JP2023548385A - 細胞内のネットワークを制御するための発現システム及びその方法、並びに該発現システムを含む細胞 - Google Patents
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Abstract
本発明は、細胞内のネットワークを制御するための発現システムに関し、前記ネットワークは、アクチュエーター分子及び出力分子を含み、前記出力分子は、前記アクチュエーター分子によって正又は負に調節され、前記発現システムは、第１のコントローラー分子をコードする組換え遺伝子を含み、前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を正又は負に調節する。本発明はさらに、前記発現システムを含む細胞、薬剤としての使用のための細胞、並びに細胞内のネットワークを制御する方法に関する。【選択図】図２３Ａ
Description
本発明は、細胞内の調節ネットワークを制御するための発現システム、及びその方法、及び該発現システムを含む細胞、並びに該細胞及び該発現システムの医療的使用に関する。
本出願は、２０２０年１１月９日に出願された欧州特許出願（ＥＰ）第２０２０６４１７．６号の優先権を主張し、これは参照により本明細書に組み込まれる。本出願は、２０２１年０７月２２日に出願された欧州特許出願（ＥＰ）第２１１８７３１６．１号の優先権を主張し、これは参照により本明細書に組み込まれる。
変化し不確実な外界の存在下で安定した内部環境を維持する能力（ホメオスタシス（恒常性）と呼ばれる）は、生命システムの特徴を規定するものである。ホメオスタシスは、多くの場合、負のフィードバックループの形態で様々な調節機構によって維持されている。ホメオスタシスの概念は、生理学及び医学に特に関連し、ホメオスタシスの喪失が疾患の発症に起因することが多い。この点において、ホメオスタシスを支配する分子機構の理解を深めることは、このような疾患の治療法の開発につながるであろう。
工学では、望ましい状態に対する摂動に直面した際に、あるシステム（系）（ｓｙｓｔｅｍ）が別のシステムをこの望ましい状態に維持する能力は、様々な制御機構及びその組み合わせによって実現されており、例えば、エレクトロニクス分野で頻繁に使用されている、積分制御器（積分コントローラー）、比例積分制御器（比例積分コントローラー）、比例微分制御器（比例微分コントローラー）、及び比例積分微分制御器（比例積分微分コントローラー）が挙げられる。
近年、人工遺伝子回路が合成生物学の分野に導入されてきた。これらのシステムは、生物細胞内の遺伝子調節ネットワークなどのネットワークを操作し、かつ人工的に制御するために使用できる。本質的には、細胞調節因子（細胞レギュレーター）をコードする組換え遺伝子を、分子生物学のツールを使用してこれらの細胞に導入する。このような人工遺伝子回路は、細胞ネットワークの調節不全に関連する様々な種類の疾患に対する有望な新規の治療法を提供する。
しかしながら、先行技術により知られている人工遺伝回路の多くは、環境の変動に対する頑健性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）を欠き、特に所望の設定値の非常に厳しい調節が必要な場合に欠いている。
本発明の目的は、この知られている人工遺伝回路のこれらの欠点に鑑み、細胞内のネットワークを頑健かつ厳密な制御様式で制御する手段及び方法を提供することである。
この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成され、さらに有利な実施形態は、本明細書の従属請求項、実施例、図面、及び一般的な説明に記載される。
本発明の第１の態様は、細胞内のネットワークを制御するための組換え発現システムであって、前記ネットワークは、アクチュエーター分子を含み、特にアクチュエータータンパク質及び出力分子を含み、特に出力タンパク質を含み、前記出力分子が前記アクチュエーター分子によって正又は負に調節され、かつ前記発現システムは、第１のコントローラー分子をコードする組換え遺伝子を含む核酸を含み、前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を正又は負に調節する、前記発現システムに関する。
一実施形態では、第１のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を正に調節する。発現システムは、第１のアンチコントローラー分子をコードする組換え遺伝子をさらに含み、ここで前記第１のアンチコントローラー分子は、前記第１のコントローラー分子を負に調節し、特にそれを不活性化、隔離、及び／又は消滅させ、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記第１のアンチコントローラー分子を負に調節し、特にそれを不活性化、隔離、及び／又は消滅させる。ａ）アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、第１のアンチコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。ｂ）アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。
一実施形態では、第１のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を負に調節する。発現システムは、第１のアンチコントローラー分子をコードする組換え遺伝子をさらに含み、ここで前記第１のアンチコントローラー分子は、前記第１のコントローラー分子を負に調節し、特にそれを不活性化、隔離、及び／又は消滅させ、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記第１のアンチコントローラー分子を負に調節し、特にそれを不活性化、隔離、及び／又は消滅させる。ａ）アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。ｂ）アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、第１のアンチコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。
特に、発現システムは、細胞内で発現可能な少なくとも１つの組換え遺伝子を有する１つ又は複数の核酸を含むか、又はそれからなる。ここで、発現とは、特に、少なくとも１つの組換え遺伝子のＲＮＡ、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写に関連し、及び任意にそれに続くｍＲＮＡの細胞内でのタンパク質への翻訳に関連する。
細胞は、原核生物（特に細菌）又は真核生物（特に真菌、植物又は動物、より特に哺乳類）の細胞であり得る。当該技術分野で知られている任意の適切な発現システムを、目的の細胞に対して使用することができる。例えば、発現システムは、分子生物学の技術分野で知られているプラスミド、ウイルス、又は人工染色体などの１つ又は複数のＤＮＡベクターを含み得る。
本明細書で使用される、「ネットワーク」という用語は、１つの生物学的実体がネットワークの他の実体のいずれかの濃度及び／又は生物活性に直接的又は間接的に影響を与えることにおいて機能的にリンクしている少なくとも２つの生物学的実体（例えば、遺伝子又はタンパク質）を示す。例えば、このようなネットワークには、ネットワーク内の少なくとも１つの他の遺伝子の転写を活性化又は抑制する、転写調節タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み得る。さらに、ネットワークの生物学的実体は、互いに相互作用するタンパク質である可能性があり、ここではネットワークの１つのタンパク質が、ネットワークの別のタンパク質の生物活性（例えば、酵素活性）を活性化又は阻害する。
本発明による細胞のネットワークでは、アクチュエーター分子（例えばタンパク質）が直接又は間接的に（すなわち、１つ又はいくつかのさらなる遺伝子又はタンパク質との相互作用を介して）出力分子（例えばタンパク質又は小分子、例えば代謝物）を正又は負に調節する。
アクチュエーター分子は、小分子であってもよい。アクチュエーター分子は、タンパク質であってもよい。
出力分子は、小分子であってもよい。出力分子は、タンパク質であってもよい。
ここで、「調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）」という用語は、アクチュエーターが細胞内の出力分子の濃度又は細胞内の生物活性（例えば、酵素活性又は標的分子との結合など）に直接的又は間接的に影響を与えることを意味する。
このような調節は、複数の機構によって行われてもよい。例えば、出力分子がタンパク質である場合、アクチュエーター分子による調節は、出力分子をコードする遺伝子の転写を直接又は間接的に活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）又は抑制（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）すること、出力分子をコードするｍＲＮＡの分解を直接又は間接的に媒介又は阻害すること、出力分子のｍＲＮＡからの翻訳を直接的又は間接的に活性化又は阻害すること、出力分子の分解、翻訳後修飾、複合体形成、細胞からの分泌又は細胞内輸送を直接的又は間接的に媒介又は阻害すること、あるいは出力分子の生物活性を活性化又は阻害すること、によって起こり得る。同様に、出力分子が小分子である場合、正又は負の調節は、例えば、この小分子の合成、分解、輸送、又は修飾に直接又は間接的に影響を与えることを伴い得る。
本発明によれば、発現システムを用いて、組換え分子コントローラー（少なくとも第１のコントローラー分子、及び任意にフィードバック分子、第１のアンチコントローラー分子、第２のコントローラー分子、及び第２のアンチコントローラー分子、下記参照）をコードする核酸を目的の細胞に導入して、アクチュエーター分子を操作すること（プロセス入力）によりネットワークの出力分子（制御種）を制御する。特に、この制御の目標は、ネットワークの平衡の変動及び外部からの摂動にもかかわらず、出力分子の所望の設定値、すなわち所望の濃度及び／又は活性を達成することである。
特定の実施形態では、発現システムは、フィードバック分子をコードする組換え遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記フィードバック分子は、出力分子によって正に調節され、かつアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、前記フィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節し、かつアクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、前記フィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節する。
なお、本明細書では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合を「正のゲインプロセス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｇａｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）」ともいい、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合を「負のゲインプロセス（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｇａｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）」ともいう。
有利なことに、フィードバック分子は、ネットワークに分子フィードバックを人工的に導入し、それによって、ネットワークへの摂動に対する出力分子の濃度及び／又は活性の安定性を向上させる。制御理論の観点では、フィードバック分子はネットワークに比例制御を導入し、換言すれば、制御種（出力分子）に適用される補正は、測定値に比例する。
ネットワークの人工的なフィードバック調節を実現するために、フィードバック分子を細胞に導入することの代替として、又はそれに加えて、調節の安定性を実現するために、ネットワークの天然に発生する（すなわち、非組換えの）フィードバックも利用することができる。つまり、ネットワーク自体が天然にフィードバック調節されている場合、例えば、第１のコントローラー分子と第１のアンチコントローラー分子とを導入するだけで（積分制御をもたらす相反モチーフ、下記参照）、組換えフィードバック分子を導入することなく、比例積分コントローラーを実装することが可能である。この場合、例えば、比例制御は、天然に発生する（すなわち、非組換えの）フィードバック機構によって実現されるであろう。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（言い換えれば、正のゲインプロセスの場合）、フィードバック分子は、特にアクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害すること、及び／又はアクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの分解を促進することによって、アクチュエーター分子の生成を負に調節するマイクロＲＮＡである。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（言い換えれば、正のゲインプロセスの場合）、フィードバック分子は、特にアクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域に結合し、ｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって、アクチュエーター分子の生成を負に調節するＲＮＡ結合タンパク質である。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（言い換えれば、負のゲインプロセスの場合）、フィードバック分子はアクチュエーター分子をコードする追加のｍＲＮＡである。ここで、「追加のｍＲＮＡ」という用語は、アクチュエーター分子をコードする天然に生じる（すなわち、非組換え）遺伝子の転写物に加えて、細胞に導入される追加の組換え遺伝子の転写物を意味する。
特定の実施形態では、第１のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を正に調節し、ここで発現システムは、第１のアンチコントローラー分子をコードする組換え遺伝子を含む核酸をさらに含み、前記第１のアンチコントローラー分子は、前記第１のコントローラー分子を負に調節し、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記第１のアンチコントローラー分子を負に調節する。特に、第１のアンチコントローラー分子は、第１のコントローラー分子を不活性化、隔離、及び／又は消滅させ、かつ第１のコントローラー分子は、第１のアンチコントローラー分子を不活性化、隔離、及び／又は消滅させる。
アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（言い換えれば、正のゲインプロセスの場合）、第１のアンチコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（言い換えれば、負のゲインプロセスの場合）、第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。このようにして、アクチュエーター分子と出力分子との間の閉制御ループが、第１のコントローラー分子及び第１のアンチコントローラー分子を介して形成される。
この種類の制御は、本明細書では「相反モチーフ（ａｎｔｉｔｈｅｔｉｃ ｍｏｔｉｆ）」とも呼ぶことができ、ネットワークの積分制御を実装し、言い換えれば、制御種（出力分子）に適用される補正は、設定値と測定値との差の積分に依存する。この実装では、特に、設定値は、細胞内のコントローラー分子の生成速度とアンチコントローラー分子の生成速度との間の比を制御することによって制御することができる。
特定の実施形態では、第１のアンチコントローラー分子は、第１のコントローラー分子を不活性化し、特に完全に不活性化し、かつ第１のコントローラー分子は、第１のアンチコントローラー分子を不活性化し、特に完全に不活性化する。特に、第１のコントローラー分子と第１のアンチコントローラー分子との間の不活性化反応は化学量論的に固定されており、言い換えれば、所定の数の第１のアンチコントローラー分子が、固定された数の第１のコントローラー分子を不活性化し、及び／又は所定の数の第１のコントローラー分子が、固定された数の第１のアンチコントローラー分子を不活性化する。ここで、「化学量論的に固定される」とは、第１のコントローラー分子と第１のアンチコントローラー分子との数の比率が時間変動しないことを意味する。
本明細書の文脈において、第１の分子が第２の分子を「不活性化」するとは、第１の分子が第２の分子の生物学的機能を停止させることを意味する。このような生物学的機能は、例えば、翻訳調節因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の標的ＤＮＡへの結合、翻訳調節因子の標的ｍＲＮＡへの結合、タンパク質の標的分子への結合、又は酵素の酵素活性であってもよい。
特定の実施形態では、第１のアンチコントローラー分子と第１のコントローラー分子とは、物理的に相互作用し、特に互いに結合し（例えば、タンパク質の場合）、又はハイブリダイズして（例えば、核酸の場合）、互いを負に調節し、特に不活性化する。
特定の実施形態では、第１のアンチコントローラー分子と第１のコントローラー分子とは、物理的に相互作用して互いを不活性化し、ここで第１のアンチコントローラー分子は、第１のコントローラー分子の生物学的機能、特に標的分子（例えば、標的のＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質）に対する第１のコントローラー分子の結合活性を停止し、ここで第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を隔離する。
本明細書の文脈では、「隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）」という用語は、第２の分子とさらなる分子との物理的相互作用が停止されるように第１の分子が第２の分子へ結合することを表す（例えば、ある１個の第１のコントローラー分子がある１個の第１のアンチコントローラー分子に結合して、この第１のアンチコントローラー分子の他の第１のコントローラー分子への結合を停止させる）。
特定の実施形態では、第１のアンチコントローラー分子と第１のコントローラー分子とは、互いを負に調節するように、特に不活性化するように、互いに消滅する。
本明細書の文脈では、「消滅」という用語は、第１の分子と第２の分子との分解をもたらす第１の分子と第２の分子との間の相互作用を表す。
特定の実施形態では、第１のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を正に調節する、アクチュエーター分子をコードするセンスｍＲＮＡ、又は活性化因子（アクチベーター）（例えばアクチュエーター分子をコードする遺伝子の転写アクチベーター）をコードするセンスｍＲＮＡを含むか、又はそれであり、ここで前記第１のアンチコントローラー分子は、前記センスｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含むアンチセンスＲＮＡを含むか、又はそれである。センスｍＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがハイブリダイズすることで、センスｍＲＮＡの翻訳が阻害される結果となる（不活性化につながる）。同時に、このハイブリダイゼーションによってアンチセンスＲＮＡが他のセンスｍＲＮＡ分子と相互作用するのを妨げる（すなわち、隔離化）。
特定の実施形態では、第１のコントローラー分子は、例えば、アクチュエーター分子をコードする遺伝子の転写を活性化すること、アクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの翻訳を活性化すること、又はアクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの分解を阻害することによって、あるいはアクチュエーター分子の機能の阻害因子（インヒビター）を負に調節することによって、アクチュエーター分子の産生を正に調節するアクチベータータンパク質であり、ここで第１のアンチコントローラー分子は、アンチアクチベータータンパク質であり、このアクチベータータンパク質とアンチアクチベータータンパク質とがタンパク質間複合体を形成し、アクチベータータンパク質によるアクチュエーター分子の正の調節は、この複合体の形成によって阻害される（不活性化がもたらされる）。同時に、この複合体の形成により、アンチアクチベータータンパク質が他のアクチベータータンパク質分子と相互作用することが妨げられる（つまり、隔離化）。
一実施形態では、第１のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を負に調節するインヒビターをコードするセンスｍＲＮＡであり、第２のコントローラー分子は、このセンスｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含むアンチセンスＲＮＡを含む。
一実施形態では、第１のコントローラー分子は、アクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するか、又はアクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの分解を活性化するか、又はアクチュエーター分子の分解を活性化するか、又はアクチュエーター分子の機能のインヒビターを正に調節することによって、アクチュエーター分子の産生を負に調節するインヒビタータンパク質であり、第１のコントローラー分子がアンチアクチベータータンパク質であり、アクチベータータンパク質とアンチアクチベータータンパク質とが複合体を形成し、インヒビタータンパク質によるアクチュエーター分子の負の調節が複合体の形成により活性化される。
特に、この相反モチーフを、分子比例積分コントローラー（ＰＩコントローラー）を実現するために、フィードバック分子のフィードバック機構と組み合わせることができる。
特定の実施形態では、分子ＰＩコントローラーを提供するために、本発現システムは、第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子、及び、特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含む核酸を含み、ここでアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセス（Ｎ型ＰＩコントローラー）の場合、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、かつ
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節する（比例制御をもたらす）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、かつ
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節する（比例制御をもたらす）。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち、負のゲインプロセス（Ｐ型ＰＩコントローラー）の場合、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、かつ
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節する（比例制御をもたらす）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、かつ
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節する（比例制御をもたらす）。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子は出力分子を正に調節し（言い換えれば、アクチュエーター分子と出力分子との間のネットワークは正のゲインプロセスを表す）、ここで第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子は出力分子を負に調節し（言い換えれば、アクチュエーター分子と出力分子との間のネットワークは負のゲインプロセスを表す）、ここで第１のアンチコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。
出力分子と第１のコントローラー分子又はアンチコントローラー分子との間のこの追加のリンクによって、相反モチーフによる比例積分制御に加えて、微分制御を実装することができる。本明細書で使用されるとおり、微分制御とは、制御種（出力分子）に適用される補正が測定値（出力）の微分値に依存する制御機構である。比例制御を実装するフィードバックループとの組み合わせにおいて、これを使用して分子二次比例－積分－微分（ＰＩＤ）コントローラーを実装することができる（二次とは、第１のコントローラー分子と第１のアンチコントローラー分子の２種類のコントローラー種の存在による）。
一実施形態では、アクチュエーター分子は出力分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。
一実施形態では、アクチュエーター分子は出力分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。
特定の実施形態では、二次ＰＩＤコントローラーを実装するために、発現システムは、第１のコントローラー分子、第２のコントローラー分子、及び特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含む核酸を含み、ここでアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセス（Ｎ型二次ＰＩＤコントローラー）の場合、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節する（この成分を比例成分と組み合わせることで、フィルタリングされたＰＤ制御が実現する）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節する（この成分を比例成分と組み合わせることで、フィルタリングされたＰＤ制御が実現する）。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち負のゲインプロセスの場合（Ｐ型二次ＰＩＤコントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節する（この成分を比例成分と組み合わせることで、フィルタリングされたＰＤ制御が実現する）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節する（この成分を比例成分と組み合わせることで、フィルタリングされたＰＤ制御が実現する）。
特定の実施形態では、発現システムは、第２のコントローラー分子をコードする組換え遺伝子を含む核酸をさらに含む。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（正のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（正のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（負のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（負のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する。
追加の第２のコントローラー分子によって、ネットワーク内で微分制御が実装される。積分制御（例えば、相反モチーフを介する）と比例制御（例えば、人工フィードバックループを使用する）とを組み合わせて、分子三次比例－積分－微分（ＰＩＤ）コントローラーを実装することができる。このコントローラーは、第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子、第２のコントローラー分子という３種の関与種による三次コントローラーである。
特定の実施形態では、分子三次ＰＩＤコントローラーを実装するために、発現システムは、第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子、第２のコントローラー分子、及び特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含む核酸を含み、ここでアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち正のゲインプロセス（Ｎ型三次ＰＩＤコントローラー）の場合：
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子はアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節するか（これは比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第２のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（これは比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第２のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子はアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節するか（これは比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第２のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（これは比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第２のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち負のゲインプロセスの場合（Ｐ型三次ＰＩＤコントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第２のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第２のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第２のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第２のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
特定の実施形態では、発現システムは、第２のアンチコントローラー分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含む核酸をさらに含み、ここで、前記第２のアンチコントローラー分子は、第２のコントローラー分子を負に調節し、特に不活性化、隔離及び／又は消滅させ、かつ前記第２のコントローラー分子は、第２のアンチコントローラー分子を負に調節し、特に不活性化、隔離及び／又は消滅させ、ここで、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセスの場合、第２のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、及びアクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち、負のゲインプロセスの場合、第２のコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。
本実施形態によれば、第２のコントローラー分子と第２のアンチコントローラー分子とは、特に、細胞内のネットワークを制御するための分子四次比例－積分－微分（ＰＩＤ）コントローラーを実装するために使用できる第２の相反モチーフを形成する。
特定の実施形態では、第２のコントローラー分子は、自身を負に調節する。
特定の実施形態では、四次ＰＩＤコントローラーを実装するために、発現システムは、第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子、第２のコントローラー分子、第２のアンチコントローラー分子、及びフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含む核酸を含み、ここで前記アクチュエーター分子が前記出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセスの場合（Ｎ型四次ＰＩＤコントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（第１の相反モチーフ）、出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節し、第２のアンチコントローラー分子は第２のコントローラー分子を負に調節し、第２のコントローラー分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し（第２の相反モチーフ）、出力分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し、かつ第２のコントローラー分子はそれ自体を負に調節する（微分制御をもたらす）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（第１の相反モチーフ）、出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節し、第２のアンチコントローラー分子は第２のコントローラー分子を負に調節し、第２のコントローラー分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し（第２の相反モチーフ）、出力分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し、かつ第２のコントローラー分子はそれ自体を負に調節する（微分制御をもたらす）。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち負のゲインプロセスの場合（Ｐ型四次ＰＩＤコントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第２のアンチコントローラー分子は第２のコントローラー分子を負に調節し、第２のコントローラー分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し（第２の相反モチーフ）、出力分子は第２のコントローラー分子を正に調節し、かつ第２のコントローラー分子はそれ自体を負に調節する（微分制御をもたらす）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第２のアンチコントローラー分子は第２のコントローラー分子を負に調節し、第２のコントローラー分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し（第２の相反モチーフ）、出力分子は第２のコントローラー分子を正に調節し、かつ第２のコントローラー分子はそれ自体を負に調節する（微分制御をもたらす）。
特定の実施形態（特に、上述のＮ型又はＰ型のＰＩコントローラー、Ｎ型又はＰ型の二次、三次又は四次ＰＩＤコントローラーのいずれか１つの場合）では、第１のアンチコントローラー分子が第１のコントローラー分子を不活性化し、特に完全に不活性化し、かつ第１のコントローラー分子が第１のアンチコントローラー分子を不活性化し、特に完全に不活性化する。特に、第１のコントローラー分子と第１のアンチコントローラー分子との間の不活性化反応は化学量論的に固定されている。
特定の実施形態（特に、上述のＮ型又はＰ型のＰＩコントローラー、Ｎ型又はＰ型の二次、三次又は四次のＰＩＤコントローラーのいずれか１つの場合）において、第１のアンチコントローラー分子と第１のコントローラー分子とは、物理的に相互作用し、特に互いに結合し（例えば、タンパク質の場合）、又はハイブリダイズし（例えば、核酸の場合）互いに負に調節し、特に不活性化する。
特定の実施形態では、（特に、上述のＮ型又はＰ型のＰＩコントローラー、Ｎ型又はＰ型の二次、三次又は四次のＰＩＤコントローラーのいずれか１つの場合）、第１のアンチコントローラー分子と第１のコントローラー分子とは物理的に相互作用して互いを不活性化し、ここで前記第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子の生物学的機能、特に第１のコントローラー分子の標的分子（例えば、標的ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質）に対する結合活性を停止させ、前記第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を隔離する。
特定の実施形態（特に、上述のＮ型又はＰ型のＰＩコントローラー、Ｎ型又はＰ型の二次、三次又は四次のＰＩＤコントローラーのいずれか１つの場合）において、第１のアンチコントローラー分子と第１のコントローラー分子とは、互いに消滅して互いを負に調節し、特に互いに不活性化する。
特定の実施形態では、第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子の発現を調節する調節因子（レギュレーター）タンパク質、特に転写アクチベーター又は転写リプレッサー、をコードするセンスｍＲＮＡであり、前記第２のアンチコントローラー分子は、前記レギュレータータンパク質をコードするセンスｍＲＮＡの配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＲＮＡであり、特にフィードバック分子がアクチュエーター分子をコードする追加のｍＲＮＡ（例えば、負のゲインプロセスの場合のＰ型コントローラー用）である場合、センスｍＲＮＡは、アクチュエーター分子をコードする追加のｍＲＮＡの発現を負に調節するレギュレータータンパク質をコードし得る。
特定の実施形態では、第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域に結合するＲＮＡ結合タンパク質であり、それによって、アクチュエーター分子を負又は正に調節し、例えば、翻訳を阻害若しくは活性化すること、又はｍＲＮＡの分解を促進若しくは阻害することによってアクチュエーター分子を負又は正に調節し、かつ第２のアンチコントローラー分子はアンチＲＮＡ結合タンパク質であり、前記ＲＮＡ結合タンパク質と前記アンチＲＮＡ結合タンパク質とが複合体を形成し、前記ＲＮＡ結合タンパク質によるアクチュエーター分子の負又は正の調節が複合体の形成によって阻害される。
アンチＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質と複合体を形成することができるタンパク質であり得る。形成された複合体は、ＲＮＡ結合タンパク質を負に調節することができる。特に、この複合体は、ＲＮＡ結合タンパク質を阻害する。ＲＮＡ結合タンパク質とアンチＲＮＡ結合タンパク質とを含む複合体を形成することにより、ＲＮＡ結合タンパク質によるアクチュエーター分子の負又は正の調節を阻害することができる。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（正のゲインプロセス）、第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（正のゲインプロセス）、第１のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（負のゲインプロセス）、第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（負のゲインプロセス）、第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する。
このようにして、１つのコントローラー種（第１のコントローラー分子）のみを用いて、分子微分コントローラーを実装することができる。出力分子が第１のコントローラー分子を正に調節するか、又は負に調節するかは、ネットワークのパラメーターによって決定される。特に、この種の微分制御は、分子ＰＤコントローラーを実装するために、人工的なフィードバックループによる比例制御と組み合わせることができる。
特定の実施形態では、比例－微分（ＰＤ）コントローラーを実装するために、発現システムは、第１のコントローラー分子、及び特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含む核酸を含み、ここでアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち正のゲインプロセス（Ｎ型ＰＤコントローラー）の場合、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第１のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第１のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第１のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第１のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち、負のゲインプロセスの場合（Ｐ型ＰＤコントローラー）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第１のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第１のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様による発現システムを含む細胞に関する。
特定の実施形態では、該細胞は哺乳類細胞であり、特にヒト細胞である。
特定の実施形態では、該細胞はＴ細胞であり、特にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。
ＣＡＲ Ｔ細胞は、がん治療において頻繁に使用され、操作されたキメラ抗原受容体は、目的のがん細胞によって発現する抗原と相互作用し、次いでこのがん細胞はＣＡＲ Ｔ細胞によって特異的に標的とされる。
特定の実施形態では、細胞内の出力分子の濃度は、細胞内の少なくとも１つの炎症性サイトカインの濃度を示し、ここではアクチュエーター分子は、細胞内の少なくとも１つの免疫抑制剤の産生又は放出を正に調節する。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法時に、サイトカイン放出症候群（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＣＲＳ）と呼ばれる状態が頻繁に発生する。ＣＲＳは全身性炎症反応症候群の一種であり、炎症亢進、低血圧性ショック、及び多臓器不全により生命を脅かすことがある。ＣＲＳ時では、正のフィードバックによりＴ細胞及びその他の免疫細胞が活性化され、サイトカインストームを引き起こす。
特に、本発明による発現システム及び細胞は、ＣＲＳ時の免疫反応を担うネットワークを制御及び安定化することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞療法時のＣＲＳに対抗するために使用することができる。
この目的のために、特に、細胞内の少なくとも１つの炎症性サイトカインの濃度を示す分子、その存在又は濃度又は活性を、出力分子として選択することができ、その出力は、本発明によるコントローラー分子によって感知される。さらに、出力分子と同じネットワークの一部であり、かつ細胞内の少なくとも１つの免疫抑制剤の産生又は放出を正に調節する分子を、免疫応答を安定させ、かつＣＲＳを緩和するアクチュエーター分子として選択することができる。例えば、アクチュエーター分子は、ＣＲＳに対して有効であることが示されているＩＬ－６のアンタゴニスト又はＩＬ－１受容体のアンタゴニストとして働くことができる。
本発明による制御機構の手段により、免疫抑制の効果がないとされるような免疫抑制効果が小さすぎること、及び抗腫瘍応答効果を阻害するとされるような免疫抑制効果が大きすぎることの両方を回避するように、このアンタゴニスト機能に対する所望の設定値を実現することができる。さらに、患者固有の投与量への適応は、本発明による制御機構を使用して達成することができる。
本発明の第３の態様は、ネットワークを含む細胞に関し、ここで前記ネットワークは、アクチュエーター分子及び出力分子を含み、前記出力分子は、前記アクチュエーター分子によって正又は負に調節され、かつ前記細胞は、第１のコントローラー分子をコードする組換え遺伝子を発現し、前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を正又は負に調節する。
特定の実施形態では、前記細胞は、原核生物（特に細菌）又は真核生物（特に真菌、植物又は動物、より特に哺乳類）の細胞である。
特定の実施形態では、細胞はフィードバック分子をコードする組換え遺伝子を発現し、ここでフィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、フィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節し、かつアクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、フィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（言い換えれば、正のゲインプロセスの場合）、フィードバック分子は、アクチュエーター分子の生成を負に調節するマイクロＲＮＡであり、特にアクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害すること、又はアクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの分解を促進することによって、アクチュエーター分子の生成を負に調節するマイクロＲＮＡである。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（言い換えれば、正のゲインプロセスの場合）、フィードバック分子は、アクチュエーター分子の生成を負に調節するＲＮＡ結合タンパク質であり、特にアクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域に結合し、ｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって、アクチュエーター分子の生成を負に調節するＲＮＡ結合タンパク質である。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（言い換えれば、負のゲインプロセスの場合）、フィードバック分子はアクチュエーター分子をコードする追加のｍＲＮＡである。ここで、「追加のｍＲＮＡ」という用語は、アクチュエーター分子をコードする天然に生じる（すなわち、非組換え）遺伝子の転写物に加えて、細胞に導入される追加の組換え遺伝子の転写物を意味する。
特定の実施形態では、第１のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を正に調節し、ここで前記細胞は、第１のアンチコントローラー分子をコードする組換え遺伝子を発現し、前記第１のアンチコントローラー分子は、第１のコントローラー分子を負に調節し、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記第１のアンチコントローラー分子を負に調節する。特に、第１のアンチコントローラー分子は、第１のコントローラー分子を不活性化、隔離、及び／又は消滅させ、かつ第１のコントローラー分子は、第１のアンチコントローラー分子を不活性化、隔離、及び／又は消滅させる。特に、第１のアンチコントローラー分子は、第１のコントローラー分子を不活性化、隔離、及び／又は消滅させ、かつ第１のコントローラー分子は、第１のアンチコントローラー分子を不活性化、隔離、及び／又は消滅させる。アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（言い換えれば、正のゲインプロセスの場合）、第１のアンチコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（言い換えれば、負のゲインプロセスの場合）、第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。このようにして、アクチュエーター分子と出力分子との間の閉制御ループが、第１のコントローラー分子及び第１のアンチコントローラー分子を介して形成される。
特定の実施形態では、第１のアンチコントローラー分子は、第１のコントローラー分子を不活性化し、特に完全に不活性化し、かつ第１のコントローラー分子は、第１のアンチコントローラー分子を不活性化し、特に完全に不活性化する。特に、第１のコントローラー分子と第１のアンチコントローラー分子との間の不活性化反応は化学量論的に固定されている。
特定の実施形態では、第１のアンチコントローラー分子及び第１のコントローラー分子は、物理的に相互作用し、特に互いに結合し（例えば、タンパク質の場合）、又はハイブリダイズして（例えば、核酸の場合）、互いを負に調節し、特に互いに不活性化する。
特定の実施形態では、第１のアンチコントローラー分子及び第１のコントローラー分子は、物理的に相互作用して互いを不活性化し、ここで第１のアンチコントローラー分子は、第１のコントローラー分子の生物学的機能、特に標的分子（例えば、標的ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質）に対する第１のコントローラー分子の結合活性を停止し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を隔離する。
特定の実施形態では、第１のアンチコントローラー分子と第１のコントローラー分子とは、互いを負に調節するように、特に不活性化するように、互いに消滅する。
特定の実施形態では、第１のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を正に調節する、アクチュエーター分子をコードするセンスｍＲＮＡ、又はアクチベーター（例えばアクチュエーター分子をコードする遺伝子の転写アクチベーター）をコードするセンスｍＲＮＡを含むか、又はそれであり、ここで前記第１のアンチコントローラー分子は、前記センスｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含むアンチセンスＲＮＡを含むか、又はそれである。センスｍＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがハイブリダイズすることで、センスｍＲＮＡの翻訳が阻害される結果となる。同時に、ハイブリダイゼーションによってアンチセンスＲＮＡが他のセンスｍＲＮＡ分子と相互作用するのを妨げる。
特定の実施形態では、第１のコントローラー分子は、例えば、アクチュエーター分子をコードする遺伝子の転写を活性化すること、アクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの翻訳を活性化すること、又はアクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの分解を阻害すること、又はアクチュエーター分子の分解を阻害すること、あるいはアクチュエーター分子の機能のインヒビターを負に調節することによって、アクチュエーター分子の産生を正に調節するアクチベータータンパク質であり、ここで第１のアンチコントローラー分子は、アンチアクチベータータンパク質であり、このアクチベータータンパク質とアンチアクチベータータンパク質とが複合体を形成し、アクチベータータンパク質によるアクチュエーター分子の正の調節は、この複合体の形成によって阻害される。同時に、複合体形成により、アンチアクチベータータンパク質が他のアクチベータータンパク質分子と相互作用するのを妨げる。
特に、この相反モチーフを、分子比例積分コントローラ（ＰＩコントローラー）を実現するために、フィードバック分子のフィードバック機構と組み合わせることができる。
特定の実施形態では、分子ＰＩコントローラーを提供するために、本細胞は、第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子、及び特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を発現し、ここでアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセスの場合（Ｎ型ＰＩコントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、かつ
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節する（比例制御をもたらす）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、かつ
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節する（比例制御をもたらす）。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち、負のゲインプロセス（Ｐ型ＰＩコントローラー）の場合、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、かつ
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節する（比例制御をもたらす）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、かつ
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節する（比例制御をもたらす）。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子は出力分子を正に調節し（言い換えれば、アクチュエーター分子と出力分子との間のネットワークは正のゲインプロセスを表す）、ここで第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子は出力分子を負に調節し（言い換えれば、アクチュエーター分子と出力分子との間のネットワークは負のゲインプロセスを表す）、ここで第１のアンチコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。
特定の実施形態では、二次ＰＩＤコントローラーを実装するために、本細胞は、第１のコントローラー分子、第２のコントローラー分子、及び特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を発現し、ここでアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセスの場合（Ｎ型二次ＰＩＤコントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節する（この成分を比例成分と組み合わせることで、フィルタリングされたＰＤ制御がもたらされる）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節する（この成分を比例成分と組み合わせることで、フィルタリングされたＰＤ制御がもたらされる）。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち、負のゲインプロセスの場合（Ｐ型二次ＰＩＤコントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節する（この成分を比例成分と組み合わせることで、フィルタリングされたＰＤ制御がもたらされる）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節する（この成分を比例成分と組み合わせることで、フィルタリングされたＰＤ制御がもたらされる）。
特定の実施形態では、本細胞は、第２のコントローラー分子をコードする組換え遺伝子をさらに発現する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（正のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（正のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（負のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（負のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する。
追加の第２のコントローラー分子によって、ネットワーク内で微分制御が実装される。積分制御（例えば、相反モチーフを介する）及び比例制御（例えば、人工フィードバックループを使用する）と組み合わせて、分子三次比例－積分－微分（ＰＩＤ）コントローラーを実装することができる。このコントローラーは、第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子、第２のコントローラー分子という３種の関与種による三次コントローラーである。
特定の実施形態では、分子三次ＰＩＤコントローラーを実装するために、本細胞は、第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子、第２のコントローラー分子、及び特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を発現し、ここでアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセスの場合（Ｎ型三次ＰＩＤコントローラー）：
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子はアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第２のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第２のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子はアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第２のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第２のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち負のゲインプロセスの場合（Ｐ型三次ＰＩＤコントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第２のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第２のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第２のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第２のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
特定の実施形態では、本細胞は、第２のアンチコントローラー分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子をさらに発現し、ここで第２のアンチコントローラー分子は、第２のコントローラー分子を負に調節し、かつ第２のコントローラー分子は、第２のアンチコントローラー分子を負に調節し、ここで、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセスの場合、第２のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつアクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち、負のゲインプロセスの場合、第２のコントローラー分子は出力分子によって正に調節される。
本実施形態によれば、第２のコントローラー分子と第２のアンチコントローラー分子とは、特に、細胞内のネットワークを制御するための分子四次比例－積分－微分（ＰＩＤ）コントローラーを実装するために使用できる第２の相反モチーフを形成する。
特定の実施形態では、第２のコントローラー分子は、自身を負に調節する。
特定の実施形態では、四次ＰＩＤコントローラーを実装するために、本細胞は、第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子、第２のコントローラー分子、第２のアンチコントローラー分子、及び特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を発現し、ここで前記アクチュエーター分子が前記出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセスの場合（Ｎ型四次ＰＩＤコントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（第１の相反モチーフ）、出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節し、第２のアンチコントローラー分子は第２のコントローラー分子を負に調節し、第２のコントローラー分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し（第２の相反モチーフ）、出力分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し、かつ第２のコントローラー分子はそれ自体を負に調節する（微分制御をもたらす）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（第１の相反モチーフ）、出力分子は第１のアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節し、第２のアンチコントローラー分子は第２のコントローラー分子を負に調節し、第２のコントローラー分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し（第２の相反モチーフ）、出力分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し、かつ第２のコントローラー分子はそれ自体を負に調節する（微分制御をもたらす）。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち負のゲインプロセスの場合（Ｐ型四次ＰＩＤコントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第２のアンチコントローラー分子は第２のコントローラー分子を負に調節し、第２のコントローラー分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し（第２の相反モチーフ）、第２のコントローラー分子はそれ自体を負に調節し、かつ出力分子は、第２のコントローラー分子を正に調節する（微分制御をもたらす）。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第２のアンチコントローラー分子は第２のコントローラー分子を負に調節し、第２のコントローラー分子は第２のアンチコントローラー分子を負に調節し（第２の相反モチーフ）、第２のコントローラー分子はそれ自体を負に調節し、かつ出力分子は、第２のコントローラー分子を正に調節する（微分制御をもたらす）。
特定の実施形態では、第２のコントローラー分子は、自身を負に調節する。
特定の実施形態（特に、上述のＮ型又はＰ型のＰＩコントローラー、Ｎ型又はＰ型の二次、三次又は四次ＰＩＤコントローラーのいずれか１つの場合）では、第１のアンチコントローラー分子が第１のコントローラー分子を不活性化し、特に完全に不活性化し、かつ第１のコントローラー分子が第１のアンチコントローラー分子を不活性化し、特に完全に不活性化する。特に、第１のコントローラー分子と第１のアンチコントローラー分子との間の不活性化反応は化学量論的に固定されている。
特定の実施形態（特に、上述のＮ型又はＰ型のＰＩコントローラー、Ｎ型又はＰ型の二次、三次又は四次のＰＩＤコントローラーのいずれか１つの場合）において、第１のアンチコントローラー分子と第１のコントローラー分子とは、物理的に相互作用し、特に互いに結合し（例えば、タンパク質の場合）、又はハイブリダイズし（例えば、核酸の場合）互いに負に調節し、特に不活性化する。
特定の実施形態（特に、上述のＮ型又はＰ型のＰＩコントローラー、Ｎ型又はＰ型の二次、三次又は四次のＰＩＤコントローラーのいずれか１つの場合）において、第１のアンチコントローラー分子と第１のコントローラー分子とは物理的に相互作用して互いを不活性化し、ここで前記第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子の生物学的機能、特に第１のコントローラー分子の標的分子（例えば、標的ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質）に対する結合活性を停止させ、前記第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を隔離する。
特定の実施形態（特に、上述のＮ型又はＰ型のＰＩコントローラー、Ｎ型又はＰ型の二次、三次又は四次のＰＩＤコントローラーのいずれか１つの場合）において、第１のアンチコントローラー分子と第１のコントローラー分子とは、互いに消滅して互いを負に調節し、特に不活性化する。
特定の実施形態では、第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子の発現を調節するレギュレータータンパク質、特に転写アクチベーター又は転写リプレッサー、をコードするセンスｍＲＮＡであり、前記第２のアンチコントローラー分子は、前記レギュレータータンパク質をコードするセンスｍＲＮＡの配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＲＮＡであり、特にフィードバック分子がアクチュエーター分子をコードする追加のｍＲＮＡ（例えば、負のゲインプロセスの場合のＰ型コントローラー用）である場合、センスｍＲＮＡは、アクチュエーター分子をコードする追加のｍＲＮＡの発現を負に調節するレギュレータータンパク質をコードし得る。
特定の実施形態では、第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域に結合するＲＮＡ結合タンパク質であり、それによって、アクチュエーター分子を負又は正に調節し、例えば、翻訳を阻害若しくは活性化すること、又はｍＲＮＡの分解を促進若しくは阻害することによってアクチュエーター分子を負又は正に調節し、かつ第２のアンチコントローラー分子はアンチＲＮＡ結合タンパク質であり、前記ＲＮＡ結合タンパク質と前記アンチＲＮＡ結合タンパク質とが複合体を形成し、前記ＲＮＡ結合タンパク質によるアクチュエーター分子の負又は正の調節が複合体の形成によって阻害される。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（正のゲインプロセス）、第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（正のゲインプロセス）、第１のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（負のゲインプロセス）、第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（負のゲインプロセス）、第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する。
このようにして、１つのコントローラー種（第１のコントローラー分子）のみを用いて、分子微分コントローラーを実装することができる。出力分子が第１のコントローラー分子を正に調節するか、又は負に調節するかは、ネットワークのパラメーターによって決定される。特に、この種類の微分制御は、分子ＰＤコントローラーを実装するために、人工的なフィードバックループによる比例制御と組み合わせることができる。
特定の実施形態では、比例－微分（ＰＤ）コントローラーを実装するために、本細胞は、第１のコントローラー分子、及び特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を発現し、ここでアクチュエーター分子は出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセスの場合（Ｎ型ＰＤコントローラー）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第１のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第１のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を負に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第１のコントローラー分子は出力分子によって負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第１のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち、負のゲインプロセスの場合（Ｐ型ＰＤコントローラー）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第１のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第１のコントローラー分子は出力分子によって正又は負に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節するか（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）、又は第１のコントローラー分子は出力分子によって正に調節され、かつ第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正又は負に調節する（比例コントローラーと共にフィルタリングされたＰＤコントローラーをもたらす）。どちらの場合にも第１のコントローラー分子の調節とアクチュエーター分子の調節とが逆符号（一方が正、他方が負）である場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーはほぼ純粋なＰＤコントローラーである。符号が同じ場合、フィルタリングされたＰＤコントローラーは、ほぼいわゆるＬＡＧコントローラーである。
本発明の第４の態様は、医薬品としての使用のための、本発明の第２の態様又は第３の態様による細胞、又は本発明の第１の態様による発現システムに関する。
本発明の第５の態様は、免疫疾患、特にサイトカイン放出症候群又は関節リウマチの治療又は予防の方法における使用のための、本発明の第２の態様又は第３の態様による細胞、又は第１の態様による発現システムに関する。
本発明の第６の態様は、代謝性疾患又は内分泌疾患、特に糖尿病の治療又は予防の方法における使用のための、本発明の第２の態様又は第３の態様による細胞、又は第１の態様による発現システムに関する。
本発明の第７の態様は、細胞、特に第２の態様又は第３の態様による細胞におけるネットワークを制御する方法に関し、該方法は、本発明の第１の態様による発現システムの少なくとも１つの組換え遺伝子を細胞内で発現させることを含む。
本方法は、ｅｘ ｖｉｖｏでの方法とすることができる。
本発明の第８の態様は、医薬品の製造における、第２の態様若しくは第３の態様による細胞、又は第１の態様による発現システムの使用に関する。
本発明の第９の態様は、免疫疾患、特にサイトカイン放出症候群若しくは関節リウマチの治療又は予防のための医薬品の製造における、第２の態様若しくは第３の態様による細胞、又は第１の態様による発現システムの使用に関する。
本発明の第１０の態様は、代謝性疾患若しくは内分泌疾患、特に糖尿病の治療又は予防のための医薬品の製造における、第２の態様若しくは第３の態様による細胞、又は第１の態様による発現システムの使用に関する。
本明細書において、単一の分離可能な特徴の代替形態が「実施形態」として記載されている場合、そのような代替形態を自由に組み合わせて、本明細書に開示された発明の別個の実施形態を形成することができると理解されたい。
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこからさらなる実施形態及び利点を導き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
特定の実施形態では、発現システムは、第２のコントローラー分子をコードする組換え遺伝子を含む核酸をさらに含む。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（正のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を正に調節し、かつ自身を負に調節するように構成的に産生される。さらに、出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、かつ第１のコントローラー分子を正に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（負のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を調節し、かつそれ自体を負に調節するように構成的に産生される。さらに、出力分子はアクチュエーター分子及び第１のコントローラー分子を正に調節する。
追加の第２のコントローラー分子によって、ネットワーク内に微分制御が実装される。積分制御（例えば、相反モチーフを介する）及び比例制御（例えば、人工フィードバックループを用いる）と組み合わせて、分子流出比例－積分－微分（ＰＩＤ）コントローラーを実装することができる。このコントローラーは、第２のコントローラー分子の流出のみを調節することから、流出コントローラーとされる。
特定の実施形態では、分子流出ＰＩＤコントローラーを実装するために、発現システムは、第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子、第２のコントローラー分子、及び特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含む核酸を含み、ここでアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち正のゲインプロセスの場合（Ｎ型流出ＰＩＤコントローラー）：
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子はアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を正に調節し、かつ自身を負に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、かつ第１のコントローラー分子を正に調節し、その結果、微分制御をもたらす。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子はアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を正に調節し、かつ自身を負に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、かつ第１のコントローラー分子を正に調節し、その結果、微分制御をもたらす。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち、負のゲインプロセスの場合（Ｐ型流出コントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を正に調節し、かつ自身を負に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、かつ第１のコントローラー分子を正に調節し、その結果、微分制御がもたらされる。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子を正に調節し、かつ自身を負に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、かつ第１のコントローラー分子を正に調節し、その結果、微分制御がもたらされる。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（正のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子はそれ自体及びアクチュエーター分子を正に調節する。さらに、出力分子は、アクチュエーター分子及び第１のコントローラー分子を正に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（負のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子はそれ自体及びアクチュエーター分子を正に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子及び第１のコントローラー分子を負に調節する。
追加の第２のコントローラー分子によって、ネットワーク内に微分制御が実装される。積分制御（例えば、相反モチーフを介する）及び比例制御（例えば、人工フィードバックループを用いる）と組み合わせて、分子流入比例－積分－微分（ＰＩＤ）コントローラーを実装することができる。このコントローラーは、第２のコントローラー分子の流入のみを調節することから、流入コントローラーとされる。
特定の実施形態では、分子流入ＰＩＤコントローラーを実装するために、発現システムは、第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子、第２のコントローラー分子、及び特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含む核酸を含み、ここでアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセスの場合（Ｎ型流入ＰＩＤコントローラー）：
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子はアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子及びそれ自身を正に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子及び第１のコントローラー分子を負に調節し、それにより、微分制御がもたらされる。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子はアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子及びそれ自身を正に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子及び第１のコントローラー分子を負に調節し、それにより、微分制御がもたらされる。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち、負のゲインプロセス（Ｐ型流入ＰＩＤコントローラー）の場合、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子及びそれ自身を正に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子及び第１のコントローラー分子を負に調節し、それにより、微分制御がもたらされる。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子は、アクチュエーター分子及びそれ自身を正に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子及び第１のコントローラー分子を負に調節し、それにより、微分制御がもたらされる。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合（正のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子はそれ自体を正及び負に調節する。第２のコントローラー分子はまた、アクチュエーター分子を正に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、かつ第１のコントローラー分子を正に調節する。
特定の実施形態では、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合（負のゲインプロセス）、第２のコントローラー分子はそれ自体を正及び負に調節する。第２のコントローラー分子はまた、アクチュエーター分子を正に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、かつ第１のコントローラー分子を負に調節する。
追加の第２のコントローラー分子によって、ネットワーク内に微分制御が実装される。積分制御（例えば、相反モチーフを介する）及び比例制御（例えば、人工フィードバックループを使用する）と組み合わせて、分子自己触媒比例－積分－微分（ＰＩＤ）コントローラーを実装することができる。このコントローラーは、第２のコントローラーの自己触媒的な産生が微分制御を実現するための重要な機構であることから、自己触媒コントローラーとされる。
特定の実施形態では、分子自己触媒ＰＩＤコントローラーを実装するために、発現システムは、第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子、第２のコントローラー分子、及び特にフィードバック分子をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含む核酸を含み、ここでアクチュエーター分子が出力分子を正に調節する場合、すなわち、正のゲインプロセスの場合（Ｎ型自己触媒ＰＩＤコントローラー）：
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子はアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はそれ自体を正及び負に調節する。第２のコントローラー分子はまた、アクチュエーター分子を正に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、第１のコントローラー分子を正に調節し、その結果、微分制御をもたらす。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子はアンチコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を負に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、特に直接負に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はそれ自体を正及び負に調節する。第２のコントローラー分子はまた、アクチュエーター分子を正に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子を負に調節し、第１のコントローラー分子を正に調節し、その結果、微分制御をもたらす。
あるいは、アクチュエーター分子が出力分子を負に調節する場合、すなわち負のゲインプロセスの場合（Ｐ型自己触媒ＰＩＤコントローラー）、
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はそれ自体を正及び負に調節する。第２のコントローラー分子はまた、アクチュエーター分子を正に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のコントローラー分子を負に調節し、その結果、微分制御をもたらす。
－ 第１のコントローラー分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のアンチコントローラー分子は第１のコントローラー分子を負に調節し、第１のコントローラー分子は第１のアンチコントローラー分子を負に調節し（相反モチーフ）、かつ出力分子は第１のコントローラー分子を正に調節し（積分制御をもたらす）、
－ フィードバック分子は出力分子によって正に調節され、かつフィードバック分子はアクチュエーター分子を正に調節するか、又は（フィードバック分子が提供されない場合）出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、特に直接正に調節し（比例制御をもたらす）、及び
－ 第２のコントローラー分子はそれ自体を正及び負に調節する。第２のコントローラー分子はまた、アクチュエーター分子を正に調節する。さらに、出力分子はアクチュエーター分子を正に調節し、第１のコントローラー分子を負に調節し、その結果、微分制御をもたらす。
図の詳細な説明
図１は、アクチベーター（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）のセンスｍＲＮＡ ｚ１（第１のコントローラー分子）とアンチセンスＲＮＡ ｚ２（第１のアンチコントローラー分子）とによって形成される相反積分フィードバックモチーフ（ａｎｔｉｔｈｅｔｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｍｏｔｉｆ）に基づく、本発明による分子Ｎ型積分コントローラーの一例を示す。図１の右側の雲は、アクチュエーター（ａｃｔｕａｔｏｒ）Ｘ１と出力（ｏｕｔｐｕｔ）ＸＬとを含む生体細胞内の調節化ネットワークを表しており、ここでアクチュエーターＸ１が出力ＸＬを正に調節し、特に間接的に、すなわち、ネットワークの複数のさらなる分子によって、正に調節する（正のゲインプロセス）。アクチベーターセンスｍＲＮＡ ｚ１は、構成的プロモーター下で細胞内で発現する第１の組換え遺伝子の産物（構築物及び分岐は「２」と表示）である。図示の例では、アクチベーターセンスｍＲＮＡ ｚ１が翻訳されて、アクチベータータンパク質 Ａｃｔが生成され、このアクチベータータンパク質 Ａｃｔは、アクチュエーターｍＲＮＡ Ｘ１（アクチュエーター分子）をコードする組換え遺伝子（構築物及び分岐を「３」と表示）の正の転写調節因子（転写レギュレーター）であり、すなわち、Ｘ１をコードする遺伝子には、アクチベーターセンシングプロモーターを有している。アンチセンスＲＮＡ ｚ２をコードする第２の遺伝子（構築物及び分岐を「１」と表示）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で、細胞内で組換え発現する。アンチセンスＲＮＡは、アクチベーターセンスＲＮＡ ｚ１と相補的な配列を持つため、ｚ１とハイブリダイズして不活性な複合体ｚ１－ｚ２となり、ｚ１の翻訳をブロックし、最終的にｚ１とｚ２の分解をもたらす（相反モチーフ）。
図１は、アクチベーター（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）のセンスｍＲＮＡ ｚ１（第１のコントローラー分子）とアンチセンスＲＮＡ ｚ２（第１のアンチコントローラー分子）とによって形成される相反積分フィードバックモチーフ（ａｎｔｉｔｈｅｔｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｍｏｔｉｆ）に基づく、本発明による分子Ｎ型積分コントローラーの一例を示す。図１の右側の雲は、アクチュエーター（ａｃｔｕａｔｏｒ）Ｘ１と出力（ｏｕｔｐｕｔ）ＸＬとを含む生体細胞内の調節化ネットワークを表しており、ここでアクチュエーターＸ１が出力ＸＬを正に調節し、特に間接的に、すなわち、ネットワークの複数のさらなる分子によって、正に調節する（正のゲインプロセス）。アクチベーターセンスｍＲＮＡ ｚ１は、構成的プロモーター下で細胞内で発現する第１の組換え遺伝子の産物（構築物及び分岐は「２」と表示）である。図示の例では、アクチベーターセンスｍＲＮＡ ｚ１が翻訳されて、アクチベータータンパク質 Ａｃｔが生成され、このアクチベータータンパク質 Ａｃｔは、アクチュエーターｍＲＮＡ Ｘ１（アクチュエーター分子）をコードする組換え遺伝子（構築物及び分岐を「３」と表示）の正の転写調節因子（転写レギュレーター）であり、すなわち、Ｘ１をコードする遺伝子には、アクチベーターセンシングプロモーターを有している。アンチセンスＲＮＡ ｚ２をコードする第２の遺伝子（構築物及び分岐を「１」と表示）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で、細胞内で組換え発現する。アンチセンスＲＮＡは、アクチベーターセンスＲＮＡ ｚ１と相補的な配列を持つため、ｚ１とハイブリダイズして不活性な複合体ｚ１－ｚ２となり、ｚ１の翻訳をブロックし、最終的にｚ１とｚ２の分解をもたらす（相反モチーフ）。
図２は、本発明による分子Ｎ型比例積分コントローラーの一例を示す。積分制御は、図１及び上述したものと同じＲＮＡベースの相反モチーフによって実装される（構築物及び分岐１～３）。さらに、マイクロＲＮＡ（フィードバック分子）をコードするさらなる組換え遺伝子（構築物及び分岐を「４」と表示）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で、細胞内で発現する。マイクロＲＮＡは、アクチュエーターｍＲＮＡ Ｘ１の非翻訳領域に結合することで、アクチュエーターｍＲＮＡの翻訳をブロックし、分解を開始させる。これにより、ＸＬとＸ１との間に負のフィードバックが実装され、相反モチーフによる積分制御に加えて、比例制御がもたらされる。
図３は、本発明による分子Ｎ型二次ＰＩＤコントローラーの一例を示す。図１及び図２、並びに上述（構築物及び分岐１～４）に示すように、ＲＮＡベースの相反モチーフ及び負のフィードバック機構が実装される。さらに、微分制御を得るために、アクチベーターセンスｍＲＮＡ ｚ１（第１のコントローラー分子）のさらなるコピーをコードするさらなる組換え遺伝子（構築物及び分岐を「５」と表示）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの制御下で細胞内で発現する。
図４は、本発明による分子Ｎ型三次ＰＩＤコントローラーの一例を示す。図１及び図２、並びに上述（構築物及び分岐１～４）に示すように、ＲＮＡベースの相反モチーフ及び負のフィードバック機構が実装される。さらに、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの制御下で、レギュレーターｍＲＮＡ ｚ３（第２のコントローラー分子）をコードするさらなる組換え遺伝子（構築物及び分岐を「５」と表示）が細胞内で発現する。レギュレーターｍＲＮＡは、アクチュエーターｍＲＮＡ Ｘ１のさらなるコピーをコードするさらなる組換え遺伝子（レギュレータータンパク質センシングプロモーターを有する構築物「６」及び分岐「６」）の転写のアクチベーター又はリプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）であるレギュレータータンパク質をコードする。
図５は、本発明による分子Ｎ型四次ＰＩＤコントローラーの一例を示す。図１及び図２、並びに上述（構築物及び分岐１～４）に示すように、ＲＮＡベースの相反モチーフ及び負のフィードバック機構が実装される。さらに、リプレッサーセンスｍＲＮＡ ｚ５をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で細胞内に発現する。リプレッサーセンスｍＲＮＡ ｚ５は、アクチュエーターｍＲＮＡ Ｘ１のさらなるコピーをコードする組換え遺伝子（Ｒｅｐセンシングプロモーターを有する構築物「６」）の転写を抑制するリプレッサータンパク質Ｒｅｐに翻訳される。さらに、リプレッサーセンスｍＲＮＡ ｚ４（第２のコントロール分子）をコードする組換え遺伝子（構築物「７」）がリプレッサータンパク質Ｒｅｐ（Ｒｅｐセンシングプロモーター）の負の制御下で発現し、かつｍＲＮＡ ｚ４と相補的なアンチセンスＲＮＡ ｚ３（第２のアンチコントローラー分子）をコードする組換え遺伝子（構築物「８」）は構成的プロモーター下で発現する。ｍＲＮＡ ｚ４とアンチセンスＲＮＡ ｚ３とはハイブリダイズし、かつ不活性な複合体を形成して、ｍＲＮＡ ｚ４の翻訳をブロックすることで分解されることになる。したがって、ｚ３とｚ４とは、ネットワークの微分制御に関与する、さらなる相反モチーフを形成する。
図６は、アクチベーターのセンスｍＲＮＡ ｚ２とアンチセンスＲＮＡ ｚ１とで形成される相反積分フィードバックモチーフに基づく、本発明による分子Ｐ型積分コントローラーの一例を示す。この例では、アクチュエーター分子Ｘ１が出力分子ＸＬを負に調節する（負のゲインプロセス）。アクチベーターセンスｍＲＮＡ ｚ２（第１のコントローラー分子）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で組換え発現する（構築物「１」）。アクチベーターセンスＲＮＡ ｚ２が翻訳され、アクチベータータンパク質Ａｃｔが得られ、このアクチベータータンパク質Ａｃｔは、アクチベーターＡｃｔセンシングプロモーター下で細胞内に組換え発現されるｍＲＮＡ ｍ１（構築物「３」）の正の転写調節因子（レギュレータ）である。ｍＲＮＡ ｍ１の遺伝子産物は、アクチュエーター分子Ｘ１の産生を（直接的又は間接的に）正に調節する。アンチセンスＲＮＡ ｚ１（第１のアンチコントローラー分子）は、構成的プロモーター下で発現し（構築物「２」を参照）、ｚ２と相補的な配列を有し、それにより、ｚ１とｚ２とが不活性複合体を形成してｚ２の翻訳を干渉し（したがってＡｃｔタンパク質産生の減少）、複合体のＲＮＡの分解に至るようになっている。このように、ｚ１とｚ２とは相反モチーフを形成し、ネットワークの積分制御がもたらされる。
図７は、図６及び上述に示したすべての構成要素を含む本発明による分子Ｐ型ＰＩコントローラ（負のゲインプロセスの制御）の一例を示す。さらに、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター（出力センシングプロモーター）の下で、「４」と表示された構築物から、さらなるｍＲＮＡ ｍ２（フィードバック分子）が細胞内で組換え発現する。ｍＲＮＡ ｍ２は、アクチュエーター分子Ｘ１（その天然遺伝子由来、又はさらなる組換え遺伝子コピー由来のいずれか）の産生を（直接的又は間接的に）正に調節するタンパク質をコードする。この結果、出力分子ＸＬとアクチュエーター分子Ｘ１との間でフィードバックループがもたらされ、相反モチーフを介した積分制御に加えて、ネットワークの比例制御がもたらされる。
図８は、図６及び図７に示したすべての構成要素（構築物１～４）を含む本発明による分子Ｐ型二次ＰＩＤコントローラーの一例を示す。さらに、アンチセンスＲＮＡ ｚ１（第１のコントローラー分子）のさらなるコピーを、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの下で細胞内で発現させて（構築物「５」）、ネットワークの微分制御を実装する。
図９は、図６及び図７に示したすべての構成要素（構築物１～４）を含む本発明による分子Ｐ型三次ＰＩＤコントローラーの一例を示す。さらに、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの下で、レギュレーターセンスｍＲＮＡ ｚ３（第２のコントローラー分子）が細胞内で組換え発現する（構築物「５」）。レギュレーターセンスｍＲＮＡ ｚ３は、レギュレータータンパク質Ｒｅｇ（転写アクチベーター又は転写リプレッサー）を産生する。さらに、ｍＲＮＡ ｍ２（アクチュエーター分子Ｘ１の正のレギュレーター）が、レギュレータータンパク質Ｒｅｇによって正又は負に調節されるプロモーターの制御下で、細胞内で組換え発現する（構築物「６」）。
図１０は、図６及び図７に示したすべての構成要素（構築物１～４）を含む本発明による分子Ｐ型四次ＰＩＤコントローラーの一例を示す。さらに、リプレッサータンパク質Ｒｅｐを産生するリプレッサーｍＲＮＡ ｚ４（第２のコントローラー分子）が、出力分子ＸＬによって正に調節され、かつ該リプレッサータンパク質によって負に調節されるプロモーターの制御下で構築物「５」から細胞内で組換え発現する。ｍＲＮＡ ｍ２をコードするさらなる構築物「６」が、出力分子ＸＬによって正に調節され、かつリプレッサータンパク質によって負に調節されるプロモーター下で、細胞内で組換え発現する。ｍＲＮＡ ｍ２は、アクチュエーター分子Ｘ１を、例えばアクチュエーター分子をコードする遺伝子のさらなるコピーからの転写を活性化することにより、正に調節する。さらに、リプレッサーｍＲＮＡ ｚ４と相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ ｚ３（第２のアンチコントローラー分子）が、構成的プロモーターから発現する（構築物「７」）。ｚ１及びｚ２について上述したように、ｚ３とｚ４とは複合体を形成してｚ４の翻訳を干渉し、最終的にｍＲＮＡのｚ３及びｚ４の分解に至る。これにより、ｚ３とｚ４とは、ネットワークの微分制御に寄与する、さらなる相反モチーフを形成する。
図１１は、本発明による分子Ｎ型積分コントローラーのさらなる例を示す。図１に示したコントローラーとは対照的に、相反モチーフはタンパク質間の相互作用によって実装される。図１１の右側の雲で表されるセルラーネットワーク（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｔｗｏｒｋ）では、アクチュエーター分子Ｘ１が出力分子ＸＬを正に調節し、つまり、正のゲインプロセスが制御されている。アクチベーターｍＲＮＡ ｚ１が、構成的プロモーターから細胞内で組換え発現する（構築物「２」を参照）。ｍＲＮＡ ｚ１が翻訳されて、アクチベータータンパク質Ｚ１（第１のコントローラー分子、Ｚ１（Ａｃｔ）とも称する）が産生される。アクチュエーター分子Ｘ１を正に調節するアクチュエーター ｍＲＮＡ ｍ１が、アクチベータータンパク質 Ｚ１によって正に調節されるプロモーターから組換え発現する（構築物「３」を参照）。さらに、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの制御下で、アンチアクチベーターｍＲＮＡ ｚ２が組換え発現する（構築物「１」を参照）。アンチアクチベーターｍＲＮＡ ｚ２は、アンチアクチベータータンパク質Ｚ２（第１のアンチコントローラー分子）に翻訳され、これはアクチベータータンパク質Ｚ１と特異的に相互作用してＺ１を隔離及び不活性化し、その結果、Ｚ１によるｍ１の転写活性化を減少又は消失させる。タンパク質Ｚ１及びＺ２は、タンパク質をベースとした相反モチーフを実現し、ネットワークの積分制御をもたらす。
図１２は、本発明による分子Ｎ型ＰＩコントローラーのさらなる例を示す。該コントローラーは、図１１に示すすべての構成要素（構築物１～３）を含む。さらに、ＲＮＡ結合タンパク質ＲＢＰ（フィードバック分子）をコードするｍＲＮＡ ｚ３が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの制御下で、（構築物「４」から）細胞内で組換え発現する。このｍＲＮＡが翻訳されて、ＲＮＡ結合タンパク質ＲＢＰが得られ、これは、アクチュエーター分子Ｘ１をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域に結合してＸ１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害し、それによって、Ｘ１を負に調節する。このように、ＸＬとＸ１との間で負のフィードバックを実装し、その結果、比例制御がもたらされる。
図１３は、本発明による分子Ｎ型二次ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す。該コントローラーは、図１１及び図１２に示すすべての構成要素（構築物１～４）を含む。さらに、上記のアクチベーターｍＲＮＡ ｚ１の第２のコピーが、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターから組換え発現する（構築物「５」を参照。この構成要素を比例構成要素と組み合わせることにより、フィルタリングされたＰＤ制御がもたらされる）。
図１４は、本発明による分子Ｎ型三次ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す。該コントローラーは、図１１及び図１２に示すすべての構成要素（構築物１～４）を含む。さらに、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターから、レギュレーターｍＲＮＡ ｚ４が細胞内で組換発現する。このｍＲＮＡ ｚ４は、翻訳のリプレッサー又はアクチベーターであるレギュレータータンパク質Ｒｅｇ（第２のコントローラー分子）に翻訳される。レギュレータータンパク質Ｒｅｇは、アクチュエーター分子Ｘ１をコードするｍＲＮＡの翻訳を負又は正に調節する（この構成要素と比例構成要素を組み合わせることで、フィルタリングされたＰＤ制御がもたらされる）。
図１５は、本発明による分子Ｎ型四次ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す。該コントローラーは、図１１及び図１２に示すすべての構成要素（構築物１～４）を含む。さらに、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの制御下で、リプレッサーｍＲＮＡ ｚ５が細胞内で組換え発現する（構築物「５」）。さらに、リプレッサー／ＲＢＰセンスｍＲＮＡ ｚ４（第２のコントローラー分子）が細胞内で組換え発現する（構築物「６」）。ｚ４の翻訳産物は、ｚ４自体の転写リプレッサーとしての機能と、アクチュエーター分子Ｘ１をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域に結合し、それによりＸ１の翻訳を抑制する、（構築物４から発現するＲＢＰに加えて）さらなるＲＮＡ結合タンパク質としての機能との、２つの機能を有するタンパク質Ｒｅｐ（リプレッサー及びＲＮＡ結合タンパク質）である。該ｍＲＮＡ ｚ４は、Ｒｅｐタンパク質によって抑制されるＲｅｐセンシティブプロモーター下で、構築物５から発現する。最後に、ｚ４と相補的な配列を持つアンチセンスＲＮＡ ｚ３（第２のアンチコントローラー分子）が、構成的プロモーター下で細胞内にて組換え発現する（構築物「７」）。アンチセンスＲＮＡ ｚ３はｍＲＮＡ ｚ４と複合体を形成し、これはｚ４の翻訳を干渉し（その結果、Ｒｅｐタンパク質濃度が低下し）、かつ最終的にｚ３とｚ４とが分解されることになる。これにより、ｚ３とｚ４とによって第２の（ＲＮＡベースの）相反モチーフが形成され、これはネットワークの微分制御に寄与する。
図１６は、本発明による分子Ｐ型積分コントローラーのさらなる例を示す。ここでは、負のゲインプロセスが調整され、すなわち、アクチュエーター分子Ｘ１が出力分子ＸＬを負に調節する。アクチベーターｍＲＮＡ ｚ２が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの制御下で、細胞内で組換え発現する（構築物「１」）。ｚ２の翻訳産物は、アクチベータータンパク質Ｚ２（第１のコントローラー分子）である。アンチアクチベーターｍＲＮＡ ｚ１が、構成的プロモーター下で細胞内にて組換え発現する（構築物「２」）。ｍＲＮＡ ｚ１は、アンチアクチベータータンパク質Ｚ１（第１のアンチコントローラー分子）に翻訳され、これは、アクチベータータンパク質Ｚ２に特異的に結合し、それによって該アンチアクチベータータンパク質を隔離及び不活性化する（タンパク質間相互作用に基づく相反モチーフ）。アクチュエーターｍＲＮＡ ｍ１が、アクチベータータンパク質 Ｚ２によって正に調節されるプロモーターの下で細胞内でさらに組換え発現する（構築物「３」）。ｍＲＮＡ ｍ１は、アクチュエーター分子Ｘ１の産生を（直接的又は間接的に）正に調節する。
図１７は、本発明による分子Ｐ型ＰＩコントローラーのさらなる例を示す。図１６及び上述に示される構成要素（構築物１～３）に加えて、該コントローラーは、ＸＬとＸ１との間の負のフィードバックループを実装するために、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの下でアクチュエーター分子Ｘ１（Ｘ１遺伝子のさらなるコピー）をコードするアクチュエーターｍＲＮＡ ｍ２（フィードバック分子）を細胞内で組換え発現するための構築物（「４」と表示）をさらに含み、その結果、ネットワークの比例制御をもたらす。
図１８は、本発明による分子Ｐ型二次ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す。このコントローラーは、図１６及び図１７、並びに上述（構築物１～４）に示したすべての構成要素を含む。さらに、アンチアクチベーターｍＲＮＡ ｚ１をコードする遺伝子のさらなるコピーが、構築物「５」を介して細胞内に導入される。これにより、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの制御下で、アンチアクチベーターｍＲＮＡ ｚ１が組換え発現し、微分制御が実現される。
図１９は、本発明による分子Ｐ型三次ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す。このコントローラーは、図１６及び図１７、並びに上述（構築物１～４）に示したすべての構成要素を含む。さらに、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの制御下で、構築物「５」からレギュレーターｍＲＮＡ ｚ３が細胞内で組換え発現する。レギュレーターｍＲＮＡは、転写のアクチベーター又はリプレッサーとなり得るレギュレータータンパク質Ｚ３（第２のコントローラー分子、図１９ではＺ３（Ｒｅｇ）とも称される）に翻訳される。さらに、レギュレータータンパク質Ｚ３によって活性化又は抑制されるプロモーターの制御下で、構築物「６」からアクチュエーターｍＲＮＡ ｍ２のさらなるコピーが組換え発現する。その結果、ネットワークの微分制御がもたらされる。
図２０は、本発明による分子Ｐ型四次ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す。このコントローラーは、図１６及び図１７、並びに上述（構築物１～４）に示したすべての構成要素を含む。さらに、ＲＮＡ結合タンパク質Ｚ４（第２のコントローラー分子）とアクチュエーター分子Ｘ１とを相前後してコードするＲＢＰ－アクチュエーターｍＲＮＡ ｚ４をコードし、それにより、それらが出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーターの制御下で細胞内で共発現するように構築物「５」を導入する。ＲＮＡ結合タンパク質Ｚ４は、ＲＢＰ－アクチュエーターｍＲＮＡ ｚ４の非翻訳領域に結合し、Ｚ４及びＸ１への翻訳を阻害する。さらに、アンチＲＢＰ ｍＲＮＡ ｚ３が細胞内で構成的プロモーターから組換え発現する（構築物「６」を参照）。ｚ３の翻訳産物はアンチＲＢＰタンパク質 Ｚ３（第２のアンチコントローラー分子）であり、これはＲＮＡ結合タンパク質Ｚ４と複合体を形成して、Ｚ４のＲＮＡ結合機能を阻害する。これにより、Ｚ３及びＺ４によって、ネットワークの微分制御に寄与する第２のタンパク質ベースの相反モチーフが実装される。
図２１は、正のゲインプロセス（Ｎ型コントローラー、左）及び負のゲインプロセス（Ｐ型コントローラー、右）のための相反積分フィードバックモチーフを埋め込んだ任意の分子ネットワークのネットワークトポロジーを示す。Ｚ１及びＺ２（第１のコントローラー分子及び第１のアンチコントローラー分子）と表示されたノードが共に、相反モチーフを形成する。種Ｚ１は、速度（ｒａｔｅ）μで生成され、種Ｚ１が速度ηで種Ｚ２と相互作用する際に機能的に消滅する。さらに、種Ｚ１は、種Ｘ１（アクチュエータ分子）の生成を促進することにより制御されたネットワークと相互作用する。フィードバックループを閉じるために、θと出力種ＸＬ（出力分子）とに比例する反応速度で種Ｚ２が生成される。
図２２ａは、開ループと閉ループのダイナミクスの比較を示す。制御されたネットワークにいずれの外乱がない場合、開ループ（下）システムと閉ループ（上）システムとの両方が望ましい設定値をたどる。しかしながら、外乱が発生し、それが持続する場合、開ループ回路は所望の設定値から逸脱するが、一方、閉ループシステムはある程度の過渡的な逸脱の後に復帰する。これはまた、しばらくすると外乱が弱まるが、なお外乱が続くケースでも同様である。相反モチーフのダイナミクスは、図２２ｂに示す常微分方程式系で与えられる。種Ｚ１の常微分方程式から種Ｚ２の常微分方程式を引いて積分すると、出力の定常状態がプラントパラメーターに依存しない値に収束することを保証するコントローラーの隠れた積分作用が明らかになる。出力の長期的な挙動は、２つの反応速度μとθとの比によって与えられる。重要なことは、この定常状態は、制御されたネットワーク内のどの速度にも依存せず、それ故、これらの速度の外乱に対してロバストである。
図２３は、哺乳類細胞における合成相反積分フィードバック回路の完全な適応を表すデータである。図２３ａは、開ループ回路及び閉ループ回路の遺伝子的実装を示す。どちらの回路も２つの遺伝子からなり、別々のプラスミドで実現される。アクチベータープラスミド（第１のコントローラー分子）の遺伝子は、蛍光タンパク質ｍＣｉｔｒｉｎｅ及び化学的誘導性分解タグ（ＳＭＡＳｈ）でタグ付けされた合成転写因子ｔＴＡ（テトラサイクリントランスアクチベーター）をコードする。その発現は強力な構成的プロモーター（ＰＥＦ－１α）によって駆動される。アンチセンスプラスミドの遺伝子は、ｔＴＡ応答性プロモーター（ＰＴＲＥ）の制御下でアンチセンスＲＮＡ（第１のアンチコントローラー分子）を発現する。開ループ構成では、ＴＲＥプロモーターを非応答性プロモーターに交換した。この設定において、制御される種はｔＴＡタンパク質であり、これはＳＭＡＳｈ分解タグの化学的誘導物質、アスナプレビル（Ａｓｕｎａｐｒｅｖｉｒ：ＡＳＶ）を添加することにより、外部から摂動させることができる。図２３ｂは、プラスミド比率が増加した場合の出力（ｍＣｉｔｒｉｎｅ）の定常状態を示す。パネル（ａ）に示すような閉ループ回路の遺伝子実装を、異なるモル比（設定値：＝アクチベーター／アンチセンス）で一過性にトランスフェクションした。データはトランスフェクション後４８時間に収集され、ｎ＝３の複製について、最低設定値（１／１６）に正規化した条件ごとの平均値±標準誤差（ｓ．ｅ）として示される。これは、プラスミド比率を増大させると、定常的な出力のレベルが増大することを示す。図２３ｃは、ＡＳＶによる分解の誘導に対する開ループと閉ループとの実装の定常応答を示す。図２３ａに示すような開ループ及び閉ループ回路の遺伝子実装を、異なるモル比で一過性にトランスフェクションし、０．０３３μＭのＡＳＶで摂動させた。データはトランスフェクション後４８時間に収集され、各設定値について未摂動の条件に正規化した条件ごとの平均値として別々に示す。これは、閉ループ回路の外乱拒絶能力を実証し、開ループ回路では適応が実現できないことを示す。
図２４は、調節されたネットワークへの摂動に対する応答を表すデータを示す。図２４ａは、負のフィードバックループを有するネットワークトポロジーの拡張を模式的に表す。ｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅからそれ自身の産生の負のフィードバックループを、ｔＴＡ応答性ＴＲＥプロモーターの制御下でＲＮＡ結合タンパク質Ｌ７Ａｅを発現させることで追加した。このタンパク質は、センスｍＲＮＡ種の５’非翻訳領域に結合して、ｔＴＡの翻訳を阻害する。図２４ｂは、閉ループ回路が制御されたネットワークのトポロジーに対して偏りがないことを示すデータである。ネットワークの摂動をコトランスフェクトすることにより、かつＡＳＶを０．０３３μｍ添加することにより、閉ループ回路及び開ループ回路を摂動した。これを２つの設定値１／２及び１（設定値：＝アクチベーター／アンチセンス）で実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクション後４８時間にフローサイトメトリーを用いて測定し、データはｎ＝３の複製について、非摂動ネットワーク及びＡＳＶなし条件で正規化した条件ごとの平均±ｓ．ｅ．として示す。
図２５は、本発明による比例－積分型コントローラーの実装を示す。図２５Ａは、独立型の比例（Ｐ）コントローラーと比例－積分（ＰＩ）コントローラーの遺伝的な実装を表す。（同じｍＲＮＡから同時に生成されるため、ｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅの代理となる）ＲＮＡ結合タンパク質Ｌ７Ａｅからの負のフィードバックループが、相反モチーフに付加される。このタンパク質は、センスｍＲＮＡ種の５’非翻訳領域に結合して、ｔＴＡ及び自身の翻訳を同時に阻害する。追加のＬ７Ａｅ結合ヘアピンを付加することで、より強力な比例フィードバックが実現する。図２５ｂは、ＰＩコントローラーが適応特性を崩さないことを実証するデータを示す。ネットワーク摂動をコトランスフェクトすることにより、かつＡＳＶを０．０３３μｍ添加することにより、ＰＩ回路及びＰ回路を摂動した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクション後４８時間にフローサイトメトリーを用いて測定し、データはｎ＝３の複製について、非摂動（ＡＳＶなし）の条件に正規化した条件ごとの平均値±ｓ．ｅとして示す。明らかに、積分フィードバックを持たないコントローラーは、適応基準を満たすことができない。しかし、ＰＩコントローラーは適応を確実にする。
図２６は、閉ループ及び開ループの積分制御を記載する数理モデルと、それに対応するフィッティング結果を示す。図２６ａは、縮小モデルの模式的かつ数学的な記述である。センスｍＲＮＡであるＺ１は、総（遊離型及び結合型）プラスミド濃度Ｄ１
Ｔ及び共有型転写リソースＰ（例えば、ポリメラーゼ）に依存する速度μで構成的に産生される。次に、Ｚ１は、Ｚ１の濃度、翻訳リソースＲ（例えば、リボソーム）、及びインヒビターとして働く全薬物濃度ＧＴに依存する速度ｋで、緑色蛍光タンパク質のＸ２に翻訳される。このタンパク質Ｘ２は二量体化し、アンチセンスＲＮＡであるＺ２の転写を活性化する転写因子として機能する。θで示される転写速度（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒａｔｅ）は、Ｘ２、Ｐ、及び総プラスミド濃度Ｄ２
Ｔの関数である。アンチセンスＲＮＡはＺ２及びＲに依存する速度νで赤色蛍光タンパク質Ｙに翻訳される。このループを閉じるために、Ｚ１とＺ２とが、速度ηで互いに隔離する。η＝０と設定することで、開ループの設定が得られる。共有リソースにより、転写／翻訳の負荷が課される。負荷は、ＰとＲとを定数にするか、又はこれらを表に示すように他の種に依存するようにするかのいずれかにより、このモデルにおいて除外又は包含することができる。図２６ｂは、実験データに対するモデルのフィッティングを示す。翻訳の負荷のみを考慮したモデルのパラメータ（Ｐ＝ＰＴ）は、緑色及び赤色の蛍光測定値を用いて最適にフィッティングされる。負荷のないシナリオではデータを適切にフィッティングさせることができず、完全な負荷のあるシナリオではモデルのフィッティング精度が大幅に向上しないことが示されている。このフィッティングしたモデルは、開／閉ループ設定、外乱の有／無、広い範囲のプラスミド比率
についてのデータと良好な一致を示す。このことは、数学的に、このシステムが翻訳の負荷のみを示すことを示唆している。
図２７は、数理モデルで使用する生化学種の一覧を示す。
図２８は、本発明によるコントローラーを記載する数理モデルで使用される詳細な生化学的反応ネットワークを示す。
図２９は、正のゲインプロセス（左、Ｎ型コントローラー）及び負のゲインプロセス（右、Ｐ型コントローラー）についての本発明による追加のフィードバック制御を有する相反モチーフに基づく分子ＰＩコントローラーを記載する数理モデルを模式的に表した図を示す。Ｘ１はアクチュエーター分子を示し、ＸＬは出力分子を示し、Ｚ１は第１のコントローラー分子（左図）又は第１のアンチコントローラー分子（右図）を示し、Ｚ２は第１のアンチコントローラー分子（左図）又は第１のコントローラー分子（右図）を示す。μはＺ１の形成速度（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）であり、ηは、Ｚ１とＺ２との複合体の形成／消滅の速度である。
図３０は、正のゲインプロセス（左、Ｎ型コントローラー）及び負のゲインプロセス（右、Ｐ型コントローラー）についての本発明による分子ＰＤコントローラーを記載する数理モデルを模式的に表した図を示す。Ｘ１はアクチュエーター分子を示し、ＸＬは出力分子を示し、Ｚは第１のコントローラー分子を示す。μはＺの形成速度であり、γＺはＺの分解速度である。
図３１は、正のゲインプロセス（左、Ｎ型コントローラー）及び負のゲインプロセス（右、Ｐ型コントローラー）についての本発明による追加のフィードバック制御を有する相反モチーフに基づく分子二次ＰＩＤコントローラーを記載する数理モデルを模式的に表した図を示す。Ｘ１はアクチュエーター分子を示し、ＸＬは出力分子を示し、Ｚ１は第１のコントローラー分子を示し、Ｚ２は第１のアンチコントローラー分子を示す。ηは、Ｚ１とＺ２との複合体の形成／消滅の速度を示す。
図３２は、正のゲインプロセス（左、Ｎ型コントローラー）及び負のゲインプロセス（右、Ｐ型コントローラー）についての本発明による追加のフィードバック制御を有する相反モチーフに基づく分子三次ＰＩＤコントローラーを記載する数理モデルを模式的に表した図を示す。Ｘ１はアクチュエーター分子を示し、ＸＬは出力分子を示し、Ｚ１は第１のコントローラー分子を示し、Ｚ２は第１のアンチコントローラー分子を示し、Ｚ３は第２のコントローラー分子を示す。ηは、Ｚ１とＺ２との複合体の形成／消滅の速度を示す。
図３２は、正のゲインプロセス（左、Ｎ型コントローラー）及び負のゲインプロセス（右、Ｐ型コントローラー）についての本発明による追加のフィードバック制御を有する２つの相反モチーフに基づく分子四次ＰＩＤコントローラーを記載する数理モデルを模式的に表した図を示す。Ｘ１はアクチュエーター分子を示し、ＸＬは出力分子を示し、Ｚ１は第１のコントローラー分子を示し、Ｚ２は第１のアンチコントローラー分子を示し、Ｚ３は第２のコントローラー分子を示し、Ｚ４は第２のアンチコントローラー分子を示す。ηは、Ｚ１とＺ２との複合体の形成／消滅の速度を示す。
図３４は、本発明による分子Ｎ型流出ＰＩＤコントローラーの一例を示す。図１及び図２、並びに上述（構築物及び分岐１～４）に示すように、ＲＮＡベースの相反モチーフ及び負のフィードバック機構が実装される。さらに、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）ｍＲＮＡ ｚ４をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で細胞内で発現する。ＲＢＰ ｍＲＮＡ ｚ４は、ＲＮＡ結合タンパク質ＲＢＰに翻訳され、これはエンドリボヌクレアーゼＥＲＮに連結したアクチベーターＡｃｔをコードするｍＲＮＡ ｚ３（Ａｃｔ－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ ｍＲＮＡ）の翻訳を抑制する。ｍＲＮＡ ｚ３は、組換え遺伝子（構成的プロモーターを持つ構築物「６」）によって転写され、エンドリボヌクレアーゼＥＲＮによって分解される。
図３５は、本発明による分子Ｎ型流入ＰＩＤコントローラーの一例を示す。図１及び図２、並びに上述（構築物及び分岐１～４）に示すように、ＲＮＡベースの相反モチーフ及び負のフィードバック機構が実装される。さらに、アクチベーター２ ｍＲＮＡ ｚ４をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）は、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で細胞内で発現する。アクチベーター２ ｍＲＮＡ ｚ４はアクチベータータンパク質Ａｃ２に翻訳され、これは別の組換え遺伝子（Ａｃｔ２センシングプロモーターを有する構築物「７」）にてコードされるアクチベーター２ ｍＲＮＡ ｚ３のさらなるコピーの転写を正に調節する。さらに、Ａｃｔ２は、アクチュエーター分子ｍＲＮＡ Ｘ１のさらなるコピーをコードする組換え遺伝子（Ａｃｔ２センシングプロモーターを有する構築物「６」）の転写を活性化する。
図３６は、本発明による分子Ｎ型自己触媒ＰＩＤコントローラーの一例を示す。図１及び図２、並びに上述（構築物及び分岐１～４）に示すように、ＲＮＡベースの相反モチーフ及び負のフィードバック機構が実装される。さらに、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）ｍＲＮＡ ｚ４をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で細胞内で発現する。ＲＢＰ ｍＲＮＡ ｚ４はＲＮＡ結合タンパク質ＲＢＰに翻訳され、アクチベーターＡｃｔ１がエンドリボヌクレアーゼＥＲＮ、内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）、及びさらなるアクチベーターＡｃｔ２に連結したものをコードするｍＲＮＡ ｚ３（Ａｃｔ１－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ－ＩＲＥＳ－Ａｃｔ２ ｍＲＮＡ）の翻訳を抑制する。ｍＲＮＡ ｚ３の転写は、組換え遺伝子（Ａｃｔ２センシングプロモーターを持つ構築物「６」）を介してアクチベーターＡｃｔ２により正に調節され、エンドリボヌクレアーゼＥＲＮにより分解される。さらに、Ａｃｔ１は、アクチュエーターｍＲＮＡ Ｘ１のさらなるコピーをコードする組換え遺伝子（アクチベーターセンシングプロモーターを有する構築物「３」）の転写を活性化する。
図３７は、図６及び図７に示したすべての構成要素（構築物１～４）を含む本発明による分子Ｐ型流出ＰＩＤコントローラーの一例を示す。さらに、アクチベーターＡｃｔがエンドリボヌクレアーゼＥＲＮに連結したものをコードするｍＲＮＡ ｚ４（Ａｃｔ－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ ｍＲＮＡ）をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で細胞内で発現する。さらに、さらなる組換え遺伝子（構成的プロモーターを有する構築物「６」）は、ｚ３で示されるアクチベーターＡｃｔがエンドリボヌクレアーゼＥＲＮと連結したものをコードするｍＲＮＡ（Ａｃｔ－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ ｍＲＮＡ）のさらなるコピーを転写し、これがアクチベータータンパク質Ａｃｔ及びｚ３を分解するエンドリボヌクレアーゼＥＲＮに翻訳される。
図３８は、図６及び図７に示したすべての構成要素（構築物１～４）を含む本発明による分子Ｐ型流入ＰＩＤコントローラーの一例を示す。さらに、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）ｍＲＮＡ ｚ４をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で細胞内で発現する。ＲＢＰ ｍＲＮＡ ｚ４は、ＲＮＡ結合タンパク質ＲＢＰに翻訳され、これがアクチベーターＡｃｔ２をコードするｍＲＮＡ ｚ３の翻訳を抑制する。ｍＲＮＡ ｚ３は、アクチベータータンパク質Ａｃｔ２によって正に調節される組換え遺伝子（アクチベーター２センシングプロモーターを持つ構築物「７」）により転写される。さらに、ｍ２ ｍＲＮＡをコードする組換え遺伝子（アクチベーター２センシングプロモーターを有する構築物「６」）は、アクチベータータンパク質Ａｃｔ２によって正に調節される。
図３９は、図６及び図７に示したすべての構成要素（構築物１～４）を含む本発明による分子Ｐ型自己触媒ＰＩＤコントローラーの一例を示す。さらに、エンドリボヌクレアーゼＥＲＮに連結したアクチベーターＡｃｔ１をコードするｍＲＮＡ ｚ４（Ａｃｔ１－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ ｍＲＮＡ）をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で細胞内で発現する。さらに、組換え遺伝子（アクチベーター２センシングプロモーターを有する構築物「６」）は、ｚ３で示されるアクチベーターＡｃｔ１がエンドリボヌクレアーゼＥＲＮに連結され、さらなるアクチベーターＡｃｔ２に連結されたものをコードするｍＲＮＡ（Ａｃｔ１－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ－Ｐ２Ａ－Ａｃｔ２ ｍＲＮＡ）を転写し、これはｚ３を分解するエンドリボヌクレアーゼＥＲＮ、及びｚ３の発現を正に調節するアクチベータータンパク質Ａｃｔ２に翻訳される。
図４０は、本発明による分子Ｎ型流出ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す。図１１及び図１２、並びに上述（構築物及び分岐１～４）に示すように、タンパク質ベースの相反モチーフ及び負のフィードバック機構が実装される。さらに、アクチベーターＡｃｔ２をエンドリボヌクレアーゼＥＲＮに連結したものをコードするｍＲＮＡ ｚ４（Ａｃｔ２－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ ｍＲＮＡ）をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、構成的に細胞内で発現する。ＲＮＡ結合タンパク質ＲＢＰによって阻害されるｚ４の翻訳により、アクチベータータンパク質Ａｃｔ２と、ｚ４を分解するエンドリボヌクレアーゼＥＲＮとが得られる。
図４１は、本発明による分子Ｎ型流入ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す。図１１及び図１２、並びに上述（構築物及び分岐１～４）に示すように、タンパク質ベースの相反モチーフ及び負のフィードバック機構を実装する。さらに、アクチベーターＡｃｔ２をコードするｍＲＮＡ ｚ５をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、出力センシングプロモーター下で細胞内で発現する。さらなる組換え遺伝子（アクチベーター２センシングプロモーターを持つ構築物「６」）は、アクチベータータンパク質Ａｃｔ２によって正に調節されて、ｍＲＮＡ ｚ４を転写する。ｚ４とｚ５との両方は、アクチベータータンパク質Ａｃｔ２へ翻訳される。
図４２は、本発明による分子Ｎ型自己触媒ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す。図１１及び図１２、並びに上述（構築物及び分岐１～４）に示すように、タンパク質ベースの相反モチーフ及び負のフィードバック機構を実装する。さらに、アクチベーターＡｃｔ２がエンドリボヌクレアーゼＥＲＮ、内部リボソーム侵入部位ＩＲＥＳ、及びアクチベーターＡｃｔ３に連結したものをコードするｍＲＮＡ ｚ４（Ａｃｔ２－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ－ＩＲＥＳ－Ａｃｔ３ ｍＲＮＡ）をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、Ａｃｔ３センシングタンパク質により駆動するアクチベータータンパク質Ａｃｔ３の正の調節下で細胞内で発現する。ｚ４の翻訳は、ＲＮＡ結合タンパク質ＲＢＰによって阻害されるが、この翻訳により、アクチュエーター分子ｍＲＮＡ ｍ１の発現を正に調節するアクチュエーター分子タンパク質Ａｃｔ２、ｚ４を分解するエンドリボヌクレアーゼＥＲＮ、及びアクチュエーター分子タンパク質Ａｃｔ３が得られる。
図４３は、図６及び図７に示したすべての構成要素（構成要素１～４）を含む本発明による分子Ｐ型流出ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す図である。さらに、エンドリボヌクレアーゼＥＲＮに連結したアクチベーターＡｃｔ２をコードするｍＲＮＡ ｚ４（Ａｃｔ２－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ ｍＲＮＡ）をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、出力センシングプロモーター下で細胞内で発現する。さらなる組換え遺伝子（構成的プロモーターを有する構築物「６」）は、エンドリボヌクレアーゼＥＲＮに連結したアクチベーターＡｃｔ２をコードするｍＲＮＡ ｚ３（Ａｃｔ２－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ ｍＲＮＡ）のさらなるコピーを発現する。ｚ３及びｚ４の両方は、ｍＲＮＡ ｍ１の発現を正に調節するアクチベータータンパク質Ａｃｔ２、ｍＲＮＡ ｚ３を分解するエンドリボヌクレアーゼＥＲＮへ翻訳される。
図４４は、図６及び図７に示したすべての構成要素（構築物１～４）を含む本発明による分子Ｐ型流入ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す。さらに、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）ｍＲＮＡ ｚ４をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、出力分子ＸＬによって正に調節されるプロモーター下で細胞内で発現する。ＲＢＰ ｍＲＮＡ ｚ４は、アクチベータータンパク質Ａｃｔ２の翻訳を抑制するＲＮＡ結合タンパク質ＲＢＰへ翻訳される。ｍＲＮＡ ｚ３は、アクチベータータンパク質Ａｃｔ２によって正に調節される組換え遺伝子（アクチベーター２センシングプロモーターを持つ構築物「６」）により転写される。さらに、ｍ１ ｍＲＮＡをコードする組換え遺伝子（Ａｃｔ１／Ａｃｔ２センシングプロモーターを持つ構築物「３」）は、アクチベータータンパク質Ａｃｔ２（及びＡｃｔ１）により正に調節される。
図４５は、図６及び図７に示したすべての構成要素（構築物１～４）を含む本発明による分子Ｐ型自己触媒ＰＩＤコントローラーのさらなる例を示す。さらに、エンドリボヌクレアーゼＥＲＮに連結したアクチベーターＡｃｔ２をコードするｍＲＮＡ ｚ４（Ａｃｔ２－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ ｍＲＮＡ）をコードする組換え遺伝子（構築物「５」）が、出力センシングプロモーター下で細胞内で発現する。さらなる組換え遺伝子（アクチベーター３センシングプロモーターを有する構築物「６」）は、アクチベーターＡｃｔ２がエンドリボヌクレアーゼＥＲＮに連結し、さらなるアクチベーターＡｃｔ３に連結したものをコードするｍＲＮＡ ｚ３（Ａｃｔ２－Ｐ２Ａ－ＥＲＮ－Ｐ２Ａ－Ａｃｔ３ ｍＲＮＡ）を発現する。ｚ３及びｚ４の両方は、ｍＲＮＡ ｍ１の発現を正に調節するアクチベータータンパク質Ａｃｔ２、ｍＲＮＡ ｚ３を分解するエンドリボヌクレアーゼＥＲＮへ翻訳される。さらにｚ３はまた、それ自身の発現を正に調節する、さらなるアクチベータータンパク質Ａｃｔ３にも翻訳される。
図４９は、相反モチーフを含む８種類の異なる有効な相互作用のプロファイルを示す。制御理論では、制御対象となるプロセスの構造を変えることはできないと仮定される。したがって、ある与えられたプロセスを制御可能にするためには、制御システムは、その利用可能な入力と出力とを介して相互作用する必要がある。生体分子システムでは、特にある分子がもう１つの分子に変化するか、もう１つの分子の産生を増やすか、又はもう１つの分子の除去を低減する場合、相互作用は正であり得る。特に、ある分子の存在によりもう１つの分子の除去が増大するか、又はもう１つの分子の産生が低減する場合、相互作用は負であり得る。
図４９は、問題となっている３つの直接又は間接的な相互作用の例を示す。アクチュエーターがどのように出力分子に影響を与え得るか、出力分子がどのようにコントローラーネットワークに作用し得るか、及びコントローラーネットワークがどのようにアクチュエーター分子に作用し得るかを説明する。制御対象のプロセス、及び相反コアモチーフの利用可能な実装に基づき、与えられた構成に最も適したプロファイルを、すべての一連の組み合わせから選択することができる。
コントローラーネットワークは、第１のコントローラー分子（Ｚ１）と第１のアンチコントローラーネットワーク（Ｚ２）とを含む。制御されたネットワークは、出力分子（Ｏ）及びアクチュエーター分子（Ａ）を介して、コントローラーネットワークと相互作用することができる。図４９では、正常の矢印は正の相互作用を示し、平頭矢印は負の相互作用を示す。
図４９ ｉ）：アクチュエーター分子（Ａ）に対する第１のコントローラー分子（Ｚ１）の正の効果。
図４９ ｉｉ）：アクチュエーター分子（Ａ）に対する第１のコントローラー分子（Ｚ１）の負の効果。
図４９ ｉ ａ）、ｉｉ ａ）：出力分子（Ｏ）に対するアクチュエーター分子（Ａ）の正の効果。
図４９ ｉ ｂ）、ｉｉ ｂ）：出力分子（Ｏ）に対するアクチュエーター分子（Ａ）の負の効果。
図４９、左列：第１のコントローラー分子（Ｚ１）（ｉｂ、ｉｉａ）又は第１のアンチコントローラーネットワーク（Ｚ２）（ｉａ、ｉｉｂ）に対する出力分子（Ｏ）の正の効果。
図４９、右列：第１のコントローラー分子（Ｚ１）（ｉａ、ｉｉｂ）又は第１のアンチコントローラーネットワーク（Ｚ２）（ｉｂ、ｉｉａ）に対する出力分子（Ｏ）の負の効果。
図５０は、正のゲインプロセスについての負の作動を有する相反積分フィードバックモチーフを記載する数理モデルを模式的に表す。Ｚ１及びＺ２（それぞれ第１のコントローラー分子、第１のアンチコントローラー分子）と表示されたノードは共に、相反モチーフを形成する。種Ｚ２は速度μで生成され、かつ速度ηで種Ｚ１と相互作用する際に機能的に消滅する。さらに、種Ｚ１は、速度（α／（ｚ１＋κ））で種Ｘ１（アクチュエータ分子）の生成を抑制することにより、制御されたネットワークと相互作用できる。フィードバックループを閉じるために、図示の例では、θと出力種ＸＬ（出力分子）とに比例する反応速度で種Ｚ１を生成する。
図５１は、リプレッサーセンスｍＲＮＡ ｚ１（第１のコントローラー分子）とアンチセンスＲＮＡ ｚ２（第１のアンチコントローラー分子）とによって形成される相反積分フィードバックモチーフに基づく本発明による分子Ｎ型積分コントローラーの一例を示す。図５１の右側の雲は、アクチュエーター及び出力を含む生体細胞内の調節されたネットワークを表しており、該アクチュエーターが該出力を特に間接的に、すなわちネットワークの複数のさらなる分子によって、調節する（正のゲインプロセス）。この例では、リプレッサーセンスｍＲＮＡ ｚ１は、出力分子によって正に調節されるプロモーター下で細胞内で発現する第１の組換え遺伝子（構築物及び分岐は１と表示）の産物である。記載の例では、リプレッサーセンスｍＲＮＡ ｚ１は翻訳され、アクチュエーターｍＲＮＡ（アクチュエータ分子）をコードする組換え遺伝子（構築物及び分岐は３と表示）の負の転写調節因子（レギュレーター）であるリプレッサータンパク質Ｒｅｐが得られ、すなわち、該アクチュエーターをコードする遺伝子は、リプレッサーセンシングプロモーターを有する。この例では、アンチセンスＲＮＡ ｚ２をコードする第２の遺伝子（構築物及び分岐は２と表示）が、構成的プロモーター下で細胞内で組換え発現する。アンチセンスＲＮＡは、リプレッサーのセンスＲＮＡ ｚ１と相補的な配列を持つため、ｚ１とハイブリダイズして、その結果、不活性な複合体ｚ１－ｚ２となり、ｚ１の翻訳をブロックし、ｚ１及びｚ２の分解を導く（相反モチーフ）。
図５２は、本発明による分子Ｎ型積分コントローラーの一例を示す。図５１に示したコントローラーとは対照的に、相反モチーフはタンパク質間の相互作用によって実装される。図５２の右側の雲によって表されるセルラーネットワークでは、アクチュエーター分子が出力分子を正に調節し、換言すれば、正のゲインプロセスが制御されている。この例では、出力分子によって正に調節されるプロモーターから、リプレッサーｍＲＮＡ ｚ１が細胞内で組換え発現する（構築物１を参照）。ｍＲＮＡ ｚ１が翻訳され、リプレッサータンパク質Ｚ１（第１のコントローラー分子、Ｚ１（Ｒｅｐ）とも呼ばれる）が得られる。アクチュエーター分子を正に調節するアクチュエーターｍＲＮＡ ｍ１が、リプレッサータンパク質Ｚ１によって負に調節されるプロモーターから組換え発現する（構築物３を参照）。さらに、アンチリプレッサーｍＲＮＡ ｚ２が、構成的プロモーターの制御下で組換え発現する（構築物２を参照）。アンチリプレッサーｍＲＮＡ ｚ２は、アンチリプレッサータンパク質Ｚ２（第１のアンチコントローラー分子）へ翻訳され、これはリプレッサータンパク質Ｚ１と特異的に相互作用してＺ１を隔離及び不活性化し、その結果、Ｚ１によるｍ１の転写抑制を減少又は消失させる。タンパク質Ｚ１及びＺ２は、タンパク質をベースとした相反モチーフを実装し、ネットワークの積分制御をもたらす。
図５３は、例示的な実験のデータを示す。この例では、図（ａ）の「サイバーループ」設定で記載される実験的な光遺伝学環境におけるＰＩＤコントローラーの有効性を実証する。この制御対象の例示的ネットワークは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において遺伝子操作される。コントローラーネットワークは、生体分子Ｉ、ＰＩ及び／又は四次ＰＩＤコントローラーの確率的ダイナミクスをシミュレートするコンピュータに実装される。制御されたネットワークは、顕微鏡下で蛍光タンパク質を介して測定できる新生ＲＮＡの生成を開始するために、光遺伝学的誘導（青色光）を介して作動する遺伝子発現回路を備える。この例では、これらの単一細胞の測定はリアルタイムで行われ、各細胞のコントローラーの確率的ダイナミクスをシミュレートするコンピュータに送られる。３つのコントローラーのそれぞれの実験結果を図（ｂ）に示す。上のプロットは、Ｉ コントローラー（１６８細胞にわたる）、ＰＩコントローラー（１２８細胞にわたる）、及び四次ＰＩＤコントローラー（１３１細胞にわたる）での平均時間応答を示す。このプロットは、細胞間の平均応答の振動を低減するＰＩコントローラーの有効性を示している。これはまた、オーバーシュートの削減においてもＰＩＤコントローラーのさらなる利点を実証している。下のプロットは、様々な応答のパワースペクトル密度（Ｐｏｗｅｒ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ：ＰＳＤ）を示す。ＰＳＤは単一細胞レベルの確率的振動（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）を明らかにするのに有効である：ＰＳＤの鋭いピークにより、確率的な単一細胞の振動が持続していることがわかる。この例では、ＰＩＤコントローラーがピークを平滑化し、単一細胞の振動を大幅に低減する効果を示している。
実施例１：哺乳類細胞における相反比例積分フィードバック制御
ここでは、哺乳類細胞における相反積分フィードバック回路のセンス／アンチセンスｍＲＮＡの実装において完全な適応が実証され、コントローラーが調節しているシステムに依存しない（ａｇｎｏｓｔｉｃ）ことを示している。
ここでは、哺乳類細胞における相反積分フィードバック回路のセンス／アンチセンスｍＲＮＡの実装において完全な適応が実証され、コントローラーが調節しているシステムに依存しない（ａｇｎｏｓｔｉｃ）ことを示している。
材料及び方法
プラスミド構築
トランスフェクション用のプラスミドは、モジュラークローニング（ＭｏＣｌｏ）酵母ツールキットスタンダードの哺乳類適応を用いて構築した（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅ Ｌｅｅ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃ ＤｅＬｏａｃｈｅ，Ｂｅｒｎａｒｄｏ Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ，及びＪｏｈｎ Ｅ Ｄｕｅｂｅｒ．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｙｅｓｔ ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｒ，ｍｕｌｔｉｐａｒｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ．ＡＣＳ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ，４（９）：９７５－９８６，２０１５）。ツールキット用のカスタムパーツは、ＰＣＲ増幅（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により生成し、ゴールデンゲートアセンブリを介してツールキットベクター内に組み立てた（Ｃａｒｏｌａ Ｅｎｇｌｅｒ，Ｒｏｍｙ Ｋａｎｄｚｉａ，及びＳｙｌｖｅｓｔｒｅ Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ．Ａ ｏｎｅ ｐｏｔ，ｏｎｅ ｓｔｅｐ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，３（１１），２００８）。ＭｏＣｌｏ手順の適用に使用したすべての酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から入手した。
プラスミド構築
トランスフェクション用のプラスミドは、モジュラークローニング（ＭｏＣｌｏ）酵母ツールキットスタンダードの哺乳類適応を用いて構築した（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅ Ｌｅｅ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃ ＤｅＬｏａｃｈｅ，Ｂｅｒｎａｒｄｏ Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ，及びＪｏｈｎ Ｅ Ｄｕｅｂｅｒ．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｙｅｓｔ ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｒ，ｍｕｌｔｉｐａｒｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ．ＡＣＳ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ，４（９）：９７５－９８６，２０１５）。ツールキット用のカスタムパーツは、ＰＣＲ増幅（Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により生成し、ゴールデンゲートアセンブリを介してツールキットベクター内に組み立てた（Ｃａｒｏｌａ Ｅｎｇｌｅｒ，Ｒｏｍｙ Ｋａｎｄｚｉａ，及びＳｙｌｖｅｓｔｒｅ Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ．Ａ ｏｎｅ ｐｏｔ，ｏｎｅ ｓｔｅｐ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，３（１１），２００８）。ＭｏＣｌｏ手順の適用に使用したすべての酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から入手した。
細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、株番号ＣＲＬ－３２１６）を、１０ ％ ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）及び１ｍｍピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞は３７℃、５％ ＣＯ２で維持した。２～３日ごとに細胞を新しいＴ２５フラスコに継代した。必要に応じて、トランスフェクション用に余剰細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬで１ｅ４細胞でプレーティングした。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、株番号ＣＲＬ－３２１６）を、１０ ％ ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）及び１ｍｍピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞は３７℃、５％ ＣＯ２で維持した。２～３日ごとに細胞を新しいＴ２５フラスコに継代した。必要に応じて、トランスフェクション用に余剰細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬで１ｅ４細胞でプレーティングした。
トランスフェクション
トランスフェクション実験に使用した細胞は、トランスフェクション溶液で処理する前約２４時間にプレーティングした。トランスフェクション溶液は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）「ＭＡＸ」（ＭＷ ４００００；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、１：３（μｇ ＤＮＡ：μｇ ＰＥＩ）の比率で、ウェルあたり合計１００ｎｇのプラスミドＤＮＡで調製した。この溶液をＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）中で調製し、細胞への添加前に約２５分間インキュベートした。
トランスフェクション実験に使用した細胞は、トランスフェクション溶液で処理する前約２４時間にプレーティングした。トランスフェクション溶液は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）「ＭＡＸ」（ＭＷ ４００００；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、１：３（μｇ ＤＮＡ：μｇ ＰＥＩ）の比率で、ウェルあたり合計１００ｎｇのプラスミドＤＮＡで調製した。この溶液をＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）中で調製し、細胞への添加前に約２５分間インキュベートした。
フローサイトメトリー
トランスフェクション後約４８時間に、細胞を６０μＬのアキュターゼ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で回収した。蛍光は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓフローサイトメーターにて、４８８ｎｍのレーザーと５２５／４０＋ＯＤ１バンドパスフィルターとを使用して測定した。各サンプルについて、全細胞懸濁液を採取した。各測定において、ゲーティング及び補正のために、追加の未染色かつ単色（ｍＣｉｔｒｉｎｅのみ）対照を収集した。
トランスフェクション後約４８時間に、細胞を６０μＬのアキュターゼ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で回収した。蛍光は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓフローサイトメーターにて、４８８ｎｍのレーザーと５２５／４０＋ＯＤ１バンドパスフィルターとを使用して測定した。各サンプルについて、全細胞懸濁液を採取した。各測定において、ゲーティング及び補正のために、追加の未染色かつ単色（ｍＣｉｔｒｉｎｅのみ）対照を収集した。
データ分析
取得したデータは、プログラミング言語Ｒで実装されたカスタム解析パイプラインを使用して解析した。測定されたイベントを自動的にゲーティングし、かつさらなるプロット及び解析のために補正した。
取得したデータは、プログラミング言語Ｒで実装されたカスタム解析パイプラインを使用して解析した。測定されたイベントを自動的にゲーティングし、かつさらなるプロット及び解析のために補正した。
結果
相反積分フィードバック回路のセンス／アンチセンスＲＮＡの実装の模式的な図を図２３Ａに示す。基本回路は、別々のプラスミドにコードされた２つの遺伝子からなる。「アクチベータープラスミド」の遺伝子は、緑色蛍光タンパク質ｍＣｉｔｒｉｎｅと融合した合成転写因子ｔＴＡ（テトラサイクリントランスアクチベーター）である。この遺伝子の発現は、強力な哺乳類ＥＦ－１αプロモーターによって駆動される。この転写因子は、「アンチセンスプラスミド」における他方の遺伝子の発現を駆動する。この遺伝子は、アクチベーターｍＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡを発現する。この２つの種がハイブリダイズすることで消滅反応が実現し、フィードバックループが閉じられる。積分フィードバックの生成が不可能な制御として、ｔＴＡ応答性のＴＲＥプロモーターを非応答性のプロモーターにより置き換えて閉ループ回路の開ループ類似回路を作成した。アクチベーターｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅの発現レベルを調節するように閉ループ構成を設定する。アクチベーターに特異的な摂動を導入するために、アスナプレビル（ＡＳＶ）誘導性分解タグ（ＳＭＡＳｈ）をｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅにさらに融合した。
相反積分フィードバック回路のセンス／アンチセンスＲＮＡの実装の模式的な図を図２３Ａに示す。基本回路は、別々のプラスミドにコードされた２つの遺伝子からなる。「アクチベータープラスミド」の遺伝子は、緑色蛍光タンパク質ｍＣｉｔｒｉｎｅと融合した合成転写因子ｔＴＡ（テトラサイクリントランスアクチベーター）である。この遺伝子の発現は、強力な哺乳類ＥＦ－１αプロモーターによって駆動される。この転写因子は、「アンチセンスプラスミド」における他方の遺伝子の発現を駆動する。この遺伝子は、アクチベーターｍＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡを発現する。この２つの種がハイブリダイズすることで消滅反応が実現し、フィードバックループが閉じられる。積分フィードバックの生成が不可能な制御として、ｔＴＡ応答性のＴＲＥプロモーターを非応答性のプロモーターにより置き換えて閉ループ回路の開ループ類似回路を作成した。アクチベーターｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅの発現レベルを調節するように閉ループ構成を設定する。アクチベーターに特異的な摂動を導入するために、アスナプレビル（ＡＳＶ）誘導性分解タグ（ＳＭＡＳｈ）をｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅにさらに融合した。
本発明者らの回路の遺伝的実装が積分フィードバックを実行することを示すために、開ループ回路又は閉ループ回路のいずれかで一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、０．０３３μｍの濃度のＡＳＶで一定の摂動を適用した。さらに、２つの遺伝子を１／１６～１／２までの範囲の比率でトランスフェクトすることにより設定値を変化させた。トランスフェクション後４８時間にフローサイトメトリーを使用して細胞の蛍光を測定した。設定値の比率が高くなるにつれ、ｔＴＡｍＣｉｔｒｉｎｅの蛍光も増加し、これはこの回路が設定値制御を可能にしていることを示唆している（図２３Ｂ）。正規化された蛍光強度が非混乱対照の０．１以内に留まっている場合に、回路は適応しているとみなした。この基準の下では、閉ループ構成で試験されたすべての設定値について適応が達成されるが、開ループ構成のいずれもが適応基準を満たすことができなかった（図２３Ｃ）。
次に、相反積分コントローラーの実装により、調節するネットワークのトポロジーに関係なく、異なる設定値での外乱拒絶をもたらすことを実証することを目指した。そのため、ｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅから自身の産生への負のフィードバックループを付加した。この負のフィードバックは、ｔＴＡ応答性ＴＲＥプロモーターの制御下で発現し、かつセンスｍＲＮＡの５’非翻訳領域に結合して翻訳を阻害する、ＲＮＡ結合タンパク質Ｌ７Ａｅにより実現した（図２４Ａ）。
閉ループ回路及び開ループ回路を、この負のフィードバックプラスミドの有無にかかわらず一時的にトランスフェクトして、調整されたネットワークに摂動を導入した。前回同様、設定値１／２及び１を、アクチベーターとアンチセンスのプラスミドを適切な比率でトランスフェクションすることにより試験した。これらの異なる条件を、０．０３３μｍのＡＳＶを添加してｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅの分解を誘導することにより、さらに分子レベルで摂動させた。図２４Ｂに示すように、閉ループ回路はほとんどの場合、両方の摂動を拒絶するが、一方で、この場合も開ループ回路は適応することができない。しかしながら、両方の摂動での設定値１／２の閉ループ回路もまた適応要件を満たすことができない。それにもかかわらず、これは同じ条件の開ループ回路としての所望の値にはるかに近い値になお留まっている。
図２４で以前に示したように、トポロジー的ネットワークの摂動を拒否する相反積分コントローラーの能力により、コントローラーの性能を複雑さを増すことでさらに向上させることができた。特に、様々な工学分野に広く適用され、比例積分（ＰＩ）制御と呼ばれる共通の制御戦略を実装した。本制御戦略は、積分（Ｉｎｔｅｇｒａｌ）（Ｉ）コントローラーに比例（Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ）（Ｐ）フィードバック動作を付加することで、適応特性を維持しつつ、過渡的ダイナミクス及び分散低減などの総合性能を向上させる。積分フィードバックよりも高速に作用する比例フィードバック制御を実装するために、代理（ｐｒｏｘｙ）タンパク質、すなわち、ＲＮＡ結合タンパク質Ｌ７Ａｅ（これはＰ２Ａ自己切断ペプチドの使用を介した単一ｍＲＮＡからｍＣｉｔｒｉｎｅ－ｔＴＡと並行して産生される）を使用した（図２５Ａ）。したがって、Ｌ７Ａｅの発現レベルは、ｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅの発現レベルに比例的に反映すると予想される。そこで、センスｍＲＮＡの５’非翻訳領域に結合することにより翻訳を阻害する代理タンパク質を介して、負のフィードバックを実現する。図２４Ａの回路とは対照的に、ＰＩコントローラーにおけるＬ７Ａｅの産生は、ｔＴＡ応答性ＴＲＥプロモーターによっては調節されないことに注意されたい。実に、これはセンスｍＲＮＡによって直接制御される。さらに、ＰＩコントローラーで実現される比例フィードバックは、追加の転写及び翻訳の工程を必要としないため、Ｌ７ＡｅのｔＴＡ依存性産生により実装されるフィードバックよりも速く作用することが期待される（図２４）。
図２５Ｂに示すとおり、積分フィードバックを有さないコントローラーは、適応基準を満たすことができない。一方、比例積分（ＰＩ）コントローラーを使用すると、図２５に示すように、ｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅの発現は、誘導された薬物外乱に対してロバストになることを保証する。これは、追加の比例フィードバックが、実際に、相反積分コントローラーの適応特性を壊さないことを示している。
図２３Ａに示される基本回路の数理的動作をよりよく理解するために、質量作用の力学の基本原理から開始して詳細な機械的モデルを導出した。大文字は、対応する太字で表される種の濃度を示すために使用する。
図２７及び図２８で実施した詳細なモデルでは、２つのプラスミド（Ｄ１及びＤ２と表記）の転写、及びセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡ（それぞれＺ１とＺ２と表記）の翻訳を捉えている。センスｍＲＮＡの翻訳により、ｔＴＡ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、及びＳＭＡＳｈタグがすべて共に融合したものから構成されるタンパク質（Ｘ１と表記）が得られる。ＳＭＡＳｈタグが薬剤（Ｇと表記）を呼び込み、次いでその薬剤が複合体Ｘ１を分解する。薬剤から逃れたタンパク質はＳＭＡＳｈタグを放出し、それによりｔＴＡとｍＣｉｔｒｉｎｅとが共に融合したままになる（Ｘ２と表記）。この後者が二量体化する場合に、これはアンチセンスＲＮＡの産生を活性化する転写因子として働く。該モデルはまた、異なる転写／翻訳のプロセス間で共有されるリソースの関与も捉えている。転写リソース（例えば、ポリメラーゼ）はＰで示され、翻訳リソース（例えば、リボソーム）はＲで示される。ここでは、図２３Ａの回路と比較して、アンチセンスＲＮＡがｍＲｕｂｙ３を含有するタンパク質（Ｙと表記）に翻訳される追加の翻訳行程が付加されることに留意されたい。これは、システムをより適切に数学的に特徴付けるために追加の一連の測定値（赤色蛍光）を取得することを可能にする。
より単純な数理モデルを得るために、この完全に詳細なモデルは、３種の弱い仮定に基づいて縮小される（以下の「モデルの縮小」の項を参照）。縮小モデルは図２６Ａに模式的かつ数学的に記載され、ここで、
は、それぞれ総濃度のプラスミド、薬剤、及びリソースを表し、定数と仮定している。縮小モデルは動的システム（ｄｙｎａｍｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ）の形態をとり、これは制御対象のプラントモジュールとフィードバック接続されるコントローラモジュールに分けることができる。開ループ（又は閉ループ）設定は、隔離速度η＝０（又はη＞＞０）を設定することによって数学的に実現される。
縮小モデルの数学的複雑さは、共有の転写及び翻訳のリソースＰとＲとによって課される負荷のモデル化の細部のレベルに依存する。ここでは、数学的複雑さが増大する３つのシナリオを検討することにする。最も単純なシナリオでは、負荷のないシステムを仮定する。つまり、リソースＰとＲとはほぼ一定であり、回路による影響を受けない。第２のシナリオでは、負荷は共有の翻訳リソースＲのみから生じると仮定される。数学的には、これは、図２６Ａの表に示すように、ＲをＺ１及びＺ２のヒル関数にすることによって実現される。これらの２つのシナリオでは、このダイナミクスは、Ｘ２；Ｙ、Ｚ１、及びＺ２において、一連のＰ＝ＰＴの常微分方程式（Ｏｒｄｉｎａｒｙ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｑｕａｔｉｏｎ：ＯＤＥ）で記述される。最後に、最後のシナリオとして、転写の負荷も考慮することである。これは、図２６Ａの表に示す代数的な制約を加えることで数学的に実現される。これにより、Ｐの陰方程式が得られ、その結果、一連の微分代数方程式（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ａｌｇｅｂｒａｉｃ Ｅｑｕａｔｉｏｎ：ＤＡＥ）が得られる。縮小モデルの詳細な導出は、以下の「モデルの縮小」の項に記載される。
次に、３つの異なるシナリオについて、モデルフィッティングを実施した。緑色の蛍光はｍＣｉｔｒｉｎｅが関与するすべての分子（Ｘ１＋Ｘ２＋二量化Ｘ２）を表し、かつ赤色の蛍光はｍＲｕｂｙ３が関与する分子（Ｙ）を表す。負荷のないシナリオが利用可能なデータを適切にフィッティングするのに十分でないことが示される（下記の「モデルフィッティング」の項）。しかしながら、翻訳の負荷はデータをフィッティングさせるのに十分であるため、図２６Ｂでは翻訳の負荷のシナリオの最適なパラメーターのフィットが示されている。実際、このモデルは、開ループ／閉ループの設定、外乱の有無、緑色／赤色の蛍光の両方、及び広い範囲のプラスミド比率
についてデータをフィッティングさせることに成功している。転写の負荷を加えることは、（さらなる自由度に起因して）わずかにフィッティングが良くなるだけなので、ここでは考慮しない。
開ループの場合、プラスミド比が高いために緑の蛍光が飽和に近づき 、プラスミド比が高いために赤の蛍光が飽和し、かつ減少し始めることが観察できる。この挙動は負荷の結果であり、負荷のないモデルでは捉えられない。さらに、閉ループ設定では、外乱の拒絶は、低いプラスミド比ではほぼ完全であるが、高いプラスミド比では低下し始めることが観察される。これは、回路が許容可能な設定値に制限をかける機能的ダイナミクス範囲を示すために予期されることである。この制限は、Ｚ１及びＺ２の分解／希釈化、及び共有されたリソースによる負荷の結果である。最後に、閉ループ設定での赤色蛍光は、開ループ設定と比較して非常に小さいことが観察できる。これは、センス－アンチセンスＲＮＡの隔離が高効率で行われ、その結果、回路が強いフィードバックを示すことを示唆している。実際に、構成的に産生されるセンスｍＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡを効率よく隔離し、かつこれを非常に低い濃度に保つ。
議論
本研究は、哺乳類細胞での相反積分フィードバックの初めての実装を示す。原理実証回路により、生物学におけるロバストかつ予測可能な制御システム工学の基礎が築かれる。
本研究は、哺乳類細胞での相反積分フィードバックの初めての実装を示す。原理実証回路により、生物学におけるロバストかつ予測可能な制御システム工学の基礎が築かれる。
相反モチーフに基づき（図２１）、完全適応が可能な概念実証回路を設計及び製作した。これは、ｍＲＮＡ分子と相補的なアンチセンスＲＮＡとのハイブリダイゼーションを利用することにより達成される。結果として生じる翻訳の阻害により、中心的な隔離機構が実現する。具体的には、転写因子ｔＴＡによって活性化されるプロモーターを介してアンチセンスＲＮＡが発現する。このアンチセンスＲＮＡは、そのｔＴＡのｍＲＮＡに相補的であり、それに結合して、負のフィードバックループを閉じる（図２３Ａ）。この回路が約３．５倍の範囲で異なる設定値を許容することを示すことで、積分フィードバック制御の特性が浮き彫りになる（図２３Ｂ）。おそらく、回路パラメーターをさらに最適化することで、該ダイナミクスの倍の範囲を改善できる可能性がある。
調節された種に対する外乱によって、閉ループ回路は適応を実現し、かつ類似の開ループ回路よりも優れていることが示されている（図２３Ｃ）。さらに、回路の設定値を変更した場合にも適応が実現することが示された。
さらに、相反積分フィードバックモチーフの実現は、調節された種のネットワーク構造にほとんど依存しない（ａｇｎｏｓｔｉｃ）ことも示された。これは、調節された種のネットワーク自体に摂動を導入することで達成した（図２４Ｂ）。さらに、このネットワークへの余剰の摂動が存在する場合でも、閉ループ回路がなお外乱を拒絶することも実証された。開ループ回路では、外乱、摂動、及び外乱を伴う摂動によって、ｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅの発現が連続してより強く減少するようになる。
最後に、相反積分制御の性能を高める目的で、比例フィードバックを付加する（図２５）。独立型の比例コントローラーでは、ｔＴＡ－ｍＣｉｔｒｉｎｅ発現の定常誤差を低減できるが、適応基準を満たすほど低減できないことが示された。一方、比例積分（ＰＩ）コントローラーは、独立型の相反モチーフの適応特性を壊さないことが示された。この追加の比例フィードバックを付加することは、過渡的ダイナミクス及び分散の低減などの性能を高めるであろうと期待される。
積分フィードバック制御を作成可能であること以外には、センス及びアンチセンスのＲＮＡの実装は、適応が非常に簡単で、かつ非常に一般的に適用可能である。センス及びアンチセンスの両方が完全にプログラム可能であり、ハイブリダイズして翻訳を阻害するのに十分な配列相同性を共有することだけが条件である。このため、内因性の転写因子のｍＲＮＡは、その転写因子により活性化されたプロモーターからアンチセンスＲＮＡを単に発現させることで、容易に相反モチーフに変換され得る。しかしながら、この場合、転写因子に対する設定値は、負のフィードバックによりアンチセンスＲＮＡを用いない場合よりも低くなり、かつさらに内因性転写因子のｍＲＮＡがあまり安定していない場合、積分器が最適な性能を発揮しないことが予想されることに注意しなければならない。
哺乳類細胞における遺伝子発現を正確かつロバストに調節する能力は、産業用バイオテクノロジー及び生物医学において多くの用途があると考えられている。
完全モデル
様々な生化学種（図２７）間の相互作用を記載した詳細な生化学反応ネットワークを、図２８に示す。
様々な生化学種（図２７）間の相互作用を記載した詳細な生化学反応ネットワークを、図２８に示す。
モデルの縮小
この項では、図２８に示した完全モデルを、図２６ｂに示したフィッティングに使用した図２７で与えられるモデルへ数学的に縮小する。モデル縮小の手順は、以下の仮定に基づくものである：
仮定１．結合反応が速い。
仮定２．ＳＭＡＳｈタグは迅速に放出される。
仮定３．複合体ｔＴＡ：ｍＣｉｔｒｉｎｅ：ＳＭＡＳｈタグの濃度は低い。
この項では、図２８に示した完全モデルを、図２６ｂに示したフィッティングに使用した図２７で与えられるモデルへ数学的に縮小する。モデル縮小の手順は、以下の仮定に基づくものである：
仮定１．結合反応が速い。
仮定２．ＳＭＡＳｈタグは迅速に放出される。
仮定３．複合体ｔＴＡ：ｍＣｉｔｒｉｎｅ：ＳＭＡＳｈタグの濃度は低い。
仮定１及び仮定２は、結合反応及び唯一の変換反応がシステム内の他の反応よりはるかに速いという事実を利用した時間スケールの分離原理に基づいている。
その結果、準定常状態近似（ｑｕａｓｉ－ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ：ＱＳＳＡ）が適用される。ＱＳＳＡは、そのダイナミクスは近似的であるが、定常状態の挙動はなお厳密である縮小モデルを与えることが強調されている。
仮定３は、複合体ｔＴＡ：ｍＣｉｔｒｉｎｅ：ＳＭＡＳＨタグ（Ｘ１）が非常に不安定であるという事実に基づき、つまり、（変換反応において）ＳＭＡＳｈタグを素早く失うか、あるいは薬剤と素早く結合し、次いで素早く破壊されるかのいずれかであることに基づいている。より正確には、仮定３は数学的に次の漸近不等式に置き換えられる：Ｘ１＜＜＿κ３。仮定３は、仮定１及び仮定２とは異なり、定常状態の形態では正確ではない近似的な縮小モデルが得られる。
ここで、縮小モデルの数学的導出を示す。保存則は次のように与えられる：
結合反応はネットワーク内の他の反応よりもはるかに速いので（仮定１）、次のように準定常状態近似（ＱＳＳＡ）を援用することができ：
ここで、様々な解離定数
は、すべて図２８に示される。
同様に、準定常状態近似値
を保存則
に代入することで、以下が得られる：
唯一残っている保存則は、
で与えられるＲＮＡポリメラーゼの保存則である。
準定常状態近似値
を代入することで、以下の代数方程式が得られ：
ここで、
である。ＰをＸ２の関数として記載したいと思う者もいるであろう。しかしながら、これはＰの三次多項式であるため、閉形態の解を明示的に書き出すのは面倒である。したがって、方程式はＰ及びＸ２において陰伏に残される。
準定常状態近似値を用いると、Ｘ１、Ｘ２、Ｚ１、Ｚ２、Ｐ、及びＹの開法（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を記載する一連の微分代数方程式（ＤＡＥ）を書き下すことができる。
準定常状態近似値を用いると、Ｘ１、Ｘ２、Ｚ１、Ｚ２、Ｐ、及びＹの開法を記載する一連の微分代数方程式（ＤＡＥ）を書き下すことができる。
この一連のＤＡＥは、次のようにコンパクトに書き換えることができ：
ここでは、以下である：
最後の近似の１つは、仮定２及び仮定３、つまりＸ１＜＜＿κ３、及び
を援用することによって実行することもできる。ここで以下とする：
その結果、
を
の微分方程式で取り除くことができ、以下のＤＡＥが得られ：
ここで、表記をわずかに乱用して、関数ｋの定義を薬剤の影響に以下として取り込むように変更する：
最後に、
は、以下のように、より便利な形に書き換えることができ：
ｎ＝２は、ヒル係数である。基底発現に対応する解離定数は、アクチベーター存在下の発現に対応する解離定数よりも大きく、すなわちκ０＞κ２であり、したがって任意のＰ＞０に対してα（Ｐ）＞０となる。
この縮小モデルを図２６Ａに示す。
モデルフィッティング
この項では、負荷のないモデルは、図２６Ｂに示すようなデータをフィッティングするのに不十分であることを示す。開ループ設定（η＝０）の負荷なしモデルは、以下の一連のＯＤＥにより記述される。
この項では、負荷のないモデルは、図２６Ｂに示すようなデータをフィッティングするのに不十分であることを示す。開ループ設定（η＝０）の負荷なしモデルは、以下の一連のＯＤＥにより記述される。
開ループのダイナミクスの固定点
は、時間微分をゼロに設定することにより計算され、以下が得られる：
実験で測定された緑色と赤色の蛍光は、それぞれＭＧ及びＭＲと表記され、以下によって与えられ：
ここで、ｃＧ及びｃＲは、それぞれ濃度を緑色及び赤色の蛍光にマッピングする比例定数である。Ａは、転写因子として機能し、かつ緑色蛍光でもあるＸ２の二量体化したものを表すことに注意されたい。定常状態でのその濃度は、
によって与えられることが示される（詳細な説明については「縮小モデル」の項を参照）。ＭＧがＤ１
Ｔにおいて二次関数的に増加することを観察されたい（Ｘ
２ は、Ｄ１
Ｔで線形的に増加するため）。さらに、ＭＲは、Ｘ
２ のヒル関数、したがってＤ１
Ｔを単調に増加させることを観察されたい。この２つの観察は，図２６Ｂに示したデータと矛盾し、なぜなら、緑色の蛍光は高いＤ１
Ｔで飽和し、赤色の蛍光は高いＤ１
Ｔで減少し始めるからである。その結果、負荷のないモデルでは、この２つの挙動を捉えることができない。
実施例２：ＰＩ、ＰＤ、及びＰＩＤの分子コントローラーの数理的説明
制御したいプロセスには、動力学的に相互作用する種Ｌを有しており、その濃度は次のように与えられる：Ｘ１，…，ＸＬ。ここで、Ｘ１は作動種の濃度（プロセスの入力）であり、ＸＬは調節種の濃度（プロセスの出力）であると仮定する。分子コントローラーは、濃度が、Ｚ１，…，Ｚｎで与えられるｎ個の種を持つものと仮定する。プロセスを制御（コントロール）する方法は、Ｘ１に影響を与えることを介して行われる（上記の図を参照）。特に以下である：
制御したいプロセスには、動力学的に相互作用する種Ｌを有しており、その濃度は次のように与えられる：Ｘ１，…，ＸＬ。ここで、Ｘ１は作動種の濃度（プロセスの入力）であり、ＸＬは調節種の濃度（プロセスの出力）であると仮定する。分子コントローラーは、濃度が、Ｚ１，…，Ｚｎで与えられるｎ個の種を持つものと仮定する。プロセスを制御（コントロール）する方法は、Ｘ１に影響を与えることを介して行われる（上記の図を参照）。特に以下である：
関数Ｕは、ＸＬに依存してフィードバックを可能にし、かつ作動種に依存することが可能であり、それにより、その濃度に依存する方法で作動種の生成又は除去を可能にし得る。
制御に関与する変数は、矢印又はＴ字の線で示されている。図２９～３３において、例えば、矢印は、矢印に関連する変数の関数としてのＸ１の生成速度の増加を示す。これは、様々な手段、例えば、Ｘ１の発現又は活性化を増加させること、分解又は阻害を減少させることなどを通じて達成され得る。一方、Ｔ字で終わる線は、Ｔ字の線に関連する変数の関数として、Ｘ１の生成速度の減少を示し、これは、反対のプロセスを通じて、例えば、発現の減少、活性化の減少、阻害の増加、分解の増加などを通じて達成され得る。図示の例では、以下であり：
かつ動作点付近のＵは、Ｚ１及びＺ２の増加関数であり、ＸＬの減少関数である。線形解析の場合、一般性を損なうことなく、単純に次のような形のＵを仮定することができ：
ここで、ｈ０及びｈ１は、これらの独立変数の単調増加関数であり（矢印と一致）、かつｈ２は、単調減少関数である（Ｔ字線と一致）。実際、ある所与の固定点では、上記のＵの両方の式の線形化は同じ形態を有している。次に実施する解析では、説明を簡単にするため、ＵのＸ１への依存性を抑制するであろう。換言すれば、本発明者らは、以下をとることにする：
Ｘ１への可能性のある依存を抑制することで一般性を失わず、Ｕの実装（例えば、作動する種の活性化／阻害／発現／分解）が作動種の濃度Ｘ１に依存する場合は常に同様に、分析を簡単に実行できる 。
１． ＰＩコントローラー
考慮すべき実装の種類は２つ存在する：Ｎ型及びＰ型である。Ｎ型コントローラーは正のプロセスに適し、Ｐ型コントローラーは負のプロセスに適している。これにより、制御ループ全体の負のフィードバックの実装を確実にする。
考慮すべき実装の種類は２つ存在する：Ｎ型及びＰ型である。Ｎ型コントローラーは正のプロセスに適し、Ｐ型コントローラーは負のプロセスに適している。これにより、制御ループ全体の負のフィードバックの実装を確実にする。
１．１ ＰＩコントローラーの二次実装
１．１．１ 負のゲインを持つプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＰ型のコントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
１．１．１ 負のゲインを持つプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＰ型のコントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｐ型ＰＩコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図２９右図を参照）：
ｈ０及びｈ２は、単調増加するものとする。
補題：閉ループが非負の固定点
を持つための必要十分条件は次のとおりである：
この固定点におけるダイナミクスを線形化すると、次のようになり：
ここで、
はそれぞれ、固定点で評価したｈ０及びｈ２の微分値である。
１．１．２ 正のゲインを持つプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＮ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
これらのプロセスでは、安定性のためにＮ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｎ型ＰＩコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図２９、左図を参照）：
ｈ０を単調減少するものとし、かつｈ１を単調増加するものとする。
補題：閉ループが非負の固定点
を持つための必要十分条件は次のとおりである：
この固定点におけるダイナミクスを線形化すると、次のようになり：
ここで、
は、それぞれ、固定点で評価したｈ０及びｈ１の微分値である。
とする。ｘＬからｕへの伝達関数は次式で与えられる：
注意：このコントローラーは、フィルタリングされた積分を備えた純粋な比例コントローラーである。しかしながら、フィルターのカットオフ周波数は、ηＺ１
＊が大きいと高くなるので、この場合はフィルターを無視することができる。
２．ＰＤコントローラー
２．１ 負のゲインプロセス
これらのプロセスを次のとおり記載する（図３０、右図）：
２．１ 負のゲインプロセス
これらのプロセスを次のとおり記載する（図３０、右図）：
非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｐ型ＰＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図３０、右図を参照）：
ｇ０は（所望のＰＤパラメーターに応じて）単調減少するか、又は単調増加すると仮定し、一方で、ｈ０及びｈは単調増加するものと仮定する。
線形化されたダイナミクス：
これは以下に従う：
２．２ 正のゲインプロセス
これらのプロセスを次のとおり記載する（図３０、左図）：
これらのプロセスを次のとおり記載する（図３０、左図）：
非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｎ型ＰＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図３０、左図を参照）：
ｇ０は（所望のＰＤパラメーターに応じて）単調減少するか、又は単調増加すると仮定し、一方で、ｈ０及びｈは単調減少するものと仮定する。
線形化されたダイナミクスは以下のとおりである：
３． ＰＩＤコントローラー
本発明者らは３つの実装を示し、１つは、２つの種を必要とする二次の実装であり、もう１つは、３つの種を必要とする三次の実装であり、最後は４つの種を必要とする四次の実装である。この二次コントローラーの実装はより単純であるが、すべてのＰＩＤコントローラーのサブセットのみしかカバーせず、一方、すべての実用的な目的のための三次の実装は、フィルタリングされたＰＤ構成要素を有するすべての可能なＰＩＤコントローラーのパラメーターをカバーする。この四次の実装は最も一般的であり、フィルタリングされたＤ構成要素を有するすべてのＰＩＤコントローラーをカバーする。これは、ＰＩＤ産業用コントローラーに最も近いものである。
本発明者らは３つの実装を示し、１つは、２つの種を必要とする二次の実装であり、もう１つは、３つの種を必要とする三次の実装であり、最後は４つの種を必要とする四次の実装である。この二次コントローラーの実装はより単純であるが、すべてのＰＩＤコントローラーのサブセットのみしかカバーせず、一方、すべての実用的な目的のための三次の実装は、フィルタリングされたＰＤ構成要素を有するすべての可能なＰＩＤコントローラーのパラメーターをカバーする。この四次の実装は最も一般的であり、フィルタリングされたＤ構成要素を有するすべてのＰＩＤコントローラーをカバーする。これは、ＰＩＤ産業用コントローラーに最も近いものである。
３．１ 二次ＰＩＤの実装
３．１．１ 負のゲインを持つプロセス
負のゲインプロセスとは、用量応答が減少するプロセスである。これらのプロセスでは、安定性のためにＰ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
３．１．１ 負のゲインを持つプロセス
負のゲインプロセスとは、用量応答が減少するプロセスである。これらのプロセスでは、安定性のためにＰ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｐ型ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図３１、右図を参照）：
ｈ０及びｈ２は単調増加するものとする。
補題：閉ループが非負の固定点
を持つための必要十分条件は次のとおりである：
この固定点におけるダイナミクスを線形化すると、次のようになり：
ここで、
は、それぞれ、固定点で評価したｈ０及びｈ２の微分値である。
とする。ｘＬからｕへの伝達関数は次式で与えられる：
３．１．２ 正のゲインを持つプロセス
正のゲインプロセスとは、用量応答が増加するプロセスである。これらのプロセスでは、安定性のためにＮ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
正のゲインプロセスとは、用量応答が増加するプロセスである。これらのプロセスでは、安定性のためにＮ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｎ型ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図３１、左図を参照）：
ｈ０を単調減少するものとし、かつｈ１を単調増加するものとする。
補題：閉ループが非負の固定点
を持つための必要十分条件は次のとおりである：
この固定点におけるダイナミクスを線形化すると、次のようになり：
ここで、
は、それぞれ、固定点で評価したｈ０及びｈ１の微分値である。
３．２ 三次ＰＩＤの実装
３．２．１ 負のゲインを持つプロセス
これらのプロセスでは通常、安定性のためにＰ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
３．２．１ 負のゲインを持つプロセス
これらのプロセスでは通常、安定性のためにＰ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロ固定点
が存在すると仮定する。ｐ型ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図３２、右図を参照）：
ｈ２は単調増加するものとする。
補題：閉ループが非負の固定点
を持つための必要十分条件は次のとおりである：
この固定点におけるダイナミクスを線形化すると、次のようになり：
ここで、
は、固定点で評価したｇ０、ｈ０、ｈ１、及びｈ３の微分値である。
３．２．２ 正のゲインを持つプロセス
これらのプロセスでは通常、安定性のためにＰ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
これらのプロセスでは通常、安定性のためにＰ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロ固定点
が存在すると仮定する。
ｎ型ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図３２、左図を参照）：
ｈ０及びｈ３は、単調減少するものとし、かつｈ１は単調増加するものとする。
閉ループが非負の固定点
を持つための必要十分条件は、
及び
である。
この固定点におけるダイナミクスを線形化すると、次のようになる：
３．３ 四次ＰＩＤコントローラー
２つの相反モチーフに基づく四次ＰＩＤコントローラーを示す。この実装は、ＰＩに加え、フィルタリングされたＤコントローラーとの実装である。微分は常にフィルタリングする必要があるため、これは最も一般的で、かつ制限の少ないアーキテクチャであり、これはすべての可能性のあるＰＩＤコントローラーのパラメーター及びフィルターカットオフパラメーターを許容する。これは最も一般的なＰＩＤアーキテクチャである。
２つの相反モチーフに基づく四次ＰＩＤコントローラーを示す。この実装は、ＰＩに加え、フィルタリングされたＤコントローラーとの実装である。微分は常にフィルタリングする必要があるため、これは最も一般的で、かつ制限の少ないアーキテクチャであり、これはすべての可能性のあるＰＩＤコントローラーのパラメーター及びフィルターカットオフパラメーターを許容する。これは最も一般的なＰＩＤアーキテクチャである。
３．３．１ 負のゲインを持つプロセス
これらのプロセスでは、安定性のために通常ｐ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
これらのプロセスでは、安定性のために通常ｐ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
ｐ型ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図３３、右図を参照）：
ｈ０及びｈ２は厳密に単調増加するものとし、かつｇ（Ｚ４；ＸＬ）はＸＬにおいて厳密に単調増加するものとし、かつＺ４において厳密に単調減少するものとする。例えば、
である。
補題１：閉ループが非負の固定点
を有するための必要十分条件は、以下である：
補題２：Ｚ２
＊、Ｚ４
＊は、ηに依存せず、かついずれも正である：
この固定点におけるダイナミクスを線形化すると、次のようになり：
ｈ’
０（＊）、ｈ’
２（＊）は固定点で評価したｈ０、ｈ２の微分値であり；
は、それぞれ固定点で評価したＺ４及びＸＬに関するｇの偏微分値である。
次に、ｘＬから
への伝達関数を計算する。ｘＬからｕＰへの伝達関数は、
で与えられ、ここで、
である。ｘＬからｕＩへの伝達関数は次式で与えられる：
ｘＬからｕＤへの伝達関数を計算するために、最初に、ｕＤからｚ４への伝達関数を計算する。
これを
である事実と組み合わせると、直ちに、ｘＬからｕＤへの伝達関数が得られ：
ここで、
である。なお、γ＞０であることに注意されたい。
これは以下に従う：
これは以下に従う：
３．３．２ 正のゲインを持つプロセス
これらのプロセスでは、通常、安定性のためにｎ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
これらのプロセスでは、通常、安定性のためにｎ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記述されると仮定する：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
ｎ型ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図３３、左図を参照）：
ここでは、ｈ０が厳密に単調減少するものとし、ｈ２が厳密に単調増加するものとし、かつｇ（Ｚ４，ＸＬ）がＸＬ及びＺ４において厳密に単調減少するものとする。例えば、
である。
補題１：閉ループが非負の固定点
を持つための必要十分条件は以下のとおりである：
補題２：Ｚ１
＊、Ｚ４
＊は、ηに依存せず、かついずれも正である：
この固定点におけるダイナミクスを線形化すると、次のようになり：
ｈ’
０（＊）、ｈ’
２（＊）は固定点で評価したｈ０、ｈ１の微分値であり；
は、それぞれ固定点で評価したＺ４及びＸＬに関するｇの偏微分値である。
次に、ｘＬから
への伝達関数を計算する。ｘＬからｕＰへの伝達関数は、
で与えられ、ここで、
である。ｘＬからｕＩへの伝達関数は次式で与えられる：
ｘＬからｕＤへの伝達関数を計算するために、最初に、ｕＤからｚ４への伝達関数を計算する。
これを
である事実と組み合わせると、直ちに、ｘＬからｄｕへの伝達関数が得られ：
ここで、
である。
であることに注意されたい。
これは以下に従う：
実施例４：流入、流出、及び自己触媒ＰＩＤ分子コントローラーの数理的記述
二次及び三次のＰＩＤコントローラーの微分演算は、インコヒーレントなフィードフォワードループを介して実現される。四次ＰＩＤコントローラーに関しては、相反微分器（Ａｎｔｉｔｈｅｔｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｏｒ）と呼ばれる微分作用素（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｏｐｅｒａｔｏｒ）が根本的に異なる。これは、相反積分モチーフをそれ自体とのフィードバックループに配置することにより実現される。これは、積分器（ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）を使用して微分器（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｏｒ）を実装するための代替的なトリックである。もちろん、純粋な微分は物理的に実現できないため、もたらされる微分器はローパスフィルタリングされる：純粋な微分は将来の入力にアクセスする必要がある。ここでは、このトリックを利用して、異なる積分器（相反積分器以外）を利用することで、他の微分器を構築することができることを示す。
二次及び三次のＰＩＤコントローラーの微分演算は、インコヒーレントなフィードフォワードループを介して実現される。四次ＰＩＤコントローラーに関しては、相反微分器（Ａｎｔｉｔｈｅｔｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｏｒ）と呼ばれる微分作用素（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｏｐｅｒａｔｏｒ）が根本的に異なる。これは、相反積分モチーフをそれ自体とのフィードバックループに配置することにより実現される。これは、積分器（ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）を使用して微分器（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｏｒ）を実装するための代替的なトリックである。もちろん、純粋な微分は物理的に実現できないため、もたらされる微分器はローパスフィルタリングされる：純粋な微分は将来の入力にアクセスする必要がある。ここでは、このトリックを利用して、異なる積分器（相反積分器以外）を利用することで、他の微分器を構築することができることを示す。
１． 流出ＰＩＤコントローラー
１．１ 正のゲインプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＮ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
１．１ 正のゲインプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＮ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｎ型流出ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図４６、左図を参照）：
ｈは、Ｚ１及びＵＤにおいて単調増加するものとし、かつＸ＿Ｌにおいて単調減少するものとする。さらに、ｇは、Ｚ３において単調増加するものとし、かつＸＬにおいて単調減少するものとする。
この固定点でのダイナミクスを線形化し、かつ（κ０＜＜Ｚ３）を仮定すると、次のようになり：
ここで、
は、固定点を評価したｘに関してｆの偏微分値を表す。
ｘＬからｕへの伝達関数を素直に計算して、次のように示すことができる：
注意：このコントローラーは，ローパスフィルタリングされた微分値を持つ比例－積分コントローラーであり、ここでω＿０はカットオフ周波数を示す。
１．２ 負のゲインプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＰ型のコントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
これらのプロセスでは、安定性のためにＰ型のコントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｐ型流出ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図４６、右図を参照）：
ｈはＺ２、ＸＬ、及びＵＤにおいて単調増加するものとする。さらに、ｇは、Ｚ３及びＸＬにおいて単調増加するものとする。
この固定点でのダイナミクスを線形化し、かつ（κ０＜＜Ｚ３）を仮定すると、次のようになり：
ここで、
は、固定点を評価したｘに関してｆの偏微分値を表す。
ｘＬからｕへの伝達関数を素直に計算して、次のように示すことができる：
注意：このコントローラーは，ローパスフィルタリングされた微分値を持つ比例－積分コントローラーであり、ここでω＿０はカットオフ周波数を示す。
２．流入ＰＩＤコントローラー
２．１ 正のゲインプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＮ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
２．１ 正のゲインプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＮ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｎ型流入ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図４７、左図を参照）：
ｈは、Ｚ１及びＵＤにおいて単調増加するものとし、かつＸ＿Ｌにおいて単調減少するものとする。さらに、ｇは、Ｚ３及びＸＬにおいて単調増加するものとする。
この固定点でのダイナミクスを線形化し、かつ（κ０＜＜Ｚ３）を仮定すると、次のようになり：
ここで、
は、固定点を評価したｘに関してｆの偏微分値を表す。
ｘＬからｕへの伝達関数を素直に計算して、次のように示すことができる：
注意：このコントローラーは，ローパスフィルタリングされた微分値を持つ比例－積分コントローラーであり、ここでω＿０はカットオフ周波数を示す。
２．２ 負のゲインプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＰ型のコントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
これらのプロセスでは、安定性のためにＰ型のコントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｐ型流出ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図４７、右図を参照）：
ｈはＺ２、ＸＬ、及びＵＤにおいて単調増加するものとする。さらに、ｇは、Ｚ＿３及びＸ＿Ｌにおいて単調増加するものとする。
この固定点でのダイナミクスを線形化し、かつ（κ０＜＜Ｚ３）を仮定すると、次のようになり：
ここで、
は、固定点を評価したｘに関してｆの偏微分値を表す。
ｘＬからｕへの伝達関数を素直に計算して、次のように示すことができる：
注意：このコントローラーは，ローパスフィルタリングされた微分値を持つ比例－積分コントローラーであり、ここでω＿０はカットオフ周波数を示す。
３．自己触媒ＰＩＤコントローラー
３．１ 正のゲインプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＮ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
３．１ 正のゲインプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＮ型コントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｎ型自己触媒ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図４８、左図を参照）：
ｈは、Ｚ１及びＵＤにおいて単調増加するものとし、かつＸ＿Ｌにおいて単調減少するものとする。さらに、ｇは、Ｚ＿３において単調増加するものとし、かつＸ＿Ｌにおいて単調減少するものとする。
固定点は２つ存在することに注意されたい：
である。１つは、関数ｇが、Ｚ３
＊＝０を不安定な固定点とするように設計可能であることを示すことができる。したがって、残りの分析については、
と仮定する。
この固定点におけるダイナミクスを線形化すると、次のようになり：
ここで、
は、固定点を評価したｘに関してｆの偏微分値を表す。
ｘＬからｕへの伝達関数を素直に計算して、次のように示すことができる：
注意：このコントローラーは，ローパスフィルタリングされた微分値を持つ比例－積分コントローラーであり、ここでω＿０はカットオフ周波数を示す。
３．２ 負のゲインプロセス
これらのプロセスでは、安定性のためにＰ型のコントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
これらのプロセスでは、安定性のためにＰ型のコントローラーが必要である。このプロセスは次のように記載される：
所望の設定値
が与えられる場合、対応する非ゼロの固定点
が存在すると仮定する。
Ｐ型自己触媒ＰＩＤコントローラーのダイナミクスは以下のとおりである（図４８、右図を参照）：
ｈはＺ２、ＸＬ、及びＵＤにおいて単調増加するものとする。さらに、ｇは、Ｚ＿３及びＸ＿Ｌにおいて単調増加するものとする。
固定点は２つ存在することに注意されたい：
である。１つは、関数ｇが、Ｚ３
＊＝０を不安定な固定点とするように設計可能であることを示すことができる。したがって、残りの分析については、
と仮定する。
この固定点におけるダイナミクスを線形化すると、次のようになり：
ここで、
は、固定点を評価したｘに関してｆの偏微分値を表す。
ｘＬからｕへの伝達関数を素直に計算して、次のように示すことができる：
注意：このコントローラーは，ローパスフィルタリングされた微分値を持つ比例－積分コントローラーであり、ここでω＿０はカットオフ周波数を示す。
Claims (16)
- 細胞内のネットワークを制御するための発現システムであって、前記ネットワークは、アクチュエーター分子及び出力分子を含み、前記出力分子は、前記アクチュエーター分子によって正又は負に調節され、前記発現システムは、第１のコントローラー分子をコードする組換え遺伝子を含み、前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を正又は負に調節し、ここで、
ｉ）前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を正の調節し、かつ前記発現システムは、第１のアンチコントローラー分子をコードする組換え遺伝子をさらに含み、前記第１のアンチコントローラー分子は、前記第１のコントローラー分子を負に調節し、特に不活性化、隔離、及び／又は消滅させ、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記第１のアンチコントローラー分子を負に調節し、特に不活性化、隔離、及び／又は消滅させ、ここで、
ａ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を正に調節する場合、前記第１のアンチコントローラー分子は前記出力分子によって正に調節され、及び
ｂ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を負に調節する場合、前記第１のコントローラー分子は前記出力分子によって正に調節されるか、あるいは
ｉｉ）前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を負に調節し、かつ前記発現システムは、第１のアンチコントローラー分子をコードする組換え遺伝子をさらに含み、前記第１のアンチコントローラー分子は、前記第１のコントローラー分子を負に調節し、特に不活性化、隔離、及び／又は消滅させ、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記第１のアンチコントローラー分子を負に調節し、特に不活性化、隔離、及び／又は消滅させ、ここで、
ａ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を正に調節する場合、前記第１のコントローラー分子は前記出力分子によって正に調節され、及び
ｂ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を負に調節する場合、前記第１のアンチコントローラー分子は前記出力分子によって正に調節される、
前記発現システム。 - 前記発現システムは、フィードバック分子をコードする組換え遺伝子をさらに含み、前記フィードバック分子は、前記出力分子によって正に調節され、かつ
ａ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を正に調節する場合、前記フィードバック分子は前記アクチュエーター分子を負に調節し、及び
ｂ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を負に調節する場合、前記フィードバック分子は前記アクチュエーター分子を正に調節する、
請求項１に記載の発現システム。 - ａ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を正に調節する場合、前記フィードバック分子は、
ｉ． 前記アクチュエーター分子の産生を負に調節するマイクロＲＮＡであるか、又は
ｉｉ． 前記アクチュエーター分子の産生を負に調節するＲＮＡ結合タンパク質であり、あるいは
ｂ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を負に調節する場合、前記フィードバック分子は、前記アクチュエーター分子をコードする追加のｍＲＮＡである、
請求項２に記載の発現システム。 - ａ． 前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子をコードするセンスｍＲＮＡ、又は前記アクチュエーター分子を正に調節するアクチベーターをコードするセンスｍＲＮＡであり、かつ第２のコントローラー分子は、前記センスｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含むアンチセンスＲＮＡを含むか、又は、
ｂ． 前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの翻訳を活性化するか、又は前記アクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの分解を阻害するか、又は前記アクチュエーター分子の分解を阻害するか、又は前記アクチュエーター分子の機能のインヒビターを負に調節することによって、前記アクチュエーター分子の産生を正に調節するアクチベータータンパク質であり、かつここで前記第１のアンチコントローラー分子は、アンチアクチベータータンパク質であり、前記アクチベータータンパク質と前記アンチアクチベータータンパク質とが複合体を形成し、前記アクチベータータンパク質による前記アクチュエーター分子の正の調節は、前記複合体の形成により阻害されるか、又は
ｃ． 前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を負に調節するインヒビターをコードするセンスｍＲＮＡであり、かつ前記第２のコントローラー分子は、前記センスｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含むアンチセンスＲＮＡを含むか、又は
ｄ． 前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するか、又は前記アクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの分解を活性化するか、又は前記アクチュエーター分子の分解を活性化するか、又は前記アクチュエーター分子の機能のインヒビターを正に調節することによって、前記アクチュエーター分子の産生を負に調節するインヒビタータンパク質であり、かつ前記第１のコントローラー分子は、アンチアクチベータータンパク質であり、前記アクチベータータンパク質と前記アンチアクチベータータンパク質とは、複合体を形成し、前記インヒビタータンパク質による前記アクチュエーター分子の負の調節は、前記複合体の形成により活性化される、
請求項１に記載の発現システム。 - ａ． 前記アクチュエーター分子は、前記出力分子を正に調節し、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記出力分子によって正に調節され、
ｂ． 前記アクチュエーター分子は、前記出力分子を負に調節し、かつ前記第１のアンチコントローラー分子は、前記出力分子によって正に調節される、
請求項１～４のいずれか一項に記載の発現システム。 - ａ． 前記アクチュエーター分子は、前記出力分子を正に調節し、かつ前記第１のアンチコントローラー分子は、前記出力分子によって正に調節され、
ｂ． 前記アクチュエーター分子は、前記出力分子を負に調節し、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記出力分子によって正に調節される、
請求項１～４のいずれか一項に記載の発現システム。 - 前記発現システムは、第２のコントローラー分子をコードする組換え遺伝子をさらに含み、
ａ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を正に調節する場合、
ｉ． 前記第２のコントローラー分子は、前記出力分子によって正又は負に調節され、かつ前記第２のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を負に調節するか、又は
ｉｉ． 前記第２のコントローラー分子は、前記出力分子によって負に調節され、かつ前記第２のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を正又は負に調節し、
及び
ｂ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を負に調節する場合、
ｉ． 前記第２のコントローラー分子は、前記出力分子によって正又は負に調節され、かつ前記第２のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を正に調節するか、又は
ｉｉ． 前記第２のコントローラー分子は、前記出力分子によって正に調節され、かつ前記第２のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を正又は負に調節する、
請求項１～６のいずれか一項に記載の発現システム。 - 前記発現システムは、第２のアンチコントローラー分子をコードする組換え遺伝子をさらに含み、前記第２のアンチコントローラー分子は、前記第２のコントローラー分子を負に調節し、特に不活性化、隔離、及び／又は消滅させ、前記第２のコントローラー分子は、前記第２のアンチコントローラー分子を負に調節し、特に不活性化、隔離、及び／又は消滅させ、かつ前記第２のコントローラー分子は自身を負に調節し、かつ
ａ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を負に調節する場合、前記第２のコントローラー分子は、前記出力分子によって正に調節され、及び
ｂ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を正に調節する場合、前記第２のコントローラー分子は、前記出力分子によって負に調節される、
請求項７に記載の発現システム。 - ａ． 前記第２のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子の発現を調節するレギュレータータンパク質をコードするセンスｍＲＮＡであり、前記第２のアンチコントローラー分子は、前記レギュレータータンパク質をコードする前記センスｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含むアンチセンスＲＮＡであり、特に前記フィードバック分子が前記アクチュエーター分子をコードする追加のｍＲＮＡである場合、前記レギュレータータンパク質は、前記アクチュエーター分子をコードする追加のｍＲＮＡの発現を調節するか、又は
ｂ． 前記第２のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域に結合し、それによって前記アクチュエーター分子を負又は正に調節するＲＮＡ結合タンパク質であり、かつ前記第２のアンチコントローラー分子は、アンチＲＮＡ結合タンパク質であり、前記ＲＮＡ結合タンパク質と前記アンチＲＮＡ結合タンパク質とは、複合体を形成し、前記ＲＮＡ結合タンパク質による前記アクチュエーター分子の負又は正の調節は、前記複合体の形成により阻害される、
請求項８に記載の発現システム。 - ａ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を正に調節する場合、
ｉ． 前記第１のコントローラー分子は、前記出力分子によって正又は負に調節され、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を負に調節するか、又は
ｉｉ． 前記第１のコントローラー分子は、前記出力分子によって負に調節され、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を正又は負に調節し、
及び
ｂ． 前記アクチュエーター分子が前記出力分子を負に調節する場合、
ｉ． 前記第１のコントローラー分子は、前記出力分子によって正又は負に調節され、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を正に調節するか、又は
ｉｉ． 前記第１のコントローラー分子は、前記出力分子によって正に調節され、かつ前記第１のコントローラー分子は、前記アクチュエーター分子を正又は負に調節する、
請求項１又は２に記載の発現システム。 - 前記アクチュエーター分子は、アクチュエータータンパク質又は小分子であり、及び／又は前記出力分子は、タンパク質、小分子から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の発現システム。
- 請求項１～１１のいずれか一項に記載の発現システムを含む細胞。
- 前記細胞は、哺乳類細胞であり、特にヒト細胞である、請求項１２に記載の細胞。
- 前記細胞は、Ｔ細胞であり、特にキメラ抗原受容体ＣＡＲを発現するＴ細胞であり、特に、細胞中の前記出力分子の濃度は、前記細胞中の少なくとも１つの炎症性サイトカインの濃度を示し、かつ前記アクチュエーター分子は、前記細胞中の少なくとも１つの免疫抑制剤の産生又は放出を正に調節する、請求項１２又は１３に記載の細胞。
- 医薬品としての使用のための、特に免疫疾患の治療の方法における使用のための、特にサイトカイン放出症候群又は関節リウマチの治療の方法における使用のための、又は代謝疾患又は内分泌疾患の治療の方法における使用のための、特に糖尿病の治療の方法における使用のための、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞内のネットワークを制御するための方法であって、特にｅｘ ｖｉｖｏでの方法であって、前記方法は、請求項１～１１のいずれか一項に記載の発現システムの少なくとも１つの組換え遺伝子を細胞内で発現させることを含む、前記方法。
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| WO2013155439A1 (en) * | 2012-04-13 | 2013-10-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Analog and mixed-signal computation and circuits in living cells |
| EP3156493B1 (en) * | 2014-04-30 | 2020-05-06 | Tsinghua University | Use of tale transcriptional repressor for modular construction of synthetic gene line in mammalian cell |
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