JP2024060213A - Method for improving separation performance of stationary phase for column chromatography - Google Patents
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Abstract
【課題】セルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）を不斉識別剤として含むカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能を改善する方法を提供する。【解決手段】カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能を改善する方法であって、担体にセルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる固定相を有機溶剤で処理する分離性能改善工程を含み、前記処理が、下記（Ａ）又は下記（Ｂ）である、カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。（Ａ）前記固定相と炭素数４以上１０以下のジアルキルエーテルとを接触させる処理。（Ｂ）前記固定相と炭素数１以上４以下の第１のアルコールとを４０℃以上前記第１のアルコールの沸点以下の温度で接触させる処理。【選択図】図８[Problem] To provide a method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography that contains cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) as an asymmetric discrimination agent. [Solution] A method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography, comprising a separation performance improving step of treating a stationary phase in which cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is supported on a carrier with an organic solvent, the treatment being either (A) or (B) below: (A) A treatment of contacting the stationary phase with a dialkyl ether having 4 to 10 carbon atoms; (B) A treatment of contacting the stationary phase with a first alcohol having 1 to 4 carbon atoms at a temperature of 40°C or higher and lower than the boiling point of the first alcohol. [Selected Figure] Figure 8
Description
本開示は、カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法に関する。 This disclosure relates to a method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography.
多くの化学物質、特に有機化合物には物理的性質又は化学的性質（例えば、沸点、融点、及び溶解度等）が完全に同一であるが、生体に及ぼす影響、すなわち生理活性の異なる化合物が存在する。その代表例として光学異性体がある。生理活性の相違において、特に医薬品分野においては、この光学異性体間での薬効、毒性、代謝、及び分布の差異が顕著にみられる場合がある。そのため、医薬品の安全性を確保すべく、厚生省では１９８５年度版の医薬品製造指針において光学異性体は生体内では全く別種の化合物として考えるべき、との考えを打ち出している。これを受け、医薬品分野では、光学異性体を分離及び分析する必要性が強く求められていた。 Many chemical substances, especially organic compounds, have completely identical physical or chemical properties (e.g. boiling point, melting point, solubility, etc.), but there are compounds that have different effects on living organisms, i.e., different physiological activities. A typical example is optical isomers. In terms of differences in physiological activity, especially in the pharmaceutical field, there are cases where significant differences in efficacy, toxicity, metabolism, and distribution between optical isomers. For this reason, in order to ensure the safety of pharmaceuticals, the Ministry of Health, Labor and Welfare put forward the idea in the 1985 edition of the Pharmaceutical Manufacturing Guidelines that optical isomers should be considered as completely different compounds in the body. In response to this, there was a strong need in the pharmaceutical field to separate and analyze optical isomers.
しかしながら、上述したように、物理的性質又は化学的性質が全く同一である場合には、化合物を認識又は分離するための古典的な手法、例えば、沸点差を利用する蒸留、溶解度差を利用する再結晶、分配係数差を利用する液液抽出、及び固液抽出等の手法で光学異性体分離を行うことは不可能である。 However, as mentioned above, when the physical or chemical properties are exactly the same, it is impossible to separate optical isomers using classical methods for identifying or separating compounds, such as distillation that exploits differences in boiling points, recrystallization that exploits differences in solubility, liquid-liquid extraction that exploits differences in distribution coefficients, and solid-liquid extraction.
そこで、分離が極めて困難な光学異性体の分離達成のため、分離対象とは異なる光学活性体をキラルセレクター（不斉識別剤）として光学異性体に作用させ、光学活性体と光学異性体との相互作用の差によって各異性体を認識及び分離する方法が開発されてきた（特許文献１、非特許文献１）。
Therefore, in order to achieve the separation of optical isomers, which are extremely difficult to separate, a method has been developed in which an optically active substance different from the object of separation is used as a chiral selector (asymmetry discrimination agent) to act on the optical isomer, and each isomer is recognized and separated based on the difference in the interaction between the optically active substance and the optical isomer (
そのために、数多くのキラルセレクターが検討されてきた。現在、世界で最も広く使用され、最も高い分離成功率を達成できるキラルセレクターは、高分子材料である多糖誘導体とされている（特許文献２～５、非特許文献２）。近年、この不斉識別剤を充填した分析用カラムを用い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）モード、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）法クロマトグラフィーモード等で、光学異性体分離を実施する手法が分析分野において多用されている。また、分析用カラムを大型化した分取用カラムによって実際の医薬品が製造されている。 For this reason, numerous chiral selectors have been investigated. Currently, the chiral selectors that are most widely used in the world and that can achieve the highest separation success rate are polysaccharide derivatives, which are polymeric materials (Patent Documents 2-5, Non-Patent Document 2). In recent years, analytical columns packed with these chiral discriminating agents are widely used in the field of analysis to separate optical isomers in high performance liquid chromatography (HPLC) mode, supercritical fluid chromatography (SFC) method chromatography mode, and other modes. In addition, actual pharmaceuticals are manufactured using preparative columns that are larger than analytical columns.
分析用カラムは、光学異性体の光学純度、すなわち、分析試料に含まれる各光学異性体の比率及び組成を特定することを目的とするものである。分析カラムは、数多く（通例、数百～数千）のサンプルを分析するうちに性能が劣化するところ、従来は、一定の性能の低下又は変化が生じた時点で寿命として破棄されることが一般的であった。カラムの寿命は、使用条件によっても変動し、想定よりも早く寿命が尽きる場合も多い。そのため、カラムの寿命を延ばす方法の開発が望まれている。 Analytical columns are intended to determine the optical purity of optical isomers, that is, the ratio and composition of each optical isomer contained in an analytical sample. The performance of analytical columns deteriorates as a large number of samples (usually hundreds to thousands) are analyzed, and traditionally, columns have generally been discarded when a certain level of performance degradation or change occurs. The lifespan of a column varies depending on the conditions of use, and it often reaches the end of its life sooner than expected. For this reason, there is a need to develop a method to extend the lifespan of columns.
最近では、性能が劣化したカラムに特定の溶剤を通液することで、カラム性能を改善させる手法も試みられている。例えば、特許文献６には、シリカゲルにセルロース（４－メチルベンゾエート）が担持されてなる固定相が充填されたカラムにジクロロメタンを通液する方法が開示されている。
Recently, attempts have been made to improve column performance by passing a specific solvent through a column with degraded performance. For example,
特許文献６に記載の方法によれば、セルロース（４－メチルベンゾエート）を含む固定相の分離性能を改善することが可能である。しかしながら、分離性能を改善させることのできる溶剤と不斉識別剤との組み合わせを選定することは、容易ではない。例えば、構造が酷似する複数種の不斉識別剤において、一の分離性能を改善し得る溶剤が、他の分離性能の改善には有効でないケースも多い。さらには、溶剤の流速又は通液量によって、分離性能の改善効果に影響を与える場合もある。そのため、不斉識別剤と、それに適した分離性能改善の条件との関係については、未だ明らかとなっていない。
According to the method described in
本開示は、セルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）を不斉識別剤として含むカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能を改善する方法を提供することを課題とする。 The objective of the present disclosure is to provide a method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography that contains cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) as an asymmetric discrimination agent.
上記課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討を重ねた。その結果、不斉識別剤としてセルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）を用いた固定相においては、固定相を特定条件で処理することにより、固定相の分離性能が改善し、上記課題を解決できることを見出した。すなわち、本開示の要旨は、以下のとおりである。 In order to solve the above problems, the inventors have conducted extensive research. As a result, they have found that in a stationary phase using cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) as an asymmetric discrimination agent, the separation performance of the stationary phase can be improved by treating the stationary phase under specific conditions, thereby solving the above problems. In other words, the gist of the present disclosure is as follows.
〔１〕
カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能を改善する方法であって、
担体にセルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる固定相を有機溶剤で処理する分離性能改善工程を含み、
前記処理が、下記（Ａ）又は下記（Ｂ）である、カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
（Ａ）前記固定相と炭素数４以上１０以下のジアルキルエーテルとを接触させる処理。
（Ｂ）前記固定相と炭素数１以上４以下の第１のアルコールとを４０℃以上前記第１のアルコールの沸点以下の温度で接触させる処理。
〔２〕
前記（Ａ）が、前記固定相が充填されたカラムに前記ジアルキルエーテルを通液させる処理である、〔１〕に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
〔３〕
前記ジアルキルエーテルが、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルである、〔１〕又は〔２〕に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
〔４〕
前記（Ｂ）が、前記固定相が充填されたカラムに前記第１のアルコールを通液した後、カラムを封止した状態で前記カラムを４０℃以上前記第１のアルコールの沸点以下の温度で加熱する処理である、〔１〕に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
〔５〕
前記第１のアルコールが、メタノール、エタノール、及びｎ－ブタノールからなる群より選択される１種以上である、〔１〕又は〔４〕に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
〔６〕
前記分離性能改善工程における前記処理が、前記（Ｂ）である、〔１〕に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
〔７〕
前記分離性能改善工程の後に、前記固定相と炭素数１以上４以下の第３のアルコールとを接触させる後処理工程をさらに含む、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
〔８〕
前記後処理工程における前記固定相と前記第３のアルコールとの接触が、前記固定相が充填されたカラムに前記第３のアルコールを通液させることにより行われる、〔７〕に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
〔９〕
前記通液における第３のアルコールの流速（線速度）が、０．０１ｍｍ／ｓｅｃ以上１０．０ｍｍ／ｓｅｃ以下である、〔８〕に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
〔１０〕
前記第３のアルコールが、メタノール、エタノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される１種以上のアルコールである、〔７〕～〔９〕のいずれかに記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
〔１１〕
前記分離性能改善工程の前に、前記固定相と炭素数１以上４以下の第２のアルコールとを接触させる前処理工程をさらに含む、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
〔１２〕
前記前処理工程における前記固定相と前記第２のアルコールとの接触が、前記固定相が充填されたカラムに前記第２のアルコールを通液させることにより行われる、〔１１〕に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
〔１３〕
カラムクロマトグラフィー用固定相の製造方法であって、
担体にセルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる被処理固定相を有機溶剤で処理する分離性能改善工程を含み、
前記処理が、下記（Ａ）又は下記（Ｂ）であり、
下記（ａ）～（ｃ）を満たす、カラムクロマトグラフィー用固定相の製造方法。
（Ａ）前記被処理固定相と炭素数４以上１０以下のジアルキルエーテルとを接触させる処理。
（Ｂ）前記被処理固定相と炭素数１以上４以下の第１のアルコールとを４０℃以上前記第１のアルコールの沸点以下の温度で接触させる処理。
（ａ）前記分離性能改善工程により分離性能の改善した固定相の分離係数（α）が、前記被処理固定相の分離係数よりも高い。
（ｂ）前記分離性能改善工程により分離性能の改善した固定相のカラム理論段数（Ｎ）が、前記被処理固定相のカラム理論段数よりも高い。
（ｃ）前記分離性能改善工程により分離性能の改善した固定相の分離度（Ｒ）が、前記被処理固定相の分離度よりも高い。
[1]
A method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography, comprising the steps of:
The separation performance improving step includes treating a stationary phase having cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) supported on a carrier with an organic solvent,
The method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography, wherein the treatment is the following (A) or (B):
(A) A treatment of contacting the stationary phase with a dialkyl ether having 4 to 10 carbon atoms.
(B) contacting the stationary phase with a first alcohol having 1 to 4 carbon atoms at a temperature of 40° C. or higher and the boiling point of the first alcohol.
[2]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [1], wherein (A) is a treatment of passing the dialkyl ether through a column packed with the stationary phase.
[3]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [1] or [2], wherein the dialkyl ether is methyl tert-butyl ether.
[4]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [1], wherein (B) is a treatment of passing the first alcohol through a column packed with the stationary phase, and then heating the column in a sealed state at a temperature of 40° C. or higher and lower than the boiling point of the first alcohol.
[5]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [1] or [4], wherein the first alcohol is one or more selected from the group consisting of methanol, ethanol, and n-butanol.
[6]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [1], wherein the treatment in the separation performance improving step is (B).
[7]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to any one of [1] to [6], further comprising a post-treatment step of contacting the stationary phase with a third alcohol having 1 to 4 carbon atoms after the separation performance improvement step.
[8]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [7], wherein the contact between the stationary phase and the third alcohol in the post-treatment step is carried out by passing the third alcohol through a column packed with the stationary phase.
[9]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [8], wherein a flow rate (linear velocity) of the third alcohol in the passing liquid is 0.01 mm/sec or more and 10.0 mm/sec or less.
[10]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to any one of [7] to [9], wherein the third alcohol is one or more alcohols selected from the group consisting of methanol, ethanol, and isopropanol.
[11]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to any one of [1] to [10], further comprising a pretreatment step of contacting the stationary phase with a second alcohol having 1 to 4 carbon atoms prior to the separation performance improvement step.
[12]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [11], wherein the contact between the stationary phase and the second alcohol in the pretreatment step is carried out by passing the second alcohol through a column packed with the stationary phase.
[13]
A method for producing a stationary phase for column chromatography, comprising the steps of:
The separation performance improving step includes treating a stationary phase to be treated, which is a carrier carrying cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate), with an organic solvent,
The treatment is the following (A) or the following (B),
A method for producing a stationary phase for column chromatography, which satisfies the following (a) to (c):
(A) A treatment in which the stationary phase to be treated is contacted with a dialkyl ether having 4 to 10 carbon atoms.
(B) A treatment in which the stationary phase to be treated is contacted with a first alcohol having 1 to 4 carbon atoms at a temperature of 40° C. or higher and the boiling point of the first alcohol or lower.
(a) The separation factor (α) of the stationary phase whose separation performance has been improved by the separation performance improving step is higher than the separation factor of the stationary phase to be treated.
(b) the number of theoretical columns (N) of the stationary phase whose separation performance has been improved by the separation performance improving step is higher than the number of theoretical columns of the stationary phase to be treated.
(c) The degree of resolution (R) of the stationary phase whose separation performance has been improved by the separation performance improving step is higher than the degree of resolution of the stationary phase to be treated.
本開示によれば、セルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）を不斉識別剤として含むカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能を改善する方法を提供す
ることができる。
そして本開示の課題及び効果は、具体的に上記に記載したものに限らず、明細書全体より当業者に明らかにされるものを含む。
According to the present disclosure, it is possible to provide a method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography that contains cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) as an asymmetric discrimination agent.
The problems and advantages of the present disclosure are not limited to those specifically described above, but include those that will become apparent to a person skilled in the art from the entire specification.
以下に、本開示について具体的な実施形態を挙げて説明するが、各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は、一例であって、本開示の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。本開示は、実施形態によって限定されるものではない。
また、本明細書に開示される各々の態様は、本明細書に開示される他のいかなる特徴とも組み合わせることができる。
The present disclosure will be described below with reference to specific embodiments, but each configuration and combination thereof in each embodiment is merely an example, and addition, omission, substitution, and other modifications of the configuration are possible as appropriate within the scope of the gist of the present disclosure. The present disclosure is not limited to the embodiments.
Additionally, each feature disclosed herein may be combined with any other feature disclosed herein.
1 カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法
本開示の一実施形態であるカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法は、担体にセルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる固定相を有機溶剤で処理する分離性能改善工程を含む。
1. Method for Improving Separation Performance of a Stationary Phase for Column Chromatography A method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography, which is one embodiment of the present disclosure, includes a separation performance improving step of treating a stationary phase comprising cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) supported on a carrier with an organic solvent.
本実施形態において、分離性能を改善する固定相は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、及びイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）等の各種カラムクロマトグラフィーに用いられるものである。 In this embodiment, the stationary phase that improves separation performance is one that is used in various types of column chromatography, such as high performance liquid chromatography (HPLC), supercritical fluid chromatography (SFC), and ion exchange chromatography (IEC).
1.1 分離性能改善工程
本実施形態において、分離性能改善工程は、担体にセルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる固定相を有機溶剤で処理する工程である。ここでいう処理とは、下記（Ａ）又は下記（Ｂ）（以下、それぞれ、「処理（Ａ）」又は「処理（Ｂ）」と称することがある。）であり、好ましくは下記（Ｂ）である。
（Ａ）固定相と炭素数４以上１０以下のジアルキルエーテルとを接触させる処理。
（Ｂ）固定相と炭素数１以上４以下の第１のアルコールとを４０℃以上第１のアルコールの沸点以下の温度で接触させる処理。
1.1 Separation performance improvement step In this embodiment, the separation performance improvement step is a step of treating a stationary phase in which cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is supported on a carrier with an organic solvent. The treatment referred to here is the following (A) or the following (B) (hereinafter sometimes referred to as "treatment (A)" or "treatment (B)", respectively), and is preferably the following (B).
(A) A treatment of contacting the stationary phase with a dialkyl ether having 4 to 10 carbon atoms.
(B) A treatment of contacting the stationary phase with a first alcohol having 1 to 4 carbon atoms at a temperature of 40° C. or higher and the boiling point of the first alcohol or lower.
1.1.1 固定相
本実施形態における固定相は、不斉識別剤としてセルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）を有し、前記不斉識別剤が担体に担持されてなるものである。
1.1.1 Stationary Phase The stationary phase in this embodiment has cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) as an asymmetric recognition agent, and the asymmetric recognition agent is supported on a carrier.
担体としては、多孔質有機担体、多孔質無機担体、多孔質有機無機複合担体、表面多孔質有機担体、表面多孔質無機担体、及び表面多孔質有機無機ハイブリッド担体等が挙げられる。これらのうち、担体は、多孔質無機担体又は表面多孔質無機担体であることが好ましい。なお、多孔質担体とは、担体全体にわたって細孔が形成されている担体を意味し、表面多孔質担体とは、無孔質の核が多孔質層に覆われた構造を有する所謂コアシェル担体を意味する。 Examples of carriers include porous organic carriers, porous inorganic carriers, porous organic-inorganic composite carriers, surface-porous organic carriers, surface-porous inorganic carriers, and surface-porous organic-inorganic hybrid carriers. Of these, the carrier is preferably a porous inorganic carrier or a surface-porous inorganic carrier. Note that the porous carrier means a carrier in which pores are formed throughout the entire carrier, and the surface-porous carrier means a so-called core-shell carrier having a structure in which a non-porous core is covered with a porous layer.
多孔質有機担体としては、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリルアミド、及びポリ（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。また、多孔質無機担体としては、シリカ、アルミナ、マグネシア、ガラス、カオリン、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ケイ酸塩、及びヒドロキシアパタイト等が挙げられ、好ましくはシリカゲルである。多孔質有機無機複合担体としては、アルコキシシランとアルキル置換又はアレキレン置換アルコキシシラン化合物とのゾルゲル反応によって形成される有機無機複合担体が挙げられる。 Examples of porous organic carriers include polystyrene, poly(meth)acrylamide, and poly(meth)acrylic acid esters. Examples of porous inorganic carriers include silica, alumina, magnesia, glass, kaolin, titanium oxide, zirconium oxide, silicates, and hydroxyapatite, with silica gel being preferred. Examples of porous organic-inorganic composite carriers include organic-inorganic composite carriers formed by the sol-gel reaction of alkoxysilane and an alkyl- or alkoxysilane-substituted compound.
不斉識別剤であるセルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）は、セルロースの水酸基の一部又は全部が３－クロロ－４－メチルフェニルカルバモイル基により修飾されたものであれば、特に限定されないが、好ましくはセルローストリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）である。 The chiral recognition agent, cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate), is not particularly limited as long as some or all of the hydroxyl groups of cellulose are modified with 3-chloro-4-methylphenylcarbamoyl groups, but is preferably cellulose tris(3-chloro-4-methylphenylcarbamate).
セルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）は、架橋物の態様で使用してもよい。セルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）の架橋物とは、セルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）同士が架橋により高分子化及び不溶化したものである。当該架橋は、架橋剤、架橋触媒、又はこれら両方による架橋であってよい。 Cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) may be used in the form of a crosslinked product. A crosslinked product of cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is a product in which cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is polymerized and insolubilized by crosslinking with other cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate). The crosslinking may be achieved by a crosslinking agent, a crosslinking catalyst, or both.
セルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）の架橋物は、セルロースの水酸基の全部が３－クロロ－４－メチルフェニルカルバモイル基により修飾された化合物（すなわち、セルローストリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート））の架橋物であってもよく、セルロースの水酸基の一部が３－クロロ－４－メチルフェニルカルバモイル基により修飾され、かつ、セルロースの水酸基の一部に架橋性基が導入された化合物の架橋物であってもよい。 The crosslinked product of cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) may be a crosslinked product of a compound in which all of the hydroxyl groups of cellulose have been modified with 3-chloro-4-methylphenylcarbamoyl groups (i.e., cellulose tris(3-chloro-4-methylphenylcarbamate)), or a crosslinked product of a compound in which some of the hydroxyl groups of cellulose have been modified with 3-chloro-4-methylphenylcarbamoyl groups and crosslinkable groups have been introduced into some of the hydroxyl groups of cellulose.
セルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）（架橋物においては、架橋前のもの）のセルロース部の数平均重合度（１分子中に含まれるピラノース環の平均数）は、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上であり、また、特に上限はないが、取り扱い性の観点から、好ましくは１，０００以下である。すなわち、セルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）のセルロース部の数平均重合度の好ましい範囲としては、５以上１，０００以下、及び１０以上１，０００以下の範囲が挙げられる。 The number-average degree of polymerization (average number of pyranose rings contained in one molecule) of the cellulose moiety of cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) (in the case of the cross-linked product, the one before cross-linking) is preferably 5 or more, more preferably 10 or more, and although there is no particular upper limit, from the viewpoint of handleability, it is preferably 1,000 or less. In other words, the preferred range of the number-average degree of polymerization of the cellulose moiety of cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is 5 or more and 1,000 or less, and 10 or more and 1,000 or less.
セルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）は、担体を被覆するように形成されている。また、セルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）は、担体表面の官能基又は表面処理により担体表面に導入された官能基を介して担体に連
結されていてもよい。また、前記連結は、例えば連結剤及び架橋剤等を介して行われたものであってもよい。
The cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is formed so as to cover the carrier. The cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) may be linked to the carrier via a functional group on the carrier surface or a functional group introduced to the carrier surface by surface treatment. The linking may be performed via, for example, a linking agent, a crosslinking agent, or the like.
1.1.2 処理（Ａ）
処理（Ａ）は、炭素数４以上１０以下のジアルキルエーテル（以下、単に「ジアルキルエーテル」と称することがある。）を有機溶剤として用いた固定相の処理に関する。より具体的には、処理（Ａ）は、固定相とジアルキルエーテルとを接触させる処理である。
1.1.2 Processing (A)
Treatment (A) relates to treatment of a stationary phase using a dialkyl ether having 4 to 10 carbon atoms (hereinafter, sometimes simply referred to as "dialkyl ether") as an organic solvent. More specifically, treatment (A) is a treatment in which the stationary phase is contacted with the dialkyl ether.
ジアルキルエーテルとしては、ジエチルエーテル、メチルイソブチルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、エチルプロピルエーテル、エチルイソプロピルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、エチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、プロピルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジ－ｎ－ブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、ジ－ｎ－ペンチルエーテル、及びｔｅｒｔ－ブチルヘキシルエーテル等が挙げられる。これらのうち、ジアルキルエーテルは、高い分離性能改善効果が得られる点で、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであることが好ましい。 Examples of dialkyl ethers include diethyl ether, methyl isobutyl ether, methyl tert-butyl ether, ethyl propyl ether, ethyl isopropyl ether, dipropyl ether, diisopropyl ether, ethyl tert-butyl ether, propyl tert-butyl ether, di-n-butyl ether, diisobutyl ether, di-n-pentyl ether, and tert-butylhexyl ether. Of these, the dialkyl ether is preferably methyl tert-butyl ether, since it provides a high effect of improving separation performance.
固定相とジアルキルエーテルとを接触させる方法は、特に限定されず、例えば固定相が充填されたカラムにジアルキルエーテルを通液させる方法を好適に採用することができる。 The method for contacting the stationary phase with the dialkyl ether is not particularly limited, and for example, a method in which the dialkyl ether is passed through a column packed with the stationary phase can be suitably used.
ジアルキルエーテルの通液は、連続的に行ってもよく、断続的に行ってもよいが、連続的に行うことが好ましい。ジアルキルエーテルの断続的な通液とは、ジアルキルエーテルの通液において、通液を一時的に停止することによりカラム内で固定相をジアルキルエーテルに浸漬させ、この浸漬状態を一定時間保持した後に通液を再開する操作が１回以上行われるものを意味する。 The dialkyl ether may be passed through continuously or intermittently, but is preferably passed through continuously. Intermittent passing of the dialkyl ether means that the stationary phase in the column is immersed in the dialkyl ether by temporarily stopping the passage of the dialkyl ether, and the immersed state is maintained for a certain period of time, after which the passage is resumed, and this operation is carried out at least once.
ジアルキルエーテルの流速（線速度）は、カラム圧力を、試料の分析において許容されるカラム圧力範囲と同等の範囲内に維持することができる限り特に制限されない。例えば、試料分析の際に、カラムが許容される圧力が５０ＭＰａ（５００ｋｇ／ｃｍ２）以下の場合は、カラム圧力が５０ＭＰａ以下となるように流速の上限を調整すればよい。カラム内の圧力は、固定相の粒子サイズ、ジアルキルエーテルの粘度等に左右されるため、これらの要素を考慮しながらジアルキルエーテルの流速の上限を適宜決定すればよい。一方、ジアルキルエーテルの流速の下限は特に限定されず、通常０ｍｍ／ｓｅｃ超である。 The flow rate (linear velocity) of the dialkyl ether is not particularly limited as long as the column pressure can be maintained within the same range as the column pressure range allowed in the analysis of the sample. For example, when the pressure allowed in the column during the sample analysis is 50 MPa (500 kg/cm 2 ) or less, the upper limit of the flow rate may be adjusted so that the column pressure is 50 MPa or less. The pressure in the column depends on the particle size of the stationary phase, the viscosity of the dialkyl ether, etc., so the upper limit of the flow rate of the dialkyl ether may be appropriately determined while taking these factors into consideration. On the other hand, the lower limit of the flow rate of the dialkyl ether is not particularly limited and is usually more than 0 mm/sec.
ジアルキルエーテルの通液量は、カラム容積に対して、好ましくは１倍以上であり、高い分離性能改善効果が得られる点で、より好ましくは２倍以上、５倍以上、又は１０倍以上である。また、ジアルキルエーテルの通液量に上限はないが、実用上の観点から、カラム容積に対して、好ましくは１，０００倍以下、より好ましくは５００倍以下、１００倍以下、又は５０倍以下である。すなわち、ジアルキルエーテルの通液量の好ましい範囲としては、例えばカラム容積に対して１倍以上１，０００倍以下、２倍以上５００倍以下、５倍以上１００倍、及び１０倍以上５０倍以下の範囲が挙げられる。 The amount of dialkyl ether passing through is preferably 1 or more times the column volume, and more preferably 2 or more, 5 or more, or 10 or more times in terms of obtaining a high effect of improving separation performance. There is no upper limit to the amount of dialkyl ether passing through, but from a practical standpoint, it is preferably 1,000 or less times the column volume, more preferably 500 or less, 100 or less, or 50 or less. In other words, preferred ranges of the amount of dialkyl ether passing through include, for example, 1 to 1,000 times, 2 to 500 times, 5 to 100 times, and 10 to 50 times the column volume.
ジアルキルエーテルの通液時間は、ジアルキルエーテルの流速及び通液量に応じて適宜選択すればよい。ただし、カラムにジアルキルエーテルを断続的に通液する場合は、ジアルキルエーテルの通液時間は、高い分離性能改善効果が得られる点で、好ましくは１５分以上、より好ましくは３０分以上、さらに好ましくは６０分以上であり、また、好ましくは３００分以下、より好ましくは１８０分以下である。すなわち、カラムにジアルキルエーテルを断続的に通液する時間の好ましい範囲としては、例えば１５分以上３００分以下、３０分以上３００分以下、及び６０分以上１８０分以下の範囲が挙げられる。 The time for passing the dialkyl ether through the column may be appropriately selected depending on the flow rate and amount of the dialkyl ether. However, when passing the dialkyl ether through the column intermittently, the time for passing the dialkyl ether through the column is preferably 15 minutes or more, more preferably 30 minutes or more, even more preferably 60 minutes or more, and preferably 300 minutes or less, more preferably 180 minutes or less, in order to obtain a high effect of improving separation performance. In other words, the preferred range of the time for passing the dialkyl ether through the column intermittently is, for example, from 15 minutes to 300 minutes, from 30 minutes to 300 minutes, and from 60 minutes to 180 minutes.
固定相とジアルキルエーテルとを接触させる際の温度は、ジアルキルエーテルが液体として存在する限り特に制限されず、好ましくは０℃以上、より好ましくは室温である。
なお、本明細書において、室温とは、１５℃以上３５℃以下の温度範囲を意味する。また、カラムオーブンを具備するカラムクロマトグラフ装置においては、カラムオーブンの設定温度を、固定相とジアルキルエーテルとを接触させる際の温度とする。
The temperature when the stationary phase is contacted with the dialkyl ether is not particularly limited as long as the dialkyl ether is present as a liquid, and is preferably 0° C. or higher, more preferably room temperature.
In this specification, room temperature means a temperature range of 15° C. to 35° C. In addition, in a column chromatograph equipped with a column oven, the set temperature of the column oven is the temperature when the stationary phase is brought into contact with the dialkyl ether.
1.1.3 処理（Ｂ）
処理（Ｂ）は、炭素数１以上４以下の第１のアルコール（以下、単に「第１のアルコール」と称することがある。）を有機溶剤として用いた固定相の処理に関する。より具体的には、処理（Ｂ）は、固定相と第１のアルコールとを４０℃以上第１のアルコールの沸点以下の温度で接触させる処理である。
1.1.3 Processing (B)
Treatment (B) relates to a treatment of the stationary phase using a first alcohol having 1 to 4 carbon atoms (hereinafter, sometimes simply referred to as the "first alcohol") as an organic solvent. More specifically, treatment (B) is a treatment in which the stationary phase is contacted with the first alcohol at a temperature of 40° C. or higher and the boiling point of the first alcohol or lower.
第１のアルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、及びイソブタノール等が挙げられる。これらのうち、第１のアルコールは、高い分離性能改善効果が得られる点で、メタノール、エタノール、及びｎ－ブタノールからなる群より選択される１種以上であることが好ましく、メタノールであることがより好ましい。 Examples of the first alcohol include methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, tert-butanol, and isobutanol. Of these, the first alcohol is preferably one or more selected from the group consisting of methanol, ethanol, and n-butanol, and more preferably methanol, in that a high separation performance improvement effect can be obtained.
固定相と第１のアルコールとを４０℃以上第１のアルコールの沸点以下の温度で接触させる方法は、特に限定されず、例えば固定相が充填されたカラムに第１のアルコールを通液した後、カラムを封止した状態でカラムを所定温度に加熱する方法（方法Ｉ）；固定相が充填されたカラムに第１のアルコールを通液しながら、カラムを所定温度に加熱する方法（方法ＩＩ）；及び所定温度に加熱した第１のアルコールを固定相が充填されたカラムに通液させる方法（方法ＩＩＩ）；等を好適に採用することができる。これらのうち、高い分離性能改善効果が得られる点及び第１のアルコールの使用量を抑制できる点で、方法Ｉがより好ましい。 The method of contacting the stationary phase with the first alcohol at a temperature of 40°C or higher and the boiling point of the first alcohol or lower is not particularly limited, and may be, for example, a method of passing the first alcohol through a column packed with the stationary phase, and then heating the column to a predetermined temperature while the column is sealed (Method I); a method of heating the column packed with the stationary phase while passing the first alcohol through the column (Method II); and a method of passing the first alcohol heated to a predetermined temperature through a column packed with the stationary phase (Method III). Of these, Method I is more preferable in that it provides a high effect of improving separation performance and can reduce the amount of the first alcohol used.
方法Ｉ及び方法ＩＩにおいて、カラムを加熱する方法は、温度コントロールが容易である点で、カラムクロマトグラフ装置に備え付けられたカラムオーブンを用いて加熱する方法であることが好ましい。なお、カラムオーブンによりカラムを加熱する場合は、カラムオーブンの設定温度を、固定相と第１のアルコールとを接触させる際の温度とする。 In Method I and Method II, the method of heating the column is preferably a method of heating using a column oven installed in the column chromatograph, since this makes it easy to control the temperature. When the column is heated using a column oven, the set temperature of the column oven is set to the temperature at which the stationary phase is brought into contact with the first alcohol.
方法Ｉ～方法ＩＩＩにおいて、固定相と第１のアルコールとを接触させる際の温度は、通常４０℃以上であり、高い分離性能改善効果が得られる点で、好ましくは４５℃以上、より好ましくは５０℃以上である。また、固定相と第１のアルコールとを接触させる際の温度は、第１のアルコールの沸点以下であり、好ましくは第１のアルコールの沸点よりも３℃以上低い温度以下である。すなわち、固定相と第１のアルコールとを接触させる際の温度の好ましい範囲としては、例えば４０℃以上第１のアルコールの沸点よりも３℃以上低い温度以下、４５℃以上第１のアルコールの沸点以下、及び５０℃以上第１のアルコールの沸点以下の範囲が挙げられる。具体例を示すと、第１のアルコールとしてメタノール（沸点６４．７℃）を使用する場合の好適な温度範囲としては、例えば４０℃以上６４．７℃以下、４５℃以上６１．７℃以下、及び５０℃以上６０℃以下の範囲が挙げられる。
なお、本明細書において、第１のアルコールの沸点とは、大気圧における沸点を意味する。また、カラムオーブンを具備するカラムクロマトグラフ装置においては、カラムオーブンの設定温度を、固定相と第１のアルコールとを接触させる際の温度とする。
In methods I to III, the temperature when the stationary phase is contacted with the first alcohol is usually 40° C. or higher, and is preferably 45° C. or higher, more preferably 50° C. or higher, in terms of obtaining a high separation performance improvement effect. The temperature when the stationary phase is contacted with the first alcohol is lower than the boiling point of the first alcohol, and is preferably lower than a temperature that is 3° C. or lower than the boiling point of the first alcohol. That is, preferred ranges of the temperature when the stationary phase is contacted with the first alcohol include, for example, 40° C. or higher and 3° C. or lower than the boiling point of the first alcohol, 45° C. or higher and lower than the boiling point of the first alcohol, and 50° C. or higher and lower than the boiling point of the first alcohol. To give a specific example, suitable temperature ranges when methanol (boiling point 64.7° C.) is used as the first alcohol include, for example, 40° C. or higher and 64.7° C. or lower, 45° C. or higher and 61.7° C. or lower, and 50° C. or higher and 60° C. or lower.
In this specification, the boiling point of the first alcohol means the boiling point at atmospheric pressure. In addition, in a column chromatograph equipped with a column oven, the set temperature of the column oven is the temperature at which the stationary phase is brought into contact with the first alcohol.
方法Ｉ～方法ＩＩＩにおいて、第１のアルコールの通液は、連続的に行ってもよく、断続的に行ってもよいが、連続的に行うことが好ましい。第１のアルコールの断続的な通液とは、第１のアルコールの通液において、通液を一時的に停止することによりカラム内で固定相を第１のアルコールに浸漬させ、この浸漬状態を一定時間保持した後に通液を再開
する操作が１回以上行われるものを意味する。
In the methods I to III, the first alcohol may be passed continuously or intermittently, but is preferably passed continuously. The intermittent passing of the first alcohol means that the stationary phase in the column is immersed in the first alcohol by temporarily stopping the passing of the first alcohol, and the immersed state is maintained for a certain period of time, after which the passing of the first alcohol is resumed, and this operation is carried out at least once.
方法Ｉ～方法ＩＩＩにおいて、第１のアルコールの流速（線速度）は、カラム圧力を、試料の分析において許容されるカラム圧力範囲と同等の範囲内に維持することができる限り特に制限されない。例えば、試料分析の際に、カラムが許容される圧力が５０ＭＰａ（５００ｋｇ／ｃｍ２）以下の場合は、カラム圧力が５０ＭＰａ以下となるように流速の上限を調整すればよい。カラム内の圧力は、固定相の粒子サイズ、第１のアルコールの粘度等に左右されるため、これらの要素を考慮しながら第１のアルコールの流速の上限を適宜決定すればよい。一方、第１のアルコールの流速の下限は特に限定されず、通常０ｍｍ／ｓｅｃ超である。 In Methods I to III, the flow rate (linear velocity) of the first alcohol is not particularly limited as long as the column pressure can be maintained within a range equivalent to the column pressure range permitted for sample analysis. For example, when the pressure permitted for the column during sample analysis is 50 MPa (500 kg/cm 2 ) or less, the upper limit of the flow rate may be adjusted so that the column pressure is 50 MPa or less. Since the pressure in the column depends on the particle size of the stationary phase, the viscosity of the first alcohol, etc., the upper limit of the flow rate of the first alcohol may be appropriately determined while taking these factors into consideration. On the other hand, the lower limit of the flow rate of the first alcohol is not particularly limited and is usually more than 0 mm/sec.
方法Ｉ～方法ＩＩＩにおいて、第１のアルコールの通液量は、カラム容積に対して、好ましくは１倍以上であり、十分な分離性能改善効果を得る観点から、より好ましくは２倍以上、５倍以上、又は１０倍以上である。また、第１のアルコールの通液量に上限はないが、実用上の観点から、カラム容積に対して、好ましくは１，０００倍以下、より好ましくは５００倍以下、１００倍以下、又は５０倍以下である。すなわち、第１のアルコールの通液量の好ましい範囲としては、例えばカラム容積に対して１倍以上１，０００倍以下、２倍以上５００倍以下、５倍以上１００倍、及び１０倍以上５０倍以下の範囲が挙げられる。 In methods I to III, the amount of the first alcohol passed through is preferably at least 1 time the column volume, and from the viewpoint of obtaining a sufficient effect of improving separation performance, more preferably at least 2 times, at least 5 times, or at least 10 times. There is no upper limit to the amount of the first alcohol passed through, but from a practical viewpoint, it is preferably at most 1,000 times the column volume, more preferably at most 500 times, at most 100 times, or at most 50 times. In other words, preferred ranges for the amount of the first alcohol passed through include, for example, 1 to 1,000 times, 2 to 500 times, 5 to 100 times, and 10 to 50 times the column volume.
方法Ｉにおいて、第１のアルコールの通液時間は、第１のアルコールの流速及び通液量に応じて適宜選択すればよい。ただし、カラムに第１のアルコールを断続的に通液する場合は、第１のアルコールの通液時間は、高い分離性能改善効果が得られる点で、好ましくは１５分以上、より好ましくは３０分以上、さらに好ましくは６０分以上であり、また、好ましくは３００分以下、より好ましくは１８０分以下である。すなわち、カラムに第１のアルコールを断続的に通液する時間の好ましい範囲としては、例えば１５分以上３００分以下、３０分以上３００分以下、及び６０分以上１８０分以下の範囲が挙げられる。 In method I, the time for passing the first alcohol may be appropriately selected depending on the flow rate and amount of the first alcohol. However, when the first alcohol is passed through the column intermittently, the time for passing the first alcohol is preferably 15 minutes or more, more preferably 30 minutes or more, even more preferably 60 minutes or more, and preferably 300 minutes or less, more preferably 180 minutes or less, in terms of obtaining a high effect of improving separation performance. In other words, the preferred range of the time for passing the first alcohol intermittently through the column is, for example, from 15 minutes to 300 minutes, from 30 minutes to 300 minutes, and from 60 minutes to 180 minutes.
また、方法Ｉにおいて、カラムを封止した状態でカラムを所定温度に加熱する際の加熱時間は、高い分離性能改善効果が得られる点で、好ましくは１２時間以上、より好ましくは１８時間以上、さらに好ましくは２４時間以上である。加熱時間の上限は、特に限定されないが、実用上の観点から、好ましくは２４０時間以下、より好ましくは２１６時間以下、さらに好ましくは１９２時間以下、特に好ましくは１２０時間以下である。すなわち、カラムを封止した状態でのカラムの加熱時間の好ましい範囲としては、例えば１２時間以上２４０時間以下、１２時間以上２１６時間以下、１８時間以上１９２時間以下、及び２４時間以上１２０時間以下の範囲が挙げられる。 In method I, the heating time when the column is heated to a predetermined temperature in a sealed state is preferably 12 hours or more, more preferably 18 hours or more, and even more preferably 24 hours or more, in order to obtain a high effect of improving separation performance. The upper limit of the heating time is not particularly limited, but from a practical viewpoint, it is preferably 240 hours or less, more preferably 216 hours or less, even more preferably 192 hours or less, and particularly preferably 120 hours or less. In other words, preferred ranges of the heating time of the column in a sealed state include, for example, 12 hours or more and 240 hours or less, 12 hours or more and 216 hours or less, 18 hours or more and 192 hours or less, and 24 hours or more and 120 hours or less.
方法ＩＩ及び方法ＩＩＩにおいて、第１のアルコールの通液時間は、固定相と第１のアルコールとが所定温度で接触している時間である。したがって、第１のアルコールの通液時間としては、方法Ｉにおけるカラムを封止した状態でカラムを所定温度に加熱する際の加熱時間と同様の時間を採用することができる。 In Method II and Method III, the time for passing the first alcohol is the time during which the stationary phase and the first alcohol are in contact at a predetermined temperature. Therefore, the time for passing the first alcohol can be the same as the heating time when the column is heated to a predetermined temperature in a sealed state in Method I.
1.1.4 分離性能の評価方法
固定相の分離性能を評価するための指標としては、保持係数（ｋ’）、分離係数（α）、カラム理論段数（Ｎ）、ピーク対称性（Ｐｓ）、及び分離度（Ｒ）を用いることができる。各指標は、以下のように定義される。
1.1.4 Method for evaluating separation performance The following indices can be used to evaluate the separation performance of a stationary phase: retention factor (k'), separation factor (α), number of theoretical columns (N), peak symmetry (Ps), and resolution (R). Each indice is defined as follows:
・保持係数ｋ１’＝（ｔ１－ｔ０）／ｔ０
・保持係数ｋ２’＝（ｔ２－ｔ０）／ｔ０
ｔ０：デッドタイム（固定相と相互作用しない物質をカラムに導入してから溶出され
るまでの時間である。便宜上、トリ－ｔｅｒｔ－ブチルベンゼンの溶出時間をデッドタイムとする。）
ｔ１：より弱く保持される成分の溶出時間
ｔ２：より強く保持される成分の溶出時間
Retention coefficient k1'=(t1-t0)/t0
Retention coefficient k2'=(t2-t0)/t0
t0: Dead time (the time from when a substance that does not interact with the stationary phase is introduced into the column until it is eluted. For convenience, the elution time of tri-tert-butylbenzene is taken as the dead time.)
t1: elution time of the weaker retained component t2: elution time of the stronger retained component
・分離係数α＝ｋ２’／ｋ１’（すなわち、（より強く保持される成分の保持係数）／（より弱く保持される成分の保持係数）） Separation factor α = k2'/k1' (i.e., (retention factor of the more strongly retained component)/(retention factor of the more weakly retained component))
・カラム理論段数（Ｎ）＝５．５４×（ｔｒ／Ｗ０．５）２
ｔｒ：保持時間
Ｗ：ピーク高さ１／２となる位置でのピーク幅（半値幅）
・ピーク対称性（Ｐｓ）＝Ｗ（５％）／２ａ
Ｗ（５％）：ピーク高さの５％の高さにおけるピーク幅（図１参照）
ａ：ピークトップから垂線をおろしてピークを二分したときの、ピーク高さの５％の高さにけるピークの立ち上がり側の幅（図１参照）
Column theoretical plate number (N) = 5.54 × (tr / W0.5) 2
tr: retention time W: peak width at half the peak height (half width)
Peak symmetry (Ps) = W (5%) / 2a
W(5%): Peak width at 5% of the peak height (see FIG. 1)
a: The width of the rising side of the peak at a height of 5% of the peak height when a perpendicular line is dropped from the peak top to divide the peak in half (see FIG. 1)
ｔＲ１，ｔＲ２：保持時間（ｔＲ１≦ｔＲ２）（図２参照）
Ｗ１，Ｗ２：ピーク幅（図２参照）
Ｗ０．５ｈ１，Ｗ０．５ｈ２：ピーク高さ１／２となる位置でのピーク幅（半値幅；図２参照）
tR1 , tR2 : retention time ( tR1 ≦ tR2 ) (see FIG. 2)
W1 , W2 : Peak width (see FIG. 2)
W 0.5h1 , W 0.5h2 : Peak width at the position where the peak height is 1/2 (half-value width; see FIG. 2)
本明細書においては、保持係数、分離係数、カラム理論段数、及び分離度のうち１つ以上の指標の値が増加しており、かつ、これらのうち値が低下した指標がないことを以って分離性能が改善したものと評価する。本実施形態においては、分離係数、カラム理論段数、及び分離度のうち１つ以上の指標の値が増加していることが好ましく、分離係数、カラム理論段数、及び分離度のうち２つ以上の値が増加していることが好ましく、分離係数、カラム理論段数、及び分離度の全ての指標において値が増加していることが好ましい。また、本実施形態に係る分離性能改善方法は、カラム理論段数及び分離度を改善する効果が特に高いため、カラム理論段数及び分離度の値が増加していることも特に好ましい。 In this specification, the separation performance is evaluated as being improved when the value of one or more of the indicators of the retention factor, separation factor, number of theoretical columns, and resolution has increased, and when none of these indicators has decreased in value. In this embodiment, it is preferable that the value of one or more of the indicators of the separation factor, number of theoretical columns, and resolution has increased, and it is preferable that the values of two or more of the separation factor, number of theoretical columns, and resolution have increased, and it is preferable that the values of all of the indicators of the separation factor, number of theoretical columns, and resolution have increased. In addition, since the separation performance improvement method according to this embodiment is particularly effective in improving the theoretical columns and resolution, it is also particularly preferable that the values of the theoretical columns and resolution have increased.
1.2 後処理工程
本実施形態においては、分離性能改善工程の後に、固定相と炭素数１以上４以下の第３のアルコール（以下、単に「第３のアルコール」と称することがある。）とを接触させる後処理工程を行うことが好ましい。かかる後処理工程を行うことにより、分離性能を安定的に改善することが可能となる。
1.2 Post-treatment step In this embodiment, after the separation performance improving step, it is preferable to carry out a post-treatment step in which the stationary phase is contacted with a third alcohol having 1 to 4 carbon atoms (hereinafter, sometimes simply referred to as "third alcohol"). By carrying out such a post-treatment step, it becomes possible to stably improve the separation performance.
1.2.1 第３のアルコール
炭素数１以上４以下の第３のアルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、及びイソブタノール等が挙げられる。これらのうち、第３のアルコールは、メタノール、エタノール、及びイソプロパノールからなる群より選択される１種以上であることが好ましく、エタノールであることがより好ましい。また、分離性能をより安定的に改善する観点から、後処理工程で用いる第３のアルコールは、処理（Ｂ）で用いられる第１のアルコールよりも炭素数の大きいアルコールであることも好ましい。炭素数１以上４以下の第３のアルコールは、１種単独で用いてもよく、２種以上を任意の組み合わせ及び比率で用いてもよい。
1.2.1 Third Alcohol Examples of the third alcohol having 1 to 4 carbon atoms include methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, sec-butanol, tert-butanol, and isobutanol. Of these, the third alcohol is preferably one or more selected from the group consisting of methanol, ethanol, and isopropanol, and more preferably ethanol. In addition, from the viewpoint of more stably improving the separation performance, it is also preferable that the third alcohol used in the post-treatment step is an alcohol having a larger carbon number than the first alcohol used in the treatment (B). The third alcohol having 1 to 4 carbon atoms may be used alone, or two or more may be used in any combination and ratio.
分離性能改善工程で処理（Ｂ）を行う場合、後処理工程で用いる第３のアルコールは、処理（Ｂ）で用いられる第１のアルコールと同一のアルコールであってもよく、異なるアルコールであってもよい。 When treatment (B) is performed in the separation performance improvement step, the third alcohol used in the post-treatment step may be the same alcohol as the first alcohol used in treatment (B) or may be a different alcohol.
1.2.2 接触条件
固定相と第３のアルコールとを接触させる方法は、特に限定されず、例えば固定相が充填されたカラムに第３のアルコールを通液させる方法を好適に採用し得る。第３のアルコールの通液は、連続的に行ってもよく、断続的に行ってもよいが、連続的に行うことが好ましい。なお、第３のアルコールの断続的な通液とは、分離性能改善工程の処理（Ａ）におけるジアルキルエーテルの断続的な通液と同義である。
1.2.2 Contact Conditions The method of contacting the stationary phase with the third alcohol is not particularly limited, and for example, a method of passing the third alcohol through a column packed with the stationary phase can be suitably adopted. The passing of the third alcohol may be performed continuously or intermittently, but is preferably performed continuously. The intermittent passing of the third alcohol is synonymous with the intermittent passing of the dialkyl ether in the treatment (A) of the separation performance improvement step.
第３のアルコールの流速（線速度）は、好ましくは０．０１ｍｍ／ｓｅｃ以上、より好ましくは０．０５ｍｍ／ｓｅｃ以上、さらに好ましくは０．１ｍｍ／ｓｅｃ以上、特に好ましくは０．３ｍｍ／ｓｅｃ以上であり、また、好ましくは１０．０ｍｍ／ｓｅｃ以下、より好ましくは８．０ｍｍ／ｓｅｃ以下、さらに好ましくは６．０ｍｍ／ｓｅｃ以下、特に好ましくは４．０ｍｍ／ｓｅｃ以下である。すなわち、第３のアルコールの流速の好ましい範囲としては、０．０１ｍｍ／ｓｅｃ以上１０．０ｍｍ／ｓｅｃ以下、０．０５ｍｍ／ｓｅｃ以上８．０ｍｍ／ｓｅｃ以下、０．１ｍｍ／ｓｅｃ以上６．０ｍｍ／ｓｅｃ以下、及び０．３ｍｍ／ｓｅｃ以上４．０ｍｍ／ｓｅｃ以下の範囲が挙げられる。 The flow rate (linear velocity) of the third alcohol is preferably 0.01 mm/sec or more, more preferably 0.05 mm/sec or more, even more preferably 0.1 mm/sec or more, particularly preferably 0.3 mm/sec or more, and is preferably 10.0 mm/sec or less, more preferably 8.0 mm/sec or less, even more preferably 6.0 mm/sec or less, particularly preferably 4.0 mm/sec or less. In other words, the preferred ranges of the flow rate of the third alcohol include 0.01 mm/sec or more and 10.0 mm/sec or less, 0.05 mm/sec or more and 8.0 mm/sec or less, 0.1 mm/sec or more and 6.0 mm/sec or less, and 0.3 mm/sec or more and 4.0 mm/sec or less.
第３のアルコールの通液量は、カラム容積に対して、好ましくは１倍以上であり、分離性能改善効果をより高める観点から、より好ましくは２倍以上又は３倍以上である。また、第３のアルコールの通液量に上限はないが、実用上の観点から、カラム容積に対して好ましくは１，０００倍以下、より好ましくは５００倍以下、１００倍又は１０倍以下である。すなわち、第３のアルコールの通液量の好ましい範囲としては、例えばカラム容積に対して１倍以上１，０００倍以下、１倍以上５００倍以下、２倍以上１００倍、及び３倍以上１０倍以下の範囲が挙げられる。 The amount of the third alcohol passed through is preferably at least 1 time the column volume, and from the viewpoint of further enhancing the effect of improving the separation performance, more preferably at least 2 times or at least 3 times. There is no upper limit to the amount of the third alcohol passed through, but from a practical viewpoint, it is preferably at most 1,000 times the column volume, more preferably at most 500 times, 100 times, or 10 times. In other words, preferred ranges of the amount of the third alcohol passed through include, for example, 1 to 1,000 times, 1 to 500 times, 2 to 100 times, and 3 to 10 times the column volume.
第３のアルコールの通液時間は、第３のアルコールの流速及び通液量に応じて適宜選択すればよい。ただし、カラムに第３のアルコールを断続的に通液する場合、第３のアルコールの通液時間は、好ましくは１５分以上、より好ましくは３０分以上、さらに好ましくは６０分以上であり、また、好ましくは３００分以下、より好ましくは１８０分以下である。すなわち、カラムに第３のアルコールを断続的に通液する時間の好ましい範囲としては、例えば１５分以上３００分以下、３０分以上３００分以下、及び６０分以上１８０分以下の範囲が挙げられる。 The time for passing the third alcohol may be appropriately selected depending on the flow rate and amount of the third alcohol. However, when the third alcohol is passed through the column intermittently, the time for passing the third alcohol is preferably 15 minutes or more, more preferably 30 minutes or more, even more preferably 60 minutes or more, and preferably 300 minutes or less, more preferably 180 minutes or less. In other words, the preferred range for the time for passing the third alcohol intermittently through the column is, for example, from 15 minutes to 300 minutes, from 30 minutes to 300 minutes, and from 60 minutes to 180 minutes.
後処理工程においては、アルコールを意図的に加熱しない条件で行うことが好ましい。したがって、第３のアルコール通液の際の第３のアルコールの温度は、好ましくは０℃以上室温以下、より好ましくは室温である。 In the post-treatment step, it is preferable to perform the step under conditions in which the alcohol is not intentionally heated. Therefore, the temperature of the third alcohol when passing through the third alcohol is preferably 0°C or higher and room temperature or lower, more preferably room temperature.
1.3 前処理工程
本実施形態においては、分離性能改善工程の前に、固定相と炭素数１～３の第２のアルコール（以下、単に「第２のアルコール」と称することがある。）とを接触させる前処理工程を行うことが好ましい。これは、分離性能改善工程において、カラム内の溶剤（移動相）との相溶性の低い有機溶剤を用いる場合は、移動相及び有機溶剤が互いに分離して分
離性能改善効果を十分に得られない虞があるところ、分離性能改善工程に先立って移動相及び有機溶剤の双方と相溶可能なアルコールをカラムに通液することで、このような事態を回避し得るからであると考えられる。また、分離性能改善工程において、分離性能改善効果を十分に発揮するためには、固定相に残存する分析試料及び不純物等を取り除いておくことが好ましく、したがって、分離性能改善工程に先立って移動相及び有機溶剤の双方と相溶可能なアルコールにより固定相を洗浄しておくことが望ましいからであると考えられる。
1.3 Pretreatment Step In this embodiment, it is preferable to carry out a pretreatment step of contacting the stationary phase with a second alcohol having 1 to 3 carbon atoms (hereinafter, sometimes simply referred to as "second alcohol") before the separation performance improvement step. This is because, when an organic solvent having low compatibility with the solvent (mobile phase) in the column is used in the separation performance improvement step, the mobile phase and the organic solvent may separate from each other and the separation performance improvement effect may not be sufficiently obtained, and this situation can be avoided by passing an alcohol compatible with both the mobile phase and the organic solvent through the column prior to the separation performance improvement step. In addition, in order to fully exert the separation performance improvement effect in the separation performance improvement step, it is preferable to remove the analysis sample and impurities remaining in the stationary phase, and therefore it is preferable to wash the stationary phase with an alcohol compatible with both the mobile phase and the organic solvent prior to the separation performance improvement step.
1.3.1 第２のアルコール
前処理工程に用いられる第２のアルコールとしては、後処理工程に用いられる第３のアルコールとして挙げた化合物と同様のものが挙げられ、好ましい態様も同様である。また、前処理工程及び後処理工程の両方を行う場合、前処理工程に用いる第２のアルコールと後処理工程に用いる第３のアルコールとは、同一であってもよく、異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。すなわち、前処理工程及び後処理工程の両方において、固定相とエタノールとを接触させることが特に好ましい。
1.3.1 Second alcohol The second alcohol used in the pretreatment step may be the same as the compound listed as the third alcohol used in the posttreatment step, and the preferred embodiments are also the same. In addition, when both the pretreatment step and the posttreatment step are performed, the second alcohol used in the pretreatment step and the third alcohol used in the posttreatment step may be the same or different, but are preferably the same. That is, it is particularly preferable to contact the stationary phase with ethanol in both the pretreatment step and the posttreatment step.
1.3.2 接触条件
固定相と第２のアルコールとを接触させる方法の説明としては、後処理工程の「1.2.2 接触条件」の項目における説明を援用する。ただし、第２のアルコールの流速（線速度）は、後処理工程における第３のアルコールの流速を採用することができるが、カラム圧力を、試料の分析において許容されるカラム圧力範囲と同等の範囲内に維持することができる限り、特に限定されない。
1.3.2 Contact Conditions The explanation of the method of contacting the stationary phase with the second alcohol is given in the section "1.2.2 Contact Conditions" in the post-treatment step. However, the flow rate (linear velocity) of the second alcohol may be the same as the flow rate of the third alcohol in the post-treatment step, but is not particularly limited as long as the column pressure can be maintained within the same range as the column pressure range acceptable for sample analysis.
本実施形態に係る分離性能改善方法によれば、使用に伴い低下したカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能を、使用前（出荷時）と同程度又は同程度以上の分離性能にまで回復させることができる。このように、本実施形態に係る分離性能改善方法により、従来は廃棄対象となっていた固定相であっても、高い分離性能を有する固定相に再生することができるため、固定相の寿命を延ばすことができる。 According to the separation performance improvement method of this embodiment, the separation performance of a stationary phase for column chromatography that has deteriorated with use can be restored to the same level or higher than the level before use (at the time of shipment). In this way, the separation performance improvement method of this embodiment can regenerate even stationary phases that would have been discarded in the past into stationary phases with high separation performance, thereby extending the life of the stationary phase.
加えて、製造直後のカラムクロマトグラフィー用固定相であって、分離性能が基準値未満である固定相に対して本実施形態に係る分離性能改善方法を使用すれば、当該固定相を、製品として必要な水準の分離性能を有する固定相に変換することができる。したがって、本実施形態に係る分離性能改善方法は、カラムクロマトグラフィー用固定相の製造において、歩留まりを向上させるためにも有効である。 In addition, if the separation performance improvement method according to this embodiment is applied to a stationary phase for column chromatography immediately after production, in which the separation performance is below a reference value, the stationary phase can be converted into a stationary phase having a required level of separation performance as a product. Therefore, the separation performance improvement method according to this embodiment is also effective in improving the yield in the production of stationary phases for column chromatography.
2 カラムクロマトグラフィー用固定相の製造方法
本開示の他の実施形態は、上述の分離性能改善方法により、当該分離性能改善方法を実施する前よりも分離性能が改善されたカラムクロマトグラフィー用固定相を製造する方法である。換言すると、本開示の他の実施形態は、担体にセルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる被処理固定相を有機溶剤で処理する分離性能改善工程を含み、前記処理が下記（Ａ）又は下記（Ｂ）である、カラムクロマトグラフィー用固定相の製造方法である（本明細書においては、分離性能改善工程を行う前の固定相を「被処理固定相」、分離性能改善工程を行った後の固定相を「分離性能の改善した固定相」と称することがある。）。
（Ａ）被処理固定相と炭素数４以上１０以下のジアルキルエーテルとを接触させる処理。（Ｂ）被処理固定相と炭素数１以上４以下の第１のアルコールとを４０℃以上第１のアルコールの沸点以下の温度で接触させる処理。
2. Method for Producing a Stationary Phase for Column Chromatography Another embodiment of the present disclosure is a method for producing a stationary phase for column chromatography having improved separation performance compared to before the separation performance improvement method is carried out, by the above-mentioned separation performance improvement method. In other words, another embodiment of the present disclosure is a method for producing a stationary phase for column chromatography, comprising a separation performance improvement step of treating a treated stationary phase having cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) supported on a carrier with an organic solvent, the treatment being the following (A) or (B) (in this specification, the stationary phase before the separation performance improvement step is sometimes referred to as the "treated stationary phase", and the stationary phase after the separation performance improvement step is sometimes referred to as the "stationary phase with improved separation performance").
(A) A treatment in which the stationary phase to be treated is contacted with a dialkyl ether having from 4 to 10 carbon atoms. (B) A treatment in which the stationary phase to be treated is contacted with a first alcohol having from 1 to 4 carbon atoms at a temperature of from 40° C. to the boiling point of the first alcohol.
すなわち、本実施形態における分離性能改善工程は、上述の分離性能改善方法における分離性能改善工程と同義である。 In other words, the separation performance improvement process in this embodiment is synonymous with the separation performance improvement process in the above-mentioned separation performance improvement method.
本実施形態において、被処理固定相とは、分離性能が低く、分離性能改善の対象となる固定相である。具体的には、試料分析の繰り返しにより分離性能が低下した固定相、及び製造プロセス中の不具合により製造された時点で十分な分離性能が得られなかった固定相等を被処理固定相として採用し得る。 In this embodiment, the stationary phase to be treated is a stationary phase that has low separation performance and is the target for improving the separation performance. Specifically, a stationary phase whose separation performance has deteriorated due to repeated sample analysis, a stationary phase that does not have sufficient separation performance at the time of manufacture due to a defect in the manufacturing process, etc. may be used as the stationary phase to be treated.
本実施形態においては、分離係数（α）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）が改善したことを以って固定相の分離性能が改善したと判断するものとする。すなわち、本実施形態に係る製造方法は、下記（ａ）～（ｃ）を満たす。
（ａ）分離性能の改善した固定相の分離係数（α）が、被処理固定相の分離係数よりも高い。
（ｂ）分離性能の改善した固定相のカラム理論段数（Ｎ）が、被処理固定相のカラム理論段数よりも高い。
（ｃ）分離性能の改善した固定相の分離度（Ｒ）が、前記被処理固定相の分離度よりも高い。
In this embodiment, the separation performance of the stationary phase is determined to be improved by improving the separation factor (α), the number of theoretical columns (N), and the resolution (R). That is, the production method according to this embodiment satisfies the following (a) to (c).
(a) The separation factor (α) of the stationary phase with improved separation performance is higher than the separation factor of the treated stationary phase.
(b) The column theoretical plate number (N) of the stationary phase with improved separation performance is higher than the column theoretical plate number of the stationary phase to be treated.
(c) The resolution (R) of the stationary phase having improved separation performance is higher than the resolution of the treated stationary phase.
また、本実施形態に係る製造方法においても、分離性能がより改善されたカラムクロマトグラフィー用固定相を製造する観点から、分離性能改善工程の前後に、それぞれに、上述の分離性能改善方法における前処理工程及び後処理工程を含んでいてもよい。 In addition, the manufacturing method according to this embodiment may also include a pre-treatment step and a post-treatment step in the above-mentioned separation performance improvement method before and after the separation performance improvement step, respectively, in order to manufacture a stationary phase for column chromatography with improved separation performance.
以下、本開示を実施例によりさらに具体的に説明するが、本開示はその要旨を逸脱しない限り、下記の実施例に限定されるものではない。 The present disclosure will be explained in more detail below with reference to examples, but the present disclosure is not limited to the following examples as long as they do not deviate from the gist of the disclosure.
〔実施例１〕
シリカゲルにセルローストリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる固定相が充填されたカラムとして、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＭカラム（０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ；株式会社ダイセル製）を用い、固定相の初期（出荷時）分離性能、劣化試験により経時劣化した状態を模擬的に再現した固定相の分離性能、及び分離性能改善方法を実施した後の固定相の分離性能をそれぞれ評価した。
Example 1
A CHIRALPAK (registered trademark) IM column (0.46 cmφ×25 cm; manufactured by Daicel Corporation) was used as a column packed with a stationary phase in which cellulose tris(3-chloro-4-methylphenylcarbamate) was supported on silica gel. The initial (shipped) separation performance of the stationary phase, the separation performance of the stationary phase which simulated a state in which it had deteriorated over time through a deterioration test, and the separation performance of the stationary phase after the separation performance improvement method was implemented were each evaluated.
［初期分離性能の評価］
使用前のＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＭカラムを液体クロマトグラフ装置（Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）シリーズ；株式会社島津製作所製）に接続した。この液体クロマトグラフ装置記分析条件でｔｒａｎｓ－スチルベンオキシドのラセミ体の光学分割を行い、固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表１に、クロマトグラムを図３に示す。
[Evaluation of initial separation performance]
The CHIRALPAK (registered trademark) IM column before use was connected to a liquid chromatograph (Nexera (registered trademark) series; manufactured by Shimadzu Corporation). Using this liquid chromatograph, optical resolution of the racemic mixture of trans-stilbene oxide was carried out under the analysis conditions described above, and the separation performance of the stationary phase was evaluated. The separation factor (α), retention factor (k'), number of theoretical columns (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 1, and the chromatogram is shown in FIG. 3.
（分析条件）
移動相：ヘキサン／２－プロパノール＝９０／１０（ｖ／ｖ）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
コンディショニング時間：６０分
(Analysis conditions)
Mobile phase: hexane/2-propanol = 90/10 (v/v)
Flow rate: 1.0 mL / min
Temperature: 25°C
Detection: UV 254 nm
Conditioning time: 60 minutes
［劣化試験後の分離性能の評価］
初期分離性能評価後、下記条件で劣化試験を行い、固定相を模擬的に劣化させた。
その後、初期分離性能の評価と同様の分析条件でｔｒａｎｓ－スチルベンオキシドのラセミ体の光学分割を行い、固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表１に、クロマトグラムを図
４に示す。
[Evaluation of separation performance after deterioration test]
After the initial separation performance evaluation, a deterioration test was carried out under the following conditions to simulate deterioration of the stationary phase.
Thereafter, the racemic mixture of trans-stilbene oxide was optically resolved under the same analytical conditions as those for evaluating the initial separation performance, and the separation performance of the stationary phase was evaluated. The separation factor (α), retention factor (k'), number of theoretical columns (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 1, and the chromatogram is shown in Figure 4.
（劣化試験条件）
移動相：酢酸エチル
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：６０分
(Deterioration test conditions)
Mobile phase: ethyl acetate Flow rate: 0.5 mL/min
Temperature: 25°C
Flow time: 60 minutes
［分離性能改善試験後の分離性能の評価］
劣化試験後の分離性能の評価後、下記条件で分離性能改善工程及び後処理工程を行い、固定相の分離性能を改善させた。
その後、初期分離性能の評価と同様の分析条件でｔｒａｎｓ－スチルベンオキシドのラセミ体の光学分割を行い、固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表１に、クロマトグラムを図５に示す。
[Evaluation of separation performance after separation performance improvement test]
After evaluating the separation performance after the deterioration test, a separation performance improvement step and a post-treatment step were carried out under the following conditions to improve the separation performance of the stationary phase.
Thereafter, the racemic mixture of trans-stilbene oxide was optically resolved under the same analytical conditions as those for evaluating the initial separation performance, and the separation performance of the stationary phase was evaluated. The separation factor (α), retention factor (k'), number of theoretical columns (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 1, and the chromatogram is shown in Figure 5.
（分離性能改善工程の条件）
移動相：メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：６０分
(Conditions for the separation performance improvement process)
Mobile phase: methyl tert-butyl ether Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25°C
Flow time: 60 minutes
（後処理工程の条件）
移動相：エタノール
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：５０分
(Conditions for post-treatment process)
Mobile phase: ethanol Flow rate: 0.5 mL/min
Temperature: 25°C
Flow time: 50 minutes
表１より、担体にセルローストリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる固定相を含むカラムに、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル及びエタノールを順次通液することで、分離係数及びカラム理論段数が改善することがわかる。より詳細には、固定相の分離係数が、使用前の固定相とほぼ同程度にまで改善することが確認された。さらに、劣化試験により初期段階の約３５％まで低下したカラム理論段数が、上記分離性能改善試験により、初期カラム理論段数を１０％以上上回るほどまでに改善することが確認された。これらのことから、本開示に係る方法は、優れた分離性能改善効果を奏
することがわかる。
From Table 1, it can be seen that the separation factor and the theoretical number of columns are improved by passing methyl tert-butyl ether and ethanol in sequence through a column containing a stationary phase in which cellulose tris(3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is supported on a carrier. More specifically, it was confirmed that the separation factor of the stationary phase was improved to almost the same level as the stationary phase before use. Furthermore, it was confirmed that the theoretical number of columns, which had decreased to about 35% of the initial stage in the deterioration test, was improved to 10% or more higher than the initial theoretical number of columns in the separation performance improvement test. From these facts, it can be seen that the method according to the present disclosure has an excellent effect of improving separation performance.
〔実施例２〕
シリカゲルにセルローストリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる固定相が充填されたカラムとして、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＭカラム（０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ；株式会社ダイセル製）を用い、固定相の初期（出荷時）分離性能、劣化試験により経時劣化した状態を模擬的に再現した固定相の分離性能、及び分離性能改善方法を実施した後の固定相の分離性能をそれぞれ評価した。
Example 2
A CHIRALPAK (registered trademark) IM column (0.46 cmφ×25 cm; manufactured by Daicel Corporation) was used as a column packed with a stationary phase in which cellulose tris(3-chloro-4-methylphenylcarbamate) was supported on silica gel. The initial (shipped) separation performance of the stationary phase, the separation performance of the stationary phase which simulated a state in which it had deteriorated over time through a deterioration test, and the separation performance of the stationary phase after the separation performance improvement method was implemented were each evaluated.
［初期分離性能の評価］
実施例１と同様にして固定相の初期分離性能を評価した。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表２に、クロマトグラムを図６に示す。
[Evaluation of initial separation performance]
The initial separation performance of the stationary phase was evaluated in the same manner as in Example 1. The separation factor (α), retention factor (k′), column theoretical plate number (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 2, and the chromatogram is shown in FIG.
［劣化試験後の分離性能の評価］
実施例１と同様にして劣化試験後の固定相の分離性能の評価を行った。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表２に、クロマトグラムを図７に示す。
[Evaluation of separation performance after deterioration test]
The separation performance of the stationary phase after the deterioration test was evaluated in the same manner as in Example 1. The separation factor (α), retention factor (k′), number of theoretical columns (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 2, and the chromatogram is shown in FIG.
［分離性能改善試験後の分離性能の評価］
分離性能改善工程及び後処理工程の条件を下記に示す通りに変更した以外は、実施例１と同様にして分離性能改善試験後の固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表２に、クロマトグラムを図８に示す。
[Evaluation of separation performance after separation performance improvement test]
Except for changing the conditions of the separation performance improvement step and the post-treatment step as shown below, the separation performance of the stationary phase after the separation performance improvement test was evaluated in the same manner as in Example 1. The separation factor (α), retention factor (k'), number of theoretical columns (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 2, and the chromatogram is shown in Figure 8.
（分離性能改善工程の条件）
移動相：メタノール
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：６０分
カラム封止後の加熱温度：６０℃
カラム封止時間：２４時間
(Conditions for the separation performance improvement process)
Mobile phase: methanol Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25°C
Flow time: 60 minutes Heating temperature after sealing the column: 60°C
Column sealing time: 24 hours
（後処理工程の条件）
移動相：エタノール
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：２０分
(Conditions for post-treatment process)
Mobile phase: ethanol Flow rate: 0.5 mL/min
Temperature: 25°C
Flow time: 20 minutes
表２より、担体にセルローストリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる固定相とメタノールとが接触した状態で加熱を行い、さらにエタノールの通液を行うことで、固定相の分離係数及びカラム理論段数が改善することがわかる。特に、劣化試験により初期段階の約８５％まで低下したカラム理論段数が、上記分離性能改善試験により、初期カラム理論段数を６％以上上回るほどまでに改善することが確認された。これらのことから、本開示に係る方法は、優れた分離性能改善効果を奏することがわかる。 From Table 2, it can be seen that the separation coefficient of the stationary phase and the theoretical number of columns are improved by heating the stationary phase, in which cellulose tris(3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is supported on the carrier, in contact with methanol, and then passing ethanol through the stationary phase. In particular, it was confirmed that the theoretical number of columns, which had decreased to about 85% of the initial number in the deterioration test, improved to 6% or more above the initial theoretical number of columns in the separation performance improvement test. From these facts, it can be seen that the method disclosed herein has an excellent effect of improving separation performance.
〔比較例１〕
シリカゲルにセルローストリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる固定相が充填されたカラムとして、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＭカラム（０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ；株式会社ダイセル製）を用い、固定相の初期（出荷時）分離性能、劣化試験により経時劣化した状態を模擬的に再現した固定相の分離性能、及び分離性能改善方法を実施した後の固定相の分離性能をそれぞれ評価した。
Comparative Example 1
A CHIRALPAK (registered trademark) IM column (0.46 cmφ×25 cm; manufactured by Daicel Corporation) was used as a column packed with a stationary phase in which cellulose tris(3-chloro-4-methylphenylcarbamate) was supported on silica gel. The initial (shipped) separation performance of the stationary phase, the separation performance of the stationary phase which simulated a state deteriorated over time by a deterioration test, and the separation performance of the stationary phase after implementation of the separation performance improvement method were each evaluated.
［初期分離性能の評価］
実施例１と同様にして固定相の初期分離性能を評価した。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表３に、クロマトグラムを図９に示す。
[Evaluation of initial separation performance]
The initial separation performance of the stationary phase was evaluated in the same manner as in Example 1. The separation factor (α), retention factor (k′), column theoretical plate number (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 3, and the chromatogram is shown in FIG.
［劣化試験後の分離性能の評価］
劣化試験条件を下記に示す通りに変更した以外は、実施例１と同様にして、劣化試験後の固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表３に、クロマトグラムを図１０に示す。
[Evaluation of separation performance after deterioration test]
Except for changing the deterioration test conditions as shown below, the separation performance of the stationary phase after the deterioration test was evaluated in the same manner as in Example 1. The separation factor (α), retention factor (k′), column theoretical plate number (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 3, and the chromatogram is shown in Figure 10.
（劣化試験条件）
移動相：テトラヒドロフラン
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：６０分
(Deterioration test conditions)
Mobile phase: tetrahydrofuran Flow rate: 0.5 mL/min
Temperature: 25°C
Flow time: 60 minutes
［分離性能改善試験後の分離性能の評価］
分離性能改善工程の条件を下記に示す通りに変更した以外は、実施例１と同様にして分離性能改善試験後の固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表３に、クロマトグラムを図１１に示す。
[Evaluation of separation performance after separation performance improvement test]
Except for changing the conditions of the separation performance improvement step as shown below, the separation performance of the stationary phase after the separation performance improvement test was evaluated in the same manner as in Example 1. The separation factor (α), retention factor (k′), column theoretical plate number (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 3, and the chromatogram is shown in Figure 11.
（分離性能改善工程の条件）
移動相：ジクロロメタン
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：１８０分
(Conditions for the separation performance improvement process)
Mobile phase: dichloromethane Flow rate: 0.3 mL/min
Temperature: 25°C
Flow time: 180 minutes
表３より、担体にセルローストリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる固定相を含むカラムに、ジクロロメタン及びエタノールを順次通液しても、カラム理論段数の値が増加しないことがわかる。また、分離係数及び分離度は、上記分離性能改善試験により値が増加するものの、分離性能改善の程度が十分でないことがわかる。 From Table 3, it can be seen that even if dichloromethane and ethanol are passed through a column containing a stationary phase in which cellulose tris(3-chloro-4-methylphenylcarbamate) is supported on the carrier, the value of the theoretical number of columns does not increase. In addition, it can be seen that although the separation coefficient and resolution increase as a result of the above separation performance improvement test, the degree of improvement in separation performance is not sufficient.
〔比較例２〕
シリカゲルにセルローストリス（４－メチルベンゾエート）が担持されてなる固定相が充填されたカラムとして、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＪカラム（０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ；株式会社ダイセル製）を用い、固定相の初期（出荷時）分離性能、劣化試験により経時劣化した状態を模擬的に再現した固定相の分離性能、及び分離性能改善方法を実施した後の固定相の分離性能をそれぞれ評価した。
Comparative Example 2
A CHIRALPAK (registered trademark) IJ column (0.46 cmφ×25 cm; manufactured by Daicel Corporation) was used as a column packed with a stationary phase consisting of cellulose tris(4-methylbenzoate) supported on silica gel. The initial (shipped) separation performance of the stationary phase, the separation performance of the stationary phase simulating a state deteriorated over time by a deterioration test, and the separation performance of the stationary phase after implementation of the separation performance improvement method were each evaluated.
［初期分離性能の評価］
使用前のＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＪカラムを液体クロマトグラフ装置（Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）シリーズ；株式会社島津製作所製）に接続した。この液体クロマトグラフ装置記分析条件でｔｒａｎｓ－スチルベンオキシドのラセミ体の光学分割を行い、固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表４に、クロマトグラムを図１２に示す。
[Evaluation of initial separation performance]
The CHIRALPAK (registered trademark) IJ column before use was connected to a liquid chromatograph (Nexera (registered trademark) series; manufactured by Shimadzu Corporation). Using this liquid chromatograph, optical resolution of the racemic mixture of trans-stilbene oxide was performed under the analysis conditions described above, and the separation performance of the stationary phase was evaluated. The separation factor (α), retention factor (k'), number of theoretical columns (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 4, and the chromatogram is shown in FIG. 12.
（分析条件）
移動相：ヘキサン／２－プロパノール＝９０／１０（ｖ／ｖ）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
コンディショニング時間：６０分
(Analysis conditions)
Mobile phase: hexane/2-propanol = 90/10 (v/v)
Flow rate: 1.0 mL / min
Temperature: 25°C
Detection: UV 254 nm
Conditioning time: 60 minutes
［劣化試験後の分離性能の評価］
初期分離性能評価後、下記条件で劣化試験を行い、固定相を模擬的に劣化させた。
その後、初期分離性能の評価と同様の分析条件でｔｒａｎｓ－スチルベンオキシドのラセミ体の光学分割を行い、固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表４に、クロマトグラムを図１３に示す。
[Evaluation of separation performance after deterioration test]
After the initial separation performance evaluation, a deterioration test was carried out under the following conditions to simulate deterioration of the stationary phase.
Thereafter, the racemic mixture of trans-stilbene oxide was optically resolved under the same analytical conditions as those for evaluating the initial separation performance, and the separation performance of the stationary phase was evaluated. The separation factor (α), retention factor (k'), number of theoretical columns (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 4, and the chromatogram is shown in Figure 13.
（劣化試験条件）
移動相：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：６０分
(Deterioration test conditions)
Mobile phase: N,N-dimethylformamide Flow rate: 0.5 mL/min
Temperature: 25°C
Flow time: 60 minutes
［分離性能改善試験後の分離性能の評価］
劣化試験後の分離性能の評価後、下記条件で分離性能改善工程及び後処理工程を行い、固定相の分離性能を改善させた。
その後、初期分離性能の評価と同様の分析条件でｔｒａｎｓ－スチルベンオキシドのラセミ体の光学分割を行い、固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α）、保持係数（ｋ’）、カラム理論段数（Ｎ）、及び分離度（Ｒ）を表４に、クロマトグラムを図１４に示す。
[Evaluation of separation performance after separation performance improvement test]
After evaluating the separation performance after the deterioration test, a separation performance improvement step and a post-treatment step were carried out under the following conditions to improve the separation performance of the stationary phase.
Thereafter, the racemic mixture of trans-stilbene oxide was optically resolved under the same analytical conditions as those for evaluating the initial separation performance, and the separation performance of the stationary phase was evaluated. The separation factor (α), retention factor (k'), number of theoretical columns (N), and resolution (R) of the stationary phase are shown in Table 4, and the chromatogram is shown in Figure 14.
（分離性能改善工程の条件）
移動相：メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：６０分
(Conditions for the separation performance improvement process)
Mobile phase: methyl tert-butyl ether Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25°C
Flow time: 60 minutes
（後処理工程の条件）
移動相：エタノール
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：５０分
(Conditions for post-treatment process)
Mobile phase: ethanol Flow rate: 0.5 mL/min
Temperature: 25°C
Flow time: 50 minutes
表２より、担体にセルローストリス（４－メチルベンゾエート）が担持されてなる固定相を含むカラムに、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル及びエタノールを順次通液した場合
、保持係数、分離係数、カラム理論段数、及び分離度の全ての指標の値が増加するものの、いずれも初期分離性能と同程度までは増加しておらず、分離性能改善の程度が十分でないことがわかる。
From Table 2, it can be seen that when methyl tert-butyl ether and ethanol are sequentially passed through a column containing a stationary phase in which cellulose tris(4-methylbenzoate) is supported on a carrier, the values of all the indices, i.e., retention coefficient, separation coefficient, number of theoretical columns, and resolution, increase, but none of them increase to the same extent as the initial separation performance, and the degree of improvement in separation performance is not sufficient.
以上より、本開示に係る方法によれば、使用により分離性能が劣化した固定相の分離性能を、使用前と同等又は同等以上にまで改善することができる。したがって、固定相の分離性能が経時的に劣化した場合であっても、本開示に係る方法を用いることで、固定相の分離性能が改善するため、固定相の寿命を延ばすことができる。 As described above, according to the method disclosed herein, the separation performance of a stationary phase whose separation performance has deteriorated due to use can be improved to the same or better than that before use. Therefore, even if the separation performance of the stationary phase deteriorates over time, the method disclosed herein can be used to improve the separation performance of the stationary phase, thereby extending the life of the stationary phase.
Claims (13)
担体にセルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる固定相を有機溶剤で処理する分離性能改善工程を含み、
前記処理が、下記（Ａ）又は下記（Ｂ）である、カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
（Ａ）前記固定相と炭素数４以上１０以下のジアルキルエーテルとを接触させる処理。
（Ｂ）前記固定相と炭素数１以上４以下の第１のアルコールとを４０℃以上前記第１のアルコールの沸点以下の温度で接触させる処理。 A method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography, comprising the steps of:
The separation performance improving step includes treating a stationary phase having cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate) supported on a carrier with an organic solvent,
The method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography, wherein the treatment is the following (A) or (B):
(A) A treatment of contacting the stationary phase with a dialkyl ether having 4 to 10 carbon atoms.
(B) contacting the stationary phase with a first alcohol having 1 to 4 carbon atoms at a temperature of 40° C. or higher and the boiling point of the first alcohol.
充填されたカラムに前記第２のアルコールを通液させることにより行われる、請求項１１に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。 The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to claim 11, wherein the contact between the stationary phase and the second alcohol in the pretreatment step is carried out by passing the second alcohol through a column packed with the stationary phase.
担体にセルロース（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）が担持されてなる被処理固定相を有機溶剤で処理する分離性能改善工程を含み、
前記処理が、下記（Ａ）又は下記（Ｂ）であり、
下記（ａ）～（ｃ）を満たす、カラムクロマトグラフィー用固定相の製造方法。
（Ａ）前記被処理固定相と炭素数４以上１０以下のジアルキルエーテルとを接触させる処理。
（Ｂ）前記被処理固定相と炭素数１以上４以下の第１のアルコールとを４０℃以上前記第１のアルコールの沸点以下の温度で接触させる処理。
（ａ）前記分離性能改善工程により分離性能の改善した固定相の分離係数（α）が、前記被処理固定相の分離係数よりも高い。
（ｂ）前記分離性能改善工程により分離性能の改善した固定相のカラム理論段数（Ｎ）が、前記被処理固定相のカラム理論段数よりも高い。
（ｃ）前記分離性能改善工程により分離性能の改善した固定相の分離度（Ｒ）が、前記被処理固定相の分離度よりも高い。 A method for producing a stationary phase for column chromatography, comprising the steps of:
The separation performance improving step includes treating a stationary phase to be treated, which is a carrier carrying cellulose (3-chloro-4-methylphenylcarbamate), with an organic solvent,
The treatment is the following (A) or the following (B),
A method for producing a stationary phase for column chromatography, which satisfies the following (a) to (c):
(A) A treatment in which the stationary phase to be treated is contacted with a dialkyl ether having 4 to 10 carbon atoms.
(B) A treatment in which the stationary phase to be treated is contacted with a first alcohol having 1 to 4 carbon atoms at a temperature of 40° C. or higher and the boiling point of the first alcohol or lower.
(a) The separation factor (α) of the stationary phase whose separation performance has been improved by the separation performance improving step is higher than the separation factor of the stationary phase to be treated.
(b) the number of theoretical columns (N) of the stationary phase whose separation performance has been improved by the separation performance improving step is higher than the number of theoretical columns of the stationary phase to be treated.
(c) The degree of resolution (R) of the stationary phase whose separation performance has been improved by the separation performance improving step is higher than the degree of resolution of the stationary phase to be treated.
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