JP2024026695A - Method for suppressing non-specific nucleic acid amplification - Google Patents
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Abstract
【課題】 ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応において非特異的な核酸増幅を抑制する手法を提供すること。【解決手段】 本発明は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応で起こり得る非特異的な核酸増幅を抑制する方法を提供する。好ましくは、前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度を０ｍＭより多く５０ｍＭ以下とする。カオトロピック剤は、好ましくはグアニジニウムイオン、尿素イオン、ヨウ化物イオン、リチウムイオン及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種である。【選択図】 なし[Problem] To provide a method for suppressing non-specific nucleic acid amplification in RT-RamDA reaction. SOLUTION: The present invention provides a method for suppressing non-specific nucleic acid amplification that may occur in the RT-RamDA reaction by allowing template RNA and a chaotropic agent to coexist in the RT-RamDA reaction solution. Preferably, the final concentration of the chaotropic agent in the RT-RamDA reaction solution is greater than 0 mM and less than 50 mM. The chaotropic agent is preferably at least one selected from the group consisting of guanidinium ions, urea ions, iodide ions, lithium ions, and salts thereof. [Selection diagram] None
Description
本発明は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅の抑制方法に関する。 The present invention relates to a method for suppressing non-specific nucleic acid amplification in RT-RamDA reaction.
ＲＴ－ＲａｍＤＡ法は、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程により、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる増幅逆転写法である（特許文献１）。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法は従来の逆転写反応よりもｃＤＮＡを１０～１００倍に増加可能であることが報告されている。そのため従来難しかった微量なＲＮＡからの低発現遺伝子の検出や検出遺伝子数の拡充が可能であり、有望な核酸増幅技術として期待されている。
The RT-RamDA method amplifies cDNA using RNA as a template by incubating a mixture containing template RNA, primers, DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme, RNase H-minus reverse transcriptase, and a substrate. This is an amplification reverse transcription method (Patent Document 1). It has been reported that the RT-RamDA method can increase
本発明者等は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行う際に、時に非特異的な核酸増幅が発生して、電気泳動で検出した際に高分子側にスメアリングが認められるケースがあり、このような意図しない非特異的な核酸増幅を抑制する手法の開発が必要であるという知見を得た。理論に束縛されることは望まないが、この非特異的な増幅が発生する一つの原因として、不適切なプライマー同士のアニーリングや異常増幅産物の凝集体の発生によることが想定され得る。そこで、本発明は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法において発生する上記のような非特異的な核酸増幅を抑制するための手段の提供を１つの目的とする。 The present inventors have discovered that when performing RT-RamDA reactions, non-specific nucleic acid amplification sometimes occurs, and smearing is observed on the polymer side when detected by electrophoresis. We obtained the knowledge that it is necessary to develop a method to suppress unintended non-specific nucleic acid amplification. Although not wishing to be bound by theory, one possible cause of this non-specific amplification is inappropriate annealing between primers or the formation of aggregates of abnormal amplification products. Therefore, one object of the present invention is to provide a means for suppressing the above-mentioned non-specific nucleic acid amplification that occurs in the RT-RamDA method.
本発明者等は、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、ＲＴ－ＲａｍＤＡ方法において、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中に鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させてＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことにより、非特異的な核酸増幅反応を抑制できることを見出し、本発明の完成に至った。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have discovered that, in the RT-RamDA method, a template RNA and a chaotropic agent are allowed to coexist in the RT-RamDA reaction solution to perform the RT-RamDA reaction. The inventors have discovered that specific nucleic acid amplification reactions can be suppressed, leading to the completion of the present invention.
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
［項１］ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅を抑制する方法であって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする方法。
［項２］ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に供する鋳型ＲＮＡ含有生体試料を、カオトロピック剤を含む細胞溶解剤で処理することにより、カオトロピック剤を含む鋳型ＲＮＡ含有生体試料液を調製し、該カオトロピック剤を含む鋳型ＲＮＡ含有生体試料液とＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液とを混合することにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中で鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させる、項１に記載の方法。
［項３］ 前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が０ｍＭより多く５０ｍＭ以下である、項１又は２に記載の方法。
［項４］ 前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が０ｍＭより多く２０ｍＭ以下である、項１から３のいずれかに記載の方法。
［項５］ 前記カオトロピック剤がグアニジニウムイオン、尿素イオン、ヨウ化物イオン、リチウムイオン及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種類のカオトロピック剤である項１から４のいずれかに記載の方法。
［項６］ 前記カオトロピック剤がグアニジニウム塩である項１から５のいずれかに記載の方法。
［項７］ 前記カオトロピック剤がグアニジンチオシアン酸塩である項１から６のいずれかに記載の方法。
［項８］ 前記ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液が更に無機塩を含む、項１から７のいずれかに記載の方法。
［項９］ 前記無機塩が、カリウム塩、マンガン塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である、項８に記載の方法。
［項１０］ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の安定化方法であって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液において鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする、方法。
［項１１］ カオトロピック剤を含有するＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液を含む、項１から１０のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
［項１２］ カオトロピック剤を含有する細胞溶解液を含む、項１から１０のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
That is, the present invention includes the following aspects.
[Item 1] A method for suppressing non-specific nucleic acid amplification in RT-RamDA reaction, characterized by coexisting template RNA and a chaotropic agent in the RT-RamDA reaction solution.
[Section 2] Prepare a template RNA-containing biological sample solution containing a chaotropic agent by treating a template RNA-containing biological sample to be subjected to RT-RamDA reaction with a cell lysing agent containing a chaotropic agent, and prepare a template RNA-containing biological sample solution containing the chaotropic agent. 2. The method according to item 1, wherein the template RNA and the chaotropic agent are allowed to coexist in the RT-RamDA reaction solution by mixing the RNA-containing biological sample solution and the RT-RamDA reaction solution.
[Item 3] The method according to Item 1 or 2, wherein the final concentration of the chaotropic agent in the RT-RamDA reaction solution is more than 0 mM and not more than 50 mM.
[Item 4] The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the final concentration of the chaotropic agent in the RT-RamDA reaction solution is more than 0 mM and not more than 20 mM.
[Item 5] The chaotropic agent according to any one of Items 1 to 4, wherein the chaotropic agent is at least one chaotropic agent selected from the group consisting of guanidinium ions, urea ions, iodide ions, lithium ions, and salts thereof. Method.
[Item 6] The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the chaotropic agent is a guanidinium salt.
[Item 7] The method according to any one of Items 1 to 6, wherein the chaotropic agent is guanidine thiocyanate.
[Item 8] The method according to any one of Items 1 to 7, wherein the RT-RamDA reaction solution further contains an inorganic salt.
[Item 9] The method according to Item 8, wherein the inorganic salt is at least one selected from the group consisting of potassium salts, manganese salts, and magnesium salts.
[Item 10] A method for stabilizing RT-RamDA reaction, characterized by allowing template RNA and a chaotropic agent to coexist in the RT-RamDA reaction solution.
[Item 11] A kit for use in the method according to any one of Items 1 to 10, comprising an RT-RamDA reaction solution containing a chaotropic agent.
[Item 12] A kit for use in the method according to any one of Items 1 to 10, comprising a cell lysate containing a chaotropic agent.
本発明により、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅反応を効果的に抑制することができる。これにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法における定量性を損なうことなく、再現性が高く、安定したＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことが可能となる。 According to the present invention, non-specific nucleic acid amplification reactions in RT-RamDA reactions can be effectively suppressed. This makes it possible to perform a stable RT-RamDA reaction with high reproducibility without impairing the quantitative nature of the RT-RamDA method.
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。また本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方または両方を意味する。 The embodiments of the present invention will be described in detail below, but the present invention is not limited thereto. In addition, all non-patent literature and patent literature described in this specification are used as a reference in this specification. In addition, "~" in this specification means "more than or equal to, less than or equal to", and for example, if it is described as "X to Y" in the specification, it means "more than or equal to X, less than or equal to Y." Moreover, "and/or" in this specification means either one or both.
一つの実施態様において、本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅を抑制する方法は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法を行うにあたり、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中で鋳型ＲＮＡ及びカオトロピック剤を共存させてＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことを特徴とする。このようにＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中でカオトロピック剤を共存させて鋳型ＲＮＡからのｃＤＮＡ増幅を行うことにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応で起こり得る非特異的な核酸増幅を、効果的に抑制・低減することができる。また、本発明の方法は、非特異的な核酸増幅を抑えて安定的に再現性良くＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができるという観点から、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の安定化方法ということもできる。 In one embodiment, the method of suppressing non-specific nucleic acid amplification in RT-RamDA reaction of the present invention includes coexisting template RNA and a chaotropic agent in the RT-RamDA reaction solution when performing the RT-RamDA method. It is characterized by carrying out RT-RamDA reaction. In this way, by coexisting a chaotropic agent in the RT-RamDA reaction solution and performing cDNA amplification from template RNA, non-specific nucleic acid amplification that may occur in the RT-RamDA reaction can be effectively suppressed and reduced. I can do it. Furthermore, the method of the present invention can also be referred to as a method for stabilizing RT-RamDA reactions from the viewpoint that non-specific nucleic acid amplification can be suppressed and RT-RamDA reactions can be performed stably and with good reproducibility.
・ＲＴ－ＲａｍＤＡ法（鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる増幅逆転写法）
ＲＴ－ＲａｍＤＡ法とは、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含む、核酸の増幅方法である。従って、本発明におけるＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は少なくとも上記の各成分（即ち、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質）を含むものである。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッド鎖のうちのｃＤＮＡ鎖をＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素により無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３’側のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡから剥がされ、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなｃＤＮＡ鎖が合成される。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法の詳細については、米国特許出願公開公報２０１７／０２７５６８５（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
・RT-RamDA method (amplification reverse transcription method in which reverse transcription of template RNA amplifies cDNA using RNA as a template)
The RT-RamDA method is a nucleic acid amplification method that includes a step of incubating a mixture containing template RNA, a primer, a DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme, an RNase H-minus type reverse transcriptase, and a substrate. . Therefore, the RT-RamDA reaction solution in the present invention contains at least each of the above components (i.e., template RNA, primer, DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme, RNase H-minus reverse transcriptase, and substrate). . In the RT-RamDA method, complementary strand DNA (cDNA) of template RNA is synthesized by the RNA-dependent DNA polymerase activity of RNase H-minus reverse transcriptase, and the cDNA strand of the hybrid strand of RNA and cDNA is made into a DNA strand-specific strand. Targeted RNA: Randomly cleaved with DNA hybrid strand degrading enzyme, the above-mentioned cleavage site becomes the starting point, and the 3' cDNA strand is peeled off from the RNA by the strand displacement activity of RNase H-minus reverse transcriptase. A new cDNA strand is synthesized at the part stripped off by reverse transcriptase. Details of the RT-RamDA method are described in US Patent Application Publication No. 2017/0275685 (which is incorporated herein in its entirety by reference).
一つの実施形態において、本発明は、上記のＲＴ－ＲａｍＤＡ法を行う際に起こり得る非特異的な核酸増幅を抑制することを特徴とする。本明細書において、「非特異的な核酸増幅」とは特に限定されず、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法において正常な特異的増幅産物以外の増幅産物が発生することを指す。例えば、増幅産物の直鎖状多量体（コンカテマー）の形成、増幅産物の直鎖状多量体（コンカテマー）の凝集体の形成、プライマー同士の直鎖状多量体（コンカテマー）の形成、プライマー同士の直鎖状多量体（コンカテマー）の凝集体の形成、プライマーのミスマッチアニーリング形成、及び／又はプライマーダイマー形成等の非特異的な増幅産物の形成が挙げられる。本発明は、上記で列挙した全ての非特異的な増幅産物の形成を抑制するものでなくてもよく、例えば、上記で列挙した非特異的な増幅産物の形成のうちの少なくとも１つの形成を抑制するものであり得る。
本明細書において、非特異的な核酸増幅が抑制されているかどうかの判断基準としては、例えば、カオトロピック剤を使用していない場合と比較して、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中にカオトロピック剤を共存させた場合に、初期鋳型量とＣｔ値との間での直線関係が改善すること、及び／又はＰＣＲ効率が改善すること（例えば、ＰＣＲ効率がより１００％に近付くこと）が挙げられる。
In one embodiment, the present invention is characterized by suppressing non-specific nucleic acid amplification that may occur when performing the above RT-RamDA method. As used herein, "non-specific nucleic acid amplification" is not particularly limited, and refers to the generation of amplification products other than normal specific amplification products in the RT-RamDA method. For example, the formation of linear multimers (concatemers) of amplification products, the formation of aggregates of linear multimers (concatemers) of amplification products, the formation of linear multimers (concatemers) between primers, and the formation of linear multimers (concatemers) between primers. Examples include the formation of non-specific amplification products such as the formation of aggregates of linear multimers (concatemers), the formation of mismatch annealing of primers, and/or the formation of primer dimers. The present invention does not have to suppress the formation of all of the non-specific amplification products listed above; for example, the present invention does not necessarily suppress the formation of at least one of the non-specific amplification products listed above. It can be suppressive.
In this specification, the criterion for determining whether non-specific nucleic acid amplification is suppressed is, for example, when a chaotropic agent is present in the RT-RamDA reaction solution, compared to when no chaotropic agent is used. In this case, the linear relationship between the initial template amount and the Ct value is improved, and/or the PCR efficiency is improved (for example, the PCR efficiency approaches 100%).
・カオトロピック剤
本発明においては、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中にカオトロピック剤を共存させることを一つの特徴とする。カオトロピック剤は、水素結合、ファンデルワールス力および疎水性効果などの非共有結合力により仲介される分子間相互作用の安定化を阻害する成分をいう。そのためカオトロピック剤は、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの巨大分子の三次元構造を破壊し、それらを変性させることが可能である。従って、過剰量のカオトロピック剤の使用は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に影響を与えることも懸念される。しかしながら、理論には束縛されないが、本発明者らの検討結果から、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に所与の条件でカオトロピック剤を共存させることによって、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応において、例えばプライマーのミスアニーリングを防ぐ作用及び／又は異常増幅産物の凝集体等を適切に解す作用等が発揮されて、意図しない非特異的な核酸増幅を抑制でき、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を安定化させることができると推察され得る。
- Chaotropic agent One feature of the present invention is that a chaotropic agent is present in the RT-RamDA reaction solution. Chaotropic agents refer to components that inhibit the stabilization of intermolecular interactions mediated by non-covalent forces such as hydrogen bonds, van der Waals forces and hydrophobic effects. Chaotropic agents are therefore capable of disrupting the three-dimensional structure of macromolecules such as proteins, DNA, or RNA, denaturing them. Therefore, there is a concern that the use of an excessive amount of a chaotropic agent may affect the RT-RamDA reaction. However, without being bound by theory, the present inventors have found that by coexisting a chaotropic agent under given conditions in the RT-RamDA reaction solution, for example, mis-annealing of primers can be prevented in the RT-RamDA reaction. It can be inferred that the action and/or the action of appropriately dissolving aggregates of abnormal amplification products, etc. can be exerted, suppressing unintended non-specific nucleic acid amplification, and stabilizing the RT-RamDA reaction.
本発明に用いられ得るカオトロピック剤としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、グアニジニウムイオン、尿素イオン、ヨウ化物イオン、リチウムイオン及びこれらの塩（例えば、塩酸塩、チオシアン酸塩、過塩素酸塩等）からなる群より選択される少なくとも１種を用いることができる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を阻害する影響が比較的小さく、また、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な核酸増幅を高度に抑制できるという観点から、カオトロピック剤としては、グアニジニウムイオン及び／又はその塩を用いるのが好ましく、グアニジニウム塩を用いることがより好ましく、グアニジンチオシアン酸塩及び／又はグアニジン塩酸塩を用いることが更に好ましく、なかでもグアニジンチオシアン酸塩を用いることが特に好ましい。 Chaotropic agents that can be used in the present invention are not particularly limited as long as they exhibit the effects of the present invention, but examples include guanidinium ions, urea ions, iodide ions, lithium ions, and salts thereof (e.g., hydrochloride, thiocyanate). At least one selected from the group consisting of salts, perchlorates, etc.) can be used. Guanidinium ions and/or their salts are used as the chaotropic agent from the viewpoint that they have a relatively small effect of inhibiting the RT-RamDA reaction and can highly suppress non-specific nucleic acid amplification in the RT-RamDA reaction. It is preferable to use guanidinium salt, it is more preferable to use guanidine thiocyanate and/or guanidine hydrochloride, and it is particularly preferable to use guanidine thiocyanate.
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の添加量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、前述のように過剰量のカオトロピック剤がＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に存在すると、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応が阻害されやすくなる懸念がある。従って、本発明において使用するカオトロピック剤の濃度は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中の終濃度として、例えば、５０ｍＭ以下であることが好ましく、４０ｍＭ以下であることがより好ましく、３０ｍＭ以下であることが更に好ましく、２０ｍＭ以下であることが特に好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度の下限値は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、一例として、０ｍＭより多い量とすることができ、１ｍＭ以上であることが好ましく、３ｍＭ以上であることがより好ましく、５ｍＭ以上であることが更に好ましく、７ｍＭ以上であることが更により好ましく、１０ｍＭ以上であることが特に好ましい。 The amount of the chaotropic agent added to the RT-RamDA reaction solution is not particularly limited as long as the effects of the present invention are achieved, but as mentioned above, if an excessive amount of the chaotropic agent is present in the RT-RamDA reaction solution, the RT-RamDA reaction will be impaired. There is a concern that they will be more easily inhibited. Therefore, the concentration of the chaotropic agent used in the present invention is preferably, for example, 50 mM or less, more preferably 40 mM or less, and still more preferably 30 mM or less, as the final concentration in the RT-RamDA reaction solution. Preferably, it is particularly preferably 20 mM or less. The lower limit of the final concentration of the chaotropic agent in the RT-RamDA reaction solution is not particularly limited as long as it achieves the effects of the present invention, but as an example, it can be greater than 0 mM, preferably 1 mM or more, It is more preferably 3mM or more, even more preferably 5mM or more, even more preferably 7mM or more, and particularly preferably 10mM or more.
・鋳型ＲＮＡ
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いる鋳型ＲＮＡとしては、組織や細胞から抽出されたＲＮＡ、組織や細胞からの抽出処理後に更に精製されたＲＮＡ（例えば、エタノール沈殿、カラム精製等の当該分野で公知の任意の精製手段により処理された精製ＲＮＡ）等の任意のＲＮＡであり得る。簡便には、鋳型ＲＮＡとして、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法による解析を望む生体試料（細胞や組織等）を細胞溶解剤で溶解した試料（本明細書では、これを「鋳型ＲＮＡ含有生体試料」ともいう）を、更なる抽出・精製工程を経ずに、そのままＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いることもできる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれる鋳型ＲＮＡの量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実に精度よくＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは０．１ｐｇ／μｌ～１０ｎｇ／μｌ、より好ましくは０．１ｐｇ／μｌ～１ｎｇ／μｌとすることができる。本発明において、鋳型ＲＮＡとして「鋳型ＲＮＡ含有生体試料」を用いる場合は、該生体試料中に含まれる鋳型ＲＮＡの量が上記濃度範囲内となるような量で使用すればよい。
・Template RNA
The template RNA used in the RT-RamDA reaction may be RNA extracted from tissues or cells, or RNA that has been further purified after extraction from tissues or cells (for example, using any method known in the art such as ethanol precipitation, column purification, etc.). It can be any RNA, such as purified RNA processed by purification means. For convenience, a template RNA is a sample obtained by dissolving a biological sample (cells, tissues, etc.) that is desired to be analyzed by the RT-RamDA method using a cell lysing agent (herein, this is also referred to as a "template RNA-containing biological sample"). can also be used as is in the RT-RamDA reaction without further extraction and purification steps. The amount of template RNA contained in the RT-RamDA reaction solution is not particularly limited as long as it achieves the effects of the present invention, but it is possible to carry out the RT-RamDA reaction more reliably and accurately, and to obtain stable and highly reproducible results. From the viewpoint of ease of obtaining, it is preferably 0.1 pg/μl to 10 ng/μl, more preferably 0.1 pg/μl to 1 ng/μl. In the present invention, when a "template RNA-containing biological sample" is used as template RNA, it may be used in an amount such that the amount of template RNA contained in the biological sample falls within the above concentration range.
核酸増幅対象となる鋳型ＲＮＡを抽出する細胞・組織の種類は特に制限されず、いかなる種類の細胞・組織であってもよい。例えば、細胞の個数は、セルソーターにより適宜調整することができる。例えば、少数（例えば１～１００個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１又は２個、より好ましくは１個）の細胞から抽出されたＲＮＡを使用することもできる。
細胞からＲＮＡを抽出する方法は、通常、細胞溶解成分を含む細胞溶解剤を用いて、細胞を溶解する工程を含む。
細胞溶解剤は、例えば、細胞溶解成分として界面活性剤を含むもの等であり得る。界面活性剤としては、例えば、アニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム）、カチオン性界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ノニオン性界面活性剤（例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、及び両イオン性界面活性剤（例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸）等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、細胞溶解剤は、細胞溶解成分としてプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＫ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、これら２種以上の組合せ等を任意に含むものであってもよい。更に特定の実施形態では、本発明で用いる細胞溶解剤は、カオトロピック剤（例えば、尿素、過塩素酸リチウム塩、グアニジン塩酸塩等のグアニジニウム塩等）を含んでいてもよいし、他の特定の実施形態では、細胞溶解剤はカオトロピック剤を含まないものであってもよい。細胞溶解剤は、通常、前記のような細胞溶解成分を、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）等の水性溶媒に溶解した水溶液の形態で使用される。
The type of cells/tissues from which the template RNA to be subjected to nucleic acid amplification is extracted is not particularly limited, and may be any type of cells/tissues. For example, the number of cells can be adjusted as appropriate using a cell sorter. For example, RNA extracted from a small number of cells (eg, 1 to 100 cells, preferably 1 to 10 cells, more preferably 1 or 2 cells, more preferably 1 cell) can also be used.
A method for extracting RNA from cells usually includes the step of lysing the cells using a cytolytic agent containing a cytolytic component.
The cell lysing agent may include, for example, a surfactant as a cell lysing component. Examples of surfactants include anionic surfactants (e.g., sodium dodecyl sulfate, sodium cholate, sodium deoxycholate), cationic surfactants (e.g., cetyltrimethylammonium bromide), and nonionic surfactants. (e.g., octylphenol ethoxylate, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate), and zwitterionic surfactants (e.g., 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonium). Examples include, but are not limited to, 1-propanesulfonic acid) and the like. Furthermore, the cell lysing agent may optionally contain protease (eg, protease K), an RNase inhibitor, a combination of two or more of these, etc. as cell lysing components. In more specific embodiments, the cell lysing agent used in the present invention may include a chaotropic agent (e.g., urea, guanidinium salts such as lithium perchlorate, guanidine hydrochloride, etc.) or other specific agents. In embodiments, the cytolytic agent may be free of chaotropic agents. The cell lysing agent is usually used in the form of an aqueous solution in which the above cell lysing component is dissolved in an aqueous solvent such as water (preferably nuclease-free water).
特定の実施形態において、本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、カオトロピック剤を含む細胞溶解剤を用いて生体試料（例えば、細胞、組織等）を溶解して得られる鋳型ＲＮＡ含有生体試料を用いることができる。このようなカオトロピック剤を含む細胞溶解剤で処理して得た鋳型ＲＮＡ含有生体試料は、更なる抽出・精製工程を経ていなければ、そのままカオトロピック剤を含む生体試料液となるため、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液と混合した場合に、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中にカオトロピック剤が持ち込まれることとなる。このようなカオトロピック剤を含む生体試料液を鋳型ＲＮＡ含有生体試料として用いる場合、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に別途、カオトロピック剤を添加する必要がないという利点がある。 In certain embodiments, the RT-RamDA method of the present invention may use a template RNA-containing biological sample obtained by lysing a biological sample (e.g., cells, tissues, etc.) using a cell lysing agent containing a chaotropic agent. can. A template RNA-containing biological sample obtained by treatment with a cell lysing agent containing a chaotropic agent will directly become a biological sample solution containing a chaotropic agent unless it undergoes further extraction and purification steps, so RT-RamDA When mixed with the reaction solution, the chaotropic agent will be brought into the RT-RamDA reaction solution. When a biological sample solution containing such a chaotropic agent is used as a template RNA-containing biological sample, there is an advantage that there is no need to separately add a chaotropic agent to the RT-RamDA reaction solution.
カオトロピック剤を含む細胞溶解剤で生体試料を溶解して得られる生体試料液を鋳型ＲＮＡ含有生体試料として用いる場合、カオトロピック剤を別途添加しても添加しなくても、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液におけるカオトロピック剤の総量の終濃度が、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは４０ｍＭ以下、更に好ましくは３０ｍＭ以下、特に好ましくは２０ｍＭ以下となるような細胞溶解液を使用することが好ましい。同様に、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液におけるカオトロピック剤の総量の終濃度の下限値が、例えば、０ｍＭより多い量、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは３ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上、更により好ましくは７ｍＭ以上、とりわけ１０ｍＭ以上となるように調整された細胞溶解液を使用することが好ましい。 When using a biological sample solution obtained by dissolving a biological sample with a cell lysing agent containing a chaotropic agent as a template RNA-containing biological sample, whether or not a chaotropic agent is added separately, the chaotropic reaction in the RT-RamDA reaction solution It is preferable to use a cell lysate in which the final concentration of the total amount of the agent is preferably 50 mM or less, more preferably 40 mM or less, still more preferably 30 mM or less, particularly preferably 20 mM or less. Similarly, the lower limit of the final concentration of the total amount of chaotropic agents in the RT-RamDA reaction solution is, for example, more than 0 mM, preferably 1 mM or more, more preferably 3 mM or more, even more preferably 5 mM or more, even more preferably 7 mM. As mentioned above, it is particularly preferable to use a cell lysate adjusted to have a concentration of 10 mM or more.
・ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素
ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素は、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を切断する活性を有する酵素であることが好ましい。当該酵素としては、例えば、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、非特異的ＤＮＡ分解酵素を使用することができる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれるＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実に精度よくＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、０．０１Ｕ／μｌ～０．１Ｕ／μｌとすることができる。
- DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme The DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme is preferably an enzyme having an activity of cleaving a DNA strand in a hybrid strand of RNA and DNA. As the enzyme, for example, a double-strand specific DNA degrading enzyme or a non-specific DNA degrading enzyme can be used. The amount of the DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme contained in the RT-RamDA reaction solution is not particularly limited as long as it achieves the effects of the present invention, but the RT-RamDA reaction can be performed more reliably and accurately, From the viewpoint of being able to easily obtain stable and highly reproducible results, it is preferably 0.01 U/μl to 0.1 U/μl.
二本鎖特異的分解酵素（二本鎖特異的ヌクレアーゼ；ＤＳＮとも言う）は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、甲殻類由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。具体的な例としては、以下のものが挙げられる。
・ Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａ ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）ＤＳＮ
・ Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）ｄｓＤＮａｓｅ
・ Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）ＤＳＮ
・ その他のＤＳＮホモログ
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。上記の中では、エビ由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体が好ましい。
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することができる。市販品としては、ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、Ｈｌ－ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、ｄｓＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｓｈｒｉｍｐ ＤＮａｓｅ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄｓＤＮａｓｅ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）などを挙げることができる。
As the double-strand specific nuclease (also referred to as DSN), enzymes derived from prokaryotes or eukaryotes can be used, but preferably double-strand specific nucleases derived from crustaceans are used. DNA degrading enzymes or modified versions thereof can be used. Specific examples include the following.
・ Solenocera melantho DNase
・Penaeus japonicus (Kuruma shrimp) DNase
・ Paralithodes camtschaticus (king crab) DSN
・Pandalus borealis dsDNase
・ Chionoecetes opilio (snow crab) DSN
- Other DSN homologues The double-stranded specific DNA degrading enzyme is preferably an enzyme that has DNA degrading activity even below 60°C. Among the above, shrimp-derived double-strand-specific DNA degrading enzymes or variants thereof are preferred.
Commercially available products can be used as the double-strand-specific DNA degrading enzyme. Commercially available products include dsDNase (ArcticZymes), Hl-dsDNase (ArcticZymes), dsDNase (Thermo Scientific), Shrimp DNase, Recombinant (Affymetrix), and Affymetrix. tlantis dsDNase (Zymo Research), Thermolabile Nuclease (Roche), etc. can be mentioned.
非特異的ＤＮＡ分解酵素としては、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有し、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖、一本鎖ＲＮＡを切断する活性を実質的に有さず、好ましくは、一本鎖ＤＮＡを切断する活性がＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性に比較して低くなる酵素を挙げることができる。非特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。このような非特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することもでき、例えば、ＤＮａｓｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、ＤＮａｓｅＩ）等を用いることが可能である。
非特異的ＤＮＡ分解酵素は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、ほ乳類由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体、より好ましくはウシ由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。
As a non-specific DNA degrading enzyme, it has the activity of cleaving the DNA strand of the hybrid strand of RNA and DNA, and has substantially no activity of cleaving the RNA strand of the hybrid strand of RNA and DNA, or single-stranded RNA. Preferably, the activity of cleaving single-stranded DNA is lower than the activity of cleaving a DNA strand of a hybrid strand of RNA and DNA. The non-specific DNA degrading enzyme is preferably an enzyme that has DNA degrading activity even at temperatures below 60°C. As such a non-specific DNA degrading enzyme, a commercially available product can be used, and for example, DNase I (manufactured by Thermo Fisher, DNase I), etc. can be used.
As the non-specific DNase, an enzyme derived from a prokaryote or a eukaryote can be used, but preferably a non-specific DNase derived from a mammal or a variant thereof, more preferably a non-specific DNase derived from a bovine. Specific DNA degrading enzymes or variants thereof can be used.
上記改変体とは、天然由来のアミノ酸配列を改変することによって得られる酵素を意味する。具体的には、天然由来のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる酵素、並びに天然由来のアミノ酸配列において１又は数個（例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなる酵素である。 The above-mentioned variant refers to an enzyme obtained by modifying a naturally occurring amino acid sequence. Specifically, an enzyme consisting of an amino acid sequence having 80% or more (preferably 90% or more, more preferably 95% or more) sequence identity with a naturally occurring amino acid sequence, and one or several enzymes in the naturally occurring amino acid sequence. The enzyme is an enzyme consisting of an amino acid sequence having deletions, substitutions, and/or additions (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids.
・一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は更に、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含んでいてもよい。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、通常、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素とともに使用される。なかでも、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素として、非特異的ＤＮＡ分解酵素を用いる場合に、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含むことが好ましい。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質としては、例えば、Ｔ４ジーン３２プロテイン、ＲｅｃＡ、ＳＳＢ（Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液が一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む場合、その一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の添加量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、１０ｎｇ／μｌ～１００ｎｇ／μｌとすることができる。
- Single-stranded DNA binding protein The RT-RamDA reaction solution may further contain a single-stranded DNA binding protein. Single-stranded DNA binding proteins are commonly used in conjunction with DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzymes. Among these, when a non-specific DNA degrading enzyme is used as the DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme, it is preferable to include a single-stranded DNA binding protein. Examples of the single-stranded DNA binding protein include T4 gene 32 protein, RecA, SSB (Single-Stranded DNA Binding Protein), and a combination of two or more of these. When the RT-RamDA reaction solution contains a single-stranded DNA-binding protein, the amount of the single-stranded DNA-binding protein added is not particularly limited as long as the effects of the present invention are achieved, but the RT-RamDA reaction can be carried out more reliably. From the viewpoint of easily obtaining stable and highly reproducible results, it is preferably 10 ng/μl to 100 ng/μl.
・プライマー
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いるプライマーとしては、鋳型ＲＮＡに対する特異的なプライマー、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、これら２種以上の組合せが挙げられる。オリゴｄＴプライマーとランダムプライマーとを組み合わせて用いる場合、それらのモル比は、例えば、オリゴｄＴプライマー：ランダムプライマーの比率が１：５～１：１５とすることができ、好ましくは１：８～１：１２である。
ランダムプライマーとしては、例えば、完全ランダムプライマー、ＮＳＲ（Ｎｏｔ Ｓｏ Ｒａｎｄｏｍ）プライマーが挙げられる。
- Primers Primers used in the RT-RamDA reaction include specific primers for template RNA, oligo dT primers, random primers, and combinations of two or more of these. When using an oligo dT primer and a random primer in combination, their molar ratio can be, for example, 1:5 to 1:15, preferably 1:8 to 1. :12.
Examples of random primers include completely random primers and NSR (Not So Random) primers.
完全ランダムプライマーとは、種々の塩基配列を有するプライマーの混合物であり、各塩基配列は完全にランダムな塩基配列である。完全ランダムプライマーは、ｒＲＮＡ配列と完全に一致する（又は完全に相補的な）配列を含み得る。完全ランダムプライマーとしては、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘキサマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマー、これらの組合せなどが例示できる。例えば、完全ランダムヘキサマーは、４種類のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）で可能な全ての塩基配列（４６種類）の混合物であってもよい。 A completely random primer is a mixture of primers having various base sequences, and each base sequence is a completely random base sequence. A completely random primer may contain a sequence that perfectly matches (or is completely complementary) to the rRNA sequence. Examples of completely random primers include completely random pentamers, completely random hexamers, completely random heptamers, completely random octamers, and combinations thereof. For example, a completely random hexamer may be a mixture of all possible base sequences (46 types) of four types of nucleotides (A, T, C, G).
ＮＳＲプライマーとは、完全ランダムプライマーから、ｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するプライマーを除去したものである。除去するｒＲＮＡ配列としては、例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列、２８Ｓ ｒＲＮＡ配列、１２Ｓ ｒＲＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列、これらの組合せが挙げられる。
ＮＳＲプライマーとしては、例えば、完全ランダムヘキサマーからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するヘキサマーを除外したものが挙げられる。また、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマーなどのプライマーセットからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するものを除外したものをＮＳＲプライマーとすることもできる。
このようなＮＳＲプライマーを使うことにより、ｍＲＮＡ等をより高感度に解析することができる。
The NSR primer is a completely random primer obtained by removing a primer having a sequence completely complementary to the rRNA sequence. Examples of rRNA sequences to be removed include 18S rRNA sequences, 28S rRNA sequences, 12S rRNA sequences, 16S rRNA sequences, and combinations thereof.
Examples of NSR primers include completely random hexamers excluding hexamers having a sequence completely complementary to the rRNA sequence. Further, a primer set such as completely random pentamer, completely random heptamer, completely random octamer, etc., excluding those having a sequence completely complementary to the rRNA sequence, can also be used as an NSR primer.
By using such NSR primers, mRNA etc. can be analyzed with higher sensitivity.
ＮＳＲプライマーの詳細については、１） Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｉｎｇ ｆｏｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｖｏｌ． ６， Ｎｏ． ９， ２００９， ｐｐ． ６４７－６４９、２） Ｏｚｓｏｌａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｔｔｏｍｏｌｅ－ｌｅｖｅｌＲＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ２０， ２０１０， ｐｐ． ５１９－５２５、３） 米国特許出願公開公報２０１０／００２９５１１（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
プライマーの長さは、アニーリングの観点から、例えば５塩基以上、好ましくは６塩基以上であり、合成の観点から、例えば３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、より好ましくは２０塩基以下である。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中における、プライマーの濃度は、特に制限されないが、例えば１～１０μＭ、好ましくは２～６μＭ、より好ましくは３～５μＭである。
For details on NSR primers, see 1) Amour et al. , Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis, Nature Methods, Vol. 6, No. 9, 2009, pp. 647-649, 2) Ozsolak et al. , Digital transcriptome profiling from attomole-level RNA samples, Genome Research, Vol. 20, 2010, pp. 519-525, 3) and the like in US Patent Application Publication No. 2010/0029511 (which is incorporated herein in its entirety by reference).
The length of the primer is, for example, 5 bases or more, preferably 6 bases or more from the standpoint of annealing, and is, for example, 30 bases or less, preferably 25 bases or less, more preferably 20 bases or less from the synthesis standpoint.
The concentration of the primer in the RT-RamDA reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 1 to 10 μM, preferably 2 to 6 μM, and more preferably 3 to 5 μM.
・デオキシリボヌクレオチド（基質）
デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが好ましい。デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートとしては、例えば、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）、これらの誘導体、これら２種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物等が好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれるデオキシリボヌクレオチド（基質）の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、０．１～５ｍＭとすることができる。
・Deoxyribonucleotide (substrate)
As the deoxyribonucleotide, deoxyribonucleoside triphosphate is preferred. Examples of deoxyribonucleotide triphosphates include deoxycytidine triphosphate (dCTP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxythymidine triphosphate (dTTP), deoxyuridine triphosphate (dUTP), and the like. and combinations of two or more of these derivatives. Among these, a mixture of dCTP, dGTP, dATP, and dTTP, a mixture of dCTP, dGTP, dATP, and dUTP, a mixture of dCTP, dGTP, dATP, dTTP, and dUTP, and the like are preferred. The amount of deoxyribonucleotide (substrate) contained in the RT-RamDA reaction solution is not particularly limited as long as it achieves the effects of the present invention, but it can perform the RT-RamDA reaction more reliably and produce stable and highly reproducible results. From the viewpoint of being easy to obtain, the concentration can be preferably set to 0.1 to 5 mM.
・ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に用いるＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素は、逆転写活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）を有する任意のタンパク質（酵素）であって、ＲＮａｓｅＨ活性を有さないものをいう。ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の例としては、例えば、トリ骨髄芽球ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）、ヒト免疫ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＨＩＶ－ＲＴ）、ＥＩＲＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、Ｃ．ヒドロゲノホルマンス（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｇｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）Ｉ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ、これらの変異体、及びこれらの誘導体が挙げられる。これらのうち、ＭＭＬＶ－ＲＴが好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に含まれるＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、０．２～２Ｕ／μｌとすることができる。
・RNase H-minus reverse transcriptase RT-RNase H-minus reverse transcriptase used in the RamDA reaction is any protein (enzyme) that has reverse transcription activity (RNA-dependent DNA polymerase activity) and has RNase H activity. refers to something that does not. Examples of RNase H-minus reverse transcriptase include Avian Myeloblastosis Virus reverse transcriptase (AMV-RT), Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (MMLV-RT), and Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (MMLV-RT). ), Human Immunovirus reverse transcriptase (HIV-RT), EIRV-RT, RAV2-RT, C. C. hydrogenoformans DNA polymerase, rTth DNA polymerase, SuperScript I, SuperScript II, variants thereof, and derivatives thereof. Among these, MMLV-RT is preferred. The amount of RNase H-minus reverse transcriptase contained in the RT-RamDA reaction solution is not particularly limited as long as it achieves the effects of the present invention; From the viewpoint of easily obtaining high results, it is preferably 0.2 to 2 U/μl.
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、最初からＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素を含む試薬として提供されてもよいし、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行う前にＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に添加するように用時調製可能なものであってもよい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に用時調製で添加する場合に用いられるＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素は、そのままの状態若しくは凍結乾燥させた状態のものであってもよいし、又は、水（好ましくは、ヌクレアーゼフリー水）で希釈した状態のものであってもよい。例えば、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中のＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写産物の終濃度が上記範囲内となるように、例えば、１／２０～１／３０になるように希釈して用いられるものとすることができる。 The RT-RamDA reaction solution of the present invention may be provided as a reagent containing RNase H-minus reverse transcriptase from the beginning, or it may be provided as a reagent containing RNase H-minus reverse transcriptase, or it may be added to the RT-RamDA reaction solution before the RT-RamDA reaction. It may be one that can be prepared. The RNase H-minus reverse transcriptase used when added to the RT-RamDA reaction solution as prepared before use may be in its original state or in a lyophilized state, or may be added in water (preferably, It may be diluted with nuclease-free water). For example, it should be diluted to 1/20 to 1/30 so that the final concentration of the RNase H minus reverse transcription product in the RT-RamDA reaction solution is within the above range. I can do it.
・無機塩
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、更に無機塩を含むことが好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中で更に無機塩を共存させることにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応をより一層効率的に行うことが可能となる。本発明に用いられ得る無機塩の種類は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、カリウム塩、マンガン塩、及び／又はマグネシウム塩を挙げることができ、好ましくはカリウム塩を挙げることができる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液に無機塩を共存させる場合、その反応液中終濃度は特に限定されないが、一例として、２０～１００ｍＭとすることができる。
- Inorganic salt The RT-RamDA reaction solution of the present invention preferably further contains an inorganic salt. By further coexisting an inorganic salt in the RT-RamDA reaction solution, it becomes possible to carry out the RT-RamDA reaction even more efficiently. The type of inorganic salt that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it achieves the effects of the present invention, but examples thereof include potassium salts, manganese salts, and/or magnesium salts, and preferably potassium salts. I can do it. When an inorganic salt is present in the RT-RamDA reaction solution, the final concentration in the reaction solution is not particularly limited, but can be, for example, 20 to 100 mM.
・ＤＮＡポリメラーゼ
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、ＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよいし、含まなくてもよい。本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液がＤＮＡポリメラーゼを含む場合、任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、例えば、下記のようなＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない：Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ（商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、これらの変異体
- DNA polymerase The RT-RamDA reaction solution of the present invention may or may not contain DNA polymerase. When the RT-RamDA reaction solution of the present invention contains a DNA polymerase, any DNA polymerase can be used, including, but not limited to, the following DNA polymerases: Taq, Tbr, Tfl, Tru, Tth, Tli, Tac, Tne, Tma, Tih, Tfi, Pfu, Pwo, Kod, Bst, Sac, Sso, Poc, Pab, Mth, Pho, ES4, VENT (trademark), DEEPVENT (trademark), these Mutant
・ＲＮａｓｅ阻害剤
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、ＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいてもよい。ＲＮａｓｅ阻害剤は、特に制限されず、例えば、ヒト胎盤由来、ラット肺由来、又はブタ肝臓由来のタンパク質が挙げられる。
-RNase inhibitor The RT-RamDA reaction solution of the present invention may contain an RNase inhibitor. The RNase inhibitor is not particularly limited, and examples include proteins derived from human placenta, rat lung, or pig liver.
・添加剤
本発明のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液は、他の添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、緩衝剤、塩、これら２種以上の組合せが挙げられる。
緩衝剤としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビス－トリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、モプス（Ｍｏｐｓ）、テス（Ｔｅｓ）、タプス（Ｔａｐｓ）、ピペス（Ｐｉｐｅｓ）、ギャプス（Ｃａｐｓ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。緩衝剤は、通常、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）に溶解され、水溶液の形態で使用される。
塩としては、例えば、塩化物（例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン）、酢酸塩（例えば、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン）、硫酸塩（例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン）、これら２種以上の組合せが挙げられる。
- Additives The RT-RamDA reaction solution of the present invention may further contain other additives. Examples of additives include buffers, salts, and combinations of two or more of these.
Examples of the buffer include Tris, Tricine, Bis-Tricine, Hepes, Mops, Tes, Taps, Pipes. , Caps, and a combination of two or more of these. Buffers are usually dissolved in water (preferably nuclease-free water) and used in the form of an aqueous solution.
Examples of salts include chlorides (e.g., lithium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, manganese chloride), acetates (e.g., lithium acetate, sodium acetate, potassium acetate, magnesium acetate, manganese acetate), sulfates. (For example, potassium sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate), and combinations of two or more of these.
・インキュベーション
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応は、解析対象とする鋳型ＲＮＡと共に、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質、並びに、必要に応じて一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、他の任意の成分を含むＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液を、所定条件下でインキュベーションすることにより核酸増幅反応させる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応におけるインキュベーションは、等温条件で行ってもよいし、熱サイクル条件で行ってもよい。その後、必要に応じて逆転写酵素を失活してもよい。逆転写の失活方法は、特に限定されるわけではないが、例えば、９０～１００℃で所定時間（例えば１～１０分）インキュベーションする方法であってもよい。
・Incubation RT-RamDA reaction consists of template RNA to be analyzed, primers, DNA strand-specific RNA:DNA hybrid strand degrading enzyme, RNase H-minus reverse transcriptase, substrate, and single-stranded as necessary. A nucleic acid amplification reaction is performed by incubating an RT-RamDA reaction solution containing a DNA binding protein and other optional components under predetermined conditions. Incubation in the RT-RamDA reaction may be performed under isothermal conditions or under thermocycling conditions. Thereafter, the reverse transcriptase may be inactivated if necessary. The method for inactivating reverse transcription is not particularly limited, but may be, for example, a method of incubation at 90 to 100°C for a predetermined time (eg, 1 to 10 minutes).
（１）等温条件
インキュベーションを等温条件で行う場合、例えば２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度、好ましくは３０～４５℃の間の所定の温度、より好ましくは３５～４０℃の間の所定の温度、例えば３７℃で所定の時間（例えば５～１８０分、好ましくは１０～１５０分）行うことができる。
２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは、２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～６０分）インキュベーションしてもよい。
２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションの後、例えば５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でインキュベーションしてもよい。５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で５～１５分インキュベーションしてもよい。
(1) Isothermal conditions When incubation is carried out under isothermal conditions, for example, a predetermined temperature between 25°C and lower than 50°C, preferably a predetermined temperature between 30 and 45°C, more preferably between 35 and 40°C. It can be carried out at a predetermined temperature, for example 37° C., for a predetermined time (for example, 5 to 180 minutes, preferably 10 to 150 minutes).
Incubation at a predetermined temperature between 25° C. or higher and lower than 50° C. may be performed in two or more stages. For example, at a predetermined temperature between 25°C and above 30°C for 5 to 15 minutes, then at a predetermined temperature between 30°C and above and below 35°C for 5 to 15 minutes, then at a predetermined temperature between 35°C and above and below 50°C. Incubation may be performed at a certain temperature for a predetermined period of time (eg, 5 to 60 minutes).
After incubation at a predetermined temperature of 25°C or more and less than 50°C, for example, incubation may be performed at a predetermined temperature of 50°C or more and less than 100°C. Incubation at a predetermined temperature between 50° C. or higher and lower than 100° C. may be performed in two or more stages. For example, incubation may be performed at a predetermined temperature between 50° C. and lower than 80° C. for 5 to 15 minutes, and then at a predetermined temperature between 80 and 90° C. for 5 to 15 minutes.
（２）熱サイクル条件
インキュベーションを熱サイクル条件で行う場合、例えば２０℃以上３０℃未満の間の所定の温度Ｔ１（例えば２５℃）と３０～４５℃の間の所定の温度Ｔ２（例えば３７℃）とを組み合わせて、Ｔ１で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とＴ２で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とを１サイクルとして、これを好ましくは１０～４０サイクル、より好ましくは１５～３５サイクル繰り返して行ってもよい。なお、上記の熱サイクルに先立って、例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば１～５分）インキュベーションしてもよい。また、上記の熱サイクルの後、例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）インキュベーションしてもよい。
(2) Thermal cycling conditions When incubation is carried out under thermal cycling conditions, for example, a predetermined temperature T1 between 20°C and lower than 30°C (e.g. 25°C) and a predetermined temperature T2 between 30 and 45°C (e.g. 37°C) ), one cycle is preferably a predetermined time at T1 (for example, 1 to 3 minutes, 2 minutes as an example) and a predetermined time at T2 (for example, 1 to 3 minutes, 2 minutes as an example). may be repeated for 10 to 40 cycles, more preferably for 15 to 35 cycles. In addition, prior to the above thermal cycle, for example, at a predetermined temperature between 25°C and lower than 30°C for a predetermined time (for example, 5 to 15 minutes), and then at a predetermined temperature between 30°C and above and below 35°C for a predetermined time. (for example, 5 to 15 minutes), and then incubated at a predetermined temperature of 35° C. or more and less than 50° C. for a predetermined time (for example, 1 to 5 minutes). Further, after the above thermal cycle, for example, at a predetermined temperature between 50°C and lower than 80°C for a predetermined time (for example, 5 to 15 minutes), then at a predetermined temperature between 80 and 90°C for a predetermined time ( For example, 5 to 15 minutes).
本発明による核酸の増幅方法は、微量のＲＮＡ（例えば、１細胞から数百細胞相当の微量ＲＮＡ）を用いたＲＴ－ＰＣＲ法またはＲＴ－ｑＰＣＲ法の一部として使用することができる。
本発明による核酸の増幅方法は、微量のＲＮＡ（例えば、１細胞から数百細胞相当の微量ＲＮＡ）を用いたＲＮＡシーケンス法に利用することができる。
The nucleic acid amplification method according to the present invention can be used as part of an RT-PCR method or RT-qPCR method using a trace amount of RNA (for example, a trace amount of RNA equivalent to one cell to several hundred cells).
The nucleic acid amplification method according to the present invention can be used in RNA sequencing using a trace amount of RNA (for example, a trace amount of RNA equivalent to one cell to several hundred cells).
ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応終了後にＰＣＲ法又はｑＰＣＲ法を行う場合、そのＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中の成分（例えば、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素等の酵素類等）をそのまま含んでいてもよいし、それらの成分を失活させたものであってもよい。これらのＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液は、ＤＮＡ増幅反応を行うための成分（例えば、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼ等）を添加したものであってもよいし、またＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液がＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡ増幅反応に必要な成分を含んでいる場合には、そのＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液はそのままＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液となり得、両組成物は相互に互換可能に呼称され得る。
ＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液等のＤＮＡ増幅のために用いられるプライマーとしては、ＤＮＡ（ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを含む）に対して特異的なプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）が好ましい。
更に、ＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液等のＤＮＡ増幅用組成物は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤、金属イオン（マグネシウムイオンなど）、蛍光色素、蛍光標識したプローブ、これら２種以上の組合せを含んでいてもよい。
When PCR or qPCR is performed after the completion of the RT-RamDA reaction, the PCR reaction solution or qPCR reaction solution contains components in the RT-RamDA reaction solution (e.g., DNA strand-specific RNA: DNA hybrid strand degrading enzyme, RNase H Enzymes such as minus-type reverse transcriptase) may be contained as they are, or these components may be inactivated. These PCR reaction solutions or qPCR reaction solutions may contain components for performing a DNA amplification reaction (for example, primers, deoxyribonucleotides, DNA polymerase, etc.), or RT-RamDA reaction solutions may contain components for performing a DNA amplification reaction. If it contains components necessary for a DNA amplification reaction such as DNA polymerase, the RT-RamDA reaction solution can directly be used as a PCR reaction solution or a qPCR reaction solution, and both compositions can be referred to interchangeably.
Primers used for DNA amplification in PCR reaction solutions or qPCR reaction solutions are preferably primers (forward primers, reverse primers) specific for DNA (including DNA reverse transcribed from RNA).
Furthermore, a DNA amplification composition such as a PCR reaction solution or a qPCR reaction solution contains an anti-DNA polymerase antibody, a reaction buffer, a metal ion (such as magnesium ion), a fluorescent dye, a fluorescently labeled probe, or a combination of two or more of these. May contain.
ＰＣＲ反応又はｑＰＣＲ反応等でのＤＮＡ増幅を熱サイクル条件で行う場合、その熱サイクル条件下でのインキュベーションは、例えば８０℃以上１００℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば１０～３０秒）と５０～７０℃の間の所定の温度で所定の時間（例えば３０秒～２分）とを１サイクルとして、これを好ましくは１０～５０サイクル、より好ましくは１５～４０サイクル繰り返して行ってもよいが、これらに限定されない。 When DNA amplification in PCR reaction, qPCR reaction, etc. is carried out under thermocycling conditions, incubation under thermocycling conditions is carried out at a predetermined temperature of, for example, 80°C or higher and lower than 100°C for a predetermined period of time (for example, 10 to 30°C). 2 seconds) and a predetermined time (for example, 30 seconds to 2 minutes) at a predetermined temperature between 50 and 70°C as one cycle, and this is preferably repeated for 10 to 50 cycles, more preferably 15 to 40 cycles. may be used, but is not limited to these.
本発明はさらに、上記した本発明の方法に用いられ得る、非特異的な核酸増幅を抑制できるキットに関する。このような本発明のキットは、非特異的な核酸増幅が抑えられて安定して精度よくＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行うことができるＲＮＡ解析キット等として提供され得る。前記のような本発明のキットは、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中に鋳型ＲＮＡとカオトロピック剤とを共存させるように構成されている限り、特に限定されない。例えば、本発明のキットは、カオトロピック剤を含むＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液（例えば、カオトロピック剤を含むプレミックス型ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応用試薬）及び／又はカオトロピック剤を含む細胞溶解液（例えば、カオトロピック剤を含むプレミックス型細胞溶解試薬）を備えたキットであり得る。つまり、カオトロピック剤は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応用試薬及び細胞溶解試薬の一方又は両方に含むことができるが、好ましくは、鋳型ＲＮＡと混合後のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液中におけるカオトロピック剤の総量が、終濃度で０ｍＭより多く５０ｍＭ以下になるように調整された量であるのがよい。本発明のキットは、さらに所望により、核酸増幅反応を実施するのに必要な他の試薬、緩衝液など含むものでもよい。他の試薬としては、プライマー、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸などを挙げることができる。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液、及び、必要に応じて添付され得る細胞溶解液、他の試薬等は、１つの容器中に全てを含む態様で提供されてもよいし、別々の容器に各試薬を含む態様で提供されてもよい。 The present invention further relates to a kit capable of suppressing non-specific nucleic acid amplification, which can be used in the above-described method of the present invention. Such a kit of the present invention can be provided as an RNA analysis kit or the like that can suppress non-specific nucleic acid amplification and perform RT-RamDA reactions stably and accurately. The kit of the present invention as described above is not particularly limited as long as it is configured so that the template RNA and the chaotropic agent coexist in the RT-RamDA reaction solution. For example, the kit of the present invention may include an RT-RamDA reaction solution containing a chaotropic agent (e.g., a premix RT-RamDA reaction reagent containing a chaotropic agent) and/or a cell lysate containing a chaotropic agent (e.g., a chaotropic agent-containing reagent for a premixed RT-RamDA reaction). The kit may include a premixed cell lysis reagent (including a premixed cell lysis reagent). That is, the chaotropic agent can be included in one or both of the RT-RamDA reaction reagent and the cell lysis reagent, but preferably the total amount of the chaotropic agent in the RT-RamDA reaction solution after mixing with the template RNA is It is preferable that the amount is adjusted so that the concentration is more than 0mM and less than 50mM. The kit of the present invention may further contain other reagents, buffers, etc. necessary for carrying out the nucleic acid amplification reaction, if desired. Other reagents can include primers, deoxyribonucleotide triphosphates, and the like. The RT-RamDA reaction solution, the cell lysis solution, other reagents, etc. that may be attached as necessary may be provided in a manner in which they are all contained in one container, or each reagent may be contained in a separate container. It may be provided in any form.
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be explained in more detail based on Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
実施例１：ＲＴ－ＲａｍＤＡ法におけるグアニジンチオシアネート（グアニジニンチオシアン酸塩）による非特異的な核酸増幅抑制（精製ＲＮＡ ５ｐｇ～１０ｎｇ）
本実施例では、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法におけるカオトロピック剤による非特異的核酸増幅への影響を確認する目的で、以下の試験を行った。
サンプル溶液（ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）に、グアニジンチオシアネートを添加し、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応により１本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。その後、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）にて、グアニジンチオシアネートの有無による増幅曲線の比較を行った。具体的には、以下の手法により行った。
本実施例で用いる核酸断片サンプルは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ５ｐｇ～１０ｎｇを用いた。
このＲＮＡ５ｐｇ～１０ｎｇをＲＴ－ＲａｍＤＡ法で逆転写反応するために、本実施例で使用したサンプル溶液（ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）に含まれる成分とそのサンプル溶液中の終濃度を以下の表１に示す。
In this example, the following test was conducted for the purpose of confirming the influence of a chaotropic agent on non-specific nucleic acid amplification in the RT-RamDA method.
Guanidine thiocyanate was added to the sample solution (RT-RamDA reaction solution), and single-stranded cDNA was synthesized by RT-RamDA reaction. Thereafter, amplification curves with and without guanidine thiocyanate were compared using quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Specifically, the following method was used.
The nucleic acid fragment sample used in this example was 5 pg to 10 ng of RNA purified from NIH3T3 cells using an RNeasy Mini Kit (Qiagen).
In order to reverse-transcribe 5 pg to 10 ng of this RNA using the RT-RamDA method, the components contained in the sample solution (RT-RamDA reaction solution) used in this example and their final concentrations in the sample solution are shown in Table 1 below. show.
精製ＲＮＡを上記組成に添加したサンプル溶液（ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）１０μｌを用いて、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法を行った。この方法では２５℃１０分、３０℃１０分、３７℃３０分、５０℃５分、及び９５℃５分の各等温条件下で反応を行った。
その後、以下の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）にてＤＮＡ量の比較を行った。
具体的には、前述のサンプル溶液（ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）中でＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った後、ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）で５倍希釈し、希釈したサンプル溶液 ２μｌをｑＰＣＲ反応に用いた。このＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後のｑＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、以下の条件で行った。
ｑＰＣＲ反応用溶液［２０μｌ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標） ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ社）、６ｐｍｏｌ フォワードプライマー、６ｐｍｏｌ リバースプライマー、２μｌ ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液、ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ］を９５℃１分処理して酵素を活性化したのち、９５℃１５秒の変性及び６０℃１分の伸長反応を４０サイクル行った。
The RT-RamDA method was performed using 10 μl of a sample solution (RT-RamDA reaction solution) in which purified RNA was added to the above composition. In this method, the reaction was carried out under isothermal conditions of 25°C for 10 minutes, 30°C for 10 minutes, 37°C for 30 minutes, 50°C for 5 minutes, and 95°C for 5 minutes.
Thereafter, the amount of DNA was compared using the following quantitative polymerase chain reaction (qPCR).
Specifically, after performing the RT-RamDA reaction in the sample solution (RT-RamDA reaction solution) described above, it was diluted 5 times with nuclease free water (Qiagen), and 2 μl of the diluted sample solution was used for the qPCR reaction. there was. qPCR after this RT-RamDA reaction was performed using StepOne Plus (Life Technologies) under the following conditions.
qPCR reaction solution [20 μl (THUNDERBIRD (trademark) SYBR qPCR Mix (TOYOBO), 6 pmol forward primer, 6 pmol reverse primer, 2 μl RT-RamDA reaction solution, nuclease free water] was treated at 95°C for 1 minute to activate the enzyme. Thereafter, 40 cycles of denaturation at 95°C for 15 seconds and extension reaction at 60°C for 1 minute were performed.
融解曲線分析は、９５℃１５秒、６０℃１５秒、及び９５℃１５秒で行った。
標的遺伝子としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるβａｃｔｉｎを使用した。
Melting curve analysis was performed at 95°C for 15 seconds, 60°C for 15 seconds, and 95°C for 15 seconds.
βactin, which is a messenger RNA (mRNA), was used as a target gene.
各遺伝子のプライマーは、以下のとおりである。
βａｃｔｉｎ（ｍＲＮＡ）
フォワードプライマー：ＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧ（配列番号１）
リバースプライマー：ＣＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＣ（配列番号２）
The primers for each gene are as follows.
βactin (mRNA)
Forward primer: CAGCTGAGAGGGAAATCGTG (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer: CGTTGCCAATAGTGATGACC (SEQ ID NO: 2)
その結果を表２及び図１に示す。
上記表１及び図１の結果に示されるように、グアニジンチオシアネートを添加していない条件１ではＣｔ値として算出できない増幅曲線が発生しており、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応において非特異的な核酸増幅増が発生しており、定量的な測定ができていない。一方でグアニジンチオシアネートを添加した条件２～４では安定した増幅曲線が得られている。ＰＣＲ効率においても条件１に比べ条件２～４のＰＣＲ効率が１００％に近く、非特異的な増幅産物が抑制されていると考えられる。このことからグアニジンチオシアネートにより、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における非特異的な増幅が抑制されることが明らかとなった。また、この結果から、鋳型ＲＮＡの量が比較的多い場合（例えば、鋳型ＲＮＡ量が１００ｐｇ～１０ｎｇとなる場合）は、グアニジンチオシアネートの量が少ないとき（例えば、１５ｍＭ以下、又は１０ｍＭ以下のとき）の方が、Ｃｔ値が低くなり、良好な結果を示すことが確認された。 As shown in the results in Table 1 and Figure 1 above, under Condition 1 without the addition of guanidine thiocyanate, an amplification curve that could not be calculated as a Ct value was generated, and nonspecific increase in nucleic acid amplification occurred in the RT-RamDA reaction. has occurred and cannot be quantitatively measured. On the other hand, stable amplification curves were obtained under conditions 2 to 4 in which guanidine thiocyanate was added. Regarding the PCR efficiency, the PCR efficiency under Conditions 2 to 4 was close to 100% compared to Condition 1, and it is considered that non-specific amplification products were suppressed. This revealed that guanidine thiocyanate suppresses nonspecific amplification in the RT-RamDA reaction. Also, from this result, when the amount of template RNA is relatively large (for example, when the amount of template RNA is 100 pg to 10 ng), when the amount of guanidine thiocyanate is small (for example, when the amount is 15 mM or less, or 10 mM or less) It was confirmed that the Ct value was lower and better results were obtained.
なお、上記開示した実施形態および実施例はすべて例示であり制限的なものではない。また、実施形態および実施例に開示された内容を組み合わせた実施形態及び実施例も本発明の範囲に含まれる。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲によって有効であり、特許請求の範囲の記載と均等の意味および範囲内のすべての変更・修正・置き換え等を含むものである。 Note that the embodiments and examples disclosed above are all illustrative and not restrictive. Furthermore, embodiments and examples that combine the contents disclosed in the embodiments and examples are also included within the scope of the present invention. The technical scope of the present invention is valid according to the scope of the claims, and includes all changes, modifications, substitutions, etc. that are equivalent to and within the scope of the claims.
本発明は、微量なＲＮＡからの低発現遺伝子の検出や検出遺伝子数の拡充を可能にするＲＴ－ＲａｍＤＡ方法において、非特異的な核酸増幅を効果的に抑制できので、より一層高精度で安定したＲＮＡ解析が可能となる。 The present invention effectively suppresses non-specific nucleic acid amplification in the RT-RamDA method, which enables detection of low-expression genes from minute amounts of RNA and expansion of the number of detected genes, resulting in higher accuracy and stability. RNA analysis becomes possible.
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