JP2024046375A - Antibody solution capable of suppressing non-specific reactions - Google Patents
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Abstract
【課題】免疫測定系での非特異的相互作用を抑制可能な方法を提供する。【解決手段】本発明は、精製工程由来のタンパク質性不純物（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ）を一定量以下にした抗体又は抗体断片を含む抗体溶液を提供する。この抗体溶液を使用することで、免疫学的測定法における非特異的相互作用を抑制することができる。【選択図】なし[Problem] To provide a method capable of suppressing non-specific interactions in an immunoassay system. [Solution] The present invention provides an antibody solution containing an antibody or antibody fragment in which proteinaceous impurities (e.g., Protein A, Protein G, or Protein L) derived from the purification process have been reduced to a certain amount or less. By using this antibody solution, non-specific interactions in immunoassays can be suppressed. [Selected Figure] None
Description
本発明は、抗体又は抗体断片を用いた免疫学的測定系における非特異的相互作用の抑制手法等に関する。 The present invention relates to a method for suppressing non-specific interactions in an immunological measurement system using an antibody or an antibody fragment.
医療現場において、感染症の診断や、疾患マーカーを利用した当該疾患の早期診断などの様々な場面で、抗原抗体反応を利用した簡易かつ迅速な免疫測定法として、ニトロセルロースメンブレン等の試験片を用いたイムノクロマト検出法が広く普及している。イムノクロマト検出法を用いて分析対象物質の量を定量する手法の一つとしては、抗原抗体反応を利用したサンドイッチ法が挙げられる。サンドイッチ法では分析対象物質に対してエピトープの異なる２種類の抗体を利用する。一方の抗体は、金コロイド、着色ラテックス粒子、蛍光粒子等の検出粒子と感作させた検出抗体として使用する。他方の抗体は、多孔質支持体の表面に線状に塗布した捕捉抗体としてテストラインを形成する。測定試料中に含まれる分析対象物質は、多孔質支持体の一端（上流側）から展開し、検出抗体と免疫複合体を形成しながら移動し、テストライン上で捕捉抗体と接触して捕捉され発色する。この発色を目視で判定あるいは光学測定装置を利用して定量することで分析対象物質を検出できる。 In the medical field, immunochromatographic detection methods using test pieces such as nitrocellulose membranes are widely used as simple and rapid immunoassay methods using antigen-antibody reactions in various situations such as diagnosing infectious diseases and early diagnosis of diseases using disease markers. One method for quantifying the amount of an analyte using immunochromatographic detection is the sandwich method using antigen-antibody reactions. In the sandwich method, two types of antibodies with different epitopes for the analyte are used. One antibody is used as a detection antibody sensitized with detection particles such as gold colloid, colored latex particles, and fluorescent particles. The other antibody forms a test line as a capture antibody applied in a line on the surface of a porous support. The analyte contained in the measurement sample develops from one end (upstream side) of the porous support, moves while forming an immune complex with the detection antibody, and comes into contact with the capture antibody on the test line and is captured and colored. The analyte can be detected by visually determining this color or quantifying it using an optical measurement device.
検体中の抗原を高感度に測定する方法であるＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法もまた、免疫検査などにおいて汎用されている手法の１つである。ＥＬＩＳＡには、サンドイッチ法、競合法などが知られている。これらのうち、サンドイッチＥＬＩＳＡは、あらかじめ目的抗原に対する抗体（捕捉抗体）を固定化させた固相表面に、検体を添加して、前記固定化抗体と検体中の抗原との抗原抗体複合体を形成させる。そこへ酵素標識抗体（検出抗体）を添加して、前記抗原抗体複合体に酵素標識抗体を結合させる。ここで余分な酵素標識化抗体を洗浄した後、発色基質を添加すると、試料中の抗原量依存的に発色反応が起こる。生成した発色物質の吸光度を吸光度計などにより測定し、濃度既知の標準品を用いて作成した標準曲線から、試料中の抗原の量を定量することができる。 The ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) method, which is a method for measuring antigens in a specimen with high sensitivity, is also one of the methods widely used in immunological tests and the like. Sandwich method, competitive method, etc. are known for ELISA. Among these, in sandwich ELISA, a sample is added to a solid phase surface on which an antibody (capture antibody) against the target antigen has been immobilized in advance, and an antigen-antibody complex is formed between the immobilized antibody and the antigen in the sample. let An enzyme-labeled antibody (detection antibody) is added thereto to bind the enzyme-labeled antibody to the antigen-antibody complex. After washing away excess enzyme-labeled antibodies, a coloring substrate is added, and a coloring reaction occurs depending on the amount of antigen in the sample. The amount of antigen in the sample can be quantified by measuring the absorbance of the produced coloring substance using an absorbance meter or the like, and from a standard curve created using standard products with known concentrations.
ところで、従来からイムノクロマト検出法やＥＬＩＳＡ法において、ブランク発色が問題となっていた。ブランク発色とは、検体により構成される液相中に分析対象物質が存在しないにもかかわらず、非特異的な反応により発色が生じることをいい、非特異発色とも言われる。ブランク発色は、特にイムノクロマト検出法における目視判定の場合には、誤って陽性と判定してしまう偽陽性の原因となり、正確な診断や治療の妨げとなる。また、光学測定装置による判定の場合には、検出感度、即ち特異的シグナルの検出能を悪化させる原因となるため、問題視されている。 Meanwhile, blank coloring has been a problem in immunochromatographic detection methods and ELISA methods. Blank coloring refers to coloring that occurs due to a nonspecific reaction even though the analyte is not present in the liquid phase constituted by the sample, and is also called nonspecific coloring. Blank coloring can cause false positives, particularly in visual judgments in immunochromatographic detection methods, and can hinder accurate diagnosis and treatment. In addition, in judgments using optical measurement devices, blank coloring can cause a deterioration in detection sensitivity, i.e., the ability to detect specific signals, and is therefore problematic.
特許文献１には、ブランク発色の低減を課題として、イムノクロマト試験片の検出部に還元性を有する単糖類および還元性を有する二糖類を抗体と共に含むことで偽陽性を抑制する手法が記載されている。また、特許文献２には、タンパク質、ポリマー、塩類及びそれらの混合物からなる非特異反応抑制剤が記載されている。特許文献３には、偽陽性を抑制する手段として検体抽出液にブロッキング剤を添加することにより、偽陽性反応を抑制する方法が記載されている。このほかにも、非特異反応に起因するブランク発色を抑制するためにタンパク質や界面活性剤を添加する方法が採られてきた。しかしながら、このような非特異反応抑制剤を添加する方法の場合、ブランク発色が抑制されても、分析対象物質の検出感度も同時に低下してしまうことが多く、未だ十分な対策とはいえなかった。 In Patent Document 1, a method is described in which the detection section of an immunochromatographic test piece contains reducing monosaccharides and reducing disaccharides together with an antibody to suppress false positives, with the aim of reducing blank color development. In addition, Patent Document 2 describes a non-specific reaction inhibitor consisting of proteins, polymers, salts, and mixtures thereof. Patent Document 3 describes a method of suppressing false positives by adding a blocking agent to a specimen extract as a means of suppressing false positives. In addition, a method of adding a protein or a surfactant to suppress blank color development caused by non-specific reactions has been adopted. However, in the case of such a method of adding a non-specific reaction inhibitor, even if blank color development is suppressed, the detection sensitivity of the analyte is often reduced at the same time, and this is still not a sufficient measure.
以上のように、イムノクロマト試験片等の免疫学的測定法に用いるデバイスを構成する部材を工夫したり、検体前処理液等へのブランク発色抑制成分（非特異反応抑制剤）を添加したりすることによる、ブランク発色抑制のための手段は数多く存在するが、免疫学的測定法の主要構成成分である抗体又は抗体断片を含む抗体溶液（抗体原料ともいう）に関する改良はこれまで殆どなされていない。 As mentioned above, it is possible to devise components that make up devices used in immunological assays such as immunochromatography test strips, or to add blank coloration suppressing components (non-specific reaction inhibitors) to sample pretreatment solutions, etc. Although there are many methods for suppressing blank color development, very few improvements have been made to date on antibody solutions (also called antibody raw materials) containing antibodies or antibody fragments, which are the main components of immunoassays. .
本発明が解決しようとする課題は、上記先行技術とは異なるアプローチにより、免疫測定法における非特異反応を抑制する新たな手法を提供することである。特には、非特異反応を抑制して偽陽性を回避でき、より特異性の高い検出を可能にする免疫測定用の抗体又は抗体断片を含む抗体溶液を提供することを目的とする。 The problem that the present invention aims to solve is to provide a new method for suppressing non-specific reactions in immunoassays by an approach different from that of the prior art. In particular, the present invention aims to provide an antibody solution containing an antibody or antibody fragment for immunoassays that can suppress non-specific reactions, avoid false positives, and enable more specific detection.
本発明者らは、上記課題を解決するため、免疫測定法に用いる抗体又は抗体断片を含む抗体溶液中の不純物に着目した。免疫測定法に用いる抗体又は抗体断片は一般に、抗体を産生するハイブリドーマ細胞や抗体又は抗体断片を産生する組換え細胞を培養することによって細胞培養液中又は細胞内に産生される。そして、そのようにして産生した抗体又は抗体断片を含有する培養液又は細胞中を精製することにより、抗体又は抗体断片を含む抗体溶液が調製される。 In order to solve the above problems, the present inventors focused on impurities in an antibody solution containing an antibody or antibody fragment used in an immunoassay. The antibody or antibody fragment used in an immunoassay is generally produced in a cell culture medium or intracellularly by culturing hybridoma cells that produce antibodies or recombinant cells that produce antibodies or antibody fragments. An antibody solution containing an antibody or antibody fragment is then prepared by purifying the culture medium or cells that contain the antibody or antibody fragment produced in this manner.
本発明者らは、この精製工程で生じる不純物のうち、タンパク質性不純物（例えば、精製工程に用いるカラムの担体に担持されたプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ等の漏出物）が一定以上である場合に、非特異反応に基づくブランク発色の問題が大きくなることを初めて特定した。この新たに得られた知見に基づき、更に鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、抗体又は抗体断片を含む抗体溶液中の精製工程由来のタンパク質性不純物（特には、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ）の含量を新たな指標とし、抗体溶液中におけるその含量を一定以下にすることで、非特異反応を高度に抑制し、ブランク発色を大幅に低減できることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have determined that among the impurities generated in this purification process, protein impurities (for example, leakage of protein A, protein G, protein L, etc. supported on the column carrier used in the purification process) are above a certain level. For the first time, we have identified that the problem of blank color development due to non-specific reactions becomes serious in some cases. Based on this newly obtained knowledge, as a result of further intensive studies, the present inventors discovered that proteinaceous impurities (in particular, protein A, protein G) derived from the purification process in antibody solutions containing antibodies or antibody fragments. The inventors have discovered that by using the content of protein L (or protein L) as a new indicator and keeping its content below a certain level in an antibody solution, non-specific reactions can be highly suppressed and blank coloration can be significantly reduced, and the present invention has been completed. reached.
本発明は、代表的には、以下の態様を包含する。
［項１］ 免疫学的測定法に用いられる抗体又はその断片を含む抗体溶液であって、精製工程由来のタンパク質性不純物の含量が０．０００５ｗ／ｖ％以下である、抗体溶液 。
［項２］ 精製工程由来のタンパク質性不純物が、プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載の抗体溶液。
［項３］ 免疫学的測定法において捕捉抗体として用いられる抗体又はその断片を含む抗体溶液である、項１又は２に記載の抗体溶液。
［項４］ 前記タンパク質性不純物の含量が０．０００１ｖ／ｖ％以下である、項３に記載の抗体溶液。
［項５］ 免疫学的測定法において検出抗体として用いられる抗体又はその断片を含む抗体溶液である、項１又は２に記載の抗体溶液。
［項６］ 前記タンパク質性不純物の含量が０．０００４ｖ／ｖ％以下である、項５に記載の抗体溶液。
［項７］ 検体との混合後における前記タンパク質性不純物の含量が、混合液全体に対して ０．００００６５ｗ／ｖ％以下となるように調整して用いられる、項５又は６に記載の抗体溶液。
［項８］ 検体との混合後における前記タンパク質性不純物の含量が、混合液全体に対して０．００００５２ｗ／ｖ％以下となるように調整して用いられる、項５～７のいずれか記載の抗体溶液。
［項９］ 抗体又はその断片が、抗体又はその断片を生産する細胞の培養によって発現された抗体又はその断片である、項１～８のいずれかに記載の抗体溶液。
［項１０］ 抗体又はその断片を生産する細胞が、動物細胞、酵母、カビ、植物細胞、昆虫細胞、藻類、放線菌、細菌、及び古細菌からなる群より選択される少なくとも１種の細胞である、項９に記載の抗体溶液。
［項１１］ 前記動物細胞が、ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、及びＶｅｒｏ細胞からなる群より選択される少なくとも１種である、項１０に記載の抗体溶液。
［項１２］ 前記細菌が、大腸菌及び枯草菌からなる群より選択される少なくとも１種である、項１０に記載の抗体溶液。
［項１３］ 抗体又はその断片が、プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質を不溶性担体に固定化したカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製された抗体又はその断片である、項１～１２のいずれかに記載の抗体溶液。
［項１４］ 免疫学的測定法が、イムノクロマト法、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、化学発光・酵素免疫測定法、放射免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、及びラテックス凝集法からなる群より選択される少なくとも１種の免疫学的測定法である、項１～１３のいずれかに記載の抗体溶液。
［項１５］ 項１～１４のいずれかに記載の抗体溶液を用いることを特徴とする、免疫学的測定法における非特異反応抑制方法。
［項１６］ 項３又は４に記載の抗体溶液を用いて捕捉抗体を調製し、且つ、項５～８のいずれかに記載の抗体溶液を用いて検出抗体を調製することを特徴とする、免疫学的測定法における非特異反応抑制方法。
［項１７］ 免疫学的測定法における非特異反応が抑制された抗体溶液の製造方法であって、
（１）抗体又はその断片を生産する細胞を培養し、該細胞において抗体又はその断片を発現させる工程；
（２）前記工程（１）で発現させた抗体又はその断片を含む細胞又は培養液を回収する工程；
（３）前記工程（２）で回収した細胞又は培養液から、抗体又はその断片を精製する工程であって、プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質を不溶性担体に固定化したカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製する、工程；及び
（４）前記工程（３）の精製により得られた精製液を用いて抗体溶液を調製する工程であって、抗体溶液におけるプロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種の精製工程由来のタンパク質性不純物の含量が０．５ｖ／ｖ％以下となるように調整する、工程、
を包含する、抗体溶液の製造方法。
［項１８］ 前記抗体溶液が、免疫学的測定法において捕捉抗体として用いられる抗体又はその断片を含む抗体溶液であり、且つ、前記工程（４）において、前記精製工程由来のタンパク質性不純物の含量が０．０００１ｗ／ｖ％以下となるように調整する、項１７に記載の製造方法。
［項１９］ 前記抗体溶液が、免疫学的測定法において検出抗体として用いられる抗体又はその断片を含む抗体溶液であり、且つ、前記工程（４）において、前記精製工程由来のタンパク質性不純物の含量が０．０００４ｗ／ｖ％以下となるように調整する、項１７に記載の製造方法。
The present invention typically includes the following aspects.
[Item 1] An antibody solution containing an antibody or a fragment thereof used in an immunoassay, wherein the content of proteinaceous impurities derived from a purification process is 0.0005 w/v% or less.
[Item 2] The antibody solution according to Item 1, wherein the proteinaceous impurity derived from the purification step is at least one selected from the group consisting of Protein A, Protein G, and Protein L.
[Item 3] The antibody solution according to Item 1 or 2, which is an antibody solution containing an antibody or a fragment thereof used as a capture antibody in an immunoassay.
[Item 4] The antibody solution according to Item 3, wherein the content of the proteinaceous impurity is 0.0001 v/v% or less.
[Item 5] The antibody solution according to Item 1 or 2, which is an antibody solution containing an antibody or a fragment thereof used as a detection antibody in an immunoassay.
[Item 6] The antibody solution according to Item 5, wherein the content of the proteinaceous impurity is 0.0004 v/v% or less.
[Item 7] The antibody solution according to Item 5 or 6, which is used after being adjusted so that the content of the proteinaceous impurity after mixing with the specimen is 0.000065 w/v% or less based on the entire mixed solution. .
[Item 8] The method according to any one of Items 5 to 7, which is used after adjusting the content of the proteinaceous impurity after mixing with the specimen to be 0.000052 w/v% or less with respect to the entire mixed liquid. Antibody solution.
[Item 9] The antibody solution according to any one of Items 1 to 8, wherein the antibody or fragment thereof is an antibody or a fragment thereof expressed by culturing cells that produce the antibody or fragment thereof.
[Item 10] The cell producing the antibody or its fragment is at least one type of cell selected from the group consisting of animal cells, yeast, molds, plant cells, insect cells, algae, actinomycetes, bacteria, and archaea. 10. The antibody solution according to item 9.
[Item 11] The antibody solution according to Item 10, wherein the animal cell is at least one selected from the group consisting of hybridoma cells, CHO cells, HEK cells, MDCK cells, and Vero cells.
[Item 12] The antibody solution according to Item 10, wherein the bacterium is at least one selected from the group consisting of E. coli and Bacillus subtilis.
[Item 13] An antibody or a fragment thereof purified by affinity chromatography using a column in which at least one protein selected from the group consisting of protein A, protein G, and protein L is immobilized on an insoluble carrier. Item 13. The antibody solution according to any one of Items 1 to 12, which is a fragment thereof.
[Section 14] Immunological assays include immunochromatography, enzyme immunoassays, chemiluminescence immunoassays, chemiluminescence/enzyme immunoassays, radioimmunoassays, electrochemiluminescence immunoassays, and latex agglutination assays. Item 14. The antibody solution according to any one of Items 1 to 13, which is at least one immunoassay method selected from the group consisting of:
[Item 15] A method for suppressing a non-specific reaction in an immunoassay, characterized by using the antibody solution according to any one of Items 1 to 14.
[Item 16] A capture antibody is prepared using the antibody solution according to Item 3 or 4, and a detection antibody is prepared using the antibody solution according to any one of Items 5 to 8. Method for suppressing non-specific reactions in immunoassays.
[Section 17] A method for producing an antibody solution in which non-specific reactions in an immunoassay are suppressed, comprising:
(1) A step of culturing cells that produce antibodies or fragments thereof and expressing the antibodies or fragments thereof in the cells;
(2) collecting cells or culture medium containing the antibody or fragment thereof expressed in step (1);
(3) A step of purifying an antibody or a fragment thereof from the cells or culture medium collected in step (2), the step of purifying at least one protein selected from the group consisting of protein A, protein G, and protein L. a step of purifying the antibody by affinity chromatography using a column immobilized on an insoluble carrier; and (4) a step of preparing an antibody solution using the purified solution obtained in the purification of step (3), A step of adjusting the content of proteinaceous impurities derived from at least one purification process selected from the group consisting of Protein A, Protein G, and Protein L in the solution to be 0.5 v/v % or less;
A method for producing an antibody solution, comprising:
[Section 18] The antibody solution is an antibody solution containing an antibody or a fragment thereof used as a capture antibody in an immunoassay, and in the step (4), the content of proteinaceous impurities derived from the purification step is reduced. Item 18. The manufacturing method according to item 17, wherein the amount is adjusted to be 0.0001 w/v% or less.
[Item 19] The antibody solution is an antibody solution containing an antibody or a fragment thereof used as a detection antibody in an immunoassay, and in the step (4), the content of proteinaceous impurities derived from the purification step is reduced. Item 18. The manufacturing method according to item 17, wherein the amount is adjusted to be 0.0004 w/v% or less.
本発明によれば、免疫学的測定法において非特異反応を抑制可能な抗体又は抗体断片を含む抗体溶液を提供することが可能になる。また、当該抗体又は抗体断片を含む抗体溶液は、診断薬、研究試薬などの種々の免疫学的測定用途に好適に利用することができる。 According to the present invention, it is possible to provide an antibody solution containing an antibody or an antibody fragment capable of suppressing non-specific reactions in immunological assays. Furthermore, the antibody solution containing the antibody or the antibody fragment can be suitably used for various immunological assay applications such as diagnostic agents and research reagents.
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。 Hereinafter, the present invention will be explained in further detail while showing embodiments of the present invention.
一つの実施形態において、本発明は、精製工程由来のタンパク質性不純物の含量が０．０００５ｗ／ｖ％以下であることを特徴とする、免疫学的測定法に用いられる抗体又はその断片を含む抗体溶液を提供する。ここで、前記タンパク質性不純物の含量は、抗体溶液全体を１００とした場合における百分率（ｗ／ｖ％）で示される。
本発明は、精製工程を経た抗体又はその断片であっても、その精製工程に由来する特定の不純物の存在によって、当該抗体又はその断片を免疫学的測定法に使用した場合に非特異反応が生じてしまうという新たな知見に基づき、その特定の不純物の含量を一定以下に調整すればよいことを見出したことに一つの特徴がある。
In one embodiment, the present invention provides an antibody solution containing an antibody or a fragment thereof for use in an immunoassay, characterized in that the content of proteinaceous impurities derived from a purification step is 0.0005 w/v % or less, wherein the content of the proteinaceous impurities is expressed as a percentage (w/v %) when the entire antibody solution is taken as 100.
One of the features of the present invention is that it has been found that even if an antibody or a fragment thereof has been subjected to a purification process, the presence of specific impurities derived from the purification process can cause non-specific reactions when the antibody or a fragment thereof is used in an immunological assay, and that this can be achieved by simply adjusting the content of the specific impurities to a certain level or below.
本明細書において、抗体又は抗体断片は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。また、前記抗体は、全長抗体であってもよく、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｄＡｂ－Ｆｃなどの抗体断片であってもよい。これらの中でも前記抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。 In this specification, an antibody or an antibody fragment is used in the broadest sense and may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. The antibody may be a full-length antibody or an antibody fragment such as scFv-Fc or dAb-Fc. Of these, it is preferable that the antibody is a monoclonal antibody.
モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、通常はただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一であるものをいう。 A monoclonal antibody is an antibody secreted by a single clone of an antibody-producing cell, which usually recognizes only one epitope (also called an antigenic determinant) and has a uniform amino acid sequence (primary structure) that constitutes the monoclonal antibody.
抗体又はその断片ははいかなる方法で製造されたものでもよい。一つの例として、モノクローナル抗体は、例えば、抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体であってもよい。 Antibodies or fragments thereof may be produced by any method. As one example, a monoclonal antibody may be a recombinant antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene.
モノクローナル抗体は、例えば、哺乳類の脾臓細胞とミエローマ細胞を細胞融合させるハイブリドーマ法、抗体ファージライブラリーから標的分子に対して親和性を有する抗体を選択するファージディスプレイ法等でも作製することができ、免疫動物から抗原特異的形質細胞を選別し、抗体遺伝子（全長又は可変領域等の一部）を単離して、抗原に親和性の高い組換え抗体を取得する方法によっても作製できる。 Monoclonal antibodies can be produced, for example, by the hybridoma method, in which mammalian spleen cells are fused with myeloma cells, or by the phage display method, in which antibodies with affinity for a target molecule are selected from an antibody phage library. They can also be produced by selecting antigen-specific plasma cells from an immunized animal, isolating the antibody gene (full length or a part of the variable region, etc.), and obtaining a recombinant antibody with high affinity for the antigen.
抗体を取得する免疫動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒト、ヒツジ、ウシ、イヌ、ロバ、ニワトリ、ネコ、ハムスター、サル、ブタ、ウマ、モルモット、サメなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。又はファージディスプレイなどの遺伝子工学的手法によって取得される抗体であってもよい。 Examples of immunized animals to obtain antibodies include mice, rats, rabbits, goats, humans, sheep, cows, dogs, donkeys, chickens, cats, hamsters, monkeys, pigs, horses, guinea pigs, sharks, etc. It is not limited to these. Alternatively, it may be an antibody obtained by genetic engineering techniques such as phage display.
抗原特異的形質細胞を選別する方法としては、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３１５２８号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法、及び米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法が挙げられる。 Methods for selecting antigen-specific plasma cells include, for example, the method described in US Patent Application Publication No. 2014/031528 (which is incorporated herein by reference in its entirety) and US Patent Application Publication No. 2018/ No. 292,407 (which is incorporated by reference in its entirety).
抗原特異的形質細胞から抗体遺伝子を取得する方法としては、例えば、ハイブリドーマ法、抗体遺伝子のクローニング等が挙げられるが、これらに限定されない。後者の方法としては、例えば、抗原特異的形質細胞からｍＲＮＡを抽出して逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成することで抗体遺伝子を取得する方法等が挙げられ、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２０８７９号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法であってもよい。当該方法は、磁気ビーズを用いて抗原特異的形質細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲにより抗体遺伝子を取得する方法であり、任意に洗浄工程を含む、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、ＤＮＡの増幅等の複数の逐次反応を並列的に実施できる反応治具を利用する方法である。 Examples of methods for obtaining antibody genes from antigen-specific plasma cells include, but are not limited to, hybridoma methods and antibody gene cloning. Examples of the latter method include a method in which an antibody gene is obtained by extracting mRNA from antigen-specific plasma cells, performing reverse transcription, and synthesizing cDNA. No. 020879 (which is incorporated by reference in its entirety). This method involves extracting mRNA from antigen-specific plasma cells using magnetic beads and obtaining antibody genes by RT-PCR, optionally including a washing step, cDNA synthesis from mRNA, DNA amplification, etc. This method uses a reaction jig that can perform multiple sequential reactions in parallel.
抗体遺伝子から組換え抗体を取得する方法は、例えば、抗体遺伝子を含む抗体発現ベクターを作製し、この抗体発現ベクターから抗体を発現させる方法であってもよい。当該方法としては、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２３００９号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法、及び米国特許出願公開第２０１１／１１７６０９号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法等が挙げられる。前者の方法では、標的遺伝子配列を含むＰＣＲ増幅産物に一つ以上の二本鎖ＤＮＡ断片を連結させることで、前記ＰＣＲ増幅産物を精製することなく、目的とする標的遺伝子に由来する配列を含む連結ＤＮＡ断片を特異的に作製できる。後者の方法では、線状化されたベクターの両端の相同組換え領域に、増幅用プライマーと標的遺伝子のみに存在する増幅用プライマー配列の内側の配列を保持させることで、標的ＤＮＡ断片を選択的に相同組換えしてベクターを構築できる。 A method for obtaining a recombinant antibody from an antibody gene may be, for example, a method for producing an antibody expression vector containing an antibody gene and expressing an antibody from this antibody expression vector. Examples of such a method include the method described in U.S. Patent Application Publication No. 2013/023009 (incorporated in its entirety by reference) and the method described in U.S. Patent Application Publication No. 2011/117609 (incorporated in its entirety by reference). In the former method, one or more double-stranded DNA fragments are ligated to a PCR amplification product containing a target gene sequence, thereby specifically producing a ligated DNA fragment containing a sequence derived from the target gene of interest without purifying the PCR amplification product. In the latter method, a vector can be constructed by selectively homologously recombining the target DNA fragment by retaining the sequence inside the amplification primer sequence present only in the amplification primer and the target gene in the homologous recombination regions at both ends of a linearized vector.
抗体又はその断片は、上記の方法によって取得した抗体又はその断片のアミノ酸配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により得ることもできる。例えば、軽鎖ＣＤＲ１～３が上記の方法によって取得した抗体の軽鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列に対してそれぞれ８０％以上の同一性を有し、且つ、重鎖ＣＤＲ１～３が上記の方法によって取得した抗体の重鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列に対してそれぞれ８０％以上の同一性を有するように設計した抗体遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、当該分野で公知の任意の宿主細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、又はＶｅｒｏ細胞等の動物細胞；酵母；カビ；植物細胞；昆虫細胞；藻類；放線菌；大腸菌又は枯草菌等の細菌；古細菌等の宿主細胞）で発現させること等によっても取得することができる。 Antibodies or fragments thereof can also be obtained by genetic engineering techniques based on the amino acid sequence information of antibodies or fragments thereof obtained by the above method. For example, the light chain CDRs 1 to 3 each have 80% or more identity to the amino acid sequence of the light chain CDRs 1 to 3 of the antibody obtained by the above method, and the heavy chain CDRs 1 to 3 have each obtained by the above method. An expression vector incorporating an antibody gene designed to have 80% or more identity to each of the amino acid sequences of heavy chain CDRs 1 to 3 of the obtained antibody is inserted into any host cell known in the art (for example, a hybridoma). host cells such as yeast; fungi; plant cells; insect cells; algae; actinomycetes; bacteria such as Escherichia coli or Bacillus subtilis; and archaea). It can also be obtained by expressing it.
さらに、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、人為的に改変されたキメラ抗体であってもよい。抗体がモノクローナル抗体である場合は、該重鎖定常領域は天然に存在する重鎖定常領域において１個以上のアミノ酸が欠失、付加、置換、及び／又は挿入されたモノクローナル抗体も、本発明の抗体に包含される。１個以上のアミノ酸が欠失、付加、置換、及び／又は挿入されたモノクローナル抗体は、例えば、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）］などの周知の技術により作製できる。欠失、付加、置換、及び／又は挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、１～数十個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個（例えば、１個、２個、３個、４個、又は５個）である。 Furthermore, the monoclonal antibody is not limited to a monoclonal antibody produced by a hybridoma, but may be an artificially modified chimeric antibody. When the antibody is a monoclonal antibody, the antibody of the present invention also includes a monoclonal antibody in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, and/or inserted in the heavy chain constant region of a naturally occurring heavy chain constant region. Monoclonal antibodies in which one or more amino acids have been deleted, added, substituted, and/or inserted can be produced by, for example, site-directed mutagenesis [Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)]. The number of amino acids to be deleted, added, substituted, and/or inserted is not particularly limited, but is 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 5 (e.g., 1, 2, 3, 4, or 5).
本発明に使用される抗体又はその断片は、上記のようにして発現させて産生した抗体又はその断片を精製して得られた抗体又はその断片であり得る。抗体又はその断片の精製方法としては、特に限定されず、当該分野で公知の任意の精製方法が実施され得る。抗体又はその断片の精製方法では、タンパク質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、レクチン等のタンパク質）を利用したアフィニティクロマトグラフィー等の方法により精製する方法等が一般に知られているが、本発明によれば、このようなタンパク質を利用する方法で精製された抗体又はその断片において特に好適に実施され得る。なかでも、プロテインＡ、プロテインＧ、及び／又はプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質を不溶性担体に固定化したカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製した抗体又はその断片から免疫学的測定法に用いられる抗体溶液を調製するのに本発明は適しており、特にプロテインＡを利用したアフィニティクロマトグラフィーにより精製した抗体又はその断片から免疫学的測定法に用いられる抗体溶液を調製するのに本発明は好適である。 The antibody or fragment thereof used in the present invention may be an antibody or a fragment thereof obtained by purifying the antibody or fragment thereof expressed and produced as described above. The method for purifying antibodies or fragments thereof is not particularly limited, and any purification method known in the art may be performed. Generally known methods for purifying antibodies or fragments thereof include methods such as affinity chromatography using proteins (e.g., proteins such as protein A, protein G, protein L, and lectin); According to the invention, the method can be carried out particularly preferably on antibodies or fragments thereof purified by a method using such a protein. Among them, immunological immunological The present invention is suitable for preparing antibody solutions used in assay methods, and is particularly suitable for preparing antibody solutions used in immunoassay methods from antibodies or fragments thereof purified by affinity chromatography using protein A. The present invention is suitable for this purpose.
本明細書において、精製工程由来のタンパク質性不純物とは、上記のような抗体又はその断片の精製工程で生じ、当該抗体又はその断片から抗体溶液の調製において不純物として混入し得る任意のタンパク質性の物質を意味する。例えば、精製工程由来のタンパク質性不純物は、抗体又はその断片の精製工程で用いられるアフィニティクロマトグラフィーにおいてカラムに固定化された抗体又はその断片と親和性を有するタンパク質の漏出物等であり得る。このような精製工程で用いられるタンパク質としては、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、及び／又はプロテインＬ等が挙げられるが、これらに限定されない。プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬとは、抗体又は抗体断片に対して特異的に吸着する性質を有することが公知の高分子タンパク質である。プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬを不溶性担体に固定化させ、当該不溶性担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより抗体又は抗体断片を特異的に分離精製する手法が広く使用されている。プロテインＡは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）に由来する細胞表面タンパク質であり、哺乳動物の抗体、特にＩｇＧのＦｃ領域と結合する性質を有する。特にモノクローナルＩｇＧ抗体精製のためのその使用は公知の技術である。プロテインＡを担持させたアフィニティーカラムは、繰り返し使用することによってカラムからプロテインＡやその断片が漏出することがある。不幸にも、プロテインＡ又はプロテインＡ断片はＩｇＧと高い親和性を保つが故に、精製抗体からの除去は容易ではない。プロテインＡは細菌性タンパク質であり、不必要な免疫反応を誘発する為、抗体医薬品ではその除去は必須である。しかし、人体又は被検動物に投与することを意図していない免疫学的測定法に用いる抗体溶液の場合は、身体内での免疫反応の副作用が問題にはならないため、これまでにその除去は特に必要とはされておらず、コスト面の問題もあり通常は除去は行われていない。ＩｇＧ定常領域と結合するプロテインＧ（Ｂｊｏｒｃｋ ａｎｄ Ｋｒｏｎｖａｌｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：９６９（１９８４））やＩｇＧ可変領域軽鎖ドメインと結合するプロテインＬ（Ｂｊｏｒｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：１１９４（１９８８））もまた、抗体又は抗体断片精製を目的としたアフィニティークロマトグラフィーの為に好適に用いられ得るが、同様に精製抗体又は抗体断片を含む抗体溶液中にこれらリガンドが残留する可能性がある。 In this specification, the proteinaceous impurities derived from the purification process refer to any proteinaceous substance that is generated in the purification process of an antibody or a fragment thereof as described above and that may be mixed as an impurity in the preparation of an antibody solution from the antibody or a fragment thereof. For example, the proteinaceous impurities derived from the purification process may be a leaked protein having affinity with the antibody or a fragment thereof immobilized on a column in affinity chromatography used in the purification process of an antibody or a fragment thereof. Examples of proteins used in such purification processes include, but are not limited to, protein A, protein G, and/or protein L. Protein A, protein G, or protein L are high molecular weight proteins known to have the property of specifically adsorbing to antibodies or antibody fragments. A method is widely used in which protein A, protein G, or protein L is immobilized on an insoluble carrier and the antibody or antibody fragment is specifically separated and purified by affinity chromatography using the insoluble carrier. Protein A is a cell surface protein derived from Staphylococcus aureus and has the property of binding to mammalian antibodies, particularly the Fc region of IgG. Its use, in particular, for the purification of monoclonal IgG antibodies is a known technique. Protein A-loaded affinity columns can leak protein A or its fragments from the column after repeated use. Unfortunately, protein A or protein A fragments have a high affinity for IgG, making them difficult to remove from purified antibodies. Protein A is a bacterial protein that induces unnecessary immune responses, so its removal is essential for antibody pharmaceuticals. However, in the case of antibody solutions used in immunological assays that are not intended to be administered to humans or test animals, its removal has not been particularly required so far, since side effects of immune responses in the body are not an issue, and removal is not usually performed due to cost issues. Protein G, which binds to the IgG constant region (Bjorck and Kronvall, J. Immunol., 133:969 (1984)), and Protein L, which binds to the IgG variable region light chain domain (Bjorck, J. Immunol., 140:1194 (1988)), can also be suitably used for affinity chromatography for the purpose of purifying antibodies or antibody fragments, but these ligands may remain in the antibody solution containing the purified antibody or antibody fragment.
本発明において一定量以下に調整する精製工程由来のタンパク質性不純物としては、特に限定されないが、より効果的に非特異反応を抑制できるという観点から、好ましくは、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質性不純物であり、より好ましくはプロテインＡである。プロテインＡ、プロテインＧ、又はプロテインＬは、これらを産生させる微生物の培養物から直接的に単離されたものでもよいし、あるいは大腸菌等の微生物宿主を利用して、組換え的に発現させたものでもよい。 In the present invention, the proteinaceous impurities derived from the purification process that are adjusted to a certain amount or less are not particularly limited, but from the viewpoint of more effectively suppressing non-specific reactions, it is preferably at least one proteinaceous impurity selected from the group consisting of protein A, protein G, and protein L, and more preferably protein A. Protein A, protein G, or protein L may be directly isolated from a culture of a microorganism that produces them, or may be recombinantly expressed using a microbial host such as Escherichia coli.
本発明の抗体又は抗体断片を含む抗体溶液の調製では、どのような手段で精製工程由来のタンパク質性不純物の含量を低減させてもよい。抗体又は抗体断片を精製する工程にて、タンパク質性の不純物（特に、プロテインＡ、プロテインＧ及び／又はプロテインＬ）を漏出し難いことが公知のカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、マルチモーダル樹脂によるクロマトグラフィーを選択して抗体又はその断片の精製を行うことでタンパク質性不純物の含量を調整することもできる。一実施形態において、プロテインＡ、プロテインＧ及び／又はプロテインＬを用いたアフィニティークロマトグラフィーで得られた抗体又は抗体断片を含む抗体溶液を更に陽イオン交換クロマトグラフィーで処理し、当該抗体溶液に残存するプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬを除去することでこれらのタンパク質性不純物の含量を一定量以下に調整してもよい。陽イオン交換クロマトグラフィーでプロテインＡ、プロテインＧ及び／又はプロテインＬを除去する方法は、当該分野で公知の方法により行うことができ、例えば、Ｃｙｔｉｖａ社製のＳＰカラムを利用して、プロテインＡがＳＰカラムに結合しないｐＨ５．２のバッファーでプロテインＡを含む抗体溶液をＳＰカラムに通して抗体のみを吸着させ、塩強度を上げることでＳＰカラムから抗体を溶出させる陽イオンクロマトグラフィーを行うことで、プロテインＡ、プロテインＧ、及び／又はプロテインＬを効果的に除去することが可能である。
また、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬの分子量はそれぞれ、約４７ｋＤａ、約２２ｋＤａ及び約３６ｋＤａであることから、これらの分子量サイズよりも大きな分画分子量（公称分画分子量）の孔径をもつ限外ろ過膜、例えば、５０ｋＤａ以上の公称分画分子量をもつ限外ろ過膜を使用してこれらのタンパク質性不純物の含量を低減することも可能である。
或いは、Ｃｙｔｉｖａ社製のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００等を利用して、ゲルろ過クロマトグラフィーによって抗体とプロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬの含量を低減することも可能である。
さらに、精製溶液中の抗体又はその断片量が高濃度で充分量あれば、単にその精製溶液を任意の溶媒（例えば、水又は緩衝剤等）で希釈することによって、これらのタンパク質性不純物の含量を一定以下になるように調整してもよい。
In preparing antibody solutions containing antibodies or antibody fragments of the invention, the content of proteinaceous impurities from the purification process may be reduced by any means. In the process of purifying antibodies or antibody fragments, affinity chromatography and cation exchange chromatography using columns known to be difficult to leak proteinaceous impurities (especially protein A, protein G and/or protein L) , anion chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxyapatite gel chromatography, gel filtration chromatography, and multimodal resin chromatography to purify the antibody or its fragment to adjust the content of proteinaceous impurities. You can also. In one embodiment, an antibody solution containing antibodies or antibody fragments obtained by affinity chromatography with Protein A, Protein G and/or Protein L is further treated with cation exchange chromatography, and the remaining antibodies in the antibody solution are further treated with cation exchange chromatography. By removing Protein A, Protein G, or Protein L, the content of these proteinaceous impurities may be adjusted to a certain amount or less. Protein A, Protein G and/or Protein L can be removed by cation exchange chromatography using a method known in the art. By passing an antibody solution containing protein A through the SP column in a pH 5.2 buffer that does not bind to the SP column, only the antibody is adsorbed, and by performing cation chromatography, the antibody is eluted from the SP column by increasing the salt strength. , Protein A, Protein G, and/or Protein L can be effectively removed.
In addition, since the molecular weights of Protein A, Protein G, and Protein L are approximately 47 kDa, approximately 22 kDa, and approximately 36 kDa, respectively, ultraviolet rays with a pore size of a molecular weight cutoff (nominal molecular weight cutoff) larger than these molecular weight sizes are It is also possible to reduce the content of these proteinaceous impurities using filtration membranes, for example ultrafiltration membranes with a nominal molecular weight cut-off of 50 kDa or more.
Alternatively, it is also possible to reduce the content of the antibody and protein A, protein G, and protein L by gel filtration chromatography using Cytiva's Superdex 200 or the like.
Additionally, if the amount of antibody or its fragments in the purified solution is high and sufficient, the content of these proteinaceous impurities can be reduced by simply diluting the purified solution with any solvent (e.g., water or buffer). may be adjusted so that it is below a certain level.
本発明の免疫学的測定法に用いられる抗体溶液は、上記のようにして得られた抗体又はその断片を任意の溶媒（例えば、水、緩衝剤等）に溶解又は懸濁した形態等であり得る。例えば、本発明の免疫学的測定法に用いられる抗体溶液は、上記のような精製工程により得た抗体又はその断片を含む溶液そのものであってもよいし、当該溶液に適当な溶媒を添加したもの、又は当該溶液を濃縮又は凍結乾燥させたものに適当な溶媒を添加したもの等であってもよい。本発明の抗体溶液はまた、上記のような溶媒及び抗体又はその断片以外にも、他の任意成分（例えば、界面活性剤、調整剤、防腐剤、安定化剤、凝集抑制剤等）の成分を含んでいてもよい。 The antibody solution used in the immunoassay method of the present invention is a form in which the antibody or fragment thereof obtained as described above is dissolved or suspended in any solvent (e.g., water, buffer, etc.). obtain. For example, the antibody solution used in the immunoassay method of the present invention may be a solution itself containing the antibody or its fragment obtained through the purification process as described above, or may be a solution containing an appropriate solvent added to the solution. Alternatively, the solution may be concentrated or freeze-dried and a suitable solvent may be added. In addition to the above-mentioned solvent and antibody or fragment thereof, the antibody solution of the present invention may also contain other optional components (e.g., surfactants, modifiers, preservatives, stabilizers, aggregation inhibitors, etc.). May contain.
緩衝剤は、本発明の効果を阻害しない限り特に限定されず、当該分野で公知の任意の緩衝剤を使用することができる。好適には、緩衝剤は、リン酸、コハク酸、グリシン、ヒスチジン、クエン酸、マレイン酸、グリシン、ヒスチジン、トリス、２，４，６－トリクロロフェノール、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、酢酸、３，３－ジメチルグルタル酸、カコジル酸、イミダゾール、コリジン、ジメチルアミノエチルアミン、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ビストリスプロパン、エチレンジアミン、ＡＣＥＳ（Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸）、アルセニック酸、クロラミンクロライド、ｐ－ニトロフェノール、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、及びそれらの組合せからなる群から選択される。また、緩衝剤は、適宜塩の形で水溶液に添加することもできる。例えば、リン酸の塩としては、リン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）、リン酸水素カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、並びにこれらの混合物などが挙げられる。 The buffer is not particularly limited as long as it does not inhibit the effects of the present invention, and any buffer known in the art can be used. Preferably, the buffer is selected from the group consisting of phosphoric acid, succinic acid, glycine, histidine, citric acid, maleic acid, glycine, histidine, tris, 2,4,6-trichlorophenol, MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), acetic acid, 3,3-dimethylglutaric acid, cacodylic acid, imidazole, collidine, dimethylaminoethylamine, PIPES (piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)), bis-trispropane, ethylenediamine, ACES (N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid), arsenic acid, chloramine chloride, p-nitrophenol, BES (N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid), MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), and combinations thereof. The buffer may also be added to the aqueous solution in the form of a suitable salt, for example, a salt of phosphoric acid may be sodium phosphate (Na 3 PO 4 ), sodium hydrogen phosphate (Na 2 HPO 4 ), sodium dihydrogen phosphate (NaH 2 PO 4 ), potassium phosphate (K 3 PO 4 ), potassium hydrogen phosphate (K 2 HPO 4 ), potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ), or a mixture thereof.
抗体溶液中における精製工程由来のタンパク質性不純物（特に、プロテインＡ、プロテインＧ及び／又はプロテインＬ）の含量は、当業者に公知の任意の方法で測定することができる。より具体的には、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ及び／又はプロテインＬを定量できる市販の定量キットにより測定することが可能である。このような市販の定量キットとして例えば、Ｃｙｇｎｕｓ社のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ （Ｆ４００）などが例示されるが、これらに限定されるものではない。 The content of protein impurities (particularly Protein A, Protein G and/or Protein L) derived from the purification process in the antibody solution can be measured by any method known to those skilled in the art. More specifically, for example, it can be measured using a commercially available quantification kit that can quantify Protein A, Protein G and/or Protein L. Examples of such commercially available quantification kits include, but are not limited to, Cygnus Protein A ELISA Kit (F400).
一つの実施形態において、本発明の免疫学的測定法に用いられる抗体又はその断片を含む抗体溶液における精製工程由来のタンパク質性不純物の含量は、当該抗体溶液全体に対して０．０００５ｗ／ｖ％以下であり得る。特に、免疫学的測定法における非特異反応を抑制できる効果が高いという観点から、好ましくは、抗体溶液全体に対するプロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種の精製工程由来タンパク質性不純物の含量が、抗体溶液全体に対して０．０００５ｗ／ｖ％以下であることが好ましく、０．０００４ｗ／ｖ％以下であることがより好ましく、０．０００１ｗ／ｖ％以下であることが更に好ましい。とりわけ、抗体溶液全体に対するプロテインＡの含量が、抗体溶液全体に対して０．０００５ｗ／ｖ％以下であることが好ましく、０．０００４ｗ／ｖ％以下であることがより好ましく、０．０００１ｗ／ｖ％以下であることが更に好ましい。このような抗体溶液とすることにより、免疫学的測定法に用いられた場合に、偽陽性の原因となり得る非特異反応に基づく反射吸光度の値を小さくすることができ、更にはブランク発色強度も抑えることが可能となり得る。本発明の抗体溶液における精製工程由来のタンパク質性不純物の含量の下限値は特に限定されないが、例えば、０．００００１ｗ／ｖ％以上であり得る。また、抗体溶液中に前記タンパク質性不純物を実質的に含まないように調整してもよいし（例えば、０．００００１ｗ／ｖ％未満）又は全く含まないようにしてもよい。 In one embodiment, the content of proteinaceous impurities derived from the purification process in the antibody solution containing the antibody or fragment thereof used in the immunoassay method of the present invention is 0.0005 w/v% based on the entire antibody solution. It can be: In particular, from the viewpoint of being highly effective in suppressing non-specific reactions in immunoassays, preferably at least one purification process source selected from the group consisting of Protein A, Protein G, and Protein L for the entire antibody solution is used. The content of proteinaceous impurities is preferably 0.0005 w/v% or less, more preferably 0.0004 w/v% or less, and 0.0001 w/v% or less based on the entire antibody solution. is even more preferable. In particular, the content of protein A in the entire antibody solution is preferably 0.0005 w/v% or less, more preferably 0.0004 w/v% or less, and 0.0001 w/v % or less is more preferable. By using such an antibody solution, when used in an immunoassay, it is possible to reduce the value of reflected absorbance based on non-specific reactions that can cause false positives, and furthermore, the blank color intensity can be reduced. It may be possible to suppress it. The lower limit of the content of proteinaceous impurities derived from the purification process in the antibody solution of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, 0.00001 w/v% or more. Further, the antibody solution may be adjusted so as to be substantially free of the proteinaceous impurities (for example, less than 0.00001 w/v%) or may be completely free of the proteinaceous impurities.
より具体的には、本発明の抗体溶液に含まれる抗体又はその断片を免疫学的測定法において捕捉抗体（固相化抗体などとも呼ばれる）として使用する場合には、後述の試験例の結果に示されるように当該抗体溶液に含まれる精製工程由来のタンパク質性不純物の影響を受け易いことが分かっているため、抗体溶液中における当該タンパク質性不純物（特には、プロテインＡ、プロテインＧ、及び／又はプロテインＬ；なかでも、プロテインＡ）の含量が特に少ないことが好ましい。この観点から、例えば、免疫学的測定法における捕捉抗体として用いられる抗体又はその断片を含む抗体溶液の場合は、当該抗体溶液中における精製工程由来のタンパク質性不純物の含量は、０．０００１ｗ／ｖ％以下であることが好ましく、例えば、０．００００１ｗ／ｖ％以下、又は０．０００００１ｗ／ｖ％以下であってもよく、また精製工程由来のタンパク質性不純物を実質的に含まないように調製されていてもよいし又は全く含まないようにしてもよい。 More specifically, when the antibody or a fragment thereof contained in the antibody solution of the present invention is used as a capture antibody (also called a solid-phase antibody, etc.) in an immunoassay, it is known that the antibody solution is easily affected by protein impurities derived from the purification process, as shown in the results of the test example described below, and therefore it is preferable that the content of the protein impurities (particularly protein A, protein G, and/or protein L; especially protein A) in the antibody solution is particularly low. From this viewpoint, for example, in the case of an antibody solution containing an antibody or a fragment thereof used as a capture antibody in an immunoassay, the content of protein impurities derived from the purification process in the antibody solution is preferably 0.0001 w/v% or less, and may be, for example, 0.00001 w/v% or less, or 0.000001 w/v% or less, and may be prepared so as to be substantially free of protein impurities derived from the purification process, or may be completely free of protein impurities.
更に別の具体例として、本発明の抗体溶液に含まれる抗体又はその断片を免疫学的測定法において検出抗体（標識抗体などとも呼ばれる）として使用する場合には、後述の試験例の結果に示されるように当該抗体溶液に含まれる精製工程由来のタンパク質性不純物の含量は多少存在してもブランク発色は抑えられることが確認できている。また、検出抗体は捕捉抗体と異なり、検体（例えば、検体保存液又は検体希釈液等に溶解又は懸濁されている検体を含む）との混合により抗原抗体反応時に希釈され得る場合もあるため、捕捉抗体として用いられる場合よりも精製工程由来のタンパク質性不純物の含量が高くてもよい場合があり得る。従って、例えば、免疫学的測定法における検出抗体として用いられる抗体又はその断片を含む抗体溶液の場合は、当該抗体溶液中における精製工程由来のタンパク質性不純物（特には、プロテインＡ、プロテインＧ、及び／又はプロテインＬ；なかでも、プロテインＡ）の含量は、０．０００４ｗ／ｖ％以下であってもよく、例えば、０．０００３ｗ／ｖ％以下、０．０００２ｗ／ｖ％以下、０．０００１ｗ／ｖ％以下、０．００００１ｗ／ｖ％以下、又は０．０００００１ｗ／ｖ％以下であってもよく、また精製工程由来のタンパク質性不純物を実質的に含まないように調製されていてもよいし又は全く含まないようにしてもよい。 As another specific example, when the antibody or its fragment contained in the antibody solution of the present invention is used as a detection antibody (also called a labeled antibody, etc.) in an immunoassay method, As shown, it has been confirmed that blank color development can be suppressed even if there is a certain amount of proteinaceous impurities derived from the purification process contained in the antibody solution. Furthermore, unlike capture antibodies, detection antibodies may be diluted during antigen-antibody reactions by mixing with specimens (including specimens dissolved or suspended in specimen preservation solutions or specimen dilution solutions, etc.). There may be cases where a higher content of proteinaceous impurities from the purification process is acceptable than when used as a capture antibody. Therefore, for example, in the case of an antibody solution containing an antibody or a fragment thereof used as a detection antibody in an immunoassay, proteinaceous impurities (particularly protein A, protein G, and / or protein L; in particular, the content of protein A) may be 0.0004 w/v% or less, for example, 0.0003 w/v% or less, 0.0002 w/v% or less, 0.0001 w/v% or less. v% or less, 0.00001 w/v% or less, or 0.000001 w/v% or less, and may be prepared so as to be substantially free of proteinaceous impurities derived from the purification process, or It may not be included at all.
一つの好ましい実施形態において、本発明の抗体溶液に含まれる抗体又はその断片を免疫学的測定法において検出抗体として使用する場合、検体（例えば、検体保存液又は検体希釈液等に溶解又は懸濁されている検体を含む）との混合後の混合液中における精製工程由来のタンパク質性不純物（特には、プロテインＡ、プロテインＧ、及び／又はプロテインＬ；なかでも、プロテインＡ）の含量が０．００００６５ｗ／ｖ％以下となるように調整されていることが好ましい。このような濃度になるように調整して用いられることにより、より一層高度に非特異反応を抑えることができる。更には、前記のような検体との混合液中の精製工程由来のタンパク質性不純物の含量が０．００００５２ｗ／ｖ％以下となるように調整されていることが好ましく、例えば、０．００００３９ｗ／ｖ％以下、０．００００２６ｗ／ｖ％、０．００００１３ｗ／ｖ％以下、０．０００００１３ｗ／ｖ％以下、又は０．００００００１３ｗ／ｖ％以下となるように調整されていることがより好ましく、また検体との混合液に精製工程由来のタンパク質性不純物を実質的に含まないように調製されていてもよいし又は全く含まないようにしてもよい。 In one preferred embodiment, when the antibody or fragment thereof contained in the antibody solution of the present invention is used as a detection antibody in an immunoassay method, it is preferable that the antibody or fragment thereof contained in the antibody solution of the present invention is The content of proteinaceous impurities (particularly protein A, protein G, and/or protein L; in particular, protein A) derived from the purification process in the mixed solution after mixing with It is preferable that the content is adjusted to 000065 w/v% or less. By adjusting and using the concentration to such a concentration, non-specific reactions can be suppressed to an even higher degree. Furthermore, it is preferable that the content of proteinaceous impurities derived from the purification process in the mixture with the specimen as described above is adjusted to 0.000052 w/v% or less, for example, 0.000039 w/v. % or less, 0.000026 w/v%, 0.000013 w/v% or less, 0.0000013 w/v% or less, or 0.00000013 w/v% or less. The mixed solution may be prepared so as to be substantially free of proteinaceous impurities derived from the purification process, or may be completely free of proteinaceous impurities derived from the purification process.
本発明の抗体溶液に含まれる抗体又は抗体断片の濃度は、免疫測定法や研究試薬用等の免疫学的測定法に用いる抗体溶液として市販されている抗体原料における一般的な濃度でよく、通常は、抗体溶液全体に対して、１０ｍｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは４ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは３ｍｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以下である。抗体の濃度は更に低濃度であってもよく、例えば、１ｍｇ／ｍＬ以下などであってもよい。当該抗体の濃度は、通常、抗体溶液全体に対して０．１ｍｇ／ｍＬ以上である。 The concentration of the antibody or antibody fragment contained in the antibody solution of the present invention may be a general concentration in antibody raw materials commercially available as antibody solutions used in immunoassays, research reagents, etc. is 10 mg/mL or less, preferably 5 mg/mL or less, more preferably 4 mg/mL or less, even more preferably 3 mg/mL or less, particularly preferably 2 mg/mL or less, based on the entire antibody solution. The concentration of the antibody may be even lower, for example, 1 mg/mL or less. The concentration of the antibody is usually 0.1 mg/mL or more based on the entire antibody solution.
一つの実施形態において、本発明の抗体溶液に含まれる抗体又はその断片を免疫学的測定法において捕捉抗体として使用する場合、抗体溶液中における抗体濃度が比較的高いものであることが好ましく、例えば、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ程度、好ましくは０．５～５ｍｇ／ｍＬ程度であるのがよく、例えば、１～３ｍｇ／ｍＬ程度であってもよい。 In one embodiment, when the antibody or fragment thereof contained in the antibody solution of the present invention is used as a capture antibody in an immunoassay, it is preferable that the antibody concentration in the antibody solution is relatively high, e.g. , about 0.1 to 10 mg/mL, preferably about 0.5 to 5 mg/mL, for example, about 1 to 3 mg/mL.
他の実施形態において、本発明の抗体溶液に含まれる抗体又はその断片を免疫学的測定法において検出抗体として使用する場合、抗体溶液中における抗体濃度が比較的低いものであることが好ましく、例えば、０．１～５ｍｇ／ｍＬ程度、好ましくは０．３～３ｍｇ／ｍＬ程度であるのがよく、例えば、０．５～２ｍｇ／ｍＬ程度であってもよい。 In other embodiments, when the antibody or fragment thereof contained in the antibody solution of the present invention is used as a detection antibody in an immunoassay, it is preferable that the antibody concentration in the antibody solution is relatively low, e.g. , about 0.1 to 5 mg/mL, preferably about 0.3 to 3 mg/mL, for example, about 0.5 to 2 mg/mL.
本発明の抗体溶液は、診断薬又は研究試薬等の種々の免疫学的測定法における用途に好適に用いられる。免疫学的測定法としては、特に制限されないが、例えばイムノクロマト法、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、化学発光・酵素免疫測定法、放射免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、免疫比濁法、ラテックス凝集法等が挙げられ、特に診断薬用途においてこれらの免疫学的測定法が実施され得る。特に本発明の抗体溶液は、固相上で検出を行う免疫学的測定法に用いられる場合に非特異反応を抑制する効果に優れている。この観点から、好ましくは、免疫学的測定法は、イムノクロマト法、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、化学発光・酵素免疫測定法、放射免疫測定法、電気化学発光免疫測定法、ラテックス凝集法であり、より好ましくはイムノクロマト法、酵素免疫測定法であり、更に好ましくはイムノクロマト法であり得る。 The antibody solution of the present invention is suitable for use in various immunoassays such as diagnostic agents or research reagents. Immunoassays include, but are not limited to, immunochromatography, enzyme immunoassay, chemiluminescence immunoassay, chemiluminescence-enzyme immunoassay, radioimmunoassay, electrochemiluminescence immunoassay, immunoturbidimetry, and latex agglutination, and these immunoassays may be performed particularly in diagnostic applications. In particular, the antibody solution of the present invention is excellent in suppressing nonspecific reactions when used in immunoassays in which detection is performed on a solid phase. From this perspective, the immunoassay may preferably be immunochromatography, enzyme immunoassay, chemiluminescence immunoassay, chemiluminescence-enzyme immunoassay, radioimmunoassay, electrochemiluminescence immunoassay, or latex agglutination, more preferably immunochromatography or enzyme immunoassay, and even more preferably immunochromatography.
一つの実施形態において、本発明の抗体溶液は、免疫学的測定法において捕捉抗体として用いられる抗体又はその断片を含み得る。捕捉抗体とは、固相に固定化されて特異的に結合する物質（好ましくは、抗体又は抗原）を捕捉する作用を有する抗体（固相化抗体ともいう）のことをいう。ここで、捕捉抗体が固定化される固相としては、例えば、多孔質の支持体等が挙げられ、より具体的には、メンブレン、フィルター、膜、ビーズ、粒子、多孔質のマトリクス、スライドなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、固相は、メンブレン、フィルター、膜、ビーズ、粒子であり得る。メンブレンとしては、例えば、ニトロセルロースメンブレン、セルロース混合エステルメンブレン、酢酸セルロースメンブレン、ポリエステルメンブレン、ポリエチレンメンブレン、ポリ塩化ビニルメンブレン、ポリフッ化ビニリデンメンブレン、ナイロン等を好適な例として挙げることができる。 In one embodiment, the antibody solution of the invention may contain an antibody or a fragment thereof used as a capture antibody in an immunoassay. The capture antibody refers to an antibody (also referred to as a solid-phase antibody) that is immobilized on a solid phase and has the ability to capture a substance (preferably an antibody or an antigen) that specifically binds. Here, examples of the solid phase on which the capture antibody is immobilized include porous supports, and more specifically, membranes, filters, membranes, beads, particles, porous matrices, slides, etc. These include, but are not limited to: Preferably, the solid phase may be a membrane, filter, film, bead, particle. Suitable examples of the membrane include nitrocellulose membrane, cellulose mixed ester membrane, cellulose acetate membrane, polyester membrane, polyethylene membrane, polyvinyl chloride membrane, polyvinylidene fluoride membrane, and nylon.
別の実施形態において、本発明の抗体溶液は、免疫学的測定法において検出抗体として用いられる抗体又はその断片を含み得る。検出抗体とは、特異的に結合する物質（好ましくは、抗体又は抗原）と反応し、免疫学的測定法において目的の抗原抗体反応が起きたことを目視又は光学的手段等により検出可能にするように任意の手段で標識化された抗体のことをいう。ここで標識としては、着色粒子（例えば、着色セルロース粒子、金コロイド粒子）、蛍光色素、蛍光タンパク質、酵素、放射性同位体、ラテックス粒子等を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、着色セルロース粒子などの着色粒子による標識であり得る。このような標識により検出する免疫学的測定方法におけるブランク発色を本発明は特に効果的に抑制し得る。 In another embodiment, the antibody solution of the invention may contain an antibody or a fragment thereof used as a detection antibody in an immunoassay. A detection antibody is a substance that reacts with a substance that specifically binds (preferably an antibody or an antigen), and makes it possible to detect visually or by optical means, etc. that the target antigen-antibody reaction has occurred in an immunoassay. This refers to an antibody that has been labeled by any means. Examples of the label include, but are not limited to, colored particles (eg, colored cellulose particles, colloidal gold particles), fluorescent dyes, fluorescent proteins, enzymes, radioactive isotopes, latex particles, and the like. Preferably, the labeling may be with colored particles, such as colored cellulose particles. The present invention can particularly effectively suppress blank color development in immunoassay methods using such labels.
本発明の抗体又は抗体断片に特異的に結合する測定対象物質（好ましくは、抗体又は抗原）としては、当該抗体又はその断片が特異的に結合反応し得る任意の測定対象物質であってよく、例えば、各種抗原、抗体、レセプター、酵素などが含まれる。当業者は、当該技術分野で公知の任意の手段により、測定対象物質に対して特異的に結合する抗体又はその断片を作製することができ、本発明では、測定対象物質の種類に応じて、本発明の抗体に含まれる抗体又はその断片を適宜選択して使用することができる。測定対象物質としては、市販品を用いてもよいし、生体試料中に含まれ得る任意のタンパク質、ペプチド等（例えば、感染症診断用の免疫学的測定法に用いられる場合は、病原性微生物由来のタンパク質、ペプチド（例えば、病原性のウイルス又は細菌等に由来するタンパク質又はペプチド）等）であってもよい。 The substance to be measured (preferably, the antibody or antigen) that specifically binds to the antibody or antibody fragment of the present invention may be any substance to be measured with which the antibody or fragment thereof can specifically bind, For example, various antigens, antibodies, receptors, enzymes, etc. are included. Those skilled in the art can produce antibodies or fragments thereof that specifically bind to the substance to be measured by any means known in the art, and in the present invention, depending on the type of substance to be measured, Antibodies or fragments thereof included in the antibodies of the present invention can be appropriately selected and used. As the substance to be measured, commercially available products may be used, or any protein, peptide, etc. that may be contained in a biological sample (for example, when used in an immunoassay method for diagnosing an infectious disease, pathogenic microorganisms, etc.) may be used. (e.g., proteins or peptides derived from pathogenic viruses or bacteria).
一つの実施形態において、本発明は、免疫学的測定法における非特異反応が抑制された抗体溶液の製造方法を提供する。当該抗体溶液の製造方法は、例えば、少なくとも以下の工程を含むことを特徴とする：
（１）抗体又はその断片を生産する細胞を培養し、該細胞において抗体又はその断片を発現させる工程；
（２）前記工程（１）で発現させた抗体又はその断片を含む細胞又は培養液を回収する工程；
（３）前記工程（２）で回収した細胞又は培養液から、抗体又はその断片を精製する工程であって、プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質を不溶性担体に固定化したカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製する、工程；及び
（４）前記工程（３）の精製により得られた精製液を用いて抗体溶液を調製する工程であって、抗体溶液におけるプロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種の精製工程由来のタンパク質性不純物の含量が０．０００５ｗ／ｖ％以下となるように調整する、工程。
In one embodiment, the present invention provides a method for producing an antibody solution in which non-specific reactions are suppressed in an immunological assay. The method for producing the antibody solution is characterized by, for example, including at least the following steps:
(1) culturing cells that produce an antibody or a fragment thereof and expressing the antibody or a fragment thereof in the cells;
(2) recovering the cells or culture medium containing the antibody or fragment thereof expressed in the step (1);
(3) a step of purifying an antibody or a fragment thereof from the cells or culture medium recovered in the step (2), which comprises purifying the antibody or a fragment thereof by affinity chromatography using a column in which at least one protein selected from the group consisting of Protein A, Protein G, and Protein L is immobilized on an insoluble carrier; and (4) a step of preparing an antibody solution using the purified liquid obtained by the purification in the step (3), which comprises adjusting the content of at least one protein impurity derived from the purification step selected from the group consisting of Protein A, Protein G, and Protein L in the antibody solution to 0.0005 w/v % or less.
前記工程（１）～（４）における細胞培養や精製の手段は、特に限定されず、当該分野で公知の任意の手段を用いることができ、例えば、前記抗体溶液の説明において詳述したものと同様の手段を使用することができる。 The means for cell culture and purification in steps (1) to (4) are not particularly limited, and any means known in the art can be used, for example, the same means as those detailed in the description of the antibody solution.
本発明の前記抗体溶液の製造方法は、工程（４）として、抗体溶液中の精製工程由来のタンパク質性不純物の含量を０．０００５ｗ／ｖ％以下に調整することを特徴とする。ここで工程（４）における調整は、前記工程（３）の精製工程により得られたアフィニティクロマトグラフィーからの溶出液又はその濃縮物等においてプロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種の精製工程由来のタンパク質性不純物の含量（特に、プロテインＡの含量）を測定し、その含量が０．０００５ｗ／ｖ％以下であれば、当該溶出液又は濃縮物等をそのまま抗体溶液としてもよい。一方、前記工程（３）の精製工程により得られたアフィニティクロマトグラフィーからの溶出液又はその濃縮物等におけるプロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種の精製工程由来のタンパク質性不純物の含量（特に、プロテインＡの含量）を測定し、その含量が０．０００５ｗ／ｖ％より多い場合は、前述のような陽イオンクロマトグラフィーなどの処理による前記タンパク質性不純物の除去、又は任意の溶媒（水、緩衝剤等）による希釈等の任意の手段により、抗体溶液における前記タンパク質性不純物の含量を０．０００５ｗ／ｖ％以下になるように調整すればよい。 The method for producing an antibody solution of the present invention is characterized in that, as step (4), the content of proteinaceous impurities derived from the purification process in the antibody solution is adjusted to 0.0005 w/v% or less. Here, the adjustment in step (4) is performed by selecting from the group consisting of protein A, protein G, and protein L in the eluate from affinity chromatography obtained in the purification step of step (3) or its concentrate. The content of proteinaceous impurities (in particular, the content of protein A) derived from at least one purification process is measured, and if the content is 0.0005 w/v% or less, the eluate or concentrate, etc., is directly used as an antibody. It may also be used as a solution. On the other hand, at least one species selected from the group consisting of Protein A, Protein G, and Protein L is derived from the purification process in the eluate from affinity chromatography obtained in the purification process in step (3) or its concentrate, etc. The content of proteinaceous impurities (in particular, the content of protein A) is measured, and if the content is greater than 0.0005 w/v%, the proteinaceous impurities are removed by treatment such as cation chromatography as described above. Alternatively, the content of the proteinaceous impurities in the antibody solution may be adjusted to 0.0005 w/v% or less by any means such as dilution with any solvent (water, buffer, etc.).
一つの好ましい実施形態において、前記製造方法により得られる抗体溶液は、免疫学的測定法において捕捉抗体として用いられる抗体又はその断片を含む抗体溶液である。この実施形態では、前記工程（４）において、プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種の精製工程由来のタンパク質性不純物の含量（特に、プロテインＡの含量）を０．０００１ｗ／ｖ％以下となるように調整することが好ましい。これにより、当該抗体溶液を捕捉抗体の調製に使用した場合に、ブランク発色をより高度に抑制することができる。 In one preferred embodiment, the antibody solution obtained by the production method is an antibody solution containing an antibody or a fragment thereof used as a capture antibody in an immunological assay. In this embodiment, in the step (4), it is preferable to adjust the content of protein impurities (particularly the content of protein A) derived from at least one purification step selected from the group consisting of protein A, protein G, and protein L to 0.0001 w/v% or less. This makes it possible to more highly suppress blank color development when the antibody solution is used to prepare a capture antibody.
他の好ましい実施形態において、前記製造方法により得られる抗体溶液は、免疫学的測定法において検出抗体として用いられる抗体又はその断片を含む抗体溶液である。この実施形態では、前記工程（４）において、プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種の精製工程由来のタンパク質性不純物の含量（特に、プロテインＡの含量）を０．０００４ｗ／ｖ％以下となるように調整することが好ましい。これにより、当該抗体溶液を検出抗体の調製に使用した場合に、ブランク発色をより高度に抑制することができる。また、検体と混合後の前記タンパク質性不純物の含量が０．００００６５ｗ／ｖ％以下となるように更に調整することで、より一層効果的にブランク発色抑制効果を得ることが可能となり得る。 In another preferred embodiment, the antibody solution obtained by the manufacturing method is an antibody solution containing an antibody or a fragment thereof used as a detection antibody in an immunological assay. In this embodiment, in the step (4), it is preferable to adjust the content of protein impurities (particularly the content of protein A) derived from at least one purification step selected from the group consisting of protein A, protein G, and protein L to 0.0004 w/v% or less. This makes it possible to more effectively suppress blank color development when the antibody solution is used to prepare a detection antibody. In addition, by further adjusting the content of the protein impurities after mixing with the sample to 0.000065 w/v% or less, it may be possible to obtain an even more effective blank color development suppression effect.
本発明の抗体溶液は、免疫学的測定法において用いられた場合に非特異反応を抑制することができ、それにより抗原抗体反応の検出において非特異的反応に基づく反射吸光度の増大を抑え、ブランク発色を効果的に低減させることができる。従って、別の観点から本発明は、前記の抗体溶液を用いることを特徴とする、免疫学的測定法における非特異反応抑制方法を提供する。この方法における抗体溶液中の精製工程由来のタンパク質性不純物の含量等は、前記抗体溶液の説明において詳述したものと同様であり得る。 The antibody solution of the present invention can suppress non-specific reactions when used in immunoassays, thereby suppressing increases in reflection absorbance due to non-specific reactions in the detection of antigen-antibody reactions and effectively reducing blank color development. Therefore, from another perspective, the present invention provides a method for suppressing non-specific reactions in immunoassays, characterized by using the antibody solution. The content of proteinaceous impurities derived from the purification process in the antibody solution in this method, etc., can be the same as those described in detail in the description of the antibody solution.
一つの好ましい実施形態では、前記抗体溶液を用いて捕捉抗体を調製し、また前記抗体溶液を用いて検出抗体を調製し、それらを用いて免疫学的測定法に用いるデバイス等を製造する。このように本発明の抗体溶液を捕捉抗体及び検出抗体の両方に使用することで、より高度に非特異反応を抑制することができる。ここで、捕捉抗体の調製に用いる抗体溶液と、検出抗体の調製に用いる抗体溶液は同じであっても異なってもよいが、それぞれ別のエピトープに反応する抗体又はその断片を含むように調製された異なる抗体溶液であることが好ましい。また、本発明の非特異反応抑制方法において、捕捉抗体の調製に用いる抗体溶液における前記タンパク質性不純物の含量と、検出抗体の調製に用いる抗体溶液におおける前記タンパク質性不純物の含量は、いずれも０．０００５ｗ／ｖ％以下であれば特に限定されず、これらの抗体溶液におけるタンパク質性不純物の含量は同じであっても異なっていてもよい。 In one preferred embodiment, the antibody solution is used to prepare a capture antibody, the antibody solution is used to prepare a detection antibody, and these are used to manufacture a device or the like for use in an immunoassay. By using the antibody solution of the present invention as both a capture antibody and a detection antibody in this way, non-specific reactions can be suppressed to a higher degree. Here, the antibody solution used to prepare the capture antibody and the antibody solution used to prepare the detection antibody may be the same or different, but each is prepared to contain antibodies or fragments thereof that react with different epitopes. Preferably, different antibody solutions are used. Furthermore, in the non-specific reaction suppression method of the present invention, the content of the proteinaceous impurities in the antibody solution used for preparing the capture antibody and the content of the proteinaceous impurities in the antibody solution used for preparing the detection antibody are both There is no particular limitation as long as it is 0.0005 w/v% or less, and the content of proteinaceous impurities in these antibody solutions may be the same or different.
本発明は、上述したような抗体又は抗体断片を含む抗体溶液により調製された免疫学的測定用キット（例えば、診断薬用キット又は研究試薬用キット）を包含する。当該キットは、容器を備えていてもよく、当該容器に抗体組成物が含まれていてもよい。また、当該キットは、当該キットの使用に必要な器具や説明書を更に備えていてもよい。このようにして調製された免疫学的測定キットは、非特異反応が抑制され、それにより非特異反応に基づく反射吸光度の増大が抑えられ、ブランク発色も効果的に抑制され、偽陽性の判定を引き起こしにくい優れたキットとすることができる。 The present invention includes an immunoassay kit (for example, a diagnostic kit or a research reagent kit) prepared with an antibody solution containing the above-described antibody or antibody fragment. The kit may include a container, and the antibody composition may be contained in the container. Moreover, the kit may further include instruments and instructions necessary for using the kit. The immunoassay kit prepared in this way suppresses non-specific reactions, thereby suppressing the increase in reflected absorbance based on non-specific reactions, and effectively suppressing blank color development, thereby preventing false positive determinations. It can be an excellent kit that is difficult to cause.
本発明において、前記免疫学的測定用キット（例えば、診断薬用キット又は研究試薬用キット）に包含された抗体溶液中に含まれる抗体又は抗体断片は、測定対象物質と特異的に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、測定対象物質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核蛋白質であれば、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核蛋白質抗体を使用できる。前記抗体は市販品が用いられてもよく、別途公知の方法で製造されてもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、分子サイズも特に限定されない。 In the present invention, the antibody or antibody fragment contained in the antibody solution included in the immunoassay kit (e.g., diagnostic kit or research reagent kit) is one that can specifically bind to the substance to be measured. If so, there are no particular limitations. For example, if the substance to be measured is SARS-CoV-2 nuclear protein, an anti-SARS-CoV-2 nuclear protein antibody can be used. The antibody may be a commercially available product, or may be separately produced by a known method. Further, the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and the molecular size is not particularly limited.
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例により、特に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with reference to examples. However, the present invention is not particularly limited to the following examples.
（実施例１：プロテインＡ含有抗体のブランク発色評価）
（１）市販抗体溶液中のプロテインＡ濃度の測定及び精製
評価に使用する市販抗体（市販の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核蛋白質モノクローナル抗体Ａ及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核蛋白質モノクローナル抗体Ｂ；これらの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２市販抗体Ａ及びＢは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核蛋白質における異なるエピトープをそれぞれ認識する抗体である）のプロテインＡ濃度をプロテインＡ濃度測定キット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、＃Ｆ４００、Ｃｙｇｎｕｓ社）を用いて測定した。次いで、それらの市販抗体を陽イオンカラムクロマトグラフィー（Ｃｙｔｉｖａ社製のＳＰカラムを利用して、プロテインＡがＳＰカラムに結合しないｐＨ５．２のバッファーでプロテインＡを含む抗体溶液をＳＰカラムに通して抗体のみを吸着させ、塩強度を上げることでＳＰカラムから抗体を溶出させる）に供して、プロテインＡを除去し、それらの抗体溶液中のプロテインＡ濃度を調整した（精製後の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２市販抗体Ａ溶液におけるプロテインＡ濃度０．０００００３ｗ／ｖ％、精製後の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２市販抗体Ｂ溶液におけるプロテインＡ濃度０．０００００２ｗ／ｖ％）。
(Example 1: Blank color evaluation of protein A-containing antibody)
(1) Measurement of Protein A Concentration in Commercial Antibody Solution and Purification The Protein A concentration of the commercial antibodies used in the evaluation (commercially available anti-SARS-CoV-2 nucleoprotein monoclonal antibody A and anti-SARS-CoV-2 nucleoprotein monoclonal antibody B; these anti-SARS-CoV-2 commercial antibodies A and B are antibodies that recognize different epitopes in the nucleoprotein of SARS-CoV-2) was measured using a Protein A concentration measurement kit (Protein A ELISA Kit, #F400, Cygnus). Next, these commercially available antibodies were subjected to cation column chromatography (using a Cytiva SP column, an antibody solution containing Protein A was passed through the SP column in a buffer of pH 5.2 in which Protein A does not bind to the SP column to adsorb only the antibody, and the antibody was eluted from the SP column by increasing the salt strength) to remove Protein A, and the Protein A concentrations in the antibody solutions were adjusted (Protein A concentration in purified anti-SARS-CoV-2 commercially available antibody A solution: 0.000003 w/v%, Protein A concentration in purified anti-SARS-CoV-2 commercially available antibody B solution: 0.000002 w/v%).
（２）抗体溶液の調製
前記のようにして精製した抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２市販抗体Ａ、Ｂを使用し、以下のようにして抗体溶液の調製を行った。まず、３．６１ｍｇ／ｍＬの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核蛋白質モノクローナル抗体（精製後の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体Ａ；抗体Ａとも略記する）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬）で２．０ｍｇ／ｍＬに調整した。次に、プロテインＡ組換え体（富士フイルム和光純薬）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬）で１ｍｇ／ｍＬに希釈した溶液（以下、「プロテインＡ溶液」とする）を調整し、プロテインAの終濃度が表1に示す濃度となるようにプロテインＡ溶液を添加した。また、４．７７ｍｇ／ｍＬの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核蛋白質モノクローナル抗体（精製後の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体Ｂ：抗体Ｂとも略記する）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬）で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈した。同様に、プロテインＡ溶液を表1に示す濃度となるように添加した。調整したプロテインＡ添加抗体を表１に示す。
(2) Preparation of antibody solution Using anti-SARS-CoV-2 commercially available antibodies A and B purified as described above, an antibody solution was prepared as follows. First, 3.61 mg/mL anti-SARS-CoV-2 nuclear protein monoclonal antibody (purified anti-SARS-CoV-2 antibody A; also abbreviated as antibody A) was added to distilled water (Otsuka Distilled Water, Otsuka Pharmaceutical) for 2 hours. The concentration was adjusted to .0 mg/mL. Next, a solution (hereinafter referred to as "Protein A solution") was prepared by diluting Protein A recombinant (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to 1 mg/mL with distilled water (Otsuka Distilled Water, Otsuka Pharmaceutical), and Protein A solution was added so that the final concentration of A was as shown in Table 1. In addition, 4.77 mg/mL of anti-SARS-CoV-2 nuclear protein monoclonal antibody (purified anti-SARS-CoV-2 antibody B: also abbreviated as antibody B) was added to 1 mL of distilled water (Otsuka Distilled Water, Otsuka Pharmaceutical). Diluted to .0 mg/mL. Similarly, protein A solution was added to the concentrations shown in Table 1. The prepared Protein A-added antibodies are shown in Table 1.
（３）イムノクロマト測定用検出抗体の作成
１．０ｗｔ％のセルロース粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ２：Ｄａｒｋ Ｎａｖｙ、平均粒子径３６５ｎｍ、旭化成）を、１０ｍＭのトリス緩衝液（和光純薬工業）（ｐＨ８．０）に懸濁させ、これに前記１．０ｍｇ／ｍＬ（０．１ｗｔ％）のプロテインＡ添加抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核蛋白質モノクローナル抗体（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体Ｂ）を加え、ボルテックスで撹拌混合した。次いで、３７℃で１２０分間静置して、抗体をセルロース微粒子表面上に結合させた。次いで、１．０ｗｔ％のカゼイン（和光純薬工業）、５０ｍＭのトリス緩衝液（和光純薬工業）からなるブロッキング液（ｐＨ９．０）を加え、３７℃で６０分間静置した。次いで、遠心分離機で抗体感作セルロース微粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、５０ｍＭのトリス緩衝液（和光純薬工業）からなる洗浄液（ｐＨ９．０）で洗浄処理を行った後に、１５ｗｔ％のスクロース（和光純薬工業）、０．２ｗｔ％のカゼイン（和光純薬工業）、５０ｍＭのトリス緩衝液（和光純薬工業）からなる保存液（ｐＨ９．０）に抗体感作セルロース微粒子を懸濁してイムノクロマト測定用検出抗体を得た。
(3) Preparation of detection antibody for immunochromatography 1.0 wt% cellulose particles (NanoAct (registered trademark), BL2: Dark Navy, average particle size 365 nm, Asahi Kasei) were suspended in 10 mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries) (pH 8.0), to which 1.0 mg/mL (0.1 wt%) of protein A-added anti-SARS-CoV-2 nucleoprotein monoclonal antibody (anti-SARS-CoV-2 antibody B) was added and mixed by vortexing. Then, the mixture was left to stand at 37 ° C for 120 minutes to bind the antibody to the cellulose microparticle surface. Next, a blocking solution (pH 9.0) consisting of 1.0 wt% casein (Wako Pure Chemical Industries) and 50 mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries) was added and left to stand at 37 ° C for 60 minutes. Next, the antibody-sensitized cellulose microparticles were precipitated using a centrifuge, and the supernatant was removed. Next, after washing with a washing solution (pH 9.0) consisting of 50 mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries), the antibody-sensitized cellulose microparticles were suspended in a storage solution (pH 9.0) consisting of 15 wt% sucrose (Wako Pure Chemical Industries), 0.2 wt% casein (Wako Pure Chemical Industries), and 50 mM Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries) to obtain a detection antibody for immunochromatographic measurement.
（４）捕捉抗体を結合させたイムノクロマト試験片（ハーフストリップ）の作製
バッキングシートで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの上面に、１～５ｍｍ程度重なるように吸収パッドを貼り合わせた。次いで、コンパクトカッター（１５３ＮＦ―１００ＩＣＧ、ニップンエンジニアリング）にて幅３ｍｍ、長さ６０ｍｍの短冊状に裁断することで、抗体無担持ハーフストリップを得た。次いで、前記抗体無担持ハーフストリップの中央部に２ｍｇ／ｍＬ のプロテインＡ添加抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核蛋白質モノクローナル抗体（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体Ａ）０．５μＬ を滴下し、４５℃で３０分間乾燥することで、捕捉抗体を固定化したハーフストリップを得た。
(4) Preparation of Immunochromatographic Test Piece (Half Strip) with Capture Antibody Binding An absorbent pad was attached to the upper surface of the nitrocellulose membrane backed with a backing sheet so as to overlap by about 1 to 5 mm. Then, the absorbent pad was cut into strips with a width of 3 mm and a length of 60 mm using a compact cutter (153NF-100ICG, Nippon Engineering) to obtain an antibody-free half strip. Next, 0.5 μL of 2 mg/mL protein A-added anti-SARS-CoV-2 nucleoprotein monoclonal antibody (anti-SARS-CoV-2 antibody A) was dropped onto the center of the antibody-free half strip, and the half strip was dried at 45° C. for 30 minutes to obtain a capture antibody-immobilized half strip.
（５）ブランク発色評価
９６ｗｅｌｌマイクロプレートの各ｗｅｌｌに、０．９ｗｔ％のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル：ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）１００（和光純薬工業）および０．１ｗｔ％ＢＳＡを含有するトリス緩衝液から成る測定試料希釈液２０μＬ、及び上記（３）で作製した各イムノクロマト測定用検出抗体３μＬを添加し、ピペッティングで混合後、前記工程（４）で作製した各ハーフストリップを差し込んだ。室温（２５℃）で１０分間静置後に、イムノクロマトリーダー（Ｃ１００６６－１０、浜松ホトニクス）にて発色度を反射吸光度（ｍＡｂｓ）で測定した。前期実験操作をそれぞれＮ＝３で行い、その平均値を算出した。
(5) Blank color development evaluation Each well of a 96-well microplate contains 0.9 wt% polyoxyethylene (10) octylphenyl ether: TritonX (registered trademark) 100 (Wako Pure Chemical Industries) and 0.1 wt% BSA. 20 μL of a measurement sample dilution solution consisting of Tris buffer and 3 μL of each detection antibody for immunochromatography measurement prepared in (3) above were added, mixed by pipetting, and then each half strip prepared in step (4) was inserted. . After standing for 10 minutes at room temperature (25° C.), the degree of color development was measured by reflection absorbance (mAbs) using an immunochromatoreader (C10066-10, Hamamatsu Photonics). Each of the first-term experimental operations was performed with N=3, and the average value was calculated.
（６）結果
プロテインＡを種々の濃度で添加した各抗体溶液とイムノクロマト試験片を用いたブランク発色評価結果を表２および表３に示す。表２は、捕捉抗体側に種々の濃度でのプロテインＡ溶液添加抗体（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体Ａ）を用いたブランク発色評価結果（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体Ｂは、プロテインＡ添加無しの条件）を、表３は、検出抗体側に種々の濃度でのプロテインＡ溶液添加抗体（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体Ｂ）を用いたブランク発色評価結果（抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体Ａは、プロテインＡ添加無しの条件）をそれぞれ示す。また、目視判定でのブランク発色結果も並記した。
(6) Results Tables 2 and 3 show blank color evaluation results using each antibody solution to which Protein A was added at various concentrations and an immunochromatographic test strip. Table 2 shows blank color evaluation results using an antibody (anti-SARS-CoV-2 antibody A) to which Protein A solution was added at various concentrations on the capture antibody side (anti-SARS-CoV-2 antibody B under conditions without the addition of Protein A), and Table 3 shows blank color evaluation results using an antibody (anti-SARS-CoV-2 antibody B) to which Protein A solution was added at various concentrations on the detection antibody side (anti-SARS-CoV-2 antibody A under conditions without the addition of Protein A). Blank color evaluation results by visual judgment are also shown.
表２より、本発明の抗体溶液を捕捉抗体及び検出抗体のいずれに用いた場合でも、抗体溶液中のプロテインＡ濃度が０．０００５ｗ／ｖ％以下となることで非特異反応に基づく反射吸光度の値が大幅に低減することが示された。なお、捕捉抗体に使用した抗体溶液中のプロテインＡ濃度が０．０００５ｗ／ｖ％以下となることでブランク発色は淡色に抑えられたが、目視で確認できる僅かな発色が確認された。一方で、捕捉抗体に用いる抗体溶液中のプロテインＡの濃度が０．０００１ｗ／ｖ％以下の場合にはブランク発色が確認されなかった。更に、表３より、検出抗体として使用する抗体溶液中のプロテインＡ濃度が０．０００５ｗ／ｖ％以下となることでブランク発色は淡色に抑えられたが、更に０．０００４ｗ／ｖ％以下となることでブランク発色が確認されず、より高度に非特異反応が抑えられ、偽陽性判定リスクを効果的に低減できることが示された。 From Table 2, it can be seen that when the antibody solution of the present invention is used as either a capture antibody or a detection antibody, the reflection absorbance due to non-specific reaction is It was shown that the value was significantly reduced. Although the blank color development was suppressed to a light color because the protein A concentration in the antibody solution used for the capture antibody was 0.0005 w/v% or less, a slight color development that could be visually confirmed was confirmed. On the other hand, no blank color development was observed when the concentration of protein A in the antibody solution used for the capture antibody was 0.0001 w/v% or less. Furthermore, from Table 3, the blank color development was suppressed to a light color when the protein A concentration in the antibody solution used as the detection antibody was 0.0005 w/v% or less, but it further decreased to 0.0004 w/v% or less. This showed that blank color development was not confirmed, non-specific reactions were suppressed to a higher degree, and the risk of false positive judgments could be effectively reduced.
本発明により、免疫測定法において非特異反応が抑制可能な抗体又は抗体断片を含む抗体溶液を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide an antibody solution containing an antibody or antibody fragment capable of suppressing non-specific reactions in an immunoassay.
Claims (19)
（１）抗体又はその断片を生産する細胞を培養し、該細胞において抗体又はその断片を発現させる工程；
（２）前記工程（１）で発現させた抗体又はその断片を含む細胞又は培養液を回収する工程；
（３）前記工程（２）で回収した細胞又は培養液から、抗体又はその断片を精製する工程であって、プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質を不溶性担体に固定化したカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製する、工程；及び
（４）前記工程（３）の精製により得られた精製液を用いて抗体溶液を調製する工程であって、抗体溶液におけるプロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬからなる群より選択される少なくとも１種の精製工程由来のタンパク質性不純物の含量が０．０００５ｗ／ｖ％以下となるように調整する、工程、
を包含する、抗体溶液の製造方法。 A method for producing an antibody solution in which non-specific reactions in an immunoassay are suppressed, the method comprising:
(1) A step of culturing cells that produce antibodies or fragments thereof and expressing the antibodies or fragments thereof in the cells;
(2) collecting cells or culture medium containing the antibody or fragment thereof expressed in step (1);
(3) A step of purifying an antibody or a fragment thereof from the cells or culture medium collected in step (2), the step of purifying at least one protein selected from the group consisting of protein A, protein G, and protein L. a step of purifying the antibody by affinity chromatography using a column immobilized on an insoluble carrier; and (4) a step of preparing an antibody solution using the purified solution obtained in the purification of step (3), adjusting the content of proteinaceous impurities derived from at least one purification process selected from the group consisting of Protein A, Protein G, and Protein L in the solution to be 0.0005 w/v% or less;
A method for producing an antibody solution, comprising:
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