JP2024019894A - Pharmaceutical composition for treatment of galectin-4 positive gastric cancer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物に関する。 The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating galectin-4-positive gastric cancer.
日本において、胃がんは年間罹患数が約１３万人、そして年間死亡者数が約５万人であり、癌の中で第３位と頻度が高い。特に、転移や再発をきたし切除することができない場合は、非常に予後が悪い癌である。胃がんの予後に大きく関わる転移として、腹膜播種、リンパ節転移、血行性転移という３つの経路が存在する。現在、転移を有する胃がんは癌診療ガイドライン上でも「ステージＩＶ胃がん」として扱われている。例えば腹膜播種を起こす胃がんにおいて、ガレクチン－４との関連が報告されている（非特許文献１～３）。しかしながら、それぞれの転移経路に特異的な診断マーカーや分子標的治療薬は存在しない。従って、化学療法と外科的な癌組織切除とを組み合わせた治療が行われている。転移が無い限局性の癌では５年生存率が９５％あるが、活発に転移し全身に拡散する遠隔転移性の胃がんでは５年生存率は３％と言われている。 In Japan, stomach cancer has an annual incidence of about 130,000 people and an annual death rate of about 50,000 people, ranking third among cancers. In particular, cancer that has metastasized or recurred and cannot be removed is a cancer with a very poor prognosis. There are three routes of metastasis that greatly affect the prognosis of gastric cancer: peritoneal dissemination, lymph node metastasis, and hematogenous metastasis. Currently, gastric cancer that has metastasized is treated as "Stage IV gastric cancer" in cancer treatment guidelines. For example, a relationship with galectin-4 has been reported in gastric cancer that causes peritoneal dissemination (Non-patent Documents 1 to 3). However, there are no diagnostic markers or molecular target therapeutics specific to each metastatic pathway. Therefore, treatment that combines chemotherapy and surgical removal of cancerous tissue is being performed. Localized cancer that has not metastasized has a 5-year survival rate of 95%, but distant metastatic gastric cancer that has actively metastasized and spread throughout the body is said to have a 5-year survival rate of 3%.
本発明の目的は、胃がんに有効な治療薬を提供することである。 An object of the present invention is to provide an effective therapeutic agent for gastric cancer.
本発明者は、胃がんに有効な治療薬について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ガレクチン－４の阻害剤によって、胃がんを効率的に治療できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ガレクチン－４阻害剤を有効成分として含む、ガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物、
［２］前記ガレクチン－４阻害剤が、遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸である、［１］に記載の胃がん治療用医薬組成物、及び
［３］前記胃がんが、腹膜播種能を有する胃がんである、［１］又は［２］に記載の胃がん治療用医薬組成物、
に関する。
As a result of intensive research into therapeutic agents effective for gastric cancer, the present inventor surprisingly discovered that gastric cancer can be efficiently treated with a galectin-4 inhibitor.
The present invention is based on these findings.
Therefore, the present invention
[1] A galectin-4-positive pharmaceutical composition for treating gastric cancer containing a galectin-4 inhibitor as an active ingredient,
[2] The pharmaceutical composition for gastric cancer treatment according to [1], wherein the galectin-4 inhibitor is a double-stranded nucleic acid that has an RNAi effect on genes, and [3] the gastric cancer has peritoneal dissemination ability. The pharmaceutical composition for gastric cancer treatment according to [1] or [2], which is gastric cancer having
Regarding.
本発明の医薬組成物によれば、ガレクチン－４陽性胃がんを効率的に治療することができる。 According to the pharmaceutical composition of the present invention, galectin-4-positive gastric cancer can be efficiently treated.
《医薬組成物》
本発明のガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物は、ガレクチン－４阻害剤を有効成分として含む。ガレクチン－４阻害剤としては、特に限定されるものではないが、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分が挙げられる。
《Pharmaceutical composition》
The galectin-4-positive pharmaceutical composition for gastric cancer treatment of the present invention contains a galectin-4 inhibitor as an active ingredient. Galectin-4 inhibitors include, but are not particularly limited to, components that suppress the function of galectin-4 protein or components that suppress the function of galectin-4 gene.
（ガレクチン－４）
ガレクチンは、β－ガラクトシドを認識するレクチンであり、１５種類のガレクチンファミリーが知られている。ガレクチン－４は、２つの糖結合領域を有するタンデムリピート型のガレクチンである。ガレクチン－４は、小腸及び大腸で強く発現していることが報告されているが、大腸がんにおいて、ガレクチン－４の発現が低下することが報告されている。
(Galectin-4)
Galectin is a lectin that recognizes β-galactoside, and 15 types of galectin families are known. Galectin-4 is a tandem repeat type galectin that has two sugar-binding regions. It has been reported that galectin-4 is strongly expressed in the small intestine and large intestine, but it has been reported that the expression of galectin-4 is decreased in colon cancer.
本発明の医薬組成物の対象となる胃がんは、ガレクチン－４陽性の胃がんである。ガレクチン－４が陽性であることによって、ガレクチン－４阻害剤によって、癌細胞の増殖を抑制することができる。ガレクチン－４陽性の胃がん細胞は、胃に限局した胃がん細胞、リンパ節転移を示す胃がん細胞、又は血行性転移を示す胃がん細胞、が挙げられる。限定されるものではないが、ガレクチン－４陽性の胃がんとしては、腹膜播種能を有する胃がんが多い。 Gastric cancer targeted by the pharmaceutical composition of the present invention is galectin-4 positive gastric cancer. By being positive for galectin-4, the proliferation of cancer cells can be suppressed by a galectin-4 inhibitor. Examples of galectin-4-positive gastric cancer cells include gastric cancer cells localized to the stomach, gastric cancer cells showing lymph node metastasis, and gastric cancer cells showing hematogenous metastasis. Although not limited to, most galectin-4-positive gastric cancers are gastric cancers that have the ability to disseminate into the peritoneum.
（ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分）
ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分としては、例えばガレクチン－４タンパク質と結合して、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分が挙げられる。このような成分としては、限定されるものではないが、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸が挙げられる。
(component that suppresses the function of galectin-4 protein)
Examples of the component that suppresses the function of galectin-4 protein include a component that binds to galectin-4 protein and suppresses the function of galectin-4 protein. Such ingredients include, but are not limited to, dextran sulfate, heparin, sulfated glycolipids, or cholesterol sulfate.
（ガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分）
ガレクチン－４遺伝子（配列番号１）の機能を抑制する成分としては、限定されるものではないが、ガレクチン－４遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する阻害性核酸としてｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ－ＲＮＡ、および人工ｍｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡが挙げられる。
前記二本鎖核酸は、ガレクチン－４遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸であり、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖核酸領域を含む核酸分子を意味し、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）であることが好ましい。
(component that suppresses galectin-4 gene function)
Components that suppress the function of the galectin-4 gene (SEQ ID NO: 1) include, but are not limited to, inhibitory nucleic acids that have an RNAi effect on the galectin-4 gene such as dsRNA, siRNA, shRNA, and mi-RNA. , and interfering RNAs such as artificial miRNAs.
The double-stranded nucleic acid is a double-stranded nucleic acid that has an RNAi effect on the galectin-4 gene, and is a nucleic acid molecule containing a double-stranded nucleic acid region formed by hybridizing a desired sense strand and an antisense strand. It is preferably siRNA (small interfering RNA).
（センス鎖及びアンチセンス鎖）
前記二本鎖核酸は、２３塩基からなる配列番号１のいずれかの標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含む。
ここで、「標的配列に対応する塩基配列」とは、標的配列と同一の塩基配列であるか、あるいは、前記標的配列において１若しくは数個（例えば、２～３個）の塩基が置換された塩基配列を意味する。二本鎖核酸がｓｉＲＮＡである場合、１～数塩基のミスマッチを含んでいても、ＲＮＡｉ効果が得られることが知られている。本発明では、標的配列と同一の塩基配列だけでなく、ＲＮＡｉ効果が得られる限り、ミスマッチを含む塩基配列であってもよい。
(sense strand and antisense strand)
The double-stranded nucleic acid includes a sense strand containing a base sequence corresponding to any target sequence of SEQ ID NO: 1 consisting of 23 bases, and an antisense strand containing a base sequence complementary to the sense strand.
Here, the "base sequence corresponding to the target sequence" is the same base sequence as the target sequence, or one or several (for example, 2 to 3) bases have been substituted in the target sequence. means a base sequence. It is known that when the double-stranded nucleic acid is siRNA, an RNAi effect can be obtained even if it contains one to several base mismatches. In the present invention, not only a base sequence that is the same as the target sequence but also a base sequence containing a mismatch may be used as long as an RNAi effect can be obtained.
また、アンチセンス鎖における「センス鎖に相補的な塩基配列」とは、センス鎖とハイブリダイズすることができる程度に相補的な塩基配列であればよく、センス鎖に完全に相補的な塩基配列であるか、あるいは、前記センス鎖に完全に相補的な塩基配列において１若しくは数個（例えば、２～３個）の塩基が置換された塩基配列であることができる。 In addition, the "nucleotide sequence complementary to the sense strand" in the antisense strand may be any nucleotide sequence that is complementary to the extent that it can hybridize with the sense strand, and is a nucleotide sequence that is completely complementary to the sense strand. Alternatively, it may be a base sequence in which one or several (for example, 2 to 3) bases are substituted in a base sequence that is completely complementary to the sense strand.
（核酸の種類と修飾）
二本鎖核酸を構成する核酸の種類は、特に限定されるものではなく、適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ型二本鎖核酸を挙げることができる。キメラ型はＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡの一部をＤＮＡに換えたものであり、血清中での安定性が高く、免疫応答誘導性が低いことが知られている。
また、二本鎖核酸は、例えば、２’－ＯＨ基の修飾、バックボーンのホスホロチオエートによる置換やボラノホスフェート基による修飾、リボースの２位と４位が架橋されたＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の導入などによって、ヌクレアーゼに対する耐性や安定化を高めることもできる。あるいは、細胞への導入効率を高める等の目的から、二本鎖核酸のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、例えば、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。
(Nucleic acid types and modifications)
The type of nucleic acid constituting the double-stranded nucleic acid is not particularly limited and can be selected as appropriate, and includes, for example, double-stranded RNA and DNA-RNA chimera type double-stranded nucleic acid. The chimeric type is a double-stranded RNA that has an RNAi effect, with part of it replaced with DNA, and is known to have high stability in serum and low immune response induction.
In addition, double-stranded nucleic acids can be produced by, for example, modification of the 2'-OH group, substitution of the backbone with phosphorothioate, modification with boranophosphate group, introduction of LNA (locked nucleic acid) in which the 2- and 4-positions of ribose are cross-linked. It is also possible to increase resistance to nucleases and stability. Alternatively, for the purpose of increasing the efficiency of introduction into cells, the 5' or 3' end of the sense strand of the double-stranded nucleic acid can be modified with nanoparticles, cholesterol, cell membrane-transmitting peptides, etc. .
（ｓｉＲＮＡ）
二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（キメラ型を含む）であることが好ましい。ここで、「ｓｉＲＮＡ」とは、１８塩基長～２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖）と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
前記ｓｉＲＮＡは、先述したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、かつ所望のＲＮＡｉ効果を示すものであれば、その末端構造に特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、前記ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。中でも、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端が２塩基～６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。
(siRNA)
The double-stranded RNA is preferably siRNA (including chimeric type). Here, "siRNA" is a small double-stranded RNA with a length of 18 to 29 bases, which cleaves the mRNA of a target gene that has a complementary sequence to the antisense strand (guide strand) of the siRNA. , has the function of suppressing the expression of target genes.
The terminal structure of the siRNA is not particularly limited as long as it contains the sense strand and antisense strand as described above and exhibits the desired RNAi effect, and can be appropriately selected. For example, the siRNA may be , may have blunt ends, or may have protruding ends (overhangs). Among these, the siRNA preferably has a structure in which the 3' end of each strand protrudes by 2 to 6 bases, and more preferably has a structure in which the 3' end of each strand protrudes by 2 bases.
本発明のｓｉＲＮＡとしては、例えば、配列番号１を標的配列とする配列番号３（5’-CCGGACAUUGCCAUCAACAGCUGAA-3’）のセンス鎖と配列番号４（5’-UUCAGCUGUUGAUGGCAAUGUCCGG-3’）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡを挙げることができる。 The siRNA of the present invention includes, for example, the sense strand of SEQ ID NO: 3 (5'-CCGGACAUUGCCAUCAACAGCUGAA-3') whose target sequence is SEQ ID NO: 1, and the antisense strand of SEQ ID NO: 4 (5'-UUCAGCUGUUGAUGGCAAUGUCCGG-3'). Examples include siRNA consisting of
（製造方法）
前記二本鎖ＲＮＡ（特にはｓｉＲＮＡ）は、従来公知の手法に基づき作製することができる。
例えば、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する１８塩基長～２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、それぞれ既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。
(Production method)
The double-stranded RNA (particularly siRNA) can be produced based on conventionally known techniques.
For example, single-stranded RNAs of 18 to 29 bases in length corresponding to the desired sense strand and antisense strand are chemically synthesized using existing automatic DNA/RNA synthesizers, respectively, and It can be produced by annealing. Furthermore, siRNA can also be produced by utilizing intracellular reactions by constructing a desired siRNA expression vector, such as the vector of the present invention described below, and introducing the expression vector into cells.
（ＤＮＡ、発現ベクター）
ＤＮＡは、先述した、前記二本鎖核酸（特にはｓｉＲＮＡ）をコードする塩基配列を含むことを特徴とするＤＮＡであり、発現ベクターは、前記ＤＮＡを含むことを特徴とする発現ベクターである。
(DNA, expression vector)
The DNA is a DNA characterized by containing the aforementioned double-stranded nucleic acid (particularly siRNA) encoding base sequence, and the expression vector is an expression vector characterized by containing the aforementioned DNA.
（ＤＮＡ）
前記ＤＮＡとしては、先述した、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列を含むＤＮＡであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列の上流（５’側）に、前記二本鎖核酸の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター等のｐｏｌ ＩＩ系プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター等のｐｏｌ ＩＩＩ系プロモーターなどが挙げられる。
(DNA)
The DNA is not particularly limited as long as it includes the base sequence encoding the double-stranded nucleic acid mentioned above, and can be appropriately selected depending on the purpose; It is preferable that a promoter sequence for controlling transcription of the double-stranded nucleic acid is linked upstream (5' side) of the sequence. The promoter sequence is not particularly limited and can be selected as appropriate, and includes, for example, pol II promoters such as CMV promoter, pol III promoters such as H1 promoter, and U6 promoter.
また、更に、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列の下流（３’側）に、前記二本鎖核酸の転写を終結させるためのターミネーター配列が連結されていることがより好ましい。前記ターミネーター配列としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 Furthermore, it is more preferable that a terminator sequence for terminating the transcription of the double-stranded nucleic acid is linked downstream (3' side) of the base sequence encoding the double-stranded nucleic acid. The terminator arrangement is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
前記プロモーター配列、前記二本鎖核酸をコードするヌクレオチド配列、及び前記ターミネーター配列を含む転写ユニットは、前記ＤＮＡにおける好ましい一態様である。なお、前記転写ユニットは、従来公知の手法を用いて構築することができる。 A transcription unit including the promoter sequence, the nucleotide sequence encoding the double-stranded nucleic acid, and the terminator sequence is a preferred embodiment of the DNA. Note that the transfer unit can be constructed using a conventionally known method.
（発現ベクター）
前記ベクターとしては、前記ＤＮＡを含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。前記ベクターは、前記二本鎖核酸（特にｓｉＲＮＡ）を発現可能な発現ベクターであることが好ましい。
前記二本鎖核酸の発現様式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば二本鎖核酸としてｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法（タンデム型）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）として一本鎖ＲＮＡを発現させる方法（ヘアピン型）等が挙げられる。ここで、ｓｈＲＮＡとは、１８塩基～２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３塩基～９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであるが、ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
(expression vector)
The vector is not particularly limited as long as it contains the DNA, and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include plasmid vectors, virus vectors, and the like. The vector is preferably an expression vector capable of expressing the double-stranded nucleic acid (particularly siRNA).
The expression mode of the double-stranded nucleic acid is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, as a method for expressing siRNA as a double-stranded nucleic acid, two short single-stranded RNAs are expressed. Examples include a method (tandem type), a method of expressing single-stranded RNA as shRNA (short hairpin RNA) (hairpin type), and the like. Here, shRNA is a single-stranded RNA that includes a dsRNA region of about 18 to 29 bases and a loop region of about 3 to 9 bases. to form a hairpin-shaped double-stranded RNA. Thereafter, the shRNA is cleaved by Dicer (RNase III enzyme) to become siRNA, which can function to suppress the expression of the target gene.
前記タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを含み、かつ、各鎖をコードするＤＮＡ配列の上流（５’側）にプロモーター配列がそれぞれ連結され、また、各鎖をコードするＤＮＡ配列の下流（３’側）にターミネーター配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含む。 The tandem siRNA expression vector includes a DNA sequence encoding a sense strand and a DNA sequence encoding an antisense strand constituting the siRNA, and upstream (5' side) of the DNA sequence encoding each strand. A promoter sequence is linked to each chain, and a terminator sequence is linked to the downstream (3' side) of the DNA sequence encoding each chain.
また、前記ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とが逆向きに配置され、前記センス鎖ＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＤＮＡ配列とがループ配列を介して接続されており、かつ、それらの上流（５’側）にプロモーター配列が、また、下流（３’側）にターミネーター配列が連結されたＤＮＡを含む。
前記各ベクターは、従来公知の手法を用いて構築することができ、例えば、前記ＤＮＡを、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結（ライゲーション）することにより構築することができる。
Further, in the hairpin-type siRNA expression vector, the DNA sequence encoding the sense strand and the DNA sequence encoding the antisense strand constituting the siRNA are arranged in opposite directions, and the sense strand DNA sequence and the antisense strand DNA are arranged in opposite directions. sequences are connected via a loop sequence, and a promoter sequence is connected upstream (5' side) of these sequences, and a terminator sequence is connected downstream (3' side) thereof.
Each of the vectors can be constructed using a conventionally known method, for example, by ligating the DNA to a cleavage site of a vector that has been previously cleaved with a restriction enzyme.
前記ＤＮＡ又は前記ベクターを細胞に導入（トランスフェクト）することにより、プロモーターが活性化され、前記二本鎖核酸を生成することができる。例えば、前記タンデム型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、センス鎖及びアンチセンス鎖が生成され、それらがハイブリダイズすることによりｓｉＲＮＡが生成される。前記ヘアピン型ベクターにおいては、前記ＤＮＡが細胞内で転写されることにより、まずヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が生成され、次いで、ダイサーによるプロセシングにより、ｓｉＲＮＡが生成される。 By introducing (transfecting) the DNA or the vector into cells, the promoter is activated and the double-stranded nucleic acid can be produced. For example, in the tandem vector, the DNA is transcribed within cells to generate a sense strand and an antisense strand, and siRNA is generated by hybridization of these strands. In the hairpin vector, hairpin RNA (shRNA) is first generated by intracellular transcription of the DNA, and then siRNA is generated by processing by Dicer.
（ｍｉＲＮＡ）
本発明の医薬組成物は、ｍｉＲＮＡを含むことができる。ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）は、２０～２５塩基長の１本鎖ＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡ）であり、遺伝子の転写後発現調節に関与する。ｍｉＲＮＡの産生過程では、初めにＲＮＡポリメラーゼIIによる転写産物（Ｐｒｉｍａｒｙ－ｍｉＲＮＡ；Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）が生じ、次にＰｒｉ－ｍｉＲＮＡは切断されステムループ配列を有するｍｉＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を生じ、さらにＤｉｃｅｒで切断されることにより成熟ｍｉＲＮＡが生じる。このｍｉＲＮＡを補充する方法として、内在性ｍｉｃｒｏＲＮＡの機能を効果的に模倣し機能増加するようにデザインされた化学合成したｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃを使用する方法、ｍｉＲＮＡ発現プラスミドを使用する方法等を用いることができる。
(miRNA)
Pharmaceutical compositions of the invention can include miRNA. miRNA (microRNA) is a single-stranded RNA (mature miRNA) with a length of 20 to 25 bases, and is involved in post-transcriptional expression regulation of genes. In the miRNA production process, a transcription product (Primary-miRNA; Pri-miRNA) is first produced by RNA polymerase II, and then Pri-miRNA is cleaved to produce a miRNA precursor (Pre-miRNA) having a stem-loop sequence. Further cleavage with Dicer produces mature miRNA. As a method for replenishing this miRNA, a method using a chemically synthesized miRNA mimic designed to effectively mimic and increase the function of endogenous microRNA, a method using a miRNA expression plasmid, etc. can be used. .
（アンチセンスオリゴ）
本発明の医薬組成物は、アンチセンスオリゴを含むことができる。アンチセンスオリゴは標的と相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡやＲＮＡで、タンパク質への発現を抑制するはたらきを持つ。核酸に様々な化学修飾を導入することで、安定性や機能などを追加することができる。その一つの例としてモルフォリノアンチセンスオリゴは、モルフォリノ環を有するオリゴＤＮＡであり、ＲＮＡに対する親和性が高く、そしてＤＮＡ分解酵素に対して抵抗性を有する。ガレクチン－４の５′非翻訳領域、またはエキソンとイントロンとの境界領域に相同性をもつように設計することによって、ガレクチン－４のｍＲＮＡからの翻訳やスプライシングを抑制することができる。
(antisense oligo)
Pharmaceutical compositions of the invention can include antisense oligos. Antisense oligos are single-stranded DNA or RNA that have a sequence complementary to the target, and have the function of suppressing protein expression. By introducing various chemical modifications to nucleic acids, stability and functionality can be added. As one example, a morpholino antisense oligo is an oligo DNA having a morpholino ring, has a high affinity for RNA, and is resistant to DNA degrading enzymes. By designing homology to the 5' untranslated region of galectin-4 or the exon-intron boundary region, translation and splicing from galectin-4 mRNA can be inhibited.
本発明のガレクチン－４陽性胃がん治療用医薬組成物は、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分（例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクター）を有効成分として含み、更に必要に応じてその他の成分を含むことができる。 The galectin-4-positive pharmaceutical composition for gastric cancer treatment of the present invention contains a component that suppresses the function of galectin-4 protein (for example, dextran sulfate, heparin, sulfated glycolipid, or cholesterol sulfate) or the function of galectin-4 gene. (for example, the double-stranded nucleic acid, DNA, or vector) as an active ingredient, and may further contain other components as necessary.
（剤形、投与方法）
前記医薬組成物の剤型としては、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
また、有効成分以外のその他の成分として、所望の医薬添加物、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を含むことができる。
(Dosage form, administration method)
The dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the desired administration method, such as oral solid dosage forms (tablets, coated tablets, granules, powders, capsules, etc.), Oral solutions (oral solutions, syrups, elixirs, etc.), injections (solutions, suspensions, solid preparations for dissolution, etc.), ointments, patches, gels, creams, external powders, sprays, inhalers Examples include powders.
In addition, other ingredients other than the active ingredient may include desired pharmaceutical additives, such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, coloring agents, flavoring agents, and the like.
前記医薬組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記医薬組成物の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。例えば、局所投与においては、前記医薬を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。前記注入には、注射等の従来公知の手法を適宜利用することができる。また、全身投与（例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等）においては、前記医薬の有効成分が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。 There are no particular restrictions on the method of administering the pharmaceutical composition; for example, local administration or systemic administration may be selected depending on the dosage form of the pharmaceutical composition, the type of disease, the patient's condition, etc. can. For example, for local administration, the medicament can be administered by injection directly into the desired site (eg, tumor site). For the injection, conventionally known techniques such as injection can be used as appropriate. In addition, in systemic administration (e.g., oral administration, intraperitoneal administration, administration into the blood, etc.), the active ingredient of the drug is stably and efficiently delivered to the desired site (e.g., tumor site). It is preferable to appropriately apply conventionally known drug delivery techniques.
前記医薬組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、例えば二本鎖核酸の量として、１ｍｇ～１００ｍｇが好ましい。
また、前記医薬組成物の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
The dosage of the pharmaceutical composition is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the age, body weight, degree of desired effect, etc. of the patient to whom it is administered. For example, the amount of double-stranded nucleic acid per administration is preferably 1 mg to 100 mg.
Furthermore, the number of times the pharmaceutical composition is administered is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the age, body weight, degree of desired effect, etc. of the patient to be administered.
《ガレクチン－４陽性胃がんの治療方法》
本発明は、ガレクチン－４陽性胃がんの治療の必要がある対象に、その有効量でガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分（例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクター）を投与することを含む、ガレクチン－４陽性胃がんの治療または予防方法を提供する。
《Treatment method for galectin-4 positive gastric cancer》
The present invention provides effective doses of ingredients that suppress the function of galectin-4 proteins (for example, dextran sulfate, heparin, sulfated glycolipids, or cholesterol sulfate) to subjects in need of treatment for galectin-4-positive gastric cancer. Alternatively, the present invention provides a method for treating or preventing galectin-4-positive gastric cancer, which comprises administering a component (eg, the double-stranded nucleic acid, DNA, or vector) that suppresses the function of the galectin-4 gene.
《ガレクチン－４陽性胃がん用医薬組成物の製造への使用》
本発明は、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分（例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクター）の、ガレクチン－４陽性胃がんの治療用医薬組成物の製造に使用することができる。
《Use for manufacturing galectin-4 positive pharmaceutical composition for gastric cancer》
The present invention provides a component that suppresses the function of galectin-4 protein (for example, dextran sulfate, heparin, sulfated glycolipid, or cholesterol sulfate), or a component that suppresses the function of galectin-4 gene (for example, the double-stranded (nucleic acid, DNA, or vector) can be used to produce a pharmaceutical composition for treating galectin-4-positive gastric cancer.
《ガレクチン－４陽性胃がん治療用のガレクチン－４阻害剤》
本発明は、ガレクチン－４陽性胃がん治療用のガレクチン－４阻害剤に関する。ガレクチン－４阻害剤としては、前記の通りガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、硫酸化糖脂質、又はコレステロール硫酸）、又はガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分（例えば、前記二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はベクター）が挙げられる。
《Galectin-4 inhibitor for treatment of galectin-4 positive gastric cancer》
The present invention relates to a galectin-4 inhibitor for the treatment of galectin-4-positive gastric cancer. As described above, galectin-4 inhibitors include components that suppress the function of galectin-4 protein (for example, dextran sulfate, heparin, sulfated glycolipids, or cholesterol sulfate), or components that suppress the function of galectin-4 gene. (For example, the double-stranded nucleic acid, DNA, or vector).
《作用》
本発明の医薬組成物が、ガレクチン－４陽性胃がんの治療、特に増殖を抑制できる理由は、詳細には検討されていない。しかしながら、以下のように推定することができる。但し、本発明は以下の推定によって、限定されるものではない。
ガレクチン－４遺伝子の機能を抑制する成分は、ガレクチン－４のｍＲＮＡの発現を抑制することによって、癌細胞の増殖を抑制すると考えられる。ガレクチン－４陽性胃がん細胞の増殖には、ガレクチン－４の発現が関与していると考えられ、ガレクチン－４の発現をｍＲＮＡのレベルで抑制することによって、ガレクチン－４陽性胃がん細胞の増殖を抑制できると推定される。
一方、ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分は、ガレクチン－４タンパク質に結合することによって、ガレクチン－４陽性胃がん細胞の増殖を抑制できると考えられる。ガレクチン－４は癌細胞の悪性度に関係する分子群（例えばｃＭＥＴ、ＣＤ４４等）に糖結合ドメインを通じて結合することによって、細胞表面への局在を安定化し、ガレクチン－４が－複合糖鎖（糖タンパク質または糖脂質）格子を形成し、格子内に存在する受容体の側方拡散を拘束することにより、受容体の凝集や情報伝達を起こす閾値を高めることが推定される。ガレクチン－４タンパク質の機能を抑制する成分は、ガレクチン－４に結合することでガレクチン－４によって発現や局在が制御されている分子への結合を阻害することができる。具体的には、ガレクチン－４の結合阻害によってｃＭＥＴの活性化を阻害する（すなわちｐＭＥＴの抑制）ことにより増殖を抑制していると考えられる。
《Effect》
The reason why the pharmaceutical composition of the present invention is able to treat galectin-4-positive gastric cancer, particularly suppress its proliferation, has not been investigated in detail. However, it can be estimated as follows. However, the present invention is not limited by the following estimation.
A component that suppresses the function of the galectin-4 gene is thought to suppress the proliferation of cancer cells by suppressing the expression of galectin-4 mRNA. Galectin-4 expression is thought to be involved in the proliferation of galectin-4-positive gastric cancer cells, and by suppressing galectin-4 expression at the mRNA level, the proliferation of galectin-4-positive gastric cancer cells is suppressed. It is estimated that it can be done.
On the other hand, a component that suppresses the function of galectin-4 protein is thought to be able to suppress the proliferation of galectin-4-positive gastric cancer cells by binding to galectin-4 protein. Galectin-4 stabilizes its localization on the cell surface by binding to molecules related to the malignancy of cancer cells (e.g., cMET, CD44, etc.) through the sugar-binding domain, It is presumed that by forming a lattice (glycoprotein or glycolipid) and restricting the lateral diffusion of receptors present within the lattice, the threshold for receptor aggregation and signal transmission is increased. A component that suppresses the function of galectin-4 protein can inhibit binding to molecules whose expression and localization are controlled by galectin-4 by binding to galectin-4. Specifically, proliferation is thought to be suppressed by inhibiting cMET activation (ie, pMET suppression) by inhibiting galectin-4 binding.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically explained with reference to Examples, but these are not intended to limit the scope of the present invention.
《実施例１》
本実施例では、ガレクチン－４陽性胃がん細胞（ＮＵＧＣ４細胞）のガレクチン－４をノックアウトした細胞を取得した。
ガレクチン－４遺伝子のノックアウトは、ホライゾンディスカバリー社のＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｅｄｉｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集試薬システムによるゲノム編集ツールを利用して行った。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含んだＥｄｉｔ－Ｒ ｈＣＭＶ－ＰｕｒｏＲ－Ｃａｓ９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ、Ｅｄｉｔ－Ｒ Ｈｕｍａｎ ＬＧＡＬＳ４（３９６０） ｃｒＲＮＡ（ＣＭ－０１２２３２－０５）とＥｄｉｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｒａｃｒＲＮＡをＤｈａｒｍａＦＥＣＴ Ｄｕｏ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＮＵＧＣ４細胞に共導入した。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを培地に添加することによりノックアウト細胞を濃縮し、さらにコロニーをピックアップして、ガレクチン－４の発現細胞が混入していないクローンを蛍光免疫染色法で選別した。ガレクチン－４の発現が認められないノックアウト株クローン、ＫＯ－１ａ、ＫＯ－１ｂ、及びＫＯ－２を選択した。ノンコーディング遺伝子に対してデザインされたＥｄｉｔ－Ｒ ｃｒＲＮＡ Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＃１をガレクチン－４用にデザインされたｃｒＲＮＡの代わりに用いて同様の操作を行い、対照株Ｃ１を樹立した。
《Example 1》
In this example, galectin-4-positive gastric cancer cells (NUGC4 cells) in which galectin-4 was knocked out were obtained.
The galectin-4 gene was knocked out using a genome editing tool using Horizon Discovery's Dharmacon Edit-R CRISPR-Cas9 genome editing reagent system. Edit-R hCMV-PuroR-Cas9 Expression Plasmid containing Puromycin resistance gene, Edit-R Human LGALS4 (3960) crRNA (CM-012232-05) and Edit-R CRISPR-Cas9 Sy nthetic tracrRNA using DharmaFECT Duo Transfection Reagent Cotransfected into NUGC4 cells. Knockout cells were concentrated by adding Puromycin to the medium, colonies were picked up, and clones that were not contaminated with cells expressing galectin-4 were selected by fluorescent immunostaining. Knockout strain clones, KO-1a, KO-1b, and KO-2, in which galectin-4 expression was not observed were selected. A control strain C1 was established by performing the same operation using Edit-R crRNA Non-targeting Control #1 designed for a non-coding gene instead of the crRNA designed for galectin-4.
ノックアウト細胞各クローンからＲＮＡを抽出し逆転写してｃＤＮＡを取得後、塩基配列を調べた結果を図１に示す。
ノックアウト細胞株ではターゲットとしたｃｒＲＮＡ部位近傍に塩基対の欠失が確認された。ノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－１ｂは同じ遺伝子配列を持ち、ノックアウト株ＫＯ－２の欠失範囲はＫＯ－１ａやＫＯ－１ｂよりも狭かった。
図１ａのように遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列の欠失はそれぞれ４５アミノ酸及び１２アミノ酸である。ウェスタンブロット法で、ガレクチン－４の発現を調べたところ、それぞれのクローンは、ガレクチン－４タンパク質の発現は認められなかった（図１ｂ）。
After RNA was extracted from each knockout cell clone and reverse transcribed to obtain cDNA, the base sequence was examined and the results are shown in FIG.
In the knockout cell line, deletion of base pairs was confirmed near the targeted crRNA site. Knockout strains KO-1a and KO-1b had the same gene sequence, and the deletion range of knockout strain KO-2 was narrower than that of KO-1a and KO-1b.
As shown in Figure 1a, the deletions in the amino acid sequence deduced from the gene sequence are 45 amino acids and 12 amino acids, respectively. When the expression of galectin-4 was examined by Western blotting, no expression of galectin-4 protein was observed in each clone (Fig. 1b).
（ノックアウト細胞株の増殖能）
前記ノックアウト細胞株の増殖能を、細胞倍化時間によって測定した。
(Proliferation ability of knockout cell line)
The proliferation ability of the knockout cell line was measured by cell doubling time.
表１に示すように、ノックアウト株の細胞倍化時間は親株、対照株に比べ長く、増殖能が低下していた。また、親株（Ｗｉｌｄ）とＫＯ－２株の増殖カーブを図２に示す。ＫＯ－２株の増殖カーブは、親株と比較して、有意に低下していた。図中の＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊は２つのグループの間で統計学的に著しく有意な差があることを示している。 As shown in Table 1, the cell doubling time of the knockout strain was longer than that of the parent strain and the control strain, and the proliferation ability was decreased. Furthermore, the growth curves of the parent strain (Wild) and the KO-2 strain are shown in FIG. The growth curve of the KO-2 strain was significantly lower than that of the parent strain. ** in the figure indicates p<0.01, and ** indicates a statistically significant difference between the two groups.
（ノックアウト細胞株の接着非依存性増殖能）
ノックアウト細胞株の接着非依存性増殖能をＧＩＬＡアッセイで測定した。接着非依存性増殖能とは細胞外基質に接着しなくても生存し増殖できる細胞の性質である。
ＧＩＬＡアッセイは、細胞培養用９６ウェルプレート（Ｎｏ．３７０４、コーニング社）及び超低吸着９６ウェルプレート（Ｎｏ．３４７４、コーニング社）に１０００個／ｗｅｌｌで細胞を播種し、５日間培養後、それぞれのプレートの生細胞に由来するＡＴＰ量を測定した。ＡＴＰ量は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０試薬（プロメガ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加後、反応液を９６ウェル白プレート（Ｎｏ．３３６２、コーニング社）に移し、発光量をＴｒｉｓｔａｒ２ ＬＢ９４２プレートリーダー（ベルトールド社）で測定した。超低吸着プレート上の細胞のＡＴＰ量と細胞培養用プレート上の細胞のＡＴＰ量の比をＬｏｗ／Ｈｉｇｈ比とした。
図３に示すように、対照株Ｃ１に比較して、ノックアウト細胞株ではＬｏｗ／Ｈｉｇｈ比が低下し、接着非依存性増殖能が低下していることが示された。
(Adhesion-independent proliferation ability of knockout cell line)
The adhesion-independent proliferation ability of the knockout cell line was measured by GILA assay. Adhesion-independent growth capacity is the property of cells that can survive and proliferate without adhesion to extracellular matrix.
In the GILA assay, cells were seeded at 1000 cells/well in a 96-well plate for cell culture (No. 3704, Corning Inc.) and an ultra-low adsorption 96-well plate (No. 3474, Corning Inc.), and after culturing for 5 days, each The amount of ATP derived from living cells of the plate was measured. The amount of ATP was determined by adding CellTiter-Glo (registered trademark) 2.0 reagent (Promega) at 100 μL/well, then transferring the reaction solution to a 96-well white plate (No. 3362, Corning), and measuring the amount of luminescence using Tristar2 LB942. Measurement was performed using a plate reader (Berthold). The ratio of the ATP amount of the cells on the ultra-low adsorption plate to the ATP amount of the cells on the cell culture plate was defined as the Low/High ratio.
As shown in FIG. 3, the knockout cell line had a lower Low/High ratio, indicating a lower adhesion-independent growth ability, compared to the control line C1.
（マウス腹膜播種モデルを用いた解析）
ノックアウト細胞株で腹膜播種を、マウスモデルを用いて解析した。免疫不全マウス（ＢＡＬＢｃ ｎｕ／ｎｕ、オス、６週齢）に、１×１０６個のヒト胃癌細胞株ＮＵＧＣ４細胞を腹腔内に移植し、３９日間飼育後開腹し腫瘍の数及び重量を計測した。
ＮＵＧＣ４細胞親株投与群は２匹、ＮＵＧＣ４対照株Ｃ１投与群は２匹、ノックアウト株ＫＯ－１ａ投与群は３匹、ノックアウト株ＫＯ－２投与群は３匹を使用し、各細胞を個体当たり１×１０６個／１００～２００μＬ ＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍで腹腔内に移植した。３９日後に剖検を行った結果と、剖検時に腫瘍重量を測定した。
(Analysis using mouse peritoneal dissemination model)
Peritoneal dissemination with knockout cell lines was analyzed using a mouse model. Immunodeficient mice (BALBc nu/nu, male, 6 weeks old) were intraperitoneally transplanted with 1 x 10 6 human gastric cancer cell line NUGC4 cells, kept for 39 days, and then subjected to laparotomy to measure the number and weight of tumors. .
Two animals were used for the NUGC4 cell parent line administration group, two animals were used for the NUGC4 control line C1 administration group, three animals were used for the knockout strain KO-1a administration group, and three animals were used for the knockout strain KO-2 administration group. ×10 6 cells/100 to 200 μL were implanted intraperitoneally in RPMI1640 medium. The results of autopsy performed 39 days later and the weight of the tumor at the time of autopsy were measured.
表２及び図４に示すように、ＮＵＧＣ４胃癌細胞親株投与群及び対照株Ｃ１投与群はどちらも腹水の貯留が認められ、腹腔内に多数の腫瘍が観察されたが、ノックアウト株投与群のマウスにはどちらも腹腔内に腫瘍は認められなかった。図中の＊はｐ＜０．０５を示し、＊は２つのグループの間で腫瘍重量に統計学的に有意な差があることを示している。 As shown in Table 2 and Figure 4, ascites was observed in both the NUGC4 gastric cancer cell parent line administration group and the control cell C1 administration group, and numerous tumors were observed in the peritoneal cavity; No tumor was found within the peritoneal cavity in either case. * in the figure indicates p<0.05, and * indicates a statistically significant difference in tumor weight between the two groups.
《実施例２》
本実施例では、ガレクチン－４の発現と相関する分子を探索した。具体的には、親株、ノックアウト細胞株（ＫＯ－１ａ株、ＫＯ－２株）、及び再発現株Ｒ３のｃＭＥＴの発現をウェスタンブロット法で調べた。再発原株Ｒ３は、ＫＯ－２株にＦＬＡＧガレクチン－４発現プラスミドを導入し、ガレクチン－４を再発現させた細胞株である。
図５に示すように、ｃＭＥＴの発現はノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－２両方で低下していた。一方、再発現株Ｒ３では、対照株及び親株とほぼ同じ程度まで回復しており、ガレクチン－４の発現がｃＭＥＴの発現に影響を与えている可能性が示唆された。
《Example 2》
In this example, we searched for molecules that correlate with the expression of galectin-4. Specifically, the expression of cMET in the parent line, knockout cell lines (KO-1a line, KO-2 line), and re-expression line R3 was examined by Western blotting. The re-originating strain R3 is a cell line obtained by introducing a FLAG galectin-4 expression plasmid into the KO-2 strain to re-express galectin-4.
As shown in FIG. 5, cMET expression was decreased in both knockout strains KO-1a and KO-2. On the other hand, the re-expression strain R3 recovered to almost the same level as the control strain and the parent strain, suggesting that the expression of galectin-4 may influence the expression of cMET.
（ガレクチン－４の発現の変化とｐＭＥＴの発現）
ガレクチン－４の発現に相関してｃＭＥＴの発現が変化していることから、ｃＭＥＴと結合して活性化させる分子ＨＧＦの有無で、ｃＭＥＴの活性化体であるｐＭＥＴの発現を調べた。
前日に１２ウェルプレートに４×１０５個／ｗｅｌｌで撒いた各細胞（対照株Ｃ１、ノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－２）を、ＰＢＳ洗浄後０．１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に置換し、４時間後ＨＧＦを含まない培地（－）あるいは５０ｎｇ／ｍＬの濃度でＨＧＦを含む培地（＋）を添加して３０分反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファーを加えて回収した。１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに添加、泳動後ＰＶＤＦ膜に転写し、実施例２で使用したガレクチン－４抗体、ｃＭＥＴ抗体、β－アクチン抗体、ｐＭＥＴ抗体（Ｙ１２３４／１２３５）（Ｄ２６）ＸＰ（登録商標） Ｒａｂｂｉｔ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で染色を行った。結果を図６に示す。
ノックアウト細胞株は、両クローン共にＨＧＦの存在の有無に関わらず、親株や再発現株Ｒ３に比べてｐＭＥＴのレベルは極めて低かった。このことから、ガレクチン－４の発現がｃＭＥＴの活性化とも相関することが明らかになった。
(Changes in galectin-4 expression and pMET expression)
Since the expression of cMET changes in correlation with the expression of galectin-4, the expression of pMET, which is an activated form of cMET, was investigated based on the presence or absence of HGF, a molecule that binds to and activates cMET.
Each cell (control strain C1, knockout strain KO-1a and KO-2) seeded at 4 x 10 cells/well in a 12-well plate the previous day was washed with PBS and replaced with RPMI 1640 medium containing 0.1% FCS. After 4 hours, a medium without HGF (-) or a medium containing HGF at a concentration of 50 ng/mL (+) was added and allowed to react for 30 minutes. After washing with PBS, SDS sample buffer was added and collected. Galectin-4 antibody, cMET antibody, β-actin antibody, pMET antibody (Y1234/1235) (D26) XP (registered trademark) used in Example 2 were added to a 12% SDS-PAGE gel and transferred to a PVDF membrane after electrophoresis ) Staining was performed with Rabbit mAb (Cell Signaling Technology). The results are shown in FIG.
Both clones had extremely low pMET levels in the knockout cell lines compared to the parent line and the re-expression line R3, regardless of the presence or absence of HGF. This revealed that the expression of galectin-4 also correlates with the activation of cMET.
（ガレクチン－４の発現の変化とＣＤ４４の発現）
次に、親株、ノックアウト細胞株（ＫＯ－１ａ株、ＫＯ－２株）、再発現株Ｒ３でのＣＤ４４の発現をウェスタンブロット法で調べた。
図７に示すように、ＣＤ４４の発現はノックアウト株ＫＯ－１ａ及びＫＯ－２の両方で低下していた。一方、再発現株Ｒ３では、対照株及び親株とほぼ同じ程度まで回復しており、ガレクチン－４の発現がＣＤ４４の発現に影響を与えている可能性が示唆された。
(Changes in galectin-4 expression and CD44 expression)
Next, the expression of CD44 in the parent strain, knockout cell lines (KO-1a strain, KO-2 strain), and re-expression strain R3 was examined by Western blotting.
As shown in FIG. 7, the expression of CD44 was decreased in both knockout strains KO-1a and KO-2. On the other hand, the re-expression strain R3 recovered to almost the same level as the control strain and the parent strain, suggesting that the expression of galectin-4 may influence the expression of CD44.
《実施例３》
本実施例では、ｐＭＥＴの発現とガレクチン－４の発現とを、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）によって解析した。
ＰＬＡはＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標） ＰＬＡ試薬（シグマアルドリッチ社）の蛍光法のマニュアルに従って行った。ＮＵＧＣ４細胞の親株及びノックアウト株ＫＯ－２を室温で１５分間４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、ＰＢＳを用いて洗浄し、浸透処理バッファー（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＰＢＳ）中で５分間浸透処理した後、３７℃で３０分間ＰＬＡ用ブロッキングバッファーを用いてブロッキングした。１次抗体として抗ｐＭＥＴ抗体及び抗ガレクチン－４抗体（ＡＦ１２２７、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）と４℃で終夜インキュベートした。
洗浄後、希釈ＰＬＡ二次抗体－ＰＬＡプローブ溶液［抗ウサギ（＋）および抗ヤギ（－）］を加え、３７℃で１時間加湿チャンバー内にてスライドをインキュベートした。洗浄後、ライゲーション反応を実施し、グリーンキットを用いて増幅反応を実施した。反応後の細胞をＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標） Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩを用いて封入し、透明なネイルポリッシュ硬化剤で周囲を密封し、蛍光顕微鏡で観察した。
ＰＬＡでは各抗体の結合する分子が４０ｎｍ以内に近接して位置する時は、ライゲーション反応によって環状ＤＮＡ鋳型が形成し、それに続く増幅反応によってハイブリダイズする蛍光オリゴプローブを使用して、局在増幅ＤＮＡを視覚化する。
図８で示されるように親株では細胞膜の近傍付近にＰＬＡシグナルが観察され、ガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接が観察された。一方、ノックアウト細胞株ＫＯ－２ではＰＬＡシグナルが観察されないことから、親株で認められたＰＬＡシグナルが特異的であることが確かめられた。
《Example 3》
In this example, pMET expression and galectin-4 expression were analyzed by proximity ligation assay (PLA).
PLA was performed according to the fluorescence method manual of Duolink (registered trademark) PLA reagent (Sigma-Aldrich). The parental and knockout strain KO-2 of NUGC4 cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 min at room temperature, washed with PBS, and incubated in permeabilization buffer (0.5% Triton X-100, PBS) for 5 min. After permeation treatment for a minute, blocking was performed using a blocking buffer for PLA at 37°C for 30 minutes. The cells were incubated overnight at 4°C with anti-pMET antibody and anti-galectin-4 antibody (AF1227, R&D Systems) as primary antibodies.
After washing, diluted PLA secondary antibody-PLA probe solutions [anti-rabbit (+) and anti-goat (-)] were added and the slides were incubated at 37°C for 1 hour in a humidified chamber. After washing, a ligation reaction was performed, and an amplification reaction was performed using a green kit. The cells after the reaction were encapsulated using Duolink (registered trademark) In Situ Mounting Medium with DAPI, the surrounding area was sealed with a transparent nail polish hardening agent, and the cells were observed using a fluorescence microscope.
In PLA, when the molecules bound by each antibody are located close to each other within 40 nm, a circular DNA template is formed by a ligation reaction, and a fluorescent oligo probe that hybridizes in a subsequent amplification reaction is used to locally amplify the DNA. Visualize.
As shown in FIG. 8, in the parent strain, PLA signals were observed near the cell membrane, and galectin-4 and pMET were observed to be in close proximity. On the other hand, since no PLA signal was observed in the knockout cell line KO-2, it was confirmed that the PLA signal observed in the parent cell line was specific.
（ＭＫＮ４５細胞のＰＬＡ）
本実施例では、ＮＵＧＣ４細胞に代えて、ＭＫＮ４５細胞を用いて、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を行った。ＭＫＮ４５細胞もガレクチン－４を発現している胃がん細胞である。
図９で示されるように無処理（－）の細胞では細胞膜の近傍付近にガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接を示すＰＬＡシグナルが観察された。また、Ｎ－結合型糖鎖合成阻害剤（ＮＧＩ－１）を１０μＭの濃度で培地に３日間添加した場合、ＰＬＡシグナルは大幅に減弱したことから、ガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接に糖鎖が関係している可能性が示唆された。抗ｐＭＥＴウサギ抗体の代わりに非免疫ウサギＩｇＧを使用した場合では、極少量のＰＬＡシグナルしか観察されなかった。
また、ガレクチン－４ウサギ抗体とＣＤ４４マウス抗体を使用し、ＰＬＡ二次抗体－ＰＬＡプローブ溶液［抗ウサギ（＋）および抗マウス（－）］を使用し同様の近接ライゲーションアッセイを行ったところ、膜近傍にＰＬＡシグナルが観察された。このことから、ＣＤ４４とガレクチン－４との近接も示唆された。
(PLA of MKN45 cells)
In this example, proximity ligation assay (PLA) was performed using MKN45 cells instead of NUGC4 cells. MKN45 cells are also gastric cancer cells that express galectin-4.
As shown in FIG. 9, in untreated (-) cells, a PLA signal indicating the proximity of galectin-4 and pMET was observed near the cell membrane. Furthermore, when N-linked glycan synthesis inhibitor (NGI-1) was added to the medium at a concentration of 10 μM for 3 days, the PLA signal was significantly attenuated, indicating that glycan chains are present in the vicinity of galectin-4 and pMET. It was suggested that they may be related. When non-immune rabbit IgG was used instead of anti-pMET rabbit antibody, only a minimal amount of PLA signal was observed.
In addition, when a similar proximity ligation assay was performed using a galectin-4 rabbit antibody and a CD44 mouse antibody and a PLA secondary antibody-PLA probe solution [anti-rabbit (+) and anti-mouse (-)], the membrane A PLA signal was observed nearby. This suggested the close proximity of CD44 and galectin-4.
《実施例４》
本実施例では、近接標識法の１つであるＳＰＰＬＡＴ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ Ｔｙｒａｍｉｄｅ）法を用いて、ＭＫＮ４５及びＮＵＧＣ４細胞表面のガレクチン－４の近接分子の同定を行った。
《Example 4》
In this example, proximal molecules of galectin-4 on the surface of MKN45 and NUGC4 cells were identified using the SPPLAT (Selective Proteomic Proximity Labeling Assay using Tyramide) method, which is one of the proximity labeling methods.
（ビオチン－ＰＥＧ４－チラミド調製]
チラミン塩酸塩（ナカライ社）を０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．８）で１．５５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、２ｍｇのＥＺＬｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ｂｉｏｔｉｎ Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ（登録商標） Ｆｏｒｍａｔ（Ａ３９２５９、サーモフィッシャー社）を０．３４ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。調製したチラミン塩酸溶液とＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン溶液を０．３４ｍＬずつ混和し、遮光して１６時間反応させた。その後、０．２２μｍフィルターでろ過した後、分注し、使用時まで－３０℃フリーザーで凍結保存した。
(Biotin-PEG4-tyramide preparation)
Tyramine hydrochloride (Nacalai) was prepared at a concentration of 1.55 mg/mL with 0.1 M boric acid buffer (pH 8.8), and 2 mg of EZLink NHS-PEG4-biotin No-Weight (registered trademark) Format (A39259, Thermo Fisher) was dissolved in 0.34 mL of DMSO. 0.34 mL each of the prepared tyramine hydrochloride solution and NHS-PEG4-biotin solution were mixed and reacted for 16 hours in the dark. Thereafter, the mixture was filtered through a 0.22 μm filter, aliquoted, and stored frozen in a -30°C freezer until use.
（ＳＰＰＬＡＴ法による細胞表面標識）
培養した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ標識した抗体をＰＢＳに溶解した１％ＢＳＡ溶液に加え、細胞と４℃で１時間反応させた。反応後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、６ｃｍ培養ディッシュの場合は１ｍＬの５０ｍＭトリス塩酸あたり６．２５μＬのビオチン－ＰＥＧ４－チラミド溶液、０．０３％の過酸化水素を加えて調製した溶液と５分反応させた。反応後、１ｍＬのカタラーゼ溶液（２００Ｕ／ｍＬ）を加え反応を停止させた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（登録商標） Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロシュ社）、ＰｈｏｓＳＴＯＰ（登録商標）（ロシュ社）及び４ｍＭ １，１０－フェナントロリン（ナカライ社）を含む０．５ｍＬのＥｚＲｉｐａ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｔｔｏ社）を添加しスクレーパーで回収し、－３０℃で凍結保存した。
(Cell surface labeling by SPPLAT method)
The cultured cells were washed three times with PBS, and the HRP-labeled antibody was added to a 1% BSA solution dissolved in PBS, and reacted with the cells at 4° C. for 1 hour. After the reaction, the cells were washed three times with PBS, and in the case of a 6 cm culture dish, a solution prepared by adding 6.25 μL of biotin-PEG4-tyramide solution and 0.03% hydrogen peroxide per 1 mL of 50 mM Tris-HCl. The reaction was allowed to proceed for 5 minutes. After the reaction, 1 mL of catalase solution (200 U/mL) was added to stop the reaction. Cells were washed three times with PBS and treated with 0.5 mL of EzRipa buffer containing cOmplete® Protease Inhibitor Cocktail (Roche), PhosSTOP® (Roche), and 4 mM 1,10-phenanthroline (Nacalai). (Atto) was added, collected with a scraper, and stored frozen at -30°C.
（ビオチン標識分子の回収）
凍結保存した細胞溶解液を解凍後、超音波処理を行い、４０００Ｇで５分遠心した。上清にＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｍａｇｎｅ（登録商標） ストレプトアビジンビーズ（Ｖ７８２０、プロメガ社）を添加し、４℃、１６時間ローテーションしながら反応させた。遠心及び磁気ビーズ分離ラックでストレプトアビジンビーズを分離しＲｉｐａ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファーでビーズから標識分子を回収した。
(Recovery of biotin-labeled molecules)
After thawing the cryopreserved cell lysate, it was treated with ultrasound and centrifuged at 4000G for 5 minutes. High Capacity Magne (registered trademark) streptavidin beads (V7820, Promega) were added to the supernatant, and the mixture was allowed to react at 4°C for 16 hours with rotation. Streptavidin beads were separated using centrifugation and a magnetic bead separation rack, washed three times with Ripa buffer, and labeled molecules were recovered from the beads using SDS sample buffer.
（ガレクチン－４抗体による標識分子）
ＳＰＰＬＡＴ法でＨＲＰ標識ガレクチン－４抗体（ａＧ４）及びＨＲＰ標識ウサギＩｇＧ（Ｃ）で細胞表面を標識した結果を図１０ａに示す。ガレクチン－４抗体（ａＧ４）の代わりにウサギＩｇＧ（Ｃ）を反応させた細胞の溶解液にみられるいくつかのバンド（＊）は細胞に存在するアビジン結合分子である。ガレクチン－４抗体（ａＧ４）特異的に多くの分子がビオチン標識された。
ストレプトアビジンビーズで回収されたビオチン標識分子の中にｐＭＥＴ及びＣＤ４４が染色されたことから、これらの分子がガレクチン－４に近接して存在することがＳＰＰＬＡＴ法でも明らかになった。
ＨＲＰ標識ガレクチン－４抗体の代わりにＨＲＰ標識ガレクチン－４を用い、標識時、５０ｍＭの濃度でスクロース（Ｓｕｃ）またはラクトース（Ｌａｃ）、あるいは１ｍｇ／ｍＬの濃度でアシアロフェチュイン（ＡＦ）を共存させてＳＰＰＬＡＴ法で細胞表面を標識した結果を図１０ｂに示す。ガレクチン－４でビオチン標識される分子は、ガレクチン－４の結合阻害活性の無いスクロースに比べ、ガレクチン－４の結合阻害活性を有するラクトースやアシアロフェチュインの共存で大幅に減少した。
ストレプトアビジンビーズで回収したビオチン標識分子の中にウェスタンブロットでｐＭＥＴ及びＣＤ４４が染色されたことから、これらの分子がガレクチン－４に近接して存在することが明らかになった。ｐＭＥＴ及びＣＤ４４の染色も阻害糖の存在で大幅に減少したことから、これらの分子とガレクチン－４の近接に糖鎖が関与していることが明らかになった。
(Labeled molecule by galectin-4 antibody)
Figure 10a shows the results of labeling the cell surface with HRP-labeled galectin-4 antibody (aG4) and HRP-labeled rabbit IgG (C) using the SPPLAT method. Several bands (*) seen in the lysate of cells reacted with rabbit IgG (C) instead of galectin-4 antibody (aG4) are avidin-binding molecules present in the cells. Many molecules were biotin-labeled specifically with galectin-4 antibody (aG4).
Since pMET and CD44 were stained in the biotin-labeled molecules recovered with streptavidin beads, it was also revealed by the SPPLAT method that these molecules were present in close proximity to galectin-4.
HRP-labeled galectin-4 was used instead of HRP-labeled galectin-4 antibody, and during labeling, sucrose (Suc) or lactose (Lac) at a concentration of 50 mM, or asialofetuin (AF) at a concentration of 1 mg/mL was coexisting. The results of cell surface labeling using the SPPLAT method are shown in FIG. 10b. Molecules biotin-labeled with galectin-4 were significantly reduced by the coexistence of lactose and asialofetuin, which have galectin-4 binding inhibitory activity, compared to sucrose, which does not have galectin-4 binding inhibitory activity.
Western blot staining of pMET and CD44 in the biotin-labeled molecules recovered with streptavidin beads revealed that these molecules were present in close proximity to galectin-4. Since the staining of pMET and CD44 was also significantly reduced in the presence of the inhibitory sugar, it became clear that sugar chains were involved in the proximity of these molecules and galectin-4.
《実施例５》
本実施例では、ｓｉＲＮＡを用いて、ガレクチン－４陽性細胞のガレクチン－４の発現を阻害した。すなわち、ガレクチン－４高発現胃癌細胞株（ＮＵＧＣ４、ＭＫＮ４５）を用いてガレクチン－４遺伝子の発現阻害（ノックダウン）実験を行い、ノックアウトと同様のフェノタイプが見られ、腹膜播種が阻害されるか調べた。
ノックダウン実験には、インビトロジェン社のｓｉＲＮＡを用いた。ガレクチン－４用のデザイン済みＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ（登録商標） ｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡ）＃３（5’-CCGGACAUUGCCAUCAACAGCUGAA-3’）、及びコントロールとしてＮｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｈｉｇｈ ＧＣ（１２９３５４００）のＳｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡを用いた。
細胞へのｓｉＲＮＡの導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（インビトロジェン社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。前日に撒き替えた細胞に、一定の濃度になるようにＯｐｔｉＭＥＭ培地で希釈したｓｉＲＮＡとＲＮＡｉＭａｘのコンプレックスを加え数日間培養後に試験に用いた。
《Example 5》
In this example, siRNA was used to inhibit the expression of galectin-4 in galectin-4 positive cells. That is, we performed an expression inhibition (knockdown) experiment of the galectin-4 gene using gastric cancer cell lines that highly express galectin-4 (NUGC4, MKN45), and found that the same phenotype as knockout was observed, and whether peritoneal dissemination was inhibited. Examined.
Invitrogen's siRNA was used in the knockdown experiment. Pre-designed Stealth RNAi (registered trademark) siRNA (Stealth siRNA) #3 (5'-CCGGACAUUGCCAUCAACAGCUGAA-3') for galectin-4 and Stealth siRNA of Negative control High GC (12935400) were used as a control. .
siRNA was introduced into cells using Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) according to the company's protocol. A complex of siRNA and RNAiMax diluted in OptiMEM medium to a constant concentration was added to the cells seeded the previous day, and after culturing for several days, the cells were used in the test.
（ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡによる関連分子の発現への影響）
ｓｉＲＮＡによって、ｃＭＥＴ及びｐＭＥＴタンパク質の発現が低下するか調べた。ＮＵＧＣ４細胞へは１０ｎＭ、ＭＫＮ４５細胞へは２５ｎＭの濃度でｓｉＲＮＡを導入し、ＳＤＳサンプルバッファーで回収し、両分子の発現をウェスタンブロットで調べた。
図１１に示すように、４８時間後に回収した細胞で、ガレクチン－４をノックダウンした細胞（Ｇｉ）ではコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞（Ｃｉ）に比べ、ＮＵＧＣ４細胞及びＭＫＮ４５細胞の両方でガレクチン－４タンパク質の発現低下が認められ、ノックアウトと同様にノックダウンでも特にｐＭＥＴタンパク質の低下が認められた。
(Influence of galectin-4 targeting siRNA on expression of related molecules)
It was investigated whether the expression of cMET and pMET proteins was reduced by siRNA. siRNA was introduced into NUGC4 cells at a concentration of 10 nM and into MKN45 cells at a concentration of 25 nM, collected with SDS sample buffer, and the expression of both molecules was examined by Western blotting.
As shown in Figure 11, among the cells collected after 48 hours, galectin-4 was knocked down in cells with galectin-4 knocked down (Gi) compared to cells into which control siRNA was introduced (Ci). A decrease in protein expression was observed, and in knockdown as well as knockdown, a decrease in pMET protein in particular was observed.
（ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ導入による増殖能への影響）
ｓｉＲＮＡの導入によって、胃がん細胞の増殖能に与える影響を調べた。前日に細胞を９６ウェルプレートに播種し、ｓｉＲＮＡ添加から７２時間後の生細胞をＷＳＴ－８法で調べ、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較した。
図１２に示すように、ガレクチン－４をノックダウンした細胞（Ｇｉ）では、無処理の細胞及びコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞（Ｃｉ）に比べ、増殖能の低下が認められた。ＭＫＮ４５細胞の方が、増殖抑制効果が高いのは、ＭＫＮ４５細胞の方がよりその増殖にｃＭＥＴ経路の関与する割合が高い為と考えられた。
(Influence on proliferation ability by introducing siRNA targeting galectin-4)
The effect of introducing siRNA on the proliferation ability of gastric cancer cells was investigated. Cells were seeded in a 96-well plate the previous day, and 72 hours after addition of siRNA, living cells were examined by the WST-8 method and compared with cells introduced with control siRNA.
As shown in FIG. 12, in cells in which galectin-4 was knocked down (Gi), a decrease in proliferation ability was observed compared to untreated cells and cells introduced with control siRNA (Ci). The reason why MKN45 cells had a higher proliferation inhibitory effect was thought to be because the cMET pathway was involved in the proliferation of MKN45 cells at a higher rate.
（ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ導入細胞のＰＬＡ）
ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ導入細胞でｐＭＥＴとガレクチン－４のＰＬＡを行った。図１３で示されるように無処理の細胞及びコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞（Ｃｉ）で、膜の近傍付近にＰＬＡシグナルが観察され、ガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接が観察された。一方、ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ導入細胞（Ｇｉ）ではＰＬＡが減弱し、膜の近傍でのシグナルが観察されなかった。このことから、ガレクチン－４のノックダウンによって、膜近傍でのガレクチン－４とｐＭＥＴとの近接が大きく抑制されることが示唆された。
(PLA of cells introduced with galectin-4 target siRNA)
PLA of pMET and galectin-4 was performed in cells introduced with galectin-4 target siRNA. As shown in FIG. 13, in untreated cells and cells introduced with control siRNA (Ci), PLA signals were observed near the membrane, and proximity of galectin-4 and pMET was observed. On the other hand, in galectin-4 target siRNA-introduced cells (Gi), PLA was attenuated and no signal was observed near the membrane. This suggested that knockdown of galectin-4 greatly suppresses the proximity of galectin-4 and pMET near the membrane.
《実施例６》
本実施例では、ｓｉＲＮＡの投与によって腹膜播種が抑制されるかを、マウスモデルを用いて解析した。
免疫不全マウス（ＢＡＬＢｃ ｎｕ／ｎｕ、オス、６週齢）に、ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５細胞３×１０６個を腹腔内に移植し、腹膜播種モデルとした。８０μｇのｓｉＲＮＡ溶解液、８０μＬのｉｎ ｖｉｖｏ実験用トランスフェクション試薬（ＬＥＯ－１０、北海道システム・サイエンス株式会社）、５％ブドウ糖液の計２５０μＬを腫瘍細胞投与後、１、４、７、１１、１４、１８、２１日目に計７回腹腔内に投与した。
動物試験に用いたガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ及びコントロールｓｉＲＮＡは、実施例５と同じ配列で、かつｉｎ ｖｉｖｏ用に調製されたもの（インビトロジェン社）を用いた。両ｓｉＲＮＡ腹腔内投与群とも、４匹ずつのマウスで実験を行った。また、２匹のマウスは腫瘍細胞のみを投与し、無処置群とした。
２８日後に開腹、剖検し、腫瘍重量を測定した結果を図１４に示す。無処置群＋対照ｓｉＲＮＡ投与群（Ｃｉ）とガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡ投与群（Ｇｉ）で統計処理を行うとｐ＝０．０１７となり、有意水準５％でガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡによる腫瘍重量の抑制が認められ、ガレクチン－４標的ｓｉＲＮＡによって腹膜播種を抑制できると考えられる。
《Example 6》
In this example, a mouse model was used to analyze whether administration of siRNA suppressed peritoneal dissemination.
3×10 6 human gastric cancer cell line MKN45 cells were intraperitoneally transplanted into an immunodeficient mouse (BALBc nu/nu, male, 6 weeks old) to serve as a peritoneal dissemination model. After administering a total of 250 μL of 80 μg of siRNA solution, 80 μL of in vivo experimental transfection reagent (LEO-10, Hokkaido System Science Co., Ltd.), and 5% glucose solution to tumor cells, 1, 4, 7, 11, 14 It was administered intraperitoneally a total of 7 times on the 18th and 21st days.
The galectin-4 target siRNA and control siRNA used in the animal test had the same sequence as in Example 5 and was prepared for in vivo use (Invitrogen). For both siRNA intraperitoneal administration groups, experiments were conducted with four mice each. In addition, two mice received only tumor cells and were set as an untreated group.
After 28 days, the tumor was subjected to laparotomy and autopsy, and the weight of the tumor was measured. The results are shown in FIG. When performing statistical processing on the untreated group + control siRNA administration group (Ci) and the galectin-4 target siRNA administration group (Gi), p = 0.017, and the tumor weight was suppressed by galectin-4 target siRNA at a significance level of 5%. It is thought that peritoneal dissemination can be suppressed by siRNA targeting galectin-4.
本発明の医薬組成物は、ガレクチン－４陽性胃がん細胞の増殖を抑制し、胃がんの抗がん剤として用いることができる。 The pharmaceutical composition of the present invention suppresses the proliferation of galectin-4-positive gastric cancer cells and can be used as an anticancer agent for gastric cancer.
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