JP2023545079A - ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム効率化のためのＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含むエンジニアリングされたガイドＲＮＡおよびその用途 - Google Patents
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Abstract
【要約】本明細書では従来技術の限界点を克服して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集活性を高めるための、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡに新しい構成を追加し、また、その構造の一部を変形したものである。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはその構成の３'末端に新しい構成であるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含むことを特徴とする。また、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはその構成のうちＣａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する役割をするスキャフォールド領域の少なくとも一部が変形されたことを特徴とする。
Description
［関連出願］
本出願は、２０２０年１０月８日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１２９９３７号および２０２１年４月１６日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００５００９３号に対する優先権を主張し、これらの出願それぞれの内容はその全体が参照によって本明細書に含まれる。
本出願は、２０２０年１０月８日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１２９９３７号および２０２１年４月１６日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００５００９３号に対する優先権を主張し、これらの出願それぞれの内容はその全体が参照によって本明細書に含まれる。
［技術分野］
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムをゲノム編集に使う分野に対する技術を開示する。
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムをゲノム編集に使う分野に対する技術を開示する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムはＣｌａｓｓ ２、Ｔｙｐｅ Ｖに分類されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））ではじめて古細菌由来のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムに対して明らかになった。その後、後続研究（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．４８、Ｎｏ．９ ５０１７（２０２０））で前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４システムをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムに分類した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは前記Ｃｌａｓｓ ２、Ｔｙｐｅ Ｖに分類されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのうち一つのＳｕｂｔｙｐｅであるＶ－Ｆ１システムに属し、これはＣａｓ１４ａをエフェクタータンパク質（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）として有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムを含む。前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに比べてエフェクタータンパク質の大きさが顕著に小さいという特徴がある。ただし、先行研究（Ｈａｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）、ＵＳ ２０２０／０１９０４９４ Ａ１）で明らかになったところでは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムは一本鎖ＤＮＡの切断能力は示すものの、二本鎖ＤＮＡに対しては切断活性がないか、極めて低いためゲノム編集技術に応用するのに限界があった。
最近先行文献（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムでＣａｓ１２ｆ１タンパク質が二量体（ｄｉｍｅｒ）を形成するという事実、およびガイドＲＮＡの構造に対して明らかにした。前記先行文献によってガイドＲＮＡ部分のうちＣａｓ１２ｆ１タンパク質と直接的に相互作用しない、いわゆるｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎがあるということが明らかになったし、さらに他の先行文献（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｆ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０））では、前記ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎ部分を除去してｉｎ ｖｉｔｒｏで二本鎖ＤＮＡの切断効率を考察したことがある。
しかし、前記先行研究は細胞内ゲノム編集活性（例えば、ｉｎｄｅｌ発生効率）を示したりこれを高める方案に対する研究ではなく、ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを除去した実験はあるが、かえって切断活性が低くなると報告した。さらに、前記研究で遂行した実験はｉｎ ｖｉｔｒｏで進めた実験であって、細胞内ゲノム編集活性を示したり効率を上げるための変形が何であるかを明らかにするには失敗した。
本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに使われてゲノム編集効率を増加させ得るエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供しようとする。
本明細書では、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれた、ゲノム編集効率を増加させ得るエンジニアリングされたスキャフォールド領域およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを提供しようとする。
本明細書では、ゲノム編集効率が増加したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を提供しようとする。
本明細書では、ゲノム編集効率が増加したエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを提供しようとする。
本明細書では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を暗号化する核酸を有するベクターを提供しようとする。
本明細書では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを使ったゲノム編集方法を提供しようとする。
本明細書では、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの用途を提供しようとする。
一実施例として、本明細書では次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを提供する：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
一実施例として、本明細書では次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを提供する：
エンジニアリングされたスキャフォールド；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧ－３'（配列番号４７５）で表現される第１配列；
５'－ＵＵＣＧ－３'で表現される第２配列；
５'－ＣＵＣＧＡ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第４配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第５配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列。
５'－ＵＵＣＧ－３'で表現される第２配列；
５'－ＣＵＣＧＡ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第４配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第５配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列。
一実施例として、本明細書では次を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを提供する：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、 ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、 ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は次を含む：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第１配列、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第１配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第２配列、
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された第３配列、
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６９）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３）からなる群から選択された第４配列が連結されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１５）からなる群から選択された第５配列、および
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１５）からなる群から選択された第５配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分の３'末端は前記スペーサーの５'末端と連結されており、
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と同一であり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と同一の場合を含まないことを特徴とする。
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と同一であり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と同一の場合を含まないことを特徴とする。
一実施例として、本明細書では次を含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を提供する：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
エンジニアリングされたガイドＲＮＡ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、前記標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
エンジニアリングされたガイドＲＮＡ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、前記標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
一実施例として、本明細書では次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクターを提供する：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
ここで、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
一実施例として、本明細書では次を含む、細胞内で標的核酸を編集する方法または標的核酸をターゲッティングする方法を提供する：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に導入すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集されるかまたはターゲッティングされ得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に導入すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集されるかまたはターゲッティングされ得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１以上１０以下であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
一実施例として、本明細書ではエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのゲノム編集用途を提供する。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムをゲノム編集に使う場合、自然界で発見されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを使う時と比較して高いゲノム編集効率を示す。
用語の定義
約
本明細書で使われる「約」という用語は、参照量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％程度に変わる量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さを意味する。
本明細書で使われる「約」という用語は、参照量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％程度に変わる量、水準、値、数、頻度、パーセント、寸法、大きさ、量、重量または長さを意味する。
Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、およびＵ
本明細書で使われるＡ、Ｔ、Ｃ、ＧおよびＵ記号は、当業界の通常の技術者が理解する意味で解釈される。文脈および技術によりＤＮＡまたはＲＮＡ上で塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに適切に解釈され得る。例えば、塩基を意味する場合は、それぞれアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）自体と解釈され得、ヌクレオシドを意味する場合はそれぞれアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）と解釈され得、配列でヌクレオチドを意味する場合は前記それぞれのヌクレオシドを含むヌクレオチドを意味するものと解釈される。
本明細書で使われるＡ、Ｔ、Ｃ、ＧおよびＵ記号は、当業界の通常の技術者が理解する意味で解釈される。文脈および技術によりＤＮＡまたはＲＮＡ上で塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに適切に解釈され得る。例えば、塩基を意味する場合は、それぞれアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）自体と解釈され得、ヌクレオシドを意味する場合はそれぞれアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）と解釈され得、配列でヌクレオチドを意味する場合は前記それぞれのヌクレオシドを含むヌクレオチドを意味するものと解釈される。
作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）
本明細書で使われる「作動可能に連結された」という用語は遺伝子発現において、特定の構成が他の構成と連結されて意図された方式通りに機能できるように連結されていることを意味する。例えば、プロモーター配列が暗号化配列と作動可能に連結されたとする時、前記プロモーターが前記暗号化配列の細胞内での転写および／または発現に影響を及ぼし得るように連結されたことを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で使われる「作動可能に連結された」という用語は遺伝子発現において、特定の構成が他の構成と連結されて意図された方式通りに機能できるように連結されていることを意味する。例えば、プロモーター配列が暗号化配列と作動可能に連結されたとする時、前記プロモーターが前記暗号化配列の細胞内での転写および／または発現に影響を及ぼし得るように連結されたことを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
標的遺伝子または標的核酸
本明細書で使われる「標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）」または「標的核酸（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）」は基本的に、ゲノム編集の対象となる細胞内遺伝子または核酸を意味する。前記標的遺伝子または標的核酸は混用されて使われ得、互いに同一の対象を指称し得る。前記標的遺伝子または標的核酸は別途に記載されない限り、対象細胞が有する固有な遺伝子または核酸、あるいは外部由来の遺伝子または核酸のすべてを意味し得、編集の対象となることができるのであれば特に制限されない。前記標的遺伝子または標的核酸は標的配列または標的配列の隣接部位を含むことができる。前記標的遺伝子または標的核酸は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。また、前記用語は当業界の通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で使われる「標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）」または「標的核酸（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）」は基本的に、ゲノム編集の対象となる細胞内遺伝子または核酸を意味する。前記標的遺伝子または標的核酸は混用されて使われ得、互いに同一の対象を指称し得る。前記標的遺伝子または標的核酸は別途に記載されない限り、対象細胞が有する固有な遺伝子または核酸、あるいは外部由来の遺伝子または核酸のすべてを意味し得、編集の対象となることができるのであれば特に制限されない。前記標的遺伝子または標的核酸は標的配列または標的配列の隣接部位を含むことができる。前記標的遺伝子または標的核酸は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。また、前記用語は当業界の通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
標的配列または認識配列
本明細書で使われる「標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「認識配列（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が標的遺伝子または標的核酸を切断するために認識する特定配列を意味する。前記標的配列はその目的により適切に選択され得る。具体的には、「標的配列」は前記前述した標的遺伝子または標的核酸内に含まれた配列であり得、本明細書で提供するガイドＲＮＡ、またはエンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれたスペーサー配列と相補性を有する配列を意味する。一般的に、前記スペーサー配列は標的遺伝子または標的核酸の配列およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクタータンパク質が認識するＰＡＭ配列を考慮して決定される。本明細書で、前記標的配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のガイドＲＮＡと相補的に結合する特定の鎖のみを指称し得、前記特定の鎖部分を含む標的二本鎖全体を指称してもよく、これは文脈により適切に解釈される。また、前記用語は当業界の通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で使われる「標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「認識配列（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が標的遺伝子または標的核酸を切断するために認識する特定配列を意味する。前記標的配列はその目的により適切に選択され得る。具体的には、「標的配列」は前記前述した標的遺伝子または標的核酸内に含まれた配列であり得、本明細書で提供するガイドＲＮＡ、またはエンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれたスペーサー配列と相補性を有する配列を意味する。一般的に、前記スペーサー配列は標的遺伝子または標的核酸の配列およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクタータンパク質が認識するＰＡＭ配列を考慮して決定される。本明細書で、前記標的配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のガイドＲＮＡと相補的に結合する特定の鎖のみを指称し得、前記特定の鎖部分を含む標的二本鎖全体を指称してもよく、これは文脈により適切に解釈される。また、前記用語は当業界の通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
ベクター
本明細書で使われる「ベクター」は別途に特定されない限り、遺伝物質を細胞内に運搬できるすべての物質を総称するものである。例えば、ベクターは対象となる遺伝物質、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクタータンパク質を暗号化する核酸、および／またはガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＤＮＡ分子であり得るが、これに制限されるものではない。前記用語は当業界の通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で使われる「ベクター」は別途に特定されない限り、遺伝物質を細胞内に運搬できるすべての物質を総称するものである。例えば、ベクターは対象となる遺伝物質、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクタータンパク質を暗号化する核酸、および／またはガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むＤＮＡ分子であり得るが、これに制限されるものではない。前記用語は当業界の通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
自然界で発見される
本明細書で「自然界で発見される（ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ）」という用語は、自然界で発見される、人為的に変形されていない対象を意味し、人為的な変形が加えられた「エンジニアリングされた対象」と区分するために使われる。前記「自然界で発見される」遺伝子、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡなどは、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ｏｒｉｇｉｎａｌ ｆｏｒｍ）およびｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ（ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）の遺伝子、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡをすべて包括する概念で使われる。前記用語はその他通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈されるべきである。
本明細書で「自然界で発見される（ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ）」という用語は、自然界で発見される、人為的に変形されていない対象を意味し、人為的な変形が加えられた「エンジニアリングされた対象」と区分するために使われる。前記「自然界で発見される」遺伝子、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡなどは、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ｏｒｉｇｉｎａｌ ｆｏｒｍ）およびｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ（ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）の遺伝子、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡをすべて包括する概念で使われる。前記用語はその他通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈されるべきである。
エンジニアリングされた
本明細書で使われる「エンジニアリングされた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」という用語は、自然界にすでに存在する構成を有する物質、分子などと区分するために使う用語であって、前記物質、分子などに人為的な変形が加えられたことを意味する。例えば、「エンジニアリングされたガイドＲＮＡ」の場合、自然界に存在するガイドＲＮＡの構成に人為的な変更が加えられたガイドＲＮＡを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で使われる「エンジニアリングされた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」という用語は、自然界にすでに存在する構成を有する物質、分子などと区分するために使う用語であって、前記物質、分子などに人為的な変形が加えられたことを意味する。例えば、「エンジニアリングされたガイドＲＮＡ」の場合、自然界に存在するガイドＲＮＡの構成に人為的な変更が加えられたガイドＲＮＡを意味する。また、前記用語は当業界の通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
ＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｏｒ Ｓｉｇｎａｌ）
本明細書で「ＮＬＳ」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核外部の物質を核内部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着して一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。具体的には、前記ＮＬＳはアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７８）を有するＳＶ４０ウイルス大型Ｔ－抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ）からのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２７９）を有するヌクレオプラスミンの二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２８０）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２８１）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２８２）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２８３）；マイオマ（ｍｙｏｍａ）Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２８４）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号２８５）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号２８６）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号２８７）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号２８８）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号２８９）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号２９０）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号２９１）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）重合酵素の配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号２９２）；またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号２９３）から由来したＮＬＳ配列であり得るが、これに制限されない。本明細書で使われる「ＮＬＳ」という用語は通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で「ＮＬＳ」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核外部の物質を核内部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着して一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。具体的には、前記ＮＬＳはアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７８）を有するＳＶ４０ウイルス大型Ｔ－抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ）からのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２７９）を有するヌクレオプラスミンの二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２８０）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２８１）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２８２）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２８３）；マイオマ（ｍｙｏｍａ）Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２８４）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号２８５）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号２８６）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号２８７）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号２８８）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号２８９）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号２９０）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号２９１）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）重合酵素の配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号２９２）；またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号２９３）から由来したＮＬＳ配列であり得るが、これに制限されない。本明細書で使われる「ＮＬＳ」という用語は通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
ＮＥＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｐｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｏｒ Ｓｉｇｎａｌ）
本明細書で「ＮＥＳ」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核内部の物質を核外部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着して一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。本明細書で使われる「ＮＥＳ」という用語は通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で「ＮＥＳ」とは、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）作用で細胞核内部の物質を核外部に輸送する時、輸送対象であるタンパク質に付着して一種の「タグ」役割をする一定の長さのペプチド、またはその配列を意味する。本明細書で使われる「ＮＥＳ」という用語は通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
タグ
本明細書で「タグ」とは、ペプチド、またはタンパク質の輸送、追跡および／または分離精製を容易にするために付加される機能的ドメインを総称するものである。具体的には、前記タグはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグなどのタグタンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＨｃＲＥＤ、ＤｓＲｅｄなどの自家蛍光タンパク質、およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）過酸化酵素（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を含むが、これに制限されるものではない。本明細書で使われる「タグ」という用語は通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
本明細書で「タグ」とは、ペプチド、またはタンパク質の輸送、追跡および／または分離精製を容易にするために付加される機能的ドメインを総称するものである。具体的には、前記タグはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグなどのタグタンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＨｃＲＥＤ、ＤｓＲｅｄなどの自家蛍光タンパク質、およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）過酸化酵素（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を含むが、これに制限されるものではない。本明細書で使われる「タグ」という用語は通常の技術者が理解できる意味をすべて含み、文脈により適切に解釈され得る。
背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の構造
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステム
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムはｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのうちＶ－Ｆサブタイプに属し、これはさらにＶ－Ｆ１～Ｖ－Ｆ３のバリアントに分かれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムは先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））でＣａｓ１４と命名されたエフェクタータンパク質のうち、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、およびＣａｓ１４ｃ変異体を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４システムを含む。この中、Ｃａｓ１４ａエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに分類される（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １８、６７（２０２０））。最近、先行研究（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１）、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｆ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０））等を通じて前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の構造が明らかになったところ、以下、これについて簡略に叙述する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムはｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのうちＶ－Ｆサブタイプに属し、これはさらにＶ－Ｆ１～Ｖ－Ｆ３のバリアントに分かれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆシステムは先行研究（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））でＣａｓ１４と命名されたエフェクタータンパク質のうち、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、およびＣａｓ１４ｃ変異体を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４システムを含む。この中、Ｃａｓ１４ａエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１４ａシステムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに分類される（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １８、６７（２０２０））。最近、先行研究（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１）、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｆ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０））等を通じて前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の構造が明らかになったところ、以下、これについて簡略に叙述する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の構造
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は二つの分子が二量体形態でガイドＲＮＡと結合して複合体をなしていることが明らかになった。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はａｍｉｎｏ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ（ＮＴＤ）およびｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍｉｎ（ＣＴＤ）に分かれ、前記二つのドメインがリンカーループ（ｌｉｎｋｅｒ ｌｏｏｐ）を通じて連結されている構造である。前記ＮＴＤはｗｅｄｇｅ（ＷＥＤ）、ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ（ＲＥＣ）、およびｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ（ＺＦ）ドメインで構成され、前記ＣＴＤはさらに他のＺＦドメインおよびＲｕｖＣドメインで構成される。Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質二量体の構造は大きくＲＥＣローブ（ＲＥＣ ｌｏｂｅ）およびｎｕｃｌｅａｓｅローブ（ＮＵＣ ｌｏｂｅ）に分けることができる。前記ＲＥＣローブは、二量体を構成する一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメイン、およびＲＥＣドメインと；二量体を構成する他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメイン、およびＲＥＣドメインで構成される。前記ｎｕｃｌｅａｓｅローブは、二量体を構成する一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインおよびＴＮＢドメインと；二量体を構成する他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインおよびＴＮＢドメインで構成される。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の各ドメインの全部または一部はそれぞれＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのスキャフォールド領域の特定の部分を認識し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体をなす。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は二つの分子が二量体形態でガイドＲＮＡと結合して複合体をなしていることが明らかになった。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はａｍｉｎｏ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ（ＮＴＤ）およびｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍｉｎ（ＣＴＤ）に分かれ、前記二つのドメインがリンカーループ（ｌｉｎｋｅｒ ｌｏｏｐ）を通じて連結されている構造である。前記ＮＴＤはｗｅｄｇｅ（ＷＥＤ）、ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ（ＲＥＣ）、およびｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ（ＺＦ）ドメインで構成され、前記ＣＴＤはさらに他のＺＦドメインおよびＲｕｖＣドメインで構成される。Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質二量体の構造は大きくＲＥＣローブ（ＲＥＣ ｌｏｂｅ）およびｎｕｃｌｅａｓｅローブ（ＮＵＣ ｌｏｂｅ）に分けることができる。前記ＲＥＣローブは、二量体を構成する一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメイン、およびＲＥＣドメインと；二量体を構成する他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメイン、およびＲＥＣドメインで構成される。前記ｎｕｃｌｅａｓｅローブは、二量体を構成する一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインおよびＴＮＢドメインと；二量体を構成する他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインおよびＴＮＢドメインで構成される。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の各ドメインの全部または一部はそれぞれＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのスキャフォールド領域の特定の部分を認識し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体をなす。
Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの構造
本明細書で、Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは大きく機能的にスペーサー、およびスキャフォールド領域に分けることができる。前記スキャフォールド領域は五つのＳｔｅｍ（Ｓｔｅｍ１～Ｓｔｅｍ５と命名）および一つのｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ（ＰＫ）で構成される。
本明細書で、Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは大きく機能的にスペーサー、およびスキャフォールド領域に分けることができる。前記スキャフォールド領域は五つのＳｔｅｍ（Ｓｔｅｍ１～Ｓｔｅｍ５と命名）および一つのｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ（ＰＫ）で構成される。
通常的に、自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡに分かれ、前記ｃｒＲＮＡはさらにｃｒＲＮＡ反復配列部分およびスペーサーに分けることができることが通常の技術者に広く知られている。前記基準とは別個に、本明細書では前記Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのうちＣａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する部分をあわせてスキャフォールド領域と指称する。前記スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの一部を含む領域であって、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する機能をする。これに対する具体的な説明は以下該当段落で記述する。
前記Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡの一部（ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｔｉ－ｒｅｐｅａｔ）、およびｃｒＲＮＡ反復部分（ｃｒＲＮＡ ｒｅｐｅａｔ）の一部が相補的に結合してデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）をなしている構造を２個含み、これを便宜上ｃｒＲＮＡ ｒｅｐｅａｔ－ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｔｉ－ｒｅｐｅａｔ（Ｒ：ＡＲ）部分と命名する。前記Ｓｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ２）、およびＰＫ（Ｒ：ＡＲ１）はこのようなｃｒＲＮＡ ｒｅｐｅａｔ－ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｔｉ－ｒｅｐｅａｔデュプレックス構造をなしている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、前記Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのうちＳｔｅｍ１部分、Ｓｔｅｍ２のうち一部、およびＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ２）部分は前記Ｃａｓ１２ｆ１二量体と相互作用しない部分であることが明らかになったし、これをｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎという。
背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計
ベクター設計概括
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをゲノム編集に使うために、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成を暗号化するヌクレオチド配列を有するベクターを細胞内に導入させて、細胞内で前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成が発現するようにする方法が広く利用されている。以下、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細胞内で発現するようにするベクターの構成要素について説明する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをゲノム編集に使うために、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成を暗号化するヌクレオチド配列を有するベクターを細胞内に導入させて、細胞内で前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成が発現するようにする方法が広く利用されている。以下、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細胞内で発現するようにするベクターの構成要素について説明する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成要素を暗号化する核酸
前記ベクターの目的はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成要素を細胞内で発現するようにすることであるので、前記ベクターの配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成要素を暗号化する核酸のうち一つ以上を含むことができる。具体的には、前記ベクターの配列は、発現しようとするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに含まれたガイドＲＮＡ、および／またはＣａｓタンパク質を暗号化する核酸を含む。この時、前記ベクターのヌクレオチド配列は野生型のガイドＲＮＡおよび野生型のＣａｓタンパク質を暗号化する核酸だけでなく、その目的によりエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびコドン最適化されたＣａｓタンパク質を暗号化する核酸またはエンジニアリングされたＣａｓタンパク質を暗号化する核酸を含むことができる。この時、前記各構成要素を暗号化する核酸配列はＤＮＡ配列であり得る。
前記ベクターの目的はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成要素を細胞内で発現するようにすることであるので、前記ベクターの配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各構成要素を暗号化する核酸のうち一つ以上を含むことができる。具体的には、前記ベクターの配列は、発現しようとするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに含まれたガイドＲＮＡ、および／またはＣａｓタンパク質を暗号化する核酸を含む。この時、前記ベクターのヌクレオチド配列は野生型のガイドＲＮＡおよび野生型のＣａｓタンパク質を暗号化する核酸だけでなく、その目的によりエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびコドン最適化されたＣａｓタンパク質を暗号化する核酸またはエンジニアリングされたＣａｓタンパク質を暗号化する核酸を含むことができる。この時、前記各構成要素を暗号化する核酸配列はＤＮＡ配列であり得る。
調節／制御要素
前記構成要素を細胞内で発現させるために、前記ベクターは一つ以上の調節／制御要素を含まなければならない。具体的には、前記調節／制御構成要素はプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化信号、コザック共通（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列、内部リボソーム流入部位（ＩＲＥＳ、Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）、スプライスアクセプター、２Ａ配列および／または複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）を含むことができるが、これに制限されるものではない。この時、前記複製起点はｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点、および／またはＢＢＶ複製起点であり得るが、これに制限されるものではない。
前記構成要素を細胞内で発現させるために、前記ベクターは一つ以上の調節／制御要素を含まなければならない。具体的には、前記調節／制御構成要素はプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化信号、コザック共通（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列、内部リボソーム流入部位（ＩＲＥＳ、Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）、スプライスアクセプター、２Ａ配列および／または複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）を含むことができるが、これに制限されるものではない。この時、前記複製起点はｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点、および／またはＢＢＶ複製起点であり得るが、これに制限されるものではない。
プロモーター
前記ベクターの発現対象を細胞内で発現させるには、各構成要素を暗号化する配列にプロモーター配列を作動的に連結させて細胞内で転写因子が活性化され得るようにしなければならない。前記プロモーター配列は対応する転写因子、または発現環境により異なって設計することができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素を細胞内で適切に発現させ得るものであれば制限されない。前記プロモーター配列はＲＮＡ重合酵素（例えば、ＲＮＡ Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、またはＰｏｌ ＩＩＩ）の活性を促進させるプロモーターであり得る。例えば、前記プロモーターはＳＶ４０初期プロモーター、ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）プロモーター、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅプロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ（ＣＭＶＩＥ）のようなｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）プロモーター、ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ｈｕｍａｎ Ｕ６ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒプロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０、４９７－５００（２００２））、ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｕ６プロモーター（ｅ．ｇ．，Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、ｈｕｍａｎ Ｈ１プロモーター（Ｈ１）、および７ＳＫのうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。
前記ベクターの発現対象を細胞内で発現させるには、各構成要素を暗号化する配列にプロモーター配列を作動的に連結させて細胞内で転写因子が活性化され得るようにしなければならない。前記プロモーター配列は対応する転写因子、または発現環境により異なって設計することができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素を細胞内で適切に発現させ得るものであれば制限されない。前記プロモーター配列はＲＮＡ重合酵素（例えば、ＲＮＡ Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、またはＰｏｌ ＩＩＩ）の活性を促進させるプロモーターであり得る。例えば、前記プロモーターはＳＶ４０初期プロモーター、ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）プロモーター、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅプロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ（ＣＭＶＩＥ）のようなｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）プロモーター、ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ｈｕｍａｎ Ｕ６ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒプロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０、４９７－５００（２００２））、ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｕ６プロモーター（ｅ．ｇ．，Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、ｈｕｍａｎ Ｈ１プロモーター（Ｈ１）、および７ＳＫのうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。
終結信号
前記転写因子の転写活動の終結を誘導する配列を終結信号と称する。前記終結信号は、プロモーター配列の種類によって変わり得る。例えば、前記プロモーターがＵ６、またはＨ１プロモーターの場合、前記プロモーターはチミジン連続配列（例えば、ＴＴＴＴＴＴ（Ｔ６）配列）を終結信号に認識する。
前記転写因子の転写活動の終結を誘導する配列を終結信号と称する。前記終結信号は、プロモーター配列の種類によって変わり得る。例えば、前記プロモーターがＵ６、またはＨ１プロモーターの場合、前記プロモーターはチミジン連続配列（例えば、ＴＴＴＴＴＴ（Ｔ６）配列）を終結信号に認識する。
付加発現要素
前記ベクターは野生型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成、および／またはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム以外に、通常の技術者が必要によって発現させようとする付加発現要素を暗号化する核酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記付加発現要素は、「タグ」段落で説明されたタグのうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。例えば、前記付加発現要素は、選別のためのｓｅｌｅｃｔｉｏｎ遺伝子、例えば、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネートアンモニウム（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ ａｍｍｏｎｉｕｍ）またはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
前記ベクターは野生型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成、および／またはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム以外に、通常の技術者が必要によって発現させようとする付加発現要素を暗号化する核酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記付加発現要素は、「タグ」段落で説明されたタグのうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。例えば、前記付加発現要素は、選別のためのｓｅｌｅｃｔｉｏｎ遺伝子、例えば、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネートアンモニウム（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ ａｍｍｏｎｉｕｍ）またはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
発現ベクターの形態
前記発現ベクターは線形、または円形ベクター形態で設計され得る。
前記発現ベクターは線形、または円形ベクター形態で設計され得る。
従来技術の限界点
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは相対的に大きさが小さいのでゲノム編集技術に適用する魅力的なシステムであり、最初に報告された以来（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））、これに対するいくつかの研究が進行されている（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）、ＵＳ ２０２０／０１９０４９４ Ａ１）。しかし、細胞（例えば、真核細胞）内でゲノム編集活性が示されないか、過度に低いためこの活用に妨げとなっている。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは相対的に大きさが小さいのでゲノム編集技術に適用する魅力的なシステムであり、最初に報告された以来（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））、これに対するいくつかの研究が進行されている（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８）、ＵＳ ２０２０／０１９０４９４ Ａ１）。しかし、細胞（例えば、真核細胞）内でゲノム編集活性が示されないか、過度に低いためこの活用に妨げとなっている。
継続された研究により最近の先行文献（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムでＣａｓ１２ｆ１タンパク質が二量体（ｄｉｍｅｒ）を形成するという事実、およびガイドＲＮＡの構造に対して明らかになった。前記先行文献によってガイドＲＮＡ部分のうちＣａｓ１２ｆ１タンパク質と直接的に相互作用しない、いわゆるｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎがあるということが明らかになったし、さらに他の先行文献（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｆ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０））では、前記ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎ部分を除去してｉｎ ｖｉｔｒｏで二本鎖ＤＮＡの切断効率を考察したことがある。しかし、前記先行研究は細胞内ゲノム編集活性（例えば、ｉｎｄｅｌ発生効率）を示したりこれを高める方案に対する研究ではなく、ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを除去した実験はあるが、かえって切断活性が低くなるものと報告している。さらに、前記研究での実験はｉｎ ｖｉｔｒｏで進めた実験であって、細胞内ゲノム編集活性を示したり効率を上げるための変形が何であるかを明らかにするには失敗した。
したがって、依然としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集活性を高めることが重要な課題として残っている。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの特徴
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ概括
本明細書では従来技術の限界点を克服して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集活性を高めるための、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡに新しい構成を追加し、また、その構造の一部を変形したものである。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、３'末端に新しい構成であるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含むことを特徴とする。また、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する役割をするスキャフォールド領域の少なくとも一部が変形されたことを特徴とする。
本明細書では従来技術の限界点を克服して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集活性を高めるための、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡに新しい構成を追加し、また、その構造の一部を変形したものである。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、３'末端に新しい構成であるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含むことを特徴とする。また、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する役割をするスキャフォールド領域の少なくとも一部が変形されたことを特徴とする。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含むことができる。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域とは異なることを特徴とする。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの特徴１－Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含む
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡにＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが追加されたことを特徴とする。前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌは前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの３'末端部分に位置し、ウリジンが豊富に含まれた部分である。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡにＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが追加されたことを特徴とする。前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌは前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの３'末端部分に位置し、ウリジンが豊富に含まれた部分である。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは３'末端部分にウリジンが豊富に含まれたＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含むことができる。一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され得る。この時、前記ＮはＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧのうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、前記ａは１以上５以下であり、ｂは０以上２以下であり、ｃは１以上１０以下であり得る。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの特徴２－スキャフォールド領域（ｓｃａｆｆｏｌｄ ｒｅｇｉｏｎ）のうち一つ以上の部分（ｐａｒｔ）が変形される
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡと比較して、そのスキャフォールド領域の一部が変形されたことを特徴とする。スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの一部を含む領域であって、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する機能をする。前記スキャフォールド領域については以下でさらに詳しく説明するであろう。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡと比較して、そのスキャフォールド領域の一部が変形されたことを特徴とする。スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの一部を含む領域であって、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する機能をする。前記スキャフォールド領域については以下でさらに詳しく説明するであろう。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域を含むことができる。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域が変形されたものである。したがって、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域とは異なる配列を有する。一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域のうち一部の領域が除去されたものであり得る。一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるガイドＲＮＡのスキャフォールド領域に含まれた特定の部分であって、一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの効果
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに使う場合、自然界で発見されるガイドＲＮＡを使う場合に比べて細胞内でゲノム編集活性が劇的に向上する効果が示される。本発明者らは実験を通じて、自然界で発見されるガイドＲＮＡにどのような構成を追加しなければならないか、あるいはそのスキャフォールド領域にどのような変形を加えればゲノム編集効率が向上するかを詳細に明らかにした。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使用すれば、前述した従来技術の限界点を克服して細胞内で高い効率で遺伝子を編集することができる。また、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡと長さが同等であるか、より短い長さを有するので、ゲノム編集技術分野で応用可能性が高い。本出願のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの長所（例えば、大きさが非常に小さいという長所）を十分にゲノム編集技術に活用できるようにする。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに使う場合、自然界で発見されるガイドＲＮＡを使う場合に比べて細胞内でゲノム編集活性が劇的に向上する効果が示される。本発明者らは実験を通じて、自然界で発見されるガイドＲＮＡにどのような構成を追加しなければならないか、あるいはそのスキャフォールド領域にどのような変形を加えればゲノム編集効率が向上するかを詳細に明らかにした。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使用すれば、前述した従来技術の限界点を克服して細胞内で高い効率で遺伝子を編集することができる。また、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、自然界で発見されるガイドＲＮＡと長さが同等であるか、より短い長さを有するので、ゲノム編集技術分野で応用可能性が高い。本出願のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの長所（例えば、大きさが非常に小さいという長所）を十分にゲノム編集技術に活用できるようにする。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの用途
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはＣａｓ１２ｆ１タンパク質と共にゲノム編集および／または遺伝子治療剤の用途で使われ得る。また、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはゲノム編集用組成物を製造するための用途で使うことができる。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはＣａｓ１２ｆ１タンパク質と共にゲノム編集および／または遺伝子治療剤の用途で使われ得る。また、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはゲノム編集用組成物を製造するための用途で使うことができる。
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ概括
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率向上のために導入できるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを提供する。前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのうちｃｒＲＮＡのスペーサーの３'末端に連結されていることを特徴とし、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが使われたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの標的核酸に対する切断効率を上げる役割をする。前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は基本的に一つ以上のウリジンを含む。前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの実際の使用環境および発現環境（例えば、真核細胞または原核細胞内部環境）によりウリジン以外の追加的なヌクレオチドをさらに含むことができる。
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率向上のために導入できるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを提供する。前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのうちｃｒＲＮＡのスペーサーの３'末端に連結されていることを特徴とし、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが使われたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの標的核酸に対する切断効率を上げる役割をする。前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は基本的に一つ以上のウリジンを含む。前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの実際の使用環境および発現環境（例えば、真核細胞または原核細胞内部環境）によりウリジン以外の追加的なヌクレオチドをさらに含むことができる。
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はＰＣＴ／ＫＲ２０２０／０１４９６１出願に開示されたＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列であり得る。以下、本明細書でＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を指称する時、ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／０１４９６１出願に開示された前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列に対する内容および実験結果をすべて含むものと理解すべきであり、前記出願の内容はその全体が参照によって本明細書に含まれる。
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列構造１－ウリジン連続配列
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を設計する上で、Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌはウリジンが一つ以上連続した配列を豊富に含むことができる。本発明者らは実験を通じてＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに導入した場合、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体のゲノム編集効率が向上することを発見した。したがって、本明細書で提供するＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はウリジンが一つ以上連続した配列を含む。
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列を設計する上で、Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌはウリジンが一つ以上連続した配列を豊富に含むことができる。本発明者らは実験を通じてＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに導入した場合、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体のゲノム編集効率が向上することを発見した。したがって、本明細書で提供するＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はウリジンが一つ以上連続した配列を含む。
一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のウリジンが連続した配列を含むことができる。
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列構造２－変形されたウリジン連続配列
本明細書で提供するＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はウリジンが１個～５個反復されるたびに、ウリジンではなく他のリボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ）が少なくとも一つ以上含まれた「変形されたウリジン反復配列」を含むことができる。前記変形されたウリジン連続配列は特にエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを発現するベクターを設計する時に有用である。
本明細書で提供するＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はウリジンが１個～５個反復されるたびに、ウリジンではなく他のリボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ）が少なくとも一つ以上含まれた「変形されたウリジン反復配列」を含むことができる。前記変形されたウリジン連続配列は特にエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを発現するベクターを設計する時に有用である。
一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はＵＶ、ＵＵＶ、ＵＵＵＶ、ＵＵＵＵＶ、および／またはＵＵＵＵＵＶが一つ以上反復した配列を含むことができる。この時、前記Ｖはアデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つである。
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列－具現例
一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され得る。この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つである。この時、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下であり、ｂは０以上である。一具現例として、前記ｂは０以上２以下であり得る。一具現例として、前記ｃは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。一具現例として、前記ｃは直前の文章で選択された二つの数値範囲内の整数であり得る。例えば、前記ｃは１以上６以下であり得る。
一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され得る。この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つである。この時、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下であり、ｂは０以上である。一具現例として、前記ｂは０以上２以下であり得る。一具現例として、前記ｃは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。一具現例として、前記ｃは直前の文章で選択された二つの数値範囲内の整数であり得る。例えば、前記ｃは１以上６以下であり得る。
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列例示
一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＲＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＲＵＵＵＲＵＵＵ－３'（配列番号６４６）、５'－ＵＵＵＵＲＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＲＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵＵ－３'（配列番号６４７）、または５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵＵＵ－３'（配列番号６４８）であり得る。一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＡＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵ－３'（配列番号２５４）、５'－ＵＵＵＵＡＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＡＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵＵ－３'（配列番号２５５）、５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵＵＵ－３'（配列番号２５６）、５'－ＵＵＵＧＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＧＵＵＵＧＵＵＵ－３'（配列番号２５７）、５'－ＵＵＵＵＧＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＧＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵ－３'（配列番号２５８）、または５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵＵ－３'（配列番号２５９）であり得る。
一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＲＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＲＵＵＵＲＵＵＵ－３'（配列番号６４６）、５'－ＵＵＵＵＲＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＲＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵＵ－３'（配列番号６４７）、または５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵＵＵ－３'（配列番号６４８）であり得る。一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＡＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵ－３'（配列番号２５４）、５'－ＵＵＵＵＡＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＡＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵＵ－３'（配列番号２５５）、５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵＵＵ－３'（配列番号２５６）、５'－ＵＵＵＧＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＧＵＵＵＧＵＵＵ－３'（配列番号２５７）、５'－ＵＵＵＵＧＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＧＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵ－３'（配列番号２５８）、または５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵＵ－３'（配列番号２５９）であり得る。
一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＵＵ－３'、５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵＵＵ－３'（配列番号２５６）、または５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵＵ－３'（配列番号２５９）であり得る。一具現例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'であり得る。
用語の説明－Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ部分を指称する用語
Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ部分－概括
自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡに分かれ、前記ｃｒＲＮＡはさらにｃｒＲＮＡ反復配列部分およびスペーサーに分けることができることが通常の技術者に広く知られている。
自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡに分かれ、前記ｃｒＲＮＡはさらにｃｒＲＮＡ反復配列部分およびスペーサーに分けることができることが通常の技術者に広く知られている。
前記基準とは別個に、本明細書では前記Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのうちＣａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用する部分をあわせてスキャフォールド領域と指称する。前記スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの一部を含み、一分子のＲＮＡを指称するものではなくてもよい。図１を参照すると、前記スキャフォールド領域はさらに第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、第５領域、および第６領域に細分化され得る。前記細分化された領域をｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ観点から叙述すると、前記第１領域～第４領域はｔｒａｃｒＲＮＡに含まれ、前記第５領域～前記第６領域はｃｒＲＮＡ、具体的にはｃｒＲＮＡ反復配列部分に含まれる。
以下、叙述される「第ｎ領域」、または「自然界で発見される第ｎ領域」（ｎは１以上６以下の整数）は基本的に自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの各部分を指称する。具体的には、前記「第ｎ領域」は原核細胞内で転写されたガイドＲＮＡの構造、および／または原核細胞システムで実際に作動するガイドＲＮＡ（原核細胞内で転写された形態ではない、活性化した形態）の構造に対応して各領域を指称し得る。エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ内の前記分類基準と対応する領域は一般的に「変形された第ｎ領域」～「エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第ｎ領域」で叙述される。
ただし、エンジニアリングされたスキャフォールド領域に含まれた第ｎ領域であっても、特に変形されないため自然界で発見される第ｎ領域と同一の場合があり得るが、そのときに限って「第ｎ領域」という用語は混用され得る。この時、前記「第ｎ領域」が指称する対象（例えば、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれた領域であるか、自然界で発見されるガイドＲＮＡに含まれた領域であるかどうか）は文脈により適切に解釈されるべきである。
ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ
本明細書で「ｔｒａｃｒＲＮＡ」、「ｃｒＲＮＡ」と記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術分野で通常の技術者が認識できる意味をすべて含む。これは、自然界で発見されるデュアルガイドＲＮＡの各分子を指称する用語で使われるのが一般的であるが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをリンカーに連結したシングルガイドＲＮＡの各該当部分を指称するのにも使われ得る。別途に叙述しない限り、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡとのみ記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを構成するｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを意味する。
本明細書で「ｔｒａｃｒＲＮＡ」、「ｃｒＲＮＡ」と記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術分野で通常の技術者が認識できる意味をすべて含む。これは、自然界で発見されるデュアルガイドＲＮＡの各分子を指称する用語で使われるのが一般的であるが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをリンカーに連結したシングルガイドＲＮＡの各該当部分を指称するのにも使われ得る。別途に叙述しない限り、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡとのみ記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを構成するｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを意味する。
一具現例として、ｔｒａｃｒＲＮＡの配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）または５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（配列番号２）であり得る。一具現例として、前記ｔｒａｃｒＲＮＡは第１領域、第２領域、第３領域、および第４領域を含む。一具現例として、前記ｔｒａｃｒＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、第１領域、第２領域、第３領域、および第４領域が順に連結されたものである。
一具現例として、ｃｒＲＮＡの配列はｃｒＲＮＡ反復配列およびスペーサー配列を含む。この時、前記ｃｒＲＮＡ反復配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）または５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４）であり得る。前記ｃｒＲＮＡ反復配列は第５領域、および第６領域を含む。前記スペーサー配列は標的配列により変わり得、一般的に１０～５０個のヌクレオチドを含む。一具現例として、前記ｃｒＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、第５領域、第６領域、およびスペーサーが順に連結されたものである。
スキャフォールド領域－概括
本明細書で「スキャフォールド領域」と記載する場合、自然界で発見されるガイドＲＮＡ部分のうちスペーサーを除いた残りの部分をあわせて指称する。具体的には、前記スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡの一部を含む。具体的には、前記ｃｒＲＮＡの一部はｃｒＲＮＡ反復配列部分であり得る。前記スキャフォールド領域は一般的にＣａｓタンパク質と相互作用できる部分と知られている。本明細書では前記スキャフォールド領域を第１領域～第６領域に分けて叙述し、各領域については以下でさらに詳しく説明する。
本明細書で「スキャフォールド領域」と記載する場合、自然界で発見されるガイドＲＮＡ部分のうちスペーサーを除いた残りの部分をあわせて指称する。具体的には、前記スキャフォールド領域はｔｒａｃｒＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡの一部を含む。具体的には、前記ｃｒＲＮＡの一部はｃｒＲＮＡ反復配列部分であり得る。前記スキャフォールド領域は一般的にＣａｓタンパク質と相互作用できる部分と知られている。本明細書では前記スキャフォールド領域を第１領域～第６領域に分けて叙述し、各領域については以下でさらに詳しく説明する。
スキャフォールド領域１－第１領域
本明細書で「第１領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端を含む領域を指称する。前記第１領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で「第１領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端を含む領域を指称する。前記第１領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
前記第１領域はＳｔｅｍ１部分（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を含む。前記第１領域は前記Ｓｔｅｍ１部分と隣接した一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。
前記第１領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを含む。
一具現例として、前記第１領域は、配列番号１または２で表現されるｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から１番目のヌクレオチドから１１番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第１領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）であり得る。
スキャフォールド領域２－第２領域
本明細書で「第２領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ内前記第１領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第２領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。この時、前記Ｓｔｅｍ構造は前記第１領域に含まれたＳｔｅｍとは異なるものである。
本明細書で「第２領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ内前記第１領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第２領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。この時、前記Ｓｔｅｍ構造は前記第１領域に含まれたＳｔｅｍとは異なるものである。
前記第２領域はＳｔｅｍ２部分（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を含む。前記第２領域は前記Ｓｔｅｍ２部分と隣接した一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。
前記第２領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメイン、および／または二量体をなす他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。前記第２領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを含む。
一具現例として、前記第２領域は配列番号１または２で表現されるｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から２２番目のヌクレオチドから７２番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第２領域の配列は５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）であり得る。
スキャフォールド領域３－第３領域
本明細書で「第３領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ内前記第２領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第３領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチド、およびｃｒＲＮＡに含まれた一部のヌクレオチドと相補的な結合を形成しているヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で「第３領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ内前記第２領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第３領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でＳｔｅｍ構造を形成するヌクレオチド、およびｃｒＲＮＡに含まれた一部のヌクレオチドと相補的な結合を形成しているヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
前記第３領域はＳｔｅｍ４部分（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））およびＳｔｅｍ３－ＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチド（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を含む。前記第３領域は前記Ｓｔｅｍ４部分および／またはＳｔｅｍ３－ＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドと隣接した一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。
前記第３領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、および／またはＲｕｖＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含む。この時、前記ヌクレオチドはＳｔｅｍ３－ＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドであり得る。
前記第３領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲｕｖＣドメインおよび／または二量体をなす他の一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＲＥＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含む。この時、前記ヌクレオチドはＳｔｅｍ４部分に含まれたヌクレオチドであり得る。
前記第３領域はｃｒＲＮＡの第６領域に含まれた一つ以上のヌクレオチドと相補的に結合する一つ以上のヌクレオチドを含む。
一具現例として、前記第３領域は配列番号１または２で表現されるｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から７３番目のヌクレオチドから１２７番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第３領域の配列は５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）であり得る。
スキャフォールド領域４－第４領域
本明細書で「第４領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡの第３領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第４領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でｃｒＲＮＡに含まれた一部のヌクレオチドと相補的な結合を形成できるヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で「第４領域」と記載する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡの第３領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第４領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内でｃｒＲＮＡに含まれた一部のヌクレオチドと相補的な結合を形成できるヌクレオチドを含み、これと隣接したヌクレオチドを含むことができる。
前記第４領域はＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドを含む（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））。前記第４領域は前記Ｓｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドと隣接した一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。
前記第４領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、および／またはＺＦドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。この時、前記ヌクレオチドはＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）のうちｔｒａｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドであり得る。
前記第４領域はｃｒＲＮＡの第５領域に含まれた一つ以上のヌクレオチドと相補的に結合する一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。前記第４領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを含む。
一具現例として、前記第４領域は配列番号１で表現されるｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から１２８番目のヌクレオチドから１４０番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第４領域は配列番号２で表現されるｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端から１２８番目のヌクレオチドから１６２番目のヌクレオチドまでを意味し得る。
一具現例として、前記第４領域の配列は５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３）または５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＡ－３'（配列番号１４）であり得る。
スキャフォールド領域５－第５領域
本明細書で「第５領域」と記載する場合、ｃｒＲＮＡ ５'末端を含む領域を指称する。前記第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で前記第４領域の一つ以上のヌクレオチドと相補的な結合を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接した任意のヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で「第５領域」と記載する場合、ｃｒＲＮＡ ５'末端を含む領域を指称する。前記第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で前記第４領域の一つ以上のヌクレオチドと相補的な結合を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接した任意のヌクレオチドを含むことができる。
前記第５領域はＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドを含む（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））。前記第５領域は前記Ｓｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドと隣接した一つ以上の任意のヌクレオチドを含むことができる。
前記第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＲＥＣドメインおよび／またはＺＦドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。この時、前記ヌクレオチドはＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）中ｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドであり得る。
前記第５領域は前記第４領域に含まれた一つ以上のヌクレオチドと相補的に結合する一つ以上のヌクレオチドを含むことができる。前記第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎを含む。
一具現例として、前記第５領域は配列番号３で表現されるｃｒＲＮＡの５'末端から１番目のヌクレオチドから１０番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第５領域は配列番号４で表現されるｃｒＲＮＡの５'末端から１番目のヌクレオチドから３０番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第５領域の配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１５）または５'－ＧＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１６）であり得る。
スキャフォールド領域６－第６領域
本明細書で「第６領域」と記載する場合、ｃｒＲＮＡ内前記第５領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第６領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で前記第３領域の一つ以上のヌクレオチドと相補的な結合を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接した任意のヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で「第６領域」と記載する場合、ｃｒＲＮＡ内前記第５領域の３'末端方向に位置した領域を指称する。前記第６領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で前記第３領域の一つ以上のヌクレオチドと相補的な結合を形成するヌクレオチドを含み、これと隣接した任意のヌクレオチドを含むことができる。
前記第６領域はＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドを含む（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））。前記第６領域は前記ＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドと隣接した一つ以上の任意のヌクレオチドを含むことができる。
前記第６領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメインおよび／またはＲｕｖＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含む。この時、前記ヌクレオチドはＳｔｅｍ３－ＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドであり得る。
一具現例として、前記第６領域は配列番号３で表現されるｃｒＲＮＡの５'末端から１１番目のヌクレオチドから１７番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第６領域は配列番号４で表現されるｃｒＲＮＡの５'末端から３１番目のヌクレオチドから３７番目のヌクレオチドまでを意味し得る。一具現例として、前記第６領域の配列は５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'であり得る。
スペーサー
本明細書で「スペーサー」と記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムで標的配列部分と混成化される一つ以上のヌクレオチドを指称する。前記スペーサーは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムでガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡの３'末端付近の１０個～５０個の連続したヌクレオチドを指称する。前記スペーサーはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを使って編集しようとする標的核酸の標的配列に対応して設計される。換言すると、前記スペーサーは標的核酸の標的配列により多様な配列を有することができる。
本明細書で「スペーサー」と記載する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムで標的配列部分と混成化される一つ以上のヌクレオチドを指称する。前記スペーサーは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムでガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡの３'末端付近の１０個～５０個の連続したヌクレオチドを指称する。前記スペーサーはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを使って編集しようとする標的核酸の標的配列に対応して設計される。換言すると、前記スペーサーは標的核酸の標的配列により多様な配列を有することができる。
エンジニアリングされたスキャフォールド領域－概括
エンジニアリングされたスキャフォールド領域概括
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率向上のために導入できるエンジニアリングされたスキャフォールド領域を提供する。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は前述したＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌとシナジーを起こして、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが使われたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率を向上させる。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのスキャフォールド領域（以下、自然界で発見されるスキャフォールド領域）で一ヶ所以上が変形されて、これとは異なる配列および／または構造を有するようになったことが特徴である。
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率向上のために導入できるエンジニアリングされたスキャフォールド領域を提供する。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は前述したＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌとシナジーを起こして、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが使われたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率を向上させる。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのスキャフォールド領域（以下、自然界で発見されるスキャフォールド領域）で一ヶ所以上が変形されて、これとは異なる配列および／または構造を有するようになったことが特徴である。
この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の機能は自然界で発見されるスキャフォールド領域と同一または類似する機能を有する。具体的には、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体のＣａｓ１２ｆ１タンパク質二量体と相互作用する機能を有する。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の各部分に対応する領域を含む。具体的には、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、第５領域、および第６領域を含み、これは自然界で発見されるスキャフォールド領域に含まれた第１領域～第６領域にそれぞれ対応される。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第１領域および／または第２領域に対応する領域を含まなくてもよい。
シングルガイドＲＮＡを作るための変形
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは一分子のシングルガイドＲＮＡであり得る。したがって、本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は各領域のうち一つ以上が変形されたものであり、追加的にｔｒａｃｒＲＮＡ第４領域の３'末端およびｃｒＲＮＡ第５領域の５'末端がリンカーを通じて連結されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは一分子のシングルガイドＲＮＡであり得る。したがって、本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は各領域のうち一つ以上が変形されたものであり、追加的にｔｒａｃｒＲＮＡ第４領域の３'末端およびｃｒＲＮＡ第５領域の５'末端がリンカーを通じて連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるスキャフォールド領域で一ヶ所以上が変形され、前記第４領域の３'末端および前記第５領域の５'末端がリンカーを通じて連結されたものであり得る。例えば、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形
第１領域変形概括
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第１領域が変形されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第１領域が変形されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は「変形された第１領域」を含むことができる。この時、前記変形された第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものである。この時、前記除去されたヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＳｔｅｍ構造を形成する領域から選択されたヌクレオチドである。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域と比較して、自然界で発見される第１領域の一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得、選択的に、前記第１領域他他の部分も変形されたものであり得る。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第１領域のうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＳｔｅｍ構造を形成する部分に含まれたヌクレオチドであり得る。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第１領域のうちＳｔｅｍ１（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））に属するヌクレオチドであり得る。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第１領域のうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＣａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないヌクレオチドであり得る。
一具現例として、前記変形された第１領域は３'末端方向に５'－Ａ－３'配列を含むことを特徴とする。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第１領域が除去されたものであり得る。換言すると、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第１領域と対応する領域を含まなくてもよい。
第１領域変形内容１－一部のヌクレオチド除去
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で５'末端の１個～２０個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で５'末端の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で５'末端で、直前の文章で選択された二つの数値範囲内連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。例えば、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で５'末端の１個～３個の連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第１領域は少なくとも一つのヌクレオチドを含み、これは５'－Ａ－３'であり得る。
第１領域変形内容２－第１領域除去
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第１領域が除去されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第１領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まなくてもよい。
第１領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列例示
一具現例として、前記変形された第１領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）から選択されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第１領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、および５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）から選択されたものであり得る。
一具現例として、第１領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１１９）、５'－ＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２０）、５'－ＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２１）、５'－ＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２２）、５'－ＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２３）、５'－ＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２４）、５'－ＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２５）、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２６）、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２７）、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２８）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２９）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３０）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３１）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３２）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３３）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３４）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３５）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３６）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３７）、および５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３８）からなる群から選択された配列；および
５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）。
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１１９）、５'－ＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２０）、５'－ＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２１）、５'－ＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２２）、５'－ＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２３）、５'－ＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２４）、５'－ＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２５）、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２６）、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２７）、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２８）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１２９）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３０）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３１）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３２）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３３）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３４）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３５）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３６）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３７）、および５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３８）からなる群から選択された配列；および
５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）。
一具現例として、第１領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、および配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、および
配列番号１４が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１６および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、および配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、および
配列番号１４が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１６および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は ５'から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、および配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、および配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
一具現例として、第１領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６８）、５'－ＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６９）、５'－ＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７０）、５'－ＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７１）、５'－ＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７２）、５'－ＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７３）、５'－ＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７４）、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７５）、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７６）、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１７９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８６）、および５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１８７）から選択された配列であり得る。
第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列例示
一具現例として、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１１、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１１、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３７９）；および
配列番号３．
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３７９）；および
配列番号３．
一具現例として、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１１、
配列番号１２、および
配列番号１４が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１６および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１１、
配列番号１２、および
配列番号１４が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１６および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'から３'末端方向に、
配列番号１１、
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１１、
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
一具現例として、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４８７）であり得る。
エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形
第２領域変形概括
本明細書で提供するエンジニアリングトァンガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第２領域が変形されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングトァンガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第２領域が変形されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は「変形された第２領域」を含むことができる。この時、前記変形された第２領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものである。この時、前記除去されたヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＳｔｅｍ構造を形成する領域から選択されたヌクレオチドである。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域と比較して、自然界で発見される第２領域の一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得、選択的に、前記第２領域他他の部分も変形されたものであり得る。一具現例として、前記ヌクレオチドの除去は前記自然界で発見される第２領域のうちＳｔｅｍ構造を形成する部分で起きたものであり、ヌクレオチドが相補的なペア単位で除去されたものであり得る。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第２領域のうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＳｔｅｍ構造を形成する部分に含まれたヌクレオチドであり得る。
一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第２領域のうちＳｔｅｍ２（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））に属するヌクレオチドであり得る。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第２領域のうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＣａｓ１２ｆ１タンパク質と相互作用しないヌクレオチドであり得る。
一具現例として、前記変形された第２領域は３'末端方向に５'－Ｇ－３'配列を有することを特徴とする。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第２領域が除去されたものであり得る。換言すると、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第２領域と対応する領域を含まなくてもよい。
第２領域変形内容１－一部のヌクレオチド除去
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第２領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第２領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第２領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で連続または非連続的に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個または５１個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１１配列基準として、５'末端から１番目～２２番目のヌクレオチド、および／または２７番目～５１番目のヌクレオチドのうち一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１１配列基準として、５'末端から１番目～２２番目のヌクレオチド、および／または２７番目～５１番目のヌクレオチドのうち一つ以上のヌクレオチドが除去され、２３番目～２６番目のヌクレオチドが異なるもので置換されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１１配列基準として、５'末端から１番目～２２番目のヌクレオチドのうち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、または２２個の連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１１配列基準として、５'末端から２７番目～５１番目のヌクレオチドのうち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個の連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第２領域の配列は少なくとも５'－Ｇ－３'を含むことを特徴とする。
第２領域変形内容２－相補的なペア（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｐａｉｒ）単位除去
前記第２領域の変形はＳｔｅｍ構造を形成する部分に含まれた互いに相補的な結合をする一対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
前記第２領域の変形はＳｔｅｍ構造を形成する部分に含まれた互いに相補的な結合をする一対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１１配列基準として、５'末端から１番目～２２番目のヌクレオチド、および２７番目～５０番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１１配列基準として、５'末端から１番目～２２番目のヌクレオチド、および２７番目～５０番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／または相補的なペアをなさない１個以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１１配列基準として、５'末端から１番目～２２番目のヌクレオチド、および２７番目～５０番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／またはミスマッチである１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
第２領域変形内容３－第２領域除去
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第２領域が除去されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第２領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域がないものであり得る。
第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列例示
一具現例として、前記変形された第２領域の配列は５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）からなる群から選択された配列であり得る。
一具現例として、前記変形された第２領域の配列は５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）からなる群から選択された配列であり得る。
一具現例として、第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３８１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＵＵＡＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３８２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＵＵＡＧＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３８３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＵＵＡＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３８４）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３８５）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３８６）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３８７）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３８８）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３８９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３９０）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３９１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３９２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３９３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３９４）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３９５）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３９６）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３９７）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３９８）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３９９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４００）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４０１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４０２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４０３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４０４）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４０５）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４０６）からなる群から選択された配列；および
配列番号３．
配列番号３．
一具現例として、第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１４が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１６および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１４が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１６および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に、配列番号１０、５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、配列番号１２、配列番号１３、リンカー、配列番号１５、および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
一具現例として、第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４０８）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＵＵＡＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４０９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＵＵＡＧＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４１０）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＵＵＡＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４１１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４１２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４１３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４１４）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４１５）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４１６）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４１７）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４１８）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４１９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４２０）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４２１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４２２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４２３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４２４）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４２５）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４２６）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４２７）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４２８）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４２９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４３０）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４３１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４３２）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４３３）からなる群から選択された配列であり得る。
第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列例示
一具現例として、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
一具現例として、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３８０）；および
配列番号３．
５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号３８０）；および
配列番号３．
一具現例として、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１２、
配列番号１４が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１６および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１２、
配列番号１４が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１６および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、リンカー、配列番号１５、および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
一具現例として、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３８０）であり得る。
エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形
第３領域変形概括
本明細書で提供するエンジニアリングトァンガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第３領域が変形されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングトァンガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第３領域が変形されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域を含むことができる。この時、前記変形された第３領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第３領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものである。この時、前記除去されたヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＳｔｅｍ構造を形成する領域から選択されたヌクレオチドである。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第３領域に含まれた一つ以上のヌクレオチドが除去されたものを含むことができる。一具現例として、前記ヌクレオチドの除去は前記自然界で発見される第３領域のうちＳｔｅｍ構造を形成する部分で起きたものであり、ヌクレオチドがベースペア単位で除去されたものであり得る。一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第３領域のうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体でＳｔｅｍ構造を形成する部分に含まれたヌクレオチドであり得る。
一具現例として、前記除去されたヌクレオチドは前記自然界で発見される第３領域のうちＳｔｅｍ４（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））に属するヌクレオチドであり得る。
一具現例として、前記変形された第３領域は５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧ－３'、５'－ＵＵＣＧ－３'、および５'－ＣＵＣＧＡ－３'配列を有することを特徴とする。
第３領域変形内容１－一部のヌクレオチド除去
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第３領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第３領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第３領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第３領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第３領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第３領域で連続的にまたは非連続的に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第３領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第３領域で、配列番号１２配列基準、５'末端から２７番目～３６番目のヌクレオチド、および／または４１番目～５０番目のヌクレオチドのうち少なくとも一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１２配列基準、５'末端から２７番目～３６番目のヌクレオチドのうち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第２領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で、配列番号１２配列基準、５'末端から４１番目～５０番目のヌクレオチドのうち１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の連続したヌクレオチドが除去されたものであり得る。
第３領域変形内容２－相補的なペア単位除去
前記第３領域の変形はＳｔｅｍ構造を形成する部分に含まれた互いに相補的な結合をする一対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
前記第３領域の変形はＳｔｅｍ構造を形成する部分に含まれた互いに相補的な結合をする一対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第３領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第３領域で、配列番号１２配列基準、５'末端から２７番目～３６番目のヌクレオチド、および４１番目～５０番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第３領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第３領域で、配列番号１２配列基準、５'末端から２７番目～３６番目のヌクレオチド、および４１番目～５０番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／または相補的なペアをなさない１個以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第３領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第３領域で、配列番号１２配列基準、５'末端から２７番目～３６番目のヌクレオチド、および４１番目～５０番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／またはミスマッチである１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
第３領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列例示
一具現例として、前記変形された第３領域の配列は５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）からなる群から選択された配列であり得る。
一具現例として、前記変形された第３領域の配列は５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）からなる群から選択された配列であり得る。
一具現例として、第３領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第３領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４４８）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４４９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４５０）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４５１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４５２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４５３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４５４）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４５５）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４５６）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４５７）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４５８）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４５９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号４６０）からなる群から選択された配列；および
配列番号３．
配列番号３．
一具現例として、第３領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１４が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１６および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１４が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１６および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、リンカー、配列番号１５、および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
一具現例として、第３領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４６２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４６３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４６４）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４６５）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４６６）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４６７）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４６８）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４６９）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４７０）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４７１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４７２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４７３）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号４７４）からなる群から選択された配列であり得る。
エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形
第４領域および第５領域変形概括
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第４領域および第５領域が変形されたものであり得る。前記第４領域および第５領域はそれぞれｔｒａｃｒＲＮＡの一部およびｃｒＲＮＡの一部に該当する領域であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で互いに混成化されてＳｔｅｍを構成する部分を含むので、該当部分がともに変形されてエンジニアリングされたスキャフォールド領域を構成することができる。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域で第４領域および第５領域が変形されたものであり得る。前記第４領域および第５領域はそれぞれｔｒａｃｒＲＮＡの一部およびｃｒＲＮＡの一部に該当する領域であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体内で互いに混成化されてＳｔｅｍを構成する部分を含むので、該当部分がともに変形されてエンジニアリングされたスキャフォールド領域を構成することができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第４領域および／または変形された第５領域を含むことができる。
変形された第４領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたことを特徴とする。変形された第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第５領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたことを特徴とする。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第４領域および／または第５領域の一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第４領域は５'末端方向に５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'配列を有する。一具現例として、前記変形された第５領域は３'末端方向に５'－ＧＧＡ－３'配列を有する。
第４領域および第５領域変形内容１－一部のヌクレオチド除去
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第４領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第４領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第５領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第４領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第４領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第５領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第４領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域で連続または非連続的に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個または２８個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第４領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域で、配列番号１３配列基準、５'末端から７番目～１３番目のヌクレオチドのうち一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第４領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域で、配列番号１４配列基準、５'末端から７番目～３４番目のヌクレオチドのうち一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第４領域の配列は少なくとも５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'を含むことを特徴とする。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第５領域で１個～７個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の変形された第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第５領域で連続または非連続的に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個または２７個のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第５領域で、配列番号１５配列基準、５'末端から１番目～７番目のヌクレオチドのうち一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。一具現例として、前記変形された第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第５領域で、配列番号１６配列基準、５'末端から１番目～２７番目のヌクレオチドのうち一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第５領域の配列は少なくとも５'－ＧＧＡ－３'を含むことを特徴とする。
第４領域および第５領域変形内容２－相補的なペア単位除去
前記第４領域および第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２複合体内で互いに相補的に結合してＳｔｅｍをなすものと知られている。前述した第４領域および第５領域の変形はこのようなＳｔｅｍを構成する一つ以上のヌクレオチドを対象とするので、前記第４領域および第５領域の変形はＳｔｅｍを構成するヌクレオチドを相補的なペア単位で除去するものであり得る。
前記第４領域および第５領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２複合体内で互いに相補的に結合してＳｔｅｍをなすものと知られている。前述した第４領域および第５領域の変形はこのようなＳｔｅｍを構成する一つ以上のヌクレオチドを対象とするので、前記第４領域および第５領域の変形はＳｔｅｍを構成するヌクレオチドを相補的なペア単位で除去するものであり得る。
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１３配列基準、７番目～１３番目のヌクレオチドおよび、配列番号１５配列基準、１番目～７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１３配列基準、７番目～１３番目のヌクレオチドおよび、配列番号１５配列基準、１番目～７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／または相補的なペアをなさない１個以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１３配列基準、７番目～１３番目のヌクレオチドおよび、配列番号１５配列基準、１番目～７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／またはミスマッチである１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１４配列基準、７番目～３４番目のヌクレオチドおよび、配列番号１６配列基準、１番目～２７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１４配列基準、７番目～３４番目のヌクレオチドおよび、配列番号１６配列基準、１番目～２７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／または相補的なペアをなさない１個以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第４領域および第５領域は前記自然界で発見されるスキャフォールド領域の第４領域および第５領域で、配列番号１４配列基準、７番目～３４番目のヌクレオチドおよび、配列番号１６配列基準、１番目～２７番目のヌクレオチドのうちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で相補的なペアをなす１対以上のヌクレオチドおよび／またはミスマッチである１対以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。
変形された第４領域および第５領域配列例示
一具現例として、前記変形された第４領域の配列は５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６８）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６９）からなる群から選択されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第４領域の配列は５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６８）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６９）からなる群から選択されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第４領域の配列は５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号７０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵ－３'（配列番号７１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵ－３'（配列番号７２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣ－３'（配列番号７３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣ－３'（配列番号７４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵ－３'（配列番号７５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣ－３'（配列番号７６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵ－３'（配列番号７７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣ－３'（配列番号７８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣ－３'（配列番号７９）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡ－３'（配列番号８０）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡ－３'（配列番号８１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵ－３'（配列番号８２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵ－３'（配列番号８３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣ－３'（配列番号８４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵ－３'（配列番号８５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧ－３'（配列番号８６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣ－３'（配列番号８７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡ－３'（配列番号８８）、５'－ＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣ－３'（配列番号８９）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＵＵＣＣＵＣＵＣＣＡＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡ－３'（配列番号９０）からなる群から選択されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第５領域の配列は５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'から選択されたものであり得る。
一具現例として、前記変形された第５領域の配列は５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９１）、５'－ＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９２）、５'－ＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９３）、５'－ＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９４）、５'－ＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９５）、５'－ＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９６）、５'－ＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９７）、５'－ＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９８）、５'－ＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号９９）、５'－ＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１００）、５'－ＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０１）、５'－ＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０２）、５'－ＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０３）、５'－ＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０４）、５'－ＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０５）、５'－ＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０６）、５'－ＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０７）、５'－ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０８）、５'－ＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１０９）、および５'－ＵＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＵＡＧＡＣＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１０）からなる群から選択されたものであり得る。
一具現例として、第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１５０）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵ－３'（配列番号１５１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'（配列番号１５２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'（配列番号１５３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号１５４）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号１５５）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号１５６）からなる群から選択された配列；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'からなる群から選択された配列。
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'からなる群から選択された配列。
一具現例として、第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～９０からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、配列番号９１～１１０からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～９０からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、配列番号９１～１１０からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
一具現例として、第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２００）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０１）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０２）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０３）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０４）、５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０５）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０６）からなる群から選択されたものであり得る。
エンジニアリングされたスキャフォールド領域５－第６領域変形
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールドで第６領域はＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドを含む領域である。前述したように、前記第６領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメインおよび／またはＲｕｖＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含む。前記エンジニアリングされたスキャフォールドの第６領域は自然界で発見されるスキャフォールドの第６領域と同一であるか、前記第６領域の機能が損傷しない限度内で変形されたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールドで第６領域はＰＫ（Ｒ：ＡＲ－１）部分のうちｃｒＲＮＡに属したヌクレオチドを含む領域である。前述したように、前記第６領域はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で、二量体をなす一つのＣａｓ１２ｆ１タンパク質のＷＥＤドメイン、ＺＦドメインおよび／またはＲｕｖＣドメインと相互作用する一つ以上のヌクレオチドを含む。前記エンジニアリングされたスキャフォールドの第６領域は自然界で発見されるスキャフォールドの第６領域と同一であるか、前記第６領域の機能が損傷しない限度内で変形されたものであり得る。
エンジニアリングされたスキャフォールド領域６－各変形の組み合わせ
各変形の組み合わせ概括
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域に前述した各領域格別変形が一つ以上組み合わせられたものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡに含まれたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域に前述した各領域格別変形が一つ以上組み合わせられたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、および変形された第２領域を含むことができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域を含み、第１領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域を含み、第２領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は第１領域および第２領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、および変形された第３領域を含むことができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域を含み、第１領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、および変形された第４領域および第５領域を含むことができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域および変形された第３領域を含むことができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域を含み、第２領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域および変形された第４領域および第５領域を含むことができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含むことができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域、および変形された第３領域を含むことができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域および変形された第３領域を含み、第１領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域および変形された第３領域を含み、第２領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域を含み、第１領域および第２領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域、および変形された第４領域および第５領域を含むことができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域および変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域および変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域および第２領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第３領域、および変形された第４領域および第５領域を含むことができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域、変形された第３領域、および変形された第４領域および第５領域を含むことができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域、変形された第３領域、および変形された第４領域および第５領域を含むことができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域、変形された第３領域、および変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第３領域、および変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域および第２領域が除去されたものであり得る。
この時、前記変形された領域は前述した各領域の変形段落で説明された通りである。
各変形の組み合わせ１－第１領域変形および第２領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域および変形された第２領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域および変形された第２領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第１領域および第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域および第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１５７）；および
５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）。
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１５７）；および
５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）。
一具現例として、第１領域および第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
一具現例として、第１領域および第２領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０７）であり得る。
各変形の組み合わせ２－第２領域変形および第１領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第２領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'から３'末端方向に、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
各変形の組み合わせ３－第１領域変形および第２領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第１領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
各変形の組み合わせ４－第１領域除去および第２領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は第１領域および第２領域が除去されたものである。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は第１領域および第２領域が除去されたものである。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記第１領域および第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１２、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域および第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'から３'末端方向に、
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１２、
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
各変形の組み合わせ５－第１領域変形および第３領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域および変形された第３領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域および変形された第３領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第１領域および第３領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域および第３領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
各変形の組み合わせ６－第３領域変形および第１領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第３領域が変形されて第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第３領域が変形されて第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は５'末端から３'末端方向に、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
各変形の組み合わせ７－第１領域変形および第４領域および第５領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第１領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１５８）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６１）。
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１５８）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６１）。
一具現例として、第１領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
一具現例として、第１領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０８）であり得る。
各変形の組み合わせ８－第４領域および第５領域変形および第１領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第４領域および第５領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１１、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１１、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第４領域および第５領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
配列番号１１、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１１、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ９－第２領域変形および第３領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域および変形された第３領域を含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域および変形された第３領域を含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第２領域および第３領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域および第３領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
各変形の組み合わせ１０－第３領域変形および第２領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第３領域が変形されて第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第３領域が変形されて第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域は５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１０、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
各変形の組み合わせ１１－第２領域変形および第４領域および第５領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第２領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１５９）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６１）。
５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１５９）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６１）。
一具現例として、第２領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'から３'末端方向に、
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
一具現例として、第２領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２０９）であり得る。
各変形の組み合わせ１２－第４領域および第５領域変形、および第２領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第４領域および第５領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第４領域および第５領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１０、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ１３－第３領域変形、および第４領域および第５領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第３領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第３領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ１４－第１領域変形、第２領域変形、および第３領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域、および変形された第３領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域、および変形された第３領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第１領域、第２領域、および第３領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域、第２領域、および第３領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
各変形の組み合わせ１５－第２領域変形、第３領域変形、および第１領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域、変形された第３領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域、変形された第３領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第２領域、および第３領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域、および第３領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
各変形の組み合わせ１６－第１領域変形、第３領域変形、および第２領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第３領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第３領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第１領域、および第３領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域、および第３領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
各変形の組み合わせ１７－第３領域変形、第１領域除去、および第２領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域を含み、第１領域および第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域を含み、第１領域および第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第３領域が変形され、第１領域および第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる。
５'末端から３'末端方向に、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、配列番号１５および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第３領域が変形され、第１領域および第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
配列番号１３、
リンカー、
配列番号１５、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
この時、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
各変形の組み合わせ１８－第１領域変形、第２領域変形、および第４領域および第５領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第１領域、第２領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域、第２領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１６０）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６１）。
５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡ－３'（配列番号１６０）；および
５'－ＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号１６１）。
一具現例として、第１領域、第２領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
一具現例として、第１領域、第２領域および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号２１０）であり得る。
各変形の組み合わせ１９－第２領域変形、第４領域および第５領域変形、および第１領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域、変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域、変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第２領域、および第４領域および第５領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域、および第４領域および第５領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ２０－第１領域変形、第４領域および第５領域変形、および第２領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第１領域、第４領域および第５領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域、第４領域および第５領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ２１－第４領域および第５領域変形、第１領域除去、および第２領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域および第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域および第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第４領域および第５領域が変形され、第１領域および第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１２、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第４領域および第５領域が変形され、第１領域および第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１２、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ２２－第１領域変形、第３領域変形、および第４領域および第５領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第１領域、第３領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域、第３領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ２３－第３領域変形、第４領域および第５領域変形、および第１領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域、および変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域、および変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第３領域、および第４領域および第５領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第３領域、および第４領域および第５領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１１、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ２４－第２領域変形、第３領域変形、および第４領域および第５領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域、変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域、変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第２領域、第３領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域、第３領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１０、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ２５－第３領域変形、第４領域および第５領域変形、および第２領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域、および変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域、および変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第３領域、および第４領域および第５領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリンなったスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号１０、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第３領域、および第４領域および第５領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリンなったスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
配列番号１０、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号１０、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ２６－第１領域変形、第２領域変形、第３領域変形、および第４領域および第５領域変形
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域、変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第２領域、変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含む。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。
一具現例として、第１領域、第２領域、第３領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域、第２領域、第３領域、および第４領域および第５領域が変形されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ２７－第２領域変形、第３領域変形、第４領域および第５領域変形、および第１領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域、変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第２領域、変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域が除去されたものである。この時、前記変形された第２領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第２領域、第３領域、および第４領域および第５領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第２領域、第３領域、および第４領域および第５領域が変形され、第１領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、および配列番号３４２～３６２からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ２８－第１領域変形、第３領域変形、第４領域および第５領域変形、および第２領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第１領域、変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含み、第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第１領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第１領域、第３領域、および第４領域および第５領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第１領域、第３領域、および第４領域および第５領域が変形され、第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、配列番号１７～２７からなる群から選択された配列、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ２９－第３領域変形、第４領域および第５領域変形、第１領域除去、および第２領域除去
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域および第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は変形された第３領域および変形された第４領域および第５領域を含み、第１領域および第２領域が除去されたものである。この時、前記変形された第３領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記変形された第４領域および第５領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」段落で説明された変形をすべて含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域と対応する領域を含まない。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域と対応する領域を含まない。
一具現例として、第３領域、および第４領域および第５領域が変形され、第１領域および第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は次を含むことができる：
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、配列番号６７～６９からなる群から選択された配列が連結された配列；および
５'末端から３'末端方向に、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'からなる群から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結された配列。
一具現例として、第３領域、および第４領域および第５領域が変形され、第１領域および第２領域が除去されたエンジニアリングされたスキャフォールド配列は５'末端から３'末端方向に、
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
配列番号４３４～４４７からなる群から選択された配列、
配列番号１１１～１１７から選択された配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'が連結されたものであり得る。
各変形の組み合わせ３０－第６領域の追加的な変形
前述したように、第６領域もその機能が損傷しない範囲内で変形され得るので、本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は前述した第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、および／または第５領域の変形～第１領域および／または第２領域の除去の他、第６領域が追加的に変形されたものであり得る。
前述したように、第６領域もその機能が損傷しない範囲内で変形され得るので、本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は前述した第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、および／または第５領域の変形～第１領域および／または第２領域の除去の他、第６領域が追加的に変形されたものであり得る。
エンジニアリングされたスキャフォールド領域７－同一性を有している配列を含む
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」、および「エンジニアリングされたスキャフォールド領域５－各変形の組み合わせ」段落で叙述されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域（以下、前述したエンジニアリングされたスキャフォールド領域）の配列と同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する配列を含む。
本明細書で提供するエンジニアリングされたスキャフォールド領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域１－第１領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域２－第２領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域３－第３領域変形」、「エンジニアリングされたスキャフォールド領域４－第４領域および第５領域変形」、および「エンジニアリングされたスキャフォールド領域５－各変形の組み合わせ」段落で叙述されたエンジニアリングされたスキャフォールド領域（以下、前述したエンジニアリングされたスキャフォールド領域）の配列と同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する配列を含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は、前述したエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列のうちいずれか一つと１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、または５０％の配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、または配列相同性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有する配列であり得る。一具現例として、前記スキャフォールド配列は、前述したエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列のうちいずれか一つと直前の文章で選択された二つの数値範囲内の％で一致する配列であり得る。例えば、前記スキャフォールド配列は前述したエンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列のうちいずれか一つと９０％～１００％一致する配列であり得る。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ概括
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集効率を上げるための、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールドは前述した「エンジニアリングされたスキャフォールド領域」で説明されたことのうちいずれか一つであり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌは「Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ」段落で説明されたことのうちいずれか一つであり得る。
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの細胞内ゲノム編集効率を上げるための、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを提供する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含む。この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールドは前述した「エンジニアリングされたスキャフォールド領域」で説明されたことのうちいずれか一つであり得る。この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌは「Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ」段落で説明されたことのうちいずれか一つであり得る。
シングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡ
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはシングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡであり得る。前記デュアルガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの独立的な二つの分子ＲＮＡで構成されたものを意味する。前記シングルガイドＲＮＡは（エンジニアリングされた）ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端および（エンジニアリングされた）ｃｒＲＮＡの５'末端がリンカーを通じて連結されて一つの分子を形成したものを意味する。換言すると、前記デュアルガイドＲＮＡで、エンジニアリングされたスキャフォールドに含まれた第４領域の３'末端および第５領域の５'末端がリンカーを通じて連結されたものを意味する。この時、エンジニアリングされたスキャフォールドの各領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域」段落で説明された変形、およびその具体的な配列をすべて含むことができる。
前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはシングルガイドＲＮＡまたはデュアルガイドＲＮＡであり得る。前記デュアルガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの独立的な二つの分子ＲＮＡで構成されたものを意味する。前記シングルガイドＲＮＡは（エンジニアリングされた）ｔｒａｃｒＲＮＡの３'末端および（エンジニアリングされた）ｃｒＲＮＡの５'末端がリンカーを通じて連結されて一つの分子を形成したものを意味する。換言すると、前記デュアルガイドＲＮＡで、エンジニアリングされたスキャフォールドに含まれた第４領域の３'末端および第５領域の５'末端がリンカーを通じて連結されたものを意味する。この時、エンジニアリングされたスキャフォールドの各領域は「エンジニアリングされたスキャフォールド領域」段落で説明された変形、およびその具体的な配列をすべて含むことができる。
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ例示１
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列はウリジン連続配列、または変形されたウリジン連続配列を含むことができる。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のウリジンが連続した配列を含むことができる。さらに他の例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はＵＶ、ＵＵＶ、ＵＵＵＶ、ＵＵＵＵＶ、および／またはＵＵＵＵＵＶが一つ以上反復した配列を含むことができる。この時、前記Ｖはアデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つである。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は５'末端から３'末端方向に、自然界で発見されるスキャフォールド領域と対応する第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、リンカー、第５領域、第６領域が順に連結されたものであり、自然界で発見されるスキャフォールド領域と比較して第１領域、第２領域、第４領域、および第５領域から選択された一つ以上の領域が変形されたものである。
一例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第１領域が変形された場合、前記変形された第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。この時、前記除去されたヌクレオチドは前記第１領域のうちＳｔｅｍ１（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））に属するヌクレオチドであり得る。この時、前記変形された第１領域の配列は５'－Ａ－３'を含むことを特徴とする。
さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第２領域が変形された場合、前記変形された第２領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。この時、前記ヌクレオチドの除去は前記第２領域のうちＳｔｅｍ２構造（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を形成する部分で起きたものであり、互いに相補的なペアをなすヌクレオチドがペア単位で除去されたものであり得る。この時、前記変形された第２領域の配列は少なくとも５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡ－３'（配列番号５１）および５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号５２）を含むことを特徴とする。さらに具体的には、前記変形された第２領域の配列は５'末端から３'末端方向に５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡ－３'（配列番号５１）および５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号５２）が順に連結されていてもよく、適切な中間配列を通じて連結されていてもよい。一例として、前記中間配列は５'－ＵＵＡＧ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＵ－３'、５'－ＡＡＵＵＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵ－３'（配列番号５８）、５'－ＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５９）、５'－ＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６０）、５'－ＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６１）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６２）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６３）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６４）、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６５）、および５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号６６）からなる群から選択されたものであり得る。
さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第４領域および第５領域が変形された場合、前記変形された第４領域および第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第４領域および／または第５領域の一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。この時、前記ヌクレオチドの除去は前記第４領域および第５領域のうちＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）構造（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を形成する部分で起きたものであり、互いに相補的なペアをなすヌクレオチドがペア単位で除去されたものであり得る。この時、前記変形された第４領域の配列は少なくとも５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'を含むことを特徴とする。この時、前記変形された第５領域の配列は少なくとも５'－ＧＧＡ－３'を含むことを特徴とする。
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ例示２
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され得る。この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１～１０である。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'であり得る。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵ－３'であり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＵＡＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号５０）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'、
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'、
この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とする。
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ例示３
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され得る。この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つである。この時、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１～１０である。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'であり得る。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵ－３'であり得る。
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され得る。この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つである。この時、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１～１０である。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'であり得る。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵ－３'であり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'で表現される第１配列；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡ－３'（配列番号５１）で表現される第２配列；
５'－ＵＵＡＧ－３'で表現される第３配列；
５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号５２）で表現される第４配列；
５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）で表現される第５配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第６配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第７配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第８配列。
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡ－３'（配列番号５１）で表現される第２配列；
５'－ＵＵＡＧ－３'で表現される第３配列；
５'－ＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧ－３'（配列番号５２）で表現される第４配列；
５'－ＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）で表現される第５配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第６配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第７配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第８配列。
一例として、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
さらに他の例として、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＧＡＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡ－３'（配列番号６４２）、５'－ＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４３）、５'－ＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４４）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４５）からなる群から選択されたものであり得る。
前記具現例の一具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＧＡ－３'、５'－ＡＧＡ－３'、５'－ＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号２９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡ－３'（配列番号３８）からなる群から選択された第９配列を追加的に含むことができる。この時、前記第９配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されていてもよい。
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５３）、および５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５４）からなる群から選択された第１０配列を追加的に含むことができる。この時、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されていてもよい。
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＣＵ－３'、５'－ＡＣＵ－３'、５'－ＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）、５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）、および５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５７）からなる群から選択された第１１配列を追加的に含むことができる。この時、前記第３配列の３'末端および前記第４配列の５'末端は前記第１１配列を通じて連結されていてもよい。
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５３）、および５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５４）からなる群から選択された第１０配列および５'－Ｕ－３'、５'－ＣＵ－３'、５'－ＡＣＵ－３'、５'－ＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'、５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）、５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）、および５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５７）からなる群から選択された第１１配列を追加的に含むことができる。この時、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されており、前記第３配列の３'末端および前記第４配列の５'末端は前記第１１配列を通じて連結されていてもよい。
一例として、前記第１０配列が５'－Ａ－３'の場合、前記第１１配列は５'－Ｕ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡ－３'の場合、前記第１１配列は５'－ＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡ－３'の場合、前記第１１配列は５'－ＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧ－３'の場合、前記第１１配列は５'－ＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣ－３'の場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵ－３'の場合、前記第１１配列は５'－ＡＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧ－３'の場合、前記第１１配列は５'－ＵＡＧＡＡＣＵ－３'または５'－ＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵ－３'の場合、前記第１１配列は５'－ＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣ－３'の場合、前記第１１配列は５'－ＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５５）であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣ－３'（配列番号５３）の場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５６）であり得る。さらに他の例として、前記第１０配列が５'－ＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣ－３'（配列番号５４）の場合、前記第１１配列は５'－ＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵ－３'（配列番号５７）であり得る。
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１２配列を追加的に含むことができる。この時、前記第６配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１２配列を通じて連結されていてもよい。
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１３配列を追加的に含むことができる。この時、前記リンカーの３'末端および前記第７配列の５'末端は前記第１３配列を通じて連結されていてもよい。
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１２配列、および５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１３配列を追加的に含むことができる。この時、前記第６配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１２配列を通じて連結され、前記リンカーの３'末端および前記第７配列の５'末端は前記第１３配列を通じて連結されていてもよい。
一例として、前記第１２配列が５'－Ｕ－３'の場合、前記第１３配列は５'－Ａ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵ－３'の場合、前記第１３配列は５'－ＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣ－３'の場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡ－３'の場合、前記第１３配列は５'－ＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵ－３'の場合、前記第１３配列は５'－ＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'の場合、前記第１３配列は５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１２配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'の場合、前記第１３配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ例示４
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列はウリジン連続配列、または変形されたウリジン連続配列であり得る。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列は１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のウリジンが連続した配列を含むことができる。さらに他の例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ配列はＵＶ、ＵＵＶ、ＵＵＵＶ、ＵＵＵＵＶ、および／またはＵＵＵＵＵＶが一つ以上反復した配列を含むことができる。この時、前記Ｖはアデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つである。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は５'末端から３'末端方向に、自然界で発見されるスキャフォールド領域と対応する第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、リンカー、第５領域、第６領域が順に連結されたものであり、自然界で発見されるスキャフォールド領域と比較して第１領域、第２領域、第３領域、第４領域、および第５領域から選択された一つ以上の領域が変形されたものであり得る。ひいては、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は自然界で発見されるスキャフォールド領域と対応する第１領域および／または第２領域が除去されたものであり得る。
一例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第１領域が変形された場合、前記変形された第１領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第１領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。この時、前記除去されたヌクレオチドは前記第１領域のうちＳｔｅｍ１（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））に属するヌクレオチドであり得る。この時、前記変形された第１領域の配列は５'－Ａ－３'を含むことを特徴とする。
さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第２領域が変形された場合、前記変形された第２領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第２領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。この時、前記ヌクレオチドの除去は前記第２領域のうちＳｔｅｍ２構造（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を形成する部分で起きたものであり、互いに相補的なペアをなすヌクレオチドがペア単位で除去されたものであり得る。この時、前記変形された第２領域の配列は少なくとも５'－Ｇ－３'を含むことを特徴とする。
さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第３領域が変形された場合、前記変形された第３領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域の第３領域で一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。この時、前記ヌクレオチドの除去は前記第３領域のうちＳｔｅｍ４構造（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を形成する部分で起きたものであり、互いに相補的なペアをなすヌクレオチドがペア単位で除去されたものであり得る。この時、前記変形された第３領域の配列は少なくとも５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧ－３'（配列番号４７５）、および５'－ＣＵＣＧＡ－３'を含むことを特徴とする。さらに具体的には、前記変形された第３領域の配列は５'末端から３'末端方向に５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧ－３'（配列番号４７５）および５'－ＣＵＣＧＡ－３'が順に連結されていてもよく、適切な中間配列を通じて連結されていてもよい。一例として、前記中間配列は５'－ＵＵＣＧ－３'、５'－ＡＵＵＣＧＣ－３'、５'－ＡＡＵＵＣＧＣ－３'、５'－ＡＡＵＵＣＧＣＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＵＣＧＣＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣ－３'（配列番号４７６）、５'－ＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣ－３'（配列番号４７７）、５'－ＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４７８）、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４７９）、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８０）、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８１）、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８２）、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８３）、および５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８４）からなる群から選択されたものであり得る。
さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の第４領域および第５領域が変形された場合、前記変形された第４領域および第５領域は、自然界で発見されるスキャフォールド領域のうち第４領域および／または第５領域の一つ以上のヌクレオチドが除去されたものであり得る。この時、前記ヌクレオチドの除去は前記第４領域および第５領域のうちＳｔｅｍ５（Ｒ：ＡＲ－２）構造（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｔｙｐｅ Ｖ－Ｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ８１、１－１３（２０２１））を形成する部分で起きたものであり、互いに相補的なペアをなすヌクレオチドがペア単位で除去されたものであり得る。この時、前記変形された第４領域の配列は少なくとも５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'を含むことを特徴とする。この時、前記変形された第５領域の配列は少なくとも５'－ＧＧＡ－３'を含むことを特徴とする。
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ例示５
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され得る。この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは０～１０である。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'であり得る。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵ－３'であり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'、
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'、
この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とする。
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ例示６
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されたものであり得る。
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され得る。この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つである。この時、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、ｃは１～１０である。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'であり得る。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵ－３'であり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧ－３'（配列番号４７５）で表現される第１配列；
５'－ＵＵＣＧ－３'で表現される第２配列；
５'－ＣＵＣＧＡ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第４配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第５配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列。
５'－ＵＵＣＧ－３'で表現される第２配列；
５'－ＣＵＣＧＡ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'で表現される第４配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第５配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列。
一例として、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であり得る。
さらに他の例として、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＧＡＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡ－３'（配列番号６４２）、５'－ＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４３）、５'－ＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４４）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４５）からなる群から選択されたものであり得る。
前記具現例の一具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第７配列を追加的に含むことができる。この時、前記第７配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されていてもよい。
前記具現例の一具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第８配列を追加的に含むことができる。この時、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されていてもよい。
前記具現例の一具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第７配列を追加的に含み、５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第８配列を追加的に含むことができる。この時、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されており、前記第７配列の３'末端は前記第８配列の５'末端と連結されていてもよい。
前記具現例の一具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＧＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）からなる群から選択された第９配列を追加的に含むことができる。この時、前記第１配列の３'末端および前記第２配列の５'末端は前記第９配列を通じて連結されていてもよい。
前記具現例の一具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｃ－３'、５'－ＣＣ－３'、５'－ＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＣＣ－３'、５'－ＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）からなる群から選択された第１０配列を追加的に含むことができる。この時、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されていてもよい。
前記具現例の一具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＧＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）からなる群から選択された第９配列を追加的に含み、５'－Ｃ－３'、５'－ＣＣ－３'、５'－ＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＣＣ－３'、５'－ＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）からなる群から選択された第１０配列を追加的に含むことができる。この時、前記第１配列の３'末端および前記第２配列の５'末端は前記第９配列を通じて連結されており、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されていてもよい。
一例として、前記第９配列が５'－Ａ－３'の場合、前記第１０配列は５'－Ｃ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第９配列が５'－ＡＡ－３'の場合、前記第１０配列は５'－Ｃ－３'、または５'－ＣＣ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第９配列が５'－ＡＡＧ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＣＣ－３'、または５'－ＡＣＣ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第９配列が５'－ＡＡＧＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＣＣ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＵＡＡＣＣ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＧＵＡＡＣＣ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＣ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＧＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）の場合、前記第１０配列は５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）であり得る。
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１１配列を追加的に含むことができる。この時、前記第４配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１１配列を通じて連結されていてもよい。
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１２配列を追加的に含むことができる。この時、前記リンカーの３'末端および前記第５配列の５'末端は前記第１２配列を通じて連結されていてもよい。
前記具現例のさらに他の具体例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１１配列、および５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１２配列を追加的に含むことができる。この時、前記第４配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１１配列を通じて連結され、前記リンカーの３'末端および前記第５配列の５'末端は前記第１２配列を通じて連結されていてもよい。
一例として、前記第１１配列が５'－Ｕ－３'の場合、前記第１２配列は５'－Ａ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１１配列が５'－ＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１１配列が５'－ＵＵＣ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。さらに他の例として、前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'であり得る。
エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡ配列例示
一具現例として、前記エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡは配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１から選択された配列を有することができる。
一具現例として、前記エンジニアリングされたシングルガイドＲＮＡは配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１から選択された配列を有することができる。
エンジニアリングされたデュアルガイドＲＮＡ例示
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含む。
一具現例として、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含む。
前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有し、標的配列と相補的な配列を有する。
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され得る。この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つである。この時、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上である。
一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'であり得る。
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は次の配列を含む：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第１配列、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第１配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第２配列、
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された第３配列、
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６９）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３）からなる群から選択された第４配列が連結されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１５）からなる群から選択された第５配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１５）からなる群から選択された第５配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分の３'末端は前記スペーサーの５'末端と連結されている。
この時、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と異なり、および／または前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と異なる。
一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は配列番号１と同一であり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は配列番号３と異なり得る。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は配列番号１と異なり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は配列番号３と同一であり得る。さらに他の一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は配列番号１と異なり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分は配列番号３と異なり得る。
一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は前記第１配列および／または第２配列を含まなくてもよい。
具体的には、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列は次からなる群から選択されたものであり得る：
５'末端から３'末端方向に、前記第２配列、前記第３配列、および前記第４配列が連結された配列、
５'末端から３'末端方向に、前記第１配列、前記第３配列、および前記第４配列が連結された配列、および
５'末端から３'末端方向に、前記第３配列、および前記第４配列が連結された配列。
５'末端から３'末端方向に、前記第１配列、前記第３配列、および前記第４配列が連結された配列、および
５'末端から３'末端方向に、前記第３配列、および前記第４配列が連結された配列。
一例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡが５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'を含む場合、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡは５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'を含むことができる。
エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体概括
本明細書ではエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を提供する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む。この時、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものである。
本明細書ではエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を提供する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む。この時、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものである。
一具現例として、本明細書ではＣａｓ１２ｆ１タンパク質およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む、標的配列を含む核酸を編集できるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を提供する。この時、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたもののうちいずれか一つであり得る。
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－概括
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質が含まれる。基本的に、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質に対してヒトコドン－最適化されたＣａｓ１２ｆ１配列であり得る。また、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することができる。しかし、特に限定しない限り、本明細書で「Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質」とする時、これは野生型、またはコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質だけでなく、変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質も包括して意味し得る。また、自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することだけでなく、前記機能の全部または一部が変形されたもの、前記機能の全部または一部が喪失されたもの、および／または追加的な機能が付加されたものをあわせて指称し得る。Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の意味は文脈により適切に解釈され得、特別な場合でない限り、最も広い意味で解釈される。以下、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の構成、または機能について詳しく説明する。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質が含まれる。基本的に、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質であり得る。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質に対してヒトコドン－最適化されたＣａｓ１２ｆ１配列であり得る。また、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することができる。しかし、特に限定しない限り、本明細書で「Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質」とする時、これは野生型、またはコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質だけでなく、変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質も包括して意味し得る。また、自然界に存在する野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することだけでなく、前記機能の全部または一部が変形されたもの、前記機能の全部または一部が喪失されたもの、および／または追加的な機能が付加されたものをあわせて指称し得る。Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の意味は文脈により適切に解釈され得、特別な場合でない限り、最も広い意味で解釈される。以下、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の構成、または機能について詳しく説明する。
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質であり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１４ファミリー（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））から由来したものであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｒｃｈａｅｏｎ由来のＣａｓ１４ａタンパク質（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ＤＮＡ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１４ ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６２、８３９－８４２（２０１８））であり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１４ａ１タンパク質であり得る。
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体は変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。前記変形されたＣａｓ１２ｆ１は野生型、またはコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質の配列で少なくとも一部の配列が変形されたものを意味する。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の変形は個別のアミノ酸単位からなったものであり得、タンパク質の機能的ドメイン単位からなるものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体は変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を含むことができる。前記変形されたＣａｓ１２ｆ１は野生型、またはコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質の配列で少なくとも一部の配列が変形されたものを意味する。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質の変形は個別のアミノ酸単位からなったものであり得、タンパク質の機能的ドメイン単位からなるものであり得る。
一具現例として、前記タンパク質の変形は野生型、またはコドン最適化されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質の配列で一つ以上のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および／またはドメインが個別的に置換、除去、および／または付加されたものであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質に含まれたＲｕｖＣドメイン内一つ以上のアミノ酸、ペプチド、および／またはポリペプチドが置換、除去、および／または付加されたものであり得る。
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質を含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質は野生型、または変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質に追加的なアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および／またはドメインが融合されたタンパク質を意味する。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質を含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１融合タンパク質は野生型、または変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質に追加的なアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および／またはドメインが融合されたタンパク質を意味する。
一具現例として、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質にベースエディター、および／または逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）が融合されたものであり得る。一具現例として、前記ベースエディターはａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ、および／またはｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅであり得る。一具現例として、前記逆転写酵素はＭｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（Ｍ－ＭＬＶ）逆転写酵素、および／またはその変異体であり得る。この時、前記逆転写酵素が融合されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質はプライムエディターとして機能することができる。
一具現例として、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質に、細胞内の遺伝子発現過程に関与できる多様な酵素が融合されたものであり得る。この時、前記酵素が融合されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は細胞内遺伝子の発現に多様な量的、質的変化を招き得る。一具現例として、前記酵素はＶＰ６４、ＤＮＭＴ、ＴＥＴ、ＫＲＡＢ、ＤＨＡＣ、ＬＳＤ、および／またはｐ３００であり得る。
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－機能の変更
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体に含まれたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することができる。本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体に含まれたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質と比較する時、機能が変更されたものであり得る。具体的には、前記変更は全部または一部の機能の変形、全部または一部の機能の喪失、および／または付加的な機能の追加であり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は当業界の通常の技術者がＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質に適用できる変更であれば、特に制限されない。この時、前記変更は公知の技術を利用したものであり得る。
本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体に含まれたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の機能を有することができる。本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体に含まれたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質と比較する時、機能が変更されたものであり得る。具体的には、前記変更は全部または一部の機能の変形、全部または一部の機能の喪失、および／または付加的な機能の追加であり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は当業界の通常の技術者がＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓタンパク質に適用できる変更であれば、特に制限されない。この時、前記変更は公知の技術を利用したものであり得る。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断するように変更されたものであり得る。ひいては、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断することができ、切断しない鎖に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）またはプライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）ができるように変更されたものであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖全部を切断できないように変更されたものであり得る。ひいては、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖全部を切断することができず、標的核酸に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、プライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、または遺伝子発現調節機能ができるように変更されたものであり得る。
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－その他変形例示
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、またはＮＥＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｐｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことができる。具体的には、前記ＮＬＳは「用語の定義」のうちＮＬＳ段落に例示されたもののうちいずれか一つであり得るが、これに制限されるものではない。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はタグを含むことができる。具体的には、前記タグは「用語の定義」のうちタグ段落に例示されたもののうちいずれか一つであり得るが、これに制限されるものではない。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はＮＬＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、またはＮＥＳ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｐｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことができる。具体的には、前記ＮＬＳは「用語の定義」のうちＮＬＳ段落に例示されたもののうちいずれか一つであり得るが、これに制限されるものではない。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質はタグを含むことができる。具体的には、前記タグは「用語の定義」のうちタグ段落に例示されたもののうちいずれか一つであり得るが、これに制限されるものではない。
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－ＰＡＭ配列
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子、または標的核酸を切断するためには二つの条件が必要である。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子、または標的核酸を切断するためには二つの条件が必要である。
第１に、標的遺伝子、または標的核酸内にＣａｓ１２ｆ１タンパク質が認識できる一定の長さの塩基配列（ヌクレオチド配列）がなければならない。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質によって認識される一定の長さの塩基配列（ヌクレオチド配列）をＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）配列という。前記ＰＡＭ配列は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質により定められる固有の配列である。第２に、前記一定の長さのＰＡＭ配列周辺にガイドＲＮＡに含まれたスペーサー配列と相補的に結合できる配列がなければならない。
このような二つの条件が満足されて、１）Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質が前記一定の長さのＰＡＭ配列を認識し、２）前記スペーサー配列部分が前記ＰＡＭ配列周辺の配列部分と相補的に結合する場合、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質／ガイドＲＮＡ複合体（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体）は標的遺伝子、または標的核酸を切断する。したがって、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の標的配列を決定する時、前記ＰＡＭ配列と隣接した配列内で前記標的配列を決定しなければならないという制約が伴う。
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－ＰＡＭ配列例示
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列はＴ－ｒｉｃｈ配列であり得る。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列はＴ－ｒｉｃｈ配列であり得る。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＨＴＮであり得る。この時、前記Ｎはデオキシチミジン（Ｔ）、デオキシアデノシン（Ａ）、デオキシシチジン（Ｃ）、またはデオキシグアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記Ｈはデオキシチミジン（Ｔ）、デオキシアデノシン（Ａ）、およびデオキシシチジン（Ｃ）のうち一つである。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＴＴＮであり得る。この時、前記Ｎはデオキシチミジン（Ｔ）、デオキシアデノシン（Ａ）、デオキシシチジン（Ｃ）、またはデオキシグアノシン（Ｇ）のうち一つである。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＴＴＡ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＣ、またはＴＴＴＧであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＡＴＡ、ＴＡＴＴ、ＴＡＴＣ、またはＴＡＴＧであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＣＴＡ、ＴＣＴＴ、ＴＣＴＣ、またはＴＣＴＧであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は５'末端から３'末端の順で、ＴＴＴＡまたはＴＴＴＧであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は野生型Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のＰＡＭ配列とは異なるものであり得る。
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質－配列例示
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は配列番号２６０～２６７からなる群から選択されたアミノ酸配列を有することができる。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は配列番号２６０～２６７からなる群から選択されたアミノ酸配列を有することができる。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列はヒトコドン－最適化された配列であり得る。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するＤＮＡ配列は配列番号２６８～２７７からなる群から選択されたＤＮＡ配列であり得る。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ
本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を構成するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものと同一の特徴および構造を有する。
本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を構成するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものと同一の特徴および構造を有する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体－構成例示
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は配列番号２６０のアミノ酸配列を有し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが結合してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体をなしていてもよい。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は配列番号２６０のアミノ酸配列を有し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが結合してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体をなしていてもよい。
一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は配列番号２６４～２６７からなる群から選択されたアミノ酸配列を有し、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１からなる群から選択された配列を有する。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡが結合してなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体はベースエディティング機能を有することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現させるためのベクター
ベクター概括
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素を発現させるためのベクターを提供する。前記ベクターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現させるように構成される。前記ベクターの配列は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素のうち一つを暗号化する核酸配列を含むか、二以上の構成要素を暗号化する核酸配列を含むことができる。前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む。前記ベクターの配列は一つ以上のプロモーター配列を含む。前記プロモーターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列と作動的に連結され、細胞内で前記核酸配列の転写が促進されるようにする。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質と同一の特徴および構成を有する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと同一の特徴および構成を有する。
本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素を発現させるためのベクターを提供する。前記ベクターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現させるように構成される。前記ベクターの配列は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素のうち一つを暗号化する核酸配列を含むか、二以上の構成要素を暗号化する核酸配列を含むことができる。前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む。前記ベクターの配列は一つ以上のプロモーター配列を含む。前記プロモーターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列と作動的に連結され、細胞内で前記核酸配列の転写が促進されるようにする。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質と同一の特徴および構成を有する。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと同一の特徴および構成を有する。
前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含むことができる。一具現例として、前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列、およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列を含むことができる。前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を細胞内で発現させるためのプロモーター配列、およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を細胞内で発現させるためのプロモーター配列を含み、前記プロモーターは各発現対象と作動的に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）されている。一具現例として、前記ベクターの配列は前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列、および前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列を含むことができる。
前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列および二以上の互いに異なるエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含むことができる。一具現例として、前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列、第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第３配列を含むことができる。ひいては、前記ベクターの配列は前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列、前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、前記第３配列と作動可能に連結された第３プロモーター配列を含むことができる。
前記ベクターで、各構成要素を暗号化する核酸配列はＤＮＡ配列であり得る。
発現対象－Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質
前記ベクターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を発現するように構成されたものであり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたものと同一の構成および特徴を有する。
前記ベクターはＣａｓ１２ｆ１タンパク質を発現するように構成されたものであり得る。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたものと同一の構成および特徴を有する。
一具現例として、前記ベクターは野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質を発現するように構成されたものであり得る。この時、前記野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１４ａ１であり得る。一具現例として、前記ベクターは標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断するように変更されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を発現するように構成されたものであり得る。ひいては、前記変更されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断することができ、切断しない鎖に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）またはプライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）ができるように変更されたものであり得る。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖全部を切断できないように変更されたものであり得る。ひいては、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖全部を切断することができず、標的核酸に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、プライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、または遺伝子発現調節機能ができるように変更されたものであり得る。
発現対象－エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ
前記ベクターはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現するように構成されたものであり得る。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明したエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと同一の特徴および構成を有する。前記ベクターは二以上の互いに異なるエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現するように構成されたものであり得る。
前記ベクターはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現するように構成されたものであり得る。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明したエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと同一の特徴および構成を有する。前記ベクターは二以上の互いに異なるエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現するように構成されたものであり得る。
発現対象－付加構成要素
前記ベクターは前述した発現対象他、ＮＬＳ、タグタンパク質などの付加構成要素を発現するように構成されたものであり得る。一具現例として、前記付加構成要素は前記Ｃａｓ１２ｆ１、変形されたＣａｓ１２ｆ１、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡとは独立的に発現することができる。さらに他の具現例として、前記付加構成要素は前記Ｃａｓ１２ｆ１、変形されたＣａｓ１２ｆ１、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと連結されて発現することができる。この時、前記付加構成要素はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを発現させようとする時に一般的に発現させる構成要素であり得、公知技術を参照することができる。前記付加構成要素は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションで説明された構成要素のうち一つ以上であり得る。
前記ベクターは前述した発現対象他、ＮＬＳ、タグタンパク質などの付加構成要素を発現するように構成されたものであり得る。一具現例として、前記付加構成要素は前記Ｃａｓ１２ｆ１、変形されたＣａｓ１２ｆ１、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡとは独立的に発現することができる。さらに他の具現例として、前記付加構成要素は前記Ｃａｓ１２ｆ１、変形されたＣａｓ１２ｆ１、および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡと連結されて発現することができる。この時、前記付加構成要素はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを発現させようとする時に一般的に発現させる構成要素であり得、公知技術を参照することができる。前記付加構成要素は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションで説明された構成要素のうち一つ以上であり得る。
ベクター構成－Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質発現配列
前記ベクター配列は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたものと同一の構成および特徴を有する。
前記ベクター配列は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で説明されたものと同一の構成および特徴を有する。
一具現例として、前記ベクターの配列は野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列を含むことができる。この時、前記野生型のＣａｓ１２ｆ１タンパク質はＣａｓ１４ａ１であり得る。一具現例として、前記ベクターの配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するヒトコドン最適化された核酸配列を含むことができる。この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するヒトコドン最適化された核酸配列はＣａｓ１４ａ１タンパク質を暗号化するヒトコドン最適化された核酸配列であり得る。一具現例として、前記ベクターの配列は変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはＣａｓ１２ｆ１融合タンパク質を暗号化する配列を含むことができる。一具現例として、前記ベクターの配列は標的核酸の二本鎖のうち一つの鎖のみ切断することができ、切断しない鎖に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）またはプライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）ができるように変更されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列を含むことができる。一具現例として、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は標的核酸の二本鎖全部を切断することができず、標的核酸に対してベースエディティング（Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、プライムエディティング（Ｐｒｉｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）、または遺伝子発現調節機能ができるように変更されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列を含むことができる。
ベクター構成－エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ発現配列
一具現例として、前記ベクターの配列はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列を含むことができる。例えば、前記ベクターの配列は配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１からなる群から選択された配列を含むことができる。
一具現例として、前記ベクターの配列はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列を含むことができる。例えば、前記ベクターの配列は配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１からなる群から選択された配列を含むことができる。
一具現例として、前記ベクターの配列は二以上の互いに異なるエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列を含むことができる。例えば、前記ベクターの配列は配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１からなる群からそれぞれ選択された第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列、および第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列を含むことができる。
ベクター構成－プロモーター配列
前記ベクター配列は各構成要素を暗号化する配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。具体的には、前記プロモーター配列は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションのうちプロモーター部分に開示されたプロモーターのうち一つであり得るが、これに制限されない。
前記ベクター配列は各構成要素を暗号化する配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。具体的には、前記プロモーター配列は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションのうちプロモーター部分に開示されたプロモーターのうち一つであり得るが、これに制限されない。
一具現例として、前記ベクター配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列、およびプロモーター配列を含むことができる。この時、前記プロモーター配列は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列と作動可能に連結されたものである。一具現例として、前記ベクター配列はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列、およびプロモーター配列を含むことができる。この時、前記プロモーター配列は前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列と作動可能に連結されたものである。一具現例として、前記ベクター配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列、およびプロモーター配列を含むことができる。この時、前記プロモーター配列は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列、および前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する配列と作動的に連結され、前記プロモーター配列によって活性化した転写因子が前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを発現させる。
ベクター構成－二以上のプロモーター配列を含むことが可能
一具現例として、前記ベクター配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する第１配列、第１プロモーター配列、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する第２配列、および第２プロモーター配列を含むことができる。この時、前記第１プロモーター配列は前記第１配列と作動的に連結され、前記第２プロモーター配列は相地第２配列と作動的に連結され、前記第１プロモーター配列によって前記第１配列の転写が誘導され、前記第２プロモーター配列によって前記第２配列の転写が誘導される。この時、前記第１プロモーターおよび前記第２プロモーターは同一の種類のプロモーターであり得る。この時、前記第１プロモーターおよび前記第２プロモーターは異なる種類のプロモーターであり得る。
一具現例として、前記ベクター配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する第１配列、第１プロモーター配列、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する第２配列、および第２プロモーター配列を含むことができる。この時、前記第１プロモーター配列は前記第１配列と作動的に連結され、前記第２プロモーター配列は相地第２配列と作動的に連結され、前記第１プロモーター配列によって前記第１配列の転写が誘導され、前記第２プロモーター配列によって前記第２配列の転写が誘導される。この時、前記第１プロモーターおよび前記第２プロモーターは同一の種類のプロモーターであり得る。この時、前記第１プロモーターおよび前記第２プロモーターは異なる種類のプロモーターであり得る。
一具現例として、前記ベクター配列はＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する第１配列、第１プロモーター配列、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する第２配列、第２プロモーター配列、第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する第３配列、および第３プロモーター配列を含むことができる。この時、前記第１プロモーター配列は前記第１配列と作動的に連結され、前記第２プロモーター配列は前記第２配列と作動的に連結され、前記第３プロモーター配列は前記第３配列と作動的に連結され、前記第１プロモーター配列によって前記第１配列の転写が誘導され、前記第２プロモーター配列によって前記第２配列の転写が誘導され、前記第３プロモーター配列によって前記第３配列の転写が誘導される。この時、前記第２プロモーターおよび前記第３プロモーターは同一の種類のプロモーターであり得る。具体的には、前記第２プロモーター配列および前記第３プロモーター配列はＵ６プロモーター配列であり得るが、これに制限されるものではない。この時、前記第２プロモーターおよび前記第３プロモーターは異なる種類のプロモーターであり得る。具体的には、前記第２プロモーターはＵ６プロモーター配列、前記第３プロモーターはＨ１プロモーター配列であり得るが、これに制限されるものではない。
ベクター構成－終結信号
前記ベクターは前記プロモーター配列と作動可能に連結された終結信号を含むことができる。この時、前記終結信号は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションの終結信号部分で開示された終結信号のうち一つであり得るが、これに制限されない。前記終結信号は、プロモーター配列の種類によって変わり得る。
前記ベクターは前記プロモーター配列と作動可能に連結された終結信号を含むことができる。この時、前記終結信号は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションの終結信号部分で開示された終結信号のうち一つであり得るが、これに制限されない。前記終結信号は、プロモーター配列の種類によって変わり得る。
一具現例として、前記ベクター配列がＵ６プロモーター配列を含む場合、前記Ｕ６プロモーター配列と作動可能に連結された、チミジン連続配列が終結信号として作用することができる。一具現例として、前記チミジン連続配列は５個以上のチミジンが連続に連結された配列であり得る。一具現例として、前記ベクター配列がＨ１プロモーター配列を含む場合、前記Ｈ１プロモーター配列と作動可能に連結された、チミジン連続配列が終結信号として作用することができる。一具現例として、前記チミジン連続配列は５個以上のチミジンが連続に連結された配列であり得る。
ベクター構成－その他構成
前記ベクター配列は前記構成他、目的により必要な構成要素を含むことができる。
前記ベクター配列は前記構成他、目的により必要な構成要素を含むことができる。
一具現例として、前記ベクター配列は調節／制御構成要素配列、および／または付加構成要素配列を含むことができる。一具現例として、前記付加構成要素は形質注入された細胞を非形質注入細胞から区別するための目的で付加されたものであり得る。この時、前記調節／制御構成要素配列および付加構成要素は「背景技術－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム発現ベクター設計」セクションに開示されたもののうち一つであり得るが、これに制限されるものではない。
ベクターの種類－ウイルスベクター
前記ベクターはウイルスベクターであり得る。
前記ベクターはウイルスベクターであり得る。
一具現例として、前記ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上であり得る。一具現例として、前記ウイルスベクターはアデノ－関連ウイルスであり得る。
ベクターの種類－非ウイルスベクター
前記ベクターは非ウイルスベクターであり得る。一具現例として、前記非ウイルスベクターはプラスミド、ファージ、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、およびｍＲＮＡで構成された群から選択される１以上であり得る。一具現例として、前記プラスミドはｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳ４５６、ｐＧ１８０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、およびｐＵＣ１９からなる群から選択されたものであり得る。一具現例として、前記ファージはλｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、およびＭ１３からなる群から選択されたものであり得る。一具現例として、前記ベクターはＰＣＲアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）であり得る。
前記ベクターは非ウイルスベクターであり得る。一具現例として、前記非ウイルスベクターはプラスミド、ファージ、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、およびｍＲＮＡで構成された群から選択される１以上であり得る。一具現例として、前記プラスミドはｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳ４５６、ｐＧ１８０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、およびｐＵＣ１９からなる群から選択されたものであり得る。一具現例として、前記ファージはλｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、およびＭ１３からなる群から選択されたものであり得る。一具現例として、前記ベクターはＰＣＲアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）であり得る。
ベクター形態－円形または線形ベクター
前記ベクターは円形または線形形態であり得る。前記ベクターが線形ベクターである場合、前記線形ベクター配列が終結信号を別途に含まなくても、その３'末端でＲＮＡ転写が終結する。これと比較して、前記ベクターが円形ベクターである場合、前記円形ベクター配列が終結信号を別途に含まないのであれば、ＲＮＡ転写が終結しなくなる。したがって、前記ベクターとして円形ベクターを使う場合、意図した対象を発現するためには各プロモーター配列に関連した転写因子に対応する終結信号が含まれなければならない。
前記ベクターは円形または線形形態であり得る。前記ベクターが線形ベクターである場合、前記線形ベクター配列が終結信号を別途に含まなくても、その３'末端でＲＮＡ転写が終結する。これと比較して、前記ベクターが円形ベクターである場合、前記円形ベクター配列が終結信号を別途に含まないのであれば、ＲＮＡ転写が終結しなくなる。したがって、前記ベクターとして円形ベクターを使う場合、意図した対象を発現するためには各プロモーター配列に関連した転写因子に対応する終結信号が含まれなければならない。
一具現例として、前記ベクターは線形ベクターであり得る。一具現例として、前記ベクターは線形のアンプリコンであり得る。一具現例として、前記ベクターは配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１からなる群から選択された配列を含む線形のアンプリコンであり得る。一具現例として、前記ベクターは円形ベクターであり得る。一具現例として、前記ベクターは配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１からなる群から選択された配列を含む円形ベクターであり得る。
ベクター－配列例示
一具現例として、前記ベクターの配列は配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１からなる群から選択された配列を含むことができる。
一具現例として、前記ベクターの配列は配列番号２１１～配列番号２５３、配列番号２９６～配列番号３０８、配列番号３１１～配列番号３２３、配列番号３２６～配列番号３３８、配列番号４８８～配列番号５４１、および配列番号５４５～配列番号５５１からなる群から選択された配列を含むことができる。
エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を含むゲノム編集用組成物
本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を含むゲノム編集用組成物を開示する。一具現例として、本明細書では次を含むゲノム編集用組成物を開示する：Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸；およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸．この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で開示されたものであり得る。この時、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落に開示されたものであり得る。
本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を含むゲノム編集用組成物を開示する。一具現例として、本明細書では次を含むゲノム編集用組成物を開示する：Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸；およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸．この時、前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」段落で開示されたものであり得る。この時、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落に開示されたものであり得る。
前記ゲノム編集用組成物は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素以外にゲノム編集用途に必要な適切な物質をさらに含むことができる。
核酸の化学的な変形
本明細書ではエンジニアリングされたｃｒＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素を発現させるためのベクターなどの核酸を含むか、核酸からなる構成要素を提供する。この時、前記構成要素で「核酸」とは、自然界に存在するＤＮＡ、またはＲＮＡであり得、前記構成核酸の一部又は全部に化学的変形が起きた、変形された核酸であり得る。一具現例として、前記構成核酸は自然界に存在するＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。一具現例として、前記構成核酸は一つ以上のヌクレオチドが化学的に変形されたものであり得る。この時、前記化学的変形は当業者に知られている核酸の変形をすべて含む。具体的には、前記化学的変形は（ＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１）に記載された核酸の変形をすべて含むことができるが、これに制限されるものではない。
本明細書ではエンジニアリングされたｃｒＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素を発現させるためのベクターなどの核酸を含むか、核酸からなる構成要素を提供する。この時、前記構成要素で「核酸」とは、自然界に存在するＤＮＡ、またはＲＮＡであり得、前記構成核酸の一部又は全部に化学的変形が起きた、変形された核酸であり得る。一具現例として、前記構成核酸は自然界に存在するＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。一具現例として、前記構成核酸は一つ以上のヌクレオチドが化学的に変形されたものであり得る。この時、前記化学的変形は当業者に知られている核酸の変形をすべて含む。具体的には、前記化学的変形は（ＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１）に記載された核酸の変形をすべて含むことができるが、これに制限されるものではない。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを利用したゲノム編集方法
ゲノム編集方法概括
本明細書ではエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを利用して対象細胞内の標的遺伝子、または標的核酸を編集する方法を提供する。前記標的遺伝子、または標的核酸は標的配列を含む。前記標的核酸は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質、またはそれぞれを暗号化する核酸を標的遺伝子、または標的核酸を含んでいる対象細胞内に送達することを含む。その結果、前記対象細胞内にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が注入されたり、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の形成が誘導され、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって標的遺伝子が編集される。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものと同一の特徴および構造を有する。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」セクションで説明されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／または変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の特徴および構成を有する。
本明細書ではエンジニアリングされたｃｒＲＮＡを利用して対象細胞内の標的遺伝子、または標的核酸を編集する方法を提供する。前記標的遺伝子、または標的核酸は標的配列を含む。前記標的核酸は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、および／またはＲＮＡであり得る。前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質、またはそれぞれを暗号化する核酸を標的遺伝子、または標的核酸を含んでいる対象細胞内に送達することを含む。その結果、前記対象細胞内にエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が注入されたり、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の形成が誘導され、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって標的遺伝子が編集される。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは、「エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ」段落で説明されたものと同一の特徴および構造を有する。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」セクションで説明されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質、および／または変形されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質と同一の特徴および構成を有する。
一具現例として、前記ゲノム編集方法は、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を対象細胞内に送達することを含むことができる。
この時、前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡはエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを含む。
この時、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は前述した「エンジニアリングされたスキャフォールド領域」段落のうちいずれか一つで叙述されたものと同一の特徴および構造を有する。一例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は配列番号１６８～１８７からなる群から選択された配列で表現され得る。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は配列番号１８８～１９９からなる群から選択された配列で表現され得る。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は配列番号２００～２０６からなる群から選択された配列で表現され得る。さらに他の例として、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は配列番号２０７～２１０からなる群から選択された配列で表現され得る。
この時、前記スペーサー配列は前記対象細胞内に含まれた標的遺伝子、または標的核酸と相補的に結合することができる。
この時、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上ゴー、ｃは１～１０である。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'であり得る。一例として、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＧＵＵＵＵ－３'であり得る。
対象細胞
一具現例として、前記対象細胞は原核細胞であり得る。一具現例として、前記対象細胞は真核細胞であり得る。具体的には、前記真核細胞は植物細胞、動物細胞、および／またはヒト細胞であり得るが、これに制限されない。
一具現例として、前記対象細胞は原核細胞であり得る。一具現例として、前記対象細胞は真核細胞であり得る。具体的には、前記真核細胞は植物細胞、動物細胞、および／またはヒト細胞であり得るが、これに制限されない。
標的配列決定
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で編集しようとする標的遺伝子、または標的核酸、および標的配列は、ゲノム編集の目的、対象細胞環境、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質が認識するＰＡＭ配列、および／またはその他の変数を考慮して決定することができる。この時、適切な長さの標的配列を決定することができるのであれば、その方法は特に制限されず、公知の技術を活用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体で編集しようとする標的遺伝子、または標的核酸、および標的配列は、ゲノム編集の目的、対象細胞環境、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質が認識するＰＡＭ配列、および／またはその他の変数を考慮して決定することができる。この時、適切な長さの標的配列を決定することができるのであれば、その方法は特に制限されず、公知の技術を活用することができる。
標的配列にともなうスペーサー配列決定
前記標的配列が決定されると、これに対応するスペーサー配列を設計する。前記スペーサー配列は前記標的配列と相補的に結合できる配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的遺伝子と相補的に結合できる配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸と相補的に結合できるように設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸の標的鎖配列に含まれた標的配列と相補的な配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸の非標的鎖配列に含まれたプロトスペーサーのＤＮＡ配列に相応するＲＮＡ配列で設計される。具体的には、前記スペーサー配列は、前記プロトスペーサー配列と同一のヌクレオチド配列を有するものの、前記ヌクレオチド配列に含まれたチミジンそれぞれがすべてウリジンで置換された配列で設計される。
前記標的配列が決定されると、これに対応するスペーサー配列を設計する。前記スペーサー配列は前記標的配列と相補的に結合できる配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的遺伝子と相補的に結合できる配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸と相補的に結合できるように設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸の標的鎖配列に含まれた標的配列と相補的な配列で設計される。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的核酸の非標的鎖配列に含まれたプロトスペーサーのＤＮＡ配列に相応するＲＮＡ配列で設計される。具体的には、前記スペーサー配列は、前記プロトスペーサー配列と同一のヌクレオチド配列を有するものの、前記ヌクレオチド配列に含まれたチミジンそれぞれがすべてウリジンで置換された配列で設計される。
一具現例として、前記スペーサーは１０～５０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個または５０個のヌクレオチドの長さを有する。好ましくは１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のヌクレオチドの長さを有する。
標的配列とスペーサー配列の相補性
一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的な配列であり得る。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と直前の文章で選択された数値範囲内相補的な配列であり得る。例えば、前記スペーサー配列は前記標的配列と６０％～９０％相補的な配列であり得る。さらに他の例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と９０％～１００％相補的な配列であり得る。
一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的な配列であり得る。一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と直前の文章で選択された数値範囲内相補的な配列であり得る。例えば、前記スペーサー配列は前記標的配列と６０％～９０％相補的な配列であり得る。さらに他の例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と９０％～１００％相補的な配列であり得る。
標的配列とスペーサー配列間のミスマッチ個数
一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のミスマッチを有する相補的な配列であり得る。一具現例として、前記スペーサー配列は直前の文章で選択された数値範囲内のミスマッチを有することができる。例えば、前記スペーサー配列は前記標的配列と０個、１個、２個、３個、４個、または５個のミスマッチを有することができる。さらに他の例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と６個～１０個のミスマッチを有することができる。
一具現例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のミスマッチを有する相補的な配列であり得る。一具現例として、前記スペーサー配列は直前の文章で選択された数値範囲内のミスマッチを有することができる。例えば、前記スペーサー配列は前記標的配列と０個、１個、２個、３個、４個、または５個のミスマッチを有することができる。さらに他の例として、前記スペーサー配列は前記標的配列と６個～１０個のミスマッチを有することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体利用
本明細書で提供するゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的特異的に遺伝子、または核酸を切断する活性を有するという点を利用する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」セクションで説明されたエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体と同一の特徴および構成を有する。
本明細書で提供するゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的特異的に遺伝子、または核酸を切断する活性を有するという点を利用する。前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体は「エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体」セクションで説明されたエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体と同一の特徴および構成を有する。
ＣＲＩＳＲＰ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体各構成要素の細胞内送達
本明細書で提供するゲノム編集方法は、対象細胞内でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸と接触することを含む。したがって、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が前記標的遺伝子、または標的核酸と接触することを誘導するために、前記ゲノム編集方法は前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の各構成要素を対象細胞内に送達することを含む。
本明細書で提供するゲノム編集方法は、対象細胞内でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸と接触することを含む。したがって、前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が前記標的遺伝子、または標的核酸と接触することを誘導するために、前記ゲノム編集方法は前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の各構成要素を対象細胞内に送達することを含む。
一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を対象細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を対象細胞内に送達することを含むことができる。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸は多様な送達形態で、多様な送達方法を利用して対象細胞内に送達され得る。
送達形態－ＲＮＰ
前記送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したリボヌクレオプロテイン粒子（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＲＮＰ）を利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を対象細胞内に注入することを含むことができる。
前記送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したリボヌクレオプロテイン粒子（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＲＮＰ）を利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を対象細胞内に注入することを含むことができる。
送達形態－非ウイルスベクター
さらに他の送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む非ウイルスベクターを利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む非ウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記非ウイルスベクターはプラスミド、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、またはｍＲＮＡであり得るが、これに制限されるものではない。さらに他の具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第１非ウイルスベクター、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第２非ウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記第１非ウイルスベクターおよび前記第２非ウイルスベクターはそれぞれプラスミド、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、およびｍＲＮＡからなる群から選択された一つであり得るが、これに制限されるものではない。
さらに他の送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む非ウイルスベクターを利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む非ウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記非ウイルスベクターはプラスミド、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、またはｍＲＮＡであり得るが、これに制限されるものではない。さらに他の具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第１非ウイルスベクター、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第２非ウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記第１非ウイルスベクターおよび前記第２非ウイルスベクターはそれぞれプラスミド、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、およびｍＲＮＡからなる群から選択された一つであり得るが、これに制限されるものではない。
送達形態－ウイルスベクター
さらに他の送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むウイルスベクターを利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択された一つであり得るが、これに制限されるものではない。一具現例として、前記ウイルスベクターはアデノ－関連ウイルスであり得る。
さらに他の送達形態として、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むウイルスベクターを利用することができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択された一つであり得るが、これに制限されるものではない。一具現例として、前記ウイルスベクターはアデノ－関連ウイルスであり得る。
さらに他の具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第１ウイルスベクター、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第２ウイルスベクターを対象細胞内に注入することを含むことができる。具体的には、前記第１ウイルスベクターおよび第２ウイルスベクターはそれぞれレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択された一つであり得るが、これに制限されるものではない。
送達方法－一般的な送達手段
前記送達方法は、細胞内にエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を適切な送達形態で細胞内に送達できるものであれば特に制限されない。一具現例として、前記送達方法は電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、磁気注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、および／または一時的な細胞圧縮またはスクイージングであり得る。
前記送達方法は、細胞内にエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を適切な送達形態で細胞内に送達できるものであれば特に制限されない。一具現例として、前記送達方法は電気穿孔法、遺伝子銃、超音波穿孔法、磁気注入法（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、および／または一時的な細胞圧縮またはスクイージングであり得る。
送達方法－ナノパーティクル
前記送達方法は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに含まれた少なくとも一つの構成要素をナノパーティクルを利用して送達するものであり得る。この時、前記送達方法は当業界の通常の技術者が適切に選択できる公知の方法であり得る。例えば、前記ナノパーティクル送達方法は（ＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１）に開示された方法であり得るが、これに制限されるものではない。
前記送達方法は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに含まれた少なくとも一つの構成要素をナノパーティクルを利用して送達するものであり得る。この時、前記送達方法は当業界の通常の技術者が適切に選択できる公知の方法であり得る。例えば、前記ナノパーティクル送達方法は（ＷＯ ２０１９／０８９８２０ Ａ１）に開示された方法であり得るが、これに制限されるものではない。
一具現例として、前記送達方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸および／またはエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸をナノパーティクルを利用して送達するものであり得る。一具現例として、前記送達方法はＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および／または第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸をナノパーティクルを利用して送達するものであり得る。この時、前記送達方法は陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ、脂質－媒介形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、燐酸カルシウム沈殿法（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）－媒介形質感染、ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ媒介形質感染、および／またはナノパーティクル－媒介核酸送達（Ｐａｎｙａｍ ｅｔ．，ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３参照）であり得るが、これに制限されるものではない。この時、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素はＲＮＰ、非ウイルスベクター、および／またはウイルスベクター形態であり得る。例えば、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの構成要素は各構成要素を暗号化するｍＲＮＡ形態であり得るが、これに制限されるものではない。
送達形態および方法－組み合わせ可能
前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内送達することを含むが、この時、前記構成の送達形態および／または送達方法は互いに同一または異なり得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸は第１送達形態で送達し、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸は第２送達形態で送達することを含むことができる。この時、前記第１送達形態および前記第２送達形態はそれぞれ前述した送達形態のうちいずれか一つであり得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸は第１送達方法で送達し、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸は第２送達方法で送達することを含むことができる。この時、前記第１送達方法および前記第２送達方法はそれぞれ前述した送達方法のうちいずれか一つであり得る。
前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内送達することを含むが、この時、前記構成の送達形態および／または送達方法は互いに同一または異なり得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸は第１送達形態で送達し、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸は第２送達形態で送達することを含むことができる。この時、前記第１送達形態および前記第２送達形態はそれぞれ前述した送達形態のうちいずれか一つであり得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸は第１送達方法で送達し、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸は第２送達方法で送達することを含むことができる。この時、前記第１送達方法および前記第２送達方法はそれぞれ前述した送達方法のうちいずれか一つであり得る。
送達順序
前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内送達することを含むが、この時、前記構成が細胞内に同時に送達されるかまたは時間差を置いて順次送達され得る。
前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内送達することを含むが、この時、前記構成が細胞内に同時に送達されるかまたは時間差を置いて順次送達され得る。
一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を同時に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達した後、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達した後、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを細胞内に送達することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を細胞内に送達した後、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを細胞内に送達することを含むことができる。
複数のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸送達
本明細書で提供するゲノム編集方法は、対象細胞内にＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、および二以上のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を送達することを含むことができる。前記方法を通じて、互いに異なる配列を標的とする二以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内に導入されたり、対象細胞内で形成され得る。その結果、細胞内に含まれた互いに異なる二以上の標的遺伝子または標的核酸が編集され得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を標的遺伝子または標的核酸を含んでいる対象細胞内に送達することを含む。この時、前記各構成要素は前述した送達形態および送達方法のうち一つ以上を使って細胞内に送達され得る。この時、二以上の構成要素が細胞内に同時に送達され得、または順次送達され得る。
本明細書で提供するゲノム編集方法は、対象細胞内にＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、および二以上のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を送達することを含むことができる。前記方法を通じて、互いに異なる配列を標的とする二以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内に導入されたり、対象細胞内で形成され得る。その結果、細胞内に含まれた互いに異なる二以上の標的遺伝子または標的核酸が編集され得る。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を標的遺伝子または標的核酸を含んでいる対象細胞内に送達することを含む。この時、前記各構成要素は前述した送達形態および送達方法のうち一つ以上を使って細胞内に送達され得る。この時、二以上の構成要素が細胞内に同時に送達され得、または順次送達され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的核酸と接触
本明細書で提供するゲノム編集方法で、標的遺伝子、または標的核酸の編集は対象細胞内でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸と接触しながらなされる。したがって、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内で接触するようにするか、接触を誘導することを含むことができる。
本明細書で提供するゲノム編集方法で、標的遺伝子、または標的核酸の編集は対象細胞内でエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸と接触しながらなされる。したがって、前記ゲノム編集方法はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内で接触するようにするか、接触を誘導することを含むことができる。
一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内で標的核酸と接触することを含むことができる。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が対象細胞内で標的核酸と接触するように誘導することを含むことができる。この時、前記誘導は前記エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が細胞内で標的核酸と接触するようにする方法であれば特に制限されない。一具現例として、前記誘導はエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達してもよい。
ゲノム編集結果－インデル（ｉｎｄｅｌ）
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸にインデルが発生し得る。この時、前記インデルは標的配列部分および／またはプロトスペーサー配列部分の内部および／または外部で起き得る。前記インデルは、ゲノム編集前に核酸のヌクレオチド配列から一部のヌクレオチドが途中で欠失したり、任意のヌクレオチドが挿入されたり、および／または前記挿入と欠失が混入された変異を称する。一般的に、標的遺伝子または標的核酸配列内インデルが起きると、該当遺伝子または核酸が不活性化する。一具現例として、前記ゲノム編集方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上のヌクレオチドが欠失および／または追加され得る。
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸にインデルが発生し得る。この時、前記インデルは標的配列部分および／またはプロトスペーサー配列部分の内部および／または外部で起き得る。前記インデルは、ゲノム編集前に核酸のヌクレオチド配列から一部のヌクレオチドが途中で欠失したり、任意のヌクレオチドが挿入されたり、および／または前記挿入と欠失が混入された変異を称する。一般的に、標的遺伝子または標的核酸配列内インデルが起きると、該当遺伝子または核酸が不活性化する。一具現例として、前記ゲノム編集方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上のヌクレオチドが欠失および／または追加され得る。
ゲノム編集結果－ベースエディティング（ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ベースエディティングが起き得る。これは標的遺伝子または標的核酸内任意のヌクレオチドが欠失、または追加されるインデルとは異なり、核酸内一つ以上の特定ヌクレオチドを意図通りに変更することを意味する。換言すると、標的遺伝子または標的核酸内特定位置で、予め意図した点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を起こすことである。一具現例として、前記ゲノム編集方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換され得る。
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ベースエディティングが起き得る。これは標的遺伝子または標的核酸内任意のヌクレオチドが欠失、または追加されるインデルとは異なり、核酸内一つ以上の特定ヌクレオチドを意図通りに変更することを意味する。換言すると、標的遺伝子または標的核酸内特定位置で、予め意図した点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を起こすことである。一具現例として、前記ゲノム編集方法の遂行結果、標的遺伝子または標的核酸内一つ以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換され得る。
ゲノム編集結果－挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ノックインが発生し得る。前記ノックインは標的遺伝子または標的核酸配列内に追加的な核酸配列を挿入することを意味する。前記ノックインが起きるためには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の他に前記追加的な核酸配列を含むドナーがさらに必要である。細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸を切断する場合、前記切断された標的遺伝子または標的核酸の修復が起きることになる。この時、前記ドナーが前記修復過程に関与して前記追加的な核酸配列が標的遺伝子または標的核酸内に挿入されるようにする。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、対象細胞内にドナーを導入することを追加的に含むことができる。例えば、前記ドナーは細胞内ゲノムに挿入するための外来ＤＮＡ配列（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、前記ドナーによって前記標的遺伝子または前記標的核酸内前記外来ＤＮＡ配列の挿入が誘導される。この時、前記ドナーを対象細胞内に送達する時、前述した送達形態および／または送達方法が使われ得る。
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸内ノックインが発生し得る。前記ノックインは標的遺伝子または標的核酸配列内に追加的な核酸配列を挿入することを意味する。前記ノックインが起きるためには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体の他に前記追加的な核酸配列を含むドナーがさらに必要である。細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が標的遺伝子または標的核酸を切断する場合、前記切断された標的遺伝子または標的核酸の修復が起きることになる。この時、前記ドナーが前記修復過程に関与して前記追加的な核酸配列が標的遺伝子または標的核酸内に挿入されるようにする。一具現例として、前記ゲノム編集方法は、対象細胞内にドナーを導入することを追加的に含むことができる。例えば、前記ドナーは細胞内ゲノムに挿入するための外来ＤＮＡ配列（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、前記ドナーによって前記標的遺伝子または前記標的核酸内前記外来ＤＮＡ配列の挿入が誘導される。この時、前記ドナーを対象細胞内に送達する時、前述した送達形態および／または送達方法が使われ得る。
ゲノム編集結果－除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸配列の全部または一部を除去することができる。前記除去は前記標的遺伝子または前記標的核酸内一部の塩基配列（ヌクレオチド配列）を一定の長さ以上除去することを意味する。前記除去は前述したインデル効果と比較して、遺伝子の特定領域、例えば、第１エクソン領域を全体的に除去（ｒｅｍｏｖａｌ）できる効果を意味する。
本明細書で提供するゲノム編集方法の遂行結果として、標的遺伝子または標的核酸配列の全部または一部を除去することができる。前記除去は前記標的遺伝子または前記標的核酸内一部の塩基配列（ヌクレオチド配列）を一定の長さ以上除去することを意味する。前記除去は前述したインデル効果と比較して、遺伝子の特定領域、例えば、第１エクソン領域を全体的に除去（ｒｅｍｏｖａｌ）できる効果を意味する。
一具現例として、前記ゲノム編集方法は、Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸、および第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を標的遺伝子または標的核酸を含む細胞内に導入することを含む。これによって、前記ゲノム編集結果標的遺伝子または標的核酸内に特定配列部分の除去が起きる。
ゲノム編集方法例示
一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したリボヌクレオプロテイン粒子形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を真核細胞内に送達することを含むことができる。この時、前記送達は電気穿孔法、またはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎを利用したものであり得る。
一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆ１タンパク質が結合したリボヌクレオプロテイン粒子形態のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体を真核細胞内に送達することを含むことができる。この時、前記送達は電気穿孔法、またはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎを利用したものであり得る。
一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸を真核細胞内に送達することを含むことができる。この時、前記送達は電気穿孔法、またはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎを利用したものであり得る。
一具現例として、前記ゲノム編集方法は、エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むアデノ－関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを真核細胞内に送達することを含むことができる。
一具現例として、前記ゲノム編集方法は、第１エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列、第２エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列、およびＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含むアデノ－関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを真核細胞内に送達することを含むことができる。
発明の可能な実施例
実施例１、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ａ
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
このとき、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
このとき、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例２、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ａ、Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ
実施例１において、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵ－３'で表現されることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１において、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵ－３'で表現されることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例３、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．０
実施例１において、前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
実施例１において、前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例４、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．１
実施例１において、前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
実施例１において、前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例５、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ａ、ＤＮＡ
実施例１～実施例４のうちいずれか一つのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
実施例１～実施例４のうちいずれか一つのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
実施例６、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧ－３'（配列番号４７５）で表現される第１配列；
５'－ＵＵＣＧ－３'で表現される第２配列；
５'－ＣＵＣＧＡ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡ－３'で表現される第４配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第５配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列。
５'－ＵＵＣＧ－３'で表現される第２配列；
５'－ＣＵＣＧＡ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡ－３'で表現される第４配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第５配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列。
実施例７、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、Ｌｉｎｋｅｒ
実施例６において、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例６において、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'であることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例８、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、Ｌｉｎｋｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ
実施例６において、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＧＡＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡ－３'（配列番号６４２）、５'－ＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４３）、５'－ＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４４）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４５）からなる群から選択されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例６において、前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＧＡＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡ－３'（配列番号６４２）、５'－ＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４３）、５'－ＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４４）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４５）からなる群から選択されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例９、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、＋ １ｓｔ ｒｅｇｉｏｎ
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第７配列を追加的に含み、前記第７配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第７配列を追加的に含み、前記第７配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１０、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ
実施例６において、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵ－３'で表現されることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例６において、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵ－３'で表現されることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１１、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、＋ ２ｎｄ ｒｅｇｉｏｎ
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第８配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第８配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１２、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、＋ １ｓｔ ｒｅｇｉｏｎ ＋ ２ｎｄ ｒｅｇｉｏｎ
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第７配列を追加的に含み、５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第８配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されており、前記第７配列の３'末端は前記第８配列の５'末端と連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第７配列を追加的に含み、５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第８配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されており、前記第７配列の３'末端は前記第８配列の５'末端と連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１３、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ３ｒｄ ｒｅｇｉｏｎ
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＧＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）からなる群から選択された第９配列を追加的に含み、５'－Ｃ－３'、５'－ＣＣ－３'、５'－ＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＣＣ－３'、５'－ＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）からなる群から選択された第１０配列を追加的に含み、前記第１配列の３'末端および前記第２配列の５'末端は前記第９配列を通じて連結されており、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＧＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）からなる群から選択された第９配列を追加的に含み、５'－Ｃ－３'、５'－ＣＣ－３'、５'－ＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＣＣ－３'、５'－ＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）からなる群から選択された第１０配列を追加的に含み、前記第１配列の３'末端および前記第２配列の５'末端は前記第９配列を通じて連結されており、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１４、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｘａｍｐｌｅｓ ｏｆ ３ｒｄ ｒｅｇｉｏｎ
実施例１３において、
前記第９配列が５'－Ａ－３'の場合、前記第１０配列は５'－Ｃ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡ－３'の場合、前記第１０配列は５'－Ｃ－３'、または５'－ＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＣＣ－３'、または５'－ＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＣ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＧＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）の場合、前記第１０配列は５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）であるエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１３において、
前記第９配列が５'－Ａ－３'の場合、前記第１０配列は５'－Ｃ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡ－３'の場合、前記第１０配列は５'－Ｃ－３'、または５'－ＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＣＣ－３'、または５'－ＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＣ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＧＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）の場合、前記第１０配列は５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）であるエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１５、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ４ｔｈ ｒｅｇｉｏｎ
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１１配列、および５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１２配列を追加的に含み、前記第４配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１１配列を通じて連結され、前記リンカーの３'末端および前記第５配列の５'末端は前記第１２配列を通じて連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１１配列、および５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１２配列を追加的に含み、前記第４配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１１配列を通じて連結され、前記リンカーの３'末端および前記第５配列の５'末端は前記第１２配列を通じて連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１６、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｅｘａｍｐｌｅ ｏｆ ４ｔｈ ｒｅｇｉｏｎ
実施例１５において、
前記第１１配列が５'－Ｕ－３'の場合、前記第１２配列は５'－Ａ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'であるエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１５において、
前記第１１配列が５'－Ｕ－３'の場合、前記第１２配列は５'－Ａ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'であるエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１７、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、ｖ４．０
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'で表現される第７配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）で表現される第８配列、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）で表現される第９配列、および５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）で表現される第１０配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されており、前記第７配列の３'末端は前記第８配列の５'末端と連結されており、前記第１配列の３'末端および前記第２配列の５'末端は前記第９配列を通じて連結されており、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'で表現される第７配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）で表現される第８配列、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）で表現される第９配列、および５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）で表現される第１０配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されており、前記第７配列の３'末端は前記第８配列の５'末端と連結されており、前記第１配列の３'末端および前記第２配列の５'末端は前記第９配列を通じて連結されており、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１８、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、ｖ４．１
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'で表現される第７配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）で表現される第８配列、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）で表現される第９配列、および５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）で表現される第１０配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されており、前記第７配列の３'末端は前記第８配列の５'末端と連結されており、前記第１配列の３'末端および前記第２配列の５'末端は前記第９配列を通じて連結されており、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例６において、前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'で表現される第７配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）で表現される第８配列、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）で表現される第９配列、および５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）で表現される第１０配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されており、前記第７配列の３'末端は前記第８配列の５'末端と連結されており、前記第１配列の３'末端および前記第２配列の５'末端は前記第９配列を通じて連結されており、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されていることを特徴とするエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例１９、ｓｇＲＮＡ ｖｅｒ．Ｂ、ＤＮＡ
実施例６～実施例１８のうちいずれか一つのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
実施例６～実施例１８のうちいずれか一つのエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
実施例２０、ｄｕａｌ ｇＲＮＡ
次を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は次を含む：
次を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は次を含む：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第１配列、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第１配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第２配列、
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された第３配列、
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６９）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３）からなる群から選択された第４配列が連結されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１５）からなる群から選択された第５配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１５）からなる群から選択された第５配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分の３'末端は前記スペーサーの５'末端と連結されており、
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列が５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と同一であり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列が５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と同一の場合は含まないことを特徴とする。
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列が５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と同一であり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列が５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と同一の場合は含まないことを特徴とする。
実施例２１、ｄｕａｌ ｇＲＮＡ、ＤＮＡ
実施例２０のエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
実施例２０のエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
実施例２２、ｃｏｍｐｌｅｘ、ｖｅｒ．Ａ
次を含む、標的配列を含む核酸を編集できるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
エンジニアリングされたガイドＲＮＡ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
次を含む、標的配列を含む核酸を編集できるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
エンジニアリングされたガイドＲＮＡ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、前記標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、前記標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例２３、ｃｏｍｐｌｅｘ、ｖｅｒ．Ａ、Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ
実施例２２において、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵ－３'で表現されることを特徴とするエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体。
実施例２２において、前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵ－３'で表現されることを特徴とするエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体。
実施例２４、ｃｏｍｐｌｅｘ、ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．０
実施例２２において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
実施例２２において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例２５、ｃｏｍｐｌｅｘ、ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．１
実施例２２において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
実施例２２において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣ ＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣ ＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例２６、ｃｏｍｐｌｅｘ、ｖｅｒ．Ｂ
次を含む、標的配列を含む核酸を編集できるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
実施例６～実施例１８のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
次を含む、標的配列を含む核酸を編集できるエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
実施例６～実施例１８のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
実施例２７、ｖｅｃｔｏｒ、ｖｅｒ．Ａ
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
ここで、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例２８、ｖｅｃｔｏｒ、ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．０
実施例２７において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするベクター：
実施例２７において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするベクター：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例２９、ｖｅｃｔｏｒ、ｖｅｒ．Ａ、ｖ４．１
実施例２７において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするベクター：
実施例２７において、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたことを特徴とするベクター：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例３０、ｖｅｃｔｏｒ、ｖｅｒ．Ａ、Ｕ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
実施例２７において、前記第２プロモーター配列はＵ６プロモーター配列であるベクター。
実施例２７において、前記第２プロモーター配列はＵ６プロモーター配列であるベクター。
実施例３１、ｖｅｃｔｏｒ、ｖｅｒ．Ａ、ｖｉｒａｌ ｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ
実施例２７において、前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とするベクター。
実施例２７において、前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とするベクター。
実施例３２、ｖｅｃｔｏｒ、ｖｅｒ．Ｂ
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
実施例６～実施例１８のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列。
次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
実施例６～実施例１８のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列。
実施例３３、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ａ
次を含む、細胞内で標的配列を含む核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
次を含む、細胞内で標的配列を含む核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含むことを特徴とする：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。
実施例３４、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ａ、ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ＲＮＰ
実施例３３において、前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体として細胞内に注入することである方法。
実施例３３において、前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体として細胞内に注入することである方法。
実施例３５、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ａ、ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ
実施例３３において、前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むベクターを細胞内に注入することである方法。
実施例３３において、前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むベクターを細胞内に注入することである方法。
実施例３６、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ａ、ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ
実施例３５において、前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とするベクター。
実施例３５において、前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上であることを特徴とするベクター。
実施例３７、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ａ、ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌ
実施例３３において、前記細胞は真核細胞であることを特徴とする方法。
実施例３３において、前記細胞は真核細胞であることを特徴とする方法。
実施例３８、ｅｄｉｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ、ｖｅｒ．Ｂ
次を含む、細胞内で標的配列を含む核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、および実施例６～実施例１８のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得る。
次を含む、細胞内で標的配列を含む核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、および実施例６～実施例１８のうちいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的配列を含む核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得る。
以下、実験例および実施例を通じて本明細書が提供する発明についてさらに詳細に説明する。これら実施例は単に本明細書によって開示される内容を例示するためのものであって、本明細書によって開示される内容の範囲がこれら実施例によって制限されるものと解釈されないことは当業界で通常の知識を有する者において自明であろう。
実験例１実験材料準備
実験例１．１プラスミドベクター設計および製造
ヒト細胞で発現するために、Ｃａｓ１２ｆ１遺伝子をコドン－最適化させたし、前記最適化された配列がベクター製造のために合成された。最終的にＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列にはｃｈｉｃｋｅｎβ－ａｃｔｉｎプロモーター、５'－および３'－末端の核位置信号配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、自己切断Ｔ２Ａペプチドに連結されたｅＧＦＰをエンコーディングする配列が付加された。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のアミノ酸配列およびこれを暗号化するＤＮＡ配列を［表１］に示した。
ヒト細胞で発現するために、Ｃａｓ１２ｆ１遺伝子をコドン－最適化させたし、前記最適化された配列がベクター製造のために合成された。最終的にＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する配列にはｃｈｉｃｋｅｎβ－ａｃｔｉｎプロモーター、５'－および３'－末端の核位置信号配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、自己切断Ｔ２Ａペプチドに連結されたｅＧＦＰをエンコーディングする配列が付加された。前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質のアミノ酸配列およびこれを暗号化するＤＮＡ配列を［表１］に示した。
（エンジニアリングされた）Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化する鋳型ＤＮＡが合成されたし、ｐＴｗｉｓｔ Ａｍｐ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にクローニングされた。必要な場合、前記ベクターはＵ６－相補的ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－相補的ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを使って、前記ガイドＲＮＡ暗号化配列の増幅のための鋳型として使われた。Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを使って、前記コドン－最適化されたＣａｓ１２ｆ１遺伝子を含むベクターにエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを暗号化するオリゴヌクレオチドをクローニングすることにより、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに対するベクターを製造した。
実験例１．２ Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡエンジニアリング
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ ３'末端に対するＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ連結は、配列－変形されたｐｒｉｍｅｒおよびＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡプラスミドベクターの存在下、Ｐｆｕ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ５（Ｂｉｏｆａｃｔ）を使って遂行された。前記ＰＣＲアンプリコンはＨｉＧｅｎｅＴＭ Ｇｅｌ＆ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｆａｃｔ）を使って精製された。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのエンジニアリングされたスキャフォールド領域のうち第２領域、第４領域および第５領域の変形はＡｐｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を使って線形化されたガイドＲＮＡ－暗号化ベクターに変形された配列（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）を送達する合成オリゴヌクレオチドをクローニングして遂行された。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのエンジニアリングされたスキャフォールド領域のうち第１領域の変形は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端部分を標的とするｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＵ６プロモーター領域を標的とするｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを使ってカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）、またはエンジニアリングされた鋳型プラスミドベクターのＰＣＲ増幅によって遂行された。前記ＰＣＲ増幅はＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）により遂行されたし、ＰＣＲ産物はＫＬＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使って結紮された（ｌｉｇａｔｅｄ）。前記結紮された（ｌｉｇａｔｅｄ）ＰＣＲ産物はＤＨ５αＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）された。Ｓａｎｇｅｒシーケンシング分析によってＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓが確認された。変形されたプラスミドベクターはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦ ｋｉｔ（ＭＮ）を使って精製された。精製されたプラスミド１マイクログラムがＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）およびＮＴＰｓ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使ったｍＲＮＡ合成の鋳型として使われた。前記製造されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡをＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使って精製し、極低温バイアル（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｖｉａｌｓ）に分注して液体窒素に保管した。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ ３'末端に対するＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ連結は、配列－変形されたｐｒｉｍｅｒおよびＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡプラスミドベクターの存在下、Ｐｆｕ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ５（Ｂｉｏｆａｃｔ）を使って遂行された。前記ＰＣＲアンプリコンはＨｉＧｅｎｅＴＭ Ｇｅｌ＆ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｆａｃｔ）を使って精製された。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのエンジニアリングされたスキャフォールド領域のうち第２領域、第４領域および第５領域の変形はＡｐｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を使って線形化されたガイドＲＮＡ－暗号化ベクターに変形された配列（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）を送達する合成オリゴヌクレオチドをクローニングして遂行された。前記エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡのエンジニアリングされたスキャフォールド領域のうち第１領域の変形は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５'末端部分を標的とするｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒおよびＵ６プロモーター領域を標的とするｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを使ってカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）、またはエンジニアリングされた鋳型プラスミドベクターのＰＣＲ増幅によって遂行された。前記ＰＣＲ増幅はＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）により遂行されたし、ＰＣＲ産物はＫＬＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使って結紮された（ｌｉｇａｔｅｄ）。前記結紮された（ｌｉｇａｔｅｄ）ＰＣＲ産物はＤＨ５αＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）された。Ｓａｎｇｅｒシーケンシング分析によってＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓが確認された。変形されたプラスミドベクターはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦ ｋｉｔ（ＭＮ）を使って精製された。精製されたプラスミド１マイクログラムがＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）およびＮＴＰｓ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使ったｍＲＮＡ合成の鋳型として使われた。前記製造されたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡをＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使って精製し、極低温バイアル（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｖｉａｌｓ）に分注して液体窒素に保管した。
実験例１．３細胞培養および形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞（ＬｅｎｔＸ－２９３Ｔ、Ｔａｋａｒａ）が１０％の熱－不活性化されたｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）およびペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地で、５％ＣＯ２条件下で培養された。細胞形質注入は電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎで遂行された。電気穿孔法の場合、実験例１．２で製造されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するプラスミドベクターおよびガイドＲＮＡ（およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡ）を暗号化するＤＮＡ各２－５μｇをＮｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って４Ｘ１０５ ＨＥＫ－２９３ Ｔ細胞に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。前記電気穿孔法は１３００Ｖ、１０ｍＡ、３ｐｕｌｓｅ条件下で遂行した。ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎのために、６－１５μＬ ＦｕＧｅｎｅ試薬を（Ｐｒｏｍｅｇａ）２－５μｇのＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するプラスミドベクターおよび１．５－５μｇのＰＣＲアンプリコンと１５分の間混合した。前記混合物（３００μＬ）が形質注入１日前に１Ｘ１０６個の細胞がプレーティングされた１．５ｍｌ ＤＭＥＭ培地に添加された。前記細胞を前記混合物の存在下１～１０日間培養させた。培養後、前記細胞が収集されたし、前記細胞のゲノムＤＮＡがＰｕｒｅＨｅｌｉｘＴＭ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮａｎｏＨｅｌｉｘ）を使ったり、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って手作業で分離された。
ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞（ＬｅｎｔＸ－２９３Ｔ、Ｔａｋａｒａ）が１０％の熱－不活性化されたｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）およびペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地で、５％ＣＯ２条件下で培養された。細胞形質注入は電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎで遂行された。電気穿孔法の場合、実験例１．２で製造されたＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するプラスミドベクターおよびガイドＲＮＡ（およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡ）を暗号化するＤＮＡ各２－５μｇをＮｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って４Ｘ１０５ ＨＥＫ－２９３ Ｔ細胞に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。前記電気穿孔法は１３００Ｖ、１０ｍＡ、３ｐｕｌｓｅ条件下で遂行した。ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎのために、６－１５μＬ ＦｕＧｅｎｅ試薬を（Ｐｒｏｍｅｇａ）２－５μｇのＣａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化するプラスミドベクターおよび１．５－５μｇのＰＣＲアンプリコンと１５分の間混合した。前記混合物（３００μＬ）が形質注入１日前に１Ｘ１０６個の細胞がプレーティングされた１．５ｍｌ ＤＭＥＭ培地に添加された。前記細胞を前記混合物の存在下１～１０日間培養させた。培養後、前記細胞が収集されたし、前記細胞のゲノムＤＮＡがＰｕｒｅＨｅｌｉｘＴＭ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＮａｎｏＨｅｌｉｘ）を使ったり、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って手作業で分離された。
実験例１．４細胞内インデル効率測定
ＨＥＫ－２９３ Ｔ細胞から分離されたゲノムＤＮＡのうち、プロトスペーサーを含む領域を標的－特異的プライマーを使ってＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下でＰＣＲを遂行した。前記増幅方法はメーカーの指示に従った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＨＴ ｄｕａｌ ｉｎｄｅｘｅｓを含む前記増幅の結果物であるＰＣＲアンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｅｑ １００を使って１５０－ｂｐペアエンドシーケンシングを遂行した。インデル頻度はＭＡＵＮＤを使って計算された。前記ＭＡＵＮＤはｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｉｂｓｃｇｅ／ｍａｕｎｄで提供される。
ＨＥＫ－２９３ Ｔ細胞から分離されたゲノムＤＮＡのうち、プロトスペーサーを含む領域を標的－特異的プライマーを使ってＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下でＰＣＲを遂行した。前記増幅方法はメーカーの指示に従った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＨＴ ｄｕａｌ ｉｎｄｅｘｅｓを含む前記増幅の結果物であるＰＣＲアンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｅｑ １００を使って１５０－ｂｐペアエンドシーケンシングを遂行した。インデル頻度はＭＡＵＮＤを使って計算された。前記ＭＡＵＮＤはｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｉｂｓｃｇｅ／ｍａｕｎｄで提供される。
実験例１．５ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ
ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＭａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｍｉＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってガイドＲＮＡ（またはエンジニアリングされたガイドＲＮＡ）またはゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出した。ガイドＲＮＡを定量化するために、ＲＮＡ特異的プライマーをｌｉｇａｔｉｏｎし、ｃｒＲＮＡ－特異的プライマーを使ってｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡは鋳型であって、定量的ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲに使われた。ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲはＫＡＦＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２Ｘ）Ｋｉｔ（ＫＡＰＡｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って分析された。
ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＭａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｍｉＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってガイドＲＮＡ（またはエンジニアリングされたガイドＲＮＡ）またはゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出した。ガイドＲＮＡを定量化するために、ＲＮＡ特異的プライマーをｌｉｇａｔｉｏｎし、ｃｒＲＮＡ－特異的プライマーを使ってｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡは鋳型であって、定量的ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲに使われた。ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲはＫＡＦＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２Ｘ）Ｋｉｔ（ＫＡＰＡｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って分析された。
実験例１．６統計分析
各実験例別実験は３回ずつ遂行したし、各値の平均値を分析に使った。
各実験例別実験は３回ずつ遂行したし、各値の平均値を分析に使った。
実験例２エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率比較１
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使ったエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率を測定するために、実験例１．１～１．２によって各実施例を製造した。実験に使った標的配列は次の［表２］に示した。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使ったエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率を測定するために、実験例１．１～１．２によって各実施例を製造した。実験に使った標的配列は次の［表２］に示した。
この時、各標的配列別に、
１）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１は自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ ｔｒａｃｒＲＮＡおよび自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ ｃｒＲＮＡを５'－ＧＡＡＡ－３'で連結させたシングルガイドＲＮＡ、
２）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．２は自然界で発見されるスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するシングルガイドＲＮＡ、
３）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１～１．ｎ．３は変形された第１領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
４）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．４～１．ｎ．６は変形された第２領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
５）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．７～１．ｎ．９は変形された第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
６）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１０は変形された第１領域および第２領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
７）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１１は変形された第１領域および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
８）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１２は変形された第２領域および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
９）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１３は変形された第１領域、第２領域、および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを示す。
１）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１は自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ ｔｒａｃｒＲＮＡおよび自然界で発見されるＣａｓ１２ｆ１ ｃｒＲＮＡを５'－ＧＡＡＡ－３'で連結させたシングルガイドＲＮＡ、
２）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．２は自然界で発見されるスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するシングルガイドＲＮＡ、
３）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１～１．ｎ．３は変形された第１領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
４）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．４～１．ｎ．６は変形された第２領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
５）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．７～１．ｎ．９は変形された第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
６）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１０は変形された第１領域および第２領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
７）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１１は変形された第１領域および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
８）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１２は変形された第２領域および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡ、
９）Ｅｘａｍｐｌｅ １．ｎ．１３は変形された第１領域、第２領域、および第４領域および第５領域を有するエンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、および５'－ＵＵＵＵＡＵＵＵＵ－３'で表現されるＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌを有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを示す。
この時、ｎは標的配列別に、１、２、または３であり、ｎが１である場合Ｔａｒｇｅｔ １（ＤＹ２）、ｎが２である場合、Ｔａｒｇｅｔ ２（ＤＹ１０）、ｎが３である場合、Ｔａｒｇｅｔ３（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２）を示す。
前記実施例別に製造されたベクターを実験例１．３によってＨＥＫ２９３ Ｔ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、実験例１．４～１．５によってインデル発生効率を測定した。これを実験例１．６によって分析した結果が図２～図１３に示されている。
実験例３エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率比較２
実験例３．１エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率比較２－１
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使ったエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率を測定するために、実験例１．１～１．２によって各実施例を製造した。実験に使った標的配列は次の［表０９］に示した。
各実施例別エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの配列は次の［表１０］～［表１３］に示した。
前記実施例別に製造されたベクターを実験例１．３によってＨＥＫ２９３ Ｔ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、実験例１．４～１．５によってインデル発生効率を測定した。これを実験例１．６によって分析した結果が図１６～図１９に示されている。
実験例３．２エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率比較２－２
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使ったエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率を測定するために、実験例１．１～１．２によって各実施例を製造した。実験に使った標的配列は［表９］に示した通りである。
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使ったエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率を測定するために、実験例１．１～１．２によって各実施例を製造した。実験に使った標的配列は［表９］に示した通りである。
各実施例別エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡの配列は次の［表１４］～［表１７］に示した。
前記実施例別に製造されたベクターを実験例１．３によってＨＥＫ２９３ Ｔ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、実験例１．４～１．５によってインデル発生効率を測定した。これを実験例１．６によって分析した結果が図２０～図２３に示されている。
実験例３．３実験結果
前記実験結果を同一標的に対する以前の実験データと比較してみると（図１４および図１５参照）、自然界で発見されるｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをリンカーに連結したＣａｓ１２ｆ１シングルガイドＲＮＡより実験例３．１、実験例３．２のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率がさらに高いことが分かる。このような結果により、実験例３．２、実験例３．３の実施例に示されたガイドＲＮＡの変形がゲノム編集効率を向上させることを類推することができる。また、実験例２および実験例３で得られた実験結果を参照すると、変形された第１領域、および／または変形された第２領域を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムが、自然界で発見されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム、および自然界で発見されるｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをリンカーに連結したＣａｓ１２ｆ１シングルガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムよりゲノム編集効率がさらに高いことで類推することができる。
前記実験結果を同一標的に対する以前の実験データと比較してみると（図１４および図１５参照）、自然界で発見されるｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをリンカーに連結したＣａｓ１２ｆ１シングルガイドＲＮＡより実験例３．１、実験例３．２のエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率がさらに高いことが分かる。このような結果により、実験例３．２、実験例３．３の実施例に示されたガイドＲＮＡの変形がゲノム編集効率を向上させることを類推することができる。また、実験例２および実験例３で得られた実験結果を参照すると、変形された第１領域、および／または変形された第２領域を含むエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムが、自然界で発見されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム、および自然界で発見されるｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをリンカーに連結したＣａｓ１２ｆ１シングルガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムよりゲノム編集効率がさらに高いことで類推することができる。
実験例４エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率比較４
実験例４．１エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率比較４－１
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使ったエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率を測定するために、実験例１．１～１．２によって各実施例を製造した。実験に使った標的配列は次の［表１８］に示した。
実験例４．１エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率比較４－１
エンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを使ったエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのインデル効率を測定するために、実験例１．１～１．２によって各実施例を製造した。実験に使った標的配列は次の［表１８］に示した。
前記実施例別に製造されたベクターを実験例１．３によってＨＥＫ２９３ Ｔ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、実験例１．４～１．５によってインデル発生効率を測定した。これを実験例１．６によって分析した結果が図２４～図２６に示されている。
実験例４．２実験結果
前記実験結果、変形された第３領域を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率が自然界で発見されるスキャフォールドを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム、および自然界で発見されるｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをリンカーに連結したＣａｓ１２ｆ１シングルガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムよりゲノム編集効率がさらに高いことで類推することができる。
前記実験結果、変形された第３領域を有するエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡを含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのゲノム編集効率が自然界で発見されるスキャフォールドを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システム、および自然界で発見されるｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをリンカーに連結したＣａｓ１２ｆ１シングルガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムよりゲノム編集効率がさらに高いことで類推することができる。
実験例５ Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ
前記実験例２～実験例４はいくつかの内因性標的に対してのみインデル効率を測定した結果である。前記結果を補充するために、さらに広範囲な標的に対してゲノム編集が可能であるかどうかを実験した。
前記実験例２～実験例４はいくつかの内因性標的に対してのみインデル効率を測定した結果である。前記結果を補充するために、さらに広範囲な標的に対してゲノム編集が可能であるかどうかを実験した。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、５'－ＴＴＴＲ－Ｎ２０－ＮＧＧ－３'配列を有する内因性ターゲットを検索して、８８個の標的を無作為で選択した（表２０～表２２）。これは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、およびＣａｓ１２ｆ１すべてに編集が可能な配列であるので、各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのゲノム編集効率を比較できる標的である。
２）ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／ＡｓＣａｓ１２ａシステム、自然界で発見されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムまたはエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成をＨＥＫ２９３－Ｔ細胞に形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。この時、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに使われたエンジニアリングされたＣａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは次の［表２３］に整理されている。
この時、前記配列のうち５'－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３'部分はスペーサー配列であり、前記［表２０］～［表２２］に示されたプロトスペーサー配列に対応するスペーサー配列にそれぞれ設計された。
３）形質感染後、前記８８個の標的に対するゲノム編集効率は図２７および表２４に示した。
実験結果、本明細書で開示しているエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは、１）自然界で発見されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムに比べてゲノム編集効率が飛び切り高く、２）真核細胞内任意の標的に対してＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９システムおよびＣＲＩＳＰＲ／ＡｓＣａｓ１２ａシステムに立ち並ぶほどのゲノム編集効率を示し、３）一部の標的に対しては他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムよりさらに高いゲノム編集効率を示すことができることが分かった。
実験例６ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙ
本明細書で開示しているエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの遺伝子切断様相を補充的に観察するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙを進めた。実験例６で使った標的ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ配列は５'－ＴＴＴＡＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣ－３'（配列番号３４１、以下Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２）であり、前記標的のＰＡＭ配列は５'－ＴＴＴＡ－３'である。
本明細書で開示しているエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの遺伝子切断様相を補充的に観察するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙを進めた。実験例６で使った標的ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ配列は５'－ＴＴＴＡＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣ－３'（配列番号３４１、以下Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２）であり、前記標的のＰＡＭ配列は５'－ＴＴＴＡ－３'である。
実験例６で使った（エンジニアリングされた）Ｃａｓ１２ｆ１ガイドＲＮＡは次の［表２５］に示されている。
実験方法は次の通りである。
１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃａｓ１４（２．５μｇ）とＣａｎｏｎｉｃａｌ、ＭＳ２／ＭＳ３／ＭＳ４、およびＭＳ２／ＭＳ３／ＭＳ４／ＭＳ５のｓｇＲＮＡをそれぞれ２μｇをインキュベーションしてＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘを形成させた。
２）これを標的配列（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２）を含んでいるプラスミドベクター（５μｇ）と３７℃で３時間の間反応させてＩｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙを進めた。
３）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌでＡｐａ１ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｃｕｔを進めた。
４）ＣｌｅａｖａｇｅとなったＤＮＡをＵｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒであるＣｏｖａｒｉｓ（Ｍ２２０）を持って次の条件でＤＮＡ ｓｈｅａｒｉｎｇを進めた。
Ｐｅａｋ ｉｎｃｉｄｅｎｔ ｐｏｗｅｒ：５０Ｗ、Ｄｕｔｙ ｆａｃｔｏｒ：２０％、Ｃｙｃｌｅｓ ｐｅｒ Ｂｕｒｓｔ：２００ ｃｐｂ、Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ：１１０ ｓｅｃ。
５）細片化されたＤＮＡをＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを利用して精製した。
６）精製されたＤＮＡをＴ４ ｌｉｇａｓｅを利用してＥｎｄ－ｆｉｌｌｉｎｇを遂行した。
７）その後、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ・ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ、＃ Ｅ７１０３）ｋｉｔとＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｅｔ １）（ＮＥＢ、＃ Ｅ７６００）ｋｉｔを利用してＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙを製作した。
８）ｑＰＣＲを遂行して各サンプルの濃度を同一に調節した。
９）製作されたｌｉｂｒａｒｙをＩｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｅｑ １００を使って１５０－ｂｐ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇした。
１０）分析された配列はＩＧＶプログラムでａｌｉｇｎｍｅｎｔした。
１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃａｓ１４（２．５μｇ）とＣａｎｏｎｉｃａｌ、ＭＳ２／ＭＳ３／ＭＳ４、およびＭＳ２／ＭＳ３／ＭＳ４／ＭＳ５のｓｇＲＮＡをそれぞれ２μｇをインキュベーションしてＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘを形成させた。
２）これを標的配列（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ－２２）を含んでいるプラスミドベクター（５μｇ）と３７℃で３時間の間反応させてＩｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙを進めた。
３）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌでＡｐａ１ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｃｕｔを進めた。
４）ＣｌｅａｖａｇｅとなったＤＮＡをＵｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒであるＣｏｖａｒｉｓ（Ｍ２２０）を持って次の条件でＤＮＡ ｓｈｅａｒｉｎｇを進めた。
Ｐｅａｋ ｉｎｃｉｄｅｎｔ ｐｏｗｅｒ：５０Ｗ、Ｄｕｔｙ ｆａｃｔｏｒ：２０％、Ｃｙｃｌｅｓ ｐｅｒ Ｂｕｒｓｔ：２００ ｃｐｂ、Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ：１１０ ｓｅｃ。
５）細片化されたＤＮＡをＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを利用して精製した。
６）精製されたＤＮＡをＴ４ ｌｉｇａｓｅを利用してＥｎｄ－ｆｉｌｌｉｎｇを遂行した。
７）その後、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ・ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ、＃ Ｅ７１０３）ｋｉｔとＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｅｔ １）（ＮＥＢ、＃ Ｅ７６００）ｋｉｔを利用してＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙを製作した。
８）ｑＰＣＲを遂行して各サンプルの濃度を同一に調節した。
９）製作されたｌｉｂｒａｒｙをＩｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｅｑ １００を使って１５０－ｂｐ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇした。
１０）分析された配列はＩＧＶプログラムでａｌｉｇｎｍｅｎｔした。
前記実験結果を図２８に図示した。
実験結果、本明細書で開示するエンジニアリングされたガイドＲＮＡを含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムは、自然界で発見されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムと比較して非標的鎖（Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ、ＮＴＳ）に対する切断活性がさらに高いことが分かった。前記結果は本明細書で開示するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの向上したゲノム編集活性に影響を及ぼす要因と判断される。
本明細書ではゲノム編集技術に使用できるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを提供し、特に、Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌおよびエンジニアリングされたスキャフォールド領域を導入してゲノム編集効率を向上させたエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを提供する。本明細書で提供するエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムをゲノム編集に使う場合、自然界で発見されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムを使う場合と比較して高いゲノム編集効率を示し、真核細胞遺伝子を編集する用途で使うことができる。
Claims (38)
- 次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。 - 前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵ－３'で表現される、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
- 前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結される、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。 - 前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結される、請求項１に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。 - 請求項１～請求項４のいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
- 次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、この時、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下であり、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧ－３'（配列番号４７５）で表現される第１配列；
５'－ＵＵＣＧ－３'で表現される第２配列；
５'－ＣＵＣＧＡ－３'で表現される第３配列；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡ－３'で表現される第４配列；
リンカー；
５'－ＧＧＡ－３'で表現される第５配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列。 - 前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'である、請求項６に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
- 前記リンカーは５'－ＧＡＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＧＡＡＡＡＡ－３'、５'－ＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡ－３'（配列番号６４２）、５'－ＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４３）、５'－ＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４４）、および５'－ＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡ－３'（配列番号６４５）からなる群から選択される、請求項６に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
- 前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第７配列を追加的に含み、前記第７配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されている、請求項６に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
- 前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵ－３'で表現される、請求項６に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
- 前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第８配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されている、請求項６に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
- 前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第７配列を追加的に含み、５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第８配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されており、前記第７配列の３'末端は前記第８配列の５'末端と連結されていること、請求項６に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
- 前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＡＡＧ－３'、５'－ＡＡＧＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）からなる群から選択された第９配列を追加的に含み、５'－Ｃ－３'、５'－ＣＣ－３'、５'－ＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＣＣ－３'、５'－ＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'、５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）からなる群から選択された第１０配列を追加的に含み、前記第１配列の３'末端および前記第２配列の５'末端は前記第９配列を通じて連結されており、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されている、請求項６に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
- 前記第９配列が５'－Ａ－３'の場合、前記第１０配列は５'－Ｃ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡ－３'の場合、前記第１０配列は５'－Ｃ－３'、または５'－ＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＣＣ－３'、または５'－ＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＣ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＧＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵ－３'の場合、前記第１０配列は５'－ＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'であり、
前記第９配列が５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）の場合、前記第１０配列は５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）である、請求項１３に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。 - 前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ｕ－３'、５'－ＵＵ－３'、５'－ＵＵＣ－３'、５'－ＵＵＣＡ－３'、５'－ＵＵＣＡＵ－３'、５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'、および５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'からなる群から選択された第１１配列、および５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'からなる群から選択された第１２配列を追加的に含み、前記第４配列の３'末端および前記リンカーの５'末端は前記第１１配列を通じて連結され、前記リンカーの３'末端および前記第５配列の５'末端は前記第１２配列を通じて連結される、請求項６に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
- 前記第１１配列が５'－Ｕ－３'の場合、前記第１２配列は５'－Ａ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＡＡＵＧＡＡ－３'であり、
前記第１１配列が５'－ＵＵＣＡＵＵＵ－３'の場合、前記第１２配列は５'－ＧＡＡＵＧＡＡ－３'である、請求項１５に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。 - 前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'で表現される第７配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）で表現される第８配列、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）で表現される第９配列、および５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）で表現される第１０配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されており、前記第７配列の３'末端は前記第８配列の５'末端と連結されており、前記第１配列の３'末端および前記第２配列の５'末端は前記第９配列を通じて連結されており、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されている、請求項６に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
- 前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－Ａ－３'で表現される第７配列、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）で表現される第８配列、５'－ＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣ－３'（配列番号４８５）で表現される第９配列、および５'－ＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣ－３'（配列番号４８６）で表現される第１０配列を追加的に含み、前記第８配列の３'末端は前記第１配列の５'末端と連結されており、前記第７配列の３'末端は前記第８配列の５'末端と連結されており、前記第１配列の３'末端および前記第２配列の５'末端は前記第９配列を通じて連結されており、前記第２配列の３'末端および前記第３配列の５'末端は前記第１０配列を通じて連結されている、請求項６に記載のエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。
- 請求項６～請求項１８のいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
- 次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムのためのエンジニアリングされたガイドＲＮＡ：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域は次を含む：
５'末端から３'末端方向に、
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された第１配列、
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された第２配列、
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された第３配列、
５'－ＡＡＣＡＡＡ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣ－３'、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡ－３'（配列番号６７）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵ－３'（配列番号６８）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵ－３'（配列番号６９）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１３）からなる群から選択された第４配列が連結されたエンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡ；および
５'－ＧＧＡ－３'、５'－ＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、５'－ＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'、および５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１５）からなる群から選択された第５配列、および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'で表現される第６配列が連結されたエンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分、
この時、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列部分の３'末端は前記スペーサーの５'末端と連結されており、
前記エンジニアリングされたｔｒａｃｒＲＮＡの配列が５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵ－３'（配列番号１）と同一であり、前記エンジニアリングされたｃｒＲＮＡ反復配列が５'－ＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号３）と同一の場合は含まない。 - 請求項２０に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ。
- 次を含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
エンジニアリングされたガイドＲＮＡ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。 - 前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は５'－ＵＵＵＵＲＵＵＵＵ－３'で表現される、請求項２２に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体。
- 前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結される、請求項２２に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。 - 前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結される、請求項２２に記載のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。 - 次を含む、エンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質；および
請求項６～請求項１８のいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡ。 - 次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
ここで、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。 - 前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結される、請求項２７に記載のベクター：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。 - 前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡに含まれた前記スキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結される、請求項２７に記載のベクター：
５'－Ａ－３'；
５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）；
５'－ＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。 - 前記第２プロモーター配列はＵ６プロモーター配列である、請求項２７に記載のベクター。
- 前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上である、請求項２７に記載のベクター。
- 次を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１システムの各構成要素を発現できるベクター：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸配列を含む第１配列；
前記第１配列と作動可能に連結された第１プロモーター配列；
請求項６～請求項１８のいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸配列を含む第２配列；および
前記第２配列と作動可能に連結された第２プロモーター配列。 - 次を含む、細胞内で標的核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、およびエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得、
前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは次を含む：
エンジニアリングされたスキャフォールド領域；
スペーサー；および
Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌ、
この時、前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡは５'末端から３'末端方向に、エンジニアリングされたスキャフォールド領域、スペーサー、およびＵ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌが順に連結されており、
前記スペーサーは１０個以上５０個以下のヌクレオチドを含み、標的配列と相補的な配列を有し、
前記Ｕ－ｒｉｃｈ ｔａｉｌの配列は（ＵａＮ）ｂＵｃで表現され、前記Ｎはアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）のうち一つであり、前記ａ、ｂ、ｃは整数であり、ａは１以上５以下、ｂは０以上であり、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡＡＡＣＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＣ－３'（配列番号７）と異なることを特徴とし、
前記エンジニアリングされたスキャフォールド領域の配列は５'末端から３'末端方向に次の配列が順に連結されたものである：
５'－Ａ－３'、５'－ＡＡ－３'、５'－ＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１７）、５'－ＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１８）、５'－ＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１９）、５'－ＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２０）、５'－ＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２１）、５'－ＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２２）、５'－ＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２３）、５'－ＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２４）、５'－ＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２５）、５'－ＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２６）、５'－ＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号２７）、および５'－ＣＵＵＣＡＣＵＧＡＵＡＡＡＧＵＧＧＡＧＡＡ－３'（配列番号１０）からなる群から選択された配列；
５'－Ｇ－３'、５'－ＵＵＡＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＵＵＡＧＵＧＧ－３'、５'－ＣＣＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４２）、５'－ＣＣＧＵＵＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＡＧＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＡＧＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＵＵＡＧＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＵＵＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３４９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＵＵＡＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＵＡＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＵＵＡＧＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５２）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＵＵＡＧＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５３）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＵＵＡＧＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５４）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＵＵＡＧＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５５）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５６）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＡＧＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５７）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５８）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３５９）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＡＧＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６０）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＵＵＡＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６１）、５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＵＵＡＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号３６２）、および５'－ＣＣＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＵＧＵＣＣＣＵＵＡＧＧＧＧＡＵＵＡＧＡＡＣＵＵＧＡＧＵＧＡＡＧＧＵＧＧ－３'（配列番号１１）からなる群から選択された配列；
５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＵＣＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＵＣＧＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３７）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＧＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３８）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＣＧＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４３９）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＵＵＣＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４０）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＵＣＧＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４１）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４２）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４３）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４４）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４５）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＵＵＣＧＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４６）、５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＵＵＣＧＣＵＣＧＡ－３'（配列番号４４７）、および５'－ＧＣＵＧＣＵＵＧＣＡＵＣＡＧＣＣＵＡＡＵＧＵＣＧＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＧＵＡＡＣＣＣＵＣＧＡ－３'（配列番号１２）からなる群から選択された配列；
５'－ＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１１）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＧＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１２）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＧＡＡＡＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１３）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１４）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１５）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１６）、５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１７）、および５'－ＡＡＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＧＡ－３'（配列番号１１８）から選択された配列；および
５'－ＡＵＧＣＡＡＣ－３'。 - 前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体として細胞内に注入することである、請求項３３に記載の方法。
- 前記送達は前記Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質を暗号化する核酸および前記エンジニアリングされたガイドＲＮＡを暗号化する核酸を含むベクターを細胞内に注入することである、請求項３３に記載の方法。
- 前記ベクターはプラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルスおよび単純ヘルペスウイルスで構成された群から選択される一つ以上である、請求項３５に記載の方法。
- 前記細胞は真核細胞である、請求項３３に記載の方法。
- 次を含む、細胞内で標的核酸を編集する方法：
Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質またはこれを暗号化する核酸、および請求項６～請求項１８のいずれか一項に記載されたエンジニアリングされたガイドＲＮＡまたはこれを暗号化する核酸を細胞内に送達すること、
これによって前記細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体が形成され得、
これによって前記標的核酸がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ｆ１複合体によって編集され得る。
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