JP2024501942A - ナノ粒子製剤のエアロゾル化方法 - Google Patents

Abstract

大気中にナノ粒子を送達するために、前記ナノ粒子を含む液剤が提供され、高作動圧力ｐまで加圧される。前記液剤は、少なくとも１つのスプレーオリフィスからなるスプレーノズルオリフィスを通じて前記高作動圧力で供給され、前記液剤を、前記複数のナノ粒子のうちの少なくとも１つのナノ粒子を含有する連続する液滴からなるジェットとして吐出する。前記複数のナノ粒子は、長さλで伸長時の破損前最大長さλmaxを有し、前記液状製剤は、前記スプレーノズルオリフィスを通過する間に、壁せん断速度γwall［毎秒］を受ける。本発明によれば、前記液剤は、λmax／（λ・γwall）秒未満の制限されたせん断時間ｔの間に、前記スプレーノズルオリフィス内で前記壁せん断速度に晒される。

Description

本発明は、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ベシクル、リポソームおよび抗体を含有する製剤を含む、ナノ粒子製剤をエアロゾル化する方法に関する。

現行の水性エアロゾル化装置として、例えば、噴霧器やソフトミスト吸入器が挙げられる。噴霧器は、圧縮空気、超音波源、または振動メッシュ／膜のいずれかを用いてエアロゾルを生成することで、製剤を分散させる。ソフトミスト吸入器は、マイクロジェットが非常に高速で衝突することによって、微細な水滴からなるミストを生成する。

欧州特許出願公開第３．５６３．８９４号明細書 国際公開第２００２／１３７８６Ａ２号

特許文献１は、このようなソフトミスト吸入器等の一例を開示しており、特に、懸濁液またはエマルジョンまたはリポソーム流体のような非ニュートン流体を噴霧するために使用される直径の小さなノズルを使用している。この既知の噴霧器は、流体を５～２５０ＭＰａの作動圧力に加圧し、加圧された流体を３～２０ミクロンの範囲の水力直径を有する２つの相互に傾斜した流路に強制的に通すための、流体ポンプを備える。これにより、非常に高速で交差する２つの流体ジェットが生成され、これらが互いに衝突することで微細な水滴からなるミストが生成される。２つの流体ジェットの高速でのこの衝突は、流体とそこに含まれる粒子とに大きな影響を与える。壊れやすく繊細なナノ粒子は、このような条件下で損傷を受ける傾向があり、多くの場合、エアロゾル化プロセスに耐えられないことが判明している。

特許文献２は、流体の流れから粒子を生成する装置と方法とを開示しており、この技術では、流体の流れを個々の液滴に変えるために振動器が使用される。流体は帯電されており、振動器は、特に、少なくとも１００ミクロンの直径を有するノズルチャネルから出てくる帯電流体に作用することができる超音波圧電トランスデューサー（変換器）を備える。この既知の方法および装置は、超音波源または振動するメッシュ／膜に起因して、かなりの機械的応力を流体に与える。流体中に含まれる分子は、せん断応力の原因となるその応力に晒され、これらの分子の分解が誘導される。そのため繊細で壊れやすい分子は、この既知の装置および方法を使用すると分解されやすい。さらに、この噴霧機構は、少なくとも１００ミクロンのノズル直径と共に、この公知の装置を、比較的大きな寸法での用途にのみ適したものとする。例えば、ノズル直径を１００ミクロンから５ミクロンに縮小すると、カプセル化化合物に対するダメージは何倍にも増加する。したがって、この公知の方法と装置は、より小さなノズルを必要とするサブミクロンの範囲では使用できず、ノズル径を小さくすると、壁面のせん断力がますます大きくなるため、流体に内包される化合物に対してさらに大きなダメージを引き起こす可能性がある。

本発明の目的は、特に、複合タンパク質、ペプチド、長鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ、大型ベシクル、リポソームおよび／または抗体を含有する製剤などの、応力感受性ナノ粒子をエアロゾル化するときに分子の完全性を維持する、複数のナノ粒子を含有する流体組成物のエアロゾル化方法を提供することである。

この目的のために、本発明は、大気中にナノ粒子を送達するための方法を提供する。この方法は：
粒子長（λ）を有する複数のナノ粒子を液体中に供給して液剤を生成すること；
前記液剤を適切な作動圧力（ｐ）まで加圧して、加圧液剤を用意すること；
前記加圧液剤を、スプレーノズルオリフィスであって、当該オリフィスの入口と出口との間のチャネル長（Ｌ）、および、前記入口と前記出口との間の平均チャネル直径（Ｈ）を有するスプレーノズルオリフィスを通して供給し、速度を有する前記液剤の液体流を生成すること；
を含み、
前記適切な動作圧力は１０ＭＰａ未満に、前記速度は１００ｍ／ｓ未満であり、
前記オリフィスは、前記平均チャネル直径（Ｈ）よりも短いチャネル長（Ｌ）を有し、
前記液体流は、各々が前記複数のナノ粒子のうちの少なくとも１つのナノ粒子を含む連続的な液滴からなるジェットとして前記出口に集められる。

特定の実施形態では、本発明に係る方法は、液剤が、複合タンパク質、大型生体分子、長鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ、ウイルス、大型ベシクル、リポソーム、バクテリオファージ、および抗体を含む群から選択される、せん断応力感受性ナノ粒子を含み、オリフィスが平均チャネル直径（Ｈ）の半分よりも短いチャネル長（Ｌ）を有することを特徴とし、好ましくは、オリフィスは、最大で平均チャネル直径（Ｈ）の４分の１であるチャネル長（Ｌ）を有することを特徴とする。実際には、このような繊細で壊れやすい分子やナノ粒子であっても、前述の条件が満たされれば、その完全性が保たれる可能性があることがわかる。

本発明に係る方法の一実施形態では、液剤は、１００，０００ｇ／ｍｏｌ超過の分子量を有するタンパク質および／または抗体分子、特に、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子などのヌクレオチド化合物を含む。

本発明に係る方法のさらなる実施形態では、液剤は、平均サイズが２０ナノメートル超過のバクテリオファージを含む。

本発明に係る方法のさらなる実施形態では、液剤は、脂質ナノ粒子またはリポソーム、特に肺サーファクタントを含み、その長さは２０ナノメートルよりも大きい。ここで、特に液剤は、タンパク質、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ワクチン、ウイルス、バクテリオファージ、および分子量が１００，０００Ｄａを超える抗体を含む群から選択されるナノ粒子を含む内容物を有するベシクルを含む。

本発明に係る方法のさらなる実施形態では、ノズルオリフィスは、１ミクロン～１０ミクロンの実質的に一定の直径（Ｈ）を有する。

本発明に係る方法のさらなる実施形態では、ノズルオリフィスは、１ミクロン～１０ミクロンの平均直径（Ｈ）を有し、オリフィスは、入口から出口までの長さの少なくとも一部にわたって先細り形状である。特に、ノズルオリフィスは、実質的に５°～４５°の間のテーパで、入口の入り口から出口に向けて細くなる正のテーパを備える。

本発明に係る方法のさらなる実施形態では、ノズルオリフィスの内壁は、疎水性スリップ流を可能にするコーティングを備える。

特定の実施形態において、本発明に係る方法は、ナノ粒子が伸長時に破断するまでの最大粒子長λ_maxを有し、液剤は、スプレーノズルオリフィスを通過する間に壁せん断速度γ_wall［毎秒］に供され、液剤は、λ_max／（λγ_wall）秒未満のせん断時間（ｔ）の間、スプレーノズルオリフィス内で壁せん断速度に晒されることを特徴とする。

脂質ナノ粒子、ベシクル、リポソーム、およびその他の球状コアシェル粒子の場合、λ_max／λ比は、３～５の間の典型的な小さな範囲にあり、平均は４であり、サイズ２０ｎｍを超える粒子サイズにはほとんど依存しないことが実験的に見出されている。ＤＮＡ、ＲＮＡ、荷電巨大分子電解質などの、直鎖状、コイル状で剛直な分子、またはナノ粒子の場合、比λ_max／λは、分子量またはナノ粒子の重量が１００，０００を超える場合に、４～６の範囲であることが実験的にわかっている。

短い分子は最大伸びがより小さいが、その反面で剛性がより高く、せん断力による破断の影響を受けにくい。より大きい分子（５００，０００Ｄａ超過）は、より大きい最大伸びを示すが、その反面で、せん断力による破断の影響をより受けやすい。これらの流体力学的効果は、破断に対する感受性を互いに補い合う傾向にある。

蛋白質や大型抗体のような柔軟な分子では、比λ_max／λは、分子量が１００，０００を超える分子では２～５であることが実験的にわかっている。バクテリオファージやウイルスなどの半硬質ナノ粒子では、比λ_max／λは、１００，０００を超えるナノ粒子重量の場合２～６の間の広い範囲にあることが実験的に見出されている。安全側にたつために、本発明に係る方法の好ましい実施形態では、比λ_max／λを４に設定することを特徴とする。

例えば、肺サーファクタントのような、非常に応力に敏感で、非常に複雑で、大きなナノ粒子（＞１００ｎｍ）の場合、比λ_max／λは、２～６の間の典型的な範囲にあることが実験的に判明している。また、ナノ粒子サイズ効果も、破断に対する感受性を互いに補い合う傾向がある。しかしながら、これらの非常に複雑な種類のナノ粒子については、補正作用も含めて、比λ_max／λは４ではなく２に設定することが最適であり得る。

体積平均分解は、通常は、壁せん断速度γ_wallよりも小さい値を有するγ_partにより決定される。このことは、この実施形態によれば、ナノ粒子製剤の分解を回避するための一般的な基準、すなわち、γ_wallｔ＝λ_max／λ＜４、が安全側に設定され、サイズλが２０ｎｍ超過のおよび／または分子量が１００，０００Ｄａを超える応力感受性を有するナノ粒子を保護することを意味する。非常に複雑で大きなナノ粒子（λ＞１００ｎｍ）については、より安全なマージンを、γ_wallｔ＝λ_max／λ＜２、に設定することができる。

この壁せん断速度とせん断時間の相互条件により、驚くべきことに、１～１０ミクロンの間の小さな直径と、２ミクロンを超えない長さを有するスプレーノズルを使用して、２～２０ミクロンの間の液滴を作製するためのエアロゾル化プロセス中に、長鎖分子とベシクルの両方の分子の完全性を維持することが可能であるように思われる。驚くべきことに、従来の噴霧器よりも少なくとも１０～１００倍の大きな壁せん断速度を使用しても、非常に短い時間の間、ナノ粒子製剤の分子の完全性が依然として保存される可能性のあることが見出された。

本発明による洞察によれば、これらの条件は、１～１０ミクロンの間の小さな直径および２ミクロン未満のノズル長を有するスプレーオリフィスを使用することによって、特に充足される。これにより、ノズルは、壁せん断速度γ_wallが高くても、ノズル壁からさらに離れた流体中のナノ粒子が、高い壁せん断速度γ_wallにあまり影響されないように構成される。壁せん断速度γ_wallは、壁面近傍と壁面に垂直な方向の速度差を、壁面までの距離で割ったものであり、単位は毎秒である。ナノ粒子に対するせん断応力は、粒子の長さにわたる局所的な速度勾配に由来し、ナノ粒子上の速度差をナノ粒子の大きさで割ったものを、ここでは、単位は毎秒の、粒子せん断速度γ_partと呼ぶ。

本発明の背後にあるさらなる洞察によると、ナノ粒子に作用する抗力は、ナノ粒子の張力とその後の破壊を誘発する可能性があり、主に粒子せん断速度γ_partに比例し、その値は、実質的に壁せん断速度γ_wall未満である。放物線状の速度分布を持つ長いパイプでは、壁せん断速度γ_wallと壁近傍の粒子せん断速度γ_partは、８Ｖ／Ｈである。しかし、パイプの中央部での粒子せん断速度γ_partはゼロである。さらに、液体はパイプの中央を速度２Ｖで流れるが、パイプの壁付近では実質的に流れがない。したがって、パイプ内の体積平均粒子せん断速度γ_partは、流れの種類とパイプの長さに応じて、長いパイプや中程度のパイプについては約４Ｖ／Ｈの間で変化し、短いパイプまたはオリフィスについては実質的に小さい値まで変化する。体積平均粒子せん断速度γ_partを低減させるために、本発明によれば、比較的短いパイプまたはオリフィスを使用することがより好ましいと思われるので、その直径と比べて比較的短いオリフィスが使用される。

本発明の洞察によれば、大きい巨大分子（macromolecules）または大きいベシクルは、粒子せん断速度γ_partに比例する流体力学的せん断力による変形力に耐えるのに充分な剛性または固有抵抗を有していない。本発明の基礎となるさらなる洞察によると、体積平均粒子せん断速度γ_partは、壁近傍の壁せん断速度γ_wallよりも実質的に小さく、ナノ粒子の完全性を維持するための安全な状態は、せん断時間が好ましくはλ_max／（λ・γ_wall）未満であることである。次に、λ_max／（λ・γ_wall）秒のせん断時間において、壁面付近のナノ粒子は、λ×λ_max／（λ・γ_wall）＝λ_maxの約γ倍の、長さλで伸長または変形される。エアロゾル化装置は、λ_max／（λ・γ_wall）秒未満の超短せん断時間ｔの間に、１秒あたりの壁せん断速度γ_wallを課す条件を与えることができるものでなければならない。その結果、ノズル壁付近のナノ粒子だけでなく、ノズル壁からより離れたナノ粒子も、その完全性を維持する。

本発明に係る方法のさらなる実施形態では、壁せん断速度γ_wallは、１００，０００を大きく上回り、特に毎秒１，０００，０００を超える。

本発明に係る方法のさらなる実施形態では、ナノ粒子は、１００，０００ｇ／ｍｏｌより大きい分子量を有する巨大分子を含む。ここで、巨大分子またはナノ粒子は、比λ_max／λが少なくとも２、好ましくは比λ_max／λが少なくとも４である。

本発明に係る方法のさらなる実施形態では、ノズルオリフィスは、直径Ｈおよび長さＬで以下のせん断条件を有するオリフィスから出る、平均速度Ｖを有するジェットを生成する：
γ_part＜γ_wall＝８Ｖ／Ｈ，ｔ＝Ｌ／Ｖ＝λ_max／（λ・γ_wall）＜λ_max／(λ・γ_part）
または
γ_part・ｔ＜γ_wall・t＝８Ｌ／Ｈ

本発明に係る特定の実施形態は、直径Ｈが１～１０ミクロンで長さＬが２ミクロン未満の小ノズルを通じて、２～２０ミクロンのサイズのエアロゾル液滴を生成するエアロゾル化中のナノ粒子製剤は、実質的に４×１０^-6秒（最大ナノ粒子伸長λ_max／λが４の場合、γ_wall・ｔ＜４が得られる）より短い超短せん断時間ｔの間に、実質的に１，０００，０００／秒を超える壁せん断速度γ_wallを受けることを特徴とする。タンパク質、ペプチド、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ベシクル、リポソーム、脂質ナノ粒子および抗体などのせん断応力に敏感なナノ粒子を含む液剤をエアロゾル化する場合、γ_wall・ｔ＝８Ｌ／Ｈという条件は、Ｌ＜Ｈ／２、すなわちノズルの長さＬがノズルの直径Ｈの半分を超えてはならないこと、を示す。

ノズル長をさらに短くすると、ノズル壁面の総面積が減少し、ナノ粒子に対する壁せん断への寄与が減少するため、ノズル長さＬはノズル直径の４分の１を超えてはならないこと、つまりＬ＜Ｈ／４であることが望ましい。これは、典型的には１００ｎｍを超えるサイズを有する非常に複雑で応力感受性のあるナノ粒子に、特に適用される。好ましくは、本発明によれば、ノズルは、動作中にナノ粒子のせん断速度を減少させるプラグフローおよびスリップフロー状態を示す、長さの短いオリフィスと共に使用される。プラグフロー状態では、ノズル壁から離れた粒子せん断速度は、より均一な速度分布に起因してかなり小さくなり、スリップフロー条件（例えば、疎水性ノズル壁を使用する）を生成し、ノズル壁付近の粒子せん断速度をも減少させる。好ましくは、ノズルがプラグ流とスリップ流の両方を同時に組み合わせて、体積平均粒子せん断速度を減少させる。

本発明に係る方法のさらなる実施形態は、装置が、直径Ｈが１～１０ミクロンで、長さＬがＬ＜Ｈ／２であり、ノズル圧力が１０～１００バールであるノズルから出る、平均速度Ｖのジェットを生成することを特徴とする。ノズル圧力を増加させることによってジェットの速度Ｖを１０ｍ／ｓを超えて増加させると、分解量を減少させることも見出されており、最適な操作圧力である約３０～８０バールがナノ粒子製剤の分解のリスクを低減させることが見出されている。

１００ｂａｒ以上の操作圧力においておよそＶ＝１００ｍ／ｓ以上の平均流速であることは、ナノ粒子の完全性にとって有害であることが判明している。おそらく、このような流速を達成するために１００ｂａｒを超える高い操作圧力がかかるため、製剤中に激しい乱流を引き起こし、ナノ粒子が破壊される可能性があるためであろう。また、そのような高いノズル圧力では、ノズルから出る液体ジェットが非常に多くの運動エネルギーを伴い、ジェットの直径の約２倍の連続した液滴からなるジェットを生成するよりも前に、ジェットは直ちに崩壊する。ジェットの望ましくない乱流と崩壊はまた、体積平均粒子せん断速度の著しい増加とナノ粒子の破壊レベルの増加をもたらす。乱流および崩壊へのこの望ましくない移行は、ジェット質量密度ρ×ジェット速度Ｖ×ノズル直径Ｈをジェット粘度ηで割った比が、２，５００より大きくなる（ρ・Ｖ・Ｈ／η＞２５００）ときはいつでも起こり得る。したがって、本発明に係る方法のさらに好ましい実施形態は、流体の質量密度（ρ）と、オリフィス内の流体速度（Ｖ）と、ノズル直径（Ｈ）と、の積を流体の粘度（η）で割った、ρ・Ｖ・Ｈ／ηとして表されるものが、２，５００未満に維持されることを特徴とする。

さらなる好ましい実施形態では、本発明に係る方法は、該ノズルオリフィスが基板によって支持される共通の膜層を通って延在する実質的に同一の複数のノズルオリフィスの集合体の一部であり、ここで基板は、上記複数のオリフィスの集合体のうちのノズルオリフィスまで延びる少なくとも１つのキャビティ（空洞）を有し、液剤は、そのキャビティに上記操作圧力で共に導入され、複数のオリフィスの集合体のうちのノズルオリフィスに供給する、ことを特徴とする。

また、最小直径Ｈが１～１０ミクロンであり、全長Ｌが２ミクロン未満であり、テーパ角が５°～４５°のわずかに正または負に先細りするテーパ状の短いオリフィスでも、満足のいく結果が得られている。

図１は、せん断流中での巨大分子の破壊を示す。 図２は、せん断流中でのベシクルの破壊を示す。 図３は、強いせん断流におけるベシクルの破壊を示す。 図４は、ベシクルが長いパイプを通過する様子を示す。 図５は、ベシクルがオリフィスを通過する様子を示す。 図６は、正に先細りするオリフィスを通過するベシクルの様子を示す。 図７は、負に先細りするオリフィスを通過するベシクルの様子を示す。

図１は、せん断流中での巨大分子の分解を示す。図１Ａはせん断流が存在しない、回転直径λを有する通常の球状巨大分子（１）を示す。図１Ｂは、矢印（２，３）によって示されるせん断流の存在下での、球状巨大分子の初期伸長を示す。図１Ｃは、巨大分子の最大長λ_maxまでのさらなる伸張を示し、より高い速度で移動する巨大分子の上部は、より小さい速度の下部から分離し始める。上部（４）および下部（５）は、１つまたは２つの残りの共有結合によってのみ分離される。図１Ｄは、巨大分子の上部および下部に作用する流体力学的せん断力により、巨大分子の中央部で共有結合の破壊が引き起こされ、２つの部分に分割された後の巨大分子を示す。

分子量が１００，０００ｇ／ｍｏｌを超える、大型タンパク質、長鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ、抗体などのような、長くて重い巨大分子は、せん断によって誘導される分解を受けやすい。以下の表１に、エアロゾル化中の様々な分子量を有する免疫グロブリン（タンパク質／抗体）のせん断分解に関するいくつかの結果をまとめる。

１ｍｌの製剤リザーバを有する振動膜ネブライザを使用して、８分間の噴霧化時間中に、２～１０ミクロンの範囲のエアロゾル液滴を生成した。より大きな分子量（＞１００，０００ｇ／ｍｏｌ）を有するタンパク質／抗体を有する希釈製剤は、明らかにせん断分解を受ける。本発明によれば、直径Ｈ＝２ミクロン、および長さＬ＝１ミクロンのオリフィスに、抗体を含む同じ製剤を平均流速Ｖ＝５ｍ／ｓで通すことによって、平均サイズが４ミクロンのエアロゾル液滴も作製されており、通過時間ｔは約２００ナノ秒である。本発明によるこの短いせん断時間により、液滴中に存在する巨大分子は、実質的に分解が少なくなった。２５°の正テーパ形状を有するオリフィスを使用すると、抗体は、１，０００，０００ｇ／ｍｏｌをはるかに超える分子量であっても、ほとんど分解を受けない。平均流速Ｖ＝２０ｍ／ｓでは、テーパのないオリフィスを通る通過時間ｔは約５０ナノ秒であり、平均流速５ｍ／ｓの場合よりも分解が少ないことがわかる。しかしながら、平均流速をＶ＝１００ｍ／ｓ（ｔ＝１０ｎｓ）まで増加させると、製剤の実質的な分解が起こる。ノズル長Ｌを０．５ミクロン（Ｈ＝２ミクロン）に減少させると、１ミクロン長のノズルの場合よりも、典型的には分解損失が相対的に１５％少なくなる。

ＤＮＡおよびＲＮＡ核酸などの巨大分子は、遺伝子治療、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）やミニＤＮＡベクターを有する非ウイルス遺伝子導入ベクターにおいて頻繁に使用される。これらの巨大分子は、対応する経路長が３０ナノメートル～３ミクロンで、１００～１０，０００のヌクレオチドまたは塩基対の範囲であり得、せん断による分解を受けやすい。以下の表２において、いくつかの結果が、これらのベクター分子のいくつかのせん断分解についてまとめられている。

１ｍｌの製剤リザーバを有する振動膜ネブライザを使用し、８分間の噴霧化時間で、２～１０ミクロンの範囲のエアロゾル液滴を生成した。より大きい分子量（＞２００，０００ｇ／ｍｏｌ）のＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクター（５μｇ／ｍｌ）を有する製剤は、明らかに分解を受ける。本発明によれば、直径Ｈ＝２ミクロン、および長さＬ＝１ミクロンのオリフィスに、ベクター分子を含む同じ製剤を平均流速Ｖ＝５ｍ／ｓで通すことによって、平均サイズが４ミクロンのエアロゾル液滴も作製されている。プラグフロー状態のため、体積平均壁せん断速度は４Ｖ／Ｈ＝１０×１０⁶／秒より著しく低くなるが、通過時間ｔは約２００ナノ秒である。本発明によるこの短いせん断時間により、液滴中に存在するベクター分子は、実質的に分解を受けていない。平均流速Ｖ＝２０ｍ／ｓの場合、テーパのないオリフィスを通る通過時間ｔは約５０ナノ秒であり、平均速度５ｍ／ｓの場合よりも分解が少ないことがわかる。しかしながら、平均速度をＶ＝１００ｍ／ｓ（ｔ＝１０ｎｓ）まで増加させると、製剤は大幅に分解する。長さ１ミクロンで２５°の負テーパ形状を有するオリフィスを使用すると、速度Ｖ＝５０ｍ／ｓで分子量１，０００，０００ｇ／ｍｏｌをはるかに超える場合でも、抗体はほとんど分解しない。ノズル長Ｌを０．５ミクロン（Ｈ＝２ミクロン、テーパなし）に減少させると、長さ１ミクロンのテーパなしのノズルの場合よりも、分解損失が平均して１０％小さくなる。水接触角が１１２°の疎水性フッ素コーティングを有するノズルの結果もまた、コーティングされていないノズルと比較して、典型的には分解損失が相対的に５～１５％減少する。

図２は、せん断流におけるベシクルまたはリポソームの破壊を示す。図２Ａは、せん断流が存在しない、サイズλを有する球状ベシクル（１１）を示す。図２Ｂは、矢印（１２，１３）によって示されるせん断流の存在下でのベシクルの初期伸長を示す。図２Ｃは、ベシクルの上部が下部よりも高い速度で移動しており、ベシクルの最長の長さλ_maxまでさらに伸長している様子を示す。図２Ｄは、ベシクルの上部と下部に作用する流体力学的なせん断力によりベシクルの中央部で破壊が起こり、２つの部分（１４，１５）に分解した後のベシクルを示す。

図３は、強いせん断流におけるベシクルまたはリポソームの分解を示す。図３Ａは、せん断流が存在しない、サイズλを有するベシクル（１１）を示す。図３Ｂは、矢印（１２，１３）によって示されるせん断流の存在下での、ベシクルの初期伸長を示す。図３Ｃは、ベシクルの上部が下部よりもはるかに高い速度で移動したため、ベシクルの最長の長さλ_maxまでさらに極端に伸張している様子を示す。図３Ｄは、ベシクルに大きな流体力学的なせん断力が作用し、３つの部分（１４，１５，１６）に破断した後のベシクルを示している。

図４は、長さＬおよび直径Ｈの長いパイプ（２２）内での、ベシクルまたはリポソーム（２１）の分解を示す。パイプの入口の手前では、大きなせん断流がないために、ベシクル（２１）は丸い。ベシクルは、パイプに入るとせん断流（２３）を受け、ベシクルの伸長段階の後で、パイプを出る前に、３つの細長い部分に破断する。３つの部分はジェット内をさらに移動し、せん断が無くなることによって３つの部分は球形となる。

図５は、ベシクルまたはリポソーム（２１）が長さＬおよび直径Ｈのオリフィスを通過する様子を示す。オリフィスの入口よりも前において、大きなせん断流がないために、ベシクル（２１）は丸い。ベシクルがオリフィスを通過するとき、ベシクルはせん断流（２３）に晒されて、細長くなるものの、破断はしない。ベシクルは次にジェット部に入り、再び球形になる。

図６は、プラグフローを示す、長さＬおよび直径Ｈを有する正テーパ状のオリフィスを通過するベシクルまたはリポソーム（２１）の様子を示す。先細りするオリフィスの入口よりも前のベシクルは丸く、プラグフロー中のせん断は小さいために、ベシクルは殆ど球形を維持する。ベシクルはその後、ジェット部に入り、球形となる。

図７は、ディフューザーとしても知られる、長さＬおよび直径Ｈを有する負テーパ状のオリフィスを通過するベシクルまたはリポソーム（２１）の様子を示す。幅の広がりによって、流れ中のナノ粒子に対するせん断は減少する。

ナノ粒子の完全性に対する有害な影響は、本発明に従って提示されるような、狭い部分の長さＬと狭い直径Ｈの比を有する先細りオリフィスの最も狭い部分において最大となるため、本発明による広いテーパリング角度を有するテーパリングオリフィスは、最も狭い直径よりも実質的に全長が長くなるように選択されてもよいことが明らかであり得る。

ベシクルおよびリポソームはまた、遺伝子治療において、特に、カプセル化されたＲＮＡベクターおよびＤＮＡベクターの肺への導入を促進するために、よく用いられる。これらのベシクルは、一般的に、０．０２～２ミクロンのサイズをとり得るため、潜在的に、エアロゾル化中にせん断による破損を受けやすい。以下の表３では、これらのベシクルのいくつかのせん断分解について、いくつかの結果がまとめられている。

１ｍｌの製剤リザーバを有する振動膜ネブライザを使用して、８分間の噴霧化時間中に、２～１０ミクロンの範囲のエアロゾル液滴を生成した。水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）とコレステロール（ＣＨ）を含む全てのリポソーム製剤（１５μｇ／ｍｌ）は、破損を被り、より小さいベシクルよりも大きいベシクルは破損しやすい。本発明によれば、直径Ｈ＝２ミクロンで長さＬ＝１ミクロンのオリフィスに、ベシクルを含む同じ製剤を平均速度Ｖ＝５ｍ／ｓで通すことによって、平均サイズが４ミクロンのエアロゾル液滴も製造された。プラグフロー状態のため、体積平均壁せん断速度は４Ｖ／Ｈ＝１０×１０⁶／秒よりも大幅に低くなるが、通過時間ｔは約１００ナノ秒である。本発明によるこの短いせん断時間によって、液滴中に存在するベシクルは、分解または破壊をほとんど受けない。平均速度Ｖ＝２０ｍ／ｓの場合、テーパのないオリフィスを通る通過時間ｔは約５０ナノ秒であり、平均速度１０ｍ／ｓの場合よりも破壊は少ないことがわかる。しかしながら、平均速度をＶ＝１００ｍ／ｓ（ｔ＝１０ｎｓ）にまで増大させると、製剤の大幅な分解が起こる。ノズル長Ｌを０．５ミクロン（Ｈ＝２ミクロン）に減少させると、長さ１ミクロンのノズルの場合よりも、分解損失が相対的に１０～４０％小さくなる。肺サーファクタントＣｕｒｏｓｕｒｆでは、振動膜ネブライザと比較して、分解が相対的に大きく減少した。水接触角が１１２°の疎水性フッ素コーティングを有する２ミクロンノズルを用いた結果でも、分解損失が典型的には相対的に５～２０％少なくなる。

好ましくは、長さまたはサイズλが２０ナノメートルより大きい、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）またはポリマーを有するハイブリッドナノ粒子（ＨＮＰ）であって、タンパク質、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび抗体を含む群から選択される他のナノ粒子を含む内容物を有するＬＮＰまたはＨＮＰを含む製剤が提供される。この方法では、せん断分解を受けやすい大きなナノ粒子が、より安全に保護される。

ナノ粒子の完全性に対する有害な影響は、本発明に従って提示されるような、狭い部分長さＬと狭い直径Ｈの比を有するテーパリングオリフィスの最も狭い部分において最大となるので、本発明による広いテーパリング角を有するテーパリングオリフィスは、最も狭い直径よりも実質的に長い全長を有するように選択され得ることが明らかであろう。

Claims (16)

1. 大気中にナノ粒子を送達する方法であって：
   粒子長（λ）を有する複数のナノ粒子を液体中に供給して液剤を生成すること；
   前記液剤を適切な作動圧力（ｐ）まで加圧して、加圧液剤を用意すること；
   前記加圧液剤を、スプレーノズルオリフィスであって、当該オリフィスの入口と出口との間のチャネル長（Ｌ）、および、前記入口と前記出口との間の平均チャネル直径（Ｈ）を有するスプレーノズルオリフィスを通して供給し、速度を有する前記液剤の液体流を生成すること；
   を含み、
   前記適切な動作圧力は１０ＭＰａ未満に、前記速度は１００ｍ／ｓ未満であり、
   前記オリフィスは、前記平均チャネル直径（Ｈ）よりも短いチャネル長（Ｌ）を有し、
   前記液体流は、各々が前記複数のナノ粒子のうちの少なくとも１つのナノ粒子を含む連続的な液滴からなるジェットとして前記出口に集められる、
   方法。
2. 前記液剤は、複合タンパク質、大型生体分子、長鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ、ウイルス、大型ベシクル、リポソーム、バクテリオファージ、および抗体を含む群から選択される、せん断応力感受性ナノ粒子を含み、
   前記オリフィスは、前記平均チャネル直径（Ｈ）の半分よりも短いチャネル長（Ｌ）を有する、
   請求項１に記載の方法。
3. 前記オリフィスは、最大で前記平均チャネル直径（Ｈ）の４分の１であるチャネル長（Ｌ）を有する、
   請求項２に記載の方法。
4. 前記液剤は、１００，０００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有するタンパク質および／または抗体分子、および／または、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のようなヌクレオチド化合物を含む、
   請求項２または３に記載の方法。
5. 前記液剤は、２０ナノメートルより大きい平均寸法を有するバクテリオファージを含む、
   請求項２または３に記載の方法。
6. 前記液剤は、脂質ナノ粒子またはリポソーム、特に肺サーファクタントを含み、
   その前記長さλは、２０ナノメートルより大きい、
   請求項２または３に記載の方法。
7. 前記液剤は、１００，０００Ｄａを超える分子量を有する、タンパク質、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ワクチン、ウイルス、バクテリオファージ、および抗体を含む群から選択されるナノ粒子を含有する内容物を有するベシクルを含む、
   請求項６に記載の方法。
8. 前記ノズルオリフィスは、１ミクロン～１０ミクロンの実質的に一定の直径（Ｈ）を有する、
   請求項２または３に記載の方法。
9. 前記ノズルオリフィスは、１ミクロン～１０ミクロンの平均直径（Ｈ）を有し、
   前記オリフィスは、前記入口から前記出口までの前記長さの少なくとも一部にわたって先細り形状である、
   請求項２または３に記載の方法。
10. 前記ノズルオリフィスは、実質的に５°～４５°の間のテーパで前記入口の入り口から前記出口に向けて細くなる正のテーパを備える、
    請求項９に記載の方法。
11. 前記ノズルオリフィスの内壁には、疎水性スリップ流を可能にするコーティングが備えられている、
    先行する請求項のいずれかに記載の方法。
12. ρ・Ｖ・Ｈ／ηとして表される、前記流体の質量密度（ρ）、前記オリフィス内の流速（Ｖ）、および前記ノズル直径（Ｈ）の積を、前記流体の粘度（η）で割ったものは、２，５００未満に維持される、
    先行する請求項のいずれかに記載の方法。
13. 前記ナノ粒子は、伸長した場合に破損前最大粒子長λ_maxを有し、
    前記液剤は、前記スプレーノズルオリフィスを通過する間に、壁せん断速度γ_wall［毎秒］を受け、
    前記液剤は、λ_max／（λ・γ_wall）秒未満のせん断時間（ｔ）の間、前記スプレーノズルオリフィス内で前記壁せん断速度に晒される、
    先行する請求項のいずれかに記載の方法。
14. 前記壁せん断速度γ_wallは、１００，０００を大きく超過し、特に毎秒１，０００，０００を超過する、
    請求項１３に記載の方法。
15. 前記ナノ粒子は、分子量が１００，０００ｇ／ｍｏｌ超過の巨大分子を含み、
    前記巨大分子は、比λ_max／λが２以上、好ましくは比λ_max／λが４以上である、
    前記請求項のいずれかに記載の方法。
16. 前記ノズルオリフィスは、基材によって支持されている共通の膜層中を延びる実質的に同一の複数のノズルオリフィスの集合体の一部であり、
    前記基材は、前記複数のオリフィスの集合体のうちの前記ノズルオリフィスに延びる、少なくとも１つのキャビティを有し、
    前記液剤は、前記作動圧力で前記キャビティに共に導入されて、前記オリフィスの集合体のうちの前記ノズルオリフィスに供給される、
    先行する請求項のいずれかに記載の方法。

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