用することができる。ヘアピンアダプター中のハイブリダイズ可能な配列は、オリゴヌクレオチドの一方または両方の末端を含んでも含まなくてもよい。いずれの末端もハイブリダイズ可能な配列に含まれない場合、両方の末端は「フリー」または「オーバーハング」である。一方の末端のみがアダプター中の別の配列にハイブリダイズ可能である場合、他方の末端は、３’オーバーハングまたは５’オーバーハングなどのオーバーハングを形成する。５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドが相補的であり、互いにハイブリダイズするように、５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドの両方がハイブリダイズ可能な配列に含まれる場合、末端は「平滑」と呼ばれる。異なるアダプターを標的ポリヌクレオチドに連続反応でまたは同時に結合することができる。例えば、第１および第２のアダプターを同じ反応に加えることができる。アダプターは、標的ポリヌクレオチドと組み合わせる前に操作することができる。例えば、末端リン酸塩を添加または除去することができる。

アダプターは、限定されないが、１つ以上の増幅プライマーアニーリング配列またはその相補体、１つ以上の配列決定プライマーアニーリング配列またはその相補体、１つ以上のバーコード配列、複数の異なるアダプターまたは異なるアダプターのサブセット間で共有される１つ以上の共通配列、１つ以上の制限酵素認識部位、１つ以上の標識ポリペプチドオーバーハングに相補的な１つ以上のオーバーハング、１つ以上のプローブ結合部位（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．によって開発されたものなどの大規模並列配列決定のためのフローセルなどの配列決定プラットフォームへの結合のための）、１つ以上のランダムまたはほぼランダムな配列（例えば、１つ以上の位置において２つ以上の異なるヌクレオチドのセットからランダムに選択される１つ以上のヌクレオチドであって、１つ以上の位置において選択される異なるヌクレオチドのそれぞれが、ランダム配列を含むアダプターのプールにおいて表される、１つ以上のヌクレオチド）、およびそれらの組み合わせを含む。２つ以上の配列要素は、互いに隣接していなくてもよく（例えば、１つ以上のヌクレオチドによって分離される）、互いに隣接していてもよく、部分的に重複していても、完全に重複していてもよい。例えば、増幅プライマーアニーリング配列は、配列決定プライマーアニーリング配列としても役立つことができる。配列要素は、３’末端もしくはその付近に、５’末端もしくはその付近に、またはアダプターオリゴヌクレオチドの内部に位置することができる。アダプターオリゴヌクレオチドが、ヘアピンなどの二次構造を形成することができる場合、配列要素は、部分的にもしくは完全に二次構造の外側に、部分的にもしくは完全に二次構造の内側に、または二次構造に関与する配列の間に位置することができる。例えば、アダプターオリゴヌクレオチドがヘアピン構造を含む場合、配列要素は、ハイブリダイズ可能な配列（「ループ」）間の配列の中を含む、ハイブリダイズ可能な配列（「ステム」）の内側または外側に部分的または完全に位置することができる。いくつかの実施形態では、異なるバーコード配列を有する複数の第１のアダプターオリゴヌクレオチド中の第１のアダプターオリゴヌクレオチドは、複数の第１のアダプターオリゴヌクレオチドのすべての間で共通の配列要素を含む。いくつかの実施形態では、すべての第２のアダプターオリゴヌクレオチドは、第１のアダプターオリゴヌクレオチドによって共有される共通の配列要素とは異なる、すべての第２のアダプターオリゴヌクレオチド間で共通の配列要素を含む。配列要素の差異は、例えば、配列長の変化、１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入、または１つ以上のヌクレオチド位置におけるヌクレオチド組成の変化（塩基変化または塩基修飾など）に起因して、異なるアダプターの少なくとも一部が完全にアラインメントしないような任意のものであり得る。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的ポリヌクレオチドに相補的な５’オーバーハング、３’オーバーハング、またはその両方を含む。相補的なオーバーハングは、限定されないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のヌクレオチド長を含む、１つ以上のヌクレオチド長であり得る。例えば、相補的なオーバーハングは、約１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド長であり得る。相補的なオーバーハングは、固定配列を含み得る。相補的なオーバーハングは、１つ以上のヌクレオチドのランダム配列を含み得、１つ以上のヌクレオチドは、１つ以上の位置において２つ以上の異なるヌクレオチドのセットからランダムに選択され、１つ以上の位置において選択された異なるヌクレオチドの各々は、ランダム配列を含む相補的なオーバーハングを有するアダプターのプールにおいて表される。いくつかの実施形態において、アダプターオーバーハングはアデニンまたはチミンからなる。

アダプターオリゴヌクレオチドは、それらが含まれる１つ以上の配列要素を収容するのに少なくとも充分な任意の適切な長さを有し得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約２００もしくはそれ以上、１０未満、１５未満、２０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満、５０未満、５５未満、６０未満、６５未満、７０未満、７５未満、８０未満、９０未満、１００未満、２００もしくはそれ以上を下回る、または、１０超、１５超、２０超、２５超、３０超、３５超、４０超、４５超、５０超、５５超、６０超、６５超、７０超、７５超、８０超、９０超、１００超、２００もしくはそれ以上を上回るヌクレオチド長である。いくつかの例では、アダプターは、約１０～約５０ヌクレオチド長であり得る。さらなる例において、アダプターは、約２０～約４０ヌクレオチド長であり得る。

本明細書で使用される場合、「バーコード」という用語は、バーコードが関連するポリヌクレオチドのいくつかの特徴を同定することを可能にする公知の核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、同定されるポリヌクレオチドの特徴は、ポリヌクレオチドが由来する試料である。いくつかの実施形態では、バーコードは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。例えば、バーコードは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、バーコードは１０、９、８、７、６、５、または４ヌクレオチド長より短くてもよい。例えば、バーコードは１０ヌクレオチド長より短くてもよい。いくつかの実施形態では、いくつかのポリヌクレオチドに関連するバーコードは、他のポリヌクレオチドに関連するバーコードとは異なる長さである。一般に、バーコードは充分な長さであり、それらが関連するバーコードに基づく試料の同定を可能にするのに充分に異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、バーコード、およびそれが関連する試料源は、バーコード配列中の１つ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、または欠失、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、または欠失などの後に、正確に同定することができる。いくつかの例では、１、２、または３個のヌクレオチドが突然変異、挿入、および／または欠失され得る。いくつかの実施形態では、複数のバーコード中の各バーコードは、少なくとも２つのヌクレオチド位置、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の位置において、複数のバーコード中の他のすべてのバーコードとは異なる。いくつかの例において、各バーコードは、少なくとも２、３、４、または５個の位置において、すべての他のバーコードとは異なり得る。いくつかの実施形態では、第１の部位および第２の部位の両方が、複数のバーコード配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、第２の部位のバーコードは、第１のアダプターオリゴヌクレオチドのバーコードから独立して選択される。いくつかの実施形態では、バーコードを有する第１の部位および第２の部位は、対の配列が同じまたは異なる１つ以上のバーコードを含むように対にされる。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、標的ポリヌクレオチドが結合されるバーコード配列に基づいて、標的ポリヌクレオチドが由来する試料を同定する工程をさらに含む。一般に、バーコードは、標的ポリヌクレオチドに結合されたときに、標的ポリヌクレオチドが由来する試料の識別子としての役割を果たす核酸配列を含み得る。

アダプターオリゴヌクレオチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合（ｃｏｕｐｌｅｄ、ｌｉｎｋｅｄ）され得、またはテザリングされ得る。例えば、クロスリンクした試料をＭＮａｓｅなどのＤＮａｓｅで、インサイチュでゲノム消化した後、１つ以上の抗体を試料に添加して、メチル化部位または転写因子結合部位などで消化されたクロマチンに結合させることができる。次に、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合（ｃｏｕｐｌｅｄ、ｌｉｎｋｅｄ）され、またはテザリングされたビオチン化アダプターオリゴヌクレオチドを試料に添加して、アダプターをクロマチン中の１つ以上の特異的部位に標的化することができる。次いで、試料をリガーゼで処理して、近接ライゲーションを行ってもよい。さらに、ストレプトアビジンを使用して、アダプターにライゲーションされたＤＮＡを単離してもよい。次いで、クロスリンクは、ＰＣＲおよび配列決定を使用して試料を増幅する前に、脱クロスリンクされ得る。代替的に、アダプター連鎖オリゴヌクレオチドは、クリックケミストリーを使用して精製試薬に結合することができる修飾ヌクレオチドを含み得る。

架橋オリゴヌクレオチド
本明細書で提供される方法は、接合部において複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合させる工程を含むことができる。場合によっては、結合させる工程は、ビオチンタグ付きヌクレオチドを使用して粘着末端をｆｉｌｌ－ｉｎすること、および平滑末端をライゲーションすることを含むことができる。特定の場合において、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを架橋オリゴヌクレオチドに接触させることを含むことができる。図１５は、第１のセグメントおよび第２のセグメントを結合するために架橋オリゴヌクレオチドを使用する例示的なワークフローを示しており、第１のセグメントおよび第２のセグメントを形成するために核酸がインサイチュで消化される。架橋オリゴヌクレオチドを第１のセグメントおよび第２のセグメントの各々にライゲーションする前に、末端を平滑化し、ポリアデニル化する。次いで、第１のセグメントおよび第２のセグメントをライゲーションして、架橋オリゴヌクレオチドを含む接合部を作製する。様々な場合において、結合させる工程は、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントをバーコードに接触させることを含むことができる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される架橋オリゴヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長～約５０ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１５ヌクレオチド長～約１８ヌクレオチド長であり得る。様々な実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。一例において、架橋オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド長である。別の例では、架橋オリゴヌクレオチドは、１２ヌクレオチド長または約１２ヌクレオチド長である。場合によっては、少なくとも１０ｂｐの架橋オリゴヌクレオチドは、安定性を増加させ、短い挿入物、染色体間ライゲーション、非特異的ライゲーション、および架橋自己ライゲーションなどの有害な近接ライゲーション事象を低減することができる。

いくつかの実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、バーコードを含み得る。特定の実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドは、複数のバーコード（例えば、２つ以上のバーコード）を含むことができる。様々な実施形態において、架橋オリゴヌクレオチドは、共に結合された複数の架橋オリゴヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、架橋オリゴヌクレオチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合され（ｃｏｕｐｌｅｄまたはｌｉｎｋｅｄ）得る。場合によっては、結合された架橋オリゴヌクレオチドは、抗体が結合される試料核酸中の位置に送達され得る。

分割およびプーリングアプローチを用いて、固有のバーコードを有する架橋オリゴヌクレオチドを生成することができる。試料の集団は、複数の群に分割することができ、架橋オリゴヌクレオチドは、架橋オリゴヌクレオチドバーコードが群間で異なるが、群内では同じであるように試料に結合させることができ、試料の群を再度プールすることができ、このプロセスを複数回繰り返すことができる。例えば、ポリヌクレオチドの集団をＡ群とＢ群へ分割することができる。例えば、第１の架橋オリゴヌクレオチドは、Ａ群のポリヌクレオチドに結合することができ、第２の架橋オリゴヌクレオチドは、Ｂ群のポリヌクレオチドに結合することができる。これにより、架橋オリゴヌクレオチドバーコードはＡ群内で同じではあるが、架橋オリゴヌクレオチドはＡ群とＢ群との間で異なる。このプロセスを反復すると、最終的には、集団中の各試料が固有の一連の架橋オリゴヌクレオチドバーコードを有することになり、単一試料（例えば、単細胞、単核、単染色体）の分析が可能になる。１つの例示的な例では、ビーズの固体支持体に結合したクロスリンクした消化核の試料を８本のチューブに分け、各々が、ライゲーションされる二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）アダプターを含む第１のアダプター群（第１の反復）の８つの固有のメンバーのうちの１つを含有する。８つのアダプターの各々は、核中のクロスリンクしたクロマチン凝集体の核酸末端へのライゲーションのための同じ５’オーバーハング配列を有することができるが、そうでなければ固有のｄｓＤＮＡ配列を有する。第１のアダプター群をライゲーションした後、核をプールして戻し、洗浄してライゲーション反応成分を除去することができる。分配、ライゲーション、およびプールのスキームは、さらに２回繰り返すことができる（２回の反復）。各アダプター群からのメンバーのライゲーション後に、クロスリンクしたクロマチン凝集体を複数のバーコードに連続して結合させることができる。場合によっては、複数のアダプター群の複数のメンバーの連続ライゲーション（反復）は、バーコードの組み合わせをもたらす。利用可能なバーコードの組み合わせの数は、反復当たりの群の数、および使用されるバーコードオリゴヌクレオチドの総数に依存する。例えば、それぞれ８つのメンバーを含む３つの反復は、８３の可能な組み合わせを有することができる。場合によっては、バーコードの組み合わせは固有である。場合によっては、バーコードの組み合わせは冗長である。バーコードの組み合わせの総数は、固有のバーコードを受け取る群の数を増加または減少させることによって、および／または、反復の数を増加または減少させることによって調整することができる。１を超えるアダプター群が使用される場合、反復アダプター結合のために、分配、結合、およびプールのスキームを使用することができる。場合によっては、分配、結合、およびプールのスキームは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０回さらに繰り返され得る。場合によっては、最後のアダプター群のメンバーは、例えば、ＰＣＲ増幅による配列決定ライブラリー調製中に、アダプターに結合したＤＮＡのその後の濃縮のための配列を含む。

（分割およびプールの）このプロセスの反復は、最終的には、集団中の各試料が固有の一連の架橋オリゴヌクレオチドバーコードを有することになり、単一試料（例えば、単細胞、単核、および単染色体）の分析が可能になる。図１６および図１７は、核酸がインサイチュで消化され、その後、末端の平滑化およびポリアデニル化される、分割およびプールのアプローチを使用する例示的なワークフローを示す。単一細胞を分注し、バーコードを各細胞に存在する末端にライゲーションする（例えば、バーコードｂｃ１）。細胞をプールし、その後、単細胞を単離し、第２のバーコードを各細胞に存在する末端にライゲーションする（例えば、バーコードｂｃ２）。細胞を再度プールし、単一細胞に分離した後、架橋アダプター（例えば、Ｂｉｏ－Ｂｒｉｄｇｅ）をライゲーションし、これは、バーコードおよびアダプターの固有の組み合わせを有する２つのセグメント間で接合部を形成する別のＤＮＡセグメントにライゲーションすることができ、接合部が由来する細胞を同定する（例えば、バーコードｂｃ１およびｂｃ２）。架橋アダプターは、その後のプルダウンまたは他の精製のために、ビオチンなどの１つ以上の親和性試薬を含むことができる。図１８は、分割およびプールのアプローチから生じるバーコードおよび架橋の組み合わせの例を示す。

別の例示的な例では、ビーズの固体支持体に結合したクロスリンクした消化核の試料を８本のチューブに分けることができ、各々が、ライゲーションされる二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）アダプターを含む第１のアダプター群（第１の反復）の８つの固有のメンバーのうちの１つを含有する。８つのアダプターの各々は、核中のクロスリンクしたクロマチン凝集体の核酸末端へのライゲーションのための同じ５’オーバーハング配列を有することができるが、そうでなければ固有のｄｓＤＮＡ配列を有する。第１のアダプター群をライゲーションした後、核をプールして戻し、洗浄してライゲーション反応成分を除去することができる。分配、ライゲーション、およびプールのスキームは、さらに２回繰り返すことができる（２回の反復）。各アダプター群からのメンバーのライゲーション後に、クロスリンクしたクロマチン凝集体を複数のバーコードに連続して結合させることができる。

場合によっては、複数のアダプター群の複数のメンバーの連続ライゲーション（反復）は、バーコードの組み合わせをもたらすことができる。利用可能なバーコードの組み合わせの数は、反復当たりの群の数、および使用されるバーコードオリゴヌクレオチドの総数に依存し得る。例えば、それぞれ８つのメンバーを含む３つの反復は、８３の可能な組み合わせを有することができる。場合によっては、バーコードの組み合わせは固有である。特定の場合には、バーコードの組み合わせは冗長である。バーコードの組み合わせの総数は、固有のバーコードを受け取る群の数を増加または減少させることによって、および／または、反復の数を増加または減少させることによって調整することができる。１を超えるアダプター群が使用される場合、反復アダプター結合のために、分配、結合、およびプールのスキームを使用することができる。様々な場合において、分配、結合、およびプールのスキームは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれ以上さらに繰り返され得る。場合によっては、最後のアダプター群のメンバーは、例えば、ＰＣＲ増幅による配列決定ライブラリー調製中に、アダプターに結合したＤＮＡのその後の濃縮のための配列を含み得る。

場合によっては、分割－プール戦略を可能にする３つのオリゴ設計が使用され得、それによって８つの異なるビオチン化オリゴと組み合わせた２つの９６ウェルプレートが使用され得、７３，７２８の異なる分子の別々のバーコード化が可能となる。特定の場合において、８つのオリゴの第１の２つのセットはビオチン化されず、８つのオリゴの第３のセットがビオチン化される。様々な場合において、各バーコード化オリゴヌクレオチドは方向性があり、各ラウンドにおいて１つのオリゴのみを加えることを可能にする。架橋オリゴヌクレオチドは、対応する末端と適合することを可能にする配列を有することができる。

特定の場合において、バーコードおよびアダプターは、完全にライゲーションされた架橋によって取られる配列空間の量を低減するために、より短い配列を有することもある。様々な場合において、架橋は、３０ｂｐの配列空間を占め得る。場合によっては、架橋は、５４ｂｐの配列空間を占め得るが、固有の分子識別子（ＵＭＩ）のためのさらなる位置を提供し得る。特定の場合において、ＵＭＩは、７３，７２８の異なる組み合わせの単一細胞同定を可能にし得る。様々な場合において、第１の２つのオリゴセットは未修飾であり、第３のオリゴセットはビオチン化されている。

架橋アダプター中のバーコード配列を使用して、試料の多重配列決定を可能にすることができる。例えば、近接ライゲーションは、いくつかの異なる試料に対して行うことができ、各試料は、異なるバーコード配列を有する架橋オリゴヌクレオチドを使用する。次いで、多重配列決定分析のために試料をプールすることができ、バーコード配列に基づいて個々の試料に配列情報を逆多重化することができる。

ゲノムアセンブリおよびハプロタイプフェージングのためのフェージングされたリードセット
ロングリードまたはショートリード配列決定技術を使用して、ゲノムアセンブリおよびハプロタイプフェージングを含む用途のために、フェージングされたリードセットを含むリードセットを生成するための方法が本明細書で提供される。いくつかのそのような方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１４７２７９においてより詳細に提供される。このような方法では、核酸分子を（例えば、クロマチン構造において）結合させ、切断して内部末端を露出させ、他の露出末端へ接合部で再結合させ、結合から解放し、配列決定することができる。この技術は、複数の配列セグメントを含む核酸分子を産生することができる。核酸分子内の複数の配列セグメントは、それらの天然の位置および配向または出発位置および配向に対して再編成されている間、保存されたフェージング情報を有することができる。接合部のいずれかの側の配列セグメントは、試料核酸分子の同じフェーズに由来すると確信してみなすことができる。

高分子量ＤＮＡを含む核酸分子は、少なくとも１つの核酸結合部分上で結合または固定化され得る。例えば、インビトロのクロマチン凝集体へと組み立てられてホルムアルデヒド処理で固定されたＤＮＡは、本明細書の方法に一貫している。核酸を結合または固定化するアプローチは、限定されないが、インビトロのまたは再構成クロマチンのアセンブリ、天然のクロマチン、ＤＮＡ結合タンパク質凝集体、ナノ粒子、ＤＮＡ結合物質を使用して被覆されたＤＮＡ結合ビーズ、ポリマー、合成ＤＮＡ結合分子、または他の固体あるいはほぼ固体の親和性分子を含む。場合によっては、ビーズは、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ－ＣｏｕｌｔｅｒＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡＭＰｕｒｅＸＰビーズなどの負に帯電したカルボキシル基を含むビーズ）である。

本明細書に記載されるものなどの核酸結合部分に結合される核酸は、配列決定デバイス上でのリード距離よりも長い距離（例えば、１０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂまたはそれ以上）だけ核酸分子上で分離された第１のセグメントおよび第２のセグメントを持つ核酸分子が、それらの共通のリン酸ジエステル結合とは独立して共に結合されるように保持され得る。そのような結合された核酸分子の切断に際し、第１のセグメントおよび第２のセグメントの露出された末端は、互いに対しライゲーションすることができる。場合によっては、核酸分子は、固体表面上で結合された核酸分子間に重なりがほとんどまたはまったくないような濃度で結合され、そうすることで、切断された分子の露出した内部末端は再びライゲーションするか、または、切断前に共通の核酸由来の相同性となる共通の核酸由来の相同性となる他のセグメントから露出した末端にのみ再び結合するようになる可能性が高い。結果的に、ＤＮＡ分子は切断され、切断された露出した内部末端は、フェージング情報を失うことなく、例えば無作為に再びライゲーションすることができる。

結合した核酸分子は、任意の数の酵素的および非酵素的アプローチのうちの１つによって内部末端を露出させるために、切断され得る。例えば、核酸分子は、一本鎖オーバーハングを残す制限エンドヌクレアーゼなどの制限酵素を用いて、消化することができる。例えば、Ｍｂｏｌ消化はこの目的に適しているが、他の制限エンドヌクレアーゼも企図される。制限エンドヌクレアーゼのリストは、例えば、ほとんどの分子生物学生成物カタログにおいて入手可能である。核酸切断のための他の非限定的な技術としては、トランスポザーゼ、タグメンテーション酵素複合体、トポイソメラーゼ、非特異的エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、フラグメンターゼ、または代替酵素の使用が挙げられる。例えば、トランスポザーゼは、トランスポザーゼ送達オリゴヌクレオチド配列の結合によって特徴付けられる核酸中の配列非依存的切断を作り出すために、結合されていない左右の境界と組み合わせて使用することができる。機械的手段（例えば、超音波処理、せん断）、熱的手段（例えば、温度変化）、または電磁的手段（例えば、ＵＶ照射などの照射）を含む物理的手段も、切断をもたらすために使用することができる。

この段階での核酸の固定化は、切断された核酸分子断片を物理的に近接した状態に保つことができ、そうすることで、最初の分子のフェージング情報が保存される。１つの核酸結合部分から得られる例示的なクロマチン凝集体を、図２８に概略的に示す。例えば、クロマチン凝集体への固定化の利点は、共通の核酸分子の別個の領域が、それらのホスホジエステル骨格とは無関係に共に保持され得、その結果、それらのフェージング情報が、ホスホジエステル骨格の切断時に失われないということである。この利点はさらに、核酸分子が切断前に結合される代替的な足場によっても伝達される。

任意選択で、再アニーリングおよび再ライゲーションを防ぐために、一本鎖「粘着性」末端オーバーハングを修飾する。例えば、粘着末端は、例えば、１つのヌクレオチドおよびポリメラーゼを添加することによって、部分的にｆｉｌｌ－ｉｎされる（図２９）。このようにして、一本鎖末端全体をｆｉｌｌ－ｉすることはできないが、末端は、以前は相補的であった末端との再ライゲーションを防ぐように修飾される。５’ＧＡＴＣ５’－プライムオーバーハングを残すＭｂｏｌ消化の例では、グアノシンヌクレオチド三リン酸のみが添加される。これは、第１の相補的塩基（「Ｃ」）の「Ｇ」ｆｉｌｌ－ｉｎのみをもたらし、５’ＧＡＴオーバーハングをもたらす。この工程は、遊離粘着末端を互いに再ライゲーションに不適合なものにするが、下流での用途のために粘着性末端を保存する。代替的に、平滑末端は、オーバーハングの完全なｆｉｌｌ－ｉｎ、平滑末端生成酵素による制限消化、一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼによる処理、または非特異的切断によって生成される。場合によっては、トランスポザーゼは、平滑末端または粘着末端を有するアダプター末端を、ＤＮＡ分子の露出した内部末端に結合させるために使用される。

任意選択で、「切断オリゴヌクレオチド」が導入される（図３０）。この切断オリゴヌクレオチドは、切断／再ライゲーション部位をマークする。いくつかの切断オリゴヌクレオチドは、露出した核酸試料の内部末端上に生成された部分的にｆｉｌｌ－ｉｎされたオーバーハングと適合する一本鎖オーバーハングを両方の末端に有する。切断オリゴヌクレオチドの例を以下に示す。場合によっては、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチドは、ライゲーション中にコンカテマーを形成することができないように、その５’末端での５’リン酸除去などによって修飾される。代替的に、平滑切断オリゴヌクレオチドを使用するか、または別個の切断オリゴヌクレオチドを使用して切断部位をマークしない。いくつかのシステムにおいて、例えば、トランスポザーゼが使用される場合、切断はトランスポゾソーム（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｓｏｍｅ）境界配列の付加、その後の境界配列の互いへのライゲーションまたは切断オリゴへのライゲーションによって達成される。例示的な切断オリゴを以下に示す。しかしながら、代替的な切断オリゴは本明細書の開示と一致しており、配列、長さ、オーバーハングの存在もしくは配列、または５’脱リン酸化などの修飾が変化する。

場合によっては、切断オリゴヌクレオチドの二本鎖領域は変化する。切断オリゴヌクレオチドの関連する特徴は、そのオーバーハングの配列であり、核酸試料へのライゲーションを可能にするが、任意選択で、自己ライゲーションまたはコンカテマー形成を妨げるように修飾される。しばしば、切断オリゴヌクレオチドは、下流の配列反応において容易に同定されるように、標的核酸分子中に存在しないかまたは存在しにくい配列を含むことが好ましい。切断オリゴは任意選択で、例えば、既知のバーコード配列またはランダムに生成された固有の識別子配列でバーコード化される。固有の識別子配列は、核酸分子中または試料中の複数の接合部が同じ固有の識別子でバーコード化される可能性を非常に低くするように設計することができる。

切断された末端は、例えば、リガーゼまたは類似の酵素を用いて、直接またはオリゴ（例えば、切断オリゴ）を介して互いに結合することができる。固定化された高分子量の核酸分子の遊離一本鎖末端が直接または切断オリゴヌクレオチドにライゲーションされるように、ライゲーションを進行させることができる（図３０）。切断オリゴヌクレオチドは、利用される場合、２つのライゲーション可能な末端を有することができるため、このライゲーションは、高分子量核酸分子の領域を効果的にまとめて鎖状にすることができる。２つの露出した末端間に切断配列または分子を付加するという結果をもたらす代替的なアプローチも、切断なしに２つの露出した末端を直接結合するためのアプローチと同様に用いることができる。

次いで、核酸を核酸結合部分から遊離させることができる。インビトロクロマチン凝集体の場合、これは、クロスリンクを脱クロスリンクすること、またはタンパク質成分を消化すること、またはクロスリンクを脱クロスリンクすることとタンパク質成分を消化することの両方によって、達成することができる。適切なアプローチは、プロテイナーゼＫによる複合体の処置であるが、多くの代替物も企図される。他の結合技術については、リンカー分子の切断または基質の分解などの適切な方法を用いることができる。

このような技術から得られる核酸分子は、様々な関連する特徴を有することができる。核酸分子内の配列セグメントは、それらの天然または出発の位置および配向に対して再編成され得るが、フェージング情報は保存される。その結果、接合部のいずれかの側の配列セグメントは、共通の試料分子の共通フェーズに確実に割り当てることができる。したがって、分子上で互いに遠く離れたセグメントは、このような技術によって、各セグメントの部分または全体が単一分子配列決定デバイスの単一のランにおいて配列決定され、決定的なフェーズ割り当てを可能にするように、一緒にまたは近接させることができる。代替的に、場合によっては、最初に隣接するセグメントは、結果として生じる核酸において互いに分離され得る。場合によっては、核酸分子は、再ライゲーションのうち少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、または１００％が、切断前に共通の核酸由来の相同性となるセグメント間になるように、再度ライゲーションされ得る。

得られた分子の別の関連する特徴は、場合によっては、元の分子配列の大部分またはすべてが、おそらく再編成されているが、最終的な切断または再編成された分子において保存されることである。例えば、場合によっては、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、または２０％以下の元の分子が、結果として生じる分子（複数可）を生成する際に失われる。したがって、フェーズ決定因子として有用であることに加えて、結果として生じる分子は、元の分子配列の実質的な割合を保持し、その結果、結果として生じる分子は任意選択で、デノボ配列決定において有用なコンティグ情報などの配列情報を同時に生成するために、または以前に生成されたコンティグ情報の独立した検証として、使用される。

いくつかの結果として生じる分子のライブラリーの別の特徴は、切断接合部が結果として生じる分子の集団の複数のメンバーには共通しないことである。すなわち、同じ出発核酸分子の異なるコピーは、接合部および再編成の異なるパターンで終わることができる。ランダム切断接合部は、非特異的切断分子を用いて、または制限エンドヌクレアーゼ選択もしくは消化パラメーターの変化を通して、生成することができる。

分子特異的な切断部位を有することの結果は、場合によっては、切断オリゴヌクレオチドが任意選択で、悪影響を及ぼさないように「切断分子」の再シャッフリングおよび再ライゲーションをもたらすプロセスから除外されることである。３つ以上の再シャッフリングされた分子のセグメントをアラインメントさせることによって、切断部位がライブラリーの他のメンバーの大部分にそれらが存在しないことによって容易に同定されることが観察される。すなわち、３つ以上の再シャッフリングされた分子が局所的にアラインメントされている場合、セグメントはすべての分子に共通であることをわかるが、セグメントのエッジは分子間で異なり得る。セグメントの局所的配列類似性がどこで終わるかに注目することにより、「非切断（ｕｎｐｕｎｃｔｕａｔｅｄ）」再編成核酸分子中の切断接合部をマッピングすることができる。

得られた核酸分子（例えば、図３１を参照）は、例えば、ロングリードシーケンサーで配列決定することができる。得られた配列リードは、元の入力分子由来の核酸配列と、それらが使用される場合には、切断オリゴの配列との間で交互するセグメントを含有する。これらのリードは、切断オリゴヌクレオチド配列を使用して各リードからの配列データを分割するためにコンピュータによって処理されることができ、またはそうでなければ、接合部を同定するために処理される。各リード内の配列セグメントは、単一の入力高分子量ＤＮＡ分子からのセグメントであり得る。元の核酸分子は、染色体などのゲノム配列またはその画分を含むことができる。セグメントリードのセットは、元の核酸分子において不連続であり得るが、ロングレンジのハプロタイプフェージングされたデータを明らかにする。これらのデータは、デノボゲノムアセンブリに、および入力ゲノム中のフェージングヘテロ接合位置のフェージングのために、使用することができる。接合部間の配列は、供給源核酸試料中の連続する核酸配列を示し、接合部を横切る配列は、核酸試料中で同相であるが、配列された足場では隣接セグメントから遠く離れて得る核酸セグメントを示している。

接合部は、様々なアプローチによって同定することができる。切断オリゴが使用される場合、接合部は、切断オリゴ配列を含有するリードにおいて同定され得る。代替的に、接合部は、以前に生成されたコンティグ配列データセット、または独立して誘導された接合部を有する第２の独立して生成されたＤＮＡ鎖分子などの核酸分子の第２の配列供給源（および、好ましくは、第３の配列供給源）との比較によって、同定することができる。配列がアラインメントされると、例えば、特定の位置へのアラインメントの質または信頼度は、１つのセグメントがどこで終了し、別のセグメントがどこで終わり、別のセグメントがどこで始まるかを示すことができる。切断をもたらすために制限酵素が使用される場合、制限酵素認識部位を含む配列は、潜在的に接合部を含むと評価され得る。いくつかの制限酵素認識部位は、酵素によって物理的にアクセス可能ではない場合があるため、すべての制限酵素認識部位が接合部を含むわけではなく、一方で、例えば、核酸は支持体に結合していたことに留意されたい。統計情報は、接合部を同定する際にも採用することができ、例えば、接合部間の長さセグメントは、特定の平均値であると予測されるか、または特定の分布に従うと予測され得る。

本明細書における操作の利点は、分子の非隣接領域を近接させながら分子フェージング情報を保存することができ、そうすることで、分子の非隣接領域が、ロングリードなどの単一のリードにおける配列決定に適した距離で単一の核酸分子中に含まれることである。したがって、出発試料において単一のロングリード操作の距離（例えば、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、またはそれ以上）よりも大きく離れている領域は、それらがロングレンジ配列決定反応の単一のリードによってカバーされる距離内にあるように、局所的に近接する。したがって、元の試料中の単一のリードのための配列決定技術の距離を超えて分離される領域は、フェーズ保存され、再編成された分子中の単一の反応において読み取られる。

得られた再構成された分子を配列決定することができ、それらの配列情報を、独立してもしくは同時に生成された配列リードもしくはコンティグ情報に、または既知の参照ゲノム配列（例えば、ヒトゲノムの既知の配列）にマッピングすることができる。得られた再編成された分子リード上で隣接するセグメントは相同性であると推定される。したがって、これらのセグメントが異種のコンティグまたはロングレンジ配列リードにマッピングされる場合、リードは、配列アセンブリにおける共通分子の共通フェーズに割り当てられる。

代替的に、複数の独立して生成された、結果として生じる再編成された分子が同時に配列決定される場合、フェージングされた試料データは任意選択でこれらの分子のみから生成され、そうすることで接合部によって分離されるセグメント配列が相同性であると推測される一方で、接合部によって分離されない配列が、試料自体において連続する核酸のストレッチを表し、例えば、デノボ配列決定に有用であり、かつフェーズ決定に有用であると推測される。しかしながら、付加的または代替的に、同時に配列決定された複数の独立して生成された結果として生じる再編成された分子は、独立して生成された足場またはコンティグ情報と依然として比較され得る。

本明細書に提示される方法および組成物は、特に、配列決定技術におけるリードの長さ（例えば、１０ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、５００ｋｂ、またはそれ以上）よりも長い距離だけ分離された分子セグメントに関して、ロングレンジフェージング情報を保存することができるが、セグメントが単一のリードによってカバーされるのに十分なほど隣接しているかまたは近接している再編成されたまたはしばしば「切断された」分子におけるそのような非隣接セグメントを提供する。

いくつかの例では、結果として生じる再編成された分子は、配列決定のために天然の分子と組み合わされる。天然の分子は、使用される場合、切断配列の欠如によって情報的に認識および利用することができる。天然の分子は、短いまたはロングリード技術を使用して配列決定され、それらのアセンブリは、再編成された分子またはライブラリーの配列決定を通して生成されるフェージング情報およびセグメント配列情報によって誘導される。

切断オリゴヌクレオチド
場合によっては、切断オリゴヌクレオチドは、露出した切断末端を結合する際に使用され得る。切断オリゴヌクレオチドは、フェーズを保存する再編成をしている試料分子の２つの切断された内部末端をクロスリンクするように、標的ポリヌクレオチドに結合され得る任意のオリゴヌクレオチドを含んでいる。切断オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログ、非カノニカルヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含み得る。多くの例において、二本鎖切断オリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイズされた２つの別個のオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチド二重鎖」とも称される）を含み、ハイブリダイゼーションは、１つ以上の平滑末端、１つ以上の３’オーバーハング、１つ以上の５’オーバーハング、ミスマッチおよび／または非対合のヌクレオチドから結果として生じる１つ以上のバルジ、またはこれらの任意の組み合わせを残し得る。いくつかの例において、異なる切断オリゴヌクレオチドは、連続的な反応においてまたは同時に、ポリヌクレオチドを標的とするために結合される。例えば、第１および第２の切断オリゴヌクレオチドが同じ反応に加えられ得る。代替的に、切断オリゴの集団は場合によっては均一である。

切断オリゴヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドと組み合わせる前に操作することができる。例えば、末端リン酸塩が除去され得る。そのような修飾は、試料分子の切断された内部末端ではなく、互いに対する切断オリゴの位置を排除する。

切断オリゴヌクレオチドは、様々な配列要素のうち１つ以上を含んでおり、限定されないが、配列またはその補体をアニーリングする１つ以上の増幅プライマー、配列またはその補体をアニーリングする１つ以上の配列決定プライマー、１つ以上のバーコード配列、多くの異なる切断オリゴヌクレオチドまたは異なる切断オリゴヌクレオチドのサブセットで共有される１つ以上の共通配列、１つ以上の制限酵素認識部位、１つ以上の標的ポリヌクレオチドオーバーハングに相補的な１つ以上のオーバーハング、１つ以上のプローブ結合部位、１つ以上のランダムまたはほぼランダムな配列、およびそれらの組み合わせを含む。いくつかの例において、２つ以上の配列要素は、互いに隣接しておらず（例えば、１つ以上のヌクレオチドにより分離される）、または、部分的もしくは完全に重なって互いに隣接している。例えば、配列をアニーリングする増幅プライマーは、配列をアニーリングする配列決定プライマーとしても役立つ。特定の例において、配列要素は、３’末端またはその付近に、５’末端またはその付近に、あるいは切断オリゴヌクレオチドの内部に位置付けられる。

代替的な実施形態において、切断オリゴは、配列決定反応において占められる配列情報の量を最小化するように二本鎖分子の完全性を維持するための塩基の最小の補体を含むか、または、切断オリゴはライゲーションのための最適な数の塩基を含むか、または切断オリゴの長さは恣意的に決定される。

いくつかの実施形態において、切断オリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的ポリヌクレオチドに相補的である、５’オーバーハング、３’オーバーハング、またはその両方を含む。特定の例において、相補的なオーバーハングは、１以上のヌクレオチド長であり、限定されないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のヌクレオチド長を含む。例えば、相補的なオーバーハングは、約１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、切断オリゴヌクレオチドのオーバーハングは、制限エンドヌクレアーゼ消化または他のＤＮＡ切断方法によって生成された標的ポリヌクレオチドのオーバーハングに相補的である。

切断オリゴヌクレオチドは、それらが構成される１つ以上の配列要素を収容するのに少なくとも十分な任意の適切な長さを有することができる。いくつかの実施形態において、切断オリゴヌクレオチドは、約４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００、もしくはそれ以上のヌクレオチド長、約４未満、５未満、６未満、７未満、８未満、９未満、１０未満、１５未満、２０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満、５０未満、５５未満、６０未満、６５未満、７０未満、７５未満、８０未満、９０未満、１００未満、２００未満、もしくはそれ以上のヌクレオチド長、または、約４超、５超、６超、７超、８超、９超、１０超、１５超、２０超、２５超、３０超、３５超、４０超、４５超、５０超、５５超、６０超、６５超、７０超、７５超、８０超、９０超、１００超、２００超、もしくはそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの例において、切断オリゴヌクレオチドは、５～１５ヌクレオチド長である。さらなる例において、切断オリゴヌクレオチドは約２０～約４０ヌクレオチドである。

好ましくは、切断オリゴヌクレオチドは、例えば、５’リン酸の切除（アルカリンホスファターゼ処理を介して、またはそのような部分がない状態で合成により新規に）によって修飾され、その結果、多量体を形成するために互いにライゲーションしない。３’ＯＨ（ヒドロキシル）部分は、切断された核酸上で５’リン酸にライゲーションすることができ、それにより第１または第２の核酸セグメントに対するライゲーションを支持する。

アダプターオリゴヌクレオチド
アダプターは、標的ポリヌクレオチドに結合され得る配列を有する任意のオリゴヌクレオチドを含む。様々な例において、アダプターオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログ、非カノニカルヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの例において、アダプターオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、または部分的に二重である。一般に、部分的に二重のアダプターオリゴヌクレオチドは、１つ以上の一本鎖領域および１つ以上の二本鎖領域を含む。二本鎖アダプターオリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイズされた２つの別個のオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチド二重鎖」とも称される）を含み、ハイブリダイゼーションは、１つ以上の平滑末端、１つ以上の３’オーバーハング、１つ以上の５’オーバーハング、ミスマッチおよび／または非対合のヌクレオチドから結果として生じる１つ以上のバルジ、またはこれらの任意の組み合わせを残し得る。いくつかの実施形態において、一本鎖アダプターオリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイズすることができる２つ以上の配列を含む。２つのそのようなハイブリダイズ可能な配列が一本鎖アダプターに含まれていると、ハイブリダイゼーションはヘアピン構造（ヘアピンアダプター）を産生する。アダプターオリゴヌクレオチドの２つのハイブリダイズされた領域がハイブリダイズされていない領域によって互いに分離されと、「バブル」構造が結果として生じる。バブル構造を含むアダプターオリゴヌクレオチドは、内部のハイブリダイゼーションを含む単一のアダプターオリゴヌクレオチドからなるか、または互いにハイブリダイズされた２つ以上のアダプターオリゴヌクレオチドを含む。アダプターオリゴヌクレオチドにおける２つのハイブリダイズ可能な配列間などでの内部配列ハイブリダイゼーションは、いくつかの例において、一本鎖アダプターオリゴヌクレオチド中に二本鎖構造を生成する。いくつかの例において、異なる種類のアダプターオリゴヌクレオチドは、異なる配列のヘアピンアダプターおよび二本鎖アダプターなどの組み合わせで使用される。特定の場合では、ヘアピンアダプター中のハイブリダイズ可能な配列は、オリゴヌクレオチドの末端の一方または両方を含んでいる。いずれの末端もハイブリダイズ可能な配列に含まれていない場合、両方の末端は「遊離（ｆｒｅｅ）」または「オーバーハング」である。一方の末端のみがアダプター中で別の配列にハイブリダイズ可能である場合、他の末端は３’オーバーハングまたは５’オーバーハングなどのオーバーハングを形成する。５’－末端ヌクレオチドおよび３’－末端ヌクレオチドの両方がハイブリダイズ可能な配列に含まれ、それにより５’－末端ヌクレオチドおよび３’－末端ヌクレオチドが相補的でかつ互いにハイブリダイズ可能となる場合、末端は「平滑」と称される。場合によっては、異なるアダプターオリゴヌクレオチドは、連続的な反応においてまたは同時に、ポリヌクレオチドを標的とするために結合される。例えば、第１および第２のアダプターオリゴヌクレオチドは同じ反応に加えられる。いくつかの例において、アダプターオリゴヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドと組み合わせる前に操作される。例えば、末端リン酸が付加または除去され得る。

アダプターオリゴヌクレオチドは、様々な配列要素のうちの１つ以上を含み、限定されないが、配列またはその補体をアニーリングする１つ以上の増幅プライマー、配列またはその補体をアニーリングする１つ以上の配列決定プライマー、１つ以上のバーコード配列、多数の異なるアダプターまたは異なるアダプターのサブセットで共有される１つ以上の共通配列、１つ以上の制限酵素認識部位、１つ以上の標的ポリヌクレオチドオーバーハングに相補的な１つ以上のオーバーハング、１つ以上のプローブ結合部位（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．により開発されたものなど、大規模並列配列決定のためのフローセルなどの配列決定プラットフォームへの結合のためのもの）、１つ以上のランダムまたはほぼランダムな配列（例えば、１つ以上の位置で２つ以上の異なるヌクレオチドのセットからランダムに選択された１つ以上のヌクレオチドであり、異なるヌクレオチドの各々はランダム配列を含むアダプターのプールの中で表わされる１つ以上の位置で選択される）、およびこれらの組み合わせを含む。多くの例において、２つ以上の配列要素は、互いに隣接しておらず（例えば、１つ以上のヌクレオチドにより分離される）、または、部分的もしくは完全に重なって互いに隣接し得る。例えば、配列をアニーリングする増幅プライマーは、配列をアニーリングする配列決定プライマーとしても役立つ。配列要素は、３’末端もしくはその付近に、５’末端もしくはその付近に、またはアダプターオリゴヌクレオチドの内部に位置する。アダプターオリゴヌクレオチドがヘアピンなどの二次構造を形成することができる場合、配列要素は、二次構造の外部に部分的もしくは完全に、二次構造の内部に部分的もしくは完全に、または二次構造に関与する配列間に位置することができる。例えば、アダプターオリゴヌクレオチドがヘアピン構造を含む場合、配列要素は、ハイブリダイズ可能な配列（「ループ」）間の配列中を含む、ハイブリダイズ可能な配列（「ステム」）の内部または外部に部分的または完全に位置することができる。いくつかの実施形態において、異なるバーコード配列を有する複数の第１のアダプターオリゴヌクレオチドにおける第１のアダプターオリゴヌクレオチドは、複数におけるすべての第１のアダプターオリゴヌクレオチド中で共通の配列要素を含む。いくつかの実施形態において、すべての第２のアダプターオリゴヌクレオチドは、第１のアダプターオリゴヌクレオチドにより共有される共通配列要素とは異なる、すべての第２のアダプターオリゴヌクレオチドに共通の配列要素を含む。配列要素の差異は、異なるアダプターの少なくとも一部が、例えば、配列長の変化、１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入、または１つ以上のヌクレオチド位置でのヌクレオチド組成の変化（塩基の変化または塩基の修飾など）が原因で完全にはアラインメントしないようなものであり得る。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、１つ以上の標的ポリヌクレオチドに相補的である、５’オーバーハング、３’オーバーハング、またはその両方を含む。相補的なオーバーハングは、１以上のヌクレオチド長であり、限定されないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のヌクレオチド長を含む。例えば、相補的なオーバーハングは、約１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド長であり得る。相補的なオーバーハングは固定化された配列を含み得る。相補的なオーバーハングは、１つ以上のヌクレオチドのランダム配列を付加的または代替的に含んでもよく、その結果、１つ以上のヌクレオチドが１つ以上の位置で２つ以上の異なるヌクレオチドのセットからランダムに選択され、異なるヌクレオチドの各々は、ランダム配列を含む相補的なオーバーハングを有するアダプターオリゴヌクレオチドのプールで表わされる１つ以上の位置で選択される。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドのオーバーハングは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成された標的ポリヌクレオチドのオーバーハングに相補的である。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドのオーバーハングはアデニンまたはチミンからなる。

アダプターオリゴヌクレオチドは、それらが構成される１つ以上の配列要素を収容するのに少なくとも十分な任意の適切な長さを有することができる。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、約４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００、もしくはそれ以上のヌクレオチド長、約４未満、５未満、６未満、７未満、８未満、９未満、１０未満、１５未満、２０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満、５０未満、５５未満、６０未満、６５未満、７０未満、７５未満、８０未満、９０未満、１００未満、２００未満、もしくはそれ以上のヌクレオチド長、または、約４超、５超、６超、７超、８超、９超、１０超、１５超、２０超、２５超、３０超、３５超、４０超、４５超、５０超、５５超、６０超、６５超、７０超、７５超、８０超、９０超、１００超、２００超、もしくはそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの例において、アダプターオリゴヌクレオチドは、５～１５ヌクレオチド長である。さらなる例において、アダプターオリゴヌクレオチドは約２０～約４０ヌクレオチド長である。

好ましくは、アダプターオリゴヌクレオチドは、例えば、５’リン酸の切除（アルカリンホスファターゼ処理を介して、またはそのような部分がない状態で合成により新規に）によって修飾され、その結果、多量体を形成するために互いにライゲーションしない。３’ＯＨ（ヒドロキシル）部分は、切断された核酸上で５’リン酸にライゲーションすることができ、それにより第１または第２の核酸セグメントに対するライゲーションを支持する。

核酸試料のフェージング情報の判定
核酸試料のフェージング情報を判定するために、核酸は、例えば、本明細書で議論される抽出方法によって最初に獲得される。多くの場合、核酸はその後、核酸分子の切断の後にフェージング情報を維持するように固体表面に結合される。好ましくは、核酸分子は、再構成クロマチンを生成するために核酸結合タンパク質と共にインビトロで組み立てられるが、他の適切な固体表面は、核酸結合タンパク質凝集体、ナノ粒子、核酸結合ビーズ、または、核酸結合物質、ポリマー、合成核酸結合分子、あるいは他の固体またはほぼ固体の親和性分子で被覆されたビーズを含む。核酸試料は、天然のクロマチンの場合など固体表面にすでに結合された状態で得ることができる。天然のクロマチンは、ホルマリン固定／パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されたまたは同様に維持された試料の形態などですでに固定されている状態で得ることができる。

核酸結合部分への結合の後、結合された核酸分子は切断され得る。切断は、任意の数の酵素方法および非酵素方法を含む、任意の適切な核酸切断実体で実行される。好ましくは、ＤＮＡ切断は、制限エンドヌクレアーゼ、フラグメンターゼ（ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ）、またはトランスポザーゼで実行される。代替的または付加的に、核酸切断は、他の制限酵素、トポイソメラーゼ、非特異的エンドヌクレアーゼ、核酸修復酵素、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、または代替的な酵素で達成される。機械的手段（例えば、超音波処理、せん断）、熱的手段（例えば、温度変化）、または電磁的手段（例えば、ＵＶ照射などの照射）を含む物理的手段も、切断をもたらすために使用することができる。核酸切断は、使用される切断方法に依存して、「粘着性」オーバーハングまたは平滑末端のいずれかを有する遊離核酸末端を産生する。粘着性オーバーハング末端が生成されると、粘着末端は任意選択で、再ライゲーションを妨げるために部分的にｆｉｌｌ－ｉｎされる。代替的に、オーバーハングは、平滑末端を産生するために完全にｆｉｌｌ－ｉｎされる。

多くの場合、オーバーハング末端は、ｄＮＴＰで部分的にまたは完全にｆｉｌｌ－ｉｎされ、これは任意選択で標識される。そのような場合、ｄＮＴＰは、ビオチン化され、硫酸化され、フルオロフォアに結合され、脱リン酸化され、または他の任意の数のヌクレオチド修飾を受けることができる。ヌクレオチド修飾は、メチル化（例えば、５－ｍＣ、５－ｈｍＣ、５－ｆＣ、５－ｃａＣ、４－ｍＣ、６－ｍＡ、８－ｏｘｏＧ、８－ｏｘｏＡ）などのエピジェネティック修飾を含み得る。標識または修飾は、ナノ細孔配列決定によって検出可能なエピジェネティック修飾などの、配列決定中に検出可能なものから選択することができ、このように、ライゲーション結合の位置は配列決定中に検出することができる。これらの標識または修飾は、結合または濃縮のために標的とされ得、例えば、メチル－シトシンを標的とする抗体は、メチル－シントンでｆｉｌｌ－ｉｎされた平滑末端を捕捉し、標的化し、結合し、または標識するために使用され得る。非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチド、または修飾されたヌクレオチド、および核酸アナログも、平滑末端のｆｉｌｌ－ｉｎの位置を標識するために使用され得る。非カノニカルヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドは、プソイドウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、キサンチン、ヒポキサンチン、プリン、２，６－ジアミノプリン、および６，８－ジアミノプリンを含み得る。核酸アナログは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、およびトレオース核酸（ＴＮＡ）を含み得る。場合によっては、オーバーハングは、ビオチンのないｄＮＴＰなどの、標識されていないｄＮＴＰでｆｉｌｌ－ｉｎされる。場合によっては、トランスポゾンでの切断など、ｆｉｌｌ－ｉｎを必要としない平滑末端が生成される。トランスポザーゼが２つの結合されていない切断オリゴヌクレオチドを挿入場合、このような遊離平滑末端が生成される。しかしながら、切断オリゴヌクレオチドは、要望通りに粘着末端または平滑末端を有するように合成される。ヒストンなどの試料核酸に関連付けられるタンパク質も修飾され得る。例えば、ヒストンは、アセチル化（例えば、リジン残基にて）および／またはメチル化（例えば、リジンとアルギニン残基にて）され得る。

次に、切断された核酸分子が依然として固体表面に結合されている一方、遊離核酸末端は共に連鎖される。連鎖は、場合によっては、ライゲーションを通じて、遊離末端間で、またはオリゴヌクレオチドなどの別個の実体で生じる。場合によっては、オリゴヌクレオチドは切断オリゴヌクレオチドである。そのような場合、切断分子末端は、切断された核酸分子の遊離末端と適合性を有する。多くの場合、切断分子はオリゴヌクレオチドのコンカテマー化（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を防ぐために脱リン酸化される。大半の場合、切断分子は、切断された核酸分子の遊離核酸末端へと各末端でライゲーションされる。多くの場合、このライゲーション工程の結果、切断された核酸分子の再編成がもたらされ、その結果、出発核酸分子において互いに本来隣接していなかった２つの遊離末端はここでペアエンドで結合される。

切断された核酸分子の遊離末端の結合の後、再編成された核酸試料は、任意の数の標準的な酵素方法および非酵素方法を使用して、核酸結合実体から放たれる。例えば、インビトロの再構成クロマチンの場合、再編成された核酸分子は、核酸結合タンパク質を変性または分解することによって放たれる。他の例において、クロスリンキングは脱クロスリンクされる。また他の例において、親和性相互作用は脱クロスリンクまたは遮断される。放たれた核酸分子は、入力核酸分子と比較して再編成される。切断分子が使用される場合、結果として生じる再編成された分子は、再編成された核酸分子の全体にわたって散在する切断オリゴヌクレオチドにより、切断された分子（ｐｕｎｃｔｕａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌｅ）と称される。これらの場合、切断部（ｐｕｎｃｔｕａｔｉｏｎｓ）に隣接する核酸セグメントはペアエンドを構築する。

本明細書に開示される方法の切断および結合の工程中に、核酸分子がこれらのプロセスの全体にわたって固体表面に結合されるため、フェージング情報は維持される。これにより、一塩基変異多型（ＳＮＰ）などの他のマーカーからの情報に依存することなく、フェージング情報の分析が可能とされ得る。本明細書に開示される方法および組成物を使用して、場合によっては、核酸分子内の２つの核酸セグメントは、元々の核酸分子上に存在していたよりも近くにあるように、再編成される。多くの例において、出発核酸試料における２つの核酸セグメントの元々の分離距離は、標準配列決定技術の平均的なリード長よりも大きい。例えば、入力核酸試料内の２つの核酸セグメント間の出発分離距離は、約１０ｋｂ、１２．５ｋｂ、１５ｋｂ、１７．５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、７０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、２００ｋｂ、３００ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、またはそれ以上である。好ましい例において、再編成された２つのＤＮＡセグメント間の分離距離は、標準配列決定技術の平均的なリード長未満である。例えば、再編成されたＤＮＡ分子内の２つの再編成されたＤＮＡセグメントを分離する距離は、約５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２５ｋｂ、２０ｋｂ、１７ｋｂ、１５ｋｂ、１４ｋｂ、１３ｋｂ、１２ｋｂ、１１ｋｂ、１０ｋｂ、９ｋｂ、８ｋｂ、７ｋｂ、６ｋｂ、５ｋｂ未満、またはそれ以下である。好ましい場合、分離距離は、ロングリード配列決定機械の平均的なリード長未満である。これらの場合において、再編成されたＤＮＡ試料が核酸結合部分から放たれ、配列決定されると、フェージング情報が判定され、デノボの配列足場を生成するのに十分な配列情報が生成される。

再編成された核酸分子のバーコード化
いくつかの例において、本明細書に記載される放たれた再編成核酸分子は、配列決定前にさらに処理される。例えば、再編成された核酸分子内に含まれる核酸セグメントは、バーコード化され得る。バーコード化は、配列リードのより容易なグループ化を可能にし得る。例えば、バーコードは、同じ再編成された核酸分子から生じる配列を同定するために使用され得る。バーコードは個々の接合部を固有に同定するためにも使用され得る。例えば、各接合部は、接合部を固有に同定することができる固有の（例えば、ランダムに生成された）バーコードでマークを付けることができる。同じ再編成された核酸分子から生じる配列を同定するための第１のバーコード、および個々の接合部を固有に同定するための第２のバーコードなど、複数のバーコードを共に使用することができる。

バーコード化は多くの技術を介して実現され得る。場合によっては、バーコードは切断オリゴ内の配列として含まれ得る。他の場合、放たれた再編成核酸分子は、少なくとも２つのセグメントを含むオリゴヌクレオチドに接触させることができ、１つのセグメントはバーコードを含み、別のセグメントは切断配列に相補的な配列を含む。切断配列へとアニーリングした後、バーコード化されたオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼで拡張されて、同じ切断された核酸分子からバーコード化された分子を生成する。切断された核酸分子は、フェージング情報が保存されている入力核酸分子の再編成されたバージョンであるため、生成されたバーコード化された分子も同じ入力核酸分子から由来する。これらのバーコード化された分子は、バーコード配列、切断相補的配列、およびゲノム配列を含む。

切断によりまたは切断なしで再編成された核酸分子について、分子は他の手段によってバーコード化され得る。例えば、再編成された核酸分子は、再編成された核酸分子からの配列を組み込むために拡張され得る、バーコード化されたオリゴヌクレオチドに接触され得る。バーコードは、切断配列に、制限酵素認識部位に、関心対象の部位（例えば、ゲノム関心領域）に、またはランダム部位（例えば、バーコードオリゴヌクレオチド上の無作為のｎ量体配列を介して）に、ハイブリダイズすることができる。再編成された核酸分子は、試料中の他の再編成された核酸分子から適切な濃縮および／または分離（例えば、空間的または時間的な分離）を使用してバーコードに接触させることができ、その結果、複数の再編成された核酸分子は与えられず、同じバーコード配列が与えられる。例えば、再編成された核酸分子を含む溶液は、１つの再編成された核酸分子のみが、所定のバーコード配列を伴ってバーコードまたはバーコードの群に接触されるような濃度に希釈され得る。バーコードは、遊離溶液中で、流体パーティション中で（例えば、液滴もしくはウェル）、またはアレイ上で（例えば、特定のアレイスポットにて）、再編成された核酸分子に接触され得る。

バーコード化された核酸分子（例えば、伸長生成物）は、例えば、ショートリード配列決定機械上で配列決定することができ、フェージング情報は、共通のフェーズへの同じバーコードを有する配列のリードのグループ化によって判定される。代替的に、配列決定の前に、バーコード化された生成物は、例えば、ロングリード配列決定技術を使用して配列決定される長い分子を生成するために、例えば、バルクライゲーション（ｂｕｌｋｌｉｇａｔｉｏｎ）を介して共に結合され得る。これらの場合、埋め込まれたリード対は、増幅アダプターおよび切断配列を介して同定可能である。さらに詳しいフェージング情報はリード対のバーコード配列から得られる。

ペアエンドでのフェージング情報の判定
本明細書には、ペアエンドからフェージング情報を判定するための方法および組成物が提供される。ペアエンドは、開示された方法、または提供された実施例にさらに例示されるもののいずれかによって生成され得る。例えば、後に切断される固体表面に結合される核酸分子の場合、遊離末端の再ライゲーションの後、再びライゲーションされた核酸セグメントは、例えば、制限消化によって固相が結合した核酸分子から放たれる。この放出の結果、複数のペアエンドがもたらされる。場合によっては、ペアエンドは増幅アダプターにライゲーションされ、増幅され、および短距離技術で配列決定される。これらの場合、複数の異なる核酸結合部分に結合した核酸分子からのペアエンドは、配列決定された試料内にある。しかしながら、ペアエンドの接合部のいずれかの側について、接合部に隣接する配列は共通の分子の共通のフェーズに由来することが、明確に結論付けられる。ペアエンドが切断オリゴヌクレオチドに結合される場合、配列決定リードにおけるペアエンド接合部は、切断オリゴヌクレオチド配列によって同定される。他の場合、ペアエンドは修飾されたヌクレオチドによって結合され、これは、使用される修飾されたヌクレオチドの配列に基づいて同定され得る。

代替的に、ペアエンドの放出後、フリーのペアエンドは、増幅アダプターにライゲーションされ、増幅され得る。これらの場合、複数のペアエンドはその後、ロングリード配列決定技術を使用して読み取られる長い分子を生成するために、共にバルクライゲーションされる。他の例において、放出されたペアエンドは、増幅工程を介入させることなく互いにバルクライゲーションされる。いずれの場合も、包埋されたリード対は、切断配列または修飾されたヌクレオチドなどの、連鎖配列に隣接している天然のＤＮＡ配列を介して同定可能である。連鎖状のペアエンドは、長い配列デバイス上で読み取られ、複数の接合部のための配列情報が得られる。ペアエンドは複数の異なる核酸結合部分に結合したＤＮＡ分子から由来するため、増幅アダプター配列に隣接するものなどの２つの個々のペアエンドに及ぶ配列は、複数の異なるＤＮＡ分子にマッピングされることがわかる。しかしながら、ペアエンド接合部のいずれかの側について、接合部に隣接する配列は共通の分子の共通のフェーズに由来することが、明確に結論付けられる。例えば、切断された分子に由来するペアエンドの場合、切断配列に隣接する配列は、共通のＤＮＡ分子へと明確に割り当てられる。好ましい場合、本明細書に開示される方法および組成物を使用して個々のペアエンドが連鎖されるため、単一リードにおいて複数のペアエンドを配列決定することができる。

特定の図を参照すると、本明細書で論じるいくつかの実施形態の図が見られる。図２８において、切断された再編成されたフェーズ保存核酸分子を構築するプロセスにおける中間体が見られる。単一の核酸分子は、再構成されたクロマチン複合体などの核酸結合部分に結合され、複合体をクロスリンクするためにホルムアルデヒドと接触させられている。複合体は、核酸分子の内部ループのみがクラスターから突出するように、集合的に再構成クロマチンと呼ばれる核酸結合成分と共にクラスターを形成する単一の核酸出発分子を含む。図２８に示すように、突出ループは、粘着末端を生成するために、制限エンドヌクレアーゼＭｂｏｌを用いて切断される。

代替的な実施形態では、核酸分子は、ＳＰＲＩでコーティングされたビーズまたは他の核酸結合剤でコーティングされたビーズなどのビーズまたは表面に結合される。核酸試料は、ビーズあたり１つの核酸分子のみが結合するような条件下で、または結合した核酸が切断後にクロスライゲーションする可能性が低いような条件下で結合する。さらに、切断は、別の制限エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、タグメンテーション酵素、非特異的エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、またはエンドヌクレアーゼ活性を有する他の薬剤を用いて交互に達成される。

図２９では、図２８の切断された核酸複合体が、オーバーハングの単一の位置をｆｉｌｌ－ｉｎするように、核酸ポリメラーゼおよびｄＧＴＰの単一の集団を使用して処理されることが分かる。ｆｉｌｌ－ｉｎ工程は、複合体の粘着末端が後の工程でクロスアニーリングおよびライゲーションするのを防止する。場合によっては、工程は除外され、複合体は、切断オリゴなしでクロスライゲーションされる。代替的に、平滑末端が生成されるか、または制限エンドヌクレアーゼではなくトランスポザーゼの作用を介してタグメンテーションアダプターが付加される。

図３０は、複合体の露出末端への切断オリゴのアニーリングおよびライゲーション後の図２８および図２９の複合体を示す。切断オリゴは、核酸塩基配列としてではなく、薄い実線として描かれている。切断オリゴは、例えば、５’リン酸基の除去によって、コンカテマー化を排除するように任意選択で修飾される。切断オリゴは任意選択で、図２９で修飾されるように、遊離粘着末端と適合性であるように設計される。他の実施形態では、切断された核酸末端は、切断オリゴを介在させることなく、互いに直接ライゲーションすることができる。

図３１は、プロテイナーゼＫを用いた処理による再構成されたクロマチンからのクロスリンキングおよび遊離の脱クロスリンク後の放出された切断された核酸分子を描いている。最終産物の切断された核酸は、切断オリゴ４０１によって分離されたセグメント４００を含む。セグメントは、元の核酸分子のフェージング情報を保存するが、ランダムに順序付けられ、開始分子に対して配向される。元の核酸分子の配列の実質的にすべてが、切断された分子中に存在するため、切断された分子の配列決定は、デノボコンティグを生成するのに充分な配列情報を生成する。

ロングリード配列決定デバイスを使用して、切断された核酸を配列決定すると、局所的な順序および配向、ならびにフェージング情報が導出される、切断されていないセグメントに対応する配列のストレッチが観察される。切断オリゴ配列にわたる長い配列リードの領域も観察される。切断オリゴのいずれかの側のこれらの配列セグメントは、互いに相同性である（および、切断された分子上の他のセグメントと相同性である）ことが知られているが、正しい順序および配向にある可能性は低い。再編成プロセスの利点は、試料分子上の互いに遠く離れたセグメントが、単一の読み取りにおいて広がるように近接させられることである。別の利点は、デノボコンティグ情報が同時に生成されるように、元の試料分子の配列情報が大部分保存されることである。

核酸
真核生物において、ゲノムＤＮＡは、核内の染色体として構成されるクロマチンに詰められる。クロマチンの基礎的な構造単位は、ヒストン八量体の周囲に包まれるＤＮＡの１４６塩基対（ｂｐ）からなるヌクレオソームである。ヒストン八量体は、コアヒストンＨ２Ａ－Ｈ２Ｂ二量体およびＨ３－Ｈ４二量体の各々の２つのコピーからなる。ヌクレオソームは、共通して「数珠玉構造（ｂｅａｄｓｏｎａｓｔｒｉｎｇ）」と称されるものにおいてＤＮＡに沿って規則的に間隔を空けられる。

ヌクレオソームへのコアヒストンおよびＤＮＡのアセンブリは、シャペロンタンパク質および関連するアセンブリ因子により媒介される。これら因子のほぼすべては、コアヒストン結合タンパク質である。ヌクレオソームアセンブリタンパク質－１（ＮＡＰ－１）などのヒストンシャペロンの一部は、ヒストンＨ３およびＨ４に結合する嗜好性を示す。新しく合成されたヒストンがアセチル化され、その後、クロマチンへのアセンブリ後に脱アセチル化されることも観察された。したがって、ヒストンのアセチル化または脱アセチル化を媒介する因子は、クロマチンアセンブリプロセスにおいて重要な役割を果たす。

一般に、２つのインビトロ方法が、クロマチンを再構成またはアセンブルするために開発されている。１つの方法はＡＴＰに依存しないものであるが、もう一方はＡＴＰに依存するものである。クロマチンを再構成するためのＡＴＰ非依存性の方法は、ヒストンシャペロンとして作用するようにタンパク質様ＮＡＰ－１または塩のいずれかと、ＤＮＡまたはコアヒストンを含んでいる。この方法の結果、細胞中の天然のコアヌクレオソーム粒子を正確に模倣しないＤＮＡ上のヒストンのランダムな配置がもたらされる。これらの粒子は、規則的に順序づけられ、拡張されたヌクレオソームアレイではなく、使用されるＤＮＡ配列が通常は２５０ｂｐよりも長くないため、しばしばモノヌクレオソームと呼ばれる（Ｋｕｎｄｕ，Ｔ．Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ６：５５１－５６１，２０００）。より大きな長さのＤＮＡ配列上の順序づけられたヌクレオソームの拡張アレイを生成するために、ＡＴＰ依存性のプロセスを通じてクロマチンをアセンブルすることができる。

過ヨウ素酸ヌクレオソームアレイのＡＴＰ依存性アセンブリは、天然のクロマチンに見られるものと同様であり、ＤＮＡ配列、コアヒストン粒子、シャペロンタンパク質、およびＡＴＰを利用するクロマチンアセンブリ因子を必要とする。ＡＣＦ（ＡＴＰを利用するクロマチンアセンブリ因子およびリモデリング因子）またはＲＳＦ（リモデリングおよびスペーシングの因子）は、インビトロでクロマチンへのヌクレオソームの拡張され、順序づけられたアレイを生成するために使用される、２つの広く研究されたアセンブリ因子である（Ｆｙｏｄｏｒｏｖ，Ｄ．Ｖ．，ａｎｄＫａｄｏｎａｇａ，Ｊ．Ｔ．ＭｅｔｈｏｄＥｎｚｙｍｏｌ．３７１：４９９－５１５，２００３；Ｋｕｎｄｕ，Ｔ．Ｋ．ｅｔａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ６：５５１－５６１，２０００）。

特定の実施形態において、本開示の方法は、限定されないが、例えば、血漿、血清、および／または尿から単離された遊離ＤＮＡ、細胞および／または組織からのアポトーシスＤＮＡ、（例えば、ＤＮａｓｅＩによって）インビトロで酵素的に断片化されたＤＮＡを含む、断片化された二本鎖ＤＮＡのあらゆる型に容易に適用することができる。

生体試料から得られた核酸は、分析に適切な断片を生成するために断片化することができる。様々な酵素法を使用して、鋳型核酸を所望の長さに断片化してもよい。ＤＮＡはＤＮａｓｅへの簡易な曝露によってランダムにせん断され得る。ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ、熱とマグネシウムへの簡単な曝露、またはせん断によって、断片化され得る。ＲＮＡはｃＤＮＡへ変換され得る。フラグメンテーションが利用される場合、ＲＮＡはフラグメンテーションの前または後に、ｃＤＮＡへ変換されてもよい。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または、一本鎖領域を含む二本鎖（例えば、ステム構造とループ構造）でもよい。

いくつかの実施形態では、クロスリンクしたＤＮＡ分子は、サイズ選択工程に供され得る。核酸のサイズ選択は、特定のサイズ未満または特定のサイズを超えるクロスリンクしたＤＮＡ分子に対して行われ得る。サイズ選択は、クロスリンクの頻度および／またはフラグメンテーション方法によって、さらに影響され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、約１４５ｂｐ～約６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約６００～約２５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐの範囲、またはこれらの値のいずれかに囲まれる任意の範囲（例えば、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐ）のＤＮＡ分子をクロスリンクすることを含んで、調製され得る。

いくつかの実施形態において、試料のポリヌクレオチドは、１を超える特定の大きさの範囲の断片化ＤＮＡ分子の集団へと断片化される。いくつかの実施形態において、断片は、少なくとも約１、約２、約５、約１０、約２０、約５０、約１００、約２００、約５００、約１０００、約２０００、約５０００、約１０，０００、約２０，０００、約５０，０００、約１００，０００、約２００，０００、約５００，０００、約１，０００，０００、約２，０００，０００、約５，０００，０００、約１０，０００，０００、またはそれ以上のゲノム当量の出発ＤＮＡから生成され得る。フラグメンテーションはＤＮａｓｅ処理によって達成され得る。いくつかの実施形態において、断片は、平均の長さが約１０～約１０，０００、約２０，０００、約３０，０００、約４０，０００、約５０，０００、約６０，０００、約７０，０００、約８０，０００、約９０，０００、約１００，０００、約１５０，０００、約２００，０００、約３００，０００、約４００，０００、約５００，０００、約６００，０００、約７００，０００、約８００，０００、約９００，０００、約１，０００，０００、約２，０００，０００、約５，０００，０００、約１０，０００，０００、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、断片は、平均の長さが約１４５ｂｐ～約６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約６００～約２５００ｂｐ、約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐ、またはこれらの値のいずれかに囲まれる任意の範囲（例えば、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐ）である。いくつかの実施形態では、断片は、平均の長さが約２５００ｂｐ未満、約１２００ｂｐ未満、約１０００ｂｐ未満、約８００ｂｐ未満、約６００ｂｐ未満、約３５０ｂｐ未満、または約２００ｂｐ未満である。他の実施形態では、断片は、平均の長さが約１００ｂｐ超、約３５０ｂｐ超、約６００ｂｐ超、約８００ｂｐ超、約１０００ｂｐ超、約１２００ｂｐ超、または約２０００ｂｐ超である。ＤＮａｓｅの非限定的な例としては、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、小球菌ヌクレアーゼ、それらのバリアント、およびそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、ＤＮａｓｅＩによる消化は、Ｍｇ＋＋がない状態およびＭｎ＋＋がある状態で、ＤＮＡ中のランダムな二本鎖切断を誘導することができる。フラグメンテーションは、５’オーバーハング、３’オーバーハング、平滑末端、またはそれらの組み合わせを有する断片を生成することができる。いくつかの実施形態において、前記方法は、アガロースゲルからのカラム精製または単離などの標準的な方法を介して、断片のサイズを選択する工程を含む。

標的化されたヌクレアーゼ酵素
本明細書で提供される断片化ＤＮＡは、任意の数のヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）またはＤＮａｓｅｓ（例えば、ＭＮａｓｅ）によるインサイチュ消化などの消化によって作製または生成することができる。場合によっては、酵素を組み合わせて使用することで、所望の消化またはフラグメンテーションを達成することができる。様々な場合において、ヌクレアーゼ（またはそのドメインもしくは断片）は、１つ以上の抗体を使用して、特定のゲノム部位に標的化され得る。例えば、クロスリンクした試料は、ヒストン結合部位、転写因子結合部位、またはメチル化ＤＮＡ部位などのＤＮＡの特定の領域に結合する抗体と接触させることができる。その後、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、またはプロテインＬなどの免疫グロブリン結合タンパク質またはその断片に結合または融合したヌクレアーゼを試料に加えることができ、ヌクレアーゼは、抗体が結合した領域においてのみＤＮＡを消化することができる。これは、例えば、所望の消化パターンを達成するために、第１の抗体がＤＮＡ試料に結合され、次いでヌクレアーゼが第１の抗体に標的化され、次いで第２の抗体がＤＮＡ試料に結合され、ヌクレアーゼが第２の抗体に標的化されるなど、組み合わせて行われ得る。

ライゲーション
いくつかの実施形態において、断片化ＤＮＡの５’末端および／または３’末端のエンドヌクレオチド配列は、ライゲーション前に修飾されない。例えば、予測可能な平滑末端を残す酵素による切断を行い、その後、平滑末端化されたＤＮＡ断片の、核酸、例えば、平滑末端を含むアダプター、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドへのライゲーションが行われ得る。いくつかの実施形態において、断片化ＤＮＡ分子は、アダプターに結合される前に平滑末端を有するＤＮＡ断片を生成するために、平滑末端の平滑化（ｂｌｕｎｔ－ｅｎｄｐｏｌｉｓｈｅｄ）（または「末端修復される」）。平滑末端の平滑化の工程は、例えば、Ｔ４ポリメラーゼについて、３’～５’のエキソヌクレアーゼ活性および５’～３’のポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼなどの適切な酵素でのインキュベーションにより達成され得る。いくつかの実施形態において、末端修復の後に、オーバーハングを生成するために、１以上のアデニン、１以上のチミン、１以上のグアニン、または１以上のシトシンなどの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のヌクレオチドの付加が続いて行われ得る。例えば、末端修復の後に、１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドの付加が続いて行われ得る。オーバーハングを有するＤＮＡ断片は、ライゲーション反応などにおいて、相補的なオーバーハングを有するオリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドなどの１つ以上の核酸に結合され得る。例えば、単一のアデニンは、鋳型の独立したポリメラーゼを使用して末端修復されたＤＮＡ断片の３’末端に付加され、その後に、３’末端で各々がチミンを有する１つ以上のアダプターへのライゲーションが行われ得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなどの核酸は、１以上のヌクレオチドでの３’末端の伸長、その後の５’リン酸化により修飾された平滑末端の二本鎖ＤＮＡ分子に結合され得る。場合によっては、３’末端の伸長は、マグネシウムを含有することができる適切な緩衝液中の１以上のｄＮＴＰの存在下で、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼもしくは本明細書で提供される適切なポリメラーゼのいずれかなどのポリメラーゼにより、または、末端のデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼの使用により、実行され得る。いくつかの実施形態において、平滑末端を有する標的ポリヌクレオチドは、平滑末端を含む１以上のアダプターに結合される。ＤＮＡ断片分子の５’末端のリン酸化は、例えば、ＡＴＰおよびマグネシウムを含有する適切な緩衝液においてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより実行され得る。断片化ＤＮＡ分子は任意選択で、例えば、ホスファターゼなどの酵素の使用により、５’末端または３’末端を脱リン酸化するために処理され得る。

本明細書で使用されるような「結合する（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇおよびｊｏｉｎｉｎｇ）」、および「ライゲーション」は、アダプターオリゴヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドなどの２つのポリヌクレオチドに関して、隣接する骨格を有する単一のより大きなポリヌクレオチドを生成するための、２つの別個のＤＮＡセグメントの共有結合を指す。２つのＤＮＡセグメントを結合する方法は、限定されないが、酵素的および非酵素的（例えば、化学的）な方法を含む。非酵素的であるライゲーション反応の例は、引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７８０，６１３号と第５，４７６，９３０号に記載される非酵素的ライゲーション技術を含む。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、リガーゼ、例えば、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼによって標的ポリヌクレオチドに結合される。各々が特徴化された反応条件を有する複数のリガーゼは、限定されないが、ｔＲＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、好熱菌ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、ＴｔｈＤＮＡリガーゼ、サームス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）ＤＮＡリガーゼ（ＩおよびＩＩ）、熱安定リガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ熱安定ＤＮＡリガーゼ、ＶａｎＣ型リガーゼ、９°ＮＤＮＡリガーゼ、ＴｓｐＤＮＡリガーゼ、およびバイオプロスペクティングにより発見された新しいリガーゼを含む、ＮＡＤ＋依存性リガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、ＰｆｕＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ１、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、およびバイオプロスペクティングにより発見された新しいリガーゼを含む、ＡＴＰ依存性リガーゼ、ならびに、それらの野生型、突然変異体アイソフォーム、および遺伝的に操作されたバリアントを含む。

ライゲーションは、相補的なオーバーハングなどのハイブリダイズ可能な配列を有するＤＮＡセグメント間で行われ得る。ライゲーションは２つの平滑末端間でも行われ得る。通常、５’リン酸塩がライゲーション反応に利用される。５’リン酸塩は標的ポリヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチドまたは両方によって提供され得る。５’リン酸塩は、必要に応じて、結合されるＤＮＡセグメントに付加され得、または上記ＤＮＡセグメントから除去され得る。５’リン酸塩の付加または除去のための方法は、限定されないが、酵素学的および化学的なプロセスを含む。５’リン酸塩の付加および／または除去に役立つ酵素は、キナーゼ、ホスファターゼ、およびポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態において、ライゲーション反応（例えば、アダプター末端および標的ポリヌクレオチド末端）における結合された２つの末端の両方とも、２つの末端を結合する際に２つの共有結合が作られるように、５’リン酸塩を提供する。いくつかの実施形態において、ライゲーション反応（例えば、アダプター末端および標的ポリヌクレオチド末端）における結合された２つの末端の１つのみが、２つの末端を結合する際に１つの共有結合のみが作られるように、５’リン酸塩を提供する。

いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドの一本鎖または両鎖での一鎖のみが、アダプターオリゴヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドの１つの末端または両方の末端における両鎖は、アダプターオリゴヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、３’リン酸塩はライゲーションの前に除去される。いくつかの実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの両方の末端に付加され、各末端の１つまたは両方の鎖が、１つ以上のアダプターオリゴヌクレオチドに結合されている。両方の末端の両方の鎖がアダプターオリゴヌクレオチドに結合されている場合、結合の後に、対応する３’末端の伸長のための鋳型としての役割を果たすことができる５’末端オーバーハングを残す切断反応が起き、その３’末端はアダプターオリゴヌクレオチドに由来する１つ以上のヌクレオチドを含むこともあれば、含まないこともある。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、１つの末端で第１のアダプターオリゴヌクレオチドに、もう１つの末端で第２のアダプターオリゴヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドの２つの末端は、単一のアダプターオリゴヌクレオチドの対向末端に結合される。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドおよびそれが結合されるアダプターオリゴヌクレオチドは、平滑末端を含む。いくつかの実施形態において、別個のライゲーション反応は、少なくとも１つのバーコード配列を含む異なる第１のアダプターオリゴヌクレオチドを使用して各試料について実行され得、その結果、いかなるバーコード配列も１を超える試料の標的ポリヌクレオチドには結合されない。ＤＮＡセグメント、またはそれに結合したアダプターオリゴヌクレオチドを有する標的ポリヌクレオチドは、結合されたアダプターにより「タグ付けされた」と考慮される。

場合によっては、ライゲーション反応は、約０．１ｎｇ／μＬ、約０．２ｎｇ／μＬ、約０．３ｎｇ／μＬ、約０．４ｎｇ／μＬ、約０．５ｎｇ／μＬ、約０．６ｎｇ／μＬ、約０．７ｎｇ／μＬ、約０．８ｎｇ／μＬ、約０．９ｎｇ／μＬ、約１．０ｎｇ／μＬ、約１．２ｎｇ／μＬ、約１．４ｎｇ／μＬ、約１．６ｎｇ／μＬ、約１．８ｎｇ／μＬ、約２．０ｎｇ／μＬ、約２．５ｎｇ／μＬ、約３．０ｎｇ／μＬ、約３．５ｎｇ／μＬ、約４．０ｎｇ／μＬ、約４．５ｎｇ／μＬ、約５．０ｎｇ／μＬ、約６．０ｎｇ／μＬ、約７．０ｎｇ／μＬ、約８．０ｎｇ／μＬ、約９．０ｎｇ／μＬ、約１０ｎｇ／μＬ、約１５ｎｇ／μＬ、約２０ｎｇ／μＬ、約３０ｎｇ／μＬ、約４０ｎｇ／μＬ、約５０ｎｇ／μＬ、約６０ｎｇ／μＬ、約７０ｎｇ／μＬ、約８０ｎｇ／μＬ、約９０ｎｇ／μＬ、約１００ｎｇ／μＬ、約１５０ｎｇ／μＬ、約２００ｎｇ／μＬ、約３００ｎｇ／μＬ、約４００ｎｇ／μＬ、約５００ｎｇ／μＬ、約６００ｎｇ／μＬ、約８００ｎｇ／μＬ、または約１０００ｎｇ／μＬのＤＮＡセグメントまたは標的のポリヌクレオチドの濃度で実行され得る。例えば、ライゲーションは、約１００ｎｇ／μＬ、約１５０ｎｇ／μＬ、約２００ｎｇ／μＬ、約３００ｎｇ／μＬ、約４００ｎｇ／μＬ、または約５００ｎｇ／μＬのＤＮＡセグメントまたは標的ポリヌクレオチドの濃度で実行され得る。

場合によっては、ライゲーション反応は、約０．１～１０００ｎｇ／μＬ、約１～１０００ｎｇ／μＬ、約１～８００ｎｇ／μＬ、約１０～８００ｎｇ／μＬ、約１０～６００ｎｇ／μＬ、約１００～６００ｎｇ／μＬ、または約１００～５００ｎｇ／μＬのＤＮＡセグメントまたは標的ポリヌクレオチドの濃度で実行され得る。

場合によっては、ライゲーション反応は、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分、約９０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、または約９６時間よりも長い間、実行され得る。他の場合、ライゲーション反応は、約５分未満、約１０分未満、約２０分未満、約３０分未満、４０分未満、約５０分未満、約６０分未満、約９０分未満、約２時間未満、約３時間未満、約４時間未満、約５時間未満、約６時間未満、約８時間未満、約１０時間未満、約１２時間未満、約１８時間未満、約２４時間未満、約３６時間未満、約４８時間未満、または約９６時間未満にわたり実行され得る。例えば、ライゲーション反応は約３０分～約９０分の間、実行され得る。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドに対するアダプターの結合は、アダプター由来のヌクレオチド配列を含む３’オーバーハングを有する結合された産物のポリヌクレオチドを産生する。

いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドに少なくとも１つのアダプターオリゴヌクレオチドを結合した後、１つ以上の標的ポリヌクレオチドの３’末端は、鋳型として１つ以上の結合されたアダプターオリゴヌクレオチドを使用して伸長される。例えば、標的ポリヌクレオチドの５’末端のみに結合される２つのハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを含むアダプターは、鋳型としてアダプターの結合された鎖を使用して、標的の結合されていない３’末端の伸長を可能にし、それと同時にまたはその後に、結合されていない鎖の変位を可能にする。２つのハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを含むアダプターの両方の鎖は、標的ポリヌクレオチドに結合され得、結合された産物は５’オーバーハングを有し、相補的な３’末端は鋳型として５’オーバーハングを使用することで伸長され得る。さらなる例として、ヘアピンアダプターオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの５’末端に結合され得る。いくつかの実施形態において、伸長される標的ポリヌクレオチドの３’末端は、アダプターオリゴヌクレオチドからの１つ以上のヌクレオチドを含む。アダプターが両方の末端で結合される標的ポリヌクレオチドについて、伸長は、５’オーバーハングを有する二本鎖標的ポリヌクレオチドの３’末端の両方に対し行われ得る。この３’末端の伸長、または「ｆｉｌｌ－ｉｎ」反応は、鋳型へハイブリダイズされるアダプターオリゴヌクレオチドの鋳型に、相補的な配列または「補体」を生成し、それにより、二本鎖配列領域を生成するために５’オーバーハングをｆｉｌｌ－ｉｎする。二本鎖標的ポリヌクレオチドの両方の末端が相補的な鎖の３’末端の伸長によりｆｉｌｌ－ｉｎされる５’オーバーハングを有する場合、産物は完全に二本鎖である。伸長は、ＤＮＡポリメラーゼなどの任意の適切なポリメラーゼにより行うことができ、その多くが市販で入手可能である。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、またはＤＮＡ依存性およびＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ活性を含み得る。ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性または非熱安定性であり得る。ＤＮＡポリメラーゼの例は、限定されないが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、ＥＸ－Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ－Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼ、ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ、Ｈｉ－Ｆｉポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、ならびにそれらのバリアント、修飾した産物、および誘導体を含み、３’末端の伸長は、独立した試料から標的ポリヌクレオチドをプールする前または後に実行され得る。

標的濃縮
特定の実施形態において、本開示は、標的核酸の濃縮および標的核酸の解析のための方法を提供する。場合によっては、濃縮の方法は溶液ベースのフォーマットである。場合によっては、標的核酸は標識剤で標識され得る。他の場合では、標的核酸は標識剤で標識される１つ以上の会合分子にクロスリンクされ得る。標識剤の例は、限定されないが、ビオチン、ポリヒスチジンタグ、および化学タグ（例えば、クリックケミストリー方法に使用されるアルキンおよびアジドの誘導体）を含む。さらに、標識された標的核酸は捕捉することができ、それにより捕捉剤の使用によって濃縮することができる。捕捉剤は、ストレプトアビジンおよび／またはアビジン、抗体、化学部分（例えば、アルキン、アジド）、および親和性精製に使用される任意の生物学的、化学的、物理的、または酵素的な薬剤であり得る。

場合によっては、固定化されたまたは固定化されていない核酸プローブが、標的核酸を捕捉するために使用され得る。例えば、標的核酸は、固体支持体上または溶液中でのプローブへのハイブリダイゼーションにより、試料から濃縮され得る。いくつかの例において、試料はゲノム試料であり得る。いくつかの例において、プローブはアンプリコンであり得る。アンプリコンはあらかじめ定められた配列を含み得る。さらに、ハイブリダイズされた標的核酸は、プローブから洗浄および／または溶出され得る。標的核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡの分子であり得る。

場合によっては、濃縮方法は、標的核酸を含む試料をプローブに接触させる工程、および標的核酸を固体支持体に結合させる工程を含み得る。場合によっては、試料は、標的核酸を得るための酵素的な方法を使用して、断片化され得る。場合によっては、プローブは、標的核酸へと特異的にハイブリダイズされ得る。場合によっては、標的核酸の平均サイズは、約１４５ｂｐ～約６００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約６００～約２５００ｂｐ、または約３５０ｂｐ～約１０００ｂｐであり得る。標的核酸はさらに、試料中の結合されていない核酸から分離され得る。固体支持体は、濃縮された標的核酸を得るために洗浄および／または溶出され得る。いくつかの例において、濃縮工程は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返され得る。例えば、濃縮工程は約１、２、または３回繰り返され得る。

場合によっては、濃縮方法は、プローブ由来のアンプリコンを提供する工程を含むことができ、増幅のための前記プローブは固体支持体に結合されている。固体支持体は、試料から特定の標的核酸を捕捉するために支持体に固定された核酸プローブを含み得る。プローブ由来のアンプリコンは、標的核酸にハイブリダイズされ得る。プローブアンプリコンへのハイブリダイゼーションの後、試料中の標的核酸は、捕捉されたプローブからハイブリダイズされた標的核酸を捕捉（例えば、ビオチン、抗体などの捕捉剤を介して）し、ならびに洗浄および／または溶出することにより、濃縮され得る。標的核酸配列はさらに、例えば、濃縮されたＰＣＲ産物の増幅されたプールを産生するためのＰＣＲ方法を使用して、増幅され得る。

場合によっては、固体支持体は、マイクロアレイ、スライド、チップ、マイクロウェル、カラム、チューブ、粒子、またはビーズであり得る。いくつかの例において、固体支持体は、ストレプトアビジンおよび／またはアビジンで被覆され得る。他の例において、固体支持体は抗体で被覆され得る。さらに、固体支持体は、ガラス、金属、セラミック、またはポリマー材料を含み得る。いくつかの実施形態において、固体支持体は核酸マイクロアレイ（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）であり得る。他の実施形態において、固形支持体は常磁性ビーズであり得る。

特定の実施形態において、本開示は、濃縮されたＤＮＡを増幅する方法を提供する。場合によっては、濃縮されたＤＮＡはリード対である。リード対は、本開示の方法により得ることができる。

いくつかの実施形態において、１つ以上の増幅および／または複製の工程が、配列決定されるライブラリーの調製のために使用される。任意の適切な増幅方法が使用され得る。使用され得る増幅技術の例は、限定されないが、定量ＰＣＲ、定量蛍光ＰＣＲ（ＱＦ－ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ－ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）、単細胞ＰＣＲ、制限断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）、ＰＣＫ－ＲＦＬＰＩＲＴ－ＰＣＲ－ＩＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、インサイチュポロニーＰＣＲ、インサイチュローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、架橋ＰＣＲ、ライゲーションで媒介されたＰＣＲ、Ｑｂレプリカーゼ増幅、逆ＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲ、およびエマルジョンＰＣＲを含む。他の適切な増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自家持続配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的な増幅、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ－ＰＣＲ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ－ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ（ＤＯＰ－ＰＣＲ）、および核酸ベース配列増幅（ＮＡＢＳＡ）を含む。本明細書で使用され得る他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号、第５，４９４，８１０号、第４，９８８，６１７号、および第６，５８２，９３８号を参照。

特定の実施形態において、ＰＣＲは、ＤＮＡ分子が個々のパーティションへ分注された後にＤＮＡ分子を増幅するために使用される。場合によっては、増幅アダプター内の１つ以上の特異的なプライミング配列が、ＰＣＲ増幅のために利用される。増幅アダプターは、個々のパーティションへの分注の前または後に、断片化ＤＮＡ分子にライゲーションされ得る。両方の末端上で適切なプライミング配列を有する増幅アダプターを含むポリヌクレオチドは、指数関数的に増幅されたＰＣＲであり得る。例えば、プライミング配列を含む増幅アダプターの不完全なライゲーション効率が原因で適切なプライミング配列を１つしか持たないポリヌクレオチドは、線形増幅のみを受けることもある。さらに、適切なプライミング配列を含むいかなるアダプターもライゲーションされない場合、ポリヌクレオチドは、増幅、例えば、ＰＣＲ増幅からまとめて除去され得る。いくつかの実施形態において、ＰＣＲサイクルの数は１０～３０の間で変動するが、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくはそれ以下にまで低くなるか、または４０、４５、５０、５５、６０、またはそれ以上にまで高くなり得る。その結果、適切なプライミング配列を有する増幅アダプターを運ぶ指数関数的に増幅可能な断片は、ＰＣＲ増幅の後、線形に増幅可能または増幅可能ではない断片と比較して、はるかに高い（１０００倍以上）濃度で存在し得る。全ゲノム増幅技術（例えば、ランダム化プライマーを用いる増幅、またはｐｈｉ２９ポリメラーゼを用いる多置換増幅）と比較したＰＣＲの利点は、限定されないが、より均一な相対的な配列カバレッジ－－各断片をサイクル毎に多くとも１回コピーすることができ、増幅がサーモサイクリングプログラムによって制御されるので－－、例えば、ＭＤＡよりも実質的に低いキメラ分子を形成する速度（Ｌａｓｋｅｎｅｔａｌ．，２００７，ＢＭＣＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）－－キメラ分子が、アセンブリグラフにおいて非生物学的配列を提示することによる正確な配列アセンブリに対する重大な問題を提起するため。これは、高い率のミスアセンブリ、または非常に曖昧で断片化されたアセンブリをもたらす－－、特異的配列を有する特異的プライミング部位を使用することと比較して、ＭＤＡにおいて通常使用されるランダム化プライマーの結合から生じ得る配列特異的バイアスを減少させること、ＰＣＲサイクル数の選択によって制御することができる最終的な増幅ＤＮＡ産物の量におけるより高い再現性、および通常の全ゲノム増幅技術と比較してＰＣＲにおいて通常使用されるポリメラーゼによる複製におけるより高い忠実度を含む。

いくつかの実施形態において、ｆｉｌｌ－ｉｎ反応は、第１および第２のプライマーを使用した１つ以上の標的ポリヌクレオチドの増幅を伴うか、または上記増幅の一部として実行され、第１のプライマーは、第１のアダプターオリゴヌクレオチドの１つ以上の補体の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な配列を含み、さらに、第２のプライマーは、第２のアダプターオリゴヌクレオチドの１つ以上の補体の少なくとも一部にハイブリダイズ可能な配列を含む。第１および第２のプライマーのそれぞれは、任意の適切な長さ、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、もしくはそれ以上のヌクレオチド、上記よりも少ないヌクレオチド、または上記よりも多いヌクレオチドであり得、その一部またはすべては、対応する標的配列に相補的であり得る（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上のヌクレオチド、上記よりも少ないヌクレオチド、または上記よりも多いヌクレオチド）。例えば、約１０～５０のヌクレオチドが対応する標的配列に相補的であり得る。

「増幅」は、標的配列のコピー数が増加する任意のプロセスを指す。場合によっては、複製反応は、ポリヌクレオチドの単一の相補的なコピー／レプリカのみを産生し得る。標的ポリヌクレオチドのプライマー指向性の増幅のための方法は、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を含む。ＰＣＲによる標的配列の増幅に好ましい条件は、プロセスにおける様々な工程で最適化され、かつ、標的のタイプ、標的の濃度、増幅される配列の長さ、標的および／または１つ以上のプライマーの配列、プライマーの長さ、プライマーの濃度、使用するポリメラーゼ、反応量、１つ以上の要素対１つ以上の他の要素の比などの反応における要素の特徴に依存し、それらの一部またはすべては変更することができる。一般に、ＰＣＲは、（二本鎖の場合に）増幅される標的の変性、１つ以上のプライマーの標的へのハイブリダイゼーション、およびＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長の工程を含み、工程は、標的配列を増幅するために繰り返される（または「サイクルされる」）。このプロセスにおける工程は、収量を増強するために、擬似的な産物の形成を減らすために、および／またはプライマーのアニーリングの特異性を増加または減少させるなどのために、様々な結果について最適化され得る。最適化の方法は、限定されないが、増幅反応における要素のタイプまたは数に対する、および／または、特定の工程での温度、特定の工程の持続時間、および／またはサイクルの数などのプロセスにおける所定の工程の条件に対する調整を含む。

いくつかの実施形態において、増幅反応は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、またはそれ以上のサイクルを含み得る。いくつかの例において、増幅反応は、少なくとも約２０、２５、３０、３５、または４０のサイクルを含み得る。いくつかの実施形態において、増幅反応は、約５、１０、１５、２０、２５、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、またはそれ以上のサイクル以下を含む。サイクルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の工程など、任意の数の工程を含み得る。工程は、限定されないが、３’末端伸長（例えば、アダプターｆｉｌｌ－ｉｎ）、プライマーアニーリング、プライマー伸長、および鎖変性を含む所定の工程の目的を達成するのに適切な、任意の温度または温度の勾配を含むことができる。工程は、限定されないが、手動で中断されるまで無期限に含む、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、４８０、５４０、６００、１２００、１８００秒、またはそれ以上、上記の秒未満、または上記の秒を超える持続時間を含む、任意の持続時間であり得る。異なる工程を含む任意の数のサイクルは、任意の順で組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、異なる工程を含む異なるサイクルは、組み合わせてのサイクルの総数が約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、または２００、またはそれ以上のサイクル、上記よりも少ないサイクル、あるいは上記よりも多いサイクルとなるように、組み合わされる。いくつかの実施形態において、増幅はｆｉｌｌ－ｉｎ反応の後に行なわれる。

いくつかの実施形態において、増幅反応は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００、１０００ｎｇの標的ＤＮＡ分子上で実行され得る。他の実施形態において、増幅反応は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００、１０００ｎｇ未満の標的ＤＮＡ分子上で実行され得る。

増幅は、独立した試料から標的ポリヌクレオチドをプールする前または後に実行され得る。

本開示の方法は、試料に存在する増幅可能な核酸の量を判定する工程を含む。任意の既知の方法は増幅可能な核酸を定量化するために使用され得、典型的な方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、具体的には定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）である。ｑＰＣＲはポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術であり、標的とされた核酸分子を増幅し、かつ同時に定量化するために使用される。ｑＰＣＲは、ＤＮＡ試料中の特異的配列の検出および定量化（ＤＮＡ入力または追加の正規化遺伝子へと正規化される際のコピーまたは相対量の絶対数として）の両方を可能にする。手順は、増幅されたＤＮＡが各増幅サイクルの後にリアルタイムでの反応において蓄積すると定量化される追加の特徴と共に、ポリメラーゼ連鎖反応の一般的な原理に従う。ＱＰＣＲは、例えば、Ｋｕｒｎｉｔら（米国特許第６，０３３，８５４号）、Ｗａｎｇら（米国特許第５，５６７，５８３号および第５，３４８，８５３号）、Ｍａら（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＳｃｉｅｎｃｅ，２（３），２００６）、Ｈｅｉｄら（ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ９８６－９９４，１９９６）、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６）、およびＨｉｇｕｃｈｉ（米国特許第６，１７１，７８５号および第５，９９４，０５６号）に記載されている。これらの内容は全体として本明細書での引用により組み込まれる。

定量化の他の方法は、二本鎖ＤＮＡと挿入する蛍光色素、および、相補的ＤＮＡでハイブリダイズされた時に蛍光を発する修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。これらの方法は広く使用することができるが、具体的には一例としてさらに詳細に記載されるようなリアルタイムＰＣＲにも適合する。第１の方法において、ＤＮＡ結合色素はＰＣＲにおいてすべての二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに結合し、その結果色素の蛍光が生じる。したがって、ＰＣＲ中のＤＮＡ産物の増加は、蛍光強度の増加を引き起こし、各サイクルにて測定され、ＤＮＡ濃度の定量化を可能にする。反応は、蛍光性の（ｄｓ）ＤＮＡ色素の追加により、標準ＰＣＲ反応と同様に調製される。反応はサーモサイクラー中で実行され、各サイクルの後、蛍光のレベルが検出器で比較され、（ｄｓ）ＤＮＡ（すなわち、ＰＣＲ産物）に結合している時に、色素は蛍光を発するのみである。標準稀釈液に関して、ＰＣＲにおける（ｄｓ）ＤＮＡ濃度が測定され得る。他のリアルタイムＰＣＲ方法のように、得られた値は、その値に関連する絶対単位を持たない。測定されたＤＮＡ／ＲＮＡ試料と標準稀釈液との比較は、標準希釈液に対する試料の割合または比率をもたらし、異なる組織または実験条件の間の相対的な比較を可能にする。標的遺伝子の定量化および／または発現における正確性を確保することは、安定して発現された遺伝子に関して標準化され得る。未知の遺伝子のコピー数は、既知のコピー数の遺伝子に対して同様に正規化され得る。

第２の方法は、プローブ配列を含有するＤＮＡのみを定量化するために、配列特異的なＲＮＡまたはＤＮＡベースのプローブを使用し、したがって、レポータープローブの使用は、特異性を著しく増大させ、いくつかの非特異的なＤＮＡ増幅の存在下でさえも定量化を可能にする。これにより、多重化、すなわち、異なるように色を付けられた標識を伴う特異的なプローブを使用することにより同じ反応における様々な遺伝子についてのアッセイを可能にするが、ただし、すべての遺伝子は同様の効率で増幅されるものとする。

この方法は、プローブの１つの末端では蛍光レポーター（例えば、６－カルボキシフルオレセイン）、およびプローブの対向する末端ではクエンチャー（例えば、６－カルボキシ－テトラメチルローダミン）を有するＤＮＡベースのプローブで一般的に実行される。クエンチャーに対するレポーターの近接性は、その蛍光の検出を妨げる。ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）の５’～３’のエキソヌクレアーゼ活性によるプローブの破壊は、レポーター－クエンチャーの近接性を破壊し、したがって、蛍光のクエンチされていない発光を可能にし、これは検出することができる。各ＰＣＲサイクルにてレポータープローブにより標的とされる産物の増加の結果、プローブの破壊およびレポーターの放出に起因する蛍光の比例的な増加が生じる。反応は標準ＰＣＲ反応と同様に調製され、レポータープローブが加えられる。反応が始まると、ＰＣＲのアニーリング段階中に、プローブとプライマーの両方がＤＮＡ標的にアニーリングされる。新しいＤＮＡ鎖の重合はプライマーから始まり、いったんポリメラーゼがプローブに到達すると、その５’－３’－エキソヌクレアーゼはプローブを分解し、クエンチャーから蛍光レポーターを物理的に分離して、結果として蛍光の増加をもたらす。蛍光はリアルタイムＰＣＲサーモサイクラーにおいて検出かつ測定され、産物の指数関数的な増加に対応する蛍光の幾何学的な増加は、各反応における閾値サイクルを判定するために使用される。

反応の対数期中に存在するＤＮＡの相対濃度は、対数目盛上でサイクル数に対する蛍光をプロットすることにより判定される（そのため、指数関数的に増大する量は直線をもたらす）。バックグラウンド上での蛍光の検出のための閾値が判定される。試料からの蛍光が閾値を超えるサイクルは、サイクル閾値、Ｃｔと呼ばれる。ＤＮＡの量は対数期中のすべてのサイクルで二倍になるため、ＤＮＡの相対量を計算することができ、例えば、他のものよりも３サイクル早いＣｔを有する試料は、２３＝８倍多い鋳型を有する。その後、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の量は、結果を既知量の核酸の連続希釈（例えば、希釈なし、１：４、１：１６、１：６４）のリアルタイムＰＣＲにより生成された標準曲線と比較することにより判定される。

特定の実施形態において、ｑＰＣＲ反応は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、例えば、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲハイブリダイゼーションプローブを利用する二重フルオロフォア手法を含み、２つのオリゴヌクレオチドプローブはアンプリコンにアニーリングされる（例えば、米国特許第６，１７４，６７０号を参照）。オリゴヌクレオチドは、効率的なエネルギー転移に適合する距離で分離されたフルオロフォアでヘッド－テールの配向（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）においてハイブリダイズするように設計される。核酸に結合されたまたは伸長産物に組み込まれた時にシグナルを発するように構造化される標識されたオリゴヌクレオチドの他の例は、ＳＣＯＲＰＩＯＮＳプローブ（例えば、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７：８０４－８０７，１９９９、および米国特許第６，３２６，１４５号）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（またはＡＭＰＬＩＦＬＯＵＲ）プライマー（例えば、Ｎａｚａｒｅｎｋｏｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：２５１６－２５２１，１９９７、および米国特許第６，１１７，６３５号）、ならびにＬＵＸプライマーおよびＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＥＡＣＯＮＳプローブ（例えば、Ｔｙａｇｉｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：３０３－３０８，１９９６および米国特許第５，９８９，８２３号）を含む。

他の実施形態において、ｑＰＣＲ反応は、蛍光Ｔａｑｍａｎ方法、およびリアルタイムで蛍光を測定することが可能な機器（例えば、ＡＢＩＰｒｉｓｍ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ）を使用する。Ｔａｑｍａｎ反応は、２つの異なる蛍光色素で標識されるハイブリダイゼーションプローブを使用する。１つの色素はレポーター色素（６－カルボキシフルオレセイン）であり、もう１つはクエンチング色素（６－カルボキシ－テトラメチルローダミン）である。プローブが無傷の場合、蛍光エネルギー転移が生じ、レポーター色素の蛍光的な発光がクエンチング色素により吸収される。ＰＣＲサイクルの伸長段階中に、蛍光ハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡポリメラーゼの５’－３’の核酸分解活性により切断される。プローブの切断時に、レポーター色素の発光はこれ以上クエンチング色素へと効率的に転移されず、その結果、レポーター色素の蛍光発光スペクトルが増加する。リアルタイムの方法または単点の検出方法を含む、任意の核酸定量化方法は、試料中の核酸の量を定量化するために使用され得る。検出は、様々な異なる方法（例えば、染色、標識されたプローブによるハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマーの組み込みと、その後のアビジン－酵素コンジュゲートの検出、増幅されたセグメントへのｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸塩の組み込み）に加えて、核酸定量化のための任意の他の適切な検出方法によって実行され得る。定量化は増幅工程を含むこともあれば、含まないこともある。

いくつかの実施形態において、本開示は、結合されたＤＮＡセグメントを同定または定量化するための標識を提供する。場合によっては、連鎖されたＤＮＡセグメントは、アレイのハイブリダイゼーションなどの下流での用途を補助するために標識され得る。例えば、連鎖されたＤＮＡセグメントは、ランダムなプライミングまたはニックトランスレーションを使用して標識され得る。

多種多様な標識（例えば、レポーター）は、限定されないが増幅工程中を含んで、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を標識するために使用されてもよい。適切な標識は、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光剤、または発色剤に加え、リガンド、補助因子、阻害剤、磁気微粒子などを含む。そのような標識の例は、米国特許第３，８１７，８３７号、米国特許第３，８５０，７５２号、米国特許第３，９３９，３５０号、米国特許第３，９９６，３４５号、米国特許第４，２７７，４３７号、米国特許第４，２７５，１４９号、および米国特許第４，３６６，２４１号に含まれており、これらは全体として引用により組み込まれる。

追加の標識は、限定されないが、β－ガラクトシダーゼ、インベルターゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、β－グルクロニダーゼ、エキソ－グルカナーゼ（ｅｘｏ－ｇｌｕｃａｎａｓｅ）、およびグルコアミラーゼを含む。蛍光標識も、特定の化学的性質で特異的に合成された蛍光試薬と同様に使用されてもよい。蛍光を測定する多種多様な方法が利用可能である。例えば、いくつかの蛍光標識は、励起または発光のスペクトルの変化を示し、いくつかの蛍光標識は１つの蛍光レポーターが蛍光を失い、一方で第２の蛍光レポーターが蛍光を増加させる共鳴エネルギー転移を示し、いくつかの蛍光標識は蛍光の消失（クエンチ）または出現を示し、いくつかの蛍光標識は回転動作を報告する。

さらに、標識化のための十分な材料を得るために、１つの反応当たりの増幅サイクルの数を増やす代わりに、複数の増幅がプールされ得る。代替的に、標識されたヌクレオチドは、増幅反応の最後のサイクル、例えば、ＰＣＲの３０のサイクル（標識なし）＋ＰＣＲの１０のサイクル（と標識）に組み込まれ得る。

特定の実施形態において、本開示は、結合されたＤＮＡセグメントに結合することができるプローブを提供する。本明細書で使用されるように、「プローブ」という用語は、関心対象の別の分子（例えば、別のオリゴヌクレオチド）にハイブリダイズすることができる分子（例えば、精製された制限消化物などにおいて自然に生じるかどうか、または合成的に、組換え的に、もしくはＰＣＲ増幅により産生されたかどうかにかかわらず、オリゴヌクレオチド）を指す。プローブは、オリゴヌクレオチドである場合、一本鎖または二本鎖であり得る。プローブは、特定の標的（例えば、遺伝子配列）の検出、同定、および単離に役立つ。場合によっては、プローブは、限定されないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに加え、酵素に基づく組織化学アッセイ）、蛍光、放射性、および発光のシステムを含む任意の検出システムにおいて検出可能となるような標識に関連付けら得る。

アレイおよびマイクロアレイに関して、「プローブ」という用語は、プローブへとハイブリダイズしたヌクレオチド配列を検出するためにアレイに固定される任意のハイブリダイズ可能な物質を指すために使用される。場合によっては、プローブは、約１０ｂｐ～５００ｂｐ、約１０ｂｐ～２５０ｂｐ、約２０ｂｐ～２５０ｂｐ、約２５ｂｐ～２００ｂｐ、約２５ｂｐ～１００ｂｐ、約３０ｂｐ～１００ｂｐ、または約３０ｂｐ～８０ｂｐであり得る。場合によっては、プローブは、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７０ｂｐ、約８０ｂｐ、約９０ｂｐ、約１００ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、または約５００ｂｐ長であり得る。例えば、プローブは約２０～約５０ｂｐ長であり得る。プローブ設計の例および論理的根拠は、ＷＯ９５／１１９９５、ＥＰ７１７，１１３、およびＷＯ９７／２９２１２で見つけることができる。

プローブ、プローブのアレイ、またはプローブのセットは、支持体上で固定され得る。支持体（例えば、固体支持体）はガラス、シリカ、プラスチック、ナイロン、またはニトロセルロースなどの様々な材料で作られ得る。支持体は剛性であり得、平らな表面を有し得る。支持体は、約１～１０，０００，０００個の分離した遺伝子座（ｒｅｓｏｌｖｅｄｌｏｃｉ）を有し得る。例えば、支持体は、約１０～１０，０００，０００、約１０～５，０００，０００、約１００～５，０００，０００、約１００～４，０００，０００、約１０００～４，０００，０００、約１０００～３，０００，０００、約１０，０００～３，０００，０００、約１０，０００～２，０００，０００、約１００，０００～２，０００，０００、または約１００，０００～１，０００，０００の分離した遺伝子座を有し得る。分離した遺伝子座の密度は、１平方センチメートル内で少なくとも約１０、約１００、約１０００、約１０，０００、約１００，０００、または約１，０００，０００の分離した遺伝子座であり得る。場合によっては、分離した遺伝子座の各々は、９５％を超える単一のタイプのオリゴヌクレオチドによって占有され得る。他の場合、分離した遺伝子座の各々は、プローブのプールされた混合物またはプローブのセットにより占有され得る。さらなる場合において、いくつかの分離した遺伝子座は、プローブのプールされた混合物またはプローブのセットにより占有され、他の分離した遺伝子座は９５％を超える単一のタイプのオリゴヌクレオチドにより占有される。

場合によっては、アレイ上の所定のヌクレオチド配列のためのプローブの数は、そのようなアレイにハイブリダイズされるＤＮＡ試料に対し非常に過剰な場合がある。例えば、アレイは、入力された試料におけるＤＮＡの量に対して約１０、約１００、約１０００、約１０，０００、約１００，０００、約１，０００，０００、または約１００，０００，０００倍のプローブ数を有し得る。

場合によっては、アレイは、約１０、約１００、約１０００、約１０，０００、約１００，０００、約１，０００，０００、約１０，０００，０００、または約１，０００，０００，０００のプローブを有し得る。

プローブのアレイまたはセットは、支持体上で段階ごとに合成され得るか、またはあらかじめ合成された形態で結合され得る。合成方法の１つは、高密度の小型化したアレイにおけるオリゴヌクレオチドプローブの合成を指示するための光の使用を伴う、ＶＬＳＩＰＳ（商標）（米国特許第５，１４３，８５４号およびＥＰ４７６，０１４に記載される）である。合成サイクルの数を減らすためのマスクの設計のためのアルゴリズムは、米国特許第５，５７１，６３９号および米国特許第５，５９３，８３９号に記載されている。アレイはさらに、ＥＰ６２４，０５９に記載されるように、機械的に制限された流路により支持体の細胞にモノマーを送達することにより、組み合わせて合成され得る。アレイはさらに、インクジェットプリンターを使用して支持体上へと試薬をスポットする（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）ことにより合成され得る（例えば、ＥＰ７２８，５２０を参照）。

いくつかの実施形態において、本開示は、アレイ上に連鎖されたＤＮＡセグメントをハイブリダイズする方法を提供する。「基材」または「アレイ」は、合成的または生合成的のいずれかで調製され得、様々な異なるフォーマット（例えば、可溶性分子のライブラリー、および、樹脂ビーズ、シリカチップ、または他の固体支持体にテザリングされたオリゴヌクレオチドのライブラリー）において生物活性についてスクリーニングされ得る核酸の故意に作り出された集合体である。加えて、「アレイ」という用語は、基材上へと実質的に任意の長さ（例えば、１～約１０００長のヌクレオチドモノマー）の核酸をスポットすることにより調製され得る核酸のそのようなライブラリーを含んでいる。

アレイの技術、ならびに様々な関連技術およびその適用は、一般的に多くのテキストブックおよび文書で記載されている。例えば、これらの文書として、Ｌｅｍｉｅｕｘｅｔａｌ．，１９９８，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ４，２７７－２８９；ＳｃｈｅｎａａｎｄＤａｖｉｓ，ＰａｒａｌｌｅｌＡｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｉｐｓ．ｉｎＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＭａｎｕａｌ（ｅｄｓ．Ｍ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ）；ＳｃｈｅｎａａｎｄＤａｖｉｓ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ，ＧｅｎｏｍｅｓａｎｄＣｈｉｐｓ．ＩｎＤＮＡＭｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ），ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９９）；ＴｈｅＣｈｉｐｐｉｎｇＦｏｒｅｃａｓｔ（ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓｓｐｅｃｉａｌｉｓｓｕｅ；Ｊａｎｕａｒｙ１９９９Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）；ＭａｒｋＳｃｈｅｎａ（Ｅｄ．），ＭｉｃｒｏａｒｒａｙＢｉｏｃｈｉｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（ＥａｔｏｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ）；Ｃｏｒｔｅｓ，２０００，ＴｈｅＳｃｉｅｎｔｉｓｔ１４［１７］：２５；ＧｗｙｎｎａｎｄＰａｇｅ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓ：ｔｈｅｎｅｘｔｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９Ａｕｇ．６、および、ＥａｋｉｎｓａｎｄＣｈｕ，１９９９，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，２１７－２１８が挙げられる。

通常、任意のライブラリーは、ライブラリーのメンバーを空間的に分離することにより、アレイへと順序正しく配置され得る。配列に適切なライブラリーの例は、核酸ライブラリー（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチドなどのライブラリーを含む）、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質のライブラリー、ならびに、任意の分子を含むライブラリー、例えば、とりわけ、リガンドライブラリーを含む。

ライブラリーは、メンバーの拡散および混合を制限するために、固相（例えば、固体の基材）上へ固定化または固定され得る。場合によっては、ＤＮＡ結合リガンドのライブラリーが調製され得る。とりわけ、ライブラリーは、膜および非多孔基材、例えば、プラスチックやガラスを含む実質的に平らな固相に固定され得る。さらに、ライブラリーは、インデキシング（すなわち、特定のメンバーへの言及またはアクセス）が容易になるような方法で配置され得る。いくつかの例において、ライブラリーのメンバーは、格子形態のスポットとして適用され得る。一般的なアッセイ系はこの目的に適合し得る。例えば、アレイは、ウェルに複数のメンバーを有するか、または各ウェルに１つのメンバーを有するマイクロプレートの表面上で固定され得る。さらに、固体の基材は、ニトロセルロースまたはナイロンの膜（例えば、ブロッティング実験に使用される膜）などの膜でもよい。代替的な基材は、ガラスまたはシリカベースの基材を含む。したがって、ライブラリーは、任意の適切な方法、例えば、電荷相互作用、あるいは、ウェルの壁もしくは底、または膜の表面への化学結合により、固定され得る。他の配置および固定化の手段、例えば、ピペット操作、ドロップ－タッチ、圧電手段、インクジェットおよびバブルジェット技術、静電気の適用などが使用され得るシリコンベースのチップの場合、フォトリソグラフィーがチップ上でライブラリーを配置および固定化するために利用され得る。

ライブラリーは、固体基材上に「スポットされる（ｓｐｏｔｔｅｄ）」ことにより配置され、これは、手動で、またはメンバーを堆積させるためにロボット工学を利用することにより行われてもよい。一般に、アレイはマクロアレイまたはマイクロアレイと記載されてもよく、違いはスポットの大きさである。マクロアレイは、約３００ミクロン以上のスポットサイズを含み得、既存のゲルおよびブロットスキャナーにより容易に画像化され得る。マイクロアレイにおけるスポットサイズは、直径２００ミクロン未満であり得、これらのアレイは通常、数千ものスポットを含んでいる。したがって、マイクロアレイは、特別なロボット工学および画像化機器を必要とし得、これらは、カスタム作製される必要があり得る。器具は概して、Ｃｏｒｔｅｓｅ，２０００，ＴｈｅＳｃｉｅｎｔｉｓｔ１４［１１］：２６による総説に記載されている。

ＤＮＡ分子の固定されたライブラリーを作製するための技術は記載されている。通常、このような方法のほとんどは、例えば、固体の基材上の様々な別個の位置で配列の様々な順列を構築するためにマスキング技術を使用して、一本鎖核酸分子ライブラリーを合成する方法について記載している。米国特許第５，８３７，８３２号は、超大規模集積回路技術に基づいてシリコン基板に固定されたＤＮＡアレイを作製するための改善された方法について記載している。特に、米国特許第５，８３７，８３２号は、本開示の固定されたＤＮＡライブラリーを作製するために使用され得る基材上の空間的に定められた場所でプローブの特定のセットを合成するために「タイリング」と呼ばれる戦略について記載している。米国特許第５，８３７，８３２号はさらに、使用され得る初期の技術に対する言及を提供する。他の場合では、アレイはさらに、光析出化学（ｐｈｏｔｏｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を使用して構築され得る。

ペプチド（またはペプチド模倣体）のアレイも、アレイにおける別個のあらかじめ定められた場所で別個のライブラリーのメンバー（例えば、固有のペプチド配列）それぞれを配する様式で、表面上で合成され得る。ライブラリーのメンバーそれぞれの同一性は、アレイにおけるその空間的位置により判定される。あらかじめ定められた分子（例えば、標的またはプローブ）と反応的なライブラリーのメンバーとの間の結合相互作用が生じるアレイにおける位置が判定され、それにより、空間的位置に基づき反応的なライブラリーのメンバーの配列が同定される。これらの方法は、米国特許第５，１４３，８５４号、ＷＯ９０／１５０７０、およびＷＯ９２／１００９２、Ｆｏｄｏｒｅｔａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７；ＤｏｗｅｒａｎｄＦｏｄｏｒ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２６：２７１に記載されている。

検出を支援するために、任意の容易に検出可能なレポーター、例えば、蛍光性、生物発光性、リン光性、放射性などのレポーターといった標識を使用することができる（上記で議論されるように）。そのようなレポーター、それらの検出、標的／プローブへの結合などは、本文書の他の場所で議論される。プローブおよび標的の標識化はさらに、Ｓｈａｌｏｎｅｔａｌ．，１９９６，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ６（７）：６３９－４５に開示されている。

いくつかの市販で入手可能なマイクロアレイのフォーマットの例は、ＭａｒｓｈａｌｌａｎｄＨｏｄｇｓｏｎ，１９９８，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６（１），２７－３１に説明されている。

アレイベースのアッセイからデータを生成するために、シグナルは、プローブとヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションの存在または不在を示すために検出され得る。さらに、直接および間接的な標識化技術も利用され得る。例えば、直接的な標識化は、アレイに関連するプローブにハイブリダイズするヌクレオチド配列へ直接的に蛍光色素を組み込む（例えば、色素は、標識化ヌクレオチドまたはＰＣＲプライマーの存在下で酵素的合成によりヌクレオチド配列に組み込まれる）。直接的な標識化スキームは、例えば、同様の化学的な構造および特徴を有する蛍光色素のファミリーの使用により、強固なハイブリダイゼーションシグナルをもたらし、かつ簡単に実施することができる。核酸の直接的な標識化を含む場合には、シアニンまたはアレクサ（ａｌｅｘａ）のアナログが、複数の蛍光比較アレイ解析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｆｌｕｏｒｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｒｒａｙａｎａｌｙｓｅｓ）に利用され得る。他の実施形態において、間接的な標識化スキームは、マイクロアレイプローブへのハイブリダイゼーションの前または後に、核酸にエピトープを組み込むために利用され得る。１つ以上の染色の手順および試薬は、ハイブリダイズされた複合体（例えば、エピトープに結合し、それによりハイブリダイズされた種のエピトープへの色素分子のコンジュゲーションによって蛍光シグナルをもたらす、蛍光分子）を標識するために使用され得る。

配列決定
様々な実施形態において、本明細書に記載されるか、そうでなければ既知の適切な配列決定方法が、試料内の核酸分子から配列情報を得るために使用される。配列決定は、古典的なサンガー配列決定方法を介して達成することができる。配列はさらに、ハイスループットシステムを使用して達成され、その一部は、成長鎖への組み込みの直後またはその際の配列決定されたヌクレオチドの検出、すなわち、リアルタイムまたはほぼリアルタイムでの配列の検出を可能にする。場合によっては、ハイスループット配列決定は、１時間につき少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、または少なくとも５００，０００の配列リードを生成し、ここで、配列決定リードは、１つのリードにつき少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１５０、約１８０、約２１０、約２４０、約２７０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、または約１０００の塩基であり得る。

配列決定は、関心対象の特定の領域の濃縮の有無にかかわらず、全ゲノムであり得る。配列決定はゲノムの特定の領域を標的とすることができる。濃縮または標的化され得るゲノムの領域としては、限定されないが、単一遺伝子（またはその領域）、遺伝子パネル、遺伝子融合物、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子座（例えば、クラスＩＨＬＡ－Ａ、Ｂ、およびＣ、クラスＩＩＨＬＡ－ＤＲＢ１／３／４／５、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１）、エクソン領域、エクソーム、および他の遺伝子座が挙げられる。ゲノム領域は、免疫応答、免疫レパートリー、免疫細胞多様性、転写（例えば、エキソーム）、癌（例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、遺伝子のパネルまたはその領域、例えば、ホットスポット領域、体細胞バリアント、ＳＮＶ、増幅、融合、腫瘍突然変異負荷（ＴＭＢ）、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ））、心疾患、遺伝性疾患、および他の疾患または状態に関連し得る。限定されないが配列捕捉を含む様々な方法を使用して、関心対象の領域を濃縮または標的化することができる。場合によっては、ライブラリー調製の前または後に配列捕捉工程（例えば、標的濃縮アレイによる）を用いて、捕捉Ｈｉ－Ｃ（ＣＨｉ－Ｃ）またはＣＨｉ－Ｃ様プロトコルが使用される。

いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ’ｓＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒＩＩＸ、ＭｉＳｅｑパーソナルシーケンサー、またはＨｉＳｅｑシステム、例えば、ＨｉＳｅｑ２５００、ＨｉＳｅｑ１５００、ＨｉＳｅｑ２０００、またはＨｉＳｅｑ１０００の機械を使用するものなどにより利用可能な技術の使用を含む。これらの機械は、合成化学による可逆的なターミネーターベースの配列決定を使用する。これらの機械は、８日で２０００億以上のＤＮＡのリードを行うことができる。３日、２日、１日以下の時間内で実行するために、より小さなシステムが利用されてもよい。

いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、ＡＢＩＳｏｌｉｄＳｙｓｔｅｍにより利用可能な技術の使用を含む。クローン増幅されたＤＮＡ断片の超並列配列決定を可能にするこの遺伝子解析プラットフォームは、ビーズに結合した。配列決定の方法論は、色素で標識したオリゴヌクレオチドによる連続的なライゲーションに基づく。

次世代配列決定は、（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ）の技術を使用する）イオン半導体配列決定を含み得る。イオン半導体配列決定は、ヌクレオチドがＤＮＡの鎖へ組み込まれる時にイオンが放出され得るという事実を利用することができる。イオン半導体配列決定を行なうために、微細加工されたウェルの高密度アレイを形成することができる。各ウェルは単一のＤＮＡ鋳型を保持することができる。ウェルの下はイオン感受性層であり、イオン感受性層の下はイオンセンサーであり得る。ヌクレオチドがＤＮＡに加えられると、Ｈ＋が放出され、ｐＨの変化として測定され得る。Ｈ＋イオンは電圧に変換され、半導体センサーにより記録され得る。アレイチップをヌクレオチドで次々にあふれさせる（ｆｌｏｏｄｅｄ）ことができる。走査、光、またはカメラは必要ではない。場合によっては、ＩＯＮＰＲＯＴＯＮ（商標）シークエンサーが核酸を配列決定するために使用される。場合によっては、ＩＯＮＰＧＭ（商標）シークエンサーが使用される。ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＰｅｒｓｏｎａｌＧｅｎｏｍｅＭａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）。ＰＧＭは２時間で１０００万のリードを行うことができる。

いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、ＨｅｌｉｃｏｓＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）により利用可能な技術、例えば、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）方法の使用を含む。ＳＭＳＳは、最大２４時間で全ヒトゲノムの配列決定を可能にすることから、固有なものである。最終的に、ＳＭＳＳは、米国特許出願公開第２００６００２４７１１号、第２００６００２４６７８号、第２００６００１２７９３号、第２００６００１２７８４号、および第２００５０１００９３２号に部分的に記載されている。

いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ装置などの４５４Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）により利用可能な技術の使用を含み、これは、機器においてＣＣＤカメラにより記録される配列決定反応により生成される化学発光シグナルを伝達するファイバオプティックプレートを含む。このファイバーオプティクスの使用は、４．５時間で最低２０００万の塩基対の検出を可能にする。

ビーズ増幅とその後のファイバーオプティクスの検出を使用する方法は、Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，Ｍ．，ｅｔａｌ． “Ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｉｎｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙｐｒｉｃｏｌｉｔｒｅｒｅａｃｔｏｒｓ，” Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３９５９、および、米国特許出願公開第２００２００１２９３０号、第２００３００６８６２９号、第２００３０１００１０２号、第２００３０１４８３４４号、第２００４０２４８１６１号、第２００５００７９５１０号、第２００５０１２４０２２号、および、第２００６００７８９０９号に記載されている。

いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、ＣｌｏｎａｌＳｉｎｇｌｅＭｏｌｅｃｕｌｅＡｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ，Ｉｎｃ．）、または可逆的なターミネーター化学を利用する合成による配列決定（ＳＢＳ）を使用して行なわれる。これらの技術は、米国特許第６，９６９，４８８号、第６，８９７，０２３号、第６，８３３，２４６号、第６，７８７，３０８号、および、米国特許出願公開第２００４０１０６１１０号、第２００３００６４３９８号、第２００３００２２２０７号、およびＣｏｎｓｔａｎｓ，Ａ．，ＴｈｅＳｃｉｅｎｔｉｓｔ２００３，１７（１３）：３６に部分的に記載されている。

次世代配列決定技術は、ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるリアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術を含み得る。ＳＭＲＴにおいて、４つのＤＮＡ塩基の各々は、４つの異なる蛍光色素の１つに結合され得る。これらの色素はホスホ結合（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎｋｅｄ）され得る。単一のＤＮＡポリメラーゼは、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）の底部にある鋳型の一本鎖ＤＮＡの単一分子で固定され得る。ＺＭＷは、（マイクロ秒で）ＺＭＷの中および外で急速に拡散することができる蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対する、ＤＮＡポリメラーゼによる単一のヌクレオチドの組み込みの観察を可能にする、閉じ込め構造（ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）となり得る。成長鎖にヌクレオチドを組み込むのに数ミリ秒かかる場合がある。この間に蛍光標識は励起され、蛍光シグナルを生成することができ、蛍光タグは切断され得る。ＺＭＷは下から照らすことができる。励起ビームからの減衰光は、各ＺＭＷの下部２０～３０ｎｍを透過することができる。２０ゼプトリットル（２０×１０^－２１リットル）の検出限界を有する顕微鏡を作成することができる。小さな検出体積は、バックグラウンドノイズの低減において１０００倍の改善を提供することができる。色素の対応する蛍光の検出は、どの塩基が組み込まれたかを示すことができる。このプロセスを繰り返すことができる。このプロセスは繰り返すことができる。

場合によっては、次世代配列決定はナノ細孔配列決定である（例えば、ＳｏｎｉＧＶａｎｄＭｅｌｌｅｒＡ．（２００７）ＣｌｉｎＣｈｅｍ５３：１９９６－２００１を参照）。ナノ細孔は、直径約１ナノメートルの小さな穴であり得る。導電性流体におけるナノ細孔の浸漬、およびそこでの電位の適用は結果として、ナノ細孔を介したイオンの伝導が原因で、僅かな電流をもたらし得る。流れる電流の量はナノ細孔のサイズに感受性があり得る。ＤＮＡ分子がナノ細孔を通ると、ＤＮＡ分子上のヌクレオチドはそれぞれ、異なる程度にまでナノ細孔を塞ぐことができる。したがって、ＤＮＡ分子がナノ細孔を通る際の、ナノ細孔を通る電流の変化は、ＤＮＡ配列の読み取りを表すことができる。ナノ細孔配列決定技術は、ＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、例えば、ＧｒｉｄｌＯＮシステムからのものであり得る。単一のナノ細孔は、マイクロウェルの上部にわたる高分子膜に挿入され得る。マイクロウェルはそれぞれ、個々の感知のための電極を有し得る。マイクロウェルは、１つのチップ当たり１００，０００以上のマイクロウェル（例えば、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、または１，０００，０００を超える）を有するアレイチップへと組み立てられ得る。機器（またはノード）がチップを解析するために使用され得る。データはリアルタイムで解析され得る。１つ以上の機器は一度に操作され得る。ナノ細孔は、タンパク質ナノ細孔、例えば、タンパク質アルファ溶血素、七量体タンパク質細孔であり得る。ナノ細孔は、ソリッドステートナノ細孔で出来ており、例えば、合成膜（例えば、ＳｉＮｘ、またはＳｉＯ２）に形成されるナノメートルサイズの穴であり得る。ナノ細孔は、ハイブリッド細孔（例えば、ソリッドステート膜へのタンパク質細孔の統合）であり得る。ナノ細孔は、集積化したセンサーを有するナノ細孔であり得る（例えば、トンネル電極検出器、容量検出器、またはグラフェンベースのナノギャップもしくはエッジ状態検出器（例えば、Ｇａｒａｊｅｔａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅｖｏｌ．６７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９３７９を参照））。ナノ細孔は、特定の型の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）を解析するために官能化することができる。ナノ細孔配列決定は、「鎖配列決定」を含むことができ、ここで、無傷なＤＮＡポリマーは、ＤＮＡが細孔を転移させる際にリアルタイムで配列決定しながらタンパク質ナノ細孔を通過することができる。酵素は二本鎖ＤＮＡの鎖を分離することができ、ナノ細孔を通じて鎖を与えることができる。ＤＮＡは一方の末端でヘアピンを有することができ、システムは両方の鎖を読み取ることができる。場合によっては、ナノ細孔配列決定は、「エキソヌクレアーゼ配列決定」であり、ここで、個々のヌクレオチドは前進性エキソヌクレアーゼによってＤＮＡ鎖から切断されることができ、そのヌクレオチドはタンパク質ナノ細孔を通過することができる。ヌクレオチドは、細孔内の分子（例えば、シクロデキストラン）に一過的に結合することができる。電流の特性的断絶を使用して、塩基を同定することができる。

ＧＥＮＩＡのナノ細孔配列決定技術を使用できる。操作したタンパク質細孔を脂質二重層の膜に包埋することができる。「能動的制御」技術を使用して、効率的なナノ細孔－膜アセンブリ、およびチャネルを通るＤＮＡ運動の制御を可能にする。場合によっては、ナノ細孔配列決定技術は、ＮＡＢｓｙｓ製である。ゲノムＤＮＡは、平均長約１００ｋｂの鎖に断片化され得る。１００ｋｂの断片を一本鎖にし、その後、六量体のプローブでハイブリダイズさせることができる。プローブを有するゲノム断片は、ナノ細孔を通って通り抜けることができ、電流対時間の追跡を作り出すことができる。電流追跡は、各ゲノム断片上のプローブの位置を提供することができる。ゲノム断片を並べて、ゲノムに対するプローブマップを作り出すことができる。そのプロセスは、プローブのライブラリーに対して並列に行うことができる。各プローブに対するゲノム長のプローブマップを生成することができる。誤りは、「移動窓配列決定バイハイブリダイゼーション（ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＢｙＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ｍｗＳＢＨ）」と称されるプロセスで修正することができる。場合によっては、ナノ細孔配列決定技術は、ＩＢＭ／Ｒｏｃｈｅ製である。電子ビームを使用して、マイクロチップにナノ細孔サイズの開口部を作製することができる。電界を使用して、ナノ細孔を通ってＤＮＡを引き寄せるまたはねじ込むことができる。ナノ細孔におけるＤＮＡトランジスタ装置は、金属と誘電体が交互になったナノメートルサイズの層を含むことができる。ＤＮＡ骨格中の別個の電荷を、電界によってＤＮＡナノ細孔の内部に閉じ込めることができる。ゲート電圧をオフ／オンすることにより、ＤＮＡ配列を読み取ることができる。

次世代配列決定は、ＤＮＡナノボール配列決定を含むことができる（例えば、ＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅｎｏｍｉｃｓによって実施されるように。例えば、Ｄｒｍａｎａｃｅｔａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２７：７８－８１を参照）。ＤＮＡを単離し、断片化し、サイズ選択することができる。例えば、ＤＮＡは（例えば、超音波処理によって）約５００ｂｐの平均長へと断片化することができる。アダプター（Ａｄｌ）を、断片の末端に結合させることができる。アダプターを使用して、配列決定反応のためのアンカーにハイブリダイズさせることができる。各末端に結合したアダプターを有するＤＮＡを、ＰＣＲ増幅することができる。アダプター配列は、相補的な一本鎖末端が互いに結合して環状ＤＮＡを形成するように、修飾することができる。ＤＮＡをメチル化して、その後の工程において使用されるＩＩＳ型制限酵素による切断からこれを保護することができる。アダプター（例えば、右のアダプター）は、制限認識部位を有することができ、制限認識部位はメチル化されないままであり得る。アダプターにおける非メチル化制限認識部位は、制限酵素（例えば、Ａｃｕｌ）によって認識され得、ＤＮＡは、Ａｃｕｌによって右アダプターの右側に１３ｂｐ切断されて、線形二本鎖ＤＮＡを形成することができる。第２のラウンドの右および左のアダプター（Ａｄ２）を、線状ＤＮＡのいずれかの末端にライゲーションすることができ、両方のアダプターが結合しているＤＮＡはすべて（例えば、ＰＣＲによって）ＰＣＲ増幅することができる。Ａｄ２配列を修飾して、それらが互いに結合して環状ＤＮＡを形成することを可能にする。ＤＮＡはメチル化することができるが、制限酵素認識部位は、左Ａｄ１アダプターにおいてメチル化されないままであり得る。制限酵素（例えば、Ａｃｕｌ）を適用することができ、ＤＮＡは、Ａｄ１の左側１３ｂｐで切断され、線状ＤＮＡ断片を形成することができる。第３ラウンドの右および左のアダプター（Ａｄ３）を、線状ＤＮＡの右面および左面にライゲーションすることができ、その結果生じる断片をＰＣＲ増幅することができる。アダプターは、互いに結合して環状ＤＮＡを形成するように、修飾することができる。ＩＩＩ型制限酵素（例えば、ＥｃｏＰ１５）を加えることができ、ＥｃｏＰ１５は、ＤＮＡをＡｄ３の左に２６ｂｐおよびＡｄ２の右に２６ｂｐ切断することができる。この切断は、ＤＮＡの大きなセグメントを除去し、ＤＮＡを再び線状化することができる。第４ラウンドの右および左のアダプター（Ａｄ４）をＤＮＡにライゲーションすることができ、ＤＮＡを（例えば、ＰＣＲによって）増幅し、互いに結合して完成した環状ＤＮＡ鋳型を形成するように、修飾することができる。

ローリングサークル複製（例えば、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用する）を使用して、ＤＮＡの小さな断片を増幅することができる。４つのアダプター配列は、ハイブリダイズすることができるパリンドローム配列を含有することができ、一本鎖をそれ自体の上に折りたたんで、平均で直径およそ２００～３００ナノメートルとなり得るＤＮＡナノボール（ＤＮＢ（商標））を形成することができる。ＤＮＡナノボールは、（例えば、吸着により）マイクロアレイ（配列決定フローセル）に結合させることができる。フローセルは二酸化ケイ素、チタン、およびヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）、ならびにフォトレジスト材料でコーティングされたシリコンウエハであり得る。配列決定は、ＤＮＡに蛍光プローブをライゲーションすることによる未連鎖の配列決定によって実施することができる。調べた位置の蛍光の色は高解像度カメラによって可視化することができる。アダプター配列間のヌクレオチド配列の同一性を決定することができる。

いくつかの実施形態において、ハイスループット配列決定は、ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｉｐｓ（Ｇｅｎｏｖｏｘｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行うことができる。特に、ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｉｐｓは、ヌクレオチド蛍光シグナル検出を１０倍～５０倍増強できる。ＡｎｙＤｏｔ．ｃｈｉｐｓおよびそれを使用する方法は、国際公開ＷＯ０２０８８３８２、ＷＯ０３０２０９６８、ＷＯ０３０３１９４７、ＷＯ２００５０４４８３６、ＰＣＴ／ＥＰ０５／０５６５７、ＰＣＴ／ＥＰ０５／０５６５５、およびドイツ特許出願第ＤＥ１０１４９７８６、ＤＥ１０２１４３９５、ＤＥ１０３５６８３７、ＤＥ１０２００４００９７０４、ＤＥ１０２００４０２５６９６、ＤＥ１０２００４０２５７４６、ＤＥ１０２００４０２５６９４、ＤＥ１０２００４０２５６９５、ＤＥ１０２００４０２５７４４、ＤＥ１０２００４０２５７４５、およびＤＥ１０２００５０１２３０１にある程度記載されている。

他のハイスループット配列決定システムとしては、Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１６Ｆｅｂｒｕａｒｙ２００１；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４Ｍａｒｃｈ２０００、および、Ｍ．Ｊ．Ｌｅｖｅｎｅｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９９：６８２－６８６、Ｊａｎｕａｒｙ２００３、ならびに、米国特許出願公開第２００３００４４７８１号および第２００６／００７８９３７号に記載されるものが挙げられる。そのようなシステム全体は、核酸分子上で測定される重合反応による塩基の経時的な付加によって複数の塩基を有する標的核酸分子を配列決定することを含み、すなわち、配列決定される鋳型核酸分子上の核酸重合酵素の活性がリアルタイムで追跡される。次いで、塩基付加の配列における各工程での核酸重合酵素の触媒活性によって、どの塩基が標的核酸の成長中の相補鎖に組み込まれているかを同定することによって、配列を推定することができる。標的核酸分子複合体上のポリメラーゼは、標的核酸分子に沿って移動し、活性部位でオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するのに適した位置に提供される。複数の標識型のヌクレオチドアナログが活性部位の近位に提供され、ヌクレオチドアナログの各識別可能な型は標的核酸配列中の異なるヌクレオチドに対して相補的である。成長核酸鎖は、ポリメラーゼを使用して活性部位で核酸鎖にヌクレオチドアナログを付加することによって伸長され、付加されるヌクレオチドアナログは、活性部位で標的核酸のヌクレオチドに対して相補的である。重合工程の結果としてオリゴヌクレオチドプライマーに付加されたヌクレオチドアナログが同定される。標識したヌクレオチドアナログを提供する工程と、成長核酸鎖を重合させる工程と、付加されたヌクレオチドアナログを同定する工程は繰り返され、それにより核酸鎖がさらに伸長され、標的核酸の配列が決定される。

キット
特定の実施形態において、本開示は、本開示の１つ以上の構成要素を含むキットをさらに提供する。キットは、限定されないが、上に記載されたものを含む任意の適切な用途に使用することができる。キットは、例えば、複数の会合分子、固定剤、ヌクレアーゼ、リガーゼ、および／またはそれらの組み合わせを含むことができる。場合によっては、会合分子は、例えば、ヒストンを含むタンパク質であり得る。場合によっては、固定剤は、ホルムアルデヒド、またはＤＳＧ、ＥＧＳ、もしくはＤＳＳを含む任意の他のＤＮＡクロスリンキング剤であり得る。

場合によっては、キットはさらに複数のビーズを含むことができる。ビーズは常磁性であり、および／または捕捉剤でコーティングされている。例えば、ビーズは、ストレプトアビジンおよび／または抗体でコーティングすることができる。

場合によっては、キットは、アダプターオリゴヌクレオチドおよび／または配列決定プライマーを含むことができる。さらに、キットは、アダプターオリゴヌクレオチドおよび／または配列決定プライマーを使用してリード対を増幅することができる装置を含むことができる。

場合によっては、キットは、限定されないが、溶解緩衝液、ライゲーション試薬（例えば、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、および／またはリガーゼ緩衝液など）、およびＰＣＲ試薬（例えば、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、および／またはＰＣＲ緩衝液など）を含むことができる。

キットはさらに、キットの構成要素を使用するためのおよび／またはリード対を生成するための指示書を含むことができる。

コンピュータおよびシステム
図３に示されるコンピュータシステム（５００）は、媒体（５１１）および／またはネットワークポート（５０５）（固定化された媒体（５１２）を有するサーバー（５０９）に任意選択で接続され得る）から命令を読み取ることができるロジック装置として理解され得る。図３に示されるものなどのシステムは、ＣＰＵ（５０１）、ディスクドライブ（５０３）、キーボード（５１５）および／またはマウス（５１６）などの任意選択の入力装置、ならびに任意選択のモニター（５０７）を含み得る。データ通信は指示された通信媒体を介して局所位置または遠隔位置のサーバーまで達成され得る。通信媒体は、データを送信および／または受信する任意の手段を含むことができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続であってもよい。そのような接続は、ワールド・ワイド・ウェブ（ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ）での通信を提供することができる。本開示に関するデータは、図３に例示されるように当事者（５２２）が受理および／または検討するために、そのようなネットワークまたは接続によって伝達され得ることが想定される。

図４は、本開示の例示的な実施形態と関連して使用可能なコンピュータシステム（１００）の第１の例のアーキテクチャを示すブロック図である。図４に描かれるように、例示的なコンピュータシステムは、命令を処理するためのプロセッサ（１０２）を含み得る。プロセッサの非限定的な例は、ＩｎｔｅｌＸｅｏｎ（商標）プロセッサ、ＡＭＤＯｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサ、Ｓａｍｓｕｎｇ３２－ｂｉｔＲＩＳＣＡＲＭ１１７６ＪＺ（Ｆ）－Ｓｖ１．０（商標）プロセッサ、ＡＲＭＣｏｒｔｅｘ－Ａ８ＳａｍｓｕｎｇＳ５ＰＣ１００（商標）プロセッサ、ＡＲＭＣｏｒｔｅｘ－Ａ８ＡｐｐｌｅＡ４（商標）プロセッサ、ＭａｒｖｅｌｌＰＸＡ９３０（商標）プロセッサ、または機能的に同等のプロセッサを含む。実行の複数のスレッドが並列処理に使用可能である。いくつかの実施形態では、単一コンピュータシステム、クラスターであろうと、または複数のコンピュータ、携帯電話、および／またはパーソナルデータアシスタントデバイスを含むネットワーク上でシステムにわたって分配されようと、複数のプロセッサまたは複数のコアを有するプロセッサを使用することができる。

図４に例示されるように、高速キャッシュ（１０４）は、プロセッサ（１０２）に接続するか、または組み込まれることで、プロセッサ（１０２）により近年使用されてきたまたは頻繁に使用されている命令またはデータのための高速メモリを提供することができる。プロセッサ（１０２）は、プロセッサバス（１０８）によりノースブリッジ（１０６）に接続される。ノースブリッジ（１０６）は、メモリバス（１１２）によりランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（１１０）に接続され、プロセッサ（１０２）によりＲＡＭ（１１０）へのアクセスを管理する。ノースブリッジ（１０６）はさらに、チップセットバス（１１６）によりサウスブリッジ（１１４）に接続される。サウスブリッジ（１１４）は次に、周辺バス（１１８）に接続される。周辺バスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ－Ｘ、ＰＣＩＥｘｐｒｅｓｓ、または他の周辺バスであってもよい。ノースブリッジおよびサウスブリッジはしばしば、プロセッサチップセットと称され、周辺バス（１１８）上でプロセッサとＲＡＭと周辺コンポーネントとの間のデータ転送を管理する。いくつかの代替的なアーキテクチャでは、ノースブリッジの機能性は、別のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサに組み込まれ得る。

いくつかの実施形態おいて、システム（１００）は、周辺バス（１１８）に取り付けられるアクセラレータカード（１２２）を含み得る。アクセラレータは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、または特定の処理を促進するための他のハードウェアを含んでもよい。例えば、アクセラレータは、適応データの再構成のために、または拡張された設定処理に使用される代数式を評価するために使用され得る。

ソフトウェアとデータは、外部ストレージ（１２４）に記憶され、プロセッサにより使用されるＲＡＭ（１１０）および／またはキャッシュ（１０４）へとロードすることができる。システム（１００）は、システムリソースの管理のためのオペレーティングシステムを含み、オペレーティングシステムの非限定的な例は、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、および他の機能的に同等なオペレーティングシステムの他に、本開示の例示的な実施形態に従ってデータの記憶および最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で実行されるアプリケーションソフトウェアを含む。

この例において、システム（１００）はさらに、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）などの外部記憶装置、および分散並列処理に使用され得る他のコンピュータシステムに対するネットワークインターフェースを提供するために、周辺バスに接続されるネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）（１２０）および（１２１）を含む。

図５は、複数のコンピュータシステム（２０２ａ）および（２０２ｂ）、複数の携帯電話およびパーソナルデータアシスタント（２０２ｃ）、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（２０４ａ）および（２０４ｂ）を含むネットワーク（２００）を示す略図である。例示的な実施形態において、システム（２０２ａ）、（２０２ｂ）、および（２０２ｃ）は、データ記憶を管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（２０４ａ）および（２０４ｂ）に記憶されたデータに対するデータアクセスを最適化することができる。数学モデルがこのデータに対して使用され、コンピュータシステム（２０２ａ）および（２０２ｂ）、ならびに携帯電話およびパーソナルデータアシスタントシステム（２０２ｃ）にわたって分散並列処理を使用して評価され得る。コンピュータシステム（２０２ａ）および（２０２ｂ）、ならびに携帯電話およびパーソナルデータアシスタントシステム（２０２ｃ）はさらに、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（２０４ａ）および（２０４ｂ）に記憶されたデータの適応データ再構築に対して並列処理を提供することができる。図５は一例のみを例示しており、多種多様な他のコンピュータのアーキテクチャおよびシステムは、本開示の様々な実施形態と連動して使用され得る。例えば、ブレードサーバーは並列処理を提供するために使用することができる。プロセッサブレードは、並列処理を提供するためにバックプレーンを介して接続可能である。ストレージも、バックプレーンに接続することができるか、または別のネットワークインターフェースを介してネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続可能である。

いくつかの例示的な実施形態では、プロセッサは、別のメモリ空間を維持することができ、他のプロセッサによる並列処理のために、ネットワークインターフェース、バックプレーン、または他のコネクターを介してデータを送信することができる。他の実施形態では、プロセッサのいくつかまたはすべては、共有の仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。

図６は、例示的な実施形態にかかる共有の仮想アドレスメモリ空間を使用する、マルチプロセッサコンピューターシステム（３００）のブロック図である。システムは、共有メモリサブシステム（３０４）にアクセス可能な複数のプロセッサ（３０２ａ－ｆ）を含む。システムは、メモリサブシステム（３０４）に複数のプログラマブルハードウェアのメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）（３０６ａ－ｆ）を組み込む。各ＭＡＰ（３０６ａ－ｆ）は、メモリ（３０８ａ－ｆ）および１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（３１０ａ－ｆ）を含み得る。ＭＡＰは設定可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズムまたはその一部は、各プロセッサと密接に協働して処理を行うためにＦＰＧＡ（３１０ａ－ｆ）に提供され得る。例えば、ＭＡＰは、データモデルに関する代数式を評価するために、および例示的な実施形態において適応データの再構成を実行するために使用され得る。この例では、各ＭＡＰは、このような目的のためにプロセッサすべてによって世界中からアクセス可能である。１つの構成において、各ＭＡＰは、関連するメモリ（３０８ａ－ｆ）にアクセスするためにダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、それにより、それぞれのマイクロプロセッサ（３０２ａ－ｆ）とは無関係に、かつこれらから非同期的に、タスクを実行することが可能となる。この構成では、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン処理（ｐｉｐｅｌｉｎｉｎｇ）および並列実行のために別のＭＡＰに結果を直接供給することができる。

上記のコンピュータのアーキテクチャおよびシステムは、例に過ぎず、汎用のプロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡ、および他のプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、ならびに他の処理素子および論理素子のあらゆる組み合わせを使用するシステムを含む、多種多様な他のコンピュータ、携帯電話、パーソナルデータアシスタントのアーキテクチャおよびシステムが、例示的な実施形態と連動して使用され得る。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムのすべてまたは一部は、ソフトウェアまたはハードウェアにおいて実施され得る。ランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、他のローカルまたは分散データストレージデバイスおよびシステムを含む、あらゆる種類のデータストレージ媒体も例示的な実施形態と連動して使用され得る。

例示的な実施形態では、コンピュータシステムは、上記または他のコンピュータのアーキテクチャおよびシステムのいずれかで実行するソフトウェアモジュールを使用して実施され得る。他の実施形態において、システムの機能は、ファームウェア、図１１で言及されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラム可能な論理回路、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または他の処理素子および論理素子において、部分的または完全に実施され得る。例えば、セットプロセッサおよびオプティマイザは、図４に例示されるアクセラレータカード（１２２）などのハードウェアアクセラレータカードの使用を介してハードウェアアクセラレーションで実施され得る。

定義
他に定義されない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的な用語は、本開示の属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および試薬が、開示された方法および組成物の実施に使用され得るが、ここでは例示的な方法および材料が記載されている。

本明細書と添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別のことを指定していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「コンティグ」への言及は、複数のそのようなコンティグを含み、「染色体の物理的なレイアウトをプローブする」への言及は、当業者に既知の染色体およびその同等物の物理的なレイアウトをプローブする１つ以上の方法への言及を含む。

さらに、「および（ａｎｄ）」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は互換的なものであり、限定的なものとしては意図されていない。

さらに、様々な実施形態の記載が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例において、「～から実質的になる」または「～からなる」という用語を使用して実施形態が代替的に記載され得ることを理解するものと理解されたい。

「配列決定リード」という用語は、本明細書で使用されるように、配列が判定されたＤＮＡの断片を指す。

「コンティグ」という用語は、本明細書で使用されるように、ＤＮＡ配列の連続領域を指す。「コンティグ」は、当該技術分野で既知である任意の数の方法、例えば、重複配列について配列決定リードを比較すること、および／または、どの配列決定リードが連続する可能性が高いかを識別するために既知の配列のデータベースに対して配列決定リードを比較することにより判定され得る。

本明細書で使用されるような「対象」という用語は、真核生物または原核生物を指すことができる。

本明細書で使用されるような「リード対（ｒｅａｄｐａｉｒ）または（ｒｅａｄ－ｐａｉｒ）」という用語は、配列情報を提供するために結合される２つ以上の要素を指すことができる。場合によっては、リード対の数は、マッピング可能なリード対の数を指す場合がある。他の場合において、リード対の数は、生成されたリード対の総数を指す場合がある。

本明細書で使用される「安定化された」という用語は、保存されているか、または分解から保護されている試料を記載することができる。場合によっては、安定化された試料は、固定剤またはクロスリンキング剤でクロスリンクまたは処理される。場合によっては、安定化された試料は、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウムなどで処理される。

本明細書で使用される「約」という用語は、別段の指定がない限り、その数のプラスまたはマイナス１０％の数を含む値の範囲として、その数を記載することができる。

本明細書で使用される場合、「核酸の露出した内部末端」は、フェーズまたは局所的な三次元構造情報を容易にするために末端隣接核酸配列情報にアクセスするために導入されたものなど、安定化または非安定化された核酸に導入された切断部位の生成によって生成された露出した末端を指すことができる。

本明細書で使用される場合、用語「約」数字は、その数の＋／－１０％に及ぶ範囲を指し、「約」範囲は、規定された範囲限界よりも１０％低い範囲～規定された範囲限界よりも１０％大きい範囲を指す。

本明細書で使用される場合、リンカー上の配列セグメントは、その配列の同定が、第２のパーティションまたは起源細胞を除外して、特定の第１のパーティションまたは起源細胞に、隣接する核酸配列を割り当てることを容易にするとき、パーティション指定または細胞指定である。識別配列は、場合によっては、パーティションまたは細胞に固有であり、したがって、他のすべての細胞と区別し、これが技術的に実行可能である場合、固有のタグは下流の分析を容易にする。しかしながら、固有の配列はすべての場合において必要とされるわけではない。場合によっては、冗長なバーコード化は、計算的に下流で解決され、それにもかかわらず、固有でないタグは、第１のパーティションまたは細胞の核酸を、第２のパーティションまたは細胞から区別するのに充分である。

本明細書で使用される場合、クラスターは、複数の別個の末端隣接配列または配列タグがマッピングされる核酸参照の領域である。場合によっては、第２の領域に対する１つの領域の近接性は、少なくとも部分的に、第２のクラスターのクラスター成分とペアエンドのリードにおいて同時に生じる第１のクラスターのクラスター成分の数を計数することによって評価される。

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられ、いかなる方法でも本発明を制限するようには意図されていない。本明細書に記載される方法とともに、本実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであり、および、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。請求項の範囲によって定義される本発明の精神内に包含されるその変化および他の使用は、当業者に想定される。

実施例１：試料調製
試料の調製には、試料の種類：細胞または組織に応じて２つの別々のプロトコルがある。溶解物定量化工程は、両方の試料の種類について同じである。試料の調製には２時間かけるべきである。

注記：１０倍のＨｉＣ洗浄緩衝液、１０倍の脱クロスリンク緩衝液（ＣｒｏｓｓｌｉｎｋＲｅｖｅｒｓａｌＢｕｆｆｅｒ）、および２０％ＳＤＳは、保存時に沈殿した可能性がある。沈殿物がもはや見えなくなるまで、溶液を３７℃で１５分間インキュベートする。使用前にボルテックスして混合する。１０倍のＨｉＣ洗浄緩衝液を超純水で１倍に希釈する。室温で保存する。試料あたり約１５ｍＬの１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液が必要である。１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液もプロトコルの残りを通して使用することができる。１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液は室温で２ヶ月間安定している。１０倍の脱クロスリンク緩衝液を超純水で１倍に希釈する。室温で保存する。試料あたり約１ｍＬの１倍の脱クロスリンク緩衝液が必要である。１倍の脱クロスリンク緩衝液も近接ライゲーションプロトコルに使用することができる。１倍の脱クロスリンク緩衝液は、室温で２ヶ月間安定している。１．５ｍＬチューブについて撹拌熱ミキサーを１２５０ｒｐｍに設定しなければならない。使用前に氷上で緩衝液を解凍し、ボルテックスすることを含む、優良試験所基準を使用する。

細胞のためのプロトコル
注記：１０ｘ１０^６細胞を出発物質として使用して、洗浄中の損失を考慮することが推奨される。１０ｘ１０^６未満の細胞が利用可能である場合、低入力プロトコルを参照されたい。開始前に、新鮮な１倍のヌクレアーゼ消化緩衝液を調製し、室温で保存する。１倍のヌクレアーゼ消化緩衝液は、室温で１日安定している。１倍のヌクレアーゼ消化緩衝液を調製するために、１４０μｌの超純水、２０μｌの１０倍のヌクレアーゼ消化緩衝液、２０μｌの１００ｍＭのＭｎＣｌ２、２０μｌの１０％トリトンを混合する。

細胞を回収し、１倍のＰＢＳで洗浄する。細胞を計数し、１０×１０^６細胞を等分し、２０００×ｇで５分間遠心分離する。上清を注意深く除去する。ペレットを５ｍｌの１倍のＰＢＳおよび１３５μｌの３７％ホルムアルデヒドに再懸濁する。試料を５ｍｌチューブに移し、細胞が沈降しないような速度にて室温で１０分間回転させる。チューブを２０００×ｇで５分間遠心分離する。細胞ペレットが緩む可能性があるため、注意しながら上清を注意深く除去する。ペレットをＨｉＣ洗浄緩衝液で洗浄し、最初に２００μｌで凝集塊を破壊し、次いで残りの４．８ｍｌを添加し、上下にピペッティングしてペレットを完全に再懸濁する。チューブを２０００×ｇで５分間回転させ、上清を注意深く除去する。合計２回の洗浄のために洗浄工程を繰り返す。２回目の洗浄液を除去した後、ペレットを１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液１ｍｌに再懸濁し、ペレットを再懸濁する。細胞を計数し、１ｘ１０^６細胞を３つの別々のチューブに加え、残りの細胞を－８０℃で凍結したペレットとして保存する。３つのチューブを２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。各チューブ中のペレットを５０μｌの１倍のヌクレアーゼ消化緩衝液（新しく調製した）に再懸濁する。チューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて２分間３０℃に予熱する。７．５μｌのヌクレアーゼ酵素混合物を含む新鮮な１．５ｍｌチューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて３０℃で２分間予熱する。予熱したヌクレアーゼ酵素混合物を、以下のように予熱した各チューブに、０．５μｌを第１のチューブに移し、２．０μｌを第２のチューブに移し、４．０μｌを第３のチューブに移す。チューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて３０℃で正確に３０分間インキュベートする。５μｌの０．５ＭのＥＤＴＡを添加して混合することによって、ヌクレアーゼ反応を停止させる。３μｌの２０％ＳＤＳを添加して細胞を溶解し、細胞を１２５０ｒｐｍで、撹拌熱ミキサー中３０℃で５分間インキュベートする。

組織のためのプロトコル
注記：６０ｍｇの組織を使用することが推奨される。６０ｍｇ未満の組織の細胞が利用可能である場合、低入力プロトコルを参照されたい。開始前に、新鮮な１倍のヌクレアーゼ消化緩衝液を調製し、室温で保存する。１倍のヌクレアーゼ消化緩衝液は、室温で１日安定している。１倍のヌクレアーゼ消化緩衝液を調製するために、１４０μｌの超純水、２０μｌの１０倍のヌクレアーゼ消化緩衝液、２０μｌの１００ｍＭのＭｎＣｌ２、２０μｌの１０％トリトンを混合する。

少なくとも６０ｍｇの凍結組織を秤量し、図１Ａおよび図１Ｂで例示される稠度まで液体窒素中で乳鉢および乳棒を用いて微粉末に粉砕し、図１Ａは不十分な組織粉砕を示し、図１Ｂは十分な組織粉砕を示す。破壊した組織を、５ｍｌの１倍のＰＢＳおよび１３５μｌの３７％ホルムアルデヒドを含む５ｍｌチューブに移す。チューブを室温で１０分間回転させる。チューブを２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。組織がペレット化しない場合、チューブを最大速度で５分間回転させる。ペレットを２００μｌの洗浄緩衝液に再懸濁し、次いで４．８ｍｌの１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液を加える。チューブを２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。洗浄工程を２回行い、最終ペレットを１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液１ｍｌに再懸濁する。再懸濁した細胞を２００μｍフィルターに通して新鮮な５ｍｌチューブに入れ、必要に応じてフィルターを交換する。さらに２ｍｌの１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液を２００μｍフィルターに通す。試料を３つの別々のチューブ中で３つの１ｍｌアリコートに分離し、各アリコートは２０ｍｇの組織に対応する。余剰組織をペレット化し、－８０℃で保存することができる。３つのチューブを２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。各チューブ中のペレットを５０μｌの１倍のヌクレアーゼ消化緩衝液（新しく調製した）に再懸濁する。チューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて２分間３０℃で予熱する。７．５μｌのヌクレアーゼ酵素混合物を含む新鮮な１．５ｍｌチューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて３０℃で２分間予熱する。予熱したヌクレアーゼ酵素混合物を、以下のように予熱した各チューブに、０．５μｌを第１のチューブに移し、２．０μｌを第２のチューブに移し、４．０μｌを第３のチューブに移す。チューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて３０℃で正確に３０分間インキュベートする。５μｌの０．５ＭのＥＤＴＡを添加して混合することによって、ヌクレアーゼ反応を停止させる。３μｌの２０％ＳＤＳを添加して細胞を溶解し、細胞を１２５０ｒｐｍで、撹拌熱ミキサー中３０℃で５分間インキュベートする。

実施例２：溶解物の定量化
注記：溶解物の定量化には２時間かけなければならない。８０％エタノールを、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズを用いたＤＮＡ精製のために新たに調製する。定量化工程は、２つの目的：近接ライゲーションステップで使用する試料の体積を決定すること、試料調製で得た３つのチューブのどれを近接ライゲーションで使用するかを決定することを有する。

各チューブからの２μｌの溶解物を１８μｌの１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液と混合することによって、各溶解物を１：１０に希釈する。希釈されていない溶解物を－８０℃で保存する。２．５μｌの各溶解物を、５０μｌの脱クロスリンク緩衝液および１．５μｌのプロテイナーゼＫを含むチューブに移す。混合物をピペッティングで混合し、１２５０ｒｐｍで攪拌熱ミキサーで５５℃で１５分間、次いで６８℃で４５分間インキュベートする。１００μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズを各チューブに加え、ボルテックスして再懸濁させ、スピンダウンさせ、磁石から離して室温で５分間インキュベートする。チューブを磁石中に５分間、または溶液が透明に見え、ビーズが完全に分離されるまで置く。上清を除去し、ビーズを、磁石からチューブを取り外すことなく、８０％エタノールで１分間２回洗浄する。２回目の洗浄後、チューブをスピンダウンさせ、磁石上に１分間置いた。残りのエタノールをピペットで除去する。ビーズを、エタノールが残らなくなるまで磁石上で５分間空気乾燥させるが、過剰乾燥させることはない。チューブを磁石から取り出し、ビーズを１０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁する。チューブをボルテックスし、スピンダウンさせ、磁石上に１分間置く。８μｌの上清を新鮮なチューブに移す。ＱｕｂｉｔＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒおよびＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＨＳキットを用いて試料を定量化する。濃度はスプレッドシートに記録される。断片サイズ分布は、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎＤ５０００またはＤ５０００ＨＳＳｃｒｅｅｎＴａｐｅを用いて決定される。Ｄ５０００ＨＳＳｃｒｅｅｎＴａｐｅを使用する場合、試料を１ｎｇ／μｌに希釈しなければならない。領域：領域１１００～２５００ｂｐ、領域２１００～６００ｂｐ、および領域３６００～２５００ｂｐをＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍで分析する。全パーセントを計算し、記録する。データは図２に示すように現れ、合計７６．３３％が１００ｂｐ～２５００ｂｐであり、合計２８．８２％が１００ｂｐ～６００ｂｐであり、合計４７．８２％が６００ｂｐ～２５００ｂｐである。

１０００ｎｇに対応する試料の体積を計算する。クロマチン消化効率（ＣＤＥ）およびクロマチン消化指数（ＣＩ）を計算する。どの試料がＱＣメトリックに合格するかを決定する。

実施例３：近接ライゲーション
注記：近接ライゲーションには５．５時間をかけなければならない。撹拌熱ミキサーを１．５ｍｌチューブについて１２５０ｒｐｍに設定する。試料を磁石の上に置く際、時間を経過させて、上清を除去する前に溶液を完全に透明にする。新鮮な架橋ライゲーション混合物（５０μｌ）を調製し、使用前に氷上で保存する。５０μｌの架橋ライゲーション混合物を調製するために、１０μｌの５×ライゲーション緩衝液、５μｌの架橋、および３５μｌの超純水を混合する。８０％エタノールを、ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズを用いたＤＮＡ精製のために新たに調製する。

クロマチン捕捉ビーズへのクロマチンの結合
クロマチン捕捉ビーズを室温にして、使用前にボルテックスする。１００μｌのクロマチン捕捉ビーズを、計算された実施例１からの試料１０００ｎｇを含む１．５ｍｌチューブに移す。試料をピペッティングによって混合し、磁石から離して室温でインキュベートする。チューブを磁石上に５分間、または溶液が透明になりビーズが分離するまで置く。上清を除去する。チューブを磁気ラックから取り出し、ビーズを１５０μｌの１倍のＨｉ－Ｃ洗浄緩衝液で洗浄し、１０回のピペッティングによって混合し、その後、１分間磁石上に置いた後、上清を除去する。洗浄工程を１回繰り返す。

末端平滑化
チューブを磁気ラックから取り出し、５０μｌの末端平滑化緩衝液および３．５μｌの末端平滑化酵素混合物を添加する。試料をピペッティングによって混合し、２２℃で３０分間、その後、６５℃で３０分間、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいてインキュベートする。チューブを室温に到達させ、次いで磁気ラック上に１分間、または溶液が透明に見えてビーズが分離するまで置く。上清を除去する。チューブを磁気ラックから取り出し、ビーズを１５０μｌの１倍のＨｉ－Ｃ洗浄緩衝液で１回洗浄し、ピペッティングによって混合する。次いで、チューブを磁気ラック上に１分間再度置き、上清を除去する。

架橋ライゲーション
チューブを磁気ラックから取り出し、５０μｌの架橋ライゲーション混合物を１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼと共に添加する（新たに作製する）。試料をピペッティングによって混合し、２２℃で３０分間インキュベートする。チューブを磁気ラック上に１分間、または溶液が透明になるまで置く。上清を除去し、チューブを磁気ラックから取り出す。ビーズを１５０μｌの１倍のＨｉ－Ｃ洗浄緩衝液で再懸濁し、ピペッティングによって混合する。チューブを磁石上に１分間置き、上清を除去する。

凝集体内ライゲーション
チューブを磁気ラックから取り出し、５０μｌの凝集体内ライゲーション緩衝液および２μｌの凝集体内ライゲーション酵素混合物をビーズに加える。試料をピペッティングによって混合し、撹拌熱ミキサーで２２℃で１時間インキュベートする。チューブを磁気ラック上に１分間、または溶液が透明に見え、ビーズが分離するまで置く。上清を除去する。

脱クロスリンク（ＣｒｏｓｓｌｉｎｋＲｅｖｅｒｓａｌ）
チューブを磁気ラックから取り出し、５０μｌに加え１．５μｌのプロテイナーゼＫをビーズに加える。試料をピペッティングで混合し、１２５０ｒｐｍで攪拌熱ミキサーで５５℃で１５分間、次いで６８℃で４５分間インキュベートする。

ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズ上でのＤＮＡ精製
ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズを３０秒間ボルテックスして再懸濁させる。３５μｌの再懸濁ビーズを１．５ｍｌの試料チューブに加える。試料をボルテックスし、スピンダウンさせ、磁石から離して室温で５分間インキュベートする。チューブを磁石上に５分間、または溶液が透明に見え、ビーズが分離するまで置く。上清を除去する。チューブを磁石上に残して、１５０μｌの８０％エタノールで２回洗浄する。ビーズをこれらの洗浄液に再懸濁せず、エタノールを添加し、１分間インキュベートし、エタノールを除去する。２回目の洗浄後、チューブをスピンダウンさせ、磁石上に１分間置き、ピペットを使用してエタノールの最後を除去する。ビーズを、エタノールが残らなくなるまで磁石上で５分間空気乾燥させるが、ビーズは乾燥し過ぎない。試料を磁石から取り出し、５２μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加える。試料をボルテックスし、スピンダウンさせ、磁石から離して室温で５分間インキュベートする。チューブをスピンダウンさせ、磁石上に１分間置く。５０μｌの上清を新鮮な１．５ｍｌチューブに移す。ビーズを廃棄する。ＱｕｂｉｔＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒおよびＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＨＳキットを用いて試料を定量化する。ライブラリー調製工程に進むには２００ｎｇが必要である。精製ＤＮＡを２０℃で最大６ヶ月保存する。

実施例４：ライブラリー調製
注記：ライブラリー調製プロトコルはフラグメンテーションを必要とせず、約２時間かけなければならない。

末端修復
注記：末端修復緩衝液は、保存中に沈殿することがあるが、目に見える沈殿物がなくなるまで３７℃で少なくとも１０分間インキュベートすべきである。２５０ｍＭのＤＴＴをピペッティングによって混合して、使用前に完全に混合する。

０．２ｍｌのＰＣＲチューブを、４８μｌの精製試料、７μｌの末端修復緩衝液、３μｌの末端修復酵素混合物、および０．５μｌの２５０ｍＭのＤＴＴで調製する。混合物をピペッティングによって混合し、スピンダウンさせる。試料をサーマルサイクラー中で２０℃で３０分間、その後、６５℃で３０分間インキュベートする。試料を１２℃に保持する。

アダプターライゲーションおよびＵＳＥＲ消化
試料を含有する０．２ｍｌのＰＣＲチューブを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用の２．５μｌのアダプター、１μｌのライゲーションエンハンサー、および３０μｌのライゲーション酵素混合物と混合する。試料をピペッティングによって混合し、チューブをスピンダウンさせる。試料をサーマルサイクラー中２０℃で１５分間インキュベートし、１２℃で保持する。３μｌのＵＳＥＲ酵素混合物をＰＣＲチューブに加える。試料をピペッティングによって混合し、スピンダウンさせる。試料をサーマルサイクラー中３７℃で１５分間インキュベートし、１２℃で保持する。

ＤＮＡ精製
ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズを３０秒間ボルテックスして再懸濁させる。８０μｌの再懸濁ビーズをＰＣＲチューブに加える。試料をボルテックスし、スピンダウンさせ、磁石から離して室温で５分間インキュベートする。チューブを磁石上に５分間、または溶液が透明に見え、ビーズが分離するまで置く。上清を除去する。チューブを磁石上に残して、１５０μｌの８０％エタノールで２回洗浄する。ビーズをこれらの洗浄液に再懸濁せず、エタノールを添加し、１分間インキュベートし、エタノールを除去する。２回目の洗浄後、チューブをスピンダウンさせ、磁石上に１分間置き、ピペットを使用してエタノールの最後を除去する。ビーズを、エタノールが残らなくなるまで磁石上で５分間空気乾燥させるが、ビーズは乾燥し過ぎない。試料を磁石から取り出し、１００μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加える。試料をボルテックスし、スピンダウンさせ、磁石から離して室温で５分間インキュベートする。チューブをスピンダウンさせ、磁石上に１分間置く。９５μｌの上清を新鮮な１．５ｍｌチューブに移す。ビーズを廃棄する。精製ＤＮＡを２０℃で一晩保存する。

実施例５：ライゲーション捕捉および増幅
注記：ライゲーション捕捉および増幅プロトコルには２時間かけなければならない。

ストレプトアビジンビーズ調製
注記：この工程はいかなるＤＮＡ試料も含まない。

ストレプトアビジンビーズをボルテックスして再懸濁させる。２５ｍｌの再懸濁ストレプトアビジンビーズを１．５ｍｌチューブに移す。ストレプトアビジンビーズを含むチューブを磁石上に５分間置き、上清を除去する。チューブを磁気ラックから取り出し、ストレプトアビジンビーズを２００μｌのＴＷＢ（ＲｅｄＬａｂｅｌ）で洗浄し、ピペッティングによって混合する。試料を磁気ラック上に１分間置き、上清を除去する。洗浄工程を１回繰り返す。次いで、ストレプトアビジンビーズを１００μｌの２×ＮＴＰ（ＹｅｌｌｏｗＬａｂｅｌ）に再懸濁し、ピペッティングによって混合する。

ライゲーション捕捉
９５μｌの精製ＤＮＡを、１００μｌの２×ＮＴＢに再懸濁したストレプトアビジンビーズと共に１．５ｍｌチューブに移す。チューブを１０秒間ボルテックスし、スピンダウンさせる。混合物を撹拌熱ミキサーにおいて２５℃で３０分間インキュベートする。

ストレプトアビジンビーズ上での試料の洗浄
注記：各洗浄について、チューブを磁気ラックから取り出し、指示された緩衝液をビーズに加え、ビーズを再懸濁し、チューブを磁石上に１分間置き、各洗浄の間にすべての上清を除去するように注意しながら、上清を除去する。

チューブをスピンダウンさせ、次いで磁石上に１分間置き、上清を除去する。ビーズを２００μｌのＬＷＢで１回洗浄する。ビーズを２００μｌのＮＷＢで２回洗浄する。ビーズを２００μｌの１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液で２回洗浄する。

インデックスＰＣＲ
注記：すべてのＰＣＲ酵素およびマスターミックスがストレプトアビジンビーズの存在下での増幅に適合性があるわけではないため、供給されたＰＣＲＲｅａｄｙＭｉｘを使用する。

最後の洗浄液を除去した後、チューブを磁気ラックから取り出し、２５μｌのＨｏｔＳｔａｒｔＰＣＲＲｅａｄｙＭｉｘ、５μｌのユニバーサルＰＣＲプライマー（ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＰｒｉｍｅｒ）、５μｌのインデックスプライマー（ＩｎｄｅｘＰｒｉｍｅｒ）（各試料に固有）、ならびに１５μｌのＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅフリーの蒸留水をビーズに加える。混合物をピペッティングによって混合し、０．２ｍｌのＰＣＲチューブに移す。このチューブをスピンダウンさせ、サーモサイクラーに入れて、以下のとおりのプログラム：９８℃で３分、１２サイクルの（９８℃で２０秒、６５℃で３０秒、７２℃で３０秒）、７２℃で１分、１２℃で保持を実行する。

サイズ選択
ＰＣＲチューブをスピンダウンし、磁石上に１分間置く。４７μｌの上清を１．５ｍｌチューブに移し、ビーズを廃棄する。５３μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）をチューブに添加して、総体積を１００μｌにする。ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズを３０秒間ボルテックスし、４５μｌの再懸濁したＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズを、試料を含む１．５ｍｌのチューブに加える。混合物をボルテックスして再懸濁させ、スピンダウンさせ、磁石から離して室温で１０分間インキュベートする。チューブをスピンダウンし、磁石上に５分間置く。１４５μｌの上清を新しい１．５ｍｌチューブに移し、ビーズを廃棄する。３５μｌのＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔビーズを１．５ｍｌチューブに加え、ボルテックスして再懸濁させ、スピンダウンさせ、磁石から離して室温で１０分間インキュベートする。チューブをスピンダウンし、磁石上に５分間置く。上清を除去する。チューブを磁石上に残し、ビーズを２００μｌの８０％エタノールで２回洗浄する。ビーズは、これらの洗浄のために再懸濁されない。チューブをスピンダウンし、磁石上に１分間置く。１０μｌのピペットチップを使用して、微量のエタノールを除去する。ビーズを、残留エタノールが残らなくなるまで５分間磁石上で空気乾燥させるが、過剰乾燥させない。ビーズを３０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁し、ピペッティングにより混合する。チューブをスピンダウンし、磁石から離して室温で２分間インキュベートする。チューブをスピンダウンし、磁石上に１分間置く。２８μｌの上清を新しい１．５ｍｌチューブに移す。このチューブはライブラリーを含む。サイズ選択されたライブラリーを、ＱｕｂｉｔＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒおよびＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＨＳキットを用いて定量化する。少なくとも６０ｎｇのＤＮＡが回収される。６０ｎｇ未満のＤＮＡが回収される場合、ライブラリーを廃棄する。ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎまたはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して、サイズ選択されたライブラリーのサイズ分布を検証し、ライブラリーのサイズ範囲は３５０ｂｐ～１０００ｂｐである。ライブラリーを－２０℃で最大６ヶ月保存する。

実施例６：低入力サンプル調製

これは、推奨入力が利用可能でないときに使用される。低試料入力により、複雑性の低い最終ライブラリーがしばしば得られる。

細胞
利用可能な細胞の数を使用し、細胞に対する実施例１の方法をヌクレアーゼ工程まで使用する。ヌクレアーゼ工程において、０．１μｌの予熱したヌクレアーゼ酵素混合物を第１のチューブに加え、０．５μｌの予熱したヌクレアーゼ酵素混合物を第２のチューブに加え、２．０μｌのヌクレアーゼ酵素混合物を第３のチューブに加える。

組織
利用可能な組織の量（少なくとも５ｍｇ）を使用し、組織に対する実施例１の方法をヌクレアーゼ工程まで使用する。ヌクレアーゼ工程において、０．１μｌの予熱したヌクレアーゼ酵素混合物を第１のチューブに加え、０．５μｌの予熱したヌクレアーゼ酵素混合物を第２のチューブに加え、２．０μｌのヌクレアーゼ酵素混合物を第３のチューブに加える。

実施例７：インデックスプライマー
以下のインデックスプライマーを使用する。

インデックスプライマーは以下のスキームに従って選択される。

実施例８：試料調製－ＭＮａｓｅ
試料の調製には、試料の種類：細胞または組織に応じて２つの別々のプロトコルがある。溶解物の定量化工程は、両方の試料の種類について同じである。試料の調製には２時間かけるべきである。

注記：１０倍のＨｉＣ洗浄緩衝液、１０倍の脱クロスリンク緩衝液、および２０％ＳＤＳは、保存時に沈殿した可能性がある。沈殿物がもはや見えなくなるまで、溶液を３７℃で１５分間インキュベートする。使用前にボルテックスして混合する。１０倍のＨｉＣ洗浄緩衝液を超純水で１倍に希釈する。室温で保存する。試料あたり約１５ｍＬの１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液が必要である。１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液もプロトコルの残りを通して使用することができる。１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液は室温で２ヶ月間安定している。１０倍の脱クロスリンク緩衝液を超純水で１倍に希釈する。室温で保存する。試料あたり約１ｍＬの１倍の脱クロスリンク緩衝液が必要である。１倍の脱クロスリンク緩衝液も近接ライゲーションプロトコルに使用することができる。１倍の脱クロスリンク緩衝液は、室温で２ヶ月間安定している。１．５ｍＬチューブについて撹拌熱ミキサーを１２５０ｒｐｍに設定しなければならない。使用前に氷上で緩衝液を解凍し、ボルテックスすることを含む、優良試験所基準を使用する。

細胞のためのプロトコル
１０ｘ１０^６細胞を出発物質として使用して、洗浄中の損失を考慮することが推奨される。１０ｘ１０^６未満の細胞が利用可能である場合、低入力プロトコルを参照されたい。開始前に、新鮮な１倍のＭＮａｓｅ消化緩衝液を調製し、室温で保存する。１倍のＭＮａｓｅ消化緩衝液は、室温で１日安定している。１倍のＭＮａｓｅ消化緩衝液を調製するために、１４０μｌの超純水、２０μｌの１０倍のＭＮａｓｅ消化緩衝液、２０μｌの１００ｍＭのＭｎＣｌ２、２０μｌの１０％トリトンを混合する。

細胞を回収し、１倍のＰＢＳで洗浄する。細胞を計数し、１０×１０^６細胞を等分し、２０００×ｇで５分間遠心分離する。上清を注意深く除去する。ペレットを５ｍｌの１倍のＰＢＳおよび１３５μｌの３７％ホルムアルデヒドに再懸濁する。試料を５ｍｌチューブに移し、細胞が沈降しないような速度で室温で１０分間回転させる。チューブを２０００×ｇで５分間遠心分離する。細胞ペレットが緩む可能性があるため、注意しながら上清を注意深く除去する。ペレットをＨｉＣ洗浄緩衝液で洗浄し、最初に２００μｌで凝集塊を破壊し、次いで残りの４．８ｍｌを添加し、上下にピペッティングしてペレットを完全に再懸濁する。チューブを２０００×ｇで５分間回転させ、上清を注意深く除去する。合計２回の洗浄のために洗浄工程を繰り返す。２回目の洗浄液を除去した後、ペレットを１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液１ｍｌに再懸濁し、ペレットを再懸濁する。細胞を計数し、１ｘ１０^６細胞を３つの別々のチューブに加え、残りの細胞を－８０℃で凍結したペレットとして保存する。３つのチューブを２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。各チューブ中のペレットを５０μｌの１倍のＭＮａｓｅ消化緩衝液（新しく調製した）に再懸濁する。チューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて２分間３０℃に予熱する。７．５μｌのＭＮａｓｅ酵素混合物を含む新鮮な１．５ｍｌチューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて３０℃で２分間予熱する。予熱したＭＮａｓｅ酵素混合物を、以下のように予熱した各チューブに、０．５μｌを第１のチューブに移し、２．０μｌを第２のチューブに移し、４．０μｌを第３のチューブに移す。チューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて３０℃で正確に３０分間インキュベートする。５μｌの０．５ＭのＥＤＴＡを添加して混合することによって、ＭＮａｓｅ反応を停止させる。３μｌの２０％ＳＤＳを添加して細胞を溶解し、細胞を１２５０ｒｐｍで撹拌熱ミキサー中３０℃で５分間インキュベートする。

組織のためのプロトコル
注記：６０ｍｇの組織を使用することが推奨される。６０ｍｇ未満の組織の細胞が利用可能である場合、低入力プロトコルを参照されたい。開始前に、新鮮な１倍のＭＮａｓｅ消化緩衝液を調製し、室温で保存する。１倍のＭＮａｓｅ消化緩衝液は、室温で１日安定している。１倍のＭＮａｓｅ消化緩衝液を調製するために、１４０μｌの超純水、２０μｌの１０倍のＭＮａｓｅ消化緩衝液、２０μｌの１００ｍＭのＭｎＣｌ２、２０μｌの１０％トリトンを混合する。少なくとも６０ｍｇの凍結組織を秤量し、図１Ａおよび図１Ｂで例示される稠度まで液体窒素中で乳鉢および乳棒を用いて微粉末に粉砕し、図１Ａは不十分な組織粉砕を示し、図１Ｂは十分な組織粉砕を示す。破壊した組織を、５ｍｌの１倍のＰＢＳおよび１３５μｌの３７％ホルムアルデヒドを含む５ｍｌチューブに移す。チューブを室温で１０分間回転させる。チューブを２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。組織がペレット化しない場合、チューブを最大速度で５分間回転させる。ペレットを２００μｌの洗浄緩衝液に再懸濁し、次いで４．８ｍｌの１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液を加える。チューブを２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。洗浄工程を２回行い、最終ペレットを１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液１ｍｌに再懸濁する。再懸濁した細胞を２００μｍフィルターに通して新鮮な５ｍｌチューブに入れ、必要に応じてフィルターを交換する。さらに２ｍｌの１倍のＨｉＣ洗浄緩衝液を２００μｍフィルターに通す。試料を３つの別々のチューブ中で３つの１ｍｌアリコートに分離し、各アリコートは２０ｍｇの組織に対応する。余剰組織をペレット化し、－８０℃で保存することができる。３つのチューブを２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去する。各チューブ中のペレットを５０μｌの１倍のＭＮａｓｅ消化緩衝液（新しく調製した）に再懸濁する。チューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて２分間３０℃に予熱する。７．５μｌのＭＮａｓｅ酵素混合物を含む新鮮な１．５ｍｌチューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて３０℃で２分間予熱する。予熱したＭＮａｓｅ酵素混合物を、以下のように予熱した各チューブに、０．５μｌを第１のチューブに移し、２．０μｌを第２のチューブに移し、４．０μｌを第３のチューブに移す。チューブを、１２５０ｒｐｍの撹拌熱ミキサーにおいて３０℃で正確に３０分間インキュベートする。５μｌの０．５ＭのＥＤＴＡを添加して混合することによって、ＭＮａｓｅ反応を停止させる。３μｌの２０％ＳＤＳを添加して細胞を溶解し、細胞を１２５０ｒｐｍで撹拌熱ミキサー中３０℃で５分間インキュベートする。

実施例９：ＭＮａｓｅ－Ｃライブラリーからの結果
本明細書中の方法を用いて近接ライゲーションライブラリーを調製し、配列決定してロングレンジ情報の尺度を決定した。図７は、ＤＮａｓｅ調製ライブラリー（「ＤＮａｓｅ－Ｃ」）、ならびに異なるクロスリンキング剤と比較したＭＮａｓｅ調製ライブラリー（「ＭＮａｓｅ－Ｃ」）を使用したリード分離を示す。各バーについて、最下部のセグメントは、ゲノムにおいて１ｋｂ超離れたリード対のパーセンテージを示し、中間のセグメントは、ゲノムにおいて１ｋｂ未満離れたリード対のパーセンテージを示し、最上部のセグメントは、染色体間相互作用を有するリード対のパーセンテージを示す。左から右へ、バーは、１）ホルムアルデヒドクロスリンカーを含むＤＮａｓｅ、２）ＤＳＧクロスリンカーを含むＤＮａｓｅ、３）１０分間反応させたＥＧＳクロスリンカーを含むＭＮａｓｅ、４）３０分間反応させたＥＧＳクロスリンカーを含むＭＮａｓｅ、５）１０分間反応させたＤＳＧクロスリンカーを含むＭＮａｓｅ、および、６）３０分間反応させたＤＳＧクロスリンカーを含むＭＮａｓｅの結果を示す。図８は、ＤＮａｓｅ－Ｃ調製ライブラリー（ＤＳＧおよびホルムアルデヒドクロスリンカーの両方を含む）と比較した、ＭＮａｓｅ－Ｃ調製ライブラリー（ＤＳＧおよびＥＧＳクロスリンカーの両方を含む）の１番染色体について計算した連鎖距離の分布を示す。ＤＳＧのより長いスペーサーアームを用いて調製されたＤＮａｓｅ－Ｃライブラリーは、図７にも反映されるように、ホルムアルデヒドを用いて調製されたＤＮａｓｅ－Ｃライブラリーと比較して、より大きい結合距離でリードのより大きい画分を示す。

ゲノムワイドヌクレオソームマッピングの測定値も決定した。図９は、異なる量のＭＮａｓｅおよび異なる消化時間：説明文に示されるように、０．０５単位で３０分間、０．５単位で３０分間、２．５単位で２０分間、および２．５単位で６０分間で調製したライブラリーの高占有率ＣＴＣＦ結合部位周辺の相対的なリードカバレッジを示す。図１０は、（左から右へ）０．０５単位（Ｕ）で３０分間（３０’）、０．５単位（Ｕ）で３０分間（３０’）、２．５単位（Ｕ）で２０分間（２０’）、および２．５単位（Ｕ）で６０分間（６０’）において、調製されたライブラリーにおいて見られるモノヌクレオソーム：ジヌクレオソームの比を示し、一番右にラダーがある。モノヌクレオソーム：ジヌクレオソームの比は、（左から右へ）０．９６、１．５１、２．３９、および４．８６であった。

実施例１０：ＭＮａｓｅ消化試料によるＨｉＣ分析
使用者は生体試料中の核酸結合タンパク質の位置を高い精度で決定することを望む。生体試料は、核酸結合タンパク質を、それらが結合している核酸にクロスリンクするために、化学的固定剤を使用してクロスリンクされる。次いで、固定された試料を、タンパク質に結合していないすべての核酸を消化する小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）で消化する。次いで、ＭＮａｓｅ処理した核酸をＤＮＡリガーゼで処理して、近接ライゲーション産物を得る。核酸を精製し、配列決定ライブラリーを作製する。配列決定ライブラリーを配列決定して、ＭＮａｓｅ消化試料のリード対を得る。核酸結合タンパク質に結合した核酸由来の配列のみが得られるので、リード対から、生体試料中の核酸結合タンパク質の局在化を高い精度で決定する。

実施例１１：ＭＮａｓｅ消化試料を含むＨｉＣｈＩＰ
ＭＮａｓｅＨｉＣｈＩＰ分析を以下のように行った。細胞の試料をホルムアルデヒドおよびＤＳＧクロスリンキングでクロスリンクし、ＭＮａｓｅでインサイチュで消化し、ＲＩＰＡ溶解緩衝液で溶解した。ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）およびＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾ヒストンに対する抗体を試料に接触させ、磁気ビーズを介してプルダウンした。末端平滑化、架橋ライゲーション、および凝集体内ライゲーションを含む近接ライゲーションを行った。次いで、クロスリンキングを脱クロスリンクさせ、ＤＮＡをクリーンアップし、配列決定ライブラリーを調製し、２０～４０００万の２×１５０ｂｐリードで配列決定した。

比較のため、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ分析を、同じ抗体を有する試料の並行セットに対して行った。手順は同じであったが、クロスリンキング、消化、および近接ライゲーションの工程は行わなかった。

図１１は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ（ＵＣＳＣ）ＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒからのＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＤＮＡＥｌｅｍｅｎｔｓ（ＥＮＣＯＤＥ）において報告されたピークと比較したＣｈＩＰ－ｓｅｑおよびＨｉＣｈＩＰの結果を示す。陰性対照ライブラリーは、全ゲノムにわたってカバレッジを示すが、ＣＴＣＦおよびＨ３Ｋ４ｍｅ３ライブラリーは、それらの結合部位についてのＥＮＣＯＤＥピークの位置と一致する遺伝子座における配列決定リードのパイルアップ（ｐｉｌｅ－ｕｐｓ）を示す。これは、これらのライブラリーがＣｈＩＰ－ｓｅｑシグナルを伝達し、リードがほぼ完全に、選択された抗体に対応するタンパク質が結合すると予想される領域からであることを示す。

図１２はＨｉＣｈＩＰ試料についてのＣＴＣＦ結合部位周辺の相対的なリードカバレッジを示す。相対的なリードカバレッジは約１４６ｂｐの周期性を示し、これはヌクレオソーム中のヒストンの存在によってＭＮａｓｅ消化から保護されるＤＮＡの領域と一致する。このことは、これらのライブラリーがＭＮａｓｅ－Ｃライブラリーの予想される保護的なプロファイルを有することを示している。

表３～５において、ｉｎｔｅｒ．ｃｈｒは染色体間であるリード対のパーセンテージを表し（ペア中の各リードは異なる染色体にマッピングされる）、＜１ｋｂは１ｋｂ未満のゲノム上での分離距離にわたるリード対のパーセンテージを表し、＞１ｋｂは１ｋｂを超えるゲノム上の分離距離にわたるリード対のパーセンテージを表し、ｆｒａｃＭａｐｐｅｄは、マッピングされたリード対のパーセンテージを表し、ｐｒｅＳｅｑＡｔ３００Ｍは、３億リードの集団からの固有のリードの数を表す。

表３は、ＭＮａｓｅ－Ｃライブラリーについての典型的なライブラリー品質管理（ＱＣ）メトリックを示す。染色体間リード対の割合は３３％～３５％であり、１ｋｂ未満の分離距離にわたるリード対の割合は７％～１２％であり、１ｋｂを超える分離距離にわたるリード対の割合は５５％～５８％であり、マッピングされた割合は６７％～７９％であり、３億のうちの固有のリード数は１．６８億～２．３８億の間である。表４に示すように、ＭＮａｓｅＨｉＣｈＩＰライブラリーのＱＣメトリックは、ＭＮａｓｅ－ＣライブラリーのＱＣメトリックと比較的類似しており、染色体間リード対は２１．６％～４３．４％であり、１ｋｂ未満にわたるリード対は１８．２％～３１．２％であり、１ｋｂ超にわたるリード対は２５．４％～５６．２％であり、３億のうちの２．７２億～２．７９億の固有のリードである。比較すると、ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーについてのＱＣメトリックは、ＭＮａｓｅ－Ｃライブラリー（または他の近接ライゲーションライブラリー）のようではなく、染色体間リードは０．４６％～１．６５％であり、１ｋｂ未満に及ぶリード対は９８．６４％～９９．４５％であり、１ｋｂ超に及ぶリード対は０．０９％～０．１６％である。

図１３は、標的タンパク質に関連するリードのパイルアップを示すリードカバレッジのグラフ（図１１に示す）、および遺伝子アノテーションのグラフにわたって提示されるリード対の接触マップを示す。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾は、近くの遺伝子の転写に関連する。密な接触（１３０１）領域は、リードカバレッジのＨ３Ｋ４ｍｅ３関連ピーク（１３０２）から始まり、左方向に続いているのが分かり、下に示されるように、この領域（１３０３）は、同じ方向に読み取られる遺伝子を含むものとしても注釈付けされる。同様に、（１３０４）において、密な接触領域が、リードカバレッジの別のＨ３Ｋ４ｍｅ３関連ピーク（１３０５）から始まり、右方向に続いているのが分かり、下に示されるように、この領域（１３０６）は、同じ方向に読み取られるＦＡＢＰ５遺伝子を含むものとしても注釈付けされる。ＣＴＣＦは、クロマチンループの形成に関連し、異なる遺伝子座に結合した２つのＣＴＣＦタンパク質が一体となり、それらの間のＤＮＡがループを形成する。トポロジー関連ドメイン（ＴＡＤ）を表す接触密度の三角形、例えば、ピーク（１３１１）、（１３１４）、（１３１７）、および（１３２０）を有するものが見られる。これらの三角形の左端および右端をなぞると、これらの領域の境界がＣＴＣＦ関連ピークと合い（例えば、（１３１１）はＣＴＣＦピーク（１３１２および１３１３）と、（１３１４）はＣＴＣＦピーク（１３１５および１３１６）と、（１３１７）はＣＴＣＦピーク（１３１８および１３１９）と、（１３２０）はＣＴＣＦピーク（１３２１および１３２２）と合う）、どの特定のＣＴＣＦ部位が一体となってどのループおよびドメインを形成するかの識別が可能となることが分かる。

図１４は図１１と同じＥＮＣＯＤＥピークに対するＭＮａｓｅＨｉＣｈＩＰ結果の比較であるが、同じ日およびその後の日の試料反復についての比較を示す。これは、プロトコルの整合性および再現性を示す。

全体として、これらの実験は、ＭＮａｓｅＨｉＣｈＩＰライブラリーがＣｈＩＰ－ｓｅｑ特徴、ＭＮａｓｅ特性、Ｈｉ－Ｃ特性を有し、タンパク質ピーク間でＨｉ－Ｃ相互作用を示し、プロトコルがロバストであり、高い再現性を有することを実証している。

実施例１２：分離－プール標識化アプローチを使用する近接ライゲーション

クロスリンキング剤で固定化された細胞を含む安定化された生体試料が得られる。試料をＤＮａｓｅで処理して、インサイチュで細胞中のＤＮＡを消化する。その後、試料を酵素で処理してＤＮＡの末端を平滑化し、ＤＮＡ末端をポリアデニル化する。次いで、細胞を９６ウェルプレートのウェルに、ウェル当たり１つの細胞で分注する。バーコードを各ウェルに加え、各ウェル中のＤＮＡ末端にライゲーションする。次いで、細胞をプールし、各ウェルに１つの細胞で再度分注する。第２のバーコードを付加し、各ウェル中の第１のバーコードにライゲーションする。次いで、細胞を再度プールし、ウェル当たり１つの細胞で再度分注し、架橋アダプターを、第２の架橋アダプターに適合性であるオーバーハングとライゲーションする。このアプローチを図１６に示す。次いで、近位端をライゲーションして、図１７に示す分子を得て、ここで、各末端は２つのバーコードと、他の末端上の別の架橋に結合する架橋とを有する。図１８は、分割およびプールのアプローチから生じるバーコードおよび架橋の組み合わせの例を示す。次いで、クロスリンキングを脱クロスリンクさせ、核酸を精製し、配列決定して配列情報を得る。

実施例１３：標的化アダプターを使用する近接ライゲーション

クロスリンキング剤で固定化された細胞を含む安定化された生体試料が得られる。試料をＤＮａｓｅで処理して、インサイチュで細胞中のＤＮＡを消化する。その後、試料を酵素で処理してＤＮＡの末端を平滑化し、ＤＮＡ末端をポリアデニル化する。次いで、試料を、ＤＮＡ中のヒストンに結合する抗体と接触させ、その後、試料を、ＤＮＡ末端をライゲーションする前に、複数のプロテインＡにテザリングされたビオチン化ライブラリーアダプターと接触させる。アダプターを、ヒストン結合抗体が結合した近位端間でライゲーションする。ストレプトアビジンを用いてビオチン化アダプターをプルダウンし、得られた精製試料上でクロスリンクを脱クロスリンクする。次いで、増幅およびＰＣＲを行って、配列情報を得る。

実施例１４：凝集体三次元核酸配置の決定は、細胞特異的情報を失う可能性がある。

三次元核酸配置分析のために細胞集団を収集する。集団の細胞は、１番染色体および２番染色体の領域を近接させる核酸配置を共有するが、３番染色体および４番染色体の領域は、細胞のすべてではないがいくつかにおいて近接している。安定化された核を分割し、断片化して内部末端を露出させ、ａｔｔＢタグを付け、次いで、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼの存在下で細胞識別情報を欠くａｔｔＰ結合核酸集団と接触させる。

ライブラリー成分を末端配列決定する。共通の分子上の１番染色体および２番染色体にマッピングされるリード対は、バックグラウンド上で示差的に観察されることが分かる。共通の分子上の３番染色体および４番染色体にマッピングされるリード対は、より低い頻度でバックグラウンド上で示差的に観察されることが分かる。

３番染色体および４番染色体が近接しているが、１番染色体および２番染色体よりも互いに遠く離れているかどうか、または細胞集団のメンバー間で配置の変動があるかどうかを区別することはできない。

実施例１５：細胞特異的な３次元核酸配置情報は、本明細書の方法によって保存される。

三次元核酸配置分析のために細胞集団を収集する。集団の細胞は、１番染色体および２番染色体の領域を近接させる核酸配置を共有するが、３番染色体および４番染色体の領域は、細胞のすべてではないがいくつかにおいて近接している。安定化された核を分割し、断片化して内部末端を露出させ、ａｔｔＢタグを付け、次いで、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼの存在下で細胞識別情報を有するａｔｔＰ結合核酸の集団と接触させる。

ライブラリー成分は、内部末端に隣接する配列、およびリンカーのパーティション識別配列の両方を得るために、末端配列決定される。共通の分子上の１番染色体および２番染色体にマッピングされるリード対は、パーティション識別配列とは無関係に、バックグラウンドの上で示差的に観察されることが分かる。共通の分子上の３番染色体および４番染色体にマッピングされるリード対は、細胞識別ライブラリー成分の第１の集団において１番染色体および２番染色体の対に匹敵するレベルで観察されるが、細胞識別ライブラリー成分の第２の集団においてバックグラウンド上では観察されないことが分かる。３番染色体および４番染色体の関連セグメントは、集団内で立体構造変化を示し、その結果、いくつかの細胞は、１番染色体および２番染色体のセグメントに匹敵する３番染色体および４番染色体のセグメントの三次元近接性を示すが、他の細胞は、１番染色体および２番染色体のセグメントに匹敵する３番染色体および４番染色体のセグメントの三次元近接性を示さないと結論付けられる。

実施例１６：細胞特異的な３次元核酸配置情報は定量的に測定される。

三次元核酸配置分析のために細胞集団を収集する。集団の細胞は、１番染色体および２番染色体の領域を近接させる核酸配置を共有するが、３番染色体および４番染色体の領域は、細胞間でそれらの近接性が定量的に変化する。安定化された核を分割し、断片化して内部末端を露出させ、ａｔｔＢタグを付け、次いで、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼの存在下で細胞識別情報を有するａｔｔＰ結合核酸の集団と接触させる。

ライブラリー成分は、内部末端に隣接する配列、およびリンカーのパーティション識別配列の両方を得るために、末端配列決定される。共通の分子上の１番染色体および２番染色体にマッピングされるリード対は、パーティション識別配列とは無関係に、バックグラウンド上で示差的に観察されることが分かる。共通分子上の３番染色体および４番染色体にマッピングされるリード対は、リード対頻度と組み合わせたパーティション識別配列情報によって示されるように、細胞に応じて変化するレベルで観察されることが分かる。１番染色体および２番染色体の示されたセグメントは、細胞集団全体にわたって近接していると結論付けられる。３番染色体および４番染色体の関連セグメントは、集団内で立体構造変化を示し、その結果、３番染色体および４番染色体の示されたセグメントの近接性に関して連続体にわたって定量的変化が存在すると結論付けられる。

実施例１７：ソラレンデンドリマーを用いた近接ライゲーション法

近接ライゲーションを用いる配列決定のために細胞試料を調製する。試料中の細胞を、ホルムアルデヒドおよびジスクシンイミジルグルタレートを用いてクロスリンクする。細胞からの核を、トリトンＸ溶液での処理によって単離する。ＰＡＭＡＭデンドリマーと混合されたＮＨＳ－エステル－ソラレンを混合して、中性ｐＨで反応してソラレン分子をデンドリマーにコンジュゲートさせる１級アミンで各ポリマーを終結させることによって作製されたソラレンデンドリマーを核に添加し、３６０ｎｍの光で光活性化する。核をＤＮａｓｅで消化し、末端をＴ／Ａライゲーションのために固定化する。アダプターを末端にライゲーションする。余剰なアダプターを洗い流す。アダプターは、近接ライゲーションを行う前にリン酸化される。ソラレンクロスリンクは、熱アルカリ処理または２５４ｎｍでのＵＶ照射によって脱クロスリンクされる。ＤＮＡを混合物から精製し、配列決定する。

本方法は、コンカテマーを生成し、より多くのクロスリンキング事象を有する閉じ込め領域を有する空間内に複数のＤＮＡ断片を維持し、それによって複数の接合部を形成する。

実施例１８：循環を用いる近接ライゲーション方法

核酸試料を断片化し、Ｔｎ５トランスポザーゼを用いてａｔｔＢでタグ付けした。核酸を捕捉ビーズに結合させ、ＰｈｉＣ３１を使用して、隣接するタグ付き断片を結合し、架橋オリゴヌクレオチドアダプターによって結合された２つの断片を有する組換え産物を作製した。核酸単離の前に、組換え産物の末端を除去し、クロスリンクを脱クロスリンクさせた。単離された組換え産物を環状化し、ＰＣＲを用いて試料核酸を増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、配列決定前にサイズ選択に供する（図３２および図３３）。この方法は、改善されたロングレンジ情報をもたらす（図３８）。

実施例１９：核試料調製

６２℃で０．３％ＳＤＳで細胞を処理することによって、近接ライゲーションのために核を調製した。核を遠心分離によって単離した後、上記のタグメンテーションおよび組換えの工程を行った。試料調製物は、改善されたカバレッジ均一性（図３４）、同等の有効なリードパーセンテージ、ｃｉｓ＞１ｋｂのパーセンテージ、ｃｉｓ＞１０ｋｂのパーセンテージ、ｃｉｓ＞１Ｍｂのパーセンテージ、および４００Ｍでの複雑性（図３５および図３６）を示した。調整された試料調製条件は、改善されたカバレッジおよび保持されたクロマチン立体構造情報をもたらした。

実施例２０：長い非コードＲＮＡ結合部位の分析

生体試料をクロスリンクし、クロマチンを調製し、ＲＮａｓｅＨで処理して、リボソームＲＮＡの試料を枯渇させる。クロマチンは、切断された末端にアデニル化／ビオチン化したオリゴヌクレオチドも付加するＴｎ５トランスポザーゼを用いて断片化される。クロマチンに結合したＲＮＡを、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いてアデニル化アダプターにライゲーションし、試料をプロテイナーゼＫで処理し、クロスリンクを脱クロスリンクする。ライゲーションしたＲＮＡの第２の鎖を逆転写酵素で伸長し、第２の鎖が産生され、ＤＮＡが精製される。ストレプトアビジンタグ付けエンドヌクレアーゼは、ビオチンタグ付けオリゴヌクレオチド付近のＤＮＡを消化する断片に結合される。配列決定ライブラリーを調製し、ビーズを用いてビオチンタグを有するＤＮＡを精製し、ｃＤＮＡ、アダプター、および結合ＤＮＡを有するライブラリーが得られる。この方法を図３９に例示する。

実施例２１：配列決定アダプターの組み込み方法

配列決定アダプターをトランスポザーゼに組み込むために様々な方法が使用される（図３７）。図３７の上部パネルにおいて、Ｔｎ５トランスポザーゼ、ならびにＴｎ５および配列決定アダプターによって認識されるモザイク末端（ＭＥ）を含むトランスポゾン末端は、トランスポソーム複合体を形成する。複合体は二本鎖ＤＮＡを断片化し、トランスポゾンを二本鎖ＤＮＡの末端に結合させ、それによってＤＮＡを断片化し、配列決定アダプターを付加する。図３７の左下のパネルにおいて、モザイク末端部位、配列決定アダプター、およびＡｔｔＢ部位は、トランスポザーゼとの単一反応においてトランスポゾンとしてＤＮＡに付加される。図３７の右下のパネルにおいて、モザイク末端部位および配列決定アダプターは、上のパネルのようにトランスポゾンとしてＤＮＡに付加され、ＡｔｔＢ部位は、別個のライゲーション反応において付加される。第１の方法では、断片サイズは２５０～２５００ｂｐの範囲であり、リードの約８６％はモザイク末端を有する。第２の方法では、断片サイズは２５～１０，０００ｂｐの範囲であり、リードの２９％はモザイク末端を含み、リードの１３％が２つのモザイク末端を有する。第３の方法では、断片サイズは２５０～２５００ｂｐの範囲であり、リードの９１％はモザイク末端を含有し、リードの３８％はライゲーションされたＡｔｔＢを含有する。

本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることが当業者には明らかであろう。当業者であれば、多くの変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく思い浮かぶであろう。本明細書に記載される実施形態に対する様々な代替物が採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、この特許請求の範囲内の方法および構造体、ならびにその均等物がそれによって包含されることが意図されている。

Claims

核酸処理の方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された試料を得る工程と、
（ｂ）前記核酸分子を、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを含む複数のセグメントへ切断する工程であって、切断する工程はトランスポザーゼによって達成される、工程と、
（ｃ）前記第１のセグメントおよび前記第２のセグメントに第１のリコンビナーゼ部位を結合させる工程と、
（ｄ）リコンビナーゼの存在下で、第２のリコンビナーゼ部位を含むリンカーに、前記第１のセグメントおよび前記第２のセグメントを接触させる工程であって、それによって、前記第１のセグメント由来の第１の配列と、前記リンカー由来のリンカー配列と、前記第２のセグメント由来の第２の配列とを含む結合された核酸を生成する、工程と、
を含む、方法。
前記トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである、請求項１に記載の方法。
前記第２のリコンビナーゼ部位は、直接反復配列として配向された２つのリコンビナーゼ部位を含む、請求項１に記載の方法。
前記リコンビナーゼはインテグラーゼである、請求項１に記載の方法。
前記インテグラーゼは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項４に記載の方法。
前記結合された核酸の５’末端を、前記結合された核酸の３’末端にライゲーションすることによって、前記結合された核酸を環状化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記結合された核酸の少なくとも一部を配列決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記配列決定する工程は、前記第１の配列の少なくとも一部および前記第２の配列の少なくとも一部を配列決定することを含む、請求項７に記載の方法。
前記第１の配列の少なくとも一部および前記第２の配列の少なくとも一部をゲノムにマッピングする工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
前記配列決定する工程からの情報を使用して、３次元ゲノムの分析を行う工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
前記安定化された試料はクロスリンクした試料である、請求項１に記載の方法。
前記安定化された試料を得る工程は、試料を得ることと、前記試料を安定化することとを含む、請求項１に記載の方法。
前記安定化された試料を得る工程は、前もって安定化された試料を得ることを含む、請求項１に記載の方法。
前記核酸結合タンパク質は、クロマチンまたはその成分を含む、請求項１に記載の方法。
前記第１のリコンビナーゼ部位および前記第２のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰおよびａｔｔＢインテグラーゼ部位を含む、請求項１に記載の方法。
前記第１のリコンビナーゼ部位は、前記第２のリコンビナーゼ部位とは異なる、請求項１に記載の方法。
前記第１のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位である、請求項１に記載の方法。
前記第２のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位である、請求項１に記載の方法。
前記結合された核酸は、ヘアピンループを形成しない、請求項１に記載の方法。
前記第１のリコンビナーゼ部位および前記第２のリコンビナーゼ部位は、トランスポザーゼモザイク末端を含む、請求項１に記載の方法。
前記リンカー配列はバーコード配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記バーコード配列はパーティション起源を示す、請求項２１に記載の方法。
前記バーコード配列は細胞起源を示す、請求項２１に記載の方法。
前記バーコード配列は細胞集団起源を示す、請求項２１に記載の方法。
前記バーコード配列は生物起源を示す、請求項２１に記載の方法。
前記バーコード配列は種起源を示す、請求項２１に記載の方法。
前記方法は４時間以下で完了する、請求項１に記載の方法。
前記安定化された試料は、５０，０００個以下の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
前記安定化された試料は、少なくとも１０，０００個の細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
前記安定化された試料、安定化された核を含む、請求項１に記載の方法。
前記安定化された試料は、５０，０００個以下の核を含む、請求項１に記載の方法。
前記安定化された試料は、少なくとも１０，０００個の核を含む、請求項３１に記載の方法。
前記安定化された試料は超音波処理されない、請求項１～３２のいずれか１つに記載の方法。
核酸処理の方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された試料を得る工程と、
（ｂ）前記核酸分子を、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを含む複数のセグメントへ切断する工程と、
（ｃ）前記第１のセグメントおよび前記第２のセグメントに第１のリコンビナーゼ部位を結合させる工程と、
（ｄ）リコンビナーゼの存在下で、第２のリコンビナーゼ部位を含むリンカーに、前記第１のセグメントおよび前記第２のセグメントを接触させる工程であって、それによって、前記第１のセグメント由来の第１の配列と、前記リンカー由来のリンカー配列と、前記第２のセグメント由来の第２の配列とを含む結合された核酸を生成し、前記第２のリコンビナーゼ部位は、直接反復配列として配向された２つのリコンビナーゼ部位を含む、工程と、
を含む、方法。
前記切断する工程はトランスポザーゼによって達成される、請求項３４に記載の方法。
前記トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである、請求項３５に記載の方法。
前記リコンビナーゼはインテグラーゼである、請求項３４に記載の方法。
前記インテグラーゼは、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項３４に記載の方法。
前記結合された核酸の５’末端を、前記結合された核酸の３’末端にライゲーションすることによって、前記結合された核酸を環状化する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
前記結合された核酸の少なくとも一部を配列決定する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
前記配列決定する工程は、前記第１の配列の少なくとも一部および前記第２の配列の少なくとも一部を配列決定することを含む、請求項３８に記載の方法。
前記第１の配列の少なくとも一部および前記第２の配列の少なくとも一部をゲノムにマッピングする工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
前記配列決定する工程からの情報を使用して、３次元ゲノムの分析を行う工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
前記安定化された試料は、クロスリンクした試料である、請求項３４に記載の方法。
前記安定化された試料を得る工程は、試料を得ることと、前記試料を安定化することとを含む、請求項３４に記載の方法。
前記安定化された試料を得る工程は、前もって安定化された試料を得ることを含む、請求項３４に記載の方法。
前記核酸結合タンパク質は、クロマチンまたはその成分を含む、請求項３４に記載の方法。
前記第１のリコンビナーゼ部位および前記第２のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰおよびａｔｔＢインテグラーゼ部位を含む、請求項３４に記載の方法。
前記第１のリコンビナーゼ部位は、前記第２のリコンビナーゼ部位とは異なる、請求項３４に記載の方法。
前記第１のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位である、請求項３４に記載の方法。
前記第２のリコンビナーゼ部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢインテグラーゼ部位である、請求項３４に記載の方法。
前記結合された核酸は、ヘアピンループを形成しない、請求項３４に記載の方法。
前記第１のリコンビナーゼ部位および前記第２のリコンビナーゼ部位は、トランスポザーゼモザイク末端を含む、請求項３４に記載の方法。
前記リンカー配列はバーコード配列を含む、請求項３４に記載の方法。
前記バーコード配列は、パーティション起源を示す、請求項５４に記載の方法。
前記バーコード配列は、細胞起源を示す、請求項５４に記載の方法。
前記バーコード配列は、細胞集団起源を示す、請求項５４に記載の方法。
前記バーコード配列は、生物起源を示す、請求項５４に記載の方法。
前記バーコード配列は、種起源を示す、請求項５４に記載の方法。
前記方法は４時間以下で完了する、請求項３４に記載の方法。
前記安定化された試料は、５０，０００個以下の細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
前記安定化された試料は、少なくとも１０，０００個の細胞を含む、請求項６１に記載の方法。
前記安定化された試料は、安定化された核を含む、請求項３４に記載の方法。
前記安定化された試料は、５０，０００個以下の核を含む、請求項３４に記載の方法。
前記安定化された試料は、少なくとも１０，０００個の核を含む、請求項６４に記載の方法。
前記安定化された試料は超音波処理されない、請求項３４～６５のいずれか１つに記載の方法。
方法であって、
（ａ）少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子を含む安定化された生体試料を得る工程と、
（ｂ）複合体を形成するために前記核酸分子をデンドリマーと接触させる工程であって、デンドリマーの１つ以上のポリマーが末端の一級アミンを含む、工程と、
（ｃ）前記核酸分子を、少なくとも第１のセグメントおよび第２のセグメントを含む複数のセグメントへ切断する工程と、
（ｄ）前記複数のセグメントの第１のセグメントおよび第２のセグメントを接合部で結合させる工程と、を含む、方法。
前記デンドリマーはクロスリンカーで修飾される、請求項６７に記載の方法。
（ｂ）の前に、前記デンドリマーをクロスリンカーに接触させる工程をさらに含む、請求項６７に記載の方法。
前記クロスリンカーはソラレン、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンを含む、請求項６８または６９に記載の方法。
前記ソラレンはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル－コンジュゲートソラレンを含む、請求項７０に記載の方法。
前記デンドリマーはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを含む、請求項６７～７１のいずれか１つに記載の方法。
（ｅ）前記デンドリマーから前記クロスリンカーを分離する工程をさらに含む、請求項６８～７２のいずれか１つに記載の方法。
分離する工程は熱アルカリ処理を含む、請求項７３に記載の方法。
分離する工程はＵＶ放射への曝露を含む、請求項７３に記載の方法。
前記複数のセグメントの一部は結合してコンカテマーを形成する、請求項６７～７５のいずれか１つに記載の方法。
前記コンカテマーは少なくとも３個のセグメントを含む、請求項７６に記載の方法。
前記コンカテマーは少なくとも４個のセグメントを含む、請求項７６に記載の方法。
前記コンカテマーは少なくとも５個のセグメントを含む、請求項７６に記載の方法。
前記コンカテマーは少なくとも６個のセグメントを含む、請求項７６に記載の方法。
前記コンカテマーは少なくとも８個のセグメントを含む、請求項７６に記載の方法。
前記コンカテマーは少なくとも１０個のセグメントを含む、請求項７６に記載の方法。
前記デンドリマーの分子量は、５キロダルトン（ｋＤａ）～１２５ｋＤａである、請求項６７～８２のいずれか１つに記載の方法。
前記デンドリマーの分子量は、６ｋＤａ～８ｋＤａである、請求項６７～８３のいずれか１つに記載の方法。
前記デンドリマーの分子量は、２５ｋＤａ～３５ｋＤａである、請求項６７～８３のいずれか１つに記載の方法。
前記デンドリマーの分子量は、１１０ｋＤａ～１２５ｋＤａである、請求項６７～８３のいずれか１つに記載の方法。
前記デンドリマーは３２～５１２個の反応基を含む、請求項６７～８２のいずれか１つに記載の方法。
前記デンドリマーは約３２個の反応基を含む、請求項６７～８７のいずれか１つに記載の方法。
前記デンドリマーは約１２８個の反応基を含む、請求項６７～８７のいずれか１つに記載の方法。
前記デンドリマーは約５１２個の反応基を含む、請求項６７～８７のいずれか１つに記載の方法。
（ｂ）の後に、デンドリマー複合体を光活性化する工程をさらに含む、請求項６７～９０のいずれか１つに記載の方法。
（ｆ）複数の選択されたセグメントを得るために、前記複数のセグメントをサイズ選択に供する工程をさらに含む、請求項６７～９１のいずれか１つに記載の方法。
切断する工程は、前記核酸分子をデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）と接触させることを含む、請求項６７～９２のいずれか１つに記載の方法。
ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、小球菌ヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９３に記載の方法。
前記安定化された生体試料はクロスリンキング剤で処理される、請求項６７～９４のいずれか１つに記載の方法。
前記クロスリンキング剤は化学的固定剤である、請求項９５に記載の方法。
前記化学的固定剤は、ホルムアルデヒド、ソラレン、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、紫外線、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９６に記載の方法。
前記クロスリンキング剤は、クロルメチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、メルファラン、ベンダムスチン、ビス（２－クロロエチル）エチルアミン、ビス（２－クロロエチル）メチルアミン、トリス（２－クロロエチル）アミン、イソファミド（ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、シシクロプラチン（ｃｉｃｙｃｌｏｐｌａｔｉｎ）、エプタプラチン（ｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、ロバプラチン、ミリプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド（ｍｉｔｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、テモゾロミド、マイトマイシンＣ、亜硝酸、ホルムアルデヒド、アセチルアルデヒド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンを含む、請求項９５に記載の方法。
前記安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料である、請求項６７～９４のいずれか１つに記載の方法。
前記安定化された生体試料は安定化された細胞溶解物を含む、請求項６７～９８のいずれか１つに記載の方法。
前記安定化された生体試料は安定化された無傷細胞を含む、請求項６７～９８のいずれか１つに記載の方法。
前記安定化された生体試料は安定化された無傷の核を含む、請求項６７～９８のいずれか１つに記載の方法。
工程（ｃ）は、前記無傷細胞または前記無傷の核の溶解の前に実施される、請求項１０１または１０２に記載の方法。
工程（ｄ）の前に、前記安定化された生体試料中で細胞および／または核を溶解させる工程をさらに含む、請求項６７～１００のいずれか１つに記載の方法。
前記安定化された生体試料は３，０００，０００未満の細胞を含む、請求項６７～９８のいずれか１つに記載の方法。
前記安定化された生体試料は１，０００，０００未満の細胞を含む、請求項６７～９８のいずれか１つに記載の方法。
前記安定化された生体試料は１００，０００未満の細胞を含む、請求項６７～９８のいずれか１つに記載の方法。
結合させる工程は、ビオチンタグ付きヌクレオチドを使用して粘着末端をｆｉｌｌ－ｉｎすること、および平滑末端をライゲーションすることを含む、請求項６７～１０７のいずれか１つに記載の方法。
結合させる工程は、少なくとも１つの架橋オリゴヌクレオチドに、少なくとも前記第１のセグメントおよび前記第２のセグメントを接触させることを含む、請求項６７～１０７のいずれか１つに記載の方法。
前記架橋オリゴヌクレオチドはバーコード配列を含む、請求項１０９に記載の方法。
結合させる工程は、少なくとも前記第１のセグメントおよび前記第２のセグメントを、複数の架橋オリゴヌクレオチドに連続して接触させることを含む、請求項１１０に記載の方法。
結合させる工程は、架橋オリゴヌクレオチドの固有の配列を受け取る安定化された生体試料の試料、細胞、核、染色体、または核酸分子をもたらす、請求項１０９に記載の方法。
結合させる工程は、少なくとも前記第１のセグメントおよび前記第２のセグメントをバーコードに接触させることを含む、請求項６７～１０７のいずれか１つに記載の方法。
（ｇ）第１のリード対を生成するために前記接合部の各側で少なくともいくつかの配列を得る工程をさらに含む、請求項６７～１１３のいずれか１つに記載の方法。
（ｈ）前記第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、
（ｉ）ゲノムに対する順序および／または配向を表す前記コンティグのセットを通る経路を決定する工程と、
をさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
（ｈ）前記第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、
（ｉ）前記コンティグのセットから、前記安定化された生体試料中の構造バリアントの存在またはヘテロ接合性の喪失を決定する工程と、
をさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
（ｈ）前記第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、
（ｉ）前記コンティグのセット内のバリアントをフェーズに割り当てる工程と、
をさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
（ｈ）前記第１のリード対をコンティグのセットにマッピングする工程と、
（ｉ）前記コンティグのセットから、前記コンティグのセットにおけるバリアントの存在を決定する工程と、
（ｊ）（１）前記安定化された生体試料についての疾患段階、予後、または処置の経過を同定すること、（２）前記バリアントの存在に基づいて薬物を選択すること、または、（３）前記安定化された生体試料についての薬物効力を同定すること、のうちの１つ以上から選択される工程を行う工程と、
をさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
分析の方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも１つの核酸結合タンパク質に複合体化された核酸分子および少なくとも１つの非コードＲＮＡを含む安定化された生体試料を得る工程と、
（ｂ）Ｔｎ５トランスポザーゼ、ならびに、モザイク末端および検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチドに、ＤＮＡ分子を接触させる工程であって、それによって前記ＤＮＡ分子を断片化し、断片化したＤＮＡ分子の末端にオリゴヌクレオチドを結合させる、工程と、
（ｃ）断片をＴ４ＲＮＡリガーゼに接触させる工程であって、それによって前記非コードＲＮＡを前記オリゴヌクレオチドにライゲーションし、前記断片化したＤＮＡ分子のクロスリンクを脱クロスリンクする、工程と、
（ｄ）二本鎖ＤＮＡ断片を作製するために、ライゲーションされたＲＮＡを逆転写酵素で伸長させる工程と、
（ｅ）前記検出可能な標識に結合する薬剤に結合されたエンドヌクレアーゼに前記二本鎖ＤＮＡ断片を接触させる工程であって、それによって前記検出可能な標識付近のＤＮＡを消化する、工程と、
（ｆ）配列決定アダプターを（ｅ）の生成物に結合させる工程と、
ｔを含む、方法。
前記非コードＲＮＡは長い非コードＲＮＡである、請求項１１９に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドはアデニル化されている、請求項１１９に記載の方法。
前記検出可能な標識はビオチンを含む、請求項１１９に記載の方法。
前記薬剤はストレプトアビジンを含む、請求項１１９に記載の方法。
前記エンドヌクレアーゼは、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、小球菌ヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１１９に記載の方法。
（ｆ）の前記生成物を濃縮する工程をさらに含む、請求項１１９に記載の方法。
前記二本鎖ＤＮＡ断片の配列を得る工程をさらに含む、請求項１１９に記載の方法。
（ｂ）の前に、前記安定化された生体試料をＲＮａｓｅＨに接触させる工程をさらに含む、請求項１１９に記載の方法。
前記安定化された生体試料はクロスリンクしたパラフィン包埋した組織試料である、請求項１１９～１２７のいずれか１つに記載の方法。
前記安定化された生体試料は安定化された細胞溶解物を含む、請求項１１９～１２７のいずれか１つに記載の方法。
前記安定化された生体試料は安定化された無傷細胞を含む、請求項１１９～１２７のいずれか１つに記載の方法。
前記安定化された生体試料は安定化された無傷の核を含む、請求項１１９～１２７のいずれか１つに記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドはバーコードをさらに含む、請求項１１９～１３１のいずれか１つに記載の方法。