JP2024051908A - Coronavirus Neutralizing Antibodies - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の目的は、より幅広い株に対して中和活性を示すことができるコロナウイルス中和抗体を提供することにある。【解決手段】特定のアミノ酸配列における特定位置のアミノ酸残基に対する結合能を有し、且つクラス３抗体であるコロナウイルス中和抗体、前記コロナウイルス中和抗体を含むコロナウイルス感染症治療薬組成物、及び前記コロナウイルス中和抗体を含む抗原検査キットを提供する。【選択図】なし[Problem] An object of the present invention is to provide a coronavirus neutralizing antibody that can exhibit neutralizing activity against a wider range of strains. [Solution] The present invention provides a coronavirus neutralizing antibody that has binding ability to amino acid residues at specific positions in a specific amino acid sequence and is a class 3 antibody, a coronavirus infection treatment composition containing the coronavirus neutralizing antibody, and an antigen test kit containing the coronavirus neutralizing antibody. [Selected Figures] None
Description
本発明は、コロナウイルス中和抗体に関する。 The present invention relates to coronavirus neutralizing antibodies.
重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、2019年に始まった爆発的なコロナウイルス症2019（COVID-19）パンデミックの原因となり、SARS-CoV-2は2022年8月4日現在、世界中で577万人以上に感染、640万人を超える死亡の原因になっている。SARS-CoV-2のオミクロン変異株（BA.1；B.1.1.529）は、2021年11月に南アフリカで初めて報告され、世界中に拡大した（非特許文献１）。オミクロン変異株の拡散によりCOVID-19の感染者が増加し、オミクロンBA.5変異株が世界的に拡散するに至っている（非特許文献２）。 Severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is the cause of the explosive coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic that began in 2019, and as of August 4, 2022, SARS-CoV-2 has infected more than 5.77 million people worldwide and caused more than 6.4 million deaths. The omicron variant of SARS-CoV-2 (BA.1; B.1.1.529) was first reported in South Africa in November 2021 and has spread worldwide (Non-Patent Document 1). The spread of the omicron variant has led to an increase in the number of COVID-19 infections, leading to the global spread of the omicron BA.5 variant (Non-Patent Document 2).
オミクロン変異株BA.1及びBA.2は、既知の中和抗体の大半を回避する（非特許文献３，４）。また、オミクロン範囲株BA.5は、クラス1抗体の結合部位周辺のF486Vや、クラス3抗体の結合部位周辺のL452Rのような変異を更に有していることによって、その回避能力が強化されている（非特許文献５）。 The omicron-range strains BA.1 and BA.2 evade most known neutralizing antibodies (Non-Patent Documents 3 and 4). In addition, the omicron-range strain BA.5 has additional mutations such as F486V near the binding site for class 1 antibodies and L452R near the binding site for class 3 antibodies, which enhances its evasion ability (Non-Patent Document 5).
これまで見出されている中和抗体は、その中和活性がコロナウイルスの特定の１種又は数種の株に対して認められるのみであり、より幅広い株に対する中和活性は期待できない。 The neutralizing antibodies discovered so far have only been shown to have neutralizing activity against one or a few specific strains of coronavirus, and neutralizing activity against a broader range of strains cannot be expected.
そこで、本発明の目的は、より幅広い株に対して中和活性を示すことができるコロナウイルス中和抗体を提供することにある。 Therefore, the object of the present invention is to provide a coronavirus neutralizing antibody that can exhibit neutralizing activity against a wider range of strains.
本発明者らは、鋭意検討の結果、これまで見出されている中和抗体とは異なるフットプリントに基づく結合様式を持つ新たな中和抗体を見出し、これらの中和抗体が、現存するコロナウイルス変異株の５種以上に対して中和活性を有することを確認した。本発明は、この知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。 As a result of extensive research, the inventors discovered new neutralizing antibodies that have a binding mode based on a footprint different from that of neutralizing antibodies found thus far, and confirmed that these neutralizing antibodies have neutralizing activity against five or more of the currently existing coronavirus mutant strains. The present invention was completed through further research based on this finding.
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 配列番号１における、Ｔ３４５、Ｒ３４６、Ｎ４３９、Ｋ４４０、Ｌ４４１、Ｄ４４２、Ｓ４４３、Ｋ４４４、Ｖ４４５、Ｎ４４８、Ｎ４５０、Ｙ４５１、及びＰ４９９に相当する位置のアミノ酸残基に対する結合能を有し、且つクラス３抗体である、コロナウイルス中和抗体。
項２． 配列番号２に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号４に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域と、
配列番号５に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号６に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号７に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、を含む、コロナウイルス中和抗体。
項３． 配列番号１における、Ｙ４４９、Ｙ４５３、Ｌ４５５、Ｆ４５６、Ｎ４７７、Ｋ４７８、Ａ４８４、Ｇ４８５、Ｆ４８６、Ｎ４８７、Ｙ４８９、Ｆ４９０、Ｒ４９３、Ｓ４９４、Ｓ４９６、Ｒ４９８、及びＹ５０１に相当する位置のアミノ酸残基に対する結合能を有する、コロナウイルス中和抗体。
項４． 配列番号８に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号９に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１０に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域と、
配列番号１１に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１２に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１３に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、を含む、コロナウイルス中和抗体。
項５． 項１又は２に記載のコロナウイルス中和抗体及び項３又は４に記載のコロナウイルス中和抗体の少なくともいずれかを含む、コロナウイルス感染症治療薬組成物。
項６． 項１又は２に記載のコロナウイルス中和抗体及び項３又は４に記載のコロナウイルス中和抗体を含む、コロナウイルス感染症治療薬組成物。
項７． 項１又は２に記載のコロナウイルス中和抗体及び項３又は４に記載のコロナウイルス中和抗体の少なくともいずれかを含む、抗原検査キット。
That is, the present invention provides the following aspects.
Item 1. A coronavirus neutralizing antibody that has binding ability to amino acid residues at positions corresponding to T345, R346, N439, K440, L441, D442, S443, K444, V445, N448, N450, Y451, and P499 in SEQ ID NO: 1 and is a Class 3 antibody.
Item 2. A heavy chain variable region including a heavy chain complementarity determining region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto;
A coronavirus neutralizing antibody comprising: a light chain variable region including a light chain complementarity determining region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:7 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto.
Item 3. A coronavirus neutralizing antibody having binding ability to amino acid residues at positions corresponding to Y449, Y453, L455, F456, N477, K478, A484, G485, F486, N487, Y489, F490, R493, S494, S496, R498, and Y501 in SEQ ID NO:1.
Item 4. A heavy chain variable region including a heavy chain complementarity determining region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto;
A coronavirus neutralizing antibody comprising: a light chain variable region including a light chain complementarity determining region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto.
Item 5. A composition for treating coronavirus infection comprising at least one of the coronavirus neutralizing antibody according to Item 1 or 2 and the coronavirus neutralizing antibody according to Item 3 or 4.
Item 6. A composition for treating coronavirus infections, comprising the coronavirus neutralizing antibody according to Item 1 or 2 and the coronavirus neutralizing antibody according to Item 3 or 4.
Item 7. An antigen test kit comprising at least one of the coronavirus neutralizing antibody according to Item 1 or 2 and the coronavirus neutralizing antibody according to Item 3 or 4.
本発明によれば、より幅広い株に対して中和活性を示すことができるコロナウイルス中和抗体が提供される。 The present invention provides a coronavirus neutralizing antibody that exhibits neutralizing activity against a wider range of strains.
１．コロナウイルス中和抗体
コロナウイルスは、コロナウイルス科のコロナウイルス亜科に属するウイルスの種であり、ヒト等の動物に感染し、呼吸器、胃腸、または神経性の疾患を発症させるプラス鎖ＲＮＡウイルスである。コロナウイルスの具体例としては、第１の所定の結合能を有するクラス３抗体に中和されるもの、又は第２の所定の結合能を有する抗体に中和されるものであることを限度として特に限定されず、例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）等が挙げられる。これらのコロナウイルスには、野生株だけでなく、変異株も包含される。これらのコロナウイルスの中でも、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としては、野生株、Ｄ６１４Ｇ変異株、デルタ変異株、オミクロンＢＡ．１変異株、オミクロンＢＡ．１．１変異株、オミクロンＢＡ．５変異株等が挙げられるが、これらに限定されず、将来的に発生し得る変異株も含まれる。
1. Coronavirus Neutralizing Antibody Coronavirus is a species of virus belonging to the Coronaviridae subfamily, and is a positive-stranded RNA virus that infects animals such as humans and causes respiratory, gastrointestinal, or neurological diseases. Specific examples of coronaviruses are not particularly limited, but include those that are neutralized by class 3 antibodies having a first predetermined binding ability or those that are neutralized by antibodies having a second predetermined binding ability, and include, for example, severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV, SARS-CoV-2), Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), and the like. These coronaviruses include not only wild strains but also mutant strains. Among these coronaviruses, SARS-CoV-2 is preferable. In addition, SARS-CoV-2 includes, but is not limited to, wild strains, D614G mutant strains, delta mutant strains, Omicron BA.1 mutant strains, Omicron BA.1.1 mutant strains, Omicron BA.5 mutant strains, and the like, and also includes mutant strains that may occur in the future.
本発明のコロナウイルス中和抗体は、第１のコロナウイルス中和抗体と、第２のコロナウイルス中和抗体とを含む。 The coronavirus neutralizing antibody of the present invention includes a first coronavirus neutralizing antibody and a second coronavirus neutralizing antibody.
第１のコロナウイルス中和抗体は、配列番号１における、Ｔ３４５、Ｒ３４６、Ｎ４３９、Ｋ４４０、Ｌ４４１、Ｄ４４２、Ｓ４４３、Ｋ４４４、Ｖ４４５、Ｎ４４８、Ｎ４５０、Ｙ４５１、及びＰ４９９に相当する位置のアミノ酸残基に対する結合能（以下において、「第１の所定の結合能」とも記載する。）を有し、且つクラス３抗体である、コロナウイルス中和抗体である。 The first coronavirus neutralizing antibody is a coronavirus neutralizing antibody that has binding ability (hereinafter also referred to as "first predetermined binding ability") to amino acid residues at positions corresponding to T345, R346, N439, K440, L441, D442, S443, K444, V445, N448, N450, Y451, and P499 in SEQ ID NO: 1, and is a Class 3 antibody.
第２のコロナウイルス中和抗体は、配列番号１における、Ｙ４４９、Ｙ４５３、Ｌ４５５、Ｆ４５６、Ｎ４７７、Ｋ４７８、Ａ４８４、Ｇ４８５、Ｆ４８６、Ｎ４８７、Ｙ４８９、Ｆ４９０、Ｒ４９３、Ｓ４９４、Ｓ４９６、Ｒ４９８、及びＹ５０１に相当する位置のアミノ酸残基に対する結合能（以下において、「第２の所定の結合能」とも記載する。）を有する、コロナウイルス中和抗体である。 The second coronavirus neutralizing antibody is a coronavirus neutralizing antibody that has binding ability (hereinafter also referred to as "second predetermined binding ability") to amino acid residues at positions corresponding to Y449, Y453, L455, F456, N477, K478, A484, G485, F486, N487, Y489, F490, R493, S494, S496, R498, and Y501 in SEQ ID NO: 1.
第１の所定の結合能及び第２の結合能に関して、配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＱＯＳ４５０２９．１で登録されている野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のアミノ酸配列である。「相当する位置のアミノ酸残基」とは、本発明の中和抗体の標的であるコロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型又は変異株）である場合は、配列番号１のアミノ酸配列中の上記所定位置のアミノ酸残基をいい、本発明の中和抗体の標的であるコロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の他のコロナウイルスである場合は、配列番号１のアミノ酸配列に対応する当該他のコロナウイルスのスパイクタンパク質のアミノ酸配列（対応するアミノ酸配列）中の、上記所定位置に対応する位置のアミノ酸残基をいう。当該対応する位置は、配列番号１のアミノ酸配列と当該対応するアミノ酸配列とのアラインメントにより特定することができる。 Regarding the first predetermined binding ability and the second binding ability, SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the spike protein of wild-type SARS-CoV-2 registered under GenBank accession number QOS45029.1. The term "amino acid residue at the corresponding position" refers to the amino acid residue at the above-mentioned predetermined position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 when the coronavirus targeted by the neutralizing antibody of the present invention is SARS-CoV-2 (wild-type or mutant strain), and refers to the amino acid residue at the position corresponding to the above-mentioned predetermined position in the amino acid sequence of the spike protein of the other coronavirus that corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (corresponding amino acid sequence) when the coronavirus targeted by the neutralizing antibody of the present invention is a coronavirus other than SARS-CoV-2. The corresponding position can be identified by alignment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with the corresponding amino acid sequence.
本発明の第１のコロナウイルス中和抗体は、以下に示すものでもある。
配列番号２に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号３に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号４に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（重鎖ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と、
配列番号５に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号６に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号７に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域（軽鎖ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域と、を含む、コロナウイルス中和抗体。
The first coronavirus neutralizing antibody of the present invention is also shown below.
a heavy chain variable region including a heavy chain complementarity determining region (heavy chain CDR) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto;
A coronavirus neutralizing antibody comprising: a light chain variable region including a light chain complementarity determining region (light chain CDR) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto.
配列番号２～７に示すアミノ酸配列は、具体的には以下の通りである。
本発明の第２のコロナウイルス中和抗体は、以下に示すものでもある。
配列番号８に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号９に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１０に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域（重鎖ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域と、
配列番号１１に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１２に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１３に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域（軽鎖ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域と、を含む、コロナウイルス中和抗体。
The second coronavirus neutralizing antibody of the present invention is also shown below.
a heavy chain variable region including a heavy chain complementarity determining region (heavy chain CDR) having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto;
A coronavirus neutralizing antibody comprising: a light chain variable region including a light chain complementarity determining region (light chain CDR) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto.
配列番号８～１３に示すアミノ酸配列は、具体的には以下の通りである。
８０％以上の配列同一性の好ましい例は、各ＣＤＲそれぞれの全長に応じて異なるが、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９２％以上、一層好ましくは９４％以上が挙げられる。 Preferred examples of sequence identity of 80% or more vary depending on the full length of each CDR, but include preferably 85% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 92% or more, and even more preferably 94% or more.
なお、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。 The term "sequence identity" refers to the value of amino acid sequence identity obtained by the bl2seq program (Tatiana A. Tatsusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., Vol. 174, p. 247-250, 1999) of BLAST PACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI)]. The parameters are set to Gap insertion cost value: 11 and Gap extension cost value: 1.
配列番号２～１３それぞれと配列同一性が８０％以上１００％未満のアミノ酸配列において、配列番号２～１３それぞれにおけるアミノ酸配列から所定のアミノ酸が置換されている場合、当該置換としては、類似アミノ酸による置換（即ち保存的アミノ酸置換）が、抗体の中和活性に変化をもたらさないことが予測されるため好適である。具体的には、アミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立しており、同じ分類に属するアミノ酸に置換されることが好ましい。
塩基性アミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン
酸性アミノ酸：グルタミン酸、アスパラギン酸
中性アミノ酸：グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グルタミン、アスパラギン、プロリン
更に、前記中性アミノ酸は、極性側鎖を有するもの（アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するもの（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、アミド含有側鎖を有するもの（アスパラギン、グルタミン）、硫黄含有側鎖を有するもの（メチオニン、システイン）、芳香族側鎖を有するもの（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基含有側鎖を有するもの（セリン、トレオニン、チロシン）、脂肪族側鎖を有するもの（アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）等に分類することもできる。
In an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more but less than 100% with each of SEQ ID NOs: 2 to 13, when a specific amino acid is substituted from the amino acid sequence in each of SEQ ID NOs: 2 to 13, the substitution with a similar amino acid (i.e., a conservative amino acid substitution) is preferred because it is predicted not to cause any change in the neutralizing activity of the antibody. Specifically, the following classifications have been established based on the properties of the amino acid side chain, and it is preferred to substitute an amino acid belonging to the same classification.
Basic amino acids: lysine, arginine, histidine Acidic amino acids: glutamic acid, aspartic acid Neutral amino acids: glycine, alanine, serine, threonine, methionine, cysteine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, leucine, isoleucine, valine, glutamine, asparagine, proline The neutral amino acids can also be classified into those having polar side chains (asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), those having non-polar side chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), those having amide-containing side chains (asparagine, glutamine), those having sulfur-containing side chains (methionine, cysteine), those having aromatic side chains (phenylalanine, tryptophan, tyrosine), those having hydroxyl-containing side chains (serine, threonine, tyrosine), those having aliphatic side chains (alanine, leucine, isoleucine, valine), and the like.
アミノ酸配列中の所定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する方法については、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌ．１５２，ｐ．２７１－２７５（１９９５）； Ｚｏｌｌｅｒ ＭＪ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１００，ｐ．４６８－５００（１９８３）、Ｋｒａｍｅｒ Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１２，ｐ．９４４１－９４５６（１９８４）； Ｋｒａｍｅｒ Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４，ｐ．３５０－３６７（１９８７）； Ｋｕｎｋｅｌ ＴＡ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．８２，ｐ．４８８－４９２（１９８５）等）が知られており、当該部位特異的変異誘発法を用いてＣＤＲのアミノ酸配列にアミノ酸置換を行うことができる。また、他のアミノ酸に置換する方法としては、ＷＯ２００５／０８０４３２に記載されているライブラリー技術も挙げられる。 Methods for substituting a specific amino acid in an amino acid sequence with another amino acid include, for example, site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh T. et al., Gene, Vol. 152, p. 271-275 (1995); Zoller MJ. et al., Methods Enzymol. Vol. 100, p. 468-500 (1983); Kramer W. et al., Nucleic Acids Res. Vol. 12, p. 9441-9456 (1984); Kramer W. et al., Methods. Enzymol. Vol. 154, p. 350-367 (1987); Kunkel TA., Proc. Natl Acad Sci USA., Vol. 82, p. 488-492 (1985), etc.) are known, and amino acid substitutions can be made in the amino acid sequence of the CDR using this site-specific mutagenesis method. In addition, a method for substituting with other amino acids includes the library technology described in WO2005/080432.
本発明のコロナウイルス中和抗体において、可変領域中のフレームワーク領域は、コロナウイルスに対する中和活性に実質的な影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本発明の第１のコロナウイルス中和抗体の具体的な配列としては、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号１４、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号１５が挙げられる。本発明の第２のコロナウイルス中和抗体の具体的な配列としては、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号１６、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号１７が挙げられる。また、本発明のコロナウイルス中和抗体において、定常領域のアミノ酸配列も、コロナウイルスに対する中和活性に実質的な影響を及ぼさない限り、特に限定されない。 In the coronavirus neutralizing antibody of the present invention, the framework region in the variable region is not particularly limited as long as it does not substantially affect the neutralizing activity against coronavirus. Specific sequences of the first coronavirus neutralizing antibody of the present invention include SEQ ID NO: 14 as the amino acid sequence of the heavy chain variable region and SEQ ID NO: 15 as the amino acid sequence of the light chain variable region. Specific sequences of the second coronavirus neutralizing antibody of the present invention include SEQ ID NO: 16 as the amino acid sequence of the heavy chain variable region and SEQ ID NO: 17 as the amino acid sequence of the light chain variable region. In addition, in the coronavirus neutralizing antibody of the present invention, the amino acid sequence of the constant region is also not particularly limited as long as it does not substantially affect the neutralizing activity against coronavirus.
配列番号２～配列番号１３に示すＣＤＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来であるが、本発明のコロナウイルス中和抗体は、ヒト抗体であってもよいし、キメラ抗体であってもよい。 The amino acid sequences of the CDRs shown in SEQ ID NOs: 2 to 13 are derived from human antibodies, but the coronavirus neutralizing antibodies of the present invention may be human antibodies or chimeric antibodies.
本発明のコロナウイルス中和抗体のアイソタイプについては特に制限されないが、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥが挙げられる。これらの中でも、ＩｇＧが好適である。 The isotype of the coronavirus neutralizing antibody of the present invention is not particularly limited, but examples include IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA (IgA1, IgA2), IgM, IgD, and IgE. Among these, IgG is preferred.
また、少なくとも第１のコロナウイルス中和抗体はクラス３抗体である。クラス３抗体は、スパイクのＲＢＤ領域がダウン、及びアップのコンフォメーションのどちらであっても結合可能であり、ＡＣＥ２結合サイトとは重ならず、ＡＣＥ２結合サイト以外のＲＢＤ領域に結合する抗体をいう（Gruel et al. Immunity 55, June 14, 2022、Figure 2D）。 In addition, at least the first coronavirus neutralizing antibody is a class 3 antibody. Class 3 antibodies can bind to the RBD region of the spike in either the down or up conformation, do not overlap with the ACE2 binding site, and bind to the RBD region other than the ACE2 binding site (Gruel et al. Immunity 55, June 14, 2022, Figure 2D).
本発明のコロナウイルス中和抗体の形態は、典型的には、単離されたモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の作製方法は特に限定されないが、例えば、“Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ， Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ． １９７５ Ａｕｇ ７；２５６（５５１７）：４９５－４９７．”に掲載されているようなハイブリドーマ法；米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え法；“Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ． １９９１ Ａｕｇ １５；３５２（６３３６）：６２４－６２８．”、又は“Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９１ Ｄｅｃ ５；２２２（３）：５８１－５９７．”に記載されているようなファージ抗体ライブラリーから単離する方法、“タンパク質実験ハンドブック， 羊土社（２００３）：９２－９６．”に掲載されている方法等により作製することができる。 The coronavirus neutralizing antibody form of the present invention is typically an isolated monoclonal antibody. The method for producing monoclonal antibodies is not particularly limited, but can be, for example, the hybridoma method described in "Kohler G, Milstein C., Nature. 1975 Aug 7; 256 (5517): 495-497."; the recombinant method described in U.S. Patent No. 4,816,567; the method of isolating from a phage antibody library described in "Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15; 352 (6336): 624-628." or "Marks et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222 (3): 581-597."; or the method described in "Protein Experiment Handbook, Yodosha (2003): 92-96.".
また、本発明のコロナウイルス中和抗体には、全長抗体（Ｆａｂ領域とＦｃ領域を有する抗体）のみならず、断片抗体も包含される。このような断片抗体として、Ｆｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ'抗体、Ｆ（ａｂ'）2抗体、ｓｃＦｖ抗体、ｄｓＦｖ抗体、ダイアボディ、ナノボディ等が挙げられる。また、本発明のコロナウイルス中和抗体には、前記の抗原結合領域を含む限り、多価特異性抗体（例えば二重特異性抗体）も包含する。これらの断片抗体及び多重特異性抗体は、従来公知の方法に従って作製することができる。 The coronavirus neutralizing antibody of the present invention includes not only full-length antibodies (antibodies having Fab and Fc regions) but also fragment antibodies. Examples of such fragment antibodies include Fv antibodies, Fab antibodies, Fab' antibodies, F(ab') 2 antibodies, scFv antibodies, dsFv antibodies, diabodies, nanobodies, and the like. The coronavirus neutralizing antibody of the present invention also includes multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) as long as they contain the above-mentioned antigen-binding region. These fragment antibodies and multispecific antibodies can be prepared according to conventional methods.
本発明のコロナウイルス中和抗体は、ポリエチレングリコール、放射性物質、トキシン等の各種化合物と結合したコンジュゲート抗体又はコンジュゲート抗体断片であってもよい。また、本発明のコロナウイルス中和抗体は、必要に応じて、結合している糖鎖が改変されていてもよいし、他のタンパク質が融合していてもよい。 The coronavirus neutralizing antibody of the present invention may be a conjugated antibody or a conjugated antibody fragment bound to various compounds such as polyethylene glycol, radioactive substances, and toxins. In addition, the coronavirus neutralizing antibody of the present invention may have modified sugar chains bound thereto, or may be fused with other proteins, as necessary.
２．核酸
本発明の核酸は、上記のコロナウイルス中和抗体をコードしている核酸である。本発明の核酸は、例えば、上記のコロナウイルス中和抗体をコードしている核酸を鋳型として、少なくともコロナウイルス中和抗体をコードしている領域をＰＣＲ等によって取得することにより得ることができる。また、本発明核酸は、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
2. Nucleic Acid The nucleic acid of the present invention is a nucleic acid encoding the above-mentioned coronavirus neutralizing antibody. The nucleic acid of the present invention can be obtained, for example, by using the above-mentioned nucleic acid encoding the coronavirus neutralizing antibody as a template to obtain at least a region encoding the coronavirus neutralizing antibody by PCR or the like. The nucleic acid of the present invention can also be artificially synthesized by gene synthesis methods.
また、核酸の塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する場合、変異導入方法は公知であり、例えば核酸の部位特異的変異導入法等が利用できる。核酸中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキットを用いて行うこともできる。 When a specific mutation is introduced into a specific site in the base sequence of a nucleic acid, a method for introducing a mutation is known, and for example, a method for introducing a site-specific mutation into a nucleic acid can be used. A specific method for converting a base in a nucleic acid can be, for example, a method using a commercially available kit.
塩基配列に変異を導入した核酸は、核酸シーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は当該塩基配列を有する核酸断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記コロナウイルス中和抗体をコードする核酸を得ることができる。 The base sequence of the nucleic acid in which a mutation has been introduced into the base sequence can be confirmed using a nucleic acid sequencer. Once the base sequence has been determined, the nucleic acid encoding the coronavirus neutralizing antibody can then be obtained by chemical synthesis, PCR using a cloned probe as a template, or hybridization using a nucleic acid fragment having the base sequence as a probe.
また、部位特異的突然変異誘発法等によって前記コロナウイルス中和抗体をコードする核酸の変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記コロナウイルス中和抗体をコードする核酸に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法によって行うことができる。 In addition, a mutant form of the nucleic acid encoding the coronavirus neutralizing antibody can be synthesized by site-directed mutagenesis or the like, which has the same function as the nucleic acid before the mutation. Mutations can be introduced into the nucleic acid encoding the coronavirus neutralizing antibody by known methods such as the Kunkel method, the gapped duplex method, and the megaprimer PCR method.
本発明の核酸の塩基配列については、当業者であれば、本発明のコロナウイルス中和抗体の上記ＣＤＲの配列に従って適宜設計可能である。例えば、配列番号２をコードする塩基配列として配列番号１８が挙げられ、配列番号３をコードする塩基配列として配列番号１９が挙げられ、配列番号４をコードする塩基配列として配列番号２０が挙げられ、配列番号５をコードする塩基配列として配列番号２１が挙げられ、配列番号６をコードする塩基配列として配列番号２２が挙げられ、配列番号７をコードする塩基配列として配列番号２３が挙げられ、配列番号８をコードする塩基配列として配列番号２４が挙げられ、配列番号９をコードする塩基配列として配列番号２５が挙げられ、配列番号１０をコードする塩基配列として配列番号２６が挙げられ、配列番号１１をコードする塩基配列として配列番号２７が挙げられ、配列番号１２をコードする塩基配列として配列番号２８が挙げられ、配列番号１３をコードする塩基配列として配列番号２９が挙げられる。 A person skilled in the art can appropriately design the base sequence of the nucleic acid of the present invention according to the above-mentioned CDR sequence of the coronavirus neutralizing antibody of the present invention. For example, an example of a base sequence encoding SEQ ID NO:2 is SEQ ID NO:18, an example of a base sequence encoding SEQ ID NO:3 is SEQ ID NO:19, an example of a base sequence encoding SEQ ID NO:4 is SEQ ID NO:21, an example of a base sequence encoding SEQ ID NO:5 is SEQ ID NO:22, an example of a base sequence encoding SEQ ID NO:6 is SEQ ID NO:23, an example of a base sequence encoding SEQ ID NO:7 is SEQ ID NO:24, an example of a base sequence encoding SEQ ID NO:9 is SEQ ID NO:25, an example of a base sequence encoding SEQ ID NO:10 is SEQ ID NO:26, an example of a base sequence encoding SEQ ID NO:11 is SEQ ID NO:27, an example of a base sequence encoding SEQ ID NO:12 is SEQ ID NO:28, and an example of a base sequence encoding SEQ ID NO:13 is SEQ ID NO:29.
例えば、本発明の核酸に含まれる重鎖可変領域をコードする塩基配列として、配列番号３０に示す塩基配列（配列番号１４で示される重鎖可変領域をコードする塩基配列）及び配列番号３１に示す塩基配列（配列番号１６で示される重鎖可変領域をコードする塩基配列）が挙げられる。本発明の核酸に含まれる軽鎖可変領域をコードする塩基配列として、配列番号３２に示す塩基配列（配列番号１５で示される軽鎖可変領域をコードする塩基配列）及び配列番号３３に示す塩基配列（配列番号１７で示される軽鎖可変領域をコードする塩基配列）が挙げられる。 For example, examples of the base sequence encoding the heavy chain variable region contained in the nucleic acid of the present invention include the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 (base sequence encoding the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 14) and the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 (base sequence encoding the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 16). Examples of the base sequence encoding the light chain variable region contained in the nucleic acid of the present invention include the base sequence shown in SEQ ID NO: 32 (base sequence encoding the light chain variable region shown in SEQ ID NO: 15) and the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 (base sequence encoding the light chain variable region shown in SEQ ID NO: 17).
３．組換えベクター
組換えベクターは、上記の本発明の核酸を含む。本発明の組換えベクターは、発現ベクターに本発明の核酸を挿入することにより得ることができる。
3. Recombinant Vector The recombinant vector contains the above-mentioned nucleic acid of the present invention. The recombinant vector of the present invention can be obtained by inserting the nucleic acid of the present invention into an expression vector.
組換えベクターには、本発明の核酸に作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明の核酸を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明の核酸が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。 The recombinant vector includes a control element such as a promoter operably linked to the nucleic acid of the present invention. A representative control element is a promoter, but may further include transcription elements such as an enhancer, a CCAAT box, a TATA box, and an SPI site, as necessary. In addition, operably linked means that various control elements such as a promoter and an enhancer that regulate the nucleic acid of the present invention are linked to the nucleic acid of the present invention in a state in which they can operate in a host cell.
発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。具体的には、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ－Ｂｌｕｅ）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０）、酵母由来プラスミド（例えばｐＳＨ１９）、動物細胞発現プラスミド（例えばｐＡ１－１１、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｖ５／Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ）、λファージなどのバクテリオファージ、ウイルス由来のベクター等が挙げられる。 The expression vector is preferably one constructed for genetic recombination from a phage, plasmid, or virus that can grow autonomously in a host. Specific examples include plasmids derived from Escherichia coli (e.g., pET-Blue), plasmids derived from Bacillus subtilis (e.g., pUB110), yeast-derived plasmids (e.g., pSH19), animal cell expression plasmids (e.g., pA1-11, pcDNA3.1-V5/His-TOPO), bacteriophages such as λ phage, and vectors derived from viruses.
４．形質転換体
形質転換体は、上記の本発明の核酸又は上記の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって得られる。
4. Transformant A transformant can be obtained by transforming a host with the above-mentioned nucleic acid of the present invention or the above-mentioned recombinant vector.
形質転換体の製造に使用される宿主としては、遺伝子の導入が可能であり、且つ自律増殖可能で本発明の遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、ヒト及びヒトを除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、サル等）の細胞、より具体的には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、サル細胞ＣＯＳ－７、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）；昆虫細胞；植物細胞；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；放線菌等；酵母等；糸状菌等が挙げられる。 The host used for producing the transformant is not particularly limited as long as it is capable of introducing a gene, of autonomous proliferation, and of expressing the traits of the gene of the present invention. Examples of the host include cells of humans and mammals other than humans (e.g., rats, mice, guinea pigs, rabbits, cows, monkeys, etc.), more specifically, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), monkey cells COS-7, human embryonic kidney cells (e.g., HEK293 cells); insect cells; plant cells; bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida, etc.; actinomycetes, etc.; yeast, etc.; filamentous fungi, etc.
形質転換体は、宿主に上記の本発明の核酸又は上記の組換えベクターを導入することによって得ることができる。本発明の核酸又は組換えベクターを導入する方法は、目的の遺伝子が宿主に導入できる限り特に限定されない。また、核酸を導入する場所も、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。本発明の核酸又は組換えベクターを導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。 The transformant can be obtained by introducing the nucleic acid of the present invention or the recombinant vector of the present invention into a host. The method for introducing the nucleic acid or recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as the gene of interest can be introduced into the host. The site where the nucleic acid is introduced is also not particularly limited as long as the gene of interest can be expressed, and may be on a plasmid or on the genome. Specific methods for introducing the nucleic acid or recombinant vector of the present invention include, for example, a recombinant vector method and a genome editing method.
宿主に本発明の核酸又は組換えベクターを導入する条件は、導入方法及び宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。 The conditions for introducing the nucleic acid or recombinant vector of the present invention into a host may be appropriately set depending on the method of introduction, the type of host, etc. When the host is a bacterium, examples of the method include a method using competent cells treated with calcium ions and the electroporation method. When the host is a yeast, examples of the method include the electroporation method, the spheroplast method, and the lithium acetate method. When the host is an animal cell, examples of the method include the electroporation method, the calcium phosphate method, and the lipofection method. When the host is an insect cell, examples of the method include the calcium phosphate method, the lipofection method, and the electroporation method. When the host is a plant, examples of the method include the electroporation method, the Agrobacterium method, the particle gun method, and the PEG method.
５．コロナウイルス中和抗体の製造方法
本発明のコロナウイルス中和抗体は、前記の形質転換体を培養することによって製造することができる。形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。得られた培養物から、適宜コロナウイルス中和抗体を回収し、精製することができる。
5. Method for Producing Coronavirus Neutralizing Antibody The coronavirus neutralizing antibody of the present invention can be produced by culturing the above-mentioned transformant. The culture conditions for the transformant may be appropriately set taking into consideration the nutritional and physiological properties of the host, and liquid culture is preferred. The coronavirus neutralizing antibody can be appropriately collected and purified from the obtained culture.
６．コロナウイルス感染症治療薬組成物
本発明は、前記本発明のコロナウイルス中和抗体を含むコロナウイルス感染症治療薬組成物も提供する。
6. Composition for treating coronavirus infection The present invention also provides a composition for treating coronavirus infection, comprising the coronavirus neutralizing antibody of the present invention.
本発明のコロナウイルス感染症治療薬組成物には、上記第１のコロナウイルス中和抗体及び上記第２のコロナウイルス中和抗体の少なくともいずれかが含まれ、好ましくは、上記第１のコロナウイルス中和抗体及び上記第２のコロナウイルス中和抗体の両方が含まれる。本発明のコロナウイルス感染症治療薬組成物には、さらに、他のコロナウイルス中和抗体が含まれていてもよい。 The coronavirus infection treatment composition of the present invention contains at least one of the first coronavirus neutralizing antibody and the second coronavirus neutralizing antibody, and preferably contains both the first coronavirus neutralizing antibody and the second coronavirus neutralizing antibody. The coronavirus infection treatment composition of the present invention may further contain other coronavirus neutralizing antibodies.
本発明のコロナウイルス感染症治療薬組成物は、前記本発明のコロナウイルス中和抗体を有効量含んでさえいればよく、その他に、医薬的に許容される担体又は添加剤を含んでいてもよい。このような担体又は添加剤としては、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、矯味剤等が挙げられる。 The coronavirus infection treatment composition of the present invention only needs to contain an effective amount of the coronavirus neutralizing antibody of the present invention, and may also contain a pharma- ceutically acceptable carrier or additive. Examples of such carriers or additives include surfactants, excipients, colorants, flavorings, preservatives, stabilizers, buffers, pH buffers, disintegrants, solubilizers, solubilizing agents, isotonicity agents, binders, disintegrants, lubricants, diluents, and flavoring agents.
また、本発明のコロナウイルス感染症治療薬組成物の投与形態については、経口的又は非経口的のいずれであってもよく、具体的には、経口投与；静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与、経粘膜投与、眼内投与等の非経口投与が挙げられる。 The administration form of the coronavirus infection treatment composition of the present invention may be either oral or parenteral, and specific examples include oral administration; and parenteral administration such as intravenous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, nasal administration, pulmonary administration, transdermal administration, transmucosal administration, and intraocular administration.
本発明のコロナウイルス感染症治療薬組成物の製剤形態については、採用する投与形態に応じて、その製剤形態を適宜設定することができる。例えば、経口投与で使用される場合には、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の製剤形態に調製すればよく、非経口投与で使用される場合には、液剤、懸濁液、エマルジョン、スプレー剤、坐剤、点眼剤等の製剤形態に調製すればよい。 The formulation form of the coronavirus infection treatment composition of the present invention can be appropriately set depending on the administration form to be adopted. For example, when used for oral administration, it may be prepared in a formulation form such as a powder, granules, capsules, syrup, suspension, etc., and when used for parenteral administration, it may be prepared in a formulation form such as a liquid, suspension, emulsion, spray, suppository, eye drop, etc.
本発明のコロナウイルス感染症治療薬組成物は、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には哺乳動物）に対して適用することができる。 The coronavirus infection treatment composition of the present invention can be applied to humans or non-human animals (typically mammals).
７．抗原検査キット
本発明は、前記本発明のコロナウイルス中和抗体を含む抗原検査キットも提供する。
7. Antigen Test Kit The present invention also provides an antigen test kit comprising the coronavirus neutralizing antibody of the present invention.
本発明の抗原検査キットには、上記第１のコロナウイルス中和抗体及び上記第２のコロナウイルス中和抗体の少なくともいずれかが含まれ、好ましくは、上記第１のコロナウイルス中和抗体及び上記第２のコロナウイルス中和抗体の両方が含まれる。 The antigen test kit of the present invention includes at least one of the first coronavirus neutralizing antibody and the second coronavirus neutralizing antibody, and preferably includes both the first coronavirus neutralizing antibody and the second coronavirus neutralizing antibody.
また、コロナウイルス中和抗体は、水不溶性担体に固定化されていてもよい。水不溶性担体としては、粒子であってもよいし、基板であってもよい。 The coronavirus neutralizing antibody may also be immobilized on a water-insoluble carrier. The water-insoluble carrier may be a particle or a substrate.
検体としては、コロナウイルスの検出が求められるものであることを限度として特に制限されず、具体的には、唾液、鼻咽頭ぬぐい液等が挙げられる。 There are no particular limitations on the specimen, so long as it is one in which detection of coronavirus is required. Specific examples include saliva and nasopharyngeal swabs.
本発明のコロナウイルス検出キットは、コロナウイルス中和抗体と検体中のウイルス抗原との抗原抗体反応を免疫測定（代表例として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。）する方法に基づいて構成され、使用されることができる。 The coronavirus detection kit of the present invention can be constructed and used based on a method of immunoassay (a representative example is enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)) of the antigen-antibody reaction between coronavirus neutralizing antibodies and viral antigens in a sample.
また、本発明のコロナウイルス検出キットは、細胞へのウイルス感染阻害、細胞への擬似ウイルスの侵入阻害、又は、スパイクタンパク質とＡＣＥ２の結合阻害等を測定する方法に基づいて構成され、使用されることもできる。 The coronavirus detection kit of the present invention can also be constructed and used based on a method for measuring inhibition of viral infection into cells, inhibition of pseudovirus entry into cells, or inhibition of binding between spike protein and ACE2, etc.
本発明のコロナウイルス検出キットには、前記本発明のコロナウイルス中和抗体の他に、他のコロナウイルス中和抗体、並びに／若しくは、測定方法に対応した他の試薬及び／又は器具が含まれていてもよい。 The coronavirus detection kit of the present invention may contain, in addition to the coronavirus neutralizing antibody of the present invention, other coronavirus neutralizing antibodies and/or other reagents and/or instruments corresponding to the measurement method.
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下において、Abは抗体を表し、mAbはモノクローナル抗体を表す。また、以下において示されるモノクローナル抗体のうち、MO1が、本発明の第１のコロナウイルス中和抗体の一実施形態であり、MO2が、本発明の第２のコロナウイルス中和抗体の一実施形態である。 The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. In the following, Ab stands for antibody, and mAb stands for monoclonal antibody. Furthermore, among the monoclonal antibodies shown below, MO1 is an embodiment of the first coronavirus neutralizing antibody of the present invention, and MO2 is an embodiment of the second coronavirus neutralizing antibody of the present invention.
（１）試験方法
（１－１）ヒトサンプルの収集
2020年7月から11月の5ヶ月間にCOVID-19に感染し、その後2回投与のmRNAワクチンを接種した患者の血液サンプルを、兵庫県立加古川医療センター（Kakogawa, Japan）で採取した。この期間にCOVID-19発症した患者は、公式の疫学データに基づくと、主にSARS-CoV-2の野生型（D614G）変異型に感染していた。各患者の検体から、血清と末梢血単核細胞（PBMC）とを分離した。SARS-CoV-2に対して高い中和活性を持つ患者（以下において、ドナーとも記載する。）の血清及びそのデータを使用した。
(1) Test method
(1-1) Collection of human samples
Blood samples from patients who were infected with COVID-19 during the 5-month period from July to November 2020 and subsequently received two doses of mRNA vaccine were collected at the Hyogo Prefectural Kakogawa Medical Center (Kakogawa, Japan). Based on official epidemiological data, patients who developed COVID-19 during this period were mainly infected with the wild-type (D614G) variant of SARS-CoV-2. Serum and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from each patient sample. Serum and data from patients (hereafter also referred to as donors) with high neutralizing activity against SARS-CoV-2 were used.
（１－２）ドナーPBMCからのヒト抗体遺伝子の単離
ドナーPBMC（末梢血単核球）からヒト抗体遺伝子を単離するために、抗SARS-CoV-2スパイクAbを発現する血清のメモリーB細胞をスクリーニングした後、単一細胞としてソーティングを行った。次に、Ecobody技術（T. Ojima-Kato, S. Nagai, H. Nakano, Ecobody technology: rapid monoclonal antibody screening method from single B cells using cell-free protein synthesis for antigen binding fragment formation. Sci Rep 7, 13979 (2017)）で示される各V遺伝子から発現する抗体Fabドメインの抗スパイク反応性を、ELISA（酵素結合免疫吸着法）（iBody、名古屋、日本）により評価した。
(1-2) Isolation of human antibody genes from donor PBMCs To isolate human antibody genes from donor PBMCs, we screened serum memory B cells expressing anti-SARS-CoV-2 spike Abs and then sorted them as single cells. Next, the anti-spike reactivity of antibody Fab domains expressed from each V gene, as shown by Ecobody technology (T. Ojima-Kato, S. Nagai, H. Nakano, Ecobody technology: rapid monoclonal antibody screening method from single B cells using cell-free protein synthesis for antigen binding fragment formation. Sci Rep 7, 13979 (2017)), was evaluated by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (iBody, Nagoya, Japan).
選択されたV遺伝子の配列を決定し、以下のようにヒト免疫グロブリン（IgG）mAb 発現ベクターにサブクローン化した。重鎖および軽鎖のV領域配列を増幅した。EcoRI-XhoIサイト及びEcoRI-BsiWIサイトを使用し、配列をそれぞれpFUSEss-CHIg-hG1およびpFUSE2ss-CLIg-hK発現ベクター（InvivoGen、カリフォルニア州、サンディエゴ）に挿入した。配列の確認には、キャピラリー電気泳動（CE）シーケンサー（モデルDS3000、日立ハイテク、東京）を使用した。 Selected V genes were sequenced and subcloned into human immunoglobulin (IgG) mAb expression vectors as follows: Heavy and light chain V region sequences were amplified. The sequences were inserted into pFUSEss-CHIg-hG1 and pFUSE2ss-CLIg-hK expression vectors (InvivoGen, San Diego, CA) using EcoRI-XhoI and EcoRI-BsiWI sites, respectively. A capillary electrophoresis (CE) sequencer (model DS3000, Hitachi High-Tech, Tokyo) was used to confirm the sequences.
（１－３）抗体の発現と精製
ポリエチレンイミンと、抗体の重鎖及び軽鎖の配列を含む2つのプラスミドとを用いて、HEK293T（ヒト腎臓）細胞にトランスフェクションすることにより、組換えmAbを発現させた。細胞は、DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）に10％FBS（牛胎児血清）を添加し、37℃に維持したCO2インキュベーター（5％CO2）内で3日間培養した。また、Expi293F(商標) Expression System（Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造元のプロトコルに沿ってmAbを発現させた。
(1-3) Antibody Expression and Purification Recombinant mAbs were expressed by transfecting HEK293T (human kidney) cells with polyethylenimine and two plasmids containing the antibody heavy and light chain sequences. The cells were cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum) in a CO2 incubator (5% CO2 ) maintained at 37°C for 3 days. mAbs were also expressed using the Expi293F™ Expression System (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's protocol.
抗体の精製には、培養上清にrProtein A Sepharose(登録商標) (Cytiva, Marlborough, MA) を加え、その混合物を4℃で10-12時間穏やかに揺動させた。得られた樹脂を500 g、4℃で5分間遠心分離し、その後、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で5回洗浄した。捕捉されたmAbは、クエン酸ナトリウム緩衝液（すなわち、40mMクエン酸三ナトリウム、pH3.4）で溶出された。その後、1M Tris-HClバッファーの添加により、溶液を直ちに～pH7.0に中和した。 For antibody purification, rProtein A Sepharose® (Cytiva, Marlborough, MA) was added to the culture supernatant, and the mixture was gently rocked at 4°C for 10-12 h. The resulting resin was centrifuged at 500 g for 5 min at 4°C, and then washed five times with cold phosphate-buffered saline (PBS). The captured mAb was eluted with sodium citrate buffer (i.e., 40 mM trisodium citrate, pH 3.4). The solution was then immediately neutralized to pH 7.0 by the addition of 1 M Tris-HCl buffer.
分子量カットオフ50,000 DのAmicon(登録商標) Ultra遠心分離フィルター（Sigma Chemicals, St.Louis, MO）で限外ろ過を行い、溶媒をPBSに置換した後、各mAbを濃縮した。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行い、各mAbの純度を測定し、ナノドロップ(商標)分光光度計（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を用いて各抗体の濃度を決定した。 Each mAb was concentrated after ultrafiltration using an Amicon® Ultra centrifugal filter with a molecular weight cutoff of 50,000 D (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) and replacing the solvent with PBS. The purity of each mAb was measured by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the concentration of each antibody was determined using a NanoDrop™ spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).
（１－４）SARS-CoV-2スパイクタンパク質のプラスミド構築と発現
プレフュージョン安定化スパイクエクトドメイン三量体を発現するために、変異D614G、R682del、R683del、R685del、F817P、A892P、A899P、A942P、K986P及びV987Pを含むスパイク1-1213のアミノ酸（aa）残基をコードするプラスミドpCAGGS（H. Niwa, K. Yamamura, J. Miyazaki, Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-199 (1991)）を用いた(C. L. Hsieh et al., Structure-based design of prefusion-stabilized SARS-CoV-2 spikes. Science 369, 1501-1505 (2020))。このコンストラクトには、T4フォルドン配列とC-末端側のHis6タグも含まれている。オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、Delta 変異を持つスパイクエクトドメインを調製した。GeneArt Gene Synthesis service (Thermo Fisher Scientific) により、Omicron BA.1 と BA.2 のスパイク配列を調製し、BA.5 の配列は BA.2 の配列を基にしたオーバーラップPCRにより調製した。また、スパイクの受容体結合ドメイン（RBD）を残基334-528と定義した。
(1-4) Plasmid construction and expression of SARS-CoV-2 spike protein To express the prefusion-stabilized spike ectodomain trimer, we used the plasmid pCAGGS (H. Niwa, K. Yamamura, J. Miyazaki, Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-199 (1991)), which encodes spike 1-1213 amino acid (aa) residues, including the mutations D614G, R682del, R683del, R685del, F817P, A892P, A899P, A942P, K986P, and V987P (CL Hsieh et al., Structure-based design of prefusion-stabilized SARS-CoV-2 spikes. Science 369, 1501-1505 (2020)). This construct also contains a T4 Foldon sequence and a C-terminal His6 tag. The spike ectodomain with the Delta mutation was prepared using overlapping polymerase chain reaction (PCR). The Omicron BA.1 and BA.2 spike sequences were prepared by GeneArt Gene Synthesis service (Thermo Fisher Scientific), and the BA.5 sequence was prepared by overlapping PCR based on the BA.2 sequence. The receptor binding domain (RBD) of the spike was defined as residues 334-528.
次に、各バリアントのRBDコーディング配列を、N末端側にスパイクシグナル配列、C末端側にHisタグを持つプラスミドpCAGGSにサブクローニングした。部位特異的な置換を実現するために、オーバーラップ PCRを実施した。配列の確認は全て上記のDS3000CEシークエンサーで行った。スパイクエクトドメインまたはRBDをHEK293T細胞または上記のExpi293F(商標)発現系で発現させた。トランスフェクション後4-5日目に、培養上清を回収した。アフィニティークロマトグラフィーマトリックスNi-NTA (nickel-charged nitriloacetic acid) agarose (Qiagen, Hilden, Germany) を用いて、標的タンパク質を精製した。タンパク質をAmicon(登録商標) Ultra遠心分離フィルターで濃縮した後、SDS-PAGEで純度を評価し、NanoDrop(商標)分光光度計で濃度を測定した。 The RBD coding sequence of each variant was then subcloned into the plasmid pCAGGS, which contains a spike signal sequence at the N-terminus and a His-tag at the C-terminus. To achieve site-specific replacement, overlap PCR was performed. All sequences were confirmed using the DS3000CE sequencer described above. Spike ectodomains or RBDs were expressed in HEK293T cells or the Expi293F™ expression system described above. Culture supernatants were harvested 4–5 days after transfection. Target proteins were purified using the affinity chromatography matrix Ni-NTA (nickel-charged nitriloacetic acid) agarose (Qiagen, Hilden, Germany). Proteins were concentrated using Amicon® Ultra centrifugal filters, followed by evaluation of purity by SDS-PAGE and measurement of concentration using a NanoDrop™ spectrophotometer.
（１－５）酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
抗原としてプレフュージョン安定化スパイクタンパク質を96ウェルELISAプレート（コーニング、ニューヨーク、ニューヨーク）のウェルに（100又は200ng／ウェル）加え、続いて4℃で12時間超インキュベートした。その後、各ウェルをPBS-0.1％Tween20（PBST）で2回洗浄した後、次のステップのために試薬を添加した。
(1-5) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Prefusion stabilized spike protein was added (100 or 200 ng/well) as antigen to wells of a 96-well ELISA plate (Corning, New York, NY) followed by incubation for >12 h at 4° C. Afterwards, each well was washed twice with PBS-0.1% Tween 20 (PBST) before adding reagents for the next step.
ウェルをブロッキングバッファー（PBSTを含む1％ウシ血清アルブミン）により4℃で2時間インキュベートし、その後、希釈した各抗体を37℃で1時間反応させた。結合した抗体の検出には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗ヒトIgG（1：10，000希釈、Abcam、Cambridge、MA）を使用し、37℃で1時間反応を継続させた。酵素反応を開始するために、ABTS(商標)溶液（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN）を加えた。室温、暗所で40分インキュベートした後、1.5% (w/v) シュウ酸脱水溶液を加えて反応を停止させた。最後に、マイクロプレート光度計（Multiskan(商標) FC, Thermo Fisher Scientific）を用いて波長405 nm（OD405）で光学密度を測定した。 The wells were incubated with blocking buffer (1% bovine serum albumin in PBST) for 2 hours at 4°C, and then each diluted antibody was reacted for 1 hour at 37°C. Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-human IgG (1:10,000 dilution, Abcam, Cambridge, MA) was used to detect the bound antibody, and the reaction continued for 1 hour at 37°C. ABTS™ solution (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) was added to start the enzyme reaction. After 40 minutes of incubation at room temperature in the dark, the reaction was stopped by adding 1.5% (w/v) dehydrated oxalic acid solution. Finally, the optical density was measured at a wavelength of 405 nm (OD405) using a microplate photometer (Multiskan™ FC, Thermo Fisher Scientific).
（１－６）ウイルス
下記表に示すウイルスを用いた。
各ウイルスのストックを作成するため、2% FBS 含有 DMEM 中の Vero E6 (TMPRSS2発現) 細胞に感染させることでウイルスを増殖させた。 To prepare stocks of each virus, the virus was propagated by infecting Vero E6 (TMPRSS2 expressing) cells in DMEM containing 2% FBS.
（１－７）プラーク減少中和試験(PRNT)
プラーク減少中和試験（PRNT）を行い各ウイルス株に対する中和率を求めるため、Vero E6/TMPRSS2細胞（2×105 cells/well）を12wellプレート（Corning）に播種し、5％CO2、37℃で24hr培養を行った。その後、細胞単層体をDMEM（FBSなし）で1回洗浄した。DMEM（FBSなし）で希釈した各抗体を、100プラーク形成単位（PFU）のSARS-CoV-2と混合し、37℃で1時間インキュベートした。次に、Vero E6/TMPRSS2細胞にウイルス-抗体混合物を加え、37℃、5% CO2で1時間培養を行った。接種液を除去した後、感染細胞をPBSで2回洗浄し、2%FBSおよび1.6%メチルセルロースを含むDMEMとともに5%CO2、37℃で3～6日間培養した。培養液を除去した後、PBSで2回洗浄し、80%メタノールで1時間室温で細胞を固定した。残った細胞は50%メタノール中1%クリスタルバイオレットで染色し、プラークを可視化し、手動でカウントした。中和率は、抗体なしで得られたプラーク数を、抗体ありで得られたプラーク数で割ることで求めた。
(1-7) Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT)
To perform the plaque reduction neutralization test (PRNT) to determine the neutralization rate against each virus strain, Vero E6/TMPRSS2 cells (2 × 10 5 cells/well) were seeded in a 12-well plate (Corning) and cultured at 37°C with 5% CO 2 for 24 hr. The cell monolayer was then washed once with DMEM (without FBS). Each antibody diluted in DMEM (without FBS) was mixed with 100 plaque-forming units (PFU) of SARS-CoV-2 and incubated at 37°C for 1 hr. The virus-antibody mixture was then added to the Vero E6/TMPRSS2 cells and cultured at 37°C with 5% CO 2 for 1 hr. After removing the inoculum, the infected cells were washed twice with PBS and cultured with DMEM containing 2% FBS and 1.6% methylcellulose at 37°C with 5% CO 2 for 3 to 6 days. After removing the culture medium, the cells were washed twice with PBS and fixed with 80% methanol at room temperature for 1 hr. The remaining cells were stained with 1% crystal violet in 50% methanol to visualize plaques, which were then counted manually. Percent neutralization was calculated by dividing the number of plaques obtained without antibody by the number of plaques obtained with antibody.
（１－８）バイオレイヤー干渉法
BLItz Biolayer Interferometer System (Sartorius, Goettingen, Germany) を用いて、各抗体とスパイクタンパク質との親和性をバイオレイヤー干渉法(BLI)により測定した。ストレプトアビジンセンサーは、Capture Select Biotin Anti-IgG-Fc (Multi-species) Conjugate (Thermo Fisher Scientific) でコーティングし、試験対象の抗体を捕獲した。各抗体をリガンドとしてセンサーに担持させた後、分析対象として各SARS-CoV-2亜種のRBDを含む溶液にセンサーを浸漬させた。得られたデータは、1:1相互作用を仮定したBLI会合解離モデルの標準式を用いてフィッティングした。すべてのリガンドと分析対象物の組み合わせについて、少なくとも2回の繰り返し測定を行い、代表的なデータを示した。
(1-8) Biolayer Interferometry
The affinity of each antibody to the spike protein was measured by biolayer interferometry (BLI) using a BLItz Biolayer Interferometer System (Sartorius, Goettingen, Germany). A streptavidin sensor was coated with Capture Select Biotin Anti-IgG-Fc (Multi-species) Conjugate (Thermo Fisher Scientific) to capture the antibodies to be tested. After each antibody was loaded onto the sensor as a ligand, the sensor was immersed in a solution containing the RBD of each SARS-CoV-2 variant as the analyte. The obtained data were fitted using the standard equation for the BLI association-dissociation model assuming a 1:1 interaction. At least two replicate measurements were performed for all ligand-analyte combinations, and representative data are shown.
（１－９）クライオ電子顕微鏡法
抗体のFabドメインは、パパイン消化により調製した。10 mM システインを添加したパパインアガロース（Thermo Fisher Scientific）と抗体溶液を混合し、1 M Tris-HCl, pH 8.8 を加えて pH を約 7 に調整した。37℃で48時間インキュベートした後、パパインアガロースをろ過し、rProtein A Sepharose resin（Cytiva, Marlborough, MA）を通過させてFcおよび未切断抗体を除去した。
(1-9) Cryo-electron microscopy The Fab domain of the antibody was prepared by papain digestion. The antibody solution was mixed with papain agarose (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10 mM cysteine, and the pH was adjusted to approximately 7 by adding 1 M Tris-HCl, pH 8.8. After incubation at 37°C for 48 h, the papain agarose was filtered and passed through rProtein A Sepharose resin (Cytiva, Marlborough, MA) to remove Fc and uncleaved antibody.
MO1 FabとBA.1プレフュージョン安定化スパイクエクトドメインの複合体を、AKTA pureシステム（Cytiva、Marlborough、MA）を用いてランニングバッファ（20 mM Tris-HCl pH 8.0および150 mM塩化ナトリウム）で平衡化したSephacryl S-300 HR column（Cytiva, Marlborough, MA）により精製した。精製した複合体をAmicon Ultra遠心分離フィルター（Sigma）分子量カット100,000 Dを用いた限外ろ過により濃縮し、9.4 mg/mlに調製した。これをグロー放電したばかりの Quantifoil ホーリーカーボングリッド (R0.6/1.0, Cu, 300 mesh) に、Vitrobot Mark IV (FEI) を用いて、8℃、湿度 100%の条件でブロット力 15、ブロット時間 4 秒で貼り付け、液体エタン中でプランジフロストした。このグリッドをOmegaタイプのインカラムエネルギーフィルターとGatan K3 camera (Gatan AMETEK, CA USA) を装備したCRYO ARM 300 (JEOL, Tokyo) に移し、300 kVで動作させ、相関二重サンプリング (CDS), カウントモードで撮影を行った。画像処理は公称倍率60,000倍で行われ、0.752A/pixの較正済みピクセルサイズに相当する（SPring-8におけるEM01CT）。入射電子ビームは平行光に設定し、検出器での線量率は10e-/pix/sであった。各露光は50フレーム、2.26秒の動画として記録され、試料での積算線量は50e-/A2であった。データはSerialEMソフトウェアと日本電子のカスタムスクリプトにより自動収集され、デフォーカス範囲はステージシフトごとに7x7x1のイメージシフトマトリクスの中心で-1.2～-1.6μmに設定された。ステージシフトは、ソフトウェアyoneoLocrを用いて穴の中心まで精細化した。 The complex of MO1 Fab and BA.1 prefusion-stabilized spike ectodomain was purified using a Sephacryl S-300 HR column (Cytiva, Marlborough, MA) equilibrated with running buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0 and 150 mM sodium chloride) using the AKTA pure system (Cytiva, Marlborough, MA). The purified complex was concentrated to 9.4 mg/ml by ultrafiltration using an Amicon Ultra centrifugal filter (Sigma) with a molecular weight cutoff of 100,000 D. The complex was applied to a freshly glow-discharged Quantifoil holey carbon grid (R0.6/1.0, Cu, 300 mesh) using a Vitrobot Mark IV (FEI) at 8°C and 100% humidity with a blot force of 15 and a blot time of 4 seconds, and plunge-frosted in liquid ethane. The grid was transferred to a CRYO ARM 300 (JEOL, Tokyo) equipped with an Omega-type in-column energy filter and a Gatan K3 camera (Gatan AMETEK, CA USA) operated at 300 kV and imaged in correlated double sampling (CDS) counting mode. Images were processed at a nominal magnification of 60,000 times, corresponding to a calibrated pixel size of 0.752 A/pix (EM01CT at SPring-8). The incident electron beam was set to parallel light, and the dose rate at the detector was 10e-/pix/s. Each exposure was recorded as a 50-frame, 2.26-s movie, with an integrated dose at the sample of 50e-/A2. Data were collected automatically with SerialEM software and JEOL custom scripts, and the defocus range was set to -1.2 to -1.6 μm at the center of the 7x7x1 image shift matrix for each stage shift. The stage shift was refined to the center of the hole using the software yoneoLocr.
（２）結果
（２－１）SARS-CoV-2に感染し、その後2回ワクチンを接種した患者のPBMCからの、SARS-CoV-2に対する中和活性を持つ抗体を産生するB細胞の取得
SARS-CoV-2亜型の共通エピトープを標的とするmAbを単離するために、感染及びその後にワクチンを接種したドナー(表２)のPBMCから抗体遺伝子を検索した。D614G、Delta、Omicron BA.1変異株のすべてに対して高い中和活性を示した患者から3つのPBMCsを選択した。このPBMCから分離した単一B細胞において、Ecobody技術により作製したFabsのELISA所見からさらに10種類の抗体遺伝子を選択し、精製した組み換えIgG抗体とV遺伝子を用いて試験を行った。10種類のmAbについて中和活性を調べ、中和活性を示した3種の抗体、つまり、MO1（本願発明の中和抗体の一例）、MO2（本願発明の中和抗体の一例）、及びMO3を得た。
(2) Results
(2-1) Isolation of B cells producing antibodies with neutralizing activity against SARS-CoV-2 from PBMCs of patients infected with SARS-CoV-2 and subsequently vaccinated twice
To isolate mAbs targeting common epitopes of SARS-CoV-2 subtypes, antibody genes were searched from PBMCs of infected and subsequently vaccinated donors (Table 2). Three PBMCs were selected from patients that showed high neutralizing activity against all of the D614G, Delta, and Omicron BA.1 variants. In single B cells isolated from these PBMCs, 10 more antibody genes were selected based on the ELISA findings of Fabs produced by Ecobody technology, and tested using purified recombinant IgG antibodies and V genes. The neutralizing activity of the 10 mAbs was examined, and three antibodies that showed neutralizing activity were obtained, namely MO1 (an example of the neutralizing antibody of the present invention), MO2 (an example of the neutralizing antibody of the present invention), and MO3.
（２－２）SARS-CoV-2変異株に対する中和モノクローナル抗体
図１Ａに示すように、D614Gに対する3種類の中和抗体（MO1、MO2、MO3）は、D614GのSARS-CoV-2スパイクタンパク質を認識することが確認された。MO1は5つの変異株（D614G、Delta、BA.1、BA.2、BA.5）の5種類のスパイクタンパク質を認識し、MO2は、BA.5以外の4つの変異株のスパイクタンパク質を認識した一方、MO3は、Delta及びBA.5以外の3つの変異株のみ認識した。
(2-2) Neutralizing monoclonal antibodies against SARS-CoV-2 mutants As shown in Figure 1A, three neutralizing antibodies against D614G (MO1, MO2, and MO3) were confirmed to recognize the SARS-CoV-2 spike protein of D614G. MO1 recognized five types of spike proteins of five mutant strains (D614G, Delta, BA.1, BA.2, and BA.5), MO2 recognized the spike proteins of four mutant strains other than BA.5, while MO3 recognized only the three mutant strains other than Delta and BA.5.
また、図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、MO1は、以下のIC50値で、5つの変異株すべてを阻害した：D614G (23.62 ng/mL), Delta (15.84 ng/mL), BA.1 (4.0 ng/mL), BA.1.1 (10.64 ng/mL), BA.2 (20.31 ng/mL), 及び BA.5 (15.67 ng/mL)。MO2は、以下のIC50値で、BA.5以外の4つの変異株を阻害した：D614G (65.81 ng/mL), Delta (88.24 ng/mL), BA.1 (17.71 ng/mL), BA.1.1 (36.05 ng/mL) 及び BA.2 (151.2 ng/mL)。一方、MO3は、以下のIC50値で、Delta及びBA.5以外の3つの変異体を阻害した：D614G (231.57 ng/mL), BA.1 (594.63 ng/mL), 及び BA.2 (701.95 ng/mL)。 As shown in Figure 1B and Figure 1C, MO1 inhibited all five mutants with the following IC50 values: D614G (23.62 ng/mL), Delta (15.84 ng/mL), BA.1 (4.0 ng/mL), BA.1.1 (10.64 ng/mL), BA.2 (20.31 ng/mL), and BA.5 (15.67 ng/mL). MO2 inhibited the four mutants other than BA.5 with the following IC50 values: D614G (65.81 ng/mL), Delta (88.24 ng/mL), BA.1 (17.71 ng/mL), BA.1.1 (36.05 ng/mL), and BA.2 (151.2 ng/mL). On the other hand, MO3 inhibited three mutants other than Delta and BA.5 with the following IC50 values: D614G (231.57 ng/mL), BA.1 (594.63 ng/mL), and BA.2 (701.95 ng/mL).
MO1及びMO2のCDRの配列解析結果は次の通りであった。
さらに、MO1の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４で表され、MO1の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５で表されるものであり、また、MO2の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６で表され、MO2の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７で表されるものであった。 Furthermore, the amino acid sequence of the heavy chain variable region of MO1 is represented by SEQ ID NO:14, the amino acid sequence of the light chain variable region of MO1 is represented by SEQ ID NO:15, the amino acid sequence of the heavy chain variable region of MO2 is represented by SEQ ID NO:16, and the amino acid sequence of the light chain variable region of MO2 is represented by SEQ ID NO:17.
（２－３）中和抗体のSARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する親和性
SARS-CoV-2 BA.2スパイクタンパク質とMO1及びMO2 mAbsの親和性をバイオレイヤー干渉法(BLI)で評価した。プレフュージョン安定化BA.2スパイクのエクトドメイン3量体は、MO1やMO2とほとんど解離せず、スパイク3量体上の多価結合部位による高い親和性を示した。MO1及びMO2ともにBA.2スパイクRBDと高い親和性を示し、解離定数（KD）はそれぞれ3.3 nM、2.0 nMであった（図２Ａ、図２Ｃ）。MO1はBA.5スパイクRBDとも高い親和性を示し、KDは11 nMであった（図２Ｂ、図２Ｃ）。
(2-3) Affinity of neutralizing antibodies to the SARS-CoV-2 spike protein
The affinity of the SARS-CoV-2 BA.2 spike protein with MO1 and MO2 mAbs was evaluated by biolayer interferometry (BLI). The ectodomain trimer of the prefusion-stabilized BA.2 spike barely dissociated with MO1 or MO2, indicating high affinity due to the multivalent binding sites on the spike trimer. Both MO1 and MO2 showed high affinity with the BA.2 spike RBD, with dissociation constants (KD) of 3.3 nM and 2.0 nM, respectively (Figure 2A, Figure 2C). MO1 also showed high affinity with the BA.5 spike RBD, with a KD of 11 nM (Figure 2B, Figure 2C).
（２－４）MO1の結合様式及びフットプリントの分析
MO1の標的部位と結合様式を検討するために、クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）解析を行った。プレフュージョン安定化BA.1スパイクのエクトドメイン及びMO1のFabドメインをクロマトグラフィーで共精製し、解析に使用した。MO1-Fab複合体のクライオ電子顕微鏡密度マップは、2.98Aのグローバル分解能で得られた。
(2-4) Analysis of the binding mode and footprint of MO1
To investigate the target site and binding mode of MO1, we performed cryo-electron microscopy (cryo-EM) analysis. The ectodomain of the prefusion-stabilized BA.1 spike and the Fab domain of MO1 were co-purified by chromatography and used for the analysis. A cryo-EM density map of the MO1-Fab complex was obtained with a global resolution of 2.98 A.
3つのMO1 Fabがマップ上で解釈可能であり、1つのアップ型のRBD及び2つのダウン型のRBDに結合した（図３Ａ、図３Ｂ）」アップ型RBDに結合したFabは、他の2つのダウン型結合したFabと比較して、おそらくRBDコンフォメーションの動きやすさにより明確ではなかったため、以下の観察はダウン型RBDに結合したFabに基づいて行われた。 Three MO1 Fabs were interpretable on the map, bound to one up-RBD and two down-RBDs (Fig. 3A, Fig. 3B)." The Fab bound to the up-RBD was less clear compared to the other two down-RBD bound Fabs, probably due to the flexibility of the RBD conformation, so the following observations are based on the Fab bound to the down-RBD.
MO1は、S309（D. Pinto et al., Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS CoV antibody. Nature 583, 290-295 (2020).）のような他のクラス3抗体と同様に、スパイクRBDの右肩付近に結合した（図３Ａ）。RBDのこの面における変異の数は一般的に少ないが、オミクロン株（特にBA.5株）ではいくつかの変異がある（図３Ｃ）。それにもかかわらず、RBD上のMO1フットプリントは、外縁のR346とK440の部位を除いて、変異部位を完全に避けている（図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ）。表面近くにある重鎖の相補性決定領域（CDR）H3はRBDループ344-349及び442-452からなり、CDR H1及びH2、CDR L1及びL3が接触部位を取り囲んでいる。MO1のフットプリントは埋没表面積が638A2とコンパクトであり、アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）の領域と重ならない（別途、スパイクRBD上のACE2ペプチダーゼドメインとMO1 Fabの空間配置を、スパイクRBD-ACE2ペプチダーゼドメイン複合体の座標に基づいて、インシリコでシミュレーションし、表面モデルとして示した結果、ACE2に結合した糖鎖とMO1 Fab軽鎖が接近しているものの、明確な衝突は観察されなかったことを確認した。） MO1 bound near the right shoulder of the spike RBD (Figure 3A), similar to other class 3 antibodies such as S309 (D. Pinto et al., Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS CoV antibody. Nature 583, 290-295 (2020).). The number of mutations on this face of the RBD is generally low, but there are several in Omicron strains (especially BA.5) (Figure 3C). Nevertheless, the MO1 footprint on the RBD completely avoids the mutation sites, except for the sites at R346 and K440 on the outer edge (Figure 3C, Figure 3D, Figure 3E). The complementarity determining region (CDR) H3 of the heavy chain, located near the surface, consists of RBD loops 344-349 and 442-452, and CDRs H1 and H2, CDRs L1 and L3 surround the contact site. The footprint of MO1 is compact with a buried surface area of 638A2, and does not overlap with the region of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). (Separately, the spatial arrangement of the ACE2 peptidase domain and MO1 Fab on the spike RBD was simulated in silico based on the coordinates of the spike RBD-ACE2 peptidase domain complex, and shown as a surface model. As a result, it was confirmed that although the glycan bound to ACE2 and the MO1 Fab light chain are close to each other, no clear collisions were observed.)
MO1とRBDの間で観察された相互作用を図３Ｆ－図３Ｉに示す。また、MO1のフットプリントに関与するSARS-CoV-2スパイクのRBD残基及び主要なSARS-CoV-2株間の保存性に関する情報を下記表に示す。フットプリントは、中和抗体の原子から４Å以内の原子を含む残基と定義される。下記表では、野生型スパイクにおけるアミノ酸残基（WT Spike residues）（BA.1のcryo-EM構造には、N440K変異が含まれる）、SARS-CoV-2の変異株間の保存性（Conservation among SARS-CoV-2 variants）、近傍に位置するMO1アミノ酸残基（MO1 residues located nearby）（添え字のH及びLは、それぞれ重鎖及び軽鎖を表す）、可能性のある相互作用（Possible interaction）（ファンデルワールス力、カチオンΠ相互作用、静電相互）、及び対応する図番号（図３Ｆ～図３Ｉのいずれか）を示す。また、N439側鎖は抗体とは反対側を向いており、L441側鎖は抗体の反対側を向いており、S443側鎖は抗体の反対側を向いている。 The observed interactions between MO1 and RBD are shown in Figure 3F-I. The following table also provides information on the RBD residues of the SARS-CoV-2 spike involved in the MO1 footprint and their conservation among the major SARS-CoV-2 strains. The footprint is defined as the residues that contain atoms within 4 Å of the neutralizing antibody atoms. The table below shows the WT Spike residues (the cryo-EM structure of BA.1 contains the N440K mutation), conservation among SARS-CoV-2 variants, MO1 residues located nearby (the subscripts H and L stand for heavy and light chains, respectively), possible interactions (van der Waals forces, cation-π interactions, electrostatic interactions), and the corresponding figure number (one of Figures 3F-I). Additionally, the N439 side chain faces away from the antibody, the L441 side chain faces away from the antibody, and the S443 side chain faces away from the antibody.
上記表に示される通り、フットプリントのアミノ酸残基（スパイクタンパク質の、T345、R346、N439、K440、L441、D442、S443、K444、V445、N448、N450、Y451、及びP499）は、オミクロン変異株に見られるN440K及びR346K以外は全て、主要なSARS-CoV-2変異株間で保存されていた（Conserved）。特に、RBDのR346がMO1のW52Aの側鎖の近くに位置しており、R346とW52Aの間のカチオンΠ相互作用を示唆した（図3F）。さらに、MO1の重鎖残基Y98、D30、D31は、RBDのR346の近くに側鎖を配していた。 As shown in the table above, all of the amino acid residues in the footprint (T345, R346, N439, K440, L441, D442, S443, K444, V445, N448, N450, Y451, and P499 in the spike protein) were conserved among the major SARS-CoV-2 variants, except for N440K and R346K, which were found in the Omicron variants. Notably, R346 in the RBD was located close to the side chain of W52 A in MO1, suggesting a cation-Π interaction between R346 and W52 A (Figure 3F). In addition, the heavy chain residues Y98, D30, and D31 of MO1 had side chains close to R346 in the RBD.
BA.1スパイクエクトドメインの部位特異的アラニン変異体を用いて、MO1フットプリント（T345、R346、N439、K440、L441、D442、S443、K444、V445、N448、N450、Y451、及びP499）においてエピトープを分析した。構造情報から側鎖の寄与が特に重要と予想されるT345、R346、K440、D442、K444、V445、N448、N450、及びY451を試験対象とした。図４Ａに示すように、MO1の抗原反応性をELISAで試験したところ、R346AとN448Aの変異抗原に対して反応性の低下が観察された一方で、他の置換を有するスパイクに対しては明確に反応した。以上のことから、MO1は、R346 及び N448を重要なエピトープとして認識することがわかった（図４Ｂ）。 Using site-specific alanine mutants of the BA.1 spike ectodomain, epitopes were analyzed in the MO1 footprint (T345, R346, N439, K440, L441, D442, S443, K444, V445, N448, N450, Y451, and P499). T345, R346, K440, D442, K444, V445, N448, N450, and Y451 were examined, as their side chain contributions are expected to be particularly important based on structural information. As shown in Figure 4A, when the antigen reactivity of MO1 was tested by ELISA, reduced reactivity was observed against the mutant antigens R346A and N448A, while it clearly reacted against spikes with other substitutions. These results indicate that MO1 recognizes R346 and N448 as important epitopes (Figure 4B).
（２－５）MO2のフットプリントの分析
同様にしてMO2のフットプリントの分析を行った結果、スパイクタンパク質の、Y449、Y453、L455、F456、N477、K478、A484、G485、F486、N487、Y489、F490、R493、S494、S496、R498、Y501がフットプリントとして導出された。
(2-5) Analysis of MO2 footprint Analysis of the MO2 footprint was performed in a similar manner, and the following footprints were derived from the spike protein: Y449, Y453, L455, F456, N477, K478, A484, G485, F486, N487, Y489, F490, R493, S494, S496, R498, and Y501.
Claims (7)
配列番号５に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号６に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号７に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、を含む、コロナウイルス中和抗体。 a heavy chain variable region including a heavy chain complementarity determining region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, an amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto;
A coronavirus neutralizing antibody comprising: a light chain variable region including a light chain complementarity determining region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:7 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto.
配列番号１１に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１２に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１３に示すアミノ酸配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、を含む、コロナウイルス中和抗体。 a heavy chain variable region including a heavy chain complementarity determining region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, an amino acid sequence shown in SEQ ID NO:9 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO:10 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto;
A coronavirus neutralizing antibody comprising: a light chain variable region including a light chain complementarity determining region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence having 80% or more sequence identity thereto.
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