JP2024037695A - Carrier production method, carrier-containing liquid and its use - Google Patents
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Abstract
【課題】キャリアの再現性を向上できる技術を提供する。【解決手段】細胞に由来するキャリアの生産方法は、細胞を含む試料液を、平均孔径８μｍ以上の第１のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン処理することにより、第１の液体を得る第１工程と、第１の液体を、密度勾配遠心によって複数の画分に分離した後、複数の画分のうち細胞膜成分を含む画分を回収する第２工程と、回収された画分を含む第２の液体を、平均孔径０．５μｍ以下の第２のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン処理することにより、キャリアを含む液体を得る第３工程と、を含む。【選択図】図１[Problem] To provide a technology that can improve the reproducibility of carriers. [Solution] A method for producing cell-derived carriers includes a first step of obtaining a first liquid by extruding a sample liquid containing cells using a first membrane filter with an average pore size of 8 μm or more, a second step of separating the first liquid into a plurality of fractions by density gradient centrifugation, and then recovering a fraction containing cell membrane components from the plurality of fractions, and a third step of obtaining a liquid containing carriers by extruding a second liquid containing the recovered fraction using a second membrane filter with an average pore size of 0.5 μm or less. [Selected Figure] Figure 1
Description
本開示は、キャリアの生産方法に関する。 The present disclosure relates to a method for producing a carrier.
薬物を標的組織へ送達するために、薬物をキャリアへ封入することによって、生体内安定性を向上させることが試みられている。また、キャリアの表面に標的化シグナル分子を存在させることにより、薬物を標的組織へと選択的に送達させることが期待される。現在、合成脂質を材料としたリポソーム製剤が、ナノキャリアとして医薬品に応用されている。しかしながら、リポソーム製剤のうち、組織標的化を目的としたものは、ポリエチレングリコール修飾による肝臓デリバリー等に限られている。この理由として、リポソーム表面への標的化シグナル分子の付加による組織標的化には、原料となる脂質への有機化学的な修飾が必要であり、この修飾の難易度が高いことが挙げられる。一方、エクソソームは、生体細胞が生理的に分泌するナノキャリアであり、薬物を人為的に封入させることで薬物キャリアとしての利用が模索されている。しかしながら、エクソソームは、細胞からの遊離量が非常に少ないという問題がある。 In order to deliver drugs to target tissues, attempts have been made to improve their in-vivo stability by encapsulating drugs in carriers. Furthermore, by having a targeting signal molecule present on the surface of the carrier, it is expected that the drug will be selectively delivered to the target tissue. Currently, liposome preparations made from synthetic lipids are being applied to pharmaceuticals as nanocarriers. However, among liposome preparations, those aimed at tissue targeting are limited to liver delivery using polyethylene glycol modification. The reason for this is that tissue targeting by adding a targeting signal molecule to the liposome surface requires organic chemical modification of the raw material lipid, and this modification is highly difficult. On the other hand, exosomes are nanocarriers physiologically secreted by living cells, and their use as drug carriers is being explored by artificially encapsulating drugs. However, exosomes have a problem in that the amount released from cells is very small.
非特許文献１および非特許文献２には、エクソソームを模倣したナノキャリアを調製する方法について開示されている。
Non-Patent
しかしながら、非特許文献１および非特許文献２に記載の技術では、細胞の状態の違いに起因して、キャリアの再現性が低いという問題があることを本願発明者らは見出した。細胞の状態の違いとしては、例えば、親細胞の継代数の違いが挙げられる。このため、キャリアの再現性を向上できる技術が求められる。
However, the present inventors have found that the techniques described in
本発明は、以下の形態として実現することが可能である。 The present invention can be realized as the following forms.
（１）本発明の一形態によれば、細胞に由来するキャリアの生産方法が提供される。細胞に由来するキャリアの生産方法は、前記細胞を含む試料液を、平均孔径８μｍ以上の第１のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン処理することにより、第１の液体を得る第１工程と、前記第１の液体を、密度勾配遠心によって複数の画分に分離した後、前記複数の画分のうち細胞膜成分を含む画分を回収する第２工程と、回収された前記画分を含む第２の液体を、平均孔径０．５μｍ以下の第２のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン処理することにより、キャリアを含む液体を得る第３工程と、を含む。この形態のキャリアの生産方法によれば、夾雑物を減らすことができ、この結果として、キャリアの再現性を向上できる。 (1) According to one embodiment of the present invention, a method for producing a carrier derived from cells is provided. The method for producing a carrier derived from cells includes a first step of obtaining a first liquid by extruding the sample liquid containing the cells using a first membrane filter having an average pore size of 8 μm or more; a second step of separating the first liquid into a plurality of fractions by density gradient centrifugation, and then collecting a fraction containing a cell membrane component among the plurality of fractions; and a second step containing the collected fraction. a third step of obtaining a carrier-containing liquid by subjecting the liquid to extrusion treatment using a second membrane filter having an average pore size of 0.5 μm or less. According to this method of producing a carrier, contaminants can be reduced, and as a result, the reproducibility of the carrier can be improved.
（２）上記（１）に記載のキャリアの生産方法において、前記第３工程では、前記第２の液体に物質を混合してエクストルージョン処理することにより、前記物質がローディングされたキャリアを得てもよい。この形態のキャリアの生産方法によれば、所望の物質がローディングされたキャリアを生産することができる。 (2) In the method for producing a carrier according to (1) above, in the third step, a carrier loaded with the substance is obtained by mixing the substance with the second liquid and subjecting it to extrusion treatment. Good too. According to this type of carrier production method, a carrier loaded with a desired substance can be produced.
（３）上記（２）に記載のキャリアの生産方法において、前記物質は、医薬品であってもよい。この形態のキャリアの生産方法によれば、医薬品がローディングされたキャリアを生産することができる。 (3) In the method for producing a carrier according to (2) above, the substance may be a pharmaceutical. According to this method of producing a carrier, it is possible to produce a carrier loaded with a drug.
（４）上記（２）に記載のキャリアの生産方法において、前記物質は、ペプチド、タンパク質、核酸、毒素、ビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、蛍光基質、抗がん剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、分子量５０以上２０００以下の化合物よりなる群から選ばれる少なくとも１種であってもよい。この形態のキャリアの生産方法によれば、所望の物質がローディングされたキャリアを生産することができる。 (4) In the method for producing a carrier according to (2) above, the substance may include peptides, proteins, nucleic acids, toxins, beads, microparticles, nanoparticles, fluorescent substrates, anticancer agents, antiinflammatory agents, angiogenic agents, etc. The inhibitor may be at least one kind selected from the group consisting of compounds having a molecular weight of 50 or more and 2000 or less. According to this type of carrier production method, a carrier loaded with a desired substance can be produced.
（５）上記（１）から上記（４）までのいずれか一項に記載のキャリアの生産方法において、前記第１のメンブレンフィルターは、平均孔径１５μｍ以下であってもよい。この形態のキャリアの生産方法によれば、粒子径のばらつきを低減することができるので、キャリアの再現性をより向上できる。 (5) In the method for producing a carrier according to any one of (1) to (4) above, the first membrane filter may have an average pore diameter of 15 μm or less. According to this method of producing a carrier, it is possible to reduce variations in particle diameter, thereby further improving the reproducibility of the carrier.
（６）上記（１）から上記（５）までのいずれか一項に記載のキャリアの生産方法において、前記第２のメンブレンフィルターは、平均孔径０．３μｍ以上であってもよい。この形態のキャリアの生産方法によれば、メンブレンフィルターの目詰まりを抑制できるので、キャリアの生産効率が低下することを抑制できる。 (6) In the method for producing a carrier according to any one of (1) to (5) above, the second membrane filter may have an average pore diameter of 0.3 μm or more. According to this embodiment of the carrier production method, clogging of the membrane filter can be suppressed, and therefore, a decrease in carrier production efficiency can be suppressed.
（７）本発明の他の形態によれば、上記（１）から（６）までのいずれか一項に記載のキャリアの生産方法によって得られたキャリアが提供される。 (7) According to another aspect of the present invention, there is provided a carrier obtained by the carrier production method described in any one of (1) to (6) above.
（８）本発明の他の形態によれば、細胞に由来するキャリアを含む液体が提供される。細胞に由来するキャリアを含む液体は、前記細胞に由来する粒子径０．１μｍ以上０．５μｍ以下の粒子が全粒子のうち９５％以上含まれる。この形態のキャリアを含む液体によれば、夾雑物が少ないキャリアを提供できる。 (8) According to another aspect of the present invention, a liquid containing a carrier derived from cells is provided. A liquid containing a carrier derived from cells contains 95% or more of all particles derived from the cells and having a particle diameter of 0.1 μm or more and 0.5 μm or less. A liquid containing a carrier in this form can provide a carrier with few impurities.
（９）上記（８）に記載のキャリアを含む液体において、ミトコンドリアに由来する成分を実質的に含まなくてもよい。この形態のキャリアを含む液体によれば、ミトコンドリアに由来する成分を実質的に含まないため、細胞死シグナルがキャリアに内包されることを抑制できる。この結果として、キャリアが送達された細胞が障害を受けることを抑制できる。 (9) The liquid containing the carrier described in (8) above may be substantially free of components derived from mitochondria. A liquid containing a carrier in this form does not substantially contain components derived from mitochondria, and therefore it is possible to suppress cell death signals from being included in the carrier. As a result, damage to cells to which the carrier is delivered can be suppressed.
（１０）上記（８）または上記（９）に記載のキャリアを含む液体において、ペプチド、タンパク質、核酸、毒素、ビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、蛍光基質、抗がん剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、分子量５０以上２０００以下の化合物よりなる群から選ばれる少なくとも１種がローディングされていてもよい。この形態のキャリアを含む液体によれば、所望の物質がローディングされたキャリアを提供できる。 (10) In a liquid containing the carrier described in (8) or (9) above, peptides, proteins, nucleic acids, toxins, beads, microparticles, nanoparticles, fluorescent substrates, anticancer drugs, antiinflammatory drugs, blood vessels, etc. At least one kind selected from the group consisting of a neogenesis inhibitor and a compound having a molecular weight of 50 or more and 2,000 or less may be loaded. A liquid containing this type of carrier can provide a carrier loaded with a desired substance.
（１１）本発明の他の形態によれば、上記（８）または上記（９）に記載の液体を含む、医薬組成物が提供される。 (11) According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the liquid described in (8) or (9) above.
なお、本発明は、種々の形態で実現することが可能である。例えば、キャリアの調製キット、キャリアを用いた薬物送達方法、キャリアを用いた薬物送達システム、キャリアを用いた薬効評価方法、キャリアを用いた薬効評価システム、キャリアを用いた送達効率の評価方法、キャリアを用いた送達効率の評価システム等の形態で実現することができる。 Note that the present invention can be implemented in various forms. For example, carrier preparation kits, drug delivery methods using carriers, drug delivery systems using carriers, drug efficacy evaluation methods using carriers, drug efficacy evaluation systems using carriers, delivery efficiency evaluation methods using carriers, carriers This can be realized in the form of a delivery efficiency evaluation system using.
図１は、本開示の一実施形態としての、細胞に由来するキャリアの生産方法を示す工程図である。図２は、キャリアの生産方法の概要を模式的に示す説明図である。キャリアの生産方法は、細胞を含む試料液を、平均孔径８μｍ以上の第１のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン処理することにより、第１の液体を得る第１工程（Ｐ１１０）と、第１の液体を、密度勾配遠心によって複数の画分に分離した後、複数の画分のうち細胞膜成分を含む画分を回収する第２工程（Ｐ１２０）と、回収された画分を含む第２の液体を、平均孔径０．５μｍ以下の第２のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン処理することにより、キャリアを含む液体を得る第３工程（Ｐ１３０）と、を含む。 FIG. 1 is a process diagram showing a method for producing a carrier derived from cells as an embodiment of the present disclosure. FIG. 2 is an explanatory diagram schematically showing an outline of a carrier production method. The carrier production method includes a first step (P110) of obtaining a first liquid by extruding a sample solution containing cells using a first membrane filter having an average pore size of 8 μm or more; A second step (P120) of separating the liquid into a plurality of fractions by density gradient centrifugation and then collecting a fraction containing cell membrane components from among the plurality of fractions, and a second liquid containing the collected fractions. and a third step (P130) of obtaining a liquid containing a carrier by subjecting it to extrusion treatment using a second membrane filter having an average pore size of 0.5 μm or less.
本開示において「キャリア」とは、他の分子を内包可能な小胞を意味する。本開示の方法によって得られるキャリアは、脂質二重層を有し、０．０５μｍ以上０．５μｍ以下の粒子径を有する。本開示の方法によって得られるキャリアは、生体内のエクソソームやリポソームを模倣した性質を有する。本開示におけるキャリアの生産方法では、第１工程に先立ち、細胞を含む試料液を準備する。 In this disclosure, "carrier" refers to a vesicle capable of encapsulating other molecules. The carrier obtained by the method of the present disclosure has a lipid bilayer and a particle size of 0.05 μm or more and 0.5 μm or less. The carrier obtained by the method of the present disclosure has properties that mimic in-vivo exosomes and liposomes. In the carrier production method according to the present disclosure, a sample solution containing cells is prepared prior to the first step.
本開示における「細胞を含む試料液」は、細胞を培養して得られた培養液や、細胞を緩衝液等に懸濁させた細胞懸濁液であってもよい。細胞懸濁液は、培養細胞にプロテアーゼやＥＤＴＡ等を添加して培養容器から剥離し、その後、緩衝液に再懸濁させたものであってもよい。また、試料液としては、特に限定されないが、例えば、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、唾液、母乳、羊水、悪性腹水、髄液、脳室液などの生体液試料であってもよい。試料液に含まれる細胞の種類としては、特に限定されないが、例えば、神経細胞、免疫細胞、上皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、結合組織細胞、幹細胞、iPS細胞やES細胞等の多能性幹細胞、腫瘍細胞等の疾患細胞、各種臓器由来の初代培養細胞や株化培養細胞等が挙げられる。試料液に含まれる細胞は、特定のタンパク質を発現するように、または特定のタンパク質の発現を抑制するように、形質転換された細胞であってもよい。細胞の生物種としては、特に限定されないが、例えば、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫、微生物、植物等が挙げられる。哺乳類としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコ等が挙げられる。 The "sample solution containing cells" in the present disclosure may be a culture solution obtained by culturing cells, or a cell suspension in which cells are suspended in a buffer solution or the like. The cell suspension may be obtained by adding protease, EDTA, etc. to cultured cells, peeling them from the culture container, and then resuspending them in a buffer solution. Further, the sample liquid is not particularly limited, but may be a biological fluid sample such as blood, serum, plasma, lymph fluid, urine, saliva, breast milk, amniotic fluid, malignant ascites, cerebrospinal fluid, or cerebral ventricular fluid. The types of cells contained in the sample solution are not particularly limited, but include, for example, pluripotent cells such as nerve cells, immune cells, epithelial cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, connective tissue cells, stem cells, iPS cells, and ES cells. Examples include stem cells, diseased cells such as tumor cells, primary cultured cells derived from various organs, established cultured cells, and the like. The cells contained in the sample solution may be cells that have been transformed to express a specific protein or to suppress the expression of a specific protein. The biological species of the cell is not particularly limited, but includes, for example, mammals, birds, reptiles, amphibians, fish, insects, microorganisms, plants, and the like. Examples of mammals include, but are not limited to, humans, primates such as monkeys, orangutans, and chimpanzees, rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, pigs, cows, goats, horses, sheep, rabbits, dogs, Examples include cats.
第１工程では、細胞を含む試料液を、平均孔径８μｍ以上の第１のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン（Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）処理する（Ｐ１１０）。第１のメンブレンフィルターとしてのメンブレンの素材は、特に限定されないが、例えば、ポリカーボネートや、ポリエーテルスルホン、親水性ポリテトラフルオロエチレン等であってもよい。第１工程のエクストルージョン処理では、手動式のシリンジを用いてもよく、電動式のシリンジを用いてもよい。また、第１工程では、例えば、ＡＶＥＳＴＩＮ，Ｉｎｃ．製のＡＶＥＳＴＩＮ（登録商標）ＬＦ－１ リポソファスト ベーシック等の手動式リポソーム調製器を用いてエクストルージョン処理を行ってもよい。また、ＡＶＥＳＴＩＮ（登録商標）のＬＦ－ＳＴＢ リポソファスト スタビライザーを併用してシリンジの押し込みを行ってもよい。 In the first step, the sample solution containing cells is subjected to extrusion treatment using a first membrane filter having an average pore size of 8 μm or more (P110). The material of the membrane as the first membrane filter is not particularly limited, and may be, for example, polycarbonate, polyether sulfone, hydrophilic polytetrafluoroethylene, or the like. In the first step of extrusion treatment, a manual syringe or an electric syringe may be used. Further, in the first step, for example, AVESTIN, Inc. The extrusion treatment may be performed using a manual liposome preparation device such as the AVESTIN® LF-1 Liposophast Basic manufactured by Co., Ltd. Further, the syringe may be pushed in together with AVESTIN (registered trademark)'s LF-STB Liposophast Stabilizer.
第１工程のエクストルージョン処理では、試料液を第１のメンブレンフィルターに複数回通過させることが好ましい。より具体的には、例えば、第１のメンブレンフィルターの両端にシリンジを接続し、一方のシリンジに試料液を入れて、第１のメンブレンフィルターを介して他方のシリンジに送り込む動作を、往復させることにより複数回実施してもよい。試料液を第１のメンブレンフィルターに複数回通過させることにより、第１の液体に含まれる粒子における粒子径のばらつきを低減することができる。通過させる回数は、３回以上が好ましく、５回以上がより好ましく、９回以上がさらに好ましく、１３回以上がより一層好ましい。 In the first step of extrusion treatment, it is preferable that the sample liquid is passed through the first membrane filter multiple times. More specifically, for example, syringes are connected to both ends of the first membrane filter, and the operation of filling one syringe with a sample liquid and sending it to the other syringe through the first membrane filter is reciprocated. It may be performed multiple times. By passing the sample liquid through the first membrane filter multiple times, it is possible to reduce variations in particle size among particles contained in the first liquid. The number of times of passing is preferably 3 or more, more preferably 5 or more, even more preferably 9 or more, and even more preferably 13 or more.
第１のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン処理を行うことにより、試料液に含まれる細胞が破砕され、その後、細胞膜が再構成される。第１のメンブレンフィルターの平均孔径が８μｍ以上であることにより、フィルターの目詰まりを抑制できるので、エクストルージョン処理の効率が低下することを抑制できる。また、第１のメンブレンフィルターの平均孔径が８μｍ以上であることにより、圧の上昇によってフィルターが破れてしまうことを抑制できる。第１のメンブレンフィルターの平均孔径は、第１の液体に含まれる粒子における粒子径のばらつきを低減する観点から、２０μｍ以下であることが好ましく、１５μｍ以下であることがより好ましく、１２μｍ以下であることがさらに好ましい。 By performing extrusion treatment using the first membrane filter, cells contained in the sample solution are disrupted, and then the cell membrane is reconstituted. When the average pore diameter of the first membrane filter is 8 μm or more, clogging of the filter can be suppressed, and therefore, a decrease in the efficiency of extrusion treatment can be suppressed. Moreover, by setting the average pore diameter of the first membrane filter to 8 μm or more, it is possible to suppress the filter from being torn due to an increase in pressure. The average pore diameter of the first membrane filter is preferably 20 μm or less, more preferably 15 μm or less, and 12 μm or less, from the viewpoint of reducing variation in particle size among particles contained in the first liquid. It is even more preferable.
第２工程では、第１の液体を、密度勾配遠心によって複数の画分に分離した後、複数の画分のうち細胞膜成分を含む画分を回収する（Ｐ１２０）。密度勾配溶液に用いられる溶質は、特に限定されないが、例えば、ショ糖、グリセロール、ポリサッカライド、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標、GE Healthcare Bioscience社製）、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標、Serumwerk Bernburg社製）、Ｐｅｒｃｏｌｌ（cytiva社製）、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（Serumwerk Bernburg社製）等を挙げることができる。密度勾配遠心の条件は、細胞膜成分を含む画分とそれ以外の画分とを分離することができる限り、特に限定されないが、例えば、密度勾配５質量％以上７０質量％以下、７，００００×ｇ以上１００，０００×ｇ以下、１０分以上２４時間以下等の条件で密度勾配超遠心を行ってもよい。例えば、ＯｐｔｉＰｒｅｐを用いた場合には、密度勾配を１０質量％～５０質量％に設定して、１０，００００×ｇ、３０分間等の条件で密度勾配超遠心を行ってもよい。なお、密度勾配遠心は、４℃等の低温で実施されることが好ましい。 In the second step, the first liquid is separated into a plurality of fractions by density gradient centrifugation, and then a fraction containing cell membrane components is collected from among the plurality of fractions (P120). The solute used in the density gradient solution is not particularly limited, but includes, for example, sucrose, glycerol, polysaccharide, Ficoll (registered trademark, manufactured by GE Healthcare Bioscience), Nycodenz (registered trademark, manufactured by Serumwerk Bernburg), Percoll (cytiva OptiPrep (manufactured by Serumwerk Bernburg), etc. The conditions for density gradient centrifugation are not particularly limited as long as the fraction containing cell membrane components can be separated from the other fractions, but for example, a density gradient of 5% by mass or more and 70% by mass or less, 70,000× Density gradient ultracentrifugation may be performed under conditions such as 10 minutes or more and 24 hours or less, 100,000 x g or more and 100,000 x g or less. For example, when using OptiPrep, density gradient ultracentrifugation may be performed under conditions such as 10,0000 x g for 30 minutes with the density gradient set at 10% by mass to 50% by mass. Note that density gradient centrifugation is preferably performed at a low temperature such as 4°C.
複数の画分のうち細胞膜成分を含む画分を回収する際に、細胞膜成分を含む画分を特定する方法については、特に限定されない。細胞膜成分を含む画分は、例えば、細胞膜を染色する色素によって予め細胞を染色した後に、密度勾配遠心によって分画された複数の画分における吸光度を測定することによって特定してもよい。また、密度勾配遠心によって分画された複数の画分に対して、細胞膜に局在する核酸を指標としたノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ、ＤＮＡアレイ等を行うことによって特定してもよい。また、密度勾配遠心によって分画された複数の画分に対して、細胞膜のマーカータンパク質を指標としたウェスタンブロッティングを行うことによって特定してもよい。細胞膜のマーカータンパク質としては、例えば、Ｎ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅや、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ等が挙げられる。細胞膜成分を含む画分は、密度勾配遠心によって分画された最上層であってもよい。例えば、ＯｐｔｉＰｒｅｐを用いた場合には、ＯｐｔｉＰｒｅｐ不含画分であってもよい。 When collecting a fraction containing a cell membrane component from among a plurality of fractions, there is no particular limitation on the method for identifying the fraction containing a cell membrane component. Fractions containing cell membrane components may be identified, for example, by staining cells in advance with a dye that stains cell membranes, and then measuring the absorbance in a plurality of fractions fractionated by density gradient centrifugation. Alternatively, identification may be performed by performing Northern hybridization, RT-PCR, DNA array, etc. using nucleic acids localized in the cell membrane as an indicator on a plurality of fractions separated by density gradient centrifugation. Alternatively, the identification may be performed by performing Western blotting using a cell membrane marker protein as an indicator for a plurality of fractions separated by density gradient centrifugation. Examples of cell membrane marker proteins include N+/K+ ATPase and N-Cadherin. The fraction containing cell membrane components may be the top layer fractionated by density gradient centrifugation. For example, when OptiPrep is used, an OptiPrep-free fraction may be used.
第２工程において回収される画分は、ミトコンドリアに由来する成分の含有量が少ないことが好ましい。ミトコンドリアは、一般に、細胞死シグナルを媒介する細胞内小器官として知られている。このため、ミトコンドリア由来成分の含有量が少ないことにより、アポトーシス等の細胞死シグナルがキャリアに内包されることを抑制できるので、キャリアが送達された細胞が障害を受けることを抑制できる。 The fraction collected in the second step preferably has a low content of mitochondria-derived components. Mitochondria are generally known as intracellular organelles that mediate cell death signals. Therefore, since the content of mitochondria-derived components is small, cell death signals such as apoptosis can be inhibited from being included in the carrier, and therefore cells to which the carrier is delivered can be inhibited from being damaged.
第３工程では、回収された前記画分を含む第２の液体を、平均孔径０．５μｍ以下の第２のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン処理することにより、キャリアを含む液体を得る（Ｐ１３０）。なお、第２の液体は、第３工程の前に、予め、例えば平均孔径０．５μｍを超えるメンブレンフィルター等を用いた更なるエクストルージョン処理が行われたものであってもよい。 In the third step, the second liquid containing the collected fraction is subjected to extrusion treatment using a second membrane filter with an average pore size of 0.5 μm or less to obtain a liquid containing the carrier (P130). . Note that the second liquid may be subjected to further extrusion treatment using, for example, a membrane filter having an average pore diameter of more than 0.5 μm before the third step.
第３工程で用いる第２のメンブレンフィルターの素材は、第１のメンブレンフィルターと同様のものであってもよい。また、第３工程のエクストルージョン処理は、第１工程のエクストルージョン処理と同様の器具を用いて行ってもよい。第３工程では、細胞膜成分を含む画分を、第２のメンブレンフィルターに複数回通過させることが好ましい。複数回通過させる方法は、上述の第１工程と同様であってもよい。細胞膜成分を含む画分を第２のメンブレンフィルターに複数回通過させることにより、第２の液体に含まれる粒子における粒子径のばらつきをより低減することができる。通過させる回数は、３回以上が好ましく、５回以上がより好ましく、９回以上がさらに好ましく、１３回以上がより一層好ましい。 The material of the second membrane filter used in the third step may be the same as that of the first membrane filter. Further, the extrusion treatment in the third step may be performed using the same equipment as in the extrusion treatment in the first step. In the third step, it is preferable that the fraction containing cell membrane components is passed through the second membrane filter multiple times. The method of passing it multiple times may be the same as the first step described above. By passing the fraction containing cell membrane components through the second membrane filter multiple times, it is possible to further reduce variations in particle size among particles contained in the second liquid. The number of times of passing is preferably 3 or more, more preferably 5 or more, even more preferably 9 or more, and even more preferably 13 or more.
第２のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン処理を行うことにより、細胞膜成分を含む画分に含まれる核が壊れて核酸が放出され、その後、膜が再構成される。第２のメンブレンフィルターの平均孔径は、夾雑物の除去効率を高める観点から、０．４μｍ以下であることがより好ましい。第２のメンブレンフィルターの平均孔径は、フィルターの目詰まりを抑制してキャリアの生産効率が低下することを抑制する観点から、０．３μｍ以上であることが好ましい。 By performing extrusion treatment using the second membrane filter, the nuclei contained in the fraction containing cell membrane components are broken, nucleic acids are released, and the membrane is then reconstituted. The average pore diameter of the second membrane filter is more preferably 0.4 μm or less from the viewpoint of increasing the efficiency of removing impurities. The average pore diameter of the second membrane filter is preferably 0.3 μm or more from the viewpoint of suppressing clogging of the filter and suppressing a decrease in carrier production efficiency.
上記生産方法によって得られた液体には、細胞に由来するキャリアとして、粒子径０．１μｍ以上０．５μｍ以下の粒子が全粒子のうち９５％以上含まれ、粒子径のばらつきも少なくなることが期待される。 The liquid obtained by the above production method contains particles with a particle size of 0.1 μm or more and 0.5 μm or less as carriers derived from cells in 95% or more of all particles, and the variation in particle size is also reduced. Be expected.
以上説明した本実施形態におけるキャリアの生産方法によれば、夾雑物を減らすことができるので、キャリアの再現性を向上できる。より具体的には、例えば、親細胞の継代数の違い等、細胞の状態の違いに起因する再現性の低下を抑制できる。一般に、親細胞の継代数の増加に伴って、アポトーシス等の細胞死シグナルが増加する傾向にある。しかしながら、本実施形態におけるキャリアの生産方法によれば、細胞死シグナルがキャリアに内包されることを抑制できるので、キャリアが送達された細胞が障害を受けることを抑制できる。 According to the carrier production method according to the present embodiment described above, contaminants can be reduced, and thus carrier reproducibility can be improved. More specifically, it is possible to suppress a decrease in reproducibility caused by differences in cell conditions, such as differences in the number of passages of parent cells. Generally, as the number of passages of parent cells increases, cell death signals such as apoptosis tend to increase. However, according to the carrier production method of the present embodiment, it is possible to suppress cell death signals from being included in the carrier, and therefore it is possible to suppress damage to cells to which the carrier is delivered.
一般に、エクソソームは、産業応用が期待される一方で、細胞からの遊離量が非常に少ないため収量が極めて小さいという問題がある。これに対して、本実施形態のキャリアの生産方法によれば、収量を増大できるので、安定供給が可能となる結果として、薬物送達システムとしての有用性を高めることができる。また、一般に、リポソームは、原料となる脂質への有機化学的な修飾が必要であるため、標的化シグナル分子の付加による組織標的化が困難であるという問題がある。これに対して、本実施形態のキャリアの生産方法によれば、原料となる親細胞への遺伝子導入によって、キャリア表面にシグナル分子を発現させることが期待できるため、組織標的化の実現性を高めることができる。また、例えば、親細胞としてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ等の蛍光基質を細胞膜上に発現する細胞を使用した場合、蛍光基質を発現するキャリアを生産できるので、体内動態の可視化に利用することができる。 In general, while exosomes are expected to have industrial applications, there is a problem in that the yield is extremely small because the amount released from cells is very small. On the other hand, according to the carrier production method of the present embodiment, the yield can be increased, and as a result, a stable supply can be achieved, and as a result, the usefulness as a drug delivery system can be increased. Furthermore, since liposomes generally require organic chemical modification of the lipids used as raw materials, there is a problem in that it is difficult to target tissues by adding targeting signal molecules. On the other hand, according to the carrier production method of the present embodiment, it is expected that signal molecules will be expressed on the carrier surface by gene introduction into the parent cells serving as raw materials, thereby increasing the feasibility of tissue targeting. be able to. Furthermore, for example, when a cell expressing a fluorescent substrate such as Luciferase on its cell membrane is used as a parent cell, a carrier expressing the fluorescent substrate can be produced, which can be used for visualization of internal dynamics.
上述の生産方法によって生産されたキャリアの内部に、薬物等の物質をローディング（導入）する方法については、特に限定されないが、例えば、リポフェクション法やリモートローディング法等を用いてもよい。キャリアの内部に薬物等の物質をローディングする方法として、エレクトロポレーションを用いてもよい。リポフェクション法は、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標、Thermo Fisher Scientific社製）等のトランスフェクション試薬を用いて行うことができる。リポフェクション法を用いて薬物等の物質をキャリアに内包させる方法の一例について、以下に説明する。この方法としては、第３工程後におけるキャリアを含む液体に、ローディングする薬物等の物質およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅは登録商標、Thermo Fisher Scientific社製）を添加し、室温で１５分間インキュベートする。その後、Ｐａｌｌ １００Ｋ メンブレンフィルター（ＰＡＬＬ社製）をセットした限外濾過フィルターユニットに供し、キャリアを回収する。このようにして、薬物等の物質がローディングされたキャリアを得ることができる。 The method of loading (introducing) a substance such as a drug into the carrier produced by the above-described production method is not particularly limited, and for example, a lipofection method, a remote loading method, etc. may be used. Electroporation may be used as a method for loading substances such as drugs into the carrier. The lipofection method can be performed, for example, using a transfection reagent such as Lipofectamine (registered trademark, manufactured by Thermo Fisher Scientific). An example of a method for encapsulating a substance such as a drug in a carrier using the lipofection method will be described below. In this method, a substance such as a drug to be loaded and Lipofectamine 3000 (Lipofectamine is a registered trademark, manufactured by Thermo Fisher Scientific) are added to the liquid containing the carrier after the third step, and the mixture is incubated at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the carrier is collected by applying it to an ultrafiltration filter unit equipped with a Pall 100K membrane filter (manufactured by PALL). In this way, a carrier loaded with a substance such as a drug can be obtained.
また、上述の生産方法の第３工程において、キャリアに内包させたい物質とともにエクストルージョン処理することにより、その物質がローディングされたキャリアを得ることができる。より具体的には、細胞膜成分を含む画分を含む第２の液体に、キャリアに内包させたい物質を混合し、その後、メンブレンフィルターを通過させることによって、脂質膜の内部に物質をローディングすることができる。 Further, in the third step of the above-described production method, by performing extrusion treatment with the substance to be included in the carrier, a carrier loaded with the substance can be obtained. More specifically, the substance to be encapsulated in the carrier is mixed with a second liquid containing a fraction containing cell membrane components, and then the substance is loaded inside the lipid membrane by passing it through a membrane filter. Can be done.
キャリアにローディングする物質としては、特に限定されないが、例えば、医薬品でもよく、この場合、医薬組成物としてもよい。また、別の態様として、キャリアにローディングする物質としては、ペプチド、タンパク質、核酸、毒素、ビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、蛍光基質、抗がん剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、分子量５０以上２０００以下の化合物よりなる群から選ばれる１種または２種以上であってもよい。核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、およびモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）等が挙げられる。ナノ粒子としては、例えば、コロイド、酸化鉄、金、炭素ナノチューブおよび磁気ビーズ等が挙げられる。蛍光基質としては、特に限定されないが、例えばローダミンが挙げられる。抗がん剤としては、特に限定されないが、例えばドキソルビシンが挙げられる。抗炎症剤としては、特に限定されないが、例えばプレドニゾロンが挙げられる。血管新生阻害剤としては、特に限定されないが、例えばベバシズマブが挙げられる。分子量５０以上２０００以下の化合物としては、特に限定されないが、例えば、タクロリムス（ＭＷ８０４）等の低分子医薬品が挙げられる。医薬品としては、人に安全に投与できるものであれば特に限定されないが、例えば、抗がん剤、抗炎症剤のほか、鎮痛剤、鎮痙剤、鎮咳剤、中枢神経系に作用する薬物等の１種以上がローディングされていてもよい。鎮痛剤としては、特に限定されないが、例えばジクロフェナクが挙げられる。鎮痙剤としては、特に限定されないが、例えばアトロピンが挙げられる。鎮咳剤としては、特に限定されないが、例えばデキストロメトルファンが挙げられる。中枢神経系に作用する薬物としては、特に限定されないが、例えばアリピプラゾールが挙げられる。
The substance loaded on the carrier is not particularly limited, but may be, for example, a pharmaceutical, and in this case, it may be a pharmaceutical composition. In another embodiment, the substances loaded on the carrier include peptides, proteins, nucleic acids, toxins, beads, microparticles, nanoparticles, fluorescent substrates, anticancer drugs, anti-inflammatory drugs, angiogenesis inhibitors,
この形態のキャリアの生産方法によれば、所望の物質がローディングされたキャリアを生産することができる。また、キャリアの生産とキャリアへのローディングとを同時に行うことができるので、キャリアへのローディングのための工程が複雑化することを抑制できる。この結果として、所望の物質がローディングされたキャリアを容易に生産できる。 According to this type of carrier production method, a carrier loaded with a desired substance can be produced. Further, since production of the carrier and loading of the carrier can be performed simultaneously, it is possible to suppress the process for loading the carrier from becoming complicated. As a result, a carrier loaded with a desired substance can be easily produced.
キャリアにローディングしたい物質ととともにエクストルージョン処理を行った場合には、その後、遠心による精密限外ろ過を行うことによって、所望の物質がローディングされたキャリアと、キャリアにローディングされなかった物質の残渣とを分離してもよい。遠心による精密限外ろ過の条件は、所望の物質がローディングされたキャリアと物質の残渣とを分離することができる限り、特に限定されないが、例えば、Ｐａｌｌ １００Ｋメンブレンフィルターをセットした限外濾過フィルターユニットに供し、５，０００ｒｐｍ、３０分間等の条件で遠心を行ってもよい。 If extrusion treatment is performed together with the substance that you want to load onto the carrier, then by performing precision ultrafiltration using centrifugation, you can separate the carrier loaded with the desired substance and the residue of the substance that was not loaded onto the carrier. may be separated. The conditions for precise ultrafiltration by centrifugation are not particularly limited as long as the carrier loaded with the desired substance and the residue of the substance can be separated, but for example, an ultrafiltration filter unit equipped with a Pall 100K membrane filter is used. The sample may be subjected to centrifugation at 5,000 rpm for 30 minutes or the like.
本開示の他の形態によれば、細胞に由来するキャリアを含む液体が提供される。細胞に由来するキャリアを含む液体は、細胞に由来する粒子径０．１μｍ以上０．５μｍ以下の粒子が全粒子のうち９５％以上含まれる。本明細書において、この割合は、全散乱光における比率であるものとする。この液体は、上述のキャリアの生産方法によって得ることができる。この液体における溶媒は、特に限定されないが、例えば、上述の生産方法の第２工程で用いた密度勾配溶液であってもよく、緩衝液等であってもよい。キャリアを含む液体における粒子径分布は、動的光散乱法（ＤＬＳ：Dynamic Light Scattering）を用いて、周囲温度２０℃、固定角９０°にてレーザー波長６５８ｎｍの条件で分析することができる。本開示の液体によれば、細胞に由来するキャリアとして、粒子径０．１μｍ以上０．５μｍ以下の粒子が全粒子のうち９５％以上含まれるので、夾雑物が少ないキャリアを提供できる。細胞に由来するキャリアを含む液体は、粒子径０．１μｍ以上０．３μｍ以下の粒子が全粒子のうち９５％以上含まれることがより好ましい。 According to another aspect of the disclosure, a liquid is provided that includes a cell-derived carrier. A liquid containing a carrier derived from cells contains 95% or more of all particles derived from cells and having a particle diameter of 0.1 μm or more and 0.5 μm or less. In this specification, this ratio is assumed to be a ratio in total scattered light. This liquid can be obtained by the carrier production method described above. The solvent in this liquid is not particularly limited, and may be, for example, the density gradient solution used in the second step of the above-mentioned production method, a buffer solution, or the like. The particle size distribution in a liquid containing a carrier can be analyzed using dynamic light scattering (DLS) at an ambient temperature of 20° C., a fixed angle of 90°, and a laser wavelength of 658 nm. According to the liquid of the present disclosure, since 95% or more of the total particles include particles with a particle size of 0.1 μm or more and 0.5 μm or less as a carrier derived from cells, a carrier with few impurities can be provided. It is more preferable that the liquid containing the carrier derived from cells contains 95% or more of all particles having a particle diameter of 0.1 μm or more and 0.3 μm or less.
細胞に由来するキャリアを含む液体は、ミトコンドリアに由来する成分を実質的に含まないことが好ましい。本開示において、「ミトコンドリアに由来する成分を実質的に含まない」とは、キャリアを含む液体をウェスタンブロッティングによって分析した場合に、ミトコンドリアに由来するタンパク質の合計発現量が、細胞膜に由来するタンパク質の合計発現量に対して１／１０未満であることを意味する。ミトコンドリアに由来する成分としては、例えば、ＴＩＭ２２、ＣＯＸ ＩＶ、ＰＵＭＡ等が挙げられる。ＰＵＭＡは、ミトコンドリア局在性アポトーシス媒介タンパク質として知られている。細胞膜に由来する成分としては、例えば、Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ等が挙げられる。細胞に由来するキャリアを含む液体が、ミトコンドリアに由来する成分を実質的に含まないことにより、細胞死シグナルがキャリアに内包されることを抑制できるので、キャリアが送達された細胞が障害を受けることを抑制できる。 Preferably, the liquid containing the cell-derived carrier is substantially free of mitochondria-derived components. In the present disclosure, "substantially free of components derived from mitochondria" means that when a liquid containing a carrier is analyzed by Western blotting, the total expression level of proteins derived from mitochondria is higher than that of proteins derived from cell membranes. This means less than 1/10 of the total expression level. Examples of components derived from mitochondria include TIM22, COX IV, PUMA, and the like. PUMA is known as a mitochondria-localized apoptosis mediating protein. Examples of components derived from cell membranes include Na+/K+ ATPase, N-cadherin, and the like. Since the liquid containing cell-derived carriers does not substantially contain mitochondria-derived components, it is possible to suppress cell death signals from being encapsulated in the carriers, thereby preventing damage to the cells to which the carriers are delivered. can be suppressed.
また、細胞に由来するキャリアを含む液体は、医薬品がローディングされている医薬組成物であってもよく、また、別の態様としては、ペプチド、タンパク質、核酸、毒素、ビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、蛍光基質、抗がん剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、分子量５０以上２０００以下の化合物よりなる群から選ばれる少なくとも１種がローディングされていてもよい。医薬品としては、人に安全に投与されるものであれば特に限定されないが、例えば、抗がん剤、抗炎症剤のほか、鎮痛剤、鎮痙剤、鎮咳剤、中枢神経系に作用する薬物等の１種以上がローディングされていてもよい。このような物質がローディングされたキャリアを含む液体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、治療や診断、実験、評価等に使用され得る。医薬組成物が液体である場合、医薬組成物の剤形として、例えば、注射剤、液剤、ローション剤等とすることができる。 In addition, the liquid containing a cell-derived carrier may be a pharmaceutical composition loaded with a drug, and in another embodiment, a peptide, protein, nucleic acid, toxin, bead, microparticle, nanoparticle. , a fluorescent substrate, an anticancer agent, an anti-inflammatory agent, an angiogenesis inhibitor, and a compound having a molecular weight of 50 or more and 2,000 or less may be loaded. Pharmaceuticals are not particularly limited as long as they can be safely administered to humans, but examples include anticancer drugs, anti-inflammatory drugs, analgesics, antispasmodics, antitussives, and drugs that act on the central nervous system. More than one species may be loaded. A liquid containing a carrier loaded with such a substance can be used for treatment, diagnosis, experiment, evaluation, etc. in vitro or in vivo. When the pharmaceutical composition is a liquid, the dosage form of the pharmaceutical composition can be, for example, an injection, a liquid, a lotion, or the like.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
＜実験１＞
図３は、実験１の手順の概要を模式的に示す説明図である。実験１は、密度勾配遠心によって分画された複数の画分のうち、細胞膜成分を含む画分を特定することを目的とする。
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FIG. 3 is an explanatory diagram schematically showing the outline of the procedure of
培養細胞として、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を用い、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤ－ＭＥＭ培地にて、３７℃５％ＣＯ２条件で、培養フラスコで培養を行った。１０ｍＭ ＥＤＴＡを３７℃で１０分間反応させることによって、細胞を培養フラスコから剥離した。その後、１０００ｒｐｍ、３分間の条件で遠心分離を行うことによって細胞を沈殿させた後に、ＰＢＳにて再懸濁した。細胞懸濁液に膜染色蛍光色素 ＤｉＤ（1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt）を１００μＭの濃度で加え、その後、室温で５分間インキュベートすることによって、細胞膜を染色した。その後、１０００ｒｐｍ、３分間の条件で遠心分離を行うことによって細胞を沈殿させた後に、ＰＢＳにて再懸濁した。このようにして、余剰の染色液を除去するとともに、細胞を洗浄した。ＡＶＥＳＴＩＮ社製のＥｘｔｒｕｄｅｒに１０μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターをセットし、１．０×１０７個のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を０．５ｍｌシリンジに充填し、エクストルージョン処理を行った。メンブレンを１３回通過させ、細胞破砕液を得た。Ｏｐｔｉｐｒｅｐによって調製した１０質量％～５０質量％密度勾配溶液に細胞破砕液を重層し、Ｏｐｔｉｍａ ＭＡＸ－ＴＬ（ベックマン社製）を用いて、１００，０００×ｇ、４℃、３０分間の条件で密度勾配超遠心を行った。密度勾配超遠心後、図３に示すＦ１からＦ７までの７つの画分に対して分析を行った。 Neuro2A cells were used as cultured cells and cultured in a culture flask at 37° C. and 5% CO 2 in D-MEM medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. Cells were detached from the culture flask by incubation with 10mM EDTA for 10 minutes at 37°C. Thereafter, the cells were precipitated by centrifugation at 1000 rpm for 3 minutes, and then resuspended in PBS. Add membrane staining fluorescent dye DiD (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt) to the cell suspension at a concentration of 100 μM, and then incubate for 5 minutes at room temperature. The cell membrane was stained by this method. Thereafter, the cells were precipitated by centrifugation at 1000 rpm for 3 minutes, and then resuspended in PBS. In this way, excess staining solution was removed and the cells were washed. A membrane filter having a pore size of 10 μm was set in an Extruder manufactured by AVESTIN, and 1.0×10 7 Neuro2A cells were filled into a 0.5 ml syringe, and extrusion treatment was performed. The membrane was passed through the membrane 13 times to obtain a cell homogenate. The cell disruption solution was layered on a 10% to 50% density gradient solution prepared by Optiprep, and the density was determined using Optima MAX-TL (manufactured by Beckman) at 100,000 x g, 4°C, and 30 minutes. Gradient ultracentrifugation was performed. After density gradient ultracentrifugation, seven fractions F1 to F7 shown in FIG. 3 were analyzed.
各画分に含まれる膜染色蛍光色素の量を比較するために、励起波長６２０ｎｍ、吸収波長６９０ｎｍにおける吸光度を測定した。図４は、各画分に含まれる膜染色蛍光色素の量を示す説明図である。図４において、縦軸は、各画分に含まれる膜染色蛍光色素の吸光度を示している。図４に示す結果から、膜染色蛍光色素は、画分Ｆ１および画分Ｆ２に比較的多く含まれていることがわかった。 In order to compare the amount of membrane staining fluorescent dye contained in each fraction, the absorbance was measured at an excitation wavelength of 620 nm and an absorption wavelength of 690 nm. FIG. 4 is an explanatory diagram showing the amount of membrane staining fluorescent dye contained in each fraction. In FIG. 4, the vertical axis indicates the absorbance of the membrane staining fluorescent dye contained in each fraction. From the results shown in FIG. 4, it was found that the membrane staining fluorescent dye was contained in a relatively large amount in fraction F1 and fraction F2.
各画分において発現しているタンパク質の種類を調べるために、各種マーカータンパク質を用いたウェスタンブロッティングを行った。細胞膜のマーカータンパク質として、Ｎ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅおよびＮ－Ｃａｄｈｅｒｉｎを用いた。サイトゾルのマーカータンパク質として、β－ＴｉｂｉｌｉｎおよびＧＡＰＤＨを用いた。ミトコンドリアのマーカータンパク質として、ＴＩＭ２２、ＣＯＸ ＩＶ、およびＰＵＭＡを用いた。ウェスタンブロッティングは、以下のようにして行った。１．０×１０５個分に相当する各画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。その後、５％スキムミルクを用いて１時間ブロッキングを行った後に、一次抗体と４℃で一晩反応させた。その後、二次抗体と室温で１時間反応させた後に、ＬＡＳ－４０００（富士フィルム社製）を用いて検出した。一次抗体としては、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅα ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ａｎｔｉ－Ｎ Ｃａｄｈｅｒｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｂｃａｍ社）、β－Ｔｕｂｕｌｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨ ｍＡｂ（Ｍｅｄｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ＴＩＭ２２ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）、Ａｎｔｉ－ＣＯＸ ＩＶ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｂｃａｍ社）、ＰＵＭＡα／β ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いた。二次抗体としては、ＥＣＬ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ‘）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｃｙｔｉｖａ社）、ＥＣＬ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ， ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ‘）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いた。 In order to investigate the types of proteins expressed in each fraction, Western blotting was performed using various marker proteins. N+/K+ ATPase and N-Cadherin were used as marker proteins for cell membranes. β-Tibilin and GAPDH were used as cytosolic marker proteins. TIM22, COX IV, and PUMA were used as mitochondrial marker proteins. Western blotting was performed as follows. Each fraction corresponding to 1.0×10 5 cells was electrophoresed by SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane. After that, blocking was performed for 1 hour using 5% skim milk, and then reacted with the primary antibody overnight at 4°C. Thereafter, it was reacted with a secondary antibody at room temperature for 1 hour, and then detected using LAS-4000 (manufactured by Fuji Film). Primary antibodies include Na + /K + -ATPase α antibody (Santa Cruz Biotechnology), Anti-N Cadherin antibody (abcam), β-Tubulin antibody (Cell Sign). Anti-GAPDH mAb (Medical & Biological Laboratories) ), TIM22 Polyclonal antibody (Proteintech), Anti-COX IV antibody (Abcam), and PUMAα/β antibody (Santa Cruz Biotechnology). As the secondary antibodies, ECL Mouse IgG, HRP-linked F(ab') 2 fragment (Cytiva), and ECL Rabbit IgG, HRP-linked F(ab') 2 fragment (Cytiva) were used.
図５は、ウェスタンブロッティングの結果を示す説明図である。図５に示す結果から、以下のことがわかった。ミトコンドリア由来のＴＩＭ２２は、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ ２０質量％～３０質量％画分に多く含まれていた。ミトコンドリア由来のＣＯＸ ＩＶおよびＰＵＭＡは、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ １５質量％～２０質量％画分に多く含まれていた。これに対し、細胞膜由来のＮ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅおよびＮ－Ｃａｄｈｅｒｉｎは、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ不含画分に最も多く含まれており、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ １０質量％画分にも含まれることがわかった。また、サイトゾル由来のβ－ＴｉｂｉｌｉｎおよびＧＡＰＤＨは、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ不含画分に最も多く含まれており、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ １０質量％～１５質量％画分にも含まれていたが、Ｏｐｔｉｐｒｅｐの濃度が増大するにつれて含有量が減少する傾向にあった。これらのことから、細胞膜由来成分の含有量が多く、且つ、ミトコンドリア由来成分の含有量が少ない画分は、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ不含画分（Ｆ１）やＯｐｔｉｐｒｅｐ １０質量％画分であることがわかった。
FIG. 5 is an explanatory diagram showing the results of Western blotting. From the results shown in FIG. 5, the following was found. Mitochondrial-derived TIM22 was abundantly contained in the
＜実験２＞
実験２は、各液体における粒子径分布を調べることを目的とする。
<Experiment 2>
Experiment 2 aimed to investigate the particle size distribution in each liquid.
培養細胞として、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を用い、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤ－ＭＥＭ培地にて、３７℃５％ＣＯ２条件で、培養フラスコで培養を行った。１０ｍＭ ＥＤＴＡを３７℃で１０分間反応させることによって、細胞を培養フラスコから剥離した。その後、１０００ｒｐｍ、３分間の条件で遠心分離を行うことによって細胞を沈殿させた後に、ＰＢＳにて再懸濁した。ＡＶＥＳＴＩＮ社製のＥｘｔｒｕｄｅｒに１０μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターをセットし、１．０×１０７個のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を０．５ｍｌシリンジに充填した。その後、メンブレンを１３回通過させることによってエクストルージョン処理を行い、第１の液体を得た（第１工程）。Ｏｐｔｉｐｒｅｐによって調製した２０質量％密度勾配溶液に第１の液体を重層し、Ｏｐｔｉｍａ ＭＡＸ－ＴＬ（ベックマン社製）を用いて、１００，０００×ｇ、４℃、３０分間の条件で密度勾配超遠心を行った。密度勾配超遠心後の上層（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ不含画分）を回収した（第２工程）。ＡＶＥＳＴＩＮ社製のＥｘｔｒｕｄｅｒに０．４μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターをセットし、第２の液体として、回収した画分を０．５ｍｌシリンジに充填した。その後、メンブレンを１３回通過させることによってエクストルージョン処理を行い、キャリアを含む液体を得た（第３工程）。 Neuro2A cells were used as cultured cells and cultured in a culture flask at 37° C. and 5% CO 2 in D-MEM medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. Cells were detached from the culture flask by incubation with 10mM EDTA for 10 minutes at 37°C. Thereafter, the cells were precipitated by centrifugation at 1000 rpm for 3 minutes, and then resuspended in PBS. A membrane filter having a pore size of 10 μm was set in an Extruder manufactured by AVESTIN, and 1.0×10 7 Neuro2A cells were filled into a 0.5 ml syringe. Thereafter, extrusion treatment was performed by passing through the membrane 13 times to obtain a first liquid (first step). The first liquid was layered on a 20% density gradient solution prepared by Optiprep, and density gradient ultracentrifugation was performed at 100,000 x g, 4°C, and 30 minutes using Optima MAX-TL (manufactured by Beckman). I did it. The upper layer (Optiprep-free fraction) after density gradient ultracentrifugation was collected (second step). A membrane filter having a pore size of 0.4 μm was set in an Extruder manufactured by AVESTIN, and the collected fraction was filled into a 0.5 ml syringe as a second liquid. Thereafter, extrusion treatment was performed by passing through the membrane 13 times to obtain a carrier-containing liquid (third step).
第１の液体、第２の液体、第３工程によって得られたキャリアを含む液体について、それぞれ粒子径分布を調べた。各画分に含まれる液体２０μｌを測定に供した。各液体について、ＤｅｌｓａＭａｘ Ｃｏｒｅ（ベックマン・コールター社製）を用いて粒子径を測定した。測定は、周囲温度を２０℃とし、固定角９０°にてレーザー波長６５８ｎｍの条件で実施した。５秒間の測定２０回分の平均を測定データとし、Ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓにより解析した。 The particle size distributions of the first liquid, the second liquid, and the carrier-containing liquid obtained in the third step were examined. 20 μl of the liquid contained in each fraction was subjected to measurement. The particle size of each liquid was measured using DelsaMax Core (manufactured by Beckman Coulter). The measurements were carried out under the conditions of an ambient temperature of 20° C., a fixed angle of 90°, and a laser wavelength of 658 nm. The average of 20 measurements for 5 seconds was used as measurement data, and analyzed by Regularization Analysis.
図６は、第１の液体における粒子径分布を示す説明図である。図７は、第２の液体における粒子径分布を示す説明図である。図８は、キャリアを含む液体における粒子径分布を示す説明図である。図６～図８において、縦軸は強度（％）を示し、横軸は粒子径（ｎｍ）を示している。 FIG. 6 is an explanatory diagram showing the particle size distribution in the first liquid. FIG. 7 is an explanatory diagram showing the particle size distribution in the second liquid. FIG. 8 is an explanatory diagram showing the particle size distribution in a liquid containing a carrier. In FIGS. 6 to 8, the vertical axis indicates intensity (%), and the horizontal axis indicates particle diameter (nm).
図６に示すように、第１工程によって得られた第１の液体は、粒子径８３７．５ｎｍをピークトップとする大きなピークを有し、また、粒子径１４０８９．６ｎｍをピークトップとするブロードなピークを有していた。このため、第１の液体には、夾雑物が多く含まれていることが示唆された。第３工程の０．４μｍフィルターによるエクストルージョンの前後の結果である図７と図８とを比較すると、エクストルージョン前の液体（第２の液体）では、粒子径２８５．７ｎｍをピークトップとするピークが認められ、エクストルージョン後の液体（キャリアを含む液体）では、粒子径１９７．７ｎｍをピークトップとするピークが認められた。そして、エクストルージョン後の液体では、エクストルージョン前の液体と比較して、ピークの形状が非常にシャープであった。したがって、各工程を経ることによって、目的とする１５０ｎｍ～２５０ｎｍ程度の粒子径を有するキャリアを精製することができたといえる。 As shown in FIG. 6, the first liquid obtained in the first step has a large peak with a particle size of 837.5 nm as the peak top, and a broad peak with a particle size of 14089.6 nm as the peak top. It had a peak. Therefore, it was suggested that the first liquid contained many impurities. Comparing Figures 7 and 8, which show the results before and after extrusion using a 0.4 μm filter in the third step, it is found that the liquid before extrusion (second liquid) has a peak top with a particle size of 285.7 nm. A peak was observed, and in the liquid after extrusion (liquid containing carrier), a peak with a particle size of 197.7 nm as the peak top was observed. The liquid after extrusion had a much sharper peak shape than the liquid before extrusion. Therefore, it can be said that by going through each step, it was possible to refine a carrier having the desired particle diameter of about 150 nm to 250 nm.
＜実験３＞
図９は、実験３の手順の概要を模式的に示す説明図である。実験３は、第３工程のエクストルージョン処理においてキャリアに物質をローディングすることを目的とする。
<Experiment 3>
FIG. 9 is an explanatory diagram schematically showing the outline of the procedure of Experiment 3. Experiment 3 aims to load a substance onto the carrier in the third step of extrusion treatment.
培養細胞として、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を用い、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤ－ＭＥＭ培地にて、３７℃５％ＣＯ２条件で、培養フラスコで培養を行った。１０ｍＭ ＥＤＴＡを３７℃で１０分間反応させることによって、細胞を培養フラスコから剥離した。その後、１０００ｒｐｍ、３分間の条件で遠心分離を行うことによって細胞を沈殿させた後に、ＰＢＳにて再懸濁した。ＡＶＥＳＴＩＮ社製のＥｘｔｒｕｄｅｒに１０μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターをセットし、１．０×１０７個のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を０．５ｍｌシリンジに充填した。その後、メンブレンを１３回通過させることによってエクストルージョン処理を行い、第１の液体を得た（第１工程）。Ｏｐｔｉｐｒｅｐによって調製した１０質量％密度勾配溶液に第１の液体を重層し、Ｏｐｔｉｍａ ＭＡＸ－ＴＬ（ベックマン社製）を用いて、１００，０００×ｇ、４℃、３０分間の条件で密度勾配超遠心を行った。密度勾配超遠心後の上層（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ不含画分）を回収した（第２工程）。 Neuro2A cells were used as cultured cells and cultured in a culture flask at 37° C. and 5% CO 2 in D-MEM medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. Cells were detached from the culture flask by incubation with 10mM EDTA for 10 minutes at 37°C. Thereafter, the cells were precipitated by centrifugation at 1000 rpm for 3 minutes, and then resuspended in PBS. A membrane filter having a pore size of 10 μm was set in an Extruder manufactured by AVESTIN, and 1.0×10 7 Neuro2A cells were filled into a 0.5 ml syringe. Thereafter, extrusion treatment was performed by passing through the membrane 13 times to obtain a first liquid (first step). The first liquid was layered on a 10% density gradient solution prepared by Optiprep, and density gradient ultracentrifugation was performed at 100,000 x g, 4°C, and 30 minutes using Optima MAX-TL (manufactured by Beckman). I did it. The upper layer (Optiprep-free fraction) after density gradient ultracentrifugation was collected (second step).
ＡＶＥＳＴＩＮ社製のＥｘｔｒｕｄｅｒに０．４μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターをセットした。回収した画分に５０μＭの脂溶性色素ＤｉＤを添加したものを０．５ｍｌシリンジに充填した。その後、メンブレンを１３回通過させることによってエクストルージョン処理を行った（第３工程）。キャリアに内包されなかったＤｉＤを除去するために、Ｐａｌｌ １００Ｋメンブレンフィルターを用いて、５，０００×ｇ、３０分間の条件で遠心することにより限外ろ過を行った。その後、上層を回収した。 A membrane filter having a pore size of 0.4 μm was set in an Extruder manufactured by AVESTIN. A 0.5 ml syringe was filled with the collected fractions to which 50 μM of a fat-soluble dye DiD was added. Thereafter, extrusion treatment was performed by passing the membrane 13 times (third step). In order to remove DiD that was not encapsulated in the carrier, ultrafiltration was performed using a Pall 100K membrane filter by centrifugation at 5,000 x g for 30 minutes. Thereafter, the upper layer was collected.
図１０は、ＤｉＤの封入効率を示す説明図である。ＤｉＤの封入効率を確認するために、吸光度を測定した。添加したＤｉＤ溶液と、限外ろ過後の上層とについて、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３（Molecular Devices社）を用いて５９５ｎｍの波長における吸光度を測定した。図１０における縦軸は、５９５ｎｍにおける吸光度を示している。図１０に示す結果から、第３工程においてＤｉＤを添加してエクストルージョン処理を行った場合、大部分のＤｉＤがキャリアに封入されることが明らかとなった。吸光度の値に基づいて算出したＤｉＤの封入効率は、８３．０１％であった。この結果から、第３工程において、キャリアにローディングしたい物質を添加してエクストルージョン処理を行うことによって、所望の物質が導入されたキャリアを効率的に生産できることが示唆された。 FIG. 10 is an explanatory diagram showing the encapsulation efficiency of DiD. In order to confirm the encapsulation efficiency of DiD, absorbance was measured. The absorbance at a wavelength of 595 nm was measured for the added DiD solution and the upper layer after ultrafiltration using SpectraMax i3 (Molecular Devices). The vertical axis in FIG. 10 indicates absorbance at 595 nm. The results shown in FIG. 10 revealed that when DiD was added and extrusion treatment was performed in the third step, most of the DiD was encapsulated in the carrier. The encapsulation efficiency of DiD calculated based on the absorbance value was 83.01%. This result suggested that in the third step, by adding the desired substance to the carrier and performing extrusion treatment, it is possible to efficiently produce a carrier into which the desired substance has been introduced.
＜実験４＞
図１１は、実験４の手順の概要を模式的に示す説明図である。実験４は、生産されたキャリアに、エレクトロポレーションを用いてタンパク質をローディングすることを目的とする。
<Experiment 4>
FIG. 11 is an explanatory diagram schematically showing the outline of the procedure of Experiment 4. Experiment 4 aims to load proteins onto the produced carrier using electroporation.
培養細胞として、１８×１０６個のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を用いた。１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤ－ＭＥＭ培地にて、３７℃５％ＣＯ２条件で、培養フラスコで培養を行った。１０ｍＭ ＥＤＴＡを３７℃で１０分間反応させることによって、細胞を培養フラスコから剥離して回収した。その後、１０００ｒｐｍ、３分間の条件で遠心分離を行うことによって細胞を沈殿させた後に、ＰＢＳに再懸濁させた。ＡＶＥＳＴＩＮ社製のＥｘｔｒｕｄｅｒに１０μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターをセットし、ＰＢＳ懸濁液をシリンジに充填した。その後、メンブレンを１３回通過させることによってエクストルージョン処理を行い、細胞破砕液を得た。Ｏｐｔｉｐｒｅｐによって調製した１５質量％、２０質量％密度勾配溶液に細胞破砕液を重層し、Ｏｐｔｉｍａ ＭＡＸ－ＴＬ（ベックマン社製）を用いて、１００，０００×ｇ、４℃、３０分間の条件で密度勾配超遠心を行った。密度勾配超遠心後の上層（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ不含画分）を回収した。回収画分に対して、ＡＶＥＳＴＩＮ社製のＥｘｔｒｕｄｅｒを用いて、１μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターを１３回通過させ、エクストルージョン処理を行った。さらに、ＡＶＥＳＴＩＮ社製のＥｘｔｒｕｄｅｒを用いて、０．４μｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターを１３回通過させることによってエクストルージョン処理を行った。これにより、キャリアを含む液体を得た。 18×10 6 Neuro2A cells were used as cultured cells. Culture was performed in a culture flask at 37° C. and 5% CO 2 in D-MEM medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. Cells were detached from the culture flask and collected by reacting with 10 mM EDTA at 37°C for 10 minutes. Thereafter, the cells were precipitated by centrifugation at 1000 rpm for 3 minutes, and then resuspended in PBS. A membrane filter having a pore size of 10 μm was set in an Extruder manufactured by AVESTIN, and the PBS suspension was filled into a syringe. Thereafter, extrusion treatment was performed by passing through the membrane 13 times to obtain a cell disruption solution. Cell disruption solution was overlaid on 15% by mass and 20% by mass density gradient solutions prepared by Optiprep, and the density was determined using Optima MAX-TL (manufactured by Beckman) at 100,000 x g, 4°C, and 30 minutes. Gradient ultracentrifugation was performed. The upper layer (Optiprep-free fraction) after density gradient ultracentrifugation was collected. The collected fraction was subjected to extrusion treatment by passing it through a membrane filter having a pore size of 1 μm 13 times using an Extruder manufactured by AVESTIN. Furthermore, extrusion treatment was performed by passing through a membrane filter having a pore size of 0.4 μm 13 times using an Extruder manufactured by AVESTIN. As a result, a liquid containing a carrier was obtained.
得られた液体を、１００Ｋのナノセップ（登録商標）のメンブラン上に採取し、Ｖ４ＸＰ－３０２４ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ Ｘ Ｋｉｔに含まれるバッファーにて回収した。４．５×１０６個、１．５×１０６個、０．５×１０６個の細胞に相当する濃度となるように同バッファーにて希釈した後に、各溶液中にＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）１μｇを添加し、Ｌｏｎｚａ社製の４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）を用いてエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーションは、製造元における「Ｎｅｕｒｏ２Ａ ＨＥ（High efficiency)」とのプリセット条件（パルスコード：ＤＳ－１３７）にて実施した。その後、１００Ｋのナノセップ（登録商標）を用いてＰＢＳにて洗浄し、キャリアを含む液体をメンブラン上に採取した。その後、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３、Molecular Devices社製）を用いて、励起波長３９５ｎｍ、吸光波長５０９ｎｍにてＧＦＰ蛍光を検出した。なお、図１１では、中空の丸で示されるキャリアに対して、ＧＦＰが封入されたキャリアにハッチングを付している。 The obtained liquid was collected on a 100K Nanosep (registered trademark) membrane and collected with the buffer included in the V4XP-3024 P3 Primary Cell 4D X Kit. After diluting with the same buffer to a concentration corresponding to 4.5 × 10 6 cells, 1.5 × 10 6 cells, and 0.5 × 10 6 cells, GFP (Green Fluorescent Protein) was added to each solution. ), and electroporation was performed using 4D-Nucleofector (registered trademark) manufactured by Lonza. Electroporation was performed under the preset conditions (pulse code: DS-137) of "Neuro2A HE (High efficiency)" by the manufacturer. Thereafter, it was washed with PBS using 100K Nanosep (registered trademark), and the liquid containing the carrier was collected onto the membrane. Thereafter, GFP fluorescence was detected using a plate reader (SpectraMax i3, manufactured by Molecular Devices) at an excitation wavelength of 395 nm and an absorption wavelength of 509 nm. Note that in FIG. 11, carriers in which GFP is encapsulated are hatched in contrast to carriers indicated by hollow circles.
図１２は、キャリアに封入されたＧＦＰの蛍光強度を示す説明図である。図１２に示されるように、キャリアの量に応じてＧＦＰ蛍光強度が増大することがわかった。この結果によれば、エレクトロポレーション法を用いることによって、タンパク質レベルの分子量の大きな分子についてもキャリアに内包させることが可能であることが示された。 FIG. 12 is an explanatory diagram showing the fluorescence intensity of GFP encapsulated in a carrier. As shown in FIG. 12, it was found that the GFP fluorescence intensity increased depending on the amount of carrier. According to this result, it was shown that by using the electroporation method, it is possible to encapsulate molecules with a large molecular weight at the protein level in a carrier.
この発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。 This invention is in no way limited to the description of the embodiments and examples of the invention described above. This invention includes various modifications that can be easily conceived by those skilled in the art without departing from the scope of the claims.
Claims (11)
前記細胞を含む試料液を、平均孔径８μｍ以上の第１のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン処理することにより、第１の液体を得る第１工程と、
前記第１の液体を、密度勾配遠心によって複数の画分に分離した後、前記複数の画分のうち細胞膜成分を含む画分を回収する第２工程と、
回収された前記画分を含む第２の液体を、平均孔径０．５μｍ以下の第２のメンブレンフィルターを用いてエクストルージョン処理することにより、キャリアを含む液体を得る第３工程と、
を含む、
キャリアの生産方法。 A method for producing a carrier derived from cells, the method comprising:
A first step of obtaining a first liquid by extruding the sample liquid containing the cells using a first membrane filter having an average pore size of 8 μm or more;
a second step of separating the first liquid into a plurality of fractions by density gradient centrifugation, and then collecting a fraction containing a cell membrane component from among the plurality of fractions;
A third step of obtaining a carrier-containing liquid by extruding the second liquid containing the collected fraction using a second membrane filter with an average pore size of 0.5 μm or less;
including,
How to produce carriers.
前記第３工程では、前記第２の液体に物質を混合してエクストルージョン処理することにより、前記物質がローディングされたキャリアを得る、キャリアの生産方法。 The method for producing a carrier according to claim 1,
In the third step, a carrier is obtained by mixing a substance with the second liquid and subjecting the mixture to extrusion treatment to obtain a carrier loaded with the substance.
前記物質は、医薬品である、キャリアの生産方法。 The method for producing a carrier according to claim 2,
A method for producing a carrier, wherein the substance is a pharmaceutical.
前記物質は、ペプチド、タンパク質、核酸、毒素、ビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、蛍光基質、抗がん剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、分子量５０以上２０００以下の化合物よりなる群から選ばれる少なくとも１種である、キャリアの生産方法。 The method for producing a carrier according to claim 2,
The substance is selected from the group consisting of peptides, proteins, nucleic acids, toxins, beads, microparticles, nanoparticles, fluorescent substrates, anticancer agents, antiinflammatory agents, angiogenesis inhibitors, and compounds with a molecular weight of 50 or more and 2000 or less. At least one method for producing a carrier.
前記第１のメンブレンフィルターは、平均孔径１５μｍ以下である、キャリアの生産方法。 In the method for producing a carrier according to claim 1 or 2,
The method for producing a carrier, wherein the first membrane filter has an average pore diameter of 15 μm or less.
前記第２のメンブレンフィルターは、平均孔径０．３μｍ以上である、キャリアの生産方法。 In the method for producing a carrier according to claim 1 or 2,
The method for producing a carrier, wherein the second membrane filter has an average pore diameter of 0.3 μm or more.
前記細胞に由来する粒子径０．１μｍ以上０．５μｍ以下の粒子が全粒子のうち９５％以上含まれる、
キャリアを含む液体。 A liquid containing a carrier derived from cells,
95% or more of all particles contain particles with a particle size of 0.1 μm or more and 0.5 μm or less derived from the cells,
Liquid containing carrier.
ミトコンドリアに由来する成分を実質的に含まない、
キャリアを含む液体。 The liquid according to claim 8,
Contains virtually no components derived from mitochondria,
Liquid containing carrier.
ペプチド、タンパク質、核酸、毒素、ビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、蛍光基質、抗がん剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、分子量５０以上２０００以下の化合物よりなる群から選ばれる少なくとも１種がローディングされた、
キャリアを含む液体。 The liquid according to claim 8 or 9,
At least one member selected from the group consisting of peptides, proteins, nucleic acids, toxins, beads, microparticles, nanoparticles, fluorescent substrates, anticancer agents, anti-inflammatory agents, angiogenesis inhibitors, and compounds with a molecular weight of 50 to 2000. loaded,
Liquid containing carrier.
Applications Claiming Priority (2)
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