JP2024009219A - Method for detecting cancer or determining progression stage of cancer - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
本発明は、がんを検出、又はがんの進行期を判定する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting cancer or determining the advanced stage of cancer.
通常、患者の症状や診察結果、又はスクリーニング検査の結果を元に、医師はがんを疑う。そして、さらに進んでがんの存在を確定するには、他の検査（いわゆる診断検査）が必要になる。がんであることが確定したら、病期の診断（ステージング）が行われる。病期とは、がんの大きさや隣接する組織への広がり方、又はより遠く離れたリンパ節や臓器に転移しているかどうか、といった基準でがんを分類し、進行の程度を示すものである。 Doctors usually suspect cancer based on a patient's symptoms, examination results, or screening test results. Other tests (so-called diagnostic tests) are then needed to go further and confirm the presence of cancer. Once it is determined that the patient has cancer, a diagnosis (staging) is performed. Stage is a classification of cancer based on criteria such as the size of the cancer, how it has spread to adjacent tissues, or whether it has metastasized to more distant lymph nodes or organs, and indicates the degree of progression. be.
スクリーニング検査とは、症状がまだ現れない段階で、がんがあるかどうかの可能性を調べる検査である。スクリーニング検査の結果は、通常決定的なものではないとされる。その後の診察や診断検査によってがんの診断が確定ないし否定される。診断検査は医師ががんを疑っている場合に行うものをいう。 A screening test is a test that examines the possibility of cancer even before symptoms appear. Screening test results are usually considered inconclusive. Subsequent examinations and diagnostic tests confirm or rule out the diagnosis of cancer. Diagnostic tests are those performed when a doctor suspects cancer.
各種の腫瘍マーカーが、スクリーニング検査において利用されている。特定の腫瘍が血液中に分泌する種々の物質が、腫瘍マーカーとして利用されている。しかし、がんでない生体の血液中にも、しばしばある程度の腫瘍マーカーが存在していることが明らかになってきており、腫瘍マーカーが検出されたとしてもその生体ががんを患っているとは限らないため、がんのスクリーニング検査において、この種の腫瘍マーカーが果たす役割は限定的であるとされる。 Various tumor markers are used in screening tests. Various substances secreted into the blood by specific tumors are used as tumor markers. However, it has become clear that some tumor markers are often present in the blood of non-cancerous organisms, and even if tumor markers are detected, it does not mean that the organism is suffering from cancer. Therefore, the role played by this type of tumor marker in cancer screening tests is said to be limited.
一方、がんが疑われる場合、通常、医師は最初にＸ線検査、超音波検査及びコンピュータ断層撮影等の画像検査を行う。これらの検査により異常な組織の塊の存在や位置、大きさを明らかにすることができる。しかし、そのような異常な組織塊が発見されたとしても、その原因ががんだとは確定できない。がんが確定するのは、例えば、疑わしい領域から採取した組織検体を顕微鏡で検査して、がん細胞の存在を見つけた時とされる。通常、この組織検体としては組織片、又は、場合により血液検体が用いられる。血液中の腫瘍マーカーの値を測定すると、診察所見又は画像検査等によるがんの診断を支持するデータやそれに反するデータが得られることがある。 On the other hand, when cancer is suspected, doctors usually first perform imaging tests such as X-rays, ultrasounds, and computed tomography. These tests can reveal the presence, location, and size of abnormal tissue masses. However, even if such an abnormal tissue mass is discovered, it cannot be determined that the cause is cancer. Cancer is confirmed, for example, when a tissue sample taken from a suspected area is examined under a microscope and the presence of cancer cells is detected. Usually, a tissue piece or, in some cases, a blood sample is used as this tissue sample. Measuring the values of tumor markers in blood may yield data that supports or contradicts a cancer diagnosis based on medical examination findings or image tests.
本発明は、がんを検出、又はがんの進行期を判定する、新しい方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a new method for detecting cancer or determining the advanced stage of cancer.
本発明者らは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の分子修飾をがんの検出、及びがんの進行期のバイオマーカーとして利用できるのではないかとの独自の着想に基づいて検討を行い、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２１、Ｌｅｔ－７ａ及びｍｉＲ－１７の四種のｍｉＲＮＡのメチル化の程度が、がんの存在、及びがんの進行期と関連していることを突き止めた。本発明者らは、かかる知見に基づき、さらに試行錯誤を重ねることにより本発明を完成するに至った。 The present inventors conducted an investigation based on the original idea that molecular modification of microRNA (miRNA) could be used for cancer detection and as a biomarker for the advanced stage of cancer, and found that miR-200c We found that the degree of methylation of four types of miRNA, miR-21, Let-7a, and miR-17, is associated with the presence of cancer and the advanced stage of cancer. Based on this knowledge, the present inventors completed the present invention through repeated trial and error.
すなわち、本発明は、下記の態様を含む。
項１．
がんを検出、又はがんの進行期を判定する方法であって、
（１）組織検体又は細胞における、以下のｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも一種のｍｉＲＮＡにおけるメチル化の程度を測定する工程；及び
（２－１）前記工程（１）で測定したｍｉＲＮＡのメチル化の程度に基づいて、当該組織検体が、がん組織由来である、若しくは、特定のがん進行期の組織由来である、と判定する工程；又は
（２－２）前記工程（１）で測定したｍｉＲＮＡのメチル化の程度に基づいて、当該細胞が、がん細胞である、若しくは、特定のがん進行期の細胞である、と判定する工程
を含む方法：
ｍｉＲ－２００ｃ；
ｍｉＲ－２１；
Ｌｅｔ－７ａ；及び
ｍｉＲ－１７。
項２．
前記工程（１）で測定するｍｉＲＮＡのメチル化の程度が、以下のｍｉＲＮＡ上の塩基からなる群より選択される少なくとも一種の塩基におけるメチル化の程度である、項１に記載の方法：
ｍｉＲ－２００ｃの第９番目のシトシン；
ｍｉＲ－２１の第９番目のシトシン；
Ｌｅｔ－７ａの第１９番目のアデニン；及び
ｍｉＲ－１７の第１３番目のアデニン。
項３．
前記工程（１）における、メチル化の程度の測定を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳ）を利用して行う、項１又は２に記載の方法。
項４．
前記組織検体として、血清又は血漿を用いる、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
That is, the present invention includes the following aspects.
Item 1.
A method for detecting cancer or determining the advanced stage of cancer, the method comprising:
(1) Measuring the degree of methylation in at least one type of miRNA selected from the group consisting of the following miRNAs in a tissue specimen or cell; and (2-1) Methyl methylation of the miRNA measured in step (1) above. or (2-2) in step (1) above, determining that the tissue specimen is derived from a cancer tissue or a tissue at a specific cancer stage based on the degree of A method comprising the step of determining that the cell is a cancer cell or a cell at a specific cancer stage based on the measured degree of miRNA methylation:
miR-200c;
miR-21;
Let-7a; and miR-17.
Item 2.
The method according to item 1, wherein the degree of methylation of miRNA measured in the step (1) is the degree of methylation at at least one base selected from the group consisting of the following bases on miRNA:
9th cytosine of miR-200c;
9th cytosine of miR-21;
adenine at position 19 of Let-7a; and adenine at position 13 of miR-17.
Item 3.
The method according to item 1 or 2, wherein the measurement of the degree of methylation in step (1) is performed using a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS/MS). .
Item 4.
4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein serum or plasma is used as the tissue specimen.
本発明によれば、がんを検出、又はがんの進行期を判定する、新しい方法を提供できる。特に、例えばステージＩ等のような早期のがんも診断できる方法を提供できる。 According to the present invention, a new method for detecting cancer or determining the advanced stage of cancer can be provided. In particular, it is possible to provide a method that can diagnose early stage cancer, such as stage I cancer.
１． 組織検体又は細胞
組織検体又は細胞は、特に限定されず、哺乳動物由来のものを幅広く使用することができる。組織検体又は細胞は、好ましくは、ヒト由来である。
1. tissue specimen or cells
The tissue specimen or cells are not particularly limited, and a wide variety of mammalian-derived tissue specimens can be used. The tissue specimen or cells are preferably of human origin.
組織検体としては、特に限定されず、幅広く使用できる。組織検体としては、非侵襲的に採取できるという点で、好ましくは、血清、血漿、唾液、尿、胆汁及び糞便等を用いることができる。これらの中でも、血清及び血漿が好ましい。血清及び血漿は、例えば末梢血由来のものを使用できる。 The tissue specimen is not particularly limited and can be used in a wide variety of ways. Preferably, serum, plasma, saliva, urine, bile, feces, etc. can be used as the tissue specimen since they can be collected non-invasively. Among these, serum and plasma are preferred. Serum and plasma derived from peripheral blood can be used, for example.
血清、血漿、唾液、尿、胆汁及び糞便等において、本発明の方法によりがんが検出された場合には、画像検査等の別の診断方法の結果と照らし合わせることにより、どの部位のがんであるのかを判定することができる。 When cancer is detected in serum, plasma, saliva, urine, bile, feces, etc. using the method of the present invention, it is possible to determine which site the cancer is in by comparing it with the results of another diagnostic method such as an image test. It is possible to determine whether there is
がんが疑われる組織に由来する組織検体を使用して本発明の判定を行うことにより、その組織ががんであるか否か、及び／又はその組織のがん進行期を判定することができる。 By performing the determination of the present invention using a tissue sample derived from a tissue suspected of being cancerous, it is possible to determine whether the tissue is cancerous and/or the stage of cancer progression of the tissue. .
２． ｍｉＲＮＡ
本発明では、以下のｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも一種のｍｉＲＮＡにおけるメチル化の程度を測定する。括弧内にそれぞれの塩基配列を示した配列番号を示す。
ｍｉＲ－２００ｃ（配列番号１）
ｍｉＲ－２１（配列番号２）
Ｌｅｔ－７ａ（配列番号３）
ｍｉＲ－１７（配列番号４）
2. miRNA
In the present invention, the degree of methylation in at least one type of miRNA selected from the group consisting of the following miRNAs is measured. The sequence number showing each base sequence is shown in parentheses.
miR-200c (SEQ ID NO: 1)
miR-21 (SEQ ID NO: 2)
Let-7a (SEQ ID NO: 3)
miR-17 (SEQ ID NO: 4)
より具体的には、以下のｍｉＲＮＡ上の塩基からなる群より選択される少なくとも一種の塩基におけるメチル化の程度を測定する。特に限定されないが、一例として、以下が挙げられる。括弧内にそれぞれどの位置がメチル化されているのかを示す。 More specifically, the degree of methylation in at least one base selected from the group consisting of the following bases on miRNA is measured. Although not particularly limited, examples include the following. The methylated positions are shown in parentheses.
ｍｉＲ－２００ｃの第９番目のシトシン［シトシン５位のメチル化（ｍ５Ｃ）］
ｍｉＲ－２１の第９番目のシトシン［シトシン５位のメチル化（ｍ５Ｃ）］
Ｌｅｔ－７ａの第１９番目のアデニン［アデニン６位のＮのメチル化（ｍ６Ａ）］
ｍｉＲ－１７の第１３番目のアデニン［アデニン６位のＮのメチル化（ｍ６Ａ）］
9th cytosine of miR-200c [methylation of cytosine 5th position (m5C)]
9th cytosine of miR-21 [methylation of cytosine 5th position (m5C)]
Adenine at position 19 of Let-7a [methylation of N at position 6 of adenine (m6A)]
Adenine at position 13 of miR-17 [methylation of N at position 6 of adenine (m6A)]
上記４種のｍｉＲＮＡ群の全てについてメチル化の程度を測定してもよいし、一部のみについて測定してもよい。一般に、検出及び判定における高い精度が求められる場合には、より多くのｍｉＲＮＡについて測定を行うことが好ましい。複数種のｍｉＲＮＡについて測定を行う場合、検出及び判定の精度、並びに作業効率等を考慮し、例えば、上記４種のｍｉＲＮＡ群から選択される２～４種、又は２～３種におけるメチル化の程度を測定することができる。 The degree of methylation may be measured for all of the above four miRNA groups, or only for some of them. Generally, when high accuracy in detection and determination is required, it is preferable to measure a larger number of miRNAs. When measuring multiple types of miRNA, for example, methylation of 2 to 4 types or 2 to 3 types selected from the above 4 types of miRNA groups should be considered, considering the accuracy of detection and determination, work efficiency, etc. The degree can be measured.
３． メチル化の程度の測定方法
ｍｉＲＮＡにおけるメチル化の程度を測定する方法は、特に限定されず、幅広い手法の中から選択することができる。
3. How to measure the degree of methylation
The method for measuring the degree of methylation in miRNA is not particularly limited and can be selected from a wide variety of methods.
測定方法としては、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳ）を利用する方法の他、バイサルファイトシークエンスや、メチル化ＲＮＡ免疫沈降シークエンス等が利用できる。 As a measurement method, for example, in addition to a method using a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS/MS), bisulfite sequencing, methylated RNA immunoprecipitation sequencing, etc. can be used. .
測定方法としては、ｍ５Ｃとｍ６Ａという複数種の分子修飾、すなわち、特定部位のメ
チル化、を一度に検出できるという点、プロセスが簡素であるという点、及び低コストである点において、特にＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳを利用する方法が好ましい。
As a measurement method, MALDI-1 is particularly effective because it can detect multiple types of molecular modifications, m5C and m6A, in other words, methylation at specific sites at the same time, the process is simple, and the cost is low. A method using TOF-MS/MS is preferred.
本発明において、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳを利用する方法は、具体的には以下のようにして行うことができる。 In the present invention, the method using MALDI-TOF-MS/MS can be specifically performed as follows.
まず、組織検体又は細胞から、適当な方法を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。続いて、目的のｍｉＲＮＡと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（相補塩基オリゴ）を表面に有するビーズを用いて、得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡの中から目的のｍｉＲＮＡを捕捉する。 First, total RNA is extracted from a tissue specimen or cells using an appropriate method. Subsequently, the target miRNA is captured from the obtained total RNA using beads having on the surface an oligonucleotide (complementary base oligo) having a sequence complementary to the target miRNA.
次に、単離されたｍｉＲＮＡを、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳを利用して分析する。メチル化された塩基は、メチル化されていない場合と比べ、マススペクトル上のピークが＋１４ｋＤａシフトする。このことを利用してメチル化の程度を測定することできる。具体的には、標的塩基について、メチル化されていない塩基由来のピークに対する、メチル化されている塩基由来のピーク（これらは互いにマススペクトル上１４ｋＤａ離間している）の比率を算出することにより、単離されたｍｉＲＮＡ全体における、メチル化されているｍｉＲＮＡの割合を算出することができる。 Next, the isolated miRNA is analyzed using MALDI-TOF-MS/MS. The peak on the mass spectrum of a methylated base shifts by +14 kDa compared to an unmethylated base. Using this fact, the degree of methylation can be measured. Specifically, for the target base, by calculating the ratio of the peak derived from the methylated base to the peak derived from the unmethylated base (these are separated from each other by 14 kDa on the mass spectrum), The proportion of methylated miRNAs in all isolated miRNAs can be calculated.
４． 判定工程
本発明者らの検討により、メチル化の程度と、がんの進行期との間に正の相関がみられることが明らかとなっている。このため、本発明の方法に供した組織検体が、がん組織由来である、若しくは、特定のがん進行期の組織由来である、と判定することが可能となる。あるいは、本発明の方法に供した細胞が、がん細胞である、若しくは、特定のがん進行期の細胞である、と判定することも可能となる。この場合、メチル化の程度がより高いほど、がんの進行期がより後期であることが示唆されているといえる。
4. Judgment process
Studies by the present inventors have revealed that there is a positive correlation between the degree of methylation and the advanced stage of cancer. Therefore, it is possible to determine that the tissue specimen subjected to the method of the present invention is derived from cancer tissue or from tissue at a specific cancer stage. Alternatively, it is also possible to determine that the cells subjected to the method of the present invention are cancer cells or cells in a specific advanced stage of cancer. In this case, it can be said that the higher the degree of methylation, the more advanced the cancer is.
本発明の方法は、特に、例えばステージＩ等のような、早期のがんを診断できるという点で有用である。 The method of the present invention is particularly useful in that it can diagnose cancer at an early stage, such as stage I.
本発明の方法により判定が可能ながんは、特に限定されず、上皮性腫瘍又は非上皮性腫瘍であってもよい。 Cancers that can be determined by the method of the present invention are not particularly limited, and may be epithelial tumors or non-epithelial tumors.
上皮性腫瘍としては、特に限定されず、例えば、消化器がん及び一部の乳がん等が挙げられる。 Epithelial tumors are not particularly limited, and include, for example, gastrointestinal cancers and some breast cancers.
消化器がんとしては、特に限定されず、例えば、大腸がん、直腸がん、胆嚢がん、胃がん、膵がん及び肝臓がん等が挙げられる。 Gastrointestinal cancers are not particularly limited, and include, for example, colon cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, liver cancer, and the like.
非上皮性腫瘍としては、特に限定されず、例えば、白血病、悪性リンパ腫、脳腫瘍、（骨）肉腫及び一部の乳がん等が挙げられる。 Non-epithelial tumors are not particularly limited, and include, for example, leukemia, malignant lymphoma, brain tumors, (osteo)sarcomas, and some breast cancers.
以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically explained with reference to Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited thereto.
Ａ．実施例１
１．組織検体の調製
事前にインフォームド・コンセントを得たヒト患者より大腸がんの組織検体を手術時に採取した。なお、悪性腫瘍領域から５ｃｍ超離間した領域から、健常組織として組織検体
を同時に採取した。また、直腸がんについても同様に組織検体を一組用意した。
A. Example 1
1. Preparation of tissue specimens
Colon cancer tissue samples were collected during surgery from human patients who had given informed consent in advance. Note that a tissue sample was simultaneously collected as healthy tissue from an area more than 5 cm away from the malignant tumor area. A set of tissue specimens for rectal cancer was also prepared in the same manner.
２．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社）を用い、製品プロトコールに沿って各組織検体からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
2. Preparation of total RNA
Total RNA was extracted from each tissue specimen using TRIzol (Invitrogen) according to the product protocol.
続いて、目的のｍｉＲＮＡと相補的な配列を有するオリゴＤＮＡを表面に有するビーズを用いて、得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡの中から目的のｍｉＲＮＡを捕捉した。このオリゴＤＮＡは、５’末端がＣ６リンカーを介してアミンで修飾されている。ＲＮＡとオリゴＤＮＡを混合後、９５℃まで加熱した後、ゆっくりと３０℃まで冷却した。得られたＲＮＡ－ＤＮＡ複合体を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２７０ Ａｍｉｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）とともに４℃にて１時間インキュベートした。 Subsequently, the target miRNA was captured from the obtained total RNA using beads having oligo DNA on the surface having a sequence complementary to the target miRNA. The 5' end of this oligo DNA is modified with an amine via a C6 linker. After mixing RNA and oligo DNA, the mixture was heated to 95°C and then slowly cooled to 30°C. The resulting RNA-DNA complex was incubated with Dynabeads® M-270 Amine (Thermo Fisher Scientific) for 1 hour at 4°C.
インキュベート後、熱で複合体を抽出し、磁性分離を経て捕捉されたｍｉＲＮＡを含む上清を得た。これを凍結乾燥後、以後の操作に用いた。 After incubation, the complex was extracted with heat, and a supernatant containing the captured miRNA was obtained through magnetic separation. This was lyophilized and used for subsequent operations.
目的のｍｉＲＮＡを捕捉する工程のイメージを図１（上段部分）に示した。 An image of the process of capturing the target miRNA is shown in Figure 1 (upper part).
３．ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ解析
Ｚｉｐ Ｔｉｐ Ｃ１８（ミリポア社）を用い、製品プロトコールに沿って、捕捉されたｍｉＲＮＡを精製した。これを、３－ヒドロキシピコリン酸（３－ＨＰＡ；ブルカーダルトニクス社）と、容積比１：１で混合し、ＭＴＰ ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ ３８４ ｔａｒｇｅｔ ｐｌａｔｅ（ブルカーダルトニクス社）上にアプライし、室温で風乾させた。
3. MALDI-TOF-MS analysis
The captured miRNA was purified using Zip Tip C18 (Millipore) according to the product protocol. This was mixed with 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA; Bruker Daltonics) at a volume ratio of 1:1, applied onto an MTP AnchorChip 384 target plate (Bruker Daltonics), and air-dried at room temperature. .
ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ マススペクトロメーター（ブルカーダルトニクス社）を用い、ネガティブイオン・モード、レフレクション・モードにてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ解析を行った。ソフトウエアＦｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌ（ヴァージョン３．4．１３５．０）（ブルカーダルトニクス社）を用い、マニュアルで
スペクトルデータを収集した。メチル化シトシンに関しては、ハイドラジン処理されたＲＮＡを用いてさらなる分析を行い、ピークがｍ５Ｃを含むことを確認した。メチル化アデニンに関しては、硫酸ジメチル処理されたＲＮＡを用いたシークエンシャルＭＳ解析により、ｍ６Ａであることを確認した。
MALDI-TOF-MS analysis was performed in negative ion mode and reflection mode using an ultraFleXtreme MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics). Spectral data were collected manually using the software FlexControl (version 3.4.135.0) (Bruker Daltonics). Regarding methylated cytosine, further analysis was performed using hydrazine-treated RNA and confirmed that the peak contained m5C. Regarding methylated adenine, it was confirmed to be m6A by sequential MS analysis using RNA treated with dimethyl sulfate.
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ解析のイメージを図１（下段部分）に示した。 An image of MALDI-TOF-MS analysis is shown in Figure 1 (lower part).
一例として、ｍｉＲ－２００ｃについての測定結果を図２に示す。このように、単離されたｍｉＲＮＡについてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳ解析を行うと、メチル化された塩基は、メチル化されていない場合と比べ、マススペクトル上のピークが＋１４ｋＤａシフトすることが判った。同様の現象が、他のｍｉＲＮＡについても確認されている。このことを利用してメチル化の程度を測定することできることが判った。具体的には、標的塩基について、メチル化されていない塩基由来のピークに対する、メチル化されている塩基由来のピーク（これらは互いにマススペクトル上１４ｋＤａ離間している）の比率（以下「メチル化率」ということがある。）を算出することにより、単離されたｍｉＲＮＡ全体における、メチル化されているｍｉＲＮＡの割合を算出することができることが判った。 As an example, the measurement results for miR-200c are shown in FIG. When MALDI-TOF-MS/MS analysis was performed on isolated miRNAs, it was found that methylated bases shift the peak on the mass spectrum by +14 kDa compared to unmethylated bases. Ta. Similar phenomena have been confirmed for other miRNAs. It was found that the degree of methylation can be measured using this fact. Specifically, for a target base, the ratio of peaks derived from methylated bases (these are separated by 14 kDa from each other on the mass spectrum) to the peak derived from unmethylated bases (hereinafter referred to as "methylation rate") It has been found that by calculating the ratio of methylated miRNAs in all isolated miRNAs, it is possible to calculate the percentage of methylated miRNAs in all isolated miRNAs.
網羅的に解析した結果、メチル化率が、正常部位に比べ、がん部位において有意に高くなっているｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－２００ｃ（配列番号１）、ｍｉＲ－２１（配列番号２）、Ｌｅｔ－７ａ（配列番号３）及びｍｉＲ－１７（配列番号４）が見出された。 As a result of comprehensive analysis, miRNAs whose methylation rate was significantly higher in cancer sites than in normal sites were miR-200c (SEQ ID NO: 1), miR-21 (SEQ ID NO: 2), and Let- 7a (SEQ ID NO: 3) and miR-17 (SEQ ID NO: 4) were found.
これら四種のｍｉＲＮＡについて、正常部位及びがん部位それぞれにおけるメチル化率（％）と、ｍｉＲＮＡ発現量（ｌｏｇ １０）とを測定した結果を図３に示す（＊Ｐ＜０．０５）。ｍｉＲＮＡ発現量は、ｑＲＴ－ＰＣＲ法により求めた。 The results of measuring the methylation rate (%) and miRNA expression level (log 10) in normal sites and cancer sites for these four types of miRNA are shown in FIG. 3 ( * P<0.05). The miRNA expression level was determined by qRT-PCR method.
ｑＲＴ－ＰＣＲ法は以下のようにして行った。ＴａｑＭａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ及びＴａｑＭａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ
ａｓｓａｙｓ（ともにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、製品プロトコールに沿って操作を行った。ＰＣＲマスターミックスとしてはＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）を用いた。
The qRT-PCR method was performed as follows. TaqMan microRNA reverse transcription kit and TaqMan microRNA
Assays (both manufactured by Applied Biosystems) were used in accordance with the product protocol. THUNDERBIRD (registered trademark) SYBR (registered trademark) qPCR Mix (Toyobo Co., Ltd.) was used as a PCR master mix.
使用プライマーを以下に示す。 The primers used are shown below.
ＧＡＰＤＨ：
Forward5′-agccacatcgctcagacac-3′（配列番号５）
Reverse5′-gcccaatacgaccaaatcc-3′（配列番号６）
ＭＥＴＴＬ３：
Forward5′- cgtactacaggatgatggctttc -3′（配列番号７）
Reverse5′- tttcatctacccgttcataccc -3′（配列番号８）
ＤＮＭＴ１：
Forward5′- caaacccctttccaaacctc -3′（配列番号９）
Reverse5′- taatcctggggctaggtgaa -3′（配列番号１０）
ＤＮＭＴ２：
Forward5′- gacattgttcagcccacttgta -3′（配列番号１１）
Reverse5′- taacacagaccctgtcccttct -3′（配列番号１２）
ＤＮＭＴ３Ａ：
Forward5′- accagcattttcctgtcttcat -3′（配列番号１３）
Reverse5′- actgggaaaccaaatacccttt -3′（配列番号１４）
ＤＮＭＴ３Ｂ：
Forward5′- gataaactcgagctgcaggact -3′（配列番号１５）
Reverse5′- tcatgacaacagggaaaagttg -3′（配列番号１６）
ＮＳＵＮ２：
Forward5′- aagaaaaggcagctctacatgg -3′（配列番号１７）
Reverse5′- caccgctgttatttctacacca -3′（配列番号１８）
ＭＹＣ：
Forward5′- gctgcttagacgctggattt -3′（配列番号１９）
Reverse5′- taacgttgaggggcatcg -3′（配列番号２０）
GAPDH:
Forward5′-agccacatcgctcagacac-3′ (SEQ ID NO: 5)
Reverse5′-gcccaatacgaccaaatcc-3′ (SEQ ID NO: 6)
METTL3:
Forward5′- cgtactacaggatgatggctttc -3′ (SEQ ID NO: 7)
Reverse5′- tttcatctacccgttcataccc -3′ (SEQ ID NO: 8)
DNMT1:
Forward5′- caaacccctttccaaacctc -3′ (SEQ ID NO: 9)
Reverse5′- taatcctggggctaggtgaa -3′ (SEQ ID NO: 10)
DNMT2:
Forward5′- gacattgttcagcccacttgta -3′ (SEQ ID NO: 11)
Reverse5′- taacacagaccctgtcccttct -3′ (SEQ ID NO: 12)
DNMT3A:
Forward5′- accagcattttcctgtcttcat -3′ (SEQ ID NO: 13)
Reverse5′- actgggaaaccaaatacccttt -3′ (SEQ ID NO: 14)
DNMT3B:
Forward5′- gataaactcgagctgcaggact -3′ (SEQ ID NO: 15)
Reverse5′- tcatgacaacagggaaaagttg -3′ (SEQ ID NO: 16)
NSUN2:
Forward5′- aagaaaaggcagctctacatgg -3′ (SEQ ID NO: 17)
Reverse5′- caccgctgttatttctacacca -3′ (SEQ ID NO: 18)
MYC:
Forward5′- gctgcttagacgctggattt -3′ (SEQ ID NO: 19)
Reverse5′- taacgttgaggggcatcg -3′ (SEQ ID NO: 20)
また、がん進行期と、メチル化率との間に正の相関があることも判った。一例として、直腸がんにおいて、ステージＩとＩＶにおけるメチル化率を、上記４種のｍｉＲＮＡにおいて測定した結果を図４に示す。ステージＩＶにおけるメチル化率のほうが、ステージＩにおけるよりも高くなっている傾向があることが判った。 It was also found that there was a positive correlation between cancer stage and methylation rate. As an example, FIG. 4 shows the results of measuring the methylation rates of the four types of miRNAs described above in stages I and IV in rectal cancer. It was found that the methylation rate in stage IV tends to be higher than in stage I.
Ｂ．実施例２
実施例１と同様に、胃がんの組織検体におけるｍｉＲＮＡメチル化を定量化した。コントロールとして、同一患者から採取した健常組織を用いた。
B. Example 2
As in Example 1, miRNA methylation in gastric cancer tissue specimens was quantified. As a control, healthy tissue collected from the same patient was used.
結果を図５に示す。正常部位に比べ、がん部位においてｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２１、Ｌｅｔ－７ａ及びｍｉＲ－１７のメチル化の程度がいずれも有意に高くなっていることが判った。 The results are shown in FIG. It was found that the methylation levels of miR-200c, miR-21, Let-7a, and miR-17 were all significantly higher in cancer sites than in normal sites.
Ｃ．実施例３
膵がん患者から採取した血清検体を用いて、実施例１と同様の方法によりｍｉＲＮＡメチル化を定量化した。コントロールとして、健常者の血清検体を用いた。
C. Example 3
miRNA methylation was quantified by the same method as in Example 1 using serum samples collected from pancreatic cancer patients. As a control, serum samples from healthy individuals were used.
ｍｉＲ－１７について定量化した結果を図６に示す。ｍｉＲ－１７のメチル化は、膵がんの全ての血清検体において検出されたが、健常検体においては検出されないか、メチル化の程度が低かった。 The results of quantifying miR-17 are shown in FIG. Methylation of miR-17 was detected in all serum samples from pancreatic cancer patients, but it was not detected or the degree of methylation was low in healthy samples.
また、既存の膵がんマーカーであるＣＡ１９－９及びＣＥＡによる判定結果（図６）と比較して、ｍｉＲ－１７のメチル化の程度は、膵がんの検出という意味ではより正確な指標となりうることが判った（図７）。なお、図７は、横軸に偽陽性率（１－特異度）、縦軸に真陽性率（感度）をプロットした、いわゆるＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）曲線である。 Furthermore, compared to the determination results using existing pancreatic cancer markers CA19-9 and CEA (Figure 6), the degree of methylation of miR-17 is a more accurate indicator for detecting pancreatic cancer. It was found that this was possible (Figure 7). Note that FIG. 7 is a so-called ROC (Receiver operating characteristics) curve in which the false positive rate (1-specificity) is plotted on the horizontal axis and the true positive rate (sensitivity) is plotted on the vertical axis.
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