JP2024034277A - mass spectrometry imaging method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、質量分析イメージング法に関する。 The present invention relates to mass spectrometry imaging methods.
ホウ素中性子捕捉治療法（Boron Neutron Capture Therapy; BNCT）は、中性子と核反応を起こしやすいホウ素をあらかじめ腫瘍細胞のみに蓄積させておくことで、正常細胞をほとんど損傷することなく腫瘍細胞のみを選択的に破壊する放射線治療法である。 Boron Neutron Capture Therapy (BNCT) is a method that selectively targets tumor cells without damaging normal cells by pre-accumulating boron, which easily causes nuclear reactions with neutrons, only in tumor cells. This is a radiation therapy method that destroys the body.
ホウ素分布を可視化するために、様々なイメージング技術の開発が進められており、例えば、非特許文献１には、二次イオン質量分析法(ＳＩＭＳ法)によるホウ素イメージング法が報告されている。 In order to visualize boron distribution, various imaging techniques are being developed. For example, Non-Patent Document 1 reports a boron imaging method using secondary ion mass spectrometry (SIMS method).
また、例えば、非特許文献２には、レーザー照射－高周波誘導結合プラズマ質量分析法(ＬＡ－ＩＣＰ－ＭＳ法)によるホウ素イメージング法が報告されている。 Furthermore, for example, Non-Patent Document 2 reports a boron imaging method using laser irradiation-high frequency inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS method).
ホウ素中性子捕捉治療法において、生体内でのホウ素の取り込み率（正常細胞内に対する腫瘍細胞内ホウ素存在比率；Ｔ／Ｎ比）はＢＮＣＴの治療効果および患者の被曝量に大きく影響する。このため、腫瘍組織とその周辺の正常組織を含む「マクロな領域（ｃｍオーダー）」における「ミクロ（数１０μｍオーダー）のホウ素分布」の評価はホウ素中性子捕捉治療法のキーポイントとなる。例えば、腫瘍内及びその周縁におけるミクロレベルのホウ素剤の分布をイメージングできれば、生体組織へのホウ素剤の取り込みメカニズムの解明にとって非常に重要な情報となり得る。 In boron neutron capture therapy, the in vivo uptake rate of boron (boron abundance ratio in tumor cells to normal cells; T/N ratio) greatly influences the therapeutic effect of BNCT and the patient's radiation dose. Therefore, evaluation of the ``microscopic boron distribution'' (on the order of several tens of micrometers) in the ``macroscopic region (on the order of cm)'' that includes tumor tissue and surrounding normal tissue is a key point of boron neutron capture therapy. For example, if it is possible to image the distribution of boron agents at the micro level within a tumor and its periphery, this could provide extremely important information for elucidating the mechanism of boron agent uptake into living tissues.
しかしながら、ＬＡ－ＩＣＰ－ＭＳ法は元素を測定対象とするため有機物の分布情報は得られない。ＳＩＭＳ法も元素や分子量１００以下を主な測定対象とするため有機物の分布情報は限定的であり、空間分解能がサブμｍオーダーであることから測定領域もμｍサイズにすぎない。従って、これらの手法では、ホウ素取り込みメカニズムの解明に重要な役割を果たす生体化合物と、ホウ素剤両方を同時にイメージングすることは不可能である。このため、生体組織におけるＴ／Ｎ比の評価やホウ素取り込みメカニズムの解明といったＢＮＣＴのニーズを共に満たすイメージング技術が確立できていないという問題がある。 However, since the LA-ICP-MS method targets elements for measurement, distribution information of organic substances cannot be obtained. Since the SIMS method mainly measures elements and molecular weights of 100 or less, the distribution information of organic substances is limited, and since the spatial resolution is on the sub-μm order, the measurement area is only μm in size. Therefore, with these methods, it is impossible to simultaneously image both biological compounds and boron agents, which play an important role in elucidating the boron uptake mechanism. For this reason, there is a problem in that an imaging technique that satisfies both the needs of BNCT, such as evaluation of the T/N ratio in living tissues and elucidation of the boron uptake mechanism, has not been established.
本発明の一態様に係る発明は、上記の問題を鑑みなされたものであり、その目的は、高い質量分解能を達成する試料作製と質量分析法とによって生体試料から微量のホウ素剤を検出し、腫瘍部のミクロな分布と、腫瘍組織と正常組織とにおけるマクロな分布を可視化できる、新規な質量分析イメージング法を提供することにある。 The invention according to one aspect of the present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is to detect trace amounts of boron agents from biological samples by sample preparation and mass spectrometry that achieve high mass resolution, The object of the present invention is to provide a novel mass spectrometry imaging method that can visualize the microscopic distribution of a tumor and the macroscopic distribution between tumor tissue and normal tissue.
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る質量分析イメージング法は、ホウ素剤を含む生体試料にマトリックスの溶液を塗布する工程と、前記マトリックスを塗布した生体試料の表面にレーザー光を照射することで、ホウ素剤に由来するイオンを生成する工程と、前記イオンのマススペクトルを取得する工程と、前記マススペクトルから前記イオンの分布をイメージングする工程と、を包含している。 In order to solve the above problems, a mass spectrometry imaging method according to one aspect of the present invention includes a step of applying a matrix solution to a biological sample containing a boron agent, and a laser beam applied to the surface of the biological sample coated with the matrix. The method includes the steps of generating ions derived from a boron agent by irradiating the method, obtaining a mass spectrum of the ions, and imaging the distribution of the ions from the mass spectrum.
本発明の一態様によれば、ホウ素剤だけでなく生体化合物の脳内における動態も評価できると考えられる。ホウ素剤と生体化合物との相互作用を解明し、さらに腫瘍蓄積効率の高い新たなホウ素剤や新たなホウ素剤投与法の開発に有効な評価方法を提供することができる。 According to one aspect of the present invention, it is possible to evaluate the dynamics of not only boron agents but also biological compounds in the brain. By elucidating the interaction between boron agents and biological compounds, we can provide an effective evaluation method for developing new boron agents with high tumor accumulation efficiency and new boron agent administration methods.
＜質量分析イメージング法＞
本開示の一態様に係る質量分析イメージング（ＭＳＩ）法は、ホウ素剤を含む試料を走査しながら測定領域を分画する１ピクセルごとにソフトイオン化法によりイオン化し、ホウ素剤に由来するイオンを分離、検出してマススペクトルを測定する。測定領域から得られたマススペクトルにおいて、ホウ素剤に由来するピークを選択し、そのピーク強度の分布を質量分析イメージ（ＭＳイメージ）として描画する。
<Mass spectrometry imaging method>
In the mass spectrometry imaging (MSI) method according to one aspect of the present disclosure, ions derived from the boron agent are separated by ionizing each pixel using a soft ionization method to fractionate a measurement region while scanning a sample containing a boron agent. , detect and measure the mass spectrum. In the mass spectrum obtained from the measurement region, a peak derived from the boron agent is selected, and the distribution of the peak intensity is drawn as a mass spectrometry image (MS image).
ＭＳイメージを描画する対象たる生体試料（以下では単に試料とも言う）は、限定されるべきではないが、例えば、腫瘍が移植されたモデルラットの脳であり得る。 The biological sample (hereinafter also simply referred to as sample) on which the MS image is drawn may be, for example, the brain of a model rat into which a tumor has been implanted, although it should not be limited.
本開示の一態様に係る質量分析イメージング（ＭＳＩ）法によれば、高い質量分解能で質量分析を行うことで、重なり合う大量かつ多種類の生体化合物に由来するピーク群からホウ素剤に由来するピークを分離、検出することができ、ホウ素剤の分布を表すＭＳイメージを描画できる。また、数１０μｍオーダーの空間分解能にて、ｃｍサイズの測定領域におけるＭＳイメージを描画できる。このため、単一の組織のみならず、例えば腫瘍組織及び正常組織（正常細胞）等の複数の組織を含む、試料に適用できる。このため、例えば、ＢＮＣＴの治療効果および患者の被曝量に大きく影響する生体内でのホウ素の取り込み率（正常細胞内に対する腫瘍細胞内ホウ素存在比率；Ｔ／Ｎ比）の経時的変化や腫瘍内のホウ素剤の局在化についても数１０μｍオーダーの空間分解能にて評価することができる。これにより脳内におけるホウ素剤の動態を解明するために有効な質量分析イメージング法を提供できる。 According to the mass spectrometry imaging (MSI) method according to one aspect of the present disclosure, by performing mass spectrometry with high mass resolution, a peak derived from a boron agent is extracted from a group of overlapping peaks derived from a large amount and many types of biological compounds. It can be separated and detected, and an MS image representing the distribution of the boron agent can be drawn. Furthermore, it is possible to draw MS images in a cm-sized measurement area with a spatial resolution on the order of several tens of μm. Therefore, it is applicable not only to a single tissue but also to a sample containing multiple tissues such as tumor tissue and normal tissue (normal cells). For this reason, for example, changes over time in the in vivo boron uptake rate (ratio of boron in tumor cells to normal cells; T/N ratio), which greatly affects the therapeutic effect of BNCT and the patient's radiation exposure, and The localization of the boron agent can also be evaluated with a spatial resolution on the order of several tens of micrometers. This makes it possible to provide an effective mass spectrometry imaging method for elucidating the dynamics of boron agents in the brain.
質量分析イメージングにおいて観察の対象であるホウ素剤は、ＢＮＣＴ剤でありえ、例えば、４－ボロノ－Ｌ－フェニルアラニン（ＢＰＡ）、及びメルカプトウンデカヒドロドデカホウ酸（２）ナトリウム（ＢＳＨ）等が上げられるがこれに限定されない。例えば、ホウ素剤は、腫瘍への取り込み効率を上げるためにＢＳＨ等に修飾基を導入したものであってもよい。 The boron agent to be observed in mass spectrometry imaging can be a BNCT agent, such as 4-borono-L-phenylalanine (BPA) and sodium mercaptoundecahydrododecaborate (BSH). but is not limited to this. For example, the boron agent may be one in which a modifying group is introduced into BSH or the like in order to increase the efficiency of uptake into the tumor.
ホウ素剤の動態を観察するための対象である腫瘍には、例えば、メラノーマ等が挙げられる。腫瘍を移植する対象は、例えば、ラット等の小型実験動物であればよい。試料の腫瘍部に局在化するホウ素剤の量は、ＢＮＣＴに求められる２０～４０ｐｐｍであることが好ましい。このような観点から、例えば、モデルラットであれば、ホウ素剤の投与量は３５０～７００ｍｇ／ｋｇｂ.ｗ.であればよい。 Examples of tumors that are targets for observing the dynamics of boron agents include melanoma. The subject to which the tumor is transplanted may be, for example, a small experimental animal such as a rat. The amount of boron agent localized in the tumor part of the sample is preferably 20 to 40 ppm, which is required for BNCT. From this point of view, for example, in the case of model rats, the dose of boron agent may be 350 to 700 mg/kg b.w.
なお、本開示の一態様に係るＭＳＩ法は、ＢＮＣＴが適用できる生体組織であれば、観察対象である試料は脳組織に限定されない。本開示の一態様に係るＭＳＩ法は、例えば、肝臓腫瘍等へのＢＮＣＴにも好適に利用できる。 Note that in the MSI method according to one aspect of the present disclosure, the sample to be observed is not limited to brain tissue as long as it is a biological tissue to which BNCT can be applied. The MSI method according to one aspect of the present disclosure can also be suitably used, for example, for BNCT of liver tumors and the like.
本開示の一態様に係る質量分析イメージング（ＭＳＩ）法は、典型的には、マトリックス支援脱離イオン化―質量分析法を採用し得る。 Mass spectrometry imaging (MSI) methods according to one aspect of the present disclosure may typically employ matrix-assisted desorption ionization-mass spectrometry.
（マトリックス支援脱離イオン化－質量分析イメージング法）
マトリックス支援脱離イオン化質－量分析イメージング法（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法）では、マトリックスを塗布した生体試料に対して規定した所定の測定領域をピクセル単位に分画し、１ピクセル（単位面積）ごとにレーザー光を照射しつつ、測定領域全体にレーザー光が照射されるように試料台ホルダーを走査させるとよい。これにより、測定領域を分画する１ピクセルごとにマススペクトルを取得する。得られたマススペクトルにおけるホウ素剤のピーク強度を１ピクセルごとに描画することで、ホウ素剤の分布を示すＭＳイメージを得ることができる。
(Matrix-assisted desorption ionization-mass spectrometry imaging method)
In the matrix-assisted desorption/ionization mass spectrometry imaging method (MALDI-MSI method), a predetermined measurement area defined for a biological sample coated with a matrix is divided into pixel units, and each pixel (unit area) is It is preferable to scan the sample stage holder while irradiating the laser beam so that the entire measurement area is irradiated with the laser beam. As a result, a mass spectrum is obtained for each pixel that divides the measurement area. By plotting the peak intensity of the boron agent in the obtained mass spectrum for each pixel, an MS image showing the distribution of the boron agent can be obtained.
１ピクセルあたりの大きさにより、測定領域における空間分解能が決定され得る。例えば腫瘍内のホウ素剤分布、腫瘍と正常組織のホウ素剤の分布等の取得したい情報に応じて、１ピクセルあたりの大きさを選択すればよい。例えば、レーザー径及び試料台ホルダーの走査位置分解能に応じて、一辺１０～２００μｍ程度の範囲で１ピクセルあたりの大きさを選択すればよい。 The size per pixel can determine the spatial resolution in the measurement area. For example, the size per pixel may be selected depending on the information desired to be acquired, such as the boron agent distribution within the tumor and the boron agent distribution between the tumor and normal tissue. For example, the size per pixel may be selected within a range of about 10 to 200 μm on a side depending on the laser diameter and the scanning position resolution of the sample stage holder.
ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法に供する試料の切片のサイズは、試料を載置する試料台の大きさ（例えば、５００ｍｍ×８００ｍｍ（縦幅×横幅）以下）を考慮して設計すればよい。当該サイズによりラット等の小型実験動物の複数の組織を捕らえることができることも本開示の一態様に係る質量分析イメージング法の利点の一つである。試料の切片の厚さは、限定されるものではないが、２０μｍ以下であることが好ましい。 The size of the sample section to be subjected to the MALDI-MSI method may be designed in consideration of the size of the sample stage on which the sample is placed (for example, 500 mm x 800 mm (length x width) or less). Another advantage of the mass spectrometry imaging method according to one embodiment of the present disclosure is that it is possible to capture multiple tissues of small experimental animals such as rats due to the size. Although the thickness of the sample section is not limited, it is preferably 20 μm or less.
試料の切片は、プレートに載置された状態にてマトリックスが塗布され、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供される。当該プレートには、例えば、導電性ガラスプレート、又はステンレスプレートが挙げられる。当該プレートのサイズは、試料の切片を載置でき、試料台に載置できればよく、限定されるべきではないが、例えば１０ｍｍ×１０ｍｍ（縦幅×横幅）程度であり得る。 A sample section is placed on a plate, coated with a matrix, and subjected to MALDI-MSI. Examples of the plate include a conductive glass plate or a stainless steel plate. The size of the plate is not limited as long as it can hold a section of the sample and can be placed on the sample stage, but may be, for example, about 10 mm x 10 mm (length x width).
ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法に用いるマトリックスは、レーザー光によって励起され、測定対象化合物のイオン化を支援する役割を果たす化合物である。マトリックスには、正イオン生成用酸性マトリックス、負イオン生成用アルカリ性マトリックス、銀（Ａｇ）等の金属マトリックスを挙げることができる。なかでも、正イオン生成用酸性マトリックスであることが好ましく、正イオン生成用酸性マトリックスには、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ，沸点：４０６℃，蒸気圧０．０±１．０ｍｍＨｇ ａｔ２５℃）、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（α－ＣＨＣＡ）、５－メトキシサリチル酸、４－クロロ-桂皮酸、ジスラノール、ｔｒａｎｓ－２－［３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）－２－メチル－２－プロペニリデン］マロノニトリル、コーヒー酸（ＣＡ）、シナピン酸（ＳＡ）、ニコチン酸（ＮＡ）、ｔｒａｎｓ－フェルラ酸（ＦＡ）、２－（４－ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）、５－クロロ－２－ヒドロキシ安息香酸、３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸（ＡＨＢＡ）３－インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）等が挙げられ、負イオン生成用アルカリ性マトリックスには、例えば、９－アミノアクリジン、１，５－ジアミノナフタレン、ノルハルマン、３，４－ジアミノフェノン（ＤＡＢＰ）、５－クロロ－２－メルカプトベンゾチアゾール（ＣＭＢＴ）等が挙げられる。なかでも、マトリックスは、正イオン生成用酸性マトリックスである、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（α－ＣＨＣＡ）であることがより好ましい。 The matrix used in the MALDI-MSI method is a compound that is excited by laser light and plays a role in supporting the ionization of the compound to be measured. Examples of the matrix include an acidic matrix for generating positive ions, an alkaline matrix for generating negative ions, and a metal matrix such as silver (Ag). Among these, an acidic matrix for positive ion generation is preferable, and the acidic matrix for positive ion generation includes 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB, boiling point: 406°C, vapor pressure 0.0 ± 1.0 mmHg at 25°C). ), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (α-CHCA), 5-methoxysalicylic acid, 4-chloro-cinnamic acid, dithranol, trans-2-[3-(4-tert-butylphenyl)-2-methyl -2-propenylidene] malononitrile, caffeic acid (CA), sinapinic acid (SA), nicotinic acid (NA), trans-ferulic acid (FA), 2-(4-hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA), 5- Chloro-2-hydroxybenzoic acid, 3-amino-4-hydroxybenzoic acid (AHBA), 3-indoleacrylic acid (IAA), retinoic acid (ATRA), etc., and the alkaline matrix for negative ion generation include, for example, Examples include 9-aminoacridine, 1,5-diaminonaphthalene, norharman, 3,4-diaminophenone (DABP), and 5-chloro-2-mercaptobenzothiazole (CMBT). Among these, the matrix is preferably 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) or α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (α-CHCA), which are acidic matrices for generating positive ions.
ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法に用いるマトリックスは腫瘍組織、及び正常組織（正常細胞）を含む、広い測定範囲においてマススペクトルを測定するという観点から、揮発性が低いマトリックスを選択することが好ましい。このような観点から、マトリックスは、蒸気圧０．０±０．８ｍｍＨｇ（２５℃）以上のものであることが好ましい。または、マトリックスは、揮発性が低いマトリックスを選択することが好ましいという観点から、沸点を参照して選択してもよい。この場合、マトリックスの沸点は、例えば３４０℃以上であればよい。 As the matrix used in the MALDI-MSI method, it is preferable to select a matrix with low volatility from the viewpoint of measuring mass spectra in a wide measurement range including tumor tissues and normal tissues (normal cells). From this point of view, the matrix preferably has a vapor pressure of 0.0±0.8 mmHg (25° C.) or higher. Alternatively, the matrix may be selected with reference to the boiling point, from the viewpoint that it is preferable to select a matrix with low volatility. In this case, the boiling point of the matrix may be, for example, 340° C. or higher.
ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法に供されるマトリックスは、観察対象たる試料の表面に結晶を形成するように塗布すればよい。一態様に係るＭＳＩ法では、マトリックス、及び溶媒を含むマトリックス溶液を調製し、当該マトリックス溶液を生体試料の表面に塗布すればよい（マトリックスの溶液を塗布する工程）。このとき、当該マトリックス溶液に含まれる溶媒を揮発させつつ、マトリックスを試料の表面に塗布するとよい。これにより、試料の表面に微細なマトリックスの結晶を堆積させることができる。 The matrix used in the MALDI-MSI method may be applied so as to form crystals on the surface of the sample to be observed. In the MSI method according to one embodiment, a matrix solution containing a matrix and a solvent may be prepared, and the matrix solution may be applied to the surface of a biological sample (step of applying the matrix solution). At this time, it is preferable to apply the matrix to the surface of the sample while evaporating the solvent contained in the matrix solution. This allows fine matrix crystals to be deposited on the surface of the sample.
マトリックス溶液は、溶媒を含み、さらに酸を含んでいてもよい。溶液に含まれるマトリックスの濃度は、限定されるべきではないが、溶媒に対し、１０～５０ｍｇ／ｍＬの範囲内であることがより好ましい。溶液に含まれるマトリックスの濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以上であることにより、ホウ素剤のイオン化を好適に支援できる。また、マトリックスの濃度が５０ｍｇ／以下であることにより、ホウ素剤に由来するイオンのマススペクトルのピークとマトリックス自身に由来するイオンのマススペクトルのピークとの重なりを低減し、ホウ素剤を検出しやすくすることができるという効果を奏する。 The matrix solution contains a solvent and may further contain an acid. Although the concentration of the matrix contained in the solution should not be limited, it is more preferably within the range of 10 to 50 mg/mL relative to the solvent. When the concentration of the matrix contained in the solution is 10 mg/mL or more, ionization of the boron agent can be favorably supported. In addition, by having a matrix concentration of 50 mg/or less, the overlap between the mass spectrum peak of ions derived from the boron agent and the mass spectrum peak of ions derived from the matrix itself is reduced, making it easier to detect the boron agent. It has the effect of being able to
溶媒はマトリックスを十分に溶解することができるものを選択すればよく、塗布時に揮発するものであることが好ましい。これにより、マトリックス溶液を塗布するときに、マトリックスが結晶化しつつ試料の表面に塗布される。溶媒は、揮発の観点から沸点が１００℃以下の溶媒を用いることが好ましい。当該溶媒には、例えば、水と有機溶媒とが挙げられ、有機溶媒には、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、メタノール、エタノール、ｉ－プロパノール等のアルコール類、酢酸エチル等のエステル類、及びアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類が挙げられる。例えば、マトリックスがＤＨＢである場合、溶媒には、ニトリル類、アルコール類をより好ましく用いることができ、ニトリル類であるアセトニトリルがさらに好ましく、アセトニトリルと水との混合溶媒であることが最も好ましい。 A solvent may be selected that can sufficiently dissolve the matrix, and is preferably one that evaporates during application. Thereby, when applying the matrix solution, the matrix is applied to the surface of the sample while being crystallized. From the viewpoint of volatilization, it is preferable to use a solvent having a boiling point of 100° C. or lower. Examples of such solvents include water and organic solvents, and examples of organic solvents include nitriles such as acetonitrile and propionitrile, alcohols such as methanol, ethanol, and i-propanol, and esters such as ethyl acetate. and ketones such as acetone and methyl ethyl ketone. For example, when the matrix is DHB, nitriles and alcohols can be more preferably used as the solvent, acetonitrile which is a nitrile is more preferable, and a mixed solvent of acetonitrile and water is most preferable.
マトリックス溶液に含まれる水は、例えば純水であればよい。 The water contained in the matrix solution may be, for example, pure water.
マトリックス溶液は、２種以上の溶媒を含む混合溶媒にマトリックスを溶解し、これにより、塗布後の結晶の大きさを調整してもよい。より具体的には、例えば、マトリックス溶液に含まれる溶媒として、水と有機溶媒との混合溶媒（有機溶媒の水溶液）を用いる場合、有機溶媒と水との合計を１００体積％として、有機溶媒が２０～９０体積％の範囲内であることが好ましい。これにより、マトリックス溶液が試料上にて滲むことを抑え、マトリックスの結晶が肥大化することを抑えることができる。これによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法において高い空間分解能が得られるという効果を奏する。これにより、マトリックス溶液が試料上に長く留まって試料自身を溶かすことを防ぎ、マトリックスの結晶が肥大化することを抑えることができる。 The matrix solution may be prepared by dissolving the matrix in a mixed solvent containing two or more types of solvents, thereby adjusting the size of the crystals after application. More specifically, for example, when using a mixed solvent of water and an organic solvent (aqueous solution of an organic solvent) as the solvent contained in the matrix solution, the organic solvent is It is preferably within the range of 20 to 90% by volume. Thereby, it is possible to suppress the matrix solution from bleeding onto the sample and to suppress the enlargement of the matrix crystals. This produces the effect that high spatial resolution can be obtained in the MALDI-MSI method. This prevents the matrix solution from remaining on the sample for a long time and dissolving the sample itself, and it is possible to suppress the enlargement of matrix crystals.
マトリックス溶液は、酸を含んでいることが好ましい。マトリックス溶液が含む酸は、揮発性があり、強酸であることが好ましい。このような観点から、酸には、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ギ酸等が挙げられ、不純物が少ないグレードを入手できることから、トリフルオロ酢酸を好ましく用いることができる。マトリックス溶液には、０．１～０．２体積％の酸が含まれていることが好ましい。マトリックス溶液に酸を添加することで、ホウ素剤に由来するイオンの中で代表的なイオンとなるプロトン付加分子の生成を促すという効果を奏する。 Preferably, the matrix solution contains an acid. The acid contained in the matrix solution is volatile and preferably a strong acid. From this point of view, examples of acids include trifluoroacetic acid (TFA), formic acid, and the like, and trifluoroacetic acid can be preferably used because it can be obtained in a grade with fewer impurities. Preferably, the matrix solution contains 0.1 to 0.2% by volume of acid. Adding an acid to the matrix solution has the effect of promoting the production of protonated molecules, which are representative ions among the ions derived from boron agents.
マトリックス溶液は、例えば、エアブラシ等によって試料の表面に塗布すればよい。マトリックスが塗布された試料は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供される。ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩでは、まず、マトリックス溶液を塗布した生体試料にレーザー光を照射し、ホウ素剤に由来するイオンを生成するとよい（イオンを生成する工程）。 The matrix solution may be applied to the surface of the sample using, for example, an airbrush. The sample coated with the matrix is subjected to MALDI-MSI. In MALDI-MSI, it is preferable to first irradiate a biological sample coated with a matrix solution with laser light to generate ions derived from a boron agent (step of generating ions).
空間分解能である１ピクセルの大きさは、走査型試料の位置分解能（例えば１０μｍ）、レーザー径（例えば、約２０μｍ）およびホウ素の局在化を観察すべき生体組織サイズのレベルにより決めればよい。例えば１ピクセルにおける１辺の大きさは２０～２００μｍであればよい。 The size of one pixel, which is the spatial resolution, may be determined based on the positional resolution of the scanning sample (for example, 10 μm), the laser diameter (for example, about 20 μm), and the level of the biological tissue size at which the localization of boron is to be observed. For example, the size of one side of one pixel may be 20 to 200 μm.
１ピクセルあたりのマススペクトルの積算数は、関心領域（ＲＯＩ）のマススペクトルにおいて、ホウ素剤に由来するイオンがピークとして検出できるイオン強度において、隣接するピークと分離できるようにすべく、Ｓ/Ｎ（signal to noise ratio）が１０以上になるように設定すればよい。 The number of integrated mass spectra per pixel is determined by the S/N so that ions derived from the boron agent can be detected as a peak in the mass spectrum of the region of interest (ROI) at an ion intensity that can be separated from adjacent peaks. (signal to noise ratio) may be set to 10 or more.
ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩでは、質量分析計における測定対象であるイオンの質量分解能を高めるためにレーザー強度及びレーザー繰り返し速度を低く設定することが有効である。レーザー強度及びレーザー繰り返し速度は、上述したイオン強度を確保できる範囲において低く設定することで、レーザー照射時に生成するイオンの空間的広がりを抑えて高い質量分解能を得ることができ、また生体化合物やマトリックス由来のピークが過度に高くなり、目的とするホウ素剤に由来するピークと重複することを回避できる。 In MALDI-MSI, it is effective to set the laser intensity and laser repetition rate low in order to increase the mass resolution of ions that are the measurement targets in a mass spectrometer. By setting the laser intensity and laser repetition rate as low as possible to ensure the above-mentioned ion intensity, it is possible to suppress the spatial spread of ions generated during laser irradiation and obtain high mass resolution. It can be avoided that the derived peak becomes excessively high and overlaps with the peak derived from the target boron agent.
続いて、質量分離部により、ホウ素剤に由来するイオンと、生体試料に由来するイオンであり、ホウ素剤に由来するイオン以外のイオンとを分離し、それぞれのイオンを検出してマススペクトルを取得するとよい（マススペクトルを取得する工程）。マススペクトルを取得する質量分析計において、測定対象であるイオンの質量分解能は、好ましくは１００００以上、より好ましくは１５０００以上あればよく、さらに好ましくは２００００以上であるとよい。また、質量分析計におけるイオンの質量分解能は、限定されるべきではないが、２０００００以下であってよく、５００００以下であってもよい。イオンの質量分解能が１００００以上であれば、生体化合物又はマトリックス由来のピークとホウ素剤のピークを分離し、試料中のホウ素剤ピークのｍ/ｚを特定できる。また、質量分解能は２００００以上（半値幅法、例えばｍ/ｚ２００において）であれば、後述するようにホウ素剤の関連イオンが検出されるｍ/ｚの範囲においてピーク質量選択幅０．０２ユニット以下でピークを抽出してＭＳイメージを描画することができ、これにより腫瘍組織の周縁におけるホウ素剤の分布、さらには、腫瘍組織の周縁のみならず、腫瘍組織内部におけるホウ素剤の分布を示すＭＳイメージを得ることができる。 Next, the mass separation section separates ions derived from the boron agent from ions derived from the biological sample but not derived from the boron agent, and each ion is detected to obtain a mass spectrum. (Process of acquiring a mass spectrum) In a mass spectrometer that acquires a mass spectrum, the mass resolution of ions to be measured is preferably 10,000 or more, more preferably 15,000 or more, and even more preferably 20,000 or more. Further, the mass resolution of ions in the mass spectrometer is not limited, but may be 200,000 or less, or 50,000 or less. If the mass resolution of the ions is 10,000 or more, it is possible to separate the peak derived from the biological compound or matrix and the peak of the boron agent, and specify the m/z of the boron agent peak in the sample. In addition, if the mass resolution is 20,000 or more (half-width method, for example at m/z 200), the peak mass selection width is 0.02 units or less in the m/z range where boron agent related ions are detected, as described later. It is possible to extract the peaks and draw an MS image, which shows the distribution of the boron agent at the periphery of the tumor tissue, and furthermore, the MS image showing the distribution of the boron agent not only at the periphery of the tumor tissue but also inside the tumor tissue. can be obtained.
質量分析計において、測定対象であるイオンの質量分解能は、好ましくは１００００以上、より好ましくは１５０００以上、さらに好ましくは２００００以上を達成するように質量分析計の各パラメータを設定することで調整すればよい。このような観点から、質量分析計は、１５０００以上の質量分解能を有するものであれば限定されず、適宜選択すればよい。 In the mass spectrometer, the mass resolution of the ions to be measured can be adjusted by setting each parameter of the mass spectrometer so as to achieve a mass resolution of preferably 10,000 or more, more preferably 15,000 or more, and still more preferably 20,000 or more. good. From this point of view, the mass spectrometer is not limited as long as it has a mass resolution of 15,000 or more, and may be selected as appropriate.
質量分解能を１５０００以上、好ましくは２００００以上にすることができる質量分析計には、例えば、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、オービトラップ型質量分析計、飛行時間型質量分析計等を挙げることができ、飛行時間型質量分析計には、例えば、スパイラル軌道飛行時間型質量分析計を挙げることができる。本開示の一態様に係る質量分析イメージング（ＭＳＩ）法は、生体試料中の微量成分の質量分析イメージングにおいて、生体化合物との分離のために用いられる誘導体化法によらずとも、普及率の高い高分解能飛行時間型質量分析計を用いることができ、このため実施が容易で技術を水平展開しやすいということも利点の１つである。 Examples of mass spectrometers that can have a mass resolution of 15,000 or more, preferably 20,000 or more include Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometers, orbitrap mass spectrometers, time-of-flight mass spectrometers, etc. Examples of time-of-flight mass spectrometers include spiral-orbit time-of-flight mass spectrometers. The mass spectrometry imaging (MSI) method according to one aspect of the present disclosure is highly popular in mass spectrometry imaging of trace components in biological samples, even without using the derivatization method used for separation from biological compounds. Another advantage is that a high-resolution time-of-flight mass spectrometer can be used, which makes implementation easier and the technology easier to horizontally deploy.
質量分解能は、上述のレーザー照射条件と共に質量分離部の種類に応じてパラメータを設定すればよく、例えば、スパイラル軌道飛行時間型等の飛行時間型質量分析計を用いる場合、遅延引き出し時間を調整することで質量分解能を調整すればよい。 The mass resolution can be determined by setting parameters according to the type of mass separation section as well as the laser irradiation conditions described above. For example, when using a time-of-flight mass spectrometer such as a spiral orbit time-of-flight type, the delay extraction time should be adjusted. This can be used to adjust the mass resolution.
また、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩは、測定前においてはホウ素剤に由来するピークが検出されるｍ/ｚ範囲を外部標準法により質量較正し、測定後においては、後述するようにマトリックスに由来し、ｍ/ｚが既知であるマススペクトルのピークを用いた内部標準法により、関心領域のマススペクトルごとに較正することが好ましい。これによりホウ素剤に由来するピークに近接して検出される生体化合物に由来するピーク、及びマトリックスに由来するピークを含むピーク群の中からホウ素剤に由来するピークを、そのピークの計算精密質量（理論値のｍ/ｚ）に対して±５０ｐｐｍのずれ以下で特定できる。 In addition, in MALDI-MSI, before measurement, the m/z range in which peaks originating from boron agents are detected is mass calibrated using an external standard method, and after measurement, as will be described later, the m/z range originating from the matrix is detected. It is preferable to calibrate each mass spectrum of the region of interest by an internal standard method using a mass spectrum peak whose z is known. As a result, a peak derived from a boron agent is selected from a peak group that includes a peak derived from a biological compound detected close to a peak derived from a boron agent and a peak derived from a matrix, and the calculated exact mass ( It can be specified with a deviation of ±50 ppm or less from the theoretical value (m/z).
ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの測定範囲は、上述したホウ素剤に由来する代表的イオンであるプロトン付加分子のみならず、ホウ素剤に由来する他のイオンも測定することができるように設定することが好ましい。例えば、ホウ素剤のプロトン付加分子のプロトンに代わり、（ｉ）ナトリウム又はカリウムが付加した分子のイオン、およびそれら分子から水が脱離した分子のイオン、並びに（ｉｉ）ホウ素剤にマトリックスが付加した分子のクラスターイオン、及びそれら分子から水が脱離した分子のクラスターイオンが挙げられる。これらイオンは、ｍ/ｚ値、及びホウ素の同位体パターンを示すことによりイオン種を推定することができる。例えば、ホウ素剤がＢＰＡであり、マトリックスがＤＨＢである場合、ｍ/ｚ３４０～３７０辺りにおける［ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ２Ｏ＋Ｎａ］＋等の二量体化物等も測定対象として含む範囲にて、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行えばよい。このような、ホウ素剤のプロトン付加分子以外のホウ素剤に由来するイオン種のＭＳイメージはホウ素剤のプロトン付加分子のＭＳイメージで観測されたホウ素剤の分布や腫瘍へのホウ素剤の蓄積または排出の時間変化を検証するのに役立つ場合がある。
The measurement range of MALDI-MSI is preferably set so that it is possible to measure not only protonated molecules, which are representative ions derived from the boron agent mentioned above, but also other ions derived from the boron agent. For example, instead of protons in the protonated molecule of the boron agent, (i) ions of molecules to which sodium or potassium has been added and ions of molecules to which water has been desorbed, and (ii) ions of molecules to which a matrix has been added to the boron agent. Examples include cluster ions of molecules and cluster ions of molecules from which water has been desorbed. The ion species of these ions can be estimated by showing the m/z value and the boron isotope pattern. For example, if the boron agent is BPA and the matrix is DHB, MALDI-MSI can be used in a range that also includes dimerized products such as [BPA+DHB-2H 2 O+Na] + around m/
ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩデータからのＭＳイメージの描画は以下の手順にて行うとよい（イメージングする工程）。 It is preferable to draw an MS image from MALDI-MSI data using the following procedure (imaging step).
（１）まず、主に腫瘍に分布しているホウ素剤に由来するピークを特定するため、測定領域全体から腫瘍を含むと考えられる領域を関心領域（ＲＯＩ）として指定し、当該関心領域のマススペクトルを抽出すればよい。（２）続いて、マトリックスに由来するｍ/ｚが既知のイオンを内部標準として採用し、ホウ素剤に由来するピーク、その付近に近接して検出される生体化合物に由来するピーク、及びマトリックスに由来するピークを含むピーク群に対してそれぞれのｍ/ｚを小数点以下3桁（精密質量）まで読み取りが可能な高分解能でそれぞれのピークを分離し、ホウ素剤に由来するピークを特定すればよい。（３）当該ホウ素剤に由来するピークのピーク強度を、測定領域を分画する１ピクセルごとに色調に変換して表示させることでＭＳイメージを描画することができる。 (1) First, in order to identify the peak derived from the boron agent mainly distributed in the tumor, a region thought to include the tumor is designated as a region of interest (ROI) from the entire measurement region, and a Just extract the spectrum. (2) Next, ions with known m/z originating from the matrix are adopted as internal standards, and the peak originating from the boron agent, the peak originating from the biological compound detected in the vicinity, and the matrix The peaks derived from the boron agent can be identified by separating each peak with a high resolution that allows the m/z of each peak to be read to three decimal places (accurate mass) for the peak group containing the derived peak. . (3) An MS image can be drawn by converting the peak intensity of the peak derived from the boron agent into a color tone for each pixel that divides the measurement area and displaying the color tone.
ここで、ホウ素剤のピークと隣接する生体由来化合物またはマトリックス由来ピークを分離して、ホウ素剤のピークの位置を特定し、そのピークから抽出した画像を得ることが重要であり、それによりホウ素剤の分布や局在がより明確な画像を取得できる。より具体的には、ホウ素剤の関連イオンが検出されるｍ/ｚの範囲においてホウ素剤のピークと生体化合物またはマトリックス由来ピークを分離するための質量分解能（ピークのｍ/ｚ÷ピーク半値幅）は１５０００以上であることが好ましく、より好ましくは２００００以上である。 Here, it is important to separate the peak of the boron agent from the adjacent bio-derived compound or matrix-derived peak, identify the position of the peak of the boron agent, and obtain an image extracted from that peak. images with clearer distribution and localization can be obtained. More specifically, the mass resolution (peak m/z ÷ peak half-width) for separating the boron agent peak from the biological compound or matrix-derived peak in the m/z range in which ions related to the boron agent are detected. is preferably 15,000 or more, more preferably 20,000 or more.
以上の手順により、これにより生体組織内のホウ素剤の分布の評価が実用上可能となる。ホウ素剤に由来するピークが複数検出される場合は同様にホウ素剤のＭＳイメージを複数取得できる。さらに腫瘍部におけるミクロなホウ素剤の分布と、腫瘍組織と正常組織とにおけるマクロなホウ素剤の分布を可視化できる。また、ホウ素剤の脳内における動態も評価できると考えられる。よって、ホウ素剤と生体化合物との相互作用を解明し、さらに腫瘍蓄積効率の高い新たなホウ素剤や新たなホウ素剤投与法の開発に有効な評価方法を提供することができると期待される。 According to the above procedure, it becomes practically possible to evaluate the distribution of boron agents in living tissues. If multiple peaks derived from the boron agent are detected, multiple MS images of the boron agent can be similarly acquired. Furthermore, it is possible to visualize the microscopic distribution of the boron agent in the tumor area and the macroscopic distribution of the boron agent between tumor tissue and normal tissue. It is also believed that the dynamics of boron agents in the brain can be evaluated. Therefore, it is expected that it will be possible to elucidate the interaction between boron agents and biological compounds, and to provide an effective evaluation method for the development of new boron agents with high tumor accumulation efficiency and new boron agent administration methods.
〔まとめ〕
本発明の態様１に係る質量分析イメージング法は、ホウ素剤を含む生体試料にマトリックスの溶液を塗布する工程と、前記マトリックスを塗布した試料の表面にレーザー光を照射することで、前記ホウ素剤に由来するイオンを生成する工程と、前記イオンを分離し、検出してマススペクトルを取得する工程と、前記マススペクトルからイオンの分布をイメージングする工程と、を包含している。
〔summary〕
The mass spectrometry imaging method according to aspect 1 of the present invention includes the steps of applying a matrix solution to a biological sample containing a boron agent, and irradiating the surface of the sample coated with the matrix with a laser beam. The method includes the steps of generating derived ions, separating and detecting the ions to obtain a mass spectrum, and imaging the ion distribution from the mass spectrum.
本発明の態様２に係る質量分析イメージング法は、上記態様１において、前記マススペクトルを取得する工程では、前記ホウ素剤に由来するイオンのピークと、前記生体試料又はマトリックスに由来するイオンであり、前記ホウ素剤に由来するイオン以外のピークとを分離するとよい。 In the mass spectrometry imaging method according to aspect 2 of the present invention, in the above aspect 1, in the step of acquiring the mass spectrum, a peak of ions originating from the boron agent and ions originating from the biological sample or matrix, It is preferable to separate peaks other than ions derived from the boron agent.
本発明の態様３に係る質量分析イメージング法は、上記態様１又は２において、前記マススペクトルを取得する工程では、ホウ素剤に由来するイオンのピークと、前記生体試料又はマトリックスに由来するイオンであり、前記ホウ素剤に由来するイオン以外のピークとをｍ/ｚ２００において質量分解能２００００以上で分離することが好ましい。 In the mass spectrometry imaging method according to aspect 3 of the present invention, in the above aspect 1 or 2, in the step of acquiring the mass spectrum, a peak of ions originating from a boron agent and an ion originating from the biological sample or matrix are obtained. It is preferable to separate peaks other than ions originating from the boron agent at m/z 200 with a mass resolution of 20,000 or more.
本発明の態様４に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～３の何れかにおいて、前記ホウ素剤が、４－ボロノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びメルカプトウンデカヒドロドデカホウ酸（２）ナトリウムから選択される少なくとも１つのホウ素剤を含むことが好ましい。
In the mass spectrometry imaging method according to
本発明の態様５に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～４の何れかにおいて、前記マトリックスとして、ジヒドロキシ安息香酸を含んでいるとよい。 The mass spectrometry imaging method according to aspect 5 of the present invention preferably includes dihydroxybenzoic acid as the matrix in any one of aspects 1 to 4 above.
本発明の態様６に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～５の何れかにおいて、前記溶液が有機溶媒を含み、当該有機溶媒に含まれる前記マトリックスの濃度が、１０～５０ｍｇ／ｍＬの範囲内であるとよい。 In the mass spectrometry imaging method according to aspect 6 of the present invention, in any one of aspects 1 to 5 above, the solution contains an organic solvent, and the concentration of the matrix contained in the organic solvent is in a range of 10 to 50 mg/mL. It is better if it is within.
本発明の態様７に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～６の何れかにおいて、前記マトリックスの溶液が、溶媒として、水、ニトリル類、アルコール類、エステル類、及びケトン類からなる群から選択される少なくとも１つの溶媒を含むことが好ましい。 In the mass spectrometry imaging method according to aspect 7 of the present invention, in any one of aspects 1 to 6 above, the matrix solution is selected from the group consisting of water, nitriles, alcohols, esters, and ketones as a solvent. Preferably, at least one selected solvent is included.
本発明の態様８に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～７の何れかにおいて、前記ホウ素剤に由来するイオンが、前記ホウ素剤と前記マトリックスとのクラスターイオンを含み得る。 In the mass spectrometry imaging method according to Aspect 8 of the present invention, in any of Aspects 1 to 7 above, the ions derived from the boron agent may include cluster ions of the boron agent and the matrix.
本発明の態様９に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～８の何れかにおいて、イメージングする工程では、正常細胞と腫瘍組織とを含む領域をイメージングするとよい。 In the mass spectrometry imaging method according to aspect 9 of the present invention, in any one of aspects 1 to 8 above, in the imaging step, it is preferable to image a region containing normal cells and tumor tissue.
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the embodiments described above, and various modifications can be made within the scope of the claims, and embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. are also included within the technical scope of the present invention.
本発明の一実施例について以下に説明する。 An embodiment of the present invention will be described below.
図１に示すスキームに沿って、脳腫瘍モデルラット及びその脳の試料の作製、マトリックスの塗布、及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化－質量分析イメージングを行なった。 In accordance with the scheme shown in FIG. 1, a brain tumor model rat and its brain samples were prepared, a matrix was applied, and matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry imaging was performed.
〔１〕試料作製
各試料を作製するために使用した試薬は以下の通りである。
４－ボロノ－Ｌ－フェニルアラニン（ＢＰＡ）
トリフルオロ酢酸，トリフルオロ酢酸ナトリウム
アセトニトリル（ＬＣ－ＭＳ測定用グレード）
標準ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００及びＰＥＧ６００）
以上のＢＰＡから標準ポリエチレングリコールまでは、富士フィルム和光純薬株式会社から購入した。２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）は、東京化成工業株式会社から購入した。
[1] Sample Preparation The reagents used to prepare each sample are as follows.
4-borono-L-phenylalanine (BPA)
Trifluoroacetic acid, sodium trifluoroacetate acetonitrile (LC-MS measurement grade)
Standard polyethylene glycol (PEG200 and PEG600)
The above BPA to standard polyethylene glycol were purchased from Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) was purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
〔１－１〕ＢＮＣＴ剤を投与した脳腫瘍モデルラットの脳の作製方法
図１の上段に示すように、悪性黒色腫瘍細胞（Ｂ１６Ｆ１０）を脳に移植した脳腫瘍モデルラットにＢＮＣＴ剤を投与した。脳腫瘍モデルラットに投与したＢＮＣＴ剤はＢＰＡ（４－ボロノ－Ｌ－フェニルアラニン）であり、投与条件は３５０ｍｇ／ｋｇ体重の量にて、２時間かけて血管投与した。その後、ＢＰＡを投与した脳腫瘍モデルラットから脳を摘出し、当該脳を液体窒素で冷却したイソペンタンが入った容器に移し、－８０℃で凍結した。脳腫瘍モデルラットの脳に蓄積したホウ素濃度は約２０μｇ／ｇであった。
[1-1] Method for producing brain of brain tumor model rat administered with BNCT agent As shown in the upper row of FIG. 1, a BNCT agent was administered to a brain tumor model rat in which malignant melanoma tumor cells (B16F10) were transplanted into the brain. The BNCT agent administered to brain tumor model rats was BPA (4-borono-L-phenylalanine), and the administration conditions were 350 mg/kg body weight, which was intravascularly administered over 2 hours. Thereafter, the brain was removed from the brain tumor model rat to which BPA had been administered, transferred to a container containing isopentane cooled with liquid nitrogen, and frozen at -80°C. The boron concentration accumulated in the brain of the brain tumor model rat was approximately 20 μg/g.
〔１－２〕試料切片の作製
質量分析イメージング用の試料として、凍結した脳腫瘍モデルラットの脳から１６μｍ厚さ程度の薄片切片を－１５℃のクライオミクロトームを用いて切り出した。切り出した試料切片を、厚さが５０μｍ、縦幅×横幅が２０ｍｍ×２０ｍｍ程度のステンレスプレートに載置した。
[1-2] Preparation of sample section As a sample for mass spectrometry imaging, a thin section approximately 16 μm thick was cut from the frozen brain tumor model rat brain using a cryomicrotome at -15°C. The cut sample section was placed on a stainless steel plate with a thickness of 50 μm and a length x width of approximately 20 mm x 20 mm.
〔１－３〕イメージング測定試料の作製
〔質量較正用試料の作製〕
トリフルオロ酢酸ナトリウムの濃度が２ｍｇ／ｍＬになるようにアセトニトリルに溶解して得た後、０．５μＬの当該溶液をステンレスプレートの試料切片が載置されていない箇所にスポットした。続いて、ＰＥＧ２００及びＰＥＧ６００のそれぞれの濃度が５ｍｇ／ｍＬになるようにアセトニトリルに溶解して得た後、１μＬの当該溶液を先のトリフルオロ酢酸ナトリウムを含むスポットの上にスポットした。
[1-3] Preparation of imaging measurement sample [Preparation of mass calibration sample]
After dissolving sodium trifluoroacetate in acetonitrile to a concentration of 2 mg/mL, 0.5 μL of the solution was spotted on a stainless steel plate where no sample section was placed. Subsequently, PEG200 and PEG600 were each dissolved in acetonitrile to a concentration of 5 mg/mL, and then 1 μL of the solution was spotted on the spot containing sodium trifluoroacetate.
〔ＢＰＡ標準試料〕
質量分解能の調整や装置感度の確認のための標準試料として、濃度が、それぞれ１００ｐｍｏｌ／μＬ、及び２０ｐｍｏｌ／μＬである２つのＢＰＡ標準液（水溶液）を準備した。ステンレスプレートの試料が載置されていない箇所に、１μＬずつ別個に各ＢＰＡ標準液をスポットした。
[BPA standard sample]
Two BPA standard solutions (aqueous solutions) with concentrations of 100 pmol/μL and 20 pmol/μL, respectively, were prepared as standard samples for adjusting mass resolution and confirming device sensitivity. 1 μL of each BPA standard solution was separately spotted on a portion of the stainless steel plate where no sample was placed.
〔マトリックス溶液〕
まず、アセトニトリルを８５体積％含むアセトニトリル水溶液に、トリフルオロ酢酸を０．１体積％になるように添加した。ついで、アセトニトリル水溶液に、４０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＨＢを溶解し、ＤＨＢの溶液を得た。
[Matrix solution]
First, trifluoroacetic acid was added to an acetonitrile aqueous solution containing 85 volume % of acetonitrile so as to have a concentration of 0.1 volume %. Next, DHB was dissolved in an acetonitrile aqueous solution to a concentration of 40 mg/mL to obtain a DHB solution.
〔マトリックスの塗布〕
図１の下段左側に示すように、エアブラシ（ノズル内径:０．２ｍｍ）に１ｍＬのＤＨＢの溶液を採取し、ステンレスプレート上の試料及び各スポット上にスプレーし、１０分間室温にて乾燥させた。
[Matrix application]
As shown on the lower left side of Figure 1, 1 mL of DHB solution was collected with an airbrush (nozzle inner diameter: 0.2 mm), sprayed onto the sample and each spot on the stainless steel plate, and dried at room temperature for 10 minutes. .
〔２〕マトリックス支援レーザー脱離イオン化－質量分析イメージング（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ）
ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩには、装置としてＭＡＬＤＩ－spiralＴＯＦ／ＴＯＦ（日本電子株式会社製）を用いた。測定モードは正イオンモードとし、測定範囲は測定対象化合物が検出できる範囲、より具体的には、ＢＰＡのプロトン付加分子（ｍ/ｚ ２１０）を含む、ｍ/ｚ ２０５～５５０の範囲に設定した。なお、本機のレーザー径は約２０μｍ、発振波長は３４９ｎｍである。
[2] Matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry imaging (MALDI-MSI)
For MALDI-MSI, MALDI-spiralTOF/TOF (manufactured by JEOL Ltd.) was used as an apparatus. The measurement mode was set to positive ion mode, and the measurement range was set to a range in which the target compound to be measured could be detected, more specifically, to a range of m/z 205 to 550, which included the protonated molecule of BPA (m/z 210). . Note that the laser diameter of this device is approximately 20 μm, and the oscillation wavelength is 349 nm.
質量分析イメージング測定前に、まず、ステンレスプレート上のＢＰＡ標準試料にレーザー光を照射し、ＢＰＡのプロトン付加分子のピーク（ｍ/ｚ ２１０）の質量分解能が約２００００となるように遅延引き出し時間等の装置パラメータを調整した。また、レーザー繰り返し速度は２５０Ｈｚに設定し、レーザー光の出力（Laser power）は４２％、検出器電圧は５８％に設定した。 Before mass spectrometry imaging measurement, first, a BPA standard sample on a stainless steel plate is irradiated with laser light, and a delayed extraction time etc. is set so that the mass resolution of the peak of BPA protonated molecules (m/z 210) is approximately 20,000. The device parameters were adjusted. Further, the laser repetition rate was set to 250 Hz, the laser light output (Laser power) was set to 42%, and the detector voltage was set to 58%.
ついで、ステンレスプレート上にスポットしたＰＥＧ２００及びＰＥＧ６００を用いて外部標準法による質量較正を行った。 Next, mass calibration was performed using an external standard method using PEG200 and PEG600 spotted on a stainless steel plate.
質量較正後、１ピクセルあたりの質量分析イメージングの設定を行った。１ピクセルのサイズを６０μｍ程度に設定し、１ピクセルあたりにおけるマススペクトル積算数は４～５とした。上述の遅延引き出し時間等の設定と合わせて、最終的にホウ素剤に由来するイオンの１ピクセルあたりの強度（Ｓ/Ｎ）が１０以上となるように設定した。 After mass calibration, settings for mass spectrometry imaging per pixel were performed. The size of one pixel was set to about 60 μm, and the number of mass spectra integrated per pixel was 4 to 5. Together with the settings of the delay extraction time and the like described above, the final intensity (S/N) per pixel of ions derived from the boron agent was set to be 10 or more.
図１の下段右側に示すように、ステンレスプレート上の試料に対するレーザー光の走査範囲として、イメージングの対象として選択した組織を含む四方を測定領域として指定し、レーザーを照射しながら試料を走査することで質量分析イメージング測定データの取り込みを実施した。 As shown on the lower right side of Figure 1, the four directions including the tissue selected for imaging are designated as the measurement area as the laser beam scanning range for the sample on the stainless steel plate, and the sample is scanned while irradiating the laser. Mass spectrometry imaging measurement data was acquired.
〔４〕データ解析およびイメージング
質量分析イメージングにより取得したマススペクトルにおけるホウ素剤に由来するピークの選択およびＭＳイメージの描画は、質量分析イメージング解析用ソフトウェア（日本電子株式会社製msMicroImager Extract software）を用いて行った。まず、ホウ素剤に由来するピークの代表的なイオンである［ＢＰＡ＋Ｈ］＋に相当するｍ/ｚ ２１０付近を広い質量選択幅０．１ユニットにて選択し、ＭＳイメージを表示した。当該ＭＳイメージから試料切片に映る腫瘍組織と考えられる形状を含む領域を大まかに把握し、当該領域を関心領域（ＲＯＩ）Ｒ１に指定した。図２に関心領域Ｒ１の位置を示す。関心領域Ｒ１のみから抽出したマススペクトル（縦軸は１ピクセルあたりのイオン強度である）を得た。
[4] Data analysis and imaging Selection of peaks derived from boron agents in mass spectra obtained by mass spectrometry imaging and drawing of MS images were performed using mass spectrometry imaging analysis software (msMicroImager Extract software manufactured by JEOL Ltd.). went. First, a region around m/z 210 corresponding to [BPA+H] +, which is a typical ion derived from a boron agent, was selected with a wide mass selection width of 0.1 unit, and an MS image was displayed. From the MS image, a region including a shape considered to be tumor tissue reflected in the sample section was roughly grasped, and the region was designated as a region of interest (ROI) R1. FIG. 2 shows the position of the region of interest R1. A mass spectrum (the vertical axis is the ion intensity per pixel) extracted only from the region of interest R1 was obtained.
次に、関心領域Ｒ１のマススペクトルを、ＤＨＢに由来するイオン（［ＤＨＢ－Ｈ＋２Ｋ］＋；ｍ/ｚ ２３０．９４６）を内部標準として採用し、質量較正を行った。 Next, the mass spectrum of the region of interest R1 was subjected to mass calibration using ions derived from DHB ([DHB-H+2K] + ; m/z 230.946) as an internal standard.
続いて、質量較正を行った関心領域Ｒ１のマススペクトルから質量較正されたｍ/ｚ値に基づいて、近接して検出される複数のピークの中からＢＰＡに由来するピークを特定した。そのピーク位置を指定し、ＭＳイメージを描画した。なお、ピークを特定する際のｍ/ｚ値の実測値理論値とのずれ（mass error）の許容値は、生体試料の質量分析イメージングにおける一般的な許容値である５０ｐｐｍ以下（ｍ/ｚ ２００の場合は２００±０．０１）とした。mass errorに伴い、ピークの質量選択幅は０．０２ユニットとした。 Next, a peak derived from BPA was identified from among a plurality of closely detected peaks based on the mass calibrated m/z value from the mass spectrum of the region of interest R1 for which mass calibration was performed. The peak position was designated and an MS image was drawn. In addition, the allowable value for the deviation (mass error) between the actual measured value and the theoretical value of the m/z value when identifying the peak is 50 ppm or less (m/z 200 200±0.01). Due to the mass error, the mass selection width of the peak was set to 0.02 units.
続いて、質量分析イメージング解析用ソフトウェア（日本電子株式会社製msMicroImager view software）を用い、ＭＳイメージのカラー画像化及び色調調整等を行った。図３に、関心領域Ｒ１のマススペクトル及び［ＢＰＡ＋Ｈ］＋に相当するｍ/ｚ２１０付近のピーク群を一点鎖線内において拡大して表示し、併せて、ＤＨＢ由来イオンｍ/ｚ ２７３のＭＳイメージ（ピーク質量選択幅０．０２ユニット）を表示している。ＢＰＡのプロトン付加分子ｍ/ｚ ２１０．０８５（［ＢＰＡ＋Ｈ］＋）のＭＳイメージは隣接する他のピークのＭＳイメージと異なり腫瘍の形状を示すだけでなく、腫瘍内部のＢＰＡの存在を示し、ＢＰＡが蓄積された状態を示唆する画像であることが確認された。実測値ｍ/ｚ ２１０．０８５のmass errorは３８ｐｐｍと許容範囲内であった。なお、同一切片上にＢＰＡ標準液をスポットし、スポット及びその周辺を測定した場合にｍ/ｚ ２１０．０８５のピーク強度が有意に増加することを確認している。 Subsequently, mass spectrometry imaging analysis software (msMicroImager view software manufactured by JEOL Ltd.) was used to convert the MS image into a color image, adjust the color tone, and the like. Figure 3 shows the mass spectrum of the region of interest R1 and the peak group around m/z 210 corresponding to [BPA+H] + enlarged within the dashed line, and also shows the MS image of the DHB-derived ion m/z 273 ( Peak mass selection width 0.02 units) is displayed. The MS image of the protonated molecule m/z 210.085 ([BPA+H] + ) of BPA, unlike the MS images of other adjacent peaks, not only shows the shape of the tumor but also shows the presence of BPA inside the tumor. It was confirmed that the image suggested a state in which . The mass error of the measured value m/z 210.085 was 38 ppm, which was within the allowable range. It has been confirmed that when a BPA standard solution is spotted on the same section and the spot and its surroundings are measured, the peak intensity at m/z 210.085 increases significantly.
図４にイメージング測定とは別に測定したＢＰＡ標準品スポット（ＤＨＢ溶液を滴下）のマススペクトルを示す。ＢＰＡの場合、ＤＨＢの脱水複合体が検出されており、ｍ/ｚ ３２８にプロトン付加分子（［ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋）、ｍ/ｚ ３５０にナトリウム付加分子（[ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ２Ｏ＋Ｎａ]＋）、ｍ/ｚ ３６６にカリウム付加分子（[ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ２Ｏ＋Ｋ]＋）が検出された。ＢＰＡとＤＨＢとの脱水複合体もＭＳイメージを描画できるＢＰＡ由来イオンと考えられた。 FIG. 4 shows a mass spectrum of a BPA standard spot (DHB solution was added dropwise) measured separately from the imaging measurement. In the case of BPA, a dehydrated complex of DHB has been detected, with a protonated molecule at m/z 328 ([BPA+DHB-2H 2 O+H] + ) and a sodium-added molecule at m/z 350 ([BPA+DHB-2H 2 O+Na] + ), and a potassium adduct molecule ([BPA+DHB-2H 2 O+K] + ) was detected at m/z 366. The dehydrated complex of BPA and DHB was also considered to be a BPA-derived ion that can be used to draw MS images.
〔５〕ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩによって得られたＭＳイメージの評価
図３上部左に［２ＤＨＢ－２Ｈ２Ｏ＋Ｈ]＋に相当するｍ/ｚ ２７３のＭＳイメージを示す。切片外側の強度が強く、切片上のＤＨＢの分布はほぼ一様で、ＢＰＡのＭＳイメージに影響しないことが確認された。従って、[ＢＰＡ＋Ｈ]＋のＭＳイメージは試料組織におけるＢＰＡの分布を可視化する有効な手段であることが確認された。
[5] Evaluation of MS image obtained by MALDI-MSI The upper left of FIG. 3 shows an MS image of m/z 273 corresponding to [2DHB-2H 2 O+H] + . It was confirmed that the intensity outside the section was strong, the distribution of DHB on the section was almost uniform, and it did not affect the MS image of BPA. Therefore, it was confirmed that the [BPA+H] + MS image is an effective means of visualizing the distribution of BPA in the sample tissue.
図５に示すように［ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ２Ｏ＋Ｎａ］＋及び［ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ２Ｏ＋Ｋ］＋のＭＳイメージはプロトン付加分子と同様に腫瘍の形状と腫瘍内部のＢＰＡの分布を示した。図５右側に示した[２ＤＨＢ－Ｈ２Ｏ＋Ｎａ]＋は僅かに腫瘍の形状を示し、[２ＤＨＢ－Ｈ２Ｏ＋Ｋ]＋は明らかな腫瘍の形状と腫瘍内部での局在を示した。ナトリウム付加分子によるＭＳイメージはナトリウムの分布に大きく影響されることなくＢＰＡの分布を示していると考えられ、プロトン付加分子によるＭＳイメージで示される分布の検証に使用できると期待される。しかし、カリウム付加分子によるＭＳイメージはカリウムの分布に依存する可能性があるため、分布の評価ではなく、ＢＰＡの蓄積や排出（ＢＰＡの有無）の評価に有効な手段であると確認された。 As shown in FIG. 5, the MS images of [BPA+DHB-2H 2 O+Na] + and [BPA+DHB-2H 2 O+K] + showed the shape of the tumor and the distribution of BPA inside the tumor as well as protonated molecules. [2DHB-H 2 O+Na] + shown on the right side of FIG. 5 showed a slight tumor shape, and [2DHB-H 2 O+K] + showed a clear tumor shape and localization within the tumor. The MS image using sodium-added molecules is thought to show the distribution of BPA without being significantly affected by the sodium distribution, and is expected to be used to verify the distribution shown in the MS image using proton-added molecules. However, since MS images using potassium-added molecules may depend on potassium distribution, it was confirmed that it is an effective means for evaluating BPA accumulation and excretion (presence or absence of BPA) rather than for evaluating distribution.
以上に説明する通り、本ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法が腫瘍モデルラットに投与したＢＰＡの脳組織内分布または蓄積の状態を可視化する方法として有効であることを確認した。 As explained above, it was confirmed that the present MALDI-MSI method is effective as a method for visualizing the distribution or accumulation state of BPA in brain tissue administered to tumor model rats.
図６に血管投与法と異なる脳脊髄液投与法にて腫瘍モデルラットに投与したＢＰＡの分布を示す［ＢＰＡ＋Ｈ］＋のＭＳイメージ（ピーク質量選択幅０．０２ユニット）及び[ＢＰＡ＋Ｈ]＋ピーク付近のマススペクトル（腫瘍部を関心領域に指定）を示す。図６に示すようにホウ素剤の投与方法によらず本ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法によってＢＰＡの分布が可視化できることを確認した。 Figure 6 shows the distribution of BPA administered to tumor model rats by a cerebrospinal fluid administration method different from the vascular administration method. MS images of [BPA+H] + (peak mass selection width 0.02 units) and the vicinity of the [BPA+H] + peak. The mass spectrum (with the tumor designated as the region of interest) is shown. As shown in FIG. 6, it was confirmed that the distribution of BPA could be visualized by this MALDI-MSI method regardless of the method of administering the boron agent.
以上では、マトリックスとして２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を用いたＭＡＬＤＩ－ＭＳによるイメージングを実施例にて説明した。マトリックスとしては、ＤＨＢと同様に、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を用いることができると期待される。 In the above, imaging by MALDI-MS using 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) as a matrix has been described in Examples. It is expected that α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) can be used as the matrix, similar to DHB.
Claims (9)
前記マトリックスを塗布した生体試料の表面にレーザー光を照射することで、前記ホウ素剤に由来するイオンを生成する工程と、
前記イオンを分離し、検出してマススペクトルを取得する工程と、
前記マススペクトルから前記イオンの分布をイメージングする工程と、を包含する、質量分析イメージング法。 applying a matrix solution to a biological sample containing a boron agent;
generating ions derived from the boron agent by irradiating the surface of the biological sample coated with the matrix with laser light;
separating and detecting the ions to obtain a mass spectrum;
A mass spectrometry imaging method comprising: imaging the distribution of the ions from the mass spectrum.
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