JP2024051576A - MEASURING DEVICE, ITS MANUFACTURING METHOD, AND METHOD FOR MEASURING TEST SUBSTANCE USING THE MEASURING DEVICE - Google Patents
MEASURING DEVICE, ITS MANUFACTURING METHOD, AND METHOD FOR MEASURING TEST SUBSTANCE USING THE MEASURING DEVICE Download PDFInfo
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Abstract
【課題】試料中に含まれる複数種類の被検物質を同時に検出することができる、SSM法を利用した計測デバイスを提供すること。【解決手段】計測デバイスは、ウェルと、ウェル内に配置された電極と、電極上に固定化されたセンサ素子と、電極を流れる電流を測定する電流測定手段とを具備する。電極は、単一のウェル内に互いに近接して配置された複数の電極であり、各電極には、種類及び／又は濃度が異なるセンサ素子がそれぞれ固定化されており、電流測定手段は、各電極を流れる電流を測定する手段である。【選択図】図２[Problem] To provide a measurement device utilizing the SSM method that can simultaneously detect multiple types of test substances contained in a sample. [Solution] The measurement device comprises a well, an electrode placed in the well, a sensor element immobilized on the electrode, and a current measurement means for measuring the current flowing through the electrode. The electrodes are multiple electrodes placed close to each other in a single well, and each electrode has a sensor element of a different type and/or concentration immobilized thereon, and the current measurement means is a means for measuring the current flowing through each electrode. [Selected Figure] Figure 2
Description
本発明は、匂いのような被検物質を定量するための計測デバイス、その製造方法及びそれを用いた被検物質の測定方法に関する。 The present invention relates to a measurement device for quantifying a test substance such as an odor, a method for manufacturing the same, and a method for measuring the test substance using the same.
試料中の匂いを測定する方法として、固定化膜標本法（Solid Supported Membrane, SSM法）が知られている。SSM法は、金電極上に脂質一重膜を固定化した計測デバイスを用いる。緩衝液中で、脂質二重膜から成るベシクル（リポソーム）に生物の嗅覚受容体を保持した匂いセンサ素子を作製し、この匂いセンサ素子を含む液を金電極上の脂質一重膜と接触させた状態で、デバイス全体を遠心することにより、匂いセンサ素子が脂質一重膜に固定化される。この状態で、前記嗅覚受容体と結合する匂い物質及びカルシウムイオン等のイオンを含む試料を、固定化された匂いセンサ素子と接触させると、嗅覚受容体と匂い物質が結合して、嗅覚受容体のイオンチャンネルが開き、脂質二重膜ベシクルから成る匂いセンサ素子の内部にイオンチャンネルを介してイオンが入ってくる。そうすると、脂質二重膜および脂質一重膜の絶縁層を介して、ベシクル内部のイオン、すなわち正電荷に対応する負電荷を充電する作用が生じ、金電極に微少電流計を介して接続された参照電極との間に微少な容量性電流が流れる。この電流を微少電流計（増幅回路を内蔵）で増幅して測定する。試料中の被検匂い物質の量が多いほど、イオンチャンネルが開放される嗅覚受容体の数やイオンチャンネルが開放される時間が増え、ベシクル内部に侵入するイオンの総量が増大するので、測定される電流値が大きくなる。すなわち、電流値が大きいほど、試料中の被検匂い物質の量が多くなるので、試料中の被検匂い物質を定量することが可能となる。 The solid supported membrane (SSM) method is known as a method for measuring odors in a sample. The SSM method uses a measurement device in which a lipid monolayer membrane is immobilized on a gold electrode. In a buffer solution, an odor sensor element is prepared in which an organism's olfactory receptor is held in a vesicle (liposome) made of a lipid bilayer membrane. The liquid containing the odor sensor element is brought into contact with the lipid monolayer membrane on the gold electrode, and the entire device is centrifuged to immobilize the odor sensor element on the lipid monolayer membrane. In this state, when a sample containing an odorant that binds to the olfactory receptor and ions such as calcium ions is brought into contact with the immobilized odor sensor element, the odorant binds to the odorant, opening the ion channel of the olfactory receptor, and the ions enter the odor sensor element made of a lipid bilayer vesicle through the ion channel. This causes an action to charge the ions inside the vesicle, i.e., the negative charge corresponding to the positive charge, through the insulating layer of the lipid bilayer membrane and lipid monolayer membrane, and a small capacitive current flows between the gold electrode and a reference electrode connected via a microcurrent meter. This current is amplified and measured using a microammeter (with built-in amplifier circuit). The greater the amount of the test odorant in the sample, the greater the number of olfactory receptors whose ion channels are opened and the time the ion channels are open, and the greater the total amount of ions that enter the vesicle, resulting in a larger measured current value. In other words, the greater the current value, the greater the amount of the test odorant in the sample, making it possible to quantify the test odorant in the sample.
公知のSSM法は、蛍光検出を利用した他の匂い測定方法等と比較して簡便であり、今後、利用が広がることが期待できる。しかしながら、公知のSSM法では、１個のウェル内に設置される電極は１個であるため、１個のウェルに設置できるセンサ素子も１種類に限定される。このため、検出できる匂い物質もセンサ素子に対応した１種類のみであり、１個のデバイスで複数種類の匂い物質を測定することはできない。このため、尿のような試料中に含まれる複数種類の匂い物質を同時に検出することはできない。 The known SSM method is simpler than other odor measurement methods that use fluorescence detection, and it is expected that its use will become more widespread in the future. However, in the known SSM method, one electrode is placed in each well, and therefore the sensor element that can be placed in each well is limited to one type. As a result, only one type of odorant corresponding to the sensor element can be detected, and multiple types of odorants cannot be measured with a single device. For this reason, it is not possible to simultaneously detect multiple types of odorants contained in a sample such as urine.
本発明の目的は、試料中に含まれる複数種類の被検物質を同時に検出することができる、SSM法を利用した計測デバイスを提供することである。 The object of the present invention is to provide a measurement device that utilizes the SSM method and can simultaneously detect multiple types of test substances contained in a sample.
試料中に含まれる複数種類の被検物質を同時に検出するために、SSM法に基づく前記公知の計測デバイスにおいて、ウェルの数を複数にしてウェルを連結し、各ウェル内の電極にそれぞれ種類の異なるセンサ素子を固定化することが考えられた。しかしながら、下記参考例に具体的に記載するとおり、複数のウェルを直列に連結して測定すると、同じ試料を各ウェルに順次流した場合でも、測定結果の再現性が低く、被検物質の正確な定量が困難であることが示された。これは、試料を供給するマイクロ流路における圧力損失に起因してウェル間で流速の差異が生じたり、検体の切り替え時に起きる被検物質の濃度ムラが生じることが原因であると推測される。 In order to simultaneously detect multiple types of test substances contained in a sample, it has been considered to provide multiple wells in the above-mentioned known measurement device based on the SSM method, connect the wells, and fix different types of sensor elements to the electrodes in each well. However, as specifically described in the Reference Example below, when multiple wells are connected in series for measurement, the reproducibility of the measurement results is low, even when the same sample is flowed sequentially into each well, making it difficult to accurately quantify the test substance. This is presumably due to differences in flow rate between wells caused by pressure loss in the microchannel that supplies the sample, and uneven concentration of the test substance that occurs when switching samples.
そこで、本願発明者らは、単一のウェル内に複数の電極を配置し、各電極に異なる種類のセンサ素子を固定化することを考えた。測定の再現性を担保するためには、複数の電極に同時に試料液を接触させることが望まれる。このためには、複数の電極を、ウェル内で近接して配置することが必要になる。しかしながら、近接して配置した複数の各電極に、異なる種類のセンサ素子を固定化することは困難である。金電極の表面が滑らかであり、表面張力により、センサ素子含有液が複数の電極を跨いで広がるからである。各電極の間に敷居を設けることも考えられるが、そうすると、各電極に同時に試料を接触させる際の妨げとなり、望ましくはない。 The inventors of the present application therefore considered placing multiple electrodes in a single well and immobilizing different types of sensor elements on each electrode. In order to ensure the reproducibility of measurements, it is desirable to contact the sample liquid with multiple electrodes simultaneously. This requires placing multiple electrodes close to each other in the well. However, it is difficult to immobilize different types of sensor elements on multiple electrodes placed close to each other. This is because the surface of the gold electrodes is smooth, and the sensor element-containing liquid spreads across the multiple electrodes due to surface tension. It is possible to provide a threshold between each electrode, but this is not desirable as it would hinder the sample from contacting each electrode simultaneously.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ステンシル治具というものを考え出した。ステンシル治具は、基板内に、各電極に対応した透孔を開けたものであり、隣接する透孔の間は隔壁が形成されている。このステンシル治具を、各透孔が各電極の上に来るように電極に積層した状態で、各センサ素子含有液を各電極と接触させることにより、近接して配置した複数の電極のそれぞれに、所定のセンサ素子を固定することができることを確認して本発明を完成した。 After extensive research, the inventors of the present application came up with a stencil jig. The stencil jig has holes in a substrate that correspond to each electrode, with partitions formed between adjacent holes. This stencil jig is stacked on top of the electrodes so that each hole is above each electrode, and when each sensor element-containing liquid is brought into contact with each electrode, it has been confirmed that a specific sensor element can be fixed to each of multiple electrodes arranged closely together, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1) ウェルと、該ウェル内に配置された電極と、該電極上に固定化されたセンサ素子と、該電極を流れる電流を測定する電流測定手段とを具備する計測デバイスであって、前記電極は、単一の前記ウェル内に互いに近接して配置された複数の電極であり、各電極には、種類及び／又は濃度が異なる前記センサ素子がそれぞれ固定化されており、前記電流測定手段は、前記各電極を流れる電流を測定する手段である、計測デバイス。
(2) 前記複数の電極は、その全体のサイズが0.1mm～10mmである、(1)記載の計測デバイス。
(3) 前記電極の前記複数の区画のそれぞれに、電流測定回路に接続するための端子が接続されている、(1)又は (2)記載の計測デバイス。
(4) 前記センサ素子が、リポソームに受容体が保持された、受容体ベシクルであり、該受容体は、対応するリガンドの存在下でイオンチャンネルが開く受容体である、(1)～(3)のいずれかに記載の計測デバイス。
(5) 前記受容体が嗅覚受容体であり、前記リガンドが匂い物質である、匂いセンサ素子が固定化された(4)記載の計測デバイス。
(6) 前記電極が脂質一重膜により被覆され、この脂質一重膜上に前記センサ素子が固定化される、(5)記載の計測デバイス。
(7) (1)又は(2)記載の計測デバイスの製造方法であって、前記複数の電極に、ステンシル治具を積層した状態で種類及び／又は濃度が異なる前記センサ素子を各電極に固定化する工程を含み、該ステンシル治具は、基板と、該基板に形成された透孔と、該透孔を複数の区画に仕切る隔壁とを具備し、該ステンシル治具を、前記隔壁により仕切られた前記透孔が前記電極と重なるように前記電極に積層して前記隔壁により前記複数の電極を区分けした状態で種類及び／又は濃度が異なる前記センサ素子を各電極に固定化する、製造方法。
(8) 前記ステンシル治具を装着した状態で遠心処理を行う、(7)記載の製造方法。
(9) (1)～(6)のいずれか１項に記載の計測デバイスを準備する工程と、被検物質を含む試料を前記複数の電極と同時に接触させる工程と、前記電流測定手段により、前記複数の電極の各電極を流れる電流を測定する工程とを含む、被検物質の測定方法。
That is, the present invention provides the following.
(1) A measurement device comprising a well, an electrode disposed in the well, a sensor element immobilized on the electrode, and a current measuring means for measuring a current flowing through the electrode, wherein the electrodes are a plurality of electrodes disposed adjacent to one another in a single well, each electrode has a sensor element of a different type and/or concentration immobilized thereon, and the current measuring means measures the current flowing through each electrode.
(2) The measurement device according to (1), wherein the plurality of electrodes have an overall size of 0.1 mm to 10 mm.
(3) A measuring device as described in (1) or (2), wherein a terminal for connecting to a current measuring circuit is connected to each of the multiple sections of the electrode.
(4) The measuring device according to any one of (1) to (3), wherein the sensor element is a receptor vesicle in which a receptor is held in a liposome, and the receptor is a receptor that opens an ion channel in the presence of a corresponding ligand.
(5) The measuring device according to (4), in which an odor sensor element is immobilized, in which the receptor is an olfactory receptor and the ligand is an odorant.
(6) The measuring device according to (5), wherein the electrodes are covered with a lipid monolayer membrane, and the sensor element is immobilized on the lipid monolayer membrane.
(7) A method for manufacturing a measuring device according to (1) or (2), comprising the step of fixing the sensor elements of different types and/or concentrations to each electrode in a state where a stencil jig is stacked on the plurality of electrodes, the stencil jig having a substrate, a through hole formed in the substrate, and a partition wall dividing the through hole into a plurality of compartments, the stencil jig being stacked on the electrodes such that the through hole divided by the partition wall overlaps with the electrodes, and the sensor elements of different types and/or concentrations are fixed to each electrode in a state where the plurality of electrodes are divided by the partition wall.
(8) The method according to (7), further comprising the step of performing a centrifugation process with the stencil tool attached.
(9) A method for measuring a test substance, comprising the steps of: preparing a measuring device described in any one of (1) to (6); contacting a sample containing the test substance with the multiple electrodes simultaneously; and measuring the current flowing through each of the multiple electrodes by the current measuring means.
本発明によれば、試料中に含まれる複数種類の被検物質を、SSM法により同時に正確に測定することが可能である。 According to the present invention, it is possible to simultaneously and accurately measure multiple types of test substances contained in a sample using the SSM method.
本発明の計測デバイスは、SSM法により、試料中の被検物質を測定するものためのものである。SSM法自体は公知であるが、本発明の計測デバイスは、SSM法による計測を行うデバイスであるので、まず、SSM法について図１に基づき説明する。 The measurement device of the present invention is for measuring a test substance in a sample by the SSM method. The SSM method itself is publicly known, but since the measurement device of the present invention is a device that performs measurements by the SSM method, the SSM method will first be explained based on Figure 1.
図１は、公知のSSM法の一例を模式的に示す図である。円筒状のウェル（図示せず）の底面を構成するガラス基板１０の上にクロム層１２がスパッタリングで形成され、このクロム層１２の上に測定電極となる金層１４がスパッタリングで形成されている。なお、クロム層１２及び金層１４の形状は、特に限定されないが、例えば円形である。この金層１４の上に、チオール基を有する化合物であるオクタデカンチオールの層１６を形成する。金はチオール基と結合する性質を有している。オクタデカンチオール層１６の上に、脂質一重膜層１８が形成されている。脂質一重膜層１８を構成する脂質は、例えば、1,2-ジフタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)のような、リポソーム形成性の脂質である。なお、脂質一重膜層１８には、表面にアミノ基を付与するために、オクタデシルアミン等を混在させることもある。 Figure 1 is a schematic diagram showing an example of a known SSM method. A chromium layer 12 is formed by sputtering on a glass substrate 10 that constitutes the bottom surface of a cylindrical well (not shown), and a gold layer 14 that serves as a measurement electrode is formed by sputtering on the chromium layer 12. The shapes of the chromium layer 12 and the gold layer 14 are not particularly limited, but may be, for example, circular. A layer 16 of octadecanethiol, a compound having a thiol group, is formed on the gold layer 14. Gold has the property of bonding with thiol groups. A lipid monolayer layer 18 is formed on the octadecanethiol layer 16. The lipid that constitutes the lipid monolayer layer 18 is, for example, a liposome-forming lipid such as 1,2-diphthanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC). Octadecylamine or the like may be mixed into the lipid monolayer layer 18 to provide an amino group on the surface.
一方、脂質二重膜から成るリポソーム２０に、嗅覚受容体２２を保持させた、脂質二重膜ベシクル（匂いセンサ素子）２４を準備する。リポソーム２０への嗅覚受容体２２の保持は、リポソームと嗅覚受容体タンパク質を混合することにより、自発的に達成される。通常、１個のリポソーム２０に複数の嗅覚受容体２２が保持される。嗅覚受容体２２は、この嗅覚受容体２２と特異的に結合する匂い物質２６（受容体と特異的に結合する物質はリガンドと呼ばれる）の存在下では、匂い物質２６と結合する。そうすると、嗅覚受容体タンパク質の構造が変化して、イオンチャンネル２２’が開く。匂いセンサ素子２４の外部にカルシウムイオン等のイオンを存在させておくと、イオンチャネルを介してカルシウムイオンが匂いセンサ素子の内部に入ってくる。そうすると、脂質二重膜および脂質一重膜の絶縁層を介して、ベシクル内部のイオン、すなわち正電荷に対応する負電荷を充電する作用が生じ、金電極に微少電流計を介して接続された参照電極との間に微少な容量性電流が流れる。この微少電流を、微少電流計３０により測定する。微少電流計３０は、市販されており、内部に増幅回路が組み込まれていて、ピコアンペアオーダーの微少電流を測定できるものである。 On the other hand, a lipid bilayer vesicle (odor sensor element) 24 is prepared in which an olfactory receptor 22 is held in a liposome 20 made of a lipid bilayer membrane. The retention of the olfactory receptor 22 in the liposome 20 is achieved spontaneously by mixing the liposome with an olfactory receptor protein. Usually, a plurality of olfactory receptors 22 are held in one liposome 20. The olfactory receptor 22 binds to the odorant 26 in the presence of an odorant 26 that specifically binds to the olfactory receptor 22 (a substance that specifically binds to a receptor is called a ligand). Then, the structure of the olfactory receptor protein changes and the ion channel 22' opens. If ions such as calcium ions are present outside the odor sensor element 24 , the calcium ions enter the inside of the odor sensor element through the ion channel. Then, an action occurs to charge the ions inside the vesicle, i.e., the negative charges corresponding to the positive charges, through the insulating layers of the lipid bilayer membrane and lipid monolayer membrane, and a small capacitive current flows between the gold electrode and the reference electrode connected via a microcurrent meter. This minute current is measured by the minute ammeter 30. The minute ammeter 30 is commercially available, has an internal amplifier circuit, and is capable of measuring minute currents of the picoampere order.
試料中に含まれる匂い物質２６の量が多いほど、イオンチャンネルが開放される嗅覚受容体の数やイオンチャンネルが開放される時間が増え、匂いセンサ素子２４内部に侵入するカルシウムイオンの数が多くなり、その結果、微少電流の電流値が増大する。このため、微少電流を測定することにより、試料中の匂い物質の定量が可能になる。 The greater the amount of odorant 26 contained in the sample, the greater the number of olfactory receptors whose ion channels are opened and the longer the ion channels are open, and the greater the number of calcium ions that enter the odor sensor element 24 , resulting in an increase in the current value of the microcurrent. Therefore, by measuring the microcurrent, it is possible to quantify the amount of odorant in the sample.
なお、上記は、SSM法の一般的な一例であるが、本発明は、上記した一例に限定されるものではない。例えば、ガラス基板は、絶縁性の材料から成る基板であればよく、例えばプラスチック製でもよい。また、電極は、必ずしも金で構成する必要はなく、電極として用いられている他の金属や炭素等でもよい。もっとも、化学的に安定で、チオール化合物と結合可能な金で構成した金電極が好ましい。また、チオール基を有する化合物もオクタデカンチオールに限定されるものではなく、脂質一重膜層をその上に形成することが可能な他の化合物、例えば、炭素数１６～２０のアルキルチオール等でもよい。さらに、脂質一重膜層やリポソームを形成する脂質もDPhPCに限定されるものではなく、他の公知のリポソーム形成性脂質でもよい。さらに、金層から成る測定電極（金電極）の形状も円形に限定されるものではなく、任意である。さらに、リポソームに固定化される受容体も嗅覚受容体に限定されるものではなく、被検物質の存在下でイオンチャネルが開く他の受容体であってもよい。 The above is a general example of the SSM method, but the present invention is not limited to the above example. For example, the glass substrate may be made of any insulating material, such as plastic. The electrodes do not necessarily need to be made of gold, and may be other metals or carbon used as electrodes. However, gold electrodes made of gold that are chemically stable and can bind to thiol compounds are preferred. The compound having a thiol group is not limited to octadecanethiol, and may be other compounds capable of forming a lipid monolayer thereon, such as alkylthiols having 16 to 20 carbon atoms. Furthermore, the lipids forming the lipid monolayer and liposomes are not limited to DPhPC, and may be other known liposome-forming lipids. Furthermore, the shape of the measurement electrode (gold electrode) made of a gold layer is not limited to a circular shape, and may be any shape. Furthermore, the receptors immobilized on the liposomes are not limited to olfactory receptors, and may be other receptors whose ion channels open in the presence of the test substance.
本発明のSSM法用の計測デバイスの最大の特徴は、単一のウェル内に複数の電極（測定電極）を互いに近接して配置したことである。互いに近接して配置した複数の電極（以下、便宜的に「一群の電極」と呼ぶことがある）の一例の平面図を図２に示す。図２に示す一群の電極は、それぞれが、中心角９０°の扇形をしている４つの電極14a、14b、14c、14dから成る。各電極は、間隙３２を空けて配置されており、隣の電極とは間隙３２によって分離されている。間隙３２は、金属層が形成されていない部分であり、ガラス基板等の絶縁性基板が露出している部分である。一群の電極の全体のサイズは、マイクロ流路から試料液を一群の電極の真上から供給した場合に、同時に各電極が試料液と接触できるサイズが好ましく、具体的には、0.1mm～10mm程度、好ましくは0.5mm～5mm程度である。ちなみに、下記実施例では3.1mmである。なお、ここで、「サイズ」とは、一群の電極が図２に示すように全体として円形に配置されている場合には、該円の直径であり、楕円形の場合には長径であり、三角形以外の多角形の場合には最長の対角線、三角形の場合には最長の辺の長さを意味する。間隙３２は、隣り合う電極同士を絶縁できればよいので、幅は全く限定されず、通常、0.01mm～0.5mm程度である。ちなみに、下記実施例では0.3mmである。なお、間隙３２は、単なる間隙でもよいが、念のため、絶縁性の樹脂組成物等を埋め込んで、絶縁しておくことが好ましい。絶縁性の樹脂組成物は、種々のものが市販されており、市販品を利用することができる。下記実施例では、樹脂組成物である市販のマニキュアトップコートを埋め込んでいる。また、試料液が各電極とムラなく同時に接触できるように、各電極は、図２に示すような、回転対称に配置することが好ましい。すなわち、必ずしも図２に示すように円形に配置することに限定されるものではなく、全体として正方形状やその他の矩形状でもよいが、各電極を回転対称に配置することが好ましい。なお、一群の電極に包含される電極の数は、図２に示すような４個に限定されるものではなく、任意に設定できるが、通常２個～１６個、特に３個～１２個程度である。単一のウェル内に一群の電極を配置すること以外の電極の構成自体は公知のSSM法と同様でよい。すなわち、好ましくは、ガラス基板上にスパッタリングでクロム層と金層（金電極）が順次形成され、金層の上にチオール化合物の層を介して脂質一重膜層が形成され、脂質一重膜層上に匂いセンサ素子等の受容体ベシクルから成るセンサ素子が固定されている。 The greatest feature of the measurement device for the SSM method of the present invention is that multiple electrodes (measurement electrodes) are arranged close to each other in a single well. Figure 2 shows a plan view of an example of multiple electrodes arranged close to each other (hereinafter, for convenience, may be referred to as a "group of electrodes"). The group of electrodes shown in Figure 2 consists of four electrodes 14a, 14b, 14c, and 14d, each of which is in the shape of a sector with a central angle of 90°. Each electrode is arranged with a gap 32 between them, and is separated from the adjacent electrode by the gap 32. The gap 32 is a portion where no metal layer is formed, and where an insulating substrate such as a glass substrate is exposed. The overall size of the group of electrodes is preferably a size that allows each electrode to contact the sample liquid at the same time when the sample liquid is supplied from the microchannel directly above the group of electrodes, and is specifically about 0.1 mm to 10 mm, preferably about 0.5 mm to 5 mm. Incidentally, in the following example, it is 3.1 mm. In addition, here, "size" means the diameter of the circle when the group of electrodes is arranged in a circle as a whole as shown in FIG. 2, the major axis in the case of an ellipse, the longest diagonal in the case of a polygon other than a triangle, and the length of the longest side in the case of a triangle. The width of the gap 32 is not limited at all as long as it can insulate adjacent electrodes from each other, and is usually about 0.01 mm to 0.5 mm. Incidentally, in the following example, it is 0.3 mm. The gap 32 may be a simple gap, but it is preferable to insulate it by filling it with an insulating resin composition or the like just to be sure. Various insulating resin compositions are commercially available, and a commercially available product can be used. In the following example, a commercially available nail polish top coat, which is a resin composition, is filled in. In addition, it is preferable to arrange each electrode in a rotational symmetrical manner as shown in FIG. 2 so that the sample liquid can contact each electrode simultaneously without unevenness. That is, it is not necessarily limited to a circular arrangement as shown in FIG. 2, and the electrodes may be in a square or other rectangular shape as a whole, but it is preferable to arrange each electrode in a rotational symmetrical manner. The number of electrodes included in one group of electrodes is not limited to four as shown in FIG. 2, and can be set arbitrarily, but is usually 2 to 16, and particularly 3 to 12. The configuration of the electrodes themselves other than arranging the group of electrodes in a single well may be the same as that of the known SSM method. That is, preferably, a chromium layer and a gold layer (gold electrode) are formed in sequence on a glass substrate by sputtering, a lipid monolayer layer is formed on the gold layer via a layer of a thiol compound, and a sensor element consisting of a receptor vesicle such as an odor sensor element is fixed on the lipid monolayer layer.
なお、上記した一群の電極の各電極には、電流測定手段との接続を容易にするために、基板の外側に突出する端子を接続することが好ましい。各電極は、リード線を介して端子に接続することができる。なお、リード線も端子も基板上に金電極と同時に、金電極と一体的にスパッタリングにより形成することができる。なお、下記実施例に記載するとおり、このリード線は絶縁性の樹脂等で絶縁しておくことが好ましい。下記実施例では、樹脂組成物である市販のマニキュアトップコートを塗布して絶縁している。 It is preferable to connect each electrode of the group of electrodes described above to a terminal that protrudes outside the substrate in order to facilitate connection to a current measuring means. Each electrode can be connected to the terminal via a lead wire. The lead wire and the terminal can be formed on the substrate simultaneously with the gold electrode and integrally with the gold electrode by sputtering. As described in the examples below, it is preferable to insulate the lead wire with an insulating resin or the like. In the examples below, the lead wire is insulated by applying a commercially available nail polish top coat, which is a resin composition.
本発明の計測デバイスは、公知のSSM法用計測デバイスと同様に、上記した、電極を形成した基板（下部基板）と、下部基板上に積層され、ウェルの側壁を構成し、ウェルに試料液等の液を供給するマイクロ流路を形成した上部基板とを含む。下部基板と上部基板は積層されるが、下部基板上に形成された、上記端子は、上部基板に被覆されずに外部に露出させることが、電流測定手段を接続しやすくなるので好ましい。 The measurement device of the present invention, like known measurement devices for the SSM method, includes a substrate (lower substrate) on which the electrodes are formed, and an upper substrate that is laminated on the lower substrate, constitutes the side walls of the wells, and has a microchannel formed thereon for supplying liquid such as a sample solution to the wells. The lower substrate and the upper substrate are laminated, but it is preferable that the terminals formed on the lower substrate are not covered by the upper substrate and are exposed to the outside, since this makes it easier to connect a current measuring means.
次に、本発明の計測器具の作製方法について説明する。本発明の計測器具に特徴的な部分は、単一のウェル内に上記した一群の電極を形成した点であり、一群の電極の形成方法以外の点は、公知のSSM法用の計測器具と同様にして作製することができる。すなわち、ウェルの底部を構成し、上記電極が配置されている下部基板と、ウェルの側壁を構成し、ウェルに試料液等の液を供給するマイクロ流路を形成した上部基板とを別々に作製し、最後にこれらを積層して固定する。以下、本発明に特徴的な電極を有する下部基板の作製方法の好ましい一例について説明する。 Next, a method for fabricating the measuring instrument of the present invention will be described. The measuring instrument of the present invention is characterized in that the group of electrodes described above is formed in a single well, and apart from the method for forming the group of electrodes, the measuring instrument can be fabricated in the same manner as known measuring instruments for the SSM method. That is, a lower substrate that constitutes the bottom of the well and on which the electrodes are arranged, and an upper substrate that constitutes the sidewall of the well and has a microchannel formed therein for supplying liquid such as a sample liquid to the well are fabricated separately, and finally these are laminated and fixed. Below, a preferred example of a method for fabricating a lower substrate having electrodes characteristic of the present invention will be described.
ガラス基板上にスパッタリングでクロム層と金層を形成する点は、公知のSSM法と同様である。なお、スパッタリングは、任意の形状にパターニングした金属層を形成できるので、本発明に特徴的な、上記した一群の電極及び各電極に接続されるリード線及び端子も同時にガラス基板上にスパッタリングにより電極と一体に形成することができる。さらに、公知のSSM法用計測器具と同様に、金電極の上にチオール化合物層を介して脂質一重膜層を形成する。 The formation of a chromium layer and a gold layer on a glass substrate by sputtering is similar to the known SSM method. Since sputtering can form a metal layer patterned into any shape, the group of electrodes described above and the lead wires and terminals connected to each electrode, which are characteristic of the present invention, can also be formed integrally with the electrodes by sputtering on the glass substrate at the same time. Furthermore, as with known measuring instruments for the SSM method, a lipid monolayer layer is formed on the gold electrodes via a thiol compound layer.
次に、受容体ベシクルから成るセンサ素子を脂質一重膜層上に固定化する。本発明の製造方法において、この工程が特徴的である。一群の電極に包含される各電極には、それぞれ異なる種類のセンサ素子及び／又は異なる濃度のセンサ素子が固定化される。センサ素子は液体に含まれているので、各電極に各センサ素子を含む液を塗布することが必要になる。ところが、電極のサイズは小さく、また、表面が滑らかであるので、１つの電極にセンサ素子液を施すと、他の電極にも跨がって施されてしまうという問題が見出された。各電極の間に高さのある敷居を形成することも考えられるが、それでは、マイクロ流路から供給される試料液を各電極に同時に適用することの妨げになる恐れがある。本願発明者らは、この問題を解決すべく、鋭意研究した結果、ステンシル治具と呼ぶ治具を考え出し、この治具を用いることにより、各電極にそれぞれのセンサ素子を的確に固定化することに成功した。以下、説明する。 Next, the sensor element made of the receptor vesicle is immobilized on the lipid monolayer. This step is characteristic of the manufacturing method of the present invention. Different types of sensor elements and/or different concentrations of sensor elements are immobilized on each electrode included in the group of electrodes. Since the sensor elements are contained in a liquid, it is necessary to apply a liquid containing each sensor element to each electrode. However, since the size of the electrodes is small and the surface is smooth, a problem was found in that when the sensor element liquid is applied to one electrode, it is applied across the other electrodes. It is possible to form a high threshold between each electrode, but this may prevent the sample liquid supplied from the microchannel from being applied to each electrode simultaneously. In order to solve this problem, the inventors of the present application have studied diligently and come up with a jig called a stencil jig, and by using this jig, they have succeeded in accurately immobilizing each sensor element on each electrode. The following will explain.
上記した、図２に示す一群の電極の各電極に異なるセンサ素子を固定化するためのステンシル治具の模式平面図を図３に示す。図３に模式的に示すステンシル治具３４は、基板３６を具備する。基板３６には、透孔３８が設けられており、透孔３８は、隔壁４０により４つに仕切られている。４つに仕切られた各扇形の透孔38a、38b、38c及び38dは、図２に示す、各扇形の４つの電極14a、14b、14c、14dと同じ形状及び寸法を有している。また、隔壁４０は、図２に示す間隙３２と同じ形状及び寸法を有している。ステンシル治具３４の厚さは、特に限定されないが、好ましくは0.1mm～10mm程度である。なお、下記実施例では4mmである。図３中の参照番号４２は、下部基板と結合するためのネジ（ボルト）を貫通するための透孔である。 FIG. 3 shows a schematic plan view of a stencil jig for fixing different sensor elements to each electrode of the group of electrodes shown in FIG. 2. The stencil jig 34 shown in FIG. 3 includes a substrate 36. The substrate 36 is provided with a through hole 38, which is divided into four parts by partitions 40. Each of the four sector-shaped through holes 38a, 38b, 38c, and 38d has the same shape and dimensions as the four sector-shaped electrodes 14a, 14b, 14c, and 14d shown in FIG. 2. The partitions 40 have the same shape and dimensions as the gaps 32 shown in FIG. 2. The thickness of the stencil jig 34 is not particularly limited, but is preferably about 0.1 mm to 10 mm. In the following embodiment, the thickness is 4 mm. Reference numeral 42 in FIG. 3 denotes a through hole for passing a screw (bolt) for connecting to a lower substrate.
図３中の４－４’線断面図を図４に示す。図４に示す。図４に示されるようにステンシル治具３４の透孔３８は、基板３６から下方に延びる側壁４４を形成することにより、基板３６の底面よりもさらに下方に延びている。隔壁４０も同様に下向きに伸びている。側壁４４の高さ（基板３６の底面から下向きに突出している距離）は、特に限定されないが、好ましくは0.1mm～2mm程度である。ステンシル治具３４は、ゴム等の弾性材料で形成することが好ましい。ステンシル治具３４を弾性材料で形成することにより、使用時にステンシル治具３４を下部基板に積層して、透孔４２を貫通するネジによってステンシル治具３４と下部基板を固着すると、下方に突出する側壁４４及び隔壁４０によって、各金電極の周縁部及び間隙３２がそれぞれ下向きに付勢されるので、各電極からのセンサ素子液の漏出を的確に阻止することができる。なお、ゴム製のステンシル治具は、市販の３Ｄプリンターにより容易に作製できる。 A cross-sectional view taken along line 4-4' in FIG. 3 is shown in FIG. 4. As shown in FIG. 4, the through-hole 38 of the stencil jig 34 extends further downward than the bottom surface of the substrate 36 by forming a side wall 44 extending downward from the substrate 36. The partition wall 40 also extends downward in the same manner. The height of the side wall 44 (the distance protruding downward from the bottom surface of the substrate 36) is not particularly limited, but is preferably about 0.1 mm to 2 mm. The stencil jig 34 is preferably formed of an elastic material such as rubber. By forming the stencil jig 34 from an elastic material, when the stencil jig 34 is laminated on the lower substrate during use and the stencil jig 34 and the lower substrate are fixed by a screw passing through the through-hole 42, the peripheral portion and the gap 32 of each gold electrode are respectively biased downward by the downwardly protruding side wall 44 and partition wall 40, so that leakage of the sensor element liquid from each electrode can be prevented accurately. The rubber stencil jig can be easily produced using a commercially available 3D printer.
次に、上記ステンシル治具３４を用いた、センサ素子固定化工程について説明する。ステンシル治具３４の上記側壁４４が円形の一群の電極の周縁部に合致し、かつ、ステンシル治具３４の透孔３８を仕切る隔壁４０が、一群の電極の間隙３２と合致するように、ステンシル治具３４を、上記のとおり脂質一重膜層まで形成した下部基板に積層する。透孔４２にネジを通し（下部基板にも対応する位置に透孔が形成してある）、下部基板の対応する透孔にネジを通して両者を結合する。ネジ（ボルトとナット）で結合した状態で、上記のとおり、側壁４４が円形の一群の電極の周縁部に合致し、かつ、透孔３８を仕切る隔壁４０が、一群の電極の間隙３２と合致するように、透孔４２と下部基板の図示しない透孔の位置を設定しておく。 Next, the sensor element immobilization process using the stencil jig 34 will be described. The stencil jig 34 is laminated on the lower substrate on which the lipid monolayer layer has been formed as described above, so that the sidewall 44 of the stencil jig 34 matches the periphery of the circular group of electrodes, and the partition wall 40 dividing the through-hole 38 of the stencil jig 34 matches the gap 32 between the group of electrodes. A screw is inserted into the through-hole 42 (a through-hole is formed at a corresponding position in the lower substrate), and the screw is inserted into the corresponding through-hole in the lower substrate to connect the two. In a state where the screws (bolts and nuts) are connected, the positions of the through-hole 42 and the through-hole (not shown) of the lower substrate are set so that the sidewall 44 matches the periphery of the circular group of electrodes, and the partition wall 40 dividing the through-hole 38 matches the gap 32 between the group of electrodes, as described above.
ステンシル治具３４を下部基板に上記のとおり装着した状態で、隔壁４０により仕切られた、各電極に対応する透孔から、各電極上に、センサ素子含有液を滴下する。各電極には、異なる種類のセンサ素子及び／又は濃度が異なるセンサ素子を含有する液を個別に滴下する。滴下するセンサ素子の量は、適宜設定されるが、センサ素子に保持される受容体タンパク質の量で、電極1mm2当り通常、0.005μg～20μg程度、好ましくは0.01～5μg程度である。なお、センサ素子の調製方法自体は周知であり、市販のトランスフェクション試薬を用いて容易に行うことができ、下記参考例にも具体的に記載されている。 With the stencil jig 34 attached to the lower substrate as described above, a liquid containing sensor elements is dropped onto each electrode through the through holes separated by the partition wall 40 and corresponding to each electrode. A liquid containing different types of sensor elements and/or different concentrations of sensor elements is dropped onto each electrode individually. The amount of sensor elements to be dropped is appropriately set, but is usually about 0.005 μg to 20 μg, preferably about 0.01 to 5 μg, per 1 mm2 of electrode in terms of the amount of receptor protein retained in the sensor element. The method of preparing the sensor element itself is well known and can be easily performed using a commercially available transfection reagent, and is specifically described in the Reference Examples below.
それぞれのセンサ素子含有液を、ステンシル治具３４を介して各電極に滴下後、ステンシル治具３４を装着した状態で、下部基板を遠心処理する。遠心処理は、スイングロータを用いて行うことができる。遠心処理の条件は、特に限定されず、適宜設定できるが、通常、100ｇ～5000ｇ程度、好ましくは、500ｇ～4000ｇ程度の加速度で、通常、1分間～120分間程度、好ましくは、5分間～60分間程度行うことができる。なお、下記実施例では、2300g、３０分間である。 Each sensor element-containing liquid is dropped onto each electrode via the stencil jig 34 , and then the lower substrate is centrifuged with the stencil jig 34 attached. The centrifugation can be performed using a swing rotor. The conditions for the centrifugation are not particularly limited and can be set appropriately, but the centrifugation can be performed usually at an acceleration of about 100 g to 5000 g, preferably about 500 g to 4000 g, for about 1 minute to 120 minutes, preferably about 5 minutes to 60 minutes. In the following example, the conditions are 2300 g and 30 minutes.
遠心処理後、ステンシル治具３４を下部基板から取り外し、ウェルの側壁を構成しウェルに液を供給するマイクロ流路を備えた上部基板を下部基板に積層し、ネジ止め等により固着する。この際、水密性を高めるために、ウェルの底部周縁にＯリングを挟み込んでも良い。なお、上記のとおり、下部基板と上部基板を積層した状態で、上記端子の部分は、上部基板に被覆されずに露出していることが好ましい。 After the centrifugation process, the stencil jig 34 is removed from the lower substrate, and an upper substrate having a microchannel that forms the sidewall of the well and supplies liquid to the well is laminated on the lower substrate and fixed by screws or the like. At this time, an O-ring may be sandwiched around the bottom edge of the well to improve watertightness. As described above, it is preferable that when the lower substrate and the upper substrate are laminated, the terminal portion is exposed and not covered by the upper substrate.
上部基板内に形成したマイクロ流路内、又はウェル内に、参照電極２８を配置し、参照電極２８と微少電流計３０と、各電極14a、14b、14c、14dをそれぞれ接続すると、本発明の計測デバイスが完成する。なお、各電極14a、14b、14c、14dを、それぞれ微少電流計に接続する必要があるので、原則的に電極の数だけ微少電流計が必要となる。もっとも、マルチプレクサを使い、電極信号をスイッチングすれば、1台でも計測は可能となる。各電極14a、14b、14c、14dについて参照電極２８は、共通に使用することができるので、参照電極２８は電極の数にかかわらず１個でよい。 The measurement device of the present invention is completed by placing the reference electrode 28 in the microchannel or well formed in the upper substrate, and connecting the reference electrode 28, the microammeter 30, and each of the electrodes 14a, 14b, 14c, and 14d. Since each of the electrodes 14a, 14b, 14c, and 14d must be connected to a microammeter, in principle, the same number of microammeters are required as there are electrodes. However, if a multiplexer is used to switch the electrode signals, measurement is possible with just one unit. The reference electrode 28 can be used in common for each of the electrodes 14a, 14b, 14c, and 14d, so only one reference electrode 28 is required regardless of the number of electrodes.
次に、本発明の計測デバイスを用いた、試料中の被検物質の測定方法について説明する。 Next, we will explain a method for measuring a test substance in a sample using the measurement device of the present invention.
被検物質（匂い物質等）と、カルシウムイオンやナトリウムイオン等のイオン、好ましくは陽イオン、を含む試料液を、上部基板内のマイクロ流路を介してウェル内に供給する。この際、一群の電極の真上から、全電極に同時に試料液が供給されるように、上部基板のマイクロ流路を形成しておくことが好ましい。これにより、電極間のバラツキをなくし、再現性を高めることができる。なお、試料液中のイオンの濃度は、特に限定されず、適宜設定されるが、通常、10mM～1000mM程度、好ましくは50mM～500mM程度である。ウェルに試料液を供給する前から経時的に微少電流（容量性電流）を測定する。測定された微少電流の変化から、試料液中の被検物質を検出又は定量することができる。なお、定量する場合には、既知濃度の被検物質を含む標準試料を複数作製し、それぞれについて電流値を測定し、被検物質濃度と電流値の関係から検量線を作成しておき、未知の試料の電流値を検量線にあてはめることにより定量が可能となる。 A sample solution containing a test substance (such as an odorant) and ions such as calcium ions and sodium ions, preferably cations, is supplied into the well through a microchannel in the upper substrate. In this case, it is preferable to form a microchannel in the upper substrate so that the sample solution is supplied to all electrodes simultaneously from directly above the group of electrodes. This eliminates variation between electrodes and improves reproducibility. The concentration of ions in the sample solution is not particularly limited and is set appropriately, but is usually about 10 mM to 1000 mM, preferably about 50 mM to 500 mM. A minute current (capacitive current) is measured over time before the sample solution is supplied to the well. The test substance in the sample solution can be detected or quantified from the change in the measured minute current. When quantifying, multiple standard samples containing the test substance of known concentrations are prepared, the current value is measured for each, and a calibration curve is created from the relationship between the test substance concentration and the current value, and quantification is possible by applying the current value of an unknown sample to the calibration curve.
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 The present invention will be specifically described below based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
参考例１～３（予備実験）
参考例１は、公知のSSM法用計測デバイス（単一のウェル内に１個の円形の金電極を含む）のウェル４個を直列に連結した例（図５ａ）、参考例２は、参考例１と同様な公知のSSM法用計測デバイスのウェル４個を並列に連結した例（図５ｂ）、参考例３は、上記した図２に示す、全体として円形の１群の金電極４個を単一のウェル内に配置した例（図５ｃ）であり、各電極に異なるセンサ素子を固定化すれば本発明の実施例となる例である。以下、具体的に説明する。
Reference Examples 1 to 3 (Preliminary Experiments)
Reference Example 1 is an example in which four wells of a known SSM method measurement device (containing one circular gold electrode in a single well) are connected in series (FIG. 5a), Reference Example 2 is an example in which four wells of a known SSM method measurement device similar to Reference Example 1 are connected in parallel (FIG. 5b), and Reference Example 3 is an example in which a group of four circular gold electrodes as a whole as shown in FIG. 2 is arranged in a single well (FIG. 5c), and these examples become embodiments of the present invention when different sensor elements are immobilized on each electrode. Specific explanations are given below.
1. 複数電極への送液
・電極配置とマイクロ流路形状の設計・作製
一種類の溶液を複数電極へ同時に送液するため、電極配置とマイクロ流路形状が異なる３種類のセンサデバイスを作製した (図５)。それぞれのデバイスは、上下部分からなる。上部は、匂い物質を含む溶液を送液するためのマイクロ流路と銀-塩化銀電極 (参照電極) を含む。下部は、昆虫嗅覚受容体 (匂いセンサ素子、以下センサ素子) を吸着させるための金電極 (測定電極) を配置したウェル（センサウェル）を含む。デバイス本体は、アクリル板をNC精密加工機で切削加工して作製した。デバイス上部 (マイクロ流路) は、切削したアクリル部品を熱圧着で接着して作製した。銀-塩化銀電極は、銀線に銀塩化銀インクを塗布して作製し、デバイス上部のマイクロ流路へ挿入した。金電極は、ガラス基盤にクロム、金の順でスパッタして作製した。デバイスへ接続したチューブ、銀-塩化銀電極の固定には接着剤を用いた。デバイスの上下部間、センサウェルと金電極の間の密着にはOリングを用いた。
1. Design and fabrication of liquid delivery to multiple electrodes, electrode arrangement, and microchannel shape Three types of sensor devices with different electrode arrangements and microchannel shapes were fabricated to deliver one type of solution to multiple electrodes simultaneously (Fig. 5). Each device consists of an upper and lower part. The upper part contains a microchannel for delivering a solution containing an odorant and a silver-silver chloride electrode (reference electrode). The lower part contains a well (sensor well) in which a gold electrode (measurement electrode) is arranged to adsorb an insect olfactory receptor (odor sensor element, hereafter referred to as sensor element). The device body was fabricated by cutting an acrylic plate with an NC precision machining machine. The upper part of the device (microchannel) was fabricated by bonding cut acrylic parts by thermocompression bonding. The silver-silver chloride electrode was fabricated by applying silver-silver chloride ink to a silver wire and inserted into the microchannel at the top of the device. The gold electrode was fabricated by sputtering chromium and gold in that order on a glass substrate. Adhesive was used to fix the tube connected to the device and the silver-silver chloride electrode. O-rings were used to seal the upper and lower parts of the device and between the sensor well and the gold electrode.
・実験方法・条件
1) 金電極（スパッタリングで形成した金層全体）を、0.5 mM 1-オクタデカンチオール (イソプロパノールに溶解) に一晩浸潤した。
2) 浸潤した金層は、イソプロパノールで洗浄後、窒素ガス気流中で乾燥させた。
3) 乾燥した金層のうち、センサ素子の吸着部（測定電極部）とパッチクランプ増幅器（微少電流計）を接続するリード線部分は、マニキュアトップコートを塗布して絶縁した。
4) マニキュアトップコートが固化後、金層はセンサ素子吸着部をセンサウェル内に配置するため、デバイス下部の2枚のアクリル部品の間に挟んで固定した。アクリル部品はネジ止めによって組み立てた。
5) 金層のセンサ素子吸着部には、7.5 mg/mlの1,2-ジフタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC, Decaneに溶解) を0.15～0.25μL/mm2で添加し、続いて、溶液Ｒ (20mM HEPES/NaOH pH 7.2, 100 mM CaCl2) をセンサウェルに滴下した。
6) センサウェル内の金電極には、センサ素子を直接、またはステンシル治具を利用して2.5～10μL/ウェル添加した。センサ素子には、無細胞合成で調製した昆虫嗅覚受容体を含む膜ベシクルを用いた。
7) センサ素子を添加したデバイス下部は、スイングロータを用いて遠心し (2300g, 30分間)、センサ素子を金電極上に吸着させた。
8) 遠心後のデバイス下部は、デバイス上部と合わせ、ネジ止めによってセンサデバイスを組立てた。
9) マイクロ流路の入口側に接続したチューブには、3方に分岐したチューブを接続した。分岐したチューブは、3台のシリンジポンプにセットされた別々のシリンジに繋がっている。マイクロ流路の出口側に接続したチューブには、廃液入れへと繋がるチューブに接続した。金電極と銀-塩化銀電極は、パッチクランプ増幅器に接続した。
10) 溶液R、溶液NA (20 mM HEPES/NaOH pH 7.2, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2), 溶液A (溶液NAに匂いセンサ素子が反応する化合物を加えたもの) を順番に送液し、溶液Aで生じた電流値変化をパッチクランプ増幅器で検出した。
- Experimental methods and conditions
1) The gold electrode (the entire gold layer formed by sputtering) was immersed in 0.5 mM 1-octadecanethiol (dissolved in isopropanol) overnight.
2) The infiltrated gold layer was washed with isopropanol and then dried in a stream of nitrogen gas.
3) Of the dried gold layer, the lead wire portion connecting the adsorption portion of the sensor element (measurement electrode portion) to the patch clamp amplifier (microcurrent meter) was insulated by applying a nail polish top coat.
4) After the nail polish topcoat had solidified, the gold layer was sandwiched between the two acrylic pieces at the bottom of the device to position the sensor element adsorption part in the sensor well. The acrylic pieces were assembled by screwing.
5) 7.5 mg/ml 1,2-diphthanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC, dissolved in decane) was added to the sensor element adsorption area of the gold layer at 0.15 to 0.25 μL/ mm2 , and then solution R (20 mM HEPES/NaOH pH 7.2, 100 mM CaCl2 ) was dripped into the sensor well.
6) The sensor element was added to the gold electrode in the sensor well at a rate of 2.5 to 10 μL/well, either directly or using a stencil tool. The sensor element was a membrane vesicle containing insect olfactory receptors prepared by cell-free synthesis.
7) The lower part of the device to which the sensor element was added was centrifuged using a swing rotor (2300g, 30 minutes) to adsorb the sensor element onto the gold electrode.
8) After centrifugation, the bottom part of the device was mated with the top part of the device and the sensor device was assembled by screwing them together.
9) A tube connected to the inlet of the microchannel was connected to a tube that branched in three directions. The branched tubes were connected to separate syringes set on three syringe pumps. The tube connected to the outlet of the microchannel was connected to a tube that led to a waste liquid container. The gold electrode and the silver-silver chloride electrode were connected to a patch clamp amplifier.
10) Solution R, solution NA (20 mM HEPES/NaOH pH 7.2, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2 ), and solution A (solution NA to which a compound that the odor sensor element reacts) were added were sequentially pumped, and the change in current value generated by solution A was detected using a patch clamp amplifier.
・結果
電極配置とマイクロ流路形状が異なる3種類のセンサデバイスのうち、(A) 1個の金電極がそれぞれ配置された4つのセンサウェルをマイクロ流路で直列に接続したもの（参考例１）は、同じ溶液を4つのウェルに送液しているにも関わらず、同様の電流値変化を与えず、再現性も悪いことが判明した (図6a)。すなわち、流路の入り口から遠いチャネルほど、信号が乱れる傾向が明確に見られた。(B) 並列に接続したもの（参考例２）は、4つのウェルに送液を到達させること自体が難しかった。一方、(C) 1個のセンサウェル内に4つに分割した金電極を配置したデバイス（参考例３）は、同様の電流値変化を再現性良く与えることを確認した (図6b)。
・Results Among the three types of sensor devices with different electrode arrangements and microchannel shapes, (A) four sensor wells each with one gold electrode arranged in series connected by a microchannel (Reference Example 1) did not give the same current value change even though the same solution was delivered to the four wells, and it was found that the reproducibility was poor (Figure 6a). In other words, the signal tended to be more disturbed the farther the channel was from the inlet of the channel. (B) For the device connected in parallel (Reference Example 2), it was difficult to deliver the solution to the four wells. On the other hand, (C) a device with four divided gold electrodes arranged in one sensor well (Reference Example 3) was confirmed to give the same current value change with good reproducibility (Figure 6b).
実施例１
2. 複数電極への匂いセンサ素子の添加
・ステンシル治具の設計・作製
図７に示したステンシル治具を作製した。本治具は、上記のセンサデバイス (C) のウェルの大きさに合致する突出部を有し、金電極が配置されたウェル底面と密着させるため、ゴム様素材で作製した。突出部には治具を貫通する4つの小孔を形成してある。突出部をウェル底面と密着させることにより、それぞれの小孔は独立して金電極まで繋がり、別々のセンサ素子の注入口となる。ステンシル治具は、3Dプリンターで作製した。
Example 1
2. Addition of odor sensor elements to multiple electrodes, design and fabrication of stencil jig The stencil jig shown in Figure 7 was fabricated. This jig has a protrusion that matches the size of the well of the sensor device (C) above, and was fabricated from a rubber-like material to ensure close contact with the bottom of the well where the gold electrodes are located. The protrusion has four small holes that penetrate the jig. By closely contacting the protrusion with the bottom of the well, each small hole is independently connected to the gold electrode, and serves as an injection port for a separate sensor element. The stencil jig was fabricated using a 3D printer.
・実験方法・条件
1) 上記1の1)～4) と同様に、4つに分割した金電極を1-オクタデカンチオールで処理し、センサウェル内に配置した。DPhPCを添加後、溶液Rを滴下した。
2) ステンシル治具は、センサウェルが位置するデバイス下部に装着し、ネジ止めによって固定した。
3) ステンシル治具の小孔に、センサ素子を2.5μＬ/ウェルで添加した。センサ素子には、昆虫嗅覚受容体を発現させた昆虫細胞Sf9から調製した膜画分を溶液Rで1mg/mlと0.1mg/mlのタンパク質濃度に希釈したものを用いた。
4) 上記1の7) と同様に、遠心操作でセンサ素子を金電極上に吸着させた。
5) 実体顕微鏡で観察し、金電極上へのセンサ素子の吸着を確認した。
- Experimental methods and conditions
1) As in 1) to 4) above, a gold electrode divided into four pieces was treated with 1-octadecanethiol and placed in the sensor well. After adding DPhPC, solution R was added dropwise.
2) The stencil jig was attached to the bottom of the device where the sensor well was located and fixed in place with screws.
3) The sensor element was added to the small holes of the stencil jig at 2.5 μL/well. The sensor element was prepared by diluting a membrane fraction prepared from insect cells Sf9 expressing insect olfactory receptors with solution R to protein concentrations of 1 mg/ml and 0.1 mg/ml.
4) As in 1.7) above, the sensor element was adsorbed onto the gold electrode by centrifugation.
5) Observation with a stereomicroscope confirmed the adsorption of the sensor element onto the gold electrode.
・結果
異なるタンパク質濃度のセンサ素子は、4つに分割された金電極上に混合することなく別々に配置された。
Results: Sensor elements with different protein concentrations were placed separately on a gold electrode divided into four sections without mixing.
実施例２
3. 複数電極を用いた、匂いセンサ素子に反応する化合物の同時検出
・１個のウェル内に4つの金電極を配置したセンサデバイスと、ステンシル治具の設計・作製
上記1、2と同様の手順に従って、センサデバイス (図８) とステンシル治具を作製した。なお、図８は、作製した1個のウェル内に4つの金電極を配置したセンサデバイスを示しており、(a)は組立て前、 (b) は金電極部分、(c)は組立て後を示す。なお、図８の(b)において、金層で「0.3-0.3」の文字のように形成されているのは、単なる表示に過ぎず、不要なものであり、何らかの機能を発揮するものではない。図８の(b)の左下の方に、図２に示すのと同様な、全体として円形の一群の電極が形成されている。図８の(b)の上部に並ぶ４個の細長い長方形が各電極に接続された端子（金層で形成）であり、各端子と各電極を接続しているのが、各リード線（金層で形成）である。なお、上部基板と積層した状態が図８の(c)に示されており、４個の端子が上部基板から外部にはみ出して露出している。
Example 2
3. Simultaneous detection of compounds that react with odor sensor elements using multiple electrodes ・Design and fabrication of a sensor device with four gold electrodes arranged in one well and a stencil jig A sensor device (Fig. 8) and a stencil jig were fabricated following the same procedures as those described in 1 and 2 above. Note that Fig. 8 shows the sensor device with four gold electrodes arranged in one well, with (a) showing the device before assembly, (b) showing the gold electrodes, and (c) showing the device after assembly. Note that the letters "0.3-0.3" formed with gold layers in Fig. 8(b) are merely for display purposes and are unnecessary and do not perform any function. A group of electrodes with an overall circular shape, similar to those shown in Fig. 2, is formed in the lower left of Fig. 8(b). The four elongated rectangles lined up at the top of Fig. 8(b) are terminals (formed with gold layers) connected to each electrode, and each terminal is connected to each electrode by each lead wire (formed with gold layers). The state in which it is laminated with the upper substrate is shown in FIG. 8(c), with the four terminals protruding and exposed to the outside from the upper substrate.
・実験方法・条件
1) 全体として円形に配置された４つ金電極（図２参照）を、0.5mM 1-オクタデカンチオール (イソプロパノールに溶解) に一晩浸潤した。
2) 浸潤した金電極は、イソプロパノールで洗浄後、窒素ガス気流中で乾燥させた。
3) 乾燥した金電極のうち、センサ素子の吸着部とパッチクランプ増幅器への接続接点以外の金属部分は、マニキュアトップコートを塗布して絶縁した。
4) マニキュアトップコートが固化後、金電極はセンサ素子吸着部をセンサウェル内に配置するため、デバイス下部の2枚のアクリル部品の間に挟んで固定した。アクリル部品はネジ止めによって組み立てた。
5) 金電極のセンサ素子吸着部には、7.5mg/ml DPhPC (デカンに溶解) を0.15～0.25μＬ/mm2で添加した。続いて、溶液R2 (30 mM HEPES/Tris pH 7.3, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 300 mMグリセロール) 125μＬをセンサウェルに滴下した。
6) ステンシル治具をデバイス下部に装着し、ネジ止めによって固定後、治具の小孔に匂いセンサ素子を2.5μＬ/ウェルで添加した。センサ素子には、昆虫嗅覚受容体を発現させた昆虫細胞Sf9から調製した膜画分を用い、タンパク質濃度を0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 1 mg/mlに調整したものを用いた。
7) センサ素子を添加したデバイス下部は、ステンシル治具を装着したままスイングロータを用いて遠心し (2,300g, 30min)、センサ素子を金電極上に吸着させた。
8) 遠心後のデバイス下部は、治具を取り外し、デバイス上部と合わせ、ネジ止めによってセンサデバイスを組立てた。
9) センサデバイスのマイクロ流路の入口側には、3方に分岐したチューブを接続した。分岐したチューブは、3台のシリンジポンプにセットされた別々のシリンジに繋がっている。マイクロ流路の出口側に接続したチューブには、廃液入れへと繋がるチューブに接続した。金電極と銀-塩化銀電極は、パッチクランプ増幅器に接続した。
10) 溶液R2、溶液NA2 (30 mM HEPES/Tris pH 7.3, 2 mM MgCl2, 100 mM CaCl2), 溶液A2 (溶液NA2に匂いセンサ素子が反応する化合物であるVUAA1を10 μM濃度で添加したもの) を順番に送液し、溶液A2で生じた電流値変化をパッチクランプ増幅器で計測した。溶液R2と溶液NA2は0.8 ml/minで30秒間送液し、溶液A2は12 ml/minで2秒間送液した。化合物の効果を検証するため、溶液A2の代わりに溶液NA2を12 ml/minで送液した場合についても電流値変化を計測した。各条件の計測は3回以上繰り返し、解析に用いた。
- Experimental methods and conditions
1) Four gold electrodes arranged in a generally circular configuration (see Figure 2) were immersed in 0.5 mM 1-octadecanethiol (dissolved in isopropanol) overnight.
2) The wetted gold electrode was washed with isopropanol and then dried in a stream of nitrogen gas.
3) The metal parts of the dried gold electrode, other than the adsorption part of the sensor element and the connection contacts to the patch clamp amplifier, were insulated by applying a nail polish top coat.
4) After the nail polish top coat had solidified, the gold electrode was sandwiched and fixed between the two acrylic parts at the bottom of the device in order to position the sensor element adsorption part in the sensor well. The acrylic parts were assembled by screwing.
5) 7.5 mg/ml DPhPC (dissolved in decane) was added to the sensor element adsorption area of the gold electrode at 0.15 to 0.25 μL/mm 2. Then, 125 μL of solution R2 (30 mM HEPES/Tris pH 7.3, 2 mM MgCl 2 , 2 mM CaCl 2 , 300 mM glycerol) was dropped into the sensor well.
6) The stencil jig was attached to the bottom of the device and fixed with screws, and then 2.5 μL/well of the odor sensor element was added to the small holes of the jig. The sensor element was made of a membrane fraction prepared from insect cells Sf9 expressing insect olfactory receptors, with the protein concentrations adjusted to 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, and 1 mg/ml.
7) The lower part of the device to which the sensor elements had been added was centrifuged (2,300g, 30min) using a swinging rotor with the stencil attached, to adsorb the sensor elements onto the gold electrode.
8) After centrifugation, the jig was removed from the bottom of the device, and the bottom was joined to the top of the device and screwed together to assemble the sensor device.
9) A tube that branched into three directions was connected to the inlet of the microchannel of the sensor device. The branched tubes were connected to separate syringes set on three syringe pumps. The tube connected to the outlet of the microchannel was connected to a tube that led to a waste liquid container. The gold electrode and the silver-silver chloride electrode were connected to a patch clamp amplifier.
10) Solution R2, solution NA2 (30 mM HEPES/Tris pH 7.3, 2 mM MgCl 2 , 100 mM CaCl 2 ), and solution A2 (NA2 to which VUAA1, a compound that reacts with the odor sensor element, was added at a concentration of 10 μM) were pumped in sequence, and the change in current value generated by solution A2 was measured with a patch clamp amplifier. Solutions R2 and NA2 were pumped at 0.8 ml/min for 30 seconds, and solution A2 was pumped at 12 ml/min for 2 seconds. To verify the effect of the compounds, solution NA2 was pumped at 12 ml/min instead of solution A2, and the change in current value was also measured. Measurements under each condition were repeated at least three times and used for analysis.
・結果
図９(a, b) に、1個のウェル内に4つの金電極を配置したセンサデバイスを用い、溶液A2を送液した際に計測された電流値と、溶液A2の代わりに溶液NA2を送液した際に計測された電流値を示す。1 mg/ml タンパク質濃度のセンサ素子を吸着させた電極を用いて計測したCh1とCh2では、化合物の有無で電流値の有意な変化は観察されなかった。これに対し、0.1 mg/ml タンパク質濃度のセンサ素子を吸着させたCh3とCh4では、化合物を含む溶液の送液でより大きな電流値が検出された。図９ (c) には、同様のセンサデバイスを用い、金電極に吸着させるセンサ素子のタンパク質濃度を検討した結果を示す。0.1 mg/mlタンパク質濃度でのみ、溶液中の化合物の有無における電流値変化で有意な差が確認された。
Results Figure 9 (a, b) shows the current measured when solution A2 was pumped using a sensor device with four gold electrodes arranged in one well, and when solution NA2 was pumped instead of solution A2. In Ch1 and Ch2, which were measured using electrodes adsorbed with a sensor element of 1 mg/ml protein concentration, no significant change in current value was observed with or without the compound. In contrast, in Ch3 and Ch4, which were adsorbed with a sensor element of 0.1 mg/ml protein concentration, a larger current value was detected when a solution containing a compound was pumped. Figure 9 (c) shows the results of investigating the protein concentration of the sensor element adsorbed on the gold electrode using a similar sensor device. A significant difference in the change in current value depending on the presence or absence of a compound in the solution was confirmed only at a protein concentration of 0.1 mg/ml.
参考例４（匂いセンサ素子の作製）
上記1～3で用いた匂いセンサ素子には、(1) 無細胞合成で調製した昆虫嗅覚受容体を含む膜ベシクルと、(2) 昆虫嗅覚受容体を発現させた昆虫細胞Sf9から調製した膜画分がある。それぞれの作製方法を記す。
Reference Example 4 (Preparation of odor sensor element)
The odor sensor elements used in 1 to 3 above include (1) membrane vesicles containing insect olfactory receptors prepared by cell-free synthesis, and (2) membrane fractions prepared from insect cells Sf9 expressing insect olfactory receptors. The preparation methods for each are described below.
・実験方法・条件
1) 無細胞合成による昆虫嗅覚受容体を含む膜ベシクルの調製
昆虫嗅覚受容体を含む膜ベシクルの調製には、市販の無細胞タンパク質合成キットを用いた。昆虫嗅覚受容体を構成する嗅覚受容体 (OR, Olfactory receptor) と共受容体 (Orco, Olfactory receptor co-receptor) のそれぞれの遺伝子DNAから、mRNAを試験管内で別々に合成した。両mRNAは、電気泳動で合成を確認後、新しい試験管内で混合し、無細胞翻訳系を利用して昆虫嗅覚受容体を合成した。合成の際には、脂質ベシクルを添加することにより、昆虫嗅覚受容体が再構成された膜ベシクルを得た。膜ベシクルは遠心操作によって精製後、匂いセンサ素子として用いた。
- Experimental methods and conditions
1) Preparation of membrane vesicles containing insect olfactory receptors by cell-free synthesis A commercially available cell-free protein synthesis kit was used to prepare membrane vesicles containing insect olfactory receptors. mRNA was synthesized in a test tube separately from the gene DNA of the olfactory receptor (OR, Olfactory receptor) and co-receptor (Orco, Olfactory receptor co-receptor) that make up the insect olfactory receptor. After confirming the synthesis of both mRNAs by electrophoresis, they were mixed in a new test tube and the insect olfactory receptor was synthesized using a cell-free translation system. During the synthesis, lipid vesicles were added to obtain membrane vesicles in which the insect olfactory receptor was reconstituted. The membrane vesicles were purified by centrifugation and used as odor sensor elements.
2) 昆虫細胞発現系による昆虫嗅覚受容体を含む膜画分の調製
昆虫嗅覚受容体を含む膜画分の調製には、昆虫細胞Sf9の一過性発現系を用いた。昆虫嗅覚受容体を構成する嗅覚受容体 (OR, Olfactory receptor) と共受容体 (Orco, Olfactory receptor co-receptor) のそれぞれの遺伝子DNAを組み込んだ別々の発現ベクターを、市販のトランスフェクション試薬と混合し、Sf9を培養したフラスコに一緒に加え、3日間培養した。培養後の細胞を回収し、破砕後、低速遠心と超遠心操作を繰り返すことにより、細胞質画分と膜画分を分離した。膜画分を回収し、市販のプロテインアッセイキットを用いてタンパク質濃度の定量後、匂いセンサ素子として用いた。
2) Preparation of membrane fractions containing insect olfactory receptors using an insect cell expression system A transient expression system of insect cell Sf9 was used to prepare membrane fractions containing insect olfactory receptors. Separate expression vectors incorporating the gene DNA of the olfactory receptor (OR, Olfactory receptor) and co-receptor (Orco, Olfactory receptor co-receptor) that constitute the insect olfactory receptor were mixed with a commercially available transfection reagent, added together to a flask in which Sf9 cells were cultured, and cultured for three days. After culture, the cells were collected and disrupted, and then the cytoplasmic fraction and membrane fraction were separated by repeated low-speed centrifugation and ultracentrifugation. The membrane fraction was collected, and the protein concentration was quantified using a commercially available protein assay kit, after which it was used as an odor sensor element.
１０ ガラス基板
１２ クロム層
１４ 金層（金電極）
１６ チオール基含有化合物の層
１８ 脂質一重膜層
２０ リポソーム
２２ 嗅覚受容体
２２’ 嗅覚受容体のイオンチャンネル
２４ 匂いセンサ素子
２６ 匂い物質（被検物質）
２８ 参照電極
３０ 微少電流計
３２ 間隙
３４ ステンシル治具
３６ 基板
３８ 透孔
４０ 隔壁
４２ 透孔（ネジ貫通用）
４４ 側壁
10 Glass substrate 12 Chromium layer 14 Gold layer (gold electrode)
16 Layer of thiol group-containing compound 18 Lipid monolayer layer 20 Liposome 22 Olfactory receptor 22' Ion channel of olfactory receptor
24 odor sensor element 26 odor substance (test substance)
28 Reference electrode 30 Microcurrent meter 32 Gap
34 stencil jig 36 substrate 38 through hole 40 partition wall 42 through hole (for screw penetration)
44 Side wall
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