JP2023548396A - コロナウイルスを予防および治療するための組成物および方法 - Google Patents

コロナウイルスを予防および治療するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

有効量のブラックシードオイルなどの有効量のチモキノンを対象に投与することを含む、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９感染などのコロナウイルスを予防または治療する方法。

Description

本発明は、コロナウイルス（例えば、COVID-19）を予防および治療するための組成物（例えば、Nigella sativa種子から抽出された組成物）および方法に関する。
SARS-CoV-2（COVID-19）は、2019年12月に中国の武漢で初めてヒトの病気として同定され、その後、3500万人以上が感染して世界的な大流行に至った。ウイルスがどのように広がっているかはまだ完全にはわかっておらず、現在研究されているが、ほとんどの場合、感染者の汚染された空気中の飛沫を介して伝播すると考えられている。この疾患の最も一般的な症状は発熱、咳、無気力であるが、ウイルスは永続的な肺の瘢痕化、呼吸不全、および最も重篤な症例での死亡につながる可能性がある。より軽度の感染症では、治療は通常、ウイルスがその経過をたどる間、自宅での安静に限られる。しかしながら、より重篤な例については、現在の治療では、デキサメタゾン、レムデシビル、およびモノクローナル抗体が含まれるが、SARS-CoV-2の治療に対して公式に承認されている薬剤はない。したがって、COVID-19を治療するための効果的な治療法が依然として必要である。
新しく出現したCOVID-19に加えて、ヒトコロナウイルス（HCoV）の6つの異なる株が報告されている。コロナウイルスは、約30kbのエンベロープをもつ正の一本鎖RNAウイルスである。それらは多種多様な宿主種に感染する。コロナウイルスは、本質的に、ゲノム構造に基づいてα、β、γ、δの4属に分類される。αおよびβコロナウイルスは哺乳類のみに感染する。229EおよびNL63などのヒトコロナウイルスは、普通の風邪と咽頭炎の原因であり、αコロナウイルスに属する。対照的に、SARS-CoV、OC43、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）およびSARS-CoV-2は、βコロナウイルスに分類される。SARSおよびMERS HCoVは最も攻撃的なコロナウイルス株であり、それぞれ、約800例の死亡をもたらしている。WHOによると、SARS HCoVの死亡率は10%であるが、MERS HCoVの死亡率は36%である。
ヒトコロナウイルス229Eは、HCoV-229Eとしても知られ、1960年代に初めて同定されたコロナウイルスの一種である。コウモリにも感染することがわかっているが、主にヒトに感染する。それは、風邪を引き起こす最も一般的なウイルスの１つと考えられており、ライノウイルスに次ぐものである。HCoV-229Eは、飛沫呼吸（すなわち、感染者のくしゃみまたは咳の飛沫を介して）および感染者または表面の物理的接触を介して伝播する。このウイルスは、12月から4月にかけてほとんどの場合活性があり、夏の月にはほとんど見られない。症例はより軽症である傾向があるため、症状は平均的な風邪と同様に現れる傾向があり、最も一般的なものは咽頭痛、鼻水、発熱である。しかし、より重篤な症例が発生することが知られており、主に免疫不全患者において、肺炎や気管支炎などの下気道感染症を引き起こす可能性があり、生命を脅かす可能性がある。HCoV-229Eに利用できる特別の薬物または治療法はないが、適切な水分補給とともに、発熱および疼痛治療薬がウイルスの経過に伴った症状の緩和に役立つことが明らかにされている。
ヒトコロナウイルスNL63（HCoV-NL63）は、ヒトに感染するコロナウイルスの新しい鎖（ストランド）である。既知の最初の症例は2004年にオランダの生後７か月の乳児で発見されたが、コウモリやヤシのシベットではずっと長い間存在することが知られていた。ウイルスがどのように伝播するかは完全にはわかっていないが、感染者や表面に触れることが、感染者からの飛沫とともに重要な役割を果たすと考えられている。HCov-NL63は主に小児、高齢者、および免疫不全患者にみられるため、症例はより重篤な傾向があり、一般的な症状は感染者の多くにおいて上気道感染、咽頭炎（クループ）、および気管支炎である。しかし、健康で二次的な健康上のリスクが全くない患者では、症例ははるかに軽度である傾向があり、咽頭痛および咳の症状はそれほど重度ではない。HCov-NL63の治療は感染によって異なる。軽症から中等症の場合、ウイルスは自然に消失する傾向があり、痛みや発熱の治療薬で緩和がみられる。より重症例では、抗ウイルス薬が治療として用いられることが多く、また、FDAによって公式に承認された治療法はないが、免疫グロブリンの静脈内投与が抑制薬として用いられる。
ヒトコロナウイルスHKU1（HCoV-HKU1）は、ヒトに感染することが明らかになった、より最近同定されたコロナウイルス鎖の１つである。2004年に香港の男性で初めて発見されたが、それはずっと以前にげっ歯類に由来したと考えられている。ヒトコロナウイルス鎖の多くと同様に、症状は通常比較的軽度であり、最も一般的には感冒と同様の症状を呈し、咽頭痛、咳、および頭痛は最も一般的な症状である。しかし、免疫機能が低下している人に発症するようなより重篤な症例では、症状が気管支炎や肺炎に進行し、生命を脅かすことがある。このウイルスは冬季後半に最も多く発生し、小児に最も頻繁にみられる。HCoV-HKU1の伝播は完全には理解されていないが、感染者の咳またはくしゃみの呼吸器飛沫を介して伝播すると理論づけられている。HCoV-HKU1に対する公式に承認されたワクチンや治療法はない。したがって、これらの他の形態のコロナウイルスを治療するための効果的な治療法が依然として必要である。
Ranunculaceae科の双子葉植物であるNigella sativaは、南ヨーロッパ、北アフリカおよび小アジア原産の白色または青色の花を持つブシの植物である。N. sativa植物からのフルーツカプセルには、一度空気にさらされると黒くなる白い三角形の種子が含まれる。ブラックシードとして知られるN. sativaの種子から得られた抽出油、ブラッククミンまたはHabatul-Bsarakahは、中東およびアジアで利用されており、他の治療成分（例えば、チモキノンの構造誘導体）の中でも活性成分であるチモキノンを含有する。
チモキノンは、直接合成でき、公的に入手可能である。例えば、中国特許公開公報第103288618A号；Millipore Sigmaのカタログ番号03416, 分析標準グレードを参照のこと。
本明細書で開示されている主題の一実施形態は、対象に治療有効量のチモキノン（例えば、これに限定されないが、ブラックシードオイルを含む組成物）を投与することを含む、対象におけるCOVID-19感染を予防または治療する方法を提供する。特定のある実施形態では、チモキノンを、COVID19感染を予防するために感染と診断される前に予防的に投与することができ、または代替的に、COVID-19を治療するために診断された（または推定された）感染の後に投与することができる。特定のある実施形態では、追加量のチモキノンをブラックシードオイルと共に投与することができる。さらに、本明細書で開示されている主題の他の実施形態は、チモキノン（例えば、ブラックシードオイル）と組み合わせて、抗レトロウイルス薬、例えばドルテグラビルをさらに投与することを含む。
他の実施形態では、本明細書に開示されている主題は、コロナウイルスを予防または治療する方法を提供する。例えば、コロナウイルスは、SARS-CoV （"SARS"）、SARS-CoV-2（"COVID-19"）、MERS-CoV、229E（αコロナウイルス）、NL63（αコロナウイルス）、OC43（βコロナウイルス）、およびHKU1（βコロナウイルス）から選択することができる。
本明細書で開示されている主題の他の実施形態は、COVID19のようなコロナウイルスを治療するための有効量のチモキノン、またはCOVID-19のようなコロナウイルスを治療する際に使用するためにラベルされた薬剤を含む組成物の使用に関する。
本発明は、本明細書に添付されている請求項（これは引用することにより本明細書の一部である）によってそれぞれ定義されている一般的および特定の実施形態をさらに対象としている。
主題の開示の例示的な実施形態である以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことにより、よりよく理解されるであろう。本開示を例示する目的で、例示的な実施形態および例示的な実施形態からのデータを図面に示す。しかしながら、この主題の適用は、示された具体的な構成および手段に限定されないことを理解すべきである。
図1は、実施例2に記載されたSARS-CoV-2-Spike-AC19のプラスミドマップである。 図2は、実施例2に記載されたSARS-CoV-2-614G-Spike-ΔC19のタンパク質配列を示す。 図3は、実施例2に記載されたSARS-CoV-2-UK変異体Spike-ΔC19のタンパク質配列を示す。 図4は、実施例2に記載されたSARS-CoV-2-Delta変異体Spike-ΔC19のタンパク質配列を示す。 図5は、実施例2に記載されたSARS-CoV-2-ブラジル変異体Spike-ΔC19のタンパク質配列を示す。 図6は、実施例2に記載された、品質管理のために用いたExpi-293F-ACE2安定細胞株のタンパク質配列を示す。 図7は、実施例2に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、種々の濃度のブラックシードオイルに対する4つの菌株（614G、Delta、UK、およびブラジル）のルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図8は、実施例2に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、種々の濃度のチモキノンに対する4株（614G、Delta、UK、およびブラジル）のルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図9は、実施例2に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、種々の濃度のオレイン酸に対する4つの菌株（614G、Delta、UK、およびブラジル）のルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図10は、実施例2に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、種々の濃度のリノール酸に対する4つの菌株（614G、Delta、UK、およびブラジル）のルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図11は、実施例2に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、種々の濃度のパルミチン酸に対する4つの菌株（614G、Delta、UK、およびブラジル）のルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図12は、実施例2に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、チモキノンの存在下で種々の濃度のオレイン酸に対する4つの菌株（614G、Delta、UK、およびブラジル）のルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図13は、実施例2に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、チモキノンの存在下で種々の濃度のリノール酸に対する4つの菌株（614G、デルタ、英国、およびブラジル）のルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図14は、実施例2に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、チモキノンの存在下で種々の濃度のパルミチン酸に対する4つの菌株（614G、デルタ、英国、およびブラジル）のルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図15は、実施例2に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、オレイン酸の存在下で種々の濃度のリノール酸に対する4つの株（614G、Delta、UK、およびブラジル）のルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図16は、実施例2に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、オレイン酸の存在下で種々の濃度のパルミチン酸に対する4つの株（614G、Delta、UK、およびブラジル）のルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図17は、実施例2に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、リノール酸の存在下での種々の濃度のパルミチン酸に対する4株（614G、デルタ、英国、およびブラジル）のルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図18は、実施例3に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、種々の濃度のブラックシードオイルに対する、ルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図19は、実施例3に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、チモキノンの存在下での種々の濃度のブラックシードオイルに対する、ルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図20は、実施例3に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、種々の濃度のチモキノンに対する、ルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図21は、実施例3に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、ブラックシードオイルの存在下での種々の濃度のチモキノンに対する、ルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図22は、実施例3に記載のように、Codex EnerCount細胞増殖アッセイキットを用いた、種々の濃度のブラックシードオイルの、ルシフェラーゼ活性および細胞数を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図23は、実施例3に記載の、Codex EnerCount細胞増殖アッセイキットを用いた、チモキノンの存在下での種々の濃度のブラックシードオイルの、ルシフェラーゼ活性および細胞数を反映し相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図24は、実施例3に記載のように、Codex EnerCount細胞増殖アッセイキットを用いた、種々の濃度のチモキノンの、ルシフェラーゼ活性および細胞数を反映し相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図25は、実施例3に記載のように、Codex EnerCount細胞増殖アッセイキットを用いた、ブラックシードオイルの存在下での種々の濃度のチモキノンの、ルシフェラーゼ活性および細胞数を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。 図26は、実施例4に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、テムサビル、テムサビル+ブラックシードオイル、およびテムサビル+チモキノンの様々な濃度の、ルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。テムサビル単独群をトップラインとして示した。 図27は、実施例4に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、種々の濃度のドルテグラビル、ドルテグラビル+ブラックシードオイル、およびドルテグラビル+チモキノンの、ルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。ドルテグラビル+1μMチモキノン群をトップラインとして示した。 図28は、実施例4に記載のように、ホタルルシフェラーゼアッセイキットを用いた、種々の低濃度のドルテグラビル、ドルテグラビル+ブラックシードオイル、およびドルテグラビル+チモキノンの、ルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映した相対発光度（RLU）のプロットを示す。ドルテグラビル単独群をトップラインとして示した。 図29は、実施例5に記載のように、コホート1における試験群ごとの全症状負荷量のモデルに基づく変化を示しており、この場合、ブラックシードオイルを表す線は非線形であり、プラセボを表す線はより線形である。 図30は、実施例5に記載のように、コホート2における試験群別の全症状負荷量のモデルに基づく変化を示しており、ここでは、ブラックシードオイルを表す線は非線形であり、プラセボを表す線はより線形である。 図31は、実施例5に記載のように、コホート3における試験群別の全症状負荷量のモデルに基づく変化を示しており、ここでは、ブラックシードオイルを表す線は非線形であり、プラセボを表す線はより線形である。 図32は、コホート1における14日目の処置群（ブラックシードオイルおよびプラセボ）間の%CD45RA+CCR7+（%CD4 T）（%CD4 T細胞）の比較を示している。ブラックシード群を左側に、プラセボ群を右側に示す。 図33は、コホート1における14日目の処置群（ブラックシードオイルおよびプラセボ）間の%CD45RA+CCR7+（%CD8 T）（%CD8 T細胞）の比較を示している。ブラックシード群を左側に、プラセボ群を右側に示す。 図34は、コホート1における14日目の処理群（ブラックシードオイルおよびプラセボ）間のCD45RA+CCR7+CD8T（abs.）（/μL）の比較を示している。ブラックシード群を左側に、プラセボ群を右側に示す。
本発明は、実施例を含む以下の説明を参照することによって、より十分に理解することができる。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味をもつ。本発明の実施または試験において、本明細書に記載された方法および材料と同様または同等の方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料を本明細書に記載する。さらに、材料、方法、および実施例はあくまで例示であり、限定されるものではない。
簡略化のために引用される、本明細書に記載される特許出願、特許、および他の引用を含むすべての公表文献は、その全てが、参照により本明細書の一部である。しかしながら、そのような公表物の引用は、それが本発明の先行技術であることを認めるものと解釈してはならない。
本明細書中で使用される場合、用語「約」または「おおよそ」は、当業者により決定される特定の値についての許容可能な範囲内を意味し、その範囲は、その値がどのように測定されるかまたはどのように決定されるか、例えば、測定システムまたは技術の限界に依存し得る。例えば、「約」は、与えられた値のいずれかの側で、最大20%、最大10%、最大5%、または最大1%以下の範囲を意味することができる。あるいは、生物系またはプロセスに関して、「約」という用語は、数値のいずれかの側面において、1桁以内、5倍以内、または2倍以内を意味することができる。本明細書に記載される数量は、特に明記しない限り、近似的であり、明示的に記載しない場合、「約」または「おおよそ」という用語があると推定されることを意味する。 より正確な記述においては、本明細書中の定量的表現のいくつかは、"約"という用語は適切でない。
「約」という用語が明示的に使用されるか否かにかかわらず、本明細書中に記載された全ての量は、実際の所定の値と、そのような所定の値に対する実験および/または測定条件による同等および近似を含めて、当業者により合理的に推定されるであろう、そのような所定の値の両側における近似を意味すると理解される。収率が百分率として示されるときはいつでも、そのような収率は、特定の化学量論的条件下で得られるであろう、同一の実体の最大量に対する、実体の質量の収率を意味する。百分率で示される濃度は、特に示されない限り、質量比を意味する。
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用語「包含する」および「含む」は、本明細書において、それらの開放的、非限定的な意味で使用される。本明細書中で使用される他の用語および語句、ならびにそれらの変形は、特に明示されていない限り、限定するのではなく、オープンエンド（開放的）であると解釈すべきである。従って、用語「例えば」は、その網羅的または限定的なリストではなく、議論における当該項目の例示的な例を提供するために使用される。同様に、「従来型」、「伝統的」、「通常」、「基準」、「既知」、および類似の意味の用語などの形容詞は、記載された項目を所定の期間または所定の時期に利用可能な項目に限定するものと解釈すべきではないが、現在または将来いずれかの時点で利用可能または既知である従来型、伝統的、通常、または基準の技術を包含するように読まれるべきである。同様に、本明細書が、当業者に明らかであるか、または公知であろう技術について言及する場合、そのような技術は、現在または将来いずれかの時点で当業者に明らかであるかまたは公知である技術を包含する。
いくつかの例における「1つ以上」、「少なくとも」、「限定されるわけではないが」または他の類似の語句のような拡張する語句の存在は、そのような拡張する語句が存在しない場合に、より狭い例が意図されまたは必要とされることを意味するとは解釈されない。本明細書を読んだ当業者に明らかなように、例示の実施形態およびそれらの種々の代替物は、例示に実施例に限定することなく実施することができる。
用語「組成物」は、本明細書に記載された抽出物および担体を構成する不活性成分（薬学的に許容可能な賦形剤）を含む製品、ならびに２つ以上の成分の組合せ、複合体形成または凝集から、または１つ以上の成分の分離から、または１つ以上の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から、直接的または間接的に生じるあらゆる製品を包含することを意図している。特定の実施形態では、本明細書で使用される「組成物」は、薬学的に許容され、経口投与に適している。代替の実施形態では、本明細書で使用される「組成物」は、薬学的に許容され、局所投与に適している。
用語「担体」とは、化合物とともに投与されるアジュバント、ビヒクル、または賦形剤を意味する。本発明の特定の実施形態では、キャリアは固形のキャリアである。適した医薬品キャリアには、レミントン: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins （2005）に記載されているものが含まれる。
本明細書中で使用される用語「剤形」は、用量が被検体または患者に投与されるべき形態である。活性抽出物は、非薬物を含む製剤の一部として投与できる。剤形は、独特の物理的及び薬学的特性を有する。剤形は、例えば、固体、液体、ゲルまたは気体であり得る。「剤形」には、例えば、カプセル、錠剤、カプレット、ゲルカプレット（ゲルキャップ）、シロップ、口腔内または鼻腔内投与用の粉末またはスプレー、チュアブル形態、および経口液体溶液が含まれる。具体的な実施形態では、剤形は固体剤形であり、より具体的には、錠剤またはカプセル剤を含む。
本発明の組成物に関連して使用される「薬学的に許容可能」という用語は、そのような組成物の分子実体および他の成分を指し、それらは生理学的に許容可能であり、動物（例えば、ヒト）に、それらの意図された投与方法（例えば、経口または非経口）に従って投与された場合に、一般的に有害反応を生じない。
「薬学的に許容される賦形剤」とは、薬剤の投与を容易にするために薬理学的組成物に添加されるか、またはビヒクル、担体、または希釈剤として使用される、不活性物質のような、被験体への投与において、非毒性で、生物学的に許容され、かつ生物学的に適切な物質を指し、薬剤と適合するものを指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々の澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが挙げられる。適した医薬品キャリアには、レミントン: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott Williams & Wilkins （2005）に記載されているものが含まれる。
本明細書中で使用される「不活性」という用語は、記載された組成物のいずれかの不活性成分を意味する。本明細書中で使用される「非活性成分」の定義は、21 C.F.R. 201.3（b）（8）に定義される米国食品医薬品局の定義に従うものであり、これは有効成分以外の製剤の任意の成分である。
本明細書中で使用される「経口投与に適する」または「局所投与に適する」とは、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規（GMP）の下で製造される無菌の医薬製品を意味する。「経口投与に適している」または「局所投与に適している」という用語は、特にそのように記載されている場合には、連邦または州政府の規制当局によって承認されているか、または動物（例えば、哺乳類）、より詳細にはヒトに使用するために米国薬局方もしくはその他一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。
本明細書中で使用される用語「障害」は、「疾患」または「状態」と互換的に使用される。例えば、神経学的障害はまた、神経学的疾患または神経学的状態を意味する。
用語「治療」、「治療する」および「処置する」は、対象における病状に向けられた治療方法を包含し、以下を含む：（i）対象が病状に罹患しやすくなっているがまだそうであると診断されていない場合、特に、病状が生じるのを防ぐ；（ii）病状を抑制する、例えば、その発症（進行）を停止させるまたはその発症を遅らせる；および（iii）病状を緩和する、例えば、望ましいエンドポイントに達するまで、病状の退行を引き起こす。これらの用語はまた、疾患の症状を改善すること（例えば、疼痛、不快感、または欠損を減少させること）を含み、ここで、そのような改善は、疾患に直接的に影響し得る（例えば、疾患の原因、伝達、または発現に影響する）、または疾患に直接的に影響しない。
本明細書の開示で用いられる用語「有効量」は、「治療有効量」と交換可能であり、本明細書に開示された特定の疾患、状態、または障害を治療するのに有効な化合物または組成物の量または用量を意味し、したがって「治療」とは、所望の予防、抑制、緩和、または改善効果を生じることを含む。本発明による治療方法では、少なくとも１つの化合物の「有効量」を被験体（例えば、哺乳動物）に投与する。「有効量」は、化合物、疾患（およびその重症度）、所望される治療、対象の年齢および体重などに応じて変化する。
本明細書中で使用される場合、「組み合わせて」という語句は、被験体に同時に投与される薬剤を指す。被験体が２つ（またはそれ以上）の薬剤を同時に投与されるときはいつでも、２つ以上の薬剤が「組み合わせて（併用して）」投与されると考えられると理解される。２つ以上の薬剤の各々は、異なるスケジュールに従って投与され得るが、異なる薬剤の個々の用量が、同時にまたは同じ組成物によって投与されることは必要とされない。むしろ、２つ（またはそれ以上の）薬剤が被検体の体内に残っている限り、それらは「組み合わされて（併用して）」投与されると考えられる。以下に説明するように、例えば、ブラックシードオイル（またはチモキノン）は、ドルテグラビルと併用して投与することができる。
本明細書中で使用される場合、用語「調節」とは、パラメータの変化（例えば、結合相互作用または活性の変化など）を指す。調節とは、パラメータの増加または減少（例えば、結合の増加または減少、活性の増加または減少など）を指すことができる。
用語「個体」、「被験体」および「患者」は、本明細書では互換的に使用され、脊椎動物、特に哺乳類、より詳細には霊長類（ヒト以外の霊長類およびヒトを含む）であり得、臨床試験またはスクリーニングまたは活性試験との関連において実験動物を含む。したがって、当業者によって容易に理解され得るように、本発明の組成物および方法は、任意の脊椎動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトへの投与に特に適している。
本明細書中で使用される「ブラックのシードオイル」または「ブラックシードオイル」という用語は、nigella sativa種子から得られた組成物（例えば、抽出物）を意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「COVID-19」は、COVID-19の全ての変種を含む。
本発明の組成物は、単独で、または他の活性成分と組み合わせて、通常、経口または非経口投与により、一定期間にわたって単回投与または複数回投与にて、被験体に投与することができる。本明細書中で使用される用語「治療有効量」とは、被験体へのその投与後に治療的または有益な効果をもたらす本発明の組成物の量をいう。
物質の濃度は、その治療効果を発揮するように選択されるが、熟練した当業者の範囲と健全な判断内において、重大な副作用を回避するのに十分に低い量である。組成物の有効量は、治療される生物学的被験体の年齢および身体的状態、状態の重症度（例えば、COVID-19症状の重症度）、治療の期間、併用療法の性質、使用される特定の化合物、組成物または他の活性成分、使用される特定の担体、および類似の因子によって変化し得る。
当業者は、このような因子を容易に評価することができ、この情報に基づいて、意図された目的のために使用される本発明の組成物の特定の有効濃度および単位投与量を決定する。例えば、適切な投与量は、in vitroまたは動物モデル試験系に由来する用量－反応曲線を外挿することによって得ることができる。例えば、Goodman and GilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics, Joel G. Harman, Lee E. Limbird, Eds.; McGraw Hill, New York, 2001; The Physician's Desk Reference, Medical Economics Company, Inc., Oradell, N.J., 1995; およびDrug Facts and Comparisons, Facts and Comparisons, Inc., St. Louis, Mo., 1993）を参照できる。製剤中に使用される正確な用量はまた、投与経路、およびウイルス感染の重篤度に依存し、医師の判断および各患者の状況に応じて決定することができる。様々な投与パターンが当業者に明らかであろう。
本発明の組成物の投与のための用量範囲は、所望の治療効果を生じるのに十分な大きさのものである。
当業者は、本発明の組成物の適切な治療用量の初期適応が、インビトロおよびインビボ動物モデル系、ならびにヒト臨床試験において決定され得ることを認識するであろう。当業者は、動物試験およびヒトでの経験を用いて、毒性または他の副作用を発生させることなく安全に投与できる投与量を同定することを知っている。ある状況では、治療量は最大許容用量に近いことが好ましい。慢性的な予防的使用には、比較的低用量が望ましい。
ある非限定的な実施形態では、約100mg～約15g、または約200mg～約7000mg、または約300mg～約5000mg、または約500mg～約5000mgのブラックシードオイル、例えば、3gのブラックシードオイルを、1日当たり、被験体（例えば、ヒト）に投与して、既存のコロナウイルス感染（例えば、COVID-19）を、予防的に防ぐまたは治療することができる。これらの量は、1日1回、または1日を通して等間隔で数回にわたって投与することができる。投与量は、約1.5～2.5重量%のチモキノンの濃度を有するブラックシードオイルに基づいており、ブラックシードオイル中に存在するチモキノンの量に応じて、投与量は、より多くまたはより少なく調整される。
予防的に使用する場合には、比較的少量を投与することができる。ブラックシードオイルを用いてコロナウイルス感染を防止するある実施形態において、約250mgから約3000mg、または500mgから約1500mg、または約750mgから約1250mg （例えば1000mg）を、1日当たり、被験体（例えば、ヒト）に投与してコロナウイルス感染（例えば、COVID-19）を予防することができる。
ブラックシードオイルを用いて既存のコロナウイルス感染を治療するある実施形態において、約500mgから約10g、または1000mgから約8000mg、または約2000mgから約4000mg （例えば3000mg）を、1日当たり、被験体（例えば、ヒト）に投与して、既存のコロナウイルス感染（例えば、CO VID-19）を治療することができる。
ある非限定的な実施形態では、既存のコロナウイルス感染（例えば、COVID-19）を、予防的に防ぐまたは治療するために、1日当たり、約0.5mgから約1000mg、または約1mgから約500mg、または約5mgから約300mg、または約10mgから約150mgのチモキノンを、被験体（例えば、ヒト）に投与することができる。これらの量は、1日1回、または1日を通して等間隔で数回にわたって投与することができる。
予防的に使用する場合には、比較的少量を投与することができる。コロナウイルス感染を防止するためにチモキノンを使用するある実施形態では、コロナウイルス感染（例えば、CO VID-19）を予防するために、1日当たり、約5mgから約80mg、または10mgから約40mg、または約20mgから約30mg （例えば、25mg）を、被験体（例えば、ヒト）に投与することができる。
チモキノンを用いた既存のコロナウイルス感染を治療するある実施形態において、約25mgから約300mg、または50mgから約150mg、または約75mgから約125mg （例えば、100mg）を、1日当たり、被験体（例えば、ヒト）に投与して、既存のコロナウイルス感染（例えば、COVID-19）を治療することができる。
非限定的に、約0.25mg～約1g、または約0.5mg～約500mg、または約0.75mg～約250mg、または約1mg～約150mgの抗レトロウイルス薬（例えば、ドルテグラビル）を、1日当たり、被験体（例えば、ヒト）に投与して、既存のコロナウイルス感染（例えば、COVID-19）を、予防的に防ぐまたは治療することができる。ある実施形態では、10mg、25mgまたは50mgの抗レトロウイルス薬が、1日当たり約1回から約10回投与される。これらの量は、1日1回、または1日を通して等間隔で数回にわたって投与することができる。
予防的に使用する場合には、比較的少量を投与することができる。コロナウイルス感染を予防するために抗ウイルス薬が使用されるある実施形態において、コロナウイルス感染を予防するために、1日当たり約0.5mgから約100mg、または1mgから約50mg、または約10mgから約40mg （例えば、25mg）のブラックシードオイルを、対象（例えば、ヒト）に投与して、コロナウイルス感染（例えば、CO VID-19）を予防することができる。
既存のコロナウイルス感染を治療するために、抗レトロウイルス薬が組み合せで使用されるある実施形態において、約5mgから約300mg、または25mgから約150mgを、1日当たり、被験体（例えば、ヒト）に投与して、既存のコロナウイルス感染（例えば、COVID-19）を治療することができる。
本明細書に開示の化合物および組成物、例えば、ブラックシードオイルおよび/または抗レトロウイルス薬は、全身的に、例えば、経口または非経口の投与経路により投与することができる。本明細書に開示の経口製剤は、商業的に入手することができ（例えば、ブラックシードオイルソフトゲルカプセル）、および/または入手可能な原料成分から処方することができる（例えば、ドルテグラビル原薬の供給源からの錠剤を処方する）。
別の実施形態では、本明細書に開示の化合物および組成物は、注射（例えば、静脈内、筋肉内）を介して投与することができる。注射に適した担体および成分（例えば、注射用水）から構成される注射可能な製剤は、当業者によって調製することができる。同様に、坐剤または鼻噴霧剤としての使用に適した組成物は、当業者によって調製することができ、本明細書に開示されている主題に従って投与することができる。
便宜上、本発明の実施形態は、SARS-CoV-2、すなわちCOVID19の治療との関連において記載される。別の実施形態では、本明細書に開示の化合物および組成物、例えばブラックシードオイルを含有する組成物を、他のコロナウイルス、例えば、SARS-CoV（「SARS」）、MERS-CoV、229E（αコロナウイルス）、NL63（αコロナウイルス）、OC43（βコロナウイルス）、およびHKU1（βコロナウイルス）を治療するために使用することができるが、これらに限定されるものではない。
１つの実施形態において、ブラックシードオイルおよび／またはある量のチモキノンを投与することによるSARS-CoV（SARS）の治療は除外される。
ブラックシードオイル
ブラックシードの油は、チモキノン（TQ）、パルミチン酸、リノール酸、ジチモキノン、チモヒドロキノン、チモール、カルバクロル、ニゲルリミン-N-オキシド、ニゲリシン（nigellicine）、ニゲルリジン、α-ヘデリンを含む。チモキノンは、従来、活性成分であると考えられているが、ブラックシードオイルの他の成分も、非結合理論に従って、有益な治療効果を与えると考えられている。
ある実施形態において、ブラックシードオイルの投与組成物中に存在するチモキノンの量は、組成物の総重量に基づき、少なくとも0.5重量%、または少なくとも0.75重量%、または少なくとも1重量%、または少なくとも1.25重量%、または少なくとも1.5重量%、少なくとも1.6重量%、または少なくとも1.75重量%、少なくとも2重量%、少なくとも2.1重量%、または少なくとも2.5重量%である。前述したように、ブラックシードオイルの投与量は、投与されたブラックシードオイル組成物中のチモキノンの濃度に基づいて調節することができる。
ある実施形態では、ブラックシードオイルは経口投与用であり、当業者に知られている加工技術により腸溶性コーティングと共に配合される。あるいはまたさらには、製剤には、特に予防的実施形態のために、ブラックシードオイルの味を改善し、患者のコンプライアンスを改善するために、味覚マスキング剤および他のフレーバーを含むことができる。
抗レトロウイルス併用療法
ある実施形態では、有効量の抗レトロウイルス薬（例えば、ドルテグラビル、または薬学的に許容可能なその塩）を、コロナウイルス（例えば、COVID-19）を予防または治療するために被験体に投与する。抗レトロウイルス薬は、チモキノン源（例えば、ブラックシードオイル）と組み合わせて投与することができる。
抗レトロウイルス薬（例えば、ドルテグラビル）の有効量は、当業者によって決定することができる。例示的な実施形態では、１日当たり投与されるドルテグラビルの量は、予防目的では約1mg～約20mg、既存の感染を治療するためには1日当たり約25mg～約100mgの範囲であり得る。他の量も、代替の実施形態で用いることができる。
ドルテグラビルの構造または機能的な誘導体はまた、コロナウイルスを予防または治療するために、本発明の特定の実施形態に従って、チモキノンおよび/またはブラックシードオイルと組み合わせて投与することもできる。例えば、カボテグラビルまたはその薬学的に許容可能な塩、ビクテグラビルまたはその薬学的に許容可能な塩を、本明細書の開示に従って投与することができる。
以下に本発明の実施態様について記載するが、その例は、付随する実施例によって説明し、またそれとともに記載する。いくつかの実施形態が本明細書に記載されているが、記載された実施形態は、本発明の範囲を限定することを意図するものではないとして理解される。それどころか、本明細書の開示は、添付のクレームによって定義されるように、発明に含めることができる代替、修正、および同等物をカバーすることを意図している。
以下の例は、本発明の特定の非限定的な側面を示すために明細書に含まれる。以下に示す実施例に開示された技術は、本発明者によって見出された技術を代表するものであり、本発明の実施において十分に機能することが当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本明細書の開示を考慮し、開示された特定の実施例において、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であり、かつ同様の結果を得られることは理解できるであろう。
実施例
実施例１：ウイルス侵入：分子ドッキング解析
COVID-19ウイルスのウイルス侵入は、ウイルススパイク蛋白質のアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）への結合を介して起こる。例えば、Lukassen, S., Chua, R. L.,Trefzer, T.,Kahn, N. C.,Schneider, M. A.,Muley, T.,. & Hennig, B. P. （2020）, SARS-CoV-2 receptor ACE 2 and TMPRSS 2 are primarily expressed in bronchial transient secretory cells. The EMBO journal, 39（10）, el05114 を参照。
チモキノンは、ウイルス-受容体複合体（PDB: 3SCK）とドッキングした。3SCK複合体は、4鎖：ACE2受容体の2鎖（A,B）とウイルススパイク糖蛋白質（E,F）の2鎖を有する。得られた複合体を界面-相互作用について解析した後、元の複合体と比較した。
コンピュータ支援オンライン分子モデリングツールmcule.comを用いた分析では、チモキノンはウイルススパイク－ACE2受容体相互作用の有意な破壊を引き起こし、TQは、水素結合数を37から24に減少させ（約35.0%減少）、塩架橋数を16から5に減少させた（約69.0%減少）。全体として、TQの結果として、接触による結合は約44.0%減少した。これらの知見は有意であり、有意な予防および治療効果をもたらすことができる。
チモキノンの陽性データ分析を考慮して、ブラックシードオイルの他の重要成分、すなわちパルミチン酸、リノール酸およびパルミチン酸を分析した。解析の結果、リノール酸とパルミチン酸で同様の結果を示した。
このプロセスを繰り返し、ドルテグラビルとウイルス－受容体複合体（PDB: 3SCK）との相互作用を評価した。薬物ドッキング前後のウイルス蛋白質－細胞受容体複合体（3sck）を比較すると、結合の数は劇的に減少していた。水素結合は37から24に減少し、さらに重要なことに、塩架橋の数は16から5に減少した。これらのデータは、ドルテグラビルがウイルス－受容体相互作用の有意な破壊を引き起こす可能性があり、同様に有意な予防および治療効果をもたらす可能性があることを示唆している。
実施例２：in vitroウイルス試験－ブラックシードオイル、チモキノンおよび脂肪酸
SARS-CoVについて以下の文献に記載のプロトコルに従い（ただし、以下に記載するように修正した）、SARS-CoV-2 Spikeタンパク質構築物でシュードタイプ化したマウス白血病ウイルス（MLV）粒子を、HEK293T細胞（Cat# CRL-3216、ATCC）中で作製した。Millet, J.K. & Whittaker, G.R. Murine Leukemia Virus （MLV）-based Coronavirus Spikepseudotyped Particle Production and Infection、Bio Protoc 6（2016）; Chen, C.Z. et al. Identifying SARS-CoV-2 entry inhibitors through drug repurposing screens of SARS-S and MERS-S pseudotyped particles, bioRxiv （2020）を参照。すべてのプラスミドDNAをZymoPURE IIプラスミドMidiprep Kit （Cat# D4201, Zymo Research）で精製した。SARS-CoV-2-Spike発現ベクターのプラスミドマップを図１に示す。
特に、800万個のHEK293T細胞を、抗生物質を一切含まない、16mlのDMEM （Cat# 25-500、Genesee Scientific）+10% FBS （Cat# 35-010-CV、Corning Life Sciences）が入った10cmの組織培養皿（Cat# sc-251460、Santa Cruz）にプレートした。2日目に、細胞を、リポフェクタミン3000試薬（Cat# L3000015、ThermoFisher）を用い、8μg のpTG-Luc、6μg のpCMV-MLVgag-pol、および6μg の図２－５に明記した変異体であるpcDNA3.1-SARS-CoV-2-Spike-AC19でトランスフェクトした。細胞をさらに48時間培養した。上清を50mlのFalconチューブに集め、290×gで7分間遠心した。次に、上清（シュードタイプウイルス溶液）を適切なシリンジを用いて0.45μmフィルター（Cat# sc-358814、Santa Cruz）に通した。次に、シュードタイプウイルス溶液をクライオバイアルに分注し、-80℃で保存した。10cmの細胞培養皿ごとに、約16mlのSARS-CoV-2-PPを産生する。SARS-CoV-2-PPは、Codex BioSolutions社で作成されたHEK293-ACE2細胞株を用いて品質管理試験を実施した（図６）。
約2重量%のチモキノン含量を有するブラックシードオイルが得られた。チモキノン（Cat #03416）はMillipore Sigma社から購入した。オレイン酸（Cat# 01008）、リノール酸（Cat# L1376）およびパルミチン酸（Cat# P500）はMilliporeSigma社から購入した。
以下のレジメンを試験した。
1. ブラックシード油単独；
2. チモキノン単独；
3. オレイン酸単独；
4. リノール酸単独；
5. パルミチン酸単独。
上記のSARS-CoV-2-PPによる感染の前日、7.5K Expi-293F-ACE2細胞を、15μlの培養液（DMEM +10% FetalClone II 血清、Cat# SH3006603、Fisher Scientific社）を入れた、ポリDリジン（Cat# 3439-100-1、Trevigen社）でプレコートした384穴白色透明プレート（Cat# 353963、Corning Life Sciences社）にプレートした。セルプレートをCO2培養器に入れ、37℃に維持した。
2日目に、以下の表１～４に示すように、96ウェル化合物プレートにて、最終濃度の5Xとなるように、試験組成物を培養液で希釈した。
表１. 化合物希釈プレート中のブラックシードオイル濃度の例
表２. 化合物希釈プレート中のチモキノン濃度の例
表３. 化合物希釈プレート中のオレイン酸濃度の例
表４. 化合物希釈プレート中のリノール酸濃度の
表５. 化合物希釈プレート中のパルミチン酸濃度の例
前述のようにして調製した各試料32 μlとSARS-CoV-2 MLVプソイド粒子80μlとを混合し、37℃で10分間インキュベートした。384ウェル細胞プレートの各ウェル中の培地を除去した後、各化合物-pp混合物17.5 μlを各ウェル中に添加した。384-ウェルアッセイプレート上のブラックシードオイルおよびチモキノンの最終濃度の例を以下の表５に示す。
表６. 384wellアッセイプレート上のブラックシードオイルとチモキノンの最終濃度の例
プレートを4℃にて15分間54gで遠心分離し、次いで培養液7.5μlを各ウェルに加えた。各ウェルの全最終容量は25μlであった。その後、細胞を37℃で42時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼアッセイキット（CB80552-010、Codex BioSolutions社）で測定した。IC50値は、GraphPad Prismの曲線フィッティングに基づいて算出した。
同時に、細胞内のATPレベルを測定するCodex社のEnerCount細胞増殖アッセイキット（Cat# CB-80551-010、Codex BioSolutions）を用いて、HEK293-ACE2細胞に対する脂肪酸の細胞毒性（Tox）を試験した。
アッセイの前日、7.5K HEK293-ACE2細胞を、15μlの培養液（DMEM +10% FetalClone II血清、Cat# SH3006603、Fisher Scientific社）が入った、ポリDリジン（Cat#3439-100-1、Trevigen社）でプレコートした384穴白色透明プレート（Cat# 353963、Corning Life Sciences社）の各ウェルに播いた。セルプレートをCO2培養器（37℃）に入れた。2日目に、試験される化合物を、最終濃度の5Xで示される上記表３－５に示される濃度に、96ウェル化合物プレート上にて培養液で希釈した。
プレートをインキュベーターから取り出し、各ウェルの培地を除去した。20 μlの培養液（DMEM +10% FetalClone II血清、Cat# SH3006603、Fisher Scientific）を各ウェルに加え戻した。表３－５に示すように調整した5X濃度の化合物の5μlを各ウェルに添加した。最終濃度は表６、E-J列と同じである。プレートを4℃にて、54gで15分間遠心分離した。その後、細胞を37℃で42時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性をCodexのEnerCount細胞増殖アッセイキットで測定した。
データは、各化合物の最高読取り値（各化合物の低濃度または無化合物）に対する割合（相対的ルシフェラーゼ活性、RLU）として正規化した。それらを用いて、化合物濃度に対する用量反応曲線を描いた。IC50値は、GraphPad Prismのカーブフィッティングに基づいて算出した。各図では、1つの化合物を4つのSARS-CoV2-PPに対して試験した。結果を図７－１１に示す。そこでは、ACE2発現細胞に感染するSARS-CoV-2-PPを阻止する、ブラックシードオイル、チモキノンおよび脂肪酸の効果が示されている。ここで、x軸は化合物濃度であり、そして、y軸は相対発光単位（RLU）であり、ルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映している。
次いで、4つの異なるSARS-CoV2-PPと化合物の以下の組み合わせを試験した。
6. チモキノン+オレイン酸
7. チモキノン+リノール酸
8. チモキノン+パルミチン酸
9. オレイン酸+リノール酸
10. オレイン酸+パルミチン酸
11. リノール酸+パルミチン酸
図７の結果に基づいて、0.05μMのチモキノンの存在下でオレイン酸、リノール酸およびパルミチン酸の用量反応アッセイ、0.01mg/mlのオレイン酸の存在下でリノール酸およびパルミチン酸の用量反応アッセイ、および0.01mg/mlのリノール酸の存在下でパルミチン酸の用量反応アッセイを実施すると決定した。
感染前日、7.5K HEK293-ACE2細胞を、15μlの培養液（DMEM +10% FetalClone II 血清、Cat# SH3006603、Fisher Scientific社）が入った、ポリDリジン（Cat# 3439-100-1,Trevigen社）をプレコートした384穴白色透明プレート（Cat# 353963、Corning Life Sciences社）に播いた。細胞プレートをCO2インキュベーター（37℃）中に置いた。
上記に開示された方法と同様の方法で、2日目に、下記の表７－１２に示すように、試験すべき化合物を96ウェル化合物プレート上にて培地で希釈した。それらは最終濃度の5倍である。
表７：0.25μMチモキノン存在下の化合物希釈プレート中のオレイン酸濃度の例
表８：0.25μMチモキノン存在下の化合物希釈プレート中のリノール酸濃度の例
表９：0.25μMチモキノン存在下での化合物希釈プレート中のパルミチン酸濃度の例
表１０：0.05mg/mlオレイン酸の存在下での化合物希釈プレートにおけるリノール酸濃度の例
表１１：0.05mg/mlのオレイン酸存在下での化合物希釈プレート中のパルミチン酸濃度の例
表１２：0.05mg/mlのリノール酸存在下での化合物希釈プレート中のパルミチン酸濃度の例
80μlのSARS-CoV-2 MLVプソイドウイルス粒子（pp）を、上記で調製した各試験化合物32μlと混合し、37℃で10分間インキュベートした。384ウェル細胞プレートの各ウェルの培地を除去した後、各化合物-pp混合物17.5μlを各ウェルに添加した。
表１３：384ウェルアッセイプレートでの、他の化合物の存在下でのオレイン酸、リノール酸およびパルミチン酸の最終濃度の例
このプレートを4℃で、15分間54gで遠心分離し、次いで追加の培養7.5μlを各ウェルに加えた。各ウェルの全最終容量は25μlであった。その後、細胞を37℃で42時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼアッセイキット（CB-80552-010、Codex BioSolutions 社）で測定した。IC50値は、GraphPad Prismのカーブフィッティングに基づいて算出した。
データは、各化合物の最高読取り値（各化合物の低濃度または無化合物）に対する割合（相対的ルシフェラーゼ活性、RLU）として正規化した。それらを用いて、化合物濃度に対する用量反応曲線を描いた。IC50値は、GraphPad Prismのカーブフィッティングに基づいて算出した。各図では、4つのSARS-CoV2-PPに対して各化合物の組み合わせを試験した。結果は図１２－１７に示す。そこでは、ACE2発現細胞に感染するSARS-CoV-2-PPをブロックする、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸とチモキノンとの、または別の脂肪酸との組合せの効果が示されている。X軸は化合物濃度を、Y軸は相対発光単位（RLU）を示し、ルシフェラーゼ活性とウイルス感染能を反映している。
チモキノンに加え、パルミチン酸もSARS-CoV-2-PP感染に対する良好な阻害剤である。そこでは、ブラジル変異体と他の変異体との間に差を示した。オレイン酸またはリノール酸と併用した場合、Delta、614G、UKおよびBrazil変異体に対して異なる効果を示し、Delta変異体に対して最も強い阻害を示した。
実施例３：in vitroウイルス試験－ブラックシードオイルおよび/またはチモキノン
実施例２に記載したのと同様の手順により、ブラックシードオイルのみの濃度を変化させた試料、チモキノンのみのモル濃度を変化させた試料、2μMのチモキノンと組み合わせたブラックシードオイルの濃度を変化させた試料、および2%のブラックシードオイルと組み合わせたチモキノンのモル濃度を変化させた試料を、それぞれ化合物希釈プレート中で調製した。調製サンプルの例を表１－４に示す。
表１４. 化合物希釈プレート中のブラックシードオイル濃度の例
表１５. 化合物希釈プレート中のチモキノン濃度の例
表１６. 2μMのチモキノン存在下での化合物希釈プレート中のブラックシードオイル濃度の例
表１７. 2%ブラックシードオイル存在下の化合物希釈プレートにおけるチモキノン濃度の例
上記のように調製した各試料32μlと80μlのSARS-CoV-2 MLVプソイド粒子とを混合し、37℃で10分間インキュベートした。384ウェル細胞プレートの各ウェル中の培地を除去した後、各化合物-pp混合物17.5μlを各ウェル中に添加した。384-ウェルアッセイプレート上のブラックシードオイルおよびチモキノンの最終濃度の例を以下の表５に示す。
表１８. 384-wellアッセイプレート上のブラックシードオイルおよびチモキノンの最終濃度の例
プレートを4℃にて15分間54gで遠心分離し、次いで追加の培養液7.5μlを各ウェルに加えた。各ウェルの全最終容量は25μlであった。その後、細胞を37℃で42時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼアッセイキット（CB80552-010、Codex BioSolutions 社）で測定した。IC50値は、GraphPad Prismのカーブフィッティングに基づいて算出した。得られた結果は、図１８－２１に示す。そこでは、SARS-CoV-2-PPが細胞に感染するのをブロックするブラックシードオイルおよびチモキノンの効果が示されている。X軸はサンプル濃度を、y軸は相対発光単位（RLU）を示し、ルシフェラーゼ活性およびウイルス感染性を反映する。
結果は、ブラックシードオイルとチモキノンがウイルス感染を阻止することを示している。しかし、高濃度では、ブラックシードオイルとチモキノンが細胞死を引き起こす可能性があることが分かった。このことは、両者が細胞毒性を有する可能性を示している。それにもかかわらず、ブラックシードオイルの毒性用量は治療用量よりも数倍高い。
これらの結果を確認するために、細胞内のATPレベルを測定するCodex社のEnerCount細胞増殖アッセイキット（Cat# CB-80551-010、Codex BioSolutions社）を用いて、ブラックシードオイルまたはチモキノンの存在下で細胞増殖アッセイを実施した。感染前日、7.5K Expi-293F-ACE2細胞を、ポリDリジン（Cat# 3439-100-1、Trevigen社）をプレコートした384ウェル白色透明プレート（Cat# 353963、Corning Life Sciences社）の各ウェルに入れた15μlの培養液（DMEM +10% FetalClone II血清、Cat#SH3006603、Fisher Scientific社）に播いた。細胞プレートをCO2インキュベーター（37℃）中に置いた。
2日目に、上の表14-17に示すように、試験すべき化合物を96ウェル化合物プレート上にて培地で希釈した。それらは最終濃度の5倍である。
プレートをインキュベーターから取り出し、各ウェルの培地を除去した。20μlの培養液（DMEM +10% FetalClone II血清、Cat# SH3006603、Fisher Scientific）を各ウェルに添加して戻した。表１－４に示すように調製した化合物5 μlを各ウェルに添加した。プレートを4℃にて、54gで15分間遠心分離した。その後、細胞を37℃で42時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性をCodexのEnerCount細胞増殖アッセイキットで測定した。結果を図２２－２５に示す。図１８－２５を参照すると、ブラックシードオイル及びチモキノンは、（例えば、ブラックシードオイル（0.06%～0.6%）及びチモキノン（1～10μM）にて）細胞毒性なしにSARS-CoV-2-MLV-PP感染を阻止することができると結論できる。ブラックシードオイルとチモキノンの間の相乗効果が存在すると考えられる。ブラックシードオイルにチモキノンを添加すると、IC50が0.16から0.09に低下し、約40.0%の有効性の増加が示唆された。同様に、チモキノンにブラックシードオイルを添加すると、IC50が4.3から3.6に低下し、約16.0%の有効性の増加が示唆された。
実施例４：in vitroウイルス試験-テムサビルとドルテグラビルの追加
実施例２に一般的に記載された方法により、テムサビルおよびドルテグラビルを、ブラックシードオイルまたはチモキノンと共に、または単独で試験した。感染前日、7.5K Expi-293F-ACE2細胞を、ポリDリジン（Cat# 3439-100-1、Trevigen社）をプレコートした384ウェル白色透明プレート（Cat# 353963、Corning Life Sciences社）の各ウェルに入れた15μlの培養液（DMEM +10% FetalClone II血清、Cat#SH3006603、Fisher Scientific社）中に播いた。細胞プレートをCO2インキュベーター（37℃）中に置いた。2日目に、試験する化合物を表6-11に示すように、96ウェル化合物プレート上の培地で希釈した。それらは最終濃度の5倍である。
調製サンプルの例を表１９－２４に示す。
表１９. 化合物希釈プレートにおけるテムサビル濃度の例
表２０. 化合物希釈プレートにおけるドルテグラビル濃度の例
表２１. 0.4%ブラックシードオイル存在下での化合物希釈プレート中のテムサビル濃度の例
表２２. 0.4%のブラックシードオイル存在下の化合物希釈プレート中のドルテグラビル濃度の例
表２３. 5μMのチモキノン存在下での化合物希釈プレート中のテムサビルの濃度の例
表２４. 5μMのチモキノン存在下での化合物希釈プレート中のドルテグラビル濃度の例
前述のように調製した各試料32μlと80μlのSARS-CoV-2 MLVプソイド粒子とを混合し、37℃で10分間インキュベートした。384ウェル細胞プレートの各ウェル中の培地を除去した後、各化合物-pp混合物17.5μlを各ウェル中に添加した。384ウェルアッセイプレート上のブラックシードオイル及びチモキノンの最終濃度の例を以下の表２５に示す。
表２５. 384ウェルアッセイプレート上のTemsavirおよびDolutegravirの最終濃度の例。
プレートを4℃にて15分間54gで遠心分離し、次いで追加の培養液7.5μlを各ウェルに加えた。各ウェルの全最終容量は25μlであった。その後、細胞を37℃で42時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼアッセイキット（CB-80552-010、コーデックス・バイオソルーションズ社）で測定した。IC50値は、GraphPad Prismのカーブフィッティングに基づいて算出した。テムサビルの結果を図２６に示し、ドルテグラビルの結果を図２７に示す。それぞれのグラフでは、x軸はテムサビルまたはドルテグラビルの濃度、Y軸は相対発光単位（RLU）を示しており、ルシフェラーゼ活性とウイルス感染能を反映している。
これらの結果は、テムサビルがExpi-293F-ACE2細胞に感染するSARS-CoV-2 MLV-PPを阻害しないことを示している。それどころか、テムサビルはSARS-CoV-2 MLV-PPの感染を増加させる可能性がある。一方、ドルテグラビルはSARS-CoV-2 MLV-PP感染に対する強力な阻害剤である。1μMのチモキノンの添加、およびより大きな程度で0.08%のブラックシードオイルの添加は、Expi-293F-ACE2細胞に対するSARS-CoV-2 MLV-PPの感染をさらに阻害する。
低濃度のドルテグラビルを用いたことを除き、上記の手順に基づいてドルテグラビルの実験を繰り返した。その結果を図28に示す。ドルテグラビルがSARS-CoV-2 MLV-PPの強力な阻害剤であることが確認される。
実施例５：CO VID-19陽性の検査を受けた参加者の治療におけるブラックシードオイルの安全性と有効性を評価するための無作為化二重盲検プラセボ対照試験
外来で新型コロナウイルス2019（COVID-19）陽性と診断された患者さんを対象に、ブラックシードオイルカプセルの安全性と有効性をプラセボと比較する無作為化（1:1）二重盲検プラセボ対照フェーズ2試験を実施した。組み入れ基準は、年齢18歳以上、最近の軽度から中等度のCOVID-19感染の臨床症状を伴う症状、スクリーニング時に迅速抗原検査（または過去3日以内にRT-PCR）でCOVID-19感染陽性が確認され、ベースライン時にRT-PCR検査で確認され、Modified FLU-PRO Plusで最低2症状のスコアが3以上であることとした。
患者には、無作為割付け日から14日間、1日2回、500mg、3カプセルの用量のブラックシードオイルを投与した。cGMP条件下で、ブラックシードオイルを腸（酸抵抗性）ハードシェルカプセルに充填し、生産し、試験した。RT-PCR法により測定した定量的ウイルス量をベースライン時および7日目および14日目に評価する。Covid-19の症状は、FLU-PRO Plusを用いてDay-14まで試験期間中毎日測定する。
本試験の主要目的は、COVID-19感染の参加者において、外来ベースで3gのブラックシードオイル（1カプセル500mg、1日2回3カプセル）を経口投与した場合、7日目までにプラセボと比較して定量的ウイルス量を有意に減少させることができるかどうか、および/またはCOVID-19感染の参加者において治療開始から7日目までにプラセボと比較してFLU-PRO Plusで測定した6つのドメイン、すなわち鼻、咽喉、眼、胸部/呼吸器、消化管、体部/全身症状の負荷によって測定した症状量を有意に減少させることができるか、である。また、本試験では、COVID-19感染の参加者を対象に、外来患者ベースで3gのブラックシードオイル（1カプセル500mg、1日2回3カプセル）を経口投与した場合とプラセボを投与した場合のウイルス量プロファイルの時間推移を比較し、さらに、COVID-19感染の参加者で対象に、3gのブラックシードオイル（1カプセル500mg、1日2回3カプセル）を服用した参加者とプラセボを服用した参加者における、7日目と14日目のRT-PCR陰性の％（すなわち、ウイルスクリアラン）を比較した。服用は、約12時間の間隔をおいて食事と一緒にすることが推奨される。参加者は、サプリメントまたはビタミンを含め、通常の標準治療を継続することができる。
本試験では、COVID-19感染症の参加者を対象に、FLU-PRO Plusにより測定した1日目から14日目までの症状の持続期間および重症度を、経時的に患者の味覚/嗅覚状態に加えて、総スコアおよびサブドメインスコア、すなわち鼻、咽喉、眼、胸部/呼吸器、消化管、体部/全身スコアで比較し、3gのブラックシードオイル（1カプセル当たり500mg、1日2回3カプセル）を外来ベースで経口投与した場合とプラセボを投与した場合との間で比較し、本試験群においてウイルス量と症状の重症度との間に関連性があるかどうか、またそのような関連性が時間とともに変化するかどうかを検証した。本試験では、COVID19感染患者にブラックシードオイル500mg経口カプセル、3カプセルを1日2回投与した場合の安全性および忍容性も評価した。さらに、本試験では、CO VID-19感染症の参加者を対象に、ブラックシードオイル活性成分（チモキノン）の基本的な薬物動態を同時点（1、7、14日目）で評価し、また、COVID-19感染症の参加者を対象に、炎症性サイトカイン、凝固因子およびエフェクター免疫細胞に対するブラックシードオイルの影響を同時点（1、7、14日目）で調査している。
試験には、COVID-19感染の参加者を対象に、ブラックシードオイル3g（1カプセルあたり500mg、1日2回3カプセル）を投与した参加者とプラセボを投与した参加者における、RT-PCR法により測定した7日目のベースラインからの量的ウイルス量の変化の測定、および、COVID-19感染の参加者を対象に、ブラックシードオイル3g（1カプセルあたり500mg、1日2回3カプセル）を投与した参加者とプラセボを投与した参加者における、FLU-PRO Plusにより測定した症状サブドメイン（鼻、咽頭、眼、胸部/呼吸器、消化管、体/全身）における1日目から7日目までの症状負荷量の測定が含まれる。
また、本試験には、COVID-19感染の参加者を対象に、ブラックシードオイル3g（1カプセル500mg、1日2回3カプセル）を服用した参加者とプラセボを服用した参加者において、RT-PCR法により測定したベースライン、7日目、および14日目からの定量的ウイルス量の変化の測定、および、COVID-19感染を有する参加者を対象に、ブラックシードオイル3g（1カプセル500mg、1日2回3カプセル）を服用した参加者とプラセボを服用した参加者において、7日目および14日目のRT-PCR陰性の％（すなわち、ウイルスクリアラン）の測定が含まれる。
また、本試験では、COVID-19感染の参加者を対象に、3gのブラックシードオイル（1カプセル500mg、1日2回3カプセル）またはプラセボのいずれかを投与したDay-1からDay-14までの試験治療中の各日において、FLU-PRO Plusを介して測定した味覚および嗅覚状態に加えて、トータルスコアおよびサブスコア（鼻、咽喉、眼、胸部/呼吸器、消化器、体/全身症状）としてのCovid-19症状の重症度およびその変化を測定した。COVID-19感染症患者におけるベースライン、Day 7、Day 14における定量的ウイルス量と症状の重症度の相関係数を求めた。また、COVID-19感染の参加者において、ブラックシードオイル3g（1カプセル500mg、1日2回3カプセル）を服用した参加者とプラセボを服用した参加者における副作用の件数も報告された。すべての有害事象および重篤な有害事象は、評価スケジュールに従い、試験期間を通じて把握した。
また、本試験には、ブラックシードオイルによる治療を受けた患者におけるHPLCを用いた1日目、7日目および14日目の血漿中のチモキノン濃度の測定、ならびにFACSを用いたこれらの患者の1日目、7日目および14日目のPBMCにおける炎症性サイトカイン産生、凝固因子および様々なエフェクター免疫細胞サブセットの測定が含まれた。
3つの患者コホート（各コホートの分析プールの患者は、n = 50、51および42例）を、ブラックシードオイルカプセル+標準治療（SOC）またはプラセボ+ SOCのいずれかに1:1の割合で無作為に割り付けた。インフォームドコンセントを取得し、選択基準を満たした後、ベースライン評価を1日目に実施し、最初の研究介入を開始した。試験のエンドポイントおよび安全性の追跡評価は、4、7、10および14日目に実施した。最終評価は21日目-最終来院時に実施した。後日、フォローアップは電話で行った。
結果
要約すると、ブラックシードオイルカプセルは、安全で忍容性があり、以下のように定義される全体症状の負荷を優位により早く減少させた（p<0.01）。全体症状の負荷は、COVID-19感染症の参加者を対象に、3gのTQ製剤（1カプセル当たり500mg、1日2回3カプセル）を外来ベースで経口投与した治療とプラセボを投与した場合との間での、FLU-PRO Plusの症状の重症度スコア全体およびサブドメインスコア（すなわち、咽喉、消化管、体/全身）における、1日目から14日目まで経時的に（Modified FLU-PRO Plusにより測定した）症状の持続期間および重症度と定義される。本試験から、ブラックシードオイルカプセルは安全であり、プラセボよりも有害事象の報告が少ないことが示された。TQ製剤による治療を受けた患者29例中3例（10.3%）に計3件の治療関連有害事象（軽度2件、中等度1件）が発現したが、プラセボで治療を受けた患者23例中6例（26.1%）に計9件の治療関連有害事象（軽度8件、中等度1件）が発現した（p=0.16）。
1日目から14日目まで経時的に症状の持続期間および重症度を、全体およびサブドメインスコア（鼻、咽喉、眼、胸部/呼吸器、胃腸、体/全身および味覚/嗅覚）の両方で、患者の報告による総FLU-PRO Plus症状重症度スコアに基づいて分析した。全症状負荷量を求めるために、被検体ごとに症状スコアを加算し、Random Coefficients Modelsを用いて比較した。3つのコホートのそれぞれにおいて、ブラックシード群における全症状負荷の変化は、二次的挙動後により急速（すなわち、より急速に減少）であるが、プラセボ群の変化はより直線的である。これを、図２９（第1コホート）、図３０（第2コホート）および図３１（第3コホート）に示す。咽喉、胃腸、体/全身のサブドメインに関するすべてのコホートのサブドメイン・スコアをモデル化し、二次的と直線的な挙動（黒種子群対プラセボ群）を比較した。これらの結果は、この二重盲検試験で報告された患者の症状が統計的に有意に減少したことを示している。
持続的な臨床反応も分析した。本試験の目的での持続的臨床反応は、Modified FLU-PRO Plusのすべての症状でスコアが2以下に低下した場合と定義する。3コホートのうち2コホートでは、いずれもプラセボと比較して、ブラックシードオイル群の方が、臨床反応の割合が高く、かつ持続的な臨床反応の割合も高かった。第3のコホートでは、ブラックシードオイルおよびプラセボは、臨床反応および持続的臨床反応においてほぼ同じ割合を示した。3つのコホートそれぞれの奏効例のうち、持続的臨床効果に達するまでの期間の中央値は、ブラックシードオイル群で6日、プラセボ群で8日であったが、この差は統計的有意差には達しなかった。また、14日目には、3つのコホートのそれぞれのブラックシード群のRT-PCR陽性率が低かったが（より良好なcovid-19回収率）、この傾向は統計的有意には達しなかった。
ウイルス量分析は、最大25,000ウイルス量検出レベルであり、分析のためには25,000を超えるウイルス量を必然的に25,000とした。しかし、3つのコホートのそれぞれにおいて、ブラックシードオイル群は14日目のウイルス負荷の中央値および平均値が低かったが、この試験の制約下ではその差は統計的有意には達しなかった。
RT-PCR検査から得られたウイルス量の元のスケールはcopics/μIであり、pl当たり25000コピーを超える値は「>25.000」と報告され、これは、データ解析の規定されたプロトコルでは25,000として表現された。RT-PCR検査が陰性であることが判明した場合、ウイルス量測定値は提供されず、ゼロと仮定し、これはデータ解析においてもゼロとして表された。試験の2群、すなわちブラックシードオイル群とプラセボ群との間でベースライン時と評価のDay-7に差はなかったが、このウイルス量の元のスケールに基づくと、元のスケール（ブラックシードオイル群とプラセボ群の平均ウイルス量はそれぞれ4488と9559、p=0.17）およびlog-スケール（ブラックシードオイル群とプラセボ群の平均値はそれぞれ2.43と4.37、p=0.17）では、2群間に示唆的な差が認められた。
また、これらのRT-PCR評価から同時に提供されたウイルス負荷量とサイクル閾値（CT）値との間のほぼ完全な相関関係を用いて、これらの症例に対し、はるかに高いウイルス負荷値を予測することにより、25,000とされたウイルス負荷データの蓄積に向けた代替解析も実施した。このCTガイド予測版に基づくと、同様に、上記の示唆的な結果は、ブラックシード群およびプラセボ群の対数尺度の平均値がそれぞれ2.59および4.63、p=0.20であり、依然として妥当であった。縦断的モデルは、時間・治療群相互作用を示唆し、ウイルス負荷分布は、プラセボで治療された患者と比較して、ブラックシードオイルで治療された患者でより速く低下することを示唆した（p=0.18）。
1日目（ベースライン）、7日目および14日目の炎症性サイトカイン、凝固因子およびエフェクター免疫細胞に対するブラックシード製剤の効果を、被検体を対象に探索した。ブラックシード群は一般的に7日目に免疫応答の増加を示さず、14日目のCD+4+CD8+T（abs.）（/μL）のLogの比較も、ブラックシードオイル応答の増加を実証しなかった。しかしながら、とりわけ、14日目の、%CD45RA+CCR7+（%CD4T）（%CD4T細胞）、%CD45RA+CCR7+（%CD8T）（%CD8T細胞）およびCD45RA+CCR7+CD8T（abs.）（/μL）は、現在までに分析されたすべてのコホート（分析継続中）で、全てのブラックシードオイル治療群で高かった。
コホート1の代表的な結果は図３２に示されており、そこでは、14日目の、治療群間の%CD45RA+CCR7+（%CD4T）（%CD4T細胞）の比較を示している。図３３の右に示されるブラックシードオイル群は、%CD45RA+CCR7+（%CD8T細胞）（%CD8T細胞）の比較を示し、図３４の右に示されるブラックシードオイル群は、CD45RA+CCR7+CD8T（abs.）（/μL）の比較を示す。
COVID患者では、臨床パラメータおよび検査パラメータが、急性期の炎症性サイトカインレベルの上昇と相関し、その後、サイトカイン放出症候群（CRS）を強く暗示するサイトカインストームおよび重度COVID-19のホールマークを誘発した。単球およびマクロファージは、COVID患者の病理学的炎症において重要な役割を果たしている。ブラックシードオイルの主成分であるチモキノンは、炎症誘発性サイトカインをダウンレギュレートし、単球およびマクロファージにおけるI型IFNおよびTNF-aの産生を調節することが示されている。従って、ブラックシードオイルの抗ウイルス活性と免疫調節活性の両方が、この臨床試験の肯定的な結果に寄与する可能性がある。
重度のCOVID-19における顕著な全身性炎症に加えて、リンパ球減少もCOVID-19の別の顕著なマーカーであり、患者の80%以上で観察されている。CD4+T細胞、CD8+T細胞およびB細胞の絶対数は、いずれも病気の重症度が増すにつれて次第に減少した。T細胞は疲弊レベルの上昇を示し、機能的多様性を低下させる。図３２－３４に示されるように、本発明らは、ネイティブ/中枢記憶表現型（CD45RAOB CCR7+）を有するCD4+およびCD8+T細胞が、プラセボと比較して、治療後14日間、有意に増加したことを確認した。このデータは、ブラックシードオイル治療患者の免疫回復を示すものとなり得る。また、治療は全体的なT細胞疲弊を直接的に防止し、SAR-CoV-2特異的T細胞増殖を促進する可能性もある。
実施例6：経口ブラックシードオイル製剤
以下に示す組成物のエマルジョンは、標準的な技術によって調製して、約5℃の温度にて不活性雰囲気下で処理し、ヒト投与に適したカプセルに充填することができる。
本明細書で言及されたすべての公表文献、特許および特許出願は、各々の公表文献、特許または特許出願が、引用により具体的かつ個別に本明細書に組み込まれた場合と同程度の引用により本明細書に組み込まれる。
本発明は、その好ましい実施態様への言及と共に具体的に示され記載されているが、付記された実施態様によって表される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更をそれにおいて行うことができることは当業者によって理解されるであろう。さらに、本明細書に含まれる全ての実施形態は、単に説明の目的のために提供されるものであり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その多くのバリエーションが可能であるため、本発明を限定するものとして解釈されるものではない。

Claims (13)

  1. 有効量のチモキノンを対象に投与することを含む、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９感染を予防または治療する方法。
  2. 前記対象にブラックシードオイルを含む組成物が投与される、請求項１に記載の方法。
  3. チモキノンが、ＣＯＶＩＤ－１９感染を予防するために、感染症と診断される前に予防的に投与される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ブラックシードオイルが、ＣＯＶＩＤ－１９感染を予防するために、感染症と診断される前に予防的に投与される、請求項２に記載の方法。
  5. 前記チモキノンが、診断された感染症に続いて、ＣＯＶＩＤ－１９を治療するために投与される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ブラックシードオイルが、診断された感染症に続いて、ＣＯＶＩＤ－１９を治療するために投与される、請求項２に記載の方法。
  7. 前記対象に、ブラックシードオイルと追加量のチモキノンを組み合わせて投与する、請求項２に記載の方法。
  8. 抗レトロウイルス薬を組み合わせて投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記抗レトロウイルス薬がドルテグラビルまたはその薬学的に許容される塩を含む、請求項６に記載の方法。
  10. 脂肪酸を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記脂肪酸が、オレイン酸、リノール酸、およびパルミチン酸、ならびにそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. ブラックシードオイルを含む組成物が少なくとも１．６重量％のチモキノンを含む、請求項２に記載の方法。
  13. ブラックシードオイルを含む組成物が少なくとも２．０重量％のチモキノンを含む、請求項１２に記載の方法。
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