JP2024008528A - Reverse transcription method without use of manganese - Google Patents

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哲大 小林
Tetsudai Kobayashi
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Abstract

To provide a method that performs a reverse transcription reaction using a nucleic acid polymerase with reverse transcription activity, without using manganese.SOLUTION: It has been discovered that modifying an amino acid corresponding to a 751-position of a DNA polymerase derived from Thermus thermophilus or a DNA polymerase derived from Themus sp Z05 enables an efficient reverse transcription reaction and a nucleic acid amplification method involving the reverse transcription reaction (for example, a RT-PCR method) even in a reaction solution free of Mn2+. The present invention provides a method, a composition or the like using the modified nucleic acid polymerase.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、マンガン(Mn)を使用せずに逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼで逆転写反応を行う方法及びこの逆転写反応を利用した核酸増幅方法(例えば、RT-PCR方法)等に関する。本発明は、研究分野のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。 The present invention relates to a method for performing a reverse transcription reaction using a nucleic acid polymerase having reverse transcription activity without using manganese (Mn), and a nucleic acid amplification method (for example, an RT-PCR method) using this reverse transcription reaction. The present invention can be used not only in the research field but also in clinical diagnosis, environmental testing, etc.

核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。 Nucleic acid amplification is a technology that amplifies a few copies of a target nucleic acid to a visible level, that is, hundreds of millions of copies or more, and it is used not only in the life science research field, but also in the medical field such as genetic diagnosis and clinical testing, as well as in foods and the environment. It is also widely used in microbial testing, etc.

代表的な核酸増幅法であるPCR(Polymerase Chain Reaction)は、(1)熱処理によるDNA変性(2本鎖DNAから1本鎖DNAへの解離)、(2)鋳型1本鎖DNAへのプライマーのアニーリング、(3)DNAポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という3ステップを1サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。 PCR (Polymerase Chain Reaction), a typical nucleic acid amplification method, involves (1) DNA denaturation by heat treatment (dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA), (2) incorporation of primers into template single-stranded DNA. This is a method of amplifying a target nucleic acid in a sample by repeating the three steps of annealing and (3) extension of the primer using DNA polymerase as one cycle, and repeating this cycle.

標的核酸がRNAである場合(例えば、病原性微生物の検出においてRNAウイルスを検出対象とする場合、あるいは遺伝子の発現量をmRNAの定量によって測定する場合など)では、逆転写酵素によりRNAをcDNAに変換する逆転写反応をPCRの前に行うRT-PCRも広く用いられている。 When the target nucleic acid is RNA (for example, when RNA viruses are to be detected in the detection of pathogenic microorganisms, or when gene expression levels are measured by quantifying mRNA), reverse transcriptase is used to convert RNA into cDNA. RT-PCR, in which a reverse transcription reaction for conversion is performed before PCR, is also widely used.

RT-PCRにおいては、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼの2種類の酵素を用いる2酵素系のRT-PCRと、逆転写活性を持つDNAポリメラーゼを用いる1酵素系のRT-PCRが存在する。2酵素系のRT-PCRは、逆転写酵素が高い逆転写活性を持つため、効率的なRTを可能にする。しかしながら、逆転写酵素は一般的に耐熱性を持たないものが多く、RNAが二次構造をとる場合は、十分な逆転写反応ができないことが知られている。またRT-PCRを連続的に実施する場合は、逆転写酵素とDNAポリメラーゼの2つの酵素の最適化が必要であり、各酵素の選択やそれらの最適な反応条件の検討等に時間を要していた。一方、1酵素系のRT-PCRは、一般に耐熱性を有するDNAポリメラーゼを用いて実施するため、二次構造を形成できない高温での逆転写を可能にする。しかしながら、DNAポリメラーゼによる逆転写活性は逆転写酵素と比較すると低いことが知られており、さらなる改善が求められていた。 In RT-PCR, there are two-enzyme RT-PCR, which uses two types of enzymes, reverse transcriptase and DNA polymerase, and one-enzyme RT-PCR, which uses DNA polymerase with reverse transcription activity. Two-enzyme RT-PCR enables efficient RT because reverse transcriptase has high reverse transcription activity. However, it is known that many reverse transcriptases generally do not have heat resistance, and that if RNA has a secondary structure, a sufficient reverse transcription reaction cannot be carried out. Furthermore, when performing RT-PCR continuously, it is necessary to optimize two enzymes, reverse transcriptase and DNA polymerase, and it takes time to select each enzyme and consider their optimal reaction conditions. was. On the other hand, single-enzyme RT-PCR is generally carried out using a thermostable DNA polymerase, and therefore enables reverse transcription at high temperatures where secondary structures cannot be formed. However, it is known that the reverse transcription activity of DNA polymerase is lower than that of reverse transcriptase, and further improvements have been desired.

DNAポリメラーゼとして汎用されるTaq DNAポリメラーゼは、マグネシウムイオン(Mg2+)存在下で微弱ながら逆転写活性を持つが、その効率は非常に低く(非特許文献1)、実用上十分な逆転写反応を行うことはできない。逆転写活性を有するDNAポリメラーゼとしては、Thermus thermophilus HB8(サーマス・サーモフィルス HB8)由来のDNAポリメラーゼ(Tth)やThemus sp Z05由来のDNAポリメラーゼ(Z05)などがこれまでに知られている。これらの酵素はマンガンイオン(Mn2+)存在下で強い逆転写活性を示すことができるが、Mn2+以外の2価イオンでは逆転写活性が非常に弱いとされている(非特許文献2)。従って、これらの逆転写活性を有するDNAポリメラーゼを用いて十分な効率で逆転写反応を行う場合には、マンガンイオンを共存させることが必須と考えられていた。例えば、特許文献1、2では、逆転写活性を有する改変されたDNAポリメラーゼを用いた実施例において、酢酸マンガン(Mn(OAc))を一緒に用いるTth DNA Polymerase RT-PCR Buffer(Roche製、非特許文献3)を使用して逆転写反応の評価を行ったことを記載している。 Taq DNA polymerase, which is commonly used as a DNA polymerase, has a weak reverse transcription activity in the presence of magnesium ions (Mg 2+ ), but its efficiency is very low (Non-Patent Document 1), making it difficult to perform a reverse transcription reaction that is sufficient for practical use. It cannot be done. As DNA polymerases having reverse transcription activity, DNA polymerases derived from Themus thermophilus HB8 (Tth) and DNA polymerases derived from Themus sp Z05 (Z05) have been known so far. Although these enzymes can exhibit strong reverse transcription activity in the presence of manganese ions (Mn 2+ ), it is said that their reverse transcription activity is very weak in the presence of divalent ions other than Mn 2+ (Non-Patent Document 2). Therefore, in order to carry out a reverse transcription reaction with sufficient efficiency using these DNA polymerases having reverse transcription activity, it has been thought that it is essential to have manganese ions present. For example , in Patent Documents 1 and 2, in an example using a modified DNA polymerase having reverse transcription activity, Tth DNA Polymerase RT-PCR Buffer (manufactured by Roche, It is described that the reverse transcription reaction was evaluated using Non-Patent Document 3).

マンガンは環境等への有害性が懸念されており、マンガンを使用せずに反応させることができる手法の開発が望まれている。また、マンガン存在下ではDNAポリメラーゼの忠実性が低下する場合があることが知られており、忠実性の面からもマンガンを使用せずに効率よく反応させることが望まれている。 There are concerns that manganese may be harmful to the environment, and there is a desire to develop a method that allows the reaction to occur without using manganese. Furthermore, it is known that the fidelity of DNA polymerase may decrease in the presence of manganese, and from the viewpoint of fidelity, it is desired to carry out the reaction efficiently without using manganese.

これまでに、PCRやRT-PCRにおいてパフォーマンスを向上させるため、DNAポリメラーゼの改良が種々実施されている。例えば、特許文献3では、野生型Thermus aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼのアミノ酸配列に特定の変異を入れることにより、マンガンを使用せずに、マグネシウムイオン共存下で効率的な逆転写を可能にすると記載している。しかし、その性能は実用上まだ十分ではなく、更なる改善が求められていた。 To date, various improvements have been made to DNA polymerases in order to improve performance in PCR and RT-PCR. For example, Patent Document 3 describes that by introducing a specific mutation into the amino acid sequence of wild-type Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase, efficient reverse transcription is enabled in the presence of magnesium ions without using manganese. are doing. However, its performance was still insufficient for practical use, and further improvements were required.

特開2020-162509号公報Japanese Patent Application Publication No. 2020-162509 特開2020-162510号公報JP2020-162510A 特許第4468919号公報Patent No. 4468919

Nucleic Acids Research 1989 Sep 176:8387-8388Nucleic Acids Research 1989 Sep 176:8387-8388 Biochemistry. 1991 Aug 6;30(31):7661-6.Biochemistry. 1991 Aug 6;30(31):7661-6. Tth DNA Polymerase(Cat.No.11 480 022 001 Product Information Sheet(製品情報シート)、Roche Diagnostics GmbH社)Tth DNA Polymerase (Cat. No. 11 480 022 001 Product Information Sheet, Roche Diagnostics GmbH)

本発明は上記の従来技術に鑑みてなされたものであり、マンガンを使用せずに、逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼで効率的に逆転写反応を行う方法を提供することを目的とする。また、マンガンイオン不存在下において、RNAから効率よく逆転写し、その逆転写産物から核酸増幅する方法の提供等を更なる目的とする。 The present invention has been made in view of the above-mentioned prior art, and an object of the present invention is to provide a method for efficiently carrying out a reverse transcription reaction using a nucleic acid polymerase having reverse transcription activity without using manganese. A further object of the present invention is to provide a method for efficiently reverse transcribing RNA and amplifying nucleic acids from the reverse transcription product in the absence of manganese ions.

本発明者は、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、Thermus thermophilus(サーマス・サーモフィルス)由来のDNAポリメラーゼ(Tth DNAポリメラーゼ、配列番号1)又はThemus sp Z05由来のDNAポリメラーゼ(Z05 DNAポリメラーゼ、配列番号2)の特定部位におけるアミノ酸を改変することで、マンガンイオン(Mn2+)を含まない反応液中でも効率的な逆転写反応及びRT-PCR反応を行うことが可能であることを見出し、更に検討を重ねて、本発明を完成するに至った。 In view of the above circumstances, the present inventors conducted extensive research and found that a DNA polymerase derived from Thermus thermophilus (Tth DNA polymerase, SEQ ID NO: 1) or a DNA polymerase derived from Themus sp Z05 (Z05 DNA polymerase) , SEQ ID NO: 2), it has been discovered that efficient reverse transcription and RT-PCR reactions can be performed even in a reaction solution that does not contain manganese ions (Mn 2+ ). After further study, the present invention was completed.

代表的な本願発明は、以下の通りである。
[項1] 配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、751位に相当する部位のアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて、マンガンイオン不存在下でRNAからcDNAを合成する逆転写反応を行う、逆転写方法。
[項2] 前記核酸ポリメラーゼが、配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と96%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、751位に相当するアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている核酸ポリメラーゼである、項1に記載の逆転写方法。
[項3] 前記核酸ポリメラーゼが、配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列において751位に相当するアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている核酸ポリメラーゼである、項1又は2に記載の逆転写方法。
[項4] 前記核酸ポリメラーゼをマグネシウムイオン共存下で反応させる、項1~3のいずれかに記載の逆転写方法。
[項5] 精製工程を経ていない生体試料を用いて逆転写反応を行う、項1~4のいずれかに記載の逆転写方法。
[項6] 逆転写反応を5分以下で行う、項1~5のいずれかに記載の逆転写方法。
[項7] 前記核酸ポリメラーゼが、更に、509位及び744位からなる群より選択される少なくとも一つに相当する部位においてアミノ酸の改変を含む、項1~6のいずれかに記載の逆転写方法。
[項8] 509位及び744位からなる群より選択される少なくとも一つに相当する部位におけるアミノ酸の改変が、ヒスチジン、リジン及びアルギニンからなる群より選択される塩基性アミノ酸への置換である、項7に記載の逆転写方法。
[項9] 以下の工程:
(a)配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、751位に相当するアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて、マンガンイオン不存在下でRNAからcDNAを合成する逆転写反応を行う工程、及び
(b)前記工程(a)の逆転写反応により生じた逆転写産物を鋳型として、前記核酸ポリメラーゼにより更に核酸増幅反応を行う工程、
を包含する、核酸増幅方法。。
[項10] 前記工程(a)の逆転写反応をマグネシウムイオン共存下で行う、項9に記載の核酸増幅方法。
[項11] 前記工程(a)の逆転写反応を精製工程を経ていない生体試料を用いて行う、項9又は10に記載の核酸増幅方法。
[項12] 前記工程(a)の逆転写反応を5分以下で完了する、項9~11のいずれかに記載の核酸増幅方法。
[項13] RT-PCR方法である、項9~12のいずれかに記載の核酸増幅方法。
[項14] 逆転写反応及びPCR反応を1時間以下で行うRT-PCR方法である、項9~13のいずれかに記載の核酸増幅方法。
[項15] 項1~8のいずれかに記載の逆転写方法又は項9~14のいずれかに記載の核酸増幅方法に用いる試薬であって、配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、751位に相当するアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼを含む、試薬。
[項16] 項1~8のいずれかに記載の逆転写方法又は項9~14のいずれかに記載の核酸増幅方法に用いる試薬キットであって、配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、751位に相当するアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼを含む、試薬キット。
[項17] マンガンイオンを生じさせる成分を含まない、項16に記載の試薬キット。
[項18] 更にマグネシウムイオンを生じさせる成分を含む、項16又は17に記載の試薬キット。
Representative inventions of the present application are as follows.
[Item 1] Consists of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and the amino acid at the site corresponding to position 751 is tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and Performing a reverse transcription reaction to synthesize cDNA from RNA in the absence of manganese ions using a nucleic acid polymerase having reverse transcription activity substituted with a neutral amino acid having a polar side chain selected from the group consisting of asparagine. Reverse transcription method.
[Item 2] The nucleic acid polymerase consists of an amino acid sequence having 96% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and the amino acid corresponding to position 751 is tyrosine, cysteine, glutamine, serine, 2. The reverse transcription method according to item 1, wherein the nucleic acid polymerase is substituted with a neutral amino acid having a polar side chain selected from the group consisting of threonine and asparagine.
[Item 3] The nucleic acid polymerase has a polar side chain in which the amino acid corresponding to position 751 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 is selected from the group consisting of tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine. 3. The reverse transcription method according to item 1 or 2, wherein the nucleic acid polymerase is substituted with a neutral amino acid having the following.
[Item 4] The reverse transcription method according to any one of Items 1 to 3, wherein the nucleic acid polymerase is reacted in the presence of magnesium ions.
[Item 5] The reverse transcription method according to any one of Items 1 to 4, wherein the reverse transcription reaction is performed using a biological sample that has not undergone a purification step.
[Item 6] The reverse transcription method according to any one of Items 1 to 5, wherein the reverse transcription reaction is performed in 5 minutes or less.
[Item 7] The reverse transcription method according to any one of Items 1 to 6, wherein the nucleic acid polymerase further comprises an amino acid modification at a site corresponding to at least one selected from the group consisting of positions 509 and 744. .
[Item 8] The modification of the amino acid at a site corresponding to at least one selected from the group consisting of positions 509 and 744 is a substitution with a basic amino acid selected from the group consisting of histidine, lysine, and arginine. The reverse transcription method according to item 7.
[Item 9] The following steps:
(a) Consists of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and the amino acid corresponding to position 751 consists of tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine performing a reverse transcription reaction for synthesizing cDNA from RNA in the absence of manganese ions using a nucleic acid polymerase having reverse transcription activity substituted with a neutral amino acid having a polar side chain selected from the group; b) further performing a nucleic acid amplification reaction with the nucleic acid polymerase using the reverse transcription product produced by the reverse transcription reaction of step (a) as a template;
A nucleic acid amplification method comprising: .
[Item 10] The nucleic acid amplification method according to Item 9, wherein the reverse transcription reaction in step (a) is performed in the presence of magnesium ions.
[Item 11] The nucleic acid amplification method according to Item 9 or 10, wherein the reverse transcription reaction in step (a) is performed using a biological sample that has not undergone a purification step.
[Item 12] The nucleic acid amplification method according to any one of Items 9 to 11, wherein the reverse transcription reaction in step (a) is completed in 5 minutes or less.
[Item 13] The nucleic acid amplification method according to any one of Items 9 to 12, which is an RT-PCR method.
[Item 14] The nucleic acid amplification method according to any one of Items 9 to 13, which is an RT-PCR method in which the reverse transcription reaction and PCR reaction are performed in 1 hour or less.
[Item 15] A reagent used in the reverse transcription method according to any one of Items 1 to 8 or the nucleic acid amplification method according to any one of Items 9 to 14, which has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 and 90 % or more, and the amino acid corresponding to position 751 is replaced with a neutral amino acid having a polar side chain selected from the group consisting of tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine. A reagent comprising a nucleic acid polymerase having reverse transcription activity.
[Item 16] A reagent kit for use in the reverse transcription method according to any one of Items 1 to 8 or the nucleic acid amplification method according to any one of Items 9 to 14, comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2. consisting of an amino acid sequence with an identity of 90% or more, and the amino acid corresponding to position 751 is a neutral amino acid having a polar side chain selected from the group consisting of tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine. A reagent kit comprising a nucleic acid polymerase having substituted reverse transcription activity.
[Item 17] The reagent kit according to Item 16, which does not contain a component that generates manganese ions.
[Item 18] The reagent kit according to Item 16 or 17, further comprising a component that generates magnesium ions.

本発明により、マンガンイオン(Mn2+)を用いなくともRNAから効率よく逆転写反応を行うことができる。従って、マンガンイオンを使用せずに、単一の逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼで逆転写反応及び増幅反応を行うことも可能になる。マンガンは環境等への影響が懸念されているため、本発明によれば、そのような懸念が低減され、環境等にやさしい逆転写反応を行うこと等が可能になる。また、マンガン共存下で生じやすいポリメラーゼの忠実性低下の影響も低減でき、高い忠実性を維持しながら効率的な逆転写反応を行うことも可能となり得る。 According to the present invention, reverse transcription reaction can be efficiently performed from RNA without using manganese ions (Mn 2+ ). Therefore, it becomes possible to perform reverse transcription and amplification reactions with a single nucleic acid polymerase having reverse transcription activity without using manganese ions. Since there are concerns about the effects of manganese on the environment, the present invention reduces such concerns and makes it possible to perform environment-friendly reverse transcription reactions. Furthermore, it is possible to reduce the influence of a decrease in polymerase fidelity that tends to occur in the coexistence of manganese, and it may become possible to perform an efficient reverse transcription reaction while maintaining high fidelity.

実施例4の結果を示す図である(RT-PCR増幅曲線)。FIG. 4 is a diagram showing the results of Example 4 (RT-PCR amplification curve). サーマス・サーモフィルス由来のDNAポリメラーゼの全長アミノ酸配列(配列番号1)及び当該アミノ酸配列をコードする塩基配列(配列番号2)を示す。The full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of DNA polymerase derived from Thermus thermophilus and the base sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) are shown. Themus sp Z05由来のDNAポリメラーゼの全長アミノ酸配列(配列番号3)及び当該アミノ酸配列をコードする塩基配列(配列番号4)を示す。The full-length amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of DNA polymerase derived from Themus sp Z05 and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) are shown. 実施例において使用したプライマー及びプローブの塩基配列を示す。The base sequences of primers and probes used in Examples are shown.

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。 Hereinafter, the present invention will be explained in further detail while showing embodiments of the present invention.

本発明は、マンガンイオンを共存させずに、逆転写活性を有する改変型核酸ポリメラーゼを用いて逆転写反応を行う方法、及びその逆転写反応を利用したRT-PCR方法等に関する。逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼとは、RNAからcDNAを合成する能力(これを「逆転写活性」(RT活性)ともいう)及び核酸を増幅する能力(これを「ポリメラーゼ活性」ともいう)を兼ね備えた核酸ポリメラーゼである。核酸ポリメラーゼは、好ましくはDNAポリメラーゼであり、ポリメラーゼ活性としてDNAを増幅するDNAポリメラーゼ活性を兼ね備えたポリメラーゼであり得る。DNAポリメラーゼとは、1本鎖の核酸を鋳型として、それに相補的な塩基配列を有するDNA鎖を合成する酵素を意味する。逆転写活性及びDNAポリメラーゼ活性の有無は、例えば、RNAを鋳型とするRT-PCRにおいて核酸増幅反応が成立するか否かで判定することができる。また例えば、後述の逆転写活性(RT活性)の評価方法に記載の手順により、当該核酸ポリメラーゼの逆転写活性の有無及びその程度を判定することができる。 The present invention relates to a method for performing a reverse transcription reaction using a modified nucleic acid polymerase having reverse transcription activity without the coexistence of manganese ions, and an RT-PCR method using the reverse transcription reaction. A nucleic acid polymerase with reverse transcription activity has the ability to synthesize cDNA from RNA (this is also referred to as "reverse transcription activity" (RT activity)) and the ability to amplify nucleic acids (this is also referred to as "polymerase activity"). It is a nucleic acid polymerase. The nucleic acid polymerase is preferably a DNA polymerase, and may be a polymerase that has a DNA polymerase activity that amplifies DNA as a polymerase activity. DNA polymerase refers to an enzyme that uses a single-stranded nucleic acid as a template to synthesize a DNA strand having a complementary base sequence. The presence or absence of reverse transcription activity and DNA polymerase activity can be determined, for example, by whether a nucleic acid amplification reaction is successful in RT-PCR using RNA as a template. Furthermore, for example, the presence or absence and degree of reverse transcription activity of the nucleic acid polymerase can be determined by the procedure described in the method for evaluating reverse transcription activity (RT activity) described below.

特定の実施形態において、本発明は、サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)由来のDNAポリメラーゼ又はThemus sp Z05由来のDNAポリメラーゼにおいて、751位に相当する部位でアミノ酸改変を有する変異型核酸ポリメラーゼを使用することを特徴とする。サーマス・サーモフィルス由来のDNAポリメラーゼの全長アミノ酸配列を配列番号1に示す。また、配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするサーマス・サーモフィルス由来の遺伝子配列を配列番号2に示す。そして、Themus sp Z05由来のDNAポリメラーゼの全長アミノ酸配列を配列番号3に示す。また、配列番号3に示されるアミノ酸配列をコードするThemus sp Z05由来の遺伝子配列を配列番号4に示す。 In certain embodiments, the invention uses a mutant nucleic acid polymerase having an amino acid modification at a site corresponding to position 751 in a DNA polymerase from Thermus thermophilus or a DNA polymerase from Themus sp Z05. It is characterized by The full-length amino acid sequence of DNA polymerase derived from Thermus thermophilus is shown in SEQ ID NO: 1. Furthermore, the gene sequence derived from Thermus thermophilus that encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2. The full-length amino acid sequence of the DNA polymerase derived from Themus sp Z05 is shown in SEQ ID NO: 3. Furthermore, the gene sequence derived from Themus sp Z05 that encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is shown in SEQ ID NO: 4.

一つの実施形態において、本発明において使用する核酸ポリメラーゼは、配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、751位に相当する部位のアミノ酸に変異(好ましくは、他のアミノ酸への置換)を含む改変型核酸ポリメラーゼであることを特徴とする。改変前のアミノ酸配列は、配列番号1又は2と完全に同一である場合に限られるものではなく、逆転写活性及びポリメラーゼ活性(好ましくはDNAポリメラーゼ活性)が維持されている限り特に制限されないが、例えば、配列番号1又は2に記載のアミノ酸配列との同一性が90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、更に好ましくは97%以上、更により好ましくは98%以上、なかでも99%以上であるアミノ酸配列から構成されるものが好適である。 In one embodiment, the nucleic acid polymerase used in the present invention mutates (preferably substitutes with another amino acid) the amino acid at the site corresponding to position 751 in a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2. ) is characterized by being a modified nucleic acid polymerase comprising: The amino acid sequence before modification is not limited to being completely identical to SEQ ID NO: 1 or 2, and is not particularly limited as long as reverse transcription activity and polymerase activity (preferably DNA polymerase activity) are maintained. For example, the identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, or However, it is preferable that the amino acid sequence consists of 99% or more of the amino acid sequence.

さらに、改変前のアミノ酸配列は、配列番号1又は2に記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。ここで「1又は数個」とは、逆転写活性及びポリメラーゼ活性(好ましくはDNAポリメラーゼ活性)が維持される限り特に制限されないが、例えば、1~20個、好ましくは1~10個、より好ましくは1~5個である。 Furthermore, the amino acid sequence before modification may be an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and/or added to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2. Here, "one or several" is not particularly limited as long as reverse transcription activity and polymerase activity (preferably DNA polymerase activity) are maintained, but for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably is 1 to 5.

前記のような配列番号1又は2と高いアミノ酸配列同一性を示す関係にある改変前のアミノ酸配列は、例えば、遺伝子工学的な手法により人為的に作製するものであってもよいし、天然に由来するタンパク質のアミノ酸配列であってもよい。このような天然に由来するアミノ酸配列としては、特に限定するものではないが、例えば、Thermus thermophilus HB8由来のDNAポリメラーゼ(Tth)、Themus sp Z05由来のDNAポリメラーゼ(Z05)、及びこれらと高い配列同一性を示すことが知られているThermotoga maritima由来のDNAポリメラーゼ(Tma)などが挙げられる。好ましくは、Tth又はZ05由来のアミノ酸配列であり、なかでも安定して高い効果を発揮し得るという観点から、Tth由来のアミノ酸配列がとりわけ好適である。 The amino acid sequence before modification that has a high amino acid sequence identity with SEQ ID NO: 1 or 2 as described above may be one that is artificially created by genetic engineering techniques, or one that is naturally occurring. It may also be the amino acid sequence of the derived protein. Such naturally derived amino acid sequences include, but are not particularly limited to, DNA polymerase derived from Thermus thermophilus HB8 (Tth), DNA polymerase derived from Themus sp Z05 (Z05), and those having high sequence identity with these. Examples include DNA polymerase derived from Thermotoga maritima (Tma), which is known to exhibit sexual activity. Amino acid sequences derived from Tth or Z05 are preferred, and amino acid sequences derived from Tth are particularly preferred from the viewpoint of being able to exhibit stable and high effects.

特定の実施形態において、本発明において使用する核酸ポリメラーゼは、配列番号1又は2におけるアミノ酸配列或いは前記のような配列番号1又は2と特定の関係にあるアミノ酸配列において、751位のフェニルアラニン(F751)に相当する部位でアミノ酸改変を有する。本発明の核酸ポリメラーゼは、F751位に相当する部位におけるアミノ酸改変以外に、本発明の効果を奏する限りにおいて、他のアミノ酸部位においても任意のアミノ酸改変を含んでいてもよい。RNAからの核酸増幅をより確実に効率よく行うことが可能であるという観点から、配列番号1又は2におけるアミノ酸配列或いは前記のような配列番号1又は2と特定の関係にあるアミノ酸配列において、509位のグルタミンに相当する部位(Q509位)及び/又は744位に相当する部位(E744)に更にアミノ酸改変を有するものとするものが好適である。 In a specific embodiment, the nucleic acid polymerase used in the present invention is a phenylalanine at position 751 (F751) in the amino acid sequence in SEQ ID NO: 1 or 2 or in an amino acid sequence having a specific relationship with SEQ ID NO: 1 or 2 as described above. It has an amino acid modification at a site corresponding to . In addition to the amino acid modification at the site corresponding to position F751, the nucleic acid polymerase of the present invention may include any amino acid modification at other amino acid sites as long as the effect of the present invention is achieved. From the viewpoint that it is possible to perform nucleic acid amplification from RNA more reliably and efficiently, in the amino acid sequence in SEQ ID NO: 1 or 2 or the amino acid sequence in a specific relationship with SEQ ID NO: 1 or 2 as described above, 509 Preferably, the amino acid is further modified at the site corresponding to glutamine at position Q509 (position Q509) and/or at the site corresponding to position 744 (E744).

本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「F751Y」などの表記を用いる。「F751Y」は、第751番目のフェニルアラニンをチロシンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「/」でつなげて表す。たとえば「Q509R/F751Y」は、第509番目のグルタミンをアルギニンに置換し、かつ、第751番目のフェニルアラニンをチロシンに置換したことを示す。なお、本明細書において、配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号1又は2上のある位置(順番)に相当する部位とは、配列の一次構造を常法に従って比較(アラインメント)したときに、配列番号1又は2の当該位置と対応する位置をいうものとする。 In this specification, simplified alphabetical symbols may be used for base sequences, amino acid sequences, and their individual constituent elements, but all of these are in accordance with conventions in the fields of molecular biology and genetic engineering. Furthermore, in this specification, in order to concisely indicate mutations in amino acid sequences, a notation such as "F751Y" is used, for example. "F751Y" indicates that the 751st phenylalanine was substituted with tyrosine, that is, it indicates the type of amino acid residue before substitution, its location, and the type of amino acid residue after substitution. Furthermore, unless otherwise specified, the sequence numbers correspond to the sequence numbers listed in the sequence listing. In addition, in the case of multiple mutants, the above notation is expressed by connecting them with "/". For example, "Q509R/F751Y" indicates that glutamine at position 509 is replaced with arginine, and phenylalanine at position 751 is replaced with tyrosine. In addition, in this specification, a site corresponding to a certain position (order) on SEQ ID NO: 1 or 2 in an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 is defined as It refers to a position that corresponds to the relevant position in SEQ ID NO: 1 or 2 when compared (aligned) according to a conventional method.

また、本明細書において「変異型核酸ポリメラーゼ」又は「改変型核酸ポリメラーゼ」という場合の「変異型」又は「改変型」とは、従来知られた核酸ポリメラーゼとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。 In addition, in this specification, when referring to "mutant nucleic acid polymerase" or "modified nucleic acid polymerase," the term "mutant type" or "modified type" means having an amino acid sequence different from that of conventionally known nucleic acid polymerases. It does not distinguish between artificial variation and natural variation.

特定の好ましい実施形態において、本発明に使用する核酸ポリメラーゼは、配列番号1又は2と特定の配列同一性を示す関係にあるアミノ酸配列において、751位に相当する部位のアミノ酸を中性のアミノ酸に改変したものである。好ましくは、751位に相当する部位でのアミノ酸を、チロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、又はアスパラギンに置換したものである。チロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、アスパラギンはいずれも極性の中性側鎖を有するアミノ酸として知られており、等電点も約5.0~約5.7程度で近く、共通の性質を示し得るアミノ酸として同等の効果が発揮されることが期待できる。 In a specific preferred embodiment, the nucleic acid polymerase used in the present invention converts the amino acid at the position corresponding to position 751 into a neutral amino acid in the amino acid sequence that has a specific sequence identity with SEQ ID NO: 1 or 2. This is a modified version. Preferably, the amino acid at the site corresponding to position 751 is substituted with tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, or asparagine. Tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine are all known as amino acids with polar and neutral side chains, and have similar isoelectric points of approximately 5.0 to 5.7, so they share common properties. It can be expected that the same effect as that of other amino acids can be exhibited.

更なる好ましい実施形態において、本発明に使用する核酸ポリメラーゼは、配列番号1又は2と特定の配列同一性を示す関係にあるアミノ酸配列において、更に509位及び/又は744位に相当する部位のアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したものである。好ましくは、509位及び/又は744位に相当する部位のアミノ酸を、アルギニン、リジン、又はヒスチジンに置換したものである。例えば、本発明の核酸ポリメラーゼは、509位に相当する部位のアミノ酸をアルギニン、又はリジンに置換したものであり得る。塩基性アミノ酸として、アルギニンの等電点は約10.8、リジンの等電点は約9.7、ヒスチジンの等電点は約7.6あることが知られている。つまり、これらの塩基性アミノ酸はいずれも高い等電点を有しているので、共通の性質を示し得るアミノ酸として同等の効果が発揮されることが期待できる。 In a further preferred embodiment, the nucleic acid polymerase used in the present invention further comprises an amino acid at a position corresponding to position 509 and/or 744 in the amino acid sequence that has a specific sequence identity with SEQ ID NO: 1 or 2. is modified to a basic amino acid. Preferably, the amino acid at the site corresponding to position 509 and/or 744 is substituted with arginine, lysine, or histidine. For example, the nucleic acid polymerase of the present invention may have the amino acid at the site corresponding to position 509 substituted with arginine or lysine. It is known that, as basic amino acids, arginine has an isoelectric point of about 10.8, lysine has an isoelectric point of about 9.7, and histidine has an isoelectric point of about 7.6. In other words, since all of these basic amino acids have high isoelectric points, they can be expected to exhibit similar effects as amino acids that can exhibit common properties.

本発明において使用される改変された核酸ポリメラーゼを製造する方法としては、従来からの公知の方法が使用できる。好ましくは、野生型核酸ポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、タンパク質工学的手法により新たな機能を有する変異型(改変型)核酸ポリメラーゼを製造する方法が用いられる。 Conventionally known methods can be used to produce the modified nucleic acid polymerase used in the present invention. Preferably, a method is used in which a mutation is introduced into a gene encoding a wild-type nucleic acid polymerase, and a mutant (modified) nucleic acid polymerase having a new function is produced by protein engineering techniques.

アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Inverse PCR法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、KOD -Plus- Mutagenesis Kit(Toyobo製)は、(1)目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてKOD DNAポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、(2)(1)のサイクルを15回繰り返す、(3)制限酵素DpnIを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、(4)新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ligationを実施し環化させる、(5)環化した遺伝子を大腸菌に形質転換することで、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットであり、本発明に使用する核酸ポリメラーゼの作製に好適に用いることができる。 As one aspect of the method for introducing amino acid modifications, a site-directed mutagenesis method based on the inverse PCR method can be used. For example, the KOD -Plus- Mutagenesis Kit (manufactured by Toyobo) involves (1) denaturing a plasmid into which a gene of interest has been inserted, annealing a mutation primer to the plasmid, and then performing an elongation reaction using KOD DNA polymerase. , (2) Repeat the cycle of (1) 15 times, (3) Selectively cleave only the template plasmid using the restriction enzyme DpnI, (4) Phosphorylate the newly synthesized gene, and remove the ligation. (5) Transforming Escherichia coli with the circularized gene to obtain a transformant carrying a plasmid into which a desired mutation has been introduced; It can be suitably used for producing a nucleic acid polymerase to be used.

本発明に使用する核酸ポリメラーゼは、Sso7dやPCNAの融合タンパク質の形態であってもよい。また、Hisタグ、GSTタグなどのタンパク質タグを付加した融合タンパク質であってもよい。 The nucleic acid polymerase used in the present invention may be in the form of a fusion protein of Sso7d or PCNA. Alternatively, it may be a fusion protein to which a protein tag such as a His tag or a GST tag is added.

上記核酸ポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばLB培地や2×YT培地に接種し、37℃で12~20時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、pBluescript由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。 The above nucleic acid polymerase gene is transferred to an expression vector as necessary, and a host such as E. coli is transformed using the expression vector, and then applied to an agar medium containing a drug such as ampicillin to form colonies. The colony is inoculated into a nutrient medium, such as LB medium or 2xYT medium, and after culturing at 37°C for 12 to 20 hours, the cells are crushed and the crude enzyme solution is extracted. The vector is preferably derived from pBluescript. Any known method may be used to disrupt the bacterial cells, including physical disruption methods such as ultrasonication, French press and glass bead crushing, and lytic enzymes such as lysozyme.

上記方法により選抜された菌株から精製核酸ポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば80℃、30分間処理し、その後硫安沈殿により核酸ポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスG-25(アマシャムファルマシア・バイオテク製)を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はSDS-PAGEによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。 Any method may be used to obtain purified nucleic acid polymerase from the strain selected by the above method, and examples include the following methods. After collecting the cells obtained by culturing them in a nutrient medium, the cells are crushed and extracted using an enzymatic or physical crushing method to obtain a crude enzyme solution. The obtained crude enzyme extract is subjected to heat treatment, for example, at 80° C. for 30 minutes, and then the nucleic acid polymerase fraction is recovered by ammonium sulfate precipitation. This crude enzyme solution can be desalted by a method such as gel filtration using Sephadex G-25 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). After this operation, the enzyme can be separated and purified by heparin Sepharose column chromatography to obtain a purified enzyme preparation. The purified enzyme preparation is purified by SDS-PAGE to the extent that it shows almost a single band.

本発明に使用する核酸ポリメラーゼが、逆転写活性及びDNAポリメラーゼ活性を有するか否かは、具体的には、下記のような方法により測定することができる。 Specifically, whether the nucleic acid polymerase used in the present invention has reverse transcription activity and DNA polymerase activity can be determined by the following method.

[逆転写活性(RT活性)の評価方法]
本発明に使用する核酸ポリメラーゼは、従来のものと比べて逆転写活性に優れ、短時間で逆転写反応を行うことが可能であり得る。具体的には、特に限定はされないが、標的RNAの全長が例えば50~300bpである場合に、好ましくは150~250bpである場合に、その標的RNAからの逆転写反応が5分以下で完了するものである。本発明において、逆転写活性はリアルタイムRT-PCRで算出されるCt、もしくはCq値から評価できる。得られたCtが1小さいことはすなわち逆転写効率が2倍、2小さいことは逆転写効率が4倍であることを示す。
[Evaluation method of reverse transcription activity (RT activity)]
The nucleic acid polymerase used in the present invention has superior reverse transcription activity compared to conventional polymerases, and may be capable of performing a reverse transcription reaction in a short time. Specifically, although not particularly limited, when the total length of the target RNA is, for example, 50 to 300 bp, preferably 150 to 250 bp, the reverse transcription reaction from the target RNA is completed in 5 minutes or less. It is something. In the present invention, reverse transcription activity can be evaluated from the Ct or Cq value calculated by real-time RT-PCR. A decrease in the obtained Ct by 1 means that the reverse transcription efficiency is twice as high, and a decrease in the obtained Ct by 2 means that the reverse transcription efficiency is 4 times as high.

[DNAポリメラーゼ活性測定法]
本発明においては、純化されたDNAポリメラーゼの活性は、以下に示す方法により測定する。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液(50mM Tris-HCl(pH8.0),50mM KCl,1mM ジチオスレイトール,0.1% Tween20,0.1% Nonidet P40,50% グリセリン)でサンプルを希釈して測定を行う。(1)下記のA液25μl、B液5μl、C液5μl、滅菌水10μl、及び酵素溶液5μlをマイクロチューブに加えて、75℃にて10分間反応する。(2)その後氷冷し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。(3)この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。(4)フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製Tri-Carb2810 TR)で計測し、鋳型DNAのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の1単位はこの条件で30分当りの10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分(即ち、D液を添加したときに不溶化する画分)に取り込む酵素量とする。
A液:40mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)16mM 塩化マグネシウム15mM ジチオスレイトール100μg/ml BSA(牛血清アルブミン)
B液:1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C液:1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D液:20% トリクロロ酢酸(2mM ピロリン酸ナトリウム)
E液:1mg/ml 仔牛胸腺DNA
[DNA polymerase activity measurement method]
In the present invention, the activity of purified DNA polymerase is measured by the method shown below. If the enzyme activity is strong, remove the sample with storage buffer (50mM Tris-HCl (pH 8.0), 50mM KCl, 1mM dithiothreitol, 0.1% Tween20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin). Dilute and measure. (1) Add 25 μl of solution A, 5 μl of solution B, 5 μl of solution C, 10 μl of sterilized water, and 5 μl of enzyme solution shown below to a microtube, and react at 75° C. for 10 minutes. (2) Then, cool on ice, add 50 μl of solution E and 100 μl of solution D, stir, and cool on ice for another 10 minutes. (3) Filter this liquid through a glass filter (GF/C filter manufactured by Whatman) and wash thoroughly with 0.1N hydrochloric acid and ethanol. (4) The radioactivity of the filter is measured using a liquid scintillation counter (Tri-Carb2810 TR manufactured by Packard) to measure the incorporation of nucleotides into template DNA. One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that incorporates 10 nmol of nucleotides into the acid-insoluble fraction (ie, the fraction that becomes insolubilized when Solution D is added) per 30 minutes under these conditions.
Solution A: 40mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) 16mM magnesium chloride 15mM dithiothreitol 100μg/ml BSA (bovine serum albumin)
Solution B: 1.5μg/μl activated calf thymus DNA
Solution C: 1.5mM dNTP (250cpm/pmol [3H]dTTP)
Solution D: 20% trichloroacetic acid (2mM sodium pyrophosphate)
Solution E: 1mg/ml calf thymus DNA

本発明に使用する核酸ポリメラーゼは、当該分野で公知の任意の核酸増幅方法において使用することができるものである。核酸増幅のための温度・時間・反応サイクル等の条件は、増幅したい核酸の種類や塩基の配列、鎖長等によって変わるが、当業者であれば適宜設定できる。通常、PCRやRT-PCRでは、(1)熱処理によるDNA変性(2本鎖DNAから1本鎖DNAへの解離)、(2)鋳型1本鎖DNAへのプライマーのアニーリング、(3)DNAポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という3ステップを1サイクルとし、このサイクルを繰り返す。本発明における伸長時間とは、(3)のプライマーを伸長させる反応に必要な1サイクルの時間を示す。また、PCRやRT-PCRでは、上記の(2)アニーリング及び(3)プライマーの伸長を同温度で、2ステップで行う場合もある。この場合には、本発明の伸長時間とは、便宜上 、(2)アニーリング及び(3)伸長を並行して行う時間を伸長時間という。一例として、本発明の核酸ポリメラーゼを用いる核酸増幅法として、PCRやRT-PCRを行う場合では、伸長時間を1kbあたり30秒以下にしてもよい。 The nucleic acid polymerase used in the present invention can be used in any nucleic acid amplification method known in the art. Conditions such as temperature, time, and reaction cycle for nucleic acid amplification vary depending on the type of nucleic acid to be amplified, base sequence, chain length, etc., and can be set as appropriate by those skilled in the art. Usually, in PCR or RT-PCR, (1) DNA denaturation by heat treatment (dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA), (2) annealing of primers to template single-stranded DNA, (3) DNA polymerase The three steps of elongation of the primer using the primer are one cycle, and this cycle is repeated. The extension time in the present invention refers to the time required for one cycle of the reaction to extend the primer (3). Furthermore, in PCR or RT-PCR, the above (2) annealing and (3) primer extension may be performed in two steps at the same temperature. In this case, the extension time of the present invention is, for convenience, the time during which (2) annealing and (3) extension are performed in parallel. As an example, when performing PCR or RT-PCR as a nucleic acid amplification method using the nucleic acid polymerase of the present invention, the extension time may be set to 30 seconds or less per 1 kb.

特定の実施形態では、本発明に使用する核酸ポリメラーゼは、PCR反応サイクルの高温下でも十分に機能し得る程度の耐熱性を備えていることが好ましい。例えば、85℃で1分以上の熱処理を実施しても、酵素活性が半分以上低下しないレベルの耐熱性を有するものが好ましい。例えば、 RT-PCRに用いられる反応温度としては、特に限定されないが、40~80℃での逆転写反応後に90~100℃での熱変性と40~80℃での会合・伸長反応を行うPCR反応サイクル条件が挙げられ、好ましくは、50~65℃での逆転写反応後に94~98℃での熱変性と55~65℃での会合・伸長反応を行うPCR反応サイクル条件(例えば、60℃での逆転写反応後に95℃での熱変性と60℃での会合・伸長反応を行うPCR反応サイクル条件)を例示することができる。本発明に使用する核酸ポリメラーゼは、このような温度範囲において良好な活性が維持されるものであり、効果的に核酸を増幅することが可能である。 In certain embodiments, the nucleic acid polymerase used in the present invention preferably has sufficient thermostability to function even under the high temperatures of PCR reaction cycles. For example, it is preferable to have heat resistance at a level where the enzyme activity does not decrease by half or more even if heat treatment is performed at 85° C. for 1 minute or more. For example, the reaction temperature used in RT-PCR is not particularly limited, but PCR involves reverse transcription reaction at 40-80°C followed by heat denaturation at 90-100°C and association/extension reaction at 40-80°C. Preferably, PCR reaction cycle conditions include reverse transcription reaction at 50 to 65°C followed by heat denaturation at 94 to 98°C and association/extension reaction at 55 to 65°C (for example, 60°C Examples of PCR reaction cycle conditions include reverse transcription reaction at 95° C. followed by heat denaturation at 95° C. and association/extension reaction at 60° C.). The nucleic acid polymerase used in the present invention maintains good activity in such a temperature range, and is capable of effectively amplifying nucleic acids.

通常、TthやZ05などのDNAポリメラーゼで逆転写する際は、マンガン(Mn)イオンを必要とする。一方、本発明の逆転写方法及び/又は逆転写反応を含む核酸増幅方法では、逆転写反応時に従来必要とされていたマンガンイオンが存在しなくてもよいことを大きな特徴としている。従って、本発明の逆転写方法及び/又は逆転写反応を含む核酸増幅方法は、マンガンイオンを生じさせる成分(例えば、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガン等のマンガン塩)を含まない条件下で逆転写反応を行うように実施される。マンガンは環境等への有害性が懸念されており、マンガンを使用せずに逆転写反応及び逆転写反応を含む核酸増幅方法(例えば、RT-PCR方法)を実施できることは非常に有益である。 Normally, manganese (Mn) ions are required when reverse transcription is performed using a DNA polymerase such as Tth or Z05. On the other hand, a major feature of the reverse transcription method and/or nucleic acid amplification method including reverse transcription reaction of the present invention is that manganese ions, which are conventionally required during reverse transcription reaction, do not need to be present. Therefore, the reverse transcription method and/or nucleic acid amplification method including a reverse transcription reaction of the present invention can be reversed under conditions that do not contain components that generate manganese ions (for example, manganese salts such as manganese chloride, manganese sulfate, and manganese acetate). It is carried out like a photoreaction. There are concerns that manganese is harmful to the environment, and it is extremely beneficial to be able to perform reverse transcription reactions and nucleic acid amplification methods (for example, RT-PCR methods) that include reverse transcription reactions without using manganese.

一つの実施形態において、本発明の逆転写方法及び/又は逆転写反応を含む核酸増幅方法は、マンガンイオンに替えて、マンガンイオン以外の二価イオン(好ましくは、二価陽イオン)が共存する条件下で、逆転写反応を行うことが好ましい。なかでも、逆転写反応時にマンガンイオンの代わりにマグネシウム(Mg)イオンを生じさせる成分が添加されていることが好ましい。マグネシウムイオンを生じさせる成分としては、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等のマグネシウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。 In one embodiment, the reverse transcription method and/or the nucleic acid amplification method including a reverse transcription reaction of the present invention includes the coexistence of divalent ions other than manganese ions (preferably divalent cations) in place of manganese ions. It is preferable to perform the reverse transcription reaction under the following conditions. Among these, it is preferable to add a component that generates magnesium (Mg) ions instead of manganese ions during the reverse transcription reaction. Examples of the component that generates magnesium ions include, but are not limited to, magnesium salts such as magnesium chloride, magnesium sulfate, and magnesium acetate.

本発明の逆転写方法及び逆転写反応を含む核酸増幅方法は、精製工程を経ていない生体試料内の核酸を精製することなく使用して、逆転写反応及び/又は増幅反応を行うことが可能である。精製とは、生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中の核酸を分離する方法であり、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、核酸を分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬によって核酸を分離する方法がある。 The reverse transcription method and the nucleic acid amplification method including the reverse transcription reaction of the present invention can perform the reverse transcription reaction and/or the amplification reaction using nucleic acid in a biological sample that has not undergone a purification step without being purified. be. Purification is a method of separating nucleic acids in a biological sample from contaminants such as tissues and cell walls of the biological sample, and methods that use phenol or phenol/chloroform to separate nucleic acids, ion exchange resins, glass filters, etc. Alternatively, there is a method of separating nucleic acids using a reagent that has a protein aggregation effect.

一つの実施形態において、本発明における逆転写方法及び逆転写反応を含む核酸増幅方法は、生体試料をこれらの精製法をとることなく、逆転写反応液及び/又は核酸増幅反応液に添加し、逆転写反応を行う方法及び/又は増幅反応を行う方法であり得る。本発明において「精製工程を経ていない生体試料」とは、生体試料そのもの、あるいは液体の生体試料を水などの溶媒を用いて希釈したもの、固体の生体試料を水などの溶媒に添加し熱をかけて破砕させたものなどが挙げられる。 In one embodiment, the reverse transcription method and the nucleic acid amplification method including reverse transcription reaction in the present invention include adding a biological sample to a reverse transcription reaction solution and/or a nucleic acid amplification reaction solution without using these purification methods, The method may be a method of performing a reverse transcription reaction and/or a method of performing an amplification reaction. In the present invention, a "biological sample that has not undergone a purification process" refers to a biological sample itself, a liquid biological sample diluted with a solvent such as water, or a solid biological sample added to a solvent such as water and heated. Examples include those that have been crushed by

臓器や細胞、ウイルスなど、増幅対象となる核酸が試料の組織内に存在する場合、前記核酸を抽出するために組織を破壊する行為(物理的な処理による破壊、界面活性剤などを使用した破壊など)は、本発明で言う精製に該当しない。また、前記方法で得られた試料、または、生体試料を、緩衝液などにより希釈する行為も本発明で言う精製に該当しない。 When a nucleic acid to be amplified exists in the tissue of a sample, such as an organ, cell, or virus, the act of destroying the tissue in order to extract the nucleic acid (destruction by physical treatment, destruction using surfactants, etc.) etc.) do not fall under the purification term of the present invention. Furthermore, the act of diluting the sample or biological sample obtained by the above method with a buffer solution does not fall under the purification term in the present invention.

本発明の方法に適用する生体試料は、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には糞便や血液、唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。 The biological sample applied to the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample collected from a living body. For example, it refers to animal and plant tissue, body fluids, excrement, cells, bacteria, viruses, etc. Body fluids include feces, blood, and saliva, and cells include, but are not limited to, white blood cells separated from blood.

一つの好ましい実施形態において、本発明の逆転写方法及び/又は逆転写反応を含む核酸増幅方法は、RNAからcDNAを合成する逆転写反応を5分以下で完了できる。RNAからcDNAを合成する逆転写反応を5分以下で完了できるとは、例えば、全長が50~300bpの標的RNAからのcDNAの合成が5分以下で完了することをいい、好ましくは、全長が150~250bpの標的RNAからのcDNAの合成が5分以下で完了することをいう。この場合の逆転写反応時間の下限値は特に限定されないが、例えば、1分以上、3分以上、又は4分以上であり得る。 In one preferred embodiment, the reverse transcription method and/or nucleic acid amplification method including a reverse transcription reaction of the present invention can complete the reverse transcription reaction for synthesizing cDNA from RNA in 5 minutes or less. Being able to complete the reverse transcription reaction for synthesizing cDNA from RNA in 5 minutes or less means, for example, that the synthesis of cDNA from a target RNA with a full length of 50 to 300 bp can be completed in 5 minutes or less, and preferably, Synthesis of cDNA from target RNA of 150 to 250 bp is completed in 5 minutes or less. The lower limit of the reverse transcription reaction time in this case is not particularly limited, but may be, for example, 1 minute or more, 3 minutes or more, or 4 minutes or more.

本発明に使用する核酸ポリメラーゼは、上記のように短時間で逆転写反応を行うことができるだけでなく、PCR反応などの増幅反応も効率よく行うことができる。従って、更なる好ましい実施形態において、本発明の核酸増幅方法は、別途、逆転写酵素を組み合わせて使用する必要がなく、単独で、逆転写反応及び増幅反応(例えば、RT-PCR反応)を行うこともできる。本発明では特定の改変型核酸ポリメラーゼを使用することにより、逆転写反応及び増幅反応を効率的に行えるので、逆転写反応及び増幅反応の全体に要する時間も短縮することができ、例えば、逆転写反応及びPCR反応(RT-PCR反応)を1時間以下で行うこともできる。この場合の逆転写反応及びPCR反応に係る時間の下限値は特に限定されないが、例えば、30分間以上、40分間以上、又は50分間以上であり得る。 The nucleic acid polymerase used in the present invention can not only perform reverse transcription reactions in a short time as described above, but also efficiently perform amplification reactions such as PCR reactions. Therefore, in a further preferred embodiment, the nucleic acid amplification method of the present invention does not require the use of a separate reverse transcriptase in combination, and the reverse transcription reaction and amplification reaction (for example, RT-PCR reaction) are carried out alone. You can also do that. In the present invention, by using a specific modified nucleic acid polymerase, the reverse transcription reaction and amplification reaction can be performed efficiently, so the time required for the entire reverse transcription reaction and amplification reaction can be shortened. The reaction and PCR reaction (RT-PCR reaction) can also be carried out in one hour or less. The lower limit of the time for the reverse transcription reaction and PCR reaction in this case is not particularly limited, but may be, for example, 30 minutes or more, 40 minutes or more, or 50 minutes or more.

一つの実施形態において、本発明の核酸増幅方法は、前記の本発明の核酸ポリメラーゼに加えて、更に別のDNAポリメラーゼを組み合わせて使用してもよい。本発明の核酸ポリメラーゼと組み合わせて用いられる別のDNAポリメラーゼは、当該分野で公知の任意のDNAポリメラーゼであり得るが、例えば、上記本発明で用いる改変型核酸ポリメラーゼ以外のThermus thermophilus由来DNAポリメラーゼ若しくはThemus sp Z05由来DNAポリメラーゼ、又はTaq DNAポリメラーゼ等のThermus aquaticus由来DNAポリメラーゼ、Tma DNAポリメラーゼ等のThermotoga maritima由来DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ等のThermococcus kodakarensis由来DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ等のPyrococcus furiosus由来DNAポリメラーゼ等を挙げることができる。なお、本明細書で、例えばThermus aquaticus由来DNAポリメラーゼという場合、Thermus aquaticusから単離された野生型DNAポリメラーゼに限定されず、当該野生型DNAポリメラーゼと高いアミノ酸配列同一性(例えば、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上又は99%以上のアミノ酸配列同一性)を示すDNAポリメラーゼ変異体又は当該野生型DNAポリメラーゼのアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたDNAポリメラーゼ変異体も含み、他の微生物に由来するDNAポリメラーゼも同様であり得る。好ましくは、組み合わせて用いられる別のDNAポリメラーゼは、上記改変型核酸ポリメラーゼ以外のThermus thermophilus由来DNAポリメラーゼ又はThemus sp Z05由来DNAポリメラーゼであり、より好ましくはTth DNAポリメラーゼ又はZ05 DNAポリメラーゼであり、更に好ましくはTth DNAポリメラーゼである。本発明の核酸ポリメラーゼともう1つ別のDNAポリメラーゼとを組み合わせて核酸増幅反応(例えば、RT-PCR反応)を行うことを二酵素系の核酸増幅反応(例えば、二酵素系RT-PCR反応)などといい、本発明の核酸ポリメラーゼはこのような態様でも好適に実施され得る。 In one embodiment, the nucleic acid amplification method of the present invention may use a combination of another DNA polymerase in addition to the aforementioned nucleic acid polymerase of the present invention. Another DNA polymerase used in combination with the nucleic acid polymerase of the present invention may be any DNA polymerase known in the art, for example, a DNA polymerase derived from Thermus thermophilus other than the modified nucleic acid polymerase used in the present invention described above or Themus sp Z05-derived DNA polymerase, or Thermus aquaticus-derived DNA polymerase such as Taq DNA polymerase, Thermotoga maritima-derived DNA polymerase such as Tma DNA polymerase, Thermoco such as KOD DNA polymerase, etc. DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus such as DNA polymerase derived from P. ccus kodakarensis and Pfu DNA polymerase etc. can be mentioned. In this specification, for example, when referring to DNA polymerase derived from Thermus aquaticus, it is not limited to a wild-type DNA polymerase isolated from Thermus aquaticus, and refers to a DNA polymerase having high amino acid sequence identity (e.g., 90% or more) with the wild-type DNA polymerase. DNA polymerase mutants exhibiting amino acid sequence identity of 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, or where one or several amino acids are deleted in the amino acid sequence of the wild-type DNA polymerase. , substitutions, and/or additions, as well as DNA polymerases derived from other microorganisms. Preferably, the other DNA polymerase used in combination is a Thermus thermophilus-derived DNA polymerase or a Themus sp Z05-derived DNA polymerase other than the modified nucleic acid polymerase, more preferably a Tth DNA polymerase or a Z05 DNA polymerase, and still more preferably is Tth DNA polymerase. A two-enzyme type nucleic acid amplification reaction (e.g., a two-enzyme type RT-PCR reaction) refers to performing a nucleic acid amplification reaction (e.g., an RT-PCR reaction) by combining the nucleic acid polymerase of the present invention and another DNA polymerase. The nucleic acid polymerase of the present invention can also be suitably implemented in such an embodiment.

本発明の方法は、逆転写反応を必要とするRNAからの核酸増幅法(例えば、RT-PCR)に適用することが特に有益である。このようなRT-PCR法では、例えば、少なくとも1種のプライマー、dNTP(デオキシリボヌクレオチド三リン酸)を反応させることによりプライマーを伸長して、DNAプライマー伸長物を合成する。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法等に適用することが可能である。 The method of the invention is particularly advantageously applied to nucleic acid amplification methods from RNA that require a reverse transcription reaction (eg, RT-PCR). In such an RT-PCR method, for example, at least one type of primer, dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate), is reacted to extend the primer to synthesize a DNA primer extension product. Specifically, it can be applied to primer extension methods, sequencing methods, conventional methods that do not involve temperature cycling, cycle sequencing methods, and the like.

更なる実施形態として、本発明は、前記のような逆転写方法及び/又は逆転写反応を含む核酸増幅方法に用いる試薬を提供する。当該試薬は、前記のような本発明に使用する特定の改変型核酸ポリメラーゼを少なくとも含めばよい。この試薬は、任意の逆転写反応及び核酸増幅反応に用いられ得るが、一つの実施形態として、DNAポリメラーゼ活性だけでなく、逆転写活性も有する核酸ポリメラーゼを含むので、例えば、RNAからの核酸増幅のために使用することができ、好ましくは、RT-PCR法において使用することができる。RT-PCRとしては、RT-PCRやqRT-PCR等が挙げられるが、これらに限定されない。即ち、本発明の試薬は、鋳型となる標的核酸(検出対象核酸)がRNAであっても核酸増幅できるため、汎用性の高い試薬とすることができる。本発明の試薬における前記改変型核酸ポリメラーゼの量は、本発明の効果を奏する限りにおいて限定されないが、例えば、逆転写反応及び/又は核酸増幅反応における終濃度が0.1~20U/20μlとなるような量を例示することができる。 As a further embodiment, the present invention provides a reagent for use in a reverse transcription method and/or a nucleic acid amplification method including a reverse transcription reaction as described above. The reagent may at least contain the specific modified nucleic acid polymerase used in the present invention as described above. This reagent can be used in any reverse transcription reaction and nucleic acid amplification reaction, but in one embodiment, it contains a nucleic acid polymerase that has not only DNA polymerase activity but also reverse transcription activity, so it can be used, for example, in nucleic acid amplification from RNA. It can be used for, preferably in RT-PCR method. Examples of RT-PCR include, but are not limited to, RT-PCR and qRT-PCR. That is, the reagent of the present invention can amplify a nucleic acid even if the target nucleic acid (nucleic acid to be detected) serving as a template is RNA, so it can be a highly versatile reagent. The amount of the modified nucleic acid polymerase in the reagent of the present invention is not limited as long as it achieves the effects of the present invention, but for example, the final concentration in the reverse transcription reaction and/or nucleic acid amplification reaction is 0.1 to 20 U/20 μl. Examples include amounts such as:

核酸増幅用試薬の一例としては、一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に互いに相補的である2種のプライマー、dNTP、及び上記のような本発明の核酸ポリメラーゼ、2価イオン、1価イオン及び緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーDNA伸長生成物に相補的である2種のプライマー、dNTP及び上記核酸ポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び/又はカリウムイオン、BSA、上述のような非イオン界面活性剤及び緩衝液を含むものとすることができる。RT-PCRに用いる試薬とする場合には、限定はされないが、例えば、反応液中終濃度が1mM以上となるマグネシウム塩 などの塩を含むことが好ましい。マグネシウム塩としては、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等のマグネシウム塩を挙げることができる。また、核酸増幅用試薬は、前記の逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼ以外に、他の核酸ポリメラーゼ(例えば、別のDNAポリメラーゼ)を更に含んでいてもよい。 Examples of reagents for nucleic acid amplification include two primers in which one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer, dNTPs, the nucleic acid polymerase of the present invention as described above, divalent ions, 1 valent ions and a buffer, and more specifically, two primers, one primer being complementary to the DNA extension product of the other, a dNTP and the above nucleic acid polymerase, magnesium ions, ammonium ions and/or potassium. It can include ionic, BSA, non-ionic surfactants and buffers as described above. When used as a reagent for RT-PCR, the reagent preferably contains a salt such as a magnesium salt, which has a final concentration of 1 mM or more in the reaction solution, although it is not limited thereto. Examples of the magnesium salt include magnesium salts such as magnesium chloride, magnesium sulfate, and magnesium acetate. Furthermore, the nucleic acid amplification reagent may further contain another nucleic acid polymerase (for example, another DNA polymerase) in addition to the aforementioned nucleic acid polymerase having reverse transcription activity.

核酸増幅用試薬の別の実施態様としては、一方のプライマーが他方のプライマーのDNA伸長生成物に互いに相補的である2種のプライマー、dNTP及び上述したような本発明における核酸ポリメラーゼ、2価イオン、1価イオン、緩衝液及び必要に応じて耐熱性核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び/又は3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を含む核酸増幅用試薬がある。該抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本核酸増幅用試薬は、PCRの感度上昇、非特異的増幅の軽減に特に有効である。 Another embodiment of the reagent for nucleic acid amplification includes two primers, one of which is complementary to the DNA extension product of the other primer, a dNTP, the nucleic acid polymerase of the present invention as described above, and a divalent ion. There are reagents for nucleic acid amplification that contain a monovalent ion, a buffer, and, if necessary, an antibody having an activity of suppressing the polymerase activity and/or 3'-5' exonuclease activity of a thermostable nucleic acid polymerase. Such antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and the like. The present nucleic acid amplification reagent is particularly effective in increasing PCR sensitivity and reducing non-specific amplification.

本発明の更なる別の一態様は、上記のような本発明に使用する特定の改変型核酸ポリメラーゼを少なくとも含む試薬キットであり得る。具体的には、本キットは、RNAからcDNAを合成する逆転写反応及び/又はRNAを鋳型とする核酸増幅反応を行うために用いられ得る。当該キットは、逆転写活性が向上した核酸ポリメラーゼを含むため、RNAを鋳型とする核酸増幅反応に好適に用いることができ、例えば、RT-PCR法等に好適に用いることができる。本発明では、特定の改変型核酸ポリメラーゼを使用することにより、マンガンイオンを必要とせずに、逆転写反応を行うことができるため、当該キットは、マンガンイオンを生じさせる成分(マンガン塩等)を含む必要が無い。好ましくは、当該キットはマグネシウムイオンを生じさせる成分(マグネシウム塩等)を含む態様であるのがよい。当該キットには、本発明の核酸増幅方法の手順を記載した添付文書等が含まれていてもよい。 Yet another aspect of the present invention may be a reagent kit containing at least the specific modified nucleic acid polymerase used in the present invention as described above. Specifically, this kit can be used to perform a reverse transcription reaction to synthesize cDNA from RNA and/or a nucleic acid amplification reaction using RNA as a template. Since the kit contains a nucleic acid polymerase with improved reverse transcription activity, it can be suitably used in a nucleic acid amplification reaction using RNA as a template, for example, it can be suitably used in RT-PCR. In the present invention, by using a specific modified nucleic acid polymerase, the reverse transcription reaction can be performed without the need for manganese ions. There is no need to include it. Preferably, the kit includes a component (such as a magnesium salt) that generates magnesium ions. The kit may include a package insert etc. that describes the procedure of the nucleic acid amplification method of the present invention.

更なる実施形態として、本発明は、前記のような本発明の核酸ポリメラーゼ、当該核酸ポリメラーゼを含む核酸増幅用試薬、又は当該核酸増幅用試薬を含む核酸増幅用キットを用いる核酸増幅方法を提供する。当該核酸増幅方法は、少なくとも以下の工程を含む方法であることが好ましい:
(a)配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、751位に相当するアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて、マンガンイオン不存在下でRNAからcDNAを合成する逆転写反応を行う工程、及び
(b)前記工程(a)の逆転写反応により生じた逆転写産物を鋳型として、前記核酸ポリメラーゼにより更に核酸増幅反応を行う工程、
上記方法によれば、前記工程(a)及び(b)を単一の改変型核酸ポリメラーゼにより実施するので、複数の酵素を組み合わせて用いる必要がなく、効率的に核酸増幅反応を行うことができる。また、特定の実施形態では、前記工程(b)においてTth DNAポリメラーゼ等の別のDNAポリメラーゼを更に組み合わせて使用してもよい。本発明に用いる核酸ポリメラーゼ、核酸増幅用試薬、及びキットは、マンガンイオンが存在しなくても、優れた逆転写活性を発揮することができるので、RNAを鋳型とする核酸増幅方法に好適である。本発明の核酸増幅方法は、例えば、RT-PCR反応を行う工程を包含する方法であり得る。逆転写反応工程は、本発明の核酸ポリメラーゼを鋳型RNAと所定条件(例えば、50~65℃で1~30分間)下で共存させることにより行うことができる。
As a further embodiment, the present invention provides a nucleic acid amplification method using the nucleic acid polymerase of the present invention as described above, a nucleic acid amplification reagent containing the nucleic acid polymerase, or a nucleic acid amplification kit containing the nucleic acid amplification reagent. . The nucleic acid amplification method preferably includes at least the following steps:
(a) Consists of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and the amino acid corresponding to position 751 consists of tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine performing a reverse transcription reaction for synthesizing cDNA from RNA in the absence of manganese ions using a nucleic acid polymerase having reverse transcription activity substituted with a neutral amino acid having a polar side chain selected from the group; b) further performing a nucleic acid amplification reaction with the nucleic acid polymerase using the reverse transcription product produced by the reverse transcription reaction of step (a) as a template;
According to the above method, since steps (a) and (b) are carried out using a single modified nucleic acid polymerase, there is no need to use multiple enzymes in combination, and the nucleic acid amplification reaction can be carried out efficiently. . Additionally, in certain embodiments, another DNA polymerase, such as Tth DNA polymerase, may be used in combination in step (b). The nucleic acid polymerase, nucleic acid amplification reagent, and kit used in the present invention can exhibit excellent reverse transcription activity even in the absence of manganese ions, and are therefore suitable for nucleic acid amplification methods using RNA as a template. . The nucleic acid amplification method of the present invention may include, for example, a step of performing an RT-PCR reaction. The reverse transcription reaction step can be carried out by allowing the nucleic acid polymerase of the present invention to coexist with template RNA under predetermined conditions (for example, at 50 to 65°C for 1 to 30 minutes).

前述のように、本発明によれば、マンガンイオンを生じさせる成分を使用せず、これに替えてマグネシウムイオン等の二価イオンを生じさせる成分を共存させることによっても、逆転写反応を効率的に行うことができる。従って、本発明の核酸増幅方法は、マンガンイオン以外の二価イオンを生じさせる成分を共存させる条件下で逆転写反応を行う工程を包含する方法であってもよいし、好ましくは、マンガンイオンに替えてマグネシウムイオンを共存させる条件下で逆転写反応を行う工程を包含する方法であってもよい。更に、本発明によればは精製工程を経ておらず核酸増幅反応を阻害し得る夾雑物質を含み得る生体試料からであっても逆転写反応(及び必要に応じてその後の増幅反応)を行うことができることも確認されている。従って、本発明の方法は、精製工程を経ていない生体試料を用いて逆転写反応を行う工程及び/又は増幅反応を行う工程を包含する方法であってもよい。また、本発明の方法は効率よく短時間で逆転写反応及び増幅反応を行うこともできる。従って、本発明の核酸増幅方法は、RNAからcDNAを合成する逆転写反応を5分以下で行う工程を包含する方法とすることができ、更には、逆転写反応及びPCR反応の全体にかかる時間が1時間以下であるRT-PCR方法としてもよい。 As described above, according to the present invention, the reverse transcription reaction can be efficiently carried out by not using a component that generates manganese ions, but instead by coexisting a component that generates divalent ions such as magnesium ions. can be done. Therefore, the nucleic acid amplification method of the present invention may include a step of performing a reverse transcription reaction under conditions in which a component that generates divalent ions other than manganese ions coexists, and preferably, Alternatively, a method may include a step of performing the reverse transcription reaction under conditions in which magnesium ions are present. Furthermore, according to the present invention, the reverse transcription reaction (and subsequent amplification reaction if necessary) can be performed even from a biological sample that has not undergone a purification process and may contain contaminants that may inhibit the nucleic acid amplification reaction. It has also been confirmed that this is possible. Therefore, the method of the present invention may include a step of performing a reverse transcription reaction and/or a step of performing an amplification reaction using a biological sample that has not undergone a purification step. Furthermore, the method of the present invention allows reverse transcription reactions and amplification reactions to be carried out efficiently and in a short time. Therefore, the nucleic acid amplification method of the present invention can include a step of performing a reverse transcription reaction for synthesizing cDNA from RNA in 5 minutes or less, and furthermore, the method can include a step of performing a reverse transcription reaction for synthesizing cDNA from RNA in 5 minutes or less, and furthermore, the method can include a step of performing a reverse transcription reaction for synthesizing cDNA from RNA in 5 minutes or less. It is also possible to use an RT-PCR method in which the time is 1 hour or less.

以下、本発明を実施例に基づき、より詳細に説明する。なお、本発明は実施例に特に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be explained in more detail based on Examples. Note that the present invention is not particularly limited to the examples.

実施例1
DNAポリメラーゼプラスミドの作製
人工合成により作成したThermus thermophilus HB8由来のDNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号2)、Themus sp Z05由来のDNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号4)をpBluescriptにクローニングし、それぞれ野生型Tth、Z05 DNAポリメラーゼを組み込んだプラスミドを作製した(それぞれpTth、pZ05)。変異をもつプラスミドの作製には、pTth、pZ05を鋳型に、KOD -Plus- Mutagenesis Kit(Toyobo)を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。二重変異の一部については作製した変異プラスミドを鋳型に、同様のキットを用いてさらに変異を入れることで作製した。作製したプラスミド、及びその際に使用した鋳型・プライマーを表1に示す。得られたプラスミドはエシェリシア・コリJM109を形質転換し、酵素調製に用いた。
Example 1
Preparation of DNA polymerase plasmid
A DNA polymerase gene derived from Thermus thermophilus HB8 (SEQ ID NO: 2) and a DNA polymerase gene derived from Themus sp Z05 (SEQ ID NO: 4), which were created by artificial synthesis, were cloned into pBluescript to create a plasmid incorporating wild type Tth and Z05 DNA polymerase, respectively. were produced (pTth and pZ05, respectively). A plasmid with a mutation was produced using pTth and pZ05 as templates and the KOD-Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo) according to the instruction manual. Some of the double mutations were created by using the created mutant plasmid as a template and further introducing mutations using a similar kit. Table 1 shows the constructed plasmids and the templates and primers used. The obtained plasmid was used to transform Escherichia coli JM109 and used for enzyme preparation.

実施例2
DNAポリメラーゼの作製
実施例1で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mlのアンピシリンを含有するTB培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mLを、500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mlのアンピシリンを含有する3mlのLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ製)で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリJM109(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にて16時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mlの破砕緩衝液(30mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、耐熱性DNAポリメラーゼを得た。
Example 2
Preparation of DNA polymerase
The bacterial cells obtained in Example 1 were cultured as follows. First, 80 mL of sterilized TB medium (Molecular cloning 2nd edition, p.A.2) containing 100 μg/ml ampicillin was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. Escherichia was cultured in 3 ml of LB medium (1% Bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; manufactured by Gibco) containing 100 μg/ml of ampicillin in advance at 37°C for 16 hours. E. coli JM109 (plasmid transformed strain) (test tube used) was inoculated and cultured at 37° C. for 16 hours with aeration. The bacterial cells were collected from the culture medium by centrifugation, suspended in 50 ml of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then sonicated to remove the bacterial cells. The cells were crushed to obtain a cell disruption solution. Next, the cell lysate was treated at 80° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Furthermore, nucleic acid removal treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate salting out, and heparin sepharose chromatography were performed, and finally, storage buffer (50mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50mM potassium chloride, 1mM dithiothreitol, 0 .1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin) to obtain a thermostable DNA polymerase.

上記精製工程のDNAポリメラーゼ活性測定は、以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。 Measurement of DNA polymerase activity in the above purification step was performed using the following procedure. In addition, when the enzyme activity was high, the sample was diluted and measured.

(試薬)
A液: 40mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)、16mM 塩化マグネシウム、15mM ジチオスレイトール、100μg/ml BSA
B液: 1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C液: 1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D液: 20% トリクロロ酢酸(2mM ピロリン酸ナトリウム)
E液: 1mg/ml 仔牛胸腺DNA
(reagent)
Solution A: 40mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 16mM magnesium chloride, 15mM dithiothreitol, 100μg/ml BSA
Solution B: 1.5μg/μl activated calf thymus DNA
Solution C: 1.5mM dNTP (250cpm/pmol [3H]dTTP)
Solution D: 20% trichloroacetic acid (2mM sodium pyrophosphate)
Solution E: 1mg/ml calf thymus DNA

(方法)
A液25μl、B液5μl、C液5μl及び滅菌水10μlを、マイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液5μlを加えて、75℃で10分間反応する。その後冷却し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製Tri-Carb2810 TR)を用いて計測し、鋳型DNAへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の1単位はこの条件下で30分当り10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。この結果、作製されたいずれの改変型DNAポリメラーゼも十分なDNAポリメラーゼ活性を有していることが確認された。
(Method)
Add 25 μl of solution A, 5 μl of solution B, 5 μl of solution C, and 10 μl of sterilized water to a microtube, stir and mix, then add 5 μl of the above purified enzyme dilution and react at 75° C. for 10 minutes. Thereafter, it is cooled, 50 μl of solution E and 100 μl of solution D are added, and after stirring, the mixture is further cooled on ice for 10 minutes. This liquid was filtered with a glass filter (GF/C filter manufactured by Whatman), thoroughly washed with 0.1N hydrochloric acid and ethanol, and the radioactivity of the filter was measured using a liquid scintillation counter (Tri-Carb2810 TR manufactured by Packard). Nucleotide incorporation into template DNA was measured. One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that incorporated 10 nmol of nucleotide into the acid-insoluble fraction per 30 minutes under these conditions. As a result, it was confirmed that all of the produced modified DNA polymerases had sufficient DNA polymerase activity.

実施例3
RT-PCRによるインフルエンザRNAの検出
実施例2で作製したDNAポリメラーゼを用いて、RNAからの1ステップでのRT-PCRを実施した。RT-PCRには5×Buffer for rTth/TTx(DNA/RNA)(Toyobo製)を用い、1×Buffer、および2.5mM Mn(OAc)もしくは2.5mM MgCl、0.4mM dNTPs、インフルエンザRNAを増幅する0.4pmolのプライマー(配列番号13及び14)、0.2pmolのプローブ(配列番号15)、1Uの抗体混合酵素を含む20μlの反応液にインフルエンザRNA、10コピーを添加し、90℃、30秒の前反応の後、60℃、5分の逆転写反応、95℃、60秒での再度、前反応後、95℃、5秒→60℃、30秒を40サイクル繰り返すスケジュールでリアルタイムPCRを行った。酵素には野生型Tth DNAポリメラーゼ、改変型Tth DNAポリメラーゼ(E683K、F751Y)、野生型のZ05 DNAポリメラーゼ、改変型Z05 DNAポリメラーゼ(F751Y)を使用し、N=2の試験を実施した。
Example 3
Detection of influenza RNA by RT-PCR
Using the DNA polymerase prepared in Example 2, one-step RT-PCR was performed from RNA. For RT-PCR, 5×Buffer for rTth/TTx (DNA/RNA) (manufactured by Toyobo) was used, 1×Buffer, and 2.5mM Mn(OAc) 2 or 2.5mM MgCl 2 , 0.4mM dNTPs, and influenza. Add 10 6 copies of influenza RNA to a 20 μl reaction solution containing 0.4 pmol of primers for amplifying RNA (SEQ ID NO: 13 and 14), 0.2 pmol of probe (SEQ ID NO: 15), and 1 U of antibody mixed enzyme, After pre-reaction at 90°C for 30 seconds, reverse transcription reaction at 60°C for 5 minutes, again at 95°C for 60 seconds, and after pre-reaction, repeat 40 cycles of 95°C, 5 seconds → 60°C, 30 seconds. Real-time PCR was performed. An N=2 test was conducted using wild-type Tth DNA polymerase, modified Tth DNA polymerase (E683K, F751Y), wild-type Z05 DNA polymerase, and modified Z05 DNA polymerase (F751Y) as enzymes.

表2にはTth DNAポリメラーゼと改変型Tth DNAポリメラーゼ(E683K、F751Y)のCt値をまとめた結果を示す。Mn(OAc)存在下、野生型のTth DNAポリメラーゼと比較し、F751Yの改変型Tth DNAポリメラーゼのCtは若干小さく、効率よくRT-PCRを実施できた。また、Mn(OAc)に替えてMgClを使用した条件下では、野生型のTth DNAポリメラーゼを用いた場合にCt値の大幅な遅れが確認された。一方、F751Yの改変型Tth DNAポリメラーゼを用いる場合のCt値は6程度小さく、50倍以上効率よく、RT-PCRを実施できた。特許第4468919号記載の変異体であるE683Kと比較しても、Ct値は1~2程度小さく、2~4倍程度効率が良いことが示された。 Table 2 shows a summary of the Ct values of Tth DNA polymerase and modified Tth DNA polymerase (E683K, F751Y). In the presence of Mn(OAc) 2 , the Ct of the F751Y modified Tth DNA polymerase was slightly smaller than that of the wild type Tth DNA polymerase, and RT-PCR could be performed efficiently. Furthermore, under conditions where MgCl2 was used instead of Mn(OAc) 2 , a significant delay in the Ct value was confirmed when wild-type Tth DNA polymerase was used. On the other hand, when F751Y modified Tth DNA polymerase was used, the Ct value was about 6 lower, and RT-PCR could be performed more than 50 times more efficiently. Even when compared with E683K, a mutant described in Patent No. 4,468,919, the Ct value was about 1 to 2 lower, and it was shown to be about 2 to 4 times more efficient.

表3にはZ05 DNAポリメラーゼと改変型Z05 DNAポリメラーゼ(F751Y)のCt値をまとめた結果を示す。Mn(OAc)存在下、野生型のZ05 DNAポリメラーゼと比較し、F751Yの改変型Z05ポリメラーゼの場合のCtは変化は見られなかった。また、Mn(OAc)に替えてMgClを使用した条件下では、野生型のZ05 DNAポリメラーゼを用いた場合に野生型Tth DNAポリメラーゼと同様にCt値の大幅な遅れが確認された。一方、F751Yの改変型Z05 DNAポリメラーゼを用いる場合のCt値は3倍程度小さく、10倍程度効率よく、RT-PCRを実施できた。この結果から、Tth DNAポリメラーゼにおける改変体と同様に、Z05 DNAポリメラーゼにおける改変体であっても、改変型DNAポリメラーゼでRT-PCRの効率が改善しており、マンガンイオン不存在下でも有効に逆転写反応を行うことができていることが示された。 Table 3 shows a summary of the Ct values of Z05 DNA polymerase and modified Z05 DNA polymerase (F751Y). In the presence of Mn(OAc) 2 , no change in Ct was observed for the F751Y modified Z05 polymerase compared to the wild type Z05 DNA polymerase. Furthermore, under conditions where MgCl 2 was used instead of Mn(OAc) 2 , when wild-type Z05 DNA polymerase was used, a significant delay in Ct value was confirmed, similar to wild-type Tth DNA polymerase. On the other hand, when using the modified F751Y Z05 DNA polymerase, the Ct value was about 3 times lower, and RT-PCR could be performed about 10 times more efficiently. From this result, similar to the modified version of Tth DNA polymerase, even the modified version of Z05 DNA polymerase improves the efficiency of RT-PCR with the modified DNA polymerase, and it can be effectively reversed even in the absence of manganese ions. It was shown that photoreaction could be performed.

本試験例で使用した反応液は、前記の改変型DNAポリメラーゼ以外に逆転写酵素を含まないことから、本発明のように特定のDNAポリメラーゼを使用することにより、全く予想外のことにマンガンイオン不存在下でも高い逆転写活性を発揮できたことが分かる。本試験例の結果から、このDNAポリメラーゼを単一の反応酵素として使用する場合であっても、逆転写反応及び増幅反応(PCR反応)を効率よく行うことができることが示された。 Since the reaction solution used in this test example does not contain reverse transcriptase other than the modified DNA polymerase described above, by using a specific DNA polymerase as in the present invention, manganese ion It can be seen that high reverse transcription activity could be exhibited even in its absence. The results of this test example showed that even when this DNA polymerase was used as a single reaction enzyme, reverse transcription reactions and amplification reactions (PCR reactions) could be performed efficiently.

実施例4
RT-PCRによるSARS-CoV-2 RNAの検出
実施例2で作製した改変型Tth DNAポリメラーゼ(F751Y)を用いて、マンガンイオン不存在下でRNAからの1ステップでのRT-PCRを実施した。RT-PCRには5×Buffer for rTth/TTx(DNA/RNA)(Toyobo製)を用い、1×Buffer、2.5mM MgCl、0.4mM dNTPs、SARS-CoV-2 RNAを増幅する0.4pmolのプライマー(配列番号16及び17)、0.2pmolのプローブ(配列番号18)、1Uの抗体混合酵素を含む20μlの反応液にSARS-CoV-2 RNA 2500、625、156、39、10、0コピーを添加し、90℃、30秒の前反応の後、60℃、5分の逆転写反応、95℃、60秒での再度、前反応後、95℃、5秒→60℃、30秒を40サイクル繰り返すスケジュールでリアルタイムPCRを行った。
Example 4
Detection of SARS-CoV-2 RNA by RT-PCR
Using the modified Tth DNA polymerase (F751Y) prepared in Example 2, one-step RT-PCR from RNA was performed in the absence of manganese ions. For RT-PCR, 5×Buffer for rTth/TTx (DNA / RNA) (manufactured by Toyobo) was used. SARS-CoV-2 RNA 2500, 625, 156, 39, 10, After pre-reaction at 90°C for 30 seconds, reverse transcription reaction at 60°C for 5 minutes, again at 95°C for 60 seconds, after pre-reaction, 95°C, 5 seconds → 60°C, 30 seconds. Real-time PCR was performed on a schedule that repeated 40 cycles per second.

図1は、RT-PCRの増幅曲線、表4にはCt値を示す。マンガンイオンを生じさせる成分に替えて、MgClを使用した場合でも、10コピーのRNAまで検出が可能であった。本発明により、有害な影響が懸念されているMnを使用することなく、RT-PCRが可能であり、環境等への影響を減らすことが可能となることが分かる。 FIG. 1 shows the RT-PCR amplification curve, and Table 4 shows the Ct values. Even when MgCl 2 was used instead of the component that generates manganese ions, it was possible to detect up to 10 copies of RNA. It can be seen that according to the present invention, RT-PCR can be performed without using Mn, which is feared to have harmful effects, and the impact on the environment can be reduced.

実施例5
RT-PCRによるノロウイルスRNAの検出
実施例2で作成した改変型Tth DNAポリメラーゼ(Q509R/F751Y)を用いて、マンガンイオン不存在下でRNAからの1ステップでのRT-PCRを実施した。RT-PCRには5×Buffer for rTth/TTx(DNA/RNA)(Toyobo製)を用い、1×Buffer、3.75mM MgCl、0.4mM dNTPs、ノロウイルス検出キットG1/G2-高速プローブ検出 Quick Step-付属のプライマー液 2μL、プローブ液 2μL、6Uの抗体混合酵素を含む20μlの反応液にノロウイルスG1 RNA、およびG2 RNAそれぞれ10、10、25コピーを添加し、90℃、60秒の前反応の後、56℃、5分の逆転写反応後、95℃、1秒→56℃、10秒を5サイクル、95℃、1秒→54℃、10秒を5サイクル、95℃、1秒→52℃、10秒を40サイクルでリアルタイムPCRを行った。
Example 5
Detection of norovirus RNA by RT-PCR
Using the modified Tth DNA polymerase (Q509R/F751Y) created in Example 2, one-step RT-PCR was performed from RNA in the absence of manganese ions. For RT-PCR, use 5x Buffer for rTth/TTx (DNA/RNA) (manufactured by Toyobo), 1x Buffer, 3.75mM MgCl 2 , 0.4mM dNTPs, Norovirus Detection Kit G1/G2 - High Speed Probe Detection Quick Step - Add 10 3 , 10 2 , and 25 copies of norovirus G1 RNA and G2 RNA to a 20 μl reaction solution containing 2 μL of the attached primer solution, 2 μL of probe solution, and 6 U of antibody mixed enzyme, and incubate at 90°C for 60 seconds. After pre-reaction, after reverse transcription reaction at 56°C for 5 minutes, 5 cycles of 95°C, 1 second → 56°C, 10 seconds, 5 cycles of 95°C, 1 second → 54°C, 10 seconds, 95°C, 1 Real-time PCR was performed with 40 cycles of 10 seconds at 52°C.

ノロウイルス検出キットG1/G2-高速プローブ検出 Quick Step-付属のプライマー液、プローブ液は、反応が問題なく実施されるとインターナルコントロール(IC)としてFAMのシグナルが得られる。また、G1型ノロウイルスRNAが含まれるとCy5のシグナルが、G2型ノロウイルスRNAが含まれるとROXのシグナルが得られる。表5にはCt値を示す。今回、マンガンイオンを含まず、これに替えてマグネシウムイオンを含む反応系でもIC、G1型、G2型すべての検出が可能であった。今回の反応は約1時間でRT-PCRが完了する高速サイクルとなっている。このような条件でも問題なく反応が実施された。また本反応系に10%糞便液1μLを添加しても、同様の結果が得られた。このことからMnを使用せず、替わりにMg存在下とした場合でも高速かつ阻害物質を含む条件で反応が実施できることが示された。 Norovirus Detection Kit G1/G2 - High Speed Probe Detection Quick Step - If the attached primer solution and probe solution are successfully carried out, a FAM signal will be obtained as an internal control (IC). Furthermore, when G1 type norovirus RNA is included, a Cy5 signal is obtained, and when G2 type norovirus RNA is included, a ROX signal is obtained. Table 5 shows the Ct values. This time, it was possible to detect all of IC, G1 type, and G2 type in a reaction system that did not contain manganese ions but instead contained magnesium ions. This reaction is a high-speed cycle in which RT-PCR is completed in about 1 hour. The reaction was carried out without problems even under these conditions. Similar results were also obtained when 1 μL of 10% fecal fluid was added to this reaction system. This indicates that the reaction can be carried out at high speed and under conditions containing inhibitors even when Mn is not used but instead in the presence of Mg.

本発明により、分子生物学の分野において有用な逆転写方法及び逆転写反応を含む核酸増幅方法(例えば、RT-PCR方法)が提供される。本発明により、従来は一般的に必要と考えられてきたマンガンを使用せずに逆転写反応を実施できるという利点がある。これにより、例えば、マンガンによる環境等への影響を抑えて、環境等にやさしい反応を可能にする。また、マンガンの使用が不要になることから、マンガン存在下で生じ得るポリメラーゼの忠実性低下の影響も抑えられることが期待できる。本発明は、遺伝子発現解析に際して特に有用であり、研究用途のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。 The present invention provides a reverse transcription method and a nucleic acid amplification method (eg, RT-PCR method) including a reverse transcription reaction, which are useful in the field of molecular biology. The present invention has the advantage that the reverse transcription reaction can be carried out without using manganese, which has heretofore been generally considered necessary. Thereby, for example, the influence of manganese on the environment can be suppressed, and an environment-friendly reaction can be performed. Furthermore, since the use of manganese is no longer necessary, it is expected that the influence of decreased fidelity of the polymerase that may occur in the presence of manganese can be suppressed. The present invention is particularly useful in gene expression analysis, and can be used not only for research purposes but also for clinical diagnosis, environmental testing, etc.

Claims (18)

配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、751位に相当する部位のアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて、マンガンイオン不存在下でRNAからcDNAを合成する逆転写反応を行う、逆転写方法。 A group consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and in which the amino acid at the site corresponding to position 751 is tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine. A reverse transcription method for performing a reverse transcription reaction for synthesizing cDNA from RNA in the absence of manganese ions using a nucleic acid polymerase having reverse transcription activity substituted with a neutral amino acid having a polar side chain selected from the above. 前記核酸ポリメラーゼが、配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と96%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、751位に相当するアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている核酸ポリメラーゼである、請求項1に記載の逆転写方法。 The nucleic acid polymerase consists of an amino acid sequence having 96% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and the amino acid corresponding to position 751 is tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine. 2. The reverse transcription method according to claim 1, wherein the nucleic acid polymerase is substituted with a neutral amino acid having a polar side chain selected from the group consisting of: 前記核酸ポリメラーゼが、配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列において751位に相当するアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている核酸ポリメラーゼである、請求項1に記載の逆転写方法。 The nucleic acid polymerase is a neutral amino acid in which the amino acid corresponding to position 751 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 has a polar side chain selected from the group consisting of tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine. The reverse transcription method according to claim 1, wherein the nucleic acid polymerase is substituted with . 前記核酸ポリメラーゼをマグネシウムイオン共存下で反応させる、請求項1に記載の逆転写方法。 The reverse transcription method according to claim 1, wherein the nucleic acid polymerase is reacted in the presence of magnesium ions. 精製工程を経ていない生体試料を用いて逆転写反応を行う、請求項1に記載の逆転写方法。 The reverse transcription method according to claim 1, wherein the reverse transcription reaction is performed using a biological sample that has not undergone a purification step. 逆転写反応を5分以下で行う、請求項1に記載の逆転写方法。 The reverse transcription method according to claim 1, wherein the reverse transcription reaction is performed in 5 minutes or less. 前記核酸ポリメラーゼが、更に、509位及び744位からなる群より選択される少なくとも一つに相当する部位においてアミノ酸の改変を含む、請求項1に記載の逆転写方法。 The reverse transcription method according to claim 1, wherein the nucleic acid polymerase further comprises an amino acid modification at a site corresponding to at least one selected from the group consisting of positions 509 and 744. 509位及び744位からなる群より選択される少なくとも一つに相当する部位におけるアミノ酸の改変が、ヒスチジン、リジン及びアルギニンからなる群より選択される塩基性アミノ酸への置換である、請求項7に記載の逆転写方法。 Claim 7, wherein the amino acid modification at a site corresponding to at least one selected from the group consisting of positions 509 and 744 is a substitution with a basic amino acid selected from the group consisting of histidine, lysine, and arginine. Reverse transcription method as described. 以下の工程:
(a)配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、751位に相当するアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて、マンガンイオン不存在下でRNAからcDNAを合成する逆転写反応を行う工程、及び
(b)前記工程(a)の逆転写反応により生じた逆転写産物を鋳型として、前記核酸ポリメラーゼにより更に核酸増幅反応を行う工程、
を包含する、核酸増幅方法。。
The following steps:
(a) Consists of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and the amino acid corresponding to position 751 consists of tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine performing a reverse transcription reaction for synthesizing cDNA from RNA in the absence of manganese ions using a nucleic acid polymerase having reverse transcription activity substituted with a neutral amino acid having a polar side chain selected from the group; b) further performing a nucleic acid amplification reaction with the nucleic acid polymerase using the reverse transcription product produced by the reverse transcription reaction of step (a) as a template;
A nucleic acid amplification method comprising: .
前記工程(a)の逆転写反応をマグネシウムイオン共存下で行う、請求項9に記載の核酸増幅方法。 10. The nucleic acid amplification method according to claim 9, wherein the reverse transcription reaction in step (a) is performed in the presence of magnesium ions. 前記工程(a)の逆転写反応を精製工程を経ていない生体試料を用いて行う、請求項9に記載の核酸増幅方法。 10. The nucleic acid amplification method according to claim 9, wherein the reverse transcription reaction in step (a) is performed using a biological sample that has not undergone a purification step. 前記工程(a)の逆転写反応を5分以下で完了する、請求項9に記載の核酸増幅方法。 The nucleic acid amplification method according to claim 9, wherein the reverse transcription reaction in step (a) is completed in 5 minutes or less. RT-PCR方法である、請求項9に記載の核酸増幅方法。 The nucleic acid amplification method according to claim 9, which is an RT-PCR method. 逆転写反応及びPCR反応を1時間以下で行うRT-PCR方法である、請求項9に記載の核酸増幅方法。 The nucleic acid amplification method according to claim 9, which is an RT-PCR method in which the reverse transcription reaction and PCR reaction are performed in 1 hour or less. 請求項1に記載の逆転写方法又は請求項9に記載の核酸増幅方法に用いる試薬であって、配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、751位に相当するアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼを含む、試薬。 A reagent used in the reverse transcription method according to claim 1 or the nucleic acid amplification method according to claim 9, comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and a nucleic acid polymerase having reverse transcription activity, in which the amino acid corresponding to position 751 is replaced with a neutral amino acid having a polar side chain selected from the group consisting of tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine. ,reagent. 請求項1に記載の逆転写方法又は請求項9に記載の核酸増幅方法に用いる試薬キットであって、配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、751位に相当するアミノ酸がチロシン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニン、及びアスパラギンからなる群より選択される極性側鎖を有する中性アミノ酸に置換されている逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼを含む、試薬キット。 A reagent kit for use in the reverse transcription method according to claim 1 or the nucleic acid amplification method according to claim 9, comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2. , and a nucleic acid polymerase having reverse transcription activity, in which the amino acid corresponding to position 751 is substituted with a neutral amino acid having a polar side chain selected from the group consisting of tyrosine, cysteine, glutamine, serine, threonine, and asparagine. Including, reagent kit. マンガンイオンを生じさせる成分を含まない、請求項16に記載の試薬キット。 The reagent kit according to claim 16, which does not contain a component that generates manganese ions. 更にマグネシウムイオンを生じさせる成分を含む、請求項16に記載の試薬キット。 The reagent kit according to claim 16, further comprising a component that generates magnesium ions.
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