JP2023548508A - ヒドロゲル組成物及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

２成分ヒドロゲルマトリックスシステムが提供され、このシステムは、三次元培養システムを含むが、これらに限定されない、様々な細胞成長使用において有用である。成分は、修飾ヒアルロン酸（ＨＡ）、及び修飾エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）を含む。例えば、マトリックス剛性、マトリックス応力緩和速度、及び細胞接着リガンド濃度を含むＨＥＬＰの変数を、独立してかつ定量的に指定することができる。

Description

患者の生検の一次組織又は多能性細胞に由来するヒトオルガノイドを含むヒト組織は、個別化医療及び疾患の前臨床モデルを改革する可能性がある。しかしながら、合成マトリックス中のヒト患者由来オルガノイドは、しばしば、スフェロイド形成工程、例えば、脱細胞化エンゲルブレスホルムスワム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ）（ＥＨＳ）マトリックス、又はフィーダー細胞との共培養のいずれかを必要とする。

患者由来のオルガノイドのための操作マトリックスを開発する最近の研究は、合成マトリックス骨格としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に依存しているが、ＰＥＧは免疫系と相互作用し、抗体形成を誘導することが知られている。

動物由来の生成物又は合成ＰＥＧを含まない、再現性がある、生分解性の最小限のマトリックスは、臨床翻訳のために非常に関心があるものであり、本明細書の開示によって対処される。

三次元培養環境の提供を含むが、これらに限定されない、細胞及び組織培養のための様々な利点を有する、２成分ヒドロゲルマトリックスシステムが記載される。成分は、（１）化学的に修飾されたヒアルロン酸（ＨＡ）、及び（２）化学的に修飾されたエラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）を含む。２つの修飾バイオポリマーを一緒に混合することにより、ヒドラゾン結合の形成が誘導され、本明細書で「ＨＥＬＰ」と称されるヒドロゲルネットワークをもたらす。ＨＡとＥＬＰとの比率の選択、及びこれらの成分のバリアントの比率は、例えば、マトリックス剛性、マトリックス応力緩和速度、並びに細胞接着リガンド濃度及び同一性を含む、ＨＥＬＰの重要な変数の調整を可能にする。これらの変数は、独立してかつ定量的に定義することができる。

ヒアルロン酸成分は、ペンダントベンズアルデヒド又はアルデヒド側基を含むように化学的に修飾される。最終的なヒドロゲル配合物中のこれら２つの化学基の比は、応力緩和変数を制御する。天然の細胞外マトリックス及びＥＨＳマトリックスの主な特徴は、それらの物理的架橋による応力緩和を受ける能力であり、これは容易にリモデリングすることができる。ペンダントアルデヒド基で修飾されたヒアルロン酸のより大きな割合を含む組成物は、ゲルの平均運動交換速度を増加させ、より速い応力緩和速度をもたらす。ペンダントベンズアルデヒド基で修飾されたヒアルロン酸の割合が高いほど、ゲルの平均運動交換速度が低下し、より遅い応力緩和速度をもたらす。応力緩和速度への修飾は、マトリックスリガンド組成物及び剛性とは無関係に達成され得る。ＨＡ－ベンズアルデヒド対ＨＡ－アルデヒドの比は、例えば、約９５：５、９０：１０、７５：２５、５０：５０、２５：７５などの比で、通常約１００：０～０：１００の範囲で、目的のヒドロゲルに対して事前に選択されてもよい。

ＥＬＰ成分は、任意選択で、細胞接着配列を散在させた、エラスチン様配列の組換え配列を含む。化学的に修飾されたＨＡと架橋するために、ＥＬＰは、ペンダントヒドラジン基を含むように化学的に修飾される。ＥＬＰ内の任意の細胞接着配列は、インテグリン結合、フィブロネクチン系、伸長ＲＧＤ配列、スクランブルＲＧＤ配列、コラーゲンＩ型に由来する細胞接着配列、例えば（配列番号３）ＤＧＥＡ、テナシンに由来する細胞接着配列、例えば（配列番号４）ＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＴＹ、（配列番号５）ＶＦＤＮＦＶＬＫなど、ラミニンに由来する細胞接着配列、例えば（配列番号６）ＩＫＶＡＶ、（配列番号７）ＹＩＧＳＲなど、カドヘリンに由来する細胞接着配列、例えば（配列番号８）ＨＡＶＤＩ、（配列番号９）ＨＡＶＤＩＨＡＶＤＩなどから選択されてよい。例えば、配列番号１及び配列番号２は、それぞれ、ＲＧＤ配列及びスクランブルＲＧＤ配列を有するＥＬＰである。

ヒドロゲルの細胞接着配列濃度は、上記に開示されるように、ＲＧＤモチーフを含むＥＬＰと、ＲＧＤモチーフを欠く、又はスクランブル若しくは非ＲＧＤ細胞接着モチーフを含むＥＬＰとの比を調整することによって変化させることができる。この比率は、通常約１００：０～０：１００、例えば約７５：２５、５０：５０、２５：７５、１０：９０の範囲で、目的のヒドロゲルに対して予め選択されてよい。いくつかの用途では、ＨＥＬＰヒドロゲルは、約０．２５ｍＭのＲＧＤ～約１．５ｍＭのＲＧＤ、例えば、約０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、１．２５ｍＭ、１．５ｍＭを含む。０．７５ｍＭを超えるものは、腸管オルガノイドの培養に好ましい。

マトリックス剛性は、ヒドラジン対アルデヒド及びベンズアルデヒド反応性基の濃度及び比によって決定され、ここで、約１：１の比は、最大の架橋を提供する。比は、例えば、約１：３、約１：２、約１．５：１、約１．２５：１、約１：１、約１：１．２５、約１：１．５、約１：２、約１：３などで変化し得る。細胞培養目的のために、好ましいゲルは、約１ｋＰａ、例えば、約７５０～１２５０ＰａのＧ’を有し得る。ヒドラジン対アルデヒド又はベンズアルデヒド基の比は、３つの変数：（１）ＥＬＰ分子当たりのヒドラジン基の数、（２）ＨＡ分子当たりのアルデヒド又はベンズアルデヒド基の数、及び（３）ＥＬＰ及びＨＡのブレンドによって変更することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているヒドロゲルマトリックスは、インビトロでの細胞の培養において使用される。いくつかの実施形態では、調整可能なＨＥＬＰヒドロゲルのマトリックスを含む３Ｄ培養環境が提供される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞をインビトロで培養する方法が提供され、方法は、目的の細胞集団を、本明細書に記載のヒドロゲル中に懸濁させること、及び埋め込まれた細胞を好適な培地中で培養することからなり、これは、初代細胞、細胞株、インビトロ再プログラム細胞、遺伝子組換え細胞、初代組織移植片などであり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト患者からの初代細胞である。いくつかの実施形態では、培養システムは、ポリエチレングリコールを含まない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、ヒドロゲルマトリックス中で培養される細胞は、目的の組織の細胞に分化する。例えば、腸管幹細胞又は腸管移植片は、腸管オルガノイドなどに分化させることができる。細胞は、更に、マトリックス解離のプロセスによって継代され得る。マトリックス解離において、ＨＥＬＰマトリックスは、エラスターゼ及びヒアルロニダーゼを使用して酵素的に分解され得る。形成されたオルガノイドは、単一細胞又は小細胞凝集体、例えば、トリプシンと更に分離され得るか、又は無傷で継代され得る。単一細胞又は小細胞凝集体の新鮮なＨＥＬＰマトリックスへのカプセル化は、形態の目に見える変化なしに、少なくとも１２の継代の連続的なオルガノイド形成を提供する。代替的には、細胞をスフェロイドに予め形成し、次いでＨＥＬＰマトリックス内にカプセル化することができる。

組織としては、腸組織、肺組織、胃組織、膵臓組織、膀胱組織、肝臓組織、骨髄間質、筋肉組織、腎臓組織、脳組織などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の培養された移植片は、一定期間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、又はそれ以上、培養中で連続的に増殖させることができる。本発明の方法によって培養された哺乳類組織移植片は、インビボでの組織成長の特徴を要約することができる。特徴としては、上皮組織、粘膜下組織、及び間質環境を含む、増殖を伴う長期の組織拡張、多系統分化、並びに細胞及び組織の超微細構造の再現が挙げられるが、これらに限定されない。培養システムは、正常又は罹患した哺乳類組織において見出される様々な細胞の成長を提供するが、培養物は、また、選択のための細胞の生成において有用であり、組織特異的幹細胞を含む任意の所与の組織について、単一系統の精製された集団又は濃縮された集団を提供する。これらの方法によって培養されたオルガノイドは、組織工学、疾患モデリング、及び創薬などの多くの用途での使用が見出される。

培養細胞は、培養期間の前又は中に実験的に修飾され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ウイルス又は細菌病原体への曝露によって修飾される。他の実施形態では、細胞は、遺伝子発現のパターンを変化させることによって、例えば、多能性を誘導するか、又はそうでなければ分化可能性を変化させるためのリプログラミング因子を提供することによって、又は細胞のがん腫へのがん原性変換を提供するがんドライバーなどを導入することによって修飾される。実験的に修飾された細胞は、治療薬の効果の調査、腫瘍療法、分化に対する効果などに有用である。

集団、例えば、複数の細胞型の複雑な集団、選別、培養などによって複雑な集団から単離された精製された細胞の集団などで、幹細胞電位を有する細胞の存在について、細胞をスクリーニングするための方法が提供される。この方法は、検出可能に標識された候補細胞を、本発明の組織移植片と共培養することを伴う。幹細胞の可能性を有する候補細胞は、基底レベルを上回る培養された移植片の増殖の増加、及び標識された候補細胞との組織特異的幹細胞の存在を示す多系統分化マーカーの共局在化によって検出される。移植片と共培養された候補細胞の幹細胞特性は、インビボ移植などを介して、長期の再構成活性を決定することによって更にアッセイされる。

本発明の別の態様では、本発明の移植培養物に対する毒性をスクリーニングすることによって、異なる組織に対する細胞毒性のための薬剤のインビトロスクリーニングのための方法が提供される。更に別の実施形態では、本発明の移植培養物による薬物の吸収を評価することによって、異なる組織による薬物吸収を評価する方法が提供される。

本発明の別の態様では、マトリックスは、シリンジ針又はカテーテルを通して押し出される。押し出し後、ＨＥＬＰマトリックスはゲル相材料を改質する。ＨＥＬＰマトリックス内にカプセル化された細胞を、３Ｄバイオプリンティング用のバイオインク、注射可能な再生医療療法用のバイオインクとして使用するために、この方法で押し出すことができる。２０００Ｐａ未満の破断応力を有する剪断薄化材料は、手の力によって注射可能である。破壊応力は、３つの変数：（１）通常１００ｋＤａ未満のＭＷでのＨＡの分子量、（２）ヒドラゾン結合の速度論（この目的のためにヒドラジン－ベンズアルデヒド反応の遅い交換速度論よりもヒドラジン－アルデヒドの速い交換速度論が好まれる）、並びに（３）通常、最終濃度がＥＬＰの約０．５～２重量％、及びＨＡの約０．５～２重量％である全体のポリマー濃度を変更することによって調整することができる。

患者由来の腸管オルガノイド形成、成長、及び経過のためのＨＥＬＰマトリックス。ａ）ヒト患者からの腸組織生検からエンテロイドが生成された。ｂ）ベンズアルデヒド修飾ヒアルロン酸（ＨＡ）及びヒドラジン修飾エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）で構成されるＨＥＬＰマトリックスの概略図。ヒアルロン酸は、細胞上のＣＤ４４受容体と係合することができるが、組換えＥＬＰは、細胞インテグリン受容体と係合するＲＧＤペプチドリガンドを含有する。ｃ）エンテロイド通過技術の概略図。エンテロイドは、単一の細胞に解離させるか、又は継代時に完全に形成されたエンテロイドとして直接新しい材料に再埋め込むことができる。ｄ）異なる材料中のエンテロイドの明視野及び共焦点蛍光顕微鏡写真、これらの材料中で解離時（左）及び再包埋時（右）。ｅ）各継代時に単一の細胞に解離された、ＨＥＬＰの継代１及び継代５で成長したエンテロイドの代表的な明視野画像。ｆ）ＥＨＳマトリックスの継代１２又はＨＥＬＰの継代１２で成長した解離したエンテロイドの成長曲線。ｎ＝３、ｎ．ｓ．＝有意ではない。ｇ）ｄ）に示される材料配合物中の単一の細胞から成長したエンテロイドのためのエンテロイド形成効率。データは平均＋／－標準偏差、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一元配置分散分析である。＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎ＝３、ｎ．ｄ．＝検出されず。 ＨＥＬＰ及びＥＨＳマトリックスで成長したオルガノイドの分化。ａ）分化実験のタイムラインの概略図。オルガノイドを成長培地中の単一細胞から１０日間培養し、続いて分化培地中で５日間培養する（方法を参照）。ｂ）初期のエンテロイドから分極化されたエンテロイド、分化されたオルガノイドへの進行を示す共焦点顕微鏡写真。ｃ）成熟腸細胞サブタイプの観察を示す共焦点顕微鏡写真：Ｐａｎｅｔｈ細胞（Ｌｙｚ^＋、左）、ゴブレット細胞（Ｍｕｃ２^＋、中）、及び腸内分泌細胞（ＣｈｇＡ^＋、右）。ｄ）維持培地中で１５日間維持された細胞と比較し、及び対照遺伝子ＢＡＣＴと比較した、分化細胞型マーカーのＲＮＡ発現の変化のＲＴ－ｑＰＣＲ定量。Ｃ_Ｔ値が正規分布であると仮定して、両側スチューデントのｔ検定を、分化された対維持培養物間のＣ_Ｔ値で実施した。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＝ｐ＜０．０５、Ｎ＝３の独立した実験、ｎ＝４の技術的な反復。 ＨＥＬＰマトリックスにおけるヒアルロン酸の役割。ａ）同じ強度でのＣＤ４４染色の比較共焦点顕微鏡写真及びＥＨＳ及びＨＥＬＰマトリックスにおけるゲイン設定。ｂ）陰性対照と比較した、カプセル化後１１日目のＥＨＳ及びＨＥＬＰマトリックスで成長したエンテロイドのフローサイトメトリー分析。ｃ）ＨＥＬＰ及びＥＬＰ－ＰＥＧマトリックスで成長したエンテロイドの播種後６日目の明視野及び共焦点顕微鏡写真。ＥＬＰ－ＰＥＧゲルにはＨＡは存在しない。ｄ）ＨＥＬＰ及びＥＬＰ－ＰＥＧで成長したエンテロイドの形成効率。データは平均＋／－標準偏差、スチューデントのｔ検定、＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎ＝３、ｎ．ｄ．＝検出されず。 ＨＥＬＰマトリックス特性のカスタムテーラリング。ａ）材料中の異なるＥＬＰバリアントをブレンドすることによって、ＲＧＤリガンド濃度の仕様を示すＨＥＬＰ概略図。ｂ）マトリックス剛性が架橋の数（上部）を変更することによって変調されるが（上）、マトリックス粘弾性は、ベンズアルデヒドをアルデヒド部分に置き換えることによって調整されることを示すＨＥＬＰ概略図。ｃ）硬質弾性体（ＥＬ）及び軟質ＥＬ ＨＥＬＰマトリックスの剪断貯蔵係数（Ｇ’）。スチューデントのｔ検定、＊＊＝ｐ＜０．０１、Ｎ＝３－５。ｄ）ＥＬ ＨＥＬＰ配合物を比較するステップひずみ応力緩和曲線。ｅ）カプセル化後１２日目のＥＬ ＨＥＬＰ材料中のエンテロイドの断面積測定。Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を用いた二元配置分散分析、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎ＝３。ｆ）硬質ＥＬ及び硬質粘弾性（ＶＥ）配合物の剪断貯蔵係数。スチューデントのｔ検定、Ｎ＝３～５、ｎ．ｓ．＝有意ではない。ｇ）硬質ＥＬ及び軟質ＶＥ配合物を比較するステップひずみ応力緩和曲線。ｈ）カプセル化後１２日目の硬質材料中のエンテロイドの断面積測定。Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を用いた二元配置分散分析、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎ＝３。 ＨＥＬＰタンパク質骨格及び化学修飾。ａ）フィブロネクチン模倣ＲＧＤ又はスクランブルＲＤＧモチーフを含有するように修飾することができるＥＬＰアミノ酸配列（配列番号３０）。ｂ）ヒドラジン部分で修飾されたＥＬＰの核磁気共鳴（ＮＭＲ）。ｃ）ベンズアルデヒド部分で修飾されたヒアルロン酸構造。ｄ）３０％修飾されたヒアルロン酸のＮＭＲと、ｃ）からの対応するピーク。 ＨＥＬＰタンパク質骨格及び化学修飾。ｅ）１２％修飾されたヒアルロン酸のＮＭＲと、ｃ）からの対応するピーク。 腸管オルガノイドは、ＥＨＳ又はＨＥＬＰマトリックス内で継代することができる。単一の患者由来の腸細胞は、ＥＨＳ又はＨＥＬＰマトリックスのいずれかに播種され、単一の細胞から繰り返し継代することができる。 ヒト腸管オルガノイドは、ＨＥＬＰの２つ以上の患者由来の細胞株において堅牢に形成される。ａ）解離時（左）と再包埋時（右）のＥＨＳ、ＨＥＬＰ、及びＥＬＰにおけるスフェロイドの明視野及び共焦点蛍光顕微鏡写真。ｂ）ａ）に示される材料配合物中の単一細胞から成長したスフェロイドのスフェロイドの形成効率。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一元配置分散分析、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、ｎ．ｄ．＝検出されず。ｃ）各継代の時点で単一細胞への解離を有する、ＨＥＬＰの継代１及び継代４で成長したスフェロイドの代表的な明視野画像。 ＨＥＬＰは、マウスの腸細胞及びヒトｉＰＳＣ由来の肝臓オルガノイドからのオルガノイド形成及び成長をサポートする。ａ）解離時（左）及び再包埋時（右）、ＨＥＬＰ及びＥＨＳマトリックスで成長したマウスの小腸スフェロイドの明視野顕微鏡写真。ｂ）明視野（左上）、カルセインＡＭ蛍光（右上）及びサイトケラチン１９（ＣＫ１９）及び肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４Ａ）の免疫染色による、ＨＥＬＰのヒト肝臓オルガノイドの顕微鏡写真。フォルスコリン／ＩＢＭＸ（３－イソブチル－１－メチルキサンチン）治療への応答を示すための機能アッセイにおけるヒト肝臓オルガノイドサイズの変化の定量化（右下）。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。 ＨＥＬＰ及びＥＨＳマトリックスで成長させたエンテロイド中のＣＤ４４^＋細胞のフローサイトメトリー分析。ａ）任意の抗体を添加しないＣＤ４４^＋ゲート細胞パーセント。ｂ）アイソタイプ抗体対照で染色したＣＤ４４^＋ゲート細胞パーセント。ｃ）ＥＨＳマトリックスで形成されたＣＤ４４^＋ゲート細胞パーセント。ｄ）ＨＥＬＰで成長させたＣＤ４４^＋ゲート細胞パーセント。 材料レオロジー。ａ～ｇ）振動剪断レオロジーを実施して、本作業で報告される全てのヒドロゲル配合物の粘弾性特性を特徴付ける。これらの周波数掃引は、１％ひずみで０．１～１０Ｈｚの間で実施され、１Ｈｚでの貯蔵係数の値に基づいて、各マトリックスの公称剛性を決定した。 別個のＨＥＬＰ配合物中で成長したスフェロイドの断面積。ａ）カプセル化後１２日目に変化する濃度のＲＧＤリガンドによる、軟質ＥＬ ＨＥＬＰと比較して硬質ＥＬで成長したエンテロイドの断面積。ｂ）カプセル化後１２日目に変化する濃度のＲＧＤリガンドによる、硬質ＶＥ ＨＥＬＰと比較して硬質ＥＬで成長したエンテロイドの断面積。Ｄｕｎｎの多重比較検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、＊＝ｐ＜０．０５。 ＨＥＬＰゲルで使用するように設計された操作されたタンパク質の低臨界溶液温度特性決定。操作されたエラスチン様タンパク質の６つの異なるバリアント（表１を参照）を合成、精製し、より低い臨界溶液温度挙動について特徴付けた。 ＨＥＬＰシステム内でこれらの操作されたタンパク質のモジュール性を実証するために、操作されたエラスチン様タンパク質の６つの異なるバリアント（表１を参照）をヒドラジン基で修飾し、ベンズアルデヒド修飾ヒアルロン酸と架橋して、６つの明らかに異なる生体活性ペプチド配列を示すＨＥＬＰゲルを形成した。６つのＨＥＬＰゲルは、振動レオロジーによってそれらの粘弾性特性を特徴付けられ、それらのゲル力学において統計学的に有意な差異を示さなかった。 架橋間の熱力学平均分子量、全体のポリマー分子量、及びヒドラゾン架橋の動態を調整することによって、ＨＥＬＰゲルは、剪断薄化であり、したがって、力を加えたときにシリンジ針又はカテーテルを介して注射可能であるように配合され得る。力を取り除くと、ゲル構造は自己修復し、ゲル相の機械的特性を回復する。この押し出し及び自己修復のサイクルは、複数回繰り返すことができる。ゲルは、３０ゲージのシリンジ針及び１５０ｃｍのカテーテル（直径０．７５ｍｍ）を含む様々な医療デバイスを介して手の力を加えたときに押し出すことができる。５つのＨＥＬＰゲルの定性的注射可能性を、各配合物を引っ掛けられた３０Ｇインスリン針を通して注射することによって試験した。（Ａ）注射可能性の基準には、以下が含まれる。（１）完全なゲル化（３０分）後に注射可能である能力、（２）片手で注射可能である、及び（３）突然のバースト注射の証拠はない。（Ｂ）各注射の記録から撮影した定性的な静止画。各ゲルは、視認性を向上させるために食品着色で染色されている。（Ｃ）定性的評価を要約した表。チェックマーク、ばつ印（×）は、それぞれ試験に合格、不合格を示す。配合物ＨＡ－Ｂは全く注射可能ではなかったため、基準（２）及び基準（３）は評価できず、（－）で指定されている。

本開示の実施形態について更に記載する前に、本開示は、記載の特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって無論変動し得ることが理解されるものである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみについて記載することを目的とし、本開示の範囲が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図するものではないことが理解されるものである。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料も、また、本開示の実施形態の実践又は試験にも使用され得る。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「化合物」への参照は、単一の化合物だけでなく、２つ以上の化合物の組み合わせも含み、「置換基」への参照は、単一の置換基並びに２つ以上の置換基などを含む。

本発明の説明及び特許請求の範囲において、特定の用語は、以下に記載される定義に従って使用される。本明細書で提供される定義は、互いに排他的であることを意図するものではないことが理解される。したがって、いくつかの化学部分は、２つ以上の用語の定義内に含まれ得る。

本明細書で使用される場合、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例えば（ｆｏｒ ｉｎｓｔａｎｃｅ）」、「など」、又は「含む」という語句は、より一般的な主題を更に明確にする例を導入することを意味する。これらの例は、本開示を理解するための補助としてのみ提供され、いかなる様式においても限定を意味するものではない。

「ヒドロゲル」という用語は、従来の意味で、溶媒（例えば、水）を吸収し、測定可能な溶解なしに膨張を受け、可逆的な変形が可能な三次元ネットワークを維持する材料を指すために使用される。本明細書で言及される「膨張」は、水分子がヒドロゲルの内部体積全体に拡散するときのヒドロゲル構造の等方性膨張を意味する。本明細書に開示されるコポリマーヒドロゲルの特性は、以下でより詳細に記載されるように、各成分の量、各成分の比率、又は特定の成分の密度を変化させることによって、所望のように調節され得る。「ヒドロゲル」という用語は、乾燥及び水和（例えば、溶媒膨潤）ヒドロゲルの両方を含み得る。

本発明のいくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、代謝活性細胞、例えば、分化細胞などの成長を含む、細胞成長のための足場を提供する。細胞は、インビトロで、例えば、１つ又は複数の細胞型の培養物で成長されてもよい。細胞は、また、インビボで、例えば、ヒドロゲルが再生細胞成長のための基質を提供する場合に成長されてもよい。本発明のヒドロゲルは、長期構造安定性のための適切な機械的強度を提供する。

エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）は、任意選択で細胞接着配列を散在させたエラスチン様配列の組換え配列を含む。化学的に修飾されたＨＡと架橋するために、ＥＬＰは、ペンダントヒドラジン基を含むように化学的に修飾される。ＥＬＰ内の任意の細胞接着配列は、細胞接着に関与するモチーフを含み、インテグリン結合、フィブロネクチン系、伸長ＲＧＤ配列、スクランブルＲＧＤ配列、コラーゲンＩ型に由来する細胞接着配列、例えば（配列番号３）ＤＧＥＡ、テナシンに由来する細胞接着配列、例えば（配列番号４）ＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＴＹ、（配列番号５）ＶＦＤＮＦＶＬＫなど、ラミニンに由来する細胞接着配列、例えば（配列番号６）ＩＫＶＡＶ、（配列番号７）ＹＩＧＳＲなど、カドヘリンに由来する細胞接着配列、例えば（配列番号８）ＨＡＶＤＩ、（配列番号９）ＨＡＶＤＩＨＡＶＤＩなどから選択されてよい。

操作されたエラスチン様タンパク質の細胞接着ドメインは、細胞表面受容体と相互作用することが知られている代替ペプチド配列を含むように設計され得る。これらの配列は、天然の細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、テナシン－Ｃ）に由来するペプチド、又は細胞接着受容体（例えば、Ｎ－カドヘリン）に由来するペプチドを含むことができる（表１）。エラスチン様領域配列とともに細胞接着ペプチド配列を選択することは、操作されたタンパク質の全体的な疎水性を定義し、したがって、より低い臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）挙動を制御する。

いくつかの実施形態では、ＥＬＰは、以下の構造を含む。

細胞接着ドメインは、約１５～約４５アミノ酸長であり、ＲＧＤ、スクランブルＲＧＤ、ＲＧＤなし、又は配列番号３～配列番号９のうちのいずれかから選択され得る、１つ以上の細胞接着配列モチーフを含む。配列番号１０～１９及び２２は、例示的なものである。

リンカー配列は、任意選択で、細胞接着配列モチーフに隣接し、ペプチドリンカーは、約５～２０、５～１５、５～１０又は５～９アミノ酸長であり得る。例示的なリンカーとしては、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３４）などの少なくとも２つのアミノ酸残基を有する直鎖ペプチドが挙げられる。好適な直鎖ペプチドとしては、ポリグリシン、ポリセリン、ポリプロリン、ポリアラニン、並びにアラニル及び／又はセリニル及び／又はプロリニル及び／又はグリシルアミノ酸残基からなるオリゴペプチドが挙げられる。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号３５）、又は（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３６）を含み、式中、ｎは、１、２、３、４、５などであるが、多くのそのようなリンカーは、当該技術分野で既知であり、使用され、この目的に役立ち得る。

エラスチン様ドメインは、（配列番号２３）ＶＰＧＩＧ、（配列番号２４）ＶＰＧＫＧ、（配列番号２５）ＶＰＧＹＧを含むが、これらに限定されない、エラスチン様モチーフからなる。配列番号２３、２４、及び２５のうちの１つ以上は、タンパク質中に存在することができる。いくつかの実施形態では、モチーフの数は、１～７、１～６、２～５、３～５であり、約５つのモチーフであり得る。例示的なドメイン配列は、例えば、配列番号２０及び２１に提供される。例としては、配列番号１、ＬＱ（ＬＤＡＳＴＶＹＡＶＧＲＧＤＳＰＡＳＳＡ［（ＶＰＧＩＧ）_２ＶＰＧＫＧ（ＶＰＧＩＧ）_２］_３）_４、及び配列番号２、ＬＱ（ＬＤＡＳＴＶＹＡＶＧＲＤＧＳＰＡＳＳＡ［（ＶＰＧＩＧ）_２ＶＰＧＫＧ（ＶＰＧＩＧ）_２］_３）_４が挙げられるが、これらに限定されない。

ＥＬＰタンパク質は、ペンダントヒドラジン基を含むように化学的に修飾され、約３～約２０個、約５～約１８個、約１０～約１４個のヒドラジン基を含んでよい。標準的なバイオ抱合化学を使用して、リジン、システイン、又はチロシンアミノ酸のいずれかの部位にペンダントヒドラジンを付着させることができる。

ヒアルロン酸は、結合組織、上皮組織、及び神経組織全体に広く分布する陰イオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとで構成される二糖類のポリマーであり、交互にβ－（１→４）及びβ－（１→３）グリコシド結合を介して連結されている。ヒアルロン酸は、最大２５，０００回の二糖繰り返しが可能である。ヒアルロン酸のポリマーは、約２０ｋＤａ～約１．５ＭＤａのサイズ、約２０Ｋｄａ～のサイズの範囲であり得る。

ヒアルロン酸は、ペンダントベンズアルデヒド又はアルデヒド側基を含むように化学的に修飾される。ＨＡは、通常、利用可能な反応性基の約５％～約３０％で修飾され、約７％～約２０％、約１０％～約１５％であり得、約１２％で修飾され得る。

アルデヒド官能基の場合、ＨＡ上のカルボン酸基をプロパルギアミンでアミド化し、ＨＡ－アルキン中間体を生成し、次いで、銅クリック化学を使用して、このアルキンを、アルデヒド官能基を含有するヘテロ二官能性小分子のアジド部分とＨＡ上で反応させ、アルデヒドで官能化されたＨＡを生成する。

ベンズアルデヒド修飾は、例えば、約３％～約３０％の所望の濃度でアルキン基を含むようにＨＡを最初に修飾することによって達成され得る。次いで、ＨＡ－アルキンをＮ－（２－アジドエチル）－４－ホルミルベンズアミドで修飾して、ＨＡ－ベンズアルデヒドを生成する。

「活性剤」、「アンタゴニスト」、「阻害剤」、「薬物」、及び「薬理学的に活性な薬剤」という用語は、生物（ヒト又は動物）に投与されると、局所及び／又は全身作用によって所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を誘導する化学物質又は化合物を指すために本明細書で互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」などの用語は、ウイルス力価の低減などの所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患若しくはその症状を完全に又は部分的に予防するという点では予防的であり得、かつ／あるいは疾患及び／若しくは疾患に起因する有害作用に対する部分的又は完全な治癒という点では治療的であり得る。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）（例えば、原発性疾患と関連し得るか、又はそれによって引き起こされ得る疾患を含む）疾患の素因を受け得るが、まだ疾患を有すると診断されていない対象において疾患又は疾患の症状が生じるのを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること、及び（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすこと（例えば、ウイルス力価の低減）を含む。

「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、限定されないが、サル及びヒトを含むヒト及び非ヒト霊長類、ラット及びマウスを含むげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、トリなどを含む動物を指す。「哺乳類」は、任意の哺乳類種の１つ又は複数のメンバーを意味し、例として、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、げっ歯類など、並びに霊長類、例えば非ヒト霊長類及びヒトを含む。非ヒト動物モデル、例えば、哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ネズミ科、ウサギ目などが、実験的調査に使用され得る。

本明細書で使用される場合、「決定する」、「測定する」、「評価する」、及び「アッセイする」という用語は、互換的に使用され、定量的及び定性的決定の両方を含む。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、コードされた及びコードされていないアミノ酸、化学的若しくは生化学的に修飾された、又は誘導されたアミノ酸、並びに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。この用語は、異種のアミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有する、又は有さない、異種及び天然のリーダー配列を有する融合、免疫学的にタグ付けされたタンパク質、検出可能な融合パートナー、例えば、蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む、融合パートナーを有する融合タンパク質などを含むが、これらに限定されない、融合タンパク質を含む。

「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか、又はそのアナログの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知又は未知の任意の機能を実行し得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、制御領域、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。核酸分子は、直鎖状であっても環状であってもよい。

「治療有効量」又は「有効量」は、疾患、状態、又は障害を治療するために哺乳類又は他の対象に投与されると、疾患、状態、又は障害に対するそのような治療に効果を与えるために十分である化合物の量を意味する。「治療有効量」は、化合物、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重などに応じて変動する。

本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒト及び動物対象のための単位投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位が、薬学的に許容される希釈剤、担体、又はビヒクルと関連して所望の効果を生じるために十分な量で計算された所定の量の化合物を含有する。単位剤形の仕様は、使用される特定の化合物及び達成される効果、並びに宿主内の各化合物に関連する薬力学に依存する。

「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される希釈剤」、「薬学的に許容される担体」、及び「薬学的に許容されるアジュバント」は、薬学的組成物の調製において有用であり、一般に安全であり、非毒性であり、生物学的にもその他においても望ましい、賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバントを意味し、獣医学的使用並びにヒト薬学的使用において許容される賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバントを含む。本明細書及び特許請求の範囲で使用される「薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバント」は、１つ及び２つ以上のそのような賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバントの両方を含む。

本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」は、哺乳類、特にヒトなどの対象への投与に好適な組成物を包含することを意味する。概して、「医薬組成物」は、無菌であり、好ましくは、対象内で望ましくない応答を誘発することが可能な汚染物質を含まない（例えば、医薬組成物中の化合物は、医薬グレードである）。薬学的組成物は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内、筋肉内、皮下などを含むいくつかの異なる投与経路を介して、治療を必要とする対象又は患者への投与のために設計され得る。

「体細胞」という用語は、生物内の全ての種類の細胞を生じさせることができない、すなわち多能性ではない、生物内の任意の細胞を包含する。言い換えれば、体細胞は、体の３つの胚葉全て、すなわち外胚葉、中胚葉及び内胚葉の細胞を自然に生成しないように十分に分化した細胞である。

「多能性の」又は「多能性」という用語は、適切な条件下で、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）からの細胞系統に関連する特性を集合的に示す細胞型に分化することができる子孫を生じさせる能力を有する細胞を指す。「幹細胞」は、有糸細胞分裂による自己再生能力及び組織又は器官に分化する可能性を特徴とする細胞である。哺乳類幹細胞では、胚性幹細胞と体性幹細胞とが区別され得る。胚性幹細胞、胚性生殖細胞、及び人工多能性細胞を含む多能性幹細胞は、出生前、出生後、又は成体生物の組織に寄与することができる。

「一次細胞」、「一次細胞株」、及び「一次培養物」という用語は、本明細書で互換的に使用され、対象に由来し、培養物の限られた数の継代、すなわち、分裂のためにインビトロで成長させられた細胞及び細胞培養物を指す。例えば、一次培養は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、又は１５回継代したが、危機段階を継代するために十分な回数ではない可能性がある培養である。典型的には、本発明の一次細胞株は、インビトロで１０未満の継代で維持される。

主題の細胞は、ヒト、霊長類、家畜及び農場動物、並びにイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどの動物園の動物、実験室の動物、又はペット動物を含む、任意の哺乳類に由来してもよい。それらは、確立された細胞株であり得るか、又はそれらは、一次細胞であり得、「一次細胞」、「一次細胞株」、及び「一次培養物」は、本明細書で互換的に使用され、対象に由来し、限られた数の継代のためにインビトロで成長させられた細胞及び細胞培養物を指す。

主題の細胞は、新生児、幼児又は成人からであり得る新鮮な又は凍結した細胞から、及び皮膚、筋肉、骨髄、末梢血、臍帯血、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃、脂肪、及び他の分化した組織を含む組織から単離され得る。組織は、生のドナーからの生検又は非泳動によって、又は死後約４８時間以内に死んだ又は瀕死のドナーから、又は死後約１２時間以内に凍結され、通常は約液体窒素温度（－１９０℃）で無期限に、約－２０℃未満に維持された新鮮に凍結された組織を得ることができる。組織からの細胞の単離のために、適切な溶液が、分散又は懸濁に使用され得る。かかる溶液は、一般に、低濃度、一般に５～２５ｍＭの許容可能な緩衝液と併せて、好都合に、ウシ胎児血清又は他の天然に存在する因子を補充された、無菌の平衡塩溶液、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩溶液などである。好都合な緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが挙げられる。

「細胞培養物」又は「培養物」という用語は、人工的なインビトロ環境における細胞の維持を意味する。しかしながら、「細胞培養」という用語は、一般的な用語であり、個々の細胞だけでなく、組織又は臓器の培養を包含するために使用され得ることを理解されたい。

目的の培養条件は、幹細胞又は前駆細胞がインビトロで増殖、分化、又は成熟する分化を許容する環境を提供する。そのような条件は、差別条件とも呼ばれ得る。環境の特徴は、細胞が培養される培地、存在し得る任意の成長因子又は分化誘導因子、及び本明細書に開示されるヒドロゲルの支持構造を含む。分化は、オルガノイド、又は同様の構造の形成によって開始され得る。

本明細書で使用される「長期培養物」は、細胞が成長し、分化し、かつ少なくとも約１０日間、又は３０日間を超えて、又は６０日間を超えて、又は１００日間を超えて、又は１５０日間を超えて生存可能である培養物を指す。

幹細胞。幹細胞という用語は、本明細書では、自己再生能力及び分化した子孫を生成する能力の両方を有する哺乳類細胞を指すために使用される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２８７－２９８を参照のこと）。一般に、幹細胞は、また、分裂後の２つの娘細胞が異なる表現型を有し得る非同期又は非対称複製を受ける能力、広範な自己再生能力、有糸分裂静止形態での存在能力、及びそれらが存在する全ての組織のクローン再生、例えば、造血幹細胞が全ての造血系統を再構成する能力の特性のうちの１つ以上を有する。「前駆細胞」は、幹細胞とは、それらが典型的には広範な自己再生能力を有さず、多くの場合、それらが由来する組織内の系統のサブセット、例えば、造血学的設定におけるリンパ系、又は赤血球系のみを再生することができるという点で異なる。

幹細胞は、抗体によって同定される特定のエピトープに関連するマーカーの存在及び特定の抗体の結合の欠如によって同定される特定のマーカーの欠如の両方によって特徴付けられ得る。幹細胞は、また、インビトロ及びインビボの両方の機能的アッセイ、特に、複数の分化子孫を生じさせる幹細胞の能力に関連するアッセイによって同定され得る。

「分化系列決定された幹細胞」は、本明細書において、特定の系統の細胞、例えば、胚葉系幹細胞を生じさせる多能性幹細胞を指すために使用される（例えば、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９８：２６１５－２６２５、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ＆Ｂａｄｅｒ（１９９６）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．７８（２）：２０５－１６などを参照されたい）。

「組織特異的幹細胞」は、本明細書では、特定の組織内に存在し、それらが存在する組織の細胞のクローン再生が可能である多能性幹細胞、例えば、造血幹細胞が全ての造血系統を再構築する能力、又は神経幹細胞が全ての神経系統／グリア系統を再構築する能力を指すために使用される。「前駆細胞」は、組織特異的幹細胞とは、それらが典型的には広範な自己再生能力を有さず、多くの場合、それらが由来する組織内の系統のサブセット、例えば、造血学的設定におけるリンパ系又は赤血球系のみ、又は神経系におけるニューロン若しくはグリアのみを再生することができるという点で異なる。

幹細胞及びその培養物多能性幹細胞は、任意の種類の組織（通常は胎児又は胎児前組織などの胚組織）に由来する細胞であり、幹細胞は、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の全ての誘導体である異なる細胞型の子孫を産生する適切な条件下で可能であるという特徴を有する。これらの細胞型は、確立された細胞株の形態で提供され得るか、又はそれらは、一次胚組織から直接得られ、分化のために直ちに使用され得る。ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリ、例えば、ｈＥＳＢＧＮ－０１、ｈＥＳＢＧＮ－０２、ｈＥＳＢＧＮ－０３、ｈＥＳＢＧＮ－０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．）、ＨＥＳ－１、ＨＥＳ－２、ＨＥＳ－３、ＨＥＳ－４、ＨＥＳ－５、ＨＥＳ－６（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、Ｍｉｚ－ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ－Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＨＳＦ－１、ＨＳＦ－６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、及びＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））に列挙されている細胞が含まれる。

対象の幹細胞としては、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５によって記載されるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）細胞によって例示される様々なタイプの胚性細胞、アカゲザル幹細胞などの他の霊長類由来の胚性幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ９２：７８４４）、マーモセット幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５：２５４）、及びヒト胚性胚芽細胞（ｈＥＧ）細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１３７２６，１９９８）が含まれる。また、中胚葉幹細胞及び他の初期心原性細胞などの分化系列決定された幹細胞も対象となる（Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９８：２６１５－２６２５、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ＆Ｂａｄｅｒ（１９９６）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．７８（２）：２０５－１６などを参照されたい）。幹細胞は、任意の哺乳類種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などから得ることができる。

ＥＳ細胞は、それらが特定の分化系列決定されていない場合、未分化であると考えられる。そのような細胞は、それらを胚又は成人由来の分化細胞から区別する形態学的特徴を示す。未分化ＥＳ細胞は、当業者によって容易に認識され、典型的には、高い核／細胞質比及び顕著な核小体を有する細胞のコロニー内の顕微鏡画像の二次元に現れる。未分化ＥＳ細胞は、未分化細胞の存在を検出するためのマーカーとして使用され得る遺伝子を発現し、そのポリペプチド産物は、陰性選択のためのマーカーとして使用され得る。例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００３／０２２４４１１Ａ１、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０３（８）：２９５６－６４、及びＴｈｏｍｓｏｎ（１９９８）（上記参照）を参照されたい。ヒトＥＳ細胞株は、ステージ特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－ｌ－８１、及びアルカリホスファターゼを含む、未分化の非ヒト霊長類ＥＳ及びヒトＥＣ細胞を特徴付ける細胞表面マーカーを発現する。ＳＳＥＡ－４エピトープを担持するグロボシリーズ糖脂質ＧＬ７は、ＳＳＥＡ－３エピトープを担持するグロボシリーズ糖脂質Ｇｂ５へのシアル酸の付加によって形成される。したがって、ＧＬ７は、ＳＳＥＡ－３及びＳＳＥＡ－４の両方に対する抗体と反応する。未分化ヒトＥＳ細胞株は、ＳＳＥＡ－１について染色しなかったが、分化細胞は、ＳＳＥＡ－ｌについて強く染色した。未分化形態でのｈＥＳ細胞の増殖方法は、ＷＯ９９／２０７４１、ＷＯ０１／５１６１６、及びＷＯ０３／０２０９２０に記載されている。

本明細書で使用される場合、「リプログラミング因子」は、転写を変化させるために細胞に作用し、それによって細胞を多分化能性又は多能性にリプログラミングする生物学的活性因子のうちの１つ以上、すなわち生物学的活性因子のカクテルを指す。リプログラミング因子は、細胞、例えば、線維芽細胞、脂肪細胞などの心疾患の目的の家族歴又は遺伝子構造を有する個体由来の細胞に、個々に又は単一の組成物として、すなわち、リプログラミング因子の予め混合された組成物として提供され得る。因子は、同じモル比又は異なるモル比で提供されてもよい。因子は、主題の発明の細胞を培養する過程で１回又は複数回提供されてもよい。いくつかの実施形態では、リプログラミング因子は、転写因子であり、これには、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ－２８が含まれるが、これらに限定されない。

体細胞は、細胞を多能性にリプログラムするために十分な組み合わせ及び量で、上記で定義されるように、リプログラミング因子と接触させる。リプログラミング因子は、個別に、又は単一の組成物、すなわち、リプログラミング因子の予め混合された組成物として、体細胞に提供され得る。いくつかの実施形態では、リプログラミング因子は、ベクター上の複数のコード配列として提供される。

遺伝子は、様々な目的のために、例えば、機能変異の喪失を有する遺伝子に置き換えるために、マーカー遺伝子を提供するためなどに、体細胞に、又はそこから誘導されるｉＰＳ細胞に導入され得る。代替的には、アンチセンスｍＲＮＡ又はリボザイムを発現するベクターを導入し、それによって望ましくない遺伝子の発現を遮断する。遺伝子療法の他の方法は、正常な前駆細胞が利点を有し、選択圧、例えば、複数の薬剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、又はｂｃｌ－２などの抗アポトーシス遺伝子にさらされることを可能にするための薬剤耐性遺伝子の導入である。上記で考察したように、例えば、電気穿孔、カルシウム沈殿ＤＮＡ、融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染などの当該技術分野において既知の様々な技術を使用して、核酸を標的細胞に導入してもよい。ＤＮＡが導入される特定の方法は、本発明の実施には重要ではない。

本明細書で使用される「腸細胞」という用語は、哺乳類の腸上皮を構成する細胞を示す。胃腸管の哺乳類の腸上皮は、明確に定義された組織構造を有する。上皮は、分化細胞（絨毛）を収容する機能領域と、上皮幹細胞ニッチを表す増殖領域（リーベルキューンの陰窩）との２つの領域に分けることができる。多能性上皮幹細胞は陰窩に存在し、吸収性腸細胞、ムチン分泌ゴブレット細胞、ペプチドホルモン分泌腸内分泌細胞、及びＰａｎｅｔｈ細胞の４つの主要な上皮系統を生じさせる。

「哺乳類の腸細胞」という語句は、哺乳類の腸に由来する細胞を意味する。典型的には、本発明の方法では、腸の断片は、外科的に得られ、約１ｍｍ^３未満のサイズに切断され、約０．５ｍｍ^３未満、又は約０．１ｍｍ^３未満であってもよく、又は代替的に、単一細胞に解離されてもよい。本明細書で使用される哺乳類としては、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などが挙げられる。腸組織は、内視鏡検査中の生検によってヒトから得ることができる。「哺乳類腸細胞」及び「腸細胞」及び「腸上皮細胞」は、互換的に使用されている。腸組織の供給源は、胎児、新生児、若年性、又は成人であり得る。

「腸」は、哺乳類の小腸及び哺乳類の大腸を指す。本明細書に記載の方法について、腸組織は、小腸又は大腸のいずれかから得られる。

「移植片」という用語は、例えば、本発明の方法に従って、哺乳類腸組織に由来し、インビトロから成長した細胞を意味する。

「腸幹細胞」は、「上皮幹細胞」と互換的に使用され、腸上皮細胞に増殖及び分化する可能性を有する幹細胞を指す。多能性上皮幹細胞は、様々な上皮系統を生じさせ、吸収性腸細胞、ムチン分泌ゴブレット細胞、ペプチドホルモン分泌腸内分泌細胞、及びＰａｎｅｔｈ細胞を含む全ての腸上皮系統を生じさせ得る。

「多系統分化マーカー」という用語は、異なる細胞型に特徴的な分化マーカーを意味する。これらの分化マーカーは、マーカーに特異的な親和性試薬、例えば、マーカーに特異的な抗体を使用すること、当該技術分野で知られているように、細胞型などを特異的に染色する化学物質を使用することによって検出することができる。末端分化マーカーの非限定的な例としては、クロモグラニンＡ、ＮｅｕｒｏＤ－腸内分泌細胞、ムチン－ゴブレット細胞、ビリン、ＣＤ１０－腸細胞、リゾチーム、Ａｎｇ４－Ｐａｎｅｔｈ細胞が挙げられる。腸内分泌、ゴブレット、及びＰａｎｅｔｈ細胞の一般的な前駆細胞は、Ｍａｔｈ１に対する抗体を使用することによって検出される。Ｐ－ＰＴＥＮ、ＳＦＲＰ５、及びＭｕｓａｓｈｉ１は、腸内幹細胞及び腸内前駆細胞において特異的に発現される。腸内アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）は、腸細胞をマークする。

「候補薬剤」という用語は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ遺伝子、遺伝子産物、小分子、及び本明細書に記載の腸細胞培養物に導入されて、移植片に対するそれらの効果をアッセイする薬理学的化合物を意味する。

「接触する」という用語は、哺乳類腸細胞の移植培養物中に候補細胞又は候補薬剤のいずれかを配置することを指す。接触は、また、候補細胞を半透過性基質中に配置する前に、培養培地中で少なくとも１時間、又は２時間超又は４時間超の間、腸移植片と共培養することを包含する。代替的には、接触とは、経管腔注射を介して、嚢胞として成長する移植片の管腔内に候補細胞を配置することを指す。

「スクリーニング」は、候補細胞を本明細書に記載の培養物と共培養するか、又は候補薬剤を本明細書に記載の培養物に添加するかのいずれかのプロセスを指す。培養に対する候補細胞又は候補薬剤の効果は、例えば、腸幹細胞を示す多系統分化マーカーの存在によって、基底レベルを上回る移植片の成長の増加によって評価される。腸移植片に対する候補細胞又は候補薬剤の効果は、連続したインビトロ継代によって、並びに皮下インプラントアッセイ及び腎カプセルアッセイによるインビボ移植によって、長期再構成活性について腸移植片をアッセイすることによって更に評価することができる。

「容器」とは、細胞を培養するための無菌環境を提供することができるガラス、プラスチック、又は金属容器を意味する。

「移植片」という用語は、本明細書では、例えば、本発明の方法に従って、インビトロで培養された哺乳類組織に由来する組織及びその細胞を意味するために使用される。移植片が由来する哺乳類組織は、個体、すなわち、一次移植片から得てもよく、又はそれは、インビトロで、例えば、人工多能性幹細胞の分化によって得られてもよい。

「オルガノイド」という用語は、本明細書では、インビボで組織の特徴、例えば、増殖を伴う長期の組織拡張、多系統分化、細胞及び組織の超微細構造の再現などを保持する培養物中の哺乳類細胞の三次元成長を意味するように使用される。一次オルガノイドは、移植片、すなわち、培養された移植片から培養されるオルガノイドである。二次オルガノイドは、一次オルガノイドの細胞のサブセットから培養されるオルガノイドであり、すなわち、一次オルガノイドは、例えば、機械的又は化学的手段によって断片化され、断片は、再現及び培養される。三次オルガノイドは、二次オルガノイドなどから培養されるオルガノイドである。

「超微細構造」は、インビボで観察される細胞又は組織の三次元構造を指す。例えば、細胞の超微細構造は、インビボでその極性又はその形態であってもよく、一方、組織の超微細構造は、組織内での互いに対する異なる細胞型の配置であってもよい。

「スクリーニング」は、候補細胞を本明細書に記載の培養物と共培養するか、又は候補薬剤を培養物に添加するかのいずれかのプロセスを指し、候補細胞又は候補薬剤が培養物に及ぼす効果を評価するプロセスを指す。効果は、任意の便利なパラメータ、例えば、移植片の成長率、幹細胞を示す多系統分化マーカーの存在などを評価することによって評価され得る。移植片に対する候補細胞又は候補薬剤の効果は、シリアルインビトロ継代によって、並びにインビボ移植によって、長期再構築活性について移植片をアッセイすることによって更に評価することができる。

培養方法
様々な哺乳類組織の培養のための培養システム及び方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織、すなわち一次組織は、哺乳類器官から得られる。組織は、任意の哺乳類種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などに由来し得る。哺乳類は、いずれの年齢であってもよく、例えば、胎児、新生児、幼体、成体であってもよい。オルガノイドを調製する目的で得ることができる組織のいくつかの非限定的な例を以下に示す。細胞又は組織は、任意の好都合な方法、例えば、生検、例えば、内視鏡検査中、手術中、針などによって、又は細胞株から、インビトロ分化などによって得られ得る。組織の場合、それは氷冷緩衝溶液、例えばＰＢＳ、ハムのＦ１２、ＭＥＭ、培養培地などに浸漬される。組織の断片は、約１ｍｍ^３未満のサイズに切断され、単一細胞に解離され得る。切断された組織を、本開示のヒドロゲルと混合する。続いて、細胞含有ヒドロゲルを好適な培地中に配置する。

いくつかの実施形態では、組織は、多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、胚性生殖細胞（ＥＧＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からインビトロで成長される。多能性幹細胞から所望の組織を誘導するために、任意の好都合な方法に従ってもよい。操作された組織は、ヒドロゲル基質に移され得る。

移植片の継続的な成長は、任意の好都合な方法、例えば、位相差顕微鏡検査、立体顕微鏡検査、組織学、免疫組織化学、電子顕微鏡検査などによって確認され得る。場合によっては、細胞の超微細構造及び多系統分化が評価され得る。培養における腸管移植片の超微細構造は、当該技術分野で知られている方法を使用して、ヘマトキシリン－エオシン染色、ＰＣＮＡ染色、電子顕微鏡検査などを実施することによって決定することができる。多系統分化は、例えば、以下でより詳細に記載されるように、末端分化マーカーに対する抗体による標識を実施することによって決定することができる。分化マーカーを検出するための抗体は、多くの供給源から市販されている。

いくつかの実施形態では、培養された移植片中の細胞は、実験的に修飾され得る。例えば、移植細胞は、ウイルス又は細菌病原体への曝露によって、例えば、治療剤の抗ウイルス又は抗細菌効果を評価するための実験用試薬を開発するために修飾され得る。外植片細胞は、遺伝子発現のパターンを修飾することによって、例えば、多能性を誘導するか、又は別の方法で分化可能性を改変するために、又は移植片培養を形成する細胞の能力又は腫瘍形質転換を受ける細胞の能力に対する遺伝子活性の増大又は喪失の影響を決定するために、リプログラミング因子を提供することによって修飾され得る。外植片細胞は、例えば、腫瘍に対する治療剤の効果を評価するために、例えば、Ｋｒａｓ．ｓｕｐ．Ｇ１２Ｄの過剰発現のためのがんドライバー－がん原性因子又は腫瘍抑制遺伝子の阻害剤、例えば、ＡＰＣ、ｐ５３、又はＳｍａｄ４などの発現を抑制する核酸を提供することによって、がん原遺伝子性又は発がん性細胞に形質転換されるように修飾されてもよい。

実験修飾は、例えば、スクリーニング目的のために、核酸、ポリペプチド、小分子、ウイルスなどである候補薬剤を移植片及びその細胞に提供する方法に関して以下に記載されるように、当該技術分野で既知の任意の方法によって行われ得る。

主題の方法によって調製されるオルガノイドは、多くの用途での使用が見出される。例えば、がん、虚血、先天性症候群、外傷、及び炎症は、臓器生理学を損なうために十分な大きさの患者組織の大部分の機能喪失又は強制的な物理的切除を引き起こす可能性がある。インビトロで哺乳類組織の移植片を成長させて、そのような患者に戻すか、又はそのような患者への移植のための組織特異的幹細胞の供給源として使用する能力は、貴重な治療選択肢である。そのような細胞は、組織のエクスビボ拡張を増強し、操作された組織及び／又は組織幹細胞の自己源を提供することができる。別の例として、主題の方法によって調製されたオルガノイドは、個体、例えば、がんを有する個体、感染などを有する個体の療法に対する応答性を予測するために使用され得る。別の例として、主題の方法によって調製されたオルガノイドは、基礎研究、例えば、疾患の基礎をよりよく理解するために、及び創薬、例えば、以下に更に記載されるもののようなスクリーン内の試薬で使用され得る。オルガノイドは、また、薬剤の薬物動態及び薬力学、例えば、活性薬剤を吸収する哺乳類組織の能力、一次哺乳類組織上又はがん原性哺乳類組織上の薬剤の細胞毒性などを評価するために有用である。

実験
操作されたマトリックスは、ヒト患者由来の腸管オルガノイドの形成、成長、経過、及び分化を可能にする。
患者の生検の一次組織に由来するヒト腸管オルガノイドは、個別化された医学及びヒト胃腸疾患の前臨床モデルを改革する可能性がある。これまでのところ、ほとんどの腸管オルガノイドは、エンゲルブレスホルムスワム（ＥＨＳ）マウス肉腫に由来する脱細胞化マトリックスで成長しており、これは、チューナビリティ及び再現性を限定した材料である。この制限を克服するために、ヒアルロン酸エラスチン様タンパク質（ＨＥＬＰ）と呼ばれるデザイナーマトリックスを報告し、成人の一次組織由来の上皮のみの腸管オルガノイドの形成、分化、及び継代を可能にする。これらの材料は、分離した患者由来細胞のカプセル化を可能にし、その後、分極された内部管腔を有する球状構造である、エンテロイドの増殖及び新たな形成を受ける。ヒトエンテロイドの１２回の継代、解離、及び再生の後、ＨＥＬＰ材料の成長は、ＥＨＳマトリックスのそれと統計的に類似していることが判明した。ＨＥＬＰ材料は、ヒトエンテロイドをより特殊な細胞型：Ｐａｎｅｔｈ細胞、ゴブレット細胞及び腸内分泌細胞に分化させることを更にサポートした。ＨＥＬＰの３つの重要な変数であるマトリックス剛性、マトリックス応力緩和速度、及びマトリックスインテグリンリガンド濃度は、各々独立して定量的に指定することができ、オルガノイドマトリックス相互作用及び潜在的な患者特有の最適化の基礎研究を可能にする。ＨＥＬＰ材料中のオルガノイド形成は、より硬い係数（Ｇ’～１ｋＰａ）、より遅い応力緩和速度（ｔ１／２～１８時間）、及びより高いインテグリンリガンド濃度（０．５～１ｍＭのＲＧＤペプチド）を有するゲルにおいて最も堅牢であることが分かった。私たちの材料は、ヒトにおけるオルガノイドの発達及び疾患を更に理解するための３Ｄインビトロモデルと、動物由来の製品又は潜在的な臨床翻訳のための合成ポリエチレングリコールを含まない再現性、生分解性、最小限のマトリックスとを提供する。

合成マトリックスは、ＥＨＳマトリックス又は他の細胞型を必要とせずに、マウス及びヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のオルガノイドの形成をサポートするように設計されている。対照的に、合成マトリックス中のヒト患者由来の腸管オルガノイドは、しばしば、ＥＨＳマトリックス中のスフェロイド形成工程、又は間葉系細胞との共培養のいずれかを必要とする。患者由来の腸管オルガノイドのための操作マトリックスを開発する最近の研究は、合成マトリックス骨格としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に依存しているが、ＰＥＧは免疫系と相互作用し、抗体形成を誘導することが知られている。ＰＥＧフリーのシステムを作成するために、デザイナーマトリックス、ヒアルロン酸エラスチン様タンパク質（ＨＥＬＰ）を報告し、成人の一次組織由来の上皮のみの腸管オルガノイドの形成、分化、及び継代を可能にする。ＨＥＬＰの３つの重要な変数（マトリックス剛性、マトリックス応力緩和速度、及びマトリックスインテグリンリガンド濃度）は、各々独立して定量的に指定することができ、オルガノイドマトリックス相互作用及び潜在的な患者特有の最適化の基礎研究を可能にする。私たちの材料は、ヒトにおける腸の発達及び腸疾患を更に理解するための３Ｄインビトロモデルと、動物由来の製品又は潜在的な臨床翻訳のための合成ＰＥＧを含まない再現性、生分解性、最小限のマトリックスとを提供する。

天然腸に見出されるバイオポリマーに触発された最小限のマトリックスが、一次ヒト組織に由来するオルガノイドの形成をサポートすると仮定した（図１ａ）。私たちのグループは、以前、ヒトエラスチン及びフィブロネクチンに由来するアミノ酸配列を使用して、一次マウス腸管オルガノイドの形成及び成長をサポートするタンパク質操作マトリックスを報告した。エラスチンは、腸細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主要な成分のうちの１つであり、フィブロネクチンは、腸幹細胞（ＩＳＣ）陰窩内で発現される。組換えエラスチン様タンパク質（ＥＬＰ、ＭＷ３７．７ｋＤａ）は、フィブロネクチンから借用されたインテグリン結合伸長ＲＧＤ配列を有するエラスチン様配列を散在させる（図１ｂ、図Ｓ１ａ）。インビボでは、ＩＳＣの維持及び増殖は、ＣＤ４４受容体によって部分的に媒介され、ＣＤ４４活性化は、腸の成長と関連する。ＣＤ４４受容体は、正常な腸成長に重要なグリコサミノグリカンであるヒアルロン酸（ＨＡ、ＭＷ１００ｋＤａ）と相互作用することができ、ＨＡを含む操作されたマトリックスが患者由来のエンテロイド培養をサポートすることができるという仮説を立てることにつながる。これら２つのバイオポリマー成分から再現可能なヒドロゲル材料を作製するために、以前に報告されたように、ヒドラジン基でＥＬＰを化学的に修飾し、ベンズアルデヒドでＨＡを化学的に修飾されたスキームを開発した（図５ｂ－ｅ）。２つの修飾されたバイオポリマーを一緒に単に混合することは、ヒドラゾン結合の形成を誘導し、ＨＥＬＰと呼ばれるヒドロゲルネットワークをもたらした。

この研究を通して、細胞を以下のように分類する。腸上皮細胞の未分化スフェロイドを患者由来の腸内エンテロイド（又はより単純にはエンテロイド）を参照し、分化すると、これらの腸内細胞構造を患者由来の腸管オルガノイドと呼ぶ。いくつかの研究では、エンテロイド状態と称するものは、特に、Ｌｇｒ５^＋ＩＳＣ集団に対する蛍光レポーター系が利用されるマウス系において、ＩＳＣコロニー又はスフェロイドと称される。ここでは、ヒトエンテロイドを単一細胞に解離させ、ヒドロゲルの共有結合架橋中にＨＥＬＰ内に埋め込んだ。３日以内に、新規のスフェロイド形成が観察された（図１ｃ、ｄ）。合成材料中のヒトエンテロイドのいくつかの以前の報告は、合成生体材料中でカプセル化する前に、ＥＨＳマトリックス中でのエンテロイド形成の最初の工程を必要とし、このプロセスを「再埋め込み」と呼ぶ（図１ｃ）。したがって、これらの２つの異なる培養方法をサポートするための異なる材料の能力を比較した。１）解離した単一細胞のカプセル化、及び２）予め形成されたエンテロイドの再埋め込み（図１ｄ）。予想されたように、かつ以前の報告と一致して、再包埋されたエンテロイドは、フィブロネクチン由来のインテグリン結合ＲＧＤリガンドを含有するＥＬＰのみのマトリックス内で少なくとも６日間成長し、生存可能であったが、ＺＯ－１及びβ－カテニン染色によって観察されたようなエンテロイド分極化が維持されなかったことに留意されたい（図１ｄ、上）。全く対照的に、ＥＬＰのみのマトリックス内の（すなわち、ＨＡなしの）解離したヒト腸細胞は、エンテロイドを形成することができず、ＲＧＤリガンド単独では、この材料中の新規オルガノイド形成をサポートするには不十分であることを示唆する。興味深いことに、操作されたマトリックスにＨＡを添加することにより、単一の腸細胞が堅牢にＨＥＬＰでエンテロイドを形成し、再埋め込みされたエンテロイドとして培養されたときに少なくとも６日生存することが可能になった（図６）。重要なことに、ＨＥＬＰで形成されたエンテロイドは、ＥＨＳマトリックスに類似した適切な腸上皮極性を示し、これは、狭い接合タンパク質密着結合－１（ＺＯ－１）の先端管腔への局在及び接着接合タンパク質β－カテニンの基底外側局在によって示された（図１ｄ）。ＨＥＬＰマトリックス内の第２の別個の患者ラインについて同様の結果が観察された（図７）。オルガノイド成長をサポートするためのＨＥＬＰマトリックスの潜在的な広範な適用性を実証するために、原発性マウス腸管エンテロイド及びヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の肝臓オルガノイドも、ＨＥＬＰマトリックスにおいて生存可能であった（図８）。

単一細胞からの堅牢なオルガノイド形成に加えて、ＨＥＬＰ内のヒトエンテロイドは、各継代後に繰り返し継代され、新しいエンテロイドを形成し続けることができる（図１ｅ、６、７ｂ、ｃ）。ＨＥＬＰマトリックスは、エラスターゼ及びヒアルロニダーゼを使用して酵素的に分解され、続いてトリプシンを使用して単一細胞へのエンテロイド溶解が行われる（培養方法を参照）。これらの単一細胞を新鮮なＨＥＬＰマトリックスにカプセル化することにより、形態の目に見える変化なしに、最大１２の継代の新しいエンテロイド形成が成功した（図１ｅ、ｆ）。ＨＥＬＰマトリックスで繰り返し継代されたエンテロイドは、培養の１２日間にわたる明視野顕微鏡検査によって観察されたように、ＥＨＳマトリックスにおけるエンテロイドの成長率と一致した（図１ｆ）。更に、これらの繰り返し継代したエンテロイドは、ＨＥＬＰ及びＥＨＳマトリックス（図１ｇ）で統計的に類似した形成速度を有していた。

ＨＥＬＰが患者由来の腸管オルガノイドへの分化をサポートできるか否かを評価するために、ＨＥＬＰに埋め込まれた単一の細胞を最初に、Ｗｎｔ３Ａ、表皮成長因子、Ｎｏｇｇｉｎ、及びＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ１を含有する成長培地中で１０日間、エンテロイドを形成させた（図２ａ）。成長培地中では、細胞は初期のエンテロイド形成を受ける（図２ｂ、左）。エンテロイドが発達するにつれて、細胞は形態学的に柱状になり、オルガノイド内の厚い頂端アクチン境界（図２ｂ、中央）及び既知の偏光マーカーの局在化（図１ｄ）によって実証される、固有の腸端基底極性を採用する。１０日目に、Ｗｎｔ及びＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ１を除去して、５日間にわたってオルガノイドへのエンテロイド分化を促進した。

このプロセスは、分化した腸細胞型を含有する起伏がある管腔の形成をもたらした（図２ｂ）。免疫細胞化学により、ＨＥＬＰ及びＥＨＳマトリックスの両方で成長したオルガノイドにおけるリゾチーム陽性Ｐａｎｅｔｈ細胞が確認された（図２ｃ）。ＨＥＬＰで成長したオルガノイドにおいて、ＥＨＳマトリックスで成長したオルガノイドと比較して、ムチン－２（Ｍｕｃ２）陽性ゴブレット細胞の発現が高いことが観察された。分化した腸内分泌細胞のマーカーであるクロモグラニン－Ａ（ＣｈｇＡ）陽性の細胞は、ＨＥＬＰマトリックスで同定されたが、ＥＨＳマトリックスでは見出されなかった。これらの分化マーカーの転写発現を評価するために、ＨＥＬＰ又はＥＨＳマトリックスで分化されたオルガノイドに対して、それぞれのマトリックス内の成長培地中で１５日間維持されたエンテロイドと比較して、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を実施した（図２ｄ）。ＬＹＺ１（リゾチーム）及び腸細胞マーカーＶＩＬ１（ビリン－１）の発現レベルは、ＨＥＬＰマトリックス及びＥＨＳマトリックスの両方において、未分化対照と比較して比較的変化しなかった。ＨＥＬＰマトリックス及びＥＨＳマトリックスの両方において、ＭＵＣ２（ムチン－２）及びＣＨＧＡ（クロモグラニン－Ａ）遺伝子発現が高い上方制御が観察された。

エンテロイドは、ＥＬＰのみのマトリックスではなく、ＨＥＬＰにおいて正常に形成されたため（図１）、次に、これらのマトリックスにおけるＨＡの許容的役割を更に探索しようとした。患者由来の腸内細胞が増殖性腸内陰窩を豊富に含み、ＨＡ受容体でもあるＣＤ４４を発現することを確認するために、ＨＥＬＰ及びＥＨＳマトリックスにおいて、単一細胞から形成されたエンテロイドに対して免疫細胞化学を実施した。興味深いことに、ＥＨＳマトリックスと比較して、ＨＥＬＰで成長したエンテロイドの末梢上のＣＤ４４染色の強度が高いことが観察された（図３ａ）。ＣＤ４４のより高い表面発現が、ＥＨＳマトリックスで成長したものと比較して、ＨＥＬＰで成長したエンテロイドからの単一の解離細胞上で観察されたため、フローサイトメトリーは、この発見を更に確認した（図３ｂ、図９）。フローサイトメトリー分析により、ＥＨＳマトリックスで成長したエンテロイド由来のＣＤ４４陽性細胞の７０％がＣＤ４４陽性であったことと比較して、ＨＥＬＰで成長したエンテロイド由来の細胞の約９０％がＣＤ４４陽性であったことが明らかになった。これらの結果は、ＨＥＬＰにおけるＨＡシグナル伝達が、エンテロイド形成を促進する上で重要な役割を果たし得ることを示唆している。ＨＡシグナル伝達がエンテロイド形成を支援した材料の重要な特徴であるか否かを更に試験するために、ＨＡ成分を修飾するために使用した場合と同じベンズアルデヒド部分を有する合成ＰＥＧポリマーを修飾した。この材料を使用して、同等濃度のＲＧＤペプチド（１ｍＭ）で、ＨＥＬＰマトリックス（図１０）に剛性マッチングしたＥＬＰ－ＰＥＧヒドロゲルマトリックスを生成した。明視野及び共焦点蛍光顕微鏡法により、ＨＥＬＰと同等の機械的特性を有するＥＬＰ－ＰＥＧゲルにおいて、エンテロイドを形成できないことが明らかになり、ＨＡ生化学的シグナル伝達がＨＥＬＰマトリックスの必須成分であることが示唆された（図３ｃ、ｄ）。

ＨＥＬＰ材料は、複数の生体材料特性の独立した選択を可能にし、異なる生化学的及び生物物理的マトリックスの手がかりに応答したオルガノイドの成長の研究を可能にする。これらのパラメータを調整することで、オルガノイド中の細胞が組織力学にどのように反応するかを注意深く研究することができる。実際、マトリックス剛性、マトリックス応力緩和、及びマトリックスＲＧＤ含有量の相互作用は、他の操作されたバイオマテリアルシステムにおいて重要であった。ＨＥＬＰシステム内のこれらの相互作用を探索するために、最初に、非細胞接着であることが知られている非インテグリン結合、配列スクランブルペプチド（ＲＤＧ）を含むＥＬＰタンパク質のバリアントを調製した。次に、ＨＥＬＰマトリックス内でＲＧＤ－とＲＤＧ－ＥＬＰタンパク質とをブレンドすることにより、マトリックス力学に影響を与えることなく、ヒドロゲル中のＲＧＤリガンドの正確な濃度を０～１ｍＭに調整することができた（図４ａ、図１０）。様々な機械的特性を有するマトリックスを作成するために、まず、ヒドラジン－ベンズアルデヒド架橋の程度（図４ｂ、上）を変化させて、硬質弾性様マトリックス（貯蔵係数、Ｇ’～１ｋＰａ、「硬質ＥＬ」と称される）及びより適合性がある、弾性マトリックス（Ｇ’～４００Ｐａ、「軟質ＥＬ」）を作成した（図４ｃ、ｄ）。これらのマトリックスは同等の準弾性応力緩和プロファイルを有し、６０分間にわたる無視できる応力緩和と約１８時間の応力減衰半減時間（ｔ_１／２）を有していた。

ＨＥＬＰマトリックスのセットにおける様々な材料特性の関数として、患者由来のエンテロイドサイズの分布を測定した（図４に平均として示されるデータ、図１１に示されるバイオリンプロット分布）。一般に、より硬いゲル（Ｇ’～１ｋＰａ）で成長したエンテロイドの断面積は、より柔らかいゲル（Ｇ’～４００Ｐａ、図４ｅ）で成長したものよりも大きかった。この結果は、マウス及び合成ＰＥＧベースのマトリックスで成長した一次ヒト腸管オルガノイドに最適であることが以前に見出された剛性範囲と一致する。この傾向に加えて、ＲＧＤリガンドを欠くマトリックスにおいて、マトリックスの剛性とは無関係に、エンテロイドがそれほど堅牢に成長しないことを観察した。これは、合成マトリックスにおける腸内オルガノイドの以前の報告と一致し、最適なオルガノイド成長のために最小閾値レベルのＲＧＤが必要であった。しかしながら、これらの以前の報告では、ＲＧＤを含まない合成マトリックスで培養されたオルガノイドは、形成することができず、生存することができなかった。生存可能なエンテロイドがＲＧＤリガンドなしでＨＥＬＰマトリックスで形成されたという事実は、ＲＧＤとＨＡの共提示がオルガノイド成長を有意に改善したが、ＨＡからのシグナル伝達がいくつかのオルガノイド形成を誘導するために十分であり得ることを示唆している（図４ｅ）。

次に、応力緩和及び粘弾性であるマトリックス内のＲＧＤ濃度の役割を探索した。「応力緩和」であるマトリックスは、細胞力によって変形された後、応力を消散させ、緩和するために分子レベルのリモデリングを受ける。他の細胞型を用いた研究は、マトリックス応力緩和がマトリックス剛性よりも細胞表現型に更に強い影響を及ぼす可能性があることを実証しており、これらの効果は、マトリックスに力を及ぼすために細胞が使用する主要なメカニズムであるため、インテグリンリガンド濃度によって異なる。したがって、マトリックス剛性、ＲＧＤリガンド濃度、及びマトリックス応力緩和の独立した調整を可能にするバイオミメティックＨＥＬＰマトリックスのファミリーを設計しようとした。天然の細胞外マトリックス及びＥＨＳマトリックスの主な特徴は、それらの物理的架橋による応力緩和を受ける能力であり、これは容易にリモデリングすることができる。ＨＥＬＰマトリックスで使用されるものなどの動的共有結合架橋の再構築動態は、隣接する化学部分の選択によって調整することができる。ＨＡ上のベンズアルデヒド基の画分をアルデヒド基（図４ｂ、底）に置き換えることによって、準弾性「硬質ＥＬ」ＨＥＬＰマトリックス（図４ｆ、ｇ）と同一の剛性を有する、より速い応力緩和（ｔ_１／２～３０分）、粘弾性ＨＥＬＰマトリックス（「硬質ＶＥ」と称される）を配合した。興味深いことに、弾性ゲルと比較して、粘弾性ゲルにおけるエンテロイド成長のためのＲＧＤリガンド濃度へのより大きな依存性を観察した（図４ｅ、ｈ）。粘弾性ゲルは、堅牢なエンテロイド成長に必要な０．７５ｍＭのＲＧＤの閾値を有した（図４ｈ）。これらのデータは、より大きなリモデリングを受けることができるマトリックスにおいて、エンテロイドは、インテグリンリガンドの存在に対してより感受性であり得る一方、エンテロイドは、より弾性的なメカニズムを有するマトリックスにおいて、より広範囲のマトリックス特性にわたってより堅牢に形成することができることを示唆する。

要約すると、ここでは、解離した単一細胞からの一次ヒト腸管オルガノイドの堅牢な形成、成長、継代（図１）及び分化（図２）を可能にするＨＥＬＰマトリックスを提示する。興味深いことに、ＨＥＬＰ内のヒアルロン酸の存在は、同様のメカニズム及びＲＧＤ－リガンド濃度を有するＥＬＰのみ及びＥＬＰ－ＰＥＧマトリックスがエンテロイド形成をサポートしなかったため、単一細胞からの新規エンテロイド形成を可能にするために十分である（図１、３）。この観察結果は、ＨＥＬＰマトリックスで培養されたエンテロイドにおけるＨＡのよく知られた受容体であるＣＤ４４の発現の増加と相関する（図３）。この受容体は、ＩＳＣの再生において重要であることが知られており、したがって、知見は、腸細胞増殖に影響を及ぼすマトリックス因子の集合的な理解に寄与し、ＨＡを含有するデザイナーマトリックスの更なるメカニズム的研究をサポートする。

ＨＥＬＰマトリックスは、この特定の細胞源に適しているだけでなく、マウスの腸管オルガノイドだけでなく、ヒトのｉＰＳＣ由来の肝臓オルガノイドもサポートしている（図８）。したがって、再現可能なオルガノイド培養に利用可能な最小限のマトリックスのライブラリにＨＥＬＰマトリックスを追加するために役立つ。これらの結果は、生化学的リガンド密度、マトリックス剛性、及びマトリックス応力緩和速度（図４）を含むいくつかの材料特性のオーダーメイドテーラリングと組み合わせて、ＨＥＬＰマトリックスを、多種多様な患者由来のオルガノイドの培養のために最適化され得るプラットフォームとして位置付ける。明確に定義された最小限の操作されたマトリックスは、ＰＥＧの使用を回避しながら、ＥＨＳマトリックスの主な制限、特にバッチ間の可変性、不十分なチューナビリティ、生物学的複雑さ、及び臨床的翻訳性を克服する。将来的には、ＨＥＬＰマトリックスは、患者固有のマトリックス特性を模倣するようにカスタマイズされ、再現可能で個別化されたオルガノイド培養をもたらす可能性がある。ヒト腸管及び他のオルガノイドの培養を可能にすることにより、ＨＥＬＰ材料は、腸疾患病理学、発達生物学、及び再生医療の研究を含む多くの将来の用途を有する。

材料及び方法
ＥＨＳマトリックスにおけるヒトエンテロイドの継代培養及び維持培養。ヒトの一次腸組織を、全ての実験のために継代４～２４の間で使用した。維持培養物中の細胞を、２４ウェルプレート内の４０μＬのＥＨＳマトリックス、特にＣｕｌｔｒｅｘ基底膜抽出低減成長因子（ＢＭＥ－ＲＧＦ）タイプ２（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にカプセル化入しながら維持した。エンテロイドは、成長速度に応じて１～２週間ごとに継代した。エンテロイドを継代させるために、Ｃｕｌｔｒｅｘ液滴を、氷冷、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸して、ゲルを溶解させ、５００×ｇで５分間遠心分離し、ＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で３７℃で１０分間処理し、５分ごとにピペット吸引によって激しく混合して、単一細胞の生成を支援した。次いで、ＴｒｙｐＬＥをエンテロイド成長培地（以下に記載）でクエンチし、５００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを細胞計数のために成長培地中で洗浄し、次いで、５００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを７５０，０００細胞／ｍＬの濃度で氷冷Ｃｕｌｔｒｅｘ中に再懸濁させ、細胞培養インキュベーターに移した。３７℃で１０分間のゲル化の後、５００μＬの予め加温された成長培地を各ウェルに添加した。小分子阻害剤１０μＭのＹ－２７６３２及び２．５μＭのＣＨＩＲ－９９０２１（両方ともＢｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから入手）を、維持培養の第１の培地変化のために培地に添加した。培地を３～４日ごとに完全に交換した。

マウスのエンテロイド単離及び培養。マウス腸管エンテロイドを、前述のように生成した。簡潔に述べると、単離されたマウスの小腸を縦方向に切断し、冷たいＰＢＳで洗浄した。次いで、組織をおおよそ５ｍｍの正方形の断片に粉砕し、冷たいＰＢＳで再度洗浄した。次いで、組織を氷上のＰＢＳ中の２ｍＭのＥＤＴＡ中でインキュベートした。このインキュベーションの後、ＥＤＴＡ溶液を吸引し、次いで、組織断片を、冷ＰＢＳを使用して１０ｍＬの血清学的ピペットとよく混合し、組織を沈降させた。上清を廃棄し、腸内陰窩を含有する沈降物をＰＢＳ中に再懸濁した。試料を激しく混合し、次いで５００×ｇで５分間遠心分離し、次いで、陰窩が豊富な上清を７０μｍの細胞ストレーナ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に通した。陰窩を２００×ｇで３分間再度遠心分離し、単一細胞を分離した。主に純粋な陰窩の一部は、培養のために使用された。

ヒト肝臓オルガノイドの分化及び培養。肝臓オルガノイドは、前述のように生成した。簡潔に述べると、正常なｉＰＳＣ由来の二次肝臓オルガノイド（ＨＯ２）を、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ中で５～１０分間消化した。２００×ｇで３分間の遠心分離によって細胞を収集し、２５μｌの１％ＨＡ中に再懸濁し、２４ウェルプレート中で１ウェル当たり１，０００個の細胞で、予めロードされた２５μｌの１％ＥＬＰと直接混合した。ＨＥＬＰ固化後、１ｍｌの成長培地を添加し、細胞を６日間培養した。成長培地は、２５０ｎＭのＬＤＮ－１９３１８９、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭのＡ８３－０１、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０、及び２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを有するＲＰＭＩ＋Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）培地からなった。次いで、１０μＭのＤＡＰＴ、１０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、１０μＭのデキサメタゾン、及び１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を補充したＨＣＭ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，ＳＵＩ）培地からなる分化培地中で更に６日間細胞を培養した。ＨＯ上でフォルスコリン誘発性腫脹アッセイを実施するために、フォルスコリン（ＦＳＫ）及び３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（それぞれ１０μＭ及び１００μＭ）の両方を添加して、ｃＡＭＰ経路を活性化し、ＨＯ培養物中のＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター）機能を２４時間増大させた。細胞透過性蛍光色素カルセイングリーンの１０μＭ溶液で染色した後、腫脹を視覚化した。次いで、２４時間治療後の各肝臓オルガノイドの総面積の差を計算し、プロットした。

腸内オルガノイド成長培地生成。オルガノイド成長ベース培地は、ＡＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及びＬ－ＷＲＮ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ３２７６）条件培地の１：１混合物からなっていた。Ｌ－ＷＲＮ条件培地を生成するために、Ｌ－ＷＲＮ細胞を、Ｌ－ＷＲＮ成長培地（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（ＰＳＱ）を補充したダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ））中のＴ１５０細胞培養フラスコ上にプレーティングし、１～２日間成長させた。成長培地を変更し、Ｌ－ＷＲＮ選択培地（Ｇ４１８の各々５００μｇ／ｍＬを補充したＬ－ＷＲＮ成長培地、及びＷｎｔ－３Ａ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ ３、及びＮｏｇｇｉｎの分泌をコードするトランスジェニックＤＮＡを含有する細胞を選択するためのヒグロマイシン抗生物質）を補充した。細胞をコンフルエントになるまで成長させ、１：４の比率で２回分割し、次いで複数のＴ１５０フラスコに分割した。細胞をＬ－ＷＲＮ成長培地中でコンフルエントまで培養し、Ｌ－ＷＲＮ回収培地（１０％ＦＢＳ及び１％ＰＳＱを有するＡＤＭＥＭ－Ｆ１２）で洗浄し、新鮮なＬ－ＷＲＮ回収培地で２４時間培養した。２４時間後、各フラスコから条件培地を回収し、組み合わせた。新鮮なＬ－ＷＲＮ回収培地を交換し、条件培地生成及び回収を最大４回繰り返した。ＡＤＭＥＭ－Ｆ１２をＬ－ＷＲＮ条件培地と１：１で混合し、以下の試薬を補充した。１ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、１ｘＧｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、１０ｍＭのニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１ｍＭのＮ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１ｘＢ－２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、０．５μＭのＡ８３－０１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１ｘＰＳＱ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、１０ｎＭのＧａｓｔｒｉｎ－Ｉ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１０μＭのＳＢ－２０２１９０（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、５０ｎｇ／ｍＬの組換えＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及び１ｘＮｏｒｍｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。

腸内オルガノイド分化腸内エンテロイドをオルガノイドに分化させるために、細胞を、ＨＥＬＰ又はＥＨＳマトリックス中の単一細胞としてカプセル化した後、成長培地中で１０日間維持し、ＰＢＳで短時間洗浄し、分化培地中に５日間培養した。分化培地は、１ｘＧｌｕｔａｍａｘ、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１ｘＮｏｒｍｏｃｉｎ、１００ｎｇ／ｍＬの組換えｎｏｇｇｉｎ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ， Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、１ｘＢ２７、１ｍＭのＮ－アセチルシステイン、５０ｎｇ／ｍＬの組換えＥＧＦ、１０ｎＭガストリン－Ｉ、１０μＭのＹ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤、５μＭのＤＡＰＴ及び５００ｎＭのＡ８３－０１を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であった。

ＥＬＰ－ヒドラジン合成。エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）を、前述のように調製した。簡潔に述べると、ＥＬＰ配列をｐＥＴ１５ｂプラスミドにクローニングし、Ｔ７プロモーターを使用してタンパク質発現を制御した。ＥＬＰをコードするプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をテリフィックブロス中で０．８のＯＤ_６００まで培養し、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して発現を誘導した。細菌にタンパク質を７時間発現させ、その後遠心分離によって採取し、１０個の緩衝液（１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中に懸濁し、３サイクルの凍結融解によって溶解した。細胞溶解物をデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）及び１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）で処理して、タンパク質分解を阻害した。ＥＬＰを、４℃及び３７℃での遠心分離工程の交互の配列によって精製し、続いて脱イオン水に対して４シフト（４８時間、１シフト当たり４Ｌの体積）の透析を行い、次いで－８０℃で凍結し、凍結乾燥した。ヒドラジン官能基でＥＬＰアミンを修飾するために、凍結乾燥ＥＬＰ（２１０ｍｇ）を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３ｍＬ中７重量％で完全に溶解し、次いで無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍＬで３．５重量％に希釈した。丸底フラスコ中で、３ｍＬの無水ＤＭＦを使用して、三Ｂｏｃ－ヒドラジノ酢酸（２当量：ＥＬＰアミン）、ヘキサフルオロホスフェートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ、２当量：ＥＬＰアミン）、及び４－メチルモルホリン（４．５当量：ＥＬＰアミン）を別々に溶解させ、この容器を５分間撹拌して、ＨＡＴＵが三Ｂｏｃ－ヒドラジノ酢酸上の遊離酸を活性化させることを可能にした。次に、丸底フラスコに撹拌しながらＥＬＰ溶液を滴下した。反応物を室温（ＲＴ）で一晩進行させた。生成物を氷冷エーテル中で沈殿させ、遠心分離し、乾燥させ、Ｂｏｃ保護ＥＬＰ－ヒドラジン中間体を得た。この中間体を^１Ｈ ＮＭＲによって分析し、修飾効率（５００Ｈｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．００（ｄ，２Ｈ），６．６２（ｄ，２Ｈ），１．４６（ｍ，２７Ｈ）を定量化した。修飾効率は、Ｂｏｃプロトン（δ１．５～１．３５）の積分シグナルを、ＥＬＰ上のチロシン残基の芳香族プロトン（δ７．００及び６．６２）と比較することによって決定した。Ｂｏｃ保護基を除去するために、ＥＬＰ－ヒドラジン中間体を２重量％で１：１のＤＣＭ：ＴＦＡ中に２．５％ｖ／ｖのトリイソプロピルシランで溶解し、通気丸底フラスコ中で室温で４時間撹拌した。生成物をエーテル中で沈殿させ、遠心分離し、乾燥させ、次いで脱イオン水に溶解させ、脱イオン水に対して３シフト（２４時間、１シフト当たり４Ｌの体積）透析し、凍結乾燥させた。

ヒアルロン酸修飾。１００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ，Ｌｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｈａｓｋａ，ＭＮ，ＵＳＡ）を、以下の全体的な手順によって、アルデヒド官能基を有するように修飾した。最初に、ＨＡ上のカルボン酸基をプロパルギアミンでアミド化し、ＨＡ－アルキン中間体を生成し、次いで、銅クリック化学を使用して、このアルキンを、アルデヒド官能基を含有するヘテロ二官能性小分子のアジド部分と反応させ、ＨＡ上にアルデヒド官能化したＨＡを生成した。

１２％の修飾のＨＡアルキン。ＨＡを２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ４．５）中に溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。本溶液に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、ＨＡ二量体単位に対して０．８当量）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、０．８当量）、及びプロパルギルアミン（０．８当量）を連続して添加した。ｐＨを６に調整した後、混合物を室温で４時間撹拌した。次いで、溶液を脱イオン水に対して６シフト（３日間、１シフト当たり４Ｌの体積）透析し、凍結乾燥させて白色粉末を得た。

３０％の修飾のＨＡアルキン。ヒアルロン酸ナトリウムをＭＥＳ緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ４．５）中に溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。この溶液に、ＮＨＳ（ＨＡ二量体単位に１．５当量）、ＥＤＣ（１．５当量）、及びプロパルギルアミン（１．０当量）を連続して添加した。ｐＨを６に調整した後、混合物を室温で４時間撹拌した。次いで、溶液を脱イオン水に対して６シフト（３日間、１シフト当たり４Ｌの体積）透析し、凍結乾燥させて白色粉末を得た。

次いで、ＨＡ－アルキンを以下の小分子、１によって修飾して、ＨＡ－ベンズアルデヒドを生成した。小分子を、以下のように生成した。

Ｎ－（２－アジドエチル）－４－ホルミルベンズアミド（１）を、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１８，１５４，２１３－２２２に公開された方法に従って合成した。わずかな修飾を加えて、以前に報告された手順に従って、分子１でＨＡを修飾した。ＨＡ－アルキン（３００ｍｇ）をＰＢＳ中に２重量％で溶解させ、続いて１（ＨＡ二量体単位への１当量）を添加した。最小量のＤＭＳＯを使用して、ＨＡ溶液に添加する前に１を溶解させた。次いで、溶液をＮ_２で３０分間泡立てた。硫酸銅（ＩＩ）五水和物（０．００４当量）及びアスコルビン酸ナトリウム（０．０６当量）を脱イオン水に溶解し、Ｎ_２で泡立て、ＨＡ溶液に添加した。室温で１日間撹拌した後、混合物を脱イオン水に対して３日間透析し、凍結乾燥した。ベンズアルデイド部分上の芳香族環のプロトンシグナルはトリアゾール基と重複するため、ＨＡ－ベンズアルデヒド上の修飾の程度は、ＨＡ骨格のＮ－アセチルグルコサミン上のメチル基の修飾に対するプロトンシグナル（δ＝７．５－８，５Ｈ）の積分によって定量化した（δ＝１．８，３Ｈ）。

ＨＡ－アルデヒド合成。ＨＡ－アルデヒドを、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００９，３０，２４９９－５０６に公開された方法に従って合成した。ＨＡをミリＱ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）水中で０．４ｗ／ｖ％で最初に溶解させ、室温で撹拌した。０．１Ｍの過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液を滴下し、反応物を暗所にて室温で一晩撹拌した。翌日、エチレングリコールを１時間添加して、任意の未反応の過ヨウ素酸塩を不活性化した。次いで、ミリＱ水に対して１０，０００ＭＷＣＯ膜を用いた透析によって、溶液を３日間精製し、新鮮な水を１２時間シフトで交換した。透析後、凍結乾燥を介して乾燥生成物を得た。

ポリエチレングリコール－ベンズアルデヒド（ＰＥＧ－ＢＺＡ）合成。ＰＥＧ－ＢＺＡを前述のように合成した。簡潔に述べると、４－ホルミル安息香酸（０．５２８ｇ、３．５２ｍｍｏｌ、１アミン当たり２．１当量、Ｓｉｇｍａ）を５ｍＬの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｓｉｇｍａ）に溶解し、ＨＡＴＵ（１．２１６ｇ、３．２ｍｍｏｌ、２当量、Ｓｉｇｍａ）及び４－メチルモルホリン（０．７９２ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ、４．５当量、Ｓｉｇｍａ）で活性化した。反応物を５分間撹拌した後、５ｍＬのＤＭＦ中に溶解させた４アーム１０ｋＤａのＰＥＧ－アミン（４ｇ、０．２ｍｍｏｌ；Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧｗｏｒｋｓ）を添加し、総反応体積１０ｍＬとした。反応物を室温で一晩撹拌した。最終ポリマーをエチルエーテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で沈殿させ、２２，０００ｒｃｆで２０分間遠心分離によってペレット化し、ミリＱ水中で再溶解させた。ＰＥＧ－ＢＺＡを、ミリＱ水に対して、４℃で３日間透析し（ＭＷＣＯ：３，５００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、透析水を１日２～３回交換した。ＰＥＧ－ＢＺＡを凍結乾燥し、－２０℃で保管した。ＰＥＧ－ＢＺＡの修飾は、^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）を使用して推定した。ＰＥＧ－ＢＺＡを、１０ｍｇ／ｍＬで重水（Ｄ_２Ｏ；Ｓｉｇｍａ）中で溶解した。δ＝９．９ｐｐｍ（１Ｈ、ｓ、アルデヒド）、δ＝７．９３及び７．８２ｐｐｍ（各々２Ｈ、ｄ、ベンゼン環）、δ＝３．５６（１アーム当たり２１７Ｈ、ｓ、ＰＥＧ）である。

操作されたヒドロゲルの形成及びレオロジー的特性決定。応力制御されたＡＲＧ２振動レオメータ（ＴＡ）で、ジオメトリとレオメータステージとの間に２８μｍのギャップを有する直径２０ｍｍの１°コーンプレート形状を使用して機械的試験を実施した。２つのヒドロゲル成分をＰＢＳ中２重量％で別々に溶解させ、氷上に保持した。まず、２５μＬのＨＡゲル成分をレオメータステージの中央にピペットし、次いで２５μＬのＥＬＰ成分をＨＡの液滴に直接ピペットし、ピペット先端を使用して成分を混合した。レオメータヘッドを速やかに下げ、ヒドロゲル成分を１Ｈｚ下、１％のひずみ振動剪断下で、室温で１０分間、及び３７℃で５分間反応させた。このプロトコルの直後に、０．１～１０Ｈｚの周波数掃引が１％のひずみで行われた。貯蔵及び損失係数は、これらの測定から１Ｈｚでの値とした。応力緩和測定のために、試料を室温で１０分間、１Ｈｚ下で３７℃で１０分間、１％の振動剪断下で、ｉｎ ｓｉｔｕでゲル化させ、次いで５％のステップひずみを適用した。応力緩和応答を少なくとも４５分間測定した。各材料のｔ_１／２は、応力が安定化した初期値の５０％まで減衰した時間として計算した。測定は少なくとも３回行われた。

操作されたマトリックス内の細胞カプセル化細胞含有ＨＥＬＰヒドロゲルを形成するために、ＥＬＰ及びＨＡゲル成分を別々に溶解して、ＰＢＳ中で２ｗ／ｖ％ストック溶液を形成した。解離した培養物を生成するために、上記のように細胞を継代させ、ペレットをＥＬＰ－ヒドラジン成分中に懸濁させ、氷上に保持した。３μＬの選択された修飾ＨＡ成分を６μＬのシリコーンモールド（直径４ｍｍ、高さ０．５ｍｍ、１２ｍｍの円形＃１カバーガラスに結合した血漿）の底部に添加した。次いで、３μＬのＥＬＰ細胞溶液を、修飾ＨＡの液滴中に直接ピペットでピペッティングした。次いで、ピペット先端を使用して、２つのヒドロゲル成分を混合し、ヒドロゲル内の細胞を均一に分散させた。ヒドロゲルを室温で１０分間、次いで３７℃で１０分間架橋させ、その後、７５０μＬの成長培地を添加した。ＥＬＰのみのゲルを形成するために、非修飾ＥＬＰタンパク質を、４℃で３．２５ｗ／ｖ％の濃度でＰＢＳ中に溶解させた。架橋剤テトラキス（ヒドロキシメチル）塩化ホスホニウム（ＴＨＰＣ）の５倍溶液を、ＰＢＳ中で１：７５０を希釈することによって調製した。細胞を上記のように継代させ、ペレットを非修飾ＥＬＰ成分中に再懸濁し、氷上に保持した。次いで、ＥＬＰ溶液をＴＨＰＣと４：１のＥＬＰ：ＴＨＰＣ体積比で混合し、ピペット吸引によりよく混合した後、ＥＬＰ－ＴＨＰＣ混合物をシリコーンガラスモールドにピペッティングした。ＥＬＰのみの培養物を、室温で１５分間、続いて３７℃で１５分間架橋させた。ＥＬＰ－ＰＥＧゲルについては、上記のようにエンテロイドを継代し、氷上で４ｗ／ｖ％のＥＬＰ－ヒドラジン中に単一細胞を懸濁した。次いで、３μＬの８ｗ／ｖ％のＰＥＧ－ＢＺＡ成分を、プレートを氷上に保持しながら、６μＬのシリコーンガラスモールドの底にピペッティングした。次いで、細胞を含む３μＬのＥＬＰ成分をＰＥＧ成分に添加し、ピペット先端と旋回させながら混合した。次いで、これらのゲルを４℃で１時間、続いて室温で１５分、続いて３７℃で１５分架橋させ、続いて７５０μＬの予め加温された成長培地を添加した。再埋め込み培養のために、ＥＨＳマトリックス中のエンテロイドを、氷上の５ｍＭのＥＤＴＡとともに４５～６０分間インキュベートして、マトリックスを完全に解離させ、次いで、５００×ｇで５分間遠心分離した。次いで、細胞を成長培地で洗浄し、５００×ｇで５分間再度遠心分離した。細胞播種密度をほぼ一定に保つために、単一細胞に解離していた同等の維持培養ウェルからの細胞数を常に実施し、再埋め込みされたエンテロイド播種密度を制御できるように、維持培養の同等の体積がほぼ同等の細胞数を有するという仮定を行った。増殖培地を３～４日ごとに交換した。全ての腸管エンテロイド実験において、小分子阻害剤Ｙ－２７６３２及びＣＨＩＲ－９９０２１は、ＥＨＳ維持培養物のように培地に含まれなかった。

ＨＥＬＰマトリックスにおけるエンテロイド継代。ＨＥＬＰ中のエンテロイドは１０～１４日ごとに継代した。ＨＥＬＰのエンテロイドを継代させるために、マトリックスは、まず、ＰＢＳ中に溶解した、ブタ膵臓由来の１００Ｕ／ｍＬエラスターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及びウシ睾丸由来の２５００Ｕ／ｍＬヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で分解した。培養培地を、シリコーン型の上面を含む培地ウェルから完全に吸引した。この上面を乾燥させると、ゲル体積に等しいエラスターゼ－ヒアルロニダーゼ混合物の液滴をゲルの上に添加した。ゲルを３７℃で１時間インキュベートして、完全なマトリックス分解を可能にした。次いで、酵素を希釈するために、過剰な成長培地中の１５ｍＬの円錐遠心分離管中に、エンテロイドをピペッティングした。エンテロイドを５００×ｇで５分間スピンダウンさせ、次いでペレットを成長培地で洗浄し、５００×ｇで５分間再度遠心分離した。次いで、上記のようにエンテロイドを継代し、上記のように単一細胞をＨＥＬＰにカプセル化した。

エンテロイドの形成及び成長分析。エンテロイド形成効率を分析するために、最大１００個のエンテロイドを、条件ごとに３つの別々のゲルについて、ゲルごとに分析した。ＥＨＳマトリックス又はＨＥＬＰ材料中でのカプセル化後４～６時間以内に、初期細胞培養は、単一細胞のみの存在を確実にするために、明視野顕微鏡下で観察される。３日ごとに、各ウェルの明視野画像を１０倍の倍率で撮影した。各時点での各ウェルについて、３つの視野がランダムに選択され、３つのｚスライスが各視野で撮影された。エンテロイド成長を分析するために、Ｗａｃｏｍ Ｉｎｔｕｏｓ錠剤を使用して、エンテロイドの輪郭をトレースし、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ）の粒子分析機能を使用してエンテロイドサイズを定量化した。以前に報告されたエンテロイド形態に基づいて、２０００μｍ^２のエンテロイド形成閾値を選択した。形態学的基準を、生存可能なエンテロイドを、ひどく変形したエンテロイドから分離するためにも適用した。この分析から、各ウェルについて、エンテロイドサイズ及び数を収集した。各画像のサイズ、及び３つのｚスライスについてのおよそ２５０μｍのｚ体積を使用して、各ウェルにおけるｚスタック体積あたりのオルガノイド数を外挿し、均一な細胞分布を仮定して、初期細胞播種密度と比較することによって、各ウェルのオルガノイド形成効率を計算した。次いで、各条件の形成効率を、３つのウェルの平均として計算した。平均エンテロイドサイズを計算するために、プールされた３つのウェルについて分布統計を生成した。外れ値は、以下のようにデータセットから除外された。
外れ値＞１．５＊Ｑ３－Ｑ１＋Ｑ３、ここで、Ｑ３はデータの第３四分位数、Ｑ１はデータの第１四分位数である。
次いで、条件ごとの３つのウェルの平均として、平均エンテロイド断面積を計算した。

免疫細胞化学。固定のための試料を調製するために、各ウェルを予め加温されたＰＢＳで短時間洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中０．１％のグルタルアルデヒドを含む７５０μＬの予め加温された４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を添加し、３７℃で３０～４５分間インキュベートすることによって固定した。次いで、固定溶液を吸引し、ＰＢＳによって３回５分間洗浄した。細胞をＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の０．２５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ－１００で３０分間透過化し、次いで、５重量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５％ｖ／ｖヤギ血清、及び０．５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ－１００でＰＢＳ中で３時間遮断した。２．５重量％のＢＳＡ、２．５％ｖ／ｖのヤギ血清、及び０．５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ－１００（抗体希釈溶液）を用いて、一次抗体希釈液をＰＢＳ中で調製し、一次インキュベーションを４℃で一晩実施した。抗体溶液を除去し、ＰＢＳＴ中で３回の５分間の洗浄を実施した。二次抗体を抗体希釈溶液中で１：５００で希釈し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、二次抗体溶液を除去し、ＰＢＳＴでそれぞれ３０分間２回洗浄した。ＤＡＰＩの１：２０００希釈及びファロジンの１：２５０希釈をＰＢＳＴ中で調製し、４５分間インキュベートし、続いてＰＢＳＴの５分間の３回の洗浄を行った。次いで、試料を過剰な液体から乾燥させ、長方形のカバーガラスの上にＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ封入剤の液滴上に反転させた。ＤＭＩ４０００ Ｂ共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で撮像する前に、室温で暗所で４８時間硬化させた。

定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析。ヒドロゲルをピペット先端を使用してシリコーン鋳型から除去し、ゲルを氷上で５００μＬのＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する１．５ｍＬのエッペンドルフ管に擦り取って移し、ＲＮＡを抽出した。次いで、溶液を超音波処理して、最適なＲＮＡ抽出のためのヒドロゲルの完全な分解を可能にした。フェノール－クロロホルム抽出を使用して、位相ロックゲル（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）でＲＮＡを単離した。一定量のＲＮＡ（０．１～１μｇ）を、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して逆転写した。次いで、５μＬのヌクレアーゼフリー水中の１μｇのｃＤＮＡを、１０μＬのＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と混合し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステムで実行した。本研究で使用するプライマーを表Ｓ２に列挙する。

フローサイトメトリー分析。上記の方法に従って、エンテロイドを単一細胞に解離させた（ＥＨＳマトリックスにおけるヒトオルガノイド継代及び維持培養並びにＨＥＬＰマトリックスにおけるエンテロイド継代を参照）。細胞を５００×ｇで５分間遠心分離してペレット化した。次いで、培地を各ペレットから除去し、細胞を、フルオロフォア共役一次抗体［ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ抗ヒトＣＤ４４抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＩｇＧ２Ｂアイソタイプ対照］を補充したＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］＋２％ｖ／ｖ ＦＢＳ［Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏ］＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン［Ｇｉｂｃｏ］）中に再懸濁した。抗体染色を、暗所にて４℃で３０分間実施した。染色後、ＦＡＣＳ緩衝液を使用して細胞を２回洗浄し、ＤＡＰＩ（１：１０，０００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させて、生細胞を選択した。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＦＡＣＳ Ｃｏｒｅ）でフローサイトメトリーを実施した。データを分析するために、ゲートは、セルダブレットを識別するために使用される高さ及び幅を有する前方及び側方散乱を使用して決定された。続いて、全てのマーカー分析及び集団頻度計算のために、生ＤＡＰＩ陰性細胞をゲート化した。

統計分析。この出版物の全ての有意性検定には、次の統計的有意性表現が使用される。＊、^＃＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。個々の平均を比較するために、図１ｇ及びＳ３からのデータを、Ｔｕｋｅｙ事後検定を用いた一元配置分散分析によって分析した。図２ｄからのデータを、非対両側スチューデントｔ検定を介して分析し、各材料の未分化条件と分化条件との間の遺伝子発現変化を比較した。図３ｄ、４ｃ、４ｆ、及びＳ４からのデータを、両側スチューデントのｔ検定を使用して分析した。個々の平均を比較するために、図４ｅ及び４ｈからのデータを、Ｔｕｋｅｙ事後検定を用いた二元配置分散分析によって分析した。図Ｓ７のデータは、Ｄｕｎｎの多重比較検定によるＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を使用して分析された。全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実施した。

参考文献：
１．Ｂａｒ－Ｅｐｈｒａｉｍ，Ｙ．Ｅ．，Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｋ． ＆ Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７７－０１９－０２４８－ｙ
２．Ｈｕｃｈ，Ｍ．，Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，Ｊ．Ａ．，Ｌｕｔｏｌｆ，Ｍ．Ｐ． ＆ Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ａｒｉａｓ，Ａ．Ｔｈｅ ｈｏｐｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｙｐｅ ｏｆ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｄｅｖ．１４４，９３８－９４１（２０１７）。
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７．Ｇｊｏｒｅｖｓｋｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５３９，５６０－５６４（２０１６）
８．Ｃｒｕｚ－Ａｃｕｎａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｃ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９，１３２６－１３３５（２０１７）
９．ＤｉＭａｒｃｏ，Ｒ．Ｌ．，Ｄｅｗｉ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｅｒｎａｌ，Ｇ．，Ｋｕｏ，Ｃ． ＆ Ｈｅｉｌｓｈｏｒｎ，Ｓ．Ｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｄｕｌｔ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．３，１３７６－１３８５（２０１５）
１０．Ｈｕｓｈｋａ，Ｅ．Ａ．，Ｙａｖｉｔｔ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｄｅｍｐｓｅｙ，Ｐ．Ｊ． ＆ Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｆｏｒｃｅｓ Ｄｉｒｅｃｔｓ Ｃｒｙｐｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｉｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ．Ｍａｔｅｒ．１９０１２１４，１－９（２０２０）
１１．Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｚｈｏｕ，Ｗ．，Ｒｏｈ，Ｔ．，Ｅｓｔｅｓ，Ｍ．Ｋ． ＆ Ｋａｐｌａｎ，Ｄ．Ｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｎｔｅｒｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｗｉｔｈ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２，１－２０（２０１７）
１２．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｇｏｒｄｉｌｌｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｆｕｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｎｔｅｒｏｉｄｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２５４，１２０１２５（２０２０）
１３．Ｒｅｚａｋｈａｎｉ，Ｓ．，Ｇｊｏｒｅｖｓｋｉ，Ｎ． ＆ Ｌｕｔｏｌｆ，Ｍ．Ｐ．Ｌｏｗ－Ｄｅｆｅｃｔ Ｔｈｉｏｌ－Ｍｉｃｈａｅｌ Ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ａｓ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ．Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２０００７６１，２０００７６１（２０２０）
１４．Ｇａｒａｙ，Ｒ．Ｐ．，Ｅｌ－Ｇｅｗｅｌｙ，Ｒ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｋ．，Ｇａｒｒａｔｔｙ，Ｇ． ＆ Ｒｉｃｈｅｔｔｅ，Ｐ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｎｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＥＧ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｇｅｎｔｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．９，１３１９－１３２３（２０１２）
１５．Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，Ｓｕｎ，Ｆ．，Ｌｉｕ，Ｓ． ＆ Ｊｉａｎｇ，Ｓ．Ａｎｔｉ－ＰＥＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１６）。ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２０１６．０６．０４０
１６．Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．Ｋ．，Ｆｏｗｌｅ，Ｗ．Ｈ．，Ｂａｒａｂｉｎｏ，Ｇ．Ａ． ＆ Ｃａｒｒｉｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏ－ｗｅｌｌ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ ｏｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃａｃｏ－２ ｃｅｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３０，６８２５－６８３４（２００９）
１７．Ｂｅｎｏｉｔ，Ｙ．Ｄ．，Ｇｒｏｕｌｘ，Ｊ．－Ｆ．，Ｇａｇｎｅ，Ｄ． ＆ Ｂｅａｕｌｉｅｕ，Ｊ．－Ｆ．ＲＧＤ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ－Ｍａｔｒｉｘ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｃｒｙｐｔ．Ｊ．Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．２０１２，１－１０（２０１２）
１８．Ｇｒａｃｚ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｅｆ Ｒｅｐｏｒｔ：ＣＤ２４ ａｎｄ ＣＤ４４ ｍａｒｋ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３１，２０２４－２０３０（２０１３）
１９．Ｉｔｚｋｏｖｉｔｚ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｏｆ ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４，１０６－１１４（２０１２）
２０．Ｒｉｅｈｌ，Ｔ．Ｅ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｌ． ＆ Ｓｔｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＴＬＲ４ ａｎｄ ＣＯＸ－２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．ＡＪＰ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０２，Ｇ３０９－Ｇ３１６（２０１２）
２１．Ｆｅｖｒ，Ｔ．，Ｒｏｂｉｎｅ，Ｓ．，Ｌｏｕｖａｒｄ，Ｄ． ＆ Ｈｕｅｌｓｋｅｎ，Ｊ．Ｗｎｔ／ －Ｃａｔｅｎｉｎ Ｉｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２７，７５５１－７５５９（２００７）
２２．Ｄｅ Ｌａ Ｍｏｔｔｅ，Ｃ．Ａ． ＆ Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｓ．Ｐ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５，（２０１５）
２３．Ｋｉｍ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＬＧＡ－ ａｎｄ／ｏｒ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｕｂｍｕｃｏｓａ－ｂａｓｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２８，５１３７－５１４３（２００７）
２４．Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ Ａｄａｐｔａｂｌｅ Ｅｌａｓｔｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ（ＥＬＰ－ＨＡ） Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｆｏｒ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２７，（２０１７）
２５．Ｌｏｕ，Ｊ．，Ｓｔｏｗｅｒｓ，Ｒ．，Ｎａｍ，Ｓ．，Ｘｉａ，Ｙ． ＆ Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｏ．Ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｌａｘｉｎｇ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ－ｃｏｌｌａｇｅｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｃｅｌｌ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ，ｆｉｂｅｒ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ａｎｄ ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ３Ｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １５４，２１３－２２２（２０１８）
２６．Ｌｏｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃ Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｗｉｔｈ Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ Ｈｉｇｈ Ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｃａｔａｌｙｓｔ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．３０，１－６（２０１８）
２７．ＭｃＫｉｎｎｏｎ，Ｄ．Ｄ．，Ｄｏｍａｉｌｌｅ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｈａ，Ｊ．Ｎ． ＆ Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｎｄ ｃｙｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｄａｐｔａｂｌｅ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ａｓ ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ ３ｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２６，８６５－８７２（２０１４）
２８．Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｗｉｔｈ ｔｕｎａｂｌｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．１５，３２６－３３３（２０１５）
２９．Ｓｔｒａｌｅｙ，Ｋ．Ｓ． ＆ Ｈｅｉｌｓｈｏｒｎ，Ｓ．Ｃ．Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ５，１１４（２００９）
３０．Ｒｏｓａｌｅｓ，Ａ．Ｍ． ＆ Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．Ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｔｏ ｃａｐｔｕｒｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒ．１，１－１６（２０１６）
３１．Ｗａｎｇ，Ｈ． ＆ Ｈｅｉｌｓｈｏｒｎ，Ｓ．Ｃ．Ａｄａｐｔａｂｌｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｌｉｎｋａｇｅｓ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２７，３７１７－３７３６（２０１５）
３２．Ｂｏｋｅｌ，Ｃ． ＆ Ｂｒｏｗｎ，Ｎ．Ｈ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｍｏｖｉｎｇ ｏｎ，ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ，ａｎｄ ｓｔｉｃｋｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ（２００２）。ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１５３４－５８０７（０２）００２６５－４
３３．Ｓｈｅｅｔｚ，Ｍ．Ｐ．，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，Ｄ．Ｐ． ＆ Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，Ｃ．Ｇ．Ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｃｅ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ－ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，５１－５４（１９９８）
３４．Ｒｏｃａ－Ｃｕｓａｃｈｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｏｒｃｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｂｙ α－ａｃｔｉｎｉｎ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０，（２０１３）
３５．Ｔａｎ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｆｏｒｃｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｔ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｅｌｌ－ｍａｔｒｉｘ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｂｏｎｄｓ．Ｓｃｉ．Ａｄｖ．６，１－１２（２０２０）
３６．Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｗｉｔｈ ｔｕｎａｂｌｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．１５，３２６－３３４（２０１６）
３７．ＭｃＫｉｎｎｏｎ，Ｄ．Ｄ．，Ｄｏｍａｉｌｌｅ，Ｄ．Ｗ．，Ｃｈａ，Ｊ．Ｎ． ＆ Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．Ｂｉｓ－ａｌｉｐｈａｔｉｃ ｈｙｄｒａｚｏｎｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒｍ ｍｏｓｔ ｒａｐｉｄｌｙ ａｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐＨ：Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．（２０１４）。

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６３／１１０，６６７号の利益及び優先権を主張し、その開示全体が本明細書に記載されている。

テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０２１年１１月３日に作成され、２１０００バイトのサイズを有するテキストファイル（ＳＴＡＮ－１７６３ＷＯ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ）で本明細書とともに提供される。テキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に
組み込まれる。

Claims (24)

1. ２成分ヒドロゲルマトリックスシステムであって、
   定義された比率の、ペンダント反応基アルデヒドを含むように修飾されたヒアルロン酸（ＨＡ）及び／又はペンダント反応基ベンズアルデヒドを含むように修飾されたＨＡを含む第１の成分と、
   ペンダント反応基ヒドラジンを含むように修飾されたエラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）を含む第２の成分と
   を含み、
   前記第１の成分と前記第２の成分との間に架橋結合が形成され、混合時にヒドロゲルが生成される、
   ２成分ヒドロゲルマトリックスシステム。
2. マトリックス剛性が、独立して、前記第１の成分上に存在する反応基の前記第２の成分上に存在する反応基に対する比率を変化させることによって調整される、請求項１に記載のシステム。
3. 反応基の比率が、ＨＡ上の反応基の数を特定すること、ＥＬＰ上の反応基の数を特定すること、及びＨＡ：ＥＬＰの比率を特定することのうちの１つ以上によって変化する、請求項１又は２に記載のシステム。
4. マトリックス応力緩和速度が、独立して、前記第１の成分中のペンダントアルデヒドを含むように修飾されたヒアルロン酸とペンダントベンズアルデヒドを含むように修飾されたヒアルロン酸との比率を変化させることによって調整される、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
5. ペンダントアルデヒドを含むように修飾されたヒアルロン酸と、ペンダントベンズアルデヒドを含むように修飾されたヒアルロン酸との比率が、１００：０～０：１００である、請求項１～４のいずれか一項に記載のシステム。
6. 前記ＥＬＰが、１～７個のエラスチン様モチーフを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のシステム。
7. 前記エラスチン様モチーフが、配列番号２３、２４、及び２５から選択される、請求項６に記載のシステム。
8. 前記ＥＬＰが、１つ以上の細胞接着配列モチーフ、又はスクランブルＲＧＤ若しくはＲＧＤ欠失を含む、１５～４５アミノ酸長の細胞接着ドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
9. 前記細胞接着配列モチーフが、ＲＧＤ又は配列番号３～配列番号９のうちのいずれかから選択される、請求項８に記載のシステム。
10. 前記ＥＬＰが、配列番号１及び配列番号２の一方又は両方を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のシステム。
11. 前記ヒドロゲルの細胞接着ペプチド濃度が、細胞接着モチーフを含むＥＬＰの細胞接着モチーフを欠くＥＬＰに対する比率を変化させることによって調整される、請求項８～１０のいずれか一項に記載のシステム。
12. 細胞接着モチーフを含むＥＬＰの細胞接着モチーフを欠くＥＬＰに対する比率が、１００：０～０：１００である、請求項１１に記載のシステム。
13. 前記ＥＬＰが、３～２０個のヒドラジン基を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のシステム。
14. 前記ヒドロゲルが、最大約１．５ｍＭのＲＧＤを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のシステム。
15. 前記ヒドロゲルが、シリンジ又はカテーテルを介して押し出すことができる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のシステム。
16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載のシステムから形成される、ヒドロゲル。
17. 請求項１６に記載のヒドロゲルを含む、細胞培養培地。
18. 哺乳類細胞を培養する方法であって、
    哺乳類細胞の開始集団を請求項１６に記載のヒドロゲル中にカプセル化することと、
    カプセル化された前記哺乳類細胞を好適な培地中に維持することと
    を含む、方法。
19. 前記哺乳類細胞の開始集団が、単一細胞懸濁液を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記哺乳類細胞の開始集団が、幹細胞を含む、請求項１８に記載の方法。
21. 前記哺乳類細胞の開始集団が、組織移植片を含む、請求項１８に記載の方法。
22. 前記哺乳類細胞の開始集団が、培養物中でオルガノイドに分化する、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記哺乳類細胞の開始集団が、腸細胞を含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記ヒドロゲルを酵素的に分解することによって、カプセル化細胞が継代する、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。

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