JP2023548508A - ヒドロゲル組成物及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
2成分ヒドロゲルマトリックスシステムが提供され、このシステムは、三次元培養システムを含むが、これらに限定されない、様々な細胞成長使用において有用である。成分は、修飾ヒアルロン酸(HA)、及び修飾エラスチン様タンパク質(ELP)を含む。例えば、マトリックス剛性、マトリックス応力緩和速度、及び細胞接着リガンド濃度を含むHELPの変数を、独立してかつ定量的に指定することができる。
Description
患者の生検の一次組織又は多能性細胞に由来するヒトオルガノイドを含むヒト組織は、個別化医療及び疾患の前臨床モデルを改革する可能性がある。しかしながら、合成マトリックス中のヒト患者由来オルガノイドは、しばしば、スフェロイド形成工程、例えば、脱細胞化エンゲルブレスホルムスワム(Engelbreth-Holm-Swarm)(EHS)マトリックス、又はフィーダー細胞との共培養のいずれかを必要とする。
患者由来のオルガノイドのための操作マトリックスを開発する最近の研究は、合成マトリックス骨格としてポリエチレングリコール(PEG)に依存しているが、PEGは免疫系と相互作用し、抗体形成を誘導することが知られている。
動物由来の生成物又は合成PEGを含まない、再現性がある、生分解性の最小限のマトリックスは、臨床翻訳のために非常に関心があるものであり、本明細書の開示によって対処される。
三次元培養環境の提供を含むが、これらに限定されない、細胞及び組織培養のための様々な利点を有する、2成分ヒドロゲルマトリックスシステムが記載される。成分は、(1)化学的に修飾されたヒアルロン酸(HA)、及び(2)化学的に修飾されたエラスチン様タンパク質(ELP)を含む。2つの修飾バイオポリマーを一緒に混合することにより、ヒドラゾン結合の形成が誘導され、本明細書で「HELP」と称されるヒドロゲルネットワークをもたらす。HAとELPとの比率の選択、及びこれらの成分のバリアントの比率は、例えば、マトリックス剛性、マトリックス応力緩和速度、並びに細胞接着リガンド濃度及び同一性を含む、HELPの重要な変数の調整を可能にする。これらの変数は、独立してかつ定量的に定義することができる。
ヒアルロン酸成分は、ペンダントベンズアルデヒド又はアルデヒド側基を含むように化学的に修飾される。最終的なヒドロゲル配合物中のこれら2つの化学基の比は、応力緩和変数を制御する。天然の細胞外マトリックス及びEHSマトリックスの主な特徴は、それらの物理的架橋による応力緩和を受ける能力であり、これは容易にリモデリングすることができる。ペンダントアルデヒド基で修飾されたヒアルロン酸のより大きな割合を含む組成物は、ゲルの平均運動交換速度を増加させ、より速い応力緩和速度をもたらす。ペンダントベンズアルデヒド基で修飾されたヒアルロン酸の割合が高いほど、ゲルの平均運動交換速度が低下し、より遅い応力緩和速度をもたらす。応力緩和速度への修飾は、マトリックスリガンド組成物及び剛性とは無関係に達成され得る。HA-ベンズアルデヒド対HA-アルデヒドの比は、例えば、約95:5、90:10、75:25、50:50、25:75などの比で、通常約100:0~0:100の範囲で、目的のヒドロゲルに対して事前に選択されてもよい。
ELP成分は、任意選択で、細胞接着配列を散在させた、エラスチン様配列の組換え配列を含む。化学的に修飾されたHAと架橋するために、ELPは、ペンダントヒドラジン基を含むように化学的に修飾される。ELP内の任意の細胞接着配列は、インテグリン結合、フィブロネクチン系、伸長RGD配列、スクランブルRGD配列、コラーゲンI型に由来する細胞接着配列、例えば(配列番号3)DGEA、テナシンに由来する細胞接着配列、例えば(配列番号4)PLAEIDGIELTY、(配列番号5)VFDNFVLKなど、ラミニンに由来する細胞接着配列、例えば(配列番号6)IKVAV、(配列番号7)YIGSRなど、カドヘリンに由来する細胞接着配列、例えば(配列番号8)HAVDI、(配列番号9)HAVDIHAVDIなどから選択されてよい。例えば、配列番号1及び配列番号2は、それぞれ、RGD配列及びスクランブルRGD配列を有するELPである。
ヒドロゲルの細胞接着配列濃度は、上記に開示されるように、RGDモチーフを含むELPと、RGDモチーフを欠く、又はスクランブル若しくは非RGD細胞接着モチーフを含むELPとの比を調整することによって変化させることができる。この比率は、通常約100:0~0:100、例えば約75:25、50:50、25:75、10:90の範囲で、目的のヒドロゲルに対して予め選択されてよい。いくつかの用途では、HELPヒドロゲルは、約0.25mMのRGD~約1.5mMのRGD、例えば、約0.25mM、0.5mM、0.75mM、1mM、1.25mM、1.5mMを含む。0.75mMを超えるものは、腸管オルガノイドの培養に好ましい。
マトリックス剛性は、ヒドラジン対アルデヒド及びベンズアルデヒド反応性基の濃度及び比によって決定され、ここで、約1:1の比は、最大の架橋を提供する。比は、例えば、約1:3、約1:2、約1.5:1、約1.25:1、約1:1、約1:1.25、約1:1.5、約1:2、約1:3などで変化し得る。細胞培養目的のために、好ましいゲルは、約1kPa、例えば、約750~1250PaのG’を有し得る。ヒドラジン対アルデヒド又はベンズアルデヒド基の比は、3つの変数:(1)ELP分子当たりのヒドラジン基の数、(2)HA分子当たりのアルデヒド又はベンズアルデヒド基の数、及び(3)ELP及びHAのブレンドによって変更することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているヒドロゲルマトリックスは、インビトロでの細胞の培養において使用される。いくつかの実施形態では、調整可能なHELPヒドロゲルのマトリックスを含む3D培養環境が提供される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞をインビトロで培養する方法が提供され、方法は、目的の細胞集団を、本明細書に記載のヒドロゲル中に懸濁させること、及び埋め込まれた細胞を好適な培地中で培養することからなり、これは、初代細胞、細胞株、インビトロ再プログラム細胞、遺伝子組換え細胞、初代組織移植片などであり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト患者からの初代細胞である。いくつかの実施形態では、培養システムは、ポリエチレングリコールを含まない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、ヒドロゲルマトリックス中で培養される細胞は、目的の組織の細胞に分化する。例えば、腸管幹細胞又は腸管移植片は、腸管オルガノイドなどに分化させることができる。細胞は、更に、マトリックス解離のプロセスによって継代され得る。マトリックス解離において、HELPマトリックスは、エラスターゼ及びヒアルロニダーゼを使用して酵素的に分解され得る。形成されたオルガノイドは、単一細胞又は小細胞凝集体、例えば、トリプシンと更に分離され得るか、又は無傷で継代され得る。単一細胞又は小細胞凝集体の新鮮なHELPマトリックスへのカプセル化は、形態の目に見える変化なしに、少なくとも12の継代の連続的なオルガノイド形成を提供する。代替的には、細胞をスフェロイドに予め形成し、次いでHELPマトリックス内にカプセル化することができる。
組織としては、腸組織、肺組織、胃組織、膵臓組織、膀胱組織、肝臓組織、骨髄間質、筋肉組織、腎臓組織、脳組織などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の培養された移植片は、一定期間、例えば、1週間、2週間、3週間、4週間、又はそれ以上、培養中で連続的に増殖させることができる。本発明の方法によって培養された哺乳類組織移植片は、インビボでの組織成長の特徴を要約することができる。特徴としては、上皮組織、粘膜下組織、及び間質環境を含む、増殖を伴う長期の組織拡張、多系統分化、並びに細胞及び組織の超微細構造の再現が挙げられるが、これらに限定されない。培養システムは、正常又は罹患した哺乳類組織において見出される様々な細胞の成長を提供するが、培養物は、また、選択のための細胞の生成において有用であり、組織特異的幹細胞を含む任意の所与の組織について、単一系統の精製された集団又は濃縮された集団を提供する。これらの方法によって培養されたオルガノイドは、組織工学、疾患モデリング、及び創薬などの多くの用途での使用が見出される。
培養細胞は、培養期間の前又は中に実験的に修飾され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ウイルス又は細菌病原体への曝露によって修飾される。他の実施形態では、細胞は、遺伝子発現のパターンを変化させることによって、例えば、多能性を誘導するか、又はそうでなければ分化可能性を変化させるためのリプログラミング因子を提供することによって、又は細胞のがん腫へのがん原性変換を提供するがんドライバーなどを導入することによって修飾される。実験的に修飾された細胞は、治療薬の効果の調査、腫瘍療法、分化に対する効果などに有用である。
集団、例えば、複数の細胞型の複雑な集団、選別、培養などによって複雑な集団から単離された精製された細胞の集団などで、幹細胞電位を有する細胞の存在について、細胞をスクリーニングするための方法が提供される。この方法は、検出可能に標識された候補細胞を、本発明の組織移植片と共培養することを伴う。幹細胞の可能性を有する候補細胞は、基底レベルを上回る培養された移植片の増殖の増加、及び標識された候補細胞との組織特異的幹細胞の存在を示す多系統分化マーカーの共局在化によって検出される。移植片と共培養された候補細胞の幹細胞特性は、インビボ移植などを介して、長期の再構成活性を決定することによって更にアッセイされる。
本発明の別の態様では、本発明の移植培養物に対する毒性をスクリーニングすることによって、異なる組織に対する細胞毒性のための薬剤のインビトロスクリーニングのための方法が提供される。更に別の実施形態では、本発明の移植培養物による薬物の吸収を評価することによって、異なる組織による薬物吸収を評価する方法が提供される。
本発明の別の態様では、マトリックスは、シリンジ針又はカテーテルを通して押し出される。押し出し後、HELPマトリックスはゲル相材料を改質する。HELPマトリックス内にカプセル化された細胞を、3Dバイオプリンティング用のバイオインク、注射可能な再生医療療法用のバイオインクとして使用するために、この方法で押し出すことができる。2000Pa未満の破断応力を有する剪断薄化材料は、手の力によって注射可能である。破壊応力は、3つの変数:(1)通常100kDa未満のMWでのHAの分子量、(2)ヒドラゾン結合の速度論(この目的のためにヒドラジン-ベンズアルデヒド反応の遅い交換速度論よりもヒドラジン-アルデヒドの速い交換速度論が好まれる)、並びに(3)通常、最終濃度がELPの約0.5~2重量%、及びHAの約0.5~2重量%である全体のポリマー濃度を変更することによって調整することができる。
本開示の実施形態について更に記載する前に、本開示は、記載の特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって無論変動し得ることが理解されるものである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみについて記載することを目的とし、本開示の範囲が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図するものではないことが理解されるものである。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料も、また、本開示の実施形態の実践又は試験にも使用され得る。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「and」、及び「the」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「化合物」への参照は、単一の化合物だけでなく、2つ以上の化合物の組み合わせも含み、「置換基」への参照は、単一の置換基並びに2つ以上の置換基などを含む。
本発明の説明及び特許請求の範囲において、特定の用語は、以下に記載される定義に従って使用される。本明細書で提供される定義は、互いに排他的であることを意図するものではないことが理解される。したがって、いくつかの化学部分は、2つ以上の用語の定義内に含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「例えば(for example)」、「例えば(for instance)」、「など」、又は「含む」という語句は、より一般的な主題を更に明確にする例を導入することを意味する。これらの例は、本開示を理解するための補助としてのみ提供され、いかなる様式においても限定を意味するものではない。
「ヒドロゲル」という用語は、従来の意味で、溶媒(例えば、水)を吸収し、測定可能な溶解なしに膨張を受け、可逆的な変形が可能な三次元ネットワークを維持する材料を指すために使用される。本明細書で言及される「膨張」は、水分子がヒドロゲルの内部体積全体に拡散するときのヒドロゲル構造の等方性膨張を意味する。本明細書に開示されるコポリマーヒドロゲルの特性は、以下でより詳細に記載されるように、各成分の量、各成分の比率、又は特定の成分の密度を変化させることによって、所望のように調節され得る。「ヒドロゲル」という用語は、乾燥及び水和(例えば、溶媒膨潤)ヒドロゲルの両方を含み得る。
本発明のいくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、代謝活性細胞、例えば、分化細胞などの成長を含む、細胞成長のための足場を提供する。細胞は、インビトロで、例えば、1つ又は複数の細胞型の培養物で成長されてもよい。細胞は、また、インビボで、例えば、ヒドロゲルが再生細胞成長のための基質を提供する場合に成長されてもよい。本発明のヒドロゲルは、長期構造安定性のための適切な機械的強度を提供する。
エラスチン様タンパク質(ELP)は、任意選択で細胞接着配列を散在させたエラスチン様配列の組換え配列を含む。化学的に修飾されたHAと架橋するために、ELPは、ペンダントヒドラジン基を含むように化学的に修飾される。ELP内の任意の細胞接着配列は、細胞接着に関与するモチーフを含み、インテグリン結合、フィブロネクチン系、伸長RGD配列、スクランブルRGD配列、コラーゲンI型に由来する細胞接着配列、例えば(配列番号3)DGEA、テナシンに由来する細胞接着配列、例えば(配列番号4)PLAEIDGIELTY、(配列番号5)VFDNFVLKなど、ラミニンに由来する細胞接着配列、例えば(配列番号6)IKVAV、(配列番号7)YIGSRなど、カドヘリンに由来する細胞接着配列、例えば(配列番号8)HAVDI、(配列番号9)HAVDIHAVDIなどから選択されてよい。
操作されたエラスチン様タンパク質の細胞接着ドメインは、細胞表面受容体と相互作用することが知られている代替ペプチド配列を含むように設計され得る。これらの配列は、天然の細胞外マトリックスタンパク質(例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、テナシン-C)に由来するペプチド、又は細胞接着受容体(例えば、N-カドヘリン)に由来するペプチドを含むことができる(表1)。エラスチン様領域配列とともに細胞接着ペプチド配列を選択することは、操作されたタンパク質の全体的な疎水性を定義し、したがって、より低い臨界溶液温度(LCST)挙動を制御する。
いくつかの実施形態では、ELPは、以下の構造を含む。
細胞接着ドメインは、約15~約45アミノ酸長であり、RGD、スクランブルRGD、RGDなし、又は配列番号3~配列番号9のうちのいずれかから選択され得る、1つ以上の細胞接着配列モチーフを含む。配列番号10~19及び22は、例示的なものである。
リンカー配列は、任意選択で、細胞接着配列モチーフに隣接し、ペプチドリンカーは、約5~20、5~15、5~10又は5~9アミノ酸長であり得る。例示的なリンカーとしては、Gly-Gly、Gly-Ala-Gly、Gly-Pro-Ala、Gly-Gly-Gly-Ser(配列番号34)などの少なくとも2つのアミノ酸残基を有する直鎖ペプチドが挙げられる。好適な直鎖ペプチドとしては、ポリグリシン、ポリセリン、ポリプロリン、ポリアラニン、並びにアラニル及び/又はセリニル及び/又はプロリニル及び/又はグリシルアミノ酸残基からなるオリゴペプチドが挙げられる。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列GSTSGSGKSSEGKG(配列番号35)、又は(GGGGS)n(配列番号36)を含み、式中、nは、1、2、3、4、5などであるが、多くのそのようなリンカーは、当該技術分野で既知であり、使用され、この目的に役立ち得る。
エラスチン様ドメインは、(配列番号23)VPGIG、(配列番号24)VPGKG、(配列番号25)VPGYGを含むが、これらに限定されない、エラスチン様モチーフからなる。配列番号23、24、及び25のうちの1つ以上は、タンパク質中に存在することができる。いくつかの実施形態では、モチーフの数は、1~7、1~6、2~5、3~5であり、約5つのモチーフであり得る。例示的なドメイン配列は、例えば、配列番号20及び21に提供される。例としては、配列番号1、LQ(LDASTVYAVGRGDSPASSA[(VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2]3)4、及び配列番号2、LQ(LDASTVYAVGRDGSPASSA[(VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2]3)4が挙げられるが、これらに限定されない。
ELPタンパク質は、ペンダントヒドラジン基を含むように化学的に修飾され、約3~約20個、約5~約18個、約10~約14個のヒドラジン基を含んでよい。標準的なバイオ抱合化学を使用して、リジン、システイン、又はチロシンアミノ酸のいずれかの部位にペンダントヒドラジンを付着させることができる。
ヒアルロン酸は、結合組織、上皮組織、及び神経組織全体に広く分布する陰イオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロン酸は、D-グルクロン酸とN-アセチル-D-グルコサミンとで構成される二糖類のポリマーであり、交互にβ-(1→4)及びβ-(1→3)グリコシド結合を介して連結されている。ヒアルロン酸は、最大25,000回の二糖繰り返しが可能である。ヒアルロン酸のポリマーは、約20kDa~約1.5MDaのサイズ、約20Kda~のサイズの範囲であり得る。
ヒアルロン酸は、ペンダントベンズアルデヒド又はアルデヒド側基を含むように化学的に修飾される。HAは、通常、利用可能な反応性基の約5%~約30%で修飾され、約7%~約20%、約10%~約15%であり得、約12%で修飾され得る。
アルデヒド官能基の場合、HA上のカルボン酸基をプロパルギアミンでアミド化し、HA-アルキン中間体を生成し、次いで、銅クリック化学を使用して、このアルキンを、アルデヒド官能基を含有するヘテロ二官能性小分子のアジド部分とHA上で反応させ、アルデヒドで官能化されたHAを生成する。
ベンズアルデヒド修飾は、例えば、約3%~約30%の所望の濃度でアルキン基を含むようにHAを最初に修飾することによって達成され得る。次いで、HA-アルキンをN-(2-アジドエチル)-4-ホルミルベンズアミドで修飾して、HA-ベンズアルデヒドを生成する。
「活性剤」、「アンタゴニスト」、「阻害剤」、「薬物」、及び「薬理学的に活性な薬剤」という用語は、生物(ヒト又は動物)に投与されると、局所及び/又は全身作用によって所望の薬理学的及び/又は生理学的効果を誘導する化学物質又は化合物を指すために本明細書で互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」などの用語は、ウイルス力価の低減などの所望の薬理学的及び/又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患若しくはその症状を完全に又は部分的に予防するという点では予防的であり得、かつ/あるいは疾患及び/若しくは疾患に起因する有害作用に対する部分的又は完全な治癒という点では治療的であり得る。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、(a)(例えば、原発性疾患と関連し得るか、又はそれによって引き起こされ得る疾患を含む)疾患の素因を受け得るが、まだ疾患を有すると診断されていない対象において疾患又は疾患の症状が生じるのを防止すること、(b)疾患を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること、及び(c)疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすこと(例えば、ウイルス力価の低減)を含む。
「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、限定されないが、サル及びヒトを含むヒト及び非ヒト霊長類、ラット及びマウスを含むげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、トリなどを含む動物を指す。「哺乳類」は、任意の哺乳類種の1つ又は複数のメンバーを意味し、例として、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、げっ歯類など、並びに霊長類、例えば非ヒト霊長類及びヒトを含む。非ヒト動物モデル、例えば、哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ネズミ科、ウサギ目などが、実験的調査に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「決定する」、「測定する」、「評価する」、及び「アッセイする」という用語は、互換的に使用され、定量的及び定性的決定の両方を含む。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、コードされた及びコードされていないアミノ酸、化学的若しくは生化学的に修飾された、又は誘導されたアミノ酸、並びに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。この用語は、異種のアミノ酸配列を有する融合タンパク質、N末端メチオニン残基を有する、又は有さない、異種及び天然のリーダー配列を有する融合、免疫学的にタグ付けされたタンパク質、検出可能な融合パートナー、例えば、蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む、融合パートナーを有する融合タンパク質などを含むが、これらに限定されない、融合タンパク質を含む。
「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか、又はそのアナログの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知又は未知の任意の機能を実行し得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、制御領域、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。核酸分子は、直鎖状であっても環状であってもよい。
「治療有効量」又は「有効量」は、疾患、状態、又は障害を治療するために哺乳類又は他の対象に投与されると、疾患、状態、又は障害に対するそのような治療に効果を与えるために十分である化合物の量を意味する。「治療有効量」は、化合物、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重などに応じて変動する。
本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒト及び動物対象のための単位投薬量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位が、薬学的に許容される希釈剤、担体、又はビヒクルと関連して所望の効果を生じるために十分な量で計算された所定の量の化合物を含有する。単位剤形の仕様は、使用される特定の化合物及び達成される効果、並びに宿主内の各化合物に関連する薬力学に依存する。
「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される希釈剤」、「薬学的に許容される担体」、及び「薬学的に許容されるアジュバント」は、薬学的組成物の調製において有用であり、一般に安全であり、非毒性であり、生物学的にもその他においても望ましい、賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバントを意味し、獣医学的使用並びにヒト薬学的使用において許容される賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバントを含む。本明細書及び特許請求の範囲で使用される「薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバント」は、1つ及び2つ以上のそのような賦形剤、希釈剤、担体、及びアジュバントの両方を含む。
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」は、哺乳類、特にヒトなどの対象への投与に好適な組成物を包含することを意味する。概して、「医薬組成物」は、無菌であり、好ましくは、対象内で望ましくない応答を誘発することが可能な汚染物質を含まない(例えば、医薬組成物中の化合物は、医薬グレードである)。薬学的組成物は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内、筋肉内、皮下などを含むいくつかの異なる投与経路を介して、治療を必要とする対象又は患者への投与のために設計され得る。
「体細胞」という用語は、生物内の全ての種類の細胞を生じさせることができない、すなわち多能性ではない、生物内の任意の細胞を包含する。言い換えれば、体細胞は、体の3つの胚葉全て、すなわち外胚葉、中胚葉及び内胚葉の細胞を自然に生成しないように十分に分化した細胞である。
「多能性の」又は「多能性」という用語は、適切な条件下で、3つの胚葉(内胚葉、中胚葉、及び外胚葉)からの細胞系統に関連する特性を集合的に示す細胞型に分化することができる子孫を生じさせる能力を有する細胞を指す。「幹細胞」は、有糸細胞分裂による自己再生能力及び組織又は器官に分化する可能性を特徴とする細胞である。哺乳類幹細胞では、胚性幹細胞と体性幹細胞とが区別され得る。胚性幹細胞、胚性生殖細胞、及び人工多能性細胞を含む多能性幹細胞は、出生前、出生後、又は成体生物の組織に寄与することができる。
「一次細胞」、「一次細胞株」、及び「一次培養物」という用語は、本明細書で互換的に使用され、対象に由来し、培養物の限られた数の継代、すなわち、分裂のためにインビトロで成長させられた細胞及び細胞培養物を指す。例えば、一次培養は、0回、1回、2回、4回、5回、10回、又は15回継代したが、危機段階を継代するために十分な回数ではない可能性がある培養である。典型的には、本発明の一次細胞株は、インビトロで10未満の継代で維持される。
主題の細胞は、ヒト、霊長類、家畜及び農場動物、並びにイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどの動物園の動物、実験室の動物、又はペット動物を含む、任意の哺乳類に由来してもよい。それらは、確立された細胞株であり得るか、又はそれらは、一次細胞であり得、「一次細胞」、「一次細胞株」、及び「一次培養物」は、本明細書で互換的に使用され、対象に由来し、限られた数の継代のためにインビトロで成長させられた細胞及び細胞培養物を指す。
主題の細胞は、新生児、幼児又は成人からであり得る新鮮な又は凍結した細胞から、及び皮膚、筋肉、骨髄、末梢血、臍帯血、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃、脂肪、及び他の分化した組織を含む組織から単離され得る。組織は、生のドナーからの生検又は非泳動によって、又は死後約48時間以内に死んだ又は瀕死のドナーから、又は死後約12時間以内に凍結され、通常は約液体窒素温度(-190℃)で無期限に、約-20℃未満に維持された新鮮に凍結された組織を得ることができる。組織からの細胞の単離のために、適切な溶液が、分散又は懸濁に使用され得る。かかる溶液は、一般に、低濃度、一般に5~25mMの許容可能な緩衝液と併せて、好都合に、ウシ胎児血清又は他の天然に存在する因子を補充された、無菌の平衡塩溶液、例えば、生理食塩水、PBS、ハンクス平衡塩溶液などである。好都合な緩衝液としては、HEPES、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが挙げられる。
「細胞培養物」又は「培養物」という用語は、人工的なインビトロ環境における細胞の維持を意味する。しかしながら、「細胞培養」という用語は、一般的な用語であり、個々の細胞だけでなく、組織又は臓器の培養を包含するために使用され得ることを理解されたい。
目的の培養条件は、幹細胞又は前駆細胞がインビトロで増殖、分化、又は成熟する分化を許容する環境を提供する。そのような条件は、差別条件とも呼ばれ得る。環境の特徴は、細胞が培養される培地、存在し得る任意の成長因子又は分化誘導因子、及び本明細書に開示されるヒドロゲルの支持構造を含む。分化は、オルガノイド、又は同様の構造の形成によって開始され得る。
本明細書で使用される「長期培養物」は、細胞が成長し、分化し、かつ少なくとも約10日間、又は30日間を超えて、又は60日間を超えて、又は100日間を超えて、又は150日間を超えて生存可能である培養物を指す。
幹細胞。幹細胞という用語は、本明細書では、自己再生能力及び分化した子孫を生成する能力の両方を有する哺乳類細胞を指すために使用される(Morrison et al.(1997)Cell 88:287-298を参照のこと)。一般に、幹細胞は、また、分裂後の2つの娘細胞が異なる表現型を有し得る非同期又は非対称複製を受ける能力、広範な自己再生能力、有糸分裂静止形態での存在能力、及びそれらが存在する全ての組織のクローン再生、例えば、造血幹細胞が全ての造血系統を再構成する能力の特性のうちの1つ以上を有する。「前駆細胞」は、幹細胞とは、それらが典型的には広範な自己再生能力を有さず、多くの場合、それらが由来する組織内の系統のサブセット、例えば、造血学的設定におけるリンパ系、又は赤血球系のみを再生することができるという点で異なる。
幹細胞は、抗体によって同定される特定のエピトープに関連するマーカーの存在及び特定の抗体の結合の欠如によって同定される特定のマーカーの欠如の両方によって特徴付けられ得る。幹細胞は、また、インビトロ及びインビボの両方の機能的アッセイ、特に、複数の分化子孫を生じさせる幹細胞の能力に関連するアッセイによって同定され得る。
「分化系列決定された幹細胞」は、本明細書において、特定の系統の細胞、例えば、胚葉系幹細胞を生じさせる多能性幹細胞を指すために使用される(例えば、Reyes et al.(2001)Blood 98:2615-2625、Eisenberg&Bader(1996)Circ Res.78(2):205-16などを参照されたい)。
「組織特異的幹細胞」は、本明細書では、特定の組織内に存在し、それらが存在する組織の細胞のクローン再生が可能である多能性幹細胞、例えば、造血幹細胞が全ての造血系統を再構築する能力、又は神経幹細胞が全ての神経系統/グリア系統を再構築する能力を指すために使用される。「前駆細胞」は、組織特異的幹細胞とは、それらが典型的には広範な自己再生能力を有さず、多くの場合、それらが由来する組織内の系統のサブセット、例えば、造血学的設定におけるリンパ系又は赤血球系のみ、又は神経系におけるニューロン若しくはグリアのみを再生することができるという点で異なる。
幹細胞及びその培養物多能性幹細胞は、任意の種類の組織(通常は胎児又は胎児前組織などの胚組織)に由来する細胞であり、幹細胞は、3つの胚葉(内胚葉、中胚葉、及び外胚葉)の全ての誘導体である異なる細胞型の子孫を産生する適切な条件下で可能であるという特徴を有する。これらの細胞型は、確立された細胞株の形態で提供され得るか、又はそれらは、一次胚組織から直接得られ、分化のために直ちに使用され得る。NIHヒト胚性幹細胞レジストリ、例えば、hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03、hESBGN-04(BresaGen,Inc.)、HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6(ES Cell International)、Miz-hES1(MizMedi Hospital-Seoul National University)、HSF-1、HSF-6(University of California at San Francisco)、及びH1、H7、H9、H13、H14(Wisconsin Alumni Research Foundation(WiCell Research Institute))に列挙されている細胞が含まれる。
対象の幹細胞としては、Thomson et al.(1998)Science 282:1145によって記載されるヒト胚性幹細胞(hES)細胞によって例示される様々なタイプの胚性細胞、アカゲザル幹細胞などの他の霊長類由来の胚性幹細胞(Thomson et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci USA92:7844)、マーモセット幹細胞(Thomson et al.(1996)Biol.Reprod.5:254)、及びヒト胚性胚芽細胞(hEG)細胞(Shamblott et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726,1998)が含まれる。また、中胚葉幹細胞及び他の初期心原性細胞などの分化系列決定された幹細胞も対象となる(Reyes et al.(2001)Blood 98:2615-2625、Eisenberg&Bader(1996)Circ Res.78(2):205-16などを参照されたい)。幹細胞は、任意の哺乳類種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などから得ることができる。
ES細胞は、それらが特定の分化系列決定されていない場合、未分化であると考えられる。そのような細胞は、それらを胚又は成人由来の分化細胞から区別する形態学的特徴を示す。未分化ES細胞は、当業者によって容易に認識され、典型的には、高い核/細胞質比及び顕著な核小体を有する細胞のコロニー内の顕微鏡画像の二次元に現れる。未分化ES細胞は、未分化細胞の存在を検出するためのマーカーとして使用され得る遺伝子を発現し、そのポリペプチド産物は、陰性選択のためのマーカーとして使用され得る。例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる、US2003/0224411A1、Bhattacharya(2004)Blood 103(8):2956-64、及びThomson(1998)(上記参照)を参照されたい。ヒトES細胞株は、ステージ特異的胚性抗原(SSEA)-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-l-81、及びアルカリホスファターゼを含む、未分化の非ヒト霊長類ES及びヒトEC細胞を特徴付ける細胞表面マーカーを発現する。SSEA-4エピトープを担持するグロボシリーズ糖脂質GL7は、SSEA-3エピトープを担持するグロボシリーズ糖脂質Gb5へのシアル酸の付加によって形成される。したがって、GL7は、SSEA-3及びSSEA-4の両方に対する抗体と反応する。未分化ヒトES細胞株は、SSEA-1について染色しなかったが、分化細胞は、SSEA-lについて強く染色した。未分化形態でのhES細胞の増殖方法は、WO99/20741、WO01/51616、及びWO03/020920に記載されている。
本明細書で使用される場合、「リプログラミング因子」は、転写を変化させるために細胞に作用し、それによって細胞を多分化能性又は多能性にリプログラミングする生物学的活性因子のうちの1つ以上、すなわち生物学的活性因子のカクテルを指す。リプログラミング因子は、細胞、例えば、線維芽細胞、脂肪細胞などの心疾患の目的の家族歴又は遺伝子構造を有する個体由来の細胞に、個々に又は単一の組成物として、すなわち、リプログラミング因子の予め混合された組成物として提供され得る。因子は、同じモル比又は異なるモル比で提供されてもよい。因子は、主題の発明の細胞を培養する過程で1回又は複数回提供されてもよい。いくつかの実施形態では、リプログラミング因子は、転写因子であり、これには、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、及びLin-28が含まれるが、これらに限定されない。
体細胞は、細胞を多能性にリプログラムするために十分な組み合わせ及び量で、上記で定義されるように、リプログラミング因子と接触させる。リプログラミング因子は、個別に、又は単一の組成物、すなわち、リプログラミング因子の予め混合された組成物として、体細胞に提供され得る。いくつかの実施形態では、リプログラミング因子は、ベクター上の複数のコード配列として提供される。
遺伝子は、様々な目的のために、例えば、機能変異の喪失を有する遺伝子に置き換えるために、マーカー遺伝子を提供するためなどに、体細胞に、又はそこから誘導されるiPS細胞に導入され得る。代替的には、アンチセンスmRNA又はリボザイムを発現するベクターを導入し、それによって望ましくない遺伝子の発現を遮断する。遺伝子療法の他の方法は、正常な前駆細胞が利点を有し、選択圧、例えば、複数の薬剤耐性遺伝子(MDR)、又はbcl-2などの抗アポトーシス遺伝子にさらされることを可能にするための薬剤耐性遺伝子の導入である。上記で考察したように、例えば、電気穿孔、カルシウム沈殿DNA、融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染などの当該技術分野において既知の様々な技術を使用して、核酸を標的細胞に導入してもよい。DNAが導入される特定の方法は、本発明の実施には重要ではない。
本明細書で使用される「腸細胞」という用語は、哺乳類の腸上皮を構成する細胞を示す。胃腸管の哺乳類の腸上皮は、明確に定義された組織構造を有する。上皮は、分化細胞(絨毛)を収容する機能領域と、上皮幹細胞ニッチを表す増殖領域(リーベルキューンの陰窩)との2つの領域に分けることができる。多能性上皮幹細胞は陰窩に存在し、吸収性腸細胞、ムチン分泌ゴブレット細胞、ペプチドホルモン分泌腸内分泌細胞、及びPaneth細胞の4つの主要な上皮系統を生じさせる。
「哺乳類の腸細胞」という語句は、哺乳類の腸に由来する細胞を意味する。典型的には、本発明の方法では、腸の断片は、外科的に得られ、約1mm3未満のサイズに切断され、約0.5mm3未満、又は約0.1mm3未満であってもよく、又は代替的に、単一細胞に解離されてもよい。本明細書で使用される哺乳類としては、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などが挙げられる。腸組織は、内視鏡検査中の生検によってヒトから得ることができる。「哺乳類腸細胞」及び「腸細胞」及び「腸上皮細胞」は、互換的に使用されている。腸組織の供給源は、胎児、新生児、若年性、又は成人であり得る。
「腸」は、哺乳類の小腸及び哺乳類の大腸を指す。本明細書に記載の方法について、腸組織は、小腸又は大腸のいずれかから得られる。
「移植片」という用語は、例えば、本発明の方法に従って、哺乳類腸組織に由来し、インビトロから成長した細胞を意味する。
「腸幹細胞」は、「上皮幹細胞」と互換的に使用され、腸上皮細胞に増殖及び分化する可能性を有する幹細胞を指す。多能性上皮幹細胞は、様々な上皮系統を生じさせ、吸収性腸細胞、ムチン分泌ゴブレット細胞、ペプチドホルモン分泌腸内分泌細胞、及びPaneth細胞を含む全ての腸上皮系統を生じさせ得る。
「多系統分化マーカー」という用語は、異なる細胞型に特徴的な分化マーカーを意味する。これらの分化マーカーは、マーカーに特異的な親和性試薬、例えば、マーカーに特異的な抗体を使用すること、当該技術分野で知られているように、細胞型などを特異的に染色する化学物質を使用することによって検出することができる。末端分化マーカーの非限定的な例としては、クロモグラニンA、NeuroD-腸内分泌細胞、ムチン-ゴブレット細胞、ビリン、CD10-腸細胞、リゾチーム、Ang4-Paneth細胞が挙げられる。腸内分泌、ゴブレット、及びPaneth細胞の一般的な前駆細胞は、Math1に対する抗体を使用することによって検出される。P-PTEN、SFRP5、及びMusashi1は、腸内幹細胞及び腸内前駆細胞において特異的に発現される。腸内アルカリホスファターゼ(IAP)は、腸細胞をマークする。
「候補薬剤」という用語は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、siRNA、shRNA遺伝子、遺伝子産物、小分子、及び本明細書に記載の腸細胞培養物に導入されて、移植片に対するそれらの効果をアッセイする薬理学的化合物を意味する。
「接触する」という用語は、哺乳類腸細胞の移植培養物中に候補細胞又は候補薬剤のいずれかを配置することを指す。接触は、また、候補細胞を半透過性基質中に配置する前に、培養培地中で少なくとも1時間、又は2時間超又は4時間超の間、腸移植片と共培養することを包含する。代替的には、接触とは、経管腔注射を介して、嚢胞として成長する移植片の管腔内に候補細胞を配置することを指す。
「スクリーニング」は、候補細胞を本明細書に記載の培養物と共培養するか、又は候補薬剤を本明細書に記載の培養物に添加するかのいずれかのプロセスを指す。培養に対する候補細胞又は候補薬剤の効果は、例えば、腸幹細胞を示す多系統分化マーカーの存在によって、基底レベルを上回る移植片の成長の増加によって評価される。腸移植片に対する候補細胞又は候補薬剤の効果は、連続したインビトロ継代によって、並びに皮下インプラントアッセイ及び腎カプセルアッセイによるインビボ移植によって、長期再構成活性について腸移植片をアッセイすることによって更に評価することができる。
「容器」とは、細胞を培養するための無菌環境を提供することができるガラス、プラスチック、又は金属容器を意味する。
「移植片」という用語は、本明細書では、例えば、本発明の方法に従って、インビトロで培養された哺乳類組織に由来する組織及びその細胞を意味するために使用される。移植片が由来する哺乳類組織は、個体、すなわち、一次移植片から得てもよく、又はそれは、インビトロで、例えば、人工多能性幹細胞の分化によって得られてもよい。
「オルガノイド」という用語は、本明細書では、インビボで組織の特徴、例えば、増殖を伴う長期の組織拡張、多系統分化、細胞及び組織の超微細構造の再現などを保持する培養物中の哺乳類細胞の三次元成長を意味するように使用される。一次オルガノイドは、移植片、すなわち、培養された移植片から培養されるオルガノイドである。二次オルガノイドは、一次オルガノイドの細胞のサブセットから培養されるオルガノイドであり、すなわち、一次オルガノイドは、例えば、機械的又は化学的手段によって断片化され、断片は、再現及び培養される。三次オルガノイドは、二次オルガノイドなどから培養されるオルガノイドである。
「超微細構造」は、インビボで観察される細胞又は組織の三次元構造を指す。例えば、細胞の超微細構造は、インビボでその極性又はその形態であってもよく、一方、組織の超微細構造は、組織内での互いに対する異なる細胞型の配置であってもよい。
「スクリーニング」は、候補細胞を本明細書に記載の培養物と共培養するか、又は候補薬剤を培養物に添加するかのいずれかのプロセスを指し、候補細胞又は候補薬剤が培養物に及ぼす効果を評価するプロセスを指す。効果は、任意の便利なパラメータ、例えば、移植片の成長率、幹細胞を示す多系統分化マーカーの存在などを評価することによって評価され得る。移植片に対する候補細胞又は候補薬剤の効果は、シリアルインビトロ継代によって、並びにインビボ移植によって、長期再構築活性について移植片をアッセイすることによって更に評価することができる。
培養方法
様々な哺乳類組織の培養のための培養システム及び方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織、すなわち一次組織は、哺乳類器官から得られる。組織は、任意の哺乳類種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などに由来し得る。哺乳類は、いずれの年齢であってもよく、例えば、胎児、新生児、幼体、成体であってもよい。オルガノイドを調製する目的で得ることができる組織のいくつかの非限定的な例を以下に示す。細胞又は組織は、任意の好都合な方法、例えば、生検、例えば、内視鏡検査中、手術中、針などによって、又は細胞株から、インビトロ分化などによって得られ得る。組織の場合、それは氷冷緩衝溶液、例えばPBS、ハムのF12、MEM、培養培地などに浸漬される。組織の断片は、約1mm3未満のサイズに切断され、単一細胞に解離され得る。切断された組織を、本開示のヒドロゲルと混合する。続いて、細胞含有ヒドロゲルを好適な培地中に配置する。
様々な哺乳類組織の培養のための培養システム及び方法が提供される。いくつかの実施形態では、組織、すなわち一次組織は、哺乳類器官から得られる。組織は、任意の哺乳類種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などに由来し得る。哺乳類は、いずれの年齢であってもよく、例えば、胎児、新生児、幼体、成体であってもよい。オルガノイドを調製する目的で得ることができる組織のいくつかの非限定的な例を以下に示す。細胞又は組織は、任意の好都合な方法、例えば、生検、例えば、内視鏡検査中、手術中、針などによって、又は細胞株から、インビトロ分化などによって得られ得る。組織の場合、それは氷冷緩衝溶液、例えばPBS、ハムのF12、MEM、培養培地などに浸漬される。組織の断片は、約1mm3未満のサイズに切断され、単一細胞に解離され得る。切断された組織を、本開示のヒドロゲルと混合する。続いて、細胞含有ヒドロゲルを好適な培地中に配置する。
いくつかの実施形態では、組織は、多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞(ESC)、胚性生殖細胞(EGC)、人工多能性幹細胞(iPSC)からインビトロで成長される。多能性幹細胞から所望の組織を誘導するために、任意の好都合な方法に従ってもよい。操作された組織は、ヒドロゲル基質に移され得る。
移植片の継続的な成長は、任意の好都合な方法、例えば、位相差顕微鏡検査、立体顕微鏡検査、組織学、免疫組織化学、電子顕微鏡検査などによって確認され得る。場合によっては、細胞の超微細構造及び多系統分化が評価され得る。培養における腸管移植片の超微細構造は、当該技術分野で知られている方法を使用して、ヘマトキシリン-エオシン染色、PCNA染色、電子顕微鏡検査などを実施することによって決定することができる。多系統分化は、例えば、以下でより詳細に記載されるように、末端分化マーカーに対する抗体による標識を実施することによって決定することができる。分化マーカーを検出するための抗体は、多くの供給源から市販されている。
いくつかの実施形態では、培養された移植片中の細胞は、実験的に修飾され得る。例えば、移植細胞は、ウイルス又は細菌病原体への曝露によって、例えば、治療剤の抗ウイルス又は抗細菌効果を評価するための実験用試薬を開発するために修飾され得る。外植片細胞は、遺伝子発現のパターンを修飾することによって、例えば、多能性を誘導するか、又は別の方法で分化可能性を改変するために、又は移植片培養を形成する細胞の能力又は腫瘍形質転換を受ける細胞の能力に対する遺伝子活性の増大又は喪失の影響を決定するために、リプログラミング因子を提供することによって修飾され得る。外植片細胞は、例えば、腫瘍に対する治療剤の効果を評価するために、例えば、Kras.sup.G12Dの過剰発現のためのがんドライバー-がん原性因子又は腫瘍抑制遺伝子の阻害剤、例えば、APC、p53、又はSmad4などの発現を抑制する核酸を提供することによって、がん原遺伝子性又は発がん性細胞に形質転換されるように修飾されてもよい。
実験修飾は、例えば、スクリーニング目的のために、核酸、ポリペプチド、小分子、ウイルスなどである候補薬剤を移植片及びその細胞に提供する方法に関して以下に記載されるように、当該技術分野で既知の任意の方法によって行われ得る。
主題の方法によって調製されるオルガノイドは、多くの用途での使用が見出される。例えば、がん、虚血、先天性症候群、外傷、及び炎症は、臓器生理学を損なうために十分な大きさの患者組織の大部分の機能喪失又は強制的な物理的切除を引き起こす可能性がある。インビトロで哺乳類組織の移植片を成長させて、そのような患者に戻すか、又はそのような患者への移植のための組織特異的幹細胞の供給源として使用する能力は、貴重な治療選択肢である。そのような細胞は、組織のエクスビボ拡張を増強し、操作された組織及び/又は組織幹細胞の自己源を提供することができる。別の例として、主題の方法によって調製されたオルガノイドは、個体、例えば、がんを有する個体、感染などを有する個体の療法に対する応答性を予測するために使用され得る。別の例として、主題の方法によって調製されたオルガノイドは、基礎研究、例えば、疾患の基礎をよりよく理解するために、及び創薬、例えば、以下に更に記載されるもののようなスクリーン内の試薬で使用され得る。オルガノイドは、また、薬剤の薬物動態及び薬力学、例えば、活性薬剤を吸収する哺乳類組織の能力、一次哺乳類組織上又はがん原性哺乳類組織上の薬剤の細胞毒性などを評価するために有用である。
実験
操作されたマトリックスは、ヒト患者由来の腸管オルガノイドの形成、成長、経過、及び分化を可能にする。
患者の生検の一次組織に由来するヒト腸管オルガノイドは、個別化された医学及びヒト胃腸疾患の前臨床モデルを改革する可能性がある。これまでのところ、ほとんどの腸管オルガノイドは、エンゲルブレスホルムスワム(EHS)マウス肉腫に由来する脱細胞化マトリックスで成長しており、これは、チューナビリティ及び再現性を限定した材料である。この制限を克服するために、ヒアルロン酸エラスチン様タンパク質(HELP)と呼ばれるデザイナーマトリックスを報告し、成人の一次組織由来の上皮のみの腸管オルガノイドの形成、分化、及び継代を可能にする。これらの材料は、分離した患者由来細胞のカプセル化を可能にし、その後、分極された内部管腔を有する球状構造である、エンテロイドの増殖及び新たな形成を受ける。ヒトエンテロイドの12回の継代、解離、及び再生の後、HELP材料の成長は、EHSマトリックスのそれと統計的に類似していることが判明した。HELP材料は、ヒトエンテロイドをより特殊な細胞型:Paneth細胞、ゴブレット細胞及び腸内分泌細胞に分化させることを更にサポートした。HELPの3つの重要な変数であるマトリックス剛性、マトリックス応力緩和速度、及びマトリックスインテグリンリガンド濃度は、各々独立して定量的に指定することができ、オルガノイドマトリックス相互作用及び潜在的な患者特有の最適化の基礎研究を可能にする。HELP材料中のオルガノイド形成は、より硬い係数(G’~1kPa)、より遅い応力緩和速度(t1/2~18時間)、及びより高いインテグリンリガンド濃度(0.5~1mMのRGDペプチド)を有するゲルにおいて最も堅牢であることが分かった。私たちの材料は、ヒトにおけるオルガノイドの発達及び疾患を更に理解するための3Dインビトロモデルと、動物由来の製品又は潜在的な臨床翻訳のための合成ポリエチレングリコールを含まない再現性、生分解性、最小限のマトリックスとを提供する。
操作されたマトリックスは、ヒト患者由来の腸管オルガノイドの形成、成長、経過、及び分化を可能にする。
患者の生検の一次組織に由来するヒト腸管オルガノイドは、個別化された医学及びヒト胃腸疾患の前臨床モデルを改革する可能性がある。これまでのところ、ほとんどの腸管オルガノイドは、エンゲルブレスホルムスワム(EHS)マウス肉腫に由来する脱細胞化マトリックスで成長しており、これは、チューナビリティ及び再現性を限定した材料である。この制限を克服するために、ヒアルロン酸エラスチン様タンパク質(HELP)と呼ばれるデザイナーマトリックスを報告し、成人の一次組織由来の上皮のみの腸管オルガノイドの形成、分化、及び継代を可能にする。これらの材料は、分離した患者由来細胞のカプセル化を可能にし、その後、分極された内部管腔を有する球状構造である、エンテロイドの増殖及び新たな形成を受ける。ヒトエンテロイドの12回の継代、解離、及び再生の後、HELP材料の成長は、EHSマトリックスのそれと統計的に類似していることが判明した。HELP材料は、ヒトエンテロイドをより特殊な細胞型:Paneth細胞、ゴブレット細胞及び腸内分泌細胞に分化させることを更にサポートした。HELPの3つの重要な変数であるマトリックス剛性、マトリックス応力緩和速度、及びマトリックスインテグリンリガンド濃度は、各々独立して定量的に指定することができ、オルガノイドマトリックス相互作用及び潜在的な患者特有の最適化の基礎研究を可能にする。HELP材料中のオルガノイド形成は、より硬い係数(G’~1kPa)、より遅い応力緩和速度(t1/2~18時間)、及びより高いインテグリンリガンド濃度(0.5~1mMのRGDペプチド)を有するゲルにおいて最も堅牢であることが分かった。私たちの材料は、ヒトにおけるオルガノイドの発達及び疾患を更に理解するための3Dインビトロモデルと、動物由来の製品又は潜在的な臨床翻訳のための合成ポリエチレングリコールを含まない再現性、生分解性、最小限のマトリックスとを提供する。
合成マトリックスは、EHSマトリックス又は他の細胞型を必要とせずに、マウス及びヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のオルガノイドの形成をサポートするように設計されている。対照的に、合成マトリックス中のヒト患者由来の腸管オルガノイドは、しばしば、EHSマトリックス中のスフェロイド形成工程、又は間葉系細胞との共培養のいずれかを必要とする。患者由来の腸管オルガノイドのための操作マトリックスを開発する最近の研究は、合成マトリックス骨格としてポリエチレングリコール(PEG)に依存しているが、PEGは免疫系と相互作用し、抗体形成を誘導することが知られている。PEGフリーのシステムを作成するために、デザイナーマトリックス、ヒアルロン酸エラスチン様タンパク質(HELP)を報告し、成人の一次組織由来の上皮のみの腸管オルガノイドの形成、分化、及び継代を可能にする。HELPの3つの重要な変数(マトリックス剛性、マトリックス応力緩和速度、及びマトリックスインテグリンリガンド濃度)は、各々独立して定量的に指定することができ、オルガノイドマトリックス相互作用及び潜在的な患者特有の最適化の基礎研究を可能にする。私たちの材料は、ヒトにおける腸の発達及び腸疾患を更に理解するための3Dインビトロモデルと、動物由来の製品又は潜在的な臨床翻訳のための合成PEGを含まない再現性、生分解性、最小限のマトリックスとを提供する。
天然腸に見出されるバイオポリマーに触発された最小限のマトリックスが、一次ヒト組織に由来するオルガノイドの形成をサポートすると仮定した(図1a)。私たちのグループは、以前、ヒトエラスチン及びフィブロネクチンに由来するアミノ酸配列を使用して、一次マウス腸管オルガノイドの形成及び成長をサポートするタンパク質操作マトリックスを報告した。エラスチンは、腸細胞外マトリックス(ECM)の主要な成分のうちの1つであり、フィブロネクチンは、腸幹細胞(ISC)陰窩内で発現される。組換えエラスチン様タンパク質(ELP、MW37.7kDa)は、フィブロネクチンから借用されたインテグリン結合伸長RGD配列を有するエラスチン様配列を散在させる(図1b、図S1a)。インビボでは、ISCの維持及び増殖は、CD44受容体によって部分的に媒介され、CD44活性化は、腸の成長と関連する。CD44受容体は、正常な腸成長に重要なグリコサミノグリカンであるヒアルロン酸(HA、MW100kDa)と相互作用することができ、HAを含む操作されたマトリックスが患者由来のエンテロイド培養をサポートすることができるという仮説を立てることにつながる。これら2つのバイオポリマー成分から再現可能なヒドロゲル材料を作製するために、以前に報告されたように、ヒドラジン基でELPを化学的に修飾し、ベンズアルデヒドでHAを化学的に修飾されたスキームを開発した(図5b-e)。2つの修飾されたバイオポリマーを一緒に単に混合することは、ヒドラゾン結合の形成を誘導し、HELPと呼ばれるヒドロゲルネットワークをもたらした。
この研究を通して、細胞を以下のように分類する。腸上皮細胞の未分化スフェロイドを患者由来の腸内エンテロイド(又はより単純にはエンテロイド)を参照し、分化すると、これらの腸内細胞構造を患者由来の腸管オルガノイドと呼ぶ。いくつかの研究では、エンテロイド状態と称するものは、特に、Lgr5+ISC集団に対する蛍光レポーター系が利用されるマウス系において、ISCコロニー又はスフェロイドと称される。ここでは、ヒトエンテロイドを単一細胞に解離させ、ヒドロゲルの共有結合架橋中にHELP内に埋め込んだ。3日以内に、新規のスフェロイド形成が観察された(図1c、d)。合成材料中のヒトエンテロイドのいくつかの以前の報告は、合成生体材料中でカプセル化する前に、EHSマトリックス中でのエンテロイド形成の最初の工程を必要とし、このプロセスを「再埋め込み」と呼ぶ(図1c)。したがって、これらの2つの異なる培養方法をサポートするための異なる材料の能力を比較した。1)解離した単一細胞のカプセル化、及び2)予め形成されたエンテロイドの再埋め込み(図1d)。予想されたように、かつ以前の報告と一致して、再包埋されたエンテロイドは、フィブロネクチン由来のインテグリン結合RGDリガンドを含有するELPのみのマトリックス内で少なくとも6日間成長し、生存可能であったが、ZO-1及びβ-カテニン染色によって観察されたようなエンテロイド分極化が維持されなかったことに留意されたい(図1d、上)。全く対照的に、ELPのみのマトリックス内の(すなわち、HAなしの)解離したヒト腸細胞は、エンテロイドを形成することができず、RGDリガンド単独では、この材料中の新規オルガノイド形成をサポートするには不十分であることを示唆する。興味深いことに、操作されたマトリックスにHAを添加することにより、単一の腸細胞が堅牢にHELPでエンテロイドを形成し、再埋め込みされたエンテロイドとして培養されたときに少なくとも6日生存することが可能になった(図6)。重要なことに、HELPで形成されたエンテロイドは、EHSマトリックスに類似した適切な腸上皮極性を示し、これは、狭い接合タンパク質密着結合-1(ZO-1)の先端管腔への局在及び接着接合タンパク質β-カテニンの基底外側局在によって示された(図1d)。HELPマトリックス内の第2の別個の患者ラインについて同様の結果が観察された(図7)。オルガノイド成長をサポートするためのHELPマトリックスの潜在的な広範な適用性を実証するために、原発性マウス腸管エンテロイド及びヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来の肝臓オルガノイドも、HELPマトリックスにおいて生存可能であった(図8)。
単一細胞からの堅牢なオルガノイド形成に加えて、HELP内のヒトエンテロイドは、各継代後に繰り返し継代され、新しいエンテロイドを形成し続けることができる(図1e、6、7b、c)。HELPマトリックスは、エラスターゼ及びヒアルロニダーゼを使用して酵素的に分解され、続いてトリプシンを使用して単一細胞へのエンテロイド溶解が行われる(培養方法を参照)。これらの単一細胞を新鮮なHELPマトリックスにカプセル化することにより、形態の目に見える変化なしに、最大12の継代の新しいエンテロイド形成が成功した(図1e、f)。HELPマトリックスで繰り返し継代されたエンテロイドは、培養の12日間にわたる明視野顕微鏡検査によって観察されたように、EHSマトリックスにおけるエンテロイドの成長率と一致した(図1f)。更に、これらの繰り返し継代したエンテロイドは、HELP及びEHSマトリックス(図1g)で統計的に類似した形成速度を有していた。
HELPが患者由来の腸管オルガノイドへの分化をサポートできるか否かを評価するために、HELPに埋め込まれた単一の細胞を最初に、Wnt3A、表皮成長因子、Noggin、及びR-spondin1を含有する成長培地中で10日間、エンテロイドを形成させた(図2a)。成長培地中では、細胞は初期のエンテロイド形成を受ける(図2b、左)。エンテロイドが発達するにつれて、細胞は形態学的に柱状になり、オルガノイド内の厚い頂端アクチン境界(図2b、中央)及び既知の偏光マーカーの局在化(図1d)によって実証される、固有の腸端基底極性を採用する。10日目に、Wnt及びR-spondin1を除去して、5日間にわたってオルガノイドへのエンテロイド分化を促進した。
このプロセスは、分化した腸細胞型を含有する起伏がある管腔の形成をもたらした(図2b)。免疫細胞化学により、HELP及びEHSマトリックスの両方で成長したオルガノイドにおけるリゾチーム陽性Paneth細胞が確認された(図2c)。HELPで成長したオルガノイドにおいて、EHSマトリックスで成長したオルガノイドと比較して、ムチン-2(Muc2)陽性ゴブレット細胞の発現が高いことが観察された。分化した腸内分泌細胞のマーカーであるクロモグラニン-A(ChgA)陽性の細胞は、HELPマトリックスで同定されたが、EHSマトリックスでは見出されなかった。これらの分化マーカーの転写発現を評価するために、HELP又はEHSマトリックスで分化されたオルガノイドに対して、それぞれのマトリックス内の成長培地中で15日間維持されたエンテロイドと比較して、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を実施した(図2d)。LYZ1(リゾチーム)及び腸細胞マーカーVIL1(ビリン-1)の発現レベルは、HELPマトリックス及びEHSマトリックスの両方において、未分化対照と比較して比較的変化しなかった。HELPマトリックス及びEHSマトリックスの両方において、MUC2(ムチン-2)及びCHGA(クロモグラニン-A)遺伝子発現が高い上方制御が観察された。
エンテロイドは、ELPのみのマトリックスではなく、HELPにおいて正常に形成されたため(図1)、次に、これらのマトリックスにおけるHAの許容的役割を更に探索しようとした。患者由来の腸内細胞が増殖性腸内陰窩を豊富に含み、HA受容体でもあるCD44を発現することを確認するために、HELP及びEHSマトリックスにおいて、単一細胞から形成されたエンテロイドに対して免疫細胞化学を実施した。興味深いことに、EHSマトリックスと比較して、HELPで成長したエンテロイドの末梢上のCD44染色の強度が高いことが観察された(図3a)。CD44のより高い表面発現が、EHSマトリックスで成長したものと比較して、HELPで成長したエンテロイドからの単一の解離細胞上で観察されたため、フローサイトメトリーは、この発見を更に確認した(図3b、図9)。フローサイトメトリー分析により、EHSマトリックスで成長したエンテロイド由来のCD44陽性細胞の70%がCD44陽性であったことと比較して、HELPで成長したエンテロイド由来の細胞の約90%がCD44陽性であったことが明らかになった。これらの結果は、HELPにおけるHAシグナル伝達が、エンテロイド形成を促進する上で重要な役割を果たし得ることを示唆している。HAシグナル伝達がエンテロイド形成を支援した材料の重要な特徴であるか否かを更に試験するために、HA成分を修飾するために使用した場合と同じベンズアルデヒド部分を有する合成PEGポリマーを修飾した。この材料を使用して、同等濃度のRGDペプチド(1mM)で、HELPマトリックス(図10)に剛性マッチングしたELP-PEGヒドロゲルマトリックスを生成した。明視野及び共焦点蛍光顕微鏡法により、HELPと同等の機械的特性を有するELP-PEGゲルにおいて、エンテロイドを形成できないことが明らかになり、HA生化学的シグナル伝達がHELPマトリックスの必須成分であることが示唆された(図3c、d)。
HELP材料は、複数の生体材料特性の独立した選択を可能にし、異なる生化学的及び生物物理的マトリックスの手がかりに応答したオルガノイドの成長の研究を可能にする。これらのパラメータを調整することで、オルガノイド中の細胞が組織力学にどのように反応するかを注意深く研究することができる。実際、マトリックス剛性、マトリックス応力緩和、及びマトリックスRGD含有量の相互作用は、他の操作されたバイオマテリアルシステムにおいて重要であった。HELPシステム内のこれらの相互作用を探索するために、最初に、非細胞接着であることが知られている非インテグリン結合、配列スクランブルペプチド(RDG)を含むELPタンパク質のバリアントを調製した。次に、HELPマトリックス内でRGD-とRDG-ELPタンパク質とをブレンドすることにより、マトリックス力学に影響を与えることなく、ヒドロゲル中のRGDリガンドの正確な濃度を0~1mMに調整することができた(図4a、図10)。様々な機械的特性を有するマトリックスを作成するために、まず、ヒドラジン-ベンズアルデヒド架橋の程度(図4b、上)を変化させて、硬質弾性様マトリックス(貯蔵係数、G’~1kPa、「硬質EL」と称される)及びより適合性がある、弾性マトリックス(G’~400Pa、「軟質EL」)を作成した(図4c、d)。これらのマトリックスは同等の準弾性応力緩和プロファイルを有し、60分間にわたる無視できる応力緩和と約18時間の応力減衰半減時間(t1/2)を有していた。
HELPマトリックスのセットにおける様々な材料特性の関数として、患者由来のエンテロイドサイズの分布を測定した(図4に平均として示されるデータ、図11に示されるバイオリンプロット分布)。一般に、より硬いゲル(G’~1kPa)で成長したエンテロイドの断面積は、より柔らかいゲル(G’~400Pa、図4e)で成長したものよりも大きかった。この結果は、マウス及び合成PEGベースのマトリックスで成長した一次ヒト腸管オルガノイドに最適であることが以前に見出された剛性範囲と一致する。この傾向に加えて、RGDリガンドを欠くマトリックスにおいて、マトリックスの剛性とは無関係に、エンテロイドがそれほど堅牢に成長しないことを観察した。これは、合成マトリックスにおける腸内オルガノイドの以前の報告と一致し、最適なオルガノイド成長のために最小閾値レベルのRGDが必要であった。しかしながら、これらの以前の報告では、RGDを含まない合成マトリックスで培養されたオルガノイドは、形成することができず、生存することができなかった。生存可能なエンテロイドがRGDリガンドなしでHELPマトリックスで形成されたという事実は、RGDとHAの共提示がオルガノイド成長を有意に改善したが、HAからのシグナル伝達がいくつかのオルガノイド形成を誘導するために十分であり得ることを示唆している(図4e)。
次に、応力緩和及び粘弾性であるマトリックス内のRGD濃度の役割を探索した。「応力緩和」であるマトリックスは、細胞力によって変形された後、応力を消散させ、緩和するために分子レベルのリモデリングを受ける。他の細胞型を用いた研究は、マトリックス応力緩和がマトリックス剛性よりも細胞表現型に更に強い影響を及ぼす可能性があることを実証しており、これらの効果は、マトリックスに力を及ぼすために細胞が使用する主要なメカニズムであるため、インテグリンリガンド濃度によって異なる。したがって、マトリックス剛性、RGDリガンド濃度、及びマトリックス応力緩和の独立した調整を可能にするバイオミメティックHELPマトリックスのファミリーを設計しようとした。天然の細胞外マトリックス及びEHSマトリックスの主な特徴は、それらの物理的架橋による応力緩和を受ける能力であり、これは容易にリモデリングすることができる。HELPマトリックスで使用されるものなどの動的共有結合架橋の再構築動態は、隣接する化学部分の選択によって調整することができる。HA上のベンズアルデヒド基の画分をアルデヒド基(図4b、底)に置き換えることによって、準弾性「硬質EL」HELPマトリックス(図4f、g)と同一の剛性を有する、より速い応力緩和(t1/2~30分)、粘弾性HELPマトリックス(「硬質VE」と称される)を配合した。興味深いことに、弾性ゲルと比較して、粘弾性ゲルにおけるエンテロイド成長のためのRGDリガンド濃度へのより大きな依存性を観察した(図4e、h)。粘弾性ゲルは、堅牢なエンテロイド成長に必要な0.75mMのRGDの閾値を有した(図4h)。これらのデータは、より大きなリモデリングを受けることができるマトリックスにおいて、エンテロイドは、インテグリンリガンドの存在に対してより感受性であり得る一方、エンテロイドは、より弾性的なメカニズムを有するマトリックスにおいて、より広範囲のマトリックス特性にわたってより堅牢に形成することができることを示唆する。
要約すると、ここでは、解離した単一細胞からの一次ヒト腸管オルガノイドの堅牢な形成、成長、継代(図1)及び分化(図2)を可能にするHELPマトリックスを提示する。興味深いことに、HELP内のヒアルロン酸の存在は、同様のメカニズム及びRGD-リガンド濃度を有するELPのみ及びELP-PEGマトリックスがエンテロイド形成をサポートしなかったため、単一細胞からの新規エンテロイド形成を可能にするために十分である(図1、3)。この観察結果は、HELPマトリックスで培養されたエンテロイドにおけるHAのよく知られた受容体であるCD44の発現の増加と相関する(図3)。この受容体は、ISCの再生において重要であることが知られており、したがって、知見は、腸細胞増殖に影響を及ぼすマトリックス因子の集合的な理解に寄与し、HAを含有するデザイナーマトリックスの更なるメカニズム的研究をサポートする。
HELPマトリックスは、この特定の細胞源に適しているだけでなく、マウスの腸管オルガノイドだけでなく、ヒトのiPSC由来の肝臓オルガノイドもサポートしている(図8)。したがって、再現可能なオルガノイド培養に利用可能な最小限のマトリックスのライブラリにHELPマトリックスを追加するために役立つ。これらの結果は、生化学的リガンド密度、マトリックス剛性、及びマトリックス応力緩和速度(図4)を含むいくつかの材料特性のオーダーメイドテーラリングと組み合わせて、HELPマトリックスを、多種多様な患者由来のオルガノイドの培養のために最適化され得るプラットフォームとして位置付ける。明確に定義された最小限の操作されたマトリックスは、PEGの使用を回避しながら、EHSマトリックスの主な制限、特にバッチ間の可変性、不十分なチューナビリティ、生物学的複雑さ、及び臨床的翻訳性を克服する。将来的には、HELPマトリックスは、患者固有のマトリックス特性を模倣するようにカスタマイズされ、再現可能で個別化されたオルガノイド培養をもたらす可能性がある。ヒト腸管及び他のオルガノイドの培養を可能にすることにより、HELP材料は、腸疾患病理学、発達生物学、及び再生医療の研究を含む多くの将来の用途を有する。
材料及び方法
EHSマトリックスにおけるヒトエンテロイドの継代培養及び維持培養。ヒトの一次腸組織を、全ての実験のために継代4~24の間で使用した。維持培養物中の細胞を、24ウェルプレート内の40μLのEHSマトリックス、特にCultrex基底膜抽出低減成長因子(BME-RGF)タイプ2(Trevigen,Gaithersburg,MD)にカプセル化入しながら維持した。エンテロイドは、成長速度に応じて1~2週間ごとに継代した。エンテロイドを継代させるために、Cultrex液滴を、氷冷、5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に浸して、ゲルを溶解させ、500×gで5分間遠心分離し、TrypLE(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)で37℃で10分間処理し、5分ごとにピペット吸引によって激しく混合して、単一細胞の生成を支援した。次いで、TrypLEをエンテロイド成長培地(以下に記載)でクエンチし、500×gで5分間遠心分離した。ペレットを細胞計数のために成長培地中で洗浄し、次いで、500×gで5分間遠心分離した。細胞ペレットを750,000細胞/mLの濃度で氷冷Cultrex中に再懸濁させ、細胞培養インキュベーターに移した。37℃で10分間のゲル化の後、500μLの予め加温された成長培地を各ウェルに添加した。小分子阻害剤10μMのY-27632及び2.5μMのCHIR-99021(両方ともBio-Techne,Minneapolis,MNから入手)を、維持培養の第1の培地変化のために培地に添加した。培地を3~4日ごとに完全に交換した。
EHSマトリックスにおけるヒトエンテロイドの継代培養及び維持培養。ヒトの一次腸組織を、全ての実験のために継代4~24の間で使用した。維持培養物中の細胞を、24ウェルプレート内の40μLのEHSマトリックス、特にCultrex基底膜抽出低減成長因子(BME-RGF)タイプ2(Trevigen,Gaithersburg,MD)にカプセル化入しながら維持した。エンテロイドは、成長速度に応じて1~2週間ごとに継代した。エンテロイドを継代させるために、Cultrex液滴を、氷冷、5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に浸して、ゲルを溶解させ、500×gで5分間遠心分離し、TrypLE(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)で37℃で10分間処理し、5分ごとにピペット吸引によって激しく混合して、単一細胞の生成を支援した。次いで、TrypLEをエンテロイド成長培地(以下に記載)でクエンチし、500×gで5分間遠心分離した。ペレットを細胞計数のために成長培地中で洗浄し、次いで、500×gで5分間遠心分離した。細胞ペレットを750,000細胞/mLの濃度で氷冷Cultrex中に再懸濁させ、細胞培養インキュベーターに移した。37℃で10分間のゲル化の後、500μLの予め加温された成長培地を各ウェルに添加した。小分子阻害剤10μMのY-27632及び2.5μMのCHIR-99021(両方ともBio-Techne,Minneapolis,MNから入手)を、維持培養の第1の培地変化のために培地に添加した。培地を3~4日ごとに完全に交換した。
マウスのエンテロイド単離及び培養。マウス腸管エンテロイドを、前述のように生成した。簡潔に述べると、単離されたマウスの小腸を縦方向に切断し、冷たいPBSで洗浄した。次いで、組織をおおよそ5mmの正方形の断片に粉砕し、冷たいPBSで再度洗浄した。次いで、組織を氷上のPBS中の2mMのEDTA中でインキュベートした。このインキュベーションの後、EDTA溶液を吸引し、次いで、組織断片を、冷PBSを使用して10mLの血清学的ピペットとよく混合し、組織を沈降させた。上清を廃棄し、腸内陰窩を含有する沈降物をPBS中に再懸濁した。試料を激しく混合し、次いで500×gで5分間遠心分離し、次いで、陰窩が豊富な上清を70μmの細胞ストレーナ(BD Biosciences,San Jose,CA)に通した。陰窩を200×gで3分間再度遠心分離し、単一細胞を分離した。主に純粋な陰窩の一部は、培養のために使用された。
ヒト肝臓オルガノイドの分化及び培養。肝臓オルガノイドは、前述のように生成した。簡潔に述べると、正常なiPSC由来の二次肝臓オルガノイド(HO2)を、0.25%トリプシン-EDTA中で5~10分間消化した。200×gで3分間の遠心分離によって細胞を収集し、25μlの1%HA中に再懸濁し、24ウェルプレート中で1ウェル当たり1,000個の細胞で、予めロードされた25μlの1%ELPと直接混合した。HELP固化後、1mlの成長培地を添加し、細胞を6日間培養した。成長培地は、250nMのLDN-193189、3μMのCHIR99021、10μMのA83-01、100ng/mlのEGF、10ng/mlのFGF10、及び20ng/mlのHGFを有するRPMI+B27(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)培地からなった。次いで、10μMのDAPT、10ng/mlのオンコスタチンM、20ng/mlのHGF、10μMのデキサメタゾン、及び10ng/mlのBMP4を補充したHCM(Lonza,Basel,SUI)培地からなる分化培地中で更に6日間細胞を培養した。HO上でフォルスコリン誘発性腫脹アッセイを実施するために、フォルスコリン(FSK)及び3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)(それぞれ10μM及び100μM)の両方を添加して、cAMP経路を活性化し、HO培養物中のCFTR(嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター)機能を24時間増大させた。細胞透過性蛍光色素カルセイングリーンの10μM溶液で染色した後、腫脹を視覚化した。次いで、24時間治療後の各肝臓オルガノイドの総面積の差を計算し、プロットした。
腸内オルガノイド成長培地生成。オルガノイド成長ベース培地は、ADMEM-F12培地(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)及びL-WRN(ATCC CRL3276)条件培地の1:1混合物からなっていた。L-WRN条件培地を生成するために、L-WRN細胞を、L-WRN成長培地(10%FBS及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(PSQ)を補充したダルベッコ改変必須培地(DMEM))中のT150細胞培養フラスコ上にプレーティングし、1~2日間成長させた。成長培地を変更し、L-WRN選択培地(G418の各々500μg/mLを補充したL-WRN成長培地、及びWnt-3A、R-spondin 3、及びNogginの分泌をコードするトランスジェニックDNAを含有する細胞を選択するためのヒグロマイシン抗生物質)を補充した。細胞をコンフルエントになるまで成長させ、1:4の比率で2回分割し、次いで複数のT150フラスコに分割した。細胞をL-WRN成長培地中でコンフルエントまで培養し、L-WRN回収培地(10%FBS及び1%PSQを有するADMEM-F12)で洗浄し、新鮮なL-WRN回収培地で24時間培養した。24時間後、各フラスコから条件培地を回収し、組み合わせた。新鮮なL-WRN回収培地を交換し、条件培地生成及び回収を最大4回繰り返した。ADMEM-F12をL-WRN条件培地と1:1で混合し、以下の試薬を補充した。1mMのHEPES(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、1xGlutamax(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、10mMのニコチンアミド(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、1mMのN-アセチルシステイン(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、1xB-27サプリメント(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、0.5μMのA83-01(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、1xPSQ(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、10nMのGastrin-I(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、10μMのSB-202190(Bio-Techne,Minneapolis,MN)、50ng/mLの組換えEGF(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、及び1xNormocin(InvivoGen,San Diego,CA)。
腸内オルガノイド分化腸内エンテロイドをオルガノイドに分化させるために、細胞を、HELP又はEHSマトリックス中の単一細胞としてカプセル化した後、成長培地中で10日間維持し、PBSで短時間洗浄し、分化培地中に5日間培養した。分化培地は、1xGlutamax、1xペニシリン/ストレプトマイシン、1xNormocin、100ng/mLの組換えnoggin(Peprotech, Rocky Hill,NJ)、1xB27、1mMのN-アセチルシステイン、50ng/mLの組換えEGF、10nMガストリン-I、10μMのY-27632 ROCK阻害剤、5μMのDAPT及び500nMのA83-01を補充したAdvanced DMEM/F12培地であった。
ELP-ヒドラジン合成。エラスチン様タンパク質(ELP)を、前述のように調製した。簡潔に述べると、ELP配列をpET15bプラスミドにクローニングし、T7プロモーターを使用してタンパク質発現を制御した。ELPをコードするプラスミドを含有するBL21(DE3)pLysS大腸菌(Life Technologies)をテリフィックブロス中で0.8のOD600まで培養し、1mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を使用して発現を誘導した。細菌にタンパク質を7時間発現させ、その後遠心分離によって採取し、10個の緩衝液(10mMのトリス、1mMのEDTA、及び100mMのNaCl、pH8.0)中に懸濁し、3サイクルの凍結融解によって溶解した。細胞溶解物をデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)及び1mMのフェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)で処理して、タンパク質分解を阻害した。ELPを、4℃及び37℃での遠心分離工程の交互の配列によって精製し、続いて脱イオン水に対して4シフト(48時間、1シフト当たり4Lの体積)の透析を行い、次いで-80℃で凍結し、凍結乾燥した。ヒドラジン官能基でELPアミンを修飾するために、凍結乾燥ELP(210mg)を無水ジメチルスルホキシド(DMSO)3mL中7重量%で完全に溶解し、次いで無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)3mLで3.5重量%に希釈した。丸底フラスコ中で、3mLの無水DMFを使用して、三Boc-ヒドラジノ酢酸(2当量:ELPアミン)、ヘキサフルオロホスフェートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム(HATU、2当量:ELPアミン)、及び4-メチルモルホリン(4.5当量:ELPアミン)を別々に溶解させ、この容器を5分間撹拌して、HATUが三Boc-ヒドラジノ酢酸上の遊離酸を活性化させることを可能にした。次に、丸底フラスコに撹拌しながらELP溶液を滴下した。反応物を室温(RT)で一晩進行させた。生成物を氷冷エーテル中で沈殿させ、遠心分離し、乾燥させ、Boc保護ELP-ヒドラジン中間体を得た。この中間体を1H NMRによって分析し、修飾効率(500Hz、DMSO-d6)δ7.00(d,2H),6.62(d,2H),1.46(m,27H)を定量化した。修飾効率は、Bocプロトン(δ1.5~1.35)の積分シグナルを、ELP上のチロシン残基の芳香族プロトン(δ7.00及び6.62)と比較することによって決定した。Boc保護基を除去するために、ELP-ヒドラジン中間体を2重量%で1:1のDCM:TFA中に2.5%v/vのトリイソプロピルシランで溶解し、通気丸底フラスコ中で室温で4時間撹拌した。生成物をエーテル中で沈殿させ、遠心分離し、乾燥させ、次いで脱イオン水に溶解させ、脱イオン水に対して3シフト(24時間、1シフト当たり4Lの体積)透析し、凍結乾燥させた。
ヒアルロン酸修飾。100kDaのヒアルロン酸ナトリウム(HA,Lifecore Biomedical,Chaska,MN,USA)を、以下の全体的な手順によって、アルデヒド官能基を有するように修飾した。最初に、HA上のカルボン酸基をプロパルギアミンでアミド化し、HA-アルキン中間体を生成し、次いで、銅クリック化学を使用して、このアルキンを、アルデヒド官能基を含有するヘテロ二官能性小分子のアジド部分と反応させ、HA上にアルデヒド官能化したHAを生成した。
12%の修飾のHAアルキン。HAを2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液(0.2M、pH4.5)中に溶解させ、10mg/mLの濃度にした。本溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS、HA二量体単位に対して0.8当量)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC、0.8当量)、及びプロパルギルアミン(0.8当量)を連続して添加した。pHを6に調整した後、混合物を室温で4時間撹拌した。次いで、溶液を脱イオン水に対して6シフト(3日間、1シフト当たり4Lの体積)透析し、凍結乾燥させて白色粉末を得た。
30%の修飾のHAアルキン。ヒアルロン酸ナトリウムをMES緩衝液(0.2M、pH4.5)中に溶解させ、10mg/mLの濃度にした。この溶液に、NHS(HA二量体単位に1.5当量)、EDC(1.5当量)、及びプロパルギルアミン(1.0当量)を連続して添加した。pHを6に調整した後、混合物を室温で4時間撹拌した。次いで、溶液を脱イオン水に対して6シフト(3日間、1シフト当たり4Lの体積)透析し、凍結乾燥させて白色粉末を得た。
次いで、HA-アルキンを以下の小分子、1によって修飾して、HA-ベンズアルデヒドを生成した。小分子を、以下のように生成した。
N-(2-アジドエチル)-4-ホルミルベンズアミド(1)を、Biomaterials,2018,154,213-222に公開された方法に従って合成した。わずかな修飾を加えて、以前に報告された手順に従って、分子1でHAを修飾した。HA-アルキン(300mg)をPBS中に2重量%で溶解させ、続いて1(HA二量体単位への1当量)を添加した。最小量のDMSOを使用して、HA溶液に添加する前に1を溶解させた。次いで、溶液をN2で30分間泡立てた。硫酸銅(II)五水和物(0.004当量)及びアスコルビン酸ナトリウム(0.06当量)を脱イオン水に溶解し、N2で泡立て、HA溶液に添加した。室温で1日間撹拌した後、混合物を脱イオン水に対して3日間透析し、凍結乾燥した。ベンズアルデイド部分上の芳香族環のプロトンシグナルはトリアゾール基と重複するため、HA-ベンズアルデヒド上の修飾の程度は、HA骨格のN-アセチルグルコサミン上のメチル基の修飾に対するプロトンシグナル(δ=7.5-8,5H)の積分によって定量化した(δ=1.8,3H)。
HA-アルデヒド合成。HA-アルデヒドを、Biomaterials,2009,30,2499-506に公開された方法に従って合成した。HAをミリQ(Milli-Q)水中で0.4w/v%で最初に溶解させ、室温で撹拌した。0.1Mの過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液を滴下し、反応物を暗所にて室温で一晩撹拌した。翌日、エチレングリコールを1時間添加して、任意の未反応の過ヨウ素酸塩を不活性化した。次いで、ミリQ水に対して10,000MWCO膜を用いた透析によって、溶液を3日間精製し、新鮮な水を12時間シフトで交換した。透析後、凍結乾燥を介して乾燥生成物を得た。
ポリエチレングリコール-ベンズアルデヒド(PEG-BZA)合成。PEG-BZAを前述のように合成した。簡潔に述べると、4-ホルミル安息香酸(0.528g、3.52mmol、1アミン当たり2.1当量、Sigma)を5mLの無水ジメチルホルムアミド(DMF、Sigma)に溶解し、HATU(1.216g、3.2mmol、2当量、Sigma)及び4-メチルモルホリン(0.792mL、7.2mmol、4.5当量、Sigma)で活性化した。反応物を5分間撹拌した後、5mLのDMF中に溶解させた4アーム10kDaのPEG-アミン(4g、0.2mmol;Creative PEGworks)を添加し、総反応体積10mLとした。反応物を室温で一晩撹拌した。最終ポリマーをエチルエーテル(Thermo Fisher)中で沈殿させ、22,000rcfで20分間遠心分離によってペレット化し、ミリQ水中で再溶解させた。PEG-BZAを、ミリQ水に対して、4℃で3日間透析し(MWCO:3,500Da、Spectrum)、透析水を1日2~3回交換した。PEG-BZAを凍結乾燥し、-20℃で保管した。PEG-BZAの修飾は、1H-NMR(500MHz)を使用して推定した。PEG-BZAを、10mg/mLで重水(D2O;Sigma)中で溶解した。δ=9.9ppm(1H、s、アルデヒド)、δ=7.93及び7.82ppm(各々2H、d、ベンゼン環)、δ=3.56(1アーム当たり217H、s、PEG)である。
操作されたヒドロゲルの形成及びレオロジー的特性決定。応力制御されたARG2振動レオメータ(TA)で、ジオメトリとレオメータステージとの間に28μmのギャップを有する直径20mmの1°コーンプレート形状を使用して機械的試験を実施した。2つのヒドロゲル成分をPBS中2重量%で別々に溶解させ、氷上に保持した。まず、25μLのHAゲル成分をレオメータステージの中央にピペットし、次いで25μLのELP成分をHAの液滴に直接ピペットし、ピペット先端を使用して成分を混合した。レオメータヘッドを速やかに下げ、ヒドロゲル成分を1Hz下、1%のひずみ振動剪断下で、室温で10分間、及び37℃で5分間反応させた。このプロトコルの直後に、0.1~10Hzの周波数掃引が1%のひずみで行われた。貯蔵及び損失係数は、これらの測定から1Hzでの値とした。応力緩和測定のために、試料を室温で10分間、1Hz下で37℃で10分間、1%の振動剪断下で、in situでゲル化させ、次いで5%のステップひずみを適用した。応力緩和応答を少なくとも45分間測定した。各材料のt1/2は、応力が安定化した初期値の50%まで減衰した時間として計算した。測定は少なくとも3回行われた。
操作されたマトリックス内の細胞カプセル化細胞含有HELPヒドロゲルを形成するために、ELP及びHAゲル成分を別々に溶解して、PBS中で2w/v%ストック溶液を形成した。解離した培養物を生成するために、上記のように細胞を継代させ、ペレットをELP-ヒドラジン成分中に懸濁させ、氷上に保持した。3μLの選択された修飾HA成分を6μLのシリコーンモールド(直径4mm、高さ0.5mm、12mmの円形#1カバーガラスに結合した血漿)の底部に添加した。次いで、3μLのELP細胞溶液を、修飾HAの液滴中に直接ピペットでピペッティングした。次いで、ピペット先端を使用して、2つのヒドロゲル成分を混合し、ヒドロゲル内の細胞を均一に分散させた。ヒドロゲルを室温で10分間、次いで37℃で10分間架橋させ、その後、750μLの成長培地を添加した。ELPのみのゲルを形成するために、非修飾ELPタンパク質を、4℃で3.25w/v%の濃度でPBS中に溶解させた。架橋剤テトラキス(ヒドロキシメチル)塩化ホスホニウム(THPC)の5倍溶液を、PBS中で1:750を希釈することによって調製した。細胞を上記のように継代させ、ペレットを非修飾ELP成分中に再懸濁し、氷上に保持した。次いで、ELP溶液をTHPCと4:1のELP:THPC体積比で混合し、ピペット吸引によりよく混合した後、ELP-THPC混合物をシリコーンガラスモールドにピペッティングした。ELPのみの培養物を、室温で15分間、続いて37℃で15分間架橋させた。ELP-PEGゲルについては、上記のようにエンテロイドを継代し、氷上で4w/v%のELP-ヒドラジン中に単一細胞を懸濁した。次いで、3μLの8w/v%のPEG-BZA成分を、プレートを氷上に保持しながら、6μLのシリコーンガラスモールドの底にピペッティングした。次いで、細胞を含む3μLのELP成分をPEG成分に添加し、ピペット先端と旋回させながら混合した。次いで、これらのゲルを4℃で1時間、続いて室温で15分、続いて37℃で15分架橋させ、続いて750μLの予め加温された成長培地を添加した。再埋め込み培養のために、EHSマトリックス中のエンテロイドを、氷上の5mMのEDTAとともに45~60分間インキュベートして、マトリックスを完全に解離させ、次いで、500×gで5分間遠心分離した。次いで、細胞を成長培地で洗浄し、500×gで5分間再度遠心分離した。細胞播種密度をほぼ一定に保つために、単一細胞に解離していた同等の維持培養ウェルからの細胞数を常に実施し、再埋め込みされたエンテロイド播種密度を制御できるように、維持培養の同等の体積がほぼ同等の細胞数を有するという仮定を行った。増殖培地を3~4日ごとに交換した。全ての腸管エンテロイド実験において、小分子阻害剤Y-27632及びCHIR-99021は、EHS維持培養物のように培地に含まれなかった。
HELPマトリックスにおけるエンテロイド継代。HELP中のエンテロイドは10~14日ごとに継代した。HELPのエンテロイドを継代させるために、マトリックスは、まず、PBS中に溶解した、ブタ膵臓由来の100U/mLエラスターゼ(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)及びウシ睾丸由来の2500U/mLヒアルロニダーゼ(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)で分解した。培養培地を、シリコーン型の上面を含む培地ウェルから完全に吸引した。この上面を乾燥させると、ゲル体積に等しいエラスターゼ-ヒアルロニダーゼ混合物の液滴をゲルの上に添加した。ゲルを37℃で1時間インキュベートして、完全なマトリックス分解を可能にした。次いで、酵素を希釈するために、過剰な成長培地中の15mLの円錐遠心分離管中に、エンテロイドをピペッティングした。エンテロイドを500×gで5分間スピンダウンさせ、次いでペレットを成長培地で洗浄し、500×gで5分間再度遠心分離した。次いで、上記のようにエンテロイドを継代し、上記のように単一細胞をHELPにカプセル化した。
エンテロイドの形成及び成長分析。エンテロイド形成効率を分析するために、最大100個のエンテロイドを、条件ごとに3つの別々のゲルについて、ゲルごとに分析した。EHSマトリックス又はHELP材料中でのカプセル化後4~6時間以内に、初期細胞培養は、単一細胞のみの存在を確実にするために、明視野顕微鏡下で観察される。3日ごとに、各ウェルの明視野画像を10倍の倍率で撮影した。各時点での各ウェルについて、3つの視野がランダムに選択され、3つのzスライスが各視野で撮影された。エンテロイド成長を分析するために、Wacom Intuos錠剤を使用して、エンテロイドの輪郭をトレースし、FIJI(ImageJ、NIH)の粒子分析機能を使用してエンテロイドサイズを定量化した。以前に報告されたエンテロイド形態に基づいて、2000μm2のエンテロイド形成閾値を選択した。形態学的基準を、生存可能なエンテロイドを、ひどく変形したエンテロイドから分離するためにも適用した。この分析から、各ウェルについて、エンテロイドサイズ及び数を収集した。各画像のサイズ、及び3つのzスライスについてのおよそ250μmのz体積を使用して、各ウェルにおけるzスタック体積あたりのオルガノイド数を外挿し、均一な細胞分布を仮定して、初期細胞播種密度と比較することによって、各ウェルのオルガノイド形成効率を計算した。次いで、各条件の形成効率を、3つのウェルの平均として計算した。平均エンテロイドサイズを計算するために、プールされた3つのウェルについて分布統計を生成した。外れ値は、以下のようにデータセットから除外された。
外れ値>1.5*Q3-Q1+Q3、ここで、Q3はデータの第3四分位数、Q1はデータの第1四分位数である。
次いで、条件ごとの3つのウェルの平均として、平均エンテロイド断面積を計算した。
外れ値>1.5*Q3-Q1+Q3、ここで、Q3はデータの第3四分位数、Q1はデータの第1四分位数である。
次いで、条件ごとの3つのウェルの平均として、平均エンテロイド断面積を計算した。
免疫細胞化学。固定のための試料を調製するために、各ウェルを予め加温されたPBSで短時間洗浄した。細胞を、PBS中0.1%のグルタルアルデヒドを含む750μLの予め加温された4%パラホルムアルデヒド(PFA)を添加し、37℃で30~45分間インキュベートすることによって固定した。次いで、固定溶液を吸引し、PBSによって3回5分間洗浄した。細胞をPBS(PBST)中の0.25%v/vのTritonX-100で30分間透過化し、次いで、5重量%のウシ血清アルブミン(BSA)、5%v/vヤギ血清、及び0.5%v/vのTritonX-100でPBS中で3時間遮断した。2.5重量%のBSA、2.5%v/vのヤギ血清、及び0.5%v/vのTritonX-100(抗体希釈溶液)を用いて、一次抗体希釈液をPBS中で調製し、一次インキュベーションを4℃で一晩実施した。抗体溶液を除去し、PBST中で3回の5分間の洗浄を実施した。二次抗体を抗体希釈溶液中で1:500で希釈し、4℃で一晩インキュベートした。次いで、二次抗体溶液を除去し、PBSTでそれぞれ30分間2回洗浄した。DAPIの1:2000希釈及びファロジンの1:250希釈をPBST中で調製し、45分間インキュベートし、続いてPBSTの5分間の3回の洗浄を行った。次いで、試料を過剰な液体から乾燥させ、長方形のカバーガラスの上にProLong Gold Antifade封入剤の液滴上に反転させた。DMI4000 B共焦点顕微鏡(Leica,Wetzlar,Germany)上で撮像する前に、室温で暗所で48時間硬化させた。
定量的リアルタイムRT-PCR分析。ヒドロゲルをピペット先端を使用してシリコーン鋳型から除去し、ゲルを氷上で500μLのTrizol試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA)を含有する1.5mLのエッペンドルフ管に擦り取って移し、RNAを抽出した。次いで、溶液を超音波処理して、最適なRNA抽出のためのヒドロゲルの完全な分解を可能にした。フェノール-クロロホルム抽出を使用して、位相ロックゲル(Quantabio,Beverly,MA)でRNAを単離した。一定量のRNA(0.1~1μg)を、高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用して逆転写した。次いで、5μLのヌクレアーゼフリー水中の1μgのcDNAを、10μLのFast SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)と混合し、Applied Biosystems StepOnePlusリアルタイムPCRシステムで実行した。本研究で使用するプライマーを表S2に列挙する。
フローサイトメトリー分析。上記の方法に従って、エンテロイドを単一細胞に解離させた(EHSマトリックスにおけるヒトオルガノイド継代及び維持培養並びにHELPマトリックスにおけるエンテロイド継代を参照)。細胞を500×gで5分間遠心分離してペレット化した。次いで、培地を各ペレットから除去し、細胞を、フルオロフォア共役一次抗体[BioLegend抗ヒトCD44抗体、BioLegend IgG2Bアイソタイプ対照]を補充したFACS緩衝液(PBS+1mMのEDTA[Invitrogen]+2%v/v FBS[Atlanta Bio]+1%ペニシリン/ストレプトマイシン[Gibco])中に再懸濁した。抗体染色を、暗所にて4℃で30分間実施した。染色後、FACS緩衝液を使用して細胞を2回洗浄し、DAPI(1:10,000、BioLegend)で200μLのFACS緩衝液中に再懸濁させて、生細胞を選択した。Beckman Coulter CytoFlex analyzer(Stanford Stem Cell Institute FACS Core)でフローサイトメトリーを実施した。データを分析するために、ゲートは、セルダブレットを識別するために使用される高さ及び幅を有する前方及び側方散乱を使用して決定された。続いて、全てのマーカー分析及び集団頻度計算のために、生DAPI陰性細胞をゲート化した。
統計分析。この出版物の全ての有意性検定には、次の統計的有意性表現が使用される。*、#=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001、***=p<0.0001。個々の平均を比較するために、図1g及びS3からのデータを、Tukey事後検定を用いた一元配置分散分析によって分析した。図2dからのデータを、非対両側スチューデントt検定を介して分析し、各材料の未分化条件と分化条件との間の遺伝子発現変化を比較した。図3d、4c、4f、及びS4からのデータを、両側スチューデントのt検定を使用して分析した。個々の平均を比較するために、図4e及び4hからのデータを、Tukey事後検定を用いた二元配置分散分析によって分析した。図S7のデータは、Dunnの多重比較検定によるKruskal-Wallis検定を使用して分析された。全ての統計分析は、GraphPad Prism 8.0ソフトウェア(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)を使用して実施した。
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関連出願の相互参照
本出願は、2020年11月6日に出願された米国仮特許出願第63/110,667号の利益及び優先権を主張し、その開示全体が本明細書に記載されている。
本出願は、2020年11月6日に出願された米国仮特許出願第63/110,667号の利益及び優先権を主張し、その開示全体が本明細書に記載されている。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、2021年11月3日に作成され、21000バイトのサイズを有するテキストファイル(STAN-1763WO_SEQ_LIST_ST25.txt)で本明細書とともに提供される。テキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に
組み込まれる。
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Claims (24)
- 2成分ヒドロゲルマトリックスシステムであって、
定義された比率の、ペンダント反応基アルデヒドを含むように修飾されたヒアルロン酸(HA)及び/又はペンダント反応基ベンズアルデヒドを含むように修飾されたHAを含む第1の成分と、
ペンダント反応基ヒドラジンを含むように修飾されたエラスチン様タンパク質(ELP)を含む第2の成分と
を含み、
前記第1の成分と前記第2の成分との間に架橋結合が形成され、混合時にヒドロゲルが生成される、
2成分ヒドロゲルマトリックスシステム。 - マトリックス剛性が、独立して、前記第1の成分上に存在する反応基の前記第2の成分上に存在する反応基に対する比率を変化させることによって調整される、請求項1に記載のシステム。
- 反応基の比率が、HA上の反応基の数を特定すること、ELP上の反応基の数を特定すること、及びHA:ELPの比率を特定することのうちの1つ以上によって変化する、請求項1又は2に記載のシステム。
- マトリックス応力緩和速度が、独立して、前記第1の成分中のペンダントアルデヒドを含むように修飾されたヒアルロン酸とペンダントベンズアルデヒドを含むように修飾されたヒアルロン酸との比率を変化させることによって調整される、請求項1~3のいずれか一項に記載のシステム。
- ペンダントアルデヒドを含むように修飾されたヒアルロン酸と、ペンダントベンズアルデヒドを含むように修飾されたヒアルロン酸との比率が、100:0~0:100である、請求項1~4のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ELPが、1~7個のエラスチン様モチーフを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記エラスチン様モチーフが、配列番号23、24、及び25から選択される、請求項6に記載のシステム。
- 前記ELPが、1つ以上の細胞接着配列モチーフ、又はスクランブルRGD若しくはRGD欠失を含む、15~45アミノ酸長の細胞接着ドメインを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記細胞接着配列モチーフが、RGD又は配列番号3~配列番号9のうちのいずれかから選択される、請求項8に記載のシステム。
- 前記ELPが、配列番号1及び配列番号2の一方又は両方を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ヒドロゲルの細胞接着ペプチド濃度が、細胞接着モチーフを含むELPの細胞接着モチーフを欠くELPに対する比率を変化させることによって調整される、請求項8~10のいずれか一項に記載のシステム。
- 細胞接着モチーフを含むELPの細胞接着モチーフを欠くELPに対する比率が、100:0~0:100である、請求項11に記載のシステム。
- 前記ELPが、3~20個のヒドラジン基を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ヒドロゲルが、最大約1.5mMのRGDを含む、請求項1~13のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ヒドロゲルが、シリンジ又はカテーテルを介して押し出すことができる、請求項1~14のいずれか一項に記載のシステム。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載のシステムから形成される、ヒドロゲル。
- 請求項16に記載のヒドロゲルを含む、細胞培養培地。
- 哺乳類細胞を培養する方法であって、
哺乳類細胞の開始集団を請求項16に記載のヒドロゲル中にカプセル化することと、
カプセル化された前記哺乳類細胞を好適な培地中に維持することと
を含む、方法。 - 前記哺乳類細胞の開始集団が、単一細胞懸濁液を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞の開始集団が、幹細胞を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞の開始集団が、組織移植片を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞の開始集団が、培養物中でオルガノイドに分化する、請求項18~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞の開始集団が、腸細胞を含む、請求項18~22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒドロゲルを酵素的に分解することによって、カプセル化細胞が継代する、請求項18~23のいずれか一項に記載の方法。
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