JP2023551694A - 回転フレーム装置及び生体適合性足場構築物 - Google Patents

Abstract

生体適合性足場構築物には、複数のコラーゲン繊維ストランドが含まれ、その第１の部分は、第１の生体適合性溶液によって被覆されており、任意選択で、その第２の部分は、第１の生体適合性溶液とは異なる第２の生体適合性溶液によって被覆されている。被覆には細胞が含まれていてもよい。さらに、足場は回転フレームコレクタ上に構築される。

Description

米国政府支援の陳述
本発明は、ＤＡＲＰＡ契約ＨＲ００１１－１５－９０００６に基づく政府支援により作成された。米国政府は、発明に関して一定の権利を有する。

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月３０日に出願された「Ｒｏｔａｔｉｎｇ Ｆｒａｍｅ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄ（回転フレーム装置及び複合生物学的足場）」と題する米国仮特許出願第６３／１１９，６２８号に対する優先権を主張する。この米国仮特許出願の全開示は参照により本明細書に組み込まれる。本出願はこのほか、２０２０年１１月３０日に出願された「Ｍｉｃｒｏｐｏｓｔ Ａｒｒａｙ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄ（マイクロポストアレイ装置及び複合生物学的足場）」と題する米国仮特許出願第６３／１１９，６１８号に対する優先権を主張する。この米国仮特許出願の全開示は参照により本明細書に組み込まれる。

筋骨格組織の損傷が、米国で治療される最も一般的な損傷の１つに挙げられる。しかし、現在の治療法では、損傷した組織の機能が損なわれ、再損傷率が高くなることがよくある。そのため、機能的な本来の組織の再生を促進することを目的として、足場のような移植片を製造するための多くの組織工学手法が開発されてきた。対象とする組織の生化学的、形態学的及び機能的な特性を再現することは特に重要である。

積層造形手法である３次元（３Ｄ）バイオプリンティングを、再生医療用途に用いる可能性がある足場の製造のために、実施することが多い。３Ｄバイオプリンティングにより、細胞及び生体材料を正確に操作して、設計された、多くの場合複雑な３Ｄ形状を作成することができる。しかし、バイオプリンティング手法では、典型的には、主要な構造材料として柔軟なヒドロゲルを利用している［Ｍａｎｄｒｙｃｋｙ ２０１６］。このようなヒドロゲルの機械的特性は、多くの場合、生来の靭帯組織及び腱組織の機械的特性よりも桁違いに低くなる。そのため、典型的なバイオプリンティング手法では、筋骨格組織の機能的特性を充分に再現することができず、組織修復のための耐荷重足場を作製することができない。

印刷された部分の機械的特性を改善するために、ヒドロゲルと共に熱可塑性ポリマーを組み込むハイブリッドバイオプリンティング手法が開発されている［Ｍｅｒｃｅｒｏｎ ２０１５］。しかし、印刷された合成素材の多くが、依然として機械的強度が限られており、損傷の治癒及び組織の再生に悪影響を及ぼす可能性がある。

このような課題に対処するために、コラーゲンなどの強力な天然生体材料を使用した繊維ベースの組織工学手法が数多く開発されてきた［Ｔａｍａｙｏｌ ２０１３］。このような手法は、織物の充分に確立された臨床使用に基づいているが、細胞化された足場を製造するための追加の手段を組み込んでいる。

このほか、治療用細胞の使用により、遺伝性、変性性、炎症性及び外傷性の筋骨格系疾患の治療を改善する可能性がもたらされる［Ｏ´Ｋｅｅｆｅ ２０１９］。これにより、生体材料足場単独の場合とは対照的に、治癒率が向上し、組織の全体的な再生と機能回復が向上する可能性がある。これは、細胞減少環境及び血管減少環境では受動的細胞内方成長が制限される可能性がある靭帯様組織及び腱様組織の場合に特に当てはまる。

生体材料足場を製造するためのいくつかの手法では、織り、編み及び編組という伝統的な織物製造プロセスによって製造される、予め製造された繊維を利用する。生体材料繊維を、湿式紡糸、マイクロ流体紡糸、生体紡糸、界面錯体形成及び溶融紡糸によって、このようなプロセスの原料として製造することができる［Ｔａｍａｙｏｌ ２０１３］。織りを使用して、２セットの縦糸又は横糸を直角に織り交ぜることによって、設計された間隙率、形態及び幾何学形状を備えたポリマー足場を作成することができる［Ａｂｒａｈａｍｓｓｏｎ ２０１０］。編みは、外科用メッシュを製造するために一般的に使用される手法であり、一連の相互接続されたループ内の絡み合った糸又はより糸から３Ｄ形状を形成する［Ｓａｈｏｏ ２００７］。編組は、複数の繊維ストランドを絡み合わせることによって、複雑な生体材料の構造又はパターンを形成することができる［Ｗａｌｔｅｒｓ ２０１２］。さらに、縫合糸で束ねられた平行な繊維の束などの比較的単純な形状を、手作業による組み立てによって作製している［Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ ２００６］。

足場の一体部分として生成される繊維を利用して生体材料足場を生成する足場製造プロセスには、電界紡糸、湿式紡糸及び直接描画が含まれる。このような手法では、溶媒蒸発、溶液槽内での重合、温度ベースの再結晶などのプロセスを利用して、生体材料溶液から超極細繊維足場を形成する。例えば、電界紡糸を使用して、組織形成を誘導するために、生体模倣表面パターンを有するランダムに配向されるか整列したポリマー繊維マットを形成している［Ｍａｕｃｋ ２００９］。湿式紡糸を、原料として繊維を形成するために使用することに加えて、回転心棒上に繊維を収集することによって繊維形成プロセス中に足場を作製するために利用することもできる［Ｋａｉｓｅｒ２０１９］。直接描画により、間隙率、繊維サイズ及び繊維配向の制御に優れた繊維ベースの足場を形成することができる［Ｗｕ ２０１５］。

しかし、織り、編み、編組、電界紡糸、湿式紡糸及び直接描画を使用して細胞化足場を作成するために必要な作製後細胞播種プロセスは、人間によるばらつきの影響を受ける可能性があり、生体材料足場の巨視的規模の形状及び多孔性に大きく依存する場合がある。例えば、孔径が小さいと、特に厚みの大きい足場又は複雑な３Ｄ形状の足場の場合、播種中の細胞の浸潤が制限される可能性がある。逆に、間隙率の高い足場では、播種された細胞を全体に均一に保持することが困難になる可能性がある。細胞播種が足場の微小規模及び巨視的規模の形状に依存しているため、設計領域内にさまざまな細胞集団を含む不均一な組織を作製する場合に特に、細胞分布全体の制御が制限される可能性がある。

プレハブ式足場上に細胞を播種する際の課題に対処するために、足場の製造プロセス中に細胞又は細胞を含む材料を直接操作する、さまざまな繊維ベースの手法が開発されている［Ｔａｍａｙｏｌ ２０１３］。細胞播種を必要とする技術と比較して、このような手法により、全体の細胞分布の一貫性と制御が向上した細胞化足場が得られる可能性がある。ポリエステル糸を、細胞を含んだヒドロゲルで被覆し、円筒形心棒周りに巻き付けて、３Ｄ管状構造を形成している［Ｌｉｂｅｒｓｋｉ ２０１１］。マイクロ流体システムを使用して、二次足場構造を形成せずに移植されることがあり得る細胞を包含するコアシェルヒドロゲル繊維を形成されている［Ｓｕｋｉｍｏｔｏ ２０１１］。微小な織り手法を利用して、類似する細胞を含んだコアシェルヒドロゲル繊維からセンチメートル規模の生体布地を形成した［Ｏｎｏｅ ２０１１］。しかし、細胞を含んだヒドロゲル繊維の機械的強度は低いため、従来の繊維製造手法を使用して加工する際に、ヒドロゲル繊維の能力が制限される［Ｏｎｏｅ ２０１１］。典型的なヒドロゲルベースのバイオプリンティングとほぼ同じ直接描画手法では、細胞懸濁液をプリントヘッド内で架橋して、繊維状の押出物から細胞を含んだ足場を形成した［Ｇｈｏｒｂａｎｉａｎ ２０１４］。全体として、このようなヒドロゲルベースの手法を使用して形成された足場の機械的特性が劣るため、筋骨格組織損傷の治療用の耐荷重足場としての適用性は限られている。

上記で考察した問題のうちの１つ又は複数に対処することが望ましいであろう。

一態様では、本開示は、回転フレーム上に作製された複数のコラーゲン超極細繊維ストランドを含む足場構築物を対象とする。ここで、ストランドは、細胞が均一に懸濁された生体適合性溶液で被覆され、ストランドは、生体組織に匹敵する特性を有する。

足場構築物は、第１の生体適合性溶液と、第１の生体適合性溶液とは異なる第２の生体適合性溶液と、実質的に整列した複数のコラーゲン超極細繊維ストランドと、を含んでもよい。コラーゲン超極細繊維の第１の部分を、第１の生体適合性溶液によって被覆してもよく、コラーゲン超極細繊維の第２の部分を、第２の生体適合性溶液によって被覆してもよい。

別の態様では、本開示は、足場構築物を作成するための装置を対象とする。この装置は、針を通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配するように構成された送達デバイスと、実質的平面状フレームと、第１の生体適合性溶液を受容するように構成された第１のウェルを含む溶液マニホールドであって、溶液マニホールドは、送達デバイスと実質的平面状フレームとの間に配置される、溶液マニホールドと、実質的平面状フレームを回転軸回りで回転させるように構成された回転デバイスと、を備えてもよい。装置は、実質的平面状フレームの回転により、針及び溶液マニホールドを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配し、それによって、コラーゲン超極細繊維ストランドを溶液マニホールド内の第１の生体適合性溶液で被覆し、コラーゲン超極細繊維ストランドを実質的平面状フレーム周りに巻き付けるように構成されてもよい。

別の態様では、本開示は、足場構築物の作成方法を対象とする。この方法は、コラーゲン超極細繊維ストランドを実質的平面状フレームに貼り付けることと、実質的平面状フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために、回転軸回りで実質的平面状フレームを回転させることと、を含んでもよい。実質的平面状フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けると、送達デバイスからコラーゲン超極細繊維ストランドが引き出され、それによって、針を通してコラーゲン超極細繊維ストランドを牽引し、第１の生体適合性溶液で満たされた溶液マニホールドの第１のウェルを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出す。

実施形態の他のシステム、方法、特徴及び利点が、以下の図面及び詳細な説明を検討すれば、当業者には明らかであるか、明らかになるであろう。そのような追加のシステム、方法、特徴及び利点がいずれも、この説明及びこの概要に含まれ、実施形態の範囲内にあり、特許請求の範囲によって保護されることが意図される。

以下の条項群は、さまざまな開示の実施形態を特定する。任意の条項群の特徴が、他の条項群の１つ又は複数の特徴と結合されたり、及び／又は交換されたりし得ることが理解されよう。

条項－２溶液手法
条項１
足場構築物であって、
複数のコラーゲン超極細繊維を備える足場構築物において、
コラーゲン超極細繊維の第１の部分を第１の生体適合性溶液によって被覆し、コラーゲン超極細繊維の第２の部分を第２の生体適合性溶液によって被覆する、足場構築物。

条項２
複数のコラーゲン微細繊維は互いに実質的に平行である、条項１に記載の足場構築物。

条項３
複数のコラーゲン超極細繊維は、複数の層のコラーゲン超極細繊維を含む、条項１に記載の足場構築物。

条項４
隣接する層のコラーゲン超極細繊維は互いに実質的に整列している、条項３に記載の足場構築物。

条項５
第１の生体適合性溶液及び第２の生体適合性溶液の少なくとも１つが、ヒアルロン酸溶液中に懸濁された細胞を含む、条項１に記載の足場構築物。

条項６
ヒアルロン酸溶液中に懸濁された細胞は、細胞適合性環境を提供する細胞培地中で調製される、条項５に記載の足場構築物。

条項７
第１の生体適合性溶液によって被覆されたコラーゲン超極細繊維の第１の部分は、足場の第１の縦方向部分に配置され、
第２の生体適合性溶液によって被覆されたコラーゲン超極細繊維の第２の部分は、足場の第２の縦方向部分に離散的に配置され、
第１の縦方向部分は第２の縦方向部分とは異なる、条項１に記載の足場構築物。

条項８
足場構築物を作成するための装置であって、装置は、
オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配するように構成された送達デバイスと、
回転可能フレームと、
第１の生体適合性溶液を受容するように構成された第１のウェルを含む溶液マニホールドであって、溶液マニホールドは、送達デバイスと回転可能フレームとの間に配置される、溶液マニホールドと、
回転可能フレームを回転軸回りで回転させるように構成された回転デバイスと、を具備する、装置において、
装置は、回転可能フレームの回転により、オリフィス及び溶液マニホールドを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、溶液マニホールド内の第１の生体適合性溶液でコラーゲン超極細繊維ストランドを被覆し、回転可能フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるように構成される、装置。

条項９
装置は、回転可能フレームの異なる部分周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために、送達デバイスと回転可能フレームとが回転軸に沿って互いに対して平行移動するように構成される、条項８に記載の装置。

条項１０
溶液マニホールドの第１のウェルは、コラーゲン超極細繊維ストランドの通過を可能にするように構成された第１の開口部を含む、条項８に記載の装置。

条項１１
溶液マニホールドは、第１の生体適合性溶液とは異なる第２の生体適合性溶液を受容するように構成された第２のウェルを含み、第２のウェルは、コラーゲン超極細繊維ストランドの通過を可能にするように構成された第２の開口部を含む、条項１０に記載の装置。

条項１２
溶液マニホールドは、第１の開口部と第２の開口部とを接続する長孔を含む、条項１１に記載の装置。

条項１３
送達デバイスは、コラーゲン超極細繊維ストランドが第１のウェルと第２のウェルのどちらを通って引き出されるかを選択するために、溶液マニホールドを長孔と平行な方向に平行移動させるように構成される、条項１２に記載の装置。

条項１４
足場構築物を作成する方法であって、
コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレームに貼り付けることと、
コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレーム周りに巻き付けるために、回転可能フレームを回転軸回りに回転させることと、を含む方法において、
回転可能フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けることにより、送達デバイスからコラーゲン超極細繊維ストランドが引き出され、それによって、オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配し、第１の生体適合性溶液で満たされた溶液マニホールドの第１のウェルを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出す、方法。

条項１５
回転可能フレームの異なる部分周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために、回転可能フレームと分配デバイスとを回転軸に沿って互いに対して平行移動させることをさらに含む、条項１４に記載の方法。

条項１６
溶液マニホールドの第１のウェルを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出すことが、第１のウェルの第１の開口部を通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出すことを含む、条項１４に記載の方法。

条項１７
第１の生体適合性溶液を含む第１のウェルと、第１の生体適合性溶液とは異なる第２の生体適合性溶液を含む溶液マニホールドの第２のウェルとを通して超極細繊維ストランドを選択的に引き出すことをさらに含む、条項１６に記載の方法。

条項１８
第２のウェルは、コラーゲン超極細繊維ストランドが通過可能であるように構成された第２の開口部を含み、
溶液マニホールドは、第１の開口部と第２の開口部とを接続する長孔を含み、
方法は、コラーゲン超極細繊維ストランドが第１のウェルと第２のウェルのどちらを通って引き出されるかを選択するために、溶液マニホールドを長孔と平行な方向に平行移動させることをさらに含む、条項１７に記載の方法。

条項１９
生体適合性溶液は、コラーゲン超極細繊維ストランド上に被覆される１つ又は複数の添加剤を含み、
１つ又は複数の添加剤は、本質的に成長因子、抗生物質、小分子医薬品からなる群から選択される、条項１４に記載の方法。

条項２０
回転フレーム上に作製された複数の細長いコラーゲン繊維ストランドを具備する複合足場であって、
ストランドは、均一に懸濁された哺乳類細胞を有し、腱細胞を含む結合組織細胞を好ましくは有し、ヒト及び非ヒト哺乳類細胞を好ましくは有するヒアルロン酸溶液内で被覆され、
ストランドは、哺乳動物又はヒトの生来の筋肉組織に匹敵する断面密度を有する、複合足場。

条項－単一溶液手法
条項１
組織化された構成で配置され、生体適合性溶液で被覆された複数のコラーゲン超極細繊維を備える足場構築物であって、
コラーゲン超極細繊維は、連続したループ状に配置される、足場構築物。

条項２
複数のコラーゲン超微細繊維は、互いに実質的に平行である、条項１に記載の足場構築物。

条項３
生体適合性溶液は、ヒアルロン酸溶液中に懸濁された細胞を含む、条項１に記載の足場構築物。

条項４
足場構築物は、ヒト筋骨格組織の機械的特性に近似するか、それを超える機械的特性を有する、条項１に記載の足場構築物。

条項５
足場構築物は、ヒトの腱組織及び靱帯組織の機械的特性に近似するか、それを超える機械的特性を有する、条項４に記載の足場構築物。

条項６
前記足場構築物は、ヒト前十字靱帯（ＡＣＬ）、ヒト棘上筋腱及びヒト筋肉の平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みに近似するか、それを超える平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みを有する、条項５に記載の足場構築物。

条項７
足場構築物を作成するための装置であって、装置は、
オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配するように構成された送達デバイスと、
回転可能フレームと、
コラーゲン超極細繊維ストランドを、ストランドの分配中に、生体適合性溶液で被覆するように構成されたストランド被覆システムであって、溶液ストランド被覆システムは送達デバイスと回転可能フレームとの間に配置される、ストランド被覆システムと、
回転可能フレームを回転軸回りで回転させるように構成された回転デバイスと、を備える装置において、
装置は、回転可能フレームの回転により、オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、コラーゲン超極細繊維ストランドを生体適合性溶液で被覆し、コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレーム周りに巻き付けるように構成される、装置。

条項８
装置は、実質的平面状フレームの異なる部分周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために、送達デバイスと実質的平面状フレームとが回転軸に沿って互いに対して平行移動するように構成される、条項７に記載の装置。

条項９
回転可能フレームは、コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付け得る少なくとも２つの平行梁を含み、ひいては連続ループに構成された足場構築物を形成する、条項７に記載の装置。

条項１０
回転可能フレームは、張力下で足場構築物の連続ループを維持するために、バネ付勢される、条項９に記載の装置。

条項１１
回転可能フレームは、平行梁を相互に固定する取り外し可能端部片を含み、取り外し可能端部片を取り外すことにより、連続ループ足場構築物を平行梁から滑り落とすことができる、条項９に記載の装置。

条項１２
回転可能フレームは、細胞培養液に浸漬されるように構成される、条項７に記載の装置。

条項１３
送達デバイスは、コラーゲン超極細繊維の複数のストランドを同時に分配するように構成される、条項７に記載の装置。

条項１４
足場構築物を作成する方法であって、
コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレームに貼り付けることと、
コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレーム周りに巻き付けるために、回転可能フレームを回転軸回りに回転させることと、を含む方法において、
回転可能フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けることにより、送達デバイスからコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配し、生体適合性溶液を通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出す、方法。

条項１５
回転可能フレームの異なる部分周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために、実質的平面状フレームと分配デバイスとを回転軸に沿って相互に平行移動させることをさらに含む、条項１４に記載の方法。

条項１６
回転可能フレームは、コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付け得る少なくとも２つの平行梁を含み、ひいては連続ループに構成された足場構築物を形成する、条項１４に記載の方法。

条項１７
平行梁を相互に固定する取り外し可能端部片を除去することと、足場構築物を平行梁から滑り落とすことと、をさらに含む、条項１６に記載の方法。

条項１８
コラーゲン超極細繊維を巻き付けた回転可能フレームを細胞培養液に浸漬することをさらに含む、条項１４に記載の方法。

条項１９
複数のコラーゲン超極細繊維は、回転可能フレームの回転によって同時に引き出される、条項１４に記載の方法。

条項２０
生体適合性溶液は、コラーゲン超極細繊維ストランド上に被覆される１つ又は複数の添加剤を含み、
１つ又は複数の添加剤は、本質的に成長因子、抗生物質、小分子医薬品からなる群から選択される、条項１４に記載の方法。

条項－液内回転フレーム手法
条項１
組織化された構成で配置され、生体適合性ヒドロゲルで被覆された複数のコラーゲン超極細繊維を備える、足場構築物であって、
コラーゲン超極細繊維は、連続したループ状に配置される、足場構築物。

条項２
生体適合性ヒドロゲルは細胞を含む、条項１に記載の足場構築物。

条項３
生体適合性ヒドロゲルはフィブリンゲルを含む、条項１に記載の足場構築物。

条項４
足場構築物は、ヒト筋骨格組織の機械的特性に近似するか、それを超える機械的特性を有する、条項１に記載の足場構築物。

条項５
足場構築物は、ヒトの腱組織及び靱帯組織の機械的特性に近似するか、それを超える機械的特性を有する、条項４に記載の足場構築物。

条項６
足場構築物は、ヒト前十字靱帯（ＡＣＬ）、ヒト棘上筋腱及びヒト筋肉の平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みに近似するか、それを超える平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みを有する、条項５に記載の足場構築物。

条項７
足場構築物を作成するための装置であって、装置は、
オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配するように構成された送達デバイスと、
回転可能フレームと、
コラーゲン超極細繊維ストランドを、ストランドの分配中に、第１の生体適合性溶液で被覆するように構成されたストランド被覆システムであって、溶液ストランド被覆システムは送達デバイスと回転可能フレームとの間に配置される、ストランド被覆システムと、
回転可能フレームを回転軸回りで回転させるように構成された回転デバイスと、を備える、装置において、
装置は、回転可能フレームの回転により、オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、コラーゲン超極細繊維ストランドを第１の生体適合性溶液で被覆し、コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレーム周りに巻き付けるように構成され、
装置は、コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレーム周りに巻き付ける間に回転可能フレームを浸漬し得る第２の生体適合性溶液を含むように構成された槽をさらに含む、装置。

条項８
装置は、回転可能フレームの異なる部分周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために、送達デバイスと回転可能フレームとが回転軸に沿って互いに対して平行移動するように構成される、条項７に記載の装置。

条項９
回転可能フレームは、コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付け得る少なくとも２つの平行梁を含み、ひいては連続ループに構成された足場構築物を形成する、条項７に記載の装置。

条項１０
回転可能フレームは、張力下で足場構築物の連続ループを維持するために、バネ付勢される、条項９に記載の装置。

条項１１
回転可能フレームは、平行梁を相互に固定する取り外し可能端部片を含み、取り外し可能端部片を取り外すことにより、連続ループ足場構築物を平行梁から滑り落とすことができる、条項９に記載の装置。

条項１２
回転可能フレームは、細胞培養液に浸漬されるように構成される、条項７に記載の装置。

条項１３
送達デバイスは、コラーゲン超極細繊維の複数のストランドを同時に分配するように構成される、条項７に記載の装置。

条項１４
足場構築物を作成する方法であって、
コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレームに貼り付けることと、
コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレーム周りに巻き付けるために、回転可能フレームを回転軸回りに回転させることと、を含む方法において、
回転可能フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けることにより、送達デバイスからコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配し、第１の生体適合性溶液を通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、
回転可能フレームは、回転可能フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付ける間に、第２の生体適合性溶液に浸漬され、
第１の生体適合性溶液は、第２の生体適合性溶液と混合して生体適合性ヒドロゲルを形成する、方法。

条項１５
回転可能フレームの異なる部分周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために、実質的平面状フレームと分配デバイスとを回転軸に沿って相互に平行移動させることをさらに含む、条項１４に記載の方法。

条項１６
回転可能フレームは、コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付け得る少なくとも２つの平行梁を含み、ひいては連続ループに構成された足場構築物を形成する、条項１４に記載の方法。

条項１７
第１の生体適合性溶液はトロンビンを含み、第２の生体適合性溶液はフィブリノーゲンを含み、このため、第１の生体適合性溶液で被覆されたストランドが第２の生体適合性溶液に浸漬されるとフィブリンゲルを形成する、条項１４に記載の方法。

条項１８
第１の生体適合性溶液は細胞懸濁液である、条項１４に記載の方法。

条項１９
複数のコラーゲン超極細繊維が、回転可能フレームの回転によって同時に引き出される、条項１４に記載の方法。

条項２０
第１の生体適合性溶液及び第２の生体適合性溶液の少なくとも１つが、コラーゲン超極細繊維ストランド上に被覆される１つ又は複数の添加剤を含み、
１つ又は複数の添加剤は、本質的に成長因子、抗生物質、小分子医薬品からなる群から選択される、条項１４に記載の方法。

条項－容積性筋損失の治療法
条項１
容積性筋損失（ＶＭＬ）を治療する方法であって、
組織化されたシート状構成に配置され、生体適合性溶液で被覆された複数のコラーゲン超極細繊維で形成された足場構築物をＶＭＬ創傷部位内に貼り付けることを含む方法。

条項２
足場構築物は、コラーゲン超極細繊維の複数のシート状の層を含む、条項１に記載の方法。

条項３
生体適合性溶液はヒアルロン酸である、条項１に記載の方法。

条項４
生体適合性溶液は細胞懸濁液である、条項１に記載の方法。

条項５
細胞懸濁液は筋前駆細胞（ＭＰＣ）を含む、条項４に記載の方法。

条項６
細胞懸濁液は、約４，０００，０００個の細胞／ｍＬを含む、条項５に記載の方法。

条項７
足場構築物は、ヒト腱の機械的特性に実質的に近似するか、それを超える機械的特性を有する、条項１に記載の方法。

条項８
足場構築物は、ヒト腱の平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みに実質的に近似するか、それを超える平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みを有する、条項７に記載の方法。

条項９
容積性筋損失（ＶＭＬ）を治療する方法であって、
ＶＭＬ創傷部位内に、組織化されたシート状構成に配置された複数のコラーゲン超極細繊維から形成された足場構築物を貼り付けることを含む方法において、
足場構築物は、コラーゲン超極細繊維の複数のシート状の層を含む、方法。

条項１０
足場構築物は生体適合性溶液で被覆される、条項９に記載の方法。

条項１１
生体適合性溶液はヒアルロン酸である、条項１０に記載の方法。

条項１２
生体適合性溶液は細胞懸濁液である、条項１０に記載の方法。

条項１３
細胞懸濁液は筋前駆細胞（ＭＰＣ）を含む、条項１２に記載の方法。

条項１４
細胞懸濁液は、約４，０００，０００個の細胞／ｍＬを含む、条項１２に記載の方法。

条項１５
足場構築物は、ヒト腱の機械的特性に実質的に近似するか、それを超える機械的特性を有する、条項９に記載の方法。

条項１６
足場構築物は、ヒト腱の平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みに実質的に近似するか、それを超える平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みを有する、条項１５に記載の方法。

特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開の複写を、要求と必要な手数料の支払いに応じて、特許庁が提供することになる。

実施形態は、以下の図面及び説明を参照することにより、さらによく理解することができる。図中の構成要素は、必ずしも一定の縮尺ではなく、代わりに実施形態の原理を説明することに重点が置かれている。さらに、図面では、類似の参照番号は、異なる図を通して対応する部分を指定する。
図１は、例示的な実施形態による足場構築物を作成するための装置の一部の概略図である。 図２は、コラーゲン超極細繊維ストランドがフレーム周りに巻き付けられた実質的平面状フレームの概略斜視図である。 図３は、図２の線３－３に沿った、針と、フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けている回転フレームとの概略断面図である。 図４は、コラーゲン超極細繊維ストランドが巻き付けられたフレームの別の実施形態の一部の概略図である。 図５は、コラーゲン超極細繊維ストランドが３つの部分に巻き付けられたフレームの別の実施形態の概略図である。 図６は、コラーゲン超極細繊維ストランドが巻き付けられたフレームの別の実施形態の概略図である。 図７は、別の例示的な実施形態による足場構築物を作成するための装置の概略図である。 図８は、図７に示す装置の一部の概略図である。 図９は、一実施形態による溶液マニホールドの概略図である。 図１０は、溶液マニホールドが左側に平行移動された状態で足場構築物を作成するための装置の概略図である。 図１１は、溶液マニホールドが右側に平行移動された状態で足場構築物を作成するための装置の概略図である。 図１２は、フレーム周りに多溶液足場が巻き付けられた状態の実質的平面状フレームの概略図である。 図１３は、例示的な実施形態による足場構築物を作成する方法のステップを示すフローチャートである。 図１４は、均一な平行繊維を示す、印刷された足場の透過光顕微鏡画像である。 図１５は、図１４の２倍の倍率で示す図１４の画像である。 図１６は、全体にわたる細胞の均一な分布のほか、細胞の伸長を示す蛍光顕微鏡写真である。 図１７は、図１６の２倍の倍率で示す図１６の画像である。 図１８は、ラット筋前駆細胞（ＭＰＣ）を印刷した足場の印刷直後の蛍光顕微鏡画像であり、生細胞、死細胞及び４０５ｎｍでのコラーゲン線維の自家蛍光を示す。 図１９は、培養の７日後の図１８に示す足場の蛍光顕微鏡画像である。 図２０は、ヒト腱細胞を印刷した足場の代謝活性を示す、培養の１日後、３日後及び７日後のａｌａｍａｒＢｌｕｅ分析の結果を示すグラフである。 図２１は、別個の領域にＭＰＣ及び腱細胞を印刷した二重溶液足場の蛍光画像であり、画像はＭＰＣの高密度領域（左）及び腱細胞の低密度領域（右）を示す。 図２２は、ＭＰＣ及び腱細胞を印刷した足場の代謝活性を示す、培養の１日後、３日後及び７日後のａｌａｍａｒＢｌｕｅ分析の結果を示すグラフである。 図２３は、回転フレーム手法を使用して印刷された無細胞足場及び細胞足場の培養の１日後及び２８日後のピーク負荷を示すグラフである。 図２４は、回転フレーム手法を使用して印刷された無細胞足場及び細胞足場の培養の１日後及び２８日後の極限引張強度（ＵＴＳ）を示すグラフである。 図２５は、回転フレーム手法を使用して印刷された無細胞足場及び細胞足場の培養の１日後及び２８日後の接線弾性率を示すグラフである。 図２６は、回転フレーム手法を使用して印刷された無細胞足場及び細胞足場の培養の１日後及び２８日後の破断点歪みを示すグラフである。 図２７は、溶液中に浸漬される間に回転可能フレーム上に足場構築物を作成するための装置の概略正面図である。 図２８は、図２７の装置の概略正面斜視図である。 図２９は、回転可能フレームが浸漬された状態の図２７の装置の概略正面斜視図である。 図３０は、図２７の装置の歯車システムの概略正面斜視図である。 図３１は、図２７の装置の歯車システムの概略正面図である。 図３２は、回転可能フレームが浸漬した状態の図２７の装置の概略正面図である。 図３３は、図２７の装置の回転可能フレームが浸漬している間の回転可能フレームの概略正面斜視図である。 図３４は、例示的な実施形態による回転可能フレームの概略的な背面斜視図である。 図３５は、コラーゲン超極細繊維が３つの別々の部分に巻かれている状態の図３４の回転可能フレームの概略正面図である。 図３６は、コラーゲン超極細繊維が巻かれた３つの部分を有する回転可能フレームの概略正面図であり、縫合糸が部分の各端部を接合し、ひいては３つの別個の足場構築物を形成する。 図３７は、細胞ヒアルロン酸溶液を通して分配された３つのコラーゲン超極細繊維の画像であり、超極細繊維の表面に直接配置された細胞を示す。 図３８は、培養の１４日後のラット筋前駆細胞（ＭＰＣ）が全体に分布され、整列された足場構築物の視野図である。 図３９は、図３８に示す足場構築物の繊維のみの成分の方向性分析を示すグラフである。 図４０は、図３８に示す足場構築物の細胞のみの成分の方向性分析を示すグラフである。 図４１は、細胞分布解析を白色で示す細胞で処理した後の図３８に示す足場構築物の画像である。 図４２は、横軸に沿って描画した、図４１に示す足場構築物の相対的な細胞充実度を示すグラフである。 図４３は、縦軸に沿って描画した、図４１に示す足場構築物の相対的な細胞充実度を示すグラフである。 図４４は、無細胞足場構築物及び細胞足場構築物の応力－歪み曲線を示すグラフである。 図４５は、無細胞足場構築物及び細胞足場構築物の測定された断面積を示すグラフである。 図４６は、無細胞足場構築物及び細胞足場構築物の極限引張応力（ＵＴＳ）を示すグラフである。 図４７は、無細胞足場構築物及び細胞足場構築物の接線弾性率を示すグラフである。 図４８は、無細胞足場構築物及び細胞足場構築物の破断時歪みを示すグラフである。 図４９Ａ－４９Ｉは、齧歯類容積性筋損失（ＶＭＬ）損傷モデルのさまざまな足場構築物の移植及び機能回復測定値を示す画像及びグラフの集合である。 図５０Ａ－５０Ｆは、表示した群についてＴＡ筋の組織学的評価を示すＨ＆Ｅ顕微鏡写真の集合である。 図５１は、インプラントコラーゲン線維（「＊」で標識）によって境界が定められた足場構築物インプラント内で成長している顕著な新規筋線維（「ＭＦ」で標識）を示すＨ＆Ｅ顕微鏡写真の集合である。 図５２は、表示した各群のインプラント領域及び欠損エリアの内部及び周囲のコラーゲンの存在を示すマッソントリクローム顕微鏡写真の集合である。 図５３Ａ－５３Ｋは、表示した群についてＳＭＡＳＨを使用した筋線維の定量化を示す顕微鏡写真及びグラフの集合である。

本発明は、高強度コラーゲン繊維を使用した生体適合性足場構築物の形成に関する。特に、本開示は、靱帯損傷、腱損傷及び容積性筋損失（ＶＭＬ）損傷を治療するための高密度コラーゲン超極細繊維からなる細胞化足場を製造するための回転フレーム製造（ＲＦＦ）の使用に関する。コラーゲン超極細繊維は、制御可能に細胞を播種され、自動化された拡張可能なバイオ製造プロセスにて、設計された間隙率、繊維パターン、巨視的寸法を備えた生きた３Ｄ移植片に形成される。

本明細書の以下の説明は、２０２１年７月２日に公開され、ｂｉｏＲｘｉｖからｈｔｔｐｓ:／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０６．２２．４４９４３１にてプレプリントが入手可能なＫ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒ、Ｋ．Ｃｏｕｇｈｅｎｏｕｒ、Ｙ．Ｍａｇｈｄｏｕｒｉ－Ｗｈｉｔｅ、Ａ．Ａ．Ｂｕｌｙｓｈｅｖａ、Ｏ．Ｓｅｒｇｅａｎｔ、Ｍ．Ｒａｒｉｄｅｎ、Ａ．Ｒａｎｄａｚｚｏ、Ａ．Ｊ．Ｓｈｅｅａｎ、Ｇ．Ｊ．Ｃｈｒｉｓｔ、Ｍ．Ｐ．Ｆｒａｎｃｉｓによる「Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｃｏｒａｔｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＡＣ－ＤＣ）ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｄ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｍｉｍｉｃ ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ（集合細胞装飾コラーゲン（ＡＣ－ＤＣ）をバイオプリントしたインプラントが筋骨格組織の特性を模倣し、機能回復を促進する）」にて実施され、文書化された試験に関連する。この公開文献の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

コラーゲンは、天然ポリマーとして、固有の生体適合性及び生物活性と、細胞の付着、整列及び増殖を促進する天然組織を模倣する微細構造の合図と、を提供するため、好ましい。本明細書に記載するように、移植片が優れた強度と安定性を提供し、作製直後及び４週間の試験管内試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養後の天然の腱組織及び靱帯組織の機械的特性と密接に一致する。さらに、そのような移植片は、検証されたＶＭＬ損傷モデルを使用して、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での本来の組織の再生と機能回復を促進する。

本明細書に記載する新規のバイオ製造手法は、再生医療用途のための細胞化足場を製造するための改良された方法を提供する。移植可能な足場を、医療用途に適した生化学的特性及び機械的特性を備えた臨床品質のコラーゲンの強力で安定した超極細繊維から製造する。

この繊維は、足場の製造中に細胞で均一かつ制御可能に被覆され、複数の種類の細胞で選択的に被覆されて、設計された不均一性を備えた足場を作成することができる。足場を、細胞の整列を知らせる微細構造の合図のほか、設計された間隙率、繊維パターン及び巨視的寸法を用いて形成する。製造プロセスは、迅速で再現性があり、自動化されている。結果として得られる足場が、天然の靱帯組織及び腱組織の生物学的、形態学的及び機能的な特性を模倣する。

本明細書に記載の実施形態は、足場構築物、足場を作成するための方法及び足場を作成するための装置に関する。そのような足場には、生体適合性溶液で被覆された複数の整列したコラーゲン超極細繊維が含まれる。そのような足場は、腱又は靱帯の移植片又は他の生体力学的な外科的修復物としての使用に適している可能性がある。

さまざまな実施形態の以下の説明を支援し、明確にするために、さまざまな用語を本明細書で定義する。特に明記しない限り、以下の定義が（特許請求の範囲を含む）本明細書全体に適用される。一貫性と便宜のために、この詳細な説明全体を通して、図示した実施形態に対応する方向を表す形容詞が採用される。

この詳細な説明全体にわたって使用し、特許請求の範囲で使用する「生体適合性溶液」という用語は、本発明の方法によって繊維を被覆するために適用される細胞の生存能力を維持し、その成長及び機能を支援する液体溶液、好ましくは、細胞培地を指す。

「コラーゲン」という用語には、アテロコラーゲン、テロコラーゲン、コラーゲン由来のゼラチンなどの予期された種類が含まれ、組換えヒトコラーゲン、ブタコラーゲン、ウシコラーゲン、クラゲコラーゲン及びその混合物などのさまざまな供給源からのコラーゲンであってもよい。当業者であれば、本明細書で考察する所与のインプラントの特定の機能及び用途に適した引張強度、弾力性、弾性及び靱性を有する超極細繊維が製造されることになることを理解するであろう。

この詳細な説明全体にわたって使用し、特許請求の範囲で使用する「繊維」という用語は、直径に対する長さの比率が高く、通常は一群として使用される繊維、糸又はフィラメントを指す。「超極細繊維」という用語は、好ましい実施形態で使用する繊維の大きさの尺度により同義的に使用する。「ストランド」という用語は繊維の個々のアイテムを指すが、繊維ベースの構築物が多くの個々の繊維ストランドで構成される場合がある。全体を通して、上記の用語には、編組などの二次又は三次の組み立てプロセスによって組み立てられた複数の副次的繊維から構成される繊維が含まれる場合がある。

この詳細な説明全体にわたって使用し、特許請求の範囲で使用する「横方向」という用語は、構成要素の幅に沿って延びる左右方向を指す。

この詳細な説明全体にわたって使用し、特許請求の範囲で使用する「縦方向」という用語は、構成要素の長さに沿って延びる方向を指す。

このような方向を表す形容詞のそれぞれは、考察したデバイス又は装置の個々の構成要素に適用し得ることが理解されよう。「上方」という用語は、地面から遠ざかる垂直方向を指し、「下方」という用語は、地面に向かう垂直方向を指す。同じように、「最上部」、「上部」及び他の類似の用語は、垂直方向にて地面から実質的に最も遠い物体の部分を指し、「底部」、「下部」及び他の類似の用語は、垂直方向にて地面に実質的に最も近い物体の部分を指す。

本開示の目的上、「固定的に取り付けられた」という用語は、構成要素が容易に分離できないように（例えば、構成要素の一方又は両方を破壊することなく）接合された２つの構成要素を指すものとする。固定的取り付けの例示的な様式には、永久接着剤、リベット、ステッチ、釘、ステープル、溶接又は他の熱接着、あるいは他の接合技術による接合が含まれてもよい。さらに、２つの構成要素が、例えば、成形プロセスにて一体的に形成されることによって「固定的に取り付けられ」てもよい。

この詳細な説明全体にわたって使用し、特許請求の範囲で使用する「足場」という用語は、繊維の２Ｄ集合体又は３Ｄ集合体を指す。「構築物」と「マクロ構造」という用語は同義で使用する。「足場構築物」、「移植片」及び「インプラント」という用語は、好ましい実施形態で使用する医療デバイスとして移植することを目的とした足場を指す。

この詳細な説明全体にわたって使用し、特許請求の範囲で使用する「垂直」という用語は、横方向及び縦方向の両方に概ね直交する方向を指す。

本開示の好ましい実施形態では、生体適合性溶液によって被覆され、実質的に整列した複数のコラーゲン超極細繊維を含む足場構築物を対象とする。当業者であれば、超極細繊維の配向及び間隔が三次元で変化する状態で、構築物中の超極細繊維が、互いに実質的に平行に整列していても、部分的に整列していても、実質的に整列していなくてもよいことを理解するであろう。さらに、いくつかの構築物には、整列した超極細繊維と整列していない超極細繊維の両方が含まれる場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、超極細繊維のいくつかは、構築物中の他の超極細繊維に対して斜めの角度で配向される場合がある。さらに、開示した方法によって製造された足場構築物が、閉ループ構成として製造される場合があるだけでなく、完成した足場構築物が、平面シート状構成、角柱状構成、円形構成又は円筒状構成のほか、他の複雑な３次元形状を有する場合がある。場合によっては、足場構築物の形状はＣＡＤモデルに基づく場合がある。

好ましい実施形態では、特定の細胞化足場を印刷するために、生体適合性溶液には、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で調製されたヒアルロン酸溶液中に懸濁された細胞が含まれる。ヒアルロン酸は、結合組織の細胞外基質の主成分であり、本明細書ではコラーゲン超極細繊維への細胞の接着を促進する「細胞接着剤」として利用される。例示的なヒアルロン酸濃度が５ｍｇ／ｍＬである場合がある。意図する用途に基づいて任意の細胞型を選択する場合があり、任意の細胞型には、幹細胞、腱細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、骨芽細胞又は多数の組織特異的細胞型が含まれる場合がある。選択した細胞型の生存を促進するには、適切な細胞培地と材料添加剤を利用する必要がある。

本開示は、そのような足場を作成するための方法及び装置を対象とする。開示したシステム及びプロセスは、開示したプロセスによる操作に充分な機械的特性（強度、柔軟性など）を有する他の天然繊維及び／又は合成材料又はその組み合わせを含む、コラーゲン超極細繊維以外の他の種類の繊維にも適用可能であることに留意されたい。さらに、いくつかの実施形態では、複数のコラーゲン超極細繊維が必ずしも互いに整列していなくてもよいことにも留意されたい。

足場は、分配されたストランドが生体適合性溶液内で被覆されるような方法でコラーゲン超極細繊維ストランドを分配することによって概ね形成される。本発明の目的のために、超極細繊維は、張力下で超極細繊維ストランドを引き出すことによって、あるいは超極細繊維ストランドを押し出すことによって分配されてもよい。いくつかの実施形態では、コラーゲン超極細繊維ストランドは、生体適合性溶液が内部導管の周囲の環状管腔から分配される状態で、同軸針の内部導管の中心管腔から分配されてもよい。生体適合性溶液は、生体適合性溶液を含む注入器のプランジャの制御された作動を介して環状管腔から分配されてもよい。

好ましい実施形態では、超極細繊維はスプールから供給される。例示的なコラーゲン線維の押出成形は、２０２０年８月６日に公開され、「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ（マイクロ流体押出成形）」と題するＦｒａｎｃｉｓらの米国特許出願公開第２０２０／０２４６５０５号明細書に開示される。この米国特許出願公開では、生来のヒトの腱及び靱帯に匹敵する極限引張強度、弾性率及び破断点歪みを有する製品について説明している。米国特許出願公開第２０２０／０２４６５０５号明細書の全開示は、付録Ａとして本明細書に添付する。

２溶液手法
図１は、例示的な実施形態による足場構築物を作成するための装置の一部の概略図である。図１に示すように、印刷デバイス１００が３Ｄ印刷アセンブリを備えてもよい。３Ｄ印刷アセンブリは、生体適合性溶液で覆われたコラーゲン超極細繊維を分配するように構成された機能をさらに備える。３Ｄ印刷アセンブリは、印刷デバイス１００のＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸の動きを制御するために設けられる。図１に示すように、印刷デバイス１００は、ステッピングモータ１０５と、ステッピングモータ１０５によって駆動されるように構成された親ネジ１１０とを備えてもよい。親ネジ１１０は、生体適合性溶液１５２を含み得る注入器１１５のプランジャ１１４を作動させるために、第１のプラットフォーム１１２を第２のプラットフォーム１１３に対して移動させるために、回転してもよい。ネジ１１０が回転すると、生体適合性溶液１５２が導管１１６を介して同軸針１２５の環状導管内に押し込まれてもよい。

生体適合性溶液１５２が分配されるのと同時に、コラーゲン超極細繊維ストランド１５０を同軸針１２５の内部導管を通して引き出してもよい。図１に示すように、スプール１２０には、コラーゲン超極細繊維ストランド１５０が含まれてもよい。分配を達成するために、コラーゲン超極細繊維ストランド１５０の自由端をフレームに固定してもよい（例えば、結びつけてもよい）。次に、フレームが回転するにつれて、コラーゲン超極細繊維ストランド１５０がスプール１２０から引き出され、同軸針１２５を通過する。この動きにつれて、コラーゲン超極細繊維ストランド１５０は生体適合性溶液１５２で被覆される。

コラーゲン超極細繊維がスプールから引き出され、同軸針を通して供給されるときにコラーゲン超極細繊維を組織化するために、フレーム１３５を設けてもよい。フレーム１３５は、コラーゲン超極細繊維ストランド１５０をフレーム１３５周りに巻き付けるために回転し、それによって、足場１５５を形成してもよい。デバイス１００は、フレーム１３５を回転させるように構成された回転デバイスを備えてもよい。例えば、図１に示すように、回転デバイスは、第１のモータ１３０及び第２のモータ１３２などの１つ又は複数のモータを備えてもよい。図１に示すように、フレーム保持装置が、矢印１４０で示すように、回転軸１３７回りに回転可能であってもよい。

さらに、フレーム保持装置へのフレーム１３５の取り付けを容易にするために、モータの一方又は両方が、例えば、矢印１４５で示すように移動可能であってもよい。いくつかの実施形態では、このようなモータの一方又は両方は、手動で移動可能であっても、電動機構を介して移動可能であってもよい。このほか、フレーム保持装置は、フレーム１３５のどの部分に足場を形成するかを確定するために移動可能であってもよい。ストランド１５０がフレーム１３５周りに巻き付けられるにつれて、装置は、矢印１４７で示すように、フレーム１３５を平行移動させるか、回転軸に沿って印刷デバイス１００を平行移動させて、ストランド１５０の後続の巻きが並んで形成されて足場１５５に幅を与えてもよい。さらに、このような巻きの複数の層を形成して、足場１５５に厚みを与えてもよい。

フレームは任意の適切な形状を有してもよい。いくつかの実施形態では、フレームは、実質的に平面の構成を有してもよい。いくつかの実施形態では、フレームは、フレーム上に構築された足場に接触することなく、フレームを把持することを容易にするための突出部又は延長部を備えてもよい。いくつかの実施形態では、フレームは、回転デバイスへの取り付けを容易にする機能を備えてもよい。いくつかの実施形態では、フレームは、例えば、複数の足場を同じフレーム上に構築することができるように構成された複数の区域を備えてもよい。いくつかの実施形態では、フレームは、ストランドをフレーム上に結びつけ、ストランドが解けるのを防ぐために、巻き付けた後にフレーム上を摺動させ得る留め具などの機構を備えてもよい。いくつかの実施形態では、フレームは、足場上の所定量の張力を維持するように構成されたバネ負荷機構を備えてもよい。

図２は、コラーゲン超極細繊維ストランドがフレーム周りに巻き付けられた実質的平面状フレームの概略斜視図である。図２に示すように、フレーム１３５は、足場が巻き付けられることになる巻き付け面として機能するように構成された第１のクロスバー２００及び第２のクロスバー２０５を備えてもよい。さらに、フレーム１３５は、第１のクロスバー２００を第２のクロスバー２０５に接続する第１の側部２１０及び第２の側部２１５を備えてもよい。このため、図２に示すように、いくつかの実施形態では、フレームは中央開口部２１７を備えてもよい。中央開口部２１７は、足場１５５がフレーム１３５に接合されるのを防止する可能性がある。さらに、中央開口部２１７は、足場１５５からフレーム１３５への細胞移動の影響を制限する可能性がある。さらに、中央開口部２１７により、周囲の細胞培地から足場１５５への栄養素の拡散を改善することができる可能性がある。

このほか図２に示すように、フレーム１３５はこのほか、フレーム全体と同じ平面内で外側に延びる複数の突出部２２０を備えてもよい。突出部２２０は、足場１５５を損傷することなくフレーム１３５を把持する／取り扱うための場所として設けられてもよい。いくつかの実施形態では、図２に示すように、突出部２２０の少なくとも一部がフレーム全体の平面に対して隆起していてもよい。このような隆起部分は、回転デバイスへの取り付けを容易にするほか、足場とその固体表面周囲、例えば、細胞培養中のマイクロウェルプレートの底部との間の距離を維持してもよい。

図３は、図２の線３－３に沿った、針と、フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けている回転フレームとの概略断面図である。図３に示すように、フレーム１３５は、矢印３００で示すように、軸１３７回りに回転してもよい。この回転により、針１２５を通してストランド１５０が引き出され、足場１５５を形成するためにストランド１５０をフレーム１３５周りに包むか、巻き付ける。

他のフレーム構成及び機能も可能である。例えば、図４は、コラーゲン超極細繊維ストランドが巻き付けられたフレームの別の実施形態の一部の概略図である。図４に示すように、フレーム４００が、第１の横材４０５、第２の横材４１０、第１の端部４１５及び第２の端部４２０を有してもよい。フレーム４００は、第１のフレーム取付具４２５及び第２のフレーム取付具４３０を備える回転デバイスに取り付けられてもよい。上記のようにフレーム４００に巻き付けることによって、足場４３５を形成してもよい。このほか図４に示すように、いくつかの実施形態では、フレーム４００の端部は、足場４３５を損傷することなくフレーム４００の把持／取り扱いを容易にするように構成された延長部４４０を備えてもよい。

図５は、コラーゲン超極細繊維ストランドが３つの部分に巻き付けられたフレームの別の実施形態の概略図である。図５に示すように、フレーム５００が、同フレーム上に複数の足場を形成するように構成されてもよい。例えば、フレーム５００は、第１の足場５１０を受容するように構成された第１の区域５０５と、第２の足場５２０を受容するように構成された第２の区域５１５と、第３の足場５３０を受容するように構成された第３の区域５２５とを備えてもよい。フレームは、足場の製造／形成を最適化するために、これより少ないか多い数の足場を受容するように構成されてもよいことが理解されよう。

このほか図５に示すように、いくつかの実施形態では、フレーム５００は、足場が解けるのを防ぐために、足場を形成した後にフレーム５００上を摺動するように構成された第１のクリップ５３５及び第２のクリップ５４０を備えてもよい。

図６は、コラーゲン超極細繊維ストランドが巻き付けられたフレームの別の実施形態の概略図である。図６に示すように、フレーム６００が、足場６１０を形成するためにコラーゲン超極細繊維ストランドの巻きを受容するように構成された周縁部６０５を備えてもよい。足場６１０上の所定の張力を実質的に一定に維持するために、フレーム６００は、例えば、バネ機構６１５によってバネ負荷されてもよい。

いくつかの実施形態では、異なる組成の足場の異なる部分を形成することが望ましい場合がある。例えば、場合によっては、骨に隣接する靱帯又は腱の足場の端部を、靱帯又は腱の他の部分とは異なる組成で形成することが望ましい場合がある。これは、天然の靭帯と腱の異なる構造／組成を再現する。異なる部分に異なる組成を有する足場を製造するために、異なる生体適合性溶液を通してコラーゲン超極細繊維ストランドを選択的に分配する装置を利用してもよい。

図７は、別の例示的な実施形態による足場構築物を作成するための装置の概略図であり、装置は、異なる生体適合性溶液を通してコラーゲン超極細繊維ストランドを選択的に分配するように構成される。図７に示すように、装置７００が、２つの異なる生体適合性溶液をそれぞれ分配するための２つの別個の柱状部を備えてもよい。第１の柱状部は、第１のステッピングモータ７０５と、ステッピングモータ７０５によって駆動されるように構成された第１の親ネジ７１０と、を備えてもよい。第１の親ネジ７１０は、生体適合性溶液を含み得る第１の注入器７６０のプランジャを作動させるために、第１プラットフォーム７１２を第２プラットフォーム７１３に対して移動させるために、回転してもよい。ネジ７１０が回転すると、生体適合性溶液が溶液マニホールド７２７に分配されてもよい。

生体適合性溶液が分配されるのと同時に、コラーゲン超極細繊維ストランドが針７２５を通して引き出されてもよい。図７に示すように、スプール７２０が、コラーゲン超極細繊維ストランドを含み、針７２５を通してストランドを分配してもよい。いくつかの実施形態では、複数のスプールが複数のストランドを同時に分配してもよい。例えば、図８に示すように、いくつかの実施形態では、スプール７２０の両側に１つ又は複数の追加のスプールを配置してもよい。

分配を達成するために、コラーゲン超極細繊維ストランド７５０の自由端をフレームに固定してもよい（例えば、結びつけてもよい）。次に、フレームが回転するにつれて、コラーゲン超極細繊維ストランド７５０がフレーム周りに巻き付けられ、ひいてはスプール７２０から針７２５を通して引き出される。

コラーゲン超極細繊維がスプールから引き出され、同軸針を通して供給されるときにコラーゲン超極細繊維を組織化するために、フレーム７３５を設けてもよい。フレーム７３５は、コラーゲン超極細繊維ストランド７５０をフレーム７３５周りに巻き付けるために回転し、それによって、足場７５５を形成してもよい。装置７００は、フレーム７３５を回転させるように構成された回転デバイスを備えてもよい。例えば、図７に示すように、回転デバイスは、第１のモータ７３０及び第２のモータ７３２などの１つ又は複数のモータを備えてもよい。図７に示すように、フレーム保持装置が、矢印７４０で示すように、回転軸７３７回りに回転可能であってもよい。

さらに、フレーム保持装置へのフレーム７３５の取り付けを容易にするために、モータの一方又は両方が、例えば、矢印７４５によって示すように移動可能であってもよい。いくつかの実施形態では、このようなモータの一方又は両方が、手動で移動可能であっても、又は電動機構を介して移動可能であってもよい。このほか、フレーム保持装置は、フレーム７３５のどの部分に足場を形成するかを確定するために移動可能であってもよい。ストランド７５０をフレーム７３５周りに巻き付けるにつれて、装置は、矢印７４７で示すように、フレーム７３５を平行移動させるか、回転軸に沿って装置７００を平行移動させて、その結果、後続のストランド７５０の巻きが並んで形成されて足場７５５に幅を与える。さらに、このような巻きの複数の層を形成して、足場７５５に厚みを与えてもよい。

溶液マニホールド７２７が第１の生体適合性溶液を含んでもよく、コラーゲン超極細繊維ストランド７５０をマニホールド７２７の開口部を通して引き出してもよい。開口部は、生体適合性溶液を含むウェルを備えるマニホールド７２７の一部を通って垂直に延びてもよい。このため、マニホールド７２７を通してストランド７５０を引き出すと、ストランド７５０は生体適合性溶液で被覆されるようになる。

針７２５を通してコラーゲン超極細繊維ストランド７５０を分配するように構成された送達デバイスは、第２の生体適合性溶液を分配するように構成された第２の柱状部を備えてもよい。例えば、装置７００は、第２のステッピングモータ７０６と、第２のステッピングモータ７０６によって駆動されるように構成された第２の親ネジ７１１とを備えてもよい。第２の親ネジ７１１は、第２の生体適合性溶液を含み得る第２の注入器７６５のプランジャを作動させるために、第３のプラットフォーム７１４を第４のプラットフォーム７１５に対して移動させるために回転してもよい。第２のネジ７１１が回転すると、第２の生体適合性溶液は溶液マニホールド７２７に分配されてもよい。

マニホールド７２７は、第２の生体適合性溶液を含むように構成された第２のウェルを備えてもよい。装置は、ストランドがどのウェルを通過するかを選択することによって、任意の時点でストランド７５０が２つの生体適合性溶液のどちらを通って引き出されることになるかを選択するように構成されてもよい。これは、溶液マニホールドを平行移動させることによって実現される。図８から図１２は、このプロセスをさらに詳細に示している。

図８は、図７に示す装置の一部の概略図である。図８に示すように、異なる生体適合性溶液を溶液マニホールド７２７に別々に送達してもよい。例えば、第１の生体適合性溶液を、第１の注入器７６０から第１の導管７７０を通ってマニホールド７２７の第１の側に送達してもよい。第２の生体適合性溶液を、第２の注入器７６５から第２の導管７７５を通ってマニホールド７２７の第２の側に送達してもよい。

図９は、一実施形態による溶液マニホールドの概略図である。図９に示すように、溶液マニホールド７２７は、第１の生体適合性溶液を受容するように構成された第１のウェル９００と、第２の生体適合性溶液を受容するように構成された第２のウェル９０５と、を備えてもよい。溶液マニホールド７２７の第１のウェル９００は、コラーゲン超極細繊維ストランドが通過することができるように構成された第１の開口部９１０を備えてもよい。さらに、第２のウェル９０５は、コラーゲン超極細繊維ストランドが通過することができるように構成された第２の開口部９１５を備えてもよい。さらに、マニホールド７２７は、第１の開口部９１０と第２の開口部９１５とを接続する長孔９２０を備えてもよい。図９に示すように、長孔９２０は、ウェルの開口部に対してかなり幅が広くなってもよい。他の実施形態では、長孔９２０は、かなり幅が狭くなってもよい。

図９はこのほか、マニホールド７２７を作動機構によって受容し得るレール９２５を示す。マニホールド７２７は、分配中に、一方のウェル又は他方のウェル内の生体適合性溶液を通してストランドを送達するために、反対方向に平行移動されてもよい。このため、分配デバイスは、コラーゲン超極細繊維ストランドが第１のウェルと第２のウェルのどちらを通って引き出されるかを選択するために、溶液マニホールドを長孔と平行な方向に平行移動させるように構成される。

図１０は、溶液マニホールドが左側に平行移動された状態で足場構築物を作成するための装置の概略図である。図１０に示すように、溶液マニホールド７２７は、ストランドがマニホールド７２７の右側部分を通って送達されるようにするために、矢印１００５によって示すように左側に平行移動されてもよい。太いケーブル１０００及び（図示しない）モータを使用して、マニホールド７２７を前後に作動／平行移動させてもよい。

図１１は、溶液マニホールドを右側に平行移動させた状態で足場構築物を作成するための装置の概略図である。図１１に示すように、溶液マニホールド７２７は、ストランドがマニホールド７２７の左側部分を通って送達されるようにするために、矢印１０１０によって示すように右側に平行移動されてもよい。

図１２は、フレーム周りに多溶液足場が巻き付けられた状態の実質的平面状フレームの概略図である。図１２に示すように、フレーム７３５には、足場１２０５が形成されてもよい。さらに図１２に示すように、足場１２０５の第１の端部１２１０が、足場１２１０の第２の端部１２１５とは異なっていてもよい。このような差は、異なる溶液を使用することによって生じる可能性がある。例えば、１つの溶液は細胞性であり、もう１つは非細胞性である場合がある。別の例では、一方の溶液には骨細胞が含まれ、他方の溶液には腱細胞又は靱帯細胞が含まれる場合がある。

他の要素が生体適合性溶液中に懸濁され、ひいてはコラーゲンストランドと共に組み込まれて足場を形成することになる場合があることに留意されたい。即ち、１つ又は複数の添加剤がコラーゲンストランド上に被覆されるように、生体適合性溶液に含まれてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、生体適合性溶液は、成長因子、抗生物質、小分子医薬品などを含んでもよい。

そのような多溶液足場を製造するために、第１の生体適合性溶液によって被覆されたコラーゲン超極細繊維の第１の部分を、足場の第１の縦方向部分に配置してもよく、第２の生体適合性溶液によって被覆されたコラーゲン超極細繊維の第２の部分を、足場の第２の縦方向部分に配置する。ここで、第１の縦方向部分は第２の縦方向部分とは異なる。

図１２に示す例では、第１の縦方向部分は第１の端部１２１０であり、第２の縦方向部分は第２の端部１２１５である。他の実施形態では、異なる組成を有する足場部分は、端部から端部までではなく、横方向に配置されてもよい。さらに、いくつかの実施形態では、足場が、異なる組成を有する３つ以上の異なる部分を有してもよい。

図１３は、例示的な実施形態による足場構築物を作成する方法のステップを示すフローチャートである。図１３に示すように、この方法は、針を通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配するステップを含んでもよい（ステップ１３００）。さらに、ステップ１３０５では、この方法は、コラーゲン超極細繊維ストランドをフレーム周りに巻き付けるステップを含んでもよい。さらに、ステップ１３１０に反映されるように、溶液マニホールドは、溶液マニホールド内の２つの溶液の間で選択するために、フレーム回転軸に沿って平行移動してもよい。この３つのステップは、ループ内で順番に実施することも、同時に実施することもできる。

さらに、足場は、生体組織を支持するために移植される可能性があるため、適切な条件に維持される必要がある。例えば、ステップ１３１５では、この方法はさらに、細胞培養条件下で２日以上足場を維持するステップを含む。場合によっては、細胞培養条件は、強度又は超極細繊維組織が大幅に低下することなく、７日間もの間維持される場合がある。

以下は、本明細書で考察した足場を製造するために使用される材料及び方法の追加の説明のほか、本明細書で考察した回転フレーム技術を使用して製造されるサンプル足場の説明である。

高密度で高度に整列した強力なコラーゲン超極細繊維から構成された細胞化足場を製造するための新たな積層造形手法が開発された。具体的には、幅約５０μｍ、厚さ約５μｍ（リボン状）の連続コラーゲン超極細繊維に細胞を均一に被覆し、同超極細繊維を硬質フレーム周りに三次元（３Ｄ）で巻き付けて足場を形成する。いくつかの実施形態では、実質的に丸形／円形の断面を有するコラーゲン超極細繊維を利用してもよい。

天然の靱帯と腱の超微細構造の組織を模倣する際、この細胞で被覆された繊維は、それ自体の隣及びそれ自体の上端に平行に巻き付けられて、設計された幅、長さ及び厚さの長方形のマクロ構造を形成する。取り外す前に、巻き付けられた繊維の張力と整列を維持するために、このようなフレーム上で足場が培養される。このような足場は、筋骨格組織の損傷での機能の再生と回復を促進することを目的とする。

この技術を実施するために、カスタム押出プリントヘッド（図１）を設計し、Ｆｏｌｇｅｒ Ｔｅｃｈ ＦＴ－５ Ｒ２商用３Ｄプリンタに取り付けた。プリントヘッドは、遊星歯車ステッピングモータによって駆動される親ネジを使用して使い捨て注入器を機械的に圧縮し、１マイクロリットル未満の分解能で細胞懸濁液を分配する。分配された細胞懸濁液は、印刷中に同軸針アセンブリの外針を通過する。コラーゲン超極細繊維の最大３つのスプールがプリントヘッドに装填され、各スプールが同軸針アセンブリの内針を通って供給されて、繊維の３つのストランドを同時に分配する。針アセンブリの出口では、コラーゲン繊維は、分配された細胞懸濁液によって均一に被覆される。伸長繊維１ミリメートルあたりに分配される細胞懸濁液の量は、ユーザが判定したプロセスパラメータであり、結果として得られる細胞密度及び足場全体の細胞の総数を制御する手段を提供する。好ましい実施形態では、細胞密度は、印刷パラメータ及び結果として得られる足場内の所望の細胞数に応じて、０から１０００万個の細胞／ｍＬの範囲で変化する可能性がある。

小さな使い捨て３Ｄ印刷フレームを２つのステッピングモータの間に保持するカスタム受容アセンブリを設計した（図１）。印刷前に、繊維を、同軸針を通して引き出し、フレーム上の最初の定着点に取り付ける。フレームをモータによって回転させると、繊維を張力下で同軸針を通して引き出し、分配された細胞懸濁液によって被覆する（図３）。フレームの回転と、フレームの幅に沿ったプリントヘッドの直線移動（供給量）とを調整することにより、高密度で高度に整列したコラーゲン超極細繊維の細胞化足場を製造する（図２）。フレーム回転を駆動するステッピングモータを手動リニアステージに取り付けており、連続する印刷間のフレームの取り付けと取り外しが簡単に実施することができる。

好ましい実施形態では、細胞化足場を印刷するために、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて調製されたヒアルロン酸溶液中に細胞を懸濁する。さらに、分配量の制御が向上し、粘度が高いため印刷中の細胞の沈降の影響が制限される。ＤＭＥＭは、印刷中に細胞の健康を維持するために必要な栄養素と細胞適合性環境を提供する。

Ｆｏｌｇｅｒ Ｔｅｃｈ ＦＴ－５ Ｒ２ハードウェアとファームウェアは、印刷手法を容易にするために変更された。市販のＦＤＭプリントヘッドが取り外され、カスタム押出プリントヘッドに置き換えられた。プリンタのＺ軸制御は、プリンタのビルドプレートに取り付けられたカスタム回転フレームアセンブリの新たなＲ回転軸として再利用された。プリントヘッドとフレームを含むフレームアセンブリの非在庫部品を、ＭａｋｅｒＢｏｔ Ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ+を使用して社内でＰＬＡから３Ｄ印刷した。Ｘ軸、Ｙ軸及び新たなＲ軸上の分解能を向上させるために、ステッピングモータと駆動プーリが全部交換された。このようなハードウェアの変更に対応するために、プリンタのファームウェアも変更された。

細胞化コラーゲン超極細繊維足場を、マイクロウェルプレート内で培養するための硬質長方形フレームなど、任意の寸法及び形状のフレーム上に形成することも、将来の移植を容易にするために２本の縫合糸の間に直接形成することもできる。硬質物体が回転するにつれて、繊維を任意の数の形状及びさまざまな方向に巻き付けることが可能であり、例えば、ロボットによる「フレーム」の多軸操作によって達成可能な複雑さが増大する。平面シート状幾何学形状、角柱幾何学形状、円形又は円筒形の幾何学形状をはじめとする複雑な３Ｄ幾何学形状を有する足場を、ＣＡＤモデルに基づいて製造してもよい。

設計された足場形状と印刷パラメータのユーザ入力を受信し、対応するＧコードファイルを出力するために、カスタムＰｙｔｈｏｎコードを開発した。この制御システムについては、以下でさらに詳しく説明する。

無菌性を維持するために、物理システム全体は、バイオセーフティキャビネット又は濾過層流フードの内部に位置づけられてもよく、全構成要素を無菌的に取り扱ってもよい。

さまざまな幾何学的形状を有する細胞化コラーゲン超極細繊維足場（図２及び図４）を、３Ｄ印刷したＰＬＡフレーム上に迅速かつ再現性よく作製した。繊維が解けるのを防ぐために留め端部を備えた単一フレーム上に複数のサンプルを印刷した（図５）。このほか、足場を、２つの長さの縫合糸の間に印刷し、専用の取り付けアセンブリを使用して培養中に張力下で保持することもあり得る（図６）。ＰＬＡフレームが、印刷された足場の繊維整列とマクロ構造を維持し、数週間にわたって培養中の安定性を維持することが認められた。印刷されたコラーゲン足場を培養中にウェルプレートの表面から持ち上げて、足場からプレートへの細胞の移動を防ぐ「脚」を備えた状態でフレームを設計した。バイオリアクター試験中などに、ピンセットでの取り扱いを改善し、留め具に装填するための取り付けポイントとしての「耳」を備えた状態でフレームを設計した。ベンチマークとして、幅２ｍｍ、長さ１０ｍｍ及び厚さ０．５ｍｍの足場を、コラーゲン超極細繊維の伸長速度１から１０００ｍｍ／分、さらには最大１０，０００ｍｍ／分以上で２０分以内に印刷することができる。いくつかの実施形態では、伸長速度は約２０ｍｍ／分（１．２ｍ／時間）であってもよい。他の実施形態では、伸長速度は３００ｍｍ／分を超えてもよい。場合によっては、例えば、フレームを任意の適切な速度で回転させて、コラーゲン超極細繊維を巻き付け得ることが理解されよう。さらに他の実施形態では、フレームは１から２４０ｒｐｍの間の任意の速度で回転してもよい。

図１４は、均一な平行繊維を示す、印刷された足場の透過光顕微鏡画像である。図１５は、図１４の２倍の倍率で示す図１４の画像である。図１６は、全体にわたる細胞の均一な分布のほか、細胞の伸長を示す蛍光顕微鏡画像である。図１７は、図１６の２倍の倍率で示す図１６の画像である。

透過光顕微鏡法により、培養３日後に、高密度で高度に整列した平行繊維足場を、良好な寸法忠実度で示している（図１４及び図１５）。培養１１日後のＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＰＴＸ蛍光プローブで標識されたヒト腱細胞の蛍光画像化が、印刷された足場全体に均一に分布した細胞及び縦方向の細胞伸長を示す（図１６及び図１７）。細胞の蛍光を４９５ｎｍでの繊維の自己蛍光と重ねる。

単一溶液回転フレーム印刷用に開発された手法と同じように、明確に定義された異なる領域において複数の細胞型で被覆された、高密度で高度に整列した強力なコラーゲン超極細繊維から構成された細胞化足場を製造するための新たな積層造形手法を開発した。単一の印刷された足場内で複数の細胞型又は印刷された溶液の場所を制御する能力は、筋腱接合部（筋腱境界面）及び付着部（腱／靱帯と骨の境界面）などの異なる組織タイプの境界面での損傷の修復と損傷組織の再生を可能にし、促進することを目的としている。

この手法を実施するために、二重溶液プリントヘッド（図７）を、Ｆｏｌｇｅｒ Ｔｅｃｈ ＦＴ－５ Ｒ２商用３Ｄプリンタと相互作用するように設計し、作製した。２つの独立した遊星歯車ステッピングモータが使い捨て注入器を個別に機械的に圧縮し、１マイクロリットル未満の分解能で細胞懸濁液を分配する。細胞懸濁液を、単一溶液回転フレーム手法を用いた場合のように同軸針を通過させるのではなく、電動スライドマニホールドの両端に分配する。マニホールドの各端部では、分配された細胞懸濁液が小さな被覆用容器に蓄積される。印刷中、自動マニホールドは前後に摺動して、細胞懸濁液の各容器を、印刷中のコラーゲン繊維と接触させるか、非接触にする。繊維が各容器を通過すると、それぞれの細胞懸濁液によって均一に被覆される。伸長繊維１ミリメートルあたりに分配された細胞懸濁液の量は、ユーザが判定するプロセスパラメータであり、足場全体で得られる細胞密度を制御する手段を提供する。

最大３つのコラーゲン繊維スプールをプリントヘッドに装填し、印刷中の繊維の張力を制御することができる調整可能な滑りクラッチに取り付ける。繊維は、スライドマニホールドの中心を通って供給される。ここで、繊維は、いずれの被覆用容器とも接触しない。例えば、溶液Ａで被覆された繊維の領域を印刷するために、電動マニホールドは、分配された溶液Ａの容器を繊維が通過するまで摺動する。次に、回転フレームが回転して容器を通して繊維を引き出し、溶液Ａで被覆する。次に、溶液Ｂで被覆された繊維の領域を印刷するために、電動マニホールドは、分配された溶液Ｂの容器を繊維が通過するまで反対方向に摺動し、繊維を再度引き出して被覆する。繊維を２つの溶液で被覆することと、回転フレームの回転とを調整することにより、異なる溶液の２つの異なる領域、あるいは異なる細胞懸濁液の場合の細胞型を含む足場を作製することができる。この手法は、複数の被覆用容器内に繊維を位置決め可能なマニホールドを使用して、異なる領域に任意の数の溶液と細胞型とを含む足場を印刷するために、都合よく拡張することができる。

回転フレーム受容基板は、上記の単一溶液回転フレーム印刷手法について説明したものと同一である。細胞化足場を印刷するために、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で調製したヒアルロン酸溶液に細胞を懸濁する。ヒアルロン酸は、細胞外基質の重要な成分であり、本明細書ではコラーゲン超極細繊維への細胞の接着を促進する「細胞接着剤」として利用される。さらに、分配量の制御が向上し、印刷中の細胞の沈降の影響が、粘度が高いため制限される。ＤＭＥＭは、印刷中に細胞の健康を維持するために必要な栄養素と細胞適合性環境を提供する。

上記で考察した修正Ｆｏｌｇｅｒ Ｔｅｃｈ ＦＴ－５ Ｒ２は、上記に記載した単一溶液プリントヘッドが多溶液プリントヘッドに置き換えられた状態で、多溶液印刷にも使用される（図７）。さらに、Ｙ軸駆動は、プリントヘッド上のスライドマニホールドの電動摺動運動を制御するように変更される。即ち、Ｙ方向の運動はプリントヘッド上でこれ以上自動化されなくなる。これは、回転フレーム印刷手法を使用するとＹ方向に必要な運動がないため、機能には影響しない。このようなハードウェアの変更に対応するために、プリンタのファームウェアも変更された。

上記のカスタムＰｙｔｈｏｎコードは、設計された足場形状と印刷パラメータのユーザ入力を受け入れ、対応するＧコードファイルを出力するために開発された。ユーザ入力には、フレームごとの足場の数、足場間の距離、足場の幅、足場の高さ、繊維の層の数、伸長繊維１ミリメートルあたりの細胞懸濁液の分配量、平行繊維間の送り距離、印刷中のフレームからプリントヘッドまでのＺ方向のスタンドオフ距離、印刷中のフレームからプリントヘッドまでのＹ方向のスタンドオフ距離、別個の領域の二重細胞型を印刷するか、単一細胞型を印刷するかを指定する値、領域Ａの長さ、領域Ｂの長さ、フレームの長さ及びフレームの回転速度が含まれる。Ｐｙｔｈｏｎコードは、設計された印刷を実行するためのあらゆるパラメータ及び運動／押し出しコマンドを含むＧコードファイルを計算し、出力する。このファイルは、設計された足場を製造するためにプリンタに送信される。Ｒｅｐｅｔｉｅｒ－Ｈｏｓｔは、このようなコマンドのほか、手動帰巣、運動及び押し出しコマンドを実行するためのユーザインターフェースとして使用される。

２つの別個の領域を有する足場を、多溶液回転フレーム印刷手法を使用して、迅速かつ再現性よく作製した（図１２）。ここでは、視覚化のために２つの異なる色の食品着色料で染色されたヒアルロン酸の異なる領域が印刷されたコラーゲン繊維足場を示す。

図１８は、ラット筋前駆細胞（ＭＰＣ）を印刷した足場の蛍光顕微鏡画像であり、生細胞、死細胞及び４０５ｎｍでのコラーゲン線維自家蛍光を示している。図１９は、図１８に示す足場の７日間の培養後の蛍光顕微鏡画像である。７日後、細胞は、図１９の緑色の存在がさらに顕著になることよって示すように、増殖した。図２０は、１日間、３日間及び７日間の培養後のヒト腱細胞を印刷した足場の代謝活性を示すａｌａｍａｒＢｌｕｅ分析の結果を示すグラフである。

最初の特性評価ステップとして、多溶液回転フレームプリントヘッドを使用して足場を作製したが、使用した溶液は１つだけであった。即ち、被覆用容器を備えたスライドマニホールドは、印刷中に繊維を被覆するために使用されるが、印刷中は静止したままであり、別の溶液による被覆に切り替えることはない。細胞の生存率と分布を評価するために、４Ｅ６細胞／ｍＬで懸濁した（Ｇｅｏｒｇｅ Ｃｈｒｉｓｔ博士の研究室からの）ラット筋前駆細胞（ＭＰＣ）を筋肉様足場に印刷した。接着細胞を、印刷のために収集する前に、標準的なプロトコルに従って蛍光親油性トレーサＤｉＤで標識した。幅５ｍｍ、長さ１０ｍｍ及び厚さ０．２５ｍｍの足場をＰＬＡフレーム上に印刷した。印刷直後、標準プロトコルに従って、死細胞核を蛍光エチジウムホモ二重体－１で標識した。足場を倒立蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ、Ｚｅｉｓｓ）で画像化した。生細胞、死細胞及び４０５ｎｍでのコラーゲン線維の自己蛍光を示す蛍光画像を重ね合わせた（図１８）。細胞を、生細胞と死細胞の適度な比率で、足場全体で均一に確認することができる。７日間の培養後に標識及び画像化を繰り返した（図１９）。細胞を、顕著な増殖により密度が増大し、生細胞と死細胞の比率が増大した状態で、足場全体で確認することができる。

このほか、腱様足場を、１Ｅ６細胞／ｍＬで懸濁したヒト腱細胞又は腱細胞（ＺｅｎＢｉｏ）を使用して印刷して、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ分析を使用して経時的な細胞代謝活性を評価した。足場を腱細胞増殖培地中の１０％ａｌａｍａｒＢｌｕｅ溶液中で４時間培養し、標準プロトコルに従って蛍光を測定した。培養中の細胞化足場の代謝活性（ｎ=７）が、７日間の培養にわたって増大することが認められた（図２０）。これは、細胞の健康、活性及び増殖の増大を示している。

図２１は、異なる領域にＭＰＣ及び腱細胞を印刷した二重溶液足場の蛍光画像であり、画像は、ＭＰＣの高密度領域（左）及び腱細胞の低密度領域（右）を示す。図２２は、１日間、３日間及び７日間の培養後のＭＰＣ及び腱細胞を印刷した足場の代謝活性を示す、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ分析の結果を示すグラフである。

多溶液回転フレーム印刷を検証するために、異なる領域に低密度のヒト腱細胞と高密度の筋前駆細胞を備えた足場を作製した。具体的には、最終的な腱細胞印刷溶液は、１．５Ｅ６ヒト腱細胞／ｍＬ（ＺｅｎＢｉｏ、ＮＣ）から構成され、ヒト筋前駆細胞（ＭＰＣ）印刷溶液は、（Ｇｅｏｒｇｅ Ｃｈｒｉｓｔ博士の研究室、ＵＶＡ、ＶＡから入手した）４Ｅ６ヒト筋前駆細胞／ｍＬから構成された。印刷されたサンプルは全長９ｍｍであり、一方の端部に長さ４ｍｍの腱細胞領域があり、反対側の端部に長さ４ｍｍのＭＰＣ領域があった。視覚化のために、両方の細胞型をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＰＴＸ蛍光プローブで標識した。印刷直後に撮影された蛍光画像では、細胞密度が高い領域（左側）と細胞密度が低い領域（右側）の異なる領域（細胞蛍光を白色で示す）を示し、その間には明確に定義された境界面が存在する（図２１）。これは、設計された領域でさまざまな材料、この場合は細胞懸濁液を使用して足場を作製する能力を示している。おそらく、これは、天然組織に存在するような境界面での指様パターンが互いに入り込むなど、さまざまなパターンに拡張されることがあり得る。腱細胞及びＭＰＣの領域を備えるこのような二重溶液足場はこのほか、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ分析を使用して細胞の代謝活性を経時的に評価するために使用された。足場を筋前駆細胞増殖培地中の１０％ａｌａｍａｒＢｌｕｅ溶液中で４時間培養し、標準プロトコルに従って蛍光を測定した。培養中の細胞化足場の代謝活性（ｎ=４）が、７日間の培養にわたって増大することが認められた（図２２）。これは、共培養中のこの２つの細胞型にわたる全体的な細胞の健康、活性及び増殖の増大を示している。

ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を印刷した足場と、同細胞を印刷していない足場を、典型的な細胞培養条件下で１日間及び２８日間培養して足場の機械的特性を評価した。図２３は、回転フレーム手法を使用して印刷された無細胞足場及び細胞足場の培養の１日後及び２８日後のピーク負荷を示すグラフである。図２４は、回転フレーム手法を使用して印刷された無細胞足場及び細胞足場の培養の１日後及び２８日後の極限引張強度（ＵＴＳ）を示すグラフである。図２５は、回転フレーム手法を使用して印刷された無細胞足場及び細胞足場の培養の１日後及び２８日後の接線弾性率を示すグラフである。図２６は、回転フレーム手法を使用して印刷された無細胞足場及び細胞足場の培養の１日後及び２８日後の破断点歪みを示すグラフである。

足場に細胞を印刷しなかったものと、細胞を印刷したものを作成して、回転フレーム手法を使用して印刷されたコラーゲン繊維足場の機械的特性と細胞の影響を特徴付けた。試験の直前に、サンプルを培養から取り出し、糸くずの出ない拭き取り繊維を使用して余分な培地を取り除いた。キャリパーを使用してサンプルの断面を測定した。各端部を、１００Ｎのロードセルを備えた一軸引張試験機（ＭＴＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ、ＭＮ）の把持部に締結した。把持部移動速度０．５ｍｍ／秒でサンプルを引張って破壊し、荷重と移動のデータを記録した。極限引張強度（ＵＴＳ）を、記録された最高荷重を使用して判定し、接線弾性率を応力－歪み曲線の線形領域によって判定した。培養の１日後及び２８日後の破壊を試験した同一の無細胞足場及び細胞足場について、ピーク荷重、ＵＴＳ、接線弾性率及び破断点歪みを図２３、図２４、図２５及び図２６にそれぞれ示す。

いくつかの実施形態では、足場構築物は、単一の生体適合性溶液を使用して形成されてもよい。即ち、足場構築物は、組織化された構成で配置され、ヒアルロン酸溶液などの生体適合性溶液で被覆された複数のコラーゲン超極細繊維を含んでもよい。いくつかの実施形態では、生体適合性溶液は、生体適合性溶液中に懸濁された細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態では、生体適合性溶液は、コラーゲン超極細繊維ストランド上に被覆されることになる１つ又は複数の添加剤を含んでもよい。１つ又は複数の添加剤は、例えば、成長因子、抗生物質、小分子医薬品又は任意の他の適切な添加剤を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、コラーゲン超極細繊維は、例えば、上記の方法で回転可能フレーム周りに巻き付けられるように、連続的なループ状に配置されてもよい。いくつかの実施形態では、複数のコラーゲン超極細繊維は互いに実質的に平行であってもよい。他の実施形態では、コラーゲン超極細繊維の少なくともいくつかは、足場構築物中の他のコラーゲン超極細繊維に対して斜めの角度で配置されてもよい。

そのような単一溶液足場構築物は、ヒト筋骨格組織の機械的特性に近似するか、それを超える機械的特性を有してもよい。いくつかの実施形態では、足場構築物は、ヒトの腱組織及び靱帯組織の機械的特性を超える機械的特性を有してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、足場構築物は、ヒト前十字靱帯（ＡＣＬ）、ヒト棘上筋腱及びヒト筋肉の平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みに近似するか、それを超える平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みを有してもよい。

単一溶液手法
単一溶液で形成された足場構築物は、上記と実質的に同一の装置上で形成されてもよい。この装置は、オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配するように構成された送達デバイスを備えてもよい。この装置は回転可能フレームを備えてもよい。さらに、装置は、コラーゲン超極細繊維ストランドを、ストランドの分配中に生体適合性溶液で被覆するように構成されたストランド被覆システムを含んでもよく、溶液ストランド被覆システムは送達デバイスと回転可能フレームとの間に配置される。さらに、装置は、回転可能フレームを回転軸回りで回転させるように構成された回転デバイスを備えてもよい。

装置は、回転可能フレームの回転によりオリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、コラーゲン超極細繊維ストランドを生体適合性溶液で被覆し、コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレーム周りに巻き付けるように構成されてもよい。装置は、実質的平面状フレームの異なる部分周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために、送達デバイス及び実質的平面状フレームが回転軸に沿って互いに対して平行移動するようにさらに構成されてもよい。

回転可能フレームは、任意の適切な構成を有してもよい。場合によっては、回転可能フレームは、コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付け得る少なくとも２つの平行な梁を備え、結果として連続ループに構成された足場構築物を形成してもよい。いくつかの実施形態では、回転可能フレームは、張力下で足場構築物の連続ループを維持するために、バネ付勢されてもよい。いくつかの実施形態では、回転可能フレームは、平行梁を互いに対して固定する取り外し可能端部片を備えてよい。ここで、取り外し可能端部片の除去により、連続ループ足場構築物を平行梁から滑り落とすことができる。いくつかの実施形態では、回転可能フレームは、細胞培養液中に浸漬されるように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、フレームは、生体適合性溶液中の細胞が足場のコラーゲン材料に向かうよりもフレーム材料に向かって移動する可能性が低い可能性がある材料で形成されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、回転可能フレームは、ステンレス鋼などの材料で形成されてもよい。細胞は、回転可能フレームのステンレス鋼梁に向かって移動するよりも、コラーゲンストランドに向かって移動する可能性が高くなる。いくつかの実施形態では、フレームは、滅菌可能な材料で形成されてもよい。

いくつかの実施形態では、送達デバイスは、コラーゲン超極細繊維の複数のストランドを同時に分配するように構成されてもよい。複数のストランドは、同じ針／オリフィスを通して分配されてもよい。例えば、場合によっては、３本のコラーゲン超極細繊維ストランドを同時に分配し、回転可能フレーム周りに巻き付けてもよい。任意の実用的な数のコラーゲン超極細繊維ストランドを同時に分配し得ることが理解されよう。複数のコラーゲン超極細繊維ストランドを同時に引き出すと、細胞付着の増大、足場構築物のサイズと強度の増大、構築物の迅速な構築、生体適合性溶液（及び細胞）が被覆され得る表面積の増大をはじめとするいくつかの利点が得られ、細胞が結合している可能性のあるコラーゲン超極細繊維間に空間が得られる。

単一の生体適合性溶液を用いて足場構築物を作成する方法は、ストランドが通過する溶液を交互に入れ替える代わりに、単一溶液を通じてストランドを連続的に分配し得る点を除いて、二重溶液足場構築物を作成するための上記のプロセスと実質的に同一であってもよい。足場構築物を作成する方法は、コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレームに貼り付けることと、回転可能フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために回転軸回りで回転可能フレームを回転させることとを含んでもよい。回転可能フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けると、送達デバイスからコラーゲン超極細繊維ストランドが引き出され、それによって、オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドが分配され、生体適合性溶液を通してコラーゲン超極細繊維ストランドが引き出される。これにより、連続ループとして構成された足場構築物が形成されてもよい。

この方法は、回転可能フレームの異なる部分周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために、実質的平面状フレーム及び分配デバイスを回転軸に沿って相互に平行移動させることをさらに含んでもよい。場合によっては、この方法は、回転可能フレームの回転によって複数のコラーゲン超極細繊維を同時に引き出すことを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、回転可能フレームは、コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付け得る少なくとも２つの平行梁を備えてもよい。場合によっては、回転可能フレームは、平行梁を互いに所定の距離に保持する２つの端部片を備えてもよい。端部片のうちの少なくとも１つは取り外し可能であってもよい。そのような実施形態では、この方法は、取り外し可能端部片の少なくとも１つを取り外すことと、足場構築物を平行梁から滑り落とすことと、を含んでもよい。

細胞溶液を利用する場合には、この方法は、コラーゲン超極細繊維を巻き付けた回転可能フレームを細胞培養液に浸漬することを含んでもよい。フレーム上の足場構築物は、所定の時間、細胞培養液中に放置されてもよい。

浸漬（ハイドロゲル）手法
回転フレーム印刷手法は、生体適合性ヒドロゲルを含む足場構築物を形成するために使用され得ることが理解されよう。そのような構築物は、第１の生体適合性溶液を通してコラーゲン超極細繊維を分配し、回転フレームを第２の生体適合性溶液に浸漬することによって形成されてもよい。第２の生体適合性溶液は、第１の生体適合性溶液と組み合わされるとヒドロゲルを生成し、ひいては生体適合性ヒドロゲルにおいて回転可能フレーム周りの複数のコラーゲン超極細繊維の巻きを包み込む。

例示的な手順には、フィブリノーゲン溶液（細胞溶液であってもよい）を通してコラーゲン超極細繊維を分配することと、トロンビン溶液に浸漬された回転フレーム上に超極細繊維を巻き付けることと、が含まれる。フィブリノーゲンとトロンビンは、組み合わされるとフィブリンヒドロゲル材料を形成し、同材料は、足場構築物を包み込むか、そうでなければ被覆する。フィブリンは、血液凝固中に形成される天然タンパク質であり、ＦＤＡが承認した医療処置で広く使用されており、その生体適合性、生物活性及び機械的特性により組織工学材料として有望である。

一方、非浸漬手順では、第１の生体適合性溶液は、（場合によってはｈＭＳＣなどの細胞を含む）ヒアルロン酸溶液であるが、浸漬手順では、第１の生体適合性溶液には、代わりに、４０ｍｇ／ｍＬウシ由来フィブリノーゲン溶液（１００万から１，０００万個の細胞／ｍＬ）に懸濁した細胞が含まれる場合がある。以前と同じように、回転フレームバイオ印刷プロセスを使用して、コラーゲン超極細繊維をこの細胞懸濁液で制御しながら被覆してもよい。このとき、繊維は、それ自体の横と上に巻き付けられ、細胞が全体に分布した３Ｄ移植片を形成する。

いくつかの実施形態では、空気中で足場形成を実施する代わりに、浸漬法は、移植片が印刷中に浸漬されたままであるｈＭＳＣ培地中に調製された７Ｕ／ｍＬのウシ由来トロンビン溶液の槽を利用してもよい。分配されたフィブリノーゲン細胞懸濁液で被覆されたコラーゲン繊維が槽に接触すると、トロンビンが急速にフィブリノーゲンの凝固を開始し、安定したフィブリンゲルの形成を開始する。このプロセスにより、細胞が繊維に結合し、印刷された足場構築物から剥がれる細胞の数が大幅に減少する。混合すると数秒以内に固化（ゲル化）のプロセスが始まる溶液を選択する必要がある。

トロンビン槽はこのほか、足場の水和を維持し、印刷中の細胞ストレスを制限するために３７℃に温められてもよい。印刷が完了すると、槽は、回転可能フレームが配置され得る培養プレートに移すための一時フレームにアクセスすることができるように下降する。

細胞代謝活性のａｌａｍａｒＢｌｕｅ分析を使用して、フィブリン移植片による細胞の健康と増殖を評価する１４日間試験を実施した。細胞の状態が変化する可能性があるため、細胞代謝活性は細胞数を直接示すものではないが、ａｌａｍａｒＢｌｕｅは標準曲線を生成することにより移植片内の細胞の総数を推定するために使用されている。連続希釈法を使用して既知の数の細胞をウェルプレートに播種し、３時間付着させ、標準的なａｌａｍａｒＢｌｕｅプロトコルを使用して評価した。全体として、細胞数の指数関数的な増大が観察され、浸漬回転フレーム手法を使用してフィブリンゲルで製造されたインプラントの優れた細胞適合性を示した。

浸漬回転フレーム手法は、いくつか例を挙げると、中和緩衝液に印刷されたコラーゲン溶液又はイオン架橋溶液に印刷されたアルギン酸ナトリウムなど、互いに接触するとヒドロゲルを形成するさまざまな細胞適合性試薬対に適用されてもよい。他の実施形態では、例示的なヒドロゲル前駆体／流体槽の組み合わせには、フィブリノーゲン＋トロンビン、フィブリノーゲン／トロンビン＋第ＸＩＩＩ因子、アルギン酸塩＋イオン性化合物、コラーゲン＋酵素溶液、シルク＋酵素溶液、あるいはゼラチン＋酵素溶液が含まれてもよい。他の試薬対は、当業者には既知であろう。

さらに、第１の生体適合性溶液は、コラーゲン超極細繊維ストランド上に被覆されることになる１つ又は複数の添加剤を含んでもよい。１つ又は複数の添加剤は、例えば、成長因子、抗生物質又は小分子医薬品を含んでもよい。

生体適合性ヒドロゲルを用いて形成された足場構築物は、ヒト筋骨格組織の機械的特性に近似するか、それを超える機械的特性を有してもよい。例えば、足場構築物は、ヒトの腱組織及び靱帯組織の機械的特性に近似するか、それを超える機械的特性を有してもよい。注目すべきことに、足場構築物は、ヒト前十字靱帯（ＡＣＬ）、ヒト棘上筋腱及びヒト筋肉の平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みに近似するか、それを超える平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みを有してもよい。

図２７は、足場構築物を、溶液中に浸漬されている間に、回転可能フレーム上に作成するための装置の概略正面図である。そのような足場構築物は、組織化された構成で配置され、生体適合性ヒドロゲルが被覆された複数のコラーゲン超極細繊維を含んでもよい。コラーゲン超極細繊維は連続ループ状に配置されてもよい。このほか、浸漬回転フレームを使用して他の形状を形成することがあり得る。例えば、回転フレーム上の巻線の少なくとも一部を、巻線の方向に対して斜めの角度で配置してもよい。

図２７に示すように、足場構築物を作成するための装置２７００が、上記の装置とほぼ同じ機械的構造を備えてもよい。例えば、装置２７００は、コラーゲン超極細繊維ストランドを分配するように構成された送達デバイスを備えてもよい。送達デバイスは、１つ又は複数のコラーゲン超極細繊維ストランドを分配するように構成されたスプール２７０５を備えてもよい。いくつかの実施形態では、スプール２７０５は複数のスプールを含んでもよい（図２８を参照）。このため、上記で考察したように、スプール２７０５は、２つ以上の超極細繊維ストランド、例えば、３つのストランドを分配するように構成されてもよい。

装置は、ストランドの分配中にコラーゲン超極細繊維ストランドを第１の生体適合性溶液で被覆するように構成されたストランド被覆システムをさらに備えてもよく、溶液ストランド被覆システムは、送達デバイスと回転可能フレームとの間に配置される。図２７に示すように、ストランド被覆システムは、第１の生体適合性溶液２７２５を含む注入器２７２０と、コラーゲン超極細繊維ストランドが通過して引き出され得るオリフィス２７１５を有する針又はノズル２７１０と、を備えてもよい。いくつかの実施形態では、オリフィスは、針又はノズル以外の異なるタイプの構造上に設けられてもよいことが理解されよう。注入器２７２０は、第１の生体適合性溶液２７２５がオリフィス２７１５を通して分配される際に、コラーゲン超極細繊維ストランドを被覆する方法で第１の生体適合性溶液２７２５を分配するように構成されてもよい。

装置２７００は、回転可能フレームの回転により、オリフィス２７１５を通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、コラーゲン超極細繊維ストランドを第１の生体適合性溶液２７２５で被覆し、コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレーム周りに巻き付けるように構成されてもよい。このため、装置２７００は、回転可能フレームを回転軸回りで回転させるように構成された回転デバイスを備えてもよい。例えば、図２７にさらに示すように、装置２７００は、回転可能フレームを回転させるように構成された回転システム２７４０を備えてもよい。回転システム２７４０は回転モータ２７４５を備えてもよい。回転モータ２７４５は、任意の適切なタイプの回転モータであってもよく、上記で考察したモータの任意の特徴を有してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、回転モータ２７４５はステッピングモータであってもよい。

装置２７００は、回転可能フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付ける間に回転可能フレームが浸漬され得る第２の生体適合性溶液を含むように構成された槽をさらに備えてもよい。例えば、図２７に示すように、装置２７００は、第２の生体適合性溶液２７３５を含む槽２７３０を備えてもよい。以下の図に示すように、槽２７３０は、回転可能フレームをその中に浸漬し、回転させ、コラーゲン超極細繊維ストランドを回転フレーム周りに巻き付けることができるように構成されてもよい。

さらに、装置２７００は、回転モータ２７４５によって回転されることになる回転可能フレームを保持するように構成された回転可能フレーム支持構造２７５０を備えてもよい。さらに、装置２７００は、回転可能フレームの取り付け位置を回転モータ２７４５に対して下方に再配置するように構成された回転可能フレーム再配置システム２７５５を備えてもよい。これにより、回転可能フレームを回転させながら槽２７３０内に配置することが可能になる。

回転可能フレームは、コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付け得る任意の適切な構成を有してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、回転可能フレームは、間隔を置いて配置された少なくとも２つの実質的に平行な梁を備えてもよい。そのような平行梁周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けると、連続ループとして構成された足場構築物が製造される。さまざまな回転可能フレームの幾何学形状にわたって、硬質フレームが、数週間にわたって培養中の繊維の整列と印刷された足場構築物のマクロ構造を維持することが認められた。

図２８は、図２７の装置の概略正面斜視図である。図２８に示すように、回転可能フレーム２７６０は、コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付け得る少なくとも２つの平行梁を備え、ひいては連続ループ状に構成される足場構築物を形成してもよい（図３４から図３６も参照）。例えば、図２８に示すように、回転可能フレーム２７６０は、第１の梁２７６５及び第２の梁２７７０を備えてもよい。いくつかの実施形態では、第１の梁２７６５及び第２の梁２７７０は、回転可能フレーム２７６０が組み立てられるとき、互いに実質的に平行であってもよい。いくつかの実施形態では、回転可能フレーム２７６０はこのほか、第１の梁２７６５と第２の梁２７７０を互いに対して固定する第１の端部片２７７５と第２の端部片２７８０を備えてもよい。いくつかの実施形態では、このような端部片の少なくとも１つが、連続ループ足場構築物を梁から滑り落とすことができるように取り外し可能であってもよい。

回転可能フレームは、図２から図６及び図１２に示し、上記で考察した設計の構成及び／又は特性を含む、さまざまな適切な構成及び／又は特性のいずれかを有してもよい。いくつかの実施形態では、回転可能フレームは、張力下で足場構築物の連続ループを維持するために、バネ付勢されてもよい。例えば、図６を参照されたい。

コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレームに巻き付けた後、フレーム全体を細胞培養液に浸漬してもよい。このため、いくつかの実施形態では、回転可能フレームは、劣化することなく細胞培養液に浸漬されるように構成されてもよい。

このほか図２８に示すように、装置２７００は、水中印刷を容易にするように構成された追加の回転アセンブリを備えてもよい。例えば、回転可能フレーム再配置システム（２７５５、図２７に示す）は、歯車システム２８００を備えてもよい。歯車システム２８００は、回転モータの回転を、低めの場所に伝達し、その結果、回転可能フレームがモータ出力軸の軸からずれた場所で回転してもよい。

足場構築物を作成する方法には、上記で考察したように、コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレームに貼り付けることと、回転可能フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために回転軸回りで回転可能フレームを回転させることと、が含まれてもよい。このほか、上記で説明したように、回転可能フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けることにより、送達デバイスからコラーゲン超極細繊維ストランドが引き出され、それによって、オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配し、第１の生体適合性溶液を通してコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出す。回転可能フレームは、回転可能フレーム周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付ける間、第２の生体適合性溶液に浸漬され、第１の生体適合性溶液と第２の生体適合性溶液とが組み合わされて生体適合性ヒドロゲルを形成する。

図２９は、回転可能フレームを浸漬した状態の図２７の装置の概略正面斜視図である。図２９に示すように、回転フレーム２７６０を浸漬するために、支持ブロック２９００を使用して槽２７３０の位置を上昇させてもよい。

図３０は、装置２７００の歯車システム２８００の概略正面斜視図である。図３０に示すように、歯車システム２８００は、回転モータの出力軸に取り付けられた第１の歯車３０００を備えてもよい。歯車システム２８００はこのほか、第１の歯車３０００によって駆動される第２の歯車３００５と、第２の歯車３００５によって駆動される第３の歯車３０１０とを備えてもよい。第３の歯車３０１０は、回転可能フレーム支持構造２７５０に取り付けられてもよい（図２７参照）

図３１は、図２７の装置の歯車システムの概略拡大正面図である。回転可能フレーム２７６０が装置に取り付けられているのがはっきりと見える。

図３２は、回転可能フレームが浸漬された状態の図２７の装置の概略正面図である。図３２に示すように、槽２７３０を持ち上げて、その下に支持ブロック２９００を配置してもよい。いくつかの実施形態では、槽２７３０は手動で移動可能であってもよい。他の実施形態では、槽２７３０は、機械式持ち上げシステムを用いて上下に昇降してもよい。これとは別に、回転可能フレーム２７６０は槽２７３０内に降下してもよい。図３３は、装置２７００に取り付けられ、槽２７３０に浸漬された回転可能フレーム２７６０の概略正面斜視図である。

図３４は、回転可能フレーム２７６０の概略背面斜視図である。図３４に示すように、回転可能フレーム２７６０は、第１の端部片２７７５及び第２の端部片２７８０によって互いに対して固定され得る第１の梁２７６５及び第２の梁２７７０から構成されてもよい。第１の端部片２７７５及び第２の端部片２７８０は、回転機構に取り付け可能であるように構成されてもよい。さらに、繰り返しになるが、端部片の一方又は両方は、足場構築物（３４０５）を梁から滑り落とすために、梁から取り外し可能であってもよい。いくつかの実施形態では、フレームの端部片は、ゴムなどの可撓性材料から形成されてもよく、その結果、足場構築物にかかる張力を軽減し、回転可能フレームから足場構築物を取り外すことができるようにするために、梁が共に圧迫されてもよい。

さらに、第１の端部片２７７５及び／又は第２の端部片２７８０は、穴３４００を備えてもよい。コラーゲン超極細繊維ストランドが、巻き付けられた後、スプールから切断され、結んでいない端が残る場合がある。ストランドの結んでいない端は、足場構築物が解けないように、穴３４００を通して結び付けられてもよい。これは、結んでいない端３４３０が穴３４００を通して結びつけられている図３５にみられる。場合によっては、穴３４００を利用して、巻き付けが実施される前にコラーゲン超極細繊維の先端を回転可能フレームに固定してもよい。

上記で考察した実施形態に関して説明したように、装置は、回転可能フレームの異なる部分周りにコラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるために、送達デバイス及び回転可能フレームが回転軸に沿って互いに対して平行移動するように構成されてもよい。図３５は、コラーゲン超極細繊維を３つの別々の区域に分けて巻き付けた状態の図３４の回転可能フレームの概略正面図である。オリフィスに対してフレームを横方向に移動させること（又はその逆）により、コラーゲン超極細繊維は、回転可能フレームの異なる区域に収集されてもよい。

特に、第１の足場構築物３４１０を回転可能フレーム２７６０の第１のエリアに形成してもよい。第２の足場構築物３４１５を回転可能フレーム２７６０の第２のエリアに形成してもよい。さらに、第３の足場構築物３４２０を回転可能フレーム２７６０の第３のエリアに形成してもよい。回転可能フレーム上に形成可能な足場構築物の数は、フレームの全体のサイズ、同時に引き出される／巻き付けられるストランドの数、コラーゲン超極細繊維ストランドの厚さ及び足場構築物の全体のサイズに依存してもよい。図３６は、創傷コラーゲン超極細繊維の３つの区域を有し、縫合糸３４２５が区域の各端を結合して、３つの別個の足場構築物を形成している回転可能フレーム２７６０の概略正面図である。

細胞の整列、分布及び機械的特性
次のセクションでは、本明細書に開示する方法を使用して形成された足場構築物の細胞整列、細胞分布及び機械的特性の態様について説明する。以下に、評価した各サンプルの製造方法を説明する。しかし、強度の大部分は、開示の全種類の足場構築物に共通するコラーゲン超極細繊維によってもたらされるものであるため、本明細書に記載の異なる製造方法のそれぞれによって形成された足場構築物の機械的特性はほぼ同じであると予想されることが理解されよう。

検査により、インプラントの優れた忠実性と細胞性が明らかになった。細胞化コラーゲン超極細繊維足場構築物を、単一溶液技術を使用して（即ち、細胞化ヒアルロン酸溶液を通して分配されたコラーゲン超極細繊維ストランドを用いて）形成した。巻き付け作業後、足場構築物を、上記のように縫合糸を使用して固定して個々の束にした。

基準インプラントにｈＭＳＣを印刷し、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ分析を使用して培養の１日後、４日後及び７日後の細胞代謝活性を評価した。蛍光により、細胞化インプラントの代謝活性が７日間の培養期間で５倍増大し、細胞の健康、活性、増殖の増大を示したことが認められた。

印刷されたインプラント全体の細胞生存率を、ｈＭＳＣの蛍光画像化によって定性的かつ定量的に評価した。図３７は、細胞ヒアルロン酸溶液を通して分配された３つのコラーゲン超極細繊維の画像である。定性的には、一般に、死細胞（赤）の数を大幅に上回る生細胞（緑）によって、高い生存率を示す。さらに、図３７は、コラーゲン超極細繊維の表面に直接配置された細胞３７００を示す。これは、単一溶液手法の利点の１つ、即ち、細胞がストランドの表面からわずかに分離してゲル内に浮遊するか懸濁したままになるヒドロゲルを形成する２溶液手法とは対照的に、細胞はストランドに引き寄せられる傾向があるということである。一方、ヒドロゲルは、さらに硬くなるため、細胞の足場構築物上の分布がいっそう均一化した状態を維持する可能性がある。

定量的には、ＩｍａｇｅＪを、確立された細胞計数技術と共に使用して、印刷直後のインプラント全体の生細胞と死細胞の数を比較した。典型的なプロセスパラメータを印刷した代表的なインプラントでは、ｈＭＳＣは印刷直後に９３．２±１．７%生存していることが認められ、細胞生存率はさまざまなインプラント形状及び印刷条件で一貫して９０％を超えていた。

さらに、細胞の蛍光画像化及び繊維自家蛍光により、ｈＭＳＣの初期分布が全体にわたって均一である印刷された培養１日後のインプラントと、密集して高密度に細胞化された培養２６日後のインプラントと、を示した。印刷された細胞は、２４時間以内にコラーゲン線維に付着してコラーゲン線維に沿って成長し、細胞の種類、初期の細胞印刷密度及び培養条件に依存する速度で密集状態になるまで増殖し続けることがわかった。

長期培養では、インプラントの全体的な外観は、目に見える繊維状の表面質感を備えたほぼ半透明から、滑らかな表面質感を備えた不透明な白から黄色がかった色に変化する。これは沈着した細胞外基質（ＥＣＭ）の顕著な蓄積を示している。このほか、隣接する繊維間の間隙を細胞が橋渡しする際の高密度の細胞内方成長を観察した。

時間の経過とともに、細胞はコラーゲン超極細繊維の縦方向の長さに沿って伸長する。基質の方向性は、機能、細胞リモデリングの可能性［Ｆｏｏｌｅｎ ２０１８］及び細胞で生成される細胞外基質の整列[Ｗａｎｇ２００３]に影響を及ぼしていることが示された。そのため、蛍光画像化及び画像処理技術を使用して、集合細胞装飾コラーゲン（ＡＣ－ＤＣ）インプラント全体の基質の方向性を定量化するために、ＩｍａｇｅＪの方向性分析を使用した。１４日間の培養後のＭＰＣを印刷したインプラントの典型的な２×２ｍｍの視野の代表的な合成画像を図３８に示す。

この整列を、定量化し、図３９及び図４０に示す。特に、図３９は、図３８に示す足場構築物の繊維のみの成分の方向性分析を示すグラフである。繊維のみの成分の分析では、ピーク方向の±１０°以内に方向特徴のほぼ全部を備えるかなりの程度に平行な繊維を示す狭い周波数分布が示される。

図４０は、図３８に示す足場構築物の細胞のみの成分の方向性分析を示すグラフである。細胞のみの成分の分析では、ほぼ全成分がピークの±２０°以内にあり、繊維に対してかなりの程度の細胞の整列が平行であることを示している、繊維の方向と本質的に同一のピークの向きを備える周波数分布が示される。ｈＭＳＣとＭＰＣの両方を印刷したインプラント全体にこの分析を実施したところ、インプラントでは、高度に整列した平行なコラーゲン線維と、高度な方向性を備えた線維方向の顕著な細胞伸長と、が一貫して示されていると結論付けられた。

さらに、均一な細胞分布を達成した。出願人は、視野内の粒子の分布を分析するための手段を適応させることによって、足場構築物全体にわたる細胞の分布を定量化する方法を開発した［Ｈａｎ２０１４、Ｏｂｅｒ２０１５］。このような方法は、ＡＣ－ＤＣプロセス制御とインプラント全体の細胞の均一な配置の再現性とを検証するための定量的手段を提供する。本明細書に示す結果は、代表的なものであり、細胞分布解析法の機能を示している。

図４１は、細胞を白色で示す細胞分布分析のための処理（例えば、ＭＰＣ細胞質膜の蛍光標識）後の図３８に示す足場構築物の画像である。細胞が構築物全体にわたって、構築物に沿って比較的均一に分布していることに留意されたい。この均一な分布を定量化し、図４２及び図４３に示す。

印刷されたインプラントの画像（例えば、図４１に示す画像）を、われわれのプロトコルに従って処理した。細胞のない空間を示す黒いピクセルと比較した細胞物質を示す白いピクセルの数によって判定された、画像の横方向及び縦方向に沿った相対的な細胞充実度は、計算され、描画される。図４２は、図４１に示す足場構築物の横軸に沿った相対的な細胞充実度を示すグラフである。図４３は、図４１に示す足場構築物の縦軸に沿った相対的な細胞充実度を示すグラフである。

相対的な細胞充実度のプロットが、印刷されたインプラント全体の細胞分布を簡単に視覚化する手段を提供する。山、谷及び歪みは、視野全体の細胞の数と配置の変化を示す。線形回帰分析を、細胞充実度を評価する簡単な方法としてさらに使用することができる。データを１００個の小型容器にて分析した完全に均一な細胞分布の場合、線形回帰分析の結果、ｙ切片が０．０１の水平線が得られる。このため、各小型容器の相対的な細胞充実度は、細胞の総数の１００分の１になることになる。ＭＰＣを印刷したＡＣ－ＤＣインプラントの代表的な視野から、横方向と縦方向の両方にわたって測定すると、線形回帰の結果がほぼ水平な線となり（図４２及び図４３）、印刷全体にわたる細胞の本質的に均一な分布を示していることがわかる。

図４２及び図４３に示すように、出願人は、シャノンエントロピーに基づく均一性尺度Ｕを用いて細胞の分布を定量化する追加の方法をさらに実施した［Ｈａｎ１０１４、Ｏｂｅｒ２０１５］。簡単に言うと、均一性尺度Ｕの範囲は０から１であり、細胞が視野のちょうど半分に存在する完全に不均一な分布のスコアは０であり、細胞が全体にわたって正確に均等に存在する完全に均一な分布のスコアは１である。相対的な細胞充実度の計算及び描画と同じように、均一性を横方向（図４２のＵ_{ｔｒａｎｓ}）及び縦方向（図４３のＵ_ｌｏｎｇ）にわたって計算し、同じ画像化技術及び画像処理技術を使用して判定した。例えば、ＭＰＣを備える代表的なＡＣ－ＤＣインプラントの場合、細胞均一性分析により、図４２に示すように、Ｕ_{ｔｒａｎｓ}＝０．８７が得られ、図４３に示すように、Ｕ_ｌｏｎｇ＝０．９５が得られる。

本明細書に記載のプロセスを使用して形成された足場構築物は、ヒト筋骨格組織の機械的特性に近似するか、それを超える機械的特性を示す。ＭＰＣは、単離し培養するのが難しく、良好に特徴付けられ、培養に充分に適応し、さまざまな研究室で広く使用されるため、生体力学的試験での播種に使用された。出願人は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞リモデリングの耐荷重能力、安定性及び効果を評価するために、静置培養で１日後及び２８日後に、ｈＭＳＣを印刷したＡＣ－ＤＣインプラント又はｈＭＳＣを印刷していないＡＣ－ＤＣインプラントの機械的特性を評価した。引張試験用のカスタム２ピン取り付け手法では、インプラントの損傷、滑り、あるいはインプラント内の個々の繊維の千鳥状の破損につながることが多い標準的な圧縮グリップでのインプラントの取り付けと比較して、大幅に一貫した結果が得られることが認められた。

図４４は、無細胞足場構築物及び細胞足場構築物の応力－歪み曲線を示すグラフである。図示のように、図４４に示す各試験群の代表的な応力－歪み曲線は、徐々に傾斜が増大する明確な「つま先」領域と、それに続く最大傾斜の直線領域と、最終的に破損を示す明確に定義された応力の急激な減少を示す。

断面積（図４５）、極限引張強度（ＵＴＳ）（図４６）、接線弾性率（図４７）及び破断点歪み（図４８）も同じように測定した。ＵＴＳ（図４６）及び接線弾性率（図４７）を表示するプロットでは、ヒトＡＣＬの平均ＵＴＳ及び引張弾性率（ａ）［Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ ２００６］と、ヒト棘上筋腱の最も強い部分（ｂ）［Ｉｔｏｉ １９９５］と、組織工学で使用される典型的なコラーゲンゲル（ｃ）［Ａｃｈｉｌｌｉ ２０１０］と、を示す水平線が描画される。図４６から図４８に示すように、ＡＣ－ＤＣバイオ印刷を使用して生成された無細胞インプラント及び細胞インプラントが、印刷直後には代表的な天然ヒト腱の重要な機械的特性とほぼ一致するか、それを超えており、培養２８日後もその状態を維持し続ける。

注目すべきことに、コラーゲン超極細繊維インプラントのＵＴＳ及び弾性率は、生物製造手法で一般的なコラーゲンゲルの強度及び剛性より数桁大きく、典型的なＵＴＳは約２０ｋＰａ、引張弾性率は約２００ｋＰａである［Ａｃｈｉｌｌｉ ２０１０］。このような値は、含まれる細胞の種類又は３Ｄ印刷された構築物の意図された成熟に関係なく、コラーゲンゲル自体の特徴である。培養の１日後及び２８日後の無細胞インプラント及び細胞インプラントは両方とも、破損する前に２０％を超える歪みを受けた（図４８）。このため、ＡＣ－ＤＣインプラントは、通常の歩行中のＡＣＬの１３．２%のピーク歪みなど、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での典型的な歪み値に耐えるのに充分な弾性を提供する［Ｔａｙｌｏｒ ２０１３］。筋肉の生体力学的試験は、その異方性、粘弾性、超弾性及び高度に非線形な弾性挙動のため、正確に評価することが非常に困難であるため、この分野ではほとんど研究されていないが、一般に、ＡＣ－ＤＣインプラントの引張特性は筋肉の引張特性を大幅に上回っている。この引張特性は、最低０．４４ＭｐａのＵＴＳ、約２．０Ｍｐａの弾性率及び繊維方向に沿った４０%を超える破断点歪みであることがある。

容積性筋損失の治療
容積性筋損失（ＶＭＬ）を含む筋骨格組織の損傷はありふれたものであり、多くの場合、永久的な障害及び変形につながる。本発明の一態様は、そのような筋骨格系軟組織の機能の修復及び再生を促進するための細胞化コラーゲン超極細繊維インプラントの調製及び使用に関する。臨床的に関連する細胞を、臨床的に関連する高強度コラーゲン線維に沿って制御可能に位置決めして、損傷した組織の形態と機能を回復するための筋骨格組織類似体を生物製造する。

ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）又はラット筋前駆細胞（ＭＰＣ）をバイオ印刷して、腱又は筋肉の再生をはじめとする多種多様な適応症に価値のあり得る人工インプラントを作成する。間葉系幹細胞は、その免疫回避特性［Ａｎｋｒｕｍ ２０１４、Ｚｈａｎｇ ２０１５］、治療効果［Ｚｈａｎｇ ２０１５、Ｊａｎｇ ２０１５、Ｌｅｅ ２０１７］、多系統分化能［Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ １９９９］及び市販の臨床的に関連する細胞型としての利用可能性により、筋骨格組織の修復と再生を増強する優れた可能性を提供する。同じように、ＭＰＣは、検証された動物モデルの容積性筋損失損傷の機能回復の促進に顕著な治療効果を示した［Ｍｉｎｔｚ（２０２０）、Ｐａｓｓｉｐｉｅｒｉ（２０１９）］。

本発明は、高い引張強度を有するグリオキサール架橋コラーゲン繊維を、バイオ印刷用のフィラメントとして使用することができ、同繊維は、自動化された拡張可能な製造プロセスで天然組織の構造的、細胞的及び機械的な類似性を再現することができるという発見に部分的に基づくものである。これは、以前は野心的なものであり、実現されていない課題であった［Ｍｕｒｐｈｙ（２０１４）、Ｍｕｒｐｈｙ （２０２０）］。

集合細胞装飾コラーゲン（「ＡＣ－ＤＣ」）バイオ印刷プロセスを使用して製造されたインプラントを使用した結果では、インプラント全体の細胞の方向性と分布が天然の筋骨格組織の細胞特性を模倣していることがわかった。本発明によるバイオ印刷されたインプラントは、ヒト筋骨格組織の強度及び剛性に近似しており、それを超えるように調整することができる。さらに、インプラントは、一般的なコラーゲンヒドロゲルの特性を桁違いに上回っていた。

このほか、そのようなインプラントの再生可能性を、げっ歯類のＶＭＬモデルにおいて生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で評価した。後肢に重大な大きさの筋肉損傷を作成して修復し、四肢のトルク発生の可能性を１２週間にわたって測定した。治療用筋前駆細胞を含むＡＣ－ＤＣインプラントが最も高い程度の回復を促進する状態で、無細胞インプラントと細胞インプラントの両方が、未修復群と比較して機能回復を促進することが認められた。

外植された筋肉断面の組織学的分析と自動画像処理により、総筋線維数、筋線維サイズの中央値が増大し、細胞化インプラントで修復された損傷の細胞化が増大していることが明らかになった。このような試験では、多くの困難な筋骨格損傷を修復する可能性を備え、天然に近い生物学的及び生体力学的な特性を備えた組織類似体を生成するための高度なバイオ印刷法の多大な可能性が提起される。

例：ＶＭＬモデルでの機能回復
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）骨格筋修復試験を、検証されたげっ歯類のＶＭＬモデルにおいて１２週間にわたって実施した。このような試験の詳細を、Ｋ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒ、Ｋ．Ｃｏｕｇｈｅｎｏｕｒ、Ｙ．Ｍａｇｈｄｏｕｒｉ－Ｗｈｉｔｅ、Ａ．Ａ．Ｂｕｌｙｓｈｅｖａ、Ｏ．Ｓｅｒｇｅａｎｔ、Ｍ．Ｒａｒｉｄｅｎ、Ａ．Ｒａｎｄａｚｚｏ、Ａ．Ｊ．Ｓｈｅｅａｎ、Ｇ．Ｊ．Ｃｈｒｉｓｔ、Ｍ．Ｐ．Ｆｒａｎｃｉｓによる２０２１年７月２日発行の「Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｃｏｒａｔｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＡＣ－ＤＣ）ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｄ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｍｉｍｉｃ ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ（集合細胞装飾コラーゲン（ＡＣ－ＤＣ）バイオ印刷インプラントは筋骨格組織の特性を模倣し、機能回復を促進する）」にて入手可能であり、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０６．２２．４４９４３１にてｂｉｏＲｘｉｖを介してプレプリントを入手可能である。この文献の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

Ｌｅｗｉｓラットの左下後肢の前脛骨（ＴＡ）筋から、全体の筋肉重量の少なくとも２０％を除去した［Ｍｉｎｔｚ（２０２０）、Ｃｏｒｏｎａ（２０１４）］。３つの修復方法を、修復を受けなかった対照群と、細胞成分を含まないＡＣ－ＤＣインプラントによる修復を受けた無細胞インプラント群と、げっ歯類のＭＰＣを印刷したＡＣ－ＤＣインプラントによる修復を受けた細胞インプラント群と、に対して直接評価した。欠損の作成、インプラントの初期配置、インプラント取り付けのための縫合糸の配置及び筋膜の置換をそれぞれ図４９Ａから図４９Ｄに示す。具体的には、図４９Ａは、約１ｃｍ×０．７ｃｍ×０．５ｃｍの大きさで、ＴＡ全体の重量の少なくとも２０％の重さのＶＭＬ損傷の作成を示す。図４９Ｂは、損傷部位に挿入された無細胞ＡＣ－ＤＣインプラントを示す。このインプラントは、図４９Ｃでは、損傷部位に縫合されており、矢印は取り付け点を示す。図４９Ｄは、インプラントを所定の位置にさらに固定するために損傷部位の上部を縫合した筋膜を示す。

動物はいずれも手術後に回復し、感染の兆候も死亡も認められなかった。実験群全体では、動物の体重が１２週間にわたって同じように増大した（図４９Ｅ）。これは、機能試験の時点に対応する、損傷前と、損傷後４週間、８週間及び１２週間での動物の体重を示している。図４９Ｆに示すように、手術時に測定された欠損重量は統計的に異なるものではなかった。図４９Ｆは、「修復なし」、「無細胞インプラント」及び「細胞インプラント」（それぞれ、ＮＲ、ＡＩ及びＣＩ）実験群に対して生じた欠損の重量を示す（ｐ＝０．８、有意差なし）。図４９Ｅから図４９Ｉでは、全データは、各時点の群ごとのｎ＝７に基づくものである（＊ｐ＜０．０５は有意性を示す）。

機能検査を、欠損作成前と、修復後の４週間、８週間及び１２週間に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で実施し、術後の筋肉の回復を評価した。簡単に説明すると、ラットの後肢を電動踏み板に取り付け、電気的に刺激して、最大等尺性トルク発生を測定した［Ｍｉｎｔｚ（２０２０）、Ｐａｓｓｉｐｉｅｒｉ（２０１９）、Ｃｏｒｏｎａ（２０１４）］。平均値を、動物の成長によるトルク発生の増大を制御するために、各時点での動物の体重に対して正規化されたトルク（Ｎ－ｍｍ／ｋｇ体重）として表す。図４９Ｇに示すように、欠損作成前の基準トルク発生能力は、治療群間で統計的に変化しなかった（ｐ=０．９、有意差なし）。修復後のトルク発生を生のトルクとして表し（図４９Ｈ）、基準トルク発生の百分率を図４９Ｉに示す。測定されたトルクと基準トルクの百分率を、修理後の４週間、８週間及び１２週間で表示する。このような数字は、インプラント埋入により機能回復が促進されることを示す。いずれの方法もほぼ同じ傾向を示すが、統計的有意性にはわずかな差異がある。

最も注目すべきは、治療用ＭＰＣを含む細胞化インプラントを用いて修復した損傷について、１２週間にわたってトルク発生能力の大幅な改善が観察されたことである。４週間後、生のトルク発生は、無細胞インプラント群及び細胞インプラント群の方が修復なし群よりも有意に低く、基準トルクの百分率は細胞インプラント群の方が有意に低かった。このトルク発生能力の初期低下は、初期の創傷治癒プロセスによるものであるか、インプラントの初期引張特性に関連している可能性があると考えられる。しかし、修復後８週間までに、治療グループ間で差は観察されなかった。

修復後１２週間では、４週間の所見とは対照的に、生のトルク発生は修復なし群と比較して細胞インプラント群で有意に高くなっていることが認められ、基準トルクの百分率は無細胞インプラント群と細胞インプラント群の両方で有意に高くなっており、治療群間のＶＭＬ損傷の機能回復での重要な傾向が明らかになった。さらに、修復を受けなかった動物では、１２週間にわたって機能の著しい低下がみられた。対照的に、無細胞インプラントを用いて修復された動物では、トルクの発生はほぼ一貫したままであり、細胞のないコラーゲン線維インプラントの存在により、修復がないことに伴う機能低下が軽減されたことが示された。

注目すべきことに、欠損作成中の協力筋の切除により、前区画でのトルク発生が約２０%除去される［Ｍｉｎｔｚ（２０２０）］。このように、正規化されたトルクは、治療群全体で最大８５Ｎ－ｍｍ／ｋｇに制限されるであろう（基準値で平均１０６Ｎ－ｍｍ／ｋｇ）。１２週間での細胞化インプラント群の平均機能回復は、協力筋切除後の理論上の最大回復の７６％であったのに対し、無細胞群では６７％、修復なし群では５７％であった。さらに、細胞インプラントを用いた修復を受けた７匹の動物のうち３匹では、８７％を超える機能回復が観察され、１匹の動物は損傷前のレベル（９９％）と比較して理論上のほぼ最大の回復まで回復した。

１２週間での生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での機能回復の評価後、形態学的かつ組織学的な検査のために単離されたＴＡ筋を収集した。無細胞ＡＣ－ＤＣインプラント及び細胞ＡＣ－ＤＣインプラントによって修復された筋肉の全体的な形態は、損傷部位に凸状の圧痕のある修復なし群よりも対照筋肉の方に類似しているように思われた。このほか、修復群の方が確認された筋膜が多かった。インプラントと周囲組織との区別は明らかではなく、コラーゲン線維インプラントの周囲の組織の内方成長又は同インプラントの吸収を示した。分離した筋肉を腹部の断面に切り出し、Ｈ＆Ｅ染色のために処理した。各実験群の代表的な画像を図５０Ａから図５０Ｄに示す。

図５０Ａから図５０Ｄでは、１２週間後の（Ａ）無傷対照群、（Ｂ）修復なし群、（Ｃ）無細胞インプラント群及び（Ｄ）細胞インプラント実験群についての前脛骨（ＴＡ）筋の代表的なＨ＆Ｅ画像を示す。黒い破線が、欠損発生のおおよその領域を示す。緑色の破線の楕円が、ＡＣ－ＤＣインプラントの場所を特定する。

図５０Ｅから図５０Ｆでは、拡大ウィンドウ図を含む（Ｅ）無細胞インプラントの場所及び（Ｆ）細胞インプラントの場所の拡大図が、細胞インプラントの場所（黄色の破線の楕円）での細胞内方成長及び筋線維形成を示す。図５０のスケールバーはいずれも、特に断りのない限り、１ｍｍである。

肉眼的検査と同じように、未修復群は損傷部位に明確な陥没があり、組織再生の欠如を示した（図５０Ｂ）。対照的に、無細胞インプラント及び細胞インプラントを用いて修復された動物では、無傷対照群と同じように組織がさらに充実し、断面が均一であるため、美容効果が向上した。インプラントから残ったコラーゲン線維が、損傷部位内で、直径１００μｍ程度の濃いピンク色のやや円形の断面として見える。インプラント内及びインプラント周りに細胞の内方成長が見える（図５０Ｅ及び５０Ｆ）。繊維断面は、細胞インプラント群よりも無細胞インプラント群の方が明白であり、おそらく細胞化インプラントの繊維吸収速度の増大を示している。細胞ＡＣ－ＤＣインプラントを用いて修復された損傷については、インプラント部位での新たな筋線維の存在に注目した（図５０Ｆ）。

Ｈ＆Ｅ切片からの画像の倍率が高くなると、図５１のインプラント領域内の新たな筋線維及び血管新生が、図５２のインプラント領域周りのマッソントリクローム染色によって定性的に示す新たなコラーゲンの沈着と共に、さらに明らかになる。図５１では、顕著な新たな筋線維を「ＭＦ」で標識している。同筋繊維は、（「＊」で標識された）インプラントコラーゲン線維によって画定すると、ＡＣ－ＤＣインプラント内で成長していることが認められた。このほか、インプラント領域では近くの血管を顕著に示しており、黒い矢印で示す。神経束を「Ｎ」で示す。図５２では、各群の切片にて、インプラント領域及び欠損エリアの内部及び周囲にコラーゲンが存在していることがわかる。

ＴＡ筋腹からの追加の切片を、図５３Ａから図５３Ｋに示すような半自動筋線維解析ソフトウェアであるＳＭＡＳＨを使用して解析するために処理した。図５３Ａから図５３Ｄでは、（Ａ）無傷対照群、（Ｂ）修復なし群、（Ｃ）無細胞インプラント群及び（Ｄ）細胞インプラント実験群について、ＴＡ筋の代表的なラミニン染色切片を示しており、破線の楕円は、損傷のおおよその領域を示している。図５３Ｅから図５３Ｈでは、（図５３Ａから図５３Ｄ）にそれぞれ対応する切片内の個々の筋線維を識別するソフトウェアからの色付けされた出力を示す。図５３Ｉは総繊維数を示し、図５３Ｊは繊維断面積（ＦＣＳＡ）中央値を示し、図５３Ｋは、無傷対照（Ｃｔｒｌ）群、修復なし（ＮＲ）群、無細胞インプラント（ＡＩ）群及び細胞インプラント（ＣＩ）実験群の線維数とＦＣＳＡの積を示す。図５３のスケールバーはいずれも１ｍｍである。提示されたデータは、各時点の群あたりのｎ=７に基づいており、*ｐ<０．０５は有意性を示す。

図５３を参照すると、ラミニン及びフルオロフォア４８８染色が、切片全体にわたって筋線維の輪郭を特定し（図５３Ａから図５３Ｄ）、着色を適用した場合に見られるように、ＳＭＡＳＨ分析により個々の線維の区別が可能になる（図５３Ｅから図５３Ｈ）。線維総数の分析では、無傷対照群、修復なし群、無細胞インプラント群及び細胞インプラント群の間に有意差は生じない（図５３Ｉ）。しかし、無細胞ＡＣ－ＤＣインプラント及び細胞ＡＣ－ＤＣインプラントを用いて修復された筋肉切片の線維断面積（ＦＣＳＡ）中央値は、修復なし群の中央値より有意に大きく、無傷対照群と有意な差はなかった（図５３Ｊ）。細胞化インプラント群及び対照群では、修復なし群との最大の差をそれぞれ、０．０００７及び０．０００２のｐ値で示す。

線維の総数に線維断面積中央値を乗算すると、総筋線維断面積が得られる（図５３Ｋ）。繰り返すと、この積では、無傷対照群と、無細胞インプラント及び細胞インプラントを用いて修復された、生存１２週間後の損傷との間に有意な差が示されず、ＡＣ－ＤＣインプラントが総筋線維面積の増大を促進したことを裏付けている。

要約すると、容積性筋損失（ＶＭＬ）を治療する方法には、組織化されたシート状構成に配置され、生体適合性溶液で被覆された複数のコラーゲン超極細繊維から形成された足場構築物をＶＭＬ創傷部位内に貼り付けることが含まれる。場合によっては、ＶＭＬ創傷部位内に足場構築物を貼り付けることには、足場構築物の２つ以上の部分をＶＭＬ創傷部位内の筋肉組織に縫合することを含んでもよい。例えば、足場構築物の四隅を創傷部位内で縫合してもよい。さらに、場合によっては、この方法は、ＶＭＬ創傷部位内に足場構築物を貼り付けた後、足場構築物上の筋膜を交換することをさらに含んでもよい。

このほか、場合によっては、所与のＶＭＬ創傷部位内に移植された足場構築物が、コラーゲン超極細繊維の複数のシート状の層を備え得ることに留意されたい。利用される層の数は、創傷部位の深さに応じて変化してもよい。同じように、使用される足場構築物の全体的なサイズは、創傷部位のサイズに応じて変化してもよい。

場合によっては、コラーゲン超極細繊維を被覆する生体適合性溶液はヒアルロン酸であってもよい。場合によっては、生体適合性溶液は細胞懸濁液であってもよい。そのような場合、細胞懸濁液は筋前駆細胞（ＭＰＣ）を含んでもよい。細胞懸濁液は、約４，０００，０００個の細胞／ｍＬを含んでもよい。これとは別に、他の濃度を使用して足場構築物を形成することがあり得る。

ＶＭＬを治療するために移植された足場構築物は、ヒト腱の機械的特性に実質的に近似するか、それを超える機械的特性を有してもよい。注目すべきことに、足場構築物は、ヒト腱の平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みに実質的に近似するか、それを超える平均極限引張強度（ＵＴＳ）、引張弾性率及び破断点歪みを有してもよい。

好ましい生体適合性足場構築物
本発明による足場構築物の好ましい実施形態では、長さ寸法及び幅寸法は、修復が意図される損傷エリアのサイズ及び形状に応じて、独立して約１ｍｍから１０ｍｍの範囲であろう。好ましくは、ＶＭＬに使用されることになる足場構築物の長さ及び幅は、独立して、約２ｃｍから９ｃｍ、３ｃｍから８ｃｍ又は４ｃｍから７ｃｍであろう。代替実施形態では、４ｃｍ（幅）×１０ｃｍ（長さ）の構造、さらに好ましくは６ｃｍ×１０ｃｍ、８ｃｍ×１０ｃｍ及び１０ｃｍ×１０ｃｍの構造で標準化されてもよい。

本発明による足場構築物の厚さは、構築物に接着した細胞が生存し続けるようにインプラントに血管を形成するレシピエント宿主の周囲組織の能力によって制限されてもよい。このため、好ましい足場構築物では、深さ（厚さ）が約０．５ｍｍ、１ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、２．５ｍｍ、３ｍｍ、３．５ｍｍ、４ｍｍ、４．５ｍｍ及び５ｍｍであろう。好ましい構築物では、インプラントは、分配され被覆された繊維の約２から８層を形成することによって製造される。これは、プリントヘッドの各通過がフレーム周りを３６０度包み込んで２つの層を形成することから、フレームに沿ったプリントヘッドの約２から４回の通過を反映するものである。

移植の目的で、医師がＶＭＬの修復に複数の足場構築物を使用する場合がある。このような構造物は、修復が意図されるエリアに沿って順次積み重ねられても、配置されてもよい。

プリントヘッドは、上記で考察したように繊維間の間隔を調整し得る足場構築物を生成するように構成されてもよい。例えば、繊維間の間隔は、平均して約０ｍｍ（即ち、繊維が直接隣接している）から約１ｍｍの範囲であることが好ましいであろう。好ましい実施形態では、繊維間の平均間隔は、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００及び１，０００ミクロンである。

本発明による細胞懸濁液の調合液は、足場構築物の分配された繊維を効果的に被覆するのに充分な密度を有するであろう。好ましい細胞密度は、上記で考察したように、約０から約１０００万個の細胞／ｍＬの範囲である。好ましい細胞懸濁液密度は、約１００，０００個、２００，０００個、４００，０００個、６００，０００個、８００，０００個、１００万個、１５０万個、２００万個、３００万個、４００万個、５００万個、６００万個、７００万個、８００万個、９００万個及び１０００万個の細胞／ｍＬである。好ましい実施形態では、伸長繊維１ミリメートル当たり約０．１から１０マイクロリットルの細胞懸濁液が押し出されることが好ましい。

足場構築物に接着する細胞集団の場合、構築物上の好ましい細胞数は、１個のインプラント当たり約１００，０００から約１００万個の細胞、あるいは１個のインプラント当たり１００万個の細胞を超える範囲であろう。好ましい範囲は、１個のインプラント当たり約２００，０００から９００，０００個、３００，０００から８００，０００個、４００，０００から７００，０００個及び５００，０００から６００，０００個の細胞である。

上記のような好ましいヒドロゲルでは、架橋溶液と接触してから数秒以内に固化が始まり、急速に安定化する必要がある。

さまざまな実施形態について説明してきたが、この説明は限定することを意図するものではなく例示的なものであり、実施形態の範囲内でさらに多くの実施形態及び実装例が可能であることは当業者には明らかであろう。特徴の多くの可能な組み合わせを添付の図に示し、この詳細な説明で考察しているが、開示した特徴の他の多くの組み合わせが可能である。特に制限のない限り、任意の実施形態の任意の特徴を、任意の他の実施形態の任意の他の特徴又は要素と組み合わせて使用しても、任意の他の特徴又は要素の代わりに使用してもよい。このため、本開示で示したり、及び／又は考察したりする特徴のいずれも、任意の適切な組み合わせで共に実装され得ることが理解されよう。上記で考察したさまざまな実施形態に関連する特徴、パラメータ、特性及び測定基準は、反対のことを明示的に示すか、非実用的なものでない限り、本明細書に開示した他の実施形態に適用される。このため、実施形態は、添付の特許請求の範囲及びその均等物を考慮する場合を除き、制限されるべきではない。このほか、添付の特許請求の範囲内で、さまざまな修正及び変更を施してもよい。

参考文献

Ａｂｒａｈａｍｓｓｏｎ（２０１０）「Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｗｏｖｅｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ（三次元織物足場上のヒト間葉系幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養中の軟骨形成と石灰化）」 Ｇｈｏｒｂａｎｉａｎ（２０１４）「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｉｒｅｃｔ ｗｒｉｔｅｒ ｆｏｒ ｃｅｌｌ－ｌａｄｅｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ（細胞を含んだヒドロゲル構築物のためのマイクロ流体ダイレクトライター）」 Ｋａｉｓｅｒ（２０１９）「Ｄｉｇｉｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｓｐｏｋｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ（特注のコラーゲン超極細繊維足場のデジタル設計と自動製造）」 Ｌｉｂｅｒｓｋｉ（２０１１）「Ｏｒｇａｎ ｗｅａｖｉｎｇ－ｗｏｖｅｎ ｔｈｒｅａｄｓ ａｎｄ ｓｈｅｅｔｓ ａｓ ａ ｓｔｅｐ ｔｏｗａｒｄｓ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｏｒｇａｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（臓器織物－人工臓器開発へのステップとしての糸とシートの織物）」 Ｍａｎｄｒｙｃｋｙ（２０１６）「３Ｄ ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｉｓｓｕｅｓ（複雑な組織を設計するための３Ｄバイオ印刷）」 Ｍａｕｃｋ（２００９）「Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ ｏｆ ｎａｎｏｆｉｂｒｏｕｓ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｆｏｒ ｆｉｂｅｒ－ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（繊維強化組織再生のためのナノ繊維集合体の力学）」 Ｍｅｒｃｅｒｏｎ（２０１５）「３Ｄ ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ－ｔｅｎｄｏｎ ｕｎｉｔ（筋腱ユニットを設計するための３Ｄバイオ印刷複合構造）」 Ｏ´Ｋｅｅｆｅ（２０１９）「Ａｍｅｒｉｃａｎ ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｉｅｓ（細胞ベースの治療に関するアメリカ骨代謝学会研究報告書）」 Ｏｎｏｅ（２０１１）「Ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌ ｆａｂｒｉｃ（生細胞織物）」 Ｓａｈｏｏ（２００７）「Ｈｙｂｒｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｅｎｄｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（潜在的な靱帯及び腱の組織工学のためのハイブリッドポリマー足場）」 Ｓｕｇｉｍｏｔｏ（２０１１）「Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（糖尿病治療のための膵臓細胞をカプセル化する移植可能なヒドロゲル超極細繊維）」 Ｔａｍａｙｏｌ（２０１３）「Ｆｉｂｅｒ－ｂａｓｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓ， ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ， ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ（繊維ベースの組織工学の進歩、課題及び機会）」 Ｗａｌｔｅｒｓ（２０１２）「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｒａｉｄ－ｔｗｉｓｔ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ（編組－撚りコラーゲン足場の設計と分析）」 Ｗｕ（２０１５）「Ｄｉｒｅｃｔ Ｅ－ｊｅｔｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ３Ｄ ｆｉｂｒｏｕｓ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｔｅｎｄｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（腱組織工学のための３Ｄ繊維質足場の直接Ｅジェット印刷）」 Ｍｉｎｔｚ（２０２０）「Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｒａｔ Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ Ｍｕｓｃｌｅ Ｌｏｓｓ Ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ（ラット容積性筋損失損傷及び修復後の機能的転帰の長期評価）」 Ｍｕｒｐｈｙ（２０１４）「３Ｄ ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｏｒｇａｎｓ（組織と臓器の３Ｄバイオ印刷）」 Ｍｕｒｐｈｙ（２０２０）「Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ３Ｄ ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ（並進運動３Ｄバイオ印刷の機会と課題）」 Ｉｔｏｉ（１９９５）「Ｔｅｎｓｉｌｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｐｒａｓｐｉｎａｔｕｓ ｔｅｎｄｏｎ（棘上筋腱の引張特性）」 Ａｎｋｒｕｍ（２０１４）「Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｖｅ， ｎｏｔ ｉｍｍｕｎｅ ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ（間葉系幹細胞：免疫特権型ではなく免疫回避型）」 Ｚｈａｎｇ（２０１５）「Ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｅｓ ｏｆ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ａ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ（細胞ベースの治療法として使用する同種間葉系幹細胞の課題と期待）」 Ｊａｎｇ（２０１５）「Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ-Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｃｒｕｃｉａｔｅ Ｌｉｇａｍｅｎｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒａｂｂｉｔ Ｍｏｄｅｌ：Ｎｅｗ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｔｅｎｄｏｎ Ｇｒａｆｔ Ｈｅａｌｉｎｇ（ウサギモデルの前十字靱帯再建でのヒト臍帯血由来間葉系幹細胞の有効性と安全性：腱移植片の治癒を促進する新たな戦略）」 Ｌｅｅ（２０１７）「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｄｉｐｏｓｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｔｅｎｄｏｎ Ｉｎｊｕｒｙ Ｍｏｄｅｌ（ラット腱損傷モデルでのヒト脂肪由来間葉系幹細胞の治療メカニズム）」 Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ（１９９９）「Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（成人ヒト間葉系幹細胞の多系統の可能性）」 Ｐａｓｓｉｐｉｅｒｉ（２０１９）「Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｄｅｔｅｃｔ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｐａｉｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ａ Ｖｏｌｕｍｅｔｉｃ Ｍｕｓｃｌｅ Ｌｏｓｓ Ｉｎｊｕｒｙ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ試験及びｉｎ ｖｉｖｏ試験では、容積性筋損失損傷での機能修復機構を検出する）」 Ｆｏｏｌｅｎ（２０１８）「Ｔｉｓｓｕｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｅｎｄｏｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ－Ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｉｃｒｏｔｉｓｓｕｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｅｎｄｏｎ ｓｃａｒｒｉｎｇ（組織の整列が腱由来細胞のリモデリングの可能性を強化する－腱瘢痕の新たな微小組織モデルからの教訓）」 Ｗａｎｇ（２００３）「Ｃｅｌｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｍａｔｒｉｘ（細胞の配向は、細胞が生成するコラーゲン性基質の整列を判定する）」 Ｈａｎ（２０１４）「Ｌａｇｒａｎｇｉａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｉｍａｇｅｓ：Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｘｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ ｄｒｏｐｓ ｍｏｖｉｎｇ ｉｎ ａ ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ（連続画像のラグランジュ解析：マイクロチャネル内を移動する液滴の混合プロセスの定量化）」 Ｏｂｅｒ（２０１５）「Ａｃｔｉｖｅ ｍｉｘｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｌｕｉｄｓ ａｔ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ（マイクロスケールでの複雑な流体の能動的混合）」 Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ（２００６）「Ｓｅｘ－ｂａｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｎｓｉｌｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ（ヒト前十字靱帯の引張特性の性別による差）」 Ａｃｈｉｌｌｉ（２０１０）「Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ－Ｂａｓｅｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ，Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｉｏｎｉｃ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｏｎ Ｇｅｌａｔｉｏｎ（血管組織工学のためのコラーゲンベースの足場の機械的特性の調整：ゲル化に対するｐＨ、温度及びイオン強度の影響）」 Ｔａｙｌｏｒ（２０１３）「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ＡＣＬ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｗａｌｋｉｎｇ（歩行中のＡＣＬの長さと相対的歪みのｉｎ ｖｉｖｏ測定）」 Ｃｏｒｏｎａ（２０１４）「Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｕｓｃｌｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｎｄ Ｂｌａｄｄｅｒ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｃｅｓ Ｐａｒｔｉａｌｌｙ Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ Ｍｕｓｃｌｅ Ｌｏｓｓ Ｉｎｊｕｒｙ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織工学的筋修復構築物及び膀胱無細胞基質の移植が、容積性筋損失損傷のラットモデルのｉｎ ｖｉｖｏ骨格筋機能を部分的に回復する）」

Claims (11)

1. 複数のコラーゲン超極細繊維を備える足場構築物であって、
   前記コラーゲン超極細繊維の第１の部分が第１の生体適合性溶液によって被覆され、前記コラーゲン超極細繊維の第２の部分が第２の生体適合性溶液によって被覆される、足場構築物。
2. 足場構築物を作成するための装置であって、前記装置は、
   オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配するように構成された送達デバイスと、
   回転可能フレームと、
   第１の生体適合性溶液を受容するように構成された第１のウェルを含む溶液マニホールドであって、前記溶液マニホールドは、前記送達デバイスと前記回転可能フレームとの間に配置される、溶液マニホールドと、
   前記回転可能フレームを回転軸回りに回転させるように構成された回転デバイスと、を備え、
   前記装置は、前記回転可能フレームの回転によって、前記オリフィス及び前記溶液マニホールドを通して前記コラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、前記溶液マニホールド内の前記第１の生体適合性溶液で前記コラーゲン超極細繊維ストランドを被覆し、前記回転可能フレーム周りに前記コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けるように構成される、装置。
3. 足場構築物を作成する方法であって、
   コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレームに貼り付けることと、
   前記コラーゲン超極細繊維ストランドを前記回転可能フレーム周りに巻き付けるために、前記回転可能フレームを回転軸回りに回転させることと、を含み、
   前記回転可能フレーム周りに前記コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けることによって、送達デバイスから前記コラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、オリフィスを通して前記コラーゲン超極細繊維ストランドを分配し、第１の生体適合性溶液で満たされた溶液マニホールドの第１のウェルを通して前記コラーゲン超極細繊維ストランドを引き出す、方法。
4. 組織化された構成で配置され、生体適合性溶液で被覆された複数のコラーゲン超極細繊維を備える、足場構築物であって、
   前記コラーゲン超極細繊維は、連続したループ状に配置される、足場構築物。
5. 足場構築物を作成するための装置であって、前記装置は、
   オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配するように構成された送達デバイスと、
   回転可能フレームと、
   前記コラーゲン超極細繊維ストランドを、前記ストランドの分配中に、生体適合性溶液で被覆するように構成されたストランド被覆システムであって、前記溶液ストランド被覆システムは前記送達デバイスと前記回転可能フレームとの間に配置される、ストランド被覆システムと、
   前記回転可能フレームを回転軸回りに回転させるように構成された回転デバイスと、を備え、
   前記装置は、前記回転可能フレームの回転によって、前記オリフィスを通して前記コラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、前記コラーゲン超極細繊維ストランドを前記生体適合性溶液で被覆し、前記コラーゲン超極細繊維ストランドを前記回転可能フレーム周りに巻き付けるように構成される、装置。
6. 足場構築物を作成する方法であって、
   コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレームに貼り付けることと、
   前記コラーゲン超極細繊維ストランドを前記回転可能フレーム周りに巻き付けるために、前記回転可能フレームを回転軸回りに回転させることと、を含み、
   前記回転可能フレーム周りに前記コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けることによって、送達デバイスから前記コラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、オリフィスを通して前記コラーゲン超極細繊維ストランドを分配し、生体適合性溶液を通して前記コラーゲン超極細繊維ストランドを引き出す、方法。
7. 組織化された構成で配置され、生体適合性ヒドロゲルで被覆された複数のコラーゲン超極細繊維を備える、足場構築物であって、
   前記コラーゲン超極細繊維は、連続したループ状に配置される、足場構築物。
8. 足場構築物を作成するための装置であって、前記装置は、
   オリフィスを通してコラーゲン超極細繊維ストランドを分配するように構成された送達デバイスと、
   回転可能フレームと、
   前記コラーゲン超極細繊維ストランドを、前記ストランドの分配中に第１の生体適合性溶液で被覆するように構成されたストランド被覆システムであって、前記溶液ストランド被覆システムは前記送達デバイスと前記回転可能フレームとの間に配置される、ストランド被覆システムと、
   前記回転可能フレームを回転軸回りに回転させるように構成された回転デバイスと、を備え、
   前記装置は、前記回転可能フレームの回転によって、前記オリフィスを通して前記コラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、前記コラーゲン超極細繊維ストランドを前記第１の生体適合性溶液で被覆し、前記コラーゲン超極細繊維ストランドを前記回転可能フレーム周りに巻き付けるように構成され、
   前記装置は、前記コラーゲン超極細繊維ストランドを前記回転可能フレームに巻き付ける間に、前記回転可能フレームを浸漬し得る第２の生体適合性溶液を含むように構成された槽をさらに備える、装置。
9. 足場構築物を作成する方法であって、
   コラーゲン超極細繊維ストランドを回転可能フレームに貼り付けることと、
   前記コラーゲン超極細繊維ストランドを前記回転可能フレーム周りに巻き付けるために、前記回転可能フレームを回転軸回りに回転させることと、を含み、
   前記回転可能フレーム周りに前記コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付けることによって、送達デバイスからコラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、それによって、オリフィスを通して前記コラーゲン超極細繊維ストランドを分配し、第１の生体適合性溶液を通して前記コラーゲン超極細繊維ストランドを引き出し、
   前記回転可能フレーム周りに前記コラーゲン超極細繊維ストランドを巻き付ける間、前記回転可能フレームは第２の生体適合性溶液に浸漬され、
   前記第１の生体適合性溶液は前記第２の生体適合性溶液と組み合わされて生体適合性ヒドロゲルを形成する、方法。
10. 容積性筋損失（ＶＭＬ）を治療する方法であって、
    組織化されたシート状構成に配置され、生体適合性溶液で被覆された複数のコラーゲン超極細繊維から形成された足場構築物をＶＭＬ創傷部位内に貼り付けることを含む、方法。
11. 容積性筋損失（ＶＭＬ）を治療する方法であって、
    組織化されたシート状構成に配置された複数のコラーゲン超極細繊維から形成された足場構築物をＶＭＬ創傷部位内に貼り付けることを含み、
    前記足場構築物は、前記コラーゲン超極細繊維の複数のシート状の層を含む、方法。

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